JPH09104699A - 血清アミロイドａを認識する抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明の課題は、炎症等のマーカーとなるヒト
血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）の凝集反応に基づく免疫学
的測定に有用な抗体と、この抗体の用途の提供である。 【解決手段】本発明は、ゲルろ過による分子量１０−４
０kDの分画に含まれるＳＡＡに対しても結合活性を備え
た新規なＳＡＡを認識する抗体である。本発明はまた、
この抗体を利用したＳＡＡの免疫学的測定試薬、免疫学
的測定方法、そしてＳＡＡの精製方法を提供する。 【効果】本発明は、優れた結合活性を備えた新しい抗体
によってＳＡＡの免疫学的凝集反応に基づく測定を可能
にした。本発明の抗体はＳＡＡに対する力価に優れ、Ｓ
ＡＡを高い感度で特異的に測定できるのみならず、測定
範囲の拡大にも貢献する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト血清中のアミロイ
ドＡ（以下、ＳＡＡと省略する）を認識する抗体、なら
びにこの抗体の使用に関するものである。臨床検査等の
分野では、物質の測定を簡便に行うために、あるいは高
い感度で特異的に測定するためにしばしば免疫学的な測
定方法が利用される。抗原性物質を免疫学的な測定方法
によって測定するには、抗原と特異的に反応する抗体が
必要となる。つまり抗原性物質であるＳＡＡの免疫学的
な測定には、ＳＡＡを認識する抗体が必要である。ＳＡ
Ａはある種のアミロイドーシスにおいて組織に沈着する
アミロイド蛋白Ａ（以下、ＡＡ蛋白と省略する）の前駆
体蛋白とされる、分子量約１２０００の血清蛋白である
[ 1]。近年になって、このＳＡＡの血清値が炎症性疾患
で上昇することが明らかにされ、鋭敏な炎症マーカーと
して評価されている[ 2][ 3]。

【０００２】

【従来技術の問題点】ＳＡＡを認識する抗体による免疫
学的測定技術については、いくつかの報告が有る[ 4][
5][ 8]。これらの先行技術文献においては、ＳＡＡを抗
体と反応させることによって生じる免疫学的な凝集を指
標として測定を行っている。免疫学的凝集反応を指標と
する測定技術は、未結合成分の物理的な分離操作（Ｂ／
Ｆ分離）が不要である。そのためＥＬＩＳＡのような不
均一系の分析方法と比べて操作が簡単で自動化が容易と
いう利点を持つ。反面、測定に利用する抗体には次のよ
うな厳しい条件が要求される。

【０００３】条件Ａ：凝集法ではより高い結合活性(avi
dity)が要求される。 凝集反応を起こし、しかも物理的に安定した凝集塊を維
持するには一般にＥＬＩＳＡで要求されるよりも高い水
準の結合活性が必要である。結合活性が不十分な抗体で
反応系を構成すると、たとえ抗体の使用量を増やして結
合活性の低さをカバーするとしても、抗原１分子に対し
て結合できる抗体の数は変わらないので十分な感度を得
ることはできない。またラテックスのような担体に抗体
を結合して用いるときにも、やはり抗体の結合量に限界
があるので、抗体の使用量を増やすという対策では限界
が有る。

【０００４】条件Ｂ：ＥＬＩＳＡでは問題とならないエ
ピトープの位置関係が凝集法では障害となることがあ
る。 凝集反応では、抗体が認識するエピトープが同一抗原上
に複数存在していなければならない。この条件はＥＬＩ
ＳＡサンドイッチ法と同じである。しかし凝集法では先
に述べたとおり物理的により強い結合を要求することか
ら、たとえ物理的な位置が異なっていても接近したエピ
トープのみで反応させることは不利である。立体障害を
起こしやすく、結果として大きな凝集塊を得にくくなる
ためである。ポリクローナルな抗体ではこのようなエピ
トープの位置関係が大きな問題となる可能性が低い。し
かしポリクローナルな抗体とはいえＳＡＡの免疫学的な
測定に有用なエピトープはわずかに数個であり、モノク
ローナル抗体ほどではないにしろエピトープの選択は大
切な条件の一つである。

【０００５】先に紹介した先行技術文献に開示された技
術に基づいて得られる抗体は、必ずしもこれらの条件を
十分に満足するものではなかった。特に抗体の結合活性
については、先の条件を満足する抗体を得ることが困難
であったため、試薬の商業的な供給はむずかしいと考え
られていた。

【０００６】具体的には、たとえばネフェロメトリック
アッセイを利用した報告[ 5]では、１−１３μg/mlの間
で直線性を確認している。ＥＬＩＳＡで１．５−３０μ
g/ml[ 6]、あるいは５５−７５０ng/200μl[ 7]を測定
した報告が有る。また免疫学的ラテックス凝集法による
測定例[ 8]では、検出限界が０．５μg/mlであるのに対
して反応曲線は３０μg/ml付近で傾きを失っている。す
なわちこの文献では６０倍程度の濃度差しか測定できて
いないことになる。この値は必ずしも不十分なものでは
ない。しかしＳＡＡの血中濃度は大きく変動し数百μg/
mlに達するものもあるので、たくさんの検体を測定する
場合には測定範囲の上限を越えることも少なからず観察
される。測定範囲を越える検体については、希釈・再測
定が要求されるので処理能力の低下につながる。ＳＡＡ
では、ドットブロットと酵素標識抗体を組み合わせた特
殊な反応系で１．２５−１６０μg/mlという測定レンジ
を実現した報告も有る[12]。しかしこの報告においては
加熱処理によって抗原性を強める処理が必要であり、本
発明のように試料を前処理無しで測定する方法とは区別
される。また固相イムノラジオメトリックアッセイによ
って、試料の変性処理を行うことなく１０００倍に及ぶ
測定範囲を実現した報告[13]もある。ただしこの結果は
ＲＩ標識抗体を使い固相の洗浄工程を実施して得たもの
である。更に標準に利用されたＳＡＡの濃度が不明なの
で、測定範囲の評価を行うことができない。

【０００７】あるいは検体の希釈率を大きくしたり、抗
体の使用量を増やすことによって高値検体の測定を可能
にすることもできる。しかしこのような対策では、結果
として測定感度を下げることになるので実用的とは言え
ない。特に従来のように結合活性の不十分な抗体では、
感度を維持しながら抗体濃度を上げることはとても困難
である。つまり、幅広い濃度の試料を同じ測定条件で測
定することができないのである。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、ＳＡ
Ａの凝集反応による測定を可能とする新しい抗体の提供
である。そしてこのような新規な抗体によって、優れた
測定性能を持つＳＡＡの免疫学的測定試薬と、測定方法
等の用途を合わせて提供するものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明の課題は、次のよ
うな反応性を備えたＳＡＡを認識する抗体によって解決
される。すなわち本発明の抗体は、ＳＡＡを認識する抗
体であって、高比重リポ蛋白質とＳＡＡを含む血清を非
変性条件下でゲルろ過により分画して得ることができる
分子量１０〜４０kDの分画に含まれるＳＡＡに反応する
抗体である。

【００１０】以下にこの条件について具体的に説明す
る。血清中ではＳＡＡの大部分が高比重リポ蛋白質（以
下ＨＤＬと省略する）と会合した状態で存在している。
ＨＤＬと会合したＳＡＡ（以下ＨＤＬ−ＳＡＡと称す
る）は、非変性条件下でゲルろ過によって分画した時に
分子量１００−３００kDに溶出される。通常ＳＡＡを精
製する時には血清のＨＤＬ分画として回収するので、一
般的な精製操作によって回収されるＳＡＡはこの１００
−３００kD分画に含まれるＳＡＡと言うことができる。
しかしゲルろ過により分子量を指標に分画していくと、
１０−４０kDの分画にもＳＡＡがわずかに溶出する。従
来の抗体ではこの分画のＳＡＡを十分な感度で検出でき
ないので追跡が困難であるが、本発明の抗体はこの分画
に含まれるＳＡＡと明らかに反応性を示す。なおＨＤＬ
−ＳＡＡは、ゲルろ過で分子量を求めると１００〜３０
０kDの分画に溶出されるので、本発明の抗体の新規な特
徴は明確に区別することができる。

【００１１】ゲルろ過による分子量１０−４０kDの分画
に溶出されるＳＡＡの代表的なものは、ＨＤＬと会合し
ていないＳＡＡ（以下ｆＳＡＡと省略する）である。精
製ｆＳＡＡを得るには、血清や腹水のようなＳＡＡを含
む原料から分子量を指標にしてｆＳＡＡを分取する方法
を利用すると良い。これらの体液中でわずかに存在する
ｆＳＡＡを回収するのである。

【００１２】具体的には次のような操作を行う。たとえ
ば血清を原料とする場合には、まずＳＡＡを多く含む血
清（ここで言うＳＡＡはＨＤＬ−ＳＡＡも含む）の比重
を調節し超遠心分離によって比重１．２３〜１．０６３
の分画を回収する。回収したＨＤＬよりも比重の大きい
分画を、抗ＳＡＡ抗体を使った抗体アフィニティークロ
マトグラフカラムにアプライし、不純物を洗浄した後に
カラムに吸着したｆＳＡＡを溶出する。このときに抗体
として用いるのは公知の抗体ではなく、本発明によるｆ
ＳＡＡを認識する抗体でなければならない。従来の抗体
ではｆＳＡＡを吸着することができないためである。溶
出したｆＳＡＡをプールし、ゲルろ過により目的とする
１０−４０kDの分子量を持つ分画を採取する。これを必
要に応じて濃縮すればｆＳＡＡを純粋な形で回収できる
[ 9]。ただしｆＳＡＡはＳＡＡ高値血清においてもわず
かしか存在しないので、多量の原料を用意しないと十分
な量を回収することはできない。たとえば１００μg/ml
のＳＡＡを含む血清１０Lを出発原料としたとき、この
ような精製方法では１mg程度の精製抗原を回収できるに
すぎない（回収率は総ＳＡＡに対して０．１%）。ＨＤ
Ｌ分画から回収する場合には一般に１０−２０%程度の
回収率が期待できることから、ｆＳＡＡの精製が困難な
ことがわかる。

【００１３】大量のｆＳＡＡを得るには、ＳＡＡのアミ
ノ酸配列をコードする遺伝子をクローニングし、適当な
ホスト−ベクター系に組み込んで発現させる方法を採用
することもできる。本発明者等の新たに得た知見によれ
ば、宿主に対して毒性の強い蛋白の発現に有用なｐＥＴ
等のベクター[10]に、公知の方法[11]でクローニングし
たＳＡＡのアミノ酸配列をコードする遺伝子[16]を組み
込みこんで大腸菌に導入すれば、ＳＡＡのアミノ酸配列
を持つ蛋白を発現可能であることを確認した。こうして
発現させたＳＡＡと同じアミノ酸配列を持つ蛋白を精製
して得られるＳＡＡ（以下ｒＳＡＡと省略する）は、当
然のことながら血清から精製したＳＡＡと同じアミノ酸
配列を持っているものの、その１分子と会合している脂
質成分はきわめて少ない。このような理由から、本発明
の抗体に対して血清から精製したｆＳＡＡとほぼ同じ抗
原性を示すものと思われる。なお発現系によっては、生
成物のＮ末端に開始コドンに対応するメチオニン残基が
残ることがある。しかし本発明者らの経験によれば、Ｓ
ＡＡの場合Ｎ末端へのメチオニン残基の付加は抗原性や
保存性に特に影響を与えなかった。したがって、Ｎ末端
へメチオニン残基を付加したペプチドは実質的にＳＡＡ
と同じアミノ酸配列を持つ蛋白と言うことができる。

【００１４】ｆＳＡＡと抗体との反応性を確認するに
は、ｆＳＡＡをそのまま、あるいは必要に応じて担体に
感作させて抗体と反応させれば良い。抗体との反応性
は、寒天中での免疫沈降反応を観察するオクテロニー
法、あるいは溶液中で免疫学的複合体の生成を観察する
免疫学的沈降反応によっても確認することができる。反
応性を数値化するためには、抗体をラテックス等の粒子
担体に感作し抗原による粒子の凝集を光学的に測定する
粒子凝集反応法、免疫複合体の生成を光学的に定量する
免疫比濁法（以下ＴＩＡと省略する）、抗原を固相化し
て抗体の反応性を酵素標識抗体等で追跡するＲＩＡ法や
ＥＬＩＳＡ法等を採用することもできる。

【００１５】反応性の確認には、この他にウエスタンブ
ロッティング法が有効である。つまり、ＨＤＬ−ＳＡＡ
とｆＳＡＡが混在した状態の抗原混合物を分子量マーカ
ーとともにOrnstein、Davisの非変性条件下での電気泳
動[14][15]により分離後、これをニトロセルロース膜に
ブロッティングする。こうして血清蛋白を固定したニト
ロセルロース膜に反応性をチェックすべき抗体を接触さ
せ、必要に応じて洗浄した後、更に抗体に対する標識抗
体を反応させる。標識抗体の結合を肉眼的に判定しても
良いし、あるいは発色強度（酵素標識）やオートラジオ
グラフィー（ＲＩ標識）の信号強度をデンシトメーター
で測定すれば定量的に反応性の比較を行うことができ
る。この方法によれば、ＨＤＬ−ＳＡＡとｆＳＡＡの両
方に対する反応性を同時に確認することができるので便
利である。

【００１６】抗体の反応性を正確に比較するには、でき
るだけ免疫反応に好ましい条件を与えるようにする。反
応性を左右する条件には、温度、ｐＨ、そして塩濃度等
を示すことができる。もっとも本発明の抗体は、基本的
にｆＳＡＡとの反応性を備えていることが重要なのであ
り、必ずしもその反応性の強さを厳密に比較しなくとも
良い。これまでに知られているＳＡＡを認識する抗体は
ｆＳＡＡとは実質的に反応しないので、反応性の有無を
確認することで、公知の抗体と明確に識別することが可
能である。上記のような反応性を持つ抗体は、凝集活性
にすぐれ、ＳＡＡの免疫学的測定方法、特に免疫学的粒
子凝集反応や免疫比濁反応のための抗体として有用であ
る。

【００１７】本発明において、抗体が特定の分子量分画
のＳＡＡと実質的に反応しないとは、たとえば次のよう
な条件のもとで抗体を反応させたときに観測可能な変化
をもたらさないことで定義することができる。

【００１８】すなわち、ＳＡＡを含まない正常ヒト血清
に一定量のＳＡＡを添加して試料とする。実施例におい
てはｒＳＡＡを添加して最終的なＳＡＡ濃度を７．５μ
g/mlとした。本発明による抗体は、１０μg/ml、好まし
くは７．５μg/mlのＳＡＡを添加した時に分子量１０−
４０kDの分画に溶出されるＳＡＡとの反応性を確認する
ことができる。このようにｒＳＡＡをＨＤＬを含む正常
ヒト血清に混合することにより、ＨＤＬと会合したＳＡ
ＡとｆＳＡＡが生じる。この試料をあらかじめ分子量マ
ーカーによって溶出パターンを確認したゲルカラムにア
プライする。ゲルろ過を行って目的とする分子量分画
（つまり１００−３００kDと１０−４０kD）を分取し、
反応性を確認するべき抗体を反応させる。抗体はラテッ
クス粒子に感作し、免疫学的な凝集反応を光学測定によ
り追跡する。このような条件で分析したとき、実質的に
抗体が反応しなければ凝集反応による光学的な変化量は
検出限界に満たない。なお一連の操作の詳細は実施例に
述べる。

【００１９】なお実施例に示すように、本発明の抗体は
ｒＳＡＡのＰＢＳ溶液をゲルろ過で分画したものを試料
とした時にも１０−４０kDの分画で反応性を示す。この
分画はｒＳＡＡそのものに他ならない。すなわち本発明
の抗体は、ラテックス粒子に結合させてｒＳＡＡと反応
させた時、明瞭な凝集活性を示すことにより公知の抗体
と識別することもできる。

【００２０】本発明による抗体の結合活性は、分子間の
結合状態を定量的にとらえる分析手法によって数値化す
ることもできる。たとえばIAsys (Affinity SENSORS)
と呼ばれる市販の光バイオセンサーは、検体を入れたセ
ンサーキュベットに様々な角度からレーザー光を当てエ
バネッセント波を共鳴させる入射角をもとにして、キュ
ベットに結合した分子の質量を算出する分析システム
で、キュベット中での分子間の結合および解離をリアル
タイムで観察することが可能である。この分析システム
のキュベットに、ゲルろ過による分子量１０−４０kDの
分画に含まれるＳＡＡ、あるいは配列1に示すアミノ酸
配列をコードする遺伝子から微生物細胞を宿主として発
現させて得られる組み換えタンパク質（ｒＳＡＡ）を固
定した後、抗ＳＡＡ抗体を反応させ解離平衡定数(M)、
あるいは会合平衡定数（M^-1）として数値化すれば良
い。好ましい態様における本発明の抗体の結合活性を解
離平衡定数で定義すれば、ｒＳＡＡを抗原として測定し
た時に２×１０^-7M以下、より好ましくはおよそ５×１
０^-8Mの値を示す。なお同じ条件で公知の抗体を分析す
ると、その数値はせいぜい５×１０^-7M程度となり、本
発明による抗体の結合活性の優れていることが明らかで
ある。

【００２１】本発明の抗体は、高度に精製したｆＳＡＡ
を免疫原に利用し更に免疫原性を高めるための特殊な免
疫方法を採用することによって安定して得ることが可能
である。免疫原に利用するｆＳＡＡは、先に説明したよ
うな方法によって得ることができる。すなわち、血清中
に存在するｆＳＡＡ、あるいはｒＳＡＡを免疫原とし、
更に抗体のスクリーニングにもこれらの抗原を利用して
前記条件を満足する抗体をプールすることにより本発明
の抗体を得ることができる。

【００２２】また精製ｆＳＡＡやｒＳＡＡを免疫原とす
るときに、その抗原性を高めるために様々な技術を応用
することができる。フロイントのコンプリート・アジュ
バント（以下、ＦＣＡと省略する）は免疫原性を高める
ために必要な成分の一つである。このほかヒト型結核菌
を追加して免疫原とする、あるいは百日咳ワクチンを免
疫時に筋注する方法を組み合わせるのが有効である。Ｓ
ＡＡは多くのほ乳動物の間で相同性が高いため、免疫動
物に対して抗原性を示しにくいことが指摘されている。
これまでに報告された凝集反応によるＳＡＡの測定範囲
が必ずしも十分でなかったことの原因の一つは、このＳ
ＡＡの抗原性の低さが原因の一つであると推測される。
本発明では免疫原にｆＳＡＡを用い、反応性をｆＳＡＡ
でスクリーニングすることによって、従来にない結合活
性を備えた抗体を得、結果として強力な凝集活性を持つ
抗体の提供を可能とした。

【００２３】こうして得られた本発明の抗体は、先に述
べたような条件、すなわちゲルろ過による分子量１０−
４０kDに溶出されるＳＡＡとの反応性を備えるととも
に、好ましくは次のような凝集活性を持つ。すなわち本
発明における好ましい抗体は、以下のような条件のもと
で反応直後から３００秒間の吸光度の変化量を測定した
ときに、盲検との差が０．０５以上の値を示す。従来の
抗体の持つ凝集活性では、このような大きな値を得るこ
とはできない。 条件：抗体を粒径０．０４〜０．６μmの重合体粒子に
感作 粒子濃度０．０２〜０．５% １．０μg/mlのヒト精製ＳＡＡと接触させる 液量比が検体：ラテックス乳液＝１：３から１：１５ なおこの反応条件は最低限必要な条件であって、この他
の反応条件は対象となる抗体の特性や利用する重合体粒
子等の他の成分に応じて好ましい条件を選択することは
言うまでもない。この他の反応条件とは、反応温度、測
定波長、反応液のｐＨや緩衝剤成分をさす。

【００２４】本発明は、前記抗体を利用したＳＡＡの免
疫学的測定試薬を合わせて提供する。本発明の抗体は、
公知の免疫学的測定試薬に適用することができる。好ま
しい試薬形態として、次のようなものを示すことができ
る。本発明による免疫学的測定用試薬としてもっとも好
ましいのは、不溶性担体粒子に抗体を感作した免疫学的
測定用試薬である。不溶性担体粒子には、ポリスチレン
やゼラチンに代表される重合体粒子の他、シリカや各種
金属ゾルのような無機材料、赤血球や細菌菌体のような
生物学的な素材が知られている。抗体は、これらの不溶
性担体に、物理的に吸着させるか、あるいは化学的に結
合することができる。抗体を結合した不溶性担体粒子は
ＳＡＡの存在下で凝集するので、この凝集を光学的に追
跡するか、あるいは目視によって判定することによって
ＳＡＡの測定が可能である。粒子凝集の光学的な測定に
は、吸光度測定や散乱光測定が知られている。光学測定
に用いられる光源は、主に不溶性担体粒子の粒径に応じ
て赤外部、近赤外部、そして可視部から波長が選択され
る。光源にはレーザーが採用される場合もある。

【００２５】本発明による免疫学的測定用試薬として
は、抗体が遊離の状態で存在し、かつ免疫学的な反応の
場に免疫複合体形成に基づく不溶性沈降物の生成を促進
する反応増強剤を供給する試薬と組み合わされている形
態も採用することもできる。この形態では、光学的に追
跡可能な形で免疫複合体を生成しなければならないの
で、強い凝集活性を備えた本発明の抗体の使用が非常に
有利である。本発明の試薬において、免疫複合体形成に
基づく不溶性沈降物の生成を促進する反応増強剤として
は、ポリエチレングリコールやその誘導体、ノニオン系
の界面活性剤、およびデキストラン硫酸等のポリアニオ
ンが知られている。これらの増強剤は、適宜組み合わせ
て利用すると良い。本発明の抗体を免疫学的な測定用試
薬とするときには、リウマチ因子や補体による非特異的
な影響を抑制することを目的として適当な酵素で消化し
た断片として用いることもできる。抗体断片としては、
ペプシンによるＦ（ａｂ’）２、プラスミンによるＦａ
ｃｂ’等が知られている。

【００２６】本発明のＳＡＡの免疫学的測定試薬には、
この他に公知の成分を組合せることができる。すなわ
ち、免疫反応に必要なｐＨを与える緩衝剤、免疫反応を
促進する反応増強剤、非特異反応を抑制する反応安定剤
やブロッカー等を組合せても良い。

【００２７】緩衝剤としては、次のようなものが利用さ
れている。 ＧＯＯＤ緩衝剤 ２−モルホリノエタンスルホン酸（2-(N-Morpholino)et
hanesulfonic acid、ＭＥＳと省略する） ピペラジン−ビス（２−エタンスルホン酸）（Piperazi
ne-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid)、ＰＩＰＥＳと省
略する） （２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸
（N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid、ＡＣ
ＥＳと省略する） ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスル
ホン酸（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoehtanesulfo
nic acid、ＢＥＳと省略する） ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキ
シメチル）メタン（Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hyd
roxymethyl)methane、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓと省略する） ３−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒ
ドロキシプロパンスルホン酸（3-[N,N-Bis(2-hydroxyet
hyl)amino]-2-hydroxypropanesulfonic acid、ＤＩＰＳ
Ｏと省略する） ２−ヒドロキシエチルピペラジン−３−プロパンスルホ
ン酸（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-3-propanesulfo
nic acid、ＥＰＰＳと省略する） ヒドロキシエチルピペラジン−２−エタンスルホン酸
（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic a
cid 、ＨＥＰＥＳと省略する） ２−ヒドロキシエチルピペラジン−２−ヒドロキシプロ
パン−３−スルホン酸（N-2-Hydroxyethylpiperazine-
N'-2-hydroxypropane-3-sulfonic acid、ＨＥＰＰＳＯ
と省略する） ３−（モルホリノ）プロパンスルホン酸（3-(N-Morphol
ino)propanesulfonic acid、ＭＯＰＳと省略する） ３−（モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン
酸（3-(N-Morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid
、ＭＯＰＳＯと省略する） ピペラジン−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン
酸）（Pioerazine-N,N'-bis(2-hydroxypropanesulfonic
acid)、ＰＯＰＳＯと省略する） N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic
acid 、ＴＡＰＳと省略する） トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ヒドロキシ−
３−アミノプロパンスルホン酸（N-Tris(hydroxymethy
l)methyl-2-hydroxy-3-aminopropanesulfonic acid、Ｔ
ＡＰＳＯと省略する） トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタン
スルホン酸（N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoeth
anesulfonic acid、ＴＥＳと省略する） その他の緩衝剤 ２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１、３−プロパン
ジオール（2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanedio
l）、またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
（Tris(hydroxymethyl)aminomethane）とも呼ばれる リン酸緩衝液 アンモニウム緩衝液 これらの緩衝剤の中でも、ＨＥＰＥＳやＰＩＰＥＳ等の
ＧＯＯＤ緩衝剤は、免疫反応に有利なｐＨを与えるのみ
ならず、蛋白質への影響が小さいので特に好ましい緩衝
剤として挙げられる。

【００２８】更に反応安定剤やブロッカーとしては、Ｂ
ＳＡ（ウシ血清アルブミン）、動物血清、ＩｇＧ、Ｉｇ
Ｇ断片（ＦａｂやＦｃ）、アルブミン、乳蛋白、アミノ
酸、ポリアミノ酸、コリン、ショ糖等の多糖類、ゼラチ
ン、ゼラチン分解物、カゼイン、グリセリン等の多価ア
ルコール等が免疫反応において反応の安定化や非特異反
応の抑止に有効なことが知られている。

【００２９】これらの各種成分を含む本発明によるＳＡ
Ａの免疫学的測定試薬は、溶液状態で、あるいは乾燥状
態で供給することができる。溶液状態で流通させるに
は、蛋白の安定性を高めることを目的として、更に各種
界面活性剤、糖、不活性蛋白等を加えても良い。これら
の安定化剤は、試薬を乾燥するときにも安定剤として、
あるいは賦形剤として有効である。本発明によるＳＡＡ
の免疫学的測定試薬を溶液状態のままで流通させる場合
には、ＳＡＡとの免疫学的な反応に影響を与えにくい防
腐剤を添加しておくと有利である。このような防腐剤に
は、アンホテリシンＢやミクロシドのような抗菌剤が用
いられる。

【００３０】本発明によるＳＡＡの免疫学的測定方法
は、先に述べたＳＡＡの免疫学的測定試薬により実現す
る。試薬が凝集反応用のものであれば、凝集反応の進行
を光学的に、もしくは肉眼によって追跡する事によって
行う事ができる。

【００３１】更に本発明は、以下の特徴を持つ新規なＳ
ＡＡの測定方法を合わせて提供する。すなわち、抗体に
よってヒト血清アミロイドＡを免疫学的に測定する方法
であって、前記抗体が不溶性担体粒子に結合されてお
り、この不溶性担体粒子の免疫学的凝集反応の測定値
が、１００倍の濃度範囲においてヒト血清アミロイドＡ
の濃度値と１：１に対応しているヒト血清アミロイドＡ
の測定方法である。先に述べたラテックス凝集反応によ
ってＳＡＡを測定する場合、ＳＡＡ濃度５０μg/mlを持
つ試料に対してそれを１００倍まで段階希釈した試料を
同じ測定条件で測定し、得られた結果をグラフにプロッ
トする。こうして描いたグラフが反応曲線である。同じ
測定条件とは、試料の希釈条件や試薬と試料の液量比等
の測定結果に影響する条件を統一することを意味する。
測定範囲の狭い公知の測定技術であっても、濃度に応じ
て希釈倍率や試料と試薬の液量比を変えれば１００倍の
濃度範囲を測定することはできる。しかし濃度に応じて
測定条件を変えることは同一の測定条件という本発明の
要件を満足しないから、公知の測定技術と本発明の測定
技術とは明瞭に区別される。

【００３２】ここでいう同じ条件とは、ある１００倍の
濃度範囲の測定のための条件が同じことを意味してい
る。したがって必ずしも常に同じ測定条件を利用する必
要はない。具体的には０．５−５０μg/mlという濃度範
囲（１００倍）の中では同じ条件を用いるが、その測定
条件と１０−１０００μg/mlという濃度範囲（１００
倍）を測定する時の条件とを同一にする必要はないので
ある。１０−１０００μg/mlを測定するには、この濃度
範囲に応じた条件とすれば良い。言い換えれば、ある一
定の測定条件のもとで、１００倍の濃度範囲を測定でき
ることが本発明の特徴である。前記測定方法では、１０
０倍という濃度範囲において対応する測定値は濃度に応
じて増加し続ける。あるいは測定値が濃度に応じて下が
る測定系であれば、この濃度範囲において測定値が下が
り続ける。言い換えれば、本発明による新規な試薬によ
って描かれる標準曲線は、好ましい態様では１００倍と
いう濃度範囲における測定値が一定の方向に変化し続け
ると定義することができる。

【００３３】従来の免疫学的ラテックス凝集反応法では
試薬として利用した抗体の結合活性が不十分なため、１
００倍という幅広い濃度範囲を同じ測定条件のもとで測
定すると直線的に反応曲線が推移するのはその一部分の
みであった。つまり低濃度域で直線性を示すものであれ
ば濃度の上昇にともなって反応曲線が下がるポイントが
現れる。この現象はプロゾーンと呼ばれ、高濃度域での
定量的な測定を困難にするものである。一方、逆に高濃
度域で直線性を示す場合には、ある濃度で反応曲線の傾
きが無くなり、測定が不可能になってしまうポイントが
現れる。つまり感度が不足するのである。プロゾーン現
象や感度不足状態のようにラテックス凝集反応の測定値
に測定対象成分の濃度変化が反映されていない状態は、
１つの測定値に対して複数の濃度が対応しており、本発
明において定義した両者の対応が１：１という条件を満
たさない。

【００３４】この他本発明は、新規な抗体を利用したＳ
ＡＡの精製方法を提供する。本発明の抗体はＳＡＡに対
する結合活性が強いので、抗体アフィニティクロマトグ
ラフ法に応用した場合に高い収率でＳＡＡを回収するこ
とができる。すなわち、ＳＡＡを含む材料をそのまま、
あるいはイオン交換クロマトグラフィーや超遠心分離等
で前処理した後に本発明の抗体を固定したカラムにアプ
ライし、免疫反応によってＳＡＡを捕捉する。ＳＡＡを
捕捉したカラムを免疫学的な結合に影響しない適当な緩
衝剤で洗浄後、免疫学的な結合を開裂する溶出剤でＳＡ
Ａを抗体からはずして回収すれば、ＳＡＡを高い収率で
得ることができる。溶出剤には１M以上の高い濃度の尿
素やグアニジン等のカオトロピック剤が利用される。抗
体アフィニティクロマトグラフ法は適当な界面活性剤の
存在下で行っても良い。

【００３５】また本発明の抗体はＨＤＬ分画以外に含ま
れるＳＡＡとも反応性を持つので、あらかじめ分子量や
比重に基づいて分画した材料に適用したときには、ｆＳ
ＡＡの回収を可能とする。本発明の抗体によって精製さ
れるＳＡＡは免疫原や免疫測定用の標準として有用であ
る。更に、先に述べたｒＳＡＡの回収に当たっても本発
明の抗体は高い結合活性を持つので有用である。ゲルろ
過による分子量１０−４０kDに含まれるＳＡＡとの反応
性を備えた本発明の抗体によれば、ｒＳＡＡの回収を容
易に行うことができるのである。

【００３６】

【作用】本発明は、特定の結合活性を持つ新規な抗体を
提供する。本発明の抗体は凝集活性に優れ、ＳＡＡの免
疫学的な凝集反応に基づく試薬の測定範囲を拡大する。
公知のＳＡＡに対する抗体は、血清のＨＤＬ分画として
回収したＳＡＡを免疫原としているので、ｆＳＡＡに対
しては実質的な反応性を持つ抗体が得られなかったもの
と推測される。一方本発明では、あえて少量しか得るこ
とのできないｆＳＡＡや、あるいは新たに得られたｒＳ
ＡＡを免疫原とする事によって新しい抗体を得た。

【００３７】本発明の抗体は、単にｆＳＡＡと反応する
のみならず、ＨＤＬ−ＳＡＡに対しても従来の抗体を上
回る結合活性を示す。本発明の抗体は、このような結合
活性を備えることによって免疫学的測定用試薬の性能を
著しく改善する。具体的には、試薬の感度を犠牲にする
こと無く広い範囲にわたって信頼性の高い測定を実現す
る。従来の抗体とのｆＳＡＡに対する結合活性の違いが
なぜ試薬性能の改善につながるのか、その作用機序は明
らかではない。しかし実験的には、単にｆＳＡＡと反応
することだけでは説明することのできない明らかな効果
が確認されている。なお生体内ではＳＡＡの大部分がＨ
ＤＬと会合した状態で存在しており、通常の生体試料中
にはｆＳＡＡはほとんど観察されない。したがって本発
明による抗体のｆＳＡＡに対する高い結合活性が誤った
分析結果につながる恐れはない。また、炎症症状のマー
カーとなるのはヒトではＳＡＡのサブタイプのうち１
α、１β、１γ、２α、および２β等であるが、本発明
の抗体はこれらのサブタイプのいずれとも反応し、しか
も炎症症状との関連を示さないサブタイプＳＡＡ−４に
対しては反応性を持たない。

【００３８】

【発明の効果】本発明の抗体によって、従来の抗体では
実現の困難な広い測定範囲を持った試薬を容易に得るこ
とができる。また本発明の抗体を利用したＳＡＡの免疫
学的測定用試薬、あるいはＳＡＡの免疫学的測定方法に
よって、自動化が容易な免疫学的凝集反応に基づく測定
範囲の広い分析が可能になる。本発明によって提供され
る新規な抗体を利用したＳＡＡの免疫学的測定試薬は、
特に高い濃度における直線性に優れ、広い測定範囲を実
現するものである。ＳＡＡは鋭敏な炎症マーカーとして
有用である。炎症症状に伴って血清濃度が上昇するのは
ヒトの場合には１α、１β、１γ、２α、および２βと
いったサブクラスである。本発明による抗体を利用すれ
ば、これらのサブクラスを広い濃度範囲にわたって測定
することができる免疫学的測定試薬の提供が可能とな
る。更に、本発明の抗体はｒＳＡＡの精製に有用であ
る。従来の抗体では精製が困難な細菌を宿主として得ら
れたｒＳＡＡを、本発明の抗体は強い結合活性で結合し
高い収率で回収することができる。

【００３９】

【実施例】

１．ＳＡＡ発現株の樹立 １−１．ＰＣＲ用プライマーの合成 ＳＡＡをコードする遺伝子をＰＣＲ増幅するために、次
の配列を持つプライマーを固相ホスファイト法で合成し
た。なおベクターのクローニングサイトに合わせてプラ
イマーの５’側にはNdeIサイトを、同じく３’側にはBa
mHIサイトを導入してあり、それぞれの認識配列を[]で
囲んだ。 ５’側プライマー： ５’−GTAGTTCAGGT[CATATG]CGAAGCTTCTTTTCGTTCCTTG−
３’ ３’側プライマー： ５’−GACA[GGATCC]GAGGAAGCTCAGTATTTCTCAG−３’

【００４０】１−２．ＰＣＲ増幅 ＳＡＡをコードするｃＤＮＡを増幅するために、１−１
に示したプライマーと、ヒト肝組織のｃＤＮＡライブラ
リーのテンプレートとを用いて、９４℃１分、６３℃１
分、７２℃１分のサイクルで３０サイクルＰＣＲ増幅し
た。増幅されたＤＮＡ断片は、２%アガロースゲル電気
泳動によりおよそ３５０bpであることが確認され、さら
に各制限酵素によるマッピングを試みたところ、公知の
ヒトＳＡＡをコードするＤＮＡ配列[16]と一致すること
が確認された。

【００４１】１−３．ヒトＳＡＡ蛋白発現ベクターの構
築 １−２で増幅したＤＮＡ断片をNdeI、BamHI（宝酒造
製）で消化後、アンピシリン耐性遺伝子を有するプラス
ミドベクターｐＥＴ２１−ａ（＋）のNdeI/BamHIサイト
に連結した。

【００４２】１−４．発現株の樹立 得られたプラスミドベクターを、塩化ルビジウム法によ
りコンピテント化した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙ
ｓＳ に導入し形質転換させた。アンピシリン（１２５
μg/ml）を含むＬＢ寒天培地に培養することにより形質
転換された菌を選択後、プラスミドを精製しｐＥＴ２１
よりも高分子量のプラスミドを持つ菌株を選別し、さら
に抗ＳＡＡ抗体と反応する分子量１２０００の蛋白を発
現する株を選択した。発現蛋白のアミノ酸配列を調べ、
配列１に示す公知のＳＡＡ１−αのＮ末端に開始コドン
由来のメチオニンが１残基付加された配列を持つことを
確認した。なお本明細書においては次のようなアミノ酸
の略号を利用する。 アラニン A or Ala アルギニン R or Arg アスパラギン N or Asn アスパラギン酸 D or Asp システイン C or Cys グルタミン Q or Gln グルタミン酸 E or Glu グリシン G or Gly ヒスチジン H or His イソロイシン I or Ile ロイシン L or Leu リジン K or Lys メチオニン M or Met フェニルアラニン F or Phe プロリン P or Pro セリン S or Ser トレオニン T or Thr トリプトファン W or Trp チロシン Y or Tyr バリン V or Val

【００４３】ここで用いたｐＥＴ２１はＴ７ファージプ
ロモーターを含む形質転換用ベクターで、宿主大腸菌に
より供給されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより組み込ん
だ遺伝子の転写が開始される。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
遺伝子は、 Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside
（ＩＰＴＧ）を培溶液に添加することで初めて誘導され
るので、遺伝子の転写をＩＰＴＧにより制御することが
できる。ＳＡＡのように難溶性の物質の発現は宿主に対
して毒性を示すため一般的には十分な発現量を期待でき
ないが、このように遺伝子の転写をコントロールすれば
菌体量が十分に増えた段階で発現を誘導できるので結果
として発現産物の収量は増加する。

【００４４】１−５．ｒＳＡＡの発現 １−４で得た大腸菌ＰＥＴ−ＳＡＡ１−ＢＬ２１株をカ
ルベニシリン（５００μg/ml）を含む３００mlのＬＢ培
地に接種し３７℃で培養した。６００nmにおける吸光度
が０．６〜０．９の時点で、１mMとなるようにＩＰＴＧ
を加え、さらに３０分後に２００μg/mlになるようにリ
ファンピシンを加え、３時間から６時間培養後、遠心に
より沈殿物として回収した。リファンピシン添加によ
り、発現ＳＡＡが宿主に及ぼす溶菌作用を押さえること
ができ、リファンピシン無添加に比べ回収量を著しく増
大している。

【００４５】１−６．精製 沈殿物をグアニジン緩衝液（４M塩酸グアニジン、０．
０２５mMトリス−塩酸、ｐＨ８．６）に分散後超音波処
理により菌体の破砕とｒＳＡＡの可溶化を行った。可溶
化したサンプルはアフニティーバッファー（０．５M
ＮａＣｌ、２mMＥＤＴＡ、０．０１M トリス塩酸・ｐ
Ｈ８．２、０．１% Ｔｗｅｅｎ２０）に透析し、遠心
分離により上清を分取後、抗ＳＡＡ抗体を吸着させたセ
ファロース４Ｂアフィニティーカラムに通し吸着後、溶
出緩衝液（０．５M ＮａＣｌ、２mM ＥＤＴＡ、０．
０１M トリス塩酸・ｐＨ８．２、０．１% Ｔｗｅｅｎ
２０、３M ＫＳＣＮ）で溶出させ、溶出分画をグアニ
ジン緩衝液で透析後SephacrylS−300カラムにアプライ
し分子量の違いで分離した。分離した分画についてディ
スク電気泳動を行ったところほぼ純粋な状態で分離され
ていることが確認された。最終的に、３００mlの培養物
からおよそ２mgのｒＳＡＡを回収した。

【００４６】２．抗体 １で得たｒＳＡＡを０．０１Mトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８．６、０．０５%Tween20含有）で１mg/mlに調整後、
ヒト型結核死菌を加えたＦＣＡ（１mlのＦＣＡに対して
結核死菌を４mg）と等量混合し、じゅうぶんに乳化させ
た後に１mlを家兎の四肢に免疫した。同時に百日咳ワク
チンを後足基部に筋注した。免疫は２週間ごとに行っ
た。４ヶ月後に一部採血して得られる抗血清について、
ｒＳＡＡに対する反応性をオクテロニー法によって確認
した。高い抗体価が確認された個体の抗血清を４０%硫
安分画してＩｇＧを回収し、ＰＢＳに対して透析し本発
明による抗ＳＡＡ抗体（１０mg/ml）を得た。

【００４７】３．抗体による試薬の調製 ２で得た抗ＳＡＡ抗体（１０mg/ml）をポリスチレンラ
テックス（平均粒径０．１０９μm）に３７℃で１時間
物理吸着させた後、０．１MのＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄
し、最終的にラテックス濃度０．４%となるように分散
媒（１%ＢＳＡを含む０．１MのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ
７．４）に懸濁させてＳＡＡラテックス凝集反応用試薬
（以下単に乳液と呼ぶ）を得た。比較のため、ＨＤＬ分
画から公知の方法により精製したＳＡＡで免疫して得ら
れた従来の抗ＳＡＡ抗体[17]についても同じ操作によっ
て試薬（乳液Ｂ）を調製した。

【００４８】４．抗体の反応性（結合活性） ３で得た乳液を用い、抗体の結合活性をラテックス凝集
反応によって比較した。操作は次のとおりである。試料
５０μlに試薬を３００μl加えて３７℃で約３分間反応
させた。この間の免疫学的凝集反応に基づく５８５nmに
おける吸光度変化量を測定した。公知の方法[18]よって
設定した標準に基づいて作成した検量線をもとにＳＡＡ
濃度を決定した。試料としては、いくつかのＳＡＡ含有
試料を希釈してゲルろ過法で分画したものを用いた。各
分画の分子量は、あらかじめ分子量マーカーを同じ条件
で溶出することにより検量線を作成し求めておいた。用
意したＳＡＡ含有試料は、次の５種類である。血清から
精製したＳＡＡは、公知の方法[17]により得たものを用
いた。また精製ＨＤＬと混合したものは、混合後４℃で
一晩放置してから実験に用いた。 (1)正常ヒト血清（ＳＡＡ濃度は検出限界以下、ＮＨＳ
と表現した）のみ (2)精製ヒトＨＤＬのＰＢＳ溶液（ＳＡＡ濃度７．５μg
/ml） (3)ｒＳＡＡのＰＢＳ溶液（ＳＡＡ濃度７．５μg/ml） (4)ＮＨＳにｒＳＡＡを添加（最終ＳＡＡ濃度は７．５
μg/ml） (5)ＮＨＳに血清から精製したＳＡＡを添加（最終ＳＡ
Ａ濃度は７．５μg/ml）

【００４９】またゲルろ過の条件は次のとおりである。
カラムにはＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（東ソー
製）を用い、２０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、０．１
５MＮａＣｌ含有）を溶出液として流速１ml/min.で溶出
し１mlずつ分画した。この条件でｆＳＡＡはFr.１３−
１５（分子量１０−４０kDに相当）に、一方ＨＤＬと会
合したＳＡＡはFr.８−１０（分子量１００−３００KD
に相当）に溶出される。

【００５０】結果は図１〜５に示すとおりである。本発
明の抗体は、ｆＳＡＡに相当するFr.１３−１５に溶出
される分画に明らかに反応性を示すが、従来法によって
得られた抗体では同じ分画における反応性が確認できな
い（図３−５）。加えて本発明の抗体は、ｆＳＡＡに対
する反応性のみならず、ＨＤＬ−ＳＡＡに対しても従来
の抗体よりも高い反応性を示している（図４−５）。こ
のような現象から、大腸菌で発現させたｒＳＡＡとｆＳ
ＡＡは免疫学的に同一であることが確認された。また図
３に示したｒＳＡＡをＰＢＳに溶解したものを試料とし
てものでは、１０−４０kDの分画に溶出されるＳＡＡは
ｒＳＡＡに他ならない。したがって公知の抗体はｒＳＡ
Ａとの間で観察可能な凝集を示さないのに対し、本発明
の抗体はｒＳＡＡと反応して凝集することが明らかであ
る。この他、図１により正常血清ではいずれの抗体でも
反応していないことがわかる。またいずれの抗体を用い
ても、ＨＤＬ分画として回収したＳＡＡと反応させた場
合には１００−３００kD（ＨＤＬ−ＳＡＡ）でのみ反応
性が確認された（図２）。

【００５１】５．試薬の直線性 本発明によって得られるＳＡＡの免疫学的測定試薬の直
線性を、従来の抗体によって得られる試薬と比較した。
０−６６μg/mlのＳＡＡを含む希釈系列を用意し、３で
得た乳液による測定を試みた。操作は次のとおりであ
る。希釈系列は濃度を検定したＳＡＡ含有血清をＳＡＡ
濃度が６６μg/mlとなるように５０mMのＨＥＰＥＳ緩衝
液（ｐＨ７.４、以下単に希釈液と記載する）で希釈し
たものをもとに、希釈液で倍々希釈して作成した。希釈
液２２５μlと各濃度のＳＡＡ含有溶液２０μlを測定セ
ルに分注し、１３０秒後に乳液７５μlを添加して波長
６６０nmで散乱光を測定（散乱光Ｔ２）、その４０秒後
に散乱光を測定（散乱光Ｔ３）、ついで１３０秒後に３
回目の散乱光測定（散乱光Ｔ４）を行って各測定点の間
の散乱光強度の差を求めた。測定には全自動免疫化学分
析装置ＬＸ−３０００（栄研化学・アナリティカルイン
スツルメント製、商品名）を用い、結果はこの装置の測
定値として得られるＤＬＳＥで示した（表１）。

【００５２】

【表１】

【００５３】表１のデータを基に標準曲線を描いたのが
図６である。図６から明らかなように、本発明の抗体を
利用した試薬では０．５２〜６６μg/mlまで測定値が増
加し続けており、１００倍以上の濃度差（具体的には約
１２７倍）を同じ条件で測定できている。これに対して
従来の抗体では３３μg/ml程度までしか直線性を保証で
きず、測定値が増加し続けている範囲は濃度差で６０倍
強である。従来の抗体による測定範囲は不十分なもので
はないかもしれないが、測定可能範囲が狭いために希釈
を要するサンプルが発生する可能性が有る。従来抗体に
対して非常に測定範囲が広い本発明の抗体によれば、測
定範囲を越えるために希釈再測定しなければならないサ
ンプルに遭遇する機会を大きく減らすことが可能であ
る。

【００５４】６．抗体の反応性（特異性） 公知の抗体と本発明の抗体の特異性を比較するため、Mu
lti-Pin Peptide Synthesis Starter Kit Non-Cleable
Type（Chiron Mimotopes Pty.Ltd.製、商品名）を用い
て１０残基ずつ４８種類のペプチドを合成後、従来の抗
ＳＡＡ抗体と本発明による抗ＳＡＡ抗体をそれぞれ反応
させ、反応性の違いを基にエピトープマッピング[19]を
試みた。合成ペプチドのアミノ酸配列は、配列１に示す
ＳＡＡのアミノ酸配列のＮ末端から順に２アミノ酸残基
ずつずらした１０残基で、９６穴マイクロタイタープレ
ートのウエルの位置に対応するように配置されたピンの
先端に固定した。これを抗体溶液を分注したウエルに浸
漬することによって免疫反応を行えるようになってい
る。抗体は２０mMのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、２%の
ＢＳＡ、０．１%のＴｗｅｅｎ２０、０．１５MのＮａＣ
ｌ含有）で２０００倍希釈後、各ウエルに１７５μl分
注して合成ペプチドを固定したピンを浸漬した。４℃に
て一晩静置後ＰＢＳでピンを洗浄し、ペルオキシダーゼ
（以下ＰＯＤと省略する）標識抗体と反応させた。ＰＯ
Ｄ標識抗体は、市販のＰＯＤ標識抗ラビットＩｇＧヤギ
血清を２０mMのリン酸緩衝液（１%のＢＳＡ、０．１５M
のＮａＣｌ含有）で２０００倍希釈して用い、各ウエル
に１７５μl分注して洗浄したピンを浸漬し室温で６０
分反応さた。反応後にピンをＰＢＳで洗浄後、１５０μ
lの基質溶液（０．８４mMのテトラメチルベンチジンと
２mM過酸化水素を含む）を分注したウエルに浸漬し、２
０分後にピンを引き上げ停止液として３．６Nの硫酸を
５０μlずつ加えた。マイクロプレートリーダーで４５
０nmにおける吸光度を測定した。

【００５５】本発明のエピトープマッピングの結果を図
７（本発明の抗体）、および図８（従来の抗体）に示
す。図の横軸の数字はピンの番号を示し、１がＮ末端の
Argから始まる１０アミノ酸残基で構成される合成ペプ
チドで、２以下が３、５、７....と２個ずつずらした１
０アミノ酸残基に相当する。両者の反応パターンにはほ
とんど違いが無く、エピトープの選択によって結合活性
の改善を説明することはできないものと推測された。

【００５６】７．抗体の反応性（結合活性） 本発明の結合活性を数値化するために、IAsysの固相リ
ガンドには抗原であるｒＳＡＡを用い、液相には抗体を
用いて測定した後、FASTfit解析ソフト（登録商標）に
よって解離平衡定数を算出した。IAsysは固相リガンド
（ｒＳＡＡ）に対する液相中の結合成分（イムノグロブ
リン分子）の結合状態をリアルタイムに観察することが
可能なシステムである。カルボキシメチルデキストラン
（ＣＭＤ）でコートされたキュベットに、０．０５%のT
ween20を含む１０mMリン酸緩衝液（１３７mMのＮａＣ
ｌ、２．７mMのＫＣｌ含有、以下ＰＢＳ／Ｔと省略す
る）を２００μl加え、温度が２４．５℃から２５．５
℃に安定化するまで約１０分間放置した後にベースライ
ンを7分間測定した。２００μlの０．４MのＥＤＣ／
０．１M ＮＨＳを７分間反応させ、カルボキシル基を活
性化した後、未反応のＥＤＣ／ＮＨＳをＰＢＳ／Ｔ 緩
衝液で洗浄除去した。予め酢酸緩衝液（１０mM、ｐＨ
５．０）に溶解しておいたｒＳＡＡ（５０μg/ml）をリ
ガンド溶液として２００μl加え１０分間固相化させ
た。なおＥＤＣとは1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropy
l)carbodiimideをさし、ＮＨＳとはN-Hydroxysuccinimi
deをさす。未反応のリガンドをＰＢＳ/Ｔで洗浄除去
後、１Mエタノールアミン水溶液ｐＨ８．５を２００μl
加え５分間反応させることにより、未反応のカルボキシ
ル基を不活化した。ＰＢＳ／Ｔで洗浄した後に固定化し
たｒＳＡＡの総量を共鳴角として数値化した。

【００５７】このキュベットに各濃度の抗体溶液を加
え、リガンドであるｒＳＡＡに会合する抗体量をリアル
タイムで測定した。続いて、ＰＢＳを加えて解離する抗
体量をリアルタイムで測定した。測定後のキュベット
は、３MのＫＳＣＮ、０．２%のＥＤＴＡ2Ｎａで２分間
処理して抗体を完全に解離後、ＰＢＳ洗浄することによ
り再利用した。キュベットに加えた抗体濃度は３１．２
５nM、６２．５nM、１２５nM、２５０nM、および３１
２．５nMで、各濃度における結合状態からIAsysのFASTf
it解析ソフト（登録商標）によって、会合速度定数Ｋ
_ass、解離速度定数Ｋ_{dis s}（あるいはＫ_on）を求め、更
に解離平衡定数Ｋ_DはＫ_diss／Ｋ_assによって算出した。
またその逆数が会合平衡定数Ｋ_Aである。使用したパラ
メーターは、各会合開始前の１２０秒間をベースライン
とし、会合相(association phase)は抗体添加後の５−
１８０秒後まで、解離相（dissociation phase)はＰＢ
Ｓ添加後の５−１２０秒までとした。この解析の結果、
従来の抗体のｒＳＡＡに対する解離平衡定数Ｋ_Dは７．
２５±２．７３×１０^-7Mであるのに対して、本発明の
抗体は１．０１±０．４８×１０^-7Mであり、両者の間
には少なくとも３倍の開きがあった。すなわち本発明の
抗体は、従来の抗体に比べてｒＳＡＡに対する結合活性
(avidity)が３倍以上大きいと言うことができる。なお
解析のためのデータの一部を図９として示した。

【００５８】引用文献 [ 1] J.Clin.Invest.53:1054-1061,1974 [ 2] J.Clin.Invest.55:746-753,1975 [ 3] J.Clin.Invest.61:390-394,1978 [ 4] Marker Protein in Inflamation, Vol.3 p157-16
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(4)523,1990

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：１０４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：ヒト 他の情報：ヒト血清アミロイドＡ 配列 Arg Ser Phe Phe Ser Phe Leu Gly Glu Ala Phe Asp Gly Ala Arg 1 5 10 15 Asp Met Trp Arg Ala Tyr Ser Asp Met Arg Glu Ala Asn Tyr Ile 20 25 30 Gly Ser Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala 35 40 45 Lys Arg Gly Pro Gly Gly Val Trp Ala Ala Glu Ala Ile Ser Asp 50 55 60 Ala Arg Glu Asn Ile Gln Arg Phe Phe Gly His Gly Ala Glu Asp 65 70 75 Ser Leu Ala Asp Gln Ala Ala Asn Glu Trp Gly Arg Ser Gly Lys 80 85 90 Asp Pro Asn His Phe Arg Pro Ala Gly Leu Pro Glu Lys Tyr 95 100

【００５９】配列番号：２ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 他の情報：ヒト血清アミロイドＡのｃＤＮＡ増幅用５’
側プライマー 配列 GTAGTTCAGG TCATATGCGA AGCTTCTTTT CGTTCCTTG 39

【００６０】配列番号：３ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 他の情報：ヒト血清アミロイドＡのｃＤＮＡ増幅用３’
側プライマー 配列 GACAGGATCC GAGGAAGCTC AGTATTTCTC AG 32

【図面の簡単な説明】

【図１】正常ヒト血清をゲルろ過により分画したフラク
ションに対する試薬の反応性を示したグラフである。図
中、縦軸はＳＡＡ測定値（μg/ml）を、横軸はフラクシ
ョン番号を示す。

【図２】ＳＡＡ含有血清から超遠心法で精製したＨＤＬ
をＰＢＳで希釈したもの（ＳＡＡ濃度７．５μg/ml）を
ゲルろ過により分画したフラクションに対する試薬の反
応性を示したグラフである。図中、縦軸はＳＡＡ測定値
（μg/ml）を、横軸はフラクション番号を示す。

【図３】ｒＳＡＡをＰＢＳで希釈したもの（ＳＡＡ濃度
７．５μg/ml）をゲルろ過により分画したフラクション
に対する試薬の反応性を示したグラフである。図中、縦
軸はＳＡＡ測定値（μg/ml）を、横軸はフラクション番
号を示す。

【図４】正常ヒト血清にｒＳＡＡを加えたもの（ＳＡＡ
濃度７．５μg/ml）をゲルろ過により分画したフラクシ
ョンに対する試薬の反応性を示したグラフである。図
中、縦軸はＳＡＡ測定値（μg/ml）を、横軸はフラクシ
ョン番号を示す。

【図５】正常ヒト血清にヒト血清から精製したＳＡＡを
加えたもの（ＳＡＡ濃度７．５μg/ml）をゲルろ過によ
り分画したフラクションに対する試薬の反応性を示した
グラフである。図中、縦軸はＳＡＡ測定値（μg/ml）
を、横軸はフラクション番号を示す。

【図６】本発明の抗体と、従来の抗体で調製したラテッ
クス凝集反応用試薬によって得られた反応曲線である。
図中、縦軸は散乱光強度の差を、横軸はＳＡＡ濃度（μ
g/ml）を示す。

【図７】本発明の抗体のエピトープマッピングの結果で
ある。図中、縦軸は４５０nmにおおける吸光度を、横軸
は合成ペプチドを固定したピンの番号を示す。

【図８】従来の抗体のエピトープマッピングの結果であ
る。図中、縦軸は４５０nmにおおける吸光度を、横軸は
合成ペプチドを固定したピンの番号を示す。

【図９】IAsysによる抗体の結合活性を解析した結果で
ある。図中、縦軸Ｋonは解離速度定数(1/s)を、横軸は
抗体濃度(nM)を示す。Ａｂ１（−●−）が従来の抗体、
Ａｂ２（−○−）が本発明の抗体である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 和田 厚文 栃木県下都賀郡野木町野木143栄研化学株 式会社内

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒト血清アミロイドＡを認識する抗体であ
   って、高比重リポ蛋白質とヒト血清アミロイドＡとを含
   む血清を非変性条件下でゲルろ過により分画して得るこ
   とができる分子量１０〜４０kDの分画に含まれるヒト血
   清アミロイドＡに反応する抗体
2. 【請求項２】分子量１０〜４０kDの分画に含まれるヒト
   血清アミロイドＡが、次の群から選択される請求項１の
   抗体 (1)ヒト血清アミロイドＡを豊富に含む血清のゲルろ過
   による分子量１０−４０kDの分画から精製したヒト血清
   アミロイドＡ (2)配列１に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子を微
   生物細胞を宿主として発現させて得られる組み換え蛋白
   質
3. 【請求項３】抗体の解離平衡定数が、配列１に示すアミ
   ノ酸配列をコードする遺伝子を微生物細胞を宿主として
   発現させて得られる組み換え蛋白質を抗原として反応さ
   せた時に２×１０^-7M以下である請求項２の抗体
4. 【請求項４】抗体が、更に高比重リポ蛋白質とヒト血清
   アミロイドＡとを含む血清を非変性条件下でゲルろ過に
   より分画して得ることができる分子量１００〜３００kD
   の分画に含まれるヒト血清アミロイドＡに反応する請求
   項１の抗体
5. 【請求項５】請求項１、または２のいずれかに記載した
   抗体を含むヒト血清アミロイドＡの免疫学的測定試薬
6. 【請求項６】抗体が不溶性担体粒子に結合されたもので
   ある請求項５のヒト血清アミロイドＡの測定用試薬
7. 【請求項７】抗体が遊離の状態で存在し、かつ免疫学的
   な反応の場に免疫複合体形成に基づく不溶性沈降物の生
   成を促進する反応増強剤を供給する試薬と組み合わされ
   ている請求項５のヒト血清アミロイドＡの測定用試薬
8. 【請求項８】抗体によってヒト血清アミロイドＡを免疫
   学的に測定する方法であって、前記抗体が不溶性担体粒
   子に結合されており、この不溶性担体粒子の免疫学的凝
   集反応の測定値が、１００倍の濃度範囲においてヒト血
   清アミロイドＡの濃度値と１：１に対応しているヒト血
   清アミロイドＡの測定方法
9. 【請求項９】請求項１または２のいずれかに記載した抗
   体を利用するヒト血清アミロイドＡの免疫学的測定方法
10. 【請求項１０】抗体を不溶性担体粒子に固定して用いる
    請求項９のヒト血清アミロイドＡの免疫学的測定方法
11. 【請求項１１】不溶性担体粒子の免疫学的反応による凝
    集を光学測定する請求項１０のヒト血清アミロイドＡの
    免疫学的測定方法
12. 【請求項１２】抗体を遊離の状態で用い、免疫複合体形
    成に基づく不溶性沈降物の生成を促進する反応増強剤の
    存在下でヒト血清アミロイドＡと反応させ、生成する不
    溶性沈降物を光学測定する請求項９のヒト血清アミロイ
    ドＡの免疫学的測定方法
13. 【請求項１３】ヒト血清アミロイドＡを抗体と結合させ
    共存成分と分離した後に抗体と結合したヒト血清アミロ
    イドＡを回収するヒト血清アミロイドＡの精製方法であ
    って、抗体として請求項１または２のいずれかに記載し
    たものを用いる方法
14. 【請求項１４】精製すべき血清アミロイドＡが、以下に
    示す１または２から選択されるゲルろ過による分子量１
    ０−４０kDの分画に含まれるものである請求項１３の精
    製方法 (1)血清中に存在し高比重リポ蛋白質分画以外に含まれ
    るヒト血清アミロイドＡ (2)ヒト血清アミロイドＡに特異的な抗原決定基を少な
    くとも１つ備えており、かつ配列１に示すアミノ酸配
    列、またはその部分配列をコードする遺伝子から発現さ
    せて得られる組み換え蛋白質
15. 【請求項１５】免疫学的凝集反応のためのヒト血清アミ
    ロイドＡを認識する抗体であって、高比重リポ蛋白質と
    ヒト血清アミロイドＡとを含む血清を非変性条件下でゲ
    ルろ過により分画して得ることができる分子量１０〜４
    ０kDの分画に含まれるヒト血清アミロイドＡに反応する
    免疫学的凝集反応用抗体
16. 【請求項１６】免疫学的凝集反応が、免疫学的ラテック
    ス凝集法である請求項１５の抗体