WO2019177158A1 - 試薬キット、測定キットおよび測定方法 - Google Patents

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WO2019177158A1
WO2019177158A1 PCT/JP2019/010921 JP2019010921W WO2019177158A1 WO 2019177158 A1 WO2019177158 A1 WO 2019177158A1 JP 2019010921 W JP2019010921 W JP 2019010921W WO 2019177158 A1 WO2019177158 A1 WO 2019177158A1
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serum amyloid
binding substance
particles
reagent kit
antibody
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中村　和浩
亮 大内
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富士フイルム株式会社
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    • G01N2800/7095—Inflammation

Definitions

  • the present invention relates to a reagent kit for measuring serum amyloid A, a measurement kit for serum amyloid A, and a method for measuring serum amyloid A in a biological sample.
  • a fluorescence detection method has been widely used as a highly sensitive and easy measurement method in biomeasurement and the like.
  • the presence of the detection target substance is detected by irradiating the sample, which is considered to contain a detection target substance that emits fluorescence when excited with light of a specific wavelength, with the excitation light of the specific wavelength. It is a method to confirm.
  • the detection target substance is not a fluorescent substance, this binding, that is, by detecting a fluorescence in the same manner as described above by contacting a sample with a substance that specifically binds to the detection target substance labeled with a fluorescent dye. The existence of a detection target substance is also widely confirmed.
  • Patent Document 1 a method using the effect of electric field enhancement by plasmon resonance has been proposed in Patent Document 1 and the like.
  • This includes a sensor chip in which a metal layer is provided in a predetermined region on a transparent support to cause plasmon resonance, and is opposite to the metal layer forming surface of the support with respect to the interface between the support and the metal film. Excitation light is incident from the surface side at a predetermined angle equal to or greater than the total reflection angle, surface plasmons are generated in the metal layer by irradiation of the excitation light, and the signal / noise ( S / N) is improved.
  • Serum amyloid A (also referred to as Serum Amyloid A: SAA) is a highly hydrophobic protein with a molecular weight of about 11,600, and various stresses such as infection, tumor and trauma are applied to the living body, resulting in inflammation. When this occurs, the blood concentration increases sharply. For this reason, the SAA concentration in blood is often measured using an immunological measurement method as an inflammation marker for knowing the degree of inflammation.
  • Patent Document 2 describes that 2 to 15% by weight of a nonionic surfactant having an HLB (Hydrophyllic Balance) value of 12 or more is blended in a method for measuring tissue factor apoprotein.
  • HLB Hydrophilic Balance
  • JP 2010-190880 A International Publication WO92 / 12429
  • the inventors of the present invention have first particles modified with a first binding substance having specific binding properties with serum amyloid A and having a label, Value / organic value) ⁇ 10 and an HLB value of 17 to 20 and a molecular weight of 1000 or less are used in combination with at least one nonionic surfactant to solve the above problems.
  • the present inventors have found that this can be done and have completed the present invention.
  • a reagent kit for measuring serum amyloid A comprising at least one nonionic surfactant having a molecular weight of 17 to 20 and a molecular weight of 1000 or less.
  • a reagent kit according to any one of [1] to [8] and a third binding substance having a specific binding property to serum amyloid A or the first binding substance A measurement kit for serum amyloid A, comprising a substrate on which a metal film is formed. [10] A second metal film is formed on the substrate. The second metal film has a fourth binding substance that has no binding property with serum amyloid A and has a specific binding property with the first binding substance.
  • a method for measuring serum amyloid A in a biological sample comprising: [12] The method for measuring serum amyloid A according to [11], wherein the concentration of the surfactant in the mixed solution is 0.01% by mass or more and 10% by mass or less. [13] The method for measuring serum amyloid A according to [11] or [12],
  • SAA can be measured easily and rapidly immunologically.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of a sensor chip.
  • FIG. 2 shows an exploded view of the sensor chip.
  • FIG. 3 shows the result of plotting the increase rate of the fluorescence signal value measured in Examples and Comparative Examples against the SAA concentration by the control kit.
  • a numerical range indicated by using “to” means a range including the numerical values described before and after “to” as the minimum value and the maximum value, respectively.
  • the reagent kit of the present invention is defined by a first particle modified with a first binding substance having a specific binding property to serum amyloid A and having a label, and (inorganic value / organic value) ⁇ 10
  • a reagent kit for measuring serum amyloid A which contains at least one nonionic surfactant having a HLB value of 17 to 20 and a molecular weight of 1000 or less.
  • the reagent kit of the present invention includes the first particles and the nonionic surfactant, but the first particles and the nonionic surfactant may be included in the kit as a mixture. It may be included separately in the kit.
  • the antigen-antibody reaction is not inhibited even when the surfactant is used, and a sufficiently strong SPF signal can be obtained.
  • the test substance in the present invention is serum amyloid A (SAA).
  • SAA is useful as an inflammation marker.
  • Examples of serum amyloid A include feline serum or serum amyloid A in cat plasma.
  • HLB Hydrophilic-Lipophilic Balance
  • an organic value and an inorganic value based on an organic conceptual diagram are used, and defined as (inorganic value / organic value) ⁇ 10.
  • a good signal intensity can be obtained in the SPF measurement system of the present invention by using a nonionic surfactant having an HLB value in the range of 17 to 20 and a molecular weight in the range of 1000 or less. I understood.
  • a surfactant having a preferable HLB value In the prior art, it is known to use a surfactant having a preferable HLB value.
  • the HLB value but also the size of the surfactant molecule is an important factor and falls within a specific range. It is essential. In other words, it is not sufficient to have an HLB value suitable for dissociating serum amyloid A from HDL. If the molecular weight is too large, the volume of the molecule inevitably increases, causing an antigen-antibody reaction after dissociation. It is presumed that it is essential to be within a molecular weight range of a specific size in order to prevent the antibody from approaching the serum amyloid A necessary for this, and in particular to cause a decrease in the signal in a low concentration sample Is done.
  • part of the serum amyloid A with respect to the 1st binding substance and the 3rd binding substance which have a binding property with serum amyloid A is shielded by HDL, and the 1st binding substance and the 3rd binding substance are serum amyloid There is a problem that it cannot be combined with A.
  • the present invention makes it possible to accurately quantitate SAA in serum by dissociating serum amyloid A from HDL using a surfactant.
  • the surfactant used in the present invention is a nonionic surfactant having a molecular weight of 1000 or less. If the molecular weight of the nonionic surfactant exceeds 1000, the site recognized as the specimen may be blocked in the same manner as HDL, and the SAA may not be measured accurately. 1000 or less nonionic surfactant is used.
  • the lower limit of the molecular weight of the surfactant is preferably 200 or more, more preferably 300 or more.
  • the upper limit of the molecular weight of the surfactant is preferably 900 or less, more preferably 800 or less, still more preferably 700 or less, and particularly preferably 600 or less.
  • a nonionic surfactant that does not relatively affect the binding property of the binding substance is used.
  • measurement may be affected by interaction with a charged group in a biological sample, and it becomes difficult to accurately measure SAA.
  • a nonionic surfactant is used.
  • the nonionic surfactant may be referred to as a nonionic surfactant as another name.
  • An anionic surfactant may be described as an anionic surfactant, a cationic surfactant as a cationic surfactant, and an amphoteric surfactant as betaine.
  • a nonionic or nonionic surfactant is used.
  • an ether type surfactant is preferable.
  • a monosaccharide having a hydrophobic group or a disaccharide having a hydrophobic group is also preferable.
  • the monosaccharide having a hydrophobic group or the disaccharide having a hydrophobic group is more preferably a compound having a glucose skeleton or a maltose skeleton.
  • Examples of the compound having a glucose skeleton or a maltose skeleton include compounds represented by the following formula (2) or the following formula (3).
  • R 11 represents an optionally substituted alkoxy group, an optionally substituted alkenyloxy group, an optionally substituted alkynyloxy group, an optionally substituted alkylthio group, or an optionally substituted A good alkenylthio group and an optionally substituted alkynylthio group;
  • R 12 , R 13 , R 14 and R 15 each independently represents a hydrogen atom or an optionally substituted hydrocarbon group; However, at least three of R 12 , R 13 , R 14 and R 15 are hydrogen atoms.
  • R 21 represents an optionally substituted alkoxy group, an optionally substituted alkenyloxy group, an optionally substituted alkynyloxy group, an optionally substituted alkylthio group, or an optionally substituted
  • R 22 , R 23 , R 24 , R 25 , R 26 , R 27 and R 28 are each independently a hydrogen atom or a substituted alkenylthio group, an optionally substituted alkynylthio group Or a good hydrocarbon group.
  • at least three of R 22 , R 23 , R 24 , R 25 , R 26 , R 27 and R 28 are hydrogen atoms.
  • More preferable examples of the compound represented by the formula (2) or the formula (3) include a compound represented by the following formula (2A) or the following formula (3A).
  • R 11 and R 21 are the same as defined in formula (2) and (3).
  • n-octyl- ⁇ -D-glucoside O001 manufactured by Dojindo
  • R 11 in formula (2A) is an octyloxy group.
  • n-dodecyl- ⁇ -D-maltoside D316, Dojindo
  • n-decyl- ⁇ -D-maltoside D382, Dojindo
  • a hydrocarbon group, an alkoxy group, an alkenyloxy group, an alkynyloxy group, an alkylthio group, an alkenylthio group and an alkynylthio group may each be substituted, and examples of the substituent include those described in Substituent Group A below. Groups.
  • the substituent of the substituent group A may be further substituted with the substituent of the substituent group A.
  • Substituent group A Sulfamoyl group, cyano group, isocyano group, thiocyanato group, isothiocyanato group, nitro group, nitrosyl group, halogen atom, hydroxy group, amino group, mercapto group, amide group, alkoxy group, aryloxy group, alkylthio group, arylthio group, carbamoyl Groups, acyl groups, aldehyde groups, carbonyl groups, aryl groups, alkyl groups, alkyl groups substituted with halogen atoms, ethenyl groups, ethynyl groups, silyl groups, and trialkylsilyl groups (such as trimethylsilyl groups).
  • hydrocarbon group examples include an alkyl group, an alkenyl group, and an alkynyl group.
  • the number of carbon atoms of the hydrocarbon group is not particularly limited, but is generally 1 to 20, preferably 1 to 16, and more preferably 1 to 12.
  • the number of carbon atoms of the alkoxy group, alkenyloxy group, alkynyloxy group, alkylthio group, alkenylthio group and alkynylthio group is not particularly limited, but is generally 1 to 20, preferably 1 to 16, more preferably Is 1-12.
  • the first binding substance used in the present invention is a substance having specific binding properties with serum amyloid A.
  • An antibody can be used as the first binding substance, but is not limited thereto.
  • the first binding substance is an antibody.
  • the first binding substance is an antibody, for example, antiserum prepared from the serum of an animal immunized with serum amyloid A or purified from antiserum as an antibody having a specific binding property with serum amyloid A
  • Monoclonal antibodies obtained by cell fusion using spleen cells of animals immunized with serum amyloid A, or fragments thereof [eg F (ab ′) 2, Fab, Fab ′ or Fv] Etc. can be used. These antibodies can be prepared by a conventional method.
  • the antibody may be modified as in the case of a chimeric antibody, or may be a commercially available antibody or an antibody prepared from animal serum or culture supernatant by a known method.
  • Antibodies can be used regardless of the animal species or subclass.
  • antibodies that can be used in the present invention are antibodies derived from organisms that can cause an immune reaction such as mice, rats, hamsters, goats, rabbits, sheep, cows, chickens, specifically mouse IgG, mouse IgM.
  • an antiserum amyloid A antibody is preferably used as the first binding substance having a specific binding property with serum amyloid A by electrostatic interaction.
  • it is preferable to select a sandwich system in which case it is necessary to coat the substrate with a pair of antibodies, and these anti-SAA monoclonal antibodies are used both on the substrate and on the first particle. It is possible.
  • the first particles used in the present invention are particles modified with the first binding substance and having a label.
  • the first particles are preferably dry particles, but are not particularly limited.
  • polymer particles such as polystyrene beads and glass particles such as glass beads can be used as particles that can be usually used for immunoassay.
  • Specific examples of the material of the first particles include polymers using monomers such as styrene, methacrylic acid, glycidyl (meth) acrylate, butadiene, vinyl chloride, vinyl acetate, methyl methacrylate, ethyl methacrylate, phenyl methacrylate, and butyl methacrylate.
  • a synthetic polymer such as a copolymer using two or more monomers, and a latex in which these are uniformly suspended is preferable.
  • organic polymer powders and inorganic substance powders, microorganisms, blood cells, cell membrane fragments, liposomes and the like can be mentioned.
  • latex materials include polystyrene, styrene-acrylic acid copolymer, styrene-methacrylic acid copolymer, styrene-glycidyl (meth) acrylate copolymer, and styrene-styrene sulfonic acid.
  • examples thereof include a salt copolymer, a methacrylic acid polymer, an acrylic acid polymer, an acrylonitrile-butadiene-styrene copolymer, a vinyl chloride-acrylic acid ester copolymer, and a polyvinyl acetate acrylate.
  • the latex a copolymer containing at least styrene as a monomer is preferable, and a copolymer of styrene and acrylic acid or methacrylic acid is particularly preferable.
  • the method for producing the latex is not particularly limited, and the latex can be produced by any polymerization method.
  • a surfactant is present at the time of antibody labeling, antibody immobilization becomes difficult. Therefore, non-emulsifier emulsion polymerization, that is, emulsion polymerization without using an emulsifier such as a surfactant, is preferable for producing the latex.
  • the first particle has a label.
  • the label preferably emits fluorescence.
  • the latex itself obtained by polymerization is fluorescent, it can be used as fluorescent latex particles as it is.
  • fluorescent latex particles can be produced by adding a fluorescent substance (fluorescent dye or the like) to the latex. That is, the fluorescent latex particles can be produced by impregnating the fluorescent particles inside the latex particles by adding the fluorescent dye to a solution of latex particles containing water and a water-soluble organic solvent and stirring the solution. is there.
  • a liposome or a microcapsule containing a fluorescent dye can be used as the fluorescent particle.
  • Fluorescent color development is not particularly limited as long as it is excited by absorbing ultraviolet light or the like and emitted upon returning to the ground state.
  • yellow-green (excitation wavelength 505 nm / emission wavelength 515 nm, the same applies hereinafter)
  • Blue 350-356 nm / 415-440 nm
  • red (535-580 nm / 575-605 nm)
  • orange 540 nm / 560 nm
  • red orange 565 nm / 580 nm
  • crimson (625 nm / 645 nm
  • dark red Fluorescence development such as 660 nm / 680 nm
  • These fluorescent particles that emit fluorescence are available from, for example, Invitrogen, and are commercially available under the trade name of FluoSpheres (registered trademark).
  • the particle size of the first particle with the label is defined as the average particle size.
  • the average particle diameter of the first particles is not particularly limited, and the preferred range varies depending on the material of the particles, the concentration range for quantifying serum amyloid A, the measuring instrument, etc., but is preferably 70 nm to 500 nm, preferably 70 nm.
  • the thickness is more preferably 300 nm or less, still more preferably 80 nm or more and 250 nm or less, and particularly preferably 90 nm or more and 200 nm or less.
  • the average particle size of the particles used in the present invention can be measured with a commercially available particle size distribution meter or the like.
  • Measurement methods for particle size distribution include optical microscopy, confocal laser scanning, electron microscopy, atomic force microscopy, static light scattering, laser diffraction, dynamic light scattering, centrifugal sedimentation, and electrical pulse.
  • Measurement methods, chromatography methods, ultrasonic attenuation methods, etc. are known, and devices corresponding to each principle are commercially available.
  • dynamic light scattering can be used for measurement.
  • the average particle diameter is a median diameter (50% diameter, d50) measured at 25 ° C. under the conditions of a viscosity of 0.8872 CP (0.8872 mPa ⁇ s) and a refractive index of water of 1.330.
  • the first particles used in the present invention are modified with the first binding substance described above.
  • the method for binding the first binding substance to the first particles having a label is not particularly limited. For example, it is described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-206115 and a protocol attached to Molecular Probes FluoSpheres (registered trademark) polystyrene microsphere F8813, and any known method for preparing a reagent for immunoaggregation reaction can be used. is there.
  • a method for immobilizing a binding substance such as an antibody on a particle
  • any of a method using physical adsorption and a method using chemical bonding by covalent bonding can be employed.
  • blocking agent that covers the surface of a particle that is not coated with a binding substance after a binding substance such as an antibody is immobilized on the particle
  • known substances such as BSA (bovine serum albumin), skim milk, casein, soy-derived components, fish-derived Components, polyethylene glycol, and the like, and commercially available blocking agents for immune reactions containing these substances and substances having the same properties as these can be used.
  • BSA bovine serum albumin
  • skim milk casein
  • soy-derived components soy-derived components
  • fish-derived Components polyethylene glycol, and the like
  • commercially available blocking agents for immune reactions containing these substances and substances having the same properties as these can be used.
  • These blocking agents can be subjected to pretreatment such as partial modification with heat, acid, alkali, or the like, if necessary.
  • the reagent kit of the present invention may further include a second particle that is modified with a second binding substance that does not specifically bind to serum amyloid A and does not have a label.
  • a test sample that reacts not only to a positive test sample containing serum amyloid A but also to a negative test sample that does not contain serum amyloid A. It is recognized as. The cause of such false positives has not been clarified, but it is thought that one of the causes is that some factor contained in the serum exists to cause a nonspecific reaction.
  • it is preferable to solve such a problem by using a second particle which is modified with a second binding substance having no specific binding property to serum amyloid A and which does not have a label. .
  • the second binding substance a substance that does not have a specific binding property with serum amyloid A can be used, and a substance that may bind to a causative substance showing false positive as described above should be used. It is preferable to use a compound having no affinity for the first binding substance.
  • an antibody or a protein Protein A, Protein G
  • an antibody is preferable.
  • the second binding substance is an antibody
  • an antiserum prepared from the serum of an animal immunized with the antigen an immunoglobulin fraction purified from the antiserum, an animal immunized with serum amyloid A
  • Monoclonal antibodies obtained by cell fusion using spleen cells, or a fragment thereof [eg, F (ab ′) 2, Fab, Fab ′, or Fv] can be used.
  • These antibodies can be prepared by a conventional method.
  • the antibody may be modified as in the case of a chimeric antibody or the like, or a commercially available antibody prepared from an animal serum or culture supernatant by a known method can be used.
  • an embodiment using an anti-CRP antibody as the second binding substance is particularly preferable.
  • the second particle has no label.
  • the second particles are preferably dry particles, but are not particularly limited.
  • polymer particles such as polystyrene beads and glass particles such as glass beads can be used as particles that can be usually used for immunoassay.
  • Specific examples of the material of the second particles include high monomers using monomers such as styrene, methacrylic acid, glycidyl (meth) acrylate, butadiene, vinyl chloride, vinyl acetate acrylate, methyl methacrylate, ethyl methacrylate, phenyl methacrylate, and butyl methacrylate.
  • latex materials include polystyrene, styrene-acrylic acid copolymer, styrene-methacrylic acid copolymer, styrene-glycidyl (meth) acrylate copolymer, and styrene-styrene sulfonic acid.
  • examples thereof include a salt copolymer, a methacrylic acid polymer, an acrylic acid polymer, an acrylonitrile-butadiene-styrene copolymer, a vinyl chloride-acrylic acid ester copolymer, and a polyvinyl acetate acrylate.
  • the latex a copolymer containing at least styrene as a monomer is preferable, and a copolymer of styrene and acrylic acid or methacrylic acid is particularly preferable.
  • the method for producing the latex is not particularly limited, and the latex can be produced by any polymerization method.
  • a surfactant is present at the time of antibody labeling, antibody immobilization becomes difficult. Therefore, non-emulsifier emulsion polymerization, that is, emulsion polymerization without using an emulsifier such as a surfactant, is preferable for producing the latex.
  • the particle size of the second particles bound by the second binding material is defined as the average particle size.
  • the average particle size of the second particles varies depending on the material of the particles, the concentration range in which serum amyloid A is quantified, measuring equipment, etc., but is preferably 70 nm to 500 nm, more preferably 100 nm to 200 nm. 120 nm or more and 180 nm or less is more preferable, and 130 nm or more and 170 nm or less is particularly preferable.
  • the mass ratio of the second particles to the first particles is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 6, and more preferably 2 to 6 More preferably.
  • the measurement kit of the present invention includes a reagent kit of the present invention described above and a third binding substance having specific binding properties to serum amyloid A or the first binding substance (that is, specific binding to serum amyloid A). And a substrate on which a first metal film on which a third binding substance having a property or a third binding substance having a specific binding property with the first binding substance is fixed is formed. Even if the said board
  • the third binding substance is not particularly limited as long as it is a substance having a specific binding property with serum amyloid A or the first binding substance.
  • Preferred examples include antigens, antibodies, and complexes thereof. It is preferable to use an antibody.
  • the third binding substance is an antibody, as an antibody having specificity for serum amyloid A, for example, antiserum prepared from the serum of an animal immunized with serum amyloid A, immunity purified from antiserum Globulin fraction, monoclonal antibodies obtained by cell fusion using spleen cells of animals immunized with serum amyloid A, or fragments thereof (for example, F (ab ′) 2, Fab, Fab ′, or Fv), etc. Can be used.
  • These antibodies can be prepared by a conventional method.
  • the antibody may be modified as in the case of a chimeric antibody, or may be a commercially available antibody or an antibody prepared from animal serum or culture supernatant by a known method.
  • Antibodies can be used regardless of the animal species or subclass.
  • antibodies that can be used in the present invention are antibodies derived from organisms that can cause an immune reaction such as mice, rats, hamsters, goats, rabbits, sheep, cows, chickens, specifically mouse IgG, mouse IgM.
  • a fragmented antibody is a molecule derived from a complete antibody having at least one antigen-binding site, and specifically, Fab, F (ab ') 2, and the like. These fragmented antibodies are molecules obtained by enzyme or chemical treatment or using genetic engineering techniques.
  • the third binding substance having specific binding properties with the first binding substance is not particularly limited, but preferred examples include antigens, antibodies, and complexes thereof.
  • the method for preparing the antibody and the type of antibody are the same as described above.
  • the fourth binding substance is a substance that does not have a binding property with serum amyloid A and has a specific binding property with the first binding substance.
  • the fourth binding substance include affinity for the first binding substance such as an antibody against the first binding substance (antibody) and a protein (Protein A, Protein G) that binds to the binding substance (antibody). It is preferable to use a compound having a property, and more preferably, an antibody can be used. The method for preparing the antibody and the type of antibody are the same as those described for the third binding substance.
  • a compound in which a part of the first binding substance bound to the first particles having a label has a relationship between the fourth binding substance and a ligand-non-ligand can be preferably used.
  • a method for immobilizing a third binding substance such as an antibody and a fourth binding substance on a substrate is described in, for example, Tech Notes Vol. 2-12 and the like, and any known method for preparing a general ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) reagent can be used.
  • surface modification by arranging a self-assembled monolayer (SAM) or the like on the substrate may be performed.
  • SAM self-assembled monolayer
  • a method for immobilizing the antibody as a binding substance on the substrate a method using physical adsorption, In addition, any method using a chemical bond by a covalent bond can be adopted.
  • blocking agent that covers the surface of the substrate that is not coated with the antibody after the antibody is immobilized on the substrate
  • known substances such as BSA (bovine serum albumin), skim milk, casein, soybean-derived components, fish-derived components, polyethylene glycol, etc.
  • BSA bovine serum albumin
  • a commercially available blocking agent for immune reaction containing these substances or substances having the same properties as these can be used.
  • These blocking agents can be subjected to pretreatment such as partial modification with heat, acid, alkali, or the like, if necessary.
  • the substrate used in the present invention is a substrate on which a metal film is formed, and the form thereof is not particularly limited, but when performing a fluorescence detection method (SPF method) by surface plasmon excitation described later, It is preferable to use a substrate having a metal film as a reaction site on the surface.
  • a substrate having a metal film As the metal constituting the metal film, a substance capable of causing surface plasmon resonance can be used. Preferred examples include metals such as gold, silver, copper, aluminum and platinum, with gold being particularly preferred. The above metals can be used alone or in combination. In consideration of adhesion to the substrate, an intervening layer made of chromium or the like may be provided between the substrate and the layer made of metal.
  • the thickness of the metal film is not particularly limited, but is preferably, for example, from 0.1 nm to 500 nm, more preferably from 1 nm to 200 nm, and particularly preferably from 1 nm to 100 nm. If it exceeds 500 nm, the surface plasmon phenomenon of the medium cannot be sufficiently detected. Moreover, when providing the intervening layer which consists of chromium etc., it is preferable that the thickness of the intervening layer is 0.1 to 10 nm.
  • the metal film may be formed by a conventional method, for example, a sputtering method, a magnetron sputtering method, a vapor deposition method, an ion plating method, an electroplating method, an electroless plating method or the like. In order to achieve good adhesion, it is preferable to form a metal film by a sputtering method.
  • the metal film is preferably disposed on the substrate.
  • “disposed on the substrate” means not only when the metal film is disposed so as to be in direct contact with the substrate but also through other layers without the metal film being in direct contact with the substrate. The case where it is arranged is included.
  • optical glass such as BK7 (borosilicate glass) which is a kind of general optical glass, or synthetic resin, specifically, polymethyl methacrylate, polyethylene terephthalate, polycarbonate,
  • a material made of a material transparent to laser light such as a cycloolefin polymer can be used.
  • Such a substrate is preferably made of a material that does not exhibit anisotropy with respect to polarized light and has excellent processability.
  • a substrate for fluorescence detection by the SPF method a substrate in which a gold film is formed on a polymethyl methacrylate by a sputtering method can be given.
  • the method for measuring serum amyloid A in a biological sample comprises: A biological sample containing serum amyloid A; first particles modified with a first binding substance having a specific binding property to serum amyloid A and having a label; (inorganic value / organic value) ⁇ 10 A step of preparing a mixed solution of at least one nonionic surfactant having an HLB value of 17 to 20 and a molecular weight of 1000 or less, and physiological saline, Adding the mixed solution to the inlet of one end of the substrate on which the first metal film on which the third binding substance having specific binding property with serum amyloid A is immobilized; Flowing the mixed liquid onto the substrate; and Obtaining information on the label on the first metal film, including.
  • the biological sample is not particularly limited as long as it is a sample that may contain the test substance serum amyloid A.
  • a biological sample particularly an animal (particularly a cat, dog, or Human body fluids (eg blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid, tears, sweat, urine, pus, runny nose or sputum) or excrement (eg feces), organs, tissues, mucous membranes and skin Can do.
  • a nonionic surfactant is used for pretreatment of a biological sample containing SAA.
  • a pretreatment liquid prepare a liquid containing a surfactant in advance and use it mixed with the sample liquid, or add a dry solid surfactant to the biological sample liquid itself, A method of use that dissolves in the liquid is used.
  • the concentration of the surfactant in the mixed solution obtained by mixing the biological sample solution and the surfactant is preferably 0.01% by mass or more and 10% by mass or less, more preferably 0.05% by mass or more and 5% by mass or less.
  • 0.1% by mass or more and 3% by mass or less is more preferable, and 0.1% by mass or more and 2% by mass or less is particularly preferable.
  • the SAA can react with the first binding substance on one particle or the second binding substance fixed on the first metal film on the substrate.
  • the mixed solution may further contain second particles modified with a second binding substance that does not have specific binding properties with serum amyloid A.
  • the fourth binding substance having binding ability to the first binding substance is immobilized on the mixed solution without binding to serum amyloid A.
  • the liquid mixture of the biological sample and the surfactant can be a liquid mixture in which the biological sample is diluted.
  • the solution used for dilution is not particularly limited as long as the effect of the present invention is exhibited, but it is preferable to use physiological saline close to the composition of the biological sample.
  • the magnification of the biological sample diluted with physiological saline can be diluted at any magnification, but when a large number of test samples are measured, measurement using the measured value and the control method, which is a measurement using a control kit Although there is a deviation from the value, it is preferable to measure serum amyloid A in a diluted state of 5 times or more in order to make it possible to keep this deviation small.
  • the magnification for diluting the biological sample becomes very high, the signal for the serum amyloid A concentration itself decreases, and accordingly, the increase in the signal for the serum amyloid A concentration decreases. Therefore, it is preferable to suppress the dilution rate to 200 times or less.
  • the measurement method of the present invention is interpreted as the broadest concept including detection of the presence or absence of serum amyloid A and measurement (ie, quantification) of the amount of serum amyloid A.
  • Specific embodiments of the measurement method of the present invention include a sandwich method or a competitive method, and the sandwich method is preferred.
  • the sandwich method is not particularly limited.
  • serum amyloid A can be measured by the following procedure. First, a first binding substance having a specific binding property with serum amyloid A and a third binding substance having a specific binding property with serum amyloid A are prepared in advance. The first binding substance is bound to the first particle having the label to produce the first particle modified with the first binding substance having a specific binding property with serum amyloid A. Next, a third binding substance is prepared and fixed on the substrate to be a reaction site (test area). A fourth binding substance is prepared and fixed on the substrate to serve as a control area.
  • a second binding substance having no specific binding property with serum amyloid A is prepared, and is bound to a second particle having no label, so as not to have a specific binding property with serum amyloid A.
  • a second particle is produced that does not have a label modified with a second binding substance.
  • grains are mixed, accommodated in a container, and are dried.
  • a test sample (or an extract thereof) that may contain serum amyloid A, a mixture of first particles and second particles, and a surfactant are mixed, and the mixed solution is applied to a substrate. Then, the flow path on the substrate is developed and brought into contact with the reaction site.
  • serum amyloid A When serum amyloid A is present in the test sample, at the reaction site, between the serum amyloid A and the first binding substance bound to the first particle, and on the serum amyloid A and the first on the reaction site.
  • a reaction an antigen-antibody reaction in the case of using an antigen and an antibody
  • the first particles corresponding to the amount of serum amyloid A are immobilized on the reaction site.
  • the sandwich method after the reaction between the third binding substance immobilized on the reaction site and serum amyloid A and the reaction between serum amyloid A and the first binding substance bound to the first particles are completed. Cleaning can also be performed for the purpose of removing the first particles that are not bonded in the test area and the control area on the substrate. Subsequently, the accurate concentration of serum amyloid A can be measured by detecting the signal intensity from the first particle bound to the reaction site. The fluorescence intensity and serum amyloid A concentration have a positive correlation.
  • the competitive method is not particularly limited, but for example, serum amyloid A can be measured by the following procedure.
  • the competition method is well known in the art as a technique for detecting antigens of low molecular weight compounds that cannot be assayed by the sandwich method.
  • a first binding substance having a specific binding property with serum amyloid A and a second binding substance having no specific binding property with serum amyloid A are prepared in advance.
  • the first binding material is then bound to the first particle and the second binding material is bound to the second particle.
  • serum amyloid A itself having a binding property to the first binding substance or a compound having a site similar to serum amyloid A and having an epitope for the first binding substance similar to serum amyloid A is formed on the substrate.
  • the first particles and the second particles are mixed, accommodated in a container, and dried.
  • a test sample (or an extract thereof) that may contain serum amyloid A, a mixture of the first particle and the second particle, and a surfactant are mixed, and the reaction is performed by developing the flow path on the substrate. Contact the site.
  • serum amyloid A is not present in the test sample, the first binding substance bound to the first particles and the serum amyloid A having binding ability to the first binding substance immobilized on the reaction site
  • the reaction takes place on the substrate either by itself or by a similar compound having an epitope for the first binding agent antibody similar to serum amyloid A.
  • serum amyloid A when serum amyloid A is present, since serum amyloid A binds to the first binding substance, it is similar to serum amyloid A itself or serum amyloid A, which has binding properties to the first binding substance. Reaction on the reaction site with a compound having an epitope for the first binding substance antibody similar to serum amyloid A is inhibited, and the first particle having the label is inhibited from being immobilized on the reaction site Is done.
  • a plurality of samples with known amounts of serum amyloid A having different concentrations of serum amyloid A are prepared in advance, and the fluorescence from the reaction site is brought into contact with the sample and binding substance-labeled fluorescent particles on the reaction site. The signal is measured at different times.
  • the temporal change (slope) of the fluorescence amount is determined at each serum amyloid A concentration. This time change is plotted on the Y axis and the serum amyloid A concentration is plotted on the X axis, and a calibration curve of the serum amyloid A concentration with respect to the time change of the fluorescence amount is obtained using an appropriate fitting method such as the least square method. Based on the calibration curve obtained in this way, the amount of serum amyloid A contained in the test sample can be quantified from the result of the temporal change in the fluorescence amount using the target test sample.
  • a test sample (or an extract thereof) that may contain serum amyloid A, a first particle having a label, a surfactant, and, if desired, a second particle A mixture is prepared.
  • This mixture can be applied onto the substrate and developed into the flow path.
  • the flow path is not particularly limited as long as it is a passage through which the test sample and the first particles having a label (and optionally second particles) flow down to the reaction site.
  • Preferred embodiments of the flow path include a spot port for spotting a test sample solution containing a first particle having a label (and optionally a second particle), and a reaction site on which a third binding substance is immobilized.
  • the metal thin film, and the flow path exists beyond the metal thin film, and the test sample has a structure capable of passing over the metal thin film.
  • a suction port can be provided on the side opposite to the spotting port with respect to the metal thin film.
  • a signal corresponding to the label is detected.
  • the label preferably emits fluorescence.
  • a signal corresponding to the label can be detected by detecting fluorescence.
  • a fluorescence detection method for example, a device capable of detecting fluorescence intensity, specifically, a microplate reader or a biosensor for performing fluorescence detection method (SPF method) by surface plasmon excitation is used. It is preferable to detect the fluorescence intensity.
  • the detection of the fluorescence intensity is usually completed for a certain time after the antigen-antibody reaction, for example, several minutes to several hours.
  • the concentration of serum amyloid A can be determined from the relationship between fluorescence intensity and serum amyloid A concentration.
  • the form of fluorescence measurement may be plate reader measurement or flow measurement.
  • the SPF method can be measured with higher sensitivity than the fluorescence detection method (epi-illumination fluorescence method) by epi-illumination excitation.
  • the surface plasmon fluorescence (SPF) biosensor for example, an optical waveguide formed of a material that transmits excitation light of a predetermined wavelength, as described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-249361, and one of the optical waveguides are used.
  • a fluorescence detecting means for detecting fluorescence generated by excitation by the evanescent wave enhanced by the surface plasmon can be used.
  • serum amyloid A can be quantified by the following method. Specifically, a sample containing serum amyloid A with known concentrations is prepared, and fluorescence signals from the fluorescence detection site are measured at a plurality of different times while flowing down the site where fluorescence is detected. From this plurality of measurement results, the temporal change (slope) of the fluorescence amount is determined at each serum amyloid A concentration.
  • This time change is plotted on the Y axis and the serum amyloid A concentration is plotted on the X axis, and a calibration curve of the serum amyloid A concentration with respect to the time change of the fluorescence amount is obtained using an appropriate fitting method such as the least square method.
  • an optical signal system based on a calibration curve corresponding to each serum amyloid A, the serum amyloid A amount of the target test sample can be specified.
  • the fluorescence detection (SPF) system by surface plasmon excitation in the present invention is an assay method for detecting fluorescence from a fluorescent substance depending on the amount of serum amyloid A immobilized on a metal thin film on a substrate.
  • This is a method different from the so-called latex agglutination method in which a change in optical transparency is detected as, for example, turbidity as the reaction proceeds.
  • the antibody-sensitized latex in the latex reagent and the antigen in the specimen are combined and aggregated by an antibody reaction.
  • the agglomerates increase with time, and the latex agglutination method is a method for quantifying the antigen concentration from the change in absorbance per unit time obtained by irradiating the agglomerates with near infrared light.
  • the latex agglutination method is a method for quantifying the antigen concentration from the change in absorbance per unit time obtained by irradiating the agglomerates with near infrared light.
  • D316 n-dodecyl- ⁇ -D-maltoside (manufactured by Dojindo), compound D382 in which R is a dodecyloxy group in the following formula (A): n-decyl- ⁇ -D-maltoside (manufactured by Dojindo)
  • Laureth 10 POE (10) lauryl ether (Emulex (registered trademark) EMALEX 710 manufactured by Nippon Emulsion Co., Ltd.)
  • Laureth 20 POE (20) lauryl ether (Emulex (registered trademark) 720 manufactured by Nippon Emulsion Co., Ltd.)
  • Laureth 30 POE (30) lauryl ether (EMALEX (registered trademark) EMALEX 730 manufactured by Nippon Emulsion Co., Ltd.)
  • Polyglyceryl-5 laurate glycerin 5-12 alkyl ester (Sunsoft A-12E-C manufactured by Taiyo Kagaku)
  • Polyglyceryl-5 myristate glycerin 5-14 alkyl ester (Sunsoft A-14E-C, manufactured by Taiyo Kagaku)
  • Caprylic acid polyglyceryl-6 glycerin 6-8 alkyl ester (Sunsoft Q-81F-C, manufactured by Taiyo Chemical
  • Example 1 Production of latex particles having an average particle size of 150 nm 30 g (288 mmol) of styrene (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) and 3 g (42 mmol) of acrylic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) are suspended in 440 mL of ultrapure water and heated to 95 ° C. The temperature was raised, an aqueous solution in which 1 g of potassium persulfate (KPS) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in 10 mL of ultrapure water was added, and the mixture was stirred at 95 ° C. and 250 rpm for 6 hours.
  • KPS potassium persulfate
  • the organic solvent was distilled off under reduced pressure with an evaporator, and then centrifugation and redispersion in a phosphate buffered saline (PBS) aqueous solution were repeated three times to carry out purification to prepare fluorescent latex particles.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Anti-SAA monoclonal antibody Anti-SAA monoclonal antibody
  • anti-CRP C-reactive protein monoclonal antibody
  • MM50175 monoclonal antibody
  • SAA purchased from Hytest
  • Cell seeding was performed on 96-well plates at 0.5 to 1.0 ⁇ 10 5 cells / well as spleen cells.
  • the culture media used were RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute medium), 10% FBS (Fetal bovine serum), and HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine-thymidine-hymoptinine-thymidine-hymoptinine-thymidine). Used as appropriate.
  • the finally grown fusion cells (hybridoma) are injected into the abdominal cavity of the mouse, and ascites is removed after a certain period of time, and the product obtained through centrifugation and purification is collected as an anti-SAA monoclonal antibody (Anti-SAA). did.
  • an anti-CRP monoclonal antibody (MM50175) was prepared using CRP (manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.) purified from a culture solution of E. coli.
  • Fluorescent particles modified with an anti-SAA antibody were prepared as follows. To 275 ⁇ L of a 2% by mass (solid content concentration) fluorescent latex particle aqueous solution (average particle diameter 150 nm), 88 ⁇ L of a 50 mmol / L MES (2- (N-morpholino) ethansulfuric acid) buffer (pH 6.6) solution was added, and 5 mg / L 176 ⁇ L of mL anti-SAA monoclonal antibody (Anti-SAA) was added and stirred at room temperature for 15 minutes.
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • aqueous solution was added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours.
  • 8.8 ⁇ L of 2 mol / L aqueous solution of Glycine manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • centrifugation (15,000 rpm, 4 ° C., 15 minutes) was performed to precipitate fluorescent latex particles.
  • Latex Particles Modified with Anti-CRP Antibody without Fluorescent Labeling 2% by mass (solid content concentration) 300 ⁇ L of latex particle aqueous solution (average particle size 150 nm), 96 ⁇ L of 250 mmol / L MES buffer (pH 5.6) solution Then, 25 mL of ultrapure water was added, and 182 ⁇ L of 5 mg / mL anti-CRP monoclonal antibody (MM50175) was further added. The resulting mixture was stirred at room temperature for 15 minutes.
  • Example 1 The dried particles used in Example 1 were prepared by storing for 15 days.
  • a previously prepared cleaning solution (0.05 mass% Tween (registered trademark) 20 (polyoxyethylene (20) PBS solution (pH 7.4)) containing sorbitan monolaurate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was repeatedly washed with 300 ⁇ L. After washing, in order to block the non-adsorbed portion of the antibody on the gold film, 300 ⁇ L of PBS solution (pH 7.4) containing 1% by mass of casein (Thermo Scientific) was added and allowed to stand at room temperature for 1 hour. did. After washing with the above washing solution, 300 ⁇ L of Immunoassay Stabilizer (manufactured by ABI) was added as a stabilizer, left at room temperature for 30 minutes, the solution was removed, and moisture was completely removed using a dryer.
  • Tween registered trademark
  • PBS solution polyoxyethylene (20) PBS solution (pH 7.4)
  • sorbitan monolaurate manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • FIG. 1 is a schematic view of the sensor chip 1
  • FIG. 2 is an exploded view of the sensor chip 1.
  • the sensor chip 1 includes an upper member 2, an intermediate member 3 and a substrate 4.
  • the upper member 2 is provided with a first container 5 and a second container 6.
  • the first container 5 and the second container 6 are collectively referred to as a container group 7.
  • a flow path 10 is formed on the substrate 4, and a detection area 8 and a reference area 9 are formed on the flow path 10.
  • test sample No. in which the serum of the cat uses the serum of the hybrids purchased from Kitayama Labes and has different concentrations of serum amyloid A as the test substance. 1 and no. 2 was prepared.
  • the liquid mixture 1 was allowed to flow down at a rate of 10 ⁇ L / min while pumping, and the fluorescence intensity on the gold surface on which the SAA antibody was immobilized was continuously measured for 1.5 minutes.
  • the increase rate of the fluorescence signal value per unit time of the fluorescence intensity obtained on each substrate is determined as the test sample No. 1 and 2, respectively.
  • Example 2 In Example 1, the same procedure as in Example 1 was performed except that the surfactant was changed to D382 instead of D316. 1 and no. 2 for each.
  • Evaluation criteria A The increase in the signal with respect to the SAA concentration is very well correlated, and the measurement of the SAA concentration can be obtained with very high accuracy.
  • B A correlation is obtained in the increase of the signal with respect to the SAA concentration, and the measurement of the SAA concentration is practically possible.
  • C Although there is a correlation between the increase width of the signal with respect to the SAA concentration, the SAA concentration measurement is practically insufficient.
  • D No correlation with signal increase with respect to SAA concentration is obtained.
  • Example 3 (13) Preparation of dry particles
  • TOYO Living, Ultra Super Dry 00 series a super dry dryer
  • Example 2 the liquid mixture 10 containing fluorescent particles was spotted at the inlet of the flow path type sensor chip, and the increase rate of the fluorescence signal value per unit time of the fluorescence intensity was determined as the test sample No. 1 and 2, respectively.
  • the rate of increase in the fluorescence signal value was determined on the same evaluation criteria as in Example 1, and the results are shown in Table 2.
  • Example 4 In the preparation of the liquid mixture 10 described in (14) using the dry particles prepared in (13) of Example 3, there was no dilution with physiological saline (1 ⁇ magnification; Example 4), dilution with physiological saline. Of the sample to be tested (cat serum) and physiological saline is appropriately changed so that the dilution with physiological saline is 100 times (Example 6). Liquid mixtures 11 to 13 were prepared and spotted at the inlet of the flow path type sensor chip in the same manner as in Example 3. The increase rate of the fluorescence signal value per unit time of the fluorescence intensity was determined, and the results are shown in Table 2. Indicated.
  • test samples (specimens) Nos. With different test substance concentrations using the serum of the hybrids purchased from Kitayama Labes. 3 to 7 were prepared.
  • SAA concentration was measured by measuring with the control kit described in (12) of Example 1, it was 2.9 ⁇ g / mL, 5.5 ⁇ g / mL, 60.8 ⁇ g / mL, 111.0 ⁇ g / mL, 159, respectively. .1 ⁇ g / mL.

Abstract

本発明の課題は、血清アミロイドＡ濃度に対するシグナルの増加の相関が高い測定を可能とする、血清アミロイドＡの測定のための試薬キット、測定キットおよび測定方法を提供することである。本発明によれば、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、（無機性値／有機性値）×１０で定義されるＨＬＢ値が１７～２０であり、かつ分子量が１０００以下である少なくとも一種の非イオン性界面活性剤とを含む、血清アミロイドＡの測定のための試薬キットが提供される。

Description

試薬キット、測定キットおよび測定方法
　本発明は、血清アミロイドＡの測定のための試薬キット、血清アミロイドＡのための測定キットおよび生体試料中の血清アミロイドＡの測定方法に関する。
　従来、バイオ測定等において、高感度かつ容易な測定法として蛍光検出法が広く用いられている。この蛍光検出法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する検出対象物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射し、そのとき蛍光を検出することによって検出対象物質の存在を確認する方法である。また、検出対象物質が蛍光体ではない場合、蛍光色素で標識された検出対象物質と特異的に結合する物質を試料に接触させ、その後上記と同様にして蛍光を検出することにより、この結合すなわち検出対象物質の存在を確認することも広くなされている。
　また、このような蛍光検出法において、感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が特許文献１などに提案されている。これは、プラズモン共鳴を生じさせるため、透明な支持体上の所定領域に金属層を設けたセンサチップを備え、支持体と金属膜との界面に対して支持体の金属層形成面と反対の面側から、全反射角以上の所定の角度で励起光を入射させ、この励起光の照射により金属層に表面プラズモンを生じさせ、その電場増強作用によって、蛍光を増強させることによりシグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）を向上させるものである。
　血清アミロイドＡ（Ｓｅｒｕｍ　Ａｍｙｌｏｉｄ　Ａ：ＳＡＡとも表記する）は、分子量約１１，６００の非常に疎水性の高いタンパク質で、生体に感染、腫瘍および外傷等の種々のストレスが加わり、それに起因して炎症が生じた際に、血中における濃度が鋭敏に増加するという性質をもっている。このため、しばしば炎症の程度を知るための炎症マーカーとして、血中のＳＡＡ濃度が免疫学的測定方法を用いて測定されている。
　しかし、ＳＡＡは疎水性が高いためか、通常血中ではほとんどが高比重リポタンパク質（ｈｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙ　ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ：ＨＤＬ）と会合していることが知られている。ＳＡＡの抗原決定基はリポタンパク質の内部の外界と接触していない部分に隠されており、そのままでは抗体と反応できないことがある。したがって、免疫学的な測定に際して、隠れた抗原決定基を露出させるための前処理が必要となることが多い。例えば、特許文献２には、組織因子アポ蛋白の測定法においてＨＬＢ（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ－Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ　Ｂａｌａｎｃｅ）値が１２以上である非イオン系界面活性剤を２～１５重量％配合することが記載されている。
特開２０１０－１９０８８０号公報 国際公開ＷＯ９２／１２４２９号
　界面活性剤処理によって血清アミロイドＡがＨＤＬとの会合状態から脱し、反応部位が外界に露出することは特許文献２の記載から明らかである。しかし、表面プラズモン励起による蛍光検出法（ＳＰＦ法）による測定系に、特許文献２に記載のように２～１５重量％の非イオン系界面活性剤を添加すると、ＨＤＬからの解離は進む一方で抗原抗体反応が強く抑制され、シグナル強度が著しく低下してしまう問題が発生する。本発明は、血清アミロイドＡ濃度に対するシグナルの増加の相関が高い測定を可能とする、血清アミロイドＡの測定のための試薬キット、測定キットおよび測定方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、（無機性値／有機性値）×１０で定義されるＨＬＢ値が１７～２０であり、かつ分子量が１０００以下である少なくとも一種の非イオン性界面活性剤とを組み合わせて使用することにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］　血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、（無機性値／有機性値）×１０で定義されるＨＬＢ値が１７～２０であり、かつ分子量が１０００以下である少なくとも一種の非イオン性界面活性剤とを含む、血清アミロイドＡの測定のための試薬キット。
［２］　上記第一の粒子の平均粒径が、７０ｎｍ以上５００ｎｍ以下である、［１］に記載の試薬キット。
［３］　血清アミロイドＡと特異的な結合性を有しない第二の結合物質により修飾され、かつ標識を有しない第二の粒子をさらに含む、［１］または［２］に記載の試薬キット。［４］　上記第二の粒子の平均粒径が、７０ｎｍ以上５００ｎｍ以下である、［３］に記載の試薬キット。
［５］　上記標識が、蛍光色素を含む、［１］から［４］の何れか一に記載の試薬キット。
［６］　上記血清アミロイドＡが、ネコ血清またはネコ血漿中の血清アミロイドＡである、［１］から［５］の何れか一に記載の試薬キット。
［７］　上記界面活性剤が、疎水性基を有する単糖類または疎水性基を有する二糖類である、［１］から［６］の何れか一に記載の試薬キット。
［８］　上記第一の結合物質が抗体である、［１］から［７］の何れか一に記載の試薬キット。
［９］　［１］から［８］の何れか一に記載の試薬キットと、血清アミロイドＡまたは上記第一の結合物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質が固定されている第一の金属膜が形成された基板とを含む、血清アミロイドＡのための測定キット。
［１０］　上記基板に、血清アミロイドＡと結合性を有さず、上記第一の結合物質と特異的な結合性を有する第四の結合物質が固定された第二の金属膜がさらに形成されている、［９］に記載の測定キット。
［１１］　血清アミロイドＡを含む生体試料と、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、（無機性値／有機性値）×１０で定義されるＨＬＢ値が１７～２０であり、かつ分子量が１０００以下である少なくとも一種の非イオン性界面活性剤と、生理食塩水との混合液を調製する工程；
血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第三の結合物質が固定されている第一の金属膜が形成された基板の一端の注入口に、上記混合液を添加する工程；
上記混合液を上記基板上に流下させる工程；および、
上記第一の金属膜上の標識の情報を取得する工程、
を含む、生体試料中の血清アミロイドＡの測定方法。
［１２］　上記混合液中の上記界面活性剤の濃度が０．０１質量％以上１０質量％以下である、［１１］に記載の血清アミロイドＡの測定方法。
［１３］　上記混合液を調製する工程が、上記生体試料に対して５倍以上希釈された混合液を調製する工程である、［１１］または［１２］に記載の血清アミロイドＡの測定方法。
　本発明による試薬キット、測定キットおよび測定方法によれば、ＳＡＡを簡易的かつ迅速に免疫学的に測定することができる。
図１は、センサチップの概略図を示す。 図２は、センサチップの分解図を示す。 図３は、対照キットによるＳＡＡ濃度に対して実施例および比較例で測定した蛍光シグナル値の増加速度をプロットした結果を示す。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を意味する。
［試薬キット］
　本発明の試薬キットは、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、（無機性値／有機性値）×１０で定義されるＨＬＢ値が１７～２０であり、かつ分子量が１０００以下である少なくとも一種の非イオン性界面活性剤とを含む、血清アミロイドＡの測定のための試薬キットである。
　本発明の試薬キットは、上記の通り、第一の粒子と、非イオン性界面活性剤とを含むが、第一の粒子と非イオン性界面活性剤とは混合物としてキットに含まれていてもよいし、別々にキットに含まれていてもよい。
　本発明では特定のＨＬＢ値を有する界面活性剤を低濃度で配合することにより、界面活性剤を使用していても抗原抗体反応が阻害されず、十分な強度のＳＰＦシグナルを得ることができる。
（血清アミロイドＡ）
　本発明における被検物質は、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）である。ＳＡＡは炎症マーカーとして有用である。血清アミロイドＡとしては、例えば、ネコ血清またはネコ血漿中の血清アミロイドＡを挙げることができる。
（界面活性剤）
　非イオン性界面活性剤の特性は、当業界では一般的にＨＬＢ（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ－Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ　Ｂａｌａｎｃｅ）で表され、ＨＬＢ値の計算方法にはいくつかの異なる方法がある。本発明においては、有機概念図（新版　有機概念図－基礎と応用　三共出版　1984年初版）に基づいた有機性値と無機性値を用いて、（無機性値／有機性値）×１０で定義されるＨＬＢ値が１７～２０の範囲であり、かつ、分子量が１０００以下の範囲である非イオン性界面活性剤を使用することにより、本発明のＳＰＦ測定系において良好なシグナル強度が得られることがわかった。
　従来技術においては、好ましいＨＬＢ値を有する界面活性剤を使用することが知られているが、本発明ではＨＬＢ値だけでなく、界面活性剤分子の大きさも重要な因子となり、ある特定の範囲内であることが必須である。すなわち、血清アミロイドＡをＨＤＬから解離させるのに適したＨＬＢ値を持つだけでは不十分で、その分子量が大きすぎると、必然的に分子の体積が大きくなり、解離した後の抗原抗体反応をするために必要な血清アミロイドＡへの抗体の接近が妨げられ、特に低濃度検体におけるシグナルの低下を引き起こすため、ある特定の大きさとなるような分子量の範囲内であることが必須であることが推定される。
　血清中ではＳＡＡの大部分が高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ）と会合した状態で存在していることが知られている。そのため、血清アミロイドＡと結合性を有する第一の結合物質および第三の結合物質に対する血清アミロイドＡの認識部位がＨＤＬに遮蔽されており、第一の結合物質および第三の結合物質が血清アミロイドＡに結合できないという問題がある。本発明は、このような現象を解決するために、界面活性剤を用いて血清アミロイドＡをＨＤＬから解離させることにより、正確に血清中のＳＡＡを定量することが可能になる。
　本発明において使用する界面活性剤は、分子量１０００以下の非イオン性界面活性剤である。非イオン性界面活性剤の分子量が１０００を超えると、ＨＤＬと同じように検体として認識される部位を遮蔽してしまう場合があり、正確にＳＡＡの測定ができなくなる場合があることから、分子量が１０００以下の非イオン性界面活性剤を使用する。界面活性剤の分子量の下限は、好ましくは２００以上であり、より好ましくは３００以上である。界面活性剤の分子量の上限は、好ましくは９００以下であり、より好ましくは８００以下であり、さらに好ましくは７００以下であり、特に好ましくは６００以下である。
　本発明においては、結合物質の結合性に比較的影響を及ぼさない非イオン性界面活性剤を用いる。イオン性界面活性剤の場合には、生体試料中の電荷を有する基と相互作用することにより測定に影響を及ぼす場合があり、ＳＡＡを正確に測定することが難しくなることから、本発明においては非イオン性界面活性剤を用いる。非イオン性界面活性剤は、別の呼称として、ノニオン性界面活性剤と表記される場合がある。陰イオン系の界面活性剤はアニオン性界面活性剤、陽イオン系の界面活性剤はカチオン性界面活性剤、両性イオン系の界面活性剤はベタインと記載されることがある。本発明では、ノニオン性、即ち、非イオン性界面活性剤が用いられる。具体的な非イオン性界面活性剤としては、エーテル型の界面活性剤が好ましい。
　界面活性剤としては、疎水性基を有する単糖類または疎水性基を有する二糖類も好ましい。疎水性基を有する単糖類または疎水性基を有する二糖類としては、より好ましくは、グルコース骨格またはマルトース骨格を有する化合物である。グルコース骨格またはマルトース骨格を有する化合物としては、下記式（２）または下記式（３）で表される化合物を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 式中、Ｒ１１は、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルケニルオキシ基、置換されていてもよいアルキニルオキシ基、置換されていてもよいアルキルチオ基、置換されていてもよいアルケニルチオ基、置換されていてもよいアルキニルチオ基を示し、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５はそれぞれ独立に、水素原子、または置換されていてもよい炭化水素基を示す。但し、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５のうち少なくとも３つは水素原子である。
式中、Ｒ２１は、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルケニルオキシ基、置換されていてもよいアルキニルオキシ基、置換されていてもよいアルキルチオ基、置換されていてもよいアルケニルチオ基、置換されていてもよいアルキニルチオ基を示し、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７およびＲ２８はそれぞれ独立に、水素原子、または置換されていてもよい炭化水素基を示す。但し、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７およびＲ２８のうち少なくとも３つは水素原子である。
　式（２）または式（３）で表される化合物のさらに好ましい例としては、さらに下記式（２Ａ）または下記式（３Ａ）で表される化合物を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 式中、Ｒ１１およびＲ２１は、式（２）および式（３）における定義と同義である。
　式（２Ａ）で表される化合物としては、以下の界面活性剤を使用することが好ましい。ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコシド（同仁化学社製Ｏ００１）。式（２Ａ）におけるＲ１１がオクチルオキシ基である化合物。
　式（３Ａ）で表される化合物としては、以下の界面活性剤を使用することが好ましい。ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（同仁化学社製Ｄ３１６）
ｎ－デシル－β－Ｄ－マルトシド（同仁化学社製Ｄ３８２）
　炭化水素基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アルキルチオ基、アルケニルチオ基およびアルキニルチオ基はそれぞれ置換されていてもよいが、置換基としては、下記の置換基群Ａに記載の置換基が挙げられる。置換基群Ａの置換基は、置換基群Ａの置換基によりさらに置換されていてもよい。
置換基群Ａ：
スルファモイル基、シアノ基、イソシアノ基、チオシアナト基、イソチオシアナト基、ニトロ基、ニトロシル基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アミノ基、メルカプト基、アミド基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、カルバモイル基、アシル基、アルデヒド基、カルボニル基、アリール基、アルキル基、ハロゲン原子で置換されたアルキル基、エテニル基、エチニル基、シリル基、およびトリアルキルシリル基（トリメチルシリル基等）。
　炭化水素基としては、アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基を挙げることができる。炭化水素基の炭素数は特に限定されないが、一般的には１～２０であり、好ましくは１～１６であり、より好ましくは１～１２である。
　アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アルキルチオ基、アルケニルチオ基およびアルキニルチオ基の炭素数は特に限定されないが、一般的には１～２０であり、好ましくは１～１６であり、より好ましくは１～１２である。
（第一の結合物質）
　本発明で用いる第一の結合物質は、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する物質である。第一の結合物質としては、抗体を使用できるが、これに限定されるものではない。好ましくは、第一の結合物質は抗体である。第一の結合物質が抗体である場合は、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する抗体として、例えば、血清アミロイドＡによって免疫された動物の血清から調製する抗血清や、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、血清アミロイドＡによって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦｖ］などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。
　抗体は、その動物種やサブクラス等によらず使用できる。例えば、本発明に用いることが可能な抗体は、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ニワトリなど免疫反応が起こり得る生物に由来する抗体、具体的には、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ、ラットＩｇＧ、ラットＩｇＭ、ハムスターＩｇＧ、ハムスターＩｇＭ、ウサギＩｇＧ、ウサギＩｇＭ、ヤギＩｇＧ、ヤギＩｇＭ、ヒツジＩｇＧ、ヒツジＩｇＭ、ウシＩｇＧ、ウシＩｇＭ、トリＩｇＹ等であり、ポリクローナルもしくはモノクローナルのどちらも使用可能である。
　特に、静電相互作用により血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質としては、抗血清アミロイドＡ抗体が好ましく用いられる。本発明ではサンドイッチ方式を選択することが好ましく、この場合には、ペアとなる抗体を基板に被覆する必要があるが、基板および第一の粒子上の両方に、これらの抗ＳＡＡモノクローナル抗体を用いることが可能である。
（第一の粒子）
　本発明で用いる第一の粒子は、上記した第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する粒子である。
　第一の粒子は、乾燥粒子であることが好ましいが、特に限定はされない。第一の粒子としては、免疫測定に通常用いられ得る粒子として、例えば、ポリスチレンビーズなどの高分子粒子、ガラスビーズ等のガラス粒子を用いることができる。第一の粒子の材質の具体例としては、スチレン、メタクリル酸、グリシジル（メタ）アクリレート、ブタジエン、塩化ビニル、酢酸ビニル、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、フェニルメタクリレート、ブチルメタクリレートなどのモノマーを用いた高分子、または２つ以上のモノマーを用いた共重合体などの合成高分子があり、これらを均一に懸濁させたラテックスが好ましい。また、その他の有機高分子粉末や無機物質粉末、微生物、血球や細胞膜片、リポソームなどが挙げられる。
　ラテックス粒子を使用する場合、ラテックスの材質の具体例としては、ポリスチレン、スチレン－アクリル酸共重合体、スチレン－メタクリル酸共重合体、スチレン－グリシジル（メタ）アクリレート共重合体、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン共重合体、塩化ビニル－アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。ラテックスとしては、単量体としてスチレンを少なくとも含む共重合体が好ましく、スチレンと、アクリル酸またはメタクリル酸との共重合体が特に好ましい。ラテックスの作製方法は特に限定されず、任意の重合方法により作製することができる。但し、抗体標識の際に界面活性剤が存在すると抗体固定化が困難となるため、ラテックスの作製には、無乳化剤乳化重合、即ち界面活性剤などの乳化剤を用いない乳化重合が好ましい。
　第一の粒子は標識を有する。標識は、蛍光を発することが好ましい。重合により得られたラテックス自体が蛍光性である場合には、そのまま蛍光ラテックス粒子として使用することができる。重合により得られたラテックスが非蛍光性の場合には、ラテックスに蛍光物質（蛍光色素など）を添加することによって、蛍光ラテックス粒子を作製することができる。即ち、蛍光ラテックス粒子は、水および水溶性有機溶剤を含むラテックス粒子の溶液に蛍光色素を添加して攪拌することなどにより、蛍光色素をラテックス粒子の内部に含浸させることにより製造することが可能である。
　標識を有する第一の粒子としては、蛍光色素を含有したリポゾ－ムやマイクロカプセル等を蛍光粒子として使用することもできる。蛍光発色は、紫外光等を吸収して励起し、基底状態に戻る際に放出されるものであれば特に制限されるものではなく、例えば、黄緑（励起波長５０５ｎｍ／放出波長５１５ｎｍ、以下同じ）、青（３５０～３５６ｎｍ／４１５～４４０ｎｍ）、赤（５３５～５８０ｎｍ／５７５～６０５ｎｍ）、オレンジ（５４０ｎｍ／５６０ｎｍ）、レッド・オレンジ（５６５ｎｍ／５８０ｎｍ）、クリムゾン（６２５ｎｍ／６４５ｎｍ）、ダークレッド（６６０ｎｍ／６８０ｎｍ）などの蛍光発色が用いられ得る。これらの蛍光を発する蛍光粒子は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手可能であり、同社においてＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（登録商標）の商品名で市販されている。
　標識を有する第一の粒子の粒径は、平均粒径として定義される。第一の粒子の平均粒径は、特に限定されず、好ましい範囲は、粒子の材質や血清アミロイドＡを定量する濃度範囲、測定機器などによって異なるが、７０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることが好ましく、７０ｎｍ以上３００ｎｍ以下であることがより好ましく、８０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下であることがさらに好ましく、９０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることが特に好ましい。
　本発明に用いられる粒子の平均粒径は、市販の粒度分布計等で計測することが可能である。粒度分布の測定法としては、光学顕微鏡法、共焦点レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、静的光散乱法、レーザー回折法、動的光散乱法、遠心沈降法、電気パルス計測法、クロマトグラフィー法、超音波減衰法等が知られており、それぞれの原理に対応した装置が市販されているが、これらの測定法の中で、動的光散乱法で計測することが好ましく、本発明では、平均粒径は、２５℃にて、粘度０．８８７２ＣＰ（０．８８７２ｍＰａ・ｓ）、水の屈折率１．３３０の条件で測定したメジアン径（５０％径、ｄ５０）として求めるものとする。
　本発明で用いる第一の粒子は、上記した第一の結合物質により修飾されている。標識を有する第一の粒子に、第一の結合物質を結合するための方法は特に限定されない。例えば、特開２０００－２０６１１５号公報やモレキュラープローブ社ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（登録商標）ポリスチレンマイクロスフィアＦ８８１３に添付のプロトコールなどに記載されており、免疫凝集反応用試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、抗体などの結合物質を粒子に固定化する方法としては、物理吸着を用いた方法、および共有結合による化学結合を用いた方法、のいずれの方法も採用可能である。抗体などの結合物質を粒子に固定させた後に結合物質が被覆されていない粒子表面を覆うブロッキング剤として、公知の物質、例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やスキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分、ポリエチレングリコールなどや、これらの物質やこれらと性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。
（第二の結合物質）
　本発明の試薬キットはさらに、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有しない第二の結合物質により修飾され、かつ標識を有しない第二の粒子を含んでいてもよい。
血清アミロイドＡを含む陽性となる被検試料だけでなく、血清アミロイドＡを含まない陰性の被検試料に対しても反応して陽性となる被検試料が存在しており、擬陽性の解決が課題として認識されている。このような擬陽性を示す原因は明確にはなっていないが、血清中に含まれる何らかの因子が存在して非特異反応を起こすことが原因の一つではないかと考えられている。本発明では、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有しない第二の結合物質により修飾され、かつ標識を有しない第二の粒子を併用することで、このような問題を解決することが好ましい。
　第二の結合物質としては、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有さない物質を使用することができ、上記したような擬陽性を示す原因物質に結合する可能性のある物質を使用することが好ましく、さらに第一の結合物質に対して親和性を有しない化合物を使用することが好ましい。第二の結合物質としては、抗体、あるいは抗体に対して結合するタンパク質（Protein A、Protein G）などを使用することができ、抗体が好ましい。例えば、第二の結合物質が抗体である場合には、その抗原によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、血清アミロイドＡによって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦｖ］などを用いることが可能である。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体も使用可能である。本発明では、第二の結合物質として、特に抗ＣＲＰ抗体を使用する態様が好ましい。
（第二の粒子）
　第二の粒子は、標識を有しない。また第二の粒子は乾燥粒子であることが好ましいが、特に限定されない。
　第二の粒子としては、免疫測定に通常用いられ得る粒子として、例えば、ポリスチレンビーズなどの高分子粒子、ガラスビーズ等のガラス粒子を用いることができる。第二の粒子の材質の具体例としては、スチレン、メタクリル酸、グリシジル（メタ）アクリレート、ブタジエン、塩化ビニル、酢酸ビニルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、フェニルメタクリレート、ブチルメタクリレートなどのモノマーを用いた高分子、または２つ以上のモノマーを用いた共重合体などの合成高分子があり、これらを均一に懸濁させたラテックスが好ましい。また、その他の有機高分子粉末や無機物質粉末、微生物、血球や細胞膜片、リポソームなどが挙げられる。
　ラテックス粒子を使用する場合、ラテックスの材質の具体例としては、ポリスチレン、スチレン－アクリル酸共重合体、スチレン－メタクリル酸共重合体、スチレン－グリシジル（メタ）アクリレート共重合体、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン共重合体、塩化ビニル－アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。ラテックスとしては、単量体としてスチレンを少なくとも含む共重合体が好ましく、スチレンと、アクリル酸またはメタクリル酸との共重合体が特に好ましい。ラテックスの作製方法は特に限定されず、任意の重合方法により作製することができる。但し、抗体標識の際に界面活性剤が存在すると抗体固定化が困難となるため、ラテックスの作製には、無乳化剤乳化重合、即ち界面活性剤などの乳化剤を用いない乳化重合が好ましい。
　第二の結合物質で結合された第二の粒子の粒径は、平均粒径として定義される。第二の粒子の平均粒径は、粒子の材質や血清アミロイドＡを定量する濃度範囲、測定機器などによって異なるが、７０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることが好ましく、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることがより好ましく、１２０ｎｍ以上１８０ｎｍ以下であることがさらに好ましく、１３０ｎｍ以上１７０ｎｍ以下であることが特に好ましい。
　第一の粒子と第二の粒子の使用比率については、第一の粒子に対する第二の粒子の質量比が１～１０であることが好ましく、１～６であることがより好ましく、２～６であることが更に好ましい。
［測定キット］
　本発明の測定キットは、上記した本発明の試薬キットと、血清アミロイドＡまたは上記第一の結合物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質（即ち、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第三の結合物質、または上記第一の結合物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質）が固定されている第一の金属膜が形成された基板とを含む。上記基板には、血清アミロイドＡと結合性を有さず、第一の結合物質と特異的な結合性を有する第四の結合物質が固定された第二の金属膜がさらに形成されていてもよい。
（第三の結合物質）
　第三の結合物質は、血清アミロイドＡまたは第一の結合物質と特異的な結合性を有する物質である限り特に限定されないが、好ましい例としては、抗原、抗体、またはこれらの複合体が挙げられ、抗体を用いることが好ましい。第三の結合物質が抗体である場合は、血清アミロイドＡに対して特異性を有する抗体として、例えば、血清アミロイドＡによって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、血清アミロイドＡによって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦｖ］などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。
　抗体は、その動物種やサブクラス等によらず使用できる。例えば、本発明に用いることが可能な抗体は、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ニワトリなど免疫反応が起こり得る生物に由来する抗体、具体的には、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ、ラットＩｇＧ、ラットＩｇＭ、ハムスターＩｇＧ、ハムスターＩｇＭ、ウサギＩｇＧ、ウサギＩｇＭ、ヤギＩｇＧ、ヤギＩｇＭ、ヒツジＩｇＧ、ヒツジＩｇＭ、ウシＩｇＧ、ウシＩｇＭ、トリＩｇＹ等であり、ポリクローナルもしくはモノクローナルのどちらも使用可能である。断片化抗体は、少なくとも１つの抗原結合部位を持つ、完全型抗体から導かれた分子であり、具体的にはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等である。これらの断片化抗体は、酵素あるいは化学的処理によって、もしくは遺伝子工学的手法を用いて得られる分子である。
　第一の結合物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質としては、特に限定されないが、好ましい例としては、抗原、抗体、またはこれらの複合体が挙げられる。抗体の調製方法および抗体の種類は、上記した内容と同様である。
（第四の結合物質）
　第四の結合物質は、血清アミロイドＡと結合性を有さず、第一の結合物質と特異的な結合性を有する物質である。第四の結合物質としては、例えば、第一の結合物質（抗体）に対する抗体、結合物質（抗体）に対して結合するタンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ）など、第一の結合物質に対して親和性を持つ化合物を使用することが好ましく、中でも更に好ましくは、抗体を使用することができる。抗体の調製方法および抗体の種類は、第三の結合物質について記載した内容と同様である。また、標識を有する第一の粒子に結合した第一の結合物質の一部が、第四の結合物質とリガンド－非リガンドの関係となる化合物を好ましく用いることができる。
（結合物質を基板に固定化する方法）
　抗体などの第三の結合物質および第四の結合物質を基板に固定化する方法は、例えば、Ｎｕｎｃ社の提供するＴｅｃｈ Ｎｏｔｅｓ Ｖｏｌ．２－１２などに記載されており、一般的なＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、基板上に自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）などを配することによる表面修飾を施しても良く、結合物質としての抗体を基板に固定化する方法としては、物理吸着を用いた方法、および共有結合による化学結合を用いた方法のいずれの方法も採用可能である。抗体を基板に固定させた後に抗体が被覆されていない基板表面を覆うブロッキング剤として、公知の物質、例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やスキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分、ポリエチレングリコールなどや、これらの物質やこれらと性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。
（基板）
　本発明で用いる基板は、金属膜が形成された基板であり、その形態は特に限定されないが、後述する表面プラズモン励起による蛍光検出法（ＳＰＦ法）を行う場合には、後述する流路、および表面に反応部位である金属膜を有する基板を使用することが好ましい。金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るような物質を用いることができる。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の金属が挙げられ、特に金が好ましい。上記の金属は単独または組み合わせて使用することも可能である。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。金属膜の膜厚は特に制限はないが、例えば、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるものが好ましく、更には、１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるものが好ましく、特に１ｎｍ以上１００ｎｍ以下であるものが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上、１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
　金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタリング法、マグネトロンスパッタリング法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができるが、基板への金属膜の良好な付着性を実現するために、スパッタリング法により金属膜を形成することが好ましい。
　金属膜は、好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置されている」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む。本発明で使用することができる基板としては例えば、一般的な光学ガラスの一種であるＢＫ７（ホウ珪酸ガラス）等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。ＳＰＦ法による蛍光検出のための基板の一例としては、ポリメチルメタクリレート上に、金膜をスパッタリング法で作製した基板などを挙げることができる。
［血清アミロイドＡの測定方法］
　本発明による生体試料中の血清アミロイドＡの測定方法は、
血清アミロイドＡを含む生体試料と、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、（無機性値／有機性値）×１０で定義されるＨＬＢ値が１７～２０であり、かつ分子量が１０００以下である少なくとも一種の非イオン性界面活性剤と、生理食塩水との混合液を調製する工程；
血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第三の結合物質が固定されている第一の金属膜が形成された基板の一端の注入口に、上記混合液を添加する工程；
上記混合液を上記基板上に流下させる工程；および、
上記第一の金属膜上の標識の情報を取得する工程、
を含む。
　生体試料としては、被検物質である血清アミロイドＡを含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物（特に、ネコ、イヌ、またはヒト）の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、または喀痰）若しくは排泄物（例えば、糞便）、臓器、組織、粘膜や皮膚などを挙げることができる。
　非イオン性界面活性剤は、ＳＡＡを含む生体試料の前処理に使用される。前処理液としては、事前に界面活性剤を含む液を準備し、検体液に混合して使用する使用方法や、生体試料液そのものに、乾燥した固形分の界面活性剤を添加して、検体液に溶かしこむ使用方法が用いられる。この場合、生体試料液と界面活性剤を混合した混合液中の界面活性剤の濃度としては、０．０１質量％以上１０質量％以下が好ましく、０．０５質量％以上５質量％以下がより好ましく、０．１質量％以上３質量％以下が更に好ましく、０．１質量％以上２質量％以下が特に好ましい。濃度が、０．０１質量％以上であると有効にＳＡＡをＨＤＬから分離することが可能となり、濃度が１０質量％以下であると、界面活性剤の影響を受けにくい状態で、標識を有する第一の粒子上の第一の結合物質や、あるいは基板上の第一の金属膜上に固定された第二の結合物質と、ＳＡＡとが反応することが可能となる。
　上記混合液は、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有しない第二の結合物質により修飾された第二の粒子をさらに含んでいてもよい。また本発明による血清アミロイドＡの測定方法は、上記混合液を、血清アミロイドＡと結合性を有さず、上記第一の結合物質に対して結合性を有する第四の結合物質が固定された第二の金属膜に接触させる工程と、上記第二の金属膜から上記標識に応じたシグナルを検出する工程と、上記第二の金属膜から検出したシグナルを用いて上記第一の金属膜から検出したシグナルを補正する工程とをさらに含んでいてもよい。
　上記生体試料と界面活性剤の混合液は、生体試料を希釈した状態の混合液を使用することができる。希釈に用いる液としては、本発明の効果を発現する限り特に制限はないが、生体試料の組成に近い生理食塩水を用いること好ましい。生理食塩水で希釈する生体試料に対する倍率はいずれの倍率での希釈が可能であるが、多数の被検試料を測定した際には、測定値と対照キットを用いた測定である対照法の測定値との乖離があるが、この乖離を小さく抑えることを可能とするためには、５倍以上に希釈した状態で血清アミロイドＡの測定をすることが好ましい。生体試料の希釈によりより高い相関が可能となるが、生体試料を希釈する倍率が非常に高くなると、血清アミロイドＡ濃度に対するシグナルそのものが低下し、それに伴い血清アミロイドＡ濃度に対するシグナルの増加が低下するため、希釈倍率は２００倍以下に抑えることが好ましい。
（測定方法）
　本発明の測定方法は、血清アミロイドＡの存在の有無の検出や血清アミロイドＡの量の測定（すなわち、定量）などを含む、最も広い概念として解釈される。本発明の測定方法の具体的な実施態様としてはサンドイッチ法または競合法が挙げられ、サンドイッチ法が好ましい。
＜サンドイッチ法＞
　サンドイッチ法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により血清アミロイドＡを測定することができる。まず、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質、および血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第三の結合物質を予め用意しておく。第一の結合物質を、標識を有する第一の粒子に結合させて、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾された第一の粒子を作製する。次いで第三の結合物質を用意し、基板上に固定して反応部位（テストエリア）とする。また、第四の結合物質を用意し、基板上に固定してコントロールエリアとする。別途、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有しない第二の結合物質を用意し、標識を有さない第二の粒子に結合させて、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾された標識を有しない第二の粒子を作製する。上記の第一の粒子と、第二の粒子を混合して容器に収納し、乾燥させる。血清アミロイドＡを含む可能性のある被検試料（またはその抽出液）と、第一の粒子と第二の粒子の混合物と、界面活性剤とを混合し、この混合した液を基板に適用し、基板上の流路上を展開させて反応部位に接触させる。被検試料中に血清アミロイドＡが存在する場合には、反応部位で、血清アミロイドＡと、第一の粒子に結合した第一の結合物質との間、および血清アミロイドＡと反応部位上の第三の結合物質との間で反応（抗原および抗体を用いた場合には、抗原抗体反応）が起こり、血清アミロイドＡの量に応じた第一の粒子が反応部位上に固定される。サンドイッチ法では、反応部位上に固定した第三の結合物質と、血清アミロイドＡとの反応、および血清アミロイドＡと第一の粒子に結合している第一の結合物質との反応が終了した後、基板上のテストエリアおよびコントロールエリアで結合しなかった第一の粒子を除去する目的で、洗浄を行うこともできる。次いで反応部位に結合した第一の粒子からのシグナル強度を検出することで、正確な血清アミロイドＡの濃度を測定することができる。なお、蛍光強度と血清アミロイドＡの濃度は、正の相関関係がある。
＜競合法＞ 
　競合法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により血清アミロイドＡを測定することができる。競合法は、サンドイッチ法でアッセイすることができない低分子化合物の抗原を検出する手法として当業界においてよく知られている。まず、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質と、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有しない第二の結合物質を予め調製する。次いで第一の結合物質を第一の粒子に結合させ、第二の結合物質を第二の粒子に結合させる。また、第一の結合物質に対して結合性を有する、血清アミロイドＡそのもの、または血清アミロイドＡと類似な部位を持ち血清アミロイドＡと同様の第一の結合物質に対するエピトープを持つ化合物を基板上に固定し反応部位とする。次に、第一の粒子と、第二の粒子を混合して容器に収納し、乾燥させる。血清アミロイドＡを含む可能性のある被検試料（またはその抽出液）と、第一の粒子と第二の粒子の混合物と、界面活性剤を混合し、基板上の流路上を展開させて反応部位に接触させる。被検試料中に血清アミロイドＡが存在しない場合には、第一の粒子に結合した第一の結合物質と、反応部位上に固定した第一の結合物質に対して結合性を有する血清アミロイドＡそのものまたは血清アミロイドＡと同様の第一の結合物質抗体に対するエピトープを持つ類似化合物とにより、基板上で反応が起こる。一方、血清アミロイドＡが存在する場合には、第一の結合物質に血清アミロイドＡが結合するため、第一の結合物質に対して結合性を有する、血清アミロイドＡそのもの、または血清アミロイドＡと類似な部位を持ち血清アミロイドＡと同様の第一の結合物質抗体に対するエピトープを持つ化合物との、反応部位上における反応が阻害され、標識を有する第一の粒子が反応部位上へ固定することが阻害される。競合法では、予め、血清アミロイドＡの濃度が異なる血清アミロイドＡの量が既知である試料を複数用意し、この試料および結合物質標識蛍光粒子を反応部位上に接触させつつ、反応部位からの蛍光シグナルを異なる複数の時刻で測定する。この複数の測定結果から、各血清アミロイドＡ濃度において、蛍光量の時間変化（傾き）を求める。この時間変化をＹ軸、血清アミロイドＡ濃度をＸ軸としてプロットし、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて、蛍光量の時間変化に対する血清アミロイドＡの濃度の検量線を取得する。このように取得した検量線に基づき、目的とする被検試料を用いた蛍光量の時間変化の結果から、被検試料に含まれる血清アミロイドＡの量を定量することができる。
（流路）
　本発明の好ましい態様においては、血清アミロイドＡを含む可能性のある被検試料（またはその抽出液）と、標識を有する第一の粒子と、界面活性剤と、さらに所望により第二の粒子とを混合した混合物を調製する。この混合物を基板上に適用し、流路に展開することができる。流路とは、被検試料と、標識を有する第一の粒子（および所望により第二の粒子）とを反応部位まで流下する通路であれば、特に制限はない。好ましい流路の態様としては、標識を有する第一の粒子（および所望により第二の粒子）を含む被検試料液を点着する点着口、第三の結合物質が固定化された反応部位としての金属薄膜、および金属薄膜を越えて流路が存在し、被検試料が、金属薄膜上を通過できる構造を有するものである。好ましくは、金属薄膜に対して、点着口とは反対側に、吸引口を設けることができる。
（標識に応じたシグナルを検出する方法）
　本発明においては、標識に応じたシグナルを検出する。上記の通り標識は蛍光を発することが好ましく、この場合には、蛍光を検出することにより、標識に応じたシグナルを検出することができる。蛍光の検出方法としては、例えば、蛍光強度を検出することができる機器、具体的には、マイクロプレートリーダー、または表面プラズモン励起による蛍光検出法（ＳＰＦ法）を行うためのバイオセンサーなどを用いて蛍光強度を検出することが好ましい。蛍光強度の検出は、通常、抗原抗体反応後一定時間、例えば、数分～数時間後に終了する。免疫複合体の形成の度合いを蛍光強度として検出することにより、蛍光強度と血清アミロイドＡの濃度の関係から、血清アミロイドＡの濃度を定量することができる。なお、蛍光の測定の形態は、プレートリーダー測定でもよいし、フロー測定でもよい。なお、ＳＰＦ法は、落射励起による蛍光検出法（落射蛍光法）よりも高感度に測定することができる。
　表面プラズモン蛍光（ＳＰＦ）バイオセンサーとしては、例えば、特開２００８－２４９３６１号公報に記載されているような、所定波長の励起光を透過させる材料から形成された光導波路と、この光導波路の一表面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを光導波路に通し、上記光導波路と金属膜との界面に対して表面プラズモンを発生させる入射角で入射させる光学系と、上記表面プラズモンによって増強されたエバネッセント波によって励起されたことによって発生する蛍光を検出する蛍光検出手段とを備えたセンサーを用いることができる。
（血清アミロイドＡの量の測定方法）
　本発明におけるＳＰＦ法での血清アミロイドＡの定量方法の一例としては、以下の方法により血清アミロイドＡを定量することができる。具体的には、各濃度既知の血清アミロイドＡを含む試料を準備し、蛍光を検出する部位を流下させつつ、蛍光検出部位からの蛍光シグナルを異なる複数の時刻で測定する。この複数の測定結果から、各血清アミロイドＡ濃度において、蛍光量の時間変化（傾き）を求める。この時間変化をＹ軸、血清アミロイドＡ濃度をＸ軸としてプロットし、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて、蛍光量の時間変化に対する血清アミロイドＡ濃度の検量線を取得する。光シグナルシステムとしては、血清アミロイドＡごとに対応する検量線に基づき、目的とする被検試料の血清アミロイドＡ量を特定することができる。
　本発明における表面プラズモン励起による蛍光検出（ＳＰＦ）系は、基板上の金属薄膜上に固定化された血清アミロイドＡの量に依存した蛍光物質からの蛍光を検出するアッセイ方法であり、溶液中での反応の進行により、光学的な透明度の変化を、例えば濁度として検出する、いわゆるラテックス凝集法とは異なる方法である。ラテックス凝集法では、ラテックス試薬中の抗体感作ラテックスと検体中の抗原が、抗体反応により結合し、凝集する。この凝集塊は時間と共に増大し、この凝集塊に近赤外光を照射して得られた単位時間当たりの吸光度変化から、抗原濃度を定量化する方式が、ラテックス凝集法である。本発明では、ラテックス凝集法に比べて、非常に簡便な血清アミロイドＡの検出方法を提供できる。
　以下に、本発明の実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。なお、以下の実施例に示される材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。以下の化学式においてＥｔはエチルを示す。
　以下の界面活性剤を使用した。
Ｄ３１６：ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（同仁化学社製）、下記式（Ａ）においてＲがドデシルオキシ基である化合物
Ｄ３８２：ｎ－デシル－β－Ｄ－マルトシド（同仁化学社製）、下記式（Ａ）においてＲがデシルオキシ基である化合物
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
Ｏ３９３：ｎ－オクチル－β－Ｄ－マルトシド　（同仁化学社製）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
ラウレス１０：ＰＯＥ（１０）ラウリルエーテル（日本エマルジョン社製ＥＭＡＬＥＸ（登録商標）EMALEX 710）
ラウレス２０：ＰＯＥ（２０）ラウリルエーテル（日本エマルジョン社製ＥＭＡＬＥＸ（登録商標）７２０）
ラウレス３０：ＰＯＥ（３０）ラウリルエーテル（日本エマルジョン社製ＥＭＡＬＥＸ（登録商標）EMALEX 730
ラウリン酸ポリグリセリル－５：グリセリン５－１２アルキルエステル（太陽化学社製サンソフトＡ－１２Ｅ－Ｃ）
ミリスチン酸ポリグリセリル－５：グリセリン５－１４アルキルエステル（太陽化学社製サンソフトＡ－１４Ｅ－Ｃ）
カプリル酸ポリグリセリル－６：グリセリン６－８アルキルエステル（太陽化学社製サンソフトＱ－８１Ｆ－Ｃ）
＜実施例１＞
（１）平均粒子径１５０ｎｍラテックス粒子の製造
　スチレン（和光純薬社製）３０ｇ（２８８ｍｍｏｌ）とアクリル酸（和光純薬社製）３ｇ（４２ｍｍｏｌ）を超純水４４０ｍＬに懸濁させ、９５℃に昇温し、過硫酸カリウム（ＫＰＳ）（和光純薬社製）１ｇを超純水１０ｍＬに溶解させた水溶液を添加し、９５℃、２５０ｒｐｍで６時間攪拌した。その後、１０，０００ｒｐｍで６時間遠心分離を３回行い、ラテックス粒子を得た。最後に、得られたラテックス粒子を超純水に再分散させた。固形分濃度が１質量％となるように、純水を添加して希釈液を調製した。粒径アナライザーＦＰＡＲ－１０００（大塚電子（株））を用いて、温度２５℃で測定したメジアン径（ｄ＝５０）として求めたところ、ラテックス粒子の平均粒子径は１５０ｎｍであった。
（２）蛍光ラテックス粒子の作製
　上記のように作製した平均粒子径１５０ｎｍのラテックス粒子の固形分濃度２質量％の水分散液１００ｍＬにメタノール１００ｍＬを加え、１０分間、室温で攪拌した。一方、別途用意したＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１ｍＬ、ＣＨＣｌ３　９ｍＬおよびエタノール１６ｍＬに溶解させた蛍光色素 （ＮＫ１３６、林原生物化学研究所製）１２ｍｇを６０分間かけてゆっくりラテックス溶液に滴下した。滴下完了後、エパポレーターで有機溶媒を減圧留去した後、遠心分離とリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）水溶液への再分散を３回繰り返し、精製を行うことで、蛍光ラテックス粒子を調製した。
（３）モノクローナル抗体の作製
　抗ＳＡＡモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ－ＳＡＡ）および抗ＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）モノクローナル抗体（ＭＭ５０１７５）は、マウス腹水法を用いて、以下のように作製した。
　Ｈｙｔｅｓｔ社より購入したＳＡＡを用いて、マウスに免疫した後に脾臓細胞を抽出し、ミエローマ（製品名Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８－Ｕ１、コスボバイオ社製）と混合し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法にて細胞融合を実施した。使用細胞としては、最終免疫してから３日後に採取した脾臓細胞を使用した。細胞比は、脾臓細胞：ミエローマ＝１０：１とした。細胞播種は、脾臓細胞として０．５～１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに播種した。使用した培地は、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｒｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｍｅｄｉｕｍ）、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清：Ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ）、およびＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン混合培地、ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ－ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ－ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　ｍｅｄｉｕｍ）を適宜使用した。最終的に増殖した融合細胞（ハイブリドーマ）をマウス腹腔内に注射し、一定期間の経時後に腹水を取り出し、遠心分離、精製工程を経て得られたものを抗ＳＡＡモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ－ＳＡＡ）として採取した。また、抗ＳＡＡモノクローナル抗体の作製と同様にして、大腸菌の培養液から精製したＣＲＰ（オリエンタル酵母工業（株）社製）を用いて、抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＭ５０１７５）を作製した。
（４）抗ＳＡＡ抗体で修飾した蛍光ラテックス粒子の調製
　抗ＳＡＡ抗体で修飾した蛍光粒子を、以下の通り調製した。
　２質量％（固形分濃度）蛍光ラテックス粒子水溶液（平均粒子径１５０ｎｍ）２７５μＬに、５０ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳ（２－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）バッファー（ｐＨ６．６）溶液８８μＬを加え、５ｍｇ／ｍＬの抗ＳＡＡモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ－ＳＡＡ）１７６μＬを添加し、室温で１５分間攪拌した。その後、１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、和光純薬社製）水溶液を５μＬ加え、室温で２時間撹拌した。２ｍｏｌ／ＬのＧｌｙｃｉｎｅ（和光純薬社製）水溶液を８．８μＬ添加して１５分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行い、蛍光ラテックス粒子を沈降させた。その後上清を取り除き、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を５００μＬ加え、超音波洗浄機により蛍光ラテックス粒子を再分散させた。再度、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行って上清を除いた後、１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液５００μＬを加えて、蛍光ラテックス粒子を再分散させることで、抗ＳＡＡ抗体結合蛍光ラテックス粒子の１質量％溶液を調製した。
（５）蛍光標識をしない抗ＣＲＰ抗体で修飾したラテックス粒子の作製
　２質量％（固形分濃度）ラテックス粒子水溶液（平均粒子径１５０ｎｍ）３００μＬに、２５０ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳバッファー（ｐＨ５．６）溶液９６μＬおよび超純水２５ｍＬを加え、さらに５ｍｇ／ｍＬの抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＭ５０１７５）１８２μＬを添加した。得られた混合物を室温で１５分間攪拌した。その後、１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ（Ｎ－ｅｔｈｙｌ－Ｎ’－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）水溶液９．６μＬを加え、得られた混合物を室温で２時間撹拌した。２ｍｏｌ／Ｌのグリシン（和光純薬（株）社製）水溶液を３０μＬ添加して、得られた混合物を３０分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行い、ラテックス粒子を沈降させた。上清を取り除き、沈殿物にＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を６００μＬ加え、超音波洗浄機によりラテックス粒子を再分散させた。再度、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行って上清を除いた後、沈殿物に１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液６００μＬを加えて、ラテックス粒子を再分散させた。このようにして抗ＣＲＰ抗体結合ラテックス粒子の１質量％溶液を調製した。
（６）乾燥粒子の作製
　超純水２４０μＬ、２０質量％のスクロース水溶液４１７μＬ、２０質量％のＢＳＡ水溶液２２９μＬ、（４）で調製した、抗ＳＡＡ抗体で修飾した蛍光ラテックス粒子（平均粒子径１５０ｎｍ）を１質量％含む分散液１２５μＬ、及び、（５）で調製した、蛍光標識をしない抗ＣＲＰ抗体で就職した結合ラテックス粒子（平均粒子径１５０ｎｍ）を１質量％含む分散液５５０μＬを混合した。ポリプロピレン（プライムポリマー社製、プライムポリプロ　ランダムＰＰグレード）を基体としたカップを準備し、上記混合液３２μＬをカップ内に点着した。その後、スーパードライ乾燥機（ＴＯＹＯリビング社、ウルトラスーパードライ００シリーズ）を用いて、１２時間かけて含水量を２５％以下となるまで乾燥させ、その後、２５℃５０％ＲＨ（相対湿度）の環境で１５日間保存することで、実施例１で使用した乾燥粒子を作製した。
（７）基板の作製
　ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ、三菱レイヨン社製、アクリペットＶＨ－００１）を基体とした基板の片面に、テストエリアおよびコントロールエリア共に幅４ｍｍ、厚さが３６ｎｍとなるように、テストエリアに用いる金膜と、その隣に、コントロールエリアに用いる金膜とを、マグネトロンスパッタリング法により作製した。この基板を幅５ｍｍとなるように裁断して基板を作製した。この基板のテストエリアの金膜上には、抗ＳＡＡモノクローナル抗体を含む液（濃度：１０μｇ／ｍＬ　ｉｎ１５０ｍｍｏｌ　ＮａＣｌ）を点着し、１時間、２５℃にてインキュベートし、物理吸着させて固定化を行った。
（８）基板の洗浄およびブロッキング
　このように調製した基板をセンサチップの流路に取り付ける前に、予め調製した洗浄用溶液（０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウラート、和光純薬社製）を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４））を３００μＬ用いて３回繰り返し洗浄した。洗浄終了後、金膜上の抗体の未吸着部分のブロッキングを行うため、１質量％カゼイン（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を３００μＬ添加し、１時間、室温で静置した。上記の洗浄用溶液で洗浄後、安定化剤としてＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ（ＡＢＩ社製）３００μＬを添加し、室温で３０分間放置し、溶液を除去して乾燥機を用いて水分を完全に取り除いた。
（９）センサチップの作製　
　特開２０１０－１９０８８０号公報の第２の実施形態の構成となるように、作製した基板を流路に封入し、流路型センサチップを作製した。その概略図を図１および図２に示した。図１は、センサチップ１の概略図であり、図２は、センサチップ１の分解図である。センサチップ１は、上部部材２、中間部材３および基板４から構成されている。上部部材２には、第一の容器５および第二の容器６が設けられている。なお、第一の容器５および第二の容器６を併せて、容器群７と称する。基板４には、流路１０が形成されており、流路１０の上には、検出領域８および参照領域９が形成されている。
（１０）被検試料の準備
　ネコの血清は、北山ラベスから購入した交雑種の血清を使用し、被検物質である血清アミロイドＡの濃度が異なる被検試料（検体）Ｎｏ．１およびＮｏ．２を用意した。
（１１）蛍光粒子を用いたＳＡＡの免疫測定
　（１０）で準備した被検試料（ネコの血清）１０μＬと、非イオン性界面活性剤であるＤ３１６（同仁化学製）の０．３３質量％の生理食塩水溶液９０μＬを充分に混合して、被検試料の混合液１を作製した。この混合液の界面活性剤Ｄ３１６の濃度は、０．３０質量％であった。次に、（４）で調製した、抗ＳＡＡ抗体標識蛍光粒子を点着し乾燥させたカップに、作製した混合液１を添加し、１０分間、十分に攪拌した。次に、上記で作製した基板を封入した流路型センサチップの注入口に蛍光粒子と混合した混合液１を点着した。点着後、ポンプ吸引を行いながら混合液１を１０μＬ／ｍｉｎの速度で流路を流下させ、ＳＡＡ抗体を固定した金面上の蛍光強度を１．５分間継続して測定した。各基板において得られた蛍光強度の単位時間における蛍光シグナル値の増加速度を被検試料Ｎｏ．１、２に対してそれぞれ求めた。
＜実施例２＞
　実施例１において、界面活性剤をＤ３１６の代わりにＤ３８２に変更すること以外は実施例１と同様に行い、蛍光シグナル値の増加速度を被検試料Ｎｏ．１およびＮｏ．２に対してそれぞれ求めた。
＜比較例１～７＞
　界面活性剤を実施例１のものから表１に記載したものに変更すること以外は実施例１と同様に行い、蛍光シグナル値の増加速度を被検試料Ｎｏ．１およびＮｏ．２に対してそれぞれ求めた。
（１２）対照キットによる測定
　免疫測定で、当業者により使用されているＥＬＩＳＡキット（Ｐｈａｓｅ　ＳＡＡ　Ａｓｓａｙ(ｃａｔ.ｎｏ.ＴＰ－８０２) : Ｔｒｉｄｅｌｔａ社製　対照キット)を用い、取り扱い説明書に従い、被検試料中の血清アミロイドＡの測定を行い被検試料Ｎｏ．１およびＮｏ．２のＳＡＡ濃度を測定した。被検試料Ｎｏ．１およびＮｏ．２のＳＡＡ濃度は、２０．０μｇ／ｍＬと８０．１μｇ／ｍＬであった。対照キットによるＳＡＡ濃度に対して実施例および比較例で測定した蛍光シグナル値の増加速度をプロットした。結果を図３に示し、評価を表１に示した。評価基準は以下の通りである。
評価基準　
Ａ：ＳＡＡ濃度に対するシグナルの増加が、非常に十分に相関していて、ＳＡＡ濃度の測定が非常に高精度に得られる。
Ｂ：ＳＡＡ濃度に対するシグナルの増加に相関が得られており、ＳＡＡ濃度の測定が実用的に可能である。
Ｃ：ＳＡＡ濃度に対するシグナルの増加幅に相関があるが、ＳＡＡ濃度測定は実用的に不十分である。
Ｄ：ＳＡＡ濃度に対するシグナル増加との相関が得られない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表１の結果から、ＨＬＢ値が１７～２０であり、かつ分子量が１０００以下である非イオン性界面活性剤を用いることで、本発明の効果が発現することが確認された。
＜実施例３＞
（１３）乾燥粒子の作製
　実施例１において、（６）乾燥粒子の作製を終了した乾燥粒子を含むカップに、実施例１の（１１）での被検試料の混合液の作製において使用したＤ３１６を、予め乾燥粒子に加えるため、２．７重量パーセント濃度のＤ３１６水溶液１０μＬを加えて十分に混合し、その後、スーパードライ乾燥機（ＴＯＹＯリビング社、ウルトラスーパードライ００シリーズ）を用いて、１２時間かけて含水量を２５％以下となるまで乾燥させ、引き続き、２５℃５０％ＲＨ（相対湿度）の環境で１５日間保存することで、界面活性剤Ｄ３１６を含む乾燥粒子を作製した。
（１４）蛍光粒子を用いたＳＡＡ粒子の免疫測定
　上記の（１０）で準備した被検試料（ネコの血清）１０μＬと、上記（１１）で使用したＤ３１６の０．３３質量％の生理食塩水溶液９０μＬの代わりに、Ｄ３１６を除いた生理食塩水９０μＬを十分に混合した以外は実施例１と同様にして、被検試料の混合液１０を調製した。次に、（１３）で調製した抗ＳＡＡ抗体標識蛍光粒子を点着し乾燥させたカップに、作製した混合液１０を添加し、１０分間、十分に攪拌した。この混合液１０に含まれる界面活性剤Ｄ３１６の濃度は、０．２７質量％であった。次いて、実施例１と同様にして、流路型センサチップの注入口に蛍光粒子を含む混合液１０を点着し、蛍光強度の単位時間における蛍光シグナル値の増加速度を被検試料Ｎｏ．１、２に対してそれぞれ求めた。実施例１と同じ評価基準で蛍光シグナル値の増加速度を求め、結果を表２に示した。
＜実施例４～６＞
　実施例３の（１３）で調製した乾燥粒子を用いて、（１４）に記載した混合液１０の調製において、生理食塩水による希釈なし（倍率１倍；実施例４）、生理食塩水による希釈が５倍（実施例５）、生理食塩水による希釈が１００倍（実施例６）となるように、被検試料（ネコの血清）と生理食塩水の混合比を適宜変更して被検試料の混合液１１～１３を調製し、実施例３と同様にして流路型センサチップの注入口に点着し、蛍光強度の単位時間における蛍光シグナル値の増加速度を求め、結果を表２に示した。
（１５）検量線の作成
　続いて、北山ラベスから購入した交雑種の血清を使用し、被検物質の濃度が異なる被検試料（検体）Ｎｏ．３～７を用意した。実施例１の（１２）に記載の対照キットによる測定を行ってＳＡＡ濃度を測定したところ、それぞれ２．９μｇ／ｍＬ、５．５μｇ／ｍＬ、６０．８μｇ／ｍＬ、１１１．０μｇ／ｍＬ、１５９．１μｇ／ｍＬであった。この被検試料（検体）Ｎｏ．３～７を用いて、実施例１で使用した流路型センサチップを用いてそれぞれ、被検試料（検体）Ｎｏ．３～７のシグナルを測定し、実施例３～実施例６に対する検量線をそれぞれ作成した。
（１６）多検体相関の測定
　動物病院にて採血された様々な種類のネコ血清５００検体について、実施例３と同様に被検試料である検体の混合液を調製してそれぞれシグナルを測定し、（１５）で作成した検量線からＳＡＡ濃度をそれぞれ算出し、（１２）で記載した対照キットにより測定した既知濃度との相関を評価した結果を「多検体相関」の結果として表２に示した。
＜多検体相関の評価基準＞
Ａ：良好（５００検体の本発明によるＳＡＡ測定値と対照キットの測定によるＳＡＡ測定値との相関プロットの線形近似線の相関係数Ｒが０．９０以上）
Ｂ：比較的良好（５００検体の本発明によるＳＡＡ測定値と対照キットの測定によるＳＡＡ測定値との相関プロットの線形近似線の相関係数Ｒが０．８０以上０．９０未満）
Ｃ：不十分（５００検体の本発明によるＳＡＡ測定値と対照キットの測定によるＳＡＡ測定値との相関プロットの線形近似線の相関係数Ｒが０．８０未満）
　結果を表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表２の結果から、被検試料の生理食塩水による希釈倍率が１倍から１００倍の間では、血清アミロイドＡ濃度に対するシグナルの増加の相関が高い測定が可能となることが分かった。その中で、界面活性剤Ｄ３１６を用いた本発明において、希釈倍率が５倍から１００倍の実施例において、多検体相関の結果が良好であり、様々なＳＡＡ濃度を有する被検試料において、シグナル強度が強くしかも良好なＳＡＡ測定結果が得られることが確認された。
１　センサチップ
２　上部部材
３　中間部材
４　基板
５　第一の容器
６　第二の容器
７　容器群
８　検出領域
９　参照領域
１０　流路

Claims (13)

  1. 血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、（無機性値／有機性値）×１０で定義されるＨＬＢ値が１７～２０であり、かつ分子量が１０００以下である少なくとも一種の非イオン性界面活性剤とを含む、血清アミロイドＡの測定のための試薬キット。
  2. 前記第一の粒子の平均粒径が、７０ｎｍ以上５００ｎｍ以下である、請求項１に記載の試薬キット。
  3. 血清アミロイドＡと特異的な結合性を有しない第二の結合物質により修飾され、かつ標識を有しない第二の粒子をさらに含む、請求項１または２に記載の試薬キット。
  4. 前記第二の粒子の平均粒径が、７０ｎｍ以上５００ｎｍ以下である、請求項３に記載の試薬キット。
  5. 前記標識が、蛍光色素を含む、請求項１から４の何れか一項に記載の試薬キット。
  6. 前記血清アミロイドＡが、ネコ血清またはネコ血漿中の血清アミロイドＡである、請求項１から５の何れか一項に記載の試薬キット。
  7. 前記界面活性剤が、疎水性基を有する単糖類または疎水性基を有する二糖類である、請求項１から６の何れか一項に記載の試薬キット。
  8. 前記第一の結合物質が抗体である、請求項１から７の何れか一項に記載の試薬キット。
  9. 請求項１から８の何れか一項に記載の試薬キットと、血清アミロイドＡまたは前記第一の結合物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質が固定されている第一の金属膜が形成された基板とを含む、血清アミロイドＡのための測定キット。
  10. 前記基板に、血清アミロイドＡと結合性を有さず、前記第一の結合物質と特異的な結合性を有する第四の結合物質が固定された第二の金属膜がさらに形成されている、請求項９に記載の測定キット。
  11. 血清アミロイドＡを含む生体試料と、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、（無機性値／有機性値）×１０で定義されるＨＬＢ値が１７～２０であり、かつ分子量が１０００以下である少なくとも一種の非イオン性界面活性剤と、生理食塩水との混合液を調製する工程；
    血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第三の結合物質が固定されている第一の金属膜が形成された基板の一端の注入口に、前記混合液を添加する工程；
    前記混合液を前記基板上に流下させる工程；および、
    前記第一の金属膜上の標識の情報を取得する工程、
    を含む、生体試料中の血清アミロイドＡの測定方法。
  12. 前記混合液中の前記界面活性剤の濃度が０．０１質量％以上１０質量％以下である、請求項１１に記載の血清アミロイドＡの測定方法。
  13. 前記混合液を調製する工程が、前記生体試料に対して５倍以上希釈された混合液を調製する工程である、請求項１１または１２に記載の血清アミロイドＡの測定方法。
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