JPH0949837A

JPH0949837A - ヒト血清アミロイドａの免疫学的測定試薬

Info

Publication number: JPH0949837A
Application number: JP7224825A
Authority: JP
Inventors: Jiro Nemoto; 二郎根本; Yasuhiro Nomata; 康博野又
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 1995-08-08
Filing date: 1995-08-08
Publication date: 1997-02-18

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明の課題は、炎症等のマーカーとなるヒト
血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）の免疫学的測定試薬を遺伝
子操作によって供給することである。【解決手段】本発明は、ＳＡＡをコードする遺伝子を微
生物を宿主とする発現系で発現させて得られたＳＡＡの
組み換え体（ｒＳＡＡ）を用いたＳＡＡの免疫学的な測
定試薬および測定方法である。本発明におけるｒＳＡＡ
は標準物質として、あるいは抗体調製用の免疫原として
用いる。【効果】本発明は、試薬原料であるＳＡＡを、安全かつ
安価に、安定して供給する。本発明のｒＳＡＡは、遺伝
子発現産物であるにもかかわらず天然のＳＡＡとほぼ同
一の免疫学的性状を備えている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト血清中のアミロイ
ドＡ（以下、ＳＡＡと省略する）に関するものである。
具体的には、遺伝子操作によって得られるＳＡＡの免疫
学的な分析操作への応用に関するものである。ＳＡＡは
ある種のアミロイドーシスにおいて組織に沈着するアミ
ロイド蛋白Ａ（以下、ＡＡ蛋白と省略する）の前駆体蛋
白とされる、分子量約１２０００の血清蛋白である。
（J.Clin.Invest.53:1054-1061,1974）近年になって、
このＳＡＡの血清値がアミロイドーシス以外の炎症性疾
患で上昇することが明らかにされ、鋭敏な炎症マーカー
として評価されている。（臨床検査32:2,P168,1988）Ｓ
ＡＡの定量値を医療現場で有効に活用するには、ＳＡＡ
の分析用試薬の供給が望まれる。そして試薬の供給にあ
たっては、標準や免疫測定用の抗体を作成するためのＳ
ＡＡが必要となる。

【０００２】

【従来技術の問題点】標準品や試薬の調製に必要なＳＡ
Ａは、現在ヒト血清あるいは血漿から精製している。一
般的なＳＡＡの精製操作によれば、ＳＡＡは血清の高比
重リポ蛋白質（以下ＨＤＬと省略する）分画から精製さ
れる。ＳＡＡはＨＤＬとの親和性が強いので、このよう
な精製方法ではＳＡＡ精製物にＨＤＬを構成している他
の蛋白質が混入してしまう可能性を否定できない。混入
した蛋白質は免疫動物に対して免疫抗原として作用し、
結果的に非特異的な抗体の産生につながる可能性が有
る。ＨＤＬを構成している他の蛋白質は血清の中にもと
もと含まれている成分なので、これに対する抗体が試薬
に含まれているとＳＡＡの測定を妨害する恐れが有る。
あらかじめＨＤＬ分画による吸収を行えば測定値への影
響を避けることができるが、製造工程が増えるので好ま
しくない。

【０００３】更にヒト血液をＳＡＡの供給原料とするこ
との最大の問題は、安定供給が困難なことである。ＳＡ
Ａは炎症症状に伴って出現する血漿蛋白であるため、原
料となるヒト血液には安定した供給を望むことができな
い。このような、いわゆる希少蛋白質については、遺伝
子操作によって安定的な供給を実現することが試みられ
る。

【０００４】遺伝子操作によってＳＡＡを得る試みの一
つに、インビトロ発現系の利用が知られている(Biochem
istry.24,2931-2936;1984)。インビトロ発現系において
は蛋白生産に細胞が介在しないことから、発現ベクター
と宿主の選択などを検討するまでもなく簡単に発現産物
を得ることができる。しかしこの発現系はあくまでも実
験室レベルのものであり、量的にもコスト面でも商用ベ
ースへの応用は現実的でない。

【０００５】ＳＡＡについては、動物細胞を宿主として
発現させた報告(J.Biol,Chem.262/32,15790-15795, 198
7)がある。しかし動物細胞の培養は微生物の培養に比べ
て厳しい条件を要求するため、大量生産には不向きであ
る。また培養系に動物血清の添加が必須となることが多
く、培養コストの上昇につながりやすい。

【０００６】これらの不利益を解決する手段として有望
なのが、細菌や酵母のような微生物を宿主とする発現系
である。ＳＡＡ遺伝子の細菌を宿主とする発現系には、
大腸菌ファージＴ７プロモーターを持つベクターを基礎
とするものが知られている(Biochim.Biophysica.Acta.1
226,323-329;1994)。この報告では細菌宿主によってＳ
ＡＡをコードする遺伝子の発現に成功しているが、得ら
れた発現生成物については繊維素形成という生理学的な
活性を確認しているのみである。

【０００７】微生物宿主によるＳＡＡの発現系には、更
に重要な課題が有る。すなわち、得られる発現産物の物
性の問題である。一般に遺伝子操作によって得られる蛋
白質は、アミノ酸配列こそ目的とする蛋白質と同一とな
るものの、この分子を修飾する脂質や糖鎖については完
全な模倣は困難である。このため、各種生理活性や物理
化学的な性状に天然の蛋白質との違いが観察されること
が少なくない。ＳＡＡにおいてはいずれの発現系におい
ても、その発現生成物が物理化学的な性状の面で標準品
や試薬原料としての実用性を備えているのかどうかにつ
いて情報が無いという基本的な問題が存在する。前述の
とおり、ＳＡＡについては動物細胞による発現生成物お
いても情報が不足しているのが現状であり、遺伝子組み
換え生成物による試薬の供給については、まったく見通
しがたっていないといえる。

【０００８】先に述べたとおり、ＳＡＡの定量を行うた
めには標準や免疫原としてのＳＡＡが必要である。ＳＡ
Ａの標準品には、少なくとも各種の分析操作において天
然のＳＡＡと同じ挙動を示すことが要求される。また免
疫原としてのＳＡＡにおいては、特異性に優れる高力価
な抗体を産生しうることが要求される。しかしＳＡＡに
ついては、いまだに試薬原料の供給を可能とする微生物
による安定した発現系は提供されていないのである。こ
のような背景から、各種試薬原料として利用可能な物理
化学的性状を持つ新しいＳＡＡの提供が望まれているの
である。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、免疫学的な
測定を可能とするＳＡＡの標準物質や免疫原を遺伝子操
作によって提供することを課題としている。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明の課題は、遺伝子
操作によって得られたＳＡＡを免疫原、あるいは標準物
質として利用したＳＡＡの免疫学的測定試薬、そして免
疫学的な測定方法によって達成される。

【００１１】本発明の遺伝子操作によって得られたＳＡ
Ａは、ＳＡＡのアミノ酸配列をコードする遺伝子をクロ
ーニングし、適当な宿主−ベクター系に組み込んで発現
させることによって得たものである。宿主としては、培
養が容易なこと、形質が安定していること、そして培養
コストをできるだけ低く抑えられること等の利点を期待
できることから、微生物細胞が好ましい。微生物には酵
母や細菌が一般に利用されている。本発明においては細
菌、特に大腸菌がベクターの供給の点で有利である。一
方ＳＡＡをコードする遺伝子を組み込むベクターについ
ては、宿主に対して毒性の強い蛋白の発現に有用なｐＥ
Ｔ２１等が好ましい。これらのベクターに公知の方法(B
iochemistry 24:2931-2936,1985)でクローニングしたＳ
ＡＡのアミノ酸配列をコードする遺伝子を組み込みこん
で大腸菌に導入すれば、ＳＡＡのアミノ酸配列を持つ蛋
白を発現可能である。

【００１２】培養物中に蓄積した発現産物は、必要に応
じて細胞構造を超音波処理等によって破壊し、更にグア
ニジンや尿素のような可溶化剤の助けを借りて溶解する
ことで上清として回収できる。この上清を透析し、更に
イムノアフィニティクロマトグラフィー、ゲルろ過、イ
オン交換クロマトグラフィー等による精製を行えば本発
明による新規なＳＡＡを高度に純粋な形で回収すること
ができる。回収した遺伝子発現産物としてのＳＡＡ（以
下ｒＳＡＡと省略する）は、当然のことながら血清から
精製したＳＡＡと同じアミノ酸配列（配列１）を持って
いる。無論発現時にイニシエーションコドンであるATG
に対応するメチオニンがプロセシングされないでＮ末端
に残ることがあるが、このようなメチオニン残基の付加
は同一とみなすものとする。

【００１３】そして本発明のｒＳＡＡはアミノ酸配列が
同じであるのみならず、天然のＳＡＡを免疫することに
よって得た従来の抗体と十分な反応性を備え、標準品と
して利用することができる。標準品とする時には、本発
明のｒＳＡＡを適当な界面活性剤に溶解することによっ
て濃度を調節して提供することができる。界面活性剤水
溶液とすることにより、血清中のＳＡＡ濃度を調整した
従来の標準品よりもはるかに容易に供給することが可能
なうえ、ヒト血液によって媒介される感染症のチェック
や不活化が不要な安全な組成物とすることができる。

【００１４】ところでＳＡＡの大部分は、血清中でＨＤ
Ｌと会合した状態で存在していることが知られている。
したがって界面活性剤水溶液の状態では血清中での存在
形体と異なっていることになる。にもかかわらず、本発
明によるｒＳＡＡは、実施例で確認するとおりＨＤＬの
有無にかかわらず天然のＳＡＡとほぼ同等の反応性を示
す。この特徴によって、本発明は界面活性剤溶液による
標準品の提供を可能としている。同時にＨＤＬを構成す
る他の蛋白質を実質的に含まない状態で精製することが
容易なため、免疫原として用いたときにＨＤＬを構成す
る他の蛋白質に対する抗体を誘導する恐れが無く、特異
性の高い抗体の調製に貢献するものである。

【００１５】あるいはもしも血清中での存在形体と条件
を揃える必要が有れば、本発明によるｒＳＡＡを必要に
応じて精製ＨＤＬやＨＤＬを含有する血清と混合してや
れば良い。このときのＨＤＬ、あるいはＨＤＬ含有血清
は、ヒトに由来するものでなくてもよい。すなわちウサ
ギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、あるいはウシ等に由来するも
のであってもなんら支障は無い。動物血清を用いれば、
経済的に有利であるし、ヒト血液を材料とする場合に比
べてヒトの感染性病原体が混入する可能性も低い。

【００１６】本発明のｒＳＡＡを標準物質としてＳＡＡ
を免疫学的に測定するには、まずあらかじめ濃度のわか
っているｒＳＡＡを測定して得られる測定値を基に検量
線を用意しておく。そして同じ反応条件で濃度が未知で
ある試料の測定を行って得られる測定値を、このあらか
じめ用意した検量線にあてはめて濃度を求める。なお標
準物質とするｒＳＡＡの濃度は、公知の一次標準（特開
平４−２５４７６０）を基準として検定しておくと良
い。

【００１７】本発明によるｒＳＡＡは、標準品としての
利用の他、免疫原に応用した場合にも天然のＳＡＡとほ
ぼ同様の結果を与える。したがって本発明によるｒＳＡ
Ａは、自身が標準としての用途を持つのみならず、免疫
原として応用することによってＳＡＡの免疫学的な測定
試薬のための抗体を提供するものである。こうして得ら
れる抗体は、酵素標識や固相に結合させることによって
ＥＬＩＳＡ用の試薬となり、また適当な増感剤と組合せ
ることによって免疫比濁分析（ＴＩＡ）用の試薬とする
こともできる。更にラテックスのような不活性粒子担体
に感作することによって、免疫学的粒子凝集反応用試薬
とすることが可能である。

【００１８】本発明のｒＳＡＡを免疫原とするときに、
その抗原性を高めるために様々な技術を応用することが
できる。フロイントのコンプリート・アジュバント（以
下、ＦＣＡと省略する）は免疫原性を高めるために必要
な成分の一つである。このほか人型結核菌と混合して免
疫原とする、あるいは百日咳トキソイドやこれを含む３
混ワクチン等と組み合せて免疫原とする方法を併用する
のが有効である。本発明の免疫原によって、ポリクロー
ナル抗体のみならずモノクローナル抗体を提供できるこ
とは言うまでもない。

【００１９】

【発明の効果】本発明によって、従来はヒト血液を原料
とせざるをえなかったＳＡＡを、遺伝子組み換えによっ
て容易に得ることができる。遺伝子組み換え技術を採用
したことにより、安全性の高いＳＡＡを安定して供給す
ることができる。本発明の最大の利点は、遺伝子操作に
よって得たｒＳＡＡであるのにもかかわらず、血液から
精製した天然のＳＡＡとほぼ等しい物理化学的性状を備
えていることである。この特徴によって、本発明による
ｒＳＡＡは、標準品や各種試薬原料等としての幅広い用
途に応用することが可能となったのである。しかも血清
から精製したもののようにＨＤＬを構成している他の蛋
白質が混入する恐れが無く、免疫原として用いたときに
特異性の向上に貢献する。以下実施例により本発明を更
に詳細に説明する。

【００２０】

【実施例】

１．ＳＡＡ発現株の樹立１−１．ＰＣＲ用プライマーの合成ＳＡＡをコードする遺伝子をＰＣＲ増幅するために、次
の配列を持つプライマーを固相ホスファイト法で合成し
た。なおベクターのクローニングサイトに合わせてプラ
イマーの５’側にはNdeIサイトを、同じく３’側にはBa
mHIサイトを導入してあり、それぞれの認識配列を[]で
囲んだ。５’側プライマー：５’−GTAGTTCAGGT[CATATG]CGAAGCTTCTTTTCGTTCCTTG−
３’ ３’側プライマー：５’−GACA[GGATCC]GAGGAAGCTCAGTATTTCTCAG−３’

【００２１】１−２．ＰＣＲ増幅ＳＡＡをコードするｃＤＮＡを増幅するために、１−１
に示したプライマーと、ヒト肝組織のｃＤＮＡライブラ
リーのテンプレートとを用いて、９４℃１分、６３℃１
分、７２℃１分のサイクルで３０サイクルＰＣＲ増幅し
た。増幅されたＤＮＡ断片は、２%アガロースゲル電気
泳動によりおよそ３５０bpであることが確認され、さら
に各制限酵素によるマッピングを試みたところ、公知の
ヒトＳＡＡをコードするＤＮＡ配列（J.Biol.Chem.262:
15790-15795(1987)）と一致することが確認された。

【００２２】１−３．ヒトＳＡＡ蛋白発現ベクターの構
築１−２で増幅したＤＮＡ断片をNdeI、BamHI（宝酒造
製）で消化後、アンピシリン耐性遺伝子を有するプラス
ミドベクターｐＥＴ２１−ａ（＋）のNdeI/BamHIサイト
に連結した。

【００２３】１−４．発現株の樹立得られたプラスミドベクターを、塩化ルビジウム法によ
りコンピテント化した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙ
ｓＳに導入し形質転換させた。アンピシリン（１２５
μg/ml）を含むＬＢ寒天培地に培養することにより形質
転換された菌を選択後、プラスミドを精製しｐＥＴ２１
よりも高分子量のプラスミドを持つ菌株を選別し、さら
に抗ＳＡＡ抗体と反応する分子量１２０００の蛋白を発
現する株を選択した。発現蛋白のアミノ酸配列を調べ、
公知のＳＡＡ１−αのＮ末に開始コドン由来のメチオニ
ンが１残基付加された配列番号１に示す配列を持つこと
を確認した。発現樹立株（ＰＥＴ−ＳＡＡ１−ＢＬ２
１）は、特許寄託センターに受託番号ＦＥＲＭＰ−１
４７７８として寄託されている。なお本明細書において
は次のようなアミノ酸の略号を利用する。アラニン A or Ala アルギニン R or Arg アスパラギン N or Asn アスパラギン酸 D or Asp システイン C or Cys グルタミン Q or Gln グルタミン酸 E or Glu グリシン G or Gly ヒスチジン H or His イソロイシン I or Ile ロイシン L or Leu リジン K or Lys メチオニン M or Met フェニルアラニン F or Phe プロリン P or Pro セリン S or Ser トレオニン T or Thr トリプトファン W or Trp チロシン Y or Tyr バリン V or Val

【００２４】ここで用いたｐＥＴ２１はＴ７ファージプ
ロモーターを含む形質転換用ベクターで、宿主大腸菌に
より供給されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより組み込ん
だ遺伝子の転写が開始される。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
遺伝子は、 Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside
（ＩＰＴＧ）を培養液に添加することで初めて誘導され
るので、遺伝子の転写をＩＰＴＧにより制御することが
できる。ＳＡＡのように難溶性の物質の発現は宿主に対
して毒性を示すため一般的には十分な発現量を期待でき
ないが、このように遺伝子の転写をコントロールすれば
菌体量が十分に増えた段階で発現を誘導できるので結果
として発現産物が増加する。

【００２５】１−５．ｒＳＡＡの発現１−４で得た大腸菌ＰＥＴ−ＳＡＡ１−ＢＬ２１株をカ
ルベニシリン（５００μg/ml）を含む３００mlのＬＢ培
地に接種し３７℃で培養した。６００ｎｍにおける吸光
度が０．６〜０．９の時点で、１ｍＭとなるようにＩＰ
ＴＧを加えてさらに３０分後、２００μg/mlになるよう
にリファンピシンを加え、３時間から６時間培養後、遠
心により沈殿物として回収した。またリファンピシン添
加により、発現ＳＡＡが宿主に及ぼす溶菌作用を押さえ
ることができ、リファンピシン無添加に比べ回収量は著
しく増大している。

【００２６】１−６．精製沈殿物をグアニジン緩衝液（４M塩酸グアニジン、０．
０２５mMトリス−塩酸、ｐＨ８．６）に分散後超音波処
理により菌体の破砕とｒＳＡＡの可溶化を行った。可溶
化したサンプルはアフィニティーバッファー（０．５M
ＮａＣｌ、２mMＥＤＴＡ、０．０１M トリス塩酸・
ｐＨ８．２、０．１% Ｔｗｅｅｎ２０）に透析し、遠
心分離により上清を分取後、抗ＳＡＡ抗体を吸着させた
セファロース４Ｂアフィニティーカラムに通し吸着後、
溶出緩衝液（０．５M ＮａＣｌ、２mM ＥＤＴＡ、
０．０１M トリス塩酸・ｐＨ８．２、０．１% Ｔｗｅ
ｅｎ２０、３M ＫＳＣＮ）で溶出させ、溶出分画をグ
アニジン緩衝液で透析後Sephacryl Ｓ−３００カラムに
アプライし分子量の違いで分離した。分離した分画につ
いてディスク電気泳動を行ったところほぼ純粋な状態で
分離されていることが確認された。最終的に、３００ml
の培養物からおよそ２mgのｒＳＡＡを回収した。

【００２７】２．抗体１で得たｒＳＡＡ（２mg/ml生理食塩水）をヒト型結核
死菌４mg/mlを加えたＦＣＡと等量混合し、じゅうぶん
に乳化させた後に１mlを家兎の四肢に免疫した。同時に
百日咳ワクチンを後足基部に筋注した。免疫は２週間ご
とに行った。４ヶ月後に一部採血して得られる抗血清に
ついて、ｒＳＡＡに対する反応性をオクテロニー法によ
って確認した。高い抗体価が確認された個体の抗血清を
４０%硫安分画してＩｇＧを回収し、ＰＢＳに対して透
析し本発明による抗ＳＡＡ抗体（１０mg/ml）を得た。

【００２８】３．抗体による試薬の調製２で得た抗ＳＡＡ抗体（１０mg/ml）をポリスチレンラ
テックス（平均粒径０．１０９μm）に３７℃で１時間
物理吸着させた後、０．１MのＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄
し、最終的にラテックス濃度０．４%となるように分散
媒（１%ＢＳＡを含む０．１MのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ
７．４）に懸濁させてＳＡＡラテックス凝集反応用試薬
（以下単に乳液と呼ぶ）を得た。比較のため、ＨＤＬ分
画から公知の方法により精製したＳＡＡで免疫して得ら
れた従来の抗ＳＡＡ抗体（特開平４−２５４７６０）に
ついても同じ操作によって試薬（乳液Ｂ）を調製した。

【００２９】４．試薬と各種ＳＡＡとの反応性３で得た乳液Ａと乳液Ｂを、各種ＳＡＡと混合して反応
性を比較した。ＳＡＡとしては、ＳＡＡ濃度既知のヒト
血清、このヒト血清と同じＳＡＡ濃度としたヒト血清か
ら精製したＳＡＡ（正常血清で希釈）、そして本発明の
ｒＳＡＡ（正常血清で希釈）を用意した。操作は次のと
おりである。試料５０μlに試薬を３００μl加えて３７
℃で約３分間反応させた。この間の免疫学的凝集反応に
基づく５８５nmにおける吸光度変化量を測定した。

【００３０】その結果、乳液Ａに対する各種ＳＡＡの反
応性はほぼ同一であり、本発明によるｒＳＡＡを原料と
する免疫学的測定試薬が天然のＳＡＡに対しても同じ様
に反応していることが確認された。一方従来の方法によ
って得られた乳液Ｂに対しても、ほぼ同じ測定値を得る
ことができ従来の技術で得られた試薬に対して本発明の
ｒＳＡＡが天然のＳＡＡと同じ反応性を示すことを確認
した。

【００３１】５．ｒＳＡＡによる標準品本発明のｒＳＡＡを血清ではなく界面活性剤溶液とし、
標準品として利用できることを確認した。本発明のｒＳ
ＡＡを０．００２%の非イオン系界面活性剤ポリオキシ
エチレンアルキルエーテル（旭電化工業製「アデカトー
ルＳＯ−１４５」、商品名）を含むＨＥＰＥＳ緩衝液に
溶解した。同じ緩衝液で段階希釈したものを試料とし、
先に調製した乳液Ａ、ならびに乳液Ｂとの反応性を観察
した。対照として同じＳＡＡ濃度を持つ血清、およびｒ
ＳＡＡを正常ヒト血清に添加したものを用いた。結果は
図１−４に示した。本発明によるｒＳＡＡと血清、ある
いはｒＳＡＡを血清に添加したものでは、傾きが若干相
違するもののパラレルな反応性を示すことが確認され
た。希釈曲線が異なる形を示す場合には標準とすること
が困難であるが、傾きの相違は標準品としての性能には
影響しない。したがって本発明のｒＳＡＡが標準品とし
て有用であることが立証された。

【配列表】配列番号：１配列の長さ：１０５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源：ヒト他の情報：ヒト血清アミロイドＡ配列 Met Arg Ser Phe Phe Ser Phe Leu Gly Glu Ala Phe Asp Gly Ala 1 5 10 15 Arg Asp Met Trp Arg Ala Tyr Ser Asp Met Arg Glu Ala Asn Tyr 20 25 30 Ile Gly Ser Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala 35 40 45 Ala Lys Arg Gly Pro Gly Gly Val Trp Ala Ala Glu Ala Ile Ser 50 55 60 Asp Ala Arg Glu Asn Ile Gln Arg Phe Phe Gly His Gly Ala Glu 65 70 75 Asp Ser Leu Ala Asp Gln Ala Ala Asn Glu Trp Gly Arg Ser Gly 80 85 90 Lys Asp Pro Asn His Phe Arg Pro Ala Gly Leu Pro Glu Lys Tyr 95 100 105

【図面の簡単な説明】

【図１】乳液Ａによって得た標準曲線。●はｒＳＡＡ添
加正常ヒト血清、○はＳＡＡ含有ヒト血清による標準で
ある。図中、縦軸は６６０nmにおける散乱光変化量、横
軸はＳＡＡ濃度（μg/ml）を示す。

【図２】乳液Ａによって得た標準曲線。●はｒＳＡＡ界
面活性剤溶液、○はＳＡＡ含有ヒト血清による標準であ
る。図中、縦軸は６６０nmにおける散乱光変化量、横軸
はＳＡＡ濃度（μg/ml）を示す。

【図３】乳液Ｂによって得た標準曲線。●はｒＳＡＡ添
加正常ヒト血清、○はＳＡＡ含有ヒト血清による標準で
ある。図中、縦軸は６６０nmにおける散乱光変化量、横
軸はＳＡＡ濃度（μg/ml）を示す。

【図４】乳液Ｂによって得た標準曲線。●はｒＳＡＡ界
面活性剤溶液、○はＳＡＡ含有ヒト血清による標準であ
る。図中、縦軸は６６０nmにおける散乱光変化量、横軸
はＳＡＡ濃度（μg/ml）を示す。

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【手続補正書】

【提出日】平成７年９月２６日

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】抗体として、遺伝子組み換えによって得ら
れたヒト血清アミロイドＡを免疫原に用いて調製した抗
体を含む、ヒト血清アミロイドＡの免疫学的測定試薬
【請求項２】抗体が、遺伝子組み換えによって得られた
ヒト血清アミロイドにアジュバントとして結核菌菌体と
百日咳毒素を組み合わせて免疫したものである請求項１
の免疫学的測定試薬
【請求項３】抗体が不溶性担体粒子に感作されたもので
ある請求項１の免疫学的測定用試薬
【請求項４】抗体が遊離の状態で存在し、かつ免疫学的
な反応の場に免疫複合体形成に基づく不溶性沈降物の生
成を促進する反応増強剤を供給する試薬と組み合わされ
ている請求項１の免疫学的測定用試薬
【請求項５】標準物質として遺伝子組み換えによって得
られたヒト血清アミロイドＡを含む、ヒト血清アミロイ
ドＡの免疫学的測定試薬
【請求項６】標準物質が、更に高比重リポ蛋白質を含む
請求項５の免疫学的測定試薬
【請求項７】標準物質が、ヒト血清アミロイドＡと高比
重リポ蛋白質の他に血清成分を含まないものである請求
項５または６の免疫学的測定試薬
【請求項８】標準物質が、界面活性剤と緩衝成分を含む
請求項５−７のいずれかの免疫学的測定試薬
【請求項９】標準物質が、血清を媒質とするものである
請求項５または６の免疫学的測定試薬
【請求項１０】遺伝子組み換えによって得られたヒト血
清アミロイドＡが、ヒト血清アミロイドＡをコードする
ＤＮＡを、大腸菌ファージＴ７プロモーター、およびプ
ロモーター活性の調節が可能なオペレーターまたはその
機能性部分と結合した血清アミロイドＡ発現ベクターの
発現生成物である請求項１に記載の免疫学的測定試薬
【請求項１１】ベクターが受託番号ＦＥＲＭＰ−１４
７７８として特許寄託センターに寄託された大腸菌が保
有するプラスミドである請求項１０の免疫学的測定試薬
【請求項１２】抗体として、遺伝子組み換えによって得
られたヒト血清アミロイドＡを免疫原に用いて調製した
抗体を利用する、ヒト血清アミロイドＡの免疫学的測定
方法
【請求項１３】免疫学的測定方法が、免疫学的粒子凝集
法または免疫比濁法である請求項１２の免疫学的測定方
法
【請求項１４】標準物質として遺伝子組み換えによって
得られたヒト血清アミロイドＡを用いる、ヒト血清アミ
ロイドＡの免疫学的測定方法
【請求項１５】遺伝子組み換えによって得られたヒト血
清アミロイドＡからなる、ヒト血清アミロイドＡの抗体
調製用免疫原