JP2023011689A - 生体高分子の精製のための超分子高アフィニティタンパク質結合系 - Google Patents

Abstract

【課題】免疫両親媒性物質を利用した抗体またはＦｃ融合タンパク質の精製方法を提供する。【解決手段】特定の実施形態において、本発明は、潜在的に簡単で費用効率の高い手段を使用する新規の抗体精製方法および系を提供する。いくつかの実施形態では、黄色ブドウ球菌プロテインＡ由来のカスタマイズされたＺ３３を使用して、水溶液中で集合して表面に生物活性エピトープを有する免疫繊維になり、ＩｇＧ結合能力を有する免疫両親媒性分子を構築する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照

本出願は、２０１７年３月３０日に提出された国際特許出願第６２／４７８，８８６号
の利益を主張し、これは、本明細書に完全に記載されているかのように、あらゆる目的で
参照により本明細書に組み込まれる。

（電子的に提出された資料の参照による組み込み）
本出願には、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で送信された配列表が含まれてお
り、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１８年３月２０日に作成された
前記ＡＳＣＩＩの複写は、Ｐ１４１６２－０２＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられ、サイズ
は１，０１６バイトである。

合成または天然のペプチドおよびそれらの誘導体の自己集合によって形成された超分子
一次元（１Ｄ）ナノ構造について、再生医療、薬物送達、および診断学におけるそれらの
重要な応用のために、過去３０年間で急速に関心が高まっている^１－１０。例えば、Ｓｔ
ｕｐｐ研究所は、生理的条件下で超分子ナノ繊維に自己集合することができるβシート形
成配列に直鎖炭化水素を結合させることにより、一連のペプチド両親媒性物質（ＰＡ）を
設計および合成した。^{２、１１－１６}ＰＡ集合体に望ましい生物活性を持たせて生物学と
関連させるために、細胞接着モチーフＲＧＤや神経突起促進配列ＩＫＶＡＶ（配列番号２
）などのさまざまな生物活性エピトープが分子設計に組み込まれている。^{１３、１７－２
０}一例では、Ｗｅｂｂｅｒらは、骨髄単核細胞（ＢＭＮＣ）の表面治療送達にＲＧＤＳ（
配列番号３）エピトープを表示する生物活性ＰＡナノ繊維を調査し、生物学的接着の強化
を示唆した。^１４自己集合ペプチドモチーフのＣ末端またはＮ末端のいずれかに対する生
物活性ペプチドのこの直接配置は、特定の生物医学的応用における生物活性材料を作製す
るための一般的な戦略になっている。ペプチド集合体の免疫原性を調整するために、Ｃｏ
ｌｌｉｅｒと共同研究者らは自己集合ペプチドＱ１１を抗原ＯＶＡペプチドに共有結合さ
せ、結果として生じる超分子ＯＶＡ－Ｑ１１ナノ繊維では免疫原性が強化されていること
を発見した。^２１

高アフィニティ抗体結合粒子および材料について、生物学的治療薬に対するモノクロー
ナル抗体の需要の増加により、製薬業界で急速に関心が高まっている。^{２２－２４}プロテ
インＡは、よく知られた抗体結合リガンドであり、ヒトを含むほとんどの哺乳動物種のＩ
ｇＧのＦｃ部分に特異的に結合する能力を持っている。^{２５－２６}しかしながら、プロテ
インＡの大きなサイズによりその工業的応用が制限されているため、多くのプロテインＡ
の合成ならびに最小化ドメインが設計および研究されている。^{２７－２９}プロテインＡの
Ｚドメインは５９アミノ酸残基を持つ最初で最も有名な合成ドメインであり、ＩｇＧ１に
結合する場合、Ｋ_ｄは～１０ｎＭである。^{３０－３１}プロテインＡのＺドメインをさらに
最小化するために、結合アフィニティを大幅に変化させることなく２ヘリックス誘導体Ｚ
３３が設計された（Ｋ_ｄ＝４３ｎＭ）。^２７高アフィニティリガンドが同定されているが
、所望の基質にリガンドを提示する方法は、抗体精製プロセスにも同様に不可欠である。
製薬業界では、抗体精製は主に、高い選択性を備えた抗体結合リガンド（例えば、プロテ
インＡ）の固定化に基づくアフィニティクロマトグラフィーに依存しているが、高いクロ
マトグラフィー媒体コストと限られた捕捉生産性とに悩まされている。^{３２－３４}アフィ
ニティ沈殿が、効果的な精製と比較的簡単なプロセスを使用して潜在的にボトルネックを
解消するバッチスループットとを提供することにより従来のクロマトグラフィー法の魅力
的な代替法になったのは、つい最近のことである。^{３５－３８}

アフィニティ沈殿の典型的な例は、エラスチン様タンパク質（ＥＬＰ）融合Ｚドメイン
を使用して、温度および塩が誘発するＥＬＰの溶解度遷移によりＩｇＧを沈殿させる。^{３
９－４０}しかしながら、細菌によって発現される大量のＥＬＰ、各ＥＬＰ融合リガンドの
限定された結合部位、および高温での抗体の潜在的な変性は、抗体結合リガンドを提示す
る新しい基質を発見する関心を促す。

自己集合ペプチド両親媒性物質の見事な分子設計から着想を得て、本発明者らは、プロ
テインＡ模倣ペプチドＺ３３を自己集合免疫両親媒性物質（ＩＡ）に組み込む方法を調査
し、自己集合状態での標的抗体への結合能力を調査した。自己集合免疫繊維（ＩＦ）と治
療用ＩｇＧ間の結合アフィニティは、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）を使用して調査され、
ＩＦを含むＺ３３が高いＩｇＧ結合アフィニティを維持することが示唆された。

多くの１次元（１Ｄ）ナノ構造は、結果として生じる集合体の方向性、方向異方性成長
を促進する分子間水素結合に不可欠なコアビルディングモチーフとして短いβシート配列
を含むペプチドまたはペプチド複合体の自己集合によって構築される。この分子設計戦略
は、細胞とのインターフェイスのための生理活性糸状βシート集合体の過剰生産に成功し
たが、アミロイドフィブリルを連想させる潜在的な毒性に関連する懸念は、α－ヘリック
スペプチドを用いる他の超分子作製戦略を促進している。

これまでに、生物活性ペプチドを、それらの生物活性を維持しながら超分子ペプチドナ
ノ構造にうまく組み込むことができることを実証した研究が数多く文献にあった。しかし
ながら、エピトープが生理活性であるためにα－ヘリックス構造を保持しなければならな
い場合、β－シート形成配列の使用とα－ヘリックスモチーフの提示との間に間隔の非両
立性の問題があるようである。これに関連して、本発明者らは、２つのα－ヘリックスを
含むモチーフであるプロテインＡ模倣ペプチドＺ３３を直鎖炭化水素に直接結合させ、モ
ノクローナル抗体に対して高い結合アフィニティを有する２つの自己集合免疫両親媒性物
質が作製されることを示し、これらの発明の超分子免疫繊維（ＩＦ）がモノクローナル抗
体免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の沈殿と精製に利用され得ることを初めて実証した。

いくつかの実施形態によれば、本発明は、アミノ酸配列ＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨ
ＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＫＩＫＳＩＲＤＤ（配列番号１）を有し、２つのα－ヘリックス
を含むモチーフである黄色ブドウ球菌のプロテインＡ模倣ペプチドＺ３３を直鎖炭化水素
へ直接結合させ、自己集合免疫両親媒性物質を作製することを含む。結果は、得られた両
親媒性ペプチドが、必須のβシートセグメントを欠いているにも関わらず、生理学的条件
下で、天然のα－ヘリックス構造を維持しながら超分子免疫繊維（ＩＦ）に効果的に結合
することができることを示す。等温滴定熱量測定により、これらの自己集合免疫繊維はｐ
Ｈ ７．４では高い特異性で免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体に結合することができるが
、溶出緩衝液ｐＨ ２．８では検出可能な結合は生じないことが確認された。

いくつかのさらなる実施形態によれば、本発明のＩＦは、標的ＩｇＧ抗体の沈殿および
精製を可能にするｐＨ依存性特異的結合を有することが実証された。

したがって、いくつかの実施形態では、タンパク質結合ペプチドの繊維状集合体への超
分子工学は、効果的なタンパク質精製に有用である。

一実施形態によれば、本発明は、直鎖炭化水素鎖に結合した抗体結合ペプチドを含む免
疫両親媒性物質を提供する。

一実施形態によれば、本発明は、直鎖炭化水素鎖に結合した抗体結合ペプチドを含む免
疫両親媒性物質を提供し、ペプチドは生理的ｐＨの水溶液中にあるときにα－ヘリックス
構造を取る。

一実施形態によれば、本発明は、直鎖炭化水素鎖に結合した抗体結合ペプチドを含む免
疫両親媒性物質であって、抗体結合ペプチドが黄色ブドウ球菌のプロテインＡのＺ３３ペ
プチドの親水性アミノ酸配列、またはその機能的部分もしくは断片もしくは誘導体を有す
る免疫両親媒性物質を提供する。

別の実施形態によれば、本発明は、直鎖炭化水素鎖に結合した抗体結合ペプチドを含む
免疫両親媒性物質であって、抗体結合ペプチドがアミノ酸配列ＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡ
ＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＫＩＫＳＩＲＤＤ（配列番号１）、またはその機能的部分も
しくは断片もしくは誘導体を有する免疫両親媒性物質を提供する。

別の実施形態によれば、本発明は、以下の工程を含む、抗体またはＦｃ融合タンパク質
の精製方法を提供する：ａ）免疫両親媒性物質を生理的ｐＨの水溶液に溶解させ、一晩熟
成させて免疫繊維（ＩＦ）に自己集合させる工程；ｂ）抗体またはＦｃ融合タンパク質を
含む試料をＩＦと混合し、ＩＦを抗体またはＦｃ融合タンパク質のＦｃ部分に結合させ、
溶液中に免疫繊維－抗体複合体または免疫繊維－Ｆｃ融合タンパク質複合体を形成させる
工程；ｃ）塩を加えて遠心分離することにより、免疫繊維－抗体複合体または免疫繊維－
Ｆｃ融合タンパク質複合体を溶液から分離する工程；ならびにｄ）ＩＦを抗体またはＦｃ
融合タンパク質から解離させ、未結合の抗体またはＦｃ融合タンパク質を収集する工程。
例えば、ｐＨを溶出条件に下げることおよび濾過または精密濾過により、ＩＦを抗体また
はＦｃ融合タンパク質から分離することができる。

（１Ａ）ＩｇＧのＦｃ部分に結合するＺ３３ペプチドの概略図。（１Ｂ）Ｃ１２－Ｚ３３および２Ｃ８－Ｚ３３の配列。アルキル基とＺ３３は、それぞれ黄色と青色の斜線部分で示されている。Ｚ３３ペプチドの２つのαヘリックスには下線が引かれている。（１Ｃ）Ｒ－Ｚ３３ ＩＦの自己集合およびＩＦとＩｇＧとの結合の概略図。 （Ａ）Ｃ１２－Ｚ３３の自己集合の概略図。（Ｂ）Ｚ３３ペプチドおよびＺ３３－Ｃ１２のそれぞれｐＨ ７．４および２．８での正規化ＣＤスペクトル。Ｃ１２－Ｚ３３のｐＨ ７．４（Ｃ、Ｄ）および２．８（Ｅ、Ｆ）でのＴＥＭ特性評価。ＴＥＭ試料は、ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）およびＩｇＧ溶出緩衝液（ｐＨ ２．８）で個別に１００μＭの濃度で調製した。ＴＥＭ試料は、２ｗｔ％酢酸ウラニルでネガティブ染色した。 １５℃の以下の２μＭ ＩｇＧ１溶液中への１００μＭＣ１２－Ｚ３３の滴定のＩＴＣプロファイル：（Ａ）ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ ７．４、および（Ｂ）ＩｇＧ溶出緩衝液、ｐＨ ２．８。１００μＭの（Ｃ）Ｚ３３および（Ｄ）Ｃ１２－ＳＺ３３の、１５℃、ｐＨ ７．４のＰＢＳ中の２μＭ ＩｇＧ１への滴定のＩＴＣプロファイル。 （Ａ）直径１６．８±１．５ｎｍのｐＨ ７．４のＰＢＳおよび（Ｂ）直径１７．３±１．９ｎｍのｐＨ ２．８のＩｇＧ溶出緩衝液中の２Ｃ８－Ｚ３３のＴＥＭ特性評価。ＴＥＭ試料の調製は、Ｃ１２－Ｚ３３の調製と同様であった。（Ｃ）ｐＨ ７．４のＰＢＳ中の１００μＭ ２Ｃ８－Ｚ３３の正規化ＣＤスペクトルは、α－ヘリックスの二次構造を示した。以下の２μＭ ＩｇＧ１溶液中への１００μＭの２Ｃ８－Ｚ３３の滴定のＩＴＣプロファイル：（Ｄ）ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ ７．４および（Ｅ）ＩｇＧ溶出緩衝液、ｐＨ ２．８中。 ０．６Ｍ Ｎａ_２ＳＯ_４溶液によって引き起こされるＩＦ－ＩｇＧ複合体の沈殿の概略図。（Ｂ）０．６Ｍ Ｎａ_２ＳＯ_４の（ｉ）添加前および（ｉｉ）添加後のＣ１２－Ｚ３３の５ｍＭ ＰＢＳ溶液ならびに（ｉｉｉ）５ｍＭ Ｃ１２－Ｚ３３、（ｉｖ）０．６Ｍ Ｎａ_２ＳＯ_４、および（ｖ）５ｍＭ Ｃ１２－Ｚ３３と０．６Ｍ Ｎａ_２ＳＯ_４とを含むＩｇＧ１の２０μＭ ＰＢＳ溶液の写真。（ｉｉ）と（ｖ）とで沈殿が観察された。（Ｃ）０．６Ｍ Ｎａ_２ＳＯ_４の添加前後のＣ１２－Ｚ３３およびＩｇＧ１＋Ｃ１２－Ｚ３３複合体の吸光度スペクトル。純ＩｇＧ１の上澄は、ＩｇＧ１＋Ｃ１２－Ｚ３３の上澄からＣ１２－Ｚ３３の上澄を引いたものに由来する。（Ｄ）０．６Ｍ Ｎａ_２ＳＯ_４の添加前後の２ｍＭ Ｃ１２－ＳＺ３３およびＩｇＧ１＋Ｃ１２－ＳＺ３３複合体の吸光度スペクトル。 ＰＢＳ、ｐＨ ７．４中でのＩｇＧコーティングＡｕナノ粒子とのインキュベーション後の（Ａ、Ｃ）１００μＭ Ｃ１２－Ｚ３３および（Ｂ、Ｄ）１００μＭ Ｃ１２－ＳＺ３３のＴＥＭ画像。ＩｇＧ濃度：０．３３－０．６６μＭ。 Ｃ１２－Ｚ３３のＣＭＣ測定。一連の濃度のＣ１２－Ｚ３３とインキュベートした後にＦｌｕｏｒｏｌｏｇ蛍光光度計（Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ、エジソン、ニュージャージー州）でモニターしたレポーター色素ナイルレッドの発光スペクトル。励起波長は５６０ｎｍに固定した；５８０～７２０ｎｍで発光スペクトルをモニターした。Ｃ１２－Ｚ３３のＣＭＣは、発光極大のブルーシフトによって決定され、遷移は、集合ナノ構造の疎水性コンパートメントへの色素の分配を示す。本明細書に示されている全てのスペクトルは、発光極大によって正規化されている。Ｃ１２－Ｚ３３のＣＭＣ範囲：２－５μＭ。 ＲＢ－Ｃ１２－Ｚ３３のＲＰ－ＨＰＬＣ（８Ａ）およびＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ（８Ｂ）特性評価。ＲＰ－ＨＰＬＣスペクトルにより、生成物の純度が確認される（＞９９％）。予想される質量は４８３８．５である。４８４０．２のピークは［Ｍ＋Ｈ］＋に相当する。 ＰＢＳ、ｐＨ ７．４中での１００μＭの（９Ａ）Ｃ１２－ＳＺ３３および（９Ｃ）ＲＢ－Ｃ１２－Ｚ３３のＴＥＭ画像。両方の分子は、それぞれ直径１１．５±１．５ｎｍおよび１３．８±１．８ｎｍのナノ繊維に自己集合した。ｐＨ ７．４のＰＢＳ中での１００μＭの（９Ｂ）Ｃ１２－ＳＺ３３および（９Ｄ）ＲＢ－Ｃ１２－Ｚ３３ナノ繊維の正規化ＣＤスペクトルは、それぞれβシートおよびαヘリックス構造を示した。 ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）中で２μＭ ＦＩＴＣ－ＩｇＧとインキュベートした１００μＭ ＲＢ－Ｃ１２－Ｚ３３の共焦点蛍光画像は、ローダミンＢの蛍光シグナルとＦＩＴＣの蛍光シグナルの共局在を示している。（Ａ）ローダミンＢ蛍光の画像。（Ｂ）ＦＩＴＣ蛍光の画像、および（Ｃ）（Ａ）と（Ｂ）との合成画像。スケールバー：２０μｍ。

ブドウ球菌プロテインＡ（ＳＰＡ）は、黄色ブドウ球菌の細胞壁に元々見られるタンパ
ク質である。３ヘリックスバンドルに折り畳まれている５つの相同ドメインで構成されて
いる。プロテインＡは、ヒトを含むほとんどの哺乳動物種の免疫グロブリンＧ（別名Ｉｇ
Ｇ）のＦｃ部分に特異的に結合するため、免疫学で重要な役割を果たす。プロテインＡの
広範な構造的および生化学的研究が実施されている。ＳＰＡをコードする最初の遺伝子は
、１９８４年にクローン化、配列決定、および発現され、プロテインＡに基づく多数の合
成および最小化されたＩｇＧ結合ドメインが続いた。このうち、Ｚ－５８ドメインは、ア
フィニティクロマトグラフィーおよびアフィニティ沈殿で広く使用される最初で最も有名
な合成ドメインである。別の最小化された結合ドメインＺ－３３が、分子の機能を大きく
変えることなく、１９９６年に得られた。

いくつかの実施形態によれば、本発明は、ＳＰＡの抗体結合ドメインのアミノ酸配列を
修飾および／または誘導体化してＩＦのビルディングユニットとして働く免疫両親媒性物
質にする方法を提供する。本明細書に記載されるのは、ＩｇＧ抗体またはその部分もしく
は断片の結合に有用なＩＦの設計および作成の例である。生理的ｐＨ範囲の水溶液で免疫
繊維が形成されると、表面に提示される露出した生理活性エピトープ（結合部位）は、Ｉ
ｇＧに特異的に結合することができる。

一実施形態によれば、本発明は、直鎖炭化水素鎖に結合した抗体結合ペプチドを含む免
疫両親媒性物質を提供する。

一実施形態によれば、本発明は、直鎖炭化水素鎖に結合した抗体結合ペプチドを含む免
疫両親媒性物質を提供し、免疫両親媒性物質は、生理的ｐＨの水溶液中にあるときにα－
ヘリックス構造を有する。

一実施形態によれば、本発明は、直鎖炭化水素鎖に結合した抗体結合ペプチドを含む免
疫両親媒性物質であって、抗体結合ペプチドが黄色ブドウ球菌のプロテインＡのＺ３３ペ
プチドの親水性アミノ酸配列、またはその機能的部分もしくは断片もしくは誘導体を有す
る免疫両親媒性物質を提供する。

別の実施形態によれば、本発明は、直鎖炭化水素鎖に結合した抗体結合ペプチドを含む
免疫両親媒性物質であって、抗体結合ペプチドがアミノ酸配列ＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡ
ＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＫＩＫＳＩＲＤＤ（配列番号１）、またはその機能的部分も
しくは断片もしくは誘導体を有する免疫両親媒性物質を提供する。

本明細書で使用される場合、「免疫両親媒性物質」という用語は、「免疫繊維」と呼ば
れる個々の安定した超分子ナノ構造に自発的に会合することができる分子を意味する。一
般的に、ＩＦは、約２．８～約７．５のｐＨ範囲で集合することができる。しかしながら
、結合特性はｐＨにも依存する。より正に帯電したＩＦは、より高いｐＨの溶液で会合し
やすく、逆に、負に帯電したＩＦは、より低いｐＨの溶液中で会合しやすくなる。

いくつかの実施形態では、親水性ペプチドは、８～２２個の炭素を有する炭化水素尾部
に結合しており、直線状であるか、分岐していてもよい。水溶液への溶解性を考慮すると
、炭素数には上限がある。親水性ペプチドは、ナノ構造の水溶性を高め、円柱状または球
状ミセル、中空ナノチューブ、トロイド、ディスクおよびベシクルを含むが、これらに限
定されない明確なナノ構造アーキテクチャの形成を、好ましい二次構造形成、例えばベー
タシート、アルファヘリックス、ポリプロリンタイプＩＩヘリックス、ベータターンを通
じて促進することができる。

本明細書で使用する場合、「抗体結合ペプチド」という用語は、抗体または抗体分子の
特定の部分、例えばＦｃ部分に高い特異性で結合する能力を有する、例えば約１０^－６Ｍ
～約１０^－１０ＭのＫ_ｄを有するペプチドを意味する。

いくつかの実施形態では、抗体結合ペプチドは、黄色ブドウ球菌のプロテインＡのＺド
メインの２ヘリックス誘導体ペプチドＺ３３の親水性アミノ酸配列、またはその機能的部
分もしくは断片もしくは誘導体である。

本明細書で使用される場合、プロテインＡのＺ３３ペプチドは、ＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹ
ＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＫＩＫＳＩＲＤＤ（配列番号１）のアミノ酸配列を有す
る。

「アミノ酸」という用語には、天然のα－アミノ酸の残基（例えば、Ａｌａ、Ａｒｇ、
Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、
Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌ）のＤまたは
Ｌ型、ならびにβ－アミノ酸、合成および非天然アミノ酸が含まれる。多くのタイプのア
ミノ酸残基がポリペプチドに有用であり、本発明は天然の遺伝的にコードされたアミノ酸
に限定されない。本明細書に記載のペプチドに利用することができるアミノ酸の例は、例
えば、Ｆａｓｍａｎ， １９８９， ＣＲＣ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ
ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃ
ＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ、およびその中に引用されている参考文献に見出すことがで
きる。幅広いアミノ酸残基の別の供給源は、ＲＳＰ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ＬＬＣの
Ｗｅｂサイトで提供されている。

本明細書における「誘導体」への言及には、本発明の発明的抗体結合ペプチドの部位、
断片、および部分が含まれる。誘導体には、単一もしくは複数のアミノ酸の置換、欠失、
および／または付加も含まれる。相同体には、同じ種のヘビから、またはヘビの同じ属も
しくはファミリーからの毒液からの機能的、構造的または立体化学的に類似したペプチド
が含まれる。そのような相同体は全て、本発明によって企図される。

類似体および模倣物には、非天然アミノ酸を含む分子、またはアミノ酸を含まないがそ
れでもペプチドと機能的に同じように振る舞う分子を含む分子が含まれる。天然物のスク
リーニングは、類似体および模倣物を特定するための有用な戦略の１つである。

ペプチド合成中に非天然アミノ酸および誘導体を組み込む例には、ノルロイシン、４－
アミノ酪酸、４－アミノ－３－ヒドロキシ－５－フェニルペンタン酸、６－アミノヘキサ
ン酸、ｔ－ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、
４－アミノ－３－ヒドロキシ－６－メチルヘプタン酸、２－チエニルアラニンおよび／ま
たはアミノ酸のＤ－異性体の使用が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で企図
される既知の非天然アミノ酸の部分的なリストを表１に示す。

表１：非天然アミノ酸

本明細書で企図される対象ペプチドの類似体には、ペプチド合成中の側鎖への修飾、非
天然アミノ酸および／またはそれらの誘導体の組み込み、および架橋剤の使用、ならびに
ペプチド分子またはそれらの類似体に立体構造上の制約を課す他の方法が含まれる。

本発明により意図される側鎖修飾の例には以下が含まれる：アルデヒドとの反応による
還元的アルキル化とそれに続くＮａＢＨ_４での還元などによるアミノ基の修飾；メチルア
セトイミデートによるアミジン化；無水酢酸によるアシル化；シアン酸塩によるアミノ基
のカルバモイル化；２、４、６－トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミ
ノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸およびテトラヒドロ無水フタル酸によるアミ
ノ基のアシル化；リジンのピリドキサール－５－リン酸によるピリドキシル化とそれに続
くＮａＢＨ_４による還元。

アルギニン残基のグアニジン基は、２，３－ブタンジオン、フェニルグリオキサールお
よびグリオキサールなどの試薬との複素環縮合生成物の形成により修飾され得る。

カルボキシル基は、Ｏ－アシルイソ尿素形成を介したカルボジイミド活性化とそれに続
く、例えば対応するアミドへのその後の誘導体化により修飾され得る。

スルフヒドリル基は、以下などの方法で修飾され得る：ヨード酢酸またはヨードアセト
アミドによるカルボキシメチル化；システイン酸への過ギ酸酸化；他のチオール化合物と
の混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの
反応；４－クロロメルクリ安息香酸、４－クロロメルクリフェニルフェニルスルホン酸、
塩化フェニル水銀、２－クロロメルクリ－４－ニトロフェノールおよびその他の水銀を使
用した水銀誘導体の形成；アルカリ性ｐＨでのシアン酸塩によるカルバモイル化。

トリプトファン残基は、例えば、Ｎ－ブロモスクシンイミドによる酸化または２－ヒド
ロキシ－５－ニトロベンジルブロミドまたはハロゲン化スルフェニルによるインドール環
のアルキル化によって修飾され得る。一方、チロシン残基は、テトラニトロメタンによる
ニトロ化により変更され、３－ニトロチロシン誘導体を形成し得る。

ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化または
ジエチルピロカルボネートによるＮ－カルボエトキシル化によって達成され得る。

架橋剤を使用して、例えば３Ｄ構造を安定化することができ、ｎ＝１～ｎ＝６の（ＣＨ
_２）_ｎスペーサー基を持つ二官能性イミドエステルなどのホモ二官能性架橋剤、グルタル
アルデヒド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、および通常Ｎ－ヒドロキシスクシ
ンイミドなどのアミノ反応性部分と、マレイミドまたはジチオ部位（ＳＨ）またはカルボ
ジイミド（ＣＯＯＨ）などの別の基特異的反応性部位とを含むヘテロ二官能性試薬を使用
する。さらに、ペプチドは以下によって立体構造的に制約され得る：例えば、Ｃ_αおよび
Ｎ_α－メチルアミノ酸の取り込み、アミノ酸のＣ_αおよびＣ_β原子間の二重結合の導入、
ならびにＮおよびＣ末端間、２つの側鎖間、または側鎖およびＮもしくはＣ末端間のアミ
ド結合の形成などの共有結合を導入することによる環状ペプチドまたは類似体の形成。

本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、長さが４～１００アミノ酸残基、好
ましくは長さが約１０～８０残基、より好ましくは長さが１５～６５残基の配列を含み、
ここで、１つのアミノ酸のα－カルボキシル基は、隣接するアミノ酸の主鎖（αまたはβ
）アミノ基にアミド結合によって結合されている。

いくつかの他の実施形態によれば、例えばダイアフィルトレーションなどのいくつかの
ろ過方法を使用して、結合した抗体から免疫繊維を分離することができる。

いくつかの実施形態によれば、一般に、本発明は、試料中の抗体またはＦｃ融合タンパ
ク質を生理学的ｐＨの水溶液中で本発明の免疫繊維と混合することにより、抗体またはＦ
ｃ融合タンパク質を精製する方法を提供し、免疫繊維が抗体またはＦｃ融合タンパク質の
Ｆｃ部分に結合することができるようにする。いくつかの実施形態では、免疫繊維はプロ
テインＡのＺ３３部分を含み、抗体のＦｃ部分に特異的である。しばらくして免疫繊維が
結合することができるようになると、免疫繊維は溶液中に免疫繊維－抗体または免疫繊維
－Ｆｃ融合タンパク質複合体を形成する。次いで、形成された複合体を、例えば塩誘導沈
殿および遠心分離を含む多くの既知分離手段により、試料中の非結合免疫繊維および抗体
またはＦｃ融合タンパク質ならびに他の成分から分離することができる。分離された複合
体は、酸性ｐＨの別の溶液に導入され、免疫繊維は抗体またはＦｃ融合タンパク質に対す
る結合アフィニティを失う。次いで、ダイアフィルトレーションまたは他の手段などの濾
過により、抗体またはＦｃ融合タンパク質を解離した免疫繊維から分離することができ、
解離したモノマーも同様に除去することができる。

本明細書で使用される「試料」という用語は、本発明の免疫繊維を使用して結合するこ
とができる目的の抗体または目的のＦｃ融合タンパク質を含む任意の試料または溶液もし
くは液体もしくは混合物を意味する。いくつかの実施形態では、試料は生体試料であり得
る。例えば、試料には、例えば、細胞培養物、細胞溶解物、および清澄化バルク（例えば
、清澄化細胞培養上澄）が含まれる。場合により、試料は、目的の抗体またはＦｃ融合タ
ンパク質を発現する宿主細胞または生物から（自然にまたは組換え的に）産生される。例
えば、細胞培養物中の細胞には、目的の抗体またはＦｃ融合タンパク質をコードする核酸
を含む発現構成体でトランスフェクトされた宿主細胞が含まれる。これらの宿主細胞は、
細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、または好ましくは培養で増殖された動物細胞であり得る
。細菌宿主細胞には大腸菌細胞が含まれるが、これに限定されない。適切な大腸菌株の例
には以下が含まれる：ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＧＭ２９２９、ＪＭ１０９、ＫＷ２５１、
ＮＭ５３８、ＮＭ５３９、および外来ＤＮＡを切断できない任意の大腸菌株。使用され得
る真菌宿主細胞には、サッカロマイセス・セレビシエ、ピキア・パストリスおよびアスペ
ルギルス細胞が含まれるが、これらに限定されない。使用され得る昆虫細胞には、カイコ
ガ、ヨトウガ、ツマジロクサヨトウ、イラクサギンウワバ、キイロショウジョウバエが含
まれるが、これらに限定されない。多くの哺乳類細胞株が適切な宿主細胞であり、例えば
、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＴＭ４、ＶＥＲＯ０７６、ＤＸＢ１１、ＭＤＣＫ、Ｂ
ＲＬ－３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ Ｇ２、ＭＭＴ、ＭＲＣ ５、ＦＳ４、ＣＨＯ、２９３Ｔ
、Ａ４３１、３Ｔ３、ＣＶ－１、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２、Ｃｏｌｏ２０５、２９３、ＨｅＬ
ａ、Ｌ細胞、ＢＨＫ、ＨＬ－６０、ＦＲｈＬ－２、Ｕ９３７、ＨａＫ、Ｊｕｒｋａｔ細胞
、Ｒａｔ２、ＢａＦ３、３２Ｄ、ＦＤＣＰ－１、ＰＣ１２、Ｍ１ｘ、マウス骨髄腫（例え
ば、ＳＰ２／０およびＮＳ０）およびＣ２Ｃ１２細胞、ならびに形質転換霊長類細胞株、
ハイブリドーマ、正常な二倍体細胞、および初代組織と初代外植体のｉｎ ｖｉｔｒｏ培
養から得られた細胞株が含まれる。

本発明の１つ以上の実施形態によれば、「生体試料」または「生体液」という用語は、
生存患者もしくは以前に生存していた患者または哺乳動物または培養細胞からの物質の任
意量を含むが、これらに限定されないことが理解される。そのような物質には、血液、血
清、血漿、尿、細胞、臓器、組織、骨、骨髄、リンパ、リンパ節、滑膜組織、軟骨細胞、
滑膜マクロファージ、内皮細胞、皮膚、細胞培養、細胞溶解物、および清澄化バルク（例
えば、清澄化細胞培養上澄）が含まれるが、これらに限定されない。

本発明のある特定の実施形態では、本発明を使用して精製されたタンパク質は抗体であ
る。「抗体」という用語は、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、
ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体断片、イムノア
ドヘシンおよび抗体－イムノアドヘシンキメラを包含する最も広い意味で使用される。

「抗体断片」には、少なくとも抗体のＦｃ部分、および典型的にはその抗原結合または
可変領域が含まれる。

「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同質な抗体の集団から得られる抗体で
あって、集団を構成する個々の抗体が、少量で存在する可能性のある自然発生突然変異を
除いて同一であるような抗体を指す従来の意味で使用される。モノクローナル抗体は非常
に特異的であり、単一抗原部位指向性である。これは、典型的には抗原の様々な決定基（
エピトープ）に対して指向性である多様な抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照
的であるが、モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して指向性である。抗体の
説明における「モノクローナル」という用語は、抗体の実質的に同質な集団から得られる
という抗体の特性を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈される
べきではない。例えば、本発明で使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ
ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５ （１９７５）によって最初に記載された従
来のハイブリドーマ技術を使用して産生することができ、または組換えＤＮＡ法を使用し
て作製することができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照）。モ
ノクローナル抗体は、例えば以下に記載されている技術を使用して、ファージ抗体ライブ
ラリーから分離することもできる：Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ
３５２：６２４－６２８ （１９９１）； Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ
． Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１－５９７ （１９９１）；ならびに米国特許第５，２２
３，４０９； ５，４０３，４８４； ５，５７１，６９８； ５，４２７，９０８ ５
，５８０，７１７； ５，９６９，１０８； ６，１７２，１９７； ５，８８５，７９
３； ６，５２１，４０４； ６，５４４，７３１； ６，５５５，３１３； ６，５８
２，９１５； および６，５９３，０８１号明細書）。

本明細書に記載のモノクローナル抗体には、「キメラ」および「ヒト化」抗体が含まれ
、その重鎖および／または軽鎖の一部は、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラ
スもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である一方、鎖（単
数または複数）の残りの部分は、所望の生物活性を示す限り、別の種に由来するか、また
は別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにそのような抗体の断片の対
応する配列と同一または相同である（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒ
ｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ
８１：６８５１－６８５５ （１９８４））。非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化
」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの
場合、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの超
可変領域残基は、望ましい特異性、アフィニティ、および容量を有するマウス、ラット、
ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域残基に置き換え
られている。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残
基は、対応する非ヒト残基に置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体
にもドナー抗体にも見られない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体の性能をさら
に向上させるために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つ
の実質的に全ての可変ドメインを含み、全てまたは実質的に全ての超可変ループは非ヒト
免疫グロブリンのものに対応し、全てまたは実質的に全てのＦＲ領域はヒト免疫グロブリ
ン配列のものである。ヒト化抗体は、任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的
にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も含む。詳細については、Ｊｏｎｅ
ｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５ （１９８６）； Ｒｉｅ
ｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９ （１９８８）
； およびＰｒｅｓｔａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２：５
９３－５９６ （１９９２）を参照。

本明細書に記載されるモノクローナル抗体には「ヒト」抗体も含まれ、これは、例えば
ヒト患者の血液またはトランスジェニック動物を使用して組換えにより調製されたものな
ど、様々な供給源から単離することができる。そのようなトランスジェニック動物の例に
は、ヒト重鎖トランス遺伝子およびヒト軽鎖トランス染色体を有するＫＭ－ＭＯＵＳＥ（
登録商標）（（Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｉｎｃ．、プリンストン、ニュージャージー州）（ＷＯ
０２／４３４７８を参照）、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）（Ａｂｇｅｎｉｘ、Ｉｎ
ｃ．、フレモント、カリフォルニア州；例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらに対する米
国特許第５，９３９，５９８； ６，０７５，１８１； ６，１１４，５９８； ６，１
５０，５８４および６，１６２，９６３号明細書に記載）、およびＨＵＭＡＢ－ＭＯＵＳ
Ｅ（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｉｎｃ ．；例えば、以下に記載されている：Ｔａｙ
ｌｏｒ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ ２０：６２８７－６２９５； Ｃｈｅｎ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９９３
） Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５： ６４７－６５６； Ｔ
ｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：３７２０－３７２４； Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ． （１９９３
） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４：１１７－１２３； Ｃｈｅｎ， Ｊ． ｅｔ
ａｌ． （１９９３） ＥＭＢＯ Ｊ． １２： ８２１－８３０； Ｔｕａｉｌｌｏ
ｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：２９１２－２９２
０； Ｔａｙｌｏｒ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６： ５７９－５９１； ａｎｄ Ｆｉｓｈｗｉｌｄ， Ｄ
． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：
８４５－８５１、米国特許５，５４５，８０６； ５，５６９，８２５； ５，６２５
，１２６； ５，６３３，４２５； ５，７８９，６５０； ５，８７７，３９７； ５
，６６１，０１６； ５，８１４，３１８； ５，８７４，２９９； ａｎｄ ５，７７
０，４２９； ５，５４５，８０７；およびＫｏｒｍａｎらに対するＰＣＴ公開番号ＷＯ
９２／０３９１８， ＷＯ ９３／１２２２７， ＷＯ ９４／２５５８５， ＷＯ
９７／１３８５２， ＷＯ ９８／２４８８４ ａｎｄ ＷＯ ９９／４５９６２， Ｗ
Ｏ ０１／１４４２４）。本発明のヒトモノクローナル抗体は、免疫時にヒト抗体応答が
生成されるように、ヒト免疫細胞が再構成されたＳＣＩＤマウスを使用して調製すること
もできる。そのようなマウスは、例えば、Ｗｉｌｓｏｎらの米国特許第５，４７６，９９
６および５，６９８，７６７号明細書に記載されている。

材料。全てのＦｍｏｃアミノ酸および樹脂をＡｄｖａｎｃｅｄ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ
Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＡＡＰＰＴＥＣ、ルイビ
ル、ケンタッキー州、ＵＸＳＡ）から購入し、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）をＮｏｖａ
ｂｉｏｃｈｅｍ（サンディエゴ、カリフォルニア州、ＵＳＡ）から入手した。治療用ヒト
ＩｇＧ１（ＩｇＧ１）をＢｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ（ボストン、マサチ
ューセッツ州、ＵＳＡ）から入手し、ＩｇＧ溶出緩衝液をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ロックフォード、イリノイ州、ＵＳＡ）から調達した。全ての他
の試薬をＶＷＲ（ラドナー、ペンシルベニア州、ＵＳＡ）から入手し、さらなる精製なし
でそのまま使用した。

分子合成。Ｃ１２－Ｚ３３および２Ｃ８－Ｚ３３免疫両親媒性物質を、同様の方法を使
用して合成した。簡単に説明すると、Ｚ３３ペプチドを最初に、標準的な９－フルオレニ
ルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相合成プロトコルを使用して、Ｆｏｃｕｓ ＸＣ自
動ペプチド合成機（ＡＡＰＰＴＥＣ、ルイビル、ケンタッキー州）で合成した。次に、Ｃ
１２（または２Ｃ８）アルキル鎖を、Ｚ３３ペプチドのＮ末端（Ｆｍｏｃ除去後）で、Ｚ
３３ペプチドに対してラウリン酸（またはオクタン酸）／ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡを４（また
は８）：４：６の比率で手動でカップリングさせ、室温で一晩振とうした。Ｆｍｏｃ脱保
護を、ＤＭＦ溶液中の２０％４－メチルピペリジンを使用して１０分間実行し、もう１回
繰り返した。全ての場合において、遊離アミンのニンヒドリン試験（Ａｎａｓｐｅｃ Ｉ
ｎｃ．、フレモント、カリフォルニア州）によって反応をモニターした。完成したペプチ
ドを、２．５時間、９２．５：５：２．５の比率のＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ_２Ｏの混合物を使
用して、固体支持体から切断した。過剰のＴＦＡを回転蒸発により除去し、冷ジエチルエ
ーテルを加えてクルードペプチドを沈殿させた。遠心分離法により、沈殿したペプチドと
ジエチルエーテルを６０００ｒｐｍで３分間分離した。ペプチドをジエチルエーテルでさ
らに２回洗浄し、溶液を遠心分離により除去した。

ＩＡを、２５°ＣでＶａｒｉａｎポリマーカラム（ＰＬＲＰ－Ｓ、１００Å、１０μｍ
、１５０×２５ｍｍ）を使用する分取ＲＰ－ＨＰＬＣで、フラクションコレクターを備え
たＶａｒｉａｎ ＰｒｏＳｔａｒ Ｍｏｄｅｌ ３２５分取ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サンタクララ、カリフォルニア州）において精製した。０．
１％ｖ／ｖ ＴＦＡを含む水／アセトニトリル勾配を、２０ｍｌ／分の流速で溶離液とし
て使用した。Ｚ３３ペプチドセグメントの吸光度ピークを２２０ｎｍでモニターした。ク
ルード物質を２０ｍｌの０．１％ＴＦＡ水溶液に溶解し、各精製実験を１０ｍｌ注入で実
施した。収集した画分をＭＡＬＤＩ－ＴｏＦ分析し（ＢｒｕｋｅｒＡｕｔｏｆｌｅｘ Ｉ
ＩＩ ＭＡＬＤＩ－ＴｏＦ機器、ビレリカ、マサチューセッツ州）、および所望の生成物
を含むものを凍結乾燥し（ＦｒｅｅＺｏｎｅ －１０５℃ ４．５Ｌ凍結乾燥機、Ｌａｂ
ｃｏｎｃｏ、カンザスシティ、ミズーリ州）、－３０℃で保存した。

免疫両親媒性物質の自己集合およびＴＥＭイメージング。１ｍＭ濃度の免疫両親媒性物
質をＨＦＩＰで前処理した後、１×ＰＢＳまたは脱イオン水に溶解し、室温で一晩熟成さ
せた；１０倍希釈した試料１０μｌを４００平方メッシュのカーボンフィルム銅グリッド
（ＥＭＳ：Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから）にスポッ
トし、フィルター紙で過剰分を除去し、グリッド上に試料の薄膜を残した。試料を５分間
乾燥させた後、１０μｌの２％酢酸ウラニルを試料グリッドに加え、３０秒後に過剰分を
除去した。全ての試料を、ＴＥＭイメージングの少なくとも３時間前に乾燥させた。

円偏光二色性分光法（ＣＤ）。両方の自己集合試料のＣＤ実験を、Ｊａｓｃｏ Ｊ－７
１０分光偏光計（ＪＡＳＣＯ、イーストン、メリーランド州、ＵＳＡ）において、１ｍｍ
経路長の石英ＵＶ－Ｖｉｓ吸収セル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
、ピッツバーグ、ペンシルベニア州、ＵＳＡ）を使用して２５℃で実施した。試料を、実
験前に１ｍＭストック溶液から１×ＰＢＳ中１００μＭに即座に希釈した。３回のスキャ
ンの平均として、１９０～２８０ｎｍの波長範囲でスペクトルを収集した。溶媒のバック
グラウンドスペクトルを取得し、試料スペクトルから差し引いた。収集したデータを、試
料濃度について正規化した。

ＩＴＣ実験。高精度ＶＰ－ＩＴＣ滴定熱量測定システム（Ｍｉｃｒｏｃａｌ Ｉｎｃ．
）を使用して、等温滴定熱量測定実験を実施した。ＩｇＧ１溶液を、１５℃の１×ＰＢＳ
（ｐＨ ７．４または２．８）中の免疫両親媒性物質で滴定した。ＩｇＧ１濃度を、０．
１％（１ｍｇ／ｍｌ）ＩｇＧ溶液の２８０ｎｍでの質量吸光係数１．４を使用して計算し
た。免疫両親媒性物質の濃度を、全窒素アッセイによって決定した（Ａｎａｌ． Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．， ６１．２ （１９７４）： ６２３－６２７）。各注入後に発生する熱を
、熱量測定信号の積分から得た。免疫両親媒性物質のＩｇＧ１への会合に伴う熱を、希釈
熱を差し引くことにより得た。データの分析を、ＭｉｃｒｏＣａｌ ＯｒｉｇｉｎＴＭパ
ッケージを使用して実行した。

（実施例１）
全長Ｚ３３免疫両親媒性物質の分子設計。ペプチド両親媒性物質、ペプチド－ポリマー
複合体、ペプチド薬物複合体などのこの両親媒性ペプチド複合体の構築を広く使用して、
様々な超分子ナノ構造が作製されている。親水性Ｚ３３ペプチド配列（ＦＮＭＱＱＱＲＲ
ＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＫＩＫＳＩＲＤＤ）（配列番号１）および疎水性ア
ルキル鎖からなるＩｇＧ結合免疫両親媒性物質を、免疫繊維（ＩＦ）のビルディングモチ
ーフとして機能するように設計した。Ｚ３３ペプチドは、高い結合アフィニティ（Ｋ_ｄ＝
４３ｎＭ）でＩｇＧのＦｃ部分に特異的に結合するプロテインＡの２ヘリックス誘導体（
図１Ａ）である。^{２８、４１－４２}

２つのＩＡ、Ｃ１２－Ｚ３３および２Ｃ８－Ｚ３３（図１Ｂ）は、ラウリン酸部位（Ｃ
１２）、または２つのオクタン酸部位（２Ｃ８）をＺ３３ペプチドのＮ末端に直接結合さ
せることにより合成した。図１Ｃに示されているように、ＩＡは自己集合してＩＦになり
、抗体混合液からＩｇＧに特異的に結合することが期待されていた。純粋なＺ３３ペプチ
ドも合成し、Ｚ３３分子およびＺ３３含有ＩＦの生物活性を比較した。別の対照分子Ｃ１
２－ＳＺ３３は、Ｃ１２をＺ３３のＮ末端にスクランブル配列で結合させることにより設
計した。全ての分子は、自動固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）方法およびＲＰ－ＨＰＬＣを
使用して合成および精製した。合成化合物の純度および予想される分子量を、分析ＨＰＬ
Ｃおよび質量分析を使用して確認した。

（実施例２）
全長Ｚ３３免疫両親媒性物質の実施形態の分子自己集合および特性評価。２つのＩＡの
自己集合は、２工程の操作で簡単に実現できる。まず、ＩＡをヘキサフルオロイソプロパ
ノール（ＨＦＩＰ）で個別に前処理し、溶解度と自己集合形態の均一性とに影響を与え得
る既存のナノ構造を除去した。次に、ＨＦＩＰを蒸発により除去した後、脱イオン水また
はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を添加し、最終濃度を１ｍＭにした。疎水性相互作用
によってＩＦのコアにトラップされたアルキルセグメントで形成されたＩＦと、溶媒に面
したシェルに提示される生理活性Ｚ３３配列（図２Ａ）。室温で一晩熟成した後、透過型
電子顕微鏡（ＴＥＭ）および円偏光二色性（ＣＤ）を使用して、集合ナノ構造の形態を特
性評価した。

本発明のＩｇＧ精製方法におけるｐＨ条件の重要な役割を考慮して、ｐＨ変動に応じた
Ｃ１２－Ｚ３３の自己集合挙動を評価した。一般的に、中性ｐＨは結合条件として通常使
用され、一方で酸性ｐＨはプロテインＡアフィニティカラムから抗体を溶出するために使
用される。^{３２、３４}中性および低ｐＨでの自己集合挙動を研究するために、ＰＢＳ（ｐ
Ｈ ７．４）およびＩｇＧ溶出緩衝液（ｐＨ ２．８）を、Ｃ１２－Ｚ３３の自己集合の
水性環境として利用した。異なるｐＨでのＣ１２－Ｚ３３ ＩＦの形態を、ＴＥＭ（図２
Ｃ～２Ｆ）およびＣＤ（図２Ｂ）で調べた。Ｃ１２－Ｚ３３分子は、上記の両方のｐＨ条
件でよく溶解し、ナノ繊維に自己集合することができるとわかった。Ｃ１２－Ｚ３３溶液
１００μＭからの代表的なＴＥＭ画像は、Ｃ１２－Ｚ３３が生理学的条件と酸性条件の両
方において、完全に伸長したペプチド分子の長さより小さい値（βシート構造で約２２．
５ｎｍ）である直径１６．０±１．７ｎｍのナノ繊維構造に自己集合したことを明らかに
した。ナノ繊維の長さはマイクロメートルスケールで示され、うまく制御できなかった。
自己集合構造内の分子パッキングをさらに理解するため、円偏光二色性（ＣＤ）を使用し
てペプチドの二次構造を試験した。Ｃ１２－Ｚ３３では２２２ｎｍ（ｎ－π^＊）および２
０８ｎｍ（π－π^＊）付近に強い負の信号が観察され、自己集合状態でのＺ３３セグメン
トのαヘリックス二次構造の形成が示唆され、純粋なＺ３３ペプチドで示された通りであ
った。ＣＤスペクトルとＩＦの測定された直径に基づいて、ＩＦにパッキングするときに
ペプチドはそのαヘリックス二次構造を維持すると推測するのが合理的である。ＰＢＳ溶
液またはＩｇＧ溶出緩衝液中のＣ１２－Ｚ３３のＣＤスペクトルは、部分的なαヘリック
ス信号のみを維持していたが、同じ緩衝液中のＺ３３ペプチドと比較して、２２２ｎｍお
よび２０８ｎｍ付近の２つの負のピークの楕円率が変化したことは注目に値する。ＣＤス
ペクトルのシフトは、Ｚ３３セグメントの分子パッキングをその遊離状態から変更するこ
とができるＩＦの形成に起因する可能性があり、その結果、結合部位に必要な特定の構造
のためにＩｇＧへの結合アフィニティに影響を与える可能性がある。

（実施例３）
ＩＦの結合アフィニティを測定するためのＩＴＣ実験。ＩＦへの組み込み後のＺ３３ペ
プチドの二次構造の構造変化を考慮すると、Ｃ１２－Ｚ３３ ＩＦの形成が元のＺ３３ペ
プチドに存在するＩｇＧ結合能力に影響するかどうかを知ることに大きな関心が寄せられ
る。自己集合Ｃ１２－Ｚ３３ ＩＦの結合アフィニティを調べるために、ＩｇＧ１への結
合の熱力学的特性を等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）で調べた。ＩＴＣは、多くのタンパク質
およびリガンド間の結合事象をモニターするために広く採用されており、^{４３－４５}これ
は、Ｃ１２－Ｚ３３ ＩＦおよびＩｇＧ１間に結合が発生するかどうかを調べる優れた方
法である。^{４６－４７}結合反応に関連する熱を段階的な注入中に記録し、熱力学的解離定
数（Ｋ_ｄ）、モルエンタルピー変化（ΔＨ°）、および化学量論（Ｎ）を含む熱力学的パ
ラメーターを直接取得することができる。^４４

テーブル１．ｐＨ ７．４のリン酸緩衝生理食塩水中１５℃でＺ３３ベースのリガンドが
ＩｇＧ１に結合するための熱力学的パラメーター。データはリガンドごとに報告される。

テーブル２．ｐＨ ７．４のリン酸緩衝生理食塩水中１５℃でＺ３３ベースのリガンドが
ＩｇＧ１に結合するための熱力学的パラメーター。データはＩｇＧ１ごとに報告される。

典型的なＩＴＣ実験では、ＰＢＳ緩衝液中の１００μＭ Ｃ１２－Ｚ３３の溶液を一晩
熟成させ、１５℃、ｐＨ ７．４の同じ緩衝液中の２μＭ ＩｇＧ１の溶液に注入した。
典型的なサーモグラムと結合等温線を図３Ａに示し、リガンドごとに報告された熱力学的
パラメーターをテーブル１にまとめる。ＩｇＧ１へのＣ１２－Ｚ３３ ＩＦの結合のＩＴ
Ｃ結果は、６５０のＫ_ｄを特徴とするエンタルピー駆動結合事象を明らかにした。Ｃ１２
－Ｚ３３ ＩＦの結合効率をさらに比較して、本発明者らは、表面プラズモン共鳴で測定
した４３ｎＭのＫ_ｄでＩｇＧ１にしっかりと結合することが証明されたＺ３３ペプチドを
合成した。Ｚ３３ペプチドのＩｇＧ１への結合特性を、ＩＴＣによりｐＨ ７．４のＰＢ
Ｓ中１５℃で測定し、典型的なサーモグラムと結合等温線を図３Ｃに示した。１００倍良
好なアフィニティに加えて、Ｚ３３の化学量論は２．３であったが、Ｃ１２－Ｚ３３の見
掛けの化学量論は３．１であり、ＩＦの全てのＣ１２－Ｚ３３をＩｇＧ１分子への結合に
利用することができるわけではないことが示された。ＩｇＧ１に結合することができるＣ
１２－Ｚ３３分子の効率は、Ｚ３３の化学量論をＣ１２－Ｚ３３の化学量論で割ることに
より、７４．２％と見積もることができる。

リガンドごとの正規化により、結合の見かけの化学量論の決定が可能になるが、テーブ
ル２に示すように、ＩｇＧのモルあたりの正規化後に熱力学的パラメーターの比較を行う
必要がある。Ｚ３３のＩｇＧへの結合は、大きくて不利なエントロピー変化とは対照的に
、大きくて有利なエンタルピーによって特徴付けられた。エンタルピーおよびエントロピ
ー変化の規模は小さかったが、Ｃ１２－Ｚ３３の結合の熱力学的特性は類似していた。Ｃ
１２－Ｚ３３はＺ３３よりも不利ではないエントロピーで結合するが、有利なエンタルピ
ーの損失はさらに大きく、全体的に低い結合アフィニティをもたらす。有利な結合エンタ
ルピーの全体的な損失は、ＩＦの崩壊に関連する不利なエンタルピーによって引き起こさ
れる可能性がある。ＩＦの制限により、ＩｇＧ１との好ましい相互作用が制限される可能
性もある。Ｃ１２－Ｚ３３によるＩｇＧ１の滴定を、１５℃のＩｇＧ溶出緩衝液（ｐＨ
２．８）でも行ったのは（図３Ｂ）、ＩＦからの溶出に適するこの低ｐＨでの結合アフィ
ニティが著しく低いことを示すためである。

ＩＦとＩｇＧ１との間の非特異的結合を排除するために、スクランブルＺ３３ペプチド
配列を有するＣ１２－ＳＺ３３を陰性対照として使用した。このＣ１２－ＳＺ３３ ＩＡ
は、ＴＥＭとＣＤとで特徴付けられた同様の自己集合特性および二次構造を示している（
データは示していない）。ＩＴＣ実験は、１００μＭ Ｃ１２－ＳＺ３３ ＩＡをｐＨ
７．４のＰＢＳ中１５℃の２μＭ ＩｇＧ１溶液に注入して結合能を測定することにより
実施した。図３Ｄのサーモグラムと結合等温線は、ＩｇＧ１とＺ３３ペプチド間の特異的
な相互作用を示唆している。

（実施例４）
ＩＦの機能の普遍性をさらに証明するために、二重鎖アルキル化ＩＡ ２Ｃ８－Ｚ３３
も、自己集合特性からＩｇＧ１への結合アフィニティまで研究した（図４Ａ－Ｅ）。均一
な直径のナノスケールＩＦがＴＥＭ画像で観察され、αヘリックスの二次構造がＣＤで確
認された。ＩＴＣの結果から、２Ｃ８－Ｚ３３とＩｇＧ１の結合はｐＨ ７．４のＰＢＳ
中１５℃で発生したが、ｐＨ ２．８の溶出緩衝液中では検出可能な結合は発生しなかっ
た。２Ｃ８－Ｚ３３の結合の見掛けの化学量論は９．１であり、結合の効率がさらに低い
ことを示している。２Ｃ８－Ｚ３３はＣ１２－Ｚ３３よりも結合のエンタルピーが有利で
はないが、エントロピーからの寄与は不利ではないため、わずかに良好な結合アフィニテ
ィをもたらす（テーブル２）。上記の結果から、表面に高密度の結合部位が提示されるこ
とにより、元のＺ３３ペプチドで示される通り、自己集合ＩＦはＩｇＧ１への有利な結合
能力を維持することができると示された。それにもかかわらず、エンタルピー起源である
ＩＦについて観察された全体的な結合アフィニティの損失がある。有利なエンタルピーの
損失は、ＩＦの制限による相互作用の損失と、粒子の崩壊に関連する不利なエンタルピー
の寄与によって説明できる。ＩＦ内の分子レベルのパッキングは、生体活性の性能に大き
く影響する可能性のある形態学的ならびに機能的特性を決定する。

（実施例５）
（ＩｇＧ分子の精製への潜在用途）
構成アミノ酸の多様性は、水素結合、π―πスタッキング、疎水性崩壊、および自己集
合ペプチドナノ繊維間の静電相互作用を含む非共有相互作用の幅広い基盤を提供する。例
えば、酸性および塩基性アミノ酸の溶解度は、イオン化の程度、ｐＨおよびイオン強度に
依存する特性によって決まる。したがって、帯電ペプチドの自己集合プロセスは、ｐＨを
調整するか、または塩を添加して静電反発力を減らし、凝集を促進し、さらには沈殿を促
進することによって容易にすることができる。Ｚ３３ペプチドに提示される多数の荷電ア
ミノ酸残基を考慮すると、本発明の発明的免疫繊維系の魅力的な利点は、容易に調整可能
な溶解度に頼る。いったんＩｇＧがＩＦに結合すると、ＩｇＧ－ＩＦ複合体は、イオン強
度の高い塩を添加することで沈殿する可能性が高くなる（図５Ａ）。

Ｃ１２－Ｚ３３ ＩＦは、ＩｇＧ１への結合アフィニティが比較的高いため、ＩｇＧ１
を沈殿させる可能性を研究するために選択された。図５Ｂ（ｉ－ｉｉ）に示すように、５
ｍＭ Ｃ１２－Ｚ３３はＰＢＳ溶液によく溶けるが、０．６Ｍ Ｎａ_２ＳＯ_４のＰＢＳ溶
液では沈殿する。ＰＢＳ溶液中のＣ１２－Ｚ３３のゼータ電位は―７．６１ｍＶであり、
Ｎａ_２ＳＯ_４の添加によりＩＦの表面の電荷が遮蔽され、沈殿が誘発される可能性がある
。ＩｇＧ１の場合、５ｍＭ Ｃ１２－Ｚ３３ならびに０．６Ｍ Ｎａ_２ＳＯ_４によく溶解
する。しかしながら、２０μＭ ＩｇＧ１と５ｍＭ Ｃ１２－Ｚ３３を５分間混合した後
、０．６Ｍ Ｎａ_２ＳＯ_４を添加すると、沈殿が観察された。沈殿物の組成を決定するた
めに、２つの並列実験を実行した。０．６Ｍ Ｎａ_２ＳＯ_４中の５ｍＭ Ｃ１２－Ｚ３３
を遠心分離し、紫外可視（ＵＶ－Ｖｉｓ）分光法を使用して、Ｎａ_２ＳＯ_４の添加前後の
２８０ｎｍでの上澄の吸光度変化をモニターした。０．６Ｍ Ｎａ_２ＳＯ_４中の５ｍＭ
Ｃ１２－Ｚ３３と２０μＭＩｇＧ１との混合液で同じ手順を実施した。図５Ｃに示すよう
に、ほとんどのＣ１２－Ｚ３３ ＩＦは０．６Ｍ Ｎａ_２ＳＯ_４で沈殿させることができ
た。ＩｇＧ１－ＩＦ複合系の場合、２８０ｎｍでの吸光度はＩｇＧ１の初期吸光度を下回
るレベルまで低下し、溶液からＩｇＧ１が除去されたことを示している。より明確に、青
線から緑線の値を引くことにより、純ＩｇＧ１の上澄の吸光度がプロットされ、６０％以
上のＩｇＧ１が上澄から除去されたことを示唆している。これまでに、ＩＦが新しいアフ
ィニティ沈殿剤として機能する可能性が予備的に証明された。

（実施例６）
（本発明のＩＦへのＩｇＧ結合の確認。）
ＴＥＭでＩｇＧ構造を特定することが困難なため、免疫繊維とＩｇＧの結合を直接視覚
化することは制限された。ＩｇＧが免疫繊維の表面に存在することを確認するために、事
前に形成されたＣ１２－Ｚ３３およびＣ１２－ＳＺ３３免疫繊維を１０ｎｍのＩｇＧ標識
Ａｕナノ粒子とともに２時間別個にインキュベートした。各溶液をＴＥＭグリッドに滴下
した後、グリッドをろ紙で吸い取り、自然乾燥させた。次に、試料を酢酸ウラニルで染色
する前に、結合していないＡｕナノ粒子を除去するために、ＰＢＳ緩衝液でグリッドを慎
重に３回洗浄した。密領域と疎領域の両方でＩｇＧコーティングＡｕナノ粒子とインキュ
ベートしたＣ１２－Ｚ３３のＴＥＭ画像（図６Ａおよび６Ｃ）は、Ｚ３３提示ナノ繊維の
表面へのＩｇＧの結合を確認した。スクランブルＺ３３配列を持つ対照ナノ繊維に付着す
るＡｕナノ粒子はほとんど観察されなかった（図６Ｂおよび６Ｄ）。この研究は、Ｃ１２
－Ｚ３３免疫繊維とＩｇＧコーティングＡｕナノ粒子の共局在化は、実際に特異的結合の
結果であることを示唆している。Ａｕナノ粒子の密度が長い免疫繊維で比較的低かったこ
とに注意する必要があり、ナノ繊維への自己集合後のＺ３３免疫両親媒性物質のタイトパ
ッキングのアクセスが制限されているためである可能性が高い。別の可能性は、ＩｇＧコ
ーティングＡｕナノ粒子がモノマー状態でＣ１２－Ｚ３３に結合し、洗浄工程で取り除か
れ得ることであり、これはＩｇＧコーティングＡｕナノ粒子のＩｇＧ濃度（０．３３－０
．６６μＭ）が、２～５μＭであるＣ１２－Ｚ３３の臨界ミセル濃度値以下であったこと
が理由である（図７）。

（実施例７）
（本発明のＩＦとのＩｇＧ相互作用の可視化。）
Ｃ１２－Ｚ３３免疫繊維とＩｇＧの相互作用をよりよく視覚化するために、Ｃ１２－Ｚ
３３を蛍光色素（ローダミンＢ）で標識すると、共焦点レーザー走査顕微鏡下で蛍光免疫
繊維とＦＩＴＣ－ＩｇＧを直接イメージングすることができる。ローダミンＢは、生体材
料の染色に広く使用されている。ローダミンＢ標識Ｃ１２－Ｚ３３（ＲＢ－Ｃ１２－Ｚ３
３）を、Ｚ３３のＮ末端にリジンを追加することにより合成し（図８）、ローダミンＢお
よびＣ１２を、新たに追加したリジンの側鎖および主鎖のアミン基に個別に結合させた。
蛍光標識はＣ１２－Ｚ３３の結合能力を妨げないと想定されたが、これは、Ｃ１２と共に
免疫繊維に自己集合した後、色素が疎水性コアに留まり、それが結合配列Ｚ３３から離れ
て位置するためである。ＰＢＳでの自己集合繊維形態は、ＴＥＭを使用して確認した（図
９Ｃ）。１ｍＭストック溶液から希釈した１００μＭ ＲＢ－Ｃ１２－Ｚ３３と２μＭ
ＦＩＴＣ－ＩｇＧをＰＢＳ中に事前混合した。イメージングの直前に３０μｌの溶液をき
れいな顕微鏡スライドにスポットし、カバースリップで覆って液体の薄層を得た。次に、
蛍光画像（図１０Ａ－Ｃ）を共焦点レーザー走査顕微鏡で撮影し、ＲＢ－Ｃ１２－Ｚ３３
（赤色）とＦＩＴＣ－ＩｇＧ（緑色）との両方からの蛍光シグナルの共局在を示した。Ｆ
ＩＴＣ－ＩｇＧは、純粋なＦＩＴＣ－ＩｇＧ溶液および同じ条件でＣ１２－ＳＺ３３とイ
ンキュベートした溶液では決して観察されない大きな明るい集合体を形成することがわか
った（データは示していない）。ＲＢ－Ｃ１２－Ｚ３３とインキュベートした場合のＦＩ
ＴＣ－ＩｇＧの明るい蛍光と比較して、低い蛍光シグナルがＰＢＳ溶液中またはＣ１２－
ＳＺ３３とインキュベートした後に検出された。これは、ＲＢ－Ｃ１２－Ｚ３３とＦＩＴ
Ｃ－ＩｇＧの結合がＦＩＴＣ－ＩｇＧの凝集と強い蛍光を誘発する一方で、ＦＩＴＣ－Ｉ
ｇＧがＰＢＳ緩衝液またはＣ１２－ＳＺ３３の存在下でよく分散することを示した。

本明細書に引用される出版物、特許出願、および特許を含む全ての参考文献は、各参考
文献が個別におよび具体的に参照により組み込まれることが示され、その全体が本明細書
に示されるのと同程度に、参照により組み込まれる。

本発明を説明する文脈における（特に以下の特許請求の範囲における）用語「ａ」およ
び「ａｎ」および「ｔｈｅ」および類似の指示対象の使用は、本明細書で特に明記しない
限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると
解釈されるものとする。「含む」、「有する」、「含む」、「含有する」という用語は、
特に断りのない限り、非限定的用語（つまり、「含むが、これに限定されない」を意味す
る）と解釈される。本明細書での値の範囲の列挙は、本明細書で特に明記しない限り、範
囲内に入る各個別の値を個別に参照する略記法として機能することを単に意図しており、
各個別の値は、本明細書で個別に列挙されているかのように明細書に組み込まれている。
本明細書で説明される全ての方法は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈によ
って明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行することができる。本明細書で提
供されるありとあらゆる例または例示的言葉（例えば「など」）の使用は、単に本発明を
より良く説明することを意図しており、特に請求されない限り、本発明の範囲を限定する
ものではない。明細書中の言語は、特許請求されていない要素が本発明の実施に不可欠で
あることを示すと解釈されるべきではない。

本発明を実施するために発明者に知られている最良の形態を含む、本発明の好ましい実
施形態が本明細書に記載されている。これらの好ましい実施形態の変形形態は、前述の説
明を読めば当業者に明らかになる可能性がある。本発明者は、当業者がそのような変形形
態を適切に使用することを期待し、本発明は、本明細書に具体的に記載されている以外の
方法で実施されることを意図している。したがって、本発明は、適用法で許可されるよう
に、本明細書に添付された特許請求の範囲に列挙された主題の全ての修正および等価物を
含む。さらに、その全ての可能な変形形態における上記要素の任意の組み合わせは、本明
細書で特に明記しない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、本発明に含まれ
る。

（参照資料）
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ｅｅ， Ｊ． Ｓ．； Ｏｌｉｖｅ， Ｃ．； Ｔｉｒｒｅｌｌ， Ｍ．， Ｓｅｌｆ－
Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ
Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅ Ｍｉｃｅｌｌｅｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ
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ｏｔｔａ， Ａ．； Ｔｉｒｒｅｌｌ， Ｍ．， Ｗｏｒｍｌｉｋｅ ｍｉｃｅｌｌｅ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｄｒ
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ｓｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ｂ ２００９， １１３ （４２）， １３７１１
－４．
１０． Ｔｒｅｎｔ， Ａ．； Ｍａｒｕｌｌｏ， Ｒ．； Ｌｉｎ， Ｂ．； Ｂｌａ
ｃｋ， Ｍ．； Ｔｉｒｒｅｌｌ， Ｍ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉ
ｅｓ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅ ｍｉｃｅｌｌｅ
ｓ． Ｓｏｆｔ Ｍａｔｔｅｒ ２０１１， ７ （２０）， ９５７２－９５８２．
１１． Ｃｕｉ， Ｈ．； Ｗｅｂｂｅｒ， Ｍ． Ｊ．； Ｓｔｕｐｐ， Ｓ． Ｉ．
， Ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅｓ：
ｆｒｏｍ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｔｏ ｂｉｏｍ
ａｔｅｒｉａｌｓ． Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２０１０， ９４ （１）， １－１８
．
１２． Ｈａｒｔｇｅｒｉｎｋ， Ｊ． Ｄ．； Ｂｅｎｉａｓｈ， Ｅ．； Ｓｔｕｐ
ｐ， Ｓ． Ｉ．， Ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉ
ｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅａｍｐｈｉｐｈｉｌｅ ｎａｎｏｆｉｂｅｒｓ． Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２００１， ２９４ （５５４７）， １６８４－１６８８．
１３． Ｎｉｅｃｅ， Ｋ． Ｌ．； Ｈａｒｔｇｅｒｉｎｋ， Ｊ． Ｄ．； Ｄｏｎ
ｎｅｒｓ， Ｊ． Ｊ．； Ｓｔｕｐｐ， Ｓ． Ｉ．， Ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ
ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｔｗｏ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅ－ａｍｐｈｉｐｈ
ｉｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎｔｏ ｎａｎｏｆｉｂｅｒｓ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏ
ｓｔａｔｉｃ ａｔｔｒａｃｔｉｏｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃ
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１４． Ｗｅｂｂｅｒ， Ｍ． Ｊ．； Ｔｏｎｇｅｒｓ， Ｊ．； Ｒｅｎａｕｌｔ，
Ｍ． Ａ．； Ｒｏｎｃａｌｌｉ， Ｊ． Ｇ．； Ｌｏｓｏｒｄｏ， Ｄ． Ｗ．；
Ｓｔｕｐｐ， Ｓ． Ｉ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ
ｐｅｐｔｉｄｅ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃｅｌｌ
ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒ ２０１０， ６ （１）， ３－
１１．
１５． Ｃｕｉ， Ｈ． Ｇ．； Ｃｈｅｅｔｈａｍ， Ａ． Ｇ．； Ｐａｓｈｕｃｋ
， Ｅ． Ｔ．； Ｓｔｕｐｐ， Ｓ． Ｉ．， Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅ ｉｎ
Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌｌｙ Ｉｓｏｍｅｒｉｃ Ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ Ａ
ｍｐｈｉｐｈｉｌｅｓ Ｄｉｃｔａｔｅｓ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｏｎｅ－
Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔ
ｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１４， １３６ （
３５）， １２４６１－１２４６８．
１６． Ｍｏｙｅｒ， Ｔ． Ｊ．； Ｆｉｎｂｌｏｏｍ， Ｊ． Ａ．； Ｃｈｅｎ，
Ｆ．； Ｔｏｆｔ， Ｄ． Ｊ．； Ｃｒｙｎｓ， Ｖ． Ｌ．； Ｓｔｕｐｐ， Ｓ
． Ｉ．， ｐＨ ａｎｄ Ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｄｉｒｅｃ
ｔ Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｉｎ Ｂｉｏｆｕｎｃｔｉｏｎ
ａｌ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１４， １３６ （４２）， １４７４６－１４
７５２．
１７． Ｗｅｂｂｅｒ， Ｍ． Ｊ．； Ｔｏｎｇｅｒｓ， Ｊ．； Ｒｅｎａｕｌｔ，
Ｍ．－Ａ．； Ｒｏｎｃａｌｌｉ， Ｊ． Ｇ．； Ｌｏｓｏｒｄｏ， Ｄ． Ｗ．；
Ｓｔｕｐｐ， Ｓ． Ｉ．，Ｒｅｐｒｉｎｔ ｏｆ： Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ
ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａ
ｐｅｕｔｉｃ ｃｅｌｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ａｃｔａ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ
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１８． Ｙｕ， Ｙ．； Ｓｌｅｅｐ， Ｅ．； Ｓｔｕｐｐ， Ｓ． Ｉ．； Ｑｉｎ
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ｉｌｅｓ Ｎａｎｏｆｉｂｅｒｓ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ
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Ｇ．； Ｔｅｋｉｎａｙ， Ａ． Ｂ．； Ｇｕｌｅｒ， Ｍ． Ｏ．， Ｂｉｏａｃｔ
ｉｖｅ ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｎａｎｏｆｉｂｅｒｓ ｆｏ
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ｎｄ， Ａ．； Ｒｅｘｅｉｓｅｎ， Ｅ． Ｌ．； Ｇａｒｇ， Ａ．； Ｃｒａｉｇ
， Ｊ． Ａ．， Ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
ｏｆ ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ ａｎｄ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅ－ａｍｐｈ
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Ｄａｎｉｅｌｓ， Ｍ． Ｄ．； Ｇａｓｉｏｒｏｗｓｋｉ， Ｊ． Ｚ．； Ｃｈｏｎ
ｇ， Ａ． Ｓ．；
Ｃｏｌｌｉｅｒ， Ｊ． Ｈ．， Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕ
ｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ．
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２２． Ｅｃｋｅｒ， Ｄ． Ｍ．； Ｊｏｎｅｓ， Ｓ． Ｄ．； Ｌｅｖｉｎｅ，
Ｈ． Ｌ．， Ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏ
ｄｙ ｍａｒｋｅｔ．
ＭＡｂｓ ２０１５， ７ （１）， ９－１４．
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Ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｊ Ｃｈｒｏｍ
ａｔｏｇｒ Ｂ
Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ２００７， ８４８
（１）， ４８－６３．
２４． Ｓｈｕｋｌａ， Ａ． Ａ．； Ｈｕｂｂａｒｄ， Ｂ．； Ｔｒｅｓｓｅｌ，
Ｔ．； Ｇｕｈａｎ， Ｓ．； Ｌｏｗ， Ｄ．， Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃ
ｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－－ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｔｆｏｒｍ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ
Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ２００７， ８４８ （１）， ２８－３９．
２５． Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ， Ｊ．， Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ｒｅ
ｆｉｎｅｍｅｎｔ ａｎｄ ａｔｏｍｉｃ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ Ｆｃ
ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｆｒａｇｍｅｎｔ
Ｂ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｆｒｏｍ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕ
ｓ ａｔ ２．９－ａｎｄ ２．８－． ＡＮＧ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ． Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ １９８１， ２０ （９）， ２３６１－２３７０．
２６． Ｍｏｋｓ， Ｔ．； ＡＢＲＡＨＭＳEＮ， Ｌ．； ＮＩＬＳＳＯＮ， Ｂ．
； Ｈｅｌｌｍａｎ， Ｕ．； ＳＪＯＱＵＩＳＴ， Ｊ．； Ｕｈｌｅｎ， Ｍ．，
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ ｆｉｖ
ｅ ＩｇＧ‐ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ． Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８６， １５６ （３）， ６３７－６４３．
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ｉｚｉｎｇ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ． Ｐ
ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ １９９６， ９３ （１２）， ５６８８－５６９２．
２８． Ｎｉｌｓｓｏｎ， Ｂ．； Ｍｏｋｓ， Ｔ．； Ｊａｎｓｓｏｎ， Ｂ．；
Ａｂｒａｈｍｓeｎ， Ｌ．； Ｅｌｍｂｌａｄ， Ａ．； Ｈｏｌｍｇｒｅｎ， Ｅ．
；Ｈｅｎｒｉｃｈｓｏｎ， Ｃ．； Ｊｏｎｅｓ， Ｔ． Ａ．； Ｕｈｌeｎ， Ｍ．
， Ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＩｇＧ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｂａｓｅｄ ｏ
ｎ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉ
ｎｅｅｒｉｎｇ １９８７， １ （２）， １０７－１１３．
２９． Ｓｔａｒｏｖａｓｎｉｋ， Ｍ． Ａ．； Ｂｒａｉｓｔｅｄ， Ａ． Ｃ．；
Ｗｅｌｌｓ， Ｊ． Ａ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｉｍｉｃｒｙ ｏｆ ａ ｎ
ａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ａ ｍｉｎｉｍｉｚｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍ
ａｉｎ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １９９７， ９４（１９）， １００８０－１００８５．
３０． Ｏｌｓｚｅｗｓｋｉ， Ｋ． Ａ．； Ｋｏｌｉｎｓｋｉ， Ａ．； Ｓｋｏｌ
ｎｉｃｋ， Ｊ．， Ｆｏｌｄｉｎｇ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｕｔ
ｅｒ ｒｅｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｔｈｒｅｅ－ｈｅｌｉｘ ｂｕｎ
ｄｌｅ ｍｏｔｉｆｓ． Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １９９６， ２５．
３１． Ｂｏｕｔｅｌｊｅ， Ｊ．； Ｋａｒｌｓｔｒｏｍ， Ａ． Ｒ．； Ｈａｒｔ
ｍａｎｉｓ， Ｍ． Ｇ．； Ｈｏｌｍｇｒｅｎ， Ｅ．； Ｓｊｏｇｒｅｎ， Ａ．；
Ｌｅｖｉｎｅ， Ｒ．Ｌ．， Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉ
ｒａｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｓ ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ａｓ
ａ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ： ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈ
ｅ ｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ｎａｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ １９９０， ２８３ （１）， １４１－１４９
．
３２． Ｈｏｂｅｒ， Ｓ．； Ｎｏｒｄ， Ｋ．； Ｌｉｎｈｕｌｔ， Ｍ．， Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ａ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｕｒｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｊ
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉ ２００７， ８４８ （１）， ４０－７．
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ｈｅｍ １９７０， ２４５（１２）， ３０５０．
３４． Ｈｕｓｅ， Ｋ．； Ｂｏｈｍｅ， Ｈ．－Ｊ．； Ｓｃｈｏｌｚ， Ｇ． Ｈ
．， Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ａｆｆｉｎｉｔ
ｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ２００２， ５１ （３）， ２
１７－２３１．
３５． Ｈａｓｓｏｕｎｅｈ， Ｗ．； Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， Ｔ．； Ｃｈｉｌ
ｋｏｔｉ， Ａ．， Ｅｌａｓｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ａ
ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔａｇ ｆｏｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉ
ｎｓ． Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ２０１０， Ｃｈａｐｔｅ
ｒ ６， Ｕｎｉｔ ６ １１．
３６． Ｓｈｅｔｈ， Ｒ． Ｄ．； Ｊｉｎ， Ｍ．； Ｂｈｕｔ， Ｂ． Ｖ．；
Ｌｉ， Ｚ．； Ｃｈｅｎ， Ｗ．； Ｃｒａｍｅｒ， Ｓ． Ｍ．， Ａｆｆｉｎｉｔ
ｙ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ
ｆｒｏｍ ａｎ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｈａｒｖｅｓｔ ｆｅｅｄｓｔｏｃｋ ｕｓ
ｉｎｇ ａｎ ＥＬＰ－Ｚ ｓｔｉｍｕｌｉ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｂｉｏｐｏｌｙｍ
ｅｒ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ２０１４， １１１ （８）， １５９
５－６０３．
３７． Ｈａｎｄｌｏｇｔｅｎ， Ｍ． Ｗ．； Ｓｔｅｆａｎｉｃｋ， Ｊ． Ｆ．；
Ａｌｖｅｓ， Ｎ． Ｊ．； Ｂｉｌｇｉｃｅｒ， Ｂ．， Ｎｏｎｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇｒａｐｈｉｃ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏ
ｒ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｖａｌｅｎｔｌｙ ａｃｔｉｖｅ
ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ ｆｌｕｉｄｓ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１３， ８５
（１０）， ５２７１－５２７８．
３８． Ｅｉｓｅｎ， Ｈ． Ｎ．； Ｓｉｓｋｉｎｄ， Ｇ． Ｗ．， Ｖａｒｉａｔ
ｉｏｎｓ ｉｎ Ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｕｒｉｎｇ
ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ
Ｒｅｓｐｏｎｓｅ＊． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９６４， ３ （７）， ９９６
－１００８．
３９． Ｍａｄａｎ， Ｂ．； Ｃｈａｕｄｈａｒｙ， Ｇ．； Ｃｒａｍｅｒ， Ｓ．
Ｍ．； Ｃｈｅｎ， Ｗ．， ＥＬＰ－ｚ ａｎｄ ＥＬＰ－ｚｚ ｃａｐｔｕｒｉｎ
ｇ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕ
ｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｂｙ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ． Ｊ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１３，
１６３ （１）， １０－６．
４０． Ｓｈｅｔｈ， Ｒ． Ｄ．； Ｂｈｕｔ， Ｂ． Ｖ．； Ｊｉｎ， Ｍ．；
Ｌｉ， Ｚ．； Ｃｈｅｎ， Ｗ．； Ｃｒａｍｅｒ， Ｓ． Ｍ．， Ｄｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ＥＬＰ－Ｚ ｂａｓｅｄ ｍＡｂ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｒｅｃ
ｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｕｓｉｎｇ ｓｃａｌｅｄ－ｄｏｗｎ ｆｉｌｔ
ｒａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１４， １９
２ Ｐｔ Ａ， １１－９．
４１． Ｋａｗａｓｈｉｍａ， Ｒ．； Ａｂｅｉ， Ｍ．； Ｆｕｋｕｄａ， Ｋ．；
Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｋ．； Ｍｕｒａｔａ， Ｔ．； Ｗａｋａｙａｍａ， Ｍ．；
Ｓｅｏ，Ｅ．； Ｈａｓｅｇａｗａ， Ｎ．； Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ， Ｈ．； Ｏｂ
ａｔａ， Ｙ．； Ｈｙｏｄｏ， Ｉ．； Ｈａｍａｄａ， Ｈ．； Ｙｏｋｏｙａｍａ
， Ｋ． Ｋ．，ＥｐＣＡＭ－ ａｎｄ ＥＧＦＲ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉ
ｖｅ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｂｉｌｉａｒｙ ｃａｎｃｅｒｓ ｕｓｉｎ
ｇ Ｚ３３－ｆｉｂｅｒ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｃ
ａｎｃｅｒ ２０１１， １２９ （５）， １２４４－５３．
４２． Ｋｉｃｋｈｏｅｆｅｒ， Ｖ． Ａ．； Ｈａｎ， Ｍ．； Ｒａｖａｌ－Ｆｅ
ｒｎａｎｄｅｓ， Ｓ．； Ｐｏｄｅｒｙｃｋｉ， Ｍ． Ｊ．； Ｍｏｎｉｚ， Ｒ．
Ｊ．；
Ｖａｃｃａｒｉ， Ｄ．； Ｓｉｌｖｅｓｔｒｙ， Ｍ．； Ｓｔｅｗａｒｔ， Ｐ．
Ｌ．； Ｋｅｌｌｙ， Ｋ． Ａ．； Ｒｏｍｅ， Ｌ． Ｈ．， Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ
ｖａｕｌｔ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｔｏ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｅｌｌ ｓｕ
ｒｆａｃｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ． Ａｃｓ Ｎａｎｏ ２００８， ３ （１）， ２
７－３６．
４３． Ｆｒｅｉｒｅ， Ｅ．； Ｋａｗａｓａｋｉ， Ｙ．； Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ－
Ｃａｍｐｏｙ， Ａ．； Ｓｃｈｏｎ， Ａ．， Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ
ｏｆ ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｙ ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ． Ｉｎ Ｂｉｏ
ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｌｉｇａｎｄ Ｂ
ｉｎｄｉｎｇ ｔｏ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔａｒｇｅｔｓ， ２０１１； ｐｐ
２７５－２９９．
４４． Ｗｉｓｅｍａｎ， Ｔ．； Ｗｉｌｌｉｓｔｏｎ， Ｓ．； Ｂｒａｎｄｔｓ，
Ｊ． Ｆ．； Ｌｉｎ， Ｌ．－Ｎ．， Ｒａｐｉｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ
ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔｓ ａｎｄ ｈｅａｔｓ ｏｆ ｂｉｎｄｉｎｇ
ｕｓｉｎｇ ａ ｎｅｗ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ． Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８９， １７９ （１）， １３１－１３
７．
４５． Ｄｅｍｅｒｓ， Ｊ．－Ｐ．； Ｍｉｔｔｅｒｍａｉｅｒ， Ａ．， Ｂｉｎｄ
ｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｎ ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂ
ｙ ＮＭＲ ａｎｄ ＩＴＣ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２００９， １３１ （１２）， ４３５５－４３６
７．
４６． ｖａｎ Ｅｌｄｉｊｋ， Ｍ． Ｂ．； Ｓｍｉｔｓ， Ｆ． Ｃ．； Ｔｈｉ
ｅｓ， Ｊ． Ｃ．； Ｍｅｃｉｎｏｖｉｃ， Ｊ．； ｖａｎ Ｈｅｓｔ， Ｊ． Ｃ
．，Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｚ３３－ａｎｔ
ｉｂｏｄｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｕｒ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ ２０１４， １７９， ３２－４１．
４７． Ｌｕｎｄ， Ｌ． Ｎ．； Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， Ｔ．； Ｔｏｏｎｅ，
Ｅ．； Ｈｏｕｅｎ， Ｇ．； Ｓｔａｂｙ， Ａ．； Ｓｔ Ｈｉｌａｉｒｅ， Ｐ
． Ｍ．，
Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ａ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ｔｏ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｔｙｐｅ
Ｇ ｂｙ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ．
Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ ２０１１， ２４ （６）， ９４５－５２．

Claims (6)

1. 直鎖炭化水素鎖に結合した抗体結合ペプチドを含む免疫両親媒性物質。
2. 直鎖炭化水素鎖に結合した抗体結合ペプチドを含む免疫両親媒性物質であって、前記ペ
   プチドが生理的ｐＨの水溶液中にあるときにα－ヘリックス構造を有する、免疫両親媒性
   物質。
3. 直鎖炭化水素鎖に結合した抗体結合ペプチドを含む免疫両親媒性物質であって、前記抗
   体結合ペプチドが黄色ブドウ球菌のプロテインＡのＺ３３ペプチドの親水性アミノ酸配列
   、またはその機能的部分もしくは断片もしくは誘導体を有する、免疫両親媒性物質。
4. 直鎖炭化水素鎖に結合した抗体結合ペプチドを含む免疫両親媒性物質であって、前記抗
   体結合ペプチドがアミノ酸配列ＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＫ
   ＩＫＳＩＲＤＤ（配列番号１）、またはその機能的部分もしくは断片もしくは誘導体を有
   する、免疫両親媒性物質。
5. 以下の工程を含む、抗体またはＦｃ融合タンパク質の精製方法：
   ａ）請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫両親媒性物質を生理的ｐＨの水溶液に
   溶解させ、一晩熟成させて免疫繊維（ＩＦ）に自己集合させる工程；
   ｂ）抗体またはＦｃ融合タンパク質を含む試料を前記ＩＦと混合し、前記ＩＦを抗体
   またはＦｃ融合タンパク質のＦｃ部分に結合させ、溶液中に免疫繊維－抗体複合体または
   免疫繊維－Ｆｃ融合タンパク質複合体を形成させる工程；
   ｃ）塩を加えて遠心分離することにより、前記免疫繊維－抗体複合体または前記免疫
   繊維－Ｆｃ融合タンパク質複合体を溶液から分離する工程；ならびに
   ｄ）前記ＩＦを前記抗体またはＦｃ融合タンパク質から解離させ、未結合の抗体また
   はＦｃ融合タンパク質を収集する工程。
6. 前記ｐＨを溶出条件に下げることおよび濾過または精密濾過により、前記ＩＦを前記抗
   体またはＦｃ融合タンパク質から分離する、請求項５に記載の方法。

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