JP3338441B2 - 組換え的に調製された官能的な合成タンパク質ポリマー - Google Patents

組換え的に調製された官能的な合成タンパク質ポリマー

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Description

【発明の詳細な説明】 序論 技術分野 本発明は、生物学的及び化学的活性構造ポリマーに基
づくアミノ酸の高分子量ポリマーの調製に関する。
背景 組換えDNA技法は、天然の遺伝子の単離及び種々の宿
主細胞におけるそれらの遺伝子の発現に適用されて来
た。典型的には、この技法は、生物学的活性ポリペプチ
ド、たとえばインターフェロン又はペプチドホルモン
（これらは、他の手段により有用な量、生成するために
は実用的でない）の生成に利用されて来た。天然の遺伝
子を単離し、イン ビトロで部位特異的突然変異誘発の
技法を用いて、これらの遺伝子を変え、そしてそれによ
って生成されるポリペプチドを変更することによって、
変性されたタンパク質を生成することもまた可能であ
る。他のポリペプチドは、いくつかの天然に存在しない
分子のキメラ分子である新規のポリペプチドを生成する
ために種々の天然の遺伝子の断片を組合すことによって
創造されて来た。
DNAの化学合成のための効果的且つ自動化された方法
の出現により、完全な遺伝子を合成し、そしてその合成
の間、意思によりそのような合成遺伝子を変性すること
が可能になって来た。しかしながら、これらの種々の技
法は、天然のポリペプチドの天然の又は変性された変種
の生成に適用されて来た。これらの技法を用いて、実質
的に新規なポリペプチドを創造する試みはほとんど行な
われていなかった。天然において、ポリペプチドは、広
範囲の化学的、物理的及び生理学的特徴を有する。それ
にもかかわらず、既知の天然に存在するポリペプチドが
適切でない商業的な用途が存在する。
生物技法は多方面にわたっているが、通常、それは天
然に存在する生成物又は天然に存在する分子の変性への
その適用に制限されて来た。それと対照的に、有機化学
的合成の強みは、安価な炭素物質を、天然分子を包含
し、しかし最も重要なことには、天然分子とは関係ない
定義され且つ予期された化学的特性を有するポリプロピ
レンおよびポリアクリレート等の全く新しい構造体を包
含する広範囲の種類のポリマー分子へ変換することがで
きる点である。
そのような材料、特にアミノ酸の反復配列を含む高分
子量ポリマーは、生化学的手段により生成するのは難か
しいことがわかった。アミノ酸の反復単位を含む大きな
ペプチドを生成するのに必要な遺伝子は、不安定であ
り、そしてしばしば、遺伝子における反復単位の欠失を
引き起こす分子間組換えを受ける。有機合成により利用
できる生物学的工程に類似する工程によりポリマー分子
を生成する生物工学の進歩は、生物工学の適用の範囲を
有意に広くするであろう。
関連文献の簡単な説明 縦に並んだ４個までの複数のラクトースオペロンのク
ローニングは、Sadlerなど.,Gene,（1980）８:279〜300
により開示される。高い反復性のサテライトDNAを含む
ハイブリッド細菌プラスミドは、Brutlagなど.,Cell,
（1977）10:509〜519により開示される。細菌における
ポリ（アスパルチル−フェニルアラニン）の合成が、Do
elなど.,Nucleic Acids Research,（1980）８:4575〜45
92により開示される。プロリンポリマーの生成をコード
するプラスミドをクローニングすることによりプロリン
含有量を富化するための方法は、Kangasなど.,Applied
and Environmental Microbiology,（1982）43:629〜635
により開示された。プラスミドレプリコン内に安定して
維持され得る高い反復性DNA配列の長さに対する生物学
的制限が、Guptaなど.,Bio/Technology,602〜609ペー
ジ、９月、1983により論議される。
発明の要約 構造成分（該構造成分は、特定の機能的な特性を有す
る異なったアミノ酸配列により分離される）を形成す
る、相互作用する反復性オリゴマー単位又は鎖を有する
ポリペプチドの生成のための方法及び組成物が提供され
る。（“鎖”とは、規則正しい配列を実質的に有する第
二鎖と一列に並ぶことができる規則正しい配列を意味
し、たとえば疎水性配列は疎水性配列と一列に並び、そ
して親水性配列は親水性配列と一列に並ぶ。）反復単位
の成分は、環境、たとえば溶液、気体、ゲル及び同様の
ものと相互作用するために介在単位の利用性を可能にす
る構造体を提供し、ここで前記介在配列は実質的に立体
的阻害性を持たず、前記鎖と比べて、他の分子と相互作
用する。長い核酸配列は、個々の多くの反復ペプチド単
位を発現する核酸オリゴマーを合成することによって構
築され、そして前記オリゴマーは、所望する長さのポリ
ヌクレオチドを供給するために連結される。相対的に等
しく間隔を置かれて存在する特異的制限部位を提供する
ことによって、追加の配列が、反復鎖の間に転向又は他
の機能的な存在性を提供する部位で導入され得る。次に
その得られた核酸読み取り枠が、所望するタンパク質生
成物の発現のために適切な発現ベクター中に導入され得
る。
特定の態様の記載 鎖を形成する反復性の比較的短いアミノ酸配列単位の
オリゴマーである新規ポリペプチドが供給され、ここで
前記鎖は、種々の機能のためにポリペプチドの環境に利
用できる配列をもたらす異なったオリゴマー単位により
分離される。
本発明の核酸配列によりコードされるポリペプチド
は、基本構造を提供するために一列に並ぶことができる
鎖を供給する。その鎖は、多かれ少なかれ直線コンホー
メーションのタンパク質鎖セグメントであろう。その鎖
は、逆方向又は直接方向に整列しており、多くの鎖は鎖
の間の機能的な存在としての反復配列以外の配列によっ
て分離されていて、媒体中の溶質又は成分に近づきやす
くされている。それらの鎖は主に天然に存在するポリマ
ーの反復単位に基づき、これらの反復単位は一般に少な
くとも３個のアミノ酸であって、同じアミノ酸を２回包
含してもよい。
本発明のポリマーを用いて、種々の目的のために種々
の構造体を供給することができる。反復単位及び既知の
ポリマー構造体とのそれらの関係に依存して、類似する
機械的引張特性が達成され得、そして特定の目的のため
に変性され得る。本発明のポリマーは、、繊維、フィル
ム、膜、接着剤、エマルジョン及び同様のものを製造す
るために単独で使用され得、又は前記生成物の複合材
料、ラミネート又は組合せを形成するために他の化合物
又は組成物と共に使用され得る。
ポリマー中の構造的に整列された要素は、β−シー
ト、α−ヘリックス、動的なβ−螺旋形状物、コラーゲ
ンヘリックス、タイプＩ又はII又はそれらの組合せであ
り、ここで異なった配列のものであり、そして通常、整
列された要素に関係しないであろう介在要素が存在する
であろう。大部分、これらの介在配列は、ループ又は回
転状のものであろう。
本発明の遺伝子は、同じアミノ酸配列単位をコードす
るDNA配列のマルチマーを含んで成り、ここで異なった
アミノ酸単位をコードする複数の異なったマルチマー
は、ブロックコポリマーを形成するために一緒に結合さ
れ得る。個々の単位は、３〜30個のアミノ酸〔９〜90ヌ
クレオチド（nt）〕、より普通には３又は４〜25個のア
ミノ酸（９〜75nt）、特に３又は４〜15個のアミノ酸
（９〜45nt）、より特定には３又は４〜８個のアミノ酸
（９〜24nt）を有し、通常、同じ単位に少なくとも２度
出現する同じアミノ酸（一般的に、少なくとも１つのア
ミノ酸により分離される）を有する。同じアミノ酸配列
をコードするマルチマーの単位は、同じアミノ酸配列を
達成するためにコドン冗長性を頼りに、複数のヌクレオ
チド配列を含むことができる。
鎖中の単位は、一般的に少なくとも約25〜約200個の
アミノ酸、通常約25〜約100個のアミノ酸、好ましくは
約30〜75個のアミノ酸のものであろう。鎖を分離する他
の配列は一般的に、少なくとも約４個、より普通には６
個〜約50個、通常約30個、より好ましくは約20個のアミ
ノ酸を有し、ここでより長い配列は、ＮからＣの方向に
鎖の整列を伴って、平行でない鎖よりもむしろ平行な鎖
と関連される。
大部分、本発明のDNA組成物は、下記式により示さ
れ： Kk（Ｗ（Ｍ）mXx（Ｎ）fYy）iLl ここで： Ｋは、約１〜100個、通常１〜60個のアミノ酸のアミ
ノ酸配列をコードするDNA配列であり、アミノ酸の合計
数の約20％よりも少ない、より一般的には約10％よりも
少ない任意の配列であり、特にマルチマー構造遺伝子が
読み枠中で、他のDNA配列に融合されている天然に存在
する任意の配列である。Ｋは開始メチオニンコドンを有
するであろう。； ｋは０又は１であり； Ｗは下記式を有し： ［（Ａ）ｎ（Ｂ）ｐ］ｑ ここで： Ａは、配列に少なくとも２度出現するように、少なく
とも１個のアミノ酸を通常有する同じアミノ酸配列単位
を、それが出現するごとにコードするDNA配列であり、
ここでＡは一般的に約９個のヌクレオチド（nt）〜約90
nt、より普通には約９又は12個〜75個のヌクレオチド、
好ましくは約９又は12〜45個のnt、より好ましくは約９
又は12〜24個のntのものであり； ここで、少なくとも２個の異なったＡ〜通常10個の異
なったＡ、より普通には６個の異なったＡが存在し、そ
してこれらは同じアミノ酸配列をコードするが、しかし
少なくとも１つのヌクレオチドでお互い異なり、そして
10個ほどのヌクレオチドで異なり、通常約５個以上のヌ
クレオチドにより他のＡ配列と異ならず、それぞれの異
なったＡは通常、少なくとも２度反復され；少なくとも
２個の異なったコドンたとえばGGC及びGGAが、同じアミ
ノ酸配列単位をコードする異なったＡにおいて、同じア
ミノ酸のために、たとえばグリシンのために使用され； ｎは、少なくとも２、通常少なくとも約８〜約250、
通常約200、時々約125であり、そして多くの場合、約50
を越えず； Ｂは、Ａ単位によりコードされるアミノ酸配列単位以
外のアミノ酸配列をコードするＡと異なったDNA配列で
あり、そしてＡ単位のオリゴマー間で結合単位として作
用し（Ｂは、一般的に約３〜45個のnt（１〜15個のアミ
ノ酸）、より普通には約３〜30個のnt（１〜10個のアミ
ノ酸）を有するであろう）； ここで、遺伝子に出現するＢ単位は同じであっても良
く又は異なっても良く、通常約10個よりも多くない異な
ったＢ単位、より普通には約５個よりも多くない異なっ
たＢ単位が存在し、ここでＢ単位は１〜45個のnt、より
普通には約１〜15個のntで異なり、ここでそれらの異な
ったＢは、同じか又は異なったアミノ酸配列をコードす
ることができ； ｐは０又は１であり、そして連続したＡ単位が存在す
ることに異なり ｑは少なくとも１の整数であり、そしてＡ及びＢにお
けるヌクレオチドの数、及びｎ及びｐの値により変化
し、可変性ｑは、構造遺伝子のマルチマー部分のために
少なくとも90個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも
約150個のnt、より好ましくは少なくとも450個のnt及び
最っとも好ましくは少なくとも900個のヌクレオチドを
供給するために選択され、そしてヌクレオチドの数は、
通常、約10,000個を越えず、より普通には約8,000個を
越えず、一般的に、約900〜6,000個、より普通には約5,
000個までの範囲で存在し；そして Ｍは、３〜150個のnt、通常６〜90個のntのDNAヌクレ
オチド配列であり、通常、生物学的又は化学的機能又は
活性をもたらす天然又は合成の配列を供給する官能配列
をコードするいづれかのアミノ酸配列をコードすること
ができ； ｍ及びｆは同じであっても良く又は異なっていても良
く、官能基がポリマー中に存在するかいづれかに依存し
て０〜３、通常０〜２であり、異なる場合、通常１〜２
であり、それらの同じ又は類似する官能基は隣接した態
様で組合され得、 ＸはＷと同じであっても良く又は異なっていても良
く、通常異なっており、そして下記式を有し： ［（A1）n1（B1）p1］q1 ここで： A1,B1,n1,p1及びq1はそれぞれA,B,n,p及びｑと同じあ
っても良く又は異なっていても良く、少なくとも１つは
異なっており、ここで類似する記号はそれらの対応する
ものと同じ定義内にあり； ｘは０又は１であり； Ｎは、Ｍと同じであっても良く又は異なっていても良
く、そしてＭと同じ定義内であり； ＹはＷと同じであっても良く又は異なっていても良
く、通常異なっており、そして下記式を有し： ［（A2）n2（B2）p2］q2 ここで： A2,B2,n2,p2及びq2はそれぞれA,B,n,p及びｑと同じで
あっても良く又は異なっていても良く、少なくとも１つ
は異なっており、ここで類似する記号はそれらの対応す
るものと同じ定義内にあり； ｙは０又は１であり； ＬはＫと同じであっても良く又は異なっていても良
く、Ｋの定義内にあるが、しかし開始メチオニンコドン
を欠き； ｌは０又は１であり； ｉは１〜100、通常１〜50、より普通には１〜30であ
り、特にｘ及びｙが０である場合、１であり； ｘ又はｙが１である場合、q,q1及びq2は合計少なくと
も２、通常少なくとも５〜約50、通常約30であろう。
ヌクレオチドの合計数は、少なくとも90個、通常少な
くとも約150個、好ましくは少なくとも約900個のntであ
り、そして20Knt（キロヌクレオチド）、通常約15nt以
下、より普通には約10Knt以下である。
上記DNA配列によりコードされるポリペプチドは、下
記式を有し： Kk′（Ｗ′Ｍ′Xx′Ｎ′Yy′）iLl′ ここで： Ｗ′は次の式を有し： ［（Ｄ）ｎ（Ｅ）ｐ］ｑ ここで:DはＡによりコードされるアミノ酸配列であり、
そして従って、１個のアミノ酸をコードするコドンを定
義する３個のヌクレオチドに基づいて数的な限界を有
し； ＥはＢによりコードされるアミノ酸配列であり、そし
てコドンを定義する３個のヌクレオチドに基づいて数的
な限界を有し、ここで個々のＥは、Ｂのコードに依存し
て、同じであっても良く又は異なっていても良く； そして、ここで、同様のＫ′,W′,M′,X′,N′,Y′及
びＬ′は、それぞれK,W,M,X,N,Y及びＬによりコードさ
れるアミノ酸配列である。しかしながら、Ｋ及びＬの場
合、続くプロセッシング、たとえばプロテアーゼ処理、
臭化シアン処理、等が、Ｎ−又はＣ−末端非マルチマー
鎖の一部又は完全な除去をもたらすことができる。
n,p,q,k,i及びｌは、前に示されたのと同じ定義を有
する。
同じ組成物（Ａ）を有する反復マルチマー単位を有す
る特定のポリマー組成物は、ｘ及びｙが０である下記式
を有し： Kk′［（Ｄ）ｎ（Ｅ）ｐ］qLl′ ここで、すべての記号は前で定義された通りであり； そして DNA配列は下記式を有し： Kk［（Ａ）ｎ（Ｂ）ｐ］qLl ここで、すべての記号は前で定義された通りである。
２〜３個のマルチマーブロックの反復単位を有するコ
ポリマー組成物をコードする特定のDNA配列は、下記式
を有し： Kk（Ｗ″Ｍ″Ｘ″Ｎ″Yy″）ｉ″Ll ここで、Ｗ″は下記式を有し： ［（A3）n3（B3）p3］q3′ ここでA3は４〜８、通常４〜６個のコドンのものであ
り、さもなければＡの定義内にあり； n3は２〜12、通常２〜10であり； B3は２〜８、通常４〜６個のコドンのものであり； p3は０又は１であり； q3は約２〜25、通常２〜20であり； Ｘ″及びＹ″はＷ″と同じであっても良く又は異なっ
ていても良く、Ｗ″と同じ定義内にあり； Ｍ″及びＮ″はＭ′及びＮ′の定義内にあり； ｉ″は少なくとも２、通常少なくとも５〜約75、通常
約50、一般的に30であり； そして他の記号は前で定義された通りである。
たった１つのマルチマータイプが存在する場合、好ま
しい式は、下記式に単純化され： ＫＫ＊（Ｗ＊（Ｍ＊）ｍ＊）ｉ＊Ｌ＊ ｌ＊ ここで:K＊は、約１〜80個のアミノ酸、通常１〜50個の
アミノ酸のアミノ酸配列をコードするDNA配列であり、
一般的にアミノ酸の合計数の約20％よりも少なく、より
一般的にはアミノ酸の合計数の約10％よりも少なく、そ
して特に、マルチマー構造遺伝子が読み枠を整合して他
のDNA配列に融合されている天然に存在する配列であ
り、存在するなら、Ｋ＊は開始メチオニンコドンであ
り； ｋ＊は０又は１であり； Ｗ＊は下記式を有し： ［（Ａ＊）ｎ＊（Ｂ＊）ｐ＊］ｑ＊ ここで： Ａ＊は、配列に少なくとも２度出現するように、少な
くとも１個のアミノ酸を通常有する同じアミノ酸配列単
位を、それが出現するごとにコードするDNA配列であ
り、ここでＡは一般的に約９個のヌクレオチド（nt）〜
約90nt、より普通には約９又は12個〜75個のヌクレオチ
ド、好ましくは約９又は12〜45個のnt、より好ましくは
約９又は12〜24個のntのものであり； Ａ＊は同じであっても良く又は異なっていても良く；
便利には、２個の異なったＡ＊、通常６個以下の異なっ
たＡ＊が存在し、同じアミノ酸配列をコードするが、し
かし少なくとも１個のヌクレオチドによりお互い異な
り、そして10個ほどのヌクレオチドにより異なることが
でき、通常、約５個以上のヌクレオチドにより他のＡ＊
配列と異なることができず、個々の異なったＡ＊は通
常、少なくとも２度、反復され；多くの場合、同じ単位
における同じアミノ酸、たとえばグリシンのために使用
される２個の異なったコドン、GGC及びGGAを使用するこ
とが好都合であり； ｎ＊は、少なくとも２、通常少なくとも約４〜約50、
通常約40、時々約35であり、そして多くの場合、約10を
越えず、 Ｂ＊は、Ａ＊単位によりコードされるアミノ酸配列単
位以外のアミノ酸配列をコードするＡと異なったDNA配
列であり、そしてＡ＊単位のオリゴマー間で結合単位と
して作用し（Ｂ＊は、一般的に約３〜45個のnt（１〜15
個のアミノ酸）、より普通には約３〜30個のnt（１〜10
個のアミノ酸）を有するであろう）； ここで、遺伝子に出現するＢ＊単位は同じであっても
良く又は異なっても良く、通常約10個よりも多くない異
なったＢ＊単位、より普通には約５個よりも多くない異
なったＢ＊単位が存在し、ここでＢ単位は１〜45個のn
t、より普通には約１〜15個のntで異なり、ここでそれ
らの異なったＢ＊は、同じか又は異なったアミノ酸配列
をコードすることができ； ｐ＊は０又は１であり、そして連続した（Ａ＊）ｎ＊
単位が存在することに異なり； ｑ＊は少なくとも１の整数であり、そしてＡ＊及びＢ
＊におけるヌクレオチドの数、及びｎ＊及びｐ＊の値に
より変化し、可変性ｑ＊は、その鎖のために少なくとも
90個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約129個のn
t、より好ましくは少なくとも500個のnt及び通常約501
個以下のntを供給するために選択され、 Ｍ＊は、少なくとも９個のnt、通常約15個のnt〜約15
0個のnt、通常約90個のnt、通常約９〜90個のntのヌク
レオチド配列であり； ｍ＊は１〜３、通常１〜２であり、ここでＭ＊は同じ
であっても良く又は異なっていても良く； ｉ＊は少なくとも２〜100、通常約50、好ましくは少
なくとも約３〜約30であり； 個々のｉ＊番目の単位のために、ｍ＊は０又は上記に
示されたような整数であり、Ｍ＊の合計数が１からｉに
変化できるように、少なくとも１単位のための整数であ
り； Ｌ＊はＫ＊の定義内にあり、但し、Ｌ＊は開始メチオ
ニンコドンを有さず； ｌ＊は０又は１である。
ヌクレオチドの合計数は、少なくとも132個のnt、通
常少なくとも900個のnt〜約10,000個のnt、通常約5,000
個のntである。
上記DNA配列によりコードされるポリペプチドは、次
の式を有し： Ｋ＊＊ Ｋ＊（Ｗ＊＊（Ｍ＊＊ ｍ＊））ｉ＊Ｌ＊＊ ｌ＊ ここで： Ｗ＊＊は次の式を有し： ［（Ｄ＊）ｎ＊（Ｅ＊）ｐ＊］ｑ＊ ここで： Ｄ＊は、Ａ＊によりコードされるアミノ酸配列であ
り、そして従って、１個のアミノ酸をコードするコドン
を定義する３個のヌクレオチドに基づいて数的な制限を
有し； Ｅ＊は、Ｂ＊によりコードされるアミノ酸配列であ
り、そして従って、コドンを定義する３個のヌクレオチ
ドに基づいて数的な制限を有し、ここで個々のＥは、Ｂ
のコードに依存して同じであっても良く又は異なってい
ても良く； Ｋ＊＊,L＊＊及びＭ＊＊は、Ｋ＊,L＊及びＭ＊により
コードされるアミン酸配列であり、そして従って、１個
のアミノ酸をコードするコドンを定義する３個のヌクレ
オチドに基づいて数的な制限を有し;K＊＊は１〜100個
のアミノ酸のものであり、任意に開始メチオニンを含
み、そしてＬは１〜100個のアミノ酸のものであり、そ
してＭ＊は３〜50個のアミノ酸のものであり、特に天然
に存在する配列を含み；そして ｋ＊,l＊,m＊,i＊,n＊,p＊及びｑ＊はすでに定義され
ている。
本発明の組成物は、通常、少なくとも約3Kドルトン、
通常5Kドルトン、時々少なくとも15Kドルトンの分子量
を有し、そして500Kドルトンほどの高さの、通常300Kド
ルトンを越えない、より普通には約250Kドルトンを越え
ない分子量を有する。
コポリマー、特にブロックコポリマーが調製され得
る。そのコポリマーは、ポリマーの化学的及び物理的、
たとえば機械的性質を調節することに高い柔軟性を付与
することに種々の利点を提供し、適切な機能を導入し、
そして異なった反復単位間の相互作用により独特の化学
的及び物理的性質を生成することができる。
通常使用されるマルチマーの組合せは、たとえば次の
通りである：（（Aa）ｎ（Bb）ｐ）ｑ、ここで記号A,B,
n,p及ｑは前で定義された通りであり、そしてａ及びｂ
は、異なったマルチマーが関与されることを示し、ここ
でａ及びｂは１〜３の範囲であり、そしてａ及びｂは同
じ数に等しくても良い。これは、A1及びB1が、他のそれ
ぞれのＡ′及びＢ′のように、関係されることを意味す
る。
組合せは、柔軟性を高めるために硬質及び軟質グルー
プを用いること、絹及びエラスチンマルチマーの組合
せ、表面に強い結合を付与するために接着剤様タンパク
質を導入することによって、コラーゲンの構造性質に変
化を付与すること、又は同様のものを包含する。
コポリマーは通常、少なくとも約5Kドルトン、より普
通には10Kドルトン〜通常約500Kドルトン、より普通に
は300Kドルトンの分子量を有するであろう。
整列されていない配列は、マルチマー内に同じであっ
ても良く又は異なっていても良く、又は異なったマルチ
マーにおいて同じか又は異なった整列配列のものであり
得る。
使用されるヌクレオチド配列は、反復単位が上記のよ
うに同じアミノ酸のために異なったコドンを有するよう
に、合成されるであろう。通常、少なくとも約25％、よ
り普通には少なくとも約40％及び一般的に少なくとも約
60％〜約95％、好ましくは約90％の、反復単位をコード
するヌクレオチド配列が同じであろう。初期構造物が自
発的な組換えでき事を受けるために実験的に示される、
これらの範囲内に高い変化が用いられるであろう。
種々の天然タンパク質は、反復構造体、たとえばＧ−
Ｘ−Ｙ（ここでＸはいづれかのアミノ酸、しばしばala
又はproに等しくそしてＹはいづれかのアミノ酸、しば
しばpro又はヒドロキシ−proに等しい）反復単位を有す
るコラーゲン、VPGG,VPGVGA及び／又はAPGVGV単位を有
するエラスチン、疎水性脂肪族又は芳香族残基により一
貫して占められる位置１及び４を有する７個のアミノ酸
のオリゴペプチド、たとえばAKLKLAE又はAKLELAEから成
る、いわゆる“七個一組”の反復単位を有するケラチン
及び配列、 Ａ−Ｋ−Ｐ−Ｐ＊−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｘ−Ｐ−Ｐ＊−Ｐ−Ｓ
−Ｔ−Ｙ−Ｘ−Ｋ（Ｐ＊はヒドロキシプロリンであり、
そしてＸは芳香族アミノ酸、特にＬ−dopaであり；アメ
リカ特許第4,585,585号及び第4,687,740号を参照のこ
と）内にあるデカペプチド又はヘキサデカペプチドを持
ったムラサキガイ（mussel）接着剤を有する。反復単位
は、個々に又は組合して使用され得、ここで個々の単位
は特定のパターンで変えられ、又は個々の鎖が供給され
得る。
反復単位としてSGAGAG（Ｇ＝グリシン;A＝アラニン;S
＝セリン）を有するポリペプチドが、特に興味の対照で
ある。この反復単位は、天然に存在する絹フィブロイン
タンパク質に見出され、そしてこれはGAGAG（SGAGAG）8
SGAAGY（Ｙ＝チロシン）として示される。
鎖間の介在オリゴマー又は変動体（turns）に関して
は、種々の配列が、ポリマーの所望する目的に依存して
使用され得る。従って、その介在配列は、整列されてお
らず、柔軟であり、接近性であり、官能性であり又はそ
れらの組合せを有する。従って、その鎖配列に関連する
介在配列は、形成され、二次加工され、押出され、紡糸
され、織られ、被覆され又は同様にされ得る広範囲の種
類の生成物を供給するように企画され得る。介在配列
は、リガンドを供給し、そして抗体、天然に存在する受
容体、非アミノ酸分子又は同様のものを結合するように
作用することができる。この場合、ポリマー構造体は、
アフィニティーカラムとして作用する広範囲の種類の分
子を特異的に結合するために使用され得、そして診断、
センサー、細胞分離、抗トロンボン形成性質を有する装
置被膜、細胞支持体同様のものに使用される。
介在配列は、化学的架橋部位のために化学的活性アミ
ノ酸を供給し、そして官能ペプチド、合成又は天然のポ
リマー又はタンパク質、非アミノ酸分子及び同様のもの
を共有結合するように作用することができる。介在配列
は、天然に存在する配列又は変性された天然に存在する
配列である。天然に存在する配列は、種々の機能を有す
る広範囲の種類の源に由来する。そのような配列は、た
とえばテナスシン（tenascin）からの細胞増殖阻害配列
（Chiquet−Ehrismannなど.,（1988）Cell 53:383〜39
0）；フィブロネクチン（−RGD−，−REDV−）からの細
胞増殖促進付着因子;Humphriesなど.,（1988）J.Cell B
iol:103:2637〜2647）フィブロネクチン（−RGD−）:Su
zukiなど.,（1985）EMBO.J.４:2519〜2524）ラミニンB1
（−YIGSR）;WO89/03392、コラーゲン;Grafなど.,（198
7）Cell 48:989〜996、ビトロネクチン（−XAP−）；細
菌接着剤（−SLF,−AIF−）（Jacobsなど.,（1987）J.B
acteriology 1691:735〜741）；成長ホルモン及びイン
シュリン；細胞機能活性剤、たとえば主な組織適合性複
合体抗原、クラスＩ及びII、特にα1,α2,β１、及びβ
２領域、たとえばHLA−A2アミノ酸50〜80及び140〜170
（Bjorkmanなど.,（1987）Nature 329:512〜518）及びH
LA−Ｄアミノ酸１〜90（Toddなど.,（1988）Science 24
0:1003〜1009）；増殖因子ドメイン、たとえばEGF,TGF
及びVGF,IL−１〜８、特に−２及び−４、及びエリトロ
ポエチン；ウィルス付着配列、たとえばヒトCD4アミノ
酸35〜60（Claytonなど.,（1988）Nature 335:363〜36
6）及び70〜95（Lifsonなど.,（1988）Science 241:712
〜716）；非タンパク質分子の結合を促進する配列、た
とえばビトロネクチンのヘパリン結合ドメイン、金属結
合ドメイン、たとえばメタロチオネイン、グルコース及
び他の糖結合ドメイン、たとえばレクチン、毒素、たと
えばアブリン、リシン及びジフテリア毒素のＢ鎖、サフ
ラトキシン又はそれらのフラグメント、等、及び解毒の
ための毒物又は毒素結合ドメイン；及び翻訳後変性のた
めの化学的活性アミノ酸又はアミノ酸配列、たとえばＮ
−結合グリコシル化のためのＮ−Ｘ−Ｓ及び化学的変性
のためのアミノ酸、C,M,H,K,R,D,E,W,F,Y,N及びＱであ
り得る。
介在配列としての特定の興味の配列は次のものを含
む： DPGKGXY ここでＸ及びＹの少なくとも１つはＣであり； EPGYIGSRCDAGY; PKGDRGDAGPK及び AVTGRGDSPAS; ここで保存性置換が官能部位以外で作られ得る。
システイン生成物に関しては、マルチマー単位に２又
は３個のシステイン、好ましはマルチマー単位のそれぞ
れの末端に隣接するシステインを有することが所望され
るであろう。化学的切断のためには、ジペプチドDP又は
EPが所望される。
対象の他の配列は、微生物、たとえばウィルス、細
菌、菌類及び原生動物のエピトープ、リン酸化部位、ペ
プチダーゼに認識部位又は同様のものである。
介在配列を有する反復単位を含むコポリマーの調製に
おける遺伝子工学の使用は、異なった単位、個々のマル
チマーにおける単位の数、それらの間の空間及びマルチ
マー組合せアセンブリーの反復体の数の適切な選択によ
り、性質を変えるための強力な方法である。従って、主
要マルチマーの数及び配置を変えることによって、種々
の異なった物理的及び化学的性質が達成され得る。
ブロックコポリマーの使用の例は、同じモノマー単位
のみを有するポリマーとは異なる性質を有する生成物を
供給するために、絹単位及びエラスチン単位の組合せで
ある。
構造遺伝子を調製するためには、種々のアプローチが
使用され得る。オリゴマーを調製するためには、DNAの
相補的鎖が合成され、その結果、ハイブリダイゼーショ
ンに基づいて、適切な末端を有する二本鎖DNAが得られ
る。所望により、個々のオリゴマー単位は同じであり、
その結果、単一段階で、コンカテマーがハイブリダイゼ
ーションの条件に依存して得られる。通常、次の例に記
載されているような従来のアニーリング及び連結条件が
使用されるであろう。
所望により、２種の異なったオリゴマー単位が調製さ
れ、ここでそれらの２種の単位の末端は他の端と相補的
な末端であるが、しかし同じ単位の末端は、一緒に結合
することができない。この方法で、個々のオリゴマー単
位を構築し、そして次に、それらを一緒に結合し、コン
カテマーを形成することができ、ここで介在結合配列が
それらの末端により少なくとも一部、定義される。構造
物に依存して、５′末端が、開始コドンメチオニンを提
供し、又は構造遺伝子が５′末端でユニーク配列（場合
によっては、、酵素的又は化学的処理により切断され得
る）を供給することができるアダプターに連結され得、
又は融合生成物を供給するために、宿主に通常内在する
遺伝子の部分に読み枠を整合して挿入され得る。アダプ
ター又は切断された遺伝子と対象の構造遺伝子の５′末
端との間に適切な相補的末端を供給することによって、
配列は、所望するタンパク質を供給するために読み枠を
整合して連結され得る。アダプター又は融合タンパク質
を用いることによって達成され得る利点は、特別な目
的、たとえば結合、分泌、他のタンパク質との複合体形
成、アフィニティー精製又は同様のもののために特異的
配列を有することを包含する。その３′領域は、類似す
る機能を付与するために、同様にして変性され得る。
構造遺伝子がいったんアセンブリーされた後、すぐに
それはクローン化され得；特に配列の長さに関して、所
望する遺伝子を有するクローンが単離され得；そしてそ
の遺伝子が除かれ、そして発現のための配列に連結する
ために使用され得る。
発現構造体は、構造遺伝子の転写及び翻訳開始及び終
結調節領域５′及び３′をそれぞれ含むであろう。すで
に示されたように、これらの領域は、融合タンパク質を
用いることによって創造され、ここで対象の構造遺伝子
が、その開始コドンから下流で及びその開始コドンと読
み枠を整合して、異なった構造遺伝子中に挿入される。
他方、発現宿主に使用するための広範囲の種類の遺伝子
からの種々の転写及び翻訳開始領域が利用され、その結
果、これらの転写及び翻訳開始領域が、対象の構造遺伝
子の転写及び翻訳開始を付与するために対象の構造遺伝
子に連結され得る。転写開始領域として同じ遺伝子から
又は異なった遺伝子からである広範囲の種類の終結領域
が利用できる。多くの構造体が文献に開示されており、
そしてそれらの同じ方法が、対象の遺伝子に適用され、
そして他の構造遺伝子と共に使用されて来た。
誘発性転写開始領域の使用が特に興味の対象である。
この場合、宿主株は、所望する生成物の有意な発現の
前、高い密度に増殖せしめられ得る。誘発性転写の提供
は、ペプチドが宿主より分泌されるよりもむしろ細胞宿
主に保持される場合、特に有用である。
多くの誘発性転写開始領域が存在し、又は特定の情況
に使用され得る。誘発性領域は、β−ガラクトシダーゼ
遺伝子を誘発するために特定の化学物質、たとえばイソ
プロピルチオガラクトシド（IPTG）により制御され得
る。他の誘発性領域は、左及び右のλプロモーター；種
々のアミノ酸ポリシストロン、たとえばヒスチジン及び
トリプトファン；温度感受性プロモーター；及び調節遺
伝子、たとえばcIts857を包含する。
都合良く使用され得る他のシステムは、転写開始領域
の組合せの使用である。所望する遺伝子の発現を調節す
るが、しかし内在性RNAポリマラーゼと共に機能しない
ことによって発現宿主において機能性でない第一転写開
始領域が使用される。次に、第二転写開始領域、たとえ
ば誘発性領域がRNAポリマラーゼの発現を調節するため
に使用され、これにより、前記第一転写開始領域が官能
的になる。この場合、発現は、外来性RNAポリマラーゼ
の発現を制御する調節領域の活性化に基づいてのみ生じ
る。このシステムは、T7ファージ転写開始領域、特にT7
ファージの遺伝子９及び10の開始領域により例示され得
る。
他のシステムは、環境、たとえば栄養物の欠乏、温
度、浸透圧、塩度又は同様のものの変化に基づく環境変
化を受ける突然変異体の使用に頼る。このシステムを例
示すると、胞子形成することができるが、しかし胞子形
成に関与される生成物の発現を開始せしめるこれらの成
分を生成することができるB.サブチリス（B.subtilis）
の株が得られる。従って、培地の条件の変化により、胞
子形成に関係する転写開始領域が活性化されるであろ
う。この情況において、宿主は、発現を開始するため
に、必要な誘発性物質又は活性化物質を供給する。
特定の宿において遺伝子の転写及び翻訳の誘発性調節
を提供するための種々の他の技法が存在する。
大部分、宿主は、細菌、藻類、菌類、繊毛菌類、植物
又は動物組織培養細胞、等から選択された単細胞生物、
たとえば原核生物又は真核生物であろう。代表的な宿主
は、E.コリ（E.coli）、B.サブチリス、B.ステアロテル
モフィラス（B.stearothermophilus）、S.セレビシアエ
（S.cerevisiae）、アスペルギラス（Aspergillus）、
ネウロスポラ（Neurospora）、CHO細胞、Hela細胞、等
を包含する、他方、完全な植物も使用され得る。
単独で又は転写に関与するいづれかの補助遺伝子と共
に、所望する遺伝子の発現のための発現構造体が、通
常、発現宿主中への導入のために適切なベクターに連結
されるであろう。多数のベクターが商業的に入手でき
る。それらのベクターは、１又は複数のユニーク制限部
位、宿主における染色体外維持のための複製システム及
び宿主に対する選択的圧力を可能にする１又は複数のマ
ーカーを有することによって通常、特徴づけられる。マ
ーカーは、相補性、栄養要求性宿主への原栄養性、生物
殺生物質、たとえば抗生物質、たとえばペニシリン又は
カナマイシンに対する耐性又は同様のものを提供するこ
とができる。多くの場合、選択的な圧力よりもむしろ、
遺伝子を含む特定のコロニーの検出を可能にするマーカ
ー遺伝子が使用される。この情況は、β−ガラクトシダ
ーゼのための遺伝子により例示され、ここで着色された
生成物を供給する基質が使用される。
いづれか補助遺伝子を含む発現構造体は、既知の技
法、特に制限、挿入及び連結を用いて発現ベクター中に
導入され得る。
次に、発現構造体は、適切な宿主の形質転換のために
使用され得る。宿主に依存して、損なわれていない細胞
又はプロトプラストのいづれかが使用され、ここで形質
転換又は接合が行なわれる。便利には、カルシウム−リ
ン酸塩−沈殿性DNA又は非イオン性界面活性剤が、宿主
中にプラスミドを導入するために使用され得る。宿主の
形質転換のためにベクターを使用する必要がないことは
好ましい。なぜならば、裸のDNAがゲノム中への組込み
のために導入され得るからである。しかしながら、組込
みが所望される場合でさえ、組込みの高い効率が、ベク
ターを用いて達成され、従って、ベクターの使用が好ま
しい。
ベクターの性質に依存し、発現構造体は染色体外要素
上に維持され又は宿主中に組込まれるようになる。組込
みが所望される場合、宿主の染色体における配列に相同
の配列を有することが、原核生物又は真核生物により通
常所望されるであろう。通常、その配列は、少なくとも
約200bp〜約5000bp、普通には約2000bpであろう。相同
の配列の選択は、いく分、任意であるが、しかし、宿主
が栄養要求性突然変異体であり、そしてその相同性が原
栄養性を付与する場合、相補性のために用いられ得る。
次に、形質転換体又は組込み体が、適切な栄養培地中
で高密度に増殖され、続いて、発現構造体の転写システ
ムの性質に従って、転写が誘発される。所望するタンパ
ク質が細胞質に保持される場合、これらの細胞は収穫さ
れ、溶解され、そしてタンパク質の使用に依存して、タ
ンパク質はさらに、従来の技法、たとえばクロマトグラ
フィー、溶媒−溶媒抽出、アフィニティークロマトグラ
フィー及び同様の技法に従って精製され得る。
次の例は、例示的であって、本発明を眼定するもので
はない。
実験 例 １ DNA調製方法 1. E.コリからプラスミドDNAの調製 A.小規模。プラスミドDNAを、煮沸方法又はアルカリ溶
解方法（Maniatisなど.,Molecular Cloning:A Laborato
ry Manual.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Sprin
g Harbor.（1982）のいづれかにより、培養物1.5mか
ら調製した。
B.大規模。プラスミド担持株を、適切な抗生物質を含む
ルリアブイヨン１中で一晩増殖せしめた。細胞を、1
0,000×ｇで５分間、遠心分離により集め、そして氷で
冷却されたTE（10mMのトリス−HCl、pH8、1mMのEDTA）1
0m中に再懸濁した。細胞を再び遠心分離し、TES（TE
及び25％（w/v）スクロース）4mに再懸濁し、そして
渦動することにより均質化した。サンプルを、次の段階
のために氷上に保持した。リゾチーム（10mg/m、1m
）を、細胞懸濁液に添加し、そして５分間インキュベ
ートし、その後、0.5MのEDTA（pH8）2mを添加した。1
0分のインキュベーション後、50mのプロテイナーゼＫ
（40mg/m）を添加し、続いて10分後、溶解緩衝液（0.
1％のTriton X−100、1mMのEDTA、50mMのトリス−HCl、
pH8）15mを添加した。15〜20分後、細胞溶解物を、3
5,000×ｇで90〜120分間、遠心分離した。上清液（19.8
m）を、CsCl20g及びエチジウムブロミド（10mg/m）
400μを有するプラスチック管に移した。溶解した
後、その混合物を、２つのポリアロマー超遠心分離管に
分け、熱により密封し、そして60,000rpmで24時間、Bec
kman Ti65モーターで遠心分離した。低いプラスミドDNA
バンドを皮下注射針により管から除いた。エチジウムブ
ロミドを、同体積のNaCl飽和イソプロパノールにより３
度、抽出した。２体積のH2Oを、そのDNA溶液に添加し、
そして次にDNAをエタノールにより沈殿せしめた。
2. 二本鎖DNAの調製。JM 103の培養物を、約0.2のOD
600に増殖せしめ、そして次に2mのアリコートに分け
た。個々のアリコートを、M13の新鮮なプラークにより
感染せしめ、そして激しく振盪しながら37℃で約６時間
インキュベートした。次に、細胞をペレット化し、そし
て上清液を続く感染のために保存した。二本鎖ファージ
DNAを、煮沸方法（Maniatisなど．）により抽出した。
3. 除タンパク質。フェノール抽出を、便利な体積、典
型的には100μ〜10mのDNAサンプルに対して行なっ
た。DNAサンプルを、0.01Mのトリス−HCl（pH7.5）、1m
MのEDTA溶液に希釈し、そして同体積の水飽和フェノー
ルを添加した。サンプルを、短く渦動し、そして氷上に
３分間、置いた。マイクロフェージにより３分間、遠心
分離した後、水性層を新しい管に除き、そして同体積の
クロロホルム：イソアミルアルコール（24:1）により１
度抽出した。
4. エタノール沈殿。水性緩衝液中、DNAをエタノール
沈殿により濃縮した。DNAサンプルに、3Mの酢酸ナトリ
ウム（pH7.5）1/10体積及び冷エタノール２〜３体積を
添加した。DNAを−70℃で30分間、又は−20℃で一晩沈
殿せしめ、そして次にマイクロフェージにより４℃で15
分間の遠心分離によりペレット化した。そのペレット
を、冷80％エタノール200μにより１度洗浄し、そし
て再び４℃で10分間ペレット化した。空気乾燥又は凍結
乾燥の後、そのペレットを適切な緩衝液に再懸濁した。
5. DNAのホスファターゼ処理。DNAのホスファターゼ処
理を、ウシ小腸ホスファターゼ（Boehringer Mannhei
m）１μ（25単位）を制限酵素消化反応に直接添加
し、そして37℃で30分間、インキュベーションを続ける
ことによって行なった。ホスファターゼを65℃で60分間
不活性化し、その後、フェノール抽出により除タンパク
質を行なった。
6. DNAポリマラーゼＩによりフィル−イン反応。DNA
を、50mMのトリス−HCl（pH7.4）、50mMのKCl、5mMのMg
Cl2及び400μＭのそれぞれ４種のデオキシヌクレオチド
三リン酸を含む緩衝液に再懸濁した。10単位のクレノウ
DNAポリマラーゼ（BRL）を添加し、そしてその反応を室
温で15分間進行せしめた。次に、DNAをフェノール抽出
し、そしてエタノール沈殿せしめた。
7. T4ポリヌクレオチドキナーゼ反応。この反応（10μ
）は次のものを含んだ:T4ポリヌクレオチドキナーゼ
（BRL）、DNA150ng、10×キナーゼ緩衝液（0.7Mのトリ
ス−HCl、pH7.6、0.1MのMgCl2、50mMのDTT）１μ及び
［32P］−ATP（200〜300μCi）。これを37℃で30分間イ
ンキュベートし、そして次に、そのDNAをNACSカラム（B
ethesda Research Labs）を用いて精製した。
8. 制限エンドヌクレアーゼによる消化。DNAを、１×
“AA"緩衝液〔10×AA緩衝液は、330mMのトリス−アセテ
ート、pH7.9、660mMの酢酸カリウム、100mMの酢酸マグ
ネシウム、50Mのジチオトレイトール（DTT）及び1mg/m
のウシ血清アルブミン（ヌクレアーゼを含まない）で
ある〕中で、制限エンドヌクレアーゼ（REN）により消
化した。可能な場合、DNAの濃度を１μg/25μ以下に
維持した。インキュベーションは、ほとんどの制限エン
ドヌクレアーゼのために37℃で１〜４時間であった。但
し、Bal I,Bal I及びNae I消化は一晩インキュベーショ
ンが行なわれた。
9. DNAの分析アガロースゲル電気泳動。ゲル分析のた
めのDNAサンプルに、0.2体積の負荷緩衝液（５×電気泳
動緩衝液、0.01％のブロモフェノールブルー染料、50mM
のEDTA及び50％のグリセロール）を添加した。次に、サ
ンプルを、1.0％（w/v）のアガロースゲルを含む水平浸
水電気泳動のレンズ中に添加した。電気泳動緩衝液は、
１×TAC又は1/2×TBEのいづれかであった。１×TACは、
40mMのトリス−塩基、10mMのEDTA（酢酸によりpH7.8に
調節されている）の溶液である。1/2×TBEは、0.045Mの
トリス−塩基、0.045Mの硼酸、1mMのEDTA、（pH8）であ
る。ゲルは40〜50Vで18時間、作動され、次に除去し、
そして0.5μg/mのエチジウムブロミドにより30分間、
染色した。DNAバンドを、長い波長のUVトランスイルミ
ネーター上で可視化した。
10. 分離アガロースゲル電気泳動。この方法及び材料
は、分析用アガロースゲル電気泳動のための方法及び材
料と同じである。唯一の差異は、精製されるDNAフラグ
メントの大きさに依存して、0.5〜2.5％（w/v）の濃度
範囲の低い融点のアガロースの使用である。DNA制限フ
ラグメントを、エチジウムブロミドにより可視化した
後、LMPアガロースゲルから切断した。
11. NACS精製。DNAを含むゲルフラグメントを、70℃で
５分間、溶融し、そしてTE1（10mMのトリス−HCl、pH7.
5、0.2MのNaCl）により約５倍に希釈した。そのゲル溶
液を、NACSカラム（BRL）に適用した。カラムを同じ緩
衝液5mによた洗浄した。結合されたDNAを、1000bpよ
りも小さなDNAフラグメントのためにTE2（10mMのトリス
−HCl、pH7.5、1.0MのNaCl）300μ又はそれよりも大
きなフラグメントのためにTE3（10mMのトリス−HCl、pH
7.5、2MのNaCl）300μにより希釈した。その希釈され
たDNAを、エタノール沈殿により濃縮した。
12. DNA連結反応。付着端を連結するための反応は次の
ものを含んだ:1μｇのDNA、１×AA緩衝液（上記段階８
を参照のこと）、1mMのATP及び20単位のT4 DNAリガーゼ
（BRL）（最終反応体積20μ中において）連結を、15
℃で16〜18時間又は室温で１〜２時間、進行せしめた。
ブラント末端連結のためには、その反応は、反応体積20
μ中に、１μｇのDNA、25mMのトリス−HCl、pH7.5、5
mMのMgCl2、5mMのDTT、0.25mMのスペルミジン、200mgの
BSA、1mMのヘキサミンコバルトクロリド（HCC）、0.5M
のATP及び400単位のT4 DNAリガーゼ（NEB）。連結は、
室温で30分〜１時間、進行せしめられた。
細菌の形質転換方法 1. 形質転換−コンピテントE.コリ細胞の調製。殺菌し
たＬブイヨン200mの培養物を、少量（ループいっぱ
い）のE.コリ細胞により接種した。これを、OD600が約
0.5に達するまで、37℃で振盪しながらインキュベート
した。培養物を氷上に10分間置き、そして6,000×ｇで1
0分間、遠心分離した。細胞ペレットを、氷で冷却され
た100mの0.1MのMgCl2中に再懸濁し、30〜40分間、氷
上に維持し、そして再び遠心分離した。そのペレットを
2mの氷により冷却された100mMのMgCl2中に再懸濁し、
殺菌した試験管に移し、そして24時間、氷上でインキュ
ベートした。次に、コンピテント細胞をアリコートし、
そして−70℃で保存した。
2. E.コリの形質転換。凍結コンピテント細胞のアリコ
ートを、氷上で融解した。細胞50μに、0.1〜１μｇ
のDNAを添加し、そしてその混合物を30分間、氷上でイ
ンキュベートした。試験管を氷から取り出し、そして42
℃の槽中に２時間、置いた。Ｌブイヨン（1m）を添加
し、そしてその形質転換混合物を、所望する温度（通常
30℃又は37℃）で２時間、振盪しながらインキュベート
した。次に、形質転換物の1/10を、適切な抗生物質を含
むＬブイヨンプレート上に置き、そして必要なら、XGAL
及びIPTGを添加した。
抗体生成、タンパク質の化学及びタンパク質の電気泳動 1. 人工的に合成されたペプチドに対する抗体の調製。
配列（GAGAGS）8GAAGYの合成ペプチドを、Kagen及びG
lick（1979）のグルタルアルデヒド方法を用いてBSAに
結合した。結合の程度を、少量の放射性ヨード化された
合成ペプチドを用いてモニターした。完全フロイントア
ジュバント中、1mg/mの濃度でのペプチド接合体を用
いて、０日目でウサギを免疫化した。動物を、３日目で
不完全フロイントアジュバント中、抗原により再注射
し、そして６日目で力価せめした。陽性血清を、抗原と
して合成ペプチドを用いるマイクロタイターRIAを用い
て検出した。Kagen及びGlick（1979）,Methods of Radi
oimmunoassay,Jaffe及びBerman（出版者）、Academic P
ress,328ページを参照のこと。
SLP III配列（Ｖ−Ｐ−Ｇ−Ｖ−Ｇ）８に対応する53
個のアミノ酸のペプチドを、Applied Biosystemsペプチ
ド合成機により調製した。36×０の分子量を有するこの
材料の収量は、約0.5gであった。そのペプチドをウシ血
清アルブミンに結合した。この材料を、ウサギにおける
抗体の調製のためにAntibodies,Inc.に送った。SLP III
配列の合成ペプチドと反応した抗血清を得た。これらの
抗血清は、gly−ala配列を含む融合ペプチドの検出のた
めに有用であった。
上記方法の後、免疫原として使用するためにキーホー
ルリンペット（Keyhole limpet）ヘモシアニンに結合さ
れた、配列（GAP［GPP］４）２（CLP部分）及びフィブ
ロネクチンの式YTITVYAVTGRGDSPASSKDISINYC（FCB部
分）を有する追加の抗原を合成した。次に、PCB及びCLP
ペプチドに結合されるポリクローナル抗血清を調製し
た。
2. タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動。増
殖培養物からの約109個のE.コリ細胞を、10,000×ｇで
５分間、遠心分離によりペレット化した。その細胞ペレ
ットを、２×サンプル緩衝液（100mMのトリス−HCl、pH
6.8、４％SDS、10％Ｂ−メチルカプトエタノール、60％
グリセロール又はスクロース）100〜500μに再懸濁
し、そしてTekmar音波破壊機を用いて30秒間、音波処理
した。サンプルを約５分間、煮沸し、そしてその細胞破
壊物20〜100μを、SDS−ポリアクリルアミドゲル（7.
5〜16％（w/v））上に負荷した。ゲルは、Laemmli（Nat
ure,27:80〜685（1970））の方法に従って調製された。
ゲル中のタンパク質を、10％メタノール、7.5％酢酸
中、２％クーマシーブリリアントブルーにより１時間、
染色し、そして10％メタノール、7.5％酢酸により一
晩、脱色した。
3. ゲル中のタンパク質のイムノブロット。タンパク質
の電気泳動の後、フランギングガラスプレートの１つ
を、ポリアクリルアミドゲルから除いた。ゲル表面を、
移行用緩衝液（25mMのトリス−HCl、192mMのグリシン、
20％のメタノール）により湿潤した。ニトロセルロース
紙片（Sartorius,SM11307）を、移行用緩衝液により飽
和し、そしてゲル上に置いた。フィルターとゲルとの間
の空気胞を除去した。ゲル及びニトロセルロースフィル
ターを、製造者（Bio−Rad）により特定されるようにし
て、トランスファー単位に置いた。トランスファーを、
200mAで３〜４時間、進行せしめた。次に、ニトロセル
ロースフィルターを除き、そしてAmido−Schwartz（0.0
5％のアミドブラック、45％の脱イオン水、45％のメタ
ノール、10％の酢酸）により３分間、染色し、そして水
中で脱色した。フィルターを、“BLOTTO"（５％（w/v）
の非脂肪ドライミルク、50mMのトリス−HCl、pH7.4、0.
9％（w/v）のNaCl、0.2％（w/v）のアジ化ナトリウム）
中において室温で少なくとも10分間インキュベートし
た。フィルターを、0.5×Blotto（2.5％の非脂肪ドライ
ミルク、50mMのトリス−HCl、pH7.4、0.9％のNaCl、0.2
％のアジ化ナトリウム）中に希釈された血清（1:50〜1:
500）中に置き、そして約16時間、室温で軽く撹拌し
た。そのフィルターを、TSA（50mMのトリス−HCl、pH7.
4、0.9％のNaCl、0.2％のアジ化ナトリウム）により５
回、１時間洗浄した。ブロットを、１×107cpmの125I−
プロテインＡを含む0.5×BLOTTO溶液15m中に置き、そ
して室温で２時間、軽く撹拌した。そのフィルターを、
TSAにより最少７回、２時間洗浄し、脱イオン水により
１度すすぎ、そして空気乾燥せしめた。ブロットをサラ
ンラップにより被覆し、オートラジオグラフィー処理し
た。
4. アミノ酸分析。アミノ酸組成物を、Henrickson及び
Meredith（1984）のPTC誘導方法により決定した。タン
パク質サンプルを、108℃での5.7Nの一定の煮沸HClによ
り24時間、真空下で加水分解した。PITCとの反応の後、
アミノ酸誘導体を、Hewlett Packard 1090システム及び
移動性基礎として0.1MのNH4OAc（pH6.78）中、０〜50％
のアセトニトリルの線状グラジェントによるSupelco C1
8カラム（4.6mm×25cm）を用いてHPLC逆相クロマトグラ
フィーにより254nmで検出した。Henrickson,R.L.及びMe
redith,S.C.（1984）Amino Analysis by Reverse Phase
High Performance Liquid Chromatofraphy.,Anal.Bioc
hem.137:65〜74を参照のこと。
5. アミノ酸配列の分析。Ｎ−末端アミノ酸配列を、Ap
plied Biosystems Model 470Aガス相タンパク質配列決
定機を用いて自動エドマン分解により決定した。PTHア
ミノ酸誘導体を、Hewlett Packard 1090システム及び複
合グラジエント緩衝液システムを有するAltex C18カラ
ム（2mm×25cm）を用いて、逆相HPLCにより分析した。
6. ペプチド合成。合成ペプチドを、製造業者による供
給されるような標準の対称無水物化学を用いて、Applie
d Biosystems Model 430Aペプチド合成機による固相合
成により調製した。それぞれの段階での結合収率を、Sa
rinなど.,（1981）の定量ニンヒドリン方法により決定
した。合成ペプチドを固体支持体から切り出し、そして
アミノ酸阻止グループを、無水HF（Stewart及びYoung,1
984）を用いて除いた。粗ペプチドを、Sephadex G−50
上でのクロマトグラフィー処理により脱塩化した。Sari
n,V.K.,Kent,S.B.H.,Tam,J.P.及びMerrifield,R.B.（19
81）,Anal.Biochem.237:727〜936,Stewart J.M.及びYou
ng,J.D.（1984）,Solid Phase Peptido Synthesis,Pier
ce Chemical Company,Rockford IL.85〜89ページを参照
のこと。
合成DNA方法 1. インビトロDNA合成。N,N−ジイソプロピルホスホラ
ミジト、調整された多孔性ガラスカラム及びすべての合
成試薬を、Applied Biosystems,Foster City,Californi
aから得た。
合成オリゴヌクレオチドを、10倍過剰の保護されたホ
スホラミジト及び合成支持体カラムに結合されたヌクレ
オチド１μモルを用いて、Applied Biosystems Model 3
80A DNA合成機によるホスフィットトリエステル方法に
より調製した。合成のために使用される化学は、合成機
と共に使用するために推薦される標準方法であり、そし
てMatleucciなど.,J.Amer.Chem.Soc.,103:3185〜3319
（1981）に記載されている。固体支持体からのオリゴマ
ーの保護解除及び切断は、McBrideなど.,Tetrahedron L
etters,24:245〜248（1983）により記載されるような標
準方法に従って行なわれた。Applied Biosystems（198
4）により推薦されるような除去された保護基の光学密
度により測定されるような合成の反復収率は、97.5％以
上であった。
粗オリゴヌクレオチド混合物を、1984年11月９日のAp
plied Biosystems Protocols（使用者会報第13号）に記
載されるようにして分離用ゲル電気泳動により精製し
た。アクリルアミドゲル濃度は、オリゴマーの長さに依
存して、10〜20％に変化した。精製されたオリゴマー
を、UVシャドウイング法により同定し、ゲルから切り出
し、そして粉砕及びソーク方法（Smith,Method in Enzy
nology,65:371〜379（1980））により抽出した。
2. DNAの配列決定。DNA配列を次の方法により決定し
た。対象の領域を含むフラグメントを、M13mp18又はM13
mp19（Maniatisなど.,1982、及びNorranderなど.,198
3）の複数のクローニング部位中にクローン化した。
一本鎖DNAを調製し、そしてラベルとして35S−デオキ
シアデノシン−５′−（α−チオ）−トリホスフェート
（New England Nuclear）を用いてプライマーエクステ
ンション法（Sangerなど.,1977及びBigginなど.,1983）
により配列決定した。多くの場合、逆転写酵素（Molecu
lar Genetics）が、Zagurskyなど．（Gene Anal.Tech.
（1985）:89〜94）により利用されたジデオキシ：デオ
キシヌクレオシデトリーホスフェート比を用いて、プラ
イマーを延長するために使用された。32S又は35Pのいづ
れかによりラベルされたデオキシアデノシントリホスフ
ェートを、これらの反応に使用した。いくつかのＧ−Ｃ
に富む酸列に現われる圧縮人工物がＧ反応からデオキシ
グアノシントリホスフェートを排除することによって、
及び代わりに、37.5μＭの最終濃度でデオキシイノシン
トリホスフェート（Ｐ−L Biochemicals）を用いて克服
された。他の混合物においては、Ｇ反応におけるジデオ
キシGTPの濃度は0.5mMであった。すべての配列決定は、
8Mの尿素を含む６又は８％ポリアクリルアミドゲル上で
行なわれた（Sangerなど.1978）。配列決定のために使
用されるプライマーは、Ｐ−L Biochemicalsから入手さ
れた。データの保存及び分析は、DNAstar及びInternati
onal Biotechnologies,Inc.の両者からのソフトフェア
ーを利用した。
発酵条件 発酵器は、10の作業体積を有する15のChemapであ
る。培養条件は次の通りである：温度＝30℃、pH＝6.8;
2.5MのNaOHがpH調節のために使用される。ヘッドスペー
ス圧力は、0.1バール以下である。溶解された酸素は50
％で調節される。空気の流れは、0.5／分〜20／分
に変化する。撹拌速度は、200〜1500rpmであった。
発酵器を、撹拌しながら30℃で15時間、培地Ａで増殖
される10％（v/v）の植え込みにより接種する。
培地Ｂは、発酵器培地であった。開始体積は５であ
った。
グルコース濃度が１％に達した時、培地Ｂの濃縮溶液
（５×）を、グルコース濃度を約１％で維持するために
発酵器に添加した。培養物が60.0のOD600に達した時、
その温度を10分間42℃に上げ、次に2.5時間39℃に下げ
た。次に、細胞を遠心分離により収穫し、そして処理す
るまで−70℃で凍結した。
例 ２ SLP III遺伝子のアセンブリー及び発現 1. SLP III遺伝子をアセンブリーするためのスケムの
要約。SLP IIIは、絹フィブロイン分子にひじょうに類
似する。なぜならば、それは規則的な間隔（約60個の残
基）でアミノ酸チロシンを含むからである。SLP III遺
伝子を、小さな部分からアセンブリーした。まず、長さ
約60bpのDNAの３個の二本鎖断片を化学的に合成した。
個々の断片を、バクテリオファージM13中への挿入によ
りクローン化し、そしてそのDNA配列を確証した。次
に、これらの断片を、ベクターから除き、そして特定の
順序で一緒に連結した。約180bpのこの結合は、SLP III
“モノマー”と命名される。次に、“モノマー”を特定
の順序で連結し、SLP IIIのジマー、トリマー、テトラ
マー、等を生成した。次に、それらのマルチマーは、SL
P IIIタンパク質を検出するためにプラスミド発現ベク
ター中に直接、又は初め、アダプタープラスミド中にク
ローン化された。アダプターへのSLP III DNAの挿入
は、追加の遺伝子操作を可能にし、そして後で、さらに
記載される。アセンブリースケムは、次の通りに描かれ
る： SLP III遺伝子の３種の断片のDNA及び対応するアミノ
酸配列が、第２表に示される。
二本鎖DNA配列は、５′から３′の方向に示されてい
る。配列によりコードされるアミノ酸（ｇ＝グリシン、
ａ＝アラニン、ｓ＝セリン、ｙ＝チロシン）は、個々の
断片のすぐ下に示されている。
上記６種の一本鎖が合成された。合成の後、DNAの鎖
を精製し、そして相同の鎖をアニールした。個々の鎖約
１μ（0.5μｇ）を、1.5mのポリプロピレンEppeneo
rf管中で、10×AA（例１のセクション８で定義された10
×AA）２μ、緩衝液及び殺菌された脱イオン水16μ
と共に混合した。その管を、煮沸槽（１のビーカーに
おいて500m）に10分間置き、そして次にそのビーカー
をホットプレートから除き、そしてベンチ上で室温に冷
却した。これは、約１〜２時間を要した。
個々の３種の二本鎖断片を、M13mp18中に別々にクロ
ーン化した。断片１を、複数のクローニング部位のSma
I及びBamH I制限部位間に連結した。断片２を、BamH I
及びPst I部位間に連結した。そして、断片３を、Pst I
部位とHin d III部位間に挿入した。それぞれのクロー
ンは次のように命名された:M13mp18.1,M13mp18.2,M13mp
18.3。そのDNA配列を、それぞれのクローン化された断
片のために決定した。正しいDNA配列を有するそれぞれ
の断片の１つの代表的な断片を回収し、そして次の段
階：“モノマー”のアセンブリーのための材料として使
用した。
2. SLP IIIの“モノマー”のアセンブリー。DNA断片２
及び３を、制限酵素によるM13クローンの消化により単
離し：断片２のためには、M13mp18.2をBamH I及びPst I
により消化し；断片３のためには、M13mp18.3をPst I及
びHin d IIIにより消化した。これらの２種の断片を精
製し、そしてBamH I及びHin d IIIにより初めに消化さ
れたM13mp18.1の等モル量と共に一緒に混合した。T4 DN
Aリガーゼを添加し、１−２−３の順序で相同のオーバ
ーラップ末端を連結した。付着端のハイブリダイゼーシ
ョン特異性により、３種の断片を、この順序でのみ効果
的に連結した。M13mp18.1.2.3と命名されたアセンブリ
ー中のクローン化された“モノマー”のDNA配列は、正
しいことが決定され、そして上記第２表に示された。
3. SLP IIIの“モノマー”のマルチマー化。多量の
“モノマー”構造遺伝子を調製するために、まず、プラ
スミドベクターpUC12中に“モノマー”をサブクローン
化した。
M13mp18.1.2.3を、EcoR I及びHin d III制限酵素によ
り消化した。SLP III“モノマー”をゲル精製し、そし
てEcoR I及びHin d IIIにより消化されたpUC12中に連結
した。その得られたプラスミドDNAを調製し、“モノマ
ー”をBan I RENによる消化によりベクターから開放
し、そしてそのフラグメントをゲル精製した。
マルチマーを構成するために、Ban I末端を有する
“モノマー"DNAを、連結により結合した。非パクンドロ
ーム性末端Ban I認識配列は、前部から後部（head−to
−tail）の順序でのみ結合を可能にする。マルチマー化
の程度を、ゲル電気泳動及びエチジウムプロミドによる
DNAの染色によりモニターした。20個以上の単位のマル
チマーを、この方法により得た。
4. SLP IIIのマルチマーのクローニング。プラスミドp
CQV2（Queenなど.,J.Appl.Mol.Gen.,2:1〜10（1983））
を、EcoR I及びBanH I制限エンドヌクレアーゼにより消
化し、そして約900bpのフラグメントを精製した。このD
NAフラグメントは、バクテリオファージλc I−857レプ
レッサー遺伝子、隣接して結合された左側の方のプロモ
ーター、PR及びcro遺伝子の開始部分を含む。プラスミ
ドpSY335（Ferrariなど.,J.Bacteriology,161:556〜562
（1985）にpJF751として記載される）をEcoR I及びBamH
I制限酵素により消化し、そして続いて、pCQV2の約900
bpのDNAフラグメントに連結した。この構成から得られ
たプラスミド、pSY751は、37℃及び42℃でβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子を発現する（但し、30℃では発現しな
い）。
このアプローチにおいては、SLP III遺伝子がまず、
中間プラスミドにおける“アダプター”配列中にクロー
ン化され、そして次に、発現システムにサブクローン化
される。そのアダプター配列は、次の有用な特徴を有す
る：ユニークな中央のBan I REN部位、Ban Iのいづれか
の側に対する３種のユニークなREN部位、メチオニン、
アスパラギン酸−プロリン又はアルギニンアミノ酸のい
づれかでのタンパク質切断のための情報コード及び小さ
なサイズ。Ban I部位は、Ban I部位を有するSLP IIIマ
ルチマーのための挿入の点である。
アダプターを、Applied Biosystems 380A Synthesize
rにより合成し、M13mp18にクローン化し、そしてDNA配
列を確かめた。次に、そのアダプターを、Ban I REN部
位を欠く特異的に構成されたプラスミドベクター中にサ
ブクローン化した。受け入れプラスミドと、次のように
して構成した。プラスミドpJH101（Ferrariなど.,198
3）をAha III制限酵素により部分的に消化し、そして再
連結した。E.コリHB101の形質転換体を、クロルアンフ
ェニコール（12.5mg/m）を含む媒体上で選択した。い
くつかの単離体の制限分析の後、１つのプラスミド、pS
Y325を選択した。このプラスミドは、クロルアンフェニ
コール−耐性遺伝子及びpJH101の複製起点（pBR322から
の）のみを含む。Xho IIにより完全に消化した後、pSY3
25を、ゲル精製されたアダプターにより連結した。その
結果は、アダプター−プラスミド、pSY937であり、そし
てその新しいREN部位を確かめた。
SLP IIIマルチマーを、pSY937のBan I部位中にクロー
ン化した。陽性のクローンを、コロン−ハイブリダイゼ
ーションにより及びハイブリダイゼーションのためのDN
Aプローブ（第２表に示されるプローブ配列）としてのS
LP IIIの断片１の低い鎖により同定した。陽性クローン
を、挿入されたマルチマーの大きさについてゲル電気泳
動により特徴づけた。最後に、SLP III配列を、フラン
キングアダプター領域におけるREN部位を用いて、発現
プラスミドの特異的位置にサブクローン化した。
SLP IIIタンパク質は、次のアミノ酸組成を有した： SLP III発現ベクター プラスミドDNA pSY1086は、SLP IIIの19反復体（3.5K
b）を含むpSY937誘導体である。このプラスミドDNAを、
Nru I及びPvu IIにより消化し、そしてこのフラグメン
トをアガロースゲル電気泳動により分離した。次に、精
製されたSLP IIIマルチマーを、Pvu II RENにより消化
されたプラスミドpSY751にクローン化した。いくつかの
クローンを分析し、そして１つのクローン（pSY1008）
を選択し、発現実験及びSLP III精製に使用した。
pSY1008のアンピシリン薬物耐性遺伝子を、pSY1010
（Dra I及びSep IによるpSY633の消化及びpUC4KのHin c
II消化により得られたKanRの挿入により生成された）
からのカナマイシンマーカーにより置換し、そして得ら
れたプラスミドをpSY1186と命名した。プラスミドpSY11
86のSLP III部分のBan Iにより除去することによって、
新規プラスミド、pSY1262を生成した。このプラスミド
は、モノマーの重合により得られたBan I末端を含むフ
ラグメントの直接的な連結を可能にするユニークなBan
I部位を含む。このプラスミドを用いて、次のタンパク
質:SELP1,2,3及びSLP 4のための挿入体を含むプラスミ
ドを生成した。
SLP IIIの生成及び精製 細胞培養。E.コリは、次の培地に培養される： 成 分 g/ 酵母抽出物 20 カサミノ酸 20 ペプトン 20 ゼラチンペプトン 20 KH2PO4 ２ K2HPO4 ２ Na2HPO4・7H2O ２ グルコース ２ アンピシリン 0.1 30℃で増殖された一晩の培養物（500m−１）を用
いて、500の発酵器中に含まれる培地375を接種し
た。発酵器条件は、100rpmの回転速度計読み、5psiの容
器背圧及び溶解されたO2を50％以上で維持するための17
0／分の空気の流れを包含する。
グルコース（1g/）及びアンピシリン（0.05g/）
を、培養物が1.0のOD650に達した時及び2.0に再び達し
た時、発酵物に添加した。培養物が2.0のOD650に達した
場合、温度を42℃に10分間上げ、そして次に38℃に２時
間下げた。次に、培養物を10℃に急冷せしめ、そして細
胞を連続した遠心分離により収穫し、そして処理するま
で−70℃で凍結した。２つの発酵からの収量は、7.3kg
及び5.2kgの湿量の細胞であった。
他の培地も使用され得、そして種々のプラスミドと共
に、種々の選択条件（すなわち、アンピシリンとカナマ
イシンとの置換）が付与されることが注目されるべきで
ある。これらの条件は、実験室規模の発酵（10の体
積）に使用されて来た。
細胞溶解。
方法１。細胞を融解し、そして1kg湿量/50mMのトリス−
HCl、pH7.0、1mMのEDTA溶液６の濃度に懸濁し、そし
て8000psiでのAPV Gaulin細胞粉砕機を２回通すことに
より破壊した。この溶解工程の間、細胞を氷浴により冷
たく維持した。次に、細胞溶解物を遠心分離機、たとえ
ば４℃で操作されるSorvall RC5B冷却遠心分離機におけ
るTZ−28ローターにより連続して26,000×ｇで遠心分離
した。これらの条件下で、生成されるSLP IIIの90％以
上がペレットに見出され得る。上清物は、下記のように
してNH4SO4沈殿法により回収され得るある生成物を含
む。ペレットは、下記のようにしてLiBrにより抽出され
る。
方法２。凍結細胞を融解し、そして1kg湿量/50mMのトリ
ス−HCl、pH7.0、10mMのEDTA溶液６の濃度に再懸濁
し、そして5mMのPMSFによりプロテアーゼ活性を阻害し
た。細胞をこの緩衝液中において、室温で0.5〜２時間
撹拌し、次にリゾチームを添加し、1g/の濃度にし、
そしてインキュベーションを20分間続けた。次に、β−
メルカプトエタノールを添加し、70mMにし、そして次
に、界面活性剤NP40を、続けてその細胞懸濁液を撹拌し
ながら、20分間にわたって添加し、１％の最終濃度にし
た。MgCl2を添加し、50mMにし、続いて1mg/の濃度で
のDNAseを添加し、そしてインキュベーションを室温で2
0分間続けた。次の細胞溶解物を、方法１におけるよう
にして、26,000×ｇで続けて遠心分離し、そして上清液
を集め、そして26,000×ｇで２回目の遠心分離を行なっ
た。この２回目の遠心分離から得られる上清物は、合計
＜５％のSLP IIIを含み、そして下記のようにしてNH4SO
4により回収され得る。第１回及び第２回の26,000×ｇ
遠心分離から得られるペレットを組合し、そして下記の
ようにしてLiBrにより抽出した。
方法３。この方法のために、T7ファージリゾチームをコ
ードする第二プラスミドを含むE.コリの株を用いた。こ
のプラスミドは、SLP III遺伝子及び耐薬物決定基をコ
ードするプラスミドと適合できる。その株を、初めの２
つの方法におけるのと同じ培地及び同じ条件下で増殖せ
しめる。しかしながら、細胞内のT7リゾチームの生成に
より、それらの細胞壁が弱くなり、そしてそれらは、＞
100mMへのEDTAの添加及び0.5〜1.0％（v/v）の濃度への
NP40の添加により発酵の完結で容易に溶解され得る。溶
解はまた、NP40の代わりに発酵ブイヨンへのクロロホル
ム（20m／）の添加により達成され得る。他方、細
胞は、溶解の前、遠心分離により集められ、初めの２つ
の方法に記載されるようにして1kg湿量/6のトリス−E
DTAの濃度に再懸濁し、そして次に、NP40又はクロロホ
ルムの添加により溶解した。いづれかの方法による細胞
溶解の後、溶解物を、初めの２つの方法に記載26,000×
ｇで連続して遠心分離した。これらの方法に関しては、
ペレットのLiBr抽出法及び上清物のNH4SO4沈殿法を用い
て、生成物を回収した。
SLP IIIの精製 上記のようにして26,000×ｇでの細胞溶解物の遠心分
離により得られたペレットを、等体積の9MのLiBrにより
抽出した。塩溶液を添加し、そしてペレットを室温（R
T）で撹拌することによって均等に懸濁した。均等な懸
濁液が得られた後、その混合物をRTで１時間撹拌する。
次に、その混合物を、４℃又はRTで、26,000×ｇで連続
して遠心分離し、ペレット及び上清液画分を生成する。
上清物を保存し、そしてペレットを上記のような同体積
の9MのLiBrにより再抽出する。１時間の混合の後、その
混合物を、26,000×ｇで遠心分離し、そしてこの遠心分
離からの上清物を、初めのLiBr抽出からの上清物と組合
し、そして４℃で一晩放置する。細胞溶解物の26,000×
ｇでのペレットに含まれるSLP IIIの約90％を、この方
法を用いてLiBrにより抽出する。
LiBr抽出物を、４℃で一晩放置した後、沈殿物が形成
し、26,000×ｇで遠心分離により除かれ、そして捨てら
れる。次に、上清物を透析バッグに置き、そして数回の
dH2Oの交換により２日間、透析する。LiBrは透析により
除かれるので、SLP III生成物は透析バッグに沈殿す
る。その沈殿物を遠心分離により集め、そしてdH2Oによ
り２〜３度洗浄する。最終的に洗浄された生成物を遠心
分離し、そして凍結乾燥せしめる。
26,000×ｇでの上清液画分からSLP IIIの回収のため
に、NH4SO4沈殿法を用いる。固体NH4SO4と、38％飽和が
達成されるまで（231g/）、４℃で維持されているサ
ンプルにゆっくりと添加する。次にその混合物を４℃で
２〜３時間、撹拌する。沈殿物を、連続した流れの遠心
分離機での遠心分離により回収し、そして同体積の蒸留
水又は0.5％SDS水溶液により４〜５度洗浄する。個々の
洗浄の後、沈殿物を連続した遠心分離により回収する。
ペレットは、汚染タンパク質が除かれるので、連続的な
洗浄によりますます白色になる。SLP IIIを洗浄ペレッ
トとして回収し、そして凍結乾燥せしめる。
SLP IIIのトリプシン処理段階 SLP IIIを、50mMのトリス−HCl、pH8.0、0.1MのNaCl
緩衝液に懸濁し、そして37℃の水浴に置き、そしてTPCK
処理されたトリプシン溶液を前記懸濁液中に混合した。
最終トリプシン濃度は0.1％であった。３時間後、その
溶液を16,000×ｇで15分間遠心分離し、そのペレット
を、まず半分に等しい体積の0.5％SDS水溶液、次に蒸留
水により洗浄した。個々の洗浄の後、ペレットを遠心分
離により回収した。最終生成物を水に再懸濁し、そして
さらに分析のために４℃で維持した。
トリプシン処理により、SLP IIIを99.4％の純度に精
製した。
SLP IIIの物理的測定 精製された絹様タンパク質の物理的測定を、微生物学
的に生成された反復アミノ酸ポリマーが天然に存在する
ポリマーの性質を完全に模倣していることを立証するた
めにカイコノガ（Bumbyx mori）の絹の物理的測定値と
比較した。物理的測定はカイコノガの絹フイブロインの
結晶領域のための逆平行鎖プリーツシートコンホメーシ
ョンのモデルを確かめるために行なわれた（Marsh,Core
y及びPauling,Biochem.Biophys.Acta（1955）16;Paulin
g及びCorey,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1953）39:24
7）。SLPフィルムから得られるＸ−線回折パターンの予
備分析は、Fra ser,MacRai及びSteward（1966）により
記載された分析と一致する。SLP IIIの円二色性（CD）
及びフーリエ交換赤外（FTIR）分光分析は、ひじょうに
延長されたβ及びβ−回転コンホメーションと一致す
る。SLP IIIから得られたスペクトルと種々の溶媒中に
おける天然に存在する絹フィブロインのスペクトルとの
比較（Isuka及びYoung,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（196
6）55:1175）は、溶液におけるSLP IIIが、絹フィブロ
インに見られるランダム及び高い定序構造体の混合物か
ら成ることを指摘する。
このデータは、SLP IIIが、高い結晶性ドメイン中に
パックできる延長されたβ鎖を含むことを示す。このデ
ータはまた、明逆なβ−回転（逆回転）コンホメーショ
ンの存在を示す。Chou及びFasman（1974），前記により
開発された二次構造予測のための数字を用いてのSLP II
Iのアミノ酸配列のコンピューター分析は、AGYG配列が
β−回転傾向を有することを示す。
第３表 材 料 ａ（Ａ） ｂ（Ａ） ｃ（Ａ） （AG）ｎ 9.42 6.95 8.87 （AGAGSG）ｎ 9.39 6.85 9.05 CTP画分 9.38 6.87 9.13 Nativeフィブロイン 9.40 6.97 9.20 SLP III 9.38 6.94 8.97 Fraserなど.,J.Mol.Biol.（1966）19:580に引用され
ている。
例 ３ PCB−SLP IIIの構成 企 画 SLP IIIポリマー（上記及びまた1987年10月29日に提
出された出願番号第114,618号、PCT/US/87/02822を参照
のこと）を選択した。なせならば、それは、有用な生成
物の二次加工を可能にし；広範囲の種類の適用のために
良好な構造特性を有し；相互作用鎖間にβ−回転構造を
有し；そしてその回転配列と他の配列との置換を可能に
する予測される構造を有するからである。フィブロネク
チン細胞−結合ドメイン、すなわちアミノ酸1405〜1512
は、強い回転傾向を有し、そして細胞付着性を提供する
トリペプチドRGDを有し、隣接するβ−鎖間の親水性ル
ープ内に存在することが予測される。この提案されたル
ープ構造を補う10個のアミノ酸配列（フィブロネクチン
細胞結合又はFCB配列として言及される）が、SLP III主
鎖内の挿入されるアミノ酸の官能ブロックを構成するた
めに選択された。SLP III主鎖内の挿入部位を、回転構
造を付与することがまた、予測されるアミノ酸配列GAAG
Yに対応するように選択した（Chou及びFassman（1974）
BiochemistryB:222〜244）。この企画は、FCB構造の保
存を可能にし、そして同時に、SLP III（GAGAGS）９β
−鎖結晶−パッキングドメインの最小の破壊を引き起こ
す。
DNA合成及び遺伝子構成 SLP III遺伝子モノマーは、提案された回転構造体、G
AAGYをコードする配列内にPst I制限エンドヌクレアー
ゼ部位を含む。この部位を用いて、FCB配列の10個のア
ミノ酸をコードする合成DNAを挿入した。36個の塩基の
長さの、FCB部位を含む２種の相補的DNA鎖を、合成し、
それらは下記に示される配列から成る： これらのオリゴヌクレオチドを、例１に記載される方
法に従って精製し、そしてpSY1304のPst I部位中にクロ
ーン化した。pSY1304はSLP IIIの単一のモノマー遺伝子
フラグメントを含む。pSY1304 DNAをPst Iにより消化
し、そしてPCBオリゴヌクレオチドの混合物と連結し
た。その連結反応生成物を、E.コリ細胞中に形質転換し
た。そのプラスミドを含むコロニーを、抗生物質クロラ
ムフェニコールを含む細菌培養プレート上で選択した。
個々のコロニーを増殖せしめ、そしてプラスミドDNAを
精製し、そしてNhe Iによる制限消化によりFCBオリゴヌ
クレオチド配列の存在について分析した。この制限部位
を含むプラスミドを、DNA配列決定にゆだね、そして２
種の候補体は正しいことが示された。これらのpSY1325
及びコードされたアミノ酸配列の１つの一部のヌクレオ
チド配列は、次の通りに示される： PCB−SLPモノマー遺伝子フラグメントを、Ban Iによ
る消化、アガロースゲルで電気泳動及びNACS精製（例１
の11）によりpSY1325から精製した。そのモノマー遺伝
子フラグメントを自己連結し、そしてBan Iにより消化
されたpSY937中にクローン化した。この連結の生成物
を、E.コリ中に形質転換し、そしてクロラムフェニコー
ル上での増殖について選択した。個々のコロニーからの
プラスミドDNAを、Nru I及びEcoR Vによる消化及びアガ
ロースゲル上での電気泳動により複数のFCB−SLPモノマ
ーフラグメントを含む挿入体について分析した。２つの
挿入体（１つは約2.1kb及び他は2.8kbである）を含む１
つのクローンを同定した。両挿入体を個々にクローン化
し、そして発現ベクターpSY751にトランスファーした。
プラスミドpSY1325をNru I及びPvu IIにより消化し、そ
して2.1及び2.8kbの挿入体バンドを精製した。これらの
DNAフラグメントを、Pvu IIによりすでに消化されてい
るpSY751に連結した。この反応の生成物をE.コリ中に形
質転換し、そして抗生物質アンピシリン上での増殖によ
り選択した。個々のコロニーからのプラスミドDNAを、F
CB−SLPポリマー遺伝子の存在について制限消化により
分析した。それぞれ2.1及び2.8kbの挿入体を含む２種の
クローン、pSY1520及びpSY1521を同定した。
生成物の精製 pSY1520及びpSY1521を含むE.コリ細胞を、50μg/m
のアンピシリンを含むLB培地中において30℃で、0.7のO
D600まで増殖せしめた。PCB−SLPポリマータンパク質の
生成を、培養温度を42℃に1.5時間上げることによって
誘発した。細胞を遠心分離により収穫し、そしてドデシ
ル硫酸ナトリウム（SDS）及びβ−メルカプトエタノー
ルを含むサンプル緩衝液中において100℃で５分間、加
熱することにより溶解した。５×108個の細胞に相当す
るこれらの溶解物のサンプルを、SDSを含む８％ポリア
クリルアミドゲルに適用し、電気泳動し、そして電気ブ
ロットによりニトロセルロースフィルターに移した。そ
のフィルターを、抗−SLP又は抗−FCBペプチド抗体と共
にインキュベートした。抗−SLP抗体との特異的免疫反
応性が、pSY1520の溶解物に約75Kd,pSY1521の溶解物に9
5Kd及びSLP IIIクローンpSY1186の溶解物に120Kdのタン
パク質バントで観察された。抗−FCB抗体との反応性
は、２種のFCB−SLPポリマーバンドについてのみ観察さ
れた。
pSY1521を含むE.コリを、例１に記載されるバッチ方
法条件を用いて１レベルで発酵せしめた。25gの湿量
の細胞を遠心分離により収穫し、そして15,000psiでの
フレンチプレスにより破壊した。その細胞溶解物を16,0
00×ｇで20分間、遠心分離し、免疫学的に決定する場
合、＞90％のFCB−SLPタンパク質を含むペレット画分を
得た。そのペレットを、50mMのトリス−HCl（pH8.0）、
150mMのNaCl、1mMのEDTA溶液により数度、洗浄し、そし
て次に5MのLiBrにより抽出した。この抽出の上清液相を
脱イオン水に対して透析し、遠心分離により集められる
沈殿物の形成をもたらした。その沈殿物を3MのLiBrによ
り再抽出し、そして溶解されたタンパク質を、蒸留水に
よる４倍希釈により選択的に沈殿せしめた。残る上清液
を、10mMのトリス（pH7.5）、1mMのEDTA、1mMのPMSF溶
液に対して透析した。沈殿したタンパク質を遠心分離に
より集め、脱イオン水に再懸濁し、そしてアミノ酸組成
について分析した。この半−精製された画分の組成は、
このポリマーに存在するアミノ酸の組成的な含有率によ
り決定される場合、約90％のFCB−SLPであることを示し
た。これらのアミノ酸の割合は、FCB−SLPポリマー遺伝
子のDNA配列により予測される割合とひじょうに相互関
係した。
生物学的活性のアッセイ FCB−SLPポリマータンパク質が細胞付着活性を示すか
どうかを決定するために、半−精製されたタンパク質
を、ニトロセルロースフィルター上に固定し、そして哺
乳類組織−培養細胞と共にインキュベートした。pSY152
0,pSY1521又はpSY1186（SLP IIIをコードするプラスミ
ド）を含むE.コリ細胞からの溶解物タンパク質を、SDS
−PAGE上で電気泳動せしめ、そして電気ブロットにより
ニトロセルロースフィルターに移した。これらのフィル
ターを、Haymanなど．（1982）前記の方法の変法を用い
て、細胞付着性を促進するそれらの能力について試験し
た。フィルターを、軽く撹拌しながら、PBS（10mMのリ
ン酸ナトリウム（pH7.4）、150mMのNaCl）中で数度清浄
し、そして５％コンデンスミルクを含むPBS中に１時間
飽和せしめた。次に、フィルターを、抗−SLP又は抗−F
CB血清（1:100希釈度の血清）を含むPBS中、５％コンデ
ンスミルク又はPBSのみにおける５％コンデンスミルク
又はPBSのみにおける５％コンデンスミルクと共に37℃
で２時間インキュベートした。フィルターをPBSにより
２度洗浄し、そして細胞と共にインキュベートした。細
胞を、0.1％のトリプシン溶液における半集密的細胞単
層の再懸濁により調製した。細胞を、10％ウシ胎児血清
を含むDME培地において０℃で30分間インキュベートし
た。細胞を遠心分離し（但し、H9リンパ球が沈殿され
た）、PBSにより洗浄し、そして最後に、血清を含まな
いDME培地に2.5×106個の細胞/mの密度で再懸濁し
た。フィルターを、平らなプラスチック皿に細胞懸濁液
と共に積層し、そしてCO2インキュベーター中において3
7℃で１時間インキュベートした。フィルターをPBS中で
２度洗浄し、非結合細胞を除去し、そして３％ホルムア
ルデヒドに固定した。フィルターを、45％メタノール、
10％酢酸、45％水におけるアミドブラックにより３分間
染色し、そして90％メタノール、２％酢酸、８％水中で
脱色した。
眼での検査によれば、ビロ（Vero）細胞（アフリカグ
リーンモンキーの腎臓の上皮細胞）と共にインキュベー
トされたフィルターは、ひじょうに染色された領域を含
んだ。これらの領域は、抗−SLP及び抗−FCB抗体を含む
平行フィルターへの反応性により決定されるように、FC
B−SLPタンパク質バンドの位置に対応した。そのフィル
ターの同じ部分の顕微鏡検査は、濃い染色が細胞の付着
によることを示した。バックグラウンド以上の細胞は、
他のE.コリ溶解物のタンパク質バンドを含むフィルター
のいづれか他の部分に結合されなかった。細胞は、SLP
IIIタンパク質バンドに対応する領域でフィルターに付
着されなかった。予測されるように、H9リンパ球と共に
インキュベートされる場合、フィルターへの細胞の特異
的結合は観察されなかった。
細胞付着に対するタンパク質濃度の効果及び特異的抗
体によるフィルター及び細胞の種々の前処理の効果を決
定するために、ドット−ブロット細胞結合アッセイが開
発された。そのアッセイは上記のようにして行なわれ
た。但し、既知濃度の半精製されたFCB−SLP及びSLP II
Iタンパク質がSchleicher及びSchuellドット−ブロット
マニホールドを用いて、ニトロセルロースフィルタード
ットに直接適用された。それぞれのサンプルを、連続す
る第１のドットが10μｇのタンパク質を含み、そして続
くドットがそのサンプルの連続する２倍の希釈物を含む
ように適用した。それぞれpSY1520及び1521からの75Kd
及び95KdのFCB−SLPタンパク質の両者は、低濃度でベロ
細胞付着を促進せしめた。細胞付着を促進するために必
要とされる75KdのFCB−SLPタンパク質の最少量は、0.05
μg/cm2であった。95KdのFCB−SLPタンパク質のために
は、その最少量は0.2μg/cm2であった。12.5μg/cm2で
さえ、SLP III含有ドットに、ほとんどの細胞が付着さ
れなかった。FCB−SLPタンパク質への細胞付着は、抗−
FCB又は抗−SLP抗体と共にそのフィルターを予備インキ
ュベートすることにより阻害された。細胞付着は阻害さ
れるが、しかし、300μg/mの濃度でFCBペプチドと共
に細胞を予備インキュベートすることによっては阻害さ
れなかった。
SLP IIIモノマー配列へのFCBの10個のアミン酸の導入
は、タンパク質ポリマーを構成し、このタンパク質の精
製及び溶解性特徴は、SLP IIIタンパク質ポリマーの特
徴とはそれ程、異ならず、そして細胞付着を促進する能
力の追加の特性を含む。対象のタンパク質ポリマーは、
単独で又は他の化合物又はタンパク質ポリマー、合成又
は天然のポリマーと一緒に、細胞付着を促進する繊維及
びフィルムに配合され得る。FCB−SLPの生物学的活性
は、変性に対して化学的に耐性である。細胞付着は、高
濃度の界面活性剤及びカオトロピック変性剤による100
℃での処理の後、FCB−SLPタンパク質に生じる。この安
定性は、生物活性物質の調製に使用される殺菌方法を促
進する。細胞及び組織培養物の増殖及び分化を増強する
ための固体−支持細胞−付着マトクックスは、そのよう
な物質の直接の用途である。対象のポリマーは、他の物
質又は支持体上に容易に付着され、細胞−結合表面を提
供する。種々の形、たとえば繊維、膜、フィルム、等で
の細胞−付着ポリマーは、激しい撹拌への細胞損傷を回
避しながら、栄養物への暴露を高める。軽く混合した液
体増殖培地内に生成細胞を懸濁する生物反応体に使用さ
れ得る。対象の物質は、織布、フィルム又は膜に製造さ
れ又はそれらの上に被覆され、そして治療工程に関与さ
れる細胞の付着により治療を促進する創傷用包帯として
使用され得る。さらに、対象のタンパク質は、装置のイ
ン ビトロ及び／又はイン ビボコロニー化を促進し、
従ってその官能性質を改良するために、血管、関節、
腱、靱帯又は同様のもののイン ビボ置換に向けられる
人工補てつ装置の壁中に配合され又はその上に付着され
得る。さらに、対象のタンパク質は、移植物、キャリヤ
ー、コーチング又は同様のものとして眼に通用され得
る。
SLP 3−Cys（SLP−Ｃ） 化学的に活性な架橋可能ポリマーの企画。
タンパク質鎖内に含まれる多くのアミノ酸は、特定の
有機及び無機試薬を用いて化学的に変性され得る。これ
らのアミノ酸のいくつかは、リシン（Ｋ）、アルギニン
（Ｒ）、グルタメート（Ｅ）、アスパーテート（Ｄ）、
システイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、
ヒスチジン（Ｈ）及びチロシン（Ｙ）である。特定の反
応が、特異的位置での鎖に追加の分子を付加する目的の
ために行なわれるタンパク質ポリマーを構成するために
又は同じ又は異なったポリマーの鎖を一緒に結合し、又
は適切な表面に鎖を結合するために、SLP−Ｃが企画さ
れた。SLP 3の59個のアミノ酸の絹様モノマーを、アミ
ノ酸配列GAGCGDPGKGCCVAを含むように変性した。その包
含配列の特徴は次の通りである:1.GAGC及びGCCVのテト
ラペプチドが、絹様アミノ酸を端に有するＢ−鎖構造に
適合し、そしてスルフヒドリルが、酸化下で反応性であ
り、そして共有架橋結合され得るシステインを含み、2.
DPGKはＢ−鎖構造に適合せず、従って絹様鎖内で整列さ
れていない構造を付与する。この後者の配列は、さら
に、２種の化学的に変性可能な追加の残基、アスパーテ
ート及びリシンを供給する利点を有し、そして特異的な
化学的ペプチド切断に影響されやすいジペプチドDPを含
む。
ポリマーの構成。
２種の下記オリゴヌクレオチド鎖を、方法のセクショ
ンに記載されているようにして合成し、そして精製し
た： これらの２種のオリゴヌクレオチド鎖をアニールし、
そしてPst I RENにより消化されたプラスミドpSY1304
（pSY937におけるSLP 3モノマー）のDNAと連結した。
この連結反応の生成物を、E.コリ鎖HB101中に形質転
換した。形質転換体からのプラスミドDNAを、精製し、
そしてBan Iにより消化し；正しい大きさの挿入体を含
むクローンを、配向の決定のためにPst I及びEco V REN
により消化した。正しいクローンからのプラスミドDNA
を配列決定した。プラスミドpPTO103（第４表に示され
る）は、所望するSLP−Ｃモノマー配列を含み、オリゴ
ヌクレオチド（１）及び（２）は、濃い字で下記に示さ
れ、そして下線を引かれている。
pPTO103からのプラスミドDNAをBan I RENにより消化
し、その消化フラグメントをアガロースゲル電気泳動に
より分離した。225bpのSLP−Ｃ遺伝子フラグメントを切
り出し、そしてNACSカラム（方法のセクションを参照の
こと）により精製した。その精製されたフラグメント
を、REN Ban Iによりすでに消化されているプラスミドp
SY1262に連結した。この連結反応の生成物を、E.コリ鎖
HB101中に形質転換した。形質転換体を、耐カナマイシ
ン性について選択した。個々の形質転換体からのプラス
ミドDNAを、SLP−ＣマルチマーDNA挿入により大きさを
高めるために精製し、そして分析した。約1.0Kbp〜5.4K
bpの大きさのいくつかのクローンが得られた。６種のク
ローン（pPTO105→pPTO110）がSLP−Ｃの発現に使用す
るために選択された。
発 現。
30℃で増殖された一晩の培養物を用いて、250mのフ
ラスコに含まれる50mの培地を接種した。カナマイシ
ンを50μg/mの最終濃度で添加し、そしてその培養物
を30℃で撹拌（200rpm）しながらインキュベートした。
培養物が0.8のOD600に達した時、その40mを、42℃で
あらかじめ暖められた新しいフラスコに移し、そして同
じ温度で約２時間インキュベートした。培養物（30℃及
び42℃）を氷上で急冷せしめ、そしてOD600を取る。1.0
のOD600のアリコートに分けられた細胞を、遠心分離に
より集め、そしてSLP抗体を用いてドットブロット及び
ウェスターン分析を行なうために使用した（方法のセク
ションを参照のこと）。精製及びアミノ酸分析のために
は、多量の培養物が使用された。
分 析。
プラスミドpPTO105を含むE.コリ株HB101を、30℃で0.
7のOD600になるまで増殖し、そして次に、40μCi/mの
35S−システインの添加の後、42℃で2.0時間、増殖し
た。これらの細胞から生成されるタンパク質を、35S−
システインの検出のために及びSLP抗体への反応性のた
めにSDS−PAGEにより分析した（方法のセクションを参
照のこと）。両分析においては、強い反応性バンドが、
約150KDの見掛の分子量をもって観察された。
SLP 3−ラミニン細胞結合（SLP−Ｌ） 神経細胞の付着のための生物学的に活性なポリマーの企
画。
ヒトラミニンB1、すなわち細胞が付着し、そして増殖
するある細胞外基部膜のタンパク質成分のアミノ酸配列
は、神経細胞のための受容体付着部位を付与することに
包含されたペンタペプチド、YIGSRを含む。２種の絹様
ポリマー（１つは、それぞれペンタペプチドを含む12個
のアミノ酸配列であり、そして他は同じような14個のア
ミノ酸配列である）を企画した。SLP−L1と命名された
第１ポリマーにおいては、SLP 3の59個のアミノ酸モノ
マーが、配列YCEDGYIGSRCDの包含により、そのチロシン
残基の近くで中断された。SLP−L2においては、その包
含配列はLCVSEPGYIGSRCDであった。それらはＢ−鎖構造
に適合しないので、絹様鎖のＢ−鎖構造体内に組込まれ
る場合、両配列は整列されていないループを形成するに
違いない。SLP−L1及びSLP−L2は、培養において及びイ
ン ビボで神経細胞の付着のための合成支持体を供給す
るように企画されている。傷つけられた神経の再生のた
めの神経管中へのこれらのポリマーの配合は、１つの可
能な適用である。
SLP−L1の構成。
下記のような２種のオリゴヌクレオチド鎖を、方法の
セクションに記載されているようにして、合成し、そし
て精製した： これらのオリゴヌクレオチド鎖を、アニールし、そし
てPst I RENによりすでに消化されたプラスミドpSY1304
（WO88/03533,65ページを参照のこと）に連結した。
この連結反応の生成物により、E.コリ鎖HB101を形質
転換した。形質転換体のプラスミドDNAを精製し、そし
てBan Iにより消化し；正しい大きさの挿入体を含むク
ローンを、Pst IおよびEco V RENにより消化し、正しい
配向を決定した。正しいクローンからのプラスミドDNA
を配列決定した。プラスミドpTO120（第５表に示され
る）は所望するSLP−L1モノマー配列を含み、オリゴヌ
クレオチド（ｉ）及び（ii）は濃い字で下記に示され、
そして下線を引かれている。
pPTO120からのプラスミドDNAをBan I RENにより消化
し、そしてその消化フラグメントをアガロースゲル電気
泳動により分離した。216bpのSLP−L1遺伝子フラグメン
トを切り出し、そしてNACSカラム（方法のセクションを
参照のこと）により精製した。精製されたフラグメント
を、REN Ban Iによりすでに消化されているプラスミドp
SY1262に連結した。この連結反応の生成物を用いて、E.
コリ株HB101を形質転換した。耐カナマイシン性を有す
る形質転換体を選択した。個々の形質転換体からのプラ
スミドDNAを精製し、そしてSLP−L1の複数DNA挿入によ
る大きさの増大を分析した。1Kbp−4Kbpの大きさのいく
つかのクローンを得た。約3.0Kbpの挿入体を有する１つ
のクローンpPTO123を、発現及びタンパク質分析のため
に選択した。
SLP−L2の構成。
下記追加の２種のオリゴヌクレオチド鎖を、前記方法
のセクションに記載されるようにして合成した： これらのオリゴヌクレオチド鎖を、アニールし、そし
てPst I及びSma I RENにより消化されているプラスミ
ドpPTO120と連結した。クロラムフェニコールに耐性の
形質転換体コロニーからのプラスミドDNAを精製した。R
EN Pst Iにより消化されない１つのプラスミド、pPTO12
1（第６表を参照のこと）を、配列決定し、そして所望
するSLP−L2モノマー遺伝子フラグメントであることが
わかった。オリゴヌクレオチド鎖（iii）及び（iv）
は、下記に濃い字で示され、そして下線を引かれてい
る。
pPTO121からのプラスミドDNAを、Ban I RENにより消
化し、そしてその消化フラグメントをアガロースゲル電
気泳動により分離する。222bpのSLP−L2遺伝子フラグメ
ントを、切り出し、NACSカラム（方法のセクションを参
照のこと）により精製した。精製されたフラグメント
を、REN Ban Iにより消化されているプラスミドpSY1262
に連結した。この連結反応の生成物を用いて、E.コリ株
HB101を形質転換する。カナマイシンに対して耐性の形
質転換体を選択する。個々の形質転換体からのプラスミ
ドDNAを、精製し、そしてSLP−L2の複数のDNA挿入によ
る大きさの増大を分析する。1Kbp〜4Kbpの大きさのいく
つかのクローンを得る。
SLP−１の発現。
30℃で増殖された一晩の培養物を用いて、250mのフ
ラスコに含まれる50mの培地を接種した。カナマイシ
ンを50μg/mの最終濃度で添加し、そしてその培養物
を30℃で撹拌（200rpm）しながらインキュベートした。
培養物が0.8のOD600に達した時、その40mを、42℃で
あらかじめ暖められた新しいフラスコに移し、そして同
じ温度で約２時間インキュベートした。培養物（30℃及
び42℃）を氷上で急冷せしめ、そしてOD600を取る。1.0
のOD600のアリコートに分けられた細胞を、遠心分離に
より集め、そしてCLP抗血清を用いてドットブロット及
びウェスターン分析を行なうために使用した（方法のセ
クションを参照のこと）。精製及びアミノ酸分析のため
には、多量の培養物が使用された。
CLP及びCLP−CB 熱可逆性ゼル化特徴を有するコラーゲン様ポリマーの企
画。
化学的に加水分解された天然コラーゲンを、他の用途
の中で写真及び医学的用途に使用されるゼラチンを生成
するために、加熱し、そして冷却することによって変性
し、そして再生することができる。この現象を担当する
コラーゲンの鎖特性は、トリプルヘリックスとして命名
されるコンホメーションを有する鎖間凝集体を自発的に
形成するその能力である。ヘリックスは、グリシンによ
り占められる第３残基ごとの位置でペプチド主鎖にひじ
ょうに近い位置から生じる鎖とグリシン間の２つの位置
でプロリン及びヒドロキシプロリンにより供給されるね
じれとの間の弱い相互作用により安定化される。３種の
ねじれ鎖の幾何学は、トリプルヘリックス内の水系結合
を可能にする。その構造は、弱くなり、そして水、小さ
な有機及び無機分子、他のタンパク質及び細胞との相互
作用に容易に影響されやすくなる。コラーゲンは多くの
異なったアミノ酸配列から成るけれども、多くの構造的
に安定するセグメントの１つは、処理されたコラーゲン
鎖のアミノ及び終結端で存在する。これらの末端は、反
復するトリペプチド配列GPP（２番目のＰはしばしばヒ
ドロキシル化される）からほとんど独占的に成る。コラ
ーゲン様ポリマーCLPは、反復するGPPトリペプチドから
主に構成される（個々のモノマーセグメント内に８
個）。遺伝子の全体の反復性を低め、そしてDNAを良好
に操作するために使用され得る追加のコドンの使用を可
能にするために、他のトリペプチドが含まれた。これら
は、GAP（２度）、GPA,GPV及びGSPであった。これらの
トリプレットのすべては、天然のコラーゲンに存在する
が、但し、CLPに使用される配列には存在しない。CLPの
性質は、高温で熱可逆性ゲル化を受けるタンパク質ポリ
マーを生成するように企画され、そして非免疫原性であ
った。ヘリックスの高い安定性は、CLPから製造される
繊維又は膜に高い引張り強さを付与するばずである。こ
れらの鎖性質は、堅い支持体に適用される場合、柔軟な
コーチングとして作用する。水溶液中でのヒドロゲルコ
ロイドの創造を可能にする。CLPの単純な配列のため
に、その光学吸光度は、220nm以下の波長で最小である
べきである。
細胞付着機能を有する柔軟コーチング材料の企画。
コラーゲン様ポリマーの種々の配合性質は、移植可能
な装置に使用される生物材料としてそれらを理想的にす
る。補てつの表面上のコーチングとして又は装置自体の
構造成分として、CLPは、改良された血液及び細胞の相
互作用を提供することによって組織結合を促進せしめる
ことができる。後者の機能は、細胞受容体のためにリガ
ンドとして作用する特異的アミノ酸配列により天然のコ
ラーゲンに媒介される。細胞付着活性を有するCLPポリ
マーを創造するためには、配列GLPGPKGDRGDAGPKGADGSP
が、CLPモノマー配列内に含まれた。疎水性GPPコラーゲ
ン様フランキング配列に比べて、21個の高く荷電された
親水性アミノ酸のブロックは、細胞との相互作用を受け
やすい不安定化された柔軟ならせん領域を形成するはず
である。移植された装置の表面の表皮化の進行は、その
寿命及び安全性を高める適合性及び拒絶特徴を改良する
であろう。対象の組成物は、新生血管形成を可能にする
創傷用包帯、眼への適用物、人工器官のためのマトリッ
クス及び同様のものとして使用され得る。
CLPモノマーの構成。
CLP（コラーゲン様タンパク質）合成遺伝子を、小さ
な部分からアセンブリーした。まず、下記のような40〜
60bpの長さのDNAの３本の二本鎖断片を、化学的に合成
した： 断片Ａ及びＣ（矢印の後の断片Ｃの配列はCLPをコー
ドしないが、しかし受容体プラスミドの複数のクローニ
ング部位の変性である）を、適切なRENにより消化され
ているプラスミドpUC19中に別々にクローン化した。そ
のDNA配列を確かめ、そして正しい配列を担持する２種
のプラスミド、pPTO111及びpPTO112を選択した。断片Ｂ
を、Ban II及びSma I RENにより消化されているpPTO11
1に連結した。プラスミドpPTO113を配列決定し、そして
正しいことが見出された。
プラスミドpPTO112及びpPTO113を、適切なRENにより
消化し、断片Ｃ及び断片Ａ＋Ｂをそれぞれ開放した。精
製の後、これらのDNAフラグメントを、Ban I及びEcoR V
RENにより前もって消化されたpSY937に連結した。この
連結反応の生成物を用いて、E.コリ株HB101を形質転換
した。形質転換体からのプラスミドDNAを精製し、そし
てBan Iにより消化し；正しい大きさの挿入体を含むク
ローンを配列決定した。プラスミドpPTO116は、断片Ａ
＋Ｂ＋Ｃのために示される所望する配列を含んだ（第７
表を参照のこと）。
CLP−CBモノマーの構成。
下記のような２種のオリゴヌクレオチド鎖を、前記方
法のセクションに記載されるようにして合成した： それらの２種のオリゴヌクレオチド鎖を、アニール
し、そしてAva I RENにより消化されているプラスミド
pPTO116（pSY937におけるCLPモノマー）のDNAに連結し
た。
この連結反応の生成物により、E.コリ鎖HB101を形質
転換した。形質転換体のプラスミドDNAを精製し、Ban I
により消化し；正しい大きさの挿入体を含むクローン
を、Pst I及びBgl I RENにより消化し、正しい配向を
決定した。正しいクローンからのプラスミドDNAを配列
決定した。プラスミドpPTO117（第８表に示される）は
所望するCLP−CBモノマー配列を含み、オリゴヌクレオ
チド（ｉ）及び（ii）は濃い字で下記に示され、そして
下線を引かれている。
CLP及びCLP−CBの発現。
30℃で増殖された一晩の培養物を用いて、250mのフ
ラスコに含まれる50mの培地を接種した。カナマイシ
ンを50μg/mの最終濃度で添加し、そしてその培養物
を30℃で撹拌（200rpm）しながらインキュベートした。
培養物が0.8のOD600に達した時、その40mを、42℃で
あらかじめ暖められた新しいフラスコに移し、そして同
じ温度で約２時間インキュベートした。培養物（30℃及
び42℃）を氷上で急冷せしめ、そしてOD600を取る。1.0
のOD600のアリコートに分けられた細胞を、遠心分離に
より集め、そしてCLP抗血清を用いてドットブロット及
びウェスターン分析を行なうために使用した（方法のセ
クションを参照のこと）。精製及びアミノ酸分析のため
には、多量の培養物が使用された。
上記方法の後、他のポリマーを調製する。これらのポ
リマーは、細胞表面受容体と相互作用するリガンド配列
を含むことによって細胞機能に影響を及ぼす。これらの
ポリマーは、ヒトラミニンB1からの神経細胞付着促進配
列YIGSRをコードするオリゴヌクレオチドを、Sam I部位
でのELP Ｉのタンパク質ポリマー配列中に挿入するこ
とによって調製される。さらに、ポリマーは、ヒトMHC
クラスＩ HLA−A2からのＴ細胞受容体結合配列、 をコードするオリゴヌクレオチドを、Pst I部位を含む
遺伝子位置で、他の態様によりSLP IIIポリマー中に挿
入することによって調製される。
これらのポリマーは、化学反応性の活性を示し、そし
てそれら自体と又は他のポリマー又は材料と架橋する。
これらのポリマーは、配列DPGK,NPGC又はRPGEをコード
するオリゴヌクレオチドを、合成ポリマー遺伝子、SLP
IIIのPst I部位中に挿入することによって調製される。
化学的に反応性のポリマーの他の例は、配列GAGD,GAGC
又はGAGKをコードするオリゴヌクレオチドを合成ポリマ
ー遺伝子のBan II部位中に挿入することによって、又は
配列GEGVP,GCGVP又はGKGVPをコードするオリゴヌクレオ
チドを合成ポリマー遺伝子ELP ＩのSma I部位中に挿入
することによって調製される。合成ポリマーSLPIV及びE
LP Ｉは、前記PCT出願に記載されている。
追加の組成物を、上記方法に従って調製する。これら
の組成物は下記のものを包含する： 構造的な能力、たとえば繊維、フィルム及び膜形成を
もたらしながら、特異的アミノ酸配列が環境に容易に利
用できるようになされ得る、良好な構造特性及び新規の
能力を有するポリマーを製造するための強力な能力が提
供されることが、上記結果から明らかである。従って、
ポリマーは、構造特徴、たとえば良好な引張り、たとえ
ば機械的性質を有する製品形成を提供するために相互作
用する鎖から構成され、そして同時に、広範囲の種類の
生物学的及び化学的用途に使用され得るアミノ酸配列を
供給する。本発明の組成物は、媒体物質としてアミノ酸
配列は、（ここで広範囲の種類の元素と特異的にキレー
ト化することができ）、精製媒体として、無機又は有機
材料、たとえば炭素繊維、ナイロン繊維、ニトロセルロ
ース、等と組合される複合材料、ラミネート、接着剤と
して、細胞の像増列のためのフラスコ被膜として、アフ
ィニティーカラムとして、生物学的材料のための支持体
として及び同様のものとして、広範囲の種類の特異的結
合物質を結合するために使用され得る。
本明細書に引用されるすべての出版物及び特許出願
は、引用により本明細書に組込まれている。
前述の発明は、明確に理解するために例示的且つ例的
にいくらか詳細に記載されているけれども、請求の範囲
体内で修飾及び変更を行なうことができる。
フロントページの続き (72)発明者 フェラーリ，フランコ エー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92037，ラ ジォラ，ハイ アベニュ 7545 (56)参考文献 特開 昭62−171697（ＪＰ，Ａ) 国際公開88／3533（ＷＯ，Ａ１) 国際公開88／7076（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 C07K 19/00 C07K 14/78 C07K 14/435 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (13)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】少なくとも15kDaのタンパク質ポリマーで
    あって、アミノ酸の同一又は異なった反復単位を含む複
    数のポリペプチド鎖を含み、少なくとも２本の鎖は前記
    反復単位以外の介在オリゴペプチドにより連結され、 前記介在オリゴペプチドは化学的に活性な基、天然の官
    能性配列または変性された天然の官能性配列を含んで成
    る、高分子構造体に組み立てることができる、前記タン
    パク質ポリマー。
  2. 【請求項２】前記反復単位が天然のタンパク質ポリマー
    のアミノ酸の、及び約３〜30個のアミノ酸の反復単位で
    あり、前記鎖が約25〜150個のアミノ酸のものであり、
    そして前記介在オリゴペプチドが、前記鎖のそれぞれの
    間に介在し、そして約６〜30個のアミノ酸のものである
    請求項１に記載のタンパク質ポリマー。
  3. 【請求項３】前記アミノ酸の反復単位が、フィブロイ
    ン、エラスチン、ケラチン又はコラーゲンの反復単位又
    は該反復単位のマルチマーの組合せである請求項１に記
    載のタンパク質ポリマー。
  4. 【請求項４】前記タンパク質ポリマーが、２種の異なっ
    たアミノ酸の反復単位のマルチマーを含んで成るブロッ
    クコポリマーである請求項１に記載のタンパク質ポリマ
    ー。
  5. 【請求項５】少なくとも15kDaのタンパク質ポリマーで
    あって、配列GAGAGS、VPGVG又はGPP及びGAPの少なくと
    も１つを有する、アミノ酸の同一又は異なった反復単位
    を含む複数のポリペプチド鎖を含み、少なくとも２本の
    鎖は前記反復単位以外の介在オリゴペプチドにより連結
    され、 前記介在オリゴペプチドは化学的に活性な基、天然の官
    能性配列または変性された天然の官能性配列を含んで成
    る、高分子構造体に組み立てることができる、前記タン
    パク質ポリマー。
  6. 【請求項６】アミノ酸の同一又は異なった反復単位を含
    む複数のポリペプチド鎖を含み、少なくとも２本の鎖は
    前記反復単位以外の介在オリゴペプチドにより連結さ
    れ、 前記介在オリゴペプチドは化学的に活性な基、天然の官
    能性配列または変性された天然の官能性配列を含んで成
    る、高分子構造体に組み立てることができる、少なくと
    も15kDaのタンパク質ポリマーをコードするDNA配列。
  7. 【請求項７】前記反復単位が約３〜30個のアミノ酸を含
    む天然のタンパク質ポリマーのアミノ酸の反復単位であ
    り、前記鎖が約25〜150個のアミノ酸のものであり、そ
    して前記介在オリゴペプチドが、前記鎖のそれぞれの間
    に介在し、そして約４〜50個のアミノ酸のものである請
    求項６に記載のDNA配列。
  8. 【請求項８】前記アミノ酸の反復単位が、配列GAGAGS、
    VPGVGもしくはGPP及びGAPの少なくとも１つを有する反
    復単位又は該アミノ酸の反復単位のマルチマーの組合せ
    を含む請求項６に記載のDNA配列。
  9. 【請求項９】前記介在オリゴペプチドが、アミノ酸配列
    RGD、DP、EP、DPGKGXY（式中、Ｘ及びＹの少なくとも１
    つはＣである）、EPGYIGSRCDAGY、PKGDRGDAGPK又はAVTG
    RDSPASを含んで成る請求項６に記載のDNA配列。
  10. 【請求項１０】複製システム及び請求項６に記載のDNA
    配列を含んで成るベクター。
  11. 【請求項１１】前記複製システムが原核生物のシステム
    である請求項10に記載のベクター。
  12. 【請求項１２】複製システム及び請求項６に記載のDNA
    配列を含んで成る原核細胞。
  13. 【請求項１３】アミノ酸の同一又は異なった反復単位を
    含む複数のポリペプチド鎖を含み、少なくとも２本の鎖
    は前記反復単位以外の介在オリゴペプチドにより連結さ
    れ、 前記介在オリゴペプチドは化学的に活性な基、天然の官
    能性配列または変性された天然の官能性配列を含んで成
    る、高分子構造体に組み立てることができる、少なくと
    も15kDaのタンパク質ポリマーの調製方法であって： 複製システム及び前記原核細胞において発現可能で、か
    つ、前記タンパク質ポリマーをコードする遺伝子を含む
    ベクターを含んで成る原核細胞を、適切な栄養培地で増
    殖し、それによって前記タンパク質ポリマーを発現せし
    めることを特徴とする方法。
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