ES2882852T3 - Formulación farmacéutica para la utilización en la fusión espinal - Google Patents

Abstract

Formulación farmacéutica para la utilización en un procedimiento de fusión espinal, que comprende: una composición para formar una matriz, que comprende por lo menos un primer componente precursor de material de matriz y un segundo componente precursor de material de matriz, capaz de formar la matriz mediante entrecruzamiento de los componentes precursores bajo condiciones apropiadas, un factor bioactivo, que es biológicamente activo en la estimulación de la formación de hueso entre dos vértebras y para efectuar o prestar soporte a la fusión espinal, siendo el factor bioactivo adecuado para ser incorporado de manera liberable en la matriz con el entrecruzamiento de los componentes precursores de material de matriz, en la que el factor bioactivo es PTH o un péptido que comprende PTH, y además en la que la PTH o el péptido que comprende PTH es el único factor bioactivo añadido que resulta eficaz para estimular la formación de hueso entre dos vértebras y para efectuar o prestar soporte a la fusión espinal.

Description

DESCRIPCIÓN

Formulación farmacéutica para la utilización en la fusión espinal

La fusión espinal, también conocida como espondilodesis o espondilosindesis, es un procedimiento de tratamiento quirúrgico utilizado para el tratamiento de diversas morbilidades, tales como la enfermedad de disco degenerativa, la espondilolistesis (desplazamiento de una vértebra), estenosis espinal, escoliosis, fractura, infección o tumor. El objetivo del procedimiento de fusión espinal es reducir la inestabilidad y, de esta manera, el dolor. Los pacientes que requieren fusión espinal presentan déficits neurológicos o dolor severo que no ha respondido al tratamiento conservador. La fusión espinal se consigue mediante instrumentación que bloquea el movimiento entre las vértebras e implica la eliminación del disco intervertebral, laminectomía, proporcionar rugosidad a las superficies óseas que se requiere fusionar y la aplicación de un material que estimula el crecimiento óseo entre vértebras contiguas. Se estima que cada año solo en los EE.UU. se llevan a cabo aproximadamente 500,000 procedimientos de fusión espinal.

La columna presenta tres grandes segmentos: la columna cervical, la columna dorsal y la columna lumbar. La columna cervical es la parte superior de la columna, conocida como cuello. Está constituida de siete vértebras. La columna dorsal es el centro de la columna. Está constituida de 12 vértebras. La columna lumbar es la parte inferior de la columna. Habitualmente está constituida de cinco vértebras; sin embargo, algunas personas pueden presentar seis vértebras lumbares. La fusión espinal se lleva a cabo más comúnmente en la zona lumbar de la columna, aunque también se utiliza para tratar problemas en la columna cervical, y más raramente, la columna dorsal.

Existen dos tipos de fusión espinal, que pueden utilizarse solos o conjuntamente:

La fusión posterolateral introduce el material que estimula el crecimiento óseo, es decir, el injerto óseo o sustitutos de injerto óseo, en la línea espinal en la parte posterior de la columna. A continuación, dichas vértebras se fijan con una fijación posterolateral y se forma el puente óseo entre los procesos transversales de la columna.

La fusión entre cuerpos sitúa el injerto óseo o sustituto de injerto óseo entre las vértebras en la zona habitualmente ocupada por el disco intervertebral. En la preparación para la fusión espinal, se elimina el disco por completo. Puede colocarse un dispositivo, el cajetín de fusión espinal, entre las vértebras a fin de mantener la alineación de la columna y la altura del disco. El cajetín intersomático puede estar constituido de polímeros sintéticos, titanio u otros metales o hueso. La fusión, es decir, el puente óseo, se encuentra entre las placas terminales de las vértebras. Las tasas de fusión habitualmente son más altas con la fusión intersomática que con la fusión posterolateral.

En la mayoría de casos, se potencia la fusión mediante un procedimiento denominado fijación, referido a la colocación de tornillos metálicos (tornillos pediculares con frecuencia constituidos de titanio), varillas o placas, para estabilizar las vértebras a fin de facilitar la fusión ósea.

El reto principal en términos de un resultado clínicamente exitoso de un procedimiento de fusión espinal es la necesidad de formar tejido óseo en lugar del tejido original en el espacio entre las vértebras. El tejido original en el caso de la fusión intersomática era un disco y en el caso de una fusión posterolateral era tejido muscular. A medida que crece el hueso y sustituye un tipo de tejido diferente, existe la necesidad de crear un medio apropiado para inducir y estimular la formación de hueso en la totalidad de la zona.

Muchos estudios han demostrado que se requiere el injerto de hueso para crear el medio apropiado a fin de que se forme un puente óseo sólido (entre las vértebras). Actualmente se utiliza injerto óseo y una diversidad de sustitutos de injerto óseo en la fusión espinal con un resultado clínico incierto. Los injertos óseos y los sustitutos de injerto óseo son autoinjertos (recolectados de la cresta ilíaca del cuerpo del paciente), aloinjertos, matriz ósea desmineralizada, diversos materiales sintéticos, tales como fosfatos de calcio o hidroxiapatitos, productos que contienen células madre que combinan células madre con una de las otras clases de sustitutos de injerto óseo, y como la última generación de sustitutos de injerto óseo, matrices que contienen factor de crecimiento, tal como InFuseTM. El autoinjerto es el estándar de oro en dicha indicación debido a su eficacia y seguridad. Sin embargo, debido al suministro limitado del propio hueso del paciente, el riesgo de dolor y morbilidad (pérdida de sangre e infección) en el sitio donante, en combinación con largas estancias hospitalarias y tiempo quirúrgico, se han continuado buscando sustitutos ideales de injerto óseo para sustituir el hueso autólogo.

Las matrices que contienen factor de crecimiento, como InFuse, han demostrado tasas de fusión equivalentes al autoinjerto y, por lo tanto, han tenido un impacto significativo en el mercado; sin embargo, existen desventajas asociadas a este producto. Aparte del caro procedimiento de producción de BMP (por sus siglas en inglés, proteína morfogénica ósea), la proteína se libera a partir de una matriz de colágeno a alta concentración. Las matrices de colágeno de origen bovino comportan todos los riesgos de los materiales xenogénicos, muestran malas propiedades de manipulación en el procedimiento quirúrgico, por ejemplo, no son moldeables para ajustarse estrechamente a la forma de la lesión o sitio de fusión y la elevada concentración de BMP administrada en el cuerpo puede conducir a la calcificación de órganos o a la formación de hueso en otras partes del cuerpo, denominada formación de hueso ectópico. En particular, se ha informado de varias complicaciones relacionadas con la utilización de BMP-2 en la fusión espinal (por ejemplo, complicaciones neurológicas inducidas por la formación ósea exuberante y complicaciones respiratorias debidas a respuestas inflamatorias/hinchazón en torno al sitio de aplicación). En julio de 2008, la FDA publicó una nota de seguridad relacionada con la utilización de InFuse en la columna cervical. El documento n° WO2009/120433 divulga espumas de fibrinas destinadas a la aplicación como materiales de vendaje de heridas y para el llenado de dispositivos tales como los cajetines de fusión espinal. Pueden añadirse sustancias biológicamente activas a las espumas de fibrina, tales como PTH.

El objetivo de la presente invención es evitar las desventajas de la técnica anterior.

Es un objetivo de la presente invención proporcionar un sustituto de injerto óseo que fusione eficazmente las vértebras en un procedimiento de fusión espinal que resulte de utilización segura.

En otro aspecto de la presente invención, el sustituto de injerto óseo resulta fácil de preparar y de aplicar durante el procedimiento quirúrgico, es decir, permite una fácil manipulación.

En todavía otro aspecto, el sustituto de injerto óseo presenta características del producto que permiten la aplicación del mismo durante la operación sin daños adicionales al tejido circundante.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la presente invención proporciona una formulación farmacéutica para la utilización en un procedimiento de fusión espinal, un producto farmacéutico para la utilización en un procedimiento de fusión espinal, un cajetín de fusión espinal intersomática que comprende la formulación o producto, respectivamente, un kit para la utilización en un procedimiento de fusión espinal, y un procedimiento para formar un producto farmacéutico para la utilización en un procedimiento de fusión espinal según se reivindica en las reivindicaciones independientes. Las formas de realización preferidas de la presente invención se definen en las reivindicaciones subordinadas respectivas y se describen posteriormente. Los materiales y procedimientos indicados en la presente memoria resultan igualmente adecuados para la formulación farmacéutica, el producto farmacéutico y el kit, así como para la utilización con respecto a un cajetín de fusión espinal.

Sumario de la invención

La formulación farmacéutica para la utilización en el procedimiento de fusión espinal comprende: (i) una composición para formar una matriz, que comprende por lo menos un primer componente precursor de material de matriz y un segundo componente de precursor de material de matriz capaz de formar la matriz mediante entrecruzamiento de los componentes precursores y un factor bioactivo, que resulta biológicamente activo en la estimulación de la formación ósea entre dos vértebras y para llevar a cabo o prestar soporte a la fusión espinal, en el que el factor bioactivo resulta adecuado para incorporarse liberablemente adecuado en la matriz tras el entrecruzamiento de los materiales de precursor de material de matriz, en el que el factor bioactivo es PTH. La PTH se encuentra presente en un intervalo de concentraciones comprendido entre 0,01 y 1 mg de PTH/ml de matriz, preferentemente entre 0,2 y 0,7 mg de PTH/ml de matriz y más preferentemente de 0,4 mg de PTH/ml de matriz. En una forma de realización preferente la matriz es una matriz de fibrina y la composición para formar la matriz de fibrina comprende como primer componente precursor de material de matriz, fibrinógeno, y como segundo componente precursor de material de matriz, trombina. Opcionalmente, uno de los componentes precursores comprende factor XlIIa y una fuente de calcio. Además, se encuentra presente PTH en un intervalo de concentraciones comprendido entre 0,01 y 1 mg de PTH/ml de matriz de fibrina, preferentemente en un intervalo de concentraciones comprendido entre 0,01 y 1 mg de PTH/ml de matriz de fibrina, más preferentemente entre 0,2 y 0,7 mg de PTH/ml de matriz de fibrina, y más preferentemente, de 0,4 mg de PTH/ml de matriz de fibrina.

Las matrices de fibrina pueden contener inherentemente cantidades muy pequeñas de BMP y otros factores de crecimiento. La PTH es el único péptido o factor proteico añadido en la formulación capaz de inducir formación de hueso.

En formas de realización preferidas, la PTH es un péptido de fusión ("péptido de fusión de PTH") que contiene por lo menos dos dominios, comprendiendo el primer dominio PTH y comprendiendo el segundo dominio un dominio de sustrato covalentemente entrecruzable capaz de entrecruzarse con la matriz de fibrina durante o después de su formación. En la presente invención, la concentración de PTH en todos los casos se indica con respecto al material de matriz, por ejemplo, la matriz de fibrina, con independencia de si se encuentran presentes gránulos.

En una forma de realización preferente, la matriz de fibrina contiene fibrinógeno en un intervalo comprendido entre 5 y 65 mg por mililitro de matriz de fibrina, más preferentemente entre 15 y 60 mg por mililitro de matriz de fibrina, todavía más preferentemente entre 25 y 55 mg por mililitro de matriz de fibrina, y más preferentemente, entre 36 y 50 mg por mililitro de matriz de fibrina. La trombina se encuentra presente en un intervalo comprendido entre 0.5 y 5 U.I. por mililitro de matriz de fibrina, más preferentemente, entre 1.25 y 3.25 U.I. por mililitro de matriz de fibrina. U.I. representa una unidad internacional de trombina y se define como la actividad contenida en 0.0853 mg del Primer patrón internacional de trombina humana.

Adicionalmente, una fuente de iones calcio ayuda a formar la matriz de fibrina. La fuente de iones calcio es preferentemente C a C h ^^ O en una concentración comprendida entre 0.5 y 5 mg por ml de matriz de fibrina, todavía más preferentemente entre 2 y 3.5 mg por ml de matriz de fibrina, más preferentemente de entre 2.6 y 3.3 mg por ml de matriz de fibrina. En una forma de realización de la presente invención, se encuentran presentes gránulos, preferentemente gránulos porosos que contienen calcio, para el soporte estructural. En el caso de que se encuentren presentes gránulos en la formulación, cualquier agua utilizada para humectar los gránulos antes de la mezcla no se considera para los intervalos de concentración anteriormente indicados, ya que dicha agua se mantiene en los poros de los gránulos durante todo el procedimiento de formación de la matriz y, de esta manera, no presenta ningún efecto diluyente de la concentración de fibrinógeno y trombina en la matriz de fibrina.

Ventajosamente, la PTH se encuentra presente en un intervalo de concentración comprendido entre 0,01 y 1 mg de PTH/ml de soluciones de precursor de fibrina (es decir, el total de soluciones de precursor de fibrina), preferentemente entre 0,2 y 0,7 mg/ml de soluciones de precursor de fibrina, y más preferentemente, de 0,4 mg/ml de soluciones de precursor de fibrina.

La composición puede contener además material granular. La concentración de PTH es con respecto a la matriz, con independencia de la presencia de gránulos.

El material granular puede ser cualquier material biocompatible que proporcione el soporte mecánico necesario para el producto farmacéutico. Preferentemente es un compuesto cerámico. Los compuestos cerámicos biodegradables han mostrado propiedades favorables al utilizarlos en la composición de PTH para la utilización en la presente invención. El compuesto cerámico preferentemente comprende un mineral de calcio, como hidroxiapatatito, fosfato de calcio o sulfato de calcio. Resultan preferentes las mezclas porosas biodegradables de hidroxiapatito y fosfato tricálcico, como TricOs de Biomatlante (Francia) o Camceram de Cam Implants, Leiden (Países Bajos). El más preferido es un compuesto que es una mezcla de hidroxiapatito (60%) y fosfato tricálcico (40%), comercializado bajo el nombre comercial TricOs. El tamaño de los gránulos está comprendido preferentemente entre 1 y 2 mm.

La proporción de los componentes líquidos en la composición de PTH, como la solución tampón de fibrinógeno y trombina y el líquido para humectar los gránulos, y los gránulos, está regulada por el espacio muerto de los gránulos. Una proporción de 1:1 de volumen de espacios muertos en los gránulos a volumen total de líquidos en la composición de PTH es el límite superior de los gránulos y constituye una forma de realización preferida de la presente invención. Resultan posibles cualesquiera cantidades de gránulos inferiores a las indicadas.

La presente invención se refiere además a un kit que comprende la formulación anteriormente indicada, almacenándose por lo menos uno de los componentes precursores de material de matriz adecuado para formar la matriz separadamente de los demás componentes precursores de material de matriz de dicha matriz.

Las formulaciones anteriormente indicadas se utilizan para la preparación de un producto farmacéutico, es decir, una matriz que contiene PTH, preferentemente una matriz de fibrina o sintética que contiene PTH para la estimulación de la fusión espinal, preferentemente la fusión espinal intersomática.

En el caso de que se administre localmente con estabilización apropiada, la matriz que contiene PTH, preferentemente la matriz de fibrina que contiene PTH, es capaz de estimular preferentemente la fusión intersomática espinal en todos los niveles de la columna. Las indicaciones preferentes particulares son las fusiones intersomáticas cervicales y lumbares. La matriz de fibrina o sintética que contiene PTH puede utilizarse en combinación con cajetines de diversos materiales (PEEK, CFRP, titanio, etc.). En una forma de realización preferida, la matriz de fibrina que contiene PTH se utiliza con cajetines realizados de PEEK o CFRP. La matriz de fibrina que contiene PTH puede formarse en el cajetín antes de su implantación o puede formarse directamente in situ después de la implantación del cajetín, dentro y fuera del mismo. En una forma de realización preferida, la matriz de fibrina que contiene PTH se prepara a partir de la composición farmacéutica que comprende componentes precursores de matriz de fibrina y PTH, y se aplica al cajetín antes de la implantación del mismo y adicionalmente también se aplica al espacio discal antes de la inserción del cajetín. La composición farmacéutica que comprende los componentes precursores de matriz y PTH puede administrarse dentro y fuera de la jaula intersomática, en una composición no entrecruzada, aunque preferentemente en forma de una composición parcialmente entrecruzada (es decir, todavía moldeable) con o sin combinación con la fijación posterior. Adicionalmente, puede llevarse a cabo un procedimiento de fusión posterolateral.

Durante toda la presente memoria, la presente invención se describe en particular para una matriz de fibrina. Sin embargo, se subraya que la invención resulta igualmente aplicable a cualquier otra matriz, por ejemplo, a matrices sintéticas, tal como se indica posteriormente.

Descripción detallada de la invención

Inesperadamente se ha encontrado que un producto farmacéutico que comprende PTH en una matriz muestra la fusión de vértebras contiguas en un procedimiento de fusión espinal, preferentemente un procedimiento de fusión espinal intersomática. Preferentemente, la PTH se incorpora liberablemente en una matriz y se aplica en un espacio de localización anatómica en donde debe formarse tejido óseo. Una localización preferente es el espacio discal y el material se aplica preferentemente junto con un cajetín intersomático. Por lo tanto, un aspecto de la presente invención es una formulación farmacéutica para la utilización en un procedimiento de fusión espinal que comprende una composición para formar una matriz y PTH adecuado para incorporarse liberablemente en la matriz tras su formación. La PTH es biológicamente activa en la estimulación de la formación de hueso entre dos vértebras y para llevar a cabo o prestar soporte a la fusión espinal. En otro aspecto, y no forma parte de la presente invención, la PTH se carga en o sobre una matriz existente, tal como, por ejemplo, una esponja de colágeno empapada con una solución de PTH, y la matriz suplementada de esta manera con PTH se implanta en la localización anatómica en donde se lleva a cabo la formación de hueso. En una forma de realización preferida, la PTH se une a la matriz mediante enlaces covalentes.

Aunque la PTH administrada localmente en fibrina con o sin material granular se ha informado en los documentos n° WO 2006/072622 y n° WO 2006/072623 que resulta adecuada para la reparación de fracturas óseas, para el tratamiento de QOS (quiste óseo solitario) y para incrementar la masa ósea en pacientes osteoporóticos, el hecho de que la formulación farmacéutica comprende PTH y el producto farmacéutico obtenido de la formulación farmacéutica de la presente invención, es decir, PTH de administración local a partir de una matriz, ha mostrado eficacia en un procedimiento de fusión espinal, resultó inesperado por varios motivos.

En primer lugar, cada medio de cicatrización presenta características únicas, lo que significa que un sustituto de injerto óseo debe someterse a ensayo en el medio de cicatrización específico que se prevé que sea predictivo de eficacia (S. D. Boden, SPINE volumen 27, número 16S, páginas S26-S31, 2002). Dicho principio también resulta aplicado por la FDA. Diferentes medios de cicatrización como, por ejemplo, un defecto metafisario, una fractura de un hueso largo o la fusión espinal intersomática, presentan niveles crecientes de dificultad en la formación de hueso nuevo (Boden S., 2002) y, de esta manera, la validación de cualquier sustituto de injerto óseo en un sitio anatómico clínico no es predictiva de su rendimiento en otra localización (Boden, 2002).

En segundo lugar, la cicatrización de fracturas es un proceso fisiológico proliferativo en el que el cuerpo facilita la reparación de una fractura ósea. El cuerpo responde al suceso traumático con la producción de varios factores de crecimiento de una manera oportuna. Dichos factores de crecimiento son capaces de atraer células madre y estimular la proliferación y diferenciación en osteoclastos, y finalmente de inducir la cicatrización ósea. En contraste, la fusión espinal es un procedimiento quirúrgico destinado a conseguir la formación y fusión ósea en dos segmentos de la columna. Por lo tanto, existe una necesidad de estimular la formación de novo de hueso.

Un material para inducir la formación de novo de hueso debe contener uno o más factores de crecimiento capaces de inducir la diferenciación de células progenitoras en osteoblastos (Boden, 2002). Las BMP presentan la capacidad de inducir la formación de novo de hueso al aplicarlas intramuscularmente en ratas (Hsu, Journal of Orthopaedic Research, agosto de 2006, páginas 1660-1669), por lo tanto, se esperaba su eficacia en la fusión espinal. Tal como han mostrado estudios por los inventores, la PTH administrada localmente en una matriz de fibrina no induce la formación de hueso ectópico, y por lo tanto no se esperaba que estimulase la fusión espinal intersomática. Sin embargo, los presentes inventores pudieron conseguir una fusión espinal potenciada al presentar PTH en un material de matriz adecuado que permitía la liberación controlada de la PTH incorporada en la misma, y colocando el material de matriz con PTH incorporado liberablemente en el mismo entre las vértebras contiguas que deben fusionarse.

La matriz se forma mediante entrecruzamiento iónico, covalente o mediante combinaciones de los mismos, de por lo menos un primer y un segundo componente precursor de material de matriz y formando de esta manera una red tridimensional, es decir, la matriz o mediante adaptación de materiales naturales y/o preformados, tales como colágeno, como la matriz. En una forma de realización, la matriz está formada de proteínas, preferentemente proteínas naturalmente presentes en el paciente en el que debe implantarse la matriz. Una matriz particularmente preferente de este tipo es la fibrina, aunque también pueden utilizarse otras matrices proteicas, tales como colágeno y gelatina. También pueden utilizarse como matriz, polisacáridos y glucoproteínas. También resulta posible utilizar componentes precursores de material de matriz sintética que son entrecruzables mediante unión iónica o covalente para formar una matriz. Preferentemente, la matriz se forma mediante entrecruzamiento covalente de componentes precursores de material de matriz.

Generalmente, los materiales de matriz y matrices divulgados en los documentos n° WO 00/44808 A1 y n° WO 03/052091 A1 resultan adecuados en la presente invención.

En una forma de realización preferida, la matriz es una matriz de fibrina. En otra forma de realización preferida, la matriz es un material sintético basado en óxido de polialquileno, preferentemente un material basado en óxido de polietileno.

Matrices de fibrina y componentes precursores de matriz de fibrina

La fibrina es un material natural que ha sido informado para varias aplicaciones biomédicas. Las matrices realizadas en fibrina se han descrito como material para matrices de crecimiento interior de células en la patente US n° 6.331.422 de Hubbell et al. La fibrina se ha utilizado en sellantes debido a su capacidad de unirse a muchos tejidos y a su papel natural en la cicatrización de heridas. Entre algunas aplicaciones específicas se incluyen la utilización de un sellante para la unión de injertos vasculares y la unión de válvulas cardiacas. Adicionalmente, dichas matrices se han utilizado como dispositivos de administración de fármaco y para la regeneración neuronal. Aunque las matrices de fibrina proporcionan un soporte sólido para la regeneración de tejido y el crecimiento interior de células, existen pocas secuencias activas en el monómero que potencian directamente dichos procedimientos.

El proceso por el que el fibrinógeno se polimeriza formando fibrina también ha sido caracterizado. Inicialmente, una proteasa corta la molécula dimérica de fibrinógeno en dos sitios simétricos. Existen varias proteasas posibles que pueden cortar el fibrinógeno, que incluye la trombina: la peptidasa y la proteasa III, y cada una corta la proteína en un sitio diferente. Una vez ha sido cortado el fibrinógeno, se produce una etapa de autopolimerización en la que los monómeros de fibrinógeno se reúnen y forman un gel de polímero entrecruzado no covalentemente. Dicho autoensamblaje se produce porque los sitios de unión resultan expuestos después de producirse el corte de proteasa. Una vez están expuestos, dichos sitios de unión en el centro de la molécula pueden unirse a otros sitios en las cadenas de fibrinógeno, que se encuentran presentes en los extremos de las cadenas peptídicas. De esta manera, se forma una red de polímero. El factor XIIIa, una transglutaminasa activada a partir de factor XIIIa por proteolisis de la trombina, a continuación puede entrecruzar covalentemente la red de polímero. Existen otras transglutaminasas y también pueden participar en el entrecruzamiento covalente e injertación en la red de fibrina.

Una vez se ha formado una matriz de fibrina entrecruzada, la posterior degradación se encuentra estrechamente controlada. Una de las moléculas clave en el control de la degradación de la fibrina es el inhibidor de la a2-plasmina. Dicha molécula actúa mediante entrecruzamiento con la cadena a de la fibrina mediante la acción del factor XIIIa. Mediante su unión a la matriz, puede localizarse en la matriz una concentración elevada de inhibidor. A continuación, el inhibidor actúa mediante el bloqueo de la unión del plasminógeno a la fibrina e inactiva la plasmina. El inhibidor de la plasmina a2 contiene un sustrato de glutamina. La secuencia exacta se ha identificado como NQEQVSPL (SEC ID n° 12 en el listado de secuencias en la solicitud n°WO 03/052 091), siendo la primera glutamina el aminoácido activo para el entrecruzamiento.

Se ha demostrado en el documento n° WO 03/052091 que los péptidos bidominio, que contienen una secuencia de sustrato de factor XIIIa y una secuencia de péptido bioactivo, pueden entrecruzarse en una matriz de fibrina y que este péptido bioactivo conserva su actividad celular in vitro.

Según la indicación y las sustancias mezcladas en la matriz de fibrina, podría variar la concentración de trombina.

Los componentes precursores de la matriz de fibrina comprenden preferentemente dos soluciones de precursor separadas, en las que la primera solución de precursor de matriz de fibrina contiene entre 10 y 130 mg de fibrinógeno por mililitro de solución de precursor, más preferentemente entre 30 y 120 mg de fibrinógeno por mililitro de solución de precursor, todavía más preferentemente entre 50 y 110 mg de fibrinógeno por mililitro de solución de precursor, y más preferentemente entre 72 y 110 mg de fibrinógeno por mililitro de solución de precursor. En el caso de que deba añadirse trombina para formar la matriz, la segunda solución de precursor de matriz de fibrina contiene entre 1 y 10 U.I. de trombina por mililitro de solución de precursor, más preferentemente entre 2.5 y 6.5 U.I. de trombina por mililitro de solución de precursor. Adicionalmente, una fuente de iones calcio puede encontrarse en cualquiera de las dos soluciones de precursor. La fuente de iones calcio es preferentemente CaCh* ² H²O en una concentración de entre 1 y 10 mg por ml de solución de precursor, todavía más preferentemente de entre 4 y 7 mg por ml de solución de precursor, más preferentemente entre 5.2 y 6.6 mg por ml de solución de precursor. Opcionalmente, se añade un enzima capaz de catalizar la formación de matriz a la solución de precursor, tal como factor XIIIa. Preferentemente, el factor XIIIa se encuentra presente en una concentración comprendida entre 0.5 y 100 U.I. por mililitro de solución de precursor, más preferentemente entre 1 y 60 U.I. por mililitro de solución de precursor, y más preferentemente, de entre 1 y 10 U.I. por mililitro de solución de precursor.

Es parte adicional de la presente invención la utilización de una formulación farmacéutica que comprende una composición para formar una matriz de fibrina, comprendiendo dicha composición unos primer y segundo componentes precursores de matriz de fibrina, que son trombina y fibrinógeno, preferentemente en forma de una solución, una fuente de calcio y una PTH para la preparación de una matriz de fibrina que contiene PTH para la estimulación de la fusión espinal, preferentemente la fusión espinal intersomática.

Matrices sintéticas y componentes precursores de material de matriz sintéticos

Entre las reacciones de entrecruzamiento para formar matrices sintéticas para la aplicación en el cuerpo se incluyen: (i) la polimerización de radicales libres entre dos o más componentes precursores de material de matriz que contienen dobles enlaces insaturados, tal como se indica en Hern et al., J. Biomed. Mater. Res. 39:266-276, 1998, (ii) una reacción de sustitución nucleofílica, tal como, por ejemplo, entre un componente precursor que incluye un grupo amina y un componente precursor que incluye un grupo succinimidilo, tal como se divulga en la patente U.S. n° 5.874.50o de Rhee et al., (iii) las reacciones de condensación y adición, y (iv) las reacciones de adición de tipo Michael entre un componente precursor de material de matriz que comprende un nucleófilo fuerte y un componente precursor de material de matriz que comprende un grupo o enlace insaturado conjugado (tal como un electrófilo fuerte). Resulta particularmente preferido la reacción entre un componente precursor de material de matriz que presenta un grupo tiol o amina como el grupo nucleofílico y un componente precursor de material de matriz que presenta un grupo acrilato o vinilsulfona como grupos electrofílicos. El grupo nucleofílico más preferente es el grupo tiol. Las reacciones de adición de tipo Michael se describen en el documento n° WO 00/44808 de Hubbell et al. Las reacciones de adición de tipo Michael permiten el entrecruzamiento in situ de por lo menos un primer y un segundo componente precursor de material de matriz bajo condiciones fisiológicas de una manera autoselectiva, incluso en presencia de materiales biológicos sensibles. En el caso de que uno de los componentes precursores de material de matriz presente una funcionalidad de por lo menos dos, y por lo menos uno de los otros componentes precursores de material de matriz presente una funcionalidad superior a dos, el sistema reaccionará autoselectivamente para formar una matriz tridimensional entrecruzada.

Preferentemente, los grupos insaturados conjugados o los enlaces insaturados conjugados son acrilatos, vinilsulfonas, metacrilatos, acrilamidas, metacrilamidas, acrilonitrilos, vinilsulfonas, 2- o 4-vinilpiridinio, maleimidas o quinonas.

Los grupos nucleofílicos preferentemente son grupos tiol, grupos amino o grupos hidroxilo. Los grupos tiol son sustancialmente más reactivos que los grupos amina no protonados. El pH resulta importante a este respecto: el tiol desprotonado es sustancialmente más reactivo que el tiol protonado. Por lo tanto, las reacciones de adición que implican una insaturación conjugada, tal como un acrilato o una quinona, con un tiol para convertir dos componentes precursores de material de matriz en una matriz, con frecuencia se llevarán a cabo mejor y más rápidamente, y autoselectivamente, a un pH de aproximadamente 8. A un pH de aproximadamente 8, la mayoría de los tioles de interés están desprotonados (y, de esta manera, son más reactivos) y la mayoría de las aminas de interés todavía están protonadas (y, de esta manera, son menos reactivas). En el caso de que se utilice un tiol como la primera molécula precursora, una estructura conjugada que es selectiva en su reactividad con el tiol respecto a las aminas resulta altamente deseable.

Entre los primer y segundo componentes precursores de material de matriz adecuados se incluyen proteínas, péptidos, polietilenglicol (PEG), polioxialquilenos, poli(alcohol vinílico), poli(alcohol etilén-co-vinílico), poli(ácido acrílico), poli(ácido etilén-co-acrílico), poli(etiloxazolina), poli(vinilpirrolidona), poli(etilén-co-vinilpirrolidona), poli(ácido maleico), poli(ácido etilén-co-maleico), poli(acrilamida) y copolímeros en bloque de poli(óxido de etileno)-co-poli(óxido de propileno). Un componente precursor de material de matriz particularmente preferido se basa en el polietilenglicol (PEG) y es un PEG funcionalizado.

El polietilenglicol proporciona un bloque constructivo conveniente. Pueden adquirirse o sintetizarse fácilmente PEG lineales (es decir, con dos extremos) o ramificados (es decir, con más de dos extremos) y después funcionalizarse los grupos terminales del PEG para introducir un nucleófilo fuerte, tal como un tiol, o una estructura conjugada, tal como un acrilato o una vinilsulfona. En el caso de que estos componentes se mezclen entre sí o con un componente correspondiente en un medio ligeramente básico, se formará una matriz mediante reacción entre el primer y segundo componentes precursores, es decir, entre el tiol y el acrilato o la vinilsulfona. Un componente PEG puede reaccionar con un componente no PEG y el peso molecular o hidrofilicidad de cualquiera de los componentes puede controlarse para manipular las características mecánicas, la permeabilidad y el contenido de agua de la matriz resultante.

En la formación de matrices, especialmente matrices que se desean que se degraden in vivo, también los péptidos proporcionan un bloque constructivo muy conveniente. Resulta sencillo sintetizar péptidos que contienen dos o más residuos de cisteína y este componente a continuación puede servir fácilmente como el primer componente precursor de matriz con grupos nucleofílicos, es decir, grupos tiol. Por ejemplo, un péptido con dos residuos de cisteína libres formará fácilmente una matriz al mezclarlo con un PEG trivinilsulfona (un PEG que presenta tres brazos con vinilsulfona en cada uno de sus brazos) a pH fisiológico o ligeramente superior (por ejemplo, entre 8 y 9). La gelación también puede transcurrir bien incluso a pH más elevados, aunque potencialmente a expensas de la autoselectividad. En el caso de que los dos componentes precursores líquidos se mezclen entre sí, reaccionarán durante un periodo de unos cuantos minutos para formar un gel elástico, que consiste en una red de cadenas de PEG, que portan los nodos de la red, con los péptidos como enlaces conectores. Los péptidos pueden seleccionarse como sustratos de proteasa, de manera que hacen que la red sea capaz de ser infiltrada y degradada por células, tal como ocurre en una red basada en proteínas, tal como en una matriz de fibrina. Preferentemente, las secuencias en los dominios son sustratos para los enzimas que participan en la migración celular (por ejemplo, como sustratos para enzimas tales como la colagenasa, la plasmina, la metaloproteinasa (MMP) o la elastasa), aunque los dominios adecuados no se encuentran limitados a dichas secuencias. Una secuencia particularmente útil es un sustrato para el enzima plasmina. Las características de degradación de los geles pueden manipularse mediante modificación de los detalles del péptido que sirven como nodos de entrecruzamiento. Puede producirse una matriz que sea degradable por colagenasa, pero no por plasmina, o por plasmina pero no por colagenasa. Además, resulta posible hacer que el gel se degrade más rápidamente o más lentamente en respuesta a dicho enzima, simplemente modificando la secuencia de aminoácidos de manera que se altera la K^m o la k^cat, o ambas, de la reacción de enzimática. De esta manera, puede hacerse que la matriz sea biomimética, en el aspecto de que es capaz de ser remodelada por las características remodeladoras normales de las células. Por ejemplo, dicho estudio muestra sitios de sustrato para la importante proteasa plasmina. La gelación del PEG con el péptido es autoselectiva.

Resulta importante incorporar los sustratos de proteasa en la matriz al formarla a partir de componentes precursores de matriz que comprenden grupos funcionales, como vinilsulfonas, que no conducen a enlaces que son hidrolíticamente degradables después de la reacción con nucleófilos, como tioles o aminas. Las matrices formadas a partir de la reacción de componentes precursores con acrilatos como grupos funcionales, preferentemente acrilatos de PEG, y componentes precursores que presentan tioles como grupos funcionales, preferentemente tioles de PEG, sí contienen enlaces hidrolíticamente degradables. Por lo tanto, la incorporación de sustratos de proteasa permite a la matriz degradarse en el cuerpo en todos los casos en los que la reacción de los componentes precursores de material de matriz no conduzca a enlaces hidrolíticamente degradables.

Las matrices sintéticas son operativamente simples de formar. Se mezclan por lo menos dos componentes precursores de material de matriz líquidos: un precursor contiene una molécula de precursor con grupos nucleofílicos y la otra molécula de precursor contiene los grupos electrofílicos. La solución salina fisiológica puede servir como el solvente. Se genera un calor mínimo en la reacción. Por lo tanto, la gelación puede llevarse a cabo in vivo o in vitro, en contacto directo con tejido, sin toxicidad adversa. De esta manera, pueden utilizarse polímeros diferentes de PEG, modificados telequélicamente o modificados en sus grupos laterales.

PTH

La hormona paratiroidea puede ser PTH^1-84 (nativa), PTH^1-38, PTH^1-34, PTH^1-31 o PTH^1-25, o cualesquiera versiones modificadas o alélicas de PTH que muestren propiedades, es decir, formación ósea, similares a las anteriormente indicadas ("PTH"). La más preferente es PTH^1-34.

Péptidos de fusión de PTH

En una forma de realización preferente, la PTH es un péptido de fusión de PTH, que comprende por lo menos dos dominios en el que el primer dominio comprende PTH y el segundo dominio comprende un dominio de sustrato covalentemente entrecruzable, preferentemente entrecruzable covalentemente, con la matriz durante o después de su formación. El dominio de sustrato es preferentemente un dominio para un enzima, preferentemente un dominio de sustrato para una transglutaminasa ("dominio de sustrato de transglutaminasa"), más preferentemente para una transglutaminasa tisular ("dominio de sustrato de transglutaminasa tisular") y más preferentemente, es un dominio de sustrato para factor XIIIa ("dominio de sustrato de factor XIIIa"). Las transglutaminasas catalizan reacciones de transferencia de acilos entre el grupo gamma-carboxamida de residuos glutaminilo unidos a la proteína y el grupo amino epsilón de los residuos de lisina, resultando en la formación de puentes de cadena lateral isopéptido N-epsilón-(gamma-glutamil)lisina. La secuencia de aminoácidos del péptido de fusión de PTH puede diseñarse para contener además un sitio de corte enzimático o hidrolítico, de esta manera la PTH puede resultar liberada con poca o ninguna modificación de la estructura primaria.

Los dominios de sustrato de transglutaminasa y, en particular, los dominios de sustrato de factor XIIIa resultan adecuados para unir el péptido de fusión de PTH a las matrices de fibrina, aunque también a matrices sintéticas durante su formación. Los componentes precursores de matriz sintética deben presentar grupos amino primarios colgantes a fin de que la transglutaminasa entrecruce el dominio de sustrato de transglutaminasa del péptido de fusión con los componentes precursores de matriz sintética. En el caso de que el péptido de fusión de PTH se sintetice para contener un grupo cisteína libre, es decir, un grupo tiol accesible, el grupo tiol podrá reaccionar con un componente precursor de matriz sintética que presenta grupos electrofílicos, tales como grupos acrilato. En una forma de realización preferida, el grupo cisteína se encuentra en el extremo N-terminal de la PTH. El sitio de degradación en el péptido de fusión es preferentemente degradable enzimáticamente, de manera que la liberación de la PTH está controlada por procesos específicos celulares, tales como la proteolisis localizada.

Los dominios de sustrato entrecruzables covalentemente por la transglutaminasa y adecuados para los fines de la presente invención han sido descritos en detalle, incluyendo sus secuencias de aminoácidos (listados de secuencias) en el documento n° WO 03/052091.

El dominio de sustrato entrecruzable puede incluir GAKDV(SEC ID n° 14 en el documento n°WO 03/052 091), KKKK (SEC ID n° 11 en el documento n°WO 03/052 091), YRGDTIGEGQQHHLGG (SEC ID n° 13 en el documento n°WO 03/052 091), o NQEQVSPL (SEC ID n° 12 en el listado de secuencias del documento n°WO 03/052091).

El dominio de sustrato de factor XIIIa más preferido presenta una secuencia de aminoácidos NQEQVSPL y en la presente memoria se denomina "TG".

El péptido de fusión de PTH puede producirse recombinantemente o mediante síntesis química. El péptido de fusión PTH 1-34 preferentemente se produce mediante síntesis química.

Tal como se indica en la presente memoria como forma de realización preferente, el dominio de sustrato de factor XIIIa se une directamente a PTH^1-34 o puede incluir un sitio de degradación entre la PTH (primer dominio) y la secuencia NQEQVSPL (segundo dominio). De esta manera, el péptido de fusión PTH^1-34 puede incorporarse dentro de la matriz de fibrina o sintética durante la formación mediante un sustrato de factor XIIIa y después liberarse en forma de PTH^1-34.

Los sitios de degradación permiten liberar la PTH con pocas o ninguna modificación de la secuencia peptídica primaria, lo que puede resultar en una actividad más elevada del factor. Además, permite controlar la liberación del factor mediante procesos específicos celulares. Lo anterior permite que los factores sean liberados a diferentes velocidades dentro del mismo material dependiendo de la localización de las células dentro del material. Lo anterior también reduce la cantidad de PTH^1-34 total necesaria, ya que su liberación está controlada por procesos celulares.

Sitios de degradación del péptido de fusión

Puede encontrarse presente un sitio de degradación enzimática o hidrolítica entre el primer y el segundo dominios del péptido de fusión. Los sitios de degradación pueden ser degradables mediante una degradación enzimática específica. Lo anterior permite el control de la liberación de la PTH mediante procesos específicos celulares, tales como la proteolisis localizada. Permite la liberación de la PTH a diferentes velocidades dependiendo de la localización de las células invasoras dentro de la matriz. Preferentemente, el sitio de degradación es cortable por un enzima seleccionado de entre el grupo que consiste en plasmina y metaloproteinasa matricial. Mediante la selección cuidadosa de K^m y k^cat de dicho sitio de degradación enzimática, puede controlarse que la degradación se produzca antes o después de la degradación de la matriz de fibrina y/o mediante la utilización de enzimas similares o diferentes para degradar la matriz. Dichos sitios degradables permiten la ingeniería de una liberación más específica de PTH a partir de las matrices de fibrina. El sitio degradable puede ser cortado por enzimas liberados a partir de las células que invaden la matriz. El sitio de degradación permite modificar la velocidad de liberación en diferentes localizaciones dentro de la matriz dependiendo de la actividad celular en esa localización y/o dentro de la matriz. Entre los beneficios adicionales se incluyen la reducción de la dosis de fármaco total dentro del sistema de liberación y la regulación espacial de la liberación, que permite liberar un porcentaje mayor del fármaco en el momento de mayor actividad celular. El sitio de degradación se abrevia "pI" en el contexto de la presente invención.

Entre los sitios proteolíticamente degradables podrían incluirse sustratos de colagenasa, plasmina, elastasa, estromelisina o activadores del plasminógeno. Los sustratos a modo de ejemplo se listan posteriormente. N1-N5 denota las posiciones de aminoácido 1-5 hacia el extremo aminoterminal de la proteína desde el sitio en que se produce la proteolisis. N1'-N4' denota las posiciones de aminoácido 1-4 hacia el extremo carboxiterminal de la proteína desde el sitio en que se produce la proteolisis.

Tabla 1: secuencias de sustrato de muestra para proteasas

Referencias:

1. Takagi y Doolittle, (1975) Biochem. 14:5149-5156.

2. Smith et al., (1995). J. Biol. Chem. 270:6440-6449.

3. Besson et al., (1996) Analytical Biochemistry 237:216-223.

4. Netzel-Arnett et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:6747-6755.

5. Coombs et al., 1998. J. Biol. Chem. 273:4323-4328.

Una forma de realización preferida es la secuencia YKNR (SEC ID n° 19 en el listado de secuencias en el documento n° WO 03/052091) entre el primer dominio y el segundo dominio. Permite que el enlace sea degradable por plasmina.

Un péptido de fusión de PTH particularmente preferido es TGpIPTH ^1-34:

NQEQVSPLYKNRSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF (SEC ID n° 18 en el listado de secuencias del documento n° WO 03/052091).

Otro péptido de fusión de PTH preferido es TG-PTH^1-34 que comprende los aminoácidos 1 a 34 de la PTH nativa, así como un dominio de sustrato de TG (transglutaminasa) pero ningún sitio de degradación NQEQVSPLSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF (SEC ID n° 17 en el listado de secuencias del documento n° WO 03/052091).

Los enzimas que podrían utilizarse para la degradación proteolítica son numerosos. Entre los sitios proteolíticamente degradables podrían incluirse sustratos de colagenasa, plasmina, elastasa, estromelisina o activadores del plasminógeno.

Definiciones

La expresión "actividad biológica" se utiliza generalmente en la presente memoria para referirse a sucesos funcionales mediados por una proteína de interés. En algunas formas de realización, lo anterior incluye sucesos sometidos a ensayo mediante la medición de las interacciones de un polipéptido con otro polipéptido. Incluye además someter a ensayo el efecto que presenta la proteína de interés sobre el crecimiento, diferenciación, muerte, migración y adhesión celular, sobre las interacciones con otras proteínas, la actividad enzimática, la fosforilación o desfosforilación de proteínas, la transcripción o la traducción.

La expresión "fusión espinal" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un procedimiento quirúrgico destinado a conseguir la formación de hueso y, de esta manera, la fusión, entre dos o más vértebras.

La expresión "mineral de calcio" se utiliza generalmente en la presente memoria para referirse a sustancias homogéneas naturales que contienen iones de calcio. Un ejemplo de un mineral de calcio es la hidroxiapatita (Ca⁵[(OH)(PO⁴)³], que es el componente principal de los dientes y los huesos.

El término "entrecruzamiento" se utiliza generalmente en la presente memoria para referirse a la formación de enlaces covalentes o iónicos, preferentemente enlaces covalentes.

La expresión "matriz de fibrina" tal como se utiliza generalmente en la presente memoria se refiere al producto de un procedimiento en el que sustancialmente la totalidad de los componentes precursores de fibrinógeno y trombina se entrecruzan en presencia de una fuente de calcio y factor XlIIa para formar una red tridimensional. Los términos “matriz”, “gel” y “red tridimensional” o “red polimérica” se utilizan como sinónimos.

El término "matriz" tal como se utiliza generalmente en la presente memoria se refiere a un material destinado interactuar con sistemas biológicos para tratar, aumentar o sustituir cualquier tejido o función del tejido que depende del material, permanente o temporalmente. La matriz puede servir como dispositivo de liberación de PTH incorporada en la misma y/o como una matriz de crecimiento interno celular. Las matrices descritas en la presente memoria están formadas de componentes precursores líquidos que pueden formar un andamiaje fuera o dentro del cuerpo en el sitio en que se requieren. Los términos "matriz", "gel" o "biomateriales" se utilizan como sinónimos en la presente memoria. Los términos "matriz" y "gel" se refieren a la composición formada después de mezclar juntos los componentes precursores. De esta manera, los términos "matriz" y "gel" comprenden redes poliméricas parcial o totalmente entrecruzadas. Pueden encontrarse en forma de un líquido, semisólido, tal como una pasta, o un sólido. Dependiendo del tipo de materiales precursores, la matriz puede hincharse con agua, aunque no disolverse en agua, es decir, formar un hidrogel que permanece en el cuerpo durante un determinado periodo de tiempo.

El término "PTH" tal como se utiliza en la presente memoria incluye la secuencia humana de PTH^1-84 y todas las versiones truncadas, modificadas y alélicas de PTH que muestran propiedades de formación ósea, en particular al incorporarlas en una matriz de fibrina u otra matriz. Las versiones truncadas preferidas de PTH son PTH^1-38, PTH^1-34 , PTH ^1-31 o PTH ^1-25. La más preferida es PTH^1-34. Preferentemente, la PTH es PTH humana, aunque la PTH de otras fuentes, tal como la PTH bovina, puede resultar adecuada.

La expresión "péptido de fusión de PTH" tal como se utiliza generalmente en la presente memoria se refiere a un péptido que contiene por lo menos un primer y un segundo dominios. Un dominio contiene PTH, preferentemente PTH 1-34, y el otro dominio contiene un dominio de sustrato entrecruzable con una matriz de fibrina u otra matriz durante o después de su formación, por ejemplo, con el hinchado. Puede encontrarse presente un sitio de degradación enzimática o hidrolítica entre el primer y el segundo dominios.

La expresión "péptido que comprende PTH" tal como se utiliza en la presente memoria incluye "PTH" y "péptidos de fusión de PTH".

La expresión "cajetín intersomático" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un dispositivo diseñado específicamente para la implantación en el espacio intersomático durante la fusión espinal para ayudar a restaurar la alineación correcta de la columna y para ayudar a mantener la altura del espacio discal.

La expresión "fijación posterior" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un dispositivo que está destinado a estabilizar un segmento espinal mediante la unión de dos vértebras. El sistema de fijación posterior puede implantarse en los procesos transversales o espinosos.

Procedimientos de utilización y aplicación

En la forma de realización preferida, el producto farmacéutico que comprende PTH en una matriz, preferentemente en una matriz de fibrina, se utiliza en combinación con un cajetín intersomático.

La gelificación/formación in situ puede producirse mediante la mezcla de las soluciones de precursor de material de matriz, preferentemente soluciones de precursor de matriz de fibrina, que contienen la PTH con los gránulos (en caso de estar presentes) y la aplicación de la composición mezclada, preferentemente entrecruzada, en el espacio intersomático. En otra forma de realización, la composición mezclada, preferentemente entrecruzada, puede aplicarse en el cajetín intersomático y después implantarse en el espacio discal preparado. Dependiendo de la indicación, la técnica operativa o preferencia del cirujano, el material mezclado puede aplicarse en un estado todavía líquido o en una consistencia similar a una pasta. Los componentes precursores de la matriz de fibrina, el fibrinógeno y la trombina, deben mantenerse separados antes de la mezcla, para evitar una polimerización prematura. Lo mismo se aplica a los componentes precursores de otras matrices. Para evitar el contacto prematuro, puede utilizarse un kit que separa las soluciones de precursores unas de otras. Con la mezcla bajo condiciones que permiten la polimerización (entrecruzamiento), las soluciones de precursores forman una red tridimensional con suplementación de PTH. Dependiendo de los componentes precursores y sus concentraciones, el tiempo de gelificación puede adaptarse a la necesidad.

Las células también pueden añadirse a la composición farmacéutica de la presente invención antes o en el momento de la implantación, o incluso después de la implantación del producto farmacéutico, es decir, después del entrecruzamiento de las moléculas de precursores.

En una primera forma de realización, se disuelve fibrinógeno en una solución tampón (que puede contener adicionalmente aprotinina para incrementar la estabilidad) a pH fisiológico (en un intervalo de pH comprendido entre 6.5 y 8.0, preferentemente entre 7.0 y 7.5) y almacenarse separadamente de una solución de trombina en un tampón de cloruro cálcico. La solución tampón para el fibrinógeno puede ser una solución de tampón de histidina que incluye adicionalmente NaCl o solución salina tamponada con TRIS. Ambas soluciones se almacenan congeladas y necesitan descongelarse antes de la aplicación.

En una forma de realización preferida, se proporciona un kit, que contiene PTH, preferentemente proteína de fusión de PTH, fibrinógeno, trombina y una fuente de calcio. Opcionalmente, el kit puede contener un material granular, preferentemente que contiene un mineral de calcio, y una enzima de entrecruzamiento, tal como factor XIIIa. La PTH, preferentemente la proteína de fusión de PTH, puede encontrarse presente en la solución de fibrinógeno o de trombina. En una forma de realización preferente, la solución de fibrinógeno contiene la PTH, preferentemente el péptido de fusión de PTH. Preferentemente, el kit contiene además un cajetín de fusión espinal intersomática.

Las soluciones de fibrinógeno y trombina (primera y segunda soluciones de precursor de material de matriz) preferentemente se mezclan por un dispositivo conector, en el que se lleva a cabo la mezcla inyectando el contenido de una jeringa en otra jeringa y de esta a la primera, varias veces.

En una forma de realización preferida, se almacenan tanto fibrinógeno como trombina por separado en forma liofilizada. Cualquiera de las dos puede contener la proteína de fusión y el material granular. Antes de la utilización, se añade el tampón Tris o de histidina al fibrinógeno. El tampón puede contener adicionalmente aprotinina. La trombina liofilizada se disuelve en la solución de cloruro cálcico. Después, se introducen las soluciones de fibrinógeno y de trombina en recipientes separados, por ejemplo, viales o cuerpos de jeringa, y se mezclan mediante un dispositivo conector bidireccional, tal como una jeringa de dos vías. Opcionalmente, los recipientes/viales/cuerpos de jeringa son bipartitos, presentando de esta manera dos cámaras separadas por una partición ajustable, que es perpendicular a las paredes del cuerpo de la jeringa. Una de las cámaras contiene el fibrinógeno o trombina liofilizado, mientras que la otra cámara contiene una solución tampón apropiada. Al apretar el émbolo, la partición se desplaza y libera el tampón en la cámara de fibrinógeno, disolviendo el fibrinógeno. Una vez se ha disuelto el fibrinógeno y la trombina, ambos cuerpos de jeringa bipartita se unen a un dispositivo conector de dos vías y se mezclan los contenidos pasándolos por la aguja de inyección conectada al dispositivo conector. Opcionalmente, el dispositivo conector contiene un mezclador estático para mejorar la mezcla del contenido.

El material granular, en caso de estar presente, se proporciona en un recipiente separado, por ejemplo, una jeringa. Según una forma de realización preferida, dicho material granular se humecta mediante inyección de agua estéril en el interior de dicha jeringa. Seguidamente, la jeringa de dos vías anteriormente indicada que contiene las soluciones de precursor de fibrina y la PTH se une a la jeringa que contiene el material granular humectado. El contenido completo de la jeringa de dos vías se transfiere a la otra jeringa. El contenido completo seguidamente se inyecta en el sitio de la fusión y es moldeable durante varios minutos. Los materiales granulares preferidos son, por ejemplo, MBCP™-hidroxiapatito/fosfato p-tricálcico-microgránulos.

Se sigue un procedimiento análogo, en el caso de que se prepare una matriz diferente, por ejemplo, una matriz sintética. Los componentes precursores de material de matriz se almacenan separados, y preferentemente se mezclan mediante un dispositivo conector tal como se ha indicado anteriormente.

Se incluyen los ejemplos siguientes para ilustrar formas de realización preferidas de la invención. En particular, en todos los ejemplos se utilizó TGpl PTH^1-34 en una matriz de fibrina, y se une covalentemente a la misma. Sin embargo, pueden utilizarse diferentes materiales de matriz, por ejemplo, matrices sintéticas, y diferentes péptidos PTH, con o sin TG, y con o sin sitio de degradación proteolítica. El agente activo, es decir, PTH, puede unirse covalente o no covalentemente a la matriz. También se subraya que los componentes para el kit de la presente invención, los componentes para formar el producto farmacéutico, y los componentes de la formulación farmacéutica, con independencia de si la formulación se encuentra en un cajetín de fusión espinal o no, son los mismos componentes que los divulgados en la presente memoria. El procedimiento para formar el producto farmacéutico utiliza los componentes de la formulación farmacéutica y el kit, respectivamente.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra las densidades minerales óseas obtenidas con diferentes formulaciones de PTH en un modelo de fusión intersomática cervical anterior en la oveja.

La figura 2 ilustra los resultados histomorfométricos obtenidos con diferentes formulaciones de PTH en un modelo de fusión intersomática lumbar transforaminal en la oveja.

La figura 3 ilustra los resultados del análisis |jCT obtenidos con diferentes formulaciones de PTH en un modelo de fusión intersomática lumbar anterior en el babuino.

La figura 4 ilustra los resultados histomorfométricos obtenidos con diferentes formulaciones de PTH en un modelo de fusión intersomática lumbar anterior en el babuino.

Ejemplo 1: modelo de fusión intersomática cervical anterior en la oveja

Se formó la matriz de fibrina a partir de TISSEEL VH S/D DUO® o de ARTISS disponible comercialmente (Baxter AG, CH-8604 Voketswil/ZH), proporcionando 4 ml de matriz de fibrina y que presentaba la composición listada posteriormente. TISSEEL y a Rt iSs se producen a partir de plasma agrupado de origen humano y el contenido de ingredientes activos puede variar de lote a lote dentro de intervalos predefinidos.

Elemento de ensayo: TGpl PTH^1-34 (en la sección experimental, TGpl PTH^{i - 34} y PTH o PTH^1-34 se utilizan como sinónimos) en fibrina se sometió a ensayo sola o con material granular. Se preparó PTH en fibrina utilizando 2 jeringas separadas, una que contenía solución de fibrinógeno y péptido de fusión de PTH, y la otra que contenía solución de trombina (jeringas 1 y 2). Se preparó PTH en fibrina con material granular utilizando 3 jeringas separadas, una jeringa de dos vías que contenía la solución de precursor de fibrina y péptido de fusión de PTH (jeringas 1 y 2) y dos jeringas de una vía que contenían gránulos (jeringas 3 y 4). La Tabla 2 lista la composición de TISSEEL o ARTISS utilizada:

Tabla 2:

itrato trisódi

riton WR 13

gua para iny

Tabla 2 (continuación)

Para preparar PTH en fibrina, la solución de precursor de fibrina de la jeringa 1 (fibrinógeno y PTH suspendidos en una solución con aprotinina, un inhibidor de serina proteinasa que ayuda a reducir la fibrolisis para conservar la integridad de la matriz de fibrina) se mezcló con la solución de precursor de fibrina de la jeringa 2 (trombina en una solución de cloruro cálcico).

Para preparar PTH en fibrina con material granular en primer lugar los gránulos de hidroxiapatita/fosfato cálcico en la jeringa 4 se humectaron mediante inyección del agua de la jeringa 3. A continuación, la solución de precursor de fibrina de la jeringa 1 se mezcló con la solución de precursor de fibrina de la jeringa 2 y después con el material granular.

Se formuló TGplPTH-^ en el componente fibrinógeno, proporcionando una concentración final que varía entre 0 mg/ml (control negativo) y 1 mg/ml de matriz de fibrina, y durante el proceso de gelación, TGplPTH-^ se entrecruzó con la matriz. Las soluciones de precursor de fibrina también contienen otros componentes de matriz de fibrina, tales como fibronectina plasmática, factor XIII, plasminógeno y albúmina humana. En el caso de que las soluciones de precursor se encuentren en volúmenes iguales, se produce un proceso de coagulación, formando fibrina, una matriz extracelular natural. El proceso de coagulación tiene lugar durante varios minutos, permitiendo la posterior manipulación, tal como la inyección simultánea de las soluciones mezclada en la jeringa 4, que contiene los gránulos humectados, o la aplicación del producto.

La PTH en fibrina se introduce en el cajetín intersomático (0,5 ml) antes de la implantación. Tras la implantación del cajetín, se aplican otros 3 ml de producto en torno al mismo.

Animales: se seleccionó un total de 96 ovejas hembra Merino de entre 51 y 110 kg (media: 62.8 kg) y aproximadamente 2 años de edad como animales experimentales. Se formaron doce grupos (figura 1) con autoinjertos como controles positivos (a) y simulados (b) como controles negativos. Los otros grupos consistían en la misma matriz de fibrina con (h-n) o sin (c-g) material granular y con diferentes concentraciones de TGplPTH-^, es decir, el objeto de la presente invención. Se realizó un seguimiento de los grupos durante 12 semanas, momento en que los animales fueron sacrificados en el matadero propiedad de la universidad. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo según la legislación alemana de protección y bienestar animal y fueron autorizados por el Comité ético local y las autoridades veterinarias.

Antes de la cirugía y durante como mínimo 10 días después, los animales se alojaron en corrales techados. En estos se controló diariamente el estado de salud de los animales para cualesquiera signos de inflamación o toxicidad, representada por dolor, infección de la herida, hinchazón local y/o modificaciones del comportamiento general, por ejemplo, ingesta de alimento, excreción de orina y heces, excitación, apatía, etc. Después de su retorno a los pastos, su estado de salud fue controlado diariamente por los cuidadores del LGF-Versuchsstation Nutztierwissenschaften, Lentzealle 75, 14195 Berlin. En caso de cualquier deterioro de la salud, las ovejas eran devueltas a las instalaciones animales de Virchow-Klinikum, Charité-Universitatsmedizin Berlin, en donde eran examinadas por los veterinarios.

Cirugía: se accedió a la columna cervical ventralmente. Utilizando un amplificador de imágenes, se identificó el espacio intervertebral C3/C4. Tras la disección del ligamento longitudinal anterior, se realizó una discectomía y las placas terminales contiguas se descorticaron. Posteriormente, se expandió el espacio intervertebral utilizando una fresa cilindrica y un cajetín de fusión intersomático (SynCage-C, curvado, azul, tamaño 7.0, REF 495.302, SYNTHES®, Synthes GmbH, Eimattstrasse 3, 4436 Oberdorf, Suiza) prellenado con los biomateriales, o autoinjerto o que se había dejado vacío (simulado de control) insertado en el espacio intervertebral preparado. A continuación, se aplicó material de ensayo adicional en torno al cajetín. El acceso quirúrgico se cerró mediante técnica de cuatro suturas.

Para el grupo de control positivo de autoinjerto, se recolectó hueso autogénico de la parte dorsal de la cresta ilíaca izquierda a través de una incisión local. Se abrió la cresta ilíaca utilizando martillo y cincel. Se realizaron dos cortes separados por 3 cm y se conectaron en un lado, de manera que esta parte de la cresta ilíaca formarse un colgajo a modo de tapa. Se extrajo el hueso esponjoso utilizando una cureta. A continuación, se reaplicó la tapa y se fijó en su posición con un filamento (Vircryl®Plus 1, J&J, Bélgica). Para cerrar el acceso quirúrgico, se suturó la hipodermis continuamente utilizando un filamento resorbible (Vircryl®Plus 3-0, J&J, Bélgica). Finalmente, se cerró la piel con un filamento no resorbible (Prolene®, 3-0, Ethicon GmbH, Norderstedt, Alemania).

Procedimientos de evaluación: los animales fueron sacrificados tras 12 semanas y se extrajo el segmento espinal que comprendía el nivel C3/C4 para el análisis final. Se utilizaron cuatro técnicas diferentes para evaluar el resultado sobre la fusión espinal y entre ellas se incluyen la radiografía, el ensayo biomecánico no destructivo, la tomografía computerizada (TC) y los exámenes histológicos.

Evaluación radiológica: las radiografías se obtuvieron antes y directamente después de la cirugía, así como 8 y 12 semanas después (unidad radiográfica: Mobilett Plus, Siemens AG, Fuji CR 24x30, Fuji). La evaluación radiográfica fue realizada por dos revisores independientes con respecto a tres parámetros diferentes: altura del espacio discal, ángulo intervertebral y fusión radiográfica. Todas las mediciones se repitieron tres veces y los resultados finales fueron revisados por el investigador principal.

Con respecto a la altura del espacio discal, se midió la altura del espacio discal intervertebral anterior, central y posterior del segmento móvil C3/C4 en escaneos radiográficos laterales. Después, se calculó la altura media del espacio discal intervertebral a partir de mediciones anterior, central y posterior.

También se midió el ángulo intervertebral en escaneos radiográficos laterales.

Se desarrolló un sistema de puntuación semicuantitativa para evaluar las radiografías. Las puntuaciones elevadas eran favorables para la cicatrización ósea.

Tomografía computerizada: después del sacrificio, se llevaron a cabo escaneos de tomografía computerizada cuantitativa periférica (pQCT) (Siemens Somatom Plus, Siemens, Erlangen). Se realizaron cortes axiales de 1 mm de grosor de la sección en paralelo al espacio discal intervertebral.

Se determinaron las densidades minerales óseas (DMO) tal como indican Kandziora y Pflugmacher (Kandziora et al., 2001 y 2004, Pflugmacher et al., 2005). Las mediciones de DMO se calibraron con un objeto de prueba de densidad mineral ósea de 6 puntos.

Se identificaron cuatro zonas diferentes y separadas de interés dentro del cajetín y se realizó una medición individual de DMO de cada zona. Las zonas seleccionadas eran idénticas en cada muestra para garantizar la comparabilidad de los resultados. Para definir las zonas, los orificios presentes en los cajetines de fusión espinal se utilizaron como puntos de referencia. Adicionalmente, se midieron cuatro zonas en los cuerpos vertebrales C3 y C4.

Las mediciones se llevaron a cabo utilizando software de escáner específico (Sienet Magic View VA 30A, Siemens, Inc., Erlangen, Alemania). Todos los parámetros fueron evaluados por tres revisores independientes.

Ensayos biomecánicos no destructivos: después del sacrificio de los animales, se evaluaron las propiedades biomecánicas de los segmentos tratados mediante ensayos mecánicos no destructivos. Se aplicaron momentos de flexión pura al segmento móvil C3/C4 utilizando un sistema de cables y poleas para inducir flexión y extensión, doblado lateral izquierdo y derecho y rotación axial izquierda y derecha. Se aplicó tensión en los cables con un aparato de ensayo uniaxial (Zwick 1456, Zwick GmbH, Ulm, Alemania) (Kandziora et al., 2001).

Se midió el desplazamiento tridimensional de cada segmento móvil utilizando un sistema de medición óptico (Qualysis, Savebalden, Suecia). Se unieron dos marcadores triangulares con tres diodos (Qualysis, Savebalden, Suecia) a los cuerpos vertebrales C3 y C4. Se detectaron las posiciones de los marcadores con dos cámaras y se registraron utilizando un sistema controlado por ordenador para estudiar los microdesplazamientos (PC-Reflex, Qualysis Inc., Savebalden, Suecia). Se calculó el desplazamiento angular de C3 con respecto a C4 mediante la utilización de software diseñado al efecto.

Los cuerpos vertebrales se incluyeron en un plástico de dos componentes (polvos de Beracryl, monómero de Beracryl, Bauer Handels GmbH Waberg, Adetswil, Suiza) para garantizar una fijación apropiada y que la extremidad inferior del segmento se uniese rígidamente a la base del aparato de ensayo. El peso del dispositivo de fijación apical resultó en una precarga axial de 25 N, correspondiente aproximadamente al peso de una cabeza de oveja. Las muestras se mantuvieron húmedas durante todo el procedimiento de ensayo. Se aplicaron momentos en incrementos de 1 Nm por segundo hasta un máximo de 6 Nm. Los especímenes en primer lugar se preacondicionaron con tres ciclos. A continuación, se adquirieron datos durante la aplicación del cuarto ciclo. El rango de movimiento (RDM), la zona neutra y elástica, así como los valores de rigidez, se determinaron a partir de las curvas de par de torsión-desplazamiento angular correspondientes.

Histología. Tras los ensayos biomecánicos, los segmentos móviles C3/4 vertebrales se sometieron a análisis histológico de secciones parasagitales no descalcificadas utilizando diferentes tinciones para evaluar los efectos de los biomateriales. Se llevó a cabo un análisis histomorfológico e histomorfométrico, así como la determinación de la fusión histológica.

En primer lugar, los segmentos se fijaron durante un día en formaldehído tamponado normal al 10%. A continuación, los segmentos se cortaron sagital y parasagitalmente en 8 secciones de 4 mm y después se fijaron durante 7 días adicionales en formaldehído tamponado normal al 10%. Después, se extrajeron las partes residuales de los cajetines y las secciones se deshidrataron en concentraciones crecientes de etanol. Tras la inclusión, en parafina o en metacrilato de metilo, se cortaron secciones longitudinales de 6 pm en el plano sagital (micrótomo Leica SM 2500S) y se utilizaron las técnicas de tinción siguientes:

1. Músculo liso alfa

2. TRAP

3. Naranja de safranina/von Kossa

4. Pentacrómico de Movat

5. Verde de metilo/van Gieson

6. Azul de toluidina

7. Masson Goldner

La puntuación de fusión histológica dentro del cajetín se evaluó basándose en la sección central realizada por dos revisores independientes en las secciones teñidas con naranja de safranina/von Kossa utilizando un sistema de puntuación de tres ejes.

Histomorfometría. Se tiñeron secciones con naranja de safranina/von Kossa, verde metilo/van Gieson y pentacrómico de Movat para la histomorfometría. Se midieron los parámetros utilizando un microscopio Leica DM-RB y un sistema de análisis de imágenes (Zeiss KS 400, Zeiss GmbH, Alemania).

En primer lugar, se definió la zona o zonas de interés (ZDI). Como primera zona, se definió una ZDI global a partir de la anchura del disco intervertebral original y una altura de 35 mm. Dentro de dicha ZDI se definieron 5 subzonas diferentes. La ZDI del cajetín comprendía un rectángulo de 7 mm de altura y 12 mm de anchura en la localización del cajetín. Contiguo a la ZDI del cajetín, se definieron ZDI dorsal y ventral desde el cajetín hasta el extremo dorsal o ventral de las vértebras, respectivamente. Además, se definieron ZDI craneal y caudal que comprendían 5 mm de las vértebras craneal (C3) o caudal (C4) contiguas al cajetín, respectivamente (figura 6).

Se calcularon los índices estructurales siguientes en la ZDI:

1. volumen óseo/volumen total

2. volumen de cartílago/volumen total

3. volumen de tejido conectivo/volumen total

4. volumen de gránulos/volumen total (solo para grupos tratados con el material granular que contiene el biomaterial)

Se determinó el tejido óseo y el conectivo a partir de las tinciones de naranja de safranina/von Kossa, el cartílago a partir de las tinciones pentacrómicas de Movat y los gránulos a partir de las tinciones de verde de metilo/van Gieson.

Histomorfología: las secciones teñidas por músculo liso alfa, TRAP, naranja de safranina/von Kossa, Masson Goldner, pentacrómico de Movat y para los grupos de sustituto de injerto óseo, adicionalmente verde de metilo/van Giesson para la histomorfología.

El análisis histomorfológico se llevó a cabo en cinco ZDI para determinar la fusión ventral, la presencia de hueso reticular, cartílago hialino, reacción potencial a cuerpos extraños, vascularización, osteolisis y la incidencia de osteoclastos y osteoblastos. Dos revisores independientes llevaron a cabo la evaluación de los diferentes grupos: uno evaluó el autoinjerto y el biomaterial sin gránulos; el otro evaluó el control simulado y el biomaterial con gránulos.

Los resultados de dichos experimentos se muestran en la figura 1:

Se observó un nivel bajo de formación de hueso en los cajetines vacíos, mientras que se observó una formación significativa de hueso con el autoinjerto.

El tratamiento con el biomaterial sin gránulos mostró una clara formación de hueso dentro del cajetín de fusión espinal y, de esta manera, la estimulación de la fusión espinal. Dependiendo de la técnica de análisis utilizada, se encontró una dependencia de la dosis con los mejores resultados con TGplPTH1-34 a dosis comprendida entre 0.2 y 0.4 mg/ml de fibrina. Al medir la DMO, la fusión radiográfica, el mantenimiento de la altura del espacio discal y el ángulo intervertebral, se observaron resultados similares o mejores que el autoinjerto.

El biomaterial con gránulos mostró resultados similares en los parámetros radiológicos que el autoinjerto; sin embargo, todavía se encontraban presentes gránulos en el momento del sacrificio de los animales, lo que podría haber conducido a una sobreestimación de la puntuación de fusión radiográfica y la DMO en estos grupos.

El análisis histomorfométrico demostró que todos los grupos tratados con el biomaterial sin gránulos mostraban un porcentaje incrementado de hueso en comparación con vacíos. Además, el biomaterial que contenía 0.2 mg de TGpIPTH1-34/ml de fibrina presentó resultados comparables al autoinjerto en el porcentaje de hueso, cartílago y tejido conectivo.

El biomaterial con gránulos presentaba un porcentaje bajo de hueso en comparación con el autoinjerto; se obtuvieron los mejores resultados con una concentración de 0.2 mg de TGpIPTH1-34/ml de fibrina.

Mientras que se observó la formación de hueso dentro del cajetín de fusión espinal, los biomateriales mostraron una estabilización peor que el autoinjerto, según la evaluación mediante ensayo biomecánico. Lo anterior podría deberse al punto temporal temprano que se seleccionó para la evaluación de la fusión espinal, al ser un tiempo excesivamente corto para una estabilización mecánica significativa.

El análisis histomorfológico mostró células inflamatorias y cantidades incrementadas de vasos sanguíneos en proximidad a los cajetines de titanio en algunos animales en los que se dejaron vacíos o se habían tratado con autoinjerto, o con los biomateriales, aunque no se observó ninguna tendencia relacionada con la concentración de TGpIPTH1-34. Además, en los grupos tratados con el biomaterial que contenía gránulos se observaron zonas de inflamación leve en torno a lo gránulos fuera del cajetín, aunque esto nuevamente no estaba relacionado con la concentración de TGpIPTH1-34. Globalmente el producto aparentemente es muy biocompatible.

Los resultados mejorados en el grupo tratado con TGplPTH-^ en comparación con los grupos de control demuestran que la presencia de dosis clínicamente relevantes de TGplPTH-^ en los biomateriales de la presente invención puede conducir a una fuerte mejora de la cicatrización. La cicatrización más rápida y la formación mejorada de hueso son características relevantes que justifican la aplicación del biomaterial de la presente invención en procedimientos de fusión espinal. Además, al evaluar los resultados de la evaluación radiológica, la DMO y la fusión histológica, puede observarse que las dosis comprendidas entre 0.2 mg/ml y 0.7 mg/ml de matriz de fibrina TGpIPTH-^ son el intervalo de concentraciones más preferido.

Ejemplo 2: modelo de fusión intersomática lumbar transforaminal en la oveja

Tal como en el Ejemplo 1, se sometió a ensayo PTH (es decir, TGpI PTH^1-34) sola y con material granular, respectivamente. Se utilizaron los mismos materiales que en el Ejemplo 1, y la preparación del producto siguió el mismo protocolo que para el Ejemplo 1, aunque en el presente estudio las concentraciones de TGpIPTH^1-34 estaban comprendidas entre 0.2 mg/ml y 0.7 mg/ml de matriz de fibrina. El tratamiento se aplicó únicamente dentro del cajetín intersomático. No se aplicó ningún material de ensayo adicional en torno al cajetín, tal como en el Ejemplo 1.

Animales: se seleccionó un total de 28 ovejas híbridas Suffolk (castrados "weathers") de peso medio 57 kg y de 3 a 6 años de edad como los animales experimentales. Se formaron siete grupos. Se utilizó el autoinjerto como control positivo y los demás grupos consistían en la misma matriz de fibrina con o sin material granular y con diferentes concentraciones de TGplPTH^1-34, es decir, los biomateriales de la presente invención. Se realizó un seguimiento de los grupos durante 16 semanas, momento en que los animales fueron sacrificados. Los cuidados y uso de los animales se llevaron a cabo de acuerdo con la normativa federal, tal como se indica en la Ley de bienestar animal. La cirugía, cuidados perioperatorios, alojamiento, prácticas higiénicas, cría y cuidados veterinarios siguieron las recomendaciones de NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (HHS, NIH, pub. n° 85-23, 1985). El personal al cuidado de los animales era personal cualificado, por formación y experiencia, para realizar las tareas requeridas.

Todos los animales recibieron un examen físico por un veterinario dentro de las dos semanas previas a la cirugía, a fin de garantizar un estado de salud normal. Cualesquiera animales que se determinase preoperatoriamente o durante l cirugía que presentaba alguna anormalidad ósea (por ejemplo, tumor u osteomielitis) u otro factor descalificante, fueron excluidos del estudio. Los animales dispusieron de una jaula de 6'x 10' preoperatoriamente y durante todo el periodo postoperatorio. Se disponía de una jaula de aislamiento para procedimientos y tratamientos espaciales, en caso necesario.

Antes de la cirugía, todos los animales se sometieron a restricción alimentaria (NPO) durante cuarenta y ocho horas y se alojaron en las instalaciones de cuidado de jaula de aislamiento. Todos los animales fueron examinados diariamente por el Director del estudio durante los primeros diez días después de la operación, con observaciones de la mortalidad, cicatrización del sitio de la herida, función ambulatoria, signos clínicos de enfermedad y cambios de comportamiento (sociales). Tras diez días postoperatorios, se llevaron a cabo dichas observaciones y fueron registradas por los técnicos de cuidado animal. Se prestó atención particular al sitio quirúrgico, con énfasis en la cicatrización de la herida y los signos de infección, en caso de existir. Los animales considerados anormales por el personal de las instalaciones fueron remitidos al Director del estudio y un veterinario diariamente para su examen. Las observaciones y sucesos adversos graves se registraron en los impresos de informe de caso y fueron comentados con respecto al diagnóstico, gravedad, tratamiento y resultado.

Cirugía: tras la administración intravenosa de la medicación anestésica y la inducción de anestesia general, se preparó asépticamente la zona lumbar anterolateral y la cresta ilíaca. Tras colocar el animal en posición de decúbito lateral, la exposición quirúrgica consistió en una incisión de diez a quince centímetros que se iniciaba en la cresta ilíaca y se extendía a lo largo de los bordes palpables de los procesos transversales lumbares a lo largo de la derecha anatómica. Se llevó a cabo el desprendimiento del oblicuo abdominal externo respecto de los procesos transversales, seguido de la disección de los tejidos blandos para permitir la exposición retroperitoneal del músculo psoas. Utilizando un elevador periostial y la electrocauterización, se expusieron los aspectos anterolaterales de los cuerpos vertebrales L2-L3 y L4-L5 y los discos intervertebrales. Se seccionaron las raíces del nervio ventral que cruzan sobre la superficie del disco, seguido de discectomía y eliminación de rebabas de las placas terminales vertebrales hasta una dimensión de aproximadamente 24 mm de profundidad x 11 mm de anchura x 11 mm de altura en ambos niveles operativos. Se llevó a cabo distracción segmentaria con un tornillo Caspar en cada nivel operativo para ayudar en la eliminación de la placa terminal y la preparación del espacio. Una vez preparado, se llenó el cajetín Tetris® PEEK (Signus Medical, LLC) con 1.6 ml según el programa de aleatorización del tratamiento y se implantó con seguridad dentro del espacio discal. Como control operativo se utilizó autoinjerto ilíaco esponjoso triturado al 100%. Cada animal recibió el mismo tratamiento a ambos niveles operatorios, para evitar la contaminación cruzada de diferentes dosis. Los tratamientos se llevaron a cabo según una tabla de aleatorización predefinida, siguiendo estrictamente las recomendaciones del fabricante para la implantación del dispositivo. Para el cierre de la herida, el músculo, capa subcutánea y piel se aproximaron con suturas de Vicryl 1-0 continuas e interrumpidas.

Bajo la misma anestesia, el animal se reposicionó en decúbito prono, se preparó asépticamente y se vendó estérilmente. Se realizó una incisión inicial en la piel en la línea media dorsal de la espalda baja, en los niveles L2-S1. La disección roma utilizando un elevador Cobb y electrocauterización, en caso necesario, se llevó a cabo en el plano sagital a lo largo del arco neural, permitiendo la exposición de las facetas L2-L3 y L4-L5 y los procesos transversales. Tras la verificación fluoroscópica del cajetín previamente implantado, se instrumentaron los dos niveles operatorios (L2-L3 y L4-L5) utilizando la fijación de tornillo y varilla transpedicular (S4® Spinal System - Aesculap Spine USA, Inc.). Para los cierres de la herida, el músculo, la capa subcutánea y la piel se aproximaron con suturas de Vicryl 1-0 continuas e interrumpidas y la piel se cerró con grapas. Los datos sobre el tipo y duración de la anestesia, duración de la cirugía, pérdida estimada de sangre, asignación de tratamiento, complicaciones, antibióticos y analgésicos se registraron en el tiempo del procedimiento quirúrgico.

Procedimientos de evaluación: los animales fueron sacrificados compasivamente tras 16 semanas. Se extrajo cuidadosamente la columna vertebral del animal y se introdujo inmediatamente en bolsas de espécimen de plástico de doble envoltorio y se congelaron a -25 grados centígrados para la posterior evaluación radiográfica, biomecánica e histológica de los segmentos móviles operatorios.

Evaluación radiológica: se obtuvieron imágenes fluoroscópicas anteroposterior y lateral de la zona lumbar intraoperatoriamente y postoperatoriamente para verificar la colocación del implante. Se obtuvieron películas simples postoperatoriamente y en el momento del sacrificio del animal a fin de evaluar la localización del implante y las radiolucencias de placa terminal. Para cada segmento operatorio, se obtuvieron imágenes de tomografía computerizada entre el nivel cefálico y el caudal del pedículo de los segmentos artrodésicos a intervalos de sección de un milímetro de grosor (Dedicated Imaging, Inc., Baltimore, Maryland). Se utilizaron las imágenes de TC para evaluar cualitativamente el éxito de la fusión intersomática y la localización de los materiales de injerto dentro del nivel de tratamiento, la incidencia de estenosis espinal y/o la calcificación ectópica anterior o lateral al cajetín implantado. Los sitios de artrodesis fueron clasificados como fusión, unión parcial o no unión por cuatro individuos ciegos al grupo de tratamiento. Se definió la fusión como 'sí' en el caso de que dos secciones sagitales en las imágenes de TC mostrasen evidencia de hueso contiguo de placa terminal a placa terminal sin signos de radiolucencias, mientras que la unión parcial se basó en una imagen sagital que contuviese hueso contiguo. Se obtuvieron imágenes simples anteroposterior y lateral de la zona lumbar intraoperatoriamente y postoperatoriamente para verificar la colocación del implante.

Ensayos biomecánicos no destructivos: en la preparación de los ensayos biomecánicos, los segmentos móviles lumbares se descongelaron a temperatura ambiente y se limpiaron de toda la musculatura residual con cuidado de preservar todas las uniones ligamentosas y la integridad del sitio móvil operatoria. Los extremos cefálico y caudal de cada espécimen se fijaron en recipientes rectangulares utilizando ocho tornillos de compresión. Se aplicó un total de tres marcadores de detección de movimiento de plexiglás sobre el espécimen: marcador 1 - elemento superior; marcador 2 - elemento inferior, y marcador 3 - base. Se dotó cada marcador de tres diodos emisores de luz no colineales diseñados para la detección por un sistema optoelectrónico de medición del movimiento (3020 OptoTrak System). Con el fin de determinar las propiedades de flexibilidad multidireccional, se aplicaron seis momentos no restringidos puros: flexión y extensión (±4 Nm eje X), doblado lateral izquierdo y derecho (±4 Nm, eje Z) y torsión izquierda y derecha (±4 Nm, eje Y) en el extremo superior del espécimen orientado verticalmente, mientras que la parte caudal del espécimen se mantuvo fija a una plataforma de ensayo. Se utilizó un momento aplicado máximo de ± 4Nm a cada modo de carga y se aplicó a una tasa de incremento de tres grados/segundo utilizando un simulador espinal con seis grados de libertad (6DOF-SS). Se llevó a cabo un total de tres ciclos de carga/descarga para cada movimiento, con análisis de los datos basado en el último ciclo. Para los seis movimientos principales - correspondientes a los momentos aplicados - las rotaciones vertebrales (grados) a nivel operatorio se cuantificaron en términos de rango máximo de movimiento (RMM). A fin de evitar la desecación durante la evaluación, los especímenes se humectaron con solución de irrigación estéril de NaCl al 0.9%.

Ensayos biomecánicos destructivos: se llevó a cabo un ensayo mecánico destructivo para cuantificar las propiedades del material estructural del tejido dentro del cajetín PEEK. Se evaluó un segmento móvil operatorio L4-L5 en cada grupo de tratamiento. Los segmentos móviles operatorios se seccionaron transversalmente, directamente a lo lago de los bordes superior e inferior del cajetín PEEK utilizando un sistema de corte Beuhler Isometer y una cuchilla de diamante de corte en láminas. Se obtuvieron dos superficies paralelas utilizando dicha técnica. A continuación, se montó el cajetín explantado sobre la plataforma de ensayo en un sistema de ensayo MTS 858 Bionix. Los ensayos de indentación por compresión se llevaron a cabo utilizando un indentador de punzón de 3 mm de diámetro a una tasa de desplazamiento de 0.2 mm por segundo hasta una profundidad de 4 mm. Se llevaron a cabo tres ensayos en cada lado de las superficies superior e inferior con cálculo de la carga de fallo máxima (newtons) para cada sitio de ensayo a partir de las curvas de carga-desplazamiento (n=6 sitios de indentación por cajetín). Se sometió a ensayo un total de ocho cajetines (uno en cada grupo) y se compararon con un control no operatorio intacto. Los especímenes operatorios seguidamente se procesaron utilizando una técnica no descalcificada para caracterizar histológicamente los tejidos presentes en cada sitio de ensayo y correlacionar estas observaciones con las propiedades mecánicas observadas. Dichos procedimientos de ensayo mecánico han sido publicadas previamente: (Grant JP et al: Spine 15;26-8:28(8)896, 2001) y (Oxland Tr et al: Spine 15;28(8)771-777, 2003).

Evaluación histopatológica e histomorfométrica: tras el análisis biomecánico, los segmentos de movimiento lumbar operatorios no incluidos en los ensayos mecánicos destructivos se seccionaron sagitalmente a lo largo de la línea central geométrica del dispositivo implantado utilizando una sierra Beuhler Isomet. Las muestras de cajetín sometidas a ensayo también se procesaron utilizando una técnica no descalcificada, aunque se seccionaron coronalmente. La preparación histológica de todas las muestras incluyó la deshidratación en etanol al 100%, la tinción utilizando la tinción ósea osteocrómica Villanueva, el procesamiento en solución no descalcificada y la inclusión en metacrilato de polimetilo (PMMA). Mediante la utilización del dispositivo de microtrituración EXAKT, los especímenes incluidos se cortaron en secciones de 300 a 600 jm de grosor, se trituraron y se pulieron a 130 |jm. Se obtuvieron microrradiografías de los especímenes montados en portaobjetos, mediante radiografía Faxitron. Los portaobjetos se situaron a doce pulgadas del haz y se expusieron durante dos minutos, utilizando una técnica de 34 kVp y 2 mA, mientras se encontraban en contacto directo con la película de artes gráficas de alta resolución monoemulsión. Se utilizaron las microrradiografías de alta resolución y microrradiografías ópticas para la evaluación de la fusión por dos revisores ciegos a los grupos de tratamiento. Se definió la fusión como hueso contiguo de placa terminal a placa terminal sin evidencia de radiolucencias intrusivas dentro del cajetín. Se puso de manifiesto la unión parcial en una fila contigua de hueso formando puente entre las placas terminales, mientras que la no unión era un hueco radiolucente continuo que comprendía el cajetín. La cuantificación histomorfométrica de siete parámetros diferentes dentro de los límites del cajetín PEEK incluía lo siguiente: zona de interés (ZDI) (mm2), superficie de implante PEEK (mm2), superficie de gránulos (mm2), superficie de hueso (mm2), superficie de médula (mm2), superficie neta de tejido (mm2) y superficie trabecular/superficie neta de tejido (%). La superficie neta de tejido representa la zona de interés menos la superficie de PEEk . Se evaluaron las muestras de cajetín PEEK incluidas en los ensayos de indentación destructiva utilizando microscopia óptica simple para caracterizar los tejidos presentes.

Para todos los especímenes, se reseccionó la médula espinal (n=2 por espécimen) y el tejido local suprayacente a los sitios del implante (n=2 por espécimen), se seccionóy se preparó por un patólogo veterinario. Los especímenes se fijaron en solución de formalina al 10% y se sometieron a procesamiento en parafina y preparación de la muestra en portaobjetos rutinarios por el laboratorio del University of Maryland Biotechnology Institute (UMBI, Baltimore, MD). Mediante la utilización de microtomía de sección fina, las secciones incluidas en parafina se cortaron (3 a 5 jm de grosor), se montaron en portaobjetos y se tiñeron utilizando una tinción estándar de hematoxilina y eosina (H+E) y especial de macrófagos (HAM-56). La evaluación patológica de todos los tejidos incluía comentarios sobre la arquitectura de los tejidos, la presencia de residuos de desgaste, la incidencia de mineralización en tejido local / histología de la médula espinal, osteolisis, así como cualesquiera signos de células gigantes de tipo cuerpo extraño / reacciones inflamatorias granulomatosas, cambios degenerativos o autólisis.

Los resultados de dichos experimentos se muestran en la figura 2:

no se observó toxicidad durante el periodo de tratamiento con cualquiera de las dosis o formulaciones de TGplPTH-i^-34 utilizadas.

La revisión histopatológica de todos los grupos de tratamiento combinados no indica evidencia de cuerpos extraños/reacciones inflamatorias o cambios patológicos significativos. Muchos tratamientos contienen bolsillos interposicionales de tejido cartilaginoso/colagenoso, que se encuentra en remodelación activa. En prácticamente todos los casos, el hueso trabecular dentro de los cajetines PEEK está densamente tejido y es esclerótico en la mayoría de zonas, conteniendo una distribución de osteocitos y anchuras de la matriz osteoide normales. Globalmente no había indicios de patología ósea debido a ninguna de las formulaciones o dosis de TGplPTH-i^-34 utilizadas en la presente investigación. Todos los especímenes histológicos pueden caracterizarse como clínicamente no notable y que experimentan un proceso de cicatrización normal, sin pruebas de reacción de células gigantes/respuesta inflamatoria u otros cambios histopatológicos significativos.

El análisis radiográfico en película simple no mostró evidencia de migración del implante. Las imágenes de TC sagitales y coronales mostraron fusiones con éxito en el autoinjerto y en el tratamiento con los biomateriales. Para el biomaterial sin gránulos, se obtuvieron mejores resultados a una concentración de TGplPTH-i^-34 comprendida entre 0.4 y 0.7 mg/ml, mientras que, para el biomaterial con gránulos, se obtuvieron mejores resultados a una concentración de TGplPTH-i^-34 de 0.2 mg/ml. Las puntuaciones de fusión histológica confirmaron el resultado radiográfico.

En la cuantificación histomorfométrica, el porcentaje de zona ósea en el cajetín era máximo para 0.4 mg/ml de TGplPTH-i^-34 en el biomaterial sin gránulos, seguido del grupo de 0.7 mg/ml y el grupo de autoinjerto. Se llevaron a cabo ensayos biomecánicos para determinar las propiedades de flexibilidad multidireccional de los segmentos lumbares, en los que se observó mejor estabilidad, indicada por un rango menor de movimiento. Los resultados mostraron que TGplPTH-i^-34 a una concentración de 0.4 mg/ml en el biomaterial sin gránulos y todas las concentraciones de TGplPTH-i^-34 en el biomaterial con gránulos proporcionaron estabilidad mecánica en comparación con el autoinjerto. En general, los gránulos proporcionan soporte estructural y podrían contribuir a la estabilización mecánica.

Los resultados obtenidos en el grupo tratado con una concentración seleccionada de TGplPTH-i^-34 en los biomateriales eran comparables o mejores que los grupos de control positivo, demostrando que la presencia de dosis clínicamente relevantes de TGplPTH-i^-34 en los biomateriales de la presente invención puede conducir a un sustituto de injerto óseo eficaz para la fusión espinal. Además, al considerar los resultados de la evaluación radiológica, biomecánica e histológica, puede observarse que las dosis comprendidas entre 0.4 mg/ml y 0.7 mg/ml de TGplPTH-i^-34 en la matriz de fibrina es el intervalo de concentraciones más preferido en el biomaterial sin gránulos y que las dosis comprendidas entre 0.2 mg/ml y 0.7 mg/ml de TGplPTH-i^-34 en la matriz de fibrina es el intervalo de concentraciones más preferido en el biomaterial con gránulos.

Ejemplo 3: modelo de fusión intersomática lumbar anterior en el babuino

Se utilizaron los mismos materiales que en los ejemplos anteriores (excepto por el material granular, que no se encontraba presente en la composición de TGplPTH-i-³⁴-fibrina del presente ejemplo).

Elemento de ensayo: se formuló TGplPTH-i^-34 en el componente fibrinógeno para proporcionar una concentración final de 0.4 mg/ml de la matriz de fibrina.

Animales: se seleccionó un total de 3 babuinos oliva o amarillos de peso aproximado de 30 kg y 8 a 11 años de edad como los animales experimentales. Los babuinos fueron sometidos a discectomía de L4/L5 y L6/L7 y fusión utilizando un cajetín vertebral radiolucente. En cada animal, un nivel contenía un volumen total de 0.7 ml de injerto de hueso autólogo dentro del cajetín (control positivo), mientras que el otro nivel contenía el mismo volumen de 0.4 ml de TGplPTH-i^-34 por ml de fibrina. Los dos niveles segmentarios de la intervención se aleatorizaron por bloques respecto al control de autoinjerto y el grupo de tratamiento. Se realizó un seguimiento de los animales durante 6 meses, momento en que los animales fueron sacrificados. Todos los experimentos animales se llevaron a cabo en la Southwest Foundation for Biomedical Research (SFBR), 7620 NW Loop 410, San Antonio, TX 78227, EE.UU., según la legislación de protección y bienestar animal ("Animal Welfare Act" y "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals"). El experimento fue autorizado por el comité institucional de cuidado y uso de los animales (IACUC, por sus siglas en inglés).

Antes y después de la cirugía, los animales fueron comprobados periódicamente para su estado general de salud.

Cirugía: los animales fueron colocados en una posición supina. La exposición quirúrgica consistía en una incisión de entre 10 y 15 cm en la pared abdominal lateral izquierda, seguido de disección del tejido blando para permitir la exposición retroperitoneal de la columna lumbar anterior. La disección roma utilizando un elevador Cobb y la electrocauterización se llevó a cabo según necesidad, para exponer los aspectos anteriores de los cuerpos vertebrales L4/L5 y L6/L7 con discos intervertebrales interpuestos. Se utilizó la radiografía intraoperatoria para verificar los niveles operatorios. La aorta y la vena cava suprayacente a la columna lumbar anterior se retrajeron suavemente y se prepararon dos sitios discales no contiguos (L4/L5 y L6/L7) en la columna lumbar, para la inserción de los implantes espaciadores. Con este fin, se abrió en los discos una ventana rectangular de aproximadamente 15 milímetros (mm) de anchura, centrada y que se extendía desde el borde caudal hasta el borde craneal de la placa terminal. El material del disco se extrajo gradualmente utilizando trépanos pequeños y legras y hasta el sangrado de las placas terminales en toda la zona en sección transversal. Un cajetín PEEK, de dimensionado apropiado para encajar estrechamente, se llenó con hueso autólogo o TGplPTH-^ en fibrina, antes de la inserción en el espacio discal intervertebral preparado. Para el tratamiento de autoinjerto, se recolectaron chips de injerto óseo corticoesponjoso utilizando un cincel curvado y un martillo a lo largo del interior de la cresta ilíaca anterior izquierda. Se procuró no violar la cubierta cortical externa de la cresta. A continuación, los chips se cortaron adicionalmente con un trépano óseo en trozos más pequeños que se utilizaron para empaquetar densamente el interior del cajetín. Para el cierre de las heridas, los músculos y fascias se aproximaron utilizando Vicryl 1-10 y se cerró la piel con suturas de Vicryl 2-0. Se documentó la posición del implante directamente después de la cirugía mediante radiografías en vista anteroposterior y lateral.

Procedimientos de evaluación: se llevó a cabo un análisis de sangre y radiológico cada 4 semanas hasta el sacrificio. Durante el periodo de seguimiento, se administraron diversos compuestos fluorescentes a fin de permitir la monitorización de la aposición de calcio durante el tiempo. Los animales fueron sacrificados tras 24 semanas y se recolectaron los segmentos vertebrales L4/L5 y L6/L7 para el análisis final. Se utilizaron tres técnicas diferentes para evaluar los resultados quirúrgicos. Entre ellos se incluían la radiografía/microrradiografía, la microtomografía computerizada (|-iTC) y los exámenes histológicos.

Evaluación radiológica: se obtuvieron radiografías en proyecciones anteroposterior y lateral antes y directamente después de la cirugía, así como cada cuatro semanas después, hasta 24 semanas después de la cirugía. Se utilizaron películas para evaluar cualitativamente la evolución y éxito de la fusión intersomática durante el estudio, así como para identificar la migración del cajetín y la reducción del espacio intervertebral. La evaluación radiográfica fue realizada por dos revisores independientes ciegos al grupo de tratamiento, siguiendo un sistema de puntuación semicuantitativo de 0 a 3 para la fusión y de 0 a 2 para el desplazamiento de un cajetín y disrupción del espacio vertebral.

Tomografía computerizada: el análisis de pTC se llevó a cabo con respecto al hueso presente en el cajetín de fusión espinal. Se utilizó un algoritmo para crear una máscara que representaba el volumen interior del cajetín. En primer lugar, se definió una zona de interés igual a la forma interna del cajetín de fusión espinal. Dentro de dicha zona de interés, se analizó el volumen óseo y después se calculó el volumen óseo dividido por el volumen total (VO/VT).

Histología: se llevó a cabo el análisis histológico cualitativa y semicuantitativamente. Para cada nivel, se prepararon tres secciones histológicas gruesas para el plano sagital medio, así como para ambos planos parasagitales con un desplazamiento de aproximadamente 4 mm. Tras el suavizado por peso durante dos días, se obtuvieron microrradiografías (Faxitron), después se trituraron a un grosor de 30 a 40 micrómetros (pm) y se tiñeron con azul de toluidina. El análisis cualitativo de las secciones histológicas se llevó a cabo centrado en la fusión dentro del cajetín, desplazamiento del cajetín, material de disco/cartílago y formación de callo (puntuación de 0 a 3). De cada nivel, se prepararon dos secciones histológicas delgadas para puntuar semicuantitativamente la presencia de osteoblastos, osteoclastos, células de tipo cuerpo extraño, linfocitos, macrófagos y células plasmáticas. Se prepararon secciones histológicas delgadas y se tiñeron con azul de toluidina y contratinción tetracrómica de Von Kossa/McNeal.

Histomorfometría: se llevó a cabo la histología cuantitativa en ciego a los grupos experimentales. En primer lugar, las fotografías se colorearon para las diferentes características (por ejemplo, tejido fibroso, hueso viejo, hueso nuevo, etc.) utilizando AdobePhotoshop®. Se llevó a cabo la histomorfometría siguiente mediante un procedimiento estandarizado y automatizado utilizando un microscopio Leica para la cuantificación. Se calcularon los porcentajes de hueso, cartílago y tejido conectivo.

Los resultados de estos experimentos se muestran en las figs. 3 y 4.

No se detectó ningún problema de seguridad con la utilización del material y en particular, no se observó hipercalcemia en el análisis de sangre.

El análisis radiográfico, histológico y de pTC demostró una reducción del espacio intervertebral en la mayoría de niveles, que podría ser secundario al procedimiento quirúrgico. También se observó una migración anterior del cajetín de poli-éter-éter-cetona (PEEK) en algunos niveles, que podría haber producido la pérdida de algo de material.

La fusión radiográfica mostró una formación de puente completo o puente claro con un pequeño hueco intervertebral en todos los animales en los grupos de tratamiento de TGplpTH^1-34 en fibrina, con una tendencia de fusión similar que el control interno de autoinjerto.

La puntuación histológica de fusión se llevó a cabo basándose en el porcentaje de puente óseo dentro del cajetín. En general, se observó un nivel bajo de fusión con solo puente óseo en un nivel tratado con autoinjerto. Respecto a la deposición ósea dentro del cajetín durante el tiempo, el autoinjerto y TGplPTH^1-34 en fibrina mostraron formación de hueso a las 8 y 13 semanas, pero no después. El análisis de pTC (figura 3) y la histomorfometría (figura 4) mostraron resultados consistentes. El nivel de formación ósea era variable entre animales, aunque comparable entre el nivel tratado y el nivel de control.

El análisis histomorfológico no mostró diferencias importantes en términos de presencia celular (osteoblastos, osteoclastos, células de tipo cuerpo extraño, linfocitos, macrófagos y células plasmáticas) entre el control de autoinjerto y grupos de tratamiento. El presente estudio mostró que TGplPTHi^-34 en fibrina es capaz de estimular la fusión espinal en un modelo de primate no humano con eficacia y tiempos comparables al autoinjerto de cresta ilíaca.

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Formulación farmacéutica para la utilización en un procedimiento de fusión espinal, que comprende: una composición para formar una matriz, que comprende por lo menos un primer componente precursor de material de matriz y un segundo componente precursor de material de matriz, capaz de formar la matriz mediante entrecruzamiento de los componentes precursores bajo condiciones apropiadas,

un factor bioactivo, que es biológicamente activo en la estimulación de la formación de hueso entre dos vértebras y para efectuar o prestar soporte a la fusión espinal, siendo el factor bioactivo adecuado para ser incorporado de manera liberable en la matriz con el entrecruzamiento de los componentes precursores de material de matriz,

en la que el factor bioactivo es PTH o un péptido que comprende PTH, y además

en la que la PTH o el péptido que comprende PTH es el único factor bioactivo añadido que resulta eficaz para estimular la formación de hueso entre dos vértebras y para efectuar o prestar soporte a la fusión espinal.

2. Formulación farmacéutica según la reivindicación 1, en la que la formulación para formar una matriz y el factor bioactivo se proporcionan en forma de componentes líquidos.

3. Formulación farmacéutica según la reivindicación 1 o 2, que comprende además un material granular, preferentemente un compuesto cerámico biodegradable.

4. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el péptido que comprende PTH es un péptido de fusión de PTH que comprende por lo menos dos dominios, comprendiendo el primer dominio PTH y comprendiendo el segundo dominio un dominio de sustrato entrecruzable.

5. Formulación farmacéutica según la reivindicación 4, en la que el segundo dominio del péptido de fusión de PTH comprende un dominio de sustrato de transglutaminasa, preferentemente un dominio de sustrato de factor XIIIa.

6. Formulación farmacéutica según la reivindicación 4 o 5, en la que el péptido de fusión de PTH comprende además un sitio de degradación enzimática o hidrolítica entre el primer y segundo dominios.

7. Formulación farmacéutica según la reivindicación 6, en la que el sitio de degradación es un sustrato para la plasmina.

8. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el péptido que comprende PTH es TGpl-PTH-i-³⁴.

9. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la matriz es fibrina, y la composición para formar la matriz comprende fibrinógeno, trombina y una fuente de calcio.

10. Formulación farmacéutica según la reivindicación 9, en la que la composición para formar la matriz de fibrina comprende: (i) fibrinógeno y trombina como primer y segundo componentes precursores de material de matriz, y opcionalmente factor XIIIa, y (ii) PTH en un intervalo comprendido entre 0.01 y 1 mg de PTH/ml de matriz de fibrina, preferentemente entre 0.2 y 0.7 mg de PTH/ml de matriz de fibrina, más preferentemente 0.4 mg de PTH/ml de matriz de fibrina.

11. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que la matriz es una matriz sintética o una matriz mixta sintética/natural, y la composición para formar la matriz comprende un componente precursor de material de matriz que presenta grupos o enlaces nucleofílicos fuertes, y un componente precursor de material de matriz que presenta grupos o enlaces electrofílicos fuertes.

12. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que el tratamiento es la fusión espinal intersomática.

13. Kit para la utilización en un procedimiento de tratamiento de la fusión espinal que comprende una formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que por lo menos uno de los componentes precursores de material de matriz capaces de formar la matriz mediante entrecruzamiento de los componentes precursores bajo condiciones apropiadas se proporciona por separado de los demás componentes precursores de material de matriz.

14. Kit según la reivindicación 13, en el que el primer componente precursor de material de matriz se proporciona en forma de una primera solución de precursor en un primer recipiente, el segundo componente precursor de material de matriz se proporciona en forma de una segunda solución de precursor en un segundo recipiente, y se proporciona PTH, o el péptido que comprende PTH, en la primera o segunda solución de precursor.

15. Kit según la reivindicación 13 o 14, en el que el kit contiene un dispositivo de fusión espinal, preferentemente un cajetín de fusión espinal intersomática.

16. Producto farmacéutico para la utilización en un procedimiento de fusión espinal que comprende una matriz y PTH, o un péptido que contiene PTH, incorporados liberablemente en la matriz, pudiendo obtenerse el producto farmacéutico mediante entrecruzamiento de la formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o que puede obtenerse mediante la utilización del kit según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15.

17. Cajetín de fusión espinal intersomática que contiene una formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o que contiene un producto farmacéutico según la reivindicación 16.

18. Procedimiento para formar un producto farmacéutico según la reivindicación 16, que comprende proporcionar un primer componente precursor de material de matriz, proporcionar un segundo componente precursor de matriz, proporcionar PTH o un péptido que comprende PTH, y mezclar el primer y segundo componentes de precursor de material de matriz y PTH o el péptido que comprende PTH, preferentemente bajo condiciones fisiológicas, para formar un material de matriz mediante entrecruzamiento del primer y segundo componentes precursores de material de matriz, presentando el material de matriz PTH o el péptido que comprende PTH incorporado liberablemente en el mismo.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, que comprende además proporcionar un material granular, humectar el material granular, y mezclar el material granular humectado y la mezcla del primer y segundo componentes precursores de material de matriz y PTH o el péptido que comprende PTH.