ES2935170T3

ES2935170T3 - Sustituto de injerto óseo autólogo

Info

Publication number: ES2935170T3
Application number: ES18799434T
Authority: ES
Inventors: Slobodan Vukicevic; Kuber T Sampath; Lovorka Grgurevic; Charles Cohen; Hermann Oppermann
Original assignee: Genera Istrazivanja doo
Current assignee: Genera Istrazivanja doo
Priority date: 2017-10-19
Filing date: 2018-10-19
Publication date: 2023-03-02
Anticipated expiration: 2038-10-19
Also published as: CN110612129A; EP3697459B1; KR20200075850A; WO2019076484A1; JP2020537590A; US10960109B2; SI3697459T1; CN110612129B; AU2018351687A1; JP2023120322A; CA3075869A1; FI3697459T3; EP3697459A1; HRP20230020T1; US20200237959A1; DK3697459T3; AU2018351687B2; PL3697459T3

Abstract

La presente invención se refiere a una composición de sustituto de injerto óseo autólogo (ABGS) para inducir la formación de hueso nuevo, promover el crecimiento óseo y tratar defectos óseos, un método de preparación de la composición de sustituto de injerto óseo autólogo y un kit para preparar el sustituto de injerto óseo autólogo. composición del implante. En un aspecto particular, la invención se refiere a una composición de sustituto de injerto óseo autólogo inyectable/extruible/implantable para uso en el tratamiento de defectos óseos, induciendo la formación de hueso nuevo y promoviendo el crecimiento óseo para la curación de fracturas óseas, fusiones espinales y para reparar defectos óseos en huesos. Procedimientos reconstructivos de cirugías ortopédicas y maxilofaciales-dentales. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Sustituto de injerto óseo autólogo

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una composición, un método de preparación de la composición y a un kit para preparar una composición de implante, siendo dicha composición capaz de imitar un "autoinjerto vivo" para su uso en el tratamiento de defectos óseos, induciendo la formación de hueso nuevo y promoviendo el crecimiento óseo. En un aspecto particular, la invención se refiere a una composición inyectable/extruíble/implantable de sustituto de injerto óseo autólogo (denominada en lo sucesivo en el presente documento por la abreviatura ABGS (del inglés Autologous Bone Graft Substitute) para su uso en el tratamiento de defectos óseos, que induce la formación de hueso nuevo y promueve el crecimiento óseo para la curación de fracturas óseas, fusiones espinales y para reparar defectos óseos en procedimientos de reconstrucción ósea de cirugías ortopédicas y maxilofaciales-dentales orales. Estado de la técnica anterior

Los injertos óseos se emplean en una diversidad de procedimientos quirúrgicos diseñados para promover el crecimiento de hueso nuevo para reparar un defecto óseo, aumentar el crecimiento óseo en un sitio particular, promover la fusión de huesos adyacentes para restaurar, mejorar la estabilidad de una estructura esquelética y reducir el dolor de espalda y pierna sufrido por un individuo afectado. En muchas situaciones, un procedimiento quirúrgico emplea un injerto óseo junto con cualquiera de una diversidad de instrumentos, tales como tornillos pediculares y varillas, para asegurar el injerto óseo implantado y mejorar la estabilidad mientras crece hueso nuevo para corregir el defecto.

La fusión espinal es un procedimiento quirúrgico empleado principalmente para aliviar el origen del dolor de espalda y pierna en un individuo en el que los segmentos vertebrales (vértebra-disco-vértebra) están dañados o inflamados. Durante una fusión espinal, se fusionan dos o más segmentos vertebrales adyacentes para restringir el movimiento y la compresión entre los segmentos y, por lo tanto, terminar o mitigar sustancialmente el dolor y la degeneración adicional que resulta del movimiento o la compresión de segmentos adyacentes dañados. Por lo tanto, el resultado deseado de un procedimiento de fusión espinal es reemplazar la disposición original de dos vértebras separadas por un disco de fibrocartílago articular por un segmento de hueso estable, continuo y que soporta carga, que a su vez alivia el dolor y modera la degeneración segmental adicional (por ejemplo, una fusión intersomática lumbar anterior, ALIF del inglés Anterior Lumbar Inter-body Fusion).

Además de aliviar el dolor y estabilizar aún más la columna para evitar la compresión, las dos apófisis transversas en ambos lados en un segmento dado (nivel) se fusionan mediante la formación de hueso funcional nuevo en sitios ectópicos utilizando autoinjerto o segmentos de aloinjerto desvitalizado o partículas de aloinjerto desvitalizado enriquecidos con la médula ósea del paciente o matriz ósea desmineralizada alogénica que contiene la médula ósea del paciente (por ejemplo, fusión lumbar posterolateral, PLF del inglés Posterolateral Lumbar Fusion). Los cirujanos utilizan instrumentos metálicos como jaulas, tornillos y varillas para ayudar a fusionar los segmentos de la columna lumbar anterior (cuerpos vertebrales) y posterior (procesos vertebrales), ya que la inmovilización (artrodesis) del movimiento minimiza la compresión sobre los nervios de la médula espinal que pasan entre dos vértebras lumbares. Para aumentar la tasa de fusión, la instrumentación se complementa con injertos óseos para estimular la osteogénesis en sitios tanto intervertebrales (fusión intersomática lumbar posterior, ALIF) como sitios ectópicos entre las apófisis transversas (fusión lumbar posterolateral, PLF) o ambos (fusión intersomática lumbar posterolateral, PLIF del inglés Posterolateral Lumbar Inter-body Fusion). Véase, por ejemplo, Mobbs, R. J. et al. Lumbar interbody fusion: techniques, indications and comparison of interbody fusion options including PLIF, TLIF, MI-TLIF, OL- IF/ATP, LLIF and ALIF. J Spine Surg 1:2-18 (2015). Puede tratarse una diversidad de trastornos con fusión espinal, incluyendo la enfermedad degenerativa del disco (DDD), la espondilolistesis, la estenosis espinal, la escoliosis, las infecciones, las fracturas, la distrofia espinal y diversos tumores.

La fusión espinal requiere un material que sirva para promover el crecimiento de nuevo hueso para fusionar vértebras adyacentes. Durante décadas, el procedimiento de fusión espinal estándar ha implicado una segunda incisión en un paciente para extraer astillas de hueso (autoinjerto) de la cresta ilíaca de la cadera del paciente. Las astillas de hueso recolectadas se insertan en el área entre las vértebras afectadas y se estabilizan con la instrumentación adecuada, tales como tornillos pediculares y varillas. Este procedimiento de fusión espinal que emplea autoinjerto del paciente también se denomina injerto óseo de cresta ilíaca (denominada en lo sucesivo en el presente documento mediante la abreviatura ICBG). La ventaja de utilizar ICBG es que las astillas de hueso recolectadas tienen células vivas de médula ósea y una matriz extracelular inmunológicamente compatible con el cuerpo del paciente y contienen elementos funcionales de la médula ósea, incluyendo glóbulos rojos y blancos y megacariocitos. Sin embargo, la utilización de un ICBG requiere que al paciente se le practique una segunda incisión. La segunda incisión para recolectar hueso para su uso como autoinjerto ha sido una preocupación en el campo, puesto que alarga el procedimiento quirúrgico y, por lo tanto, el tiempo que el paciente está bajo anestesia, proporciona otro sitio para el dolor posoperatorio (véase, por ejemplo, Kim et al., Spine J. 9:886-92; 2009) y, como otra incisión en el paciente, aumenta el riesgo de infección. Además, la cantidad de IGBG que podría recolectarse es limitada.

Para reducir dichos riesgos adicionales para el paciente, se han desarrollado y sometido a ensayo diversas composiciones implantables alternativas en un esfuerzo por reemplazar la necesidad de un autoinjerto durante el procedimiento quirúrgico. Dichas composiciones alternativas pueden comprender aloinjertos (por ejemplo, hueso de cadáver de un banco de huesos), matriz ósea desmineralizada (DBM), diversas cerámicas (compuestos a base de calcio), polímeros sintéticos, proteínas moforgenéticas óseas (BMP, del inglés bone morphogenetic proteins) y sus análogos, junto con un armazón de colágeno de origen animal, y diversas combinaciones de los mismos. Para los detalles, véase Gupta S, M. V., Gupta MC (2017) Biology of spine fusion and application of osteo-biologics in spine surgery. En: Vukicevic S, Sampath. KT. (ed) Bone Morphogenetic Proteins: Systems Biology Regulators. Springer International Publishing. Sin embargo, los intentos de desarrollar alternativas al autoinjerto para la fusión espinal se han encontrado con sus propios desafíos adicionales para conseguir una aprobación regulatoria.

El dispositivo de fusión cónica lumbar INFUSE® Bone Graft/LT-CAGE (Medtronic Sofamor Danek, Memphis, Tennessee, EE.UU.) fue aprobado en 2002 como sustituto del ICBG para el tratamiento de DDD en un nivel (vertebra-disco-vertebra, ALIF) de L2 a S1 utilizando un abordaje anterior en pacientes equeléticamente maduros. El componente de INFUSE® Bone Graft consiste en proteína morfogénica ósea humana-2 (rhBMP-2) aplicada a un portador de esponja de colágeno absorbible derivado de tendón de Aquiles bovino, que se utiliza para rellenar un componente de jaula con rosca lordótica (LT). Cada dispositivo contiene 12 miligramos de rhBMP-2 (en total), una lámina de colágeno empapada con 6 mg y llenada por separado en jaulas de 2 LT que se insertan en el espacio del disco vertebral. Para los detalles, véase INFUSE Bone Graft product information: Lumbar. (2002) Medtronic Sofamor Danek EE.UU., Inc. www.accessdata.fda.gov/cdrh docs/pdf/P000058c.pdf. Consultado en febrero de 2010. En el procedimiento quirúrgico aprobado, se implanta un dispositivo en cada lado del nivel vertebral afectado para promover la fusión estabilizadora en cada lado del segmento. La capacidad del dispositivo para promover la fusión espinal en diversos enfoques posteriores no aprobados también ha sido objeto de varios estudios. Véase, por ejemplo, Cahill et al., JAMA 302:58-66 (2009); Carragee, et al., Spine J 11:471-491 (2011). Sin embargo, el uso no aprobado produjo problemas de seguridad no deseados que llevaron a una comparecencia ante el congreso y al control de la FDA.

El producto sustituto de injerto óseo AMPLIFY® (Medtronic) fue diseñado y probado originalmente como un sustituto de ICBG para la fusión espinal utilizando un enfoque posterolateral (PLF). Este producto sustituto de ICBG entregó 40 mg de rhBMP-2 en una losa sintética porosa que está compuesta de esponja de colágeno derivada de tendón de Aquiles bovino impregnada con gránulos cerámicos de material compuesto de hidroxilapatita (HA) y fosfato tricálcico (TCP). Aunque el producto sustituto de injerto óseo AMPLIFY® proporcionó una fusión espinal moderada en el tratamiento de DDD, la Agencia de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) se negó a aprobar el producto citando que un número significativo de pacientes continúa experimentando dolor lumbar y dolor en las piernas y preocupaciones por los posibles riesgos de cáncer asociados con la dosis relativamente alta de rhBMP-2 y la formación de hueso ectópica no deseada en sitios alejados del implante atribuida a la mayor cantidad BMP-2 utilizada en el dispositivo. Véase, por ejemplo, Executive Summary for P050036 Medtronic's AMPLIFY™ rhBMP-2 Matrix Orthopedic and Rehabilitation Devices Advisory Panel (2010) Food and Drug Administration.

El implante OP-1® (Olympus/Stryker) es un dispositivo implantable para la regeneración ósea. El dispositivo contiene BMP-7 recombinante humana (rhBMP-7) dispersa dentro de un colágeno de tipo I derivado de hueso bovino. Debido a que no se consiguió una diferencia estadística en la formación de hueso nuevo sobre el autoinjerto, el implante OP-1® recibió la aprobación de la FDA únicamente para el uso de exención de dispositivo humanitario (HDE) como alternativa al autoinjerto en defectos de seudoartrosis de huesos largos donde el uso de autoinjerto es inviable y los tratamientos alternativos han fracasado. Véase, por ejemplo, la información del producto Stryker Biotech OP-1 Implant® (2009) www.stryker.com/stelient/groups/public/documents/web prod/ 126737. pdf. Consultado en febrero de 2010.

Un OP-1 Putty® es una composición que combina rhBMP-7, un colágeno óseo bovino y un aditivo de masilla (carboximetilcelulosa). El dispositivo OP-1 Putty® se evaluó en un estudio clínico de fusión posterolateral (PLF), pero tampoco consiguió una diferencia estadística en comparación con el autoinjerto. El OP-1 Putty® ha sido aprobado, por lo tanto, para su uso HDE en fusión espinal. Véase, por ejemplo, la información del producto Stryker Biotech OP-1 Putty® (2009) www.stryker.com/stellent/groups/public/documents/web prod/127024.pdf. Consultado en febrero de 2010.

Además del uso de autoinjerto en fusión espinal, existe una diversidad de otras indicaciones ortopédicas y dentales que se tratan utilizando autoinjerto. Dichas indicaciones incluyen diversos defectos y fracturas, tales como diáfasis, fracturas distales del radio, fracturas de seudoartrosis tibial, osteotomía tibial alta, fracturas osteoporóticas (fracturas vertebrales por compresión, fractura femoral atípica), defectos por quistes óseos y defectos por tumores óseos y también diversos defectos y anomalías orales, peridontales y maxilofaciales. Además, el autoinjerto también se utiliza para tratar seudoartrosis y pseudofracturas asociadas con trastornos musculoesqueléticos raros como la hipofosfatasia (mutación en el gen de la fosfatasa alcalina no específica de tejido), neurofibromatosis tipo I (mutación en el gen de la neurofibromina), osteogénesis imperfecta (mutación en el gen del colágeno tipo I). Dependiendo de la gravedad de la pérdida ósea en tales condiciones, la cantidad de autoinjerto que puede obtenerse de forma segura de a paciente puede no ser suficiente o puede carecer de calidad ósea (en pacientes fumadores comprometidos, diabéticos, usuarios de esteroides y osteoporóticos) para proporcionar el tratamiento deseado. En tales casos, tienen mucha demanda los sustitutos de injertos óseos biológicos que sean seguros y capaces de inducir una formación ósea robusta que esté restringida a los sitios defectuosos. Para una lectura completa, Vukicevic S, Sampath TK, editors. Bone Morphogenetic Proteins: from Laboratory to Clinical Practice. Basel: Birkhauser Verlag, 2002; Vukicevic S, Sampath, KT, editor. Bone Morphogenetic Proteins: Systems Biology Regulators. Springer International Publishing; 2017.

El documento de Patente WO2009129631 A1 desvela un implante biocompatible para la reparación ósea que comprende una membrana flexible ajustada alrededor de un defecto óseo y una composición de gel de plasma rico en plaquetas contenida dentro del espacio vacío creado por la membrana, y una composición de gel de plasma rico en plaquetas contenida dentro de dicho espacio vacío creado por la membrana. La Patente WO2009129631A1 no desvela coágulos de sangre autóloga, BMP que promueve el crecimiento óseo y CRM que comprende un aloinjerto óseo en su composición. En vista del BMP, la Patente WO2009129631A1 solo menciona que se puede agregar o incorporar BMP en superficies de una membrana flexible.

El documento de Patente WO2008011192A2 desvela un coágulo derivado de sangre completa obtenido para su uso en el tratamiento de defectos óseos preparado mediante las etapas que comprenden: (a) combinar: (1 ) sangre completa, (2) una proteína osteogénica, (3) ion de calcio proporcionado exógenamente y (4) opcionalmente, una mezcla de fibrina-trombina proporcionada exógenamente, (b) incubar los ingredientes combinados en la etapa (a) hasta que se forma un coágulo mecánicamente estable, en donde el ion de calcio proporcionado exógenamente está presente a una concentración que es eficaz para proporcionar un gel de coágulo homogéneo, cohesivo, que puede inyectarse con jeringa, inyectable y maleable. La Patente WO2008011192A2 no desvela ningún gel de coágulo de sangre autóloga que proporcione una liberación sostenida de la proteína morfogenética ósea osteogénica. La Patente WO2008011192A2 desvela un material de coágulo mecánicamente mal definido, semisólido, similar a una gelatina, que se disuelve rápidamente y, por lo tanto, no proporciona una liberación sostenida de la proteína morfogenética ósea osteogénica.

El documento de Patente WO9119510A1 desvela formulaciones farmacéuticas osteoinductoras que comprenden agentes antifibrinolíticos, tales como ácido caproico del aminoácido épsilon (EACA) u otros análogos de lisina o se desvelan inhibidores de serina proteasa y proteínas inductoras de cartílago y/o hueso. El efecto de las formulaciones se basa en el uso de EACA en comparación con muestras que carecen de EACA en el tratamiento de defectos de cartílago y/o hueso. La dosis óptima de hueso alogénico con BMP-2 no se desvela en la Patente WO9119510A1. Los ejemplos de la Patente WO9119510A1 develan que EACA parece aumentar particularmente la respuesta en los implantes de BMP-2/sangre autóloga.

Hasta la fecha, los pacientes están limitados a solo unos pocos productos como posibles alternativas para someterse a un procedimiento de autoinjerto para la fusión espinal y otros procedimientos ortopédicos. Claramente, sigue existiendo la necesidad de composiciones mejoradas que puedan promover el nivel y la calidad del crecimiento de hueso nuevo requeridos para la reparación exitosa de defectos óseos y para la fusión espinal sin la necesidad de someter a los pacientes a los riesgos, dolores y limitaciones adicionales asociados con los procedimientos de autoinjerto.

Sumario de la invención

La invención resuelve los problemas ilustrados en la técnica anterior, proporcionando una composición de sustituto de injerto óseo autólogo (ABGS) que serviría como un mimético de ICBG para su uso en la promoción del crecimiento de nuevo hueso en un sitio en un individuo que necesita tratamiento. En un aspecto particular, la invención se refiere a una composición inyectable/extruible/implantable de sustituto de injerto óseo autólogo (ABGS) para su uso en el tratamiento de defectos óseos, induciendo la formación de hueso nuevo y promoviendo el crecimiento óseo para la curación de fracturas óseas, fusiones espinales y para reparar defectos óseos en procedimientos de reconstrucción ósea de cirugías ortopédicas y maxilofaciales-dentales orales.

La invención se refiere a una composición de sustituto de injerto óseo autólogo para inducir la formación de hueso nuevo, promover el crecimiento óseo y tratar el defecto óseo, en donde la composición comprende:

(i) sangre autóloga;

(ii) una proteína morfogenética ósea osteogénica seleccionada entre el grupo que consiste en BMP-6, BMP-2, ^bM^p-7, BMP-4, BMP-5, BMP-8, BMP-9, BMP-12 y BMP-13, heterodímeros de las mismas y combinaciones de las mismas, en un intervalo de 0,002 a 1 mg por ml de sangre autóloga; y

(iii) una matriz resistente a la compresión, la matriz resistente a la compresión se selecciona del grupo que consiste en un aloinjerto óseo, hidroxiapatita, fosfato tricálcico y combinaciones de los mismos;

en donde la sangre autóloga forma un gel de coágulo que comprende la proteína morfogenética ósea osteogénica dentro de una malla de fibrina y reforzada con la matriz resistente a la compresión.

La invención se refiere además a un método de preparación de una composición de sustituto de injerto óseo autólogo, en donde el método comprende las etapas de:

(1 ) mezclar:

a) sangre autóloga;

b) una proteína morfogenética ósea osteogénica seleccionada del grupo que consiste en BMP-6, BMP-2, BMP-7, BMP-4, BMP-5, BMP-8, BMP- 9, BMP-12, BMP-13, heterodímeros de las mismas y combinaciones de las mismas, en un intervalo de 0,002 a 1 mg por ml de sangre autóloga; y

c) una matriz resistente a la compresión, la matriz resistente a la compresión se selecciona del grupo que consiste en un aloinjerto óseo, hidroxiapatita, fosfato tricálcico y combinaciones de los mismos;

(2) incubar los componentes de la etapa (1 ) durante un periodo suficiente para formar un gel de coágulo.

En una realización, la invención proporciona una composición de sustituto de injerto óseo autólogo (ABGS), un sustituto de autoinjerto para promover el crecimiento de nuevo hueso, que comprende:

1) sangre autóloga (AB),

2) una proteína morfogenética ósea osteogénica seleccionada del grupo que consiste en BMP-6, BMP-2, BMP-7, BMP-4, BMP-5, BMP-8, BMP-9, BMP-12, BMP-13, heterodímeros de las mismas y combinaciones de las mismas, en un intervalo de 0,002 a 1 mg por ml de sangre autóloga, y

3) un agente de coagulación sanguínea seleccionado entre sales de calcio farmacológicamente aceptables en solución iónica o nanopartículas y conjugados de microesferas de Ca++, y

4) una matriz resistente a la compresión, la matriz resistente a la compresión se selecciona del grupo que consiste en un aloinjerto óseo, hidroxiapatita, fosfato tricálcico y combinaciones de los mismos,

en donde la sangre autóloga forma un gel de coágulo que comprende proteína morfogenética ósea osteogénica dentro de una malla de fibrina, sales de calcio y la matriz resistente a la compresión (denominada en lo sucesivo en el presente documento mediante la abreviatura CRM).

La proteína morfogenética ósea osteogénica se selecciona entre BMP-6, BMP-2, BMP-7, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-9, BMP-12 y BMP-13, heterodímeros de las mismas y combinaciones de las mismas. Las proteínas moforgenéticas óseas osteogénicas son muy adecuadas.

La sangre autóloga (denominada en lo sucesivo en el presente documento mediante la abreviatura AB) puede comprender además un plasma rico en plaquetas autólogo o alogénico (denominado en lo sucesivo en el presente documento mediante la abreviatura PRP).

La matriz resistente a la compresión (CRM) se selecciona entre el grupo que consiste en: un aloinjerto óseo, un material compuesto de carbonato-fosfato cálcico y combinaciones de los mismos.

En otra realización, la invención proporciona un kit para preparar un implante de composición de sustituto de injerto óseo autólogo para inducir la formación de hueso nuevo.

La presente divulgación proporciona una composición de sustituto de injerto óseo autólogo descrita en el presente documento que puede comprender además una población proporcionada exógenamente de aspirado de médula ósea del paciente que contiene células osteoprogenitoras.

La presente divulgación proporciona una composición de sustituto de injerto óseo autólogo descrita en el presente documento que puede comprender además una población proporcionada exógenamente de células madre mesenquimales expandidas ex vivo (células osteoprogenitoras) de la médula ósea de los pacientes.

La presente divulgación proporciona una composición de sustituto de injerto óseo autólogo descrita en el presente documento que puede comprender además una población proporcionada exógenamente de células madre mesenquimales expandidas ex vivo (células osteoprogenitoras) de tejido adiposo de los pacientes.

La presente divulgación proporciona una composición de sustituto de injerto óseo autólogo descrita en el presente documento que puede comprender además una población proporcionada exógenamente de células madre mesenquimales expandidas ex vivo (células osteoprogenitoras) de capa perióstica de los pacientes (periostio). La presente divulgación proporciona una composición de sustituto de injerto óseo autólogo descrita en el presente documento que puede comprender además fragmentos de tejido picado proporcionados exógenamente preparados a partir de hueso local adyacente del paciente, músculo esquelético adecuado y/o fascia.

La presente divulgación proporciona una composición de sustituto de injerto óseo autólogo descrita en el presente documento que puede comprender además una población proporcionada exógenamente de células madre mesenquimales expandidas ex vivo (células osteoprogenitoras) derivadas de médula ósea alogénica o tejido adiposo o periostio de individuos inmunocompatibles de pacientes.

La presente divulgación proporciona una composición de sustituto de injerto óseo autólogo descrita en el presente documento que puede comprender además una población proporcionada exógenamente de células madre mesenquimales expandidas ex vivo (células osteoprogenitoras) derivadas de cordón umbilical alogénico.

En la presente divulgación, una composición de sustituto de injerto óseo autólogo descrita en el presente documento comprende una matriz resistente a la compresión (CRM) seleccionada del grupo que consiste en: aloinjerto óseo (por ejemplo, preparado a partir de hueso cortical o hueso trabecular o ambos), y un material compuesto de carbonato-fostato cálcico (denominado en lo sucesivo en el presente documento mediante la abreviatura cerámica). Dicho material compuesto de carbonato-fosfato cálcico se selecciona entre el grupo que consiste en: hidroxiapatita (HA), fosfato tricálcico (TCP) y combinaciones de los mismos.

La presente divulgación, sin que forme parte de la invención reivindicada, proporciona una composición de sustituto de injerto óseo autólogo descrita en el presente documento que puede comprender además matriz ósea desmineralizada alogénica.

La presente divulgación, sin que forme parte de la invención reivindicada, proporciona una composición de sustituto de injerto óseo autólogo descrita en el presente documento que puede comprender además un sustituto de injerto óseo que puede comprender además un polímero biorreabsorbible termosensible de fase inversa. Dicho polímero biorreabsorbible termosensible de fase inversa puede mezclarse en sangre autóloga (AB) que asume la reología de la composición que comprende el AB, el BMP y el CRM para que pueda inyectarse en fase líquida a temperatura ambiente, y a medida que la temperatura aumenta hasta la temperatura corporal (37 °C) forma un gel biocompatible en el sitio de entrega/implante. Por lo tanto, la composición proporciona una composición inyectable no invasiva que contiene un BMP, un CRM y un polímero biorreabsorbible termosensible de fase inversa dentro de la sangre autóloga. Esta formulación puede administrarse de forma no invasiva, por ejemplo, mediante inyección, superando de este modo las limitaciones asociadas con el sustituto de injerto óseo sólido comercializado actualmente. El ABGS inyectable induce eficazmente la formación de hueso nuevo, en un modelo de rata estándar de formación ósea ectópica. Esta composición inyectable permite la formación de hueso nuevo a concentraciones de BMP relativamente bajas, puesto que se une firmemente a las proteínas plasmáticas que son retenidas por el polímero biorreabsorbible termosensible de fase inversa a temperatura corporal a lo largo de una duración sostenible.

En otra realización, la invención proporciona un método de preparación de una composición de sustituto de injerto óseo autólogo para tratar un defecto óseo, induciendo la formación de hueso nuevo y promoviendo el crecimiento óseo, en donde el método comprende las etapas de:

(1 ) combinar:

a) sangre autóloga (AB),

b) una proteína morfogenética ósea osteogénica seleccionada entre BMP-6, BMP-2, BMP-7, BMP-4, BMP-5, BMP-9, BMP-12 y BMP-13, heterodímeros de las mismas y combinaciones de las mismas, en un intervalo de 0,002 a 1 mg por ml de sangre autóloga.

c) un agente de coagulación sanguínea seleccionado entre sales de calcio farmacológicamente aceptables en solución iónica o nanopartículas y conjugados de microesferas de Ca++; y

d) una matriz resistente a la compresión, la matriz resistente a la compresión se selecciona del grupo que consiste en un aloinjerto óseo, hidroxiapatita, fostato tricálcico y combinaciones de los mismos;

En otra realización, antes de la etapa (2) se añaden componentes adicionales.

La presente divulgación, proporciona un método de preparación de una composición de sustituto de injerto óseo autólogo para su uso en el tratamiento de un defecto óseo, induciendo la formación de hueso nuevo y promoviendo el crecimiento óseo, en donde el ABGS se prepara mediante las etapas que comprenden:

(1 ) combinar:

a) sangre autóloga,

b) una proteína morfogenética ósea osteogénica seleccionada entre BMP-6, BMP-2, BMP-7, BMP-2, BMP-9, BMP-12 y BMP-13, heterodímeros de las mismas y combinaciones de las mismas, en un intervalo de 0,002 a 1 mg por ml de sangre autóloga.

c) un agente de coagulación sanguínea seleccionado entre sales de calcio farmacológicamente aceptables en solución iónica o nanopartículas y conjugados de microesferas de Ca++;

(d) opcionalmente una población proporcionada exógenamente de células mesenquimales autólogas o alogénicas expandidas ex vivo (células osteoprogenitoras) de médula ósea, tejido adiposo, capa perióstica y/o cordón umbilical; y/o

(e) opcionalmente una matriz ósea desmineralizada;

La presente divulgación, sin que forme parte de la invención reivindicada, proporciona un método de preparación de una composición de sustituto de injerto óseo autólogo para su uso en el tratamiento de un defecto óseo, induciendo la formación de hueso nuevo y promoviendo el crecimiento óseo, en donde el ABGS se prepara mediante las etapas que comprenden:

(1 ) combinar

a) sangre autóloga,

b) un hueso osteogénico morfogenético,

d) una matriz resistente a la compresión (CRM),

(d) un polímero biorreabsorbible termosensible de fase inversa,

(e) opcionalmente una población proporcionada exógenamente de células mesenquimales autólogas o alogénicas expandidas ex vivo (células osteoprogenitoras) de médula ósea, tejido adiposo, capa perióstica o cordón umbilical, y/o

(f) opcionalmente una matriz ósea desmineralizada; y

(2) incubar los componentes de la etapa (1 ) durante un periodo suficiente para formar un gel de coágulo que tenga la reología para que pueda ser inyectado a temperatura ambiente en fase líquida, y a medida que la temperatura aumenta hasta la temperatura corporal (37 °C) forma un gel biocompatible en el sitio de entrega/implante.

Un ABGS descrito en el presente documento puede ser implantado o inyectado (por ejemplo, utilizando una jeringa) en el sitio de un defecto óseo o un sitio que requiera el crecimiento de nuevo hueso (por ejemplo, fusión espinal, aumentos esqueléticos).

Una BMP osteogénica útil en una composición de ABGS descrita en el presente documento se selecciona entre el grupo que consiste en BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP- 8, Bm P-9, BMP-12, BMP-13, heterodímeros de las mismas y combinaciones de las mismas. Más preferentemente, la BMP osteogénica es BMP-6.

Una BMP osteogénica está presente en un ABGS descrito en el presente documento en una cantidad que varía de 0,002 mg a 1 mg de proteína BMP osteogénica (preferentemente BMP-6) por mililitro (ml) de sangre autóloga.

La presente divulgación proporciona un ABGS descrito en el presente documento que comprende una matriz resistente a la compresión (CRM) seleccionada entre el grupo que consiste en: aloinjerto óseo y material compuesto de carbonato-fosfato cálcico.

En donde, la composición de carbonato-fosfato cálcico se selecciona entre el grupo que consiste en: hidroxiapatita (HA), fosfato tricálcico (TCP) y combinaciones de los mismos.

En otra realización, la invención proporciona un kit para preparar un implante de ABGS para inducir la formación de hueso nuevo, que comprende:

un juego de agujas de mariposa para la extracción de sangre autóloga;

un soporte de recipiente de liofilización que comprende una aguja protegida con un manguito de goma;

un tubo estéril que conecta la aguja de mariposa y el soporte de recipiente de liofilización;

una pinza de tubo para liberar el vacío o para detener el flujo de sangre;

un recipiente de liofilización con un tapón de goma que contiene proteína BMP morfogénica ósea osteogénica liofilizada mezclada con CRM;

en donde el CRM se selecciona entre el grupo que consiste en aloinjerto óseo, hidroxiapatita, fostato tricálcico y combinaciones de los mismos, una proteína morfogenética ósea osteogénica se selecciona entre BMP-6, BMP-2, BMP-7, BMP-4, BMP-5, BMP-8, BMP-9, BMP-12, BMP-13, heterodímeros de las mismas y combinaciones de las mismas. Preferentemente, la proteína morfogénica ósea osteogénica es BMP-6.

En otra realización, la invención proporciona un método para preparar un implante de ABGS para inducir la formación de hueso nuevo, comprendiendo el método de preparación las etapas:

(1 ) combinar:

a. sangre autóloga;

b. una proteína morfogenética ósea osteogénica seleccionada entre BMP-6, BMP-2, BMP-7, BMP-4, BMP-5, BMP-8, BMP-9, BMP-12, BMP-13, heterodímeros de las mismas y combinaciones de las mismas, en un intervalo de 0,002 a 1 mg por ml de sangre autóloga.

c. una matriz resistente a la compresión (CRM) seleccionada entre el grupo que consiste en aloinjerto óseo, hidroxiapatita, fostato tricálcico y combinaciones de los mismos;

(2) mezclar la proteína morfogénica ósea osteogénica en solución acuosa con la CRM en un vial de liofilización en el que se optimiza un volumen de solución acuosa de proteína morfogénica ósea osteogénica añadida a la CRM para una humectación completa de la CRM;

(3) liofilización de la proteína morfogénica ósea osteogénica y la CRM;

(4) añadir sangre autóloga; y

(5) incubar los componentes de la etapa (1) durante un periodo suficiente para formar un coágulo de sangre biomecánicamente estable alrededor de la CRM.

Preferentemente, la proteína morfogenética ósea osteogénica es BMP-6.

Una composición de sustituto de injerto óseo autólogo descrita en el presente documento también puede utilizarse en el tratamiento de cualquiera de una diversidad de defectos óseos en los que se requiere la formación o crecimiento de hueso nuevo. Dichos defectos óseos que pueden ser tratados utilizando un ABGS descrito en el presente documento incluyen una fractura de diáfisis, una fractura de radio distal, una seudoartrosis tibial, una fractura osteoporótica, un defecto de quiste óseo (por ejemplo, donde debe generarse hueso nuevo para llenar un vacío ocupado anteriormente por el quiste), un defecto tumoral óseo (por ejemplo, donde debe generarse hueso nuevo para reemplazar el hueso perdido por el cáncer o que ha sido extirpado mediante cirugía), seudoartrosis y pseudofracturas asociadas con trastornos esqueléticos congénitos (ejemplo hipofosfatasia, neurofibromatosis tipo I, osteogénesis imperfecta), una fractura osteoporótica (por ejemplo, una fractura por compresión vertebral o una fractura de diáfisis atípica), un defecto óseo oral (por ejemplo, diversos defectos de los dientes), un defecto periodontal y un defecto o anomalía maxilofacial (incluyendo los aumentos óseos en la mandíbula, la cara y la cabeza).

Un "sustituto de injerto óseo autólogo" (ABGS, del inglés Autologous Bone Graft Substitute) descrito en el presente documento también puede utilizarse para promover el crecimiento de nuevo hueso en cualquiera de una diversidad de indicaciones ortopédicas y dentales que incluyen fusión espinal, osteotomía tibial alta y aumentos maxilofaciales. En el ABGS, la BMP se combina con un coágulo de sangre autóloga que después se refuerza con una matriz resistente a la compresión para guiar la formación de nuevo tejido óseo. La BMP-6 es una BMP preferida, puesto que no se une con avidez al antagonista de BMP, nogina (Song et al., J Biol Chem.; 285(16):12169-80 (2010), que abunda en los huesos, y también se une a la mayoría de los receptores tipo I y tipo II de BMP-6 (a diferencia de BMP2 y BMP7) para la señalización. Un coágulo de sangre autóloga (ABC, del inglés Autologous Blood Coagulum) es un sustrato preferido para la administración de BMP, ya que varias proteínas plasmáticas se unen estrechamente a BMP6, lo que da como resultado la liberación sostenida y lineal de BMP6 durante siete a diez días. El ABC también proporciona un entorno permisible para la osteogénesis en presencia de una CRM sin provocar inflamación ni respuestas inmunitarias, en marcado contraste con la inflamación observada cuando las ^bM^pse implantan con colágeno derivado de animales como sustrato. Además, la sangre autóloga contiene células osteoprogenitoras (células madre mesenquimales) que pueden responder fácilmente a BMP-6 durante la formación de coágulos para iniciar la formación de hueso nuevo en el sitio del implante.

Una composición de sustituto de injerto óseo autólogo (ABGS) como se ha descrito anteriormente, también puede utilizarse la densidad mineral ósea de la cabeza femoral y el cuerpo vertebral en pacientes con osteopenia grave que padecen osteopenia posmenopáusica o senil o inducida por esteroides. Estos pacientes con osteopenia grave pueden sufrir fracturas de cadera y vertebrales al caer. En estos pacientes, pueden inyectarse pequeños volúmenes de ABGS en el hueso trabecular en múltiples sitios con un volumen pequeño para promover el crecimiento óseo y mejorar la densidad mineral ósea de la cabeza femoral y el cuerpo vertebral.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra una fotomicrografía de un ABGS preparado por el método N.° 2 o N.° 3 y una CRM de sangre humana de un voluntario. Se utilizó un aloinjerto humano del banco de tejidos como CRM; la izquierda es una imagen macroscópica, el centro es de rayos X y la derecha es una microtomografía computerizada;

Las Figuras 2A y 2B muestran observaciones histológicas de los implantes de (coágulo de sangre autóloga que contiene aloinjerto/hueso alogénico del donante) ALLO más implantes de ABC e implantes de ABC ALLO rhBMP6 el día 7 y el día 35;

Las Figuras 2C y 2D muestran análisis de microtomografía computerizada de ABC/ALLO y ABGS (ABC/ALLO/rhBMP6) de los implantes del día 7 y el día 35;

Las Figuras 2E y 2F son gráficos que ilustran el volumen del aloinjerto y el volumen óseo cuantificados utilizando análisis de microtomografía computerizada para ABC más ALLO y ABC ALLO rhBMP6 el día 7 y el día 35 en los implantes subcutáneos de rata;

La Figura 3A muestra fotomicrografías de histología de coágulo de sangre autóloga que contiene aloinjerto (ALLO) implantado en sitios subcutáneos de rata;

La Figura 3B muestra fotomicrografías de histología cuando se formularon partículas de ALLO dentro de ABC implantados en sitios subcutáneos de rata;

La Figura 3C muestra fotomicrografías de histología cuando se formularon e implantaron implantes que contenían partículas de ABC ALLO rhBMP6, ALLO en sitios subcutáneos de rata;

La Figura 3D muestra un gráfico que ilustra el número promedio de FBGC multinucleados contados morfométricamente a partir de tres secciones histológicas representativas de implantes ALLO, ALLO ABC y ALLO ABC rhBMP6;

Las Figuras 3E y 3F muestran fotomicrografías de histología caracterizada por inmunohistoquímica para tinción con fosfatasa ácida;

La Figura 4A es un gráfico que ilustra la cantidad de rhBMP6 liberada de un ABGS sin aloinjerto y con aloinjerto de dos tamaños de partículas diferentes;

Las Figuras 4B y 4C son gráficos que ilustran la liberación acumulativa de rhBMP6 de un ABGS sin aloinjerto y con aloinjerto de dos tamaños de partículas diferentes;

La Figura 5 muestra la formación de hueso nuevo inducida de forma reproducible en el cúbito de un conejo y el defecto de tamaño crítico restaurado evaluado por radiografía de una manera dependiente de la dosis como se representa en las semanas 6, 9, 13, 16, 19 y 23;

Las Figuras 6A y 6C muestran radiografías y, respectivamente, análisis de cúbito de conejo de microtomagrafía computerizada que ilustran una respuesta dependiente de la dosis;

La Figura 6B muestra la puntuación radiográfica de los rayos X de la figura 6A;

La Figura 6D muestra el análisis morfométrico del canal medular y el volumen óseo del defecto;

La Figura 7 muestra secciones de histología de defectos de cúbito de conejo a diferentes dosis de rhBMP6; La Figura 8A muestra una imagen de rayos X de cúbito de conejo tratado con rhBMP7 en colágeno y rhBMP6 en un coágulo de sangre autóloga (ABC) como se representa en las semanas 6 y 2;

La Figura 8B muestra un gráfico que ilustra una puntuación de rayos X de cúbito de conejo tratado con rhBMP7 en colágeno y rhBMP6 en un coágulo de sangre autóloga (ABC) y solo con colágeno como se representa en las semanas 6 y 2;

La Figura 8C muestra un gráfico que ilustra el volumen óseo (BV) de cúbito de conejo tratado con rhBMP7 en colágeno y rhBMP6 en un coágulo de sangre autóloga (ABC) y solo con colágeno como se representa en las semanas 6 y 2;

La Figura 8D muestra un gráfico que ilustra la actividad de BMP6 y BMP7 en dependencia de nogina;

La Figura 9 muestra fotografías de rayos X, microtomografía computerizada y anatomía macroscópica de un ABGS con y sin ALLO a dosis variables de rhBMP6 por ml de ABC en comparación con ABC solo y ABC más grupos ALLO para la fusión espinal en la fusión lumbar posterolateral (PLF) de conejo;

Las Figuras 10A a 10D muestran gráficos que ilustran las mediciones cuantitativas en el volumen óseo, el número trabecular y la interconectividad trabecular, según se determinaron mediante análisis de microtomografía computerizada;

La Figura 11A muestra la histología de un implante de ABGS. Esta muestra la formación de hueso nuevo con una remodelación y osteointegración típicas en la interfaz entre el hueso recién formado y las apófisis transversas nativas;

La Figura 11B muestra la histología de sueros de conejos tratados con implantes ABC/rhBMP6 el día 21 después de la implantación del ABGS en comparación con el día 0;

La Figura 12A muestra imágenes de rayos X de fusión espinal en ovejas tratadas con 62,5 pg/ml de rhBMP6 y 187,5 pg/ml de rhBMP6 con aloinjerto óseo, y aloinjerto óseo e instrumentación.

La Figura 12B muestra el mismo espécimen de oveja tras la exploración mediante microtomografía computerizada;

Las Figuras 12C a 12F muestran análisis cuantitativos de microtomografía computerizada de volumen óseo de fusión espinal (C), número trabecular (D), separación trabecular (E) y densidad de conectividad (F);

La Figura 13A muestra un espécimen de fusión espinal de oveja de anatomía macroscópica con hueso recién formado totalmente integrado con las apófisis transversas de las vértebras lumbares (flechas de color blanco); La Figura 13B muestra áreas cuadrangulares bilaterales de vértebras lumbares (cuadros blancos), apófisis transversas (cuadros negros) y hueso recién formado entre apófisis transversas (cuadros grises) en los que se han medido los parámetros morfométricos de las Figuras 13C a 13E. En el panel derecho de la Figura 13B se muestra una sección transversal más precisa de la integración completa de las apófisis transversas con el hueso recién formado (flechas de color blanco);

Las Figuras 13C a 13E muestran análisis cuantitativos de microtomografía computerizada del volumen óseo (C), el índice del modelo estructural (D) y el grosor óseo (E);

La Figura 14 muestra exploraciones de rayos X y microtomografía computerizada del modelo de fusión espinal intersomática anterior (ALIF) en ovejas después de 11 semanas de cirugía;

La Figura 15 muestra la capacidad de un coágulo de sangre para unirse a BMP6;

La Figura 16 muestra la liberación de BMP de materiales cerámicos cargados con BMP y el efecto de la adición de ABC sobre la liberación, durante intervalos de 3 días, medido mediante ensayo Elisa;

La Figura 17 ilustra una vista en perspectiva esquemática de un kit para preparar un ABGS para inducir la formación de hueso nuevo;

La Figura 18 ilustra una vista lateral esquemática de un kit para preparar un ABGS para inducir la formación de hueso nuevo;

La Figura 19 ilustra un recipiente de liofilización que comprende un contenido liofilizado (BMP CRM);

La Figura 20 ilustra un recipiente de liofilización que comprende un coágulo de sangre mecánicamente estable formado alrededor de la rhBMP-6 liofilizada y la matriz resistente a la compresión;

La Figura 21 muestra fosfato tricálcico (TCP) implantada en un ABC con rhBMP6 en el sitio subcutáneo en rata y analizado los días 1, 3, 7 y 35. El día 35 se ha formado nuevo hueso entre las partículas de TCP (última fila). La Figura 22 muestra una gran ampliación de los implantes de la Figura 21 el día 35, lo que indica que el hueso recién formado ha rodeado partículas de TCP con signos de sustitución de TCP por hueso (sustitución progresiva) (flechas de color blanco); y

La Figura 23 muestra gel de plasma rico en plaquetas (PRP) preparado a partir de 2 ml de sangre de rata e implantado bajo la piel de rata sin BMP6, con 5 o con 20 pg de BMP6. El hueso recién formado en muestras de PRP enriquecidas con BMP6 está marcado con círculos blancos.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona una composición de sustituto de injerto óseo autólogo (ABGS) para su uso en el tratamiento de defectos óseos, induciendo la formación de hueso nuevo y promoviendo el crecimiento de nuevo hueso en un sitio deseado. El ABGS según la invención puede utilizarse ventajosamente en lugar de un autoinjerto en procedimientos para generar o restaurar hueso en un sitio particular en un individuo que necesita tratamiento del mismo. Un ABGS según una realización de la invención se forma combinando (mezclando) un conjunto de componentes que comprende una muestra de sangre autóloga, una proteína morfogenética ósea osteogénica (preferentemente BMP-6) y una matriz resistente a la compresión (CRM). Dichos componentes se incuban durante un periodo suficiente para formar un gel de coágulo. Un ABGS según otra realización de la invención puede formularse precipitando o liofilizando en primer lugar una proteína morfogenética ósea osteogénica (preferentemente BMP-6) sobre una matriz resistente a la compresión en una forma geométrica específica (por ejemplo, partículas, un cilindro o una losa) y después añadiendo sangre autóloga e incubando durante un periodo suficiente para formar un coágulo de sangre biomecánicamente estable alrededor de la combinación liofilizada de proteína morfogenética ósea osteogénica y la CRM.

Un ABGS según una realización adicional de la invención se forma combinando (mezclando) un conjunto de componentes que comprende una muestra de sangre autóloga, una proteína morfogenética ósea osteogénica (preferentemente BMP-6) y un agente de coagulación sanguínea.

Según la invención, un ABGS descrito en el presente documento puede implantarse o inyectarse fácilmente o aplicarse de otro modo en un sitio en el que existe la necesidad o el deseo de un crecimiento de hueso nuevo. El sustituto de injerto óseo autólogo (ABGS) esencialmente imita el "autoinjerto vivo" de una manera:

1 ) emplea sangre autóloga que no provoca una tormenta de citoquinas inflamatorias ni una reacción a un cuerpo extraño, puesto que enmascara la superficie de la matriz resistente a la compresión (ya sea en forma de partículas, cilindros o losas) para enmascarar el reconocimiento de los linfocitos T como material extraño (por ejemplo, materiales cerámicos de alto contenido mineral en el sitio ectópico),

2) proporciona osteoprogenitores circulantes atrapados en el coágulo de sangre que responden inmediatamente a la BMP,

3) no provoca respuestas inmunitarias con generación de anticuerpos a diferencia del colágeno derivado de animales convencional que puede actuar como adyuvante para la reacción inmunitaria a la BMP recombinante, 4) permite que la BMP se una firmemente a proteínas plasmáticas dentro de la malla de fibrina, por lo que la BMP permanece localmente disponible o es liberada lentamente en el sitio del implante durante varios días para activar los receptores de BMP en células madre mesenquimales reclutadas para respuestas osteogénicas.

5) Las partículas de matriz resistente a la compresión en el injerto son biocompatibles y también proporcionan buenas propiedades de manejo. Además, el contenido mineral (hidroxiapatita) experimenta una sustitución progresiva a medida que se reemplaza por hueso recién formado.

6) BMP-6 en la BMP preferida, puesto que no se une con avidez a la nogina (Song et al., J Biol Chem.; 285(16):12169-80 (2010), un antagonista natural de BMP abundante en el hueso, por lo tanto, permite el uso de dosis menores en comparación con BMP-2 o BMP-7, lo que reduce los problemas de seguridad y evita el uso de dosis excesivas de BMP en la clínica.

Un ABGS según otra realización de la invención puede formularse combinando (mezclando) un conjunto de componentes que comprende una muestra de sangre autóloga, una proteína morfogenética ósea osteogénica (BMP), una matriz resistente a la compresión (CRM) y un polímero biorreabsorbible termosensible de fase inversa; e incubando los componentes durante un periodo suficiente para formar un gel de coágulo que tiene la reología para que la composición se pueda inyectar a temperatura ambiente en una fase líquida, y a medida que la temperatura aumenta hasta la temperatura corporal (adecuadamente 37 °C) forma un gel biocompatible en el sitio de entrega/implante.

Para que la invención pueda entenderse con mayor claridad, se definen los siguientes términos. Las expresiones "proteína morfogenética ósea", "BMP", "BMP osteogénica" y "morfógeno" son sinónimas y se refieren a cualquier miembro de una subclase particular (es decir, la familia de BMP) de la superfamilia de factor de crecimiento transformante-p (TGF-p) de proteínas (véase, por ejemplo, Massague J (1998) TGF-p signal transduction. Annu Rev Biochem 67: 753-791; Sampath TK, Rueger DC (1994) Structure, function and orthopedic application of osteogenic protein-1 (OP-1). Complications in Orthopedics 9:101-107 (1994); Patentes de Estados Unidos N.° 4.968.590; 5.011.691; 5.674.844; 6.333.312). Todas estas BMP tienen un péptido señal, un prodominio y un dominio carboxiterminal (maduro). El dominio carboxiterminal es la forma madura del monómero de BMP y contiene una región altamente conservada caracterizada por siete cisteínas, llamada "dominio de 7 cisternas", y sello distintivo de las proteínas de la familia BMP que forman un nudo de cisteína (véase, Griffith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 93: 878-883 (1996).

Las BMP se aislaron originalmente a partir de huesos de mamíferos utilizando métodos de purificación de proteínas (véase, por ejemplo, Sampath, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 84: 7109-7113 (1987); Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85: 9484-9488 (1988); Sampath, et al., J. Biol. Chem. 265: 13198-13205 (1990); Patente de Estados Unidos N.° 5.496.552). Sin embargo, las BMP también se ha detectado en o aislado de otros tejidos y órganos de mamíferos, incluyendo los riñones, el hígado, los pulmones, el cerebro, los músculos, los dientes y el intestino. Las BMP también pueden producirse utilizando tecnología de ADN recombinante in vitro estándar para la expresión en cultivos de células procarióticas o eucarióticas (véase, por ejemplo, Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 87:2220-2224 (1990); Wozney et al., Science, 242: 1528-1534 (1988)). Algunas BMP también están disponibles en el mercado para uso local (por ejemplo, BMP-7 es fabricado y distribuido para el tratamiento de fracturas sin unión de huesos largos por Stryker, Kalamazoo, Michigan, EE.UU.). BMP-2 es fabricado y distribuido para fracturas agudas de huesos largos por Wyeth (Madison, Nueva Jersey, EE.UU.) y también para fusiones espinales en el injerto óseo InFUSE® que emplean un portador de esponja de colágeno bovino tipo I procesado en combinación con una jaula roscada implantable lordóticamente (LT/CAGE® Lumbar Tapered Fusion Device de Medtronic Sofamor Danek USA, Inc.; Memphis, Tennessee, EE.UU.).

Las BMP existen normalmente como dímeros de los mismos polipéptidos monoméricos (homodímeros) que se mantienen unidos por interacciones hidrófobas y al menos un enlace disulfuro ente cadenas (entre monómeros). Las BMP útiles en las composiciones y métodos descritos en el presente documento son aquellas que tienen actividad osteogénica, es decir, la capacidad para estimular formación ósea. La actividad osteogénica (u "osteoinductiva") puede detectarse utilizando cualquiera de una diversidad de ensayos estándar. Dichos ensayos osteogénicos incluyen ensayos de formación ósea ectópica en los que se implanta una matriz portadora que comprende colágeno y una BMP en un sitio ectópico en un roedor y después se supervisa la formación ósea (Sampath TK y Reddi AH Proc. Natl. Acad. Sci. EE.^uU., 78: 75997603 (1981). En una variación de dicho ensayo, la matriz puede implantarse en un sitio ectópico y la BMP administrarse en el sitio, por ejemplo, mediante inyección intravenosa en el roedor. Otra forma de someter a ensayo la actividad osteogénica de la BMP es incubar células progenitoras mesenquimales cultivadas con una BMP y después supervisar la diferenciación de las células en condrocitos y/u osteoblastos (véase, por ejemplo, Asahina et al., Exp. Cell. Res., 222: 38-47 (1996)). Las BMP que tienen actividad osteogénica y que, por lo tanto, son útiles en las composiciones y métodos descritos en el presente documento incluyen BMP-2, B^mP-4, BMP-6, BMP-7, BMP-9, BMP-12, BMP-13 y heterodímeros de las mismas, tanto purificadas a partir de una fuente natural si la hubiera, producidas de forma recombinante por medio de células eucariotas (por ejemplo, de mamíferos, levaduras, insectos, peces) o procariotas (por ejemplo, bacterias), o producidas en todo o en parte por medio de métodos de síntesis de proteínas in vitro. Una BMP que tiene actividad osteogénica también puede poseer una o más actividades farmacológicas beneficiosas, tales como la capacidad para restaurar o regenerar órganos o tejidos blandos dañados, por ejemplo, riñones isquémicos (Vukicevic et al., J. Clin. Invest., 102: 202-214 (1998).

La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a un material que no es biológicamente, químicamente o de ningún otro modo incompatible con la química corporal y la actividad meta eficaz de una ^bM^p osteogénica o cualquier otro componente en una composición que pueda administrarse a un individuo para promover el crecimiento óseo según la invención. Uno o más etapas o elementos nombrados también describen la composición y método correspondiente, de forma más limitada, como "que consiste esencialmente en" (o "que consta esencialmente de") las mismas etapas o elementos nombrados, lo que significa que la composición o método incluyen los elementos o etapas esenciales nombrados y también pueden incluir elementos o etapas adicionales que no afectan materialmente a la característica o características básicas y novedosas de la composición o el método. También se entiende que cualquier composición o método descrito en el presente documento como "que comprende" o "que consiste esencialmente en" una o más etapas o elementos nombrados también describe la composición o el método correspondiente, de forma más limitada y cerrada que "que consiste en" (o "que consta de") las etapas o elementos nombrados con la exclusión de cualquier otro etapa o elemento no nombrado. En cualquier composición o método descrito en el presente documento, los equivalentes conocidos o divulgados de cualquier elemento o etapa esencial mencionado pueden sustituirse por ese elemento o etapa. A menos que se indique lo contrario, el significado de otros términos es el mismo que entienden y utilizan los expertos en la técnica, incluyendo los campos de cirugías ortopédicas, medicina, inmunología, bioquímica, biología molecular y regeneración de tejidos.

La BMP presente en un sustituto de injerto óseo descrita en el presente documento promueve el crecimiento de nuevo hueso a partir de células progenitoras que están presentes o migran al sitio del defecto donde se implanta el sustituto de injerto óseo. Cualquier proteína morfogenética ósea osteogénica (BMP) puede utilizarse en las composiciones y métodos descritos en el presente documento, sin embargo, esto no es parte de la invención según se reivindica, incluidos los heterodímeros de dos BMP y combinaciones (mezclas) de dos o más BMP. Las BMP osteogénicas preferidas útiles en un sustituto de injerto óseo descrito en el presente documento incluyen, sin limitación, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP- 6, BMP-7, BMP-9, BMP-12, BMP-13, heterodímeros de las mismas y combinaciones de las mismas. Incluso más preferida para su uso en un sustituto de injerto óseo descrito en el presente documento es una BMP osteogénica seleccionada entre BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, heterodímeros de las mismas y combinaciones de las mismas. Lo más preferentemente, la BMP utilizada en un sustituto de injerto óseo descrito en el presente documento es BMP-6.

Una matriz resistente a la compresión (CRM) presente en un sustituto de injerto óseo descrito en el presente documento proporciona un armazón biocompatible que soporta estructuralmente y también es reemplazado progresivamente por el crecimiento de nuevo hueso estimulado por el componente osteogénico de la BMP del sustituto de injerto óseo autólogo implantado. La CRM útil en un sustituto de injerto óseo autólogo descrito en el presente documento incluye cualquiera de las matrices resistentes a la compresión que se emplean actualmente en los dispositivos que han sido aprobados para su uso en la fusión espinal. Una característica de las CRM de los dispositivos aprobados actualmente de fusión espinal es que son capaces de soportar las fuerzas locales que se aplican a un sustituto de injerto óseo implantado por la musculatura espinal local y las vértebras. La CRM útil en el sustituto de injerto óseo autólogo descrito en el presente documento incluye un aloinjerto (injerto óseo preparado a partir del hueso de individuos distintos al individuo que necesita tratamiento)), un polímero o copolímero biorreabsorbible (por ejemplo, polilacturo, poliglucoluro, etc. No parte de la invención según se reivindica), material compuesto sintético de carbonato-fosfato cálcico, tal como hidroxiapatita (HA), fostato tricálcico (TCP) y combinaciones de los mismos. La CRM útil en un sustituto de injerto óseo descrito en el presente documento también puede comprender un aloinjerto y uno o más materiales compuestos de carbonato-fosfato cálcico y/o un polímero o copolímero biorreabsorbible o combinaciones de los mismos. Los gránulos de CRM para su uso en un sustituto de injerto óseo según la invención pueden tener un tamaño de gránulo de 74 pm a 8 mm, obtenido utilizando un tamiz para dichos tamaños de gránulo.

El tamaño de los gránulos de CRM para su uso en el sustituto de injerto óseo autólogo descrito en el presente documento está en un intervalo de 74 pm a 8 mm. Una geometría o forma preferida de las CRM incluye cilindros, losas, láminas o mallas de dimensiones específicas dependiendo del defecto óseo. La geometría o forma de la CRM puede tener cualquier forma de una cualquiera seleccionada entre cilindro, losa, lámina, malla o cualquier otra forma dependiendo del defecto óseo.

La forma geométrica de la matriz resistente a la compresión viene dictada por la indicación médica. Un tamaño de poro y de partícula de la CRM en la composición con ABC con BMP6 debe ser preferentemente compatible con el tamaño del defecto óseo. Por ejemplo, en las aplicaciones dentales para rellenar el defecto óseo tras la extracción de un diente, el tamaño de partícula de CRM debería estar en el intervalo de 72 a 420 pm en una cantidad que cubra aproximadamente el 30 por ciento de todo el volumen del ABGS. Para el aumento de la cresta alveolar en medicina dental que permita la inserción de más material cerámico de implantes dentales, el tamaño de partícula de CRM puede estar preferentemente en el intervalo de 0,5 a 4 mm. Para defectos óseos de huesos largos, como las seudoartrosis de la tibia, el defecto de 1 a 3 cm de longitud puede ser rellenado con la CRM que tiene un tamaño de partícula de 3 a 8 mm. Para defectos óseos largos, mayores a 3 cm hasta 10 cm de longitud, puede utilizarse la CRM en forma de cilindros o losas en combinación con el ABC y la BMP6. El tamaño de poro de las partículas de CRM debe ser lo suficientemente largo para permitir el crecimiento interno de vasos sanguíneos, lo que facilitará aún más la formación de hueso nuevo en un sitio ortotópico (entre los extremos de los huesos) o ectópico (lejos del esqueleto).

Además, para defectos óseos de huesos largos, como las seudoartrosis de la tibia, el defecto de 1 a 3 cm de longitud puede ser rellenado con la CRM que consiste en carbonato-fosfato cálcico sintético (material cerámico) o un aloinjerto que tiene un tamaño de partícula de 3 a 8 mm. Para defectos óseos largos, mayores de 3 cm hasta 10 cm de longitud, pueden utilizarse materiales cerámicos en forma de cilindros o losas, en combinación con el ABC y la BMP6. Preferentemente, los cilindros o losas estarán hechos de un 20 % de hidroxiapatita (HA) y un 80 % de fosfato tricálcico (TCP), liofilizados con una BMP, preferentemente BMP6, en un recipiente de liofilización estéril conectado a la unidad de recolección de sangre que permitirá que una cantidad adecuada de sangre cubra el cilindro o losa que se insertará a continuación entre defectos óseos grandes o entre las apófisis transversas de las vértebras de la columna, preferentemente de la columna lumbar para inducir la formación ósea ectópica y apoyar la fusión de dos vértebras lumbares adyacentes. Puede utilizarse un principio similar para fusionar las vértebras torácicas. El tamaño de poro de las partículas cerámicas debe ser lo suficientemente largo para permitir el crecimiento interno de vasos sanguíneos, lo que facilitará aún más la formación de hueso nuevo en un sitio ortotópico (entre los extremos de los huesos) o ectópico (lejos del esqueleto). Los cilindros cerámicos deben tener una estructura de núcleo central para la unión única de partículas individuales de material cerámico a lo largo de dicho elemento de núcleo para proporcionar una estructura más estable biomecánicamente para defectos óseos segmentarios y fusión espinal de dos o más vértebras en pacientes con dolor lumbar de espalda debido a una enfermedad degenerativa del disco.

Los polímeros termosensibles son poloxámeros que pueden ser copolímeros no iónicos de tres bloques compuestos de una cadena central hidrófoba de polioxipropileno (poli (óxido de propileno)) flanqueada por dos cadenas hidrófilas de polioxietileno (poli (óxido de etileno)). Véase, en general, la Patente US 3.740.421. Los poloxámeros incluyen los productos Synperonics (Croda Inc., Edison, NJ), particularmente el poloxámero 407; Pluronic (BASF Corporation, Florham Park, NJ); y Kolliphor (BASF Corporation, Tarrytown, NY), un aceite de ricino polietoxilado y gel de oclusión endovascular LeGoo®, que está compuesto de un 20 % (porcentaje en peso en solución salina) de poloxámero 407 purificado. El copolímero de Poloxamer 407/Pluronic F-127 (bloques de óxido de etileno y óxido de propileno) se adquirió de BASF (Mount Olive, NJ) y se utilizó en el presente estudio. El polímero se disolvió en solución salina tamponada con fosfato (PBS, del inglés Phosphate Buffered Saline) para una concentración final de polímero de 20 40 % en peso/volumen. A esta concentración el polímero muestra propiedades termorreversibles, estado fluido a temperatura ambiente y estado de gel a temperatura corporal. Por ejemplo, se prepararon geles al 20 % añadiendo 20 g de Pluronic F-127 a 100 ml de PBS fría y se dejaron en agitación durante la noche a 4 °C para una disolución adecuada. A continuación, la solución se filtró con un filtro de 0,22 pm para esterilización. Los poloxámeros son una familia de polímeros biocompatibles solubles en agua que poseen propiedades termosensibles inversas (es decir, según aumente la temperatura, aumenta la viscosidad). En particular, el poloxámero utilizado es no tóxico, biocompatible, soluble en agua y su viscosidad disminuye con el aumento de la temperatura en un intervalo de uso. A temperatura ambiente, la composición es inyectable, pero viscosa. Al calentarse a la temperatura corporal, experimenta un cambio de fase inducido por la temperatura sin ninguna alteración efectiva en la composición química (sin curado) para formar un tapón o losa polimérica. A temperatura ambiente o por debajo, la viscosidad de la composición es adecuada para su inyección mediante una jeringa, por ejemplo, el ABGS muestra la jeringa administrada desde una jeringa de 5-15 cc con un tamaño de aguja de 20 G-1,5". El ABGS puede ser una masilla maleable. La composición tiene entre el 50 y el 80 % en peso de líquido. El tamaño de partícula promedio de la CRM está en un intervalo entre 70 y 425 pm, o 1-5 mm según lo determine el tamiz de partículas. Los componentes de la composición se disuelven/suspenden en sangre autóloga. El ABGS puede incluir un agente de contraste radiológico.

La composición de sustituto de injerto óseo autólogo (coágulo de sangre autóloga/BMP-6/CRM o BMP6/CRM/coágulo de sangre autóloga o BMP6/CRM/plasma autólogo o alogénico rico en plaquetas o sangre autóloga/BMP-6/CRM/polímero termosensible de fase inversa) con o sin aspirado de médula ósea autóloga, con o sin MSC expandidos desde médula ósea autóloga, o tejido adiposo autólogo o periostio autólogo, o cordón umbilical alogénico descrito en el presente documento proporciona un microambiente permisivo para inducir una formación robusta de hueso nuevo al superar una respuesta indeseable que puede suceder al utilizar un aloinjerto óseo o materiales cerámicos sintéticos de armazón de colágeno derivado de animal o materiales compuestos de colágeno-CRM ricos en minerales (fosfato cálcico o carbonato cálcico o sulfato cálcico) que han sido aprobados para su uso con BMP en humanos. En particular, la implantación del ABGS descrito en el presente documento no desencadena una respuesta inflamatoria e inmunológica rápida y robusta ("tormenta inflamatoria") ni reacciones ante un cuerpo extraño (formación de células gigantes multinucleadas) que pueden suceder en el sitio (específicamente en sitios ectópicos) de implantación de los sustitutos de injerto óseo aprobados actualmente. La "tormenta inflamatoria" comprende abundantes células productoras de citoquinas, infiltrantes e inflamatorias (por ejemplo, monocitos, leucocitos polimorfonucleares, macrófagos, miofibroblastos, fibrocitos), respuestas inmunológicas o reacción a cuerpos extraños (formación de células gigantes multinucleadas). Para superar una tormenta inflamatoria provocada por los materiales compuestos de CRM/CRM-colágeno y una respuesta inmunitaria y fibrogénica provocada por el colágeno derivado de animal, se emplean altas concentraciones de BMP en el dispositivo actual que plantea problemas de seguridad indeseados como la formación ósea ectópica lejos del sitio del implante. Durante la "tormenta inflamatoria", la población de dichas células inflamatorias/inmunológicas (no progenitoras) es significativamente mayor que la población de células madre mesenquimales (células osteoprogenitoras) que responden para formar hueso nuevo cuando entran en contacto con una BMP osteogénica. El desencadenante principal para la "tormenta inflamatoria" de células no progenitoras parece deberse a la presencia del componente de CRM que se utiliza actualmente como armazón en los sustitutos de injerto óseo de BMP.

De acuerdo con este punto de vista, en los sitios ectópicos, las células gigantes multinucleadas de cuerpo extraño son reclutadas por una CRM de los sustitutos de injerto óseo aprobados actualmente en números que son lo suficientemente grandes para interferir o inhibir de otro modo la capacidad de las células osteoprogenitoras, que están ausentes o están presentes números significativamente menores, para responder a la BMP osteogénica y producir suficiente crecimiento de nuevo hueso requerido para tratar el defecto óseo. Por el contrario, el sustituto de injerto óseo autólogo (ABGS) descrito en el presente documento que contiene el componente de CRM similar o comparable que se encuentra en los sustitutos de injerto óseo aprobados actualmente, no provoca una tormenta inflamatoria de células cuando se implanta o se aplica de otro modo en un sitio que necesita el crecimiento de nuevo hueso. En cambio, la CRM en el ABGS descrito en el presente documento proporciona una estructura inicial similar a un mineral (dentro del gel de coágulo) que es absorbida y reemplazada en una progresión ordenada por el crecimiento de nuevo hueso en la cantidad y tipo requeridos para conseguir el tratamiento deseado, tal como la reparación de un defecto óseo o la fusión de segmentos óseos adyacentes. El descubrimiento de una biología inesperada indica que el componente de sangre autóloga del ABGS descrito en el presente documento es responsable de suprimir o interrumpir el desencadenamiento de una "tormenta inflamatoria" por el componente de la CRM y la supresión de una reacción a un cuerpo extraño al inhibir la formación de células gigantes multinucleadas que de lo contrario sucedería en ausencia del coágulo.

La generación de una "tormenta inflamatoria" robusta probablemente sea la razón por la que los sustitutos de injerto óseo de coágulo de sangre no autóloga aprobados actualmente, tales como los aprobados para la fusión espinal, emplean cantidades relativamente grandes de BMP osteogénica (por ejemplo, más de 12-40 mg por nivel para indicación de la columna vertebral) a fin de promover el crecimiento de nuevo hueso. El hecho de que el uso de tales cantidades relativamente grandes de BMP pueda dar como resultado la formación ósea en sitios distales del sitio local del implante genera preocupación en las agencias reguladoras por los potenciales efectos secundarios adversos. Por el contrario, el ABGS descrito en el presente documento comprende un gel de coágulo de sangre autóloga y emplea ventajosamente cantidades significativamente menores de BMP para promover el crecimiento de nuevo hueso que los niveles encontrados en los dispositivos de sustituto de injerto óseo aprobados actualmente. Típicamente, la cantidad de BMP presente en la composición de sustituto de injerto óseo autólogo descrita en el presente documento será de cinco a veinte veces menor que la cantidad de BMP utilizada en dispositivos de sustituto de injerto óseo aprobados actualmente. A modo de ejemplos no limitantes, el ABGS de la presente invención puede comprender de 0,002 mg a 1 mg de BMP por ml de sangre autóloga. Preferentemente, la BMP es BMP-6, que no se une a nogina, un antagonista de BMP de origen natural abundante en el uso y que se expanda a través de la mayoría de receptores de BMP de tipo I y II.

Opcionalmente, el ABGS descrito en el presente documento puede comprender además una matriz ósea alogénica desmineralizada (o "matriz ósea desmineralizada"), que es una composición de gel derivada de hueso alogénico y que contiene factores residuales que pueden aumentar el crecimiento de nuevo hueso. Debido a su estado de gel, el ABGS descrito en el presente documento puede administrarse en un sitio que necesite crecimiento de nuevo hueso mediante implantación (colocando el sustituto de injerto óseo dentro o en un sitio) o mediante inyección (por ejemplo, utilizando una jeringa). A menos que se indique lo contrario, los términos "implantado" e "implantación" también se entiende que abarcan la aplicación de un sustituto de injerto óseo descrito en el presente documento a un sitio del defecto mediante inyección.

Opcionalmente, el ABGS puede aumentarse con células madre mesenquimales (osteoprogenitores) obtenidas o expandidas a partir de médula ósea o tejido adiposo autólogo o alogénico. En algunos incidentes, el ABGS puede estar enriquecido con fragmentos de tejido de hueso, músculo y fascia locales. Este nivel de ABGS aumentado de células/tejidos es ventajoso cuando las células que responden a BMP se minimizan en el sitio dado (por ejemplo, tibia distal) y en trastornos genéticos raros (hipofosfatasia, neurofibromatosis tipo I y osteogénesis imperfecta). Además, el ABGS que comprende polímero biorreabsorbible termosensible de fase inversa, proporcionará biocompatibilidad y propiedad de manejo como inyectable a temperatura ambiente y logrará una estructura similar a un gel sólido a la temperatura corporal. La presencia de sangre autóloga proporciona protección frente a la tormenta inflamatoria provocada por la CRM añadida al ABGS, así como biocompatibilidad y proporciona un equivalente de tejido de "autoinjerto".

En algunos casos, el ABGS puede prepararse con un plasma rico en plaquetas (PRP) alogénico o autólogo que sustituye a la sangre autóloga (AB). Debido a sus diversas propiedades, la composición de sustituto de injerto óseo autólogo descrita en el presente documento puede utilizarse ventajosamente en lugar de un "autoinjerto" en uno o más de una diversidad de tratamientos que emplean autoinjerto extraído de un individuo que necesita tratamiento. La utilización de la composición de ABGS en el tratamiento de defectos óseos incluye la fusión espinal, reparación de fracturas óseas esqueléticas, osteotomía tibial alta, reparaciones dentales, reparaciones periodontales, seudoartrosis, pseudofracturas asociadas con trastornos esqueléticos raros y aumentos maxilofaciales. En particular, el ABGS se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de cualquiera de una diversidad de defectos óseos. Tales defectos óseos pueden incluir fracturas diafisarias, fracturas distales del radio, fracturas de seudoartrosis tibial, fracturas osteoporóticas (tales como fractura por compresión vertebral y fractura diafisaria atípica), quistes óseos (donde debe generarse hueso para llevar un vacío), tumores óseos (donde el hueso nuevo debe reemplazar hueso que se ha perdido por un cáncer o que ha sido extirpado por cirugía), defectos orales, defectos periodontales y diversas anomalías maxilofaciales. El uso del sustituto de injerto óseo autólogo descrito en el presente documento extiende ventajosamente el uso de tales procedimientos más allá de la limitación de la cantidad de autoinjerto que puede extraerse con seguridad de un individuo que necesita tratamiento con el mismo. Solo se utilizan componentes farmacéuticamente aceptables en la preparación de una composición implantable de la invención.

El término "aloinjerto" es un término de la técnica y se refiere a hueso de un cadáver que ha sido preparado asépticamente para su implantación en un paciente. El aloinjerto puede obtenerse comercialmente de bancos de tejido óseo.

Los términos "trastorno" y "enfermedad" son sinónimos y se refieren a cualquier afección patológica, independientemente de la causa o el agente etiológico. Un "defecto" en un hueso u otro tejido se refiere a un sitio de crecimiento de tejido anormal o deficiente. Una "enfermedad" o "trastorno" puede caracterizarse por uno o más "defectos" en uno o más tejidos. Como se usa en el presente documento, los términos "tratamiento" y "tratar" se refieren a cualquier régimen que alivia uno o más síntomas o manifestaciones de una enfermedad o trastorno, que inhibe, detiene o revierte (provoca el retroceso) de una enfermedad o trastorno, o que previene aparición de una enfermedad o trastorno. El término "tratamiento" incluye la profilaxis (prevención) de uno o más síntomas o manifestaciones de una enfermedad, incluyendo la mejora o la inhibición de la extensión de un síntoma o manifestación, incluyendo el dolor, que de otro modo caracterizaría la enfermedad en ausencia del tratamiento.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" es una cantidad de un compuesto (por ejemplo, proteína osteogénica BMP) que promueve el crecimiento óseo en un lugar deseado y en una cantidad deseada para lograr un punto final deseado, como una fusión espinal estabilizada de vértebras adyacentes, el relleno de un defecto óseo con hueso nuevo, el puente de los extremos distales de un defecto óseo o la corrección o reconstrucción de una lesión o anomalía oral o maxilofacial. Dicho punto final puede determinarse siguiendo el crecimiento de nuevo hueso por medio de metodologías estándar, tales como rayos X o inspección visual por parte de un cirujano u otro sanitario capacitado.

Una composición o método descrito en el presente documento como "que comprende" una o más etapas o elementos nombrados tiene sentido abierto, lo que significa que las etapas o elementos nombrados son esenciales, pero que pueden añadirse otros elementos o etapas dentro del alcance de la composición o método. Para evitar la prolijidad, también se entiende que cualquier composición o método descrito en el presente documento como "que comprende" (o "que consta de").

Descripción de estudio de liberación de materiales cerámicos

El coágulo formado en presencia de rhBMP6 sin ningún material compuesto de carbonato-fostato cálcico, en lo sucesivo material cerámico, se utilizó para comparación. Se descubrió que el ABGS que contenía rhBMP6/ABC liberó inicialmente cantidades mayores que disminuyeron de forma constante a niveles muy bajos después de 10 días.

Por el contrario, con el ABGS que contenía rhBMP6/ABC/materiales cerámicos, todavía se observaba una liberación sustancial después de 10 días. Por lo tanto, el material cerámico tiene una acción más duradera.

Los tamaños de partícula de fosfato tricálcico (TCP) - hidroxiapatita (HA) TCP-HA tienen algún efecto, pero todos los tamaños se unen a BMP.

Con los materiales cerámicos precargados con BMP sin la adición de ABC se observó que no hubo una liberación lineal temprana hasta después de al menos 6 días. La liberación aumentará en 10 días y probablemente más allá. Sin embargo, cuando el material cerámico precargado se mezcló con el ABC, hubo un poco de liberación, seguido de un intervalo de menos liberación. El resultado fue la combinación de curvas de liberación de solo el material cerámico precargado y del ABC sin materiales cerámicos. La liberación inicial se debió presumiblemente a la adición del ABC que contenía algo de proteasa de plasmina de la reacción de coagulación. Esto habría modificado algunas de las BMP de tal manera que eliminaran la capacidad de unión al material cerámico.

La modificación probable de BMP6 para permitir la liberación es la eliminación del bucle N-terminal rico en arginina que contiene también un sitio de unión a heparina. Esta liberación inicial no se observó sin la adición del ABC. Por lo tanto, la liberación debida a la adición de ABC se debería a proteínas y proteasas presentes en el coágulo que interactúan con la BMP provocando la liberación. Sin embargo, no todas las BMP se convertirían inmediatamente de esta manera, lo que explica la BMP que permaneció con el material cerámico. Finalmente, esta también se liberará una vez que la proteasa residual haya tenido más tiempo para actuar.

Esto se reivindica como una mejora: liberación más retrasada y más duradera.

También, la unión a la CRM es muy estrecha (se libera por medio de 100 mM de fosfato, pero no se producirá únicamente con medio/solución salina). Se concluye que el material cerámico se une fuertemente a BMP a través de las interacciones iónicas, de modo que casi no se libera durante los primeros días. Esto favorece la estrecha localización de la formación de hueso nuevo.

Y esta estrecha unión impide la liberación exuberante y la propagación de la formación ósea.

La Figura 16 ilustra los resultados de liberación de BMP6 obtenidos de materiales cerámicos con partículas de diferentes tamaños. El material cerámico se fabrica por medio de CaP, Biomaterials LLC. Se colocaron materiales cerámicos de diferentes tamaños en tubos Eppendorf, 140 mg en cada tubo. Después, se añadieron 200 pl de una solución que contenía 50 pg de sustancia farmacológica BMP6 en tampón de glicina 20 mM de pH 6 al material cerámico seco, donde se absorbió inmediatamente. Se dejó interactuar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Este volumen de 200 pl de líquido fue absorbido rápidamente por las partículas de material cerámico de calidad más fina, mientras que el grano más grande tuvo una capacidad notablemente inferior para adsorber el líquido.

Los tubos con material cerámico humedecido se pusieron en un congelador a -80 grados centígrados durante 30 minutes y después se transfirieron a un liofilizador GEA SL-2 con la temperatura de almacenamiento a -18 °C y después se criodesecaron durante 24 horas. En ese momento, los materiales estaban completamente secos y el vacío permaneció estable a una presión restante de 20 microbares.

Este material cerámico seco, precargado con BMP6, se evaluó después en un estudio de liberación de BMP durante 10 días utilizando un ensayo Elisa para BMP6 de RnD Systems. En paralelo, los tubos con matriz liofilizada precargada recibieron sangre, que se dejó coagular después de mezclarla suavemente con las partículas de material cerámico. El suero se extrajo del coágulo y estas muestras también se evaluaron para determinar la liberación de BMP durante 10 días.

También, para comparar la cinética de liberación, se dispuso una muestra de "ABC+BMP6" es decir, 50 pg de BMP y 200 pl de sangre para formar un coágulo, del que también se extrajo el suero.

Para medir la liberación de BMP6, las muestras de coágulo descritas y las muestras de matriz de BMP6 sin el ABC, respectivamente, se enjuagaron en primer lugar con 1 ml de medio de cultivo tisular, después de lo cual se añadió 1 ml de medio recién preparado durante 1 día. Este 1 ml se recogió para el ensayo Elisa y fue reemplazado por el medio recién preparado después de 3 días. Se recogió de nuevo y se reemplazó el día 6 y se recogió de nuevo el día 10 para el ensayo Elisa.

Los resultados de los estudios se muestran en la figura 16, paneles A a G, que ilustran una liberación de rhBMP6 desde ABGS, in vitro, durante los primeros 10 días, medido mediante ensayo Elisa. El panel A muestra la liberación desde el coágulo de ABC+BMP6, los paneles B, D y E muestran la liberación desde materiales cerámicos de diferentes rangos de tamaño de grano, es decir de 1 a 4 mm (B), de 0,5 a 2,5 mm (D), de 0,5 a 1,5 mm (E). Los paneles C, F y G muestran la liberación correspondiente de los materiales cerámicos con coágulo, comparando nuevamente el grano grueso, medio y fino.

Se compara la liberación de BMP6 durante 10 días de siete portadores de BMP diferentes, 140 mg cada uno, que contienen 50 ng de rhBMP6. El eje Y muestra los microgramos de BMP6 liberados en 1 ml de medio de cultivo celular sin suero utilizado para empapar los portadores, reemplazándose el medio cada pocos días (eje X) y ensayándose mediante Elisa.

Panel A: 0,14 ml de ABC BMP6, sin material cerámico. Los paneles B, D, F muestran material cerámico con BMP6 pero sin el ABC. Los paneles C, E y G muestran material cerámico con BMP6 y adición del ABC. Panel B: material cerámico de tamaño de partículas grande (1000-4000 pm); Panel C: igual que el B, pero con el ABC añadido; Panel D: material cerámico de tamaño de partículas medio (500-2500 pm); E: igual que el D, pero con el ABC añadido; F: material cerámico de tamaño de partículas pequeño (500-1500 pm) y G: igual que el F, pero con el ABC añadido. El primer punto de datos (W) en cada panel representa BMP6 obtenido de un lavado inicial (1 ml) de los portadores. Las conclusiones fueron que el material cerámico precargado con BMP6 sin el ABC mostró una liberación retardada de BMP, mientras que el material cerámico más el ABC muestran una liberación bifásica, inicialmente similar a ABC+BMP6, pero que después dura mucho más que ABC+BMP6. Por lo tanto, la combinación da una liberación más uniforme y prolongada.

Ejemplo 1: Preparación de composición de sustituto de injerto óseo autólogo (ABGS)

El sustituto de injerto óseo autólogo (ABGS) está compuesto de lo siguiente:

1) BMP6 humana recombinante (rhBMP6);

2) Sangre autóloga; y

3) Sal de calcio o estroncio o magnesio (a bajo mM) que está en forma de solución acuosa o nanopartículas o microesferas

o

1) BMP6 humana recombinante (rhBMP6);

2) sangre autóloga;

3) Sal de calcio o estroncio o magnesio (a bajo mM) que está en forma de solución acuosa o nanopartículas o microesferas; y

4) Matriz resistente a la compresión (CRM)

Métodos de preparación

Método N.° 1: Injerto óseo comparativo sin componente de matriz resistente a la compresión (CRM)

El injerto óseo comparativo está compuesto de lo siguiente:

1) BMP6 humana recombinante (rhBMP6)

2) Sangre autóloga

La sangre autóloga se extrae periféricamente del paciente o se recolecta localmente (sangre local). Para estudios preclínicos, la sangre autóloga puede recolectarse de venas marginales de las orejas, como en el caso de los conejos, o de venas yugulares, como en el caso de las ovejas, respectivamente, en tubos sin ninguna sustancia anticoagulante complementada con 5 a 50 mM/ml sangre, sal de calcio o estroncio o magnesio (por ejemplo, cloruro, carbonato, bicarbonato, gluconato) tanto en solución como en o nanopartículas o solución de microesferas en un volumen específico de sangre autóloga. La rhBMP6 liofilizada se disolvió en un pequeño volumen (10-500 pl) de agua para inyección y después se mezcló con sangre autóloga (0,2 a 10 ml). Inmediatamente después mezclar rhBMP6 con sangre autóloga (en un minuto) se dejó de coagular a temperatura ambiente con las estructuras y propiedades reológicas definidas según se determinó mediante la rigidez, elasticidad y la deformación.

Método N.° 2: Injerto óseo comparativo con componente de matriz resistente a la compresión (CRM)

El sustituto de injerto óseo autólogo (ABGS) está compuesto de lo siguiente:

1) BMP6 humana recombinante (rhBMP6)

2) Sangre autóloga

4) Matriz resistente a la compresión (CRM)

La sangre autóloga se extrae periféricamente del paciente o se recolecta localmente (sangre local). Para estudios preclínicos, la sangre autóloga puede recolectarse de venas marginales de las orejas, como en el caso de los conejos, o de venas yugulares, como en el caso de las ovejas, respectivamente, en tubos sin ninguna sustancia anticoagulante complementada con 0,1 ml de solución 50 mM de CaCl2 en un volumen específico dependiendo de la indicación. La rhBMP6 liofilizada se disolvió en un pequeño volumen (10-200 pl) de agua para inyección y después se mezcló con sangre autóloga. Inmediatamente después de mezclar rhBMP6 con sangre autóloga, se añadió la CRM en forma de partículas y después se dejó coagular a temperatura ambiente con la estructura y propiedades reológicas definidas según se determinó mediante la rigidez, elasticidad y deformación (ref.).

Método N.° 3: Sustituto de injerto óseo autólogo con componente de matriz resistente a la compresión (CRM) La CRM (en forma de partículas o cilindro o losa o malla) se empapa o se humedece lo suficiente en rhBMP6 disuelta en un pequeño volumen (10-1000 pl) de agua para inyección y se somete a liofilización al vacío. Al material compuesto de CRM-rhBMP6 liofilizado, se le añadió suficiente sangre autóloga sin ninguna sustancia anticoagulante complementada con 0,1 ml de CaCl250 mM y después se dejó coagular a temperatura ambiente con la estructura y propiedades reológicas definidas, según se determinó mediante rigidez, elasticidad y deformación.

Método N.° 4: Sustituto de injerto óseo autólogo con componente de matriz resistente a la compresión (CRM) Un método para preparar un ABGS para inducir la formación de hueso nuevo, comprendiendo el método de preparación las etapas de:

(1 ) combinar:

a. sangre autóloga;

b. una proteína morfogenética ósea osteogénica humana recombinante BMP-6 (rhBMP-6);

c. una matriz resistente a la compresión 12 (CRM) seleccionada entre el grupo que consiste en aloinjerto óseo, hidroxiapatita, fostato tricálcico y combinaciones de los mismos;

(2) mezclar rhBMP6 en solución acuosa con la matriz resistente a la compresión 12 (CRM) en un recipiente de liofilización 10, en el que un volumen de solución acuosa de rhBMP-6 añadida a la CRM se optimiza para la humectación completa de la CRM;

(3) liofilización de la rhBMP-6 y la matriz resistente a la compresión 12 (CRM);

(4) añadir la sangre autóloga; y

(5) incubar una proteína morfogénica ósea osteogénica liofilizada y la matriz resistente a la compresión 12 (CRM) y sangre autóloga durante un periodo suficiente para formar un coágulo de sangre biomecánicamente estable 13 alrededor de la rhBMP-6 liofilizada y la matriz resistente a la compresión 12 (CRM).

Primero, se mezcla rhBMP6 en solución acuosa con la matriz resistente a la compresión 12 (CRM) en un recipiente de liofilización 10 que puede sellarse al vacío con un tapón de goma 9 y asegurarse pinzando con una tapa de aluminio o una tapa roscada adicional. El volumen de la solución acuosa de rhBMP6 que se añade a la matriz resistente a la compresión 12 (CRM) seleccionada se optimiza para la humectación completa de la CRM. El volumen de la solución acuosa de rhBMP6 para la humectación puede ser suficiente o igual al volumen de la matriz resistente a la compresión 12 (CRM) dependiendo de la geometría de la CRM (porosa frente a no porosa; partículas frente a cilindro). Si el volumen acuoso excede el volumen de humectación, puede dar como resultado un poco de rhBMP6 seca a lo largo del recipiente de liofilización 10. El criodesecado se realiza hasta la sequedad completa. RhBMP6/CRM, tras la liofilización, el recipiente de liofilización 10 se cierra al vacío (los tapones de goma se empujan hasta el fondo) y se almacena preferentemente a -20 °C o 4 °C.

En segundo lugar, la sangre autóloga se recolecta de la vena del paciente, como una flebotomía típica, una aspiradora que contiene la rhBMP6-CRM criodesecada (como se ilustra en la Figura 19). Una línea más larga de un tubo estéril 5 con una abrazadera 3 probablemente puede facilitar el procesamiento de la sangre al recipiente de liofilización 10. El recipiente de liofilización 10 con contenido liofilizado (rhBMP6 CRM) 12 se coloca en un soporte de recipiente de liofilización 2 para garantizar la punción segura del tapón de goma 9 del recipiente de liofilización 10, garantizando la inserción estéril de la aguja 1 a través del septo. La aguja 1 puede estar protegida por otro manguito de goma 4 también para garantizar a aún más la esterilidad. El soporte de recipiente de liofilización 2 está conectado por el tubo estéril 5 a una aguja 7 para flebotomía, e inicialmente se sujeta con una pequeña abrazadera de manguera de plástico. Las Figuras 17 a 20 ilustran un kit para preparar un ABGS de implante para inducir la formación de hueso nuevo. Por ejemplo, el kit para preparar el ABGS de implante para inducir la formación de hueso nuevo comprende: un juego de agujas de mariposa 6, 7, 8 para una extracción de sangre autóloga;

un soporte de recipiente de liofilización 2 que comprende una aguja 1 protegida con un manguito de goma 9; un tubo estéril 5 que conecta el juego de agujas de mariposa 6, 7, 8 y el soporte de recipiente de liofilización 2;

una pinza de tubo 3 para liberar el vacío o para detener el flujo de sangre;

un recipiente de liofilización 10 con un tapón de goma 9 que contiene rhBMP6 liofilizada mezclada con la matriz resistente a la compresión 12 (CRM);

La matriz resistente a la compresión 12 (CRM) se selecciona entre el grupo que consiste en aloinjerto óseo, hidroxiapatita, fostato tricálcico y combinaciones de los mismos.

El recipiente de liofilización 10 puede tener cualquier forma adecuada para recibir la matriz resistente a la compresión 12 (CRM), donde la matriz resistente a la compresión 12 (CRM) puede tener la forma de cualquiera seleccionado entre un cilindro, una losa, una lámina, una malla o cualquier otra forma dependiendo del defecto óseo.

Ejemplo N.° 2 Métodos de evaluación de CRM (implantes subcutáneos en ratas)

Las siguientes CRM se utilizaron en la preparación del ABGS.

Aloinjerto

TCP HA

conjugados de TCP/HA

Sulfato cálcico

Material compuesto de carbonato-fosfato cálcico (material cerámico)

Polímeros biorreabsorbibles

Hidrogeles biorreabsorbibles

La siguiente geometría de una CRM dada se utilizó en la fabricación del ABGS

El tamaño de partícula está en un intervalo de 74 pm a 8 mm.

La CRM puede estar en forma de partículas o puede tener cualquier forma de una cualquiera seleccionada entre cilindro, losa, lámina, malla o cualquier otra forma dependiendo de un defecto óseo

Las CRM con diferentes propiedades físicas se formulan con rhBMP6 utilizando tanto el método N.° 2 como el N.° 3 como se describe en el Ejemplo N.° 1. La respuesta celular y la actividad inductora de hueso de la composición de sustituto de injerto óseo autólogo, ABGS, se evaluó implantando en sitios o inyectando percutáneamente en la fascia abdominal o bolsas de músculo esquelético de roedores. A los 1, 3, 7 y 12-35 días después de la implantación/inyecciones, se recogieron los implantes y se analizó la respuesta celular y la actividad formadora de hueso por histología según se describe (Sampath, TK. y Reddi, AH. PNAS 1981).

El ABGS se preparó a partir de 0,25-0,5 ml de sangre completa de rata que se mezcló con una cantidad adecuada de BMP (ejemplo 2 a 200 pg de BMP-6 recombinante por ml de sangre) y después se añadió la CRM (aloinjerto, hueso alogénico de donante (ALLO) o fosfato tricálcico (TCP) o material compuesto de TCP e hidroxiapatita (HA)), se dejó coagular durante 60 minutos en una jeringa de 1 ml. Después de retirar el suero, se implantó el ABC con un volumen de aproximadamente 125 -300 pl. La mayoría de la rhBMP-6 (>95 %) se unió al ABC. La respuesta osteogénica de cada dosis de rhBMP-6 se ensayó en 4 a 8 implantes en dos a cuatro ratas cada uno. Se creó un pequeño bolsillo debajo de la piel en las regiones abdominales debajo de la axila para implantar el ABGS preparado con sangre autóloga/rhBMP-6/CRM. El ABGS (aprox. 125-300 pl sin suero) se implantó y se selló con una única sutura a la fascia y 3 puntos a la piel. Para analizar la formación ósea ectópica, los animales se escanearon utilizando un dispositivo de microtomografía computerizada 1076 (SkyScan, Bélgica) a los 28 días tras la implantación. Se observó la formación ósea ectópica en todos los grupos de animales y se cuantificó mediante análisis de microtomografía computerizada. La cuantificación del hueso ectópico mostró una dependencia de la dosis. La respuesta celular y la formación ósea se evalúan mediante histología en varios intervalos de tiempo después de la sustitución progresiva más evidente a mayor aumento.

la implantación subcutánea de coágulo de sangre autóloga (ABC) solo recluta células madre mesenquimales migratorias (osteoprogenitores) dentro de los días 1-3 y forma cápsulas de tejido que después experimentan una disolución en los días 7-9, mientras que los implantes de ABC que contienen rhBMP6 indujeron la diferenciación de los MSC en el hueso endocondral el día 7, el hueso recién formado experimenta después remodelación en el día 21 35 relleno con osículos que contienen elementos funcionales de la médula ósea. La observación histológica de los implantes de ALLO más implantes de ABC y los implantes de ABC ALLO rhBMP6 el día 7 y el día 35 se muestran en las Figuras 2A y 2B. Ya hay signos de formación de hueso endocondral en los implantes que contienen rhBMP6 en el día 7. En los implantes del día 35, se produjo una sólida formación ósea en los implantes ABC/ALLO/rhBMP6 entre y en aposición con partículas ALLO que sufrieron una remodelación ósea típica a través de sustitución progresiva (reabsorción del aloinjerto reemplazado por hueso recién formado). El análisis de microtomografía computerizada de ABC/ALLO y ABGS (ABC/ALLO/rhBMP6) de los implantes del día 7 y el día 35, visualizados como microtomografía computerizada general, específicamente partículas de ALLO y el hueso remodelado recién formado sin partículas de ALLO se muestran en las Figuras 2C y 2D. Los implantes ALLO y ABC por sí solos no indujeron hueso y formaron las cápsulas similares a tejido fibroso alrededor de los implantes y después se reabsorbieron el día 18-21. En los implantes ABC/ALLO que contenían rhBMP6, se observó osteogénesis con una resolución gradual del aloinjerto. Las Figuras 2E y 2F representan el volumen del aloinjerto y el volumen óseo cuantificados utilizando análisis de microtomografía computerizada para ABC más ALLO y ABC ALLO rhBMP6 el día 7 y el día 35 en los implantes subcutáneos de rata.

Ejemplo N.° 3: Actividad biológica inesperada de la sangre autóloga

Se utilizó el ensayo de implante subcutáneo de rata para evaluar la función de la sangre autóloga en la superación de la reacción inflamatoria y de cuerpo extraño en el ABGS que contenía CRM (aloinjerto y/o materiales cerámicos sintéticos (trifosfato cálcico o hidroxiapatita o una combinación de los mismos) en la generación del ABGS utilizando el método N.° 2 o N.° 3. La actividad osteogénica se ensayó a diferentes dosis. Se añadieron implantes de ABC/rhBMP6/ALLO, partículas de aloinjerto de rata de 74-420 pm, a entre 0,1 y 0,5 g/ml de sangre autóloga.

Para identificar la inflamación y el rechazo de cuerpos extraños en implantes que contienen aloinjertos, los implantes se recolectaron desde el día 1, 3 y 7 y las secciones se tiñeron con tinción H&E/o con azul de toluidina y se realizó la detección de fosfatasa ácida mediante histoquímica en secciones incrustadas en parafina. Los grupos examinados incluyeron solo aloinjerto, aloinjerto mezclado con el ABC o aloinjerto con el ABC y 25 pg de rhBMP6 por ml de sangre autóloga, los implantes se extrajeron de los animales los días 7 o 14 y se sometieron a análisis de células gigantes de cuerpo extraño.

Los resultados demuestran que las partículas de aloinjerto (ALLO) cuando se implantaron en sitios subcutáneos de rata indujeron inflamación y una reacción a un cuerpo extraño debidas al alto contenido de minerales en sitios ectópicos por el reclutamiento de fagocitos mononucleares en los días 1-3, que después se fusionaron para formar células gigantes multinucleadas de cuerpo extraño (FBGC) en el día 7-14 (Figura 3A). El insulto inflamatorio y la fusión de FBGC multinucleados se redujeron significativamente en número cuando las partículas de ALLO se formularon dentro del ABC (Figura 3B y 3D). En los implantes de ABGS que contenían ABC ALLO rhBMP6, hubo menos o ningún FBGC con formación del hueso endocondral (Figura 3C y 3D) en aposición a partículas de ALLO. La Figura 3D representa el número promedio de FBGC multinucleados contados morfométricamente a partir de tres secciones histológicas representativas de implantes ALLO, ALLO ABC y ALLO ABC rhBMP6. Las células de FBGC multinucleadas reclutadas por los implantes de ALLO se caracterizaron además mediante inmunohistoquímica para tinción con fosfatasa ácida, que se redujeron mediante la adición de ABC (Figura 3E y 3F). Se observaron hallazgos similares cuando se usó material cerámico (fosfato tricálcico o hidroxiapatita o una combinación de los mismos) como la CRM (véase la Figura 21).

Ejemplo N.° 4: Farmacocinética y liberación acumulativa de rhBMP6 a partir de ABGS in vitro y retención de rhBMP6 en el implante.

El ABGS que contenía sangre humana y aloinjerto se formuló como se describe tanto en el método N.° 2 como el N.° 3. Se recogieron muestras de sangre de voluntarios humanos sanos de la vena cubital en tubos sin anticoagulantes. Tras la extracción, la sangre se mezcló con aloinjerto (tamaños de partículas de 2-5 mm o 5-8 mm) y rhBMP6 en dos concentraciones (62,5 o 125 pg por ml de sangre). Después de completarse la coagulación (60 min), se enjuagó el aloinjerto ABC+rhBMP6 plus con 1 ml del medio basal. Cada implante se colocó en un tubo Falcon que contenía 3 ml de medio Eagle modificado de Dulbecco. Los tubos se incubaron a 37 °C durante 10 días y el medio se reemplazó los días 1, 3, 6, 8 y 10. La cantidad de BMP6 liberada del aloinjerto ABC plus en el medio se determinó mediante ELISA específico de rhBMP6 (R&D Systems, DY507).

La cantidad de rhBMP6 liberada del ABGS sin aloinjerto y con aloinjerto de dos tamaños de partículas diferentes se muestran en la Figura 4A. El ABGS se preparó utilizando sangre humana de voluntarios y la CRM es aloinjerto humano del banco de tejido óseo en la clínica que se utiliza para los. La rhBMP6 se liberó fácilmente en los primeros 3-6 días, después de lo cual se estabilizó. Aunque el aloinjerto que contenía ABGS mostró un poco más de liberación de rhBMP6, esta no fue estadísticamente significativa. La liberación acumulada medida en los días 1, 3, 6, 8 y 10 y la liberación total calculada (%) del ABGS fue aproximadamente el 3-9 % de la dosis de rhBMP6 total (Figuras 4B-4C). La adición de aloinjerto pareció tener una liberación ligeramente más acumulativa. La rhBMP6 se une principalmente a proteínas plasmáticas en el ABGS con o sin aloinjerto como se examinó in vitro. Es probable que la farmacocinética de rhBMP6 cambie en el sitio del implante a medida que la proteína es captada por las células que responden para desencadenar la diferenciación ósea endocondral.

Características de unión y liberación de RhBMP6 con ABGS que contienen materiales cerámicos o ALLO:

La RhBMP6 añadida se une fuerte y específicamente a materiales cerámicos en la superficie, así como dentro de los poros a través de interacciones iónicas e hidrófobas y eso requiere fosfato 100 mM para eluir la proteína de unión. La unión de rhBMP6 al coágulo se basa en proteína-proteína con proteínas plasmáticas y membrana celular en la superficie de los eritrocitos con interacciones hidrófobas y también puede implicar probablemente una alta afinidad de unión a glicosoaminoglicanos similares a la heparina, ya que se sabe que BMP6 se une al sulfato de heparina. Por lo tanto, hay dos mecanismos (ortogonales) mediante los cuales rhBMP6 se retiene en el ABGS que contiene material cerámico-rhBMP6-ABC.

La muy alta capacidad de unión del coágulo se ilustra mediante SDS-PAGE en inmunotransferencia con anti BMP6. (nota: Se ve un fondo de alto PM en la parte superior de todas las líneas debido a la reacción cruzada de los anticuerpos). La capacidad del coágulo para la unión de BMP6 se muestra en la Figura 15. Las líneas 2 - 13 muestran cantidades crecientes de BMP que se habían añadido para la unión a BMP en el coágulo y que podrían liberarse posteriormente de manera cuantitativa mediante la solubilización con un tampón de muestra SDS. Incluso a 800 pg por ml de sangre no han aparecido cantidades significativas de BMP6 en el sobrenadante del suero ni signos de saturación del coágulo. Esto es importante, ya que no se producirá una formación de hueso exuberante, puesto que no hay una liberación extensa de BMP. La Figura 16 muestra la liberación de BMP de los materiales cerámicos precargados durante intervalos de 3 días, medida mediante ensayo Elisa.

Ejemplo N.° 5: Perfil de producto objetivo de ABGS: Un mimético de autoinjerto

Presentamos que el sustituto de injerto óseo autólogo (ABGS) que contiene BMP6 humana recombinante (rhBMP6) dispersa dentro de un coágulo de sangre autóloga (ABC), con partículas de aloinjerto (ALLO), es capaz de inducir la formación de hueso nuevo. Se eligió BMP6 como la proteína morfogenética preferida, puesto que no se une con avidez a nogina, un antagonista natural de BMP presente en abundancia en los huesos. BMP6 también se une a la mayoría de los receptores de BMP de tipo I y II y exhibe una alta actividad de fosfatasa alcalina específica en cultivos de células osteoblásticas, lo que permite el uso de dosis más bajas en comparación con BMP2 o BMP7. El coágulo de sangre autóloga (ABC) se eligió como portador, puesto que 1) disminuye la inflamación, 2) proporciona osteoprogenitores circulantes, 3) promueve la unión de rhBMP6 con proteínas plasmáticas firmemente dentro de la malla de fibrina y se libera lentamente como una proteína intacta, 4) reduce las respuestas inmunitarias y evita la generación de anticuerpos contra rhBMP6, y 5) finalmente proporciona un entorno permisible para la diferenciación ósea endocondral. Las partículas de ALLO se añadieron uniformemente en el ABC para proporcionar biocompatibilidad, buenas propiedades de manejo y resistencia a la compresión.

Los ABGS que contienen ABC más ALLO se fabrican con propiedades reológicas definidas. La adición de partículas de aloinjerto reduce el tiempo necesario para lograr el coágulo y mejora las propiedades de manejo. Observamos por primera vez que ABC tiene una propiedad biológica inherente inesperada, ya que supera las respuestas de cuerpo extraño provocadas por minerales con alto contenido de Ca/P (ALLO) en sitios ectópicos. El ABC reduce significativamente la formación de células gigantes de cuerpo extraño multinucleadas alrededor de las partículas del aloinjerto y permite el reclutamiento de células madre mesenquimales que después, en respuesta a rhBMP6, experimentan diferenciación ósea endocondral. Las características de unión y liberación de rhBMP6 y la dosis de rhBMP6 requerida para inducir una formación ósea óptima son comparables en el ABGS con o sin aloinjerto. El hueso recién formado en el aloinjerto que contiene ABG^ses compacto y experimenta una remodelación ósea típica, según lo examinado por análisis de microtomografía computerizada e histología en implantes subcutáneos de rata, que imita la asimilación del autoinjerto observada en el sitio ortotrópico. El ABGS (ABC/aloinjerto/rhBMP6) indujo el hueso endocondral y las partículas de ALLO fueron asimiladas con el hueso recién formado a través de una sustitución progresiva (Figura 22). El ABGS (ABC/TCP/rhBMP6) que contenía materiales cerámicos sintéticos se representa en la Figura 22. El ABGS induce hueso de manera dependiente de la dosis con una dosis efectiva de rhBMP6 a 100 pg/ml de ABC.

Se utilizaron colágenos de suero bovino como portadores para suministrar la BMP; se utilizó malla de colágeno de tipo I reconstruido soluble en ácido derivado de tendón de Aquiles bovino como en InFuse®31 o como un material compuesto con forma de losa con materiales cerámicos sintéticos como en Amplify®38 para suministrar la rhBMP2. Se utilizaron colágeno de tipo I derivado de hueso de la diáfisis bovina en forma de partículas y/o combinado con aditivo CM-celulosa como masilla inyectable para rhBMP7/OP1 como en OP1-Implants®39 y OP1-Putty®40. La esterilización de estos colágenos de origen bovino mediante métodos químicos o radiación gamma para usos clínicos también agregó modificaciones indeseadas al portador de colágeno40. Aquí, presentamos el coágulo de sangre autóloga como un portador nativo para suministrar rhBMP6 (ABGS) con aloinjerto (ALLO) como una matriz resistente a la compresión para promover la fusión lumbar posterolateral y minimizar los ejemplos de efectos adversos, como 1) generación de anticuerpo contra una BMP cuando se administra con colágeno de origen animal que sirve como adyuvante, 2) inflamación nerviosa41 como resultado de altas dosis de BMP usadas y liberadas fácilmente lejos de los sitios el implante y 3) compresión nerviosa debida al deterioro funcional del soporte óseo biomecánico.

Ejemplo comparativo N.° 6: ABGS (AB frente a plasma autólogo rico en plaquetas)

El ABGS se formuló utilizando proteínas de sangre autóloga (AB) derivadas de plasma rico en plaquetas (PRP) con rhBMP6 y comparándolo con el ABGS formulado con el coágulo de sangre autóloga (ABC). Además, el ABGS se formuló con a Bc y PRP. El ABGS-ABC (formulado con ABC), el ABGS-PRP (formulado con PRP) y el ABGS-ABC/PRP (formulado tanto con ABC como con PRP) se examinaron en un ensayo de implante subcutáneo en ratas. La Figura 23 muestra que la PRP autóloga preparada a partir de ratas e implantada bajo la piel de la rata no formó un hueso 14 días después, mientras que 5 y 20 pg de BMP-6 añadidos a PRP autóloga indujeron hueso nuevo dependiente de la dosis (indicado en un círculo blanco).

Ejemplo N.° 7: Estudios preclínicos realizados para predecir resultados clínicos

Modelo de defecto segmentario de la diáfisis en conejos:

La eficacia del ABGS en la reducción de defectos críticos de tamaño óseo se probó en el modelo de defecto segmentario del cúbito de conejo. El ABC se recogió de las venas marginales de las orejas del conejo en un volumen de 1,5 ml. Se añadió rhBMP6 en la sangre en cantidades de 25 pg, 50 pg y 100 pg con una concentración de cloruro de calcio de 50 mM y se mezcló haciendo rotar los tubos. Se prepararon ABC rhBMP6 en una jeringa y se dejaron coagular a temperatura ambiente durante 60-90 min. La porción líquida (suero) se retiró y el gel de ABGS homogéneo, cohesivo, inyectable y maleable estuvo listo para su uso.

Los protocolos de estudio se realizaron en conejos de laboratorio machos (Oryctolagus cuniculus), cepa Nueva Zelanda, de 10 semanas de edad (2,3 - 2,5 kg de peso corporal). Los animales se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos (cada uno n=5): A) control, defecto relleno solo con ABC; B) defecto relleno con el ABC rhBMP6 (25 pg/ml); C) defecto relleno con el ABC rhBMP6 (50 pg/ml) y D) defecto relleno con el ABC rhBMP6 (100 pg/ml). En otro experimento (n=5 por grupo), el ABGS (1,5 ml de ABC rhBMP6 (100 pg/ml) se comparó con colágeno (150 mg) rhBMP7 (100 pg/100 mg;) en las semanas 2 y 8 después de la implantación.

Se extrajo un segmento de cúbito que medía 17 mm (defecto grande) y se implantó el ABGS en el sitio del defecto, dejando el radio intacto para la estabilidad mecánica, sin utilizar dispositivos de fijación internos o externos. Se tomaron imágenes radiológicas de la extremidad anterior derecha inmediatamente después de la cirugía y durante el periodo de curación ósea de 23 semanas. Durante el experimento no hubo efectos adversos. El resultado de la cicatrización se analizó mediante radiografía, cuantificación de microtomografía computerizada e histología.

El ABC implantado solo no dio como resultado la formación de hueso nuevo, no logró conseguir el puenteado del defecto (Figura 5). Sin embargo, el ABC que contenía rhBMP6 (ABGS), indujo de forma reproducible la formación de hueso nuevo y restauró el defecto, según se evaluó por radiografía. La formación de hueso nuevo se indujo de manera dependiente de la dosis, como se representa en las semanas 6, 9, 13, 16, 19 y 23 (Figura 5), y todos los cúbitos de conejo se muestran en la semana 23 (Figuras 6A y 6C). Los análisis de microtomagrafía computerizada mostraron un aumento dependiente de la dosis en la cantidad de hueso, según se examinó por el volumen óseo (BV) y el volumen medular (MV), que son comparables a los del hueso intacto del lado contralateral (Figura 6D). La calidad ósea se confirmó además mediante histología, como se muestra en una muestra representativa de cada grupo (Figura 7). La dosis de 100 pg de rhBMP6/ml de ABC dio como resultado la restauración completa con cortezas totalmente establecidas y canal medular remodelado. La evaluación histológica confirmó el puenteado completo de los defectos de tamaño crítico del cúbito en conejos tratados con 100 pg de rhBMP6/ml de a Bc (Figura 7).

En el mismo modelo, comparamos lado a lado el dispositivo de rhBMP7/colágeno óseo bovino con el ABGS (rhBMP6/ABC). El colágeno solo no indujo la formación de hueso, pero la rhBMP7 que contenía colágeno indujo la formación de hueso nuevo (Fig.8A). El dispositivo comercial de rhBMP7/colágeno óseo bovino contiene 3,5 mg de rhBMP7/g de colágeno, y para rellenar el defecto del cúbito de conejo utilizamos 300 mg, que representan la cantidad total de 1,06 mg de rhBMP7 en un portador de colágeno. Este puenteado inducido por rhBMP7/colágeno del defecto del cúbito se comparó con el del ABGS (100 pg de rhBMP6 en 1,5 ml de sangre) como se muestra en la Fig. 8A. El ABGS indujo, en las semanas 2 y 6, la formación de un nuevo hueso uniforme y experimentó una remodelación para volver a unir las nuevas cortezas con el hueso anfitrión adyacente, mientras que la formación ósea con rhBMP7/colágeno se retrasó. El análisis de microtomagrafía computerizada confirmó que el ABGS que contenía rhBMP6 indujo en la semana 8 tras la cirugía aproximadamente 2 veces más volumen óseo (Fig. 8B-C).

El resultado de este estudio preclínico nos permitió evaluar el estudio de seguridad de fase I aleatorizado, controlado con placebo y doble ciego del primer ensayo en seres humanos (FIH, del inglés First-in-Human) en pacientes con fracturas de radio distal (DRF) (1) y el estudio de la eficacia y seguridad de fase I/II en pacientes con osteotomía tibial alta (OTA) (2)

Estudio de fusión lumbar posterolateral (PLF) en conejos:

Se evaluó la actividad inductora de hueso para la fusión espinal del ABGS en un modelo de conejo de fusión lumbar posterolateral (PLF). Los protocolos del estudio se llevaron a cabo en conejos de laboratorio blancos macho de Nueva Zelanda (Oryctolagus cuniculus), variante de Nueva Zelanda, de 14 semanas de edad y un peso corporal entre 3 y 5 kg. 28 conejos esqueléticamente maduros se sometieron a una fusión de la apófisis intertransversa bilateral posterior entre las vértebras lumbares L5-L647. Los animales se dividieron en 7 grupos experimentales de cuatro cada uno de la siguiente manera: el ABC solo sirvió como control; el ABC con 50 pg (0,05 mg/ml; 125 pg por dispositivo) de rhBMP6; el ABC con 100 pg (0,1 mg/ml; 250 pg por dispositivo) de rhBMP6; el ABC con 200 pg (0,2 mg/ml; 500 pg por dispositivo) de rhBMP6; el ABC con 200 pg (0,2 mg/ml; 500 pg por dispositivo) de rhBMP6 y aloinjerto óseo de conejo desvitalizado (0,3 g/ml); el ABC con 400 pg (0,4 mg/ml; 1000 pg por dispositivo) de rhBMP6 y aloinjerto óseo de conejo desvitalizado (0,3 g/ml); el ABC y aloinjerto óseo de conejo desvitalizado (0,3 g/ml) sin rhBMP6 sirvió como control. El volumen del ABC para la preparación del dispositivo fue 2,5 ml por lado de implantación.

La Figura 9 muestra fotografías de rayos X, microtomografía computerizada y anatomía macroscópica del ABGS con y sin ALLO a dosis variables de rhBMP6 por ml de ABC en comparación con los grupos de ABC solo y ABC más ALLO. El hueso recién formado entre dos procesos de transferencia por el ABGS es compacto y se distribuye uniformemente dentro del implante y se separa de la periferia del tejido blando que rodea al implante, según se examinó a las 14 semanas. El grupo que contenía rhBMP6 a 50 pg/ml de ABC (125 pg/implante) demostró formación de hueso nuevo, pero logró la fusión en dos de los 4 conejos, lo que sugiere que la cantidad de rhBMP6 podría no haber sido suficiente. A 100 pg de rhBMP6/ml de ABC (250 pg/implante), se observó una fusión completa en todos los conejos. A 200 pg de rhBMP6/ml de ABC (500 pg/implante), de nuevo todos los conejos mostraron fusión en ambos lados, pero no más de la cantidad observada en el grupo de 100 pg/ml de ABC. Dado que el ALLO es capaz de inducir inflamación y de formar FBGC multinucleados, hemos formulado implantes de ABGS que contenían 2x rhBMP6 a 200 o 4x rhBMP6 a 400 pg/ml de ABC (500 o 1000 pg/implante). El ABGS más ALLO que contenía 200 pg/ml de ABC (500 pg/implante) indujo una fusión completa con un volumen óseo comparable al del ABGS que tenía 100 pg/ml de ABC (250 pg/implante) y una mayor cantidad de rhBMP6 a 400 pg/ml de ABC (1000 pg/implante) no aumentó más el volumen óseo. Los grupos que tenían solo el ABC o el ABC más ALLO no se fusionaron en absoluto, aunque el ABC contenía osteoprogenitores circulantes endógenos y factores de crecimiento dentro de las partículas de ALLO y el ALLO puede liberar BMP endógenas tras la reabsorción. El área de contacto entre las apófisis transversas y el hueso recién formado era indistinguible y fusionada en un segmento óseo continuo. Las mediciones cuantitativas del volumen óseo, el número trabecular y la interconectividad trabecular, según se determinó mediante análisis de microtomografía computerizada, se muestran en las Figuras 10A-10D. El ABGS a 100 pg de rhBMP6/ml de ABC parece ser la dosis óptima y duplicar la dosis no aumentó necesariamente los parámetros de formación ósea. Los implantes de ABGS más AllO que contenían 200 o 400 pg/ml de ABC también dieron como resultado la formación de hueso nuevo comparable con el ABGS sin ALLO a 100 pg/ml de ABC.

La histología de los implantes de ABGS mostró formación de hueso nuevo con una remodelación típica y osteointegración en la interfaz entre el hueso recién formado y las apófisis transversas nativas (Figura 11A). En los implantes ALLO que contienen ABGS, el hueso recién formado experimenta una rápida remodelación ósea y se asimila por completo con partículas de ALLO y, finalmente, son reemplazados por una sustitución progresiva como se muestra en ABC/rhBMP6/ALLO a 200 pg/ml (500 pg/implante) a un aumento bajo y alto (Figura 11A). La histología de ABC/ALLO mostró ausencia de hueso nuevo, excepto por la formación de tejido fibroso. Además, cabe mencionar que no se detectaron anticuerpos anti-rhBMP6 en sueros de conejos tratados con implantes ABC/rhBMP6 el día 21 después de la implantación de ABGS en comparación con el día 0 (Figura 11B). Las Figuras 11C y 11D ilustran la absorbancia en función de la dilución en suero en el día 0 y el día 21 a 1 y 2 mg de rhBMP6.

Estudio de fusión lumbar posterolateral (PLF) en ovejas

Los protocolos de estudio se realizaron en ovejas hembra (Ovis spp.), mestizas, de 2 a 3 años de edad, con certificado de salud y un peso corporal entre 60 y 70 kg.

Se han realizado dos experimentos separados de PLF en ovejas. En el primer experimento, 8 ovejas hembra fueron tratadas quirúrgicamente con el ABC solo (n=2) y con el ABC que contenía 62,5 pg/ml (0,5 mg total) de rhBMP6 (n=6) sin instrumentación. En el segundo experimento, a 14 ovejas se les administró el ABC que contenía 187,5 pg/ml (1,5 mg totales) de rhBMP6. Los animales fueron asignados a tres grupos: grupos A, el ABC solo (n=2), grupo B, el ABC/rhBMP6 con instrumentación (n=6) y grupo C, el ABC/rhBMP6/ y aloinjerto de oveja desvitalizado (2 g/implante) con instrumentación (n=6). Las cirugías se realizaron bajo anestesia general y fueron realizadas para todos los animales por el mismo equipo quirúrgico. La muestra de sangre autóloga para la preparación del implante (16 ml) fue recogida de la vena yugular del animal y se prepararon e implantaron dos implantes (8 ml cada uno) bilateralmente por animal después de la decorticación de la cara lateral de las apófisis transversas hasta que hizo evidente el sangrado. Las ovejas se asignaron aleatoriamente al grupo y recibieron implantes apropiados colocados bilateralmente en la apófisis transversa y la lámina. La supervisión clínica y radiográfica fue realizada por un veterinario inmediatamente después de la cirugía, en las semanas 8 y 27, cuando finalizó el estudio. Durante el experimento no se observaron efectos adversos en ningún grupo experimental.

Evaluamos el ABGS sin ALLO a una dosis de 62,5 pg de rhBMP6/ml de ABC (0,5 mg/implante) o de 187,5 pg de rhBMP6/ml de ABC (1,5 mg/implante). Ambos grupos indujeron la formación de hueso nuevo y consiguieron una fusión completa cosechada a los 6 meses tras la implantación, como se examinó por rayos X (Figura 12A) y microtomografía computerizada (Figura 12B). No hay ninguna diferencia aparente en la cantidad de hueso formado entre las dos dosis, lo que sugiere que la rhBMP6 en el intervalo de aproximadamente 100 pg/ml de ABC parece ser una dosis efectiva y no hay mucha diferencia entre las dosis efectivas en los estudios de p Lf tanto de conejos como de ovejas. El examen de ABGS con ALLO a 187,5 pg de rhBMP6/ml de ABC (1,5 mg/implante) con y sin instrumentación también indujo la formación de hueso nuevo y mostró significativamente más que el ABGS sin ALLO (Figuras 12C-12F). Las ovejas tratadas con el ABGS e instrumentación tuvieron un éxito en la formación de hueso nuevo bilateral de aproximadamente el 83 % (2/12 implantes no se fusionaron por completo), mientras que la adición de aloinjerto óseo al ABGS aumentó la tasa de éxito de fusión a aproximadamente el 93 % (1/12 implantes no se fusionó por completo) (véase la Figura 12)

Las fotomicrografías de anatomía macroscópica de fusión espinal del estudio bilateral de PLF en ovejas y en el espacio intermedio entre las apófisis transversas con hueso recién formado se muestran en la Figura 13A y el análisis de microtomografía computerizada de la misma en la Figura 13B de una oveja representativa. La osteointegración entre el hueso recién formado en sitios ectópicos y las apófisis transversas nativas fue indistinguible y la fusión fue compacta y fuerte. Las mediciones cuantitativas de volumen óseo, índice del modelo estructural y grosor óseo del hueso recién fusionado y la apófisis transversa nativa adyacente y las vértebras lumbares, como se examinaron mediante análisis de microtomografía computerizada, se presentan en las Figuras 13C a 13E. El hueso recién formado tenía un mayor volumen óseo, número trabecular e interconectividad trabecular en comparación con el hueso transverso nativo y las vértebras lumbares adyacentes. Se están realizando estudios para definir la dosis y las características físicas de las partículas de ALLO y la cantidad requerida (masa por volumen de ABC) que se requieren para una fusión lumbar exitosa de larga duración entre dos apófisis transversas de un solo nivel y múltiples niveles en ovejas. El resultado de los estudios de PLF en conejos y ovejas nos permitió evaluar la eficacia de la fusión intercorporal lumbar posterolateral (PLIF) en fase II aleatorizada y doble ciego controlada frente al autoinjerto (3)

Estudio de fusión intercorporal lumbar anterior en ovejas

La eficacia de ABGS con rhBMP6 se sometió a ensayo en la fusión espinal lumbar anterior en ovejas después de la implantación de la caja DePuy Cervical CFRP I/F. Para el experimento se utilizaron 10 ovejas hembra (raza Merinolandschaf), con 3-4 de edad, con un peso de 50-60 kg, y se dividieron en 2 grupos experimentales, en concreto, control: jaula rellena con ABC sin rhBMP6 (n = 4); y experimental: jaula rellena con coágulo de sangre autóloga con 250 pg/ml de rhBMP6 (n = 5).

Las cirugías se realizaron bajo anestesia general y fueron realizadas para todos los animales por el mismo equipo quirúrgico. La muestra de sangre para la preparación del implante (2 ml) se recogió de la vena yugular. Las jaulas están hechas de polímero reforzado fibra de carbono (ancho/profundidad/altura) 15 mm x 12 mm x 5 mm. Tras la escisión del disco intervertebral (L5-L6) y el raspado del cartílago de la placa terminal, se implantó la jaula cervical y se rellenó con aproximadamente 1 cc de coágulo de sangre, mientras que otro 1 cc se distribuyó bilateralmente alrededor de la jaula. Las ovejas fueron supervisadas clínica y radiográficamente inmediatamente después de la cirugía, 7 y 11 semanas después.

El curso temporal de la maduración de la fusión se evaluó mediante examen quirúrgico, radiografía y análisis de pCT (microtomofgrafía computerizada). Se realizaron radiografías simples, anteroposterior y lateral de las columnas en condiciones consistentes. El estado de la fusión se evaluó en las radiografías simples. Las radiografías fueron evaluadas de forma independiente por tres cirujanos ortopédicos con ocultación. Se realizaron tomografías computarizadas para evaluar la fusión en sección transversal y en tres dimensiones.

El experimento se terminó en la semana 11 después de la cirugía y todos los animales sobrevivieron, excepto una oveja del grupo de control que murió debido a una infección respiratoria. No se registraron efectos secundarios relacionados con la movilidad, parálisis parcial o total, irritación y/o dolor nervioso, disminución de la ingesta de alimentos y pérdida de peso. No se observaron osificaciones ectópicas, edemas ni ningún otro cambio morfológico visible. En las ovejas que recibieron rhBMP6, había hueso recién formado dentro y fuera de la jaula (n=5), y el hueso estaba fusionado con ambos cuerpos vertebrales. Se formó algo de hueso en la jaula de los animales de control, pero la fusión no fue completa. El volumen óseo y el grosor del hueso recién formado fueron significativamente mayores en las ovejas tratadas con ABGS con rhBMP6, en comparación con los animales de control. Los resultados del modelo de fusión espinal intersomática anterior (ALIF) en ovejas después de 11 semanas se presentan en la Figura 14.

Con referencia a la Figura 14, en la imagen de rayos X de la oveja de control, el espacio entre dos vértebras (flecha negra) no está fusionado con hueso recién formado, como también se evidencia en las exploraciones de microtomografía computerizada mediante flechas de color blanco que apuntan al hueso dentro de la jaula y flechas de color rojo que indican el espacio fuera de la jaula (vistas lateral e inferior). En la imagen de rayos X de las ovejas tratada con ABGS y rhBMP6 hay hueso recién formado entre dos vértebras adyacentes, que se confirma en las exploraciones de microtomografía computerizada por un hueso continuo (flecha de color blanco en las vistas lateral e inferior) y espacio vacío fuera de la jaula (flechas oscuras en las vistas lateral e inferior). Este experimento con ovejas utilizando una jaula cervical (humana) para ALIF demostró que ABGS con rhBMP6 (250 pg/ml) dio como resultado una fusión completa de las dos vértebras lumbares adyacentes, en comparación con la fusión incompleta en los animales de control.

Referencias:

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición de sustituto de injerto óseo autólogo para inducir la formación de hueso nuevo, promover el crecimiento óseo y tratar el defecto óseo, en la que la composición comprende:

(i) sangre autóloga;

(ii) una proteína morfogenética ósea osteogénica seleccionada del grupo que consiste en BMP-6, BMP-2, BMP-7, BMP-4, BMP-5, BMP-8, BMP-9, BMP-12 y BMP-13, heterodímeros de las mismas y combinaciones de las mismas, en un intervalo de 0,002 a 1 mg por ml de sangre autóloga; y

2. La composición, según la reivindicación 1, en la que la matriz resistente a la compresión tiene una forma cualquiera seleccionada entre cilindro, losa, lámina, malla, partículas o cualquier otra forma dependiendo de un defecto óseo.

3. La composición, según las reivindicaciones 1 y 2, en la que la proteína morfogenética ósea osteogénica se liofiliza sobre la matriz resistente a la compresión.

4. La composición, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el gel de coágulo proporciona una liberación sostenida de la proteína morfogenética ósea osteogénica BMP-6 durante 7 a 10 días.

5. La composición, según la reivindicación 1, en la que la matriz resistente a la compresión se selecciona entre hidroxiapatita, fosfato tricálcico y combinaciones de los mismos, se observa una liberación sustancial de la proteína morfogenética ósea osteogénica BMP-6 después de 10 días.

6. La composición, según la reivindicación 1, en la que la proteína morfogenética ósea osteogénica es BMP-6 presente en una cantidad de 200 pg por ml de sangre autóloga.

7. La composición, según la reivindicación 1, en la que la proteína morfogenética ósea osteogénica es BMP-6 en la cantidad de 100 pg por ml de sangre autóloga.

8. La composición, según la reivindicación 1, en la que la composición comprende además un agente de coagulación sanguínea.

9. La composición, según la reivindicación 8, en la que el agente de coagulación sanguínea se selecciona entre sales de calcio, estroncio o magnesio farmacológicamente aceptables, tanto en forma de solución como en forma de nanopartículas o microesferas en sangre autóloga, y el agente de coagulación sanguínea está presente en una cantidad de 5 a 50 mM por ml de sangre autóloga.

10. La composición, según la reivindicación 9, en la que la proteína morfogenética ósea osteogénica es BMP-6 presente en el intervalo de 2 a 200 pg por ml de sangre autóloga.

11. La composición, según la reivindicación 9, en la que la proteína morfogenética ósea osteogénica es BMP-6 en la cantidad de 100 pg por ml de sangre autóloga.

12. La composición, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que la composición es inyectable, extruible o implantable.

13. Un método de preparación de una composición de sustituto de injerto óseo autólogo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el método comprende las etapas de:

(1) mezclar:

a) sangre autóloga;

b) una proteína morfogenética ósea osteogénica seleccionada del grupo que consiste en BMP-6, BMP-2, BMP-7, BMP-4, BMP-5, BMP-8, BMP-9, BMP-12, BMP-13, heterodímeros de las mismas y combinaciones de las mismas, en un intervalo de 0,002 a 1 mg por ml de sangre autóloga; y

(2) incubar los componentes de la etapa (1) durante un periodo suficiente para formar un gel de coágulo.

14. El método de preparación de una composición de sustituto de injerto óseo autólogo, según la reivindicación 13, en el que el método comprende las siguientes etapas:

a. mezclar la proteína morfogénica ósea osteogénica en una solución acuosa con la matriz resistente a la compresión en un recipiente de liofilización estéril (10), en el que un volumen de solución acuosa de proteína morfogénica ósea osteogénica añadido a la matriz resistente a la compresión se optimiza para la humectación completa de la matriz resistente a la compresión;

b. liofilización de la proteína morfogénica ósea osteogénica y la matriz resistente a la compresión;

c. añadir sangre autóloga; y

d. incubar una proteína morfogénica ósea osteogénica liofilizada, la matriz resistente a la compresión y sangre autóloga durante un periodo suficiente para formar un coágulo de sangre biomecánicamente estable (13) alrededor de la proteína morfogénica ósea osteogénica liofilizada y la matriz resistente a la compresión.

15. El método de preparación, según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14, en el que el gel de coágulo proporciona una liberación sostenida de la proteína morfogenética ósea osteogénica BMP-6 durante 7 a 10 días.

16. El método de preparación, según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14, en el que para la matriz resistente a la compresión que se selecciona entre hidroxiapatita, fosfato tricálcico y combinaciones de los mismos, se observa una liberación sustancial de la proteína morfogenética ósea osteogénica BMP-6 después de 10 días.

17. El método de preparación, según la reivindicación 13, en el que el método comprende además añadir en la etapa (1 ) un agente de coagulación sanguínea, el agente de coagulación sanguínea se selecciona entre sales de calcio, estroncio o magnesio farmacológicamente aceptables, tanto en forma de una solución, como en forma de nanopartículas o microesferas en sangre autóloga y el agente de coagulación sanguínea está presente en una cantidad de 5 a 50 mM por ml de sangre autóloga.

18. El método de preparación, según la reivindicación 17, en el que la proteína morfogenética ósea osteogénica es BMP-6 presente en el intervalo de 2 a 200 pg por ml de sangre autóloga.

19. El método de preparación, según la reivindicación 18, en el que la proteína morfogenética ósea osteogénica es BMP-6 en la cantidad de 100 pg por ml de sangre autóloga.

20. El método de preparación, según la reivindicación 17, en el que el gel de coágulo se deja coagular durante 60-90 minutos.

21. Una composición, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para su uso en el tratamiento de defectos óseos en los que se requiere la formación de hueso nuevo, promoviendo y/o induciendo el crecimiento óseo en procedimientos para generar o restaurar hueso en un sitio particular en un individuo que necesita dicho tratamiento.

22. La composición, según la reivindicación 21, para su uso en el tratamiento de la fusión lumbar posterolateral; fusión intersomática lumbar, escoliosis del adulto, traumatismo (reconstrucción de columna), reconstrucción maxilarcraneal u osteotomía tibial alta.