JP2001525662A - 合成繰り返しｄｎａの調製方法 - Google Patents

合成繰り返しｄｎａの調製方法

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Abstract

(57)【要約】 アミノ酸の繰り返し配列を含む、大きなポリペプチドを、生物学的技術、特に前記大きなポリペプチドの発現用のDNAコード配列を利用して、製造するための方法を提供する。外因性の転写および翻訳領域を利用して、前記大きなポリペプチドの製造を制御する系をも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 合成繰り返しDNAの調製方法 序文 技術的分野 この分野は高分子量ポリマー、核酸あるいはまた核酸の発現産物であるペプチ ドに関するものであり、特に繰返し配列(repeating sequence)を有する高分子量 ペプチドの生化学的方法による生産、構造物質として用途が見出せるペプチドに 関する。背景 組換えDNA技術は天然の遺伝子の単離および種々の宿主細胞中での遺伝子の発 現に用いられている。典型的には、この技術は他の方法では有用な量で産生する ことが実際的でない、インターフェロンやペプチドホルモンのような活性ポリペ プチドの生物的産生において有用である。天然の遺伝子を単離することにより改 変タンパク質を産生することも可能であり、部位特異的in vitro変異導入技術を 用いて遺伝子を改変することも可能であり、それにより産生されるポリペプチド を変異させることも可能である。新しいポリペプチドを産生するために天然の遺 伝子の種々の断片をつなぐことによって他のポリペプチドが作製されており、そ れらは天然に存在するいくつかの分子のキメラ分子である。 DNAの化学合成に関する効率的で自動化された方法が出現したので遺伝子全体 を合成して、そのような合成遺伝子を合成の過程で自由に改変することができる ようになった。しかしながら、こうした種々の技術は天然のポリペプチドまたは その修飾改変体の産生に適用されてきた。これらの技術を本質的に新規なポリペ プチドを作製するために使用する試みはほとんどなされていない。天然には、ポ リペプチドは化学的、物理的および生理学的に幅広い性質を有している。それに もかかわらず、既知の天然に存在するポリペプチドが適当でない商業的応用例が 存在する。 バイオテクノロジーの用途は広いが、通常これは天然に生ずる産物または天然 に生ずる分子の改変への適用に限られてきた。これに対して、有機化学合成のひ とつの大きな力は、高価でない炭素材料を天然に生ずる分子、もっとも重要なこ とにはポリプロピレンおよびポリアクリレートのような新規な化学構造体（これ らは天然に存在する分子と関連しないことが明らかであり、かつ予測される化学 的性質を有する）を含む非常に多種のポリマー分子に変換させる能力を有してい る。 そのような物質、特にアミノ酸の繰返し配列を有する高分子量ポリマーは生化 学的方法では生産が難しいことが分かっている。アミノ酸の繰返し配列を有する 大きなペプチドを産生するために必要な遺伝子は不安定であり、しばしば分子内 組換えを起こし、遺伝子内の繰り返し単位の欠失を生じる。有機合成によって得 られるものと類似したポリマー分子を生物学的方法によって生産することができ るバイオテクノロジーの開発はバイオテクノロジーの応用範囲を大きく広げるで あろう。関連する文献の簡単な説明 ４つまでのラクトースオペロンを直列に複数クローニングすることはSaldler ら、Gene（1980）8:279-300に開示されている。高度に繰り返しのあるサテライ トDNAを含むハイブリッドバクテリアプラスミドはBrutlagら、Cell(1977)10:509 -519に開示されている。バクテリア中でのポリ（アスパルチル-フェニルアラニ ン）の合成はDoelら、Nucleic Acids Reaearch(1980)8:4575-4592に開示されて いる。プロリンポリマーの産生をコードするプラスミドのクローニングによって プロリン含量を増大させる方法はKangasら、Applied and Environmental Microb iology(1982)43:629-635に開示されている。プラスミドレプリコン内に安定に維 持されるであろう高度反復DNA配列の長さの生物学的限界はGuptaら、Nio/Techno logy，p602-609，September 1983で論じられている。発明の概要 合成遺伝子の発現による、短い繰り返し単位の長いストレッチを有するタンパ ク質ポリマーの生産のための方法が提供される。アミノ酸繰り返し単位はタンパ ク質ポリマーに対するモチーフを提供する配列でありタンパク質ポリマーをコー ドする遺伝子の主要部分を構成するものである。単一のタンパク質ポリマー中に １以上のアミノ酸繰り返し単位のタイプが存在することがある。タンパク質ポリ マーの設計により、１以上の異なるアミノ酸繰り返し単位、場合により、１以上 のアミノ酸断続リンカーまたはスペーサー配列が「モノマー」へ作り上げられて もよい。最終的なタンパク質ポリマー中、アミノ酸モノマーは連続的に複製され て望みの分子量を達成する。 タンパク質ポリマーをコードする遺伝子を構築するために、アミノ酸モノマー 配列をコードするDNAモノマー配列が初めに設計されて合成される。DNAモノマー を合成するためには３つの異なるアプローチがある:（１）多数のdsDNA断片を合 成する。これらはその合成と並行して、あるいはクローニングとそれに続く制限 酵素消化の後にライゲーションされると望みのDNAモノマー配列となるものであ る。各dsDNAセグメントは典型的には数個のアミノ酸繰り返し単位をコードする が、このセグメントはアミノ酸断続リンカーまたはスペーサー配列をコードして いてもよい。dsDNAセグメントは、少なくとも部分的に重なりがあるオリゴマー を合成し、オリゴマー対をハイブリダイズさせてdsDNAを供給することによって 合成される。次にdsDNAモノマーは、それぞれのdsDNAセグメントをクローニング ベクターにクローン化し、続いて、制限酵素切断とライゲーションにより第１の セグメントの全部若しくは一部、または、それぞれの付加されたdsDNAセグメン トの全部若しくは一部を有するクローニングベクターへ順番に挿入されることに よりアッセンブルされる。アッセンブルは、全てのdsDNAセグメントを同時にク ローニングベクターにクローニングするものであって、そこにおいて各個々のセ グメントが第２のセグメントの5'または3'末端に相補的な3'または5'末端を有す るものである（以下同様）か、または、適切な配列を有するオープンリーディン グフレームでモノマーが得られるような方法の手ごろな要素を組み合わせること によって行なわれ、このモノマーはシーケンシングされる；または、 （２）DNAモノマーの全部または一部の一本鎖を合成し、相補鎖を合成する。簡 便なのはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用するもので、合成される各PCRテン プレートは、適切なプライマー結合部位配列を側方に有する、ssDNAモノマーの 適当な配列を含む。次に得られたdsDNAセグメントは制限酵素消化で消化されて プライマー結合部位が除去され、クローニングベクターにクローン化され、１よ り多くのセグメントが合成されていた場合には、上記のようにアッセンブルされ てモノマーが形成され、シーケンシングされる；あるいは、（３）適当な制限酵 素を用いて、上記（１）および／または（２）のように調製しておいたＤＮＡモ ノマーの一部を欠失させ、または（場合によっては上述のように合成した新しい dsDNAセグメントを含めて）全部または一部を結合し、このモノマーの特性を決 定する。一般には、dsDNAセグメントは各クローニングステップの後でシーケン シングされ、上記（１）および／または（２）のように調製されたdsDNAセグメ ントは結合されてモノマーを形成することができ、そのモノマーはシーケンシン グされる。新しいDNAが合成されモノマーに導入される場合は、少なくともその 新しいDNAおよび通常はモノマー全体がシーケンシングされるであろう。 このモノマーはオリゴマー化のための、予め定めておいた末端を有する。次に モノマーはライゲーション条件下で鎖状につながれ、すなわちオリゴマー化され てモノマーのマルチマーを形成し、このマルチマーは種々の数のモノマーを含む であろうから種々の数のモノマーを有する多数の遺伝子を生じさせるかもしれな い。 少なくとも１個のマルチマーが発現ベクターに挿入され、そのベクターは遺伝 子発現のための適当な発現宿主に導入される。発現宿主はタンパク質が発現され 、単離されるかもしれない条件下で増殖される。 図面の簡単な説明 図１：プラスミドpSY701の構造。 図２Ａ〜Ｂ:（ａ）β-ラクタマーゼ、または、（ｂ）gly-ala-ペプチドに対す る抗体を用いた、ポリペプチド産物のイムノブロット。 図３：プラスミドpG10/SlpIの構築フローチャート。 図４Ａ〜Ｂ：ポリペプチド産物のイムノブロット。（ａ）T7gp10/SlpIと抗-Sl pAb、（ｂ）T7gp9/SlpIと抗-SlpAb、または（ｃ）クマシーブルー染色。 図５：プラスミドpSY856の構築フローチャート。 図６：T7系によるカナマイシン耐性遺伝子産物の蓄積の時間経過。 図７：プラスミドpSY857の構築フローチャート。 図８：プラスミドpSY980の構築フローチャート。 図９Ａ〜Ｂ:（Ａ）β-ガラクトシダーゼ/SlpIII融合遺伝子の産物を含むゲル のアミドブラック染色;（Ｂ）抗-Slp抗体による、同じ産物のイムノブロット。 図10：プラスミドpSY1280の構築フローチャート。 具体的な実施形態の説明 比較的短い繰り返しアミノ酸単位のブロックポリマーである新規なポリペプチ ドが提供される。繰り返し単位のブロック（オリゴマー）は種々のアミノ酸配列 のスペーサで結合されていてもよい。本ポリペプチドはたった一つの繰り返しア ミノ酸配列を含んでいてもよく、多数の（同じまたは異なるアミノ酸配列の）繰 り返しアミノ酸配列を含んでいてもよい。この新規なポリペプチドは特に繊維状 または構造タンパク質として有用であり、結晶状、エラストマー状、強固で骨質 物質、例えば、シルク、エラスチン、コラーゲン、ケラチンまたは繰り返しアミ ノ酸配列モチーフを有する、天然に現れる他の構造ポリマーに類似するが、それ とは異なるタンパク質として有用である。以前にはマルチ繰り返し単位を有する 遺伝子に関連していた問題を特に回避するために繰り返し単位含有ペプチドをコ ードする遺伝子が作製される。 本明細書に記載した方法によって作製される遺伝子は一般には少なくとも900n tの長さであり、通常は少なくとも1200ntの長さ、好ましくは少なくとも1500nt の長さで、通常20knt長を越えず、さらに通例12knt長を越えず、多くは6knt長を 越えない。これは通常、約30kDa1、通例少なくとも約35kDa1で、約250kDalを越 えず、より通常には125kDalを越えないタンパク質を生じさせる。タンパク質ポ リマーをコードする合成遺伝子を作製する方法にはdsDNA「モノマー」 （これはもっぱらアミノ酸繰り返し単位をコードする伸長されたDNAセグメント ある）を調製することが含まれ、この最終産物は２、しばしば少なくとも３、か ら50まで、通常は約30以下、より通常には約20以下のモノマー単位を有する。以 下に記載する、一つの例外があり、その例外においてはモノマーが最終的な繰り 返し単位遺伝子の全体であってもよい。モノマーは、一つの例外を除き、遺伝子 を提供するためのマルチ化の前に配列が確定しているdsDNAであろう。 dsDNAモノマーのサイズは望みのアミノ酸モノマー配列およびモノマーを得る 方法に依存する。モノマーがいずれかの新生されてライゲーションされたDNAを 用いて構築される場合は、モノマーはマルチ化に先立って必ずシーケンシングさ れ、DNAシーケンシング技術の実用上の限界はモノマーサイズを約500nt、通常40 0ntに制限する。遺伝子モノマーが、前もって構築され、シーケンシングされた モノマーの消化断片だけから構築される場合は、最終的な遺伝子モノマーは典型 的には制限消化によって特徴づけられる。従って、遺伝子モノマーは望みのアミ ノ酸繰り返し単位および周期性に依存して、最終遺伝子と同じほど大きくなり得 る。 同じアミノ酸配列をコードする繰り返し単位の長いトラックを含む主題の遺伝 子の性質のために、モノマー遺伝子がうまく調製できるであろう方法は制限され 、配列の信頼性に関する確実性が要求される。調製の初期的方法においては、多 数のステージがあった：重なり合い、ハイブリダイズするとセグメントを提供す るssDNAの対の調製；セグメントのクローニング；配列の忠実性を保証するため のセグメントのシーケンシング；モノマー形成のためのセグメントの結合。これ らの種々の操作が行なわれる順序と方法は変更することができ、遺伝子およびそ れがコードするタンパク質の性質に依存するものである。望まない組換えが起こ る可能性を低減するために、同じ繰り返し単位をコードするために異なる核酸配 列が使用される。 モノマーを得るために３種の方法がある。第１の方法は、約１から12、より通 常は１から９、多くは１から６の繰り返しアミノ酸単位をコードする１本鎖デオ キシヌクレオチドオリゴマーの合成とdsDNAモノマー配列へのアッセンブリによ るものである。各繰り返し単位は約３から30コドン(９から90塩基)、通常 は約３から25コドン、より通常は約３から15コドン、多くは９コドン以下のコド ンを有し、特に天然に現れるモチーフを模倣するときはそうである。dsDNAモノ マー配列中のアミノ酸繰り返し単位の数は、繰り返し単位のサイズの実際の程度 に依存するであろう。ssDNAオリゴマーは約15から120塩基、通例約21から90塩基 、より通常は約39から72塩基を有するように調製されるのが便利であるが、オリ ゴマーは300塩基、より通例は約252塩基を有するものまで調製されることがある 。数個のアミノ酸を有する繰り返し単位（通常３から15の範囲のアミノ酸、より 通常は３から９の範囲のアミノ酸）に関しては、１本鎖オリゴマーは約２から12 アミノ酸繰り返し単位を有するのが都合がよい。 タンパク質ポリマーが同じ繰り返し単位を有する場合は、異なる１本鎖オリゴ マーの数は通常少なくとも２(１対を形成)、より通常は約６(３対を形成)、また は８またはそれ以上（４対またはそれ以上を形成）である。ブロックコポリマー が調製される場合は、オリゴマーの数は異なるブロックの数およびそのブロック の大きさに依存するであろう。種々のssDNAオリゴマーのオリゴマー対によって 形成されるdsDNAセグメントは同じアミノ酸配列をコードしていてもよく、また は、異なるアミノ酸配列をコードしていてもよいが、１を越えるdsDNAセグメン トが合成される場合は、少なくとも２つのセグメントは異なるヌクレオチド配列 を有するであろう。dsDNAセグメントを形成するオリゴマーの各対は相補的であ り、少なくとも部分的にオーバーラップしており、平滑末端または接着末端(突 出末端)、好ましくは突出末端を提供し、dsDNAのアッセンブルとライゲーション を容易にし「モノマー」を形成させる。 dsDNAセグメントは、原核生物用ベクター内で複製起点と、１以上のdsDNAセグ メントの挿入に都合のよい、ポリリンカーを含んでいてもよい制限部位を有する ベクターを直線化することによりアッセンブルされるのが都合がよい。このベク ターは選抜用のマーカー遺伝子も有し、これは通常は抗生物質耐性を与えるが、 例えば発色団または発光団の形成といった、他の明確な性質を与えることがある 。マーカーは抗生物質耐性を与えるのが好ましく、抗生物試薬には幅広い種類が あり、例えば、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、アクチノマイシン、 ネオマイシン、アンピシリン、ハイグロマイシン、重金属その他がある。他のマ ー カーにはβ-ガラクトシダーゼ（基質X-galにより青色を呈する）が含まれる。大 腸菌内のクローニング用には沢山のクローニングベクターが商業的に入手可能で あり、ここで例示する必要はない。次にこのベクターは、リン酸カルシウム沈殿 DNA、融合、トランスフェクション、接合その他を含む、都合のよいなんらかの 手段で適当なクローニング用宿主に導入される。次に細胞は適当な選択培地で増 殖される。生存している細胞は集められ、溶解されてプラスミドが単離される。 dsDNAセグメントの多様性を有することにより、第１のセグメントが第２のセ グメントの5'または3'末端に相補的な3'または5'末端を有するように（以降も同 様）末端が設計されることがあり、その末端は種々の制限酵素に対する種々のコ ンセンサス配列を有してもよく、またはいかなる既知の制限酵素によっても認識 されないものでもよい。dsDNAセグメントの末端は5'突出末端を有するように選 ばれてもよく、3'突出末端を有するように選ばれても、同じ鎖（コード鎖または 非コード鎖のいずれか）に5'突出末端と3'突出末端を有するように選ばれてもよ い。突出末端の相補は、異なるdsDNAセグメントがライゲーションされるときは 、制限酵素部位を破壊することも、維持することもある。 制限酵素はクローニンクベクターdsDNAを消化してdsDNAセグメントを挿入する ために使用される。ベクターの制限酵素消化は、すでに挿入されたdsDNAセグメ ントを有するか否かを問わず、挿入される次のdsDNAセグメントの末端に相補的 な末端を提供し、それは既に２以上の合成dsDNAセグメントが組み合わさったも のであることがある。dsDNAセグメント配列の選択において、一般にセグメント の末端に近いところでベクターの直線化が可能で次のdsDNAセグメントの挿入を 可能とする末端配列が選ばれる。しかしながら、時には予めクローン化したセグ メントの内部にdsDNAを挿入すべくモノマーを作製することが便利である。クロ ーニングベクターに挿入される最終的なdsDNAセグメント配列は合成されたdsDNA セグメント全体ではないかもしれないが、制限酵素消化によって形成される、挿 入を可能とする適当な相補末端を有するであろう。同様に、ベクターの消化は次 のdsDNAセグメントの挿入のために、制限酵素消化により適当な末端を作り出す ことがある。この制限酵素消化は元の合成されてクローン化されたDNAの一部を 欠失させるものである。一般に、モノマーの構築において、単一の制限酵 素部位に対応する単一の制限酵素でベクターを開裂させるのが好ましく、その結 果部分的酵素消化を避けることができる。 各dsDNAセグメントの端に異なる末端を有することにより、たとえ、それらが リン酸化されていても個々のセグメントはオリゴマー化することができない。こ のように、異なるセグメントが結合されるときは、セグメントの組の端は相補的 末端を有するであろう。その結果それらはオリゴマー化され得る。各dsDNAの3' および5'末端は一般に、クローニングベクター中に唯一つのセグメントが一つの 方向にクローン化され得るように選ばれる。しかしながら、時にはセグメントが すでに存在しているモノマー又はモノマーの一部中にクローン化され得るように 相補的な3'末端と5'末端を有することが都合がよいが、そのときは正しい方向に 正しい数でセグメントが挿入されたクローンを選抜する必要がある。モノマーの 構築に際して、dsDNAのいくつかの組み合わせは互いにリーディングフレーム内 にはないかもしれない。しかしながら、dsDNAセグメント配列とモノマー構築に 使用する制限酵素を適切に選択することにより、モノマーを含む最終的なdsDNA の組み合わせは望みのアミノ酸配列をコードする連続的なオープンリーディング フレーム内にあるであろう。上述したアプローチはモノマーを形成させる他の方 法と共に利用することができ、以下に記載する。 これらの技術と設計ストラテジーを用いると、以下の実施例に記載するように 種々の方法でdsDNAを構築することができる。一つの変法において第１のdsDNAセ グメントは制限酵素消化により直線化された後にクローニングベクターにクロー ン化される。クローニング後、第１のdsDNAセグメントの特性を、制限解析およ びシーケンシングなどで明らかにする。dsDNAセグメントが比較的小さい場合は 、シーケンシングは迅速に行われ実質的に誤り無しに行うことができる。 第１のdsDNAが正しい配列を有していることが示されたならば、このベクター を遺伝子調製の次のステージに用いてもよい。ベクターはクローン化された第１ のdsDNAセグメントの5'または3'端で直線化される。ベクター中の、クローン化 されたdsDNAの5'および／または3'末端のポリリンカーを使用することにより、 ベクターはポリリンカー中を切断する制限酵素を用いて消化され、次のdsDNAセ グメントの3'または5'末端に相補的な5'または3'ベクター末端を提供してもよい 。 また、コンセンサス配列から遠いところを切断する制限酵素を用いることもでき る。この方法では、構築されつつあるモノマーDNAを切断することなくベクター は繰り返し切断およびライゲーションされる。クローニングの後、結合したdsDN Aセグメントは上述のように特性を明らかにされるだろう。この過程は全てのdsD NAセグメントが挿入されて配列および適切な順序とリーディングフレーム内にあ ることが確かめられるまで繰り返されるであろう。 他の変法においては、２以上のdsDNAセグメントが上述のように順番に、すで にクローン化されているセグメントの3'または5'末端へそれぞれ新しい挿入がな されてクローン化されることがあり、次に他のdsDNAセグメントが前にクローン 化したセグメントの間に挿入されることがある。他の変法においては、第１のds DNAセグメントが上述のようにクローニングされ、次に他のdsDNAセグメントがク ローン化されているセグメントの内部に挿入されることがある。他の変法におい ては、２以上のdsDNAセグメントが１つのベクターに同時にクローニングされる ことがあり、追加のdsDNAセグメントが連続してａ）前にクローン化されたDNAセ グメントの3'または5'末端に挿入、ｂ）前にクローン化されたDNAセグメントの 間に挿入、またはｃ）前にクローン化されたセグメントの内部に挿入されること がある。他の変法においては、モノマーを構成する全てのdsDNAセグメントが同 時にクローニングベクター中にライゲーションされることがある。他の変法にお いては、モノマーを含む各dsDNAセグメントが個々にクローン化されて特性づけ られることがある。次に個々のdsDNAセグメントは次に精製されて一段階のクロ ーニングステップでライゲーションされてモノマーを構築し、シーケンシングさ れる。 モノマーを構築するためのこの方法の本質的な要素は、ssDNAの対が更なる操 作に先だってdsDNAセグメントにアニーリングされることである。一般には、各d sDNAまたはセグメントの組み合わせは、一度クローン化されたなら更なる操作に 先だってシーケンシングされる。モノマーはマルチマー化に先だって常にシーケ ンシングされる。 第２のアプローチはモノマー全部または一部の１本鎖の合成に依っている。合 成技術は300塩基以上の合理的に正確なオリゴヌクレオチド合成を可能とする。 たいていの場合、１本鎖は約100から300塩基の範囲内であり、通常約100から250 塩基の範囲である。１本鎖は次に相補鎖を作製するために使用され、ポリメラー ゼ連鎖反応（「PCR」）を用いるのが都合がよい。合成されたPCRテンプレートは適 当なプライマー結合部位配列を側方に有するssDNAモノマーの適当な配列を含ん でいる。 PCRに使用されるプライマーは繰返し配列に容易にはハイブリダイズしないよ うに設計され、全体として増幅される配列のヌクレオチド配列とは本質的に異な るヌクレオチド配列を有するが、好ましくはプライマーの一部は増幅される配列 の非−繰り返し部分と共通の配列を含み、この配列は約30ヌクレオチド以下、通 常は約25ヌクレオチド以下で、少なくとも10ヌクレオチド、通常は少なくとも12 ヌクレオチドであろう。プライマー中のヌクレオチド総数は一般には約15から50 の範囲、より普通には20から45の範囲であろう。標的とハイブリダイズするプラ イマーの部分において、標的ssDNAと結合するプライマー中に制限酵素コンセン サス配列が全く含まれない、あるいは一部が含まれ、一部のみが含まれる場合は 標的がコンセンサス配列を完成させるであろう。制限酵素消化は標的ｓsDNAにハ イブリダイズするプライマー配列の末端、または末端の遠方における切断を許す 。たいていの場合、制限酵素コンセンサス配列はプライマーに含まれ、制限酵素 消化はモノマーアミノ酸モチーフは維持されるであろう。好ましくは、制限酵素 消化による切断後にプライマーから、約５nt以下、通常は約３nt以下、好ましく は２nt以下が残されるであろう。通常は、制限酵素に関するコンセンサス配列は ６から８、通常６ヌクレオチドである。3'および5'プライマーは互いにハイブリ ダイズしないように異なっているであろう。プライマーが効率よく働くために、 プライマーはそれぞれの相補DNA配列へのハイブリダイゼーションの特徴であるTm および△Ｇが類似していなければならない。これらの特徴はプライマーの長さ 、標的ssDNAとハイブリダイズする配列の長さ、生じるGC結合の割合によって制 御することができる。一般にプライマーは少なくとも40％、より普通には少なく とも45％のＧおよびＣを有し、おそらくは50％以上、通常は約75％以下、より普 通には約65％以下であろう。プライマーと各々の相補的結合部位とのハイブリダ イゼーションのためには、Tmは一般に約84から90℃、 通常は約85から89℃の範囲、より普通には約87℃±1℃であろう。プライマー対 間のTmの相違は約2℃未満、通常は約1.5℃未満、より普通には約0.75℃未満であ ろう。そのようなTmは、塩濃度1000mMおよびオリゴヌクレオチド濃度0.6ピコモ ルを仮定して、マッキントッシュ（Macintosh）コンピューター用 により決定される。プライマーの標的ssDNAへのハイブリダイゼーションは、プ ライマー全体に関して同様な制限をかけて、一般に約68から73、通常は約71℃± １であろう。 さらに、プライマーのごく一部以上が最終的な遺伝子配列に寄与することのな いようにプライマーが選ばれるため、制限酵素部位はプライマー配列の除去がで きるように存在するであろうし、マルチマー化ができるような末端、詳しくは接 着末端を備えた配列を生じさせるであろう。この末端は制限酵素部位を作り出す こともあり、あるいは制限酵素部位が破壊されることもある。こうして、切断部 位はコンセンサス配列の内部に現れることもあり、コンセンサス配列から遠くに 現れることもあるが、相補末端を提供するものである。 得られたdsDNAセグメントは次に制限酵素消化によって消化されてプライマー 結合部位が除去され、ベクター中にクローニングされ、１を越えるセグメントが 合成されていた場合は、上述のようにベクター中でアッセンブルされてモノマー を形成する。得られたdsDNAモノマーはクローニングされ、精製され、正しい配 列を有していることを確かめるためにシーケンシングされる。このように調製さ れたモノマーは、アミノ酸繰返し配列のサイズと数に関して、上述したdsDNAセ グメントの連続的、および／または同時クローニングによって調製されるモノマ ーと同じ制限をもつ。 モノマーが調製され、特性が明らかにされ、望みの配列が確かめられた後、こ のモノマーは常法に従ってベクターから切り出され精製されるであろう。この時 点で、「モノマー」合成が完了する。このモノマーは遺伝子を作製するために使 用されるであろう。上記の記載から明らかなように、（１）および／または（２ ）のように調製されたdsDNAセグメントは組み合わされてモノマーを形成するこ とができ、そのモノマーはシーケンシングされる。 ３番目のアプローチは、上述のいずれかの方法によって前もって調製された、 すでにモノマー中に存在している特性の明らかなdsDNAを使用することに依存し ている。このアプローチを利用すると、新しいモノマー調製に大きな融通性が許 されることとなり、特に異なるアミノ酸繰り返し単位を含むコポリマーが望まれ るときはそうである。適当な制限酵素を用い、モノマーを含むdsDNAの全部また は一部が精製されることがある。ある例では、前に合成されたモノマーが次に新 しいモノマーとして上記の（１）および／または（２）のように新たに合成され たdsDNAセグメントと組み合わせて使用されることがあり、また前に合成された モノマーの一部分が、それ自体新たなモノマーとして使用されることがある。他 の例では、２以上の別々のモノマー由来の望みのdsDNAが、それら自体で、また は上記の（１）および／または（２）のように調製された新たな合成されたdsDN Aと一緒に、結合されて注目しているアミノ酸繰り返し単位をコードする新たな モノマーが構築されることがある。結合されるべき消化モノマーDNA断片は相補 的または非相補的末端を有していてよい。モノマー配列の末端が相補的でない場 合は、必要に応じて、アダプター、充填、核酸消化等によって相補的にしてもよ い。適切なモノマー配列が連続的および／または同時に一緒にクローニングされ て新たなモノマーが作製されると、このモノマーは必要であれば次に特性が明ら かにされシーケンシングされる。新たに合成されたアダプターまたは反応中の充 填、核酸消化等が用いられるときは、修飾モノマーDNAを含む領域はシーケンシ ングされる。 望みのタンパク質産物をコードする遺伝子がモノマーのホモオリゴマーである ときは、末端は接着末端であることが望ましく、同じ制限部位コンセンサス配列 を維持することもあり、コンセンサス配列以外の配列を生じさせることもある。 適当な制限酵素またはポリリンカーを選択することにより、モノマーの末端は同 じまたは異なる末端制限部位を有することがあるが、そのモノマーがマルチマー 化されるべきものならば相補的な末端を有するであろう。好ましくは、非対称コ ンセンサス部位でベクターからモノマーを切断する単一の制限酵素が使用される であろう。しかしながら認識部位の外側で切断する制限酵素も使用できる。異な る、しかし相補的である末端を有するモノマーを得て、このモノマーは、一方向 のみにアッセンブルしつつあるモノマーとのみin vitroでライゲーションされる であろう。 上の記載で明らかなように、通常モノマーは予め調製した多数のdsDNAセグメ ントを含む分子であり、通常は少なくとも２種の異なるdsDNAセグメントから形 成されているが(同一のアミノ酸配列をコードしていても、そうでなくてもよい) 、一般には最終的なポリマー遺伝子全体にわたって繰り返しアミノ酸単位の同じ パターンのブロックを提供する(例外はモノマーが、その遺伝子である場合)。こ のように、モノマーはアミノ酸繰返し配列がさまざまな、ホモポリマー、コポリ マーまたは一定のモチーフを有するポリマーを提供する。例えば、コラーゲンが 挙げられる。 次にモノマーはライゲーションによりマルチマー化され、ライゲーション条件 で0.01から100μgのモノマーが使用されるのが都合がよく、これで種々の数のモ ノマーを有するマルチマーが得られる。次に、マルチマーは大きさで分けられ、 所定のサイズのマルチマーが選択される。もとの混合物、部分精製混合物、また はそれをサイズ分画した画分のいずれもベクター中に導入されることがある。ア ダプターベクターまたは適当な発現ベクターのどちらも用いられる。アダプター ベクターは、どのリーディングフレームでも読み取られることができるようにそ の中への挿入を許すポリリンカーを有する。この方法において、発現ベクターか らマルチマー遺伝子を切り出して移すことができるための種々の単一制限酵素部 位を導入することがある。マルチマー遺伝子は発現ベクターに移される前に特性 が明らかにされ精製されることがある。このマルチマーはベクター中への挿入を 許す適当な末端を有するであろう。また、ベクター中に存在する、あるいは末端 と共に挿入される、遺伝子の正確な切り出しを可能とする末端グループを有する のが適当である。発現用に特定のサイズのマルチマーが選ばれることもあり、ま た種々のサイズの多数のマルチマーが選ばれることもあり、その結果、同じ繰り 返しモチーフを有するタンパク質ポリマーのファミリーが得られる。 発現ベクターは、適当な発現宿主中で機能する（通常はエピソームとして維持 されるための）複製起点、および選択マーカーを有することを特徴とする。上述 したマーカーが利用できるであろう。非組込み用のベクターまたは構築物用には 、 複製起点は通常多コピー、通常は平均約５コピー以上を与えるものである。 発現ベクターは発現宿主中で機能するプロモーターも有しているであろう。誘 導可能なまたは構成的な転写のいずれにしろ、高レベルの転写を与える、種々の プロモーターが利用可能である。プロモーターの例には、β-ラクタマーゼ、β- ガラクトシダーゼ、λPLまたはλPRプロモーター、trpEプロモーター、trp-lac プロモーター、T7プロモーター(特に遺伝子９および10)、cItsなどが含まれる。 マルチマー遺伝子および直線化されたベクターはハイブリダイズ条件（通常ライ ゲーション条件を含む）下で一緒にされてよい。マルチマー遺伝子が開始コドン を有しない場合は、そのようなコドンを付加することができる。より好都合には 、マルチマー遺伝子はベクター中の、プロモーターの転写支配下にあるコード配 列中に挿入されることがある。ベクター中のコード配列は一般には200bpを越え ず、通常は約60bpを越えず、マルチマー遺伝子が挿入される部位は適切なリーデ ィングフレーム中にコード配列とマルチマー遺伝子を有するであろう。一般には 、ベクター中に存在するコード配列は、コード配列中の塩基総数の20％以下、通 常は10％より少なく、好ましくは約５％よりも少ないであろう。 タンパク質ポリマーをペリプラズム空間へ分泌することができるように、シグ ナル配列がコード配列の5'末端に存在することがある。たいていの場合、酸性物 は細胞内で作られるであろう。 ベクターの代わりにDNA構築物が発現宿主の形質転換に使用されることがあり 、発現宿主のゲノム中へその構築物が組み込まれる。この構築物はベクターとは 第１にエピソーム様維持のための複製起点を欠いている点で異なっているであろ う。従って、この構築物は少なくとも転写および翻訳開始および終結領域、その 開始および終結領域の間でそれらの調節制御下にあるタンパク質ポリマーをコー ドする遺伝子、上述したような選抜用のマーカー、および、宿主ゲノム中への組 込みのための相同配列、ポリメラーゼ連鎖反応を開始させるための配列、制限部 位などの他の機能的配列を提供するであろう。 たいていの場合、発現宿主は通常単一細胞性の原核生物または真核生物である が、多細胞生物からのものであることもある。生物は、バクテリア、藻類、昆虫 細胞、植物細胞等からえらばれるであろう。宿主の例には、大腸菌(E.coli)、枯 草菌(B.subtilis)、B.stearothermophilus、酵母(S.cerevisiae)その他が含まれ る。 次に発現宿主は常法に従って適当な培養培地中で増殖させられる(例えば発酵) 。細胞が適当な密度まで増殖した後、その細胞は集められ、溶解され、産生物が 、その物理的および化学的性質に従って適切な方法で単離されることがある。あ る例においては、産生物が中程度の温度で水性培地に非溶解性であり、少し上昇 させた温度、約60℃を越える温度で変性剤抽出により精製されることがある(米 国特許第5,235,041号を参照せよ)。適切には、粗産生物または精製産生物は次に 意図した目的に使用されてよい。 主題の発明の遺伝子は同じアミノ酸配列をコードするDNAがつながったモノマ ーを含み、異なるアミノ酸繰返し配列をコードする２以上の異なるモノマーの全 部または一部が一緒に結合してブロックコポリマーをコードする新たなモノマー を形成していることがある。個々のアミノ酸単位は３から30のアミノ酸(９から9 0nt)、通常は３から25アミノ酸(９から75nt)、より普通には３から15（９から45 nt）アミノ酸を有し、通常は、同じ単位中に、通常は少なくとも１個のアミノ酸 で隔てられている、少なくとも２回現れる同じアミノ酸を有するであろう。いく つかの例では、アミノ酸の最小数は４であろう。モノマー中、同じアミノ酸繰り 返し単位をコードするdsDNAは、同じアミノ酸配列を達成するためのコード重複 により、２以上のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。 たいていの場合、本発明のDNA組成物は以下の式で表される： Kk(W MrXxNsYy)iLl 式中、Ｋは約１から250アミノ酸の、通常は１から60アミノ酸のアミノ酸配列 をコードするDNAであり、構築物の調製方法およびタンパク質産物の目的に依存 してどんな配列であってもよく、アミノ酸総数の約20％より通常は少なく、より 一般にはアミノ酸総数の約10％未満であり、マルチマー構造遺伝子が他のDNA配 列にインフレーム(in reading frame)で融合しているどんな配列、特に天然に現 れる配列であってもよい。Ｋは、存在する場合は開始メチオニンコドンを含むで あろう。ＬはＫと同じまたは異なっていてよく、Ｋの定義内に入るが、開始メチ オニンコドンは欠いている； ｋおよびｌは同じ又は異なっており０または１である； Ｗは、式 [(A)n(B)p]q であり、式中、 Aは、それが現れる都度、配列中に少なくとも２回現れる少なくとも１つのア ミノ酸を有する同じアミノ酸繰返し配列をコードするDNA配列であり、Aは通常約 ９から90ヌクレオチド(nt)、より普通には約９または12から75nt、好ましくは約 ９または12から45nt、より好ましくは約９または12から30ntであり、いくつかの 例では24nt程度に少ないことがあり； 通常は少なくとも２つの異なるAが存在し、通常10以下の異なるA、より普通に は６以下の異なるAが存在し、それらは同じアミノ酸配列をコードするが少なく とも１個のヌクレオチドが互いに異なり、10ヌクレオチド程度まで異なることが あり、通常は他のA配列から約５ヌクレオチドを越えて異なることはなく、各異 なるAは通常少なくとも２回繰り返され；同じアミノ酸配列単位をコードする異 なるA中で少なくとも２種の異なるコドンが同じアミノ酸に対して使用され（例 えばグリシンに対してGGCとGGA）; ｎは少なくとも２、通常は少なくとも約４、より普通には少なくとも約８、お よび約250以下、通常は約200以下、しばしば約125以下の整数であり、いくつか の場合には約50を越えないことがあり； Bは、A単位によってコードされるアミノ酸単位と異なるアミノ酸単位をコード する、Aと異なるDNA配列であり、A単位のオリゴマー間のリンク単位として働き 、Ｂは一般に約３から45nt(１から15アミノ酸）、より普通には約３から30nt（ １から10アミノ酸）を有するであろう； ここで遺伝子中に現れるB単位は同じであっても異なっていてもよく、通常約1 0を越える異なるB単位が存在することはなく、より普通には約５以下の異なるB 単位が存在し、ここでB単位は約１から45nt、より普通には約１から15ntと変化 してもよく、異なるBは同じアミノ酸配列をコードしていても、異なるアミノ酸 配列をコードしていてもよく； ｐは０または１であり、続くA単位がある度ごとに異なっていてもよく； ｑは少なくとも１である整数であり、AおよびB中のヌクレオチドの数および、 ｎとｐの値により変動するであろう；変数ｑは構造遺伝子のマルチマー部分のた めに少なくとも90nt、好ましくは少なくとも約150nt、より好ましくは少なくと も450nt、最も好ましくは少なくとも900ntを提供するように選ばれ、ヌクレオチ ド数は通常約10,000ntを越えず、より普通には約8,000ntを越えず、一般には約9 00から6,000nt、より普通には約5,000ntまでの範囲であろう；および、Mは約12 から150nt、通常は18から150nt、より普通には約90nt以下のDNAヌクレオチド配 列であり、いかなるアミノ酸配列をコードしてもよく、通常は天然の、または合 成配列を提供し、生物学的または化学的機能または活性を生じさせる機能配列を コードしており； ｒとｓは同じまたは異なっており、０から３、通常は０から２であり、ポリマ ー中に機能群(functional group)が存在するかどうかに依存し、通常は１から２ であり、異なっている場合は、同じまたは類似の機能群が連続したかたちで結合 されることがあり； NはMと同じまたは異なっていてよく、Ｍと同じ定義が当てはまる； XはWと同じまたは異なっていてよく、通常は異なっており、式、 を有するであろう（式中、 A1、B1、N1、p1およびq1はそれぞれA、B、n、pおよびqと同じまたは異なり、少 なくとも１つは異なっており、式中類似のシンボルはその相対物と同じ定義が当 てはまる）; xは０または１であり； YはWと同じ又は異なっていてもよく、通常は異なり、式、を有するであろう（式中、 A2、B2、N2、p2およびq2はそれぞれA、B、n、pおよびqと同じまたは異なり、少 なくとも１つは異なっており、式中類似のシンボルはその相対物と同じ定義が当 てはまる）; yは０または１であり； iは１から100，通常は１から50、より普通には１から30、特にx、y、rおよびs が０であるときは１であり； xまたはyが１のときは、q、q1およびq2は合計が合計が少なくとも２、通常は 少なくとも５であり、約50以下、通常は約33以下であろう。 ヌクレオチドの総数は少なくとも900ヌクレオチド、通常は少なくとも約1200n t、好ましくは少なくとも約1500ntで、かつ20knt(キロヌクレオチド)、通常は約 6knt以下、より普通には約４knt以下であろう。 上記DNA配列によってコードされるペプチドは式、 K'k(W'M'rX'xN'sY'y)iL'l を有するであろう。式中、W'は式、 [(D)n(E)p]q を有するであろう（式中、 DはAによってコードされるアミノ酸配列であり、従って一つのアミノ酸をコー ドするコドンを定義する３ヌクレオチドに基づく数的制限を有し； EはBによってコードされるアミノ酸配列であり、従って一つのアミノ酸をコー ドするコドンを定義する３ヌクレオチドに基づく数的制限を有し、各EはBのコー ドに依存して同じでも異なっていてもよく； 同様に、K'、W'，M'、X'、N'、Y'およびL'はそれぞれK、W、M、X、N、Yおよび Lによってコードされるアミノ酸配列である。しかしながら、KとLの場合には、 プロテアーゼ処理、臭化シアン処理等のような続いての処理がN-またはC-末端非 マルチマー鎖を部分的にまたは完全に除去する結果を生じることがあり;n、p、q 、k、r、s、x、iおよびlは前に示したのと同じ定義を有する。） 同じ組成(A)を有するアミノ酸繰り返し単位を有する特定のポリマー組成物は 式、 K'k[(D)n(E)p]qL'l を有するであろう（xおよびyが０）(式中、全てのシンボルは前に定義した)；お よび、DNA配列は式、 Kk[(A)n(B)p]qLl を有するであろう(式中、全てのシンボルは前に定義した)。 ２から３個のマルチマーブロックの繰り返し単位を有するコポリマー組成物を コートする特定のDNA配列は式、 K"k(W"M"rX"xN"sY"y)iL"l を有するであろう。式中、W"は式、 を有するマルチマーであり（式中、A3は３から15、通常は４から６のコドンであ り、その他の点ではAの定義が当てはまる； n3は約２から40、通常は２から32； B3は２から20、通常は４から６コドン； p3は０または１； q3は約２から50、通常は２から30であり、nとqについて上述したように、n3の 値に依存する); X"およびY"はW"と同じ又は異なっており、通常は異なり、W"と同じ定義が当て はまり； M"およびN"はM'およびN'と同じ定義が当てはまり； i"は少なくとも２、通常は少なくとも５、かつ約75以下、通常は約50以下、一 般には30を越えず； 他のシンボルは前に定義したものであり、xおよびyの少なくとも１つは１であ る。 本発明の組成物は通常、少なくとも約30kDalの分子量、通常50kDal、しばしば 少なくとも約60kDa1の分子量を有するであろうが、500kDal、またはこれより大 きい分子量を有することもあり、通常は300kDalを越えず、より普通には約250kD alを越えず、多くの例では125kDalを越えないであろう。高い範囲は一般にマル チマーの組み合わせであり、個々のマルチマーは通常約150kDal未満、通 常約100kDal未満であろう。 使用されるヌクレオチド配列は、上述のように、繰り返し単位が同じアミノ酸 に対して異なるコドンを有するように合成されるであろう。繰り返し単位をコー ドするヌクレオチド配列の、通常は少なくとも約25％、より普通には少なくとも 約40％、かつ一般には少なくとも約60％、しかし、約95％以下、好ましくは約90 ％以下は同じであろう。最初の構築物が自発的組換えを受けることが経験的に示 される場合は、これらの範囲内の、より多様なものが採用されるであろう。 特に注目されるのは、繰り返し単位SGAGAG（G=グリシン；A=アラニン；S=セリ ン）を有するペプチドであり、ここで繰り返し単位の最初のアミノ酸としてSを 選択したのは任意的なものであり、最初と最後の単位を除いて他の全てのは同じ だからである。この繰り返し単位は、天然に現れるシルクフィブロインタンパク 質に見られ、これは、 GAGA(SGAGAG)8SGAAGY (Y=チロシン) と表すことができる。主題の発明において、繰り返し単位はN-末端がMGAGAGであ ってよく、または一般に少なくとも約３個のアミノ酸、通常は少なくとも約5個 のアミノ酸、より普通には12個のアミノ酸、かつ235以下、通常は100アミノ酸以 下の、繰り返し単位と異なっていてもよい他の一切の配列であってもよいとして 設計される。一般に、異なるN-末端は、遺伝子のベクタへの、融合タンパク質の 発現を生じさせるような挿入の結果であろう。産生物の望みの特性を妨害しない 一切のタンパク質がN-末端を提供してもよい。特に、内在性宿主タンパク質、例 えばバクテリアのタンパク質が用いられることがある。タンパク質の選択は転写 開始領域の性質に依存する。同様に、C-末端は繰り返し配列と異なるアミノ酸配 列を有することがある。都合がよいのは、１から255、しばしば１から100、通常 は１から25のアミノ酸が存在することで、天然に現れる構造遺伝子のC-末端でも よく、それはここでも典型的には融合産物の形成から生ずるものである。 シルク様タンパク質(Slp)遺伝子は上述したように約5から25の繰り返し単位、 より普通には約10から20の繰り返し単位のオリゴマーを提供することにより作製 されてよい。種々の接着末端を有することにより、オリゴマーはつながって２ 以上のオリゴマー単位、通常は約50以下のオリゴマー単位、より普通には30以下 のオリゴマー単位、しばしば約25以下のオリゴマー単位を有するポリマーを供給 することがある。 シルク様タンパク質は、同じまたは異なる巻き方を有する交互のマルチマーを 有することにより変化することがある。例えば、式中で(B)pは偶数または奇数の アミノ酸を与えてもよい。シルクにおいては、グリシンの水素は一方の側に整列 することがあり、アラニンおよびセリンのメチルおよびヒドロキシルがもう一方 の側に整列することがある。(B)pが偶数の場合は、連続的に整列し、奇数の場合 は(A)nが交互に整列する。このように、(B)pにコードされるアミノ酸の数を変え ることにより種々の特性が達成される。 特に興味深いのは、天然に、例えばカイコ(Bombyx mori)に見られるシルクの 組成およひ物理的特性を模倣するポリペプチドである。 また基本繰り返し単位GVGVP(G=グリシン、V=バリン、P=プロリン)を有するペ プチドも注目され、これは天然に現れるエラスチンに見られることがある；また VPGVGおよび／またはAPGVGV単位もそうである(繰り返し単位中の最初のアミノ酸 の選択はここでも任意である)。主題の発明において、N-末端はいかなる好都合 な配列であってもよく、望むなら、プロテアーゼにより全体または部分的に除去 されてよい。通常は主題のモチーフを有しないN-末端配列は約125未満、しばし ば約100アミノ酸未満、より普通には約60アミノ酸未満であろう。 特に興味深いのは、約２から32、好ましくは８単位の基本配列であり、基本繰 り返し単位と異なる３から15のアミノ酸の内部反復を含んでいてもよい、約３か ら50のアミノ酸、通常は12から48のアミノ酸で隔てられているものである。例え ば、第２の繰り返し単位はGAGAGSが２回繰り返されるものであり得る。基本繰返 し配列の総数は一般には約150から500、より普通には150から300、さらに普通に は175から250の範囲であろう。C-末端は繰り返し単位で終わってもその部分で終 わっても、１から125、通常は１から50のアミノ酸からなる異なる配列で終わっ てもよい。C-末端は本発明には決定的ではなく、主として都合のよさで選択され るであろう。N-末端と同様にタンパク質分解性切断用に設計されることがある。 シルクタンパク質の場合のように、主題のエラスチン様タンパク 質も同様に操作され得る。 特に興味深いのは、エラスチンの特性を模倣するタンパク質、および、エラス トマー特性を与え、異なる物理特性、例えば、伸縮特性を与え、または溶解特性 を改変する、異なる繰り返し単位ポリマーのエラスチンブロックの使用である。 特に興味深いのは、Ｇαβの配列（αとβはいかなるアミノ酸でもよく、特に １つはプロリンである）を有するコラーゲン様タンパク質である。通常、タンパ ク質中でαおよびβはタンパク質中のプロリンの総パーセンテージがタンパク質 中のアミノ酸の約10から45（数％）の間となるように選ばれる。グリシンとプロ リン以外の特に興味あるアミノ酸はアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン 、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、アス パラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジンである。タンパク質の作成後、既知の方 法により１以上のプロリンはヒドロキシプロリンに酸化されてもよい。 また、興味あるのは、繰り返し単位としてK-L-(1)-L-A-E-Aを有するペプチド である(１は塩基性または酸性アミノ酸、特にKまたはEであり、１が塩基性また は酸性アミノ酸であるかに関して繰り返し単位は互い違いになる)。この構造は ケラチンに通常見られる。 繰り返し単位を含むコポリマーは、種々の単位、各マルチマー中の単位の数、 それらの間隔、マルチマー組み合わせアッセンブリの繰り返し数を適切に選択す ることにより、特性を変化させるための強力な方法である。このように、１次モ ノマーの数および配置を変えることにより種々の異なる物理的および化学的特性 が達成できる。 ブロックコポリマーの使用例は、同じモノマー単位のみを有するポリマーとは 別の特有の特性を有する産物を提供するために、シルク単位とエラスチン単位を 組み合わせることである。 繰り返しタンパク質には種々の用途が見いだせる。Slpタンパク質はシルクの 代用品その他として固有の特性を有する繊維を生産するのに用いられてもよい。 コラーゲンタンパク質は、その機能に依存して、コラーゲンがテロペプチドを含 まないまたはテロペプチドを含むように生産され得る。アテロペプチドコラーゲ ンは、あるとしても低い免疫原性しか有しないはずであり、その結果種々の人工 器官のため、またはその他の応用においてコラーゲンの代用品として有用な構造 要素である。同様に、ケラチンのような繰り返し配列を有する他のタンパク質も 主題の発明によって調製できる。他の有用な繰り返しタンパク質はクモの糸およ び他の反復動物繊維の配列に基づいて調製できる。免疫のために有用な人工ペプ チドも、寄生虫、バクテリア、およびウイルスのような病原性微生物の種々の表 面抗原中の繰返し配列に基づいて調製することができる。 以下の実施例は説明のために提供されるものであり限定のためではない。 実施例１ DNA 調製法 １．大腸菌からのプラスミド調製 Ａ．小スケール：プラスミドDNAを1.5ml培養物からボイル法またはアルカリ溶菌 法のいずれかにより調製した(Maniatisら、Molecular Cloning:A Labovatory Ma nual．Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor(1982))。 Ｂ．大スケール：プラスミド保持菌を適当な抗生物質を含む１Ｌのルリア培地で 一晩培養した。細胞を10,000xgで５分間遠心し、10mlの氷冷却TE（10mM Tris-HC l pH8、1mM EDTA）に再懸濁した。細胞を再び遠心し4mlのTES（TEおよび25％シ ョ糖）に再懸濁しボルテックスによりホモゲナイズした。サンプルを氷中に維持 して以下のステップを行った。リゾチーム(10mg/mlを1ml)を細胞懸濁液に加え、 ５分間インキュベーションし、2mlの0.5M EDTA pH8を加えた。10分間のインキュ ベーション後、50mlのプロテインキナーゼK(40mg/ml)を加え、続いて10分間後に 15mlの溶解バッファー（0.1％ Triton X-100、1mM EDTA、50mM Tris-HCl pH8） を加えた。15-20分後、細胞ライセートを35,000xgで90〜120分間遠心した。上清 (19.8ml)を20mgのCsClと400μlのエチジウムブロミド（10mg/ml）の入ったプラ スチックチューブに入れた。溶解後、混合物を２つのポリアロマー超遠心チュー ブに分け、熱シールし、Beckman Ti 65ロータで60,000rpmにて24時間遠心した。 下の方のプラスミドDNAバンドを皮下注射針でチューブから取り出した。エチジ ウムブロミドは当体積のNaCl-飽和イソプロパノールで３回抽出した。２体積のH2 OをDNA溶液に加え、次にこのDNAをエタノールで沈殿させた。 ２．２本鎖DNAの調製： JM103の培養物をOD600が約0.2まで増殖させ、次に2mlアリコートに分けた。各 アリコートにM13の新しいプラークを感染させ37℃にて約６時間激しく振盪して インキュベーションした。次に細胞をペレット化し上清を後の感染のために保存 した。２本鎖ファージDNAをボイル法によって抽出した(Maniatisら)。 ３．脱タンパク質： フェノール抽出を都合のよいDNAサンプル体積で行った。典型的には100μlか ら10mlとした。DNAサンプルを0.01M Tris-HCl pH7.5、1ml EDTAで希釈し、等体 積の水-飽和フェノールを加えた。サンプルを短くボルテックスし、氷中に３分 間おいた。微量遠心機で３分間遠心後、水性層を新しいチューブに取り出し、等 体積のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で一回抽出した。 ４．エタノール沈殿： 水性バッファー中のDNAをエタノール沈殿により濃縮した。DNAサンプルに1/10 体積の3M酢酸ナトリウムpH7.5を加え２〜３体積の冷却エタノールを加えた。DNA を-70℃にて30分間、または-20℃にて一晩沈殿させ、微量遠心機で４℃にて15分 間遠心することによりペレット化した。このペレットを200μlの冷却80％エタノ ールで１回洗浄し、4℃にて10分間再度ペレット化した。風乾または凍結乾燥後 、このペレットを適当なバッファーに再懸濁した。 ５．DNA のホスファターゼ処理： Ａ． DNAのホスファターゼ処理を1μl（25単位）の子ウシ腸ホスファターゼ（B oehringer Mannheim）を直接制限酵素消化反応に加えることによって行い、37℃ にて30分間インキュベーションを続けることによって行った。ホスファターゼは フェノール抽出による脱タンパク質の前に65℃、60分間で失活させた。 Ｂ．DNAのホスファターゼ処理はまた、制限酵素消化物からのエタノール沈殿DNA を20mM Tris-HCl pH8.0、10mM MgCl2に最終濃度20μg/mlになるように再懸濁 することによっても行った。エビアルカリホスファターゼ（「SAP」）を２U/μgDN Aで加え、この混合物を37℃で１時間インキュベーションし、65℃にて20分間熱 失活させ、Probindフィルター(Millipore)および続いてBio-Spinカラムに通した 。次にDNAをエタノール沈殿し、適切なバッファー中に再懸濁した。 ６．DNA のリン酸化： アニーリングの前にリン酸化をポリヌクレオチドキナーゼ3'-ホスファターゼ- フリー（Boehringer Mannheim）を用いて行った。反応は37℃にて30分間50μlの 反応体積で行った。反応内容物：12.5μgDNA，5μlの10xキナーゼバッファー(0. 5MのTris pH7.5、10mMスペルミジン、0.1M MgCl2、150mM DTT、1mM EDTA)および ２μlポリヌクレオチドキナーゼ(10U/μl)。リン酸化の後、塩とグリセロールを TEABで平衡化したBio-Spin6カラム(BioRad)を用いてDNA鎖から除いた。 ７．DNA ポリメラーゼＩによる充填反応： DNAを50mM Tris-HCl H7.4、50mM KCl、5mM MgCl2、および各４種のデオキシリ ボヌクレオチド三リン酸400μMを含むバッファー中に再懸濁した。10単位のKlen ow DNAポリメラーゼ(BRL)を加え、室温で15分間反応を続けさせた。次にDNAをフ ェノール抽出し、エタノール沈殿した。 ８．T4 ポリヌクレオチドキナーゼ反応： 反応（10μl）の内容:T4ポリヌクレオチドキナーゼ(BRL)、150ngのDNA、1μl の10xキナーゼバッファー（0.7M Tris-HCl pH7.6、0.1M MgCl2、50mM DTT）およ び[32P]-ATP(200〜300nCi)。これを37℃にて30分間インキュベーションし、次に NACSカラム（Bethesda Research Labs）を用いてDNAを精製した。 ９．制限エンドヌクレアーゼによる消化： 制限エンドヌクレアーゼ(REN)を1x"AA"バッファー[10x AAバッファーは330mM Tris-アセテート、pH7.9、660mM酢酸カリウム、100mM酢酸マグネシウム、50 mMジチオスレイトール(DTT)および1mg/mlウシ血清アルブミン(ヌクレアーゼフリ ー)]。可能ならば常に、DNA濃度は1μg/25μl未満に維持した。たいていの制限 エンドヌクレアーゼについてはインキュベーションを37℃にて1〜4時間行ったが 、BalI、BanIおよびNaeI消化については一晩インキュベーションした。 10．DNA の解析用アガロースゲル電気泳動： ゲル解析のためのDNAサンプルに0.2体積のローディングバッファー（5x電気泳 動バッファー、0.01％ブロモフェノールブルー色素、50mM EDTA、および50％グ リセロール）を加えた。次にこのサンプルを1.0(w/v)％アガロースゲルを入れた 水平サブマリン電気泳動ユニットのレーンにのせた。電気泳動バッファーは、1x TACか1/2xTBEとした。1xTACとは40mM Tris塩基、10mM EDTA、酢酸でpH7.8に調製 したものである。1/2xTBEとは、0.045M Tris塩基、0.045Mホウ酸、1mM EDTA、pH 8である。ゲルを40〜50Ｖで18時間泳動し、次に取り出し、0.5μg/mlエチジウム ブロミドで30分間染色した。DNAバントは長波長UVトランスイルミネーター上で 視覚化された。 11．調製用ゲル電気泳動： 方法と材料は解析用アガロースゲル電気泳動と同じである。唯一の違いは、低 融点(「LMP」)アガロースを、精製すべきDNA断片の大きさによって0.5〜2.5％（w/ v）の濃度で使用したことである。エチジウムブロミドで視覚化したのちDNA制限 断片をLMPアガロースゲルから切り出した。アガロースライゲーションのために 使用したバッファーは１ｘTAE(50mM Tris-アセテート、pH7.8)であった。 12．NACS 精製： DNAを含むゲル断片を70℃にて５分間溶かし、約５倍のTE1（10mM Tris-HClpH7 .5、0.2M NaCl）で希釈した。ゲル溶液をNACSカラム（BRL）にアプライした。こ のカラムを5mlの同じバッファーで洗浄した。結合したDNAを、1000bpよりも小さ なDNA断片に対しては300μlのTE2（10mM Tris-HCl pH7.5、1.0M NaCl）で、また は、より大きな断片に対しては300μlのTE3（10mM Tris-HCl pH7.5、 2.5M NaCl）で溶出した。溶出したDNAをエタノール沈殿により濃縮した。 13．DNA ライゲーション 接着末端のライゲーション反応の内容：最終反応体積20μl中、1μg DNA、1 ｘ AAバッファー(上記ステップ９を参照せよ)、1mM ATPおよび20単位のT4DNAリ ガーゼ(BRL)。ライゲーションは15℃にて16〜18時間または室温にて１〜２時間 進行させた。平滑末端ライゲーション用の反応には、1μg DNA、25mM Tris-HCl pH7.5、5mM MgCl2、5M DTT、0.25mMスペルミジン、200mg BSA、1mMヘキサミン コバルトクロリド(HCC)、0.5mM ATPおよび400単位のT4 DNAリガーゼ(NEB)が20μ lの反応体積に含めた。ライゲーションは室温で30分から１時間進行させた。 14．アガロースDNAライゲーション アガロースを65℃で溶かし、次に温度を37℃まで下げ、ライゲーションバッフ ァー（5x＝100mM Tris-HCl、pH7.5、50mM MgCl2、50mM DTT、1mM ATP)を加えた ；このチューブを次に室温に放置し、リガーゼ（1000単位のT4 DNAリガーゼ(NEB )）を加え、反応体積を通常は50μlとした。反応物を15℃で16〜18時間インキュ ベーションした。 15．DNA 精製のためのフルターおよびカラムの使用 含む溶液をこのフィルターユニットにアプライし、Sorvall Microspin 24S中、1 2,000RPMで30秒間スピンした。 Ｂ．Microcon-30フィルター(Amicon):DNAを含む溶液をこのフィルターにアプラ イして、微量遠心機で12,000RPMにて６分間スピンすることによって２回H2Oで交 換して洗浄した。 Ｃ．Bio-Spin6カラム（“Bio-Spin”、BioRad):DNA溶液から塩およびグリセロー ルを、予めTEAB（炭酸水素トリエチルアンモニウムpH7.0）で平衡化しておいた このカラムにアプライし、HB4ローターを用いてSorvall RC5B遠心機で2,500RP Mで４分間スピンすることによって除いた。 この工程は大きさ400μlまでのアガロース切片に対して用いることができる。 アガロースゲル電気泳動後、DNAをエチジウムブロミド染色で視覚化し、注目し ているDNAバンドを含むアガロース塊を切り出す。次にアガロースを-20℃にて１ 時間凍結する；次に素早く37℃、５分間で溶解する。次にアガロースを徹底的に 細かくする。次にこの細片をフィルターユニットのサンプルカップに移し5,000x gで標準的な遠心機中20分間スピンする。次にアガロースを200μlのTris-EDTAま たは他のバッファー中に再懸濁し、室温で30分間インキュベーションしてゲルか らさらにDNAを溶出させる。混合物を次にさらに20分間10,000RPMで遠心する。こ の時点で、DNAは濾過チューブ中でアガロース断片と分離され、続くDNA操作の用 意が整っている。バクテリア形質転換法 １．形質転換-コンピテント大腸菌細胞の調製： 200mlの滅菌Ｌ培地培養液に大腸菌細胞の小さな一白金耳分を接種した。これ を37℃にてOD600がおよそ0.5になるまで振盪しながらインキュベーションした。 培養物を氷中に10分間置き、6,000xgで10分間遠心した。細胞ペレットを100mlの 氷冷却0.1M MgCl2に再懸濁し、氷中で30〜40分間放置し、再び遠心した。ペレッ トを2mlの氷冷却100mM CaCl2に再懸濁し、滅菌試験管に移し氷中で24時間インキ ュベーションした。コンピテント細胞を一定量に分け、-70℃にて保存した。 ２．大腸菌の形質転換 凍結したコンピテント細胞のアリコートを氷中で溶かした。50μlの細胞に0.1 から１μgのDNAを加え、混合物を氷中で30分間インキュベーションした。チュー ブを氷中から取り出し、２分間42℃の水槽に置いた。Ｌ培地（1ml）を加え、形 質転換混合物を振盪しながら望みの温度（通常30℃または37℃）で２時間イ ンキュベーションした。次に形質転換したうちの1/10を、適当な抗生物質を含み 、必要な場合はXgalおよびIPTGを加えたＬ培地プレートにまいた。 ３．B.subtilis のDNA形質転換 B.subtilis細胞を初期定常状態まで増殖させた(クレット単位の変化が15分 間で５％以下)。形質転換は確立されている方法に従った（Anagnostopoulosら、 1981）(文献８)。細胞（0.45ml)を1〜10μgのDNAと37℃にて80分間振盪しながら インキュベーションし、次に適当な抗生物質を含むTBAB寒天プレートにまいた。 ４．B.subtilis からのプラスミドDNAの単離 B.subtilisからのプラスミドDNAはアルカリ溶菌法と類似の方法で得たが、ペ レット化した細胞は8mlの溶液１（50mMグルコース、10mM EDTA、25mM Tris-HCl( pH8.0)、10mg/mlリゾチーム）に再懸濁し、室温で30分間インキュベーションし た。次に16mlの溶液２（0.2N NaOH、１％(w/v)SDS）を加え、氷中で10分間イン キュベーションした。最後に、12mlの3M酢酸カリウム（pH4.8）を加え、氷中で さらに20分間インキュベーションした。溶解した細胞をSorval SS-34ローター中 で15分間15,000rpmにて遠心した。DNAを等体積のイソプロピルアルコールを加え て7,000rpmで遠心することにより沈殿させた。ペレットを5mlの10mM Tris-HCl(p H7.5)、1mM EDTA(TE)に再懸濁した。この溶液を一度フェノール抽出しクロロホ ルム抽出した。DNAをエタノールで沈殿させ、3mlのTEに再懸濁した。4.2gのCsCl 、10mg/mlの400μlのエチジウムブロミドおよびTEを加えることにより体積を5.2 mlに調製した。この溶液をBechkmanクイックシールポリアロマー遠心チューブに 移しBeckman vTi65ローターで45,000にて18時間遠心した。抗体作製、タンパク質化学およびタンパク質の電気泳動 １．人工合成ペプチドに対する抗体の調製 配列(GAGAGS)8GAAGYの合成ペプチドをKagenとGlick(1979)のグルタルアルデ ヒド法を用いてBSAに結合した。結合の程度を微量の放射性ヨウ素化合成ペプチ ドを用いてモニターした。 SlpIII配列に対応する53アミノ酸のペプチドをApplied Biosystems社のペプチ ド合成機で調製した。分子量3640のこの物質の収量は、およそ0.5グラムであっ た。このペプチドをウシ血清アルブミンに結合した。この材料をAntibodies社に ウサギでの抗体調製のために送った。フロイントの完全アジュバント中、1mg/ml の濃度のタンパク質結合物を第０日においてウサギを免疫するために使用した。 第30日においてフロイントの不完全アジュバント中の抗原を動物に再注射し、第 60日に力価測定した。陽性の血清は合成ペプチドを抗原として使用したマイクロ タイターRIAを用いて検出した(KagenとClick(1979)、Methods of Radioilnmunoa ssay，JaffeとBerman編集、Academic Press，p328)。SlpIおよびSlpIII配列のど ちらの合成ペプチドに対しても反応する抗血清が得られた。これらの抗血清はgl y-ala(SLP)配列を含む融合ペプチドを検出するために有用である。 上記の方法に従って、式(V-P-G-V-G)8を有する抗原を合成し、スカシガイのヘ モシアニン(keyhole limpet hemocyanin)に結合した。ELPペプチドに結合するポ リクローナル抗体を上述のようにして調製した。 同じ方法に従って、ファイブロネクチンの式YTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYC(FCB 部分)、および、式(GAPGAPGSQGAPGLQ)2YMK（コラーゲン様タンパク質(CLP)配列 の繰り返し単位）を有する追加の抗原を合成し、免疫原として使用するためにス カシガイのヘモシアニンに結合した。次に、FCBペプチドおよび、以下に記載す るCLP3.7配列およびPPAS配列のそれぞれに結合するポリクローン性抗血清を上述 のようにして調製した。 ２．タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動 増殖培養物から約109の大腸菌細胞を10,000xgにて５分間遠心することによ りペレット化した。細胞ペレットを100から500μlの２Ｘサンプルバッファー（1 00mM Tris-HCl pH6.8、4％SDS、10％β-メルカプトエタノール、60％グリセロー ルまたはショ糖）に再懸濁し、Tekmar超音波破砕機を用いて30秒間 超音波処理した。サンプルをおよそ５分間煮沸し、細胞溶解液の20から100μlを SDS-ポリアクリルアミドゲル(7.5から16％ w/v)にのせた。ゲルはLaemmli、Natu re(1970)227:680-685の方法に従って調製した。ゲル中のタンパク質を10％メタ ノール、7.5％酢酸中の２％クマシーブリリアントブルーで１時間染色し、10％ メタノール、7.5％酢酸で一晩脱染した。 ３．タンパク質発現解析 30℃で増殖させた一晩培養物を使用して250mlフラスコにいれた50mlのLB培地 に接種した。カナマイシンを最終濃度50μg/mlの濃度で加え、培養物を30℃にて 振盪しながら（200rpm）インキュベーションした。培養物が0.8のOD600に達した とき40mlを予め42℃に加温しておいた新しいフラスコに移し、同じ温度でおよそ ２時間インキュベーションした。培養物（30℃および42℃）を氷で冷却し、OD60 0 を測定した。細胞を遠心により集め、1.0 OD600アリコートに分け、適当な抗体 を用いたウェスタン解析を行うために利用した。 ４．ゲル中のタンパク質のイムノブロッティング タンパク質の泳動後、ポリアクリルアミドゲルから側面のガラスのうち１枚を 外した。ゲル表面を転写バッファー（25mM Tris-HCl、192mMグリシン、20％メタ ノール）で湿らせた。１枚のニトロセルロースペーパー(Sartorius、SM11307)を 転写バッファーで飽和させゲルに上層した。フィルターとゲルの間の気泡を取り 除いた。ゲルおよびニトロセルロースフィルターを転写ユニット中に業者(BioRa d)が指定するように設置した。転写は200mAで３〜４時間行わせた。次に、ニト ロセルロースフィルターを取り出し、Amido-Schwartz(0.05％アミドブラック、4 5％脱イオン水、45％メタノール、10％酢酸)で３分間染色し、H2O中で脱染した 。フィルターを室温で少なくとも10分間「BLOTTO」（５％w/v脱脂乳、50mM Tris -HCl pH7.4、0.9% w/v NaCl、0．2％ w/vナトリウムアジド）中でインキュベー ションした。フィルターを0.5xBlotto（2.5％脱脂乳、50mM Tris-HCl pK7.4、0. 9％ NaCl、0.2％ナトリウムアジド）で適当に希釈した（1:50から1:500）血清中 におき、室温にておよそ16時間ゆっくりと振盪した。このフィルター をTSA（50mM Tris-HCl pH7.4、0.9％ NaCl、0.2％ナトリウムアジド）で５回交 換しつつ、１時間の間洗浄した。ブロットを、1x107cpmの125I-プロテインＡを 含む0.5xBLOTTO溶液中に置き、室温にて２時間振盪した。フィルターを最小量の TSAで７回交換しつつ２時間洗浄し、脱イオン水で１回リンスして風乾した。 125I-プロテインＡ検出法の代わりも使用した。その方法はホースラディッシ ュペルオキシダーゼ(HRP)で活性化される化学蛍光シグナルに依存するものであ る。化学蛍光試薬はAmershamおよびDupon NENのような、いくつかの業者から容 易に入手できる。ウェスタンブロットを調製し、BLOTTOでブロッキングした。た くさんの方法がHRPレポーター酵素を導入するために使用された。それらには、 例えば、ハプテン／抗-ハプテン-HRP、ビオチン化抗体／ストレプトアビジン-HR P、ヤギまたはマウス抗-ウサギIgG-ビオチン化／ストレプトアビジン-HRP、また はヤギまたはマウス抗ウサギIgG-HRPのような２次レポーターが含まれる。これ らの試薬はBioRadやAmershamのような種々の供給源から購入し、ときにはビオチ ン化抗体は我々の研究室においてVector Laboratories社、Burlingame、CA(カタ ログ番号SP-1200)のBiotin NHSを使用して製品に添付の方法に従って調製した。 以下はタンパク質ポリマーの発現を検出するために使用した方法の例である。 ブロットをBLOTTOで希釈した(1:7500)ビオチン化ヤギ抗-ウサギIgG(BioRad)を 含む15mlのBLOTTO溶液中に置き、室温にて２時間緩やかに振盪した。フィルター をTSA（50mM Tris-HCl pH7.4、0.9％ NaCl、0.2％ナトリウムアジド）を３回交 換しながら30分間洗浄した。次にブロットを室温にて20mlのTBS（100mMTris塩基 、150mM NaCl、pH7.5）HRP-ストレプトアビジン（Amersham）(0.1％Tween20を含 むTBSで1:1000に希釈)中で撹拌しながら20分間インキュベーションした。次にブ ロットを0.3％ Tween20を含むTBS中で各５分間ずつ３回洗浄し、次に0.1％ Twee n20を含むTBS中で各５分間ずつ３回洗浄した。次にブロットを現像液＃１および ＃２（Amersham）の等量混合物12ml中でゆるやかに撹拌しながら１分間インキュ ベーションした。ブロットを現像液から取り出しオートラジオグラフにかけた。 ５．アミノ酸分析 アミノ酸組成はHenricksonとMeredith(1984)のPTC誘導体化法によって決定し た。タンパク質サンプルを108℃で常時沸騰している5.7NのKClで減圧下２４時間 加水分解した。PITCと反応させた後、アミノ酸誘導体をHewlett Packard 1090ま たはWaters 600Eシステムおよび0.1M NH4OAC pH6.78中0−50％のアセトニトリル 直線勾配を与えたSupelco C18カラム(4.6mm ｘ 25cm)を移動担体として用いたHP LC逆相クロマトグラフィーにより254nmにて検出した(Henrickson、R.L.とMeredi th，S.C.（1984）Amino Analysis by Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography．Anal．Biochem，137:65-74)。 ６．アミノ酸配列解析 N-末端アミノ酸配列はApplied Biosystemsモデル470A気相タンパク質シーケン サーを用いた自動エドマン分解によって決定した。PTHアミノ酸誘導体はHewlett Packard 1090またはWaters 600EシステムとAltex C18カラム（2mm ｘ 25cm）に より複合勾配バッファー系で解析した。 ７．ペプチド合成 合成ペプチドはApplied Biosystemsモデル430Aペプチド合成機で業者が提供す る標準的な対称無水物化学を用いた固相合成によって調製した。各ステップのカ ップリング収率をSarinら(1981)の定量的ニンヒドリン法によって決定した。合 成ペプチドを固相支持体から切り離し、アミノ酸ブロック基を無水HFを用いて除 去した(StewartとYoung、1984)。粗ペプチドをSephadex Ｇ−50のクロマトグラ フィーにより脱塩した(Sarin，V.K.，Kent,S.B.H.，Tam，J.P.およびMerrifield ，R.B.(1981)，Anal．Biochem，237:927-936、Stewart，J.M.とYoung，J.D.(198 4)，Solid Phase Peptide Synthesis，Pierce Chemical Company，Rockford，IL ．pp85-89)。合成DNA法 １． In vitro DNA 合成 N,N-ジイソプロピルホスホラミダイトまたはβ-シアノエチルホスホラミダイ ト、制御細孔ガラスカラム(controlled-pore glass columns)およびすべての合 成試薬はApplied Biosystems社、Foster City、Californiaから入手した。 合成オリゴヌクレオチドは、Applied Biosystemsモデル380Aまたは381A DNA合 成機で10倍過剰の保護ホスホラミダイトと合成支持カラムに結合した0.2または １μモルのヌクレオチドを用いてホスファイトトリエステル法によって調製した 。合成に使用した化学作用はこの合成機の使用に関して推奨されているプロトコ ルであり記載されているものである(Matteucciら、Journal Amer．Chem．Soc.,1 03:3185-3319(1981))。脱保護および固相支持体からのオリゴマーの切り出しはM cBrideら、Tetrahedron Letters，24:245-248(1983)に記載され、かつ、Applied Biosystems社から提供されている標準的手順に従って行った。Applied Biosyst ems社が推薦するように(1984)除去した保護基の光学的濃度によって測定した合 成の反復収率は、97.5％よりも大きかった。 粗オリゴヌクレオチド混合物を、1984年11月９日のApplied Biosystems社プロ トコル（ユーザーニュースNo.13）に記載され、「合成オリゴヌクレオチドの評 価と単離(Evaluating and Isolating Synthetic Oligonucleotides)」(1992)中 で改定されたように調製用ゲル電気泳動によって精製した。アクリルアミドゲル 濃度はオリゴマーの長さによって10から20％まで変えた。精製したオリゴマーは UVシャドーイングによって確認し、ゲルから切り出しクラッシュ・アンド・ソー ク法（Smith，Methods in Enzymology，65:371-379(1980)）によって抽出した。 100塩基よりも長いオリゴヌクレオチドのDNA合成のために、381A DNA合成機に ついてApplied Biosystems社が推薦するプロトコルから合成サイクルを変更した 。使用する試薬は全て新しいものとした。全ての試薬はアセトニトリル（BUrdic k and Jacksonカタログ番号017-4、水含量0.001％未満）と2000Å孔サイズカラ ム(Glen Research)を除いてApplied Biosystems社から供給された。オリゴの長 さのために、合成の間に空になった試薬ビンを交換できるように合成途中 に停止をはさむ必要があった。この途中停止はサイクルの最初のステップで行い 、停止はできるだけ短く保った。各合成サイクルの最初の、脱トリチル後のTCA による洗浄は、推奨される時間の約２倍から３倍に増加させた。キャッピングの ために割り当てられている時間も欠落誤配列(truncated failure sequences)を 抑えるために増加させた。合成後、脱保護を55℃にて６時間行った。脱塩した後 、合成DNAをPCRを用いて増幅した。 ２．DNA のシーケンシング DNA配列は以下の方法によって決定した。注目する領域を含む断片をM13mp18ま たはM13mp19のマルチクローニング部位にクローン化し、１本鎖DNAを調製し、文 献に記載されているように(Sangerら、1977;Maniatisら、1982;Norranderら、19 83．Gene 26:101-106;Sangerら、1977 Proc．Natl．Acad．Sci．USA．74:5463-5 467およびBiggin 1983 Proc．Natl．Acad．Sci．USA．80:3963-3965;Sangerら、 1978，FEBS Letters，87:101-110)35S-デオキシアデノシン5'（α-チオ）三リン 酸(New England Nuclear)をラベルとして用いたプライマー伸長法によってシー ケンシングした。いくつかの場合には、プライマーを伸長するために逆転写酵素 (Molecular Genetics)を使用し、Zagurskyら、Gene Anal．Techn.(1985)2:89-9 4で用いられたジデオキシ：デオキシヌクレオチド三リン酸の比を使用した。32Pまたは35Sのどちらかでラベルしたデオキシアデノシン三リン酸をこれらの 反応で使用した。いくつかのG-Cリッチ配列において現れる圧縮人工物はデオキ シグアノシン三リン酸をＧ反応から除き、デオキシイノシン三リン酸(P-LBioche micals)を最終濃度37.5μMで代わりに使用することによって克服した。他の混合 物においては、Ｇ反応中のジデオキシGTPは0.5mMとした。全てのシーケンスは８ Ｍ尿素を含む６または８％のポリアクリルアミドゲルで泳動した(Sangerら1978) 。シーケンシングに使用したプライマーはP-L Biochemicals社から購入した。デ ータの保存と解析はIBMパーソナルコンピューター用にはDNAstarおよびInternat ional Biotechnologiesおよび、アップルMacintoshパーソナルコンピューター用 にはDNA Strider、DNA Inspection IIe、またはDNAidのソ フトウエアを使用した。 ３．クローン化DNAのin vitro変異導入 変異を導入する配列を含むプラスミドDNA（１μg）を２つの別々の反応で消化 した。１つの反応は対象配列のすぐ側方の部位で切断する、１または２種の制限 エンドヌクレアーゼを含むものである。第２の反応では、DNAを変異させる配列 から遠い部位で１度だけ切断する制限エンドヌクレアーゼでDNAを消化した。第 １の反応で生成されたDNA断片をアガロースゲル電気泳動で分離し、変異させる 配列を欠く大きな断片を切り出して精製した。第２の反応によるDNA、第１の反 応による大きな断片および変異配列を有する20〜30塩基長の合成オリゴヌクレオ チドを分子比１：１：250で混合した。この混合物を、25〜100μlの100mM NaCl 、6.5mM Tris-HCl pH7.5、8mM MgCl2および1mM β-メルカプトエタノール中100 ℃にて３分間加熱して変性させた。変性混合物を以下のように徐々に温度を下げ ることによって再アニーリングさせた：37℃30分間、4℃で30分間、および0℃で 10分間。反応に0.5mMデオキシリボヌクレオチド三リン酸、1mM ATP、400単位のT 4 DNAリガーゼと５単位の大腸菌DNAポリメラーゼ大断片を添加し、15℃にて12〜 16時間インキュベーションした。次に反応混合物で大腸菌を形質転換し抗生物質 耐性コロニーを選抜した。 ４．２本鎖プラスミドDNAのジデオキシDNAシーケンシング プラスミドDNAは先に記載されたように調製した(大腸菌からのプラスミドDNA の調製、小スケール、Maniatisら)。プライマーは前に記載したようにDNA合成機 を用いて合成し、M13シーケンシングについて上述したような手順に従ってプラ スミドDNAにアニーリングした。シーケンシング反応はシークエナーゼ（Sequena se）(米国biochemical)を用いて行い、その条件は供給者が推奨するものとした 。全てのシーケンスは上述したようにポリアクリルアミドゲルで流した。 ５．PCR 増幅 行った。およそ1μlの各プライマーDNAを１ｘPCRバッファー(Perkin Elmer社か ら10x溶液として供給される)、200μMの各dNT、5UのAmpliTaq、およびいろいろ の濃度の標的DNAに加えた。増幅はPerkin ElmerDNAサーマルサイクラーモデル48 0内で、以下のステップサイクルを各12分間、30サイクルで行った：95℃、62℃ 、および72℃。種々の反応のアリコートを0.5xTaバッファー中で1.5％の低融点 アガロースアガロースゲル電気泳動により解析した。望みのバンドを与える反応 混合物をプールし、12,000Rpmにて30秒間Sorvall Microspin24S内でスピンしてU ltra-Probindフィルターユニット(Millipore)を通してAmpliTaq酵素を除去した 。次にMicrocon-30フルター(Amicon)を使用して、12,000RPMにて６分間微量遠心 機内でスピンしてバッファーをH2Oで２回交換した。塩およびグリセロールは、T EABで平衡化したBio-Spin ６カラム（BioRadより）を用いてSorvall RC5B遠心機 内で、2,500RPMにて４分間HB4ローターを使用して増幅dsDNAから除去した。次に DNAを減圧下で濃縮した。発酵条件 発酵装置は15LのChemap、10Lの運転容量である。培養条件は：温度＝30℃、pH 6.8；pH制御のために2.5MのNaOHを使用。ヘッドスペースの圧力は0.1バールより 低くした。溶存酸素は50％に制御した。空気流量は0.5L/分から20L/分まで変化 させた。振盪速度は200〜1500rpmまで変化させた。この発酵装置に培地Ａで30℃ にて15時間振盪して培養した種菌を10％(v/v)接種した。 培地Ｂ、ＣまたはＤは発酵培地である。10リットル発酵の場合の開始容積は3L 以上とし、１リットル発酵の場合は0.5リットル以上とした。 発酵開始容積が望みの最終容積よりも少ない場合は、炭素源濃度が１％に達し たときに、炭素源濃度をおよそ１％に保つために培地Ｂ，Ｃ，またはＤの濃縮液 （５ｘ）を発酵装置に加えた。 培地が60.0のＯＤ600に達したとき、温度を42℃に10分間上げ、次に39℃また は40℃に２〜３時間下げた。細胞を遠心で集め、必要であれば、処理するまで-7 0℃に凍結した。 タンパク質ポリマーの発現に使用した他の発酵装置は通常は15L MBR、10L運 転容積、または13L Braun Biostat E、8.5L運転容積であった。発酵装置の選択 とその大きさは決定的でない。大腸菌の増殖に使用されるいかなる培地も使用で きる。窒素源はNZアミンから無機塩にまでわたり、使用した炭素源は通常グリセ ロールまたはグルコースであった。全ての発酵はプラスミドの要求（例えば、カ ナマイシン、アンピシリンなど）によって要請される適当な選択条件で行なった 。大腸菌におけるタンパク質ポリマーを発現させるために使用する発酵方法は流 加培養法(fed-batch method)とした。これは組換え生物体の発酵に好んで用いら れる方法だが、他の方法も使用できる。 流加法は生物が指数関数期から定常状態へ移行する細胞増殖ステージを利用す るものである。この移行は多くの場合、必須栄養素の欠乏か、または代謝副産物 の蓄積の結果によるものである。移行が栄養素の欠乏の結果である場合は、系へ の栄養素の添加は細胞分裂を続けさせることになる。運転中１以上の必須栄養素 を発酵容器に加えて増加させることができ、正味の体積は発酵工程の間に増加す る。その結果増殖速度が制御され菌体量と発現レベルを最適化することができる 。培養物中の細胞数が最大に達し、または最大に到達しつつあるときに、使用す る発現系に依存した適当な物理的または化学的シグナルを与えることによってタ ンパク質ポリマー産生を誘導する。蓄積する産生物が最大レベルに達するまで産 生は続くであろう(Fiestchko，J.およびRitch,T.，Chem．Eng．Commun.(1986)， 45:229-240，Seo，J.H.;Bailey，J.E.，Biotechnol．Bioeng.(1986)，28:1590-1 594.)。 表１：培地表 培地Ａ：LB培地 構成 g/L NaCl 10 トリプトン 10 酵母エキストラクト ５ カナマイシン 5x10-3 表１．培地表つづき 培地Ｂ 構成 g/L NH4Cl 4.5 KH2PO4 0.76 MgSO4・7H2O 0.18 K2SO4 0.09 CaCl2 24x10-3 FeSO4・7H2O 7.6x10-3 TE 0.5ml カザミノ酸 25 酵母エキストラクト 5 グルコース 20 カナマイシン 5x103 培地Ｄ 構成 g/l (NH4)2SO4 5.6 K2HPO4 6.7 MgSO4・7H2O 7.8 NaH2PO4・H2O 3.8 EDTA 0.98 微量成分 1ml 酵母エキストラクト又はNZアミン 50 グルコース又はグリセロール 20 カナマイシン又はアンピシリン 5x10-3 実施例２ SlpI 遺伝子のアッセンブルと発現 １．SlpI 遺伝子をアッセンブルするための計画の概要 カイコ(Bombyx mori)によって作られるシルクフィブロインタンパク質中にも っとも頻繁に現れる繰り返し（反復）オリゴペプチド[Lucas,FとK.M．Rudall(19 86)Extracelluar Fibrous Proteins:The Silks．p.475-558，Comprehensive Bio chemistry，第26巻、篇Ｂ中，M.FlorkinとF.H.stotz編集、Elsevier，Amsterdam ]をコードする18bpのDNA配列をin vitroで合成した。２つの１本鎖を合成し、一 緒にアニーリングし、次に得られた２本鎖セグメントをヘッド・トゥー・テイル でマルチマー化して13反復に至り、かつそれを越えるコンカテマーを作製した。 我々が続けて取り扱ったシルクI(silkI)の構造遺伝子はオリゴペプチドGAGAGS（ ここでg=グリシン、ａ＝アラニンおよびs=セリンである）をコードする13の繰り 返しを有していた。この構造遺伝子を「モノマー」と称することにする。我々は SlpI遺伝子の「ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマーおよびヘキサマー 」(26個の繰り返し(SlpI-2)、39個の繰り返し(SlpI-3)、52個の繰り返し(SlpI-4 )、65個の繰り返し(SlpI-5)、および78個の繰り返し(SlpI-6)を有する)を構築し た。各モノマー単位の間には短い中間配列が存在する。アッセンブルは以下のよ うに図解される： ２．「モノマー」SlpI構造遺伝子のアッセンブル 上に示した２つの１本鎖を前述のように合成した。これらの鎖をゲル電気泳動 で別々に精製し、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化し、一緒に混合 してアニーリングさせた。これにより長いコンカテマー中でヘッド・トウ・テイ ルに整列した２本鎖セグメントが生じる。セグメント間のホスホジエステル結合 をT4 DNAリガーゼにより形成させた。DNAポリメラーゼのKlenow断片を用いて端 の接着末端を埋めることによって反応を停止させた。次に平滑末端にした繰り返 しDNAをプラスミドベクターpUC12(Vieraら、Gene 19:259-268(1982))のHincII R EN部位にライゲーションした。ライゲーションしたDNAで大腸菌を形質転換し、 アンピシリン存在下での増殖能について形質転換体を選抜した。可能性のあるク ローンのDNAを解析した：REN消化とゲル電気泳動によるサイズおよび方向に関し て。適切な方向に向いている大きなインサートの単離体についてDNA配列を決定 した。続くマルチマー化のために選択した「モノマー」クローンはオリゴペプチ ドAGAGSGをコードする13回の繰り返しを有しており、これをpSY708と名付けた。 pSY708のDNA配列、推定アミノ酸配列およびSlpIインサートおよび側方領域のREN 部位を表２に示す。３．発現ベクターpSY701の構築 プラスミドpSP65（10μg、Boehringer Mannheim）をAatII RENで消化し、フェ ノール抽出し、エタノール沈殿した。DNAを10μlのH2Oに再懸濁した。このDNAの 1/2をエクソヌクレアーゼIIIで以下の混合物中で消化した：５μgのDNA、10μl の10xエクソヌクレアーゼIIIバッファー（600mM Tris-HCl pH8.0、6.6mM MgCl2 、10mM β-メルカプトエタノール）および９単位のエクソヌクレアー ゼIII、総体積200μl。20μlのサンプルを０、１、2.5、５および7.5分で取り、 直ちに５μgのtRNAと36単位のS1ヌクレアーゼを含むバッファー（30mM酢酸ナト リウム、pH4.5、0.25M NaCl、1mM ZnSO4）100μlで希釈した。インキュベーショ ンを30℃にて45分間行ない、次に15μlの停止バッファー（0.5M Tris pH9.0、12 5mM EDTA、１％ w/v SDS、200μg/ml tRNA）を加えて反応を終了させた。サンプ ルをフェノール抽出し、エタノール沈殿した。再懸濁したDNAをSmaI RENで消化 し、低融点アガロースの１％ゲルで電気泳動した。β-ラクタマーゼ遺伝子、プ ラスミド複製起点およびβ-ガラクトシダーゼプロモーターを含むDNA断片に対応 するゲルバンドをゲルから切り出し、65℃で溶解した。１容積のH2Oを加えた。 各サンプル中（各時点）のDNAをアガロース存在下のライゲーションにより再環 化させた。この反応は８μlの溶解ゲル、２μlのライゲーションバッファー(100 mM Tris-HCl pH7.5、50mM MgCl2、50mM DTT、1mM ATP)、10単位のT4DNAリガーゼ を含むものであり、15℃にて３時間インキュベーションした。JM101コンピテン ト細胞をこのライゲーションしたDNAで形質転換しアンピシリンを含む（40μg/m l）L培地プレート上の増殖によって選抜した。４つの形質転換体からプラスミド DNAを調製した。このDNAをBamHI RENで消化し、DNAポリメラーゼIのKlenow断片 を用いて32P-dGTPでラベルし、PvuIで消化し、次に最も小さい断片をゲル精製し た。１つの形質転換体からの断片をマクサムギルバート法を用いてシーケンシン グした。他の３つのプラスミドの断片をさらにTaqIで消化し同じゲルで電気泳動 した。シーケンシングしたプラスミドはマルチクローニング部位とβ-ラクタマ ーゼのN-末端ATGの上流部との間で融合していた。他の２つのプラスミドのBamHI -TaqI断片の大きさはマルチクローニング部位とβ-ラクタマーゼ遺伝子の４番目 のアミノ酸との間が融合していることを示した。変化したβ-ラクタマーゼのN- 末端領域に対応するアミノ酸配列およびDNAを以下に、pSY701のREN部位の円形マ ップとともに図１に示した。図１のアミノ酸配列は、met-thr-met-ile-thr-pro- ser-leu-gly-cys-arg-ser-thr-leu-glu-asp-pro-his-phe-arg-val-ala-leu-ile- pro-phe-phe-ala-ala-phe-cys-leu-pro-val-phe-ala-hisである。 ４．pSY708 からの「モノマー」SlpIのpSY701への挿入 プラスミドpSY708をHindIIIで消化し、接着末端をDNAポリメラーゼＩのKlenow 断片を用いて埋め、次にBamHIで消化した。プラスミドpSY701をXbaIで消化し、 上述のように埋め、BamHIで消化した。ｐSY708のDNA断片とpSY701の骨格を低融 点アガロースゲルを通して電気泳動により精製し、NACS(BRL)カラムで精製した 。適切な断片を混合し、ライゲーションし、大腸菌JM109を形質転換した。形質 転換した細胞をアンピシリン(40mg/ml)、IPTG（5x10-4M）およびＸgal（20mg/ml ）を含むＬプレート上で増殖させることにより選抜した。形質転換体をそのプラ スミド内容物について解析し、REN部位のマッピングで決定したところによれば 適切な方向でモノマーSlpI-1配列のインサートを有していたため１つ（pSY756） を更なる研究のために選択した。pSY756の全体のDNA配列は決定しなかったが、 インサートとベクターの接続部は上流のXbaIと下流のBamHIに対する正しい制限 配列として確認した。 ５．pSY756 のSlpI遺伝子のマルチマー化 プラスミドpSY708をREN SmaIで消化し、ポリペプチドarg(ala-gly-ala-gly-se r-gly)13thr-leu-glu-asp-pro(R(AGAGSG)13TLEDP)をコードする配列を含むDNA断 片を上記の４のように精製した。プラスミドpSY756をSmaIで消化し、脱タンパク 質し、pSY708からの精製DNA断片とライゲーションした。大腸菌JM109の形質転換 体はアンピシリンを含む培地で選択した。クローンは、pSY708クローンの元々の モノマー配列を２単位(ダイマーpSY882)、３単位(トライマーpSY883)、４単位（ テトラマーpSY915)含んでいた。同様に、ペンタマーおよびヘキサマーも構築し た。これらの全てのプラスミドは遺伝的に安定で、β-ラクタマーゼとの融合と してgly-alaペプチドを作り出す。 ６．β-ラクタマーゼタンパク質と融合したSlpI遺伝子の発現 β-ラクタマーゼとの融合としてのSlpIペプチドの大腸菌における合成をイム ノブロッティング（ウェスタン）解析によって検出した。抗-“Slp”抗体を合成 シルクペプチドに対して生じさせた。β-ラクタマーゼとSlpIとの融合は大腸菌 β-ラクタマーゼに対して生じさせた抗体で検出した。図２に示したように、こ の抗体は大腸菌β-ラクタマーゼに融合したSlpIのダイマーおよびトライマーと 反応する。SlpIインサートはこの酵素のシグナル配列の５番目のアミノ酸の前に 置かれる。β-ラクタマーゼ抗体（図2A）はプロセッシングされない融合タンパ ク質および図中で主要な抗原性バンドとして約28kDalの位置に現れる、プロセッ シングされた成熟酵素の両方を検出する。全てのSlp含有ポリペプチドの移動度 は異常に遅く、これらのタンパク質はゲル上に示されるほど大きくない。 抗-Slp抗体はこれらの融合産物の検出において有用である。図2Bの第２〜第５ レーンはβ-ラクタマーゼとSlpIのダイマー融合物を含む４つの別個のクローン を表し、一方、第６および第７レーンはトライマー融合物を含む２つのクローン からのものである。そこに見られるように、トライマーの抗原性はダイマーより もかなり大きい。先行する実験から、SlpIモノマーのみを含む融合タンパク質は 抗-Slp抗体では全く検出されないことが知られている。トライマーペプチドの抗 原性の増加は、これをβ-ラクタマーゼシグナルペプチドとのプロッセシングさ れた融合物として検出することを可能とする。プロッセシングされた形は図2Bの 第６および第７レーンに約33kDalの位置に見られる。SlpI-3トライマーとβ-ラ クタマーゼシグナルペプチドとの融合に対応するペプチド（gly-ala抗体で検出 ）のみならず、正常にプロセッシングされたβ-ラクタマーゼ成熟酵素（β-ラク タマーゼ抗体で検出）が現れることは、シグナル配列中のSlpI配列の挿入にもか かわらず、この酵素のタンパク質分解性プロッセシングが大腸菌内で起こること を示唆している。 ７．ａ．T7 遺伝子への融合によるSlpI遺伝子の発現 SlpI配列はバクテリオファージT7の遺伝子９との融合、および、遺伝子10との 融合タンパク質としても発現されている。構築は図３に図解した。プラスミドpS Y915（SlpI-4テトラマーを含む）をREN SalIで完全消化、およびBamHIで部分消 化した。SlpI-4テトラマーを含むDNA断片を精製し、次に、REN SalIとBamHIで消 化しておいたプラスミドpSY114（Promega Biotech社のpG2）にクローニングした 。この中間体プラスミドから、テトラマーインサートSlpIをREN AccIとEcoRIで取り出した。この断片を次にEcoRIとAsuIIで消化したpSY663（完 全なT7遺伝子９配列を有するpBR322；Studierら(1986)のpAR441）にクローニン グした。得られたプラスミド中で、SlpIテトラマーは遺伝子９のC-末端近くで遺 伝子９翻訳リーディングフレームに融合している。このプラスミドを、IPTG誘導 性β-ガラクトシダーゼプロモータの転写制御下にあるT7 RNAポリメラーゼ遺伝 子が染色体中に挿入されている大腸菌株Ｏ-48（Studierら(1986)のHMS174(λDE3 )株）を形質転換するために使用した。この構成では、SlpI-4配列の発現はT7 RN Aポリメラーゼの産生に依存しており、T7 RNAポリメラーゼ自体はIPTG誘導性β- ガラクトシダーゼプロモータに制御されている。図4Bおよび4Cに示したように、 これらの細胞をIPTGで誘導すると遺伝子9/SlpI融合遺伝子のタンパク質産物が合 成され、合成Slpペプチドに対する抗体で検出される。融合産物はゲル中で82kDa lの大きさであるかのごとく移動する。予想される大きさはわずかに65kDalであ る。異常な移動度は異常なアミノ酸組成（グリシンとアラニンに富む）に特徴的 であり、全てのSlp含有産生物に見られる。 同様な方法で、プロモーター領域およびT7遺伝子10の最初の13アミノ酸を含む プラスミドpSY638（StudierのpAR2113）をREN BamHIで消化し、DNAポリメラーゼ のKlenow断片で埋め、次にREN EcoRIで消化した。直線化したこのプラスミドへp SY633のSlpI-4テトラマーを含むAsuII-EcoRI断片をクローニングした。このライ ゲーションはT7遺伝子10の13番アミノ酸に続くシルクテトラマーのインフレーム 融合を作り出す。N-末端13アミノ酸は大きなSlpIタンパク質の小さな部分に過ぎ ないので、この最後の融合産物は更なるプロセッシングなしでスピニングに使用 してもよい。融合産物は約30kDalの大きさであるが、異常な移動度を有し、より 大きいかのごとく(50kDal)移動する。これは図4Aに示した。 β-ラクタマーゼ遺伝子中にT7発現系とは逆方向にカナマイシン耐性遺伝子を 挿入することによりプラスミドpG9/SlpI-4およびpG10/SlpI-4を更に改良した。 従って、T7系からのいかなる低レベル発現もβ-ラクタマーゼ活性の上昇をもた らすことがない。そのような活性はプラスミド保持の選抜のために添加されてい る培地中のアンピシリンを消滅させる。アンピシリンがなくなると、プラスミド は培養物から失われた。カナマイシン耐性遺伝子はこの問題を回避し、とくに大 スケール培養のためのT7発現系の重要な改良を意味するものである。カナマイシ ン耐性遺伝子（最初Tn903に由来）をプラスミドpUC4K(Veira，J.とJ.Messing(19 82)Gene 19:259-268)からHincII断片として単離した。pG10/SlpI-4およびカナマ イシン耐性遺伝子を含むこのプラスミドをpSY997と呼ぶ。 ７．ｂ．SlpI-4 の発酵および精製 pSY997を有する大腸菌株Ｏ-48を37℃にてChemapまたはBraun発酵装置を用い、 10LのLB中でＯＤ（Klett単位）が300まで（3x109細胞/ml）まで増殖させた。次 に、3.5mM IPTGを添加してT7系を誘導した。150分後、Milliporeフィルターユニ ット（Pelliconカセットシステム、分子量100,000カットオフフィルター）を用 いて10xに濃縮した。この細胞懸濁液を、処理するまで-70℃で凍結した。 細胞懸濁物を水槽中42℃にて溶かし、フレンチプレスで溶菌し、ライセートを 25℃にて125,000xgで１時間スピンした。澄んだ上清を室温にて15分間DNase(250 μm/ml)で処理し、次に45μm滅菌フィルターを通して濾過した。濾液体積を測り 緩やかに撹拌しながら氷中でインキュベーションした。濾液の1mlあたり231mgの 硫酸アンモニウムを45分間以上かけて添加した。硫酸アンモニウム10gごとにpH を中和するために1mlのNaOHを添加した。 連続して撹拌しながら２時間後、混合物を9,000xgで10分間スピンした。ペレ ットを蒸留水で元の濾液体積の1/10に再懸濁した。遠心と再懸濁を３回繰り返し た。ペレットを蒸留水で元の濾液体積の1/10に再懸濁した。サンプルはタンパク 質濃度、アミノ酸組成およびタンパク質配列に関して標準的な方法で解析した。 これは産生物を得るためのいくつかの方法の一つである。この方法は90％よりも 高純度のSlpI-4を生じさせる。アミノ酸素組成は、期待したようにほとんど専ら gly,alaおよびserであり、N-末端アミノ酸配列は遺伝子10のリーダー配列であっ た。 ８．枯草菌(Bacillus subtilis)におけるT7 RNAポリメラーゼの制御された発現 プラスミドpSY558（Studierら、1986のpAR1151）のT7 RNAポリメラーゼ遺伝子 （T7遺伝子１、T7ヌクレオチド3128〜5845）のコード配列をクローン化DNAのin vitro変異導入によって改変した。我々は位置3171に制限エンドヌクレアーゼNde Iの認識配列を挿入した。前述したように合成したオリゴデオキシヌクレオチド を用いて、T7遺伝子１配列をその天然の配列であるTAAATGを、改変した配列、CA TATGに変えた。 同様に、プラスミドpCB1291(Rosenblumら、J.Bacteriology 148:341-351(1981 ))からの枯草菌遺伝子spoVGの上流制御配列をin vitro変異導入によって、位置8 5において(Johnsonら、Nature，302:800-804(1993))NdeI切断部位を含むように 改変した。次にspoVG遺伝子の上流制御配列を、新しいNdeI切断部位を介してT7 RNAポリメラーゼ遺伝子のコード配列とライゲーションした。大腸菌HB101を形質 転換した後、個々のアンピシリン耐性単離菌のプラスミド内容を制限マッピング で調べた。正しい構築物をpSY649と名付けた。 spoVG:T7 RNAポリメラーゼ融合遺伝子を含むプラスミド(pSY649)を、枯草菌で 働くクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むように更に改変した。最初に、プラ スミドpGR71-P43(Goldfarbら、Nature，293:309-311(1981))から約1200塩基対の NdeIからSalIの断片を単離した。この断片は枯草菌のP43プロモーターを含んで おり、その隣にTn9由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺 伝子を含んでいる。Klenow DNAポリメラーゼ反応を用いて全ての接着末端を埋め た後、この断片をpUC13(Veieraら、Gene，19:259-268(1982))のマルチクローニ ング部位内のXbaI部位に挿入した。次に使用するため、アンピシリンおよびクロ ラムフェニコールに耐性の形質転換体を選抜した。正しいプラスミド構築物をpS Y630と名付けた。P43プロモーター配列に融合したクロラムフェニコールアセチ ルトランスフェラーゼを含む、プラスミドpSY630のSmaIからHincIIのエンドヌク レアーゼ切断断片をゲル精製し、T4 DNAポリメラーゼで処理しておいたプラスミ ドpSY649のPvuI部位に平滑末端ライゲーションした。次に、得られたプラスミド pSY856で枯草菌1168を形質転換した。プラスミドpSY856は枯草菌中で自律的に複 製できないため、クロラムフェニコール耐性の安定形質転換体はプラスミドの枯 草菌染色体への組込みの結果生じている筈である(Ferr ariら、J.Bacteriolory，154:1513-1515(1983))。組込みは、相同組込みによっ て容易になり、バクテリア染色体のspoVGまたはP43座において最も起こりやすい (pSY856はこれらの２つの部位でのみ枯草菌染色体と相同なDNA配列を含んでいる )。得られた菌株「BIPoL」を、選択マーカーの安定性を決定するためクロラムフ ェニコールの存在下および非存在下で増殖させた。T7ポリメラーゼの発現が達成 され、菌株の増殖または生存率に明らかな効果を全く与えなかった。 ９．ａ．枯草菌株BIPoLにおける、プラスミドに保持された標的遺伝子の発現 抗生物質カナマイシンに対する耐性をコードする遺伝子を含む、黄色ブドウ球 菌(Staphylococcus aureus)のプラスミドpUB110(Laceyら、J.Med．Microbiology ，7;285-297，1974)をBIPoL株の増殖-制御spoVG:T7 RNAポリメラーゼ遺伝子の発 現をテストするために使用した。T7遺伝子９プロモーター配列を含むT7 DNAのEc oRI-BamHI断片（位置21,402から22,858）をプラスミドpAR441(Studierら、1986) から精製した。このDNA断片をpUB110中のEcoRIとBamHI制限エンドヌクレアーゼ 部位の間にライゲーションした。得られたプラスミド、pSY952はカナマイシン耐 性遺伝子と同じ方向にT7特異的プロモーターを含んでいる。プラスミドpSY952で 枯草菌1168とBIPoLを形質転換し、これらの菌株を、プラスミド由来カナマイシ ン耐性遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現レベルに関して解析した 。1168、pUB110を有する1168、pSY952を有する1168、BIPoL、pUB110を有するBIP oL、およびpSY952を有するBIPoLの増殖培養物からおよそ109個の細胞を、増殖サ イクルまたは胞子形成サイクルの幾つかの時点で取り出した。これらの細胞サン プル中のタンパク質を処理してポリアクリルアミドゲル電気泳動によって解析し た。 spoVGプロモーターからの転写速度は細胞密度の関数として増加し、初期胞子 形成の間に最大に達するので、培養中、培養物が胞子形成に入るにつれpSY952を 含むBIPoL株における標的タンパク質の急速な蓄積が期待される。結果は、培養 物が定常状態に近づき、定常状態に入るにつれて分子量34kDalのタンパク質が大 きく増加することを示した。タンパク質のサイズはpSY592にコードされるカナマ イシン耐性遺伝子産物に予想されるサイズと一致した(Sadaieら、J.Bact eriology,141:1178-1182(1980))。このタンパク質はBIPoLまたはpSY952を含む11 68(spoVG-制御T7 RNAポリメラーゼ遺伝子を欠く)またはT7プロモーター配列を欠 くpUB110を有するBIPoLにおいては存在しない。pSY952を有するBIPoLにおいて増 殖24時間後の、標的タンパク質の最大蓄積レベルは、デンシトメーターで測定し たところ全細胞タンパク質の20％であった。 ９．ｂ．枯草菌におけるSlpI-4の発現 pG10SlpIをREN EcoRIで消化した。Klenow DNAポリメラーゼ反応を用いて接着 末端を埋めた後、このDNAをREN BglIIで消化した。プラスミドpSY662をREN SmaI およびBamHIで消化した。２つのプラスミドを低融点アガロースを通して電気泳 動で精製し、NACS(BRL)カラムで精製した。pG10SlpIのDNA断片をpSY662の骨格に ライゲーションし、アンピシリン（40μg/ml）を含めて大腸菌内へ形質転換した 。形質転換体をプラスミド内容に関して解析し、１個（pSY662/G10/SlpI-4）を 更なる研究のために選択した。 枯草菌BIPoLのコンピテント細胞をpSY662/G10/SlpI-4で形質転換し、37℃にて 振盪しながら90分間インキュベーションした。形質転換混合物を10μg/mlのテト ラサイクリンを含む新しいLBで1:100に希釈し、振盪しながら37℃にてインキュ ベーションした。サンプルをとり、同数の細胞を溶菌し、SDS-PAGEによる分離の ためゲルにのせた。遺伝子10/SlpI-4融合タンパク質の合成を検出するために、 抗-Slp抗体を用いてイムノブロット解析を行なった。 枯草菌におけるSlpI-4ポリペプチドの発現は、ポリアクリルアミドゲルからニ トロセルロースフィルターへ細胞タンパク質を転写した後に、抗-Slp抗体との血 清反応性によって検出した。CNBrで細胞タンパク質を徹底的に処理することによ り、血清反応性タンパク質がSlpI-4遺伝子産物であることを確かめた。CNBr処理 はメチオニン残基の後で切断するはずであるが、SlpI-4はメチオニンを欠くため インタクトで残るであろう。CNBr処理はクマシーブルー色素で染色され得るタン パク質の98％よりも多くを消滅させた。かつ、メチオニンを欠くタンパク質につ いて期待したように、SlpI-4はインタクトで残り、なお抗-Slp血清と反応した。実施例３ SlpIII 遺伝子のアッセンブルと発現 １．SlpIII 遺伝子アッセンブルのための計画の概要 合成遺伝子SlpIIIはSlpI遺伝子に類似で、カイコ、Bombyx moriによって作ら れるシルクフィブロインタンパク質の結晶質領域に類似のタンパク質をコードし ている。SlpIIIは規則的な間隔（約50残基）でアミノ酸チロシンを含むが、SlpI マルチマーはこれを含まないため、SlpIIIはシルクフィブロイン分子により近い 。SlpIII遺伝子はより小さな部分からアッセンブルされる。最初に、長さ約60bp の２本鎖DNAの断片を３つ、化学的に合成した。各断片をバクテリオファージH13 に挿入することによってクローニングし、DNA配列を確かめた。次にこれらの断 片をベクターから外し、特定の順序で一緒に結合した。約180bpのこの結合物をS lpIII「モノマー」と名付けた。次に「モノマー」を特定の順序で結合してSplII Iのダイマー、トライマー、テトラマーなどを作った。次にマルチマーを、SlpII Iタンパク質を検出するためプラスミド発現ベクターに直接クローニング、また は、最初にアダプタープラスミドにクローニングした。アダプターへのSlpIII D NAの挿入はさらなる遺伝子操作を可能とし、これは後で更に記載する。アッセン ブルの概略は以下のように図解される： ２．2 本鎖DNA断片の合成 アッセンブルの概略は以下のように図解される： SlpIII遺伝子の３つの断片DNAおよび対応するアミノ酸配列を表３に示す。 二本鎖DNA配列を5'→3'方向で示す。配列によってコードされたアミノ酸(g=グ リシン、a=アラニン、s=セリン、y=チロシン)を各セクションのすぐ下に示す。 制限エンドヌクレアーゼで切断する認識配列を各セクションの上に示す。 上記の６種の一本鎖を合成した。合成後、DNA鎖を精製し、相同鎖をアニール した。約1μl(0.5μg)の各鎖を2μlの10×AA(説明)緩衝液及び16μlの滅菌脱イ オン水と1.5mlのポリプロピレンエッペンドルフチューブ内で混合した。そのチ ューブを沸騰水浴(1リットルのビーカー中500ml)に10分間入れてからそのビーカ ーをホットプレートから取り出し、ベンチ上で室温まで冷却した。これには約1 〜2時間必要であった。 ３種の二本鎖セクションの各々をM13mp18へ別々にクローン化した。セクショ ン１をマルチクローニング部位のSmaIとBamHIの制限部位間に結合した。セクシ ョン２をBamHIとPstIの部位間に結合した。セクション３をPstIとHindIIIの部位 間に挿入した。各クローンは、M13mp18.1、M13pm18.2、M13mp18.3である。各ク ローン化セクションのDNA配列を求めた。正しいDNA配列を有する代表的な各セク ションを回収し、次の工程:“モノマー”の構築の材料とした。 3．SlpIII “モノマー”のアッセンブル: M13クローンを制限酵素で消化することによりDNAセクション２と３を単離した 。セクション２については、M13mp18.2をBamHIとPstIで消化し、セクション３に ついては、M13mp18.3をPstIとHindIIIで消化した。２種のセクションを精製し、 最初にBamHIとHindIIIで消化したM13mp18.1と同モル量で共に混合した。T4 DNA リガーゼを加えて1-2-3の順序に相同オーバーラップ端を結合した。付着末端の ハイブリッド形成特異性のために、３種のセクションはこの順序でのみ効率よく 結合した。M13mp18.1.2.3と名付けた構築物におけるクローン化“モノマー”のD NA配列が正しく上記２に示される通りであることが求められた。 4．SlpIII の“モノマー”のマルチマー化: 多量の“モノマー”構造遺伝子を調製するために、“モノマー”をまずプラス ミドベクターpUC12にサブクローン化した。M13mp18.1.2.3をEcoRIとHindIIIの制 限酵素で消化した。SlpIII“モノマー”をゲル精製し、EcoRIとHindIIIで消化し たpUC12に結合した。得られたプラスミドDNAを調製し、BanI RENで消 化することによりベクターから“モノマー”が遊離し、断片をゲル精製した。 マルチマーを作成するために、“モノマー”DNAとBanI端を連結反応で結合し た。非回文式BanI末端認識配列は頭-尾順序でのみ結合が可能である。マルチマ ー化の程度をゲル電気泳動とDNAを臭化エチジウムで染色することによりモニタ ーする。この方法で20単位を超えるマルチマーを得た。 5．SlpIII マルチマーのクローニング: プラスミドpCQV2(Queenら，J．Appl．Mol．Gen.，2:1-10(1983))をEcoRIとBam HIの制限エンドヌクレアーゼで消化し、約900bpの断片を精製した。このDNA断片 は、バクテリオファージλcI-857リプレッサー遺伝子、密接に結合した右方プロ モーター、PR、及びcro遺伝子の開始部分を含む。プラスミドpSY335(Ferrariら ，J．Bacteriology，161:556-562(1985)にpJF751として記載されている)をEcoRI とBamHIの制限酵素で消化し、続いて約900bpのpCQV2のDNA断片に結合した。この 構築から得られたプラスミド、pSY751は、37℃と42℃でβガラクトシダーゼ遺伝 子を発現するが30℃では発現しない(図８)。 この方法では、まずSlpIII遺伝子を中間プラスミド内の“アダプター”配列へ クローン化し、次に発現系へサブクローン化する。そのアダプター配列は次の有 用な特徴がある:BanI REN中心部位がユニークである、BanIの両側の３つのREN部 位がユニークである、メチオニン、アスパラギン酸-プロリンか又はアルギニン のアミノ酸におけるタンパク質切断情報をコードしている及びサイズが小さい。 BanI部位は、BanI端を有するSlpIIIマルチマーの挿入点である。 アダプターをアプライドバイオシステムズ380Aシンセサイザーで合成し、M13m p18においてクローン化し、DNA配列を証明した。次に、アダプターをBanI REN部 位のない特別に構築したプラスミドベクターへサブクローン化した。受容体プラ スミドを次のように作成した。プラスミドｐJH101(Ferrariら，1983)をAhaIII制 限酵素で部分的に消化し、結合した。大腸菌HB101の形質転換細胞をクロラムフ ェニコール(12.5mg/ml)を含む培養液について選択した。数種の単離物を制限分 析した後、１種のプラスミド、pSY325を選んだ(図７)。このプラスミドは、クロ ラムフェニコール耐性遺伝子とpJH101の複製開始点(pBR322由来)のみ含む。XhoI Iで完全に消化した後、pSY325をゲル精製アダプターと結合した。結果はア ダプター-プラスミド、pSY937であった。新しいpSY937 REN部位を確認した。 SlpIIIマルチマーをpSY937のBanI部位へクローン化した(図７)。正のクローン をコロニーハイブリッド形成及びハイブリッド形成用DNAプローブとしてSlpIII のセクション１の小さい方の鎖で同定した(表２に示されるプローブ配列)。挿入 したマルチマーのサイズのゲル電気泳動により正のクローンを確認した。更に、 フランキングアタプター領域内のREN部位を用いてSlpIII配列を発現プローブの 特定の場所へサブクローン化した。 SlpIIIタンパク質は次のアミノ酸組成を有した。 (fm)は開始コドンを意味する。SlpIII 発現ベクター プラスミドDNA ｐSY1086は19反復のSlpIIIのを含むpSY937誘導体である。この プラスミドDNAをNruIとPvuIIで消化し、断片をアガロースゲル電気泳動で分離し た。次に精製したSlpIIIマルチマーをPvuIII RENで消化したプラスミドpSY751に おいてクローン化した。数種のクローンを分析し、発現実験とSlpIII精製に用い られる１種(pSY1008)を選んだ。 pSY1008のアンピシリン薬剤耐性遺伝子をpSY1010由来カナマイシンマーカー(p SY633をDraIとSspIで消化し、pUC4KのHincII消化で得られたKanRを挿入すること により作製した)で置換し、それ以後のプラスミドをpSY1186と呼んだ。プラスミ ドpSY1186のSlpIII部分をBanIで取り出すことにより新しいプラスミド、pSY1262 を作成した。このプラスミドは、モノマーの重合で得られたBanI端を含む断片の 直接の連結反応を可能にするユニークなBanI部位を含む。このプラスミドを用い て次のタンパク質:SELP1、2、3及びSlp4の挿入断片を含むプラスミドを作成する 。SlpIII 細胞培養物の作製と精製 大腸菌を次の培養液中で培養する。 培養液C g/l 酵母エキストラクト 20 カサミノ酸 20 ペプトン 20 ゼラチンペプトン 20 KH2PO4 2 K2HPO4 2 Na2HPO47H2O 2 グルコース 2 アンピシリン 0.1 30℃で増殖した一夜培養物(500ml〜1リットル)を用いて500リットルの発酵槽 に含まれる375リットルの培養液に播種した。発酵条件は、100rpmのタコメータ ー読み取り、5psiの容器逆圧及び50％より大きい溶存酸素を維持する170リット ル/分の空気流量が含まれる。 培養物がOD6501.0と2.0に達したときにグルコース(1g/l)とアンピシリン(0.05 g/l)を発酵に加えた。培養物がOD6502.0に達したときに温度を42℃まで10分間上 げ、次に38℃まで２時間下げた。次に、培養物を10℃に冷却し、連続遠心分離機 で細胞を収集し、処理されるまで-70℃で冷凍した。２つの別の発酵からの収量 は細胞の湿重量7.3kgと5.2kgであった。 他の培養液も用いられ、異なるプラスミドと共に種々の選択条件が加えられる (即ち、アンピシリンをカナマイシン使用に置き換える)ことは留意されなければ ならない。これらの条件を実験室規模の発酵(10リットル容量)で用いた。細胞溶解 方法1. 細胞を解凍し、50mMトリス-HCl pH7.0、1mM EDTAに1kg湿重量/6リット ルの濃度まで懸濁し、8000psiのAPRゴーリン細胞破壊機を２回通して破壊した。 この溶解手順中、細胞を氷浴を用いて冷たくした。次に、細胞ライゼートを 4℃で作動させるソルバールRC5B冷凍遠心機のT2-28ローターのような連続遠心分 離機により26,000×gで遠心分離した。これらの条件下で生成した90％より多いS lpIIIは沈降物中に見られる。上清はいくつかの産物を含み、下記のNH4SO4沈降 により回収された。沈降物を下記のようにLiBrで抽出した。方法2. 冷凍した細胞を解凍し、50mMトリス-HCl pH7.0、10mM EDTA及びプロテ アーゼ活性を阻害する5mM PMSFに1kg湿重量/6リットルの濃度まで懸濁した。細 胞をこの緩衝液中室温で0.5〜2時間撹拌してからリゾチームを1g/lの濃度まで加 え、インキュベーションを20分間続けた。次に、βメルカプトエタノールを70mM まで加えてから消浄剤NP40を1％の最終濃度まで20分間細胞浮遊液を連続して撹 拌しつつ加えた。次に、MgCl2を50mMまで加え、続いてDNAseを1mg/lの濃度で加 え、室温で20分間インキュベーションを続けた。次に、細胞ライゼートを連続遠 心機の26,000×gで方法１のように遠心し、上清を集め、26,000×gで２回連続遠 心分離機を通過させた。この２回目の遠心分離から得られた上清は全SlpIIIの<5 ％未満を含有し、下記のようにNH4SO4回収されなかった。１回目と２回目の26,0 00×gの遠心分離から得られた沈降物を合わせ、下記のようにLiBrで抽出した。方法3. 本方法については、T7ファージリゾチームをコードする第２プラスミド を含む大服菌株を用いた。このプラスミドは、SlpIII遺伝子をコードしているプ ラスミド及び薬剤耐性決定基に適合する。その株を最初の２法と同じ培養液中で 同じ条件下で増殖した。しかしながら、細胞内でT7リゾチームを生成するために 、細胞壁が弱く、EDTAを>100mMまでNP40を0.5〜1.0％v/vまで加えることにより 発酵の完了時に溶解されやすかった。溶解は、NP40の代わりに発酵ブロスにクロ ロホルム(20ml/リットル)を加えることによっても達成された。また、細胞は溶 解前に遠心分離により集められ、最初の２法に記載されたトリス-EDTAに1kg湿重 量/6リットルまで懸濁され、NP40又はクロロホルムを加えることにより溶解した 。いずれかの方法で細胞を溶解した後、ライゼートを最初の２法に記載された26 ,000×gの連続ローターで遠心分離した。これらの方法と共に、沈降物のLiBr抽 出及び上清のNH4SO4沈殿を用いて産物を回収した。SlpIII の精製 上記のように細胞ライゼートを26,000×gで遠心分離することにより得られた 沈降物を同量の9M LiBrで抽出した。塩溶液を加え、沈降物を室温(RT)で撹拌す ることにより一様に懸濁した。一様な懸濁液が得られた後に混合液をRTで１時間 撹拌した。次に、混合液を4℃又はRTで連続ローターの26,000×gで遠心分離して 沈降物と上清画分を生成した。上清をセーブし、沈降物を上記のように同量の9M LiBrで抽出した。１時間混合した後、混合液を26,000×gで遠心し、この遠心分 離からの上清を最初のLiBr抽出からの上清と合わせ、4℃で一晩放置した。細胞 ライゼート26,000×g沈降物に含まれるSlpIIIの約90％がこの手順を用いてLiBr で抽出した。 LiBr抽出液を4℃で一晩放置した後、生成した沈殿を26,000×gの遠心分離によ り除去し、捨てた。次に、上清を透析バッグに入れ、dH2Oを数回替えて２日間透 析した。LiBrが透析により除去されたので、SlpIII産物が透析バッグ内に沈殿し た。沈殿を遠心分離により集め、dH2Oで2〜3回洗浄した。最終洗浄産物を遠心分 離し、凍結乾燥により乾燥した。 26,000×g上清画分からの回収については、NH4SO4沈殿を用いた。4℃に維持し た試料に固体NH4SO4を38％飽和が得られるまで徐々に加えた(231g/l)。次に、混 合液を4℃で2〜3時間撹拌した。沈殿を連続流遠心分離機の遠心分離により回収 し、同量の蒸留水又はH2O中0.5％SDSで4〜5回洗浄した。各洗浄後、沈殿を連続 遠心分離により回収した。沈降物は、混入しているタンパク質が除去されるにつ れて逐次洗浄により徐々に白くなった。SlpIIIを洗浄した沈降物として回収し、 凍結乾燥により乾燥した。SlpIII のトリプシン処理工程 SlpIIIを50mMトリスHCl、pH8.0、0.1M NaCl緩衝液に懸濁し、37℃の水浴に入 れ、その浮遊液にTPCK処理トリプシン溶液を混合した。最終トリプシン濃度は0. 1％であった。３時間後、その溶液を16,000×gで15分間遠心分離し、沈降物を最 初に同量のH2O中0.5％SDS、次に蒸留水で洗浄した。各洗浄後、沈降物を遠心分 離により回収した。最終産物を水に懸濁し、分析用に4℃に保持した。 トリプシン処理において、SlpIIIは純度99.4％まで精製された。SlpIII の物理的測定 生成した反復アミノ酸ポリマーが天然に存在するポリマーの性質を微生物学的 に正確に模倣することを確かめるために、精製したシルク様タンパク質の物理的 測定をボンビクス・モリシルクと比較した。ボンビクス・モリ(Bombyx mori)シ ルクフィブロインの結晶領域の逆平行鎖プリーツシートコンホメーションを確認 するために物理的測定を行った(Marsh，Corey & Pauling，Biochem，Biophys．A cta(1955)16;Pauling & Corey，Proc．Natl．Acad．Sci．USA(1953)39:247)。Sl p膜から得られたx線回折パターンの予備的分析は、Fraser，MacRai & Steward(1 966)によって記載されたものと一致している(表4)。SlpIIIの円二色性(CD)とフ ーリエ変換赤外(FTIR)分光分析は、広がったβ及びβターンコンホメーションと 一致した。SlpIIIから得られたスペクトルと種々の溶媒中天然に存在するシルク フィブロインのスペクトル(Isuka & Young,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1966)55:11 75)との比較から溶液中のSlpIIIはシルクフィブロインに見られるランダム構造 と高度な定序構造の混合物からなることが示された。 Fraserら，J．Mol．Biol．(1966)19:580に記載されたもの。 実施例４ EBSI 遺伝子構築: 上記のように６種のオリゴヌクレオチド鎖を合成及び精製した。 オリゴヌクレオチド鎖(iii)、(iv)、(v)および(vi)をアニールし、HindIIIとE coRIで消化したプラスミドpBSm13(+)(Stratagene)のDNAと結合した。この連結反 応産物を大腸菌株JM109へ形質転換した。形質転換細胞コロニーについてアンピ シリン耐性を選択した。コロニーについて32P標識オリゴヌクレオチド(iii)、(v )とのハイブリッド形成をスクリーニングした。数種の正にハイブリッド形成す るクローンからのプラスミドDNAを精製及び配列決定した。２種のプラスミド、p SY1292とpSY1293はオリゴヌクレオチド(iii)、(v)と(iv)、(vi)に示された配列 を有した。これらの配列は、１つを除いて合成オリゴヌクレオチドに存在するヌ クレオチドの全てを有した。(iii)の７位のG:C塩基対が消失していた。この塩基 対の欠除はBanI部位の１つを遮断した。遺伝子断片の5'端の第2 BanI部位を導入 するために、オリゴヌクレオチド(i)と(ii)をアニールし、HindIIIとEcoRIで消 化したプラスミドpBSm13(+)と結合した。アンピシリン耐性の形質転換細胞コロ ニーからのプラスミドDNAを精製した。オリゴヌクレオチド配列に含まれるユニ ークな部位のStuIで消化できる２種のプラスミド、pSY1295とpSY1296を配列決定 した。共にオリゴヌクレオチド(i)と(ii)に示された配列を含むことがわかった 。pSY1292からのプラスミドDNAをHindIII、SIヌクレアーゼ及びEcoRIで連続して 消化した。消化産物をアガロースゲルの電気泳動で分離し、約150塩基対のDNA断 片をゲルから切除した。このDNA断片をStuIとEcoRIで消化したプラスミドDNA pS Y1296と結合した。この連結反応産物を大腸菌株JM109へ形質転換し、アンピシリ ン耐性を選択した。コロニーについて32P標識オリゴヌクレオチド(v)に対するハ イブリッド形成をスクリーニングした。２種の正にハイブリッド形成するクロー ンからのプラスミドDNAを精製及び配列決定した。これらのプラスミドをpSY1297 とpSY1298と名付けた。次の配列を有した。 EBSI マルチマー遺伝子の構築: BanI末端付着DNA断片を受容するためにBanII受容体プラスミドpSY937を修飾し た。このために２種のオリゴヌクレオチドを合成した。 オリゴヌクレオチド(vii)と(viii)をアニールし、BamHIで消化したプラスミド DNA pSY937と結合した。この連結反応産物を大腸菌株JM109へ形質転換し、コロ ニーについてクロラムフェニコール耐性を選択した。形質転換細胞コロニーを32 P標識オリゴヌクレオチド(vii)に対するハイブリッド形成によりスクリーニング した。２種の正にハイブリッド形成するクローンからのプラスミドDNAは、DNAシ ークエンシングで求めたオリゴヌクレオチド(vii)と(viii)に示された配列を有 した。 プラスミドDNA pSY1298をBanIIで消化し、消化断片をアガロースゲル電気泳動 により分離した。約150塩基対のEBSI遺伝子断片を切除し、電気的溶出とエノタ ール沈殿により精製した。約1μgの精製した断片を自己ライゲーションしてサイ ズが450〜6,000bpの範囲のマルチマーを作製した。次に自己連結反応産物をBanI Iで消化したプラスミドDNA pSY1299と結合した。この連結反応産物を大腸菌株HB 101へ形質転換した。形質転換細胞についてクロラムフェコール耐 性を選択した。個々の形質転換細胞からのプラスミドDNAを精製し、EBSIマルチ マーDNA挿入のために増大したサイズを分析した。サイズが1.5〜4.4Kbpの範囲の 挿入断片を含む10種のクローン(pSY1240-1249)を得た。EBSI マルチマー遺伝子の発現: 4Kb EBSIマルチマー遺伝子を含むクローンの１種、pSY1248をλPR発現ベクタ ー、pSY751においてクローン化した。pSY1248からのプラスミドDNAをNruIとPvuI Iで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離し、EBSIマルチマー遺伝子に対応す るDNAバンドを切除し、NACS精製により精製した。プラスミドpSY751からのDNAを PvuIIで消化し、pSY1248からのNruI-PvuII断片で結合した。この連結反応産物を 大腸菌HB101へ形質転換し、形質転換細胞についてアンピシリン耐性を選択した 。新規なプラスミドpSY1280を含む２種のクローンを単離した。pSY1280を含む大 腸菌細胞を30℃でOD600 0.7まで増殖してから42℃で1.5時間に変えた。これらの 細胞によって産生したタンパク質をSDS-PAGEで分析した。分離したタンパク質を ニトロセルロース紙に移し、抗ELPウサギ血清との免疫反応性により検出した。 見掛け分子量120kDalで強く反応するタンパク質バンドが認められた。 pSY1280のアンピシリン薬剤耐性遺伝子をカナマイシンマーカーで置き換え、 以後のプラスミドをpSY1332と呼んだ。このプラスミドをEBSIの精製用発酵に用 いた(方法を参照されたい)。 EBSI タンパク質の精製: プラスミドpSY1280を含む大腸菌株HB101を10リットル容量で発酵させた。細胞 をろ過により濃縮し、遠心分離により収集した。沈降した細胞を処理されるまで -70℃で凍結保存した。凍結細胞を解凍し、4mlの50mMトリス-HCl pH7.0、10mM E DTA、5mM PMSF/g細胞の湿重量に懸濁した。細胞をフランス押圧により15,000psi で２回破壊してから０℃に冷却した。粗ライゼートを26,000×gの遠 心分離により20分間透明にした。固体硫酸アンモニウムを20％飽和まで加える(1 14g/l)ことにより上清タンパク質を沈殿させた。10,000×gで10分間遠心分離す ることにより沈殿を集めた。沈降物を10mlのH2Oに懸濁し、10mMトリスpH8.0、0. 15M NaClに対して4℃で透析した。透析した溶液を0.1％トリプシン(Sigma)で1.5 時間室温で消化し、20％硫酸アンモニウムで沈殿した。沈殿したタンパク質をH2 Oに懸濁し、10mMトリスpH7.0、1mM EDTAに対して4℃で透析した。この試料のタ ンパク質純度をアミノ酸組成により分析し、83％であることが求められた。EBSI タンパク質の弾性: 上記半精製EBSIタンパク質の可溶性製剤を37℃で30分間インキュベートし、10 ,000×g、室温で10分間遠心分離した。この処理はEBSIタンパク質を凝集させ、 不溶性にし、半透明な固形物に沈降させる。固形物は、ガラス棒を用いて撹拌或 いはマセレーションによる機械的破壊に対して耐性であった。固形物を剃刀の刃 で細片に切断し、高度の弾性を示した。これらの細片は伸張と弛緩を繰り返した 後にその形を完全に保持した。圧縮に抵抗し、組織の不可逆変形は明らかでなか った。EBSI 精製 EBSI試料(純度70％)を50mMトリスHCl、50mM NaCl、pH8.0中4℃で一晩緩衝液を １度取り替えて透析した。沈殿が見られた場合、試料を27,000×g、4℃で15分間 遠心分離した。残りの工程を全て4℃で行った。上清を50mMトリスHCl、50mM NaC l、pH8.0で平衡化したDEAE-セファセルカラムに加えた。EBSIを含むフロースル ーを集め、プールした。NaClをDEAE-セファセルカラムからプールした画分に加 えて試料中2M NaClの最終濃度にした。27,000×gで20分間遠心分離により不溶性 物質を除去した。次に、上清を2M NaClを添加した50mMリン酸ナトリウム緩衝液 、pH7.0で平衡化したフェニル-セファロースカラムに充填した。溶離しているタ ンパク質がA280で検出されなくなるまでカラムを緩衝液で広範囲に洗浄した。次 に、カラムを50mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0、次に水で段階的に溶離した 。EBSI活性画分をプールし、分析用に4℃で保存した。 これらの工程を前の手順に加えることにより100％純粋なEBSIを得た。実施例５ ELPI の構築と発現 ２種のオリゴヌクレオチドを方法の項に記載されるように合成及び精製した。 ２種のオリゴヌクレオチド鎖をアニールし、REN HindIIIとEcoRIで消化したプ ラスミドpBS m13(+)(Stratagene)のDNAとアニールした。 この連結反応産物を大腸菌株JM109へ形質転換した。形質転換細胞コロニーに ついて32P標識オリゴヌクレオチド(i)とのハイブリッド形成をスクリーニングし た。正にハイブリッド形成するクローンからのプラスミドDNAを精製及び配列決 定した。１種のプラスミド、pSY1287がオリゴヌクレオチド(i)と(ii)に示された 配列を有した。 pSY1287からのプラスミドDNAをBanI RENで消化し、消化断片をアガロースゲル 電気泳動で分離した。ELPI遺伝子断片、約60bpを切り出し、NACSカラムで精製し た。約1μgの精製断片を自己ライゲーションしてサイズが300〜5000bpの範囲の マルチマーを作製した。 次に、自己ライゲーション産物をREN BanIで消化したプラスミドDNA pSY937と 結合した。この連結配列産物を大腸菌株HB101へ形質転換した。形質転換細胞に ついてクロラムフェニコール耐性を選択した。個々の形質転換細胞からのプラス ミドDNAを精製し、ELPI多重DNA挿入によるサイズの増大を分析した。サイズが1. 0〜2.5kbpの範囲の挿入断片を有する４種のクローン(pSY1388-1391)を得た。こ れらのクローンをAPR発現ベクターpSY751中でクローン化した。得られたクロー ン(pSY1392-1395)をELPIの発現に用いた。 ELPIタンパク質は次のアミノ酸組成を有した。 SELP1 遺伝子の構築と発現 方法の項に記載されたように2種のオリゴヌクレオチド鎖を合成及び精製した 。 これらのオリゴヌクレオチド鎖をアニールし、PstI RENで消化したプラスミド pSY1304と連結した(pSY1304はpSY857のトライマー単位の代わりにモノマー単位 をもっていることによりpSY857と異なる)。クロラムフェニコール耐性の形質転 換細胞コロニーからのプラスミドDNAを精製した。REN SnaBIで消化できる１種の プラスミド、pSY1365を配列決定し、正しいことがわかった。 記載されたように精製した(ELPIの構築と発現)ELPI遺伝子断片を製造業者(Str atagene)によって記載されたようにマングビーンヌクレアーゼで処理した。次に 、DNA断片混合液を、REN、FspI、SnaBI及び子ウシ腸ホスファターゼで連続して 消化したプラスミドDNA pSY1365と結合した。この連結反応産物を大腸菌株HB101 へ形質転換し、クロラムフェニコール耐性を選択した。個々の形質転換細胞から のプラスミドDNAを精製し、ELPIモノマーDNA挿入を分析した。２種のプラスミド 、pSY1366 AとBを配列決定した。共にELPI DNA配列を正しい方向で含むことがわ かった。 プラスミドDNA pSY1365をREN BanIで消化し、SELP1モノマーを含むDNA断片を ゲル精製した。マルチマーを作成するために、1μgのSELP1 DNA断片を自己ライ ゲーションした。サイズが500bp〜10kbpの範囲のマルチマーを得た。SELP1マル チマーをpSY1262のBanI部位へクローン化した。 挿入したマルチマーのサイズのゲル電気泳動により正のクローンを確認し、発 現とタンパク質の分析に用いた。 SELP2- モノマーの構築 プラスミドDNA pSY1298をBanII RENで消化し、EBSI遺伝子断片を上記のように 精製した。EBSIモノマー断片をBanII RENで消化し子ウシ腸ホスファターゼで処 理したpSY1304(pSY857として構築したSlpIIIのモノマーを含むpSY937)へ結合し た。 連結反応混合産物を大腸菌株HB101において形質転換した。形質転換細胞につ いてクロラムフェニコール耐性を選択した。数種の単離物を制限分析した後、SE LP2モノマー遺伝子に対応するDNA断片を含むプラスミド、pSY1301を選んだ。SELP2- 多重遺伝子のアッセンブルと発現 プラスミドDNA pSY1301をREN BanIで消化し、SELP2“モノマー”を含むDNA断 片をゲル精製した。マルチマーを作成するために、1μgのSELP2 DNA断片を自己 ライゲーションした。サイズが12kbより大きいマルチマーを得た。 SELP2マルチマーをpSY1262のBanI部位へクローン化した。挿入したマルチマー のサイズのゲル電気泳動により正のクローンを確認した。サイズが1.5〜11kbの 範囲の挿入断片を有するクローンを選択した。6kb(18反復)の挿入断片を含むプ ラスミドDNA pSY1372を分析とタンパク質精製用に用いた。SELP2- タンパク質精製 プラスミドpSY1372を含む大腸菌株HB101を発酵方法に記載された手順に従って 発酵させた。細胞を遠心分離により収集した。沈降した細胞を処理されるまで-7 0℃で凍結保存した。凍結した細胞を氷で解凍し、4mlの50mMトリスHCl、pH7.0、 10mM EDTA、5mM PMSF/g細胞の湿重量に懸濁した。8,000psiのゴーリン細胞破壊 機を通過させることにより細胞を破壊した。粗ライゼートを26,000×gで20分間 遠心分離することにより透明にした。SELP2タンパク質を>75％含む上清を、20％ 硫酸アンモニウム(114g/l)を加えることにより沈殿した。10,000×gで10 分間遠心分離することにより沈殿を集めた。沈降物を10mlのH2Oに懸濁し、10mM トリスpH8.0、0.15M NaClに対して4℃で透析した。透析した物質を26,000×gで1 5分間遠心分離して約10％のSELP2タンパク質を含むタンパク質の不溶性画分を集 めた。この不溶性タンパク質沈降物を0.2％SDS中50℃で30分間ときどき振とうし ながら２回洗浄した。そのつど26,000×gで15分間遠心分離することにより不溶 性タンパク質を集め、続いて50％エタノールで洗浄した。最終タンパク質沈降物 を水に懸濁し、ウェスタンブロット分析及びアミノ酸組成により分析した。ウェ スタンブロットにより、SELP2タンパク質はサイズが大きな分子量と同質である と思われる(>150kDal)。アミノ酸組成によりSELP2標品は純度約80％であり、ア ミノ酸(Ser:Gly:Ala:Pro:Val:Tyr)の実測モル比はpSY1372内に有するSELP2配列 から予想した組成と極めて一致している。 SELP3- 構築と発現 プラスミドDNA pSY1301をREN HaeIIで部分的に消化し、消化断片をアガロース ゲル電気泳動で分離した。大きい方のDNA断片を切除し、NACSカラムで精製した 。精製した断片を自己ライゲーションし、連結反応物を70℃で15分間加熱してT4 DNAリガーゼを不活性化し、最後にREN PstIで消化した。次に、消化混合液を大 腸菌株JM109へ形質転換した。形質転換細胞についてクロラムフェニコール耐性 を選択した。個々の形質転換細胞からのプラスミドDNAを精製し、(1)RENpstI耐 性;及び(2)SELP2遺伝子断片内に含まれる60bp HaeII断片の欠失を分析した。１ 種のクローン(pSY1377)が両要件を満たした。pSY1377由来のプラスミドDNAをREN BanIで消化し、SELP3モノマーを含むDNA断片をゲル精製した。マルチマーを作 成するために、1μgのSELP3 DNA断片を自己ライゲーションした。サイズが500bp 〜10kbpの範囲のマルチマーを得た。SELP3マルチマーをpSY1262のBanI部位へク ローン化した。挿入したマルチマーのサイズのゲル電気泳動により正のクローン を確認し、発現とタンパク質分析に用いた。 SLP4 −構築および発現 pSY1304由来のプラスミドDNAを、REN HaeIIで部分的に消化し、該消化により 得たフラグメントを、アガロースゲル電気泳動により分離した。得られた大きな フラグメントを、切断し、NACSカラムで精製した。該精製フラグメントを、自己 ライゲーションさせ、該ライゲーション反応系を70℃にて15分間加熱して、該T4 DNAリガーゼを不活性化し、かつ場合によりREN PstIで消化した。この消化混合 物で、大腸菌株JM109を形質転換させた。形質転換体を、クロラムフェニコール 耐性につき選別した。個々の形質転換体由来のプラスミドDNAを精製し、かつ(1) REN PstIに対する耐性および(2)該SELP2遺伝子フラクメント内に含まれる60bpの HaeIIフラグメントの除去について分析した。一つのクローン(pSY1378)がこれら ２つの要件を満たした。プラスミドDNApSY1378をREN BanIで消化し、該SLP4モノ マーを含む該DNAフラグメントを、ゲル精製に掛けた。マルチマーを生成するた めに、１μｇのSLP4 DNAを自己ライゲーションさせた。マルチマーが得られ、そ のサイズは300bp〜6kbpの範囲内にあった。該SLP4マルチマーを、pSY1262のBanI サイトにクローニングした。正のクローンを、ゲル電気泳動により、該挿入され たマルチマーのサイズについて特徴付けし、かつ発現およびタンパク分析のため に使用した。 FCB-SLPIII(SLPF) の構築および発現 該SLPIIIポリマーは、その予想された構造のために、生物学的に機能性の配 列を挿入するための骨格構造として選択され、有用な生成物の製造を可能とした 。該生成物は、広範囲の用途で使用するのに有用な構造上の特徴を有し、相互作 用性ストランド間にB-ターン構造をもち、かつ該ターン配列の、他の配列との置 換を可能とする。該フィブロネクチン細胞結合ドメイン、即ちアミノ酸1405-151 2は、強力なターン性癖を有し、該トリペプチドRGDが、細胞接着のために用意さ れており、これは隣接するB-ストランド間の親水性のループ内に存在するものと 予想されている。この提案されたループ構造に跨がる10個のアミノ酸の配列（こ れはフィブロネクチン細胞結合またはFCB配列と呼ばれている）が選択され、該S LPIII骨格に挿入すべきアミノ酸の機能的なブロックを構成する。該SLPIII骨格 内の該挿入サイトは、該アミノ酸配列GAAGYに対応するように選択され、該配列 もターン構造を与えるものと予想される(Chou & Fassman，Biochemistry，1974 ，13:222-244)。この着想は、該FCB構造の保存を可能とし、一方で該SLPIII(GAG AGS)9 B-ストランド結晶−充填ドメインの最小の崩壊を生ずる。 該SLPIII遺伝子モノマーは、該提案されたターン構造GAAGYをコードする該配 列内にPstI制限エンドヌクレアーゼサイトを含む。このサイトを、該FCB配列の 該10個のアミノ酸をコードする合成DNAを挿入するのに使用した。長さ36塩基の 該FCBサイトを含む２つの相補性DNAストランドを合成したが、これは以下に示す 配列からなっていた。 これらのオリゴヌクレオチドは、実施例１に記載の手順に従って精製され、か つpSY1304のPstIサイトにクローニングされた。pSY1304 DNAを、PstIにより消化 し、該FCBオリゴヌクレオチド混合物でライゲーションした。このライゲーショ ン反応生成物によって、大腸菌細胞を形質転換した。該プラスミドを含有するコ ロニーを、抗菌性のクロラムフェニコールを含有するバクテリア培養プレート上 で選別した。個々のコロニーを成育させ、プラスミドDNAを精製し、かつ該FCBオ リゴヌクレオチド配列の存在について、NheIで制限消化することによ り分析した。この制限さいと含むプラスミドを、DNA配列決定処理にかけたとこ ろ、２つの候補は正しいことが示された。これらのうちの一つ、pSY1325の部分 ヌクレオチド配列およびこれによりコードされるアミノ酸配列は以下の通りであ った。 該FCB-SLPモノマー遺伝子フラグメントを、BanIによる消化、アガロースゲル 電気泳動およびNACS精製（実施例１）によりpSY1325から精製した。該モノマー 遺伝子フラグメントを、自己ライゲーションさせ、BanIにより消化したpSY937に クローニングした。このライゲーションによる生成物で、大腸菌を形質転換し、 クロラムフェニコール上での成長につき選別した。個々のコロニーからの プラスミドDNAを、多重FCB-SLPモノマーフラグメントを含有する挿入片につき、 NruIおよびEcoRVによる消化およびアガロースゲル電気泳動により解析した。一 つのクローンが、２つの挿入片を含むものと同定され、その一方は約2.1kbであ り、また他方は2.8kbであった。これら両挿入片を、別々にクローニングし、か つ発現ベクターpSY751に移した。プラスミドpSY1325をNruIおよびPvuIIで消化し 、該2.1および2.8kbの挿入片バンドを精製した。これらのDNAフラグメントを、P vuIIにより消化したpSY751とライゲーションした。この反応の生成物により、大 腸菌を形質転換し、抗生物質アンピシリン上での成育について選別した。個々の クローン由来のプラスミドDNAを、該FCB-SLPポリマー遺伝子の存在について、制 限消化により分析した。２種のクローンを、pSY1520および1521として同定し、 これらはそれぞれ2.1および2.8kbの挿入片を含んでいた。 pSY1520およびpSY1521を含む大腸菌細胞を、30℃にて、50μg/mlのアンピシリ ンを含有するLB培地中で、OD600が0.7となるまで成育させた。該FCB-SLPポリマ ータンパクの製造は、1.5時間に渡り、該培養物温度を42℃まで増大させること にり誘発させた。該細胞を、遠心分離により収穫し、ドデシル硫酸ナトリウム(S DS)およびβ-メルカプトエタノールを含有するサンプルバッファー中で、100℃ にて５分間加熱することにより溶解させた。5x108個の細胞に相当するこれら溶 解物のサンプルを、SDSを含有する8%のポリアクリルアミドゲルに適用して、電 気泳動させ、エレクトロブロッティングによりニトロセルロースフィルタに転写 した。該フィルタを、抗-SLPまたは抗-FCBペプチド抗体と共にインキュベートし た。該抗-SLP抗体との特異的免疫反応性が、pSY1520の溶解物中の約75kdの、pSY 1521の溶解物中の95kdのおよび該SLPIIIクローンpSY1186の溶解物中の120kdのタ ンパクバンドについて観測された。該抗-FCB抗体との反応性は、該２つのFCB-SL Pポリマーバンドについてのみ観測された。 プラスミドpPT0134の構築 多重クローニングサイト(MCS)を含む、２つのオリゴヌクレオチドストランド を合成し、実施例１に記載のようにして精製した。 アニール処理後、これら２つのオリゴヌクレオチドストランドを、BanIおよび EcoRI RENで消化した、pSY937とライゲーションした。このライゲーション混合 物の生成物で、大腸菌を形質転換し、抗生物質クロラムフェニコールを含有する バクテリアプレート上で選別した。個々のクローン由来のプラスミドDNAを、Sca IおよびStuI RENで消化した後、アガロースゲル電気泳動により分析した。一個 のプラスミドpPT0124が、予想されたDNAフラグメントを含んでいた。 次いで、これらの新規なMCSを、プラスミドpSY1367に移した。このプラスミド は、pSY1299の派生体であり、これをNciI RENで消化し、かつその大きなDNAフラ グメントを、アガロースゲル電気泳動およびNACS精製により精製した。この精製 されたDNAフラグメントを、DNAポリメラーゼで処理し(実施例１)、ライゲーショ ンし、次いでFokIで消化した後、大腸菌株HB101を形質転換した。単一のコロニ ー由来のプラスミドDNAを精製し、かつ制限消化により分析した。一方のプラス ミドpSY1366は、正確であり、pSY1299中に存在する該FokIサイトのみを欠いてい ることが分かった。 ２つのオリゴヌクレオチドストランドを合成し、実施例１に記載のようにして 精製した。 オリゴヌクレオチドストランド1.Aおよび1.Bをアニールし、BanIIおよびFspI RENにより消化した、プラスミドpSY1366のDNAとライゲーションした。このライ ゲーション反応の生成物により、大腸菌株HB101を形質転換した。形質転換され たコロニー由来のプラスミドDNAを精製し、FokIで消化した。FokIで線状化した クローンを配列決定した。プラスミドpSY1367は、所定のMCS配列を含んでおり、 またこれを後の構築のために選択した。 プラスミドpPT0124およびpSY1367を、NruIおよびNcoIで消化し、得られたDNA フラグメントを、アガロースゲル電気泳動およびNACS精製により精製した。得ら れたpPT0124由来の小さなフラグメント（約500bp）を、pSY1367由来の大きなフ ラグメントとライゲーションした。該ライゲーション混合物の生成物により、大 腸菌を形質転換した。単一のコロニー由来のプラスミドDNAを、精製し、制限消 化およびDNA配列決定により分析した。一方のプラスミドpPT0134は該所定の配列 を含んでおり、これを更なるDNA構築のためのアクセプタベクターとして使用し た。SELPF の構築および発現 プラスミドpSY1521のDNAを、BanI RENで消化し、また該SLPF(FCB-SlpIII)モノ マーを、NACSカラム（実施例１を参照のこと）を使用して、精製した。このDNA フラグメントを、予めFokI RENで消化した、pPT0134とライゲーションし、ウシ の腸ホスファターゼ（実施例１を参照のこと）で処理し、その後NACSカラムを使 用して精製した。このライゲーション反応の生成物により、大腸菌株HB101を形 質転換した。得られた形質転換体を、クロラムフェニコールに対する耐性に基づ いて選別した。形質転換されたコロニー由来のプラスミドDNAを精製し、かつFok Iで消化した。該正しい制限パターンをもつクローンを配列決定した。プラスミ ドpPT0141は、該所定のSLPFモノマー配列を含み、これを後の構 築のたに選択した。 プラスミドpSY1377をBanI RENで消化し、該SELP3遺伝子モノマーDNAフラグメ ントを、アガロースゲル電気泳動およびその後のNACSカラム処理により精製した 。268bpの該精製されたSELP3遺伝子モノマーを、予めBanI RENで消化した、pPT0 141のプラスミドDNAとライゲーションし、NACSカラムを使用して精製した。この ライゲーション反応の生成物により、大腸菌株HB101を形質転換した。形質転換 体を、クロラムフェニコールに対する耐性に基づいて選別した。形質転換された コロニー由来のプラスミドDNAを精製し、かつFokIで消化した。該正しい制限パ ターンをもつクローンを配列決定した。プラスミドpPT0146は該所定のSELPFモノ マーDNAを含んでいた。 pPT0146由来のプラスミドDNAを、FokI RENで消化し、得られた消化フラグメン トを、アガロースゲル電気泳動により分離した。477bpのSELPF遺伝子フラグメン トを、切断し、NACSカラムにより精製した(実施例１を参照のこと)。この精製し たフラグメントを、REN BanIで消化しておいた、プラスミドpSY1262とライゲー ションした。このライゲーション反応の生成物により、大腸菌株HB101を形質転 換した。形質転換体を、カナマイシンに対する耐性に基づいて選別した。個々の 形質転換体由来のプラスミドDNAを、精製し、SELPF多重DNA挿入により増大した サイズについて分析した。幾つかのクローンを得たが、これらのサイズは1kbp〜 6kbpの範囲内にあった。約2.9kbpの挿入片をもつ、一つのクローンpPT0183を、 発現およびタンパク分析のために選択した。 プラスミドpPT0183を含む、大腸菌株HB101を、実施例１に記載のようにして成 育させた。これら細胞により製造されたタンパクを、SDS-PAGEにより分析して、 SLPおよびELP抗体に対する反応性を検出した。何れの分析においても、強力な反 応性バンドが観測され、その見掛けの分子量は約100kDであった。 プラスミドpACYC184(Chang，A.Y.C．& cOHEN，S.N.，J．Bacteriol.，1987，1 34:1141-1156)を、BanI RENで消化し、アガロースゲル電気泳動により精製し、 約2,000bpに相当する得られたDNAフラグメントを、NACSカラムを使用して、更に 精製した。このDNAフラグメントを、DNAポリメラーゼを使用することにより完全 にし(実施例１を参照のこと)、次いで自己ライゲーションさせた。該ライゲーシ ョン混合物の生成物により、大腸菌株HB101を形質転換し、30μg/mlのクロラム フェニコールを含有するバクテリアプレート上で選別した。個々のコロニー由来 のプラスミドDNAを、Eco47IIIで消化することにより、線状化した。一つのクロ ーンpPT0235を、後のDNAの操作のためのアクセプタベクターとして使用した。 ２種のオリゴヌクレオチドストランドを合成し、実施例１に記載のようにして 精製した。 これら２つのオリゴヌクレオチドストランドを、アニールし、Eco47IIIおよび SnaI RENで消化しておいた、プラスミドpPT0235のDNAとライゲーションした。こ のライゲーション反応生成物により、大腸菌株HB101を形質転換した。形質転換 体のプラスミドDNAを精製し、かつEco47IIIまたはSnaIまたはNruI RENと組み合 わせた、EcoRIで消化した。正確な消化パターンを与えた、２つのク ローン由来のプラスミドDNAを、配列決定した。pPT0285と命名された、その一つ のプラスミドは、正確であることが分かり、従ってこれを更なる構築処理のため に選択した。CLP3.7 の構築および発現 該CLP3.7遺伝子モノマーをコードする、一つのオリゴヌクレオチドストランド （第５表を参照のこと）を、アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems) DNA合成装置モデル381Aおよびグレンリサーチ(Glen Research)により供給される 2000・の合成カラムを使用して合成した。この合成後、該226塩基のDNAフラグメ ントを、脱保護し、NH4 OH中で55℃にて６時間処理することにより、該カラム担 体から開裂させた。 ２つの付随的なDNAストランドを合成して、PCR増幅用のプライマーとして使用 した。これらDNAプライマーの該合成並びに精製は、実施例１に記載のようにし て実施した。これら２つのストランドは以下の通りである。 実施例１に記載のように、該PCR反応を実施した。 該DNAを、再懸濁し、実施例１に記載のように、BabI RENで消化した。この消 化したDNAを、実施例１に記載のように精製し、次いで予めBanIで消化したpPT02 85とライゲーションし、SAPで処理し、かつ実施例１に記載のように精製 した。このライゲーション反応生成物により、大腸菌株HB101を形質転換した。 形質転換体由来のプラスミドDNAを精製し、上記のように分析した。コロニーを 取り出し、プレート上に移し、50μｌの溶解バッファー(1%のツイーン(Tween)20 、10%のトリス(Tris)-HCl(pH8.0)、1mMのEDTA)を含有する、0.5mlの微量遠心管 に入れた。この遠心管を閉じ、95℃にて10分間インキュベートした。次いで、室 温まで冷却し、５μｌの溶解液を、0.5mlのパーキンエルマー(Perkin Elmer)製 の肉厚の薄いジーヌアンプ(Gene AmpTM)反応管中の、45μｌのマスターミックス (MasterMix)(上記のような1xPCRバッファー、5Uのアンプリタック(Amplitaq)、2 00μMのdNTPs)に添加した。増幅は、パーキンエルマー(Perkin Elmer)DNAサーマ ル(Thermal)サイクラーモデル480内で、30サイクル実施し、引き続き95℃、52℃ および72℃での各１分間のサイクルを実施した。種々の反応からのアリコートを 、0.5xTAEバッファー中の、1.5%の低融点アガロースを使用した、アガロースゲ ル電気泳動により分析した。該正確なサイズの挿入片を示すクローンからのプラ スミドDNAを、精製しかつDNA配列決定により分析した。プラスミドpPT0310は該 所定のCLP3.7モノマー配列を含んでいた(第６表参照)。 CLP3.7 ポリマーの構築 pPT0310由来のプラスミドDNAを、BanI RENで消化し、これら消化したフラグメ ントをアガロースゲル電気泳動により分離した。180bpの該CLP3.7遺伝子を、切 断し、NACSカラム（方法の章を参照）により精製した。この精製したフラグメン トを、プラスミドpSY1262とライゲーションした。該プラスミドは、以下のよう にして製造した。即ち、pSY1262プラスミドDNAを、BanI RENで消化し、引き続き シュリンプアルカリンホスファターゼ(SAP)で、実施例１に記載のように処理し た。 このライゲーション反応生成物により、大腸菌株HB101を形質転換した。形質 転換体をカナマイシンに対する耐性について選別した。個々の形質転換体由来の プラスミドDNAを精製し、CLP3.7多重DNA挿入のために、増加したサイズについて 分析した。幾つかのクローンを得たが、約1.25kbpおよび2.6kbpの挿入片を含む ２つのクローン(それぞれpPT0314およびpPT0312)を選択し、CLP3.7の発現のため に使用した。CLP3.7 の分析 プラスミドpPT0314またはpPT0312を含む大腸菌株HB101を、実施例１に記載の ように成育させた。これら細胞の製造したタンパクを、SDS-PAGEにより分析して 、CLP抗体に対する反応性を検出した。どの分析においても、強力な反応性バン ドが観測され、その見掛け上の分子量は、それぞれ130kDおよび5OkDであった。 PPAS1-A ポリマーの構築 該プロテインポリマーアドヘーシブサブストレート(Protein Polymer Adhesiv e Substrate)(PPAS)ポリマーを、構造的骨格内にヒトフィブリンガンマ鎖の、17 アミノ酸のオリゴペプチドブロックを含むように設計した。ここで該構造的骨格 は、ヒトコラーゲンタイプI(GAPGTPGPQGLPGSP、CLP3.7モノマー繰り返しアミノ 酸配列)の、15アミノ酸のペプチドブロックの、３個の完全な繰り返し体からな る。PPAS1-A 遺伝子モノマーの合成および構築 太字で示された該フィブリンガンマ配列を含む、該PPAS1-Aアミノ酸モノマー 配列は、以下の通りである。 一つのオリゴヌクレオチドストランド（第７表参照）を、アプライドバイオシ ステムズDNA合成装置モデル381Aおよびグレンリサーチにより供給される2000・ の合成カラムを使用して合成した。この合成中、該123塩基のDNAフラグメントを 、脱保護し、NH4 OH中で55℃にて６時間処理することにより、該カラム担体から 開裂させた。 次いで、該PCR反応を、該CLP3.7モノマーの構築で使用したものと同一のプラ イマーを使用して、前に記載したように実施した。次いで、この増幅したDNAを 再懸濁し、ApaLIおよびDraI RENで消化した。次に、該消化したDNAを、プロバイ ンド(Probind)フィルタ、次いでバイオ−スピン(Bio-Spin)カラムを使用して精 製し、次いでApaLIおよびEcoRV RENで予め消化した、pPT0310とライゲーション し、NACSカラムで精製した。このライゲーション反応の生成物により、大腸菌株 HB101を形質転換した。形質転換体由来のプラスミドDNAを精製し、Eco0109、Hin cIIおよびHindIII RENを使用して消化することにより分析した。該正確なサイズ の挿入片を示すクローン由来のプラスミドDNAを精製し、かつDNA配列決定によっ て分析した。プラスミドpPT0318は、上記所定のPPAS1-A遺伝子モノマー配列（第 ８表参照）を含んでいた。 発現プラスミドpPT0317の構築 pSY1262のプラスミドDNAを、PvuII RENで線状化し、次いでプロバインドフィ ルタ、引き続きバイオ−スピンカラムに通した。次に、このDNAをSAPで処理し、 以下のようにして調製したpQE-17(QIAGENカタログ#33173)からのDNAフラグメン トによりライゲーションした。pQE-17のプラスミドDNAを、BglIIおよびHindIII RENで消化し、その36bpフラグメント（第９表参照）を、プロバインドフィルタ 、引き続きバイオ−スピンカラムを使用して精製した。このDNAを、更にマイク ロコン−30(Microcon-30)を使用して更に精製し、該36bpフラグメントを含む濾 液を放置した。次に、このDNAを、DNAポリメラーゼＩで処理し、プロバインドフ ィルタ、引き続きバイオ−スピンカラムに通して、精製した。 このライゲーション反応の生成物により、大腸菌HB101を形質転換した。形質 転換体由来のプラスミドDNAを精製し、BstYIおよびBst1 1071 RENを使用して消 化することにより分析した。正確な制限パターンを示すクローン由来のプ ラスミドDNAを精製し、DNA配列決定により分析した。プラスミドpPT0317は、該 所定のDNA挿入片を含んでおり、従ってこれを更なるDNA操作のために使用した。PPAS1-A ポリマーの構築 pPT0318由来のプラスミドDNAをBanI RENにより消化し、その消化フラグメント を、アガロースゲル電気泳動により分離した。216bpの該PPAS1-A遺伝子フラグメ ントを切断し、ウルトラフリー(Ultrafree)-MCフィルタを用いて精製した。この 精製されたフラグメントを、以下のようにして調製したプラスミドpPT0317とラ イゲーションした。pPT0317のプラスミドDNAを、BanI RENで消化し、次いでプロ バインドフィルタ、引き続きバイオ−スピンカラムに通した。次に、このDNAを 、SAPで処理した。 このライゲーション反応の生成物により、大腸菌株HB101を形質転換した。形 質転換体を、カナマイシンに対する耐性につき選別した。個々の形質転換体由来 のプラスミドDNAを精製し、EcoRIおよびEcoRV RENを使用して、PPAS1-Aマルチマ ー遺伝子挿入片について解析した。挿入片のサイズが200bp〜約４kbの範囲にあ る、幾つかのクローンを得た。10〜20個の繰り返し体を含む幾つかのクローンを 選択し、該PPAS1-Aポリマーの発現において使用した。PPAS1-A 発現分析 プラスミドpPT0321、pPT0325、pPT0326またはpPT0327を含む、大腸菌株HB101 を、前に記載したように培養した。これら細胞により生成されたタンパクは、CL P抗体に対する反応性につき、ウエスタンブロット法により分析した場合に、見 掛け上の分子量80kD〜180kDをもつ、強力な反応性バンドを示した。該PPAS1-Aモ ノマーの10個の繰り返し体を含む、一つのクローンpPT0321を、更なる研究のた めに選択した。 実施例７ SELP8K およびSELP8Eの構築 SELP8KおよびSELP8Eと命名したポリマーを調製した。これらは、エラスチン− 様のブロックに、特異的化学的反応性基をもつことにより特徴付けられる。これ らポリマーの構築を、以下に示すが、前記した遺伝子モノマーSELPO(米国特許第 5,243,038号参照、pSY1298、ここではSELPOはEBSIと呼ばれている)から出発する 。 SELP8KおよびSELP8Eアミノ酸モノマー配列を、以下のように設計する。 SELP8Kモノマー (GAGAGS)4 (GVGVP)4 GKGVP (GVGVP)3 SELP8Eモノマー (GAGAGS)4 (GVGVP)4 GEGVP (GVGVP)3 SELP8 遺伝子モノマーの構築 プラスミドpSY1378(米国特許第5,243,038号参照)を、BanI RENで消化し、アガ ロースゲル電気泳動法、引き続きNACSカラムを利用して精製し、次いで得られる DNAを、2.5M酢酸アンモニウム中でエタノール沈殿させ、予めFokI RENで消化さ れた、pPT0134(PCT/US92/09485号参照)とライゲーションし、フェノール／クロ ロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。 このライゲーション混合物の生成物により大腸菌株HB101を形質転換した。形 質転換体由来のプラスミドDNAを精製し、NruIおよびXmnI RENを使用して消化す ることにより分析した。該所定の制限パターンを含むプラスミドpPT0255を得た が、これを後の構築のために使用した。 pPT0255のプラスミドDNAをCfr101 RENで、次にRNAseで処理した。該消化によ り得られたフラグメントを、アガロースゲル電気泳動により分離し、得られたDN Aを切断し、かつ自己ライゲーションさせた。このライゲーション混合物の生成 物により、大腸菌株HB101を形質転換した。形質転換体由来のプラスミドD NAを精製し、NaeIおよびStuI RENを使用して消化することにより分析した。該所 定の欠損を含むプラスミドpPT0267を、引き続き構築のために使用した。 第10表に記載したような２種のオリゴヌクレオチドを合成し、実施例１に記載 のようにして精製した。 これら２つのオリゴヌクレオチドストランドをアニールし、予めBanIIおよびS caIRENで消化したプラスミドpPT0267のDNAとライゲーションし、アガロースゲル 電気泳動、引き続きNACSカラムを使用して精製した。 このライゲーション反応生成物により、大腸菌株HB101を形質転換した。形質 転換体由来のプラスミドDNAを精製し、DraIで消化した。該正確な消化パターン を示した２つのクローン由来のプラスミドDNAを配列決定した。一方のプラスミ ドDNA、即ち消化しだpPT0287は正確であることが分かり、これを更なる構築のた めに選択した。 pSY1298のプラスミドDNA(米国特許第5,243,038号参照)をBanII RENで消化し、 そのSELPO遺伝子フラグメントを、アガロースゲル電気泳動、これに続くNACSで 精製し、次いでBanIIで消化したpPT0287とライゲーションした。次に、該酵素を 、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により除去した。 該ライゲーション反応混合物の生成物により、大腸菌株HB101を形質転換した 。形質転換体由来のプラスミドDNAを精製し、DraI RENを使用した消化により分 析した。該正確な消化パターンを示すクローン由来のプラスミドDNAを、更にBan II、AhaIIおよびStuI RENで消化した。プラスミドpPT0289は該所定のSELP8モノ マー配列（第11表参照）を含んでいた。 SELP8K およびSELP8E遺伝子モノマーの構築 該SELP8遺伝子モノマーの一部をコードする、一つのオリゴヌクレオチドスト ランドを、位置90における単一塩基多形性をもつように合成した。この位置にお ける、アデニンおよびグアニジン両者の使用は、単一の合成で、アミノ酸のリジ ンおよびグルタミン酸をコードする、オリゴヌクレオチド（第12図参照）を生成 した。この合成は、アプライドバイオシステムズDNA合成装置モデル381Aおよび グレンリサーチにより供給される2000・の合成カラムを使用して行った。この合 成中、ボトル交換のために必要な分断−ポーズを最小化した。合成後、該202塩 基のDNAフラグメントを、脱保護し、30%のNH4 OH中で55℃にて６時間処理するこ とにより、該カラム担体から開裂させた。 ２つの付随的なDNAストランドを、PCR増幅用のプライマーとして使用した。 これら２つのストランドは以下の通りであった。 該PCR反応を実施し、その反応生成物を実施例１に記載のように精製した。 このDNAを再懸濁し、BanII RENにより実施例１に記載のように消化した。次に 、この消化したDNAを、低融点アガロースゲル電気泳動により分離し、子めBanII RENで消化したpPT0289とライゲーションし、NACSカラムにより精製した。この ライゲーション反応の生成物により、大腸菌株HB101を形質転換した。単離され た形質転換体由来のプラスミドDNAを精製し、ApaLIおよひEcoNI RENを使用して 消化することによって分析した。該正確な消化パターンを示すクローン由来のプ ラスミドDNAを、Asp700 RENを使用して消化することにより更に分析して、該多 形性位置におけるリジンまたはグルタミン酸をコードするクローンを識別した。 これらの多形性の各々を含むクローン由来のプラスミドDNAを精製し、DNA配列決 定により分析した。プラスミドpPT0340は、該所定のSELP8Kモノマー配列を含み 、かつプラスミドpPT0350は該所定のSELP8Eモノマー配列を含んでいた(それぞれ 以下の第13および14表を参照のこと)。 SELP8K ポリマーの構築 pPT0340由来のプラスミドDNAを、BanI RENで消化し、該消化したフラグメント を、アガロースゲル電気泳動により分離した。192bpの該SELP8K遺伝子フラグメ ントを切断し、NACSカラムで精製した。この精製したフラグメントを、BanI REN で消化されているプラスミドpPT0317とライゲーションし、ミリポアプロバイン ド(Millipore Probind)およびバイオ−スピン６カラムに通した。このDNAを、次 にシュリンプのアルカリンホスファターゼ(SAP)で、実施例１に記載のようにし て処理した。 このライゲーション反応生成物により、大腸菌株HB101を形質転換した。形質 転換体をカナマイシン耐性について選別した。個々の形質転換体由来のプラスミ ドDNAを精製し、かつSELP8Kモノマー多重DNA挿入により増大したサイズについて 分析した。200bp〜約7kbの範囲内のサイズの挿入片を含む幾つかのクローンを得 た。６〜32個の繰り返し体を含むクローンを使用して、該SELP8Kタンパクポリマ ーの発現を行った(pPT0341、pPT0343、pPT0344、pPT0345およびpPT0347)。SELP8K 発現の解析 プラスミドpPT0341、pPT0343、pPT0344、pPT0345およびpPT0347を含む大腸菌 株HB101を、実施例１に記載のようにして成長させた。これら細胞により生成さ れたタンパクを、ウエスタンブロット法により分析して、SLP抗体に対して反応 性のタンパクを検出した。各クローンは強力な反応バンドを形成した。該 生成物の見掛けの分子量は、約35kD〜250kD以上に及ぶものであった。菌株pPT03 45は、見掛けの分子量80,000をもつSLP抗体反応性バンドを形成した。プラスミ ドpPT0345によりコードされる該SELP8Kの予想されたアミノ酸配列を、以下に示 す。 SELPOK ポリマーの構築 SELP8Kのコポリマー構造は、以下のような配列:［(SLPブロック)４(ELPブロッ ク)８］の、絹−状のブロック(SLPブロック)およびエラスチン−状のブロック(E LPブロック)からなる。付随的なポリマーは、その絹−状乃至エラスチン−状ブ ロックの長さを調節することにより、種々の再吸収および溶解特性をもち、かつ その反応性を維持するように設計した。SELP0Kは、SELP8Kとは違い、結晶性の絹 −状のブロックの半分の長さをもち、一方で該エラスチン−状のブロックに関す る分散頻度を維持している。 介在配列を含み、インビボでの、コラーゲナーゼ(92kd)によるタンパク分解開 裂を介して、再吸収を促進するポリマーをも設計した。SELP0K-CS1は、６個のア ミノ酸挿入片(GAGAGSGVGVPLGPLGPGVGVP)内に、コラーゲナーゼ(PLGP)に対する２ つの隣接する開裂サイトを含む。プラスミドpPT0317の構築 pSY1262のプラスミドDNA(米国特許第5,243,038号参照)をPvuII RENにより線状 化し、次にプロバインドフィルタおよびバイオ−スピン６カラムに通した。次い で、このDNAをシュリンプのアルカリンホスファターゼ(SAP)で処理した。次いで 、この線状化したpSY1262 DNAを、以下のようにして調製したpQE-17(QI AGENカタログ#33173)からのDNAフラグメントとライゲーションした。pQE-17のプ ラスミドDNAを、BglIIおよびHindIII RENで消化し、第15表に示したその36bpフ ラグメントを、プロバインドフィルタおよびバイオ−スピンカラムを用いて精製 した。このDNAを、更にマイクロコン−30(Microcon-30)を使用して更に精製し、 該36bpフラグメントを含む濾液を放置した。次に、このDNAをDNAポリメラーゼＩ で処理し、プロバインドフィルタおよびバイオースピンカラム（実施例１参照） を使用して、精製した。 このライゲーション反応の生成物により、大腸菌HB101を形質転換した。形質 転換体由来のプラスミドDNAを精製し、Bst1107IおよびEcoRV RENを使用して消化 することにより分析した。所定のDNAフラグメントを含むクローンを、更にBst11 07IおよびBstYI RENにより消化し、該挿入片の配向を決定した。該正確な制限パ ターンを示す該クローン由来のプラスミドDNAを精製し、DNA配列決定によって分 析した。プラスミドpPT0317は、該所定のDNA挿入片を含んでおり、従ってこれを 更なるDNA構築操作のために使用した。SELP0K ポリマーの構築 第16表に示したような一本のオリゴヌクレオチドストランドを、アプライドバ イオシステムズ社製のDNA合成装置モデル381Aおよびグレンリサーチにより供給 されている2000Å合成カラムを使用して、合成した。この合成後に、該93個のDN Aフラグメントを脱保護し、水酸化アンモニウム中で55℃にて６時間処理するこ とにより、該カラム担体から開裂した。 該PCR反応を、SELP8K遺伝子モノマーの構築体につき上記したものと同一の、 ２つのDNAプライマーを使用して実施し、該反応生成物を精製した。該DNAを再懸 濁し、BanI RENで消化した。次に、この消化したDNAを、低融点アガロースゲル により分離し、予めBanI RENで消化しておいた、pPT0285(PCT/US92/09485参照) とライゲーションし、NACSカラムで精製した。このライゲーション反応の生成物 により大腸菌株HB101を形質転換した。形質転換体由来のプラスミドDNAを精製し 、EcoRIおよびBanII RENを使用して消化することにより分析した。該正確な制限 パターンを示す該クローン由来のプラスミドDNAを精製し、DNA配列決定により分 析した。 プラスミドpPT0358は、該所定の配列を含み、従ってこれを引き続きDNA構築操 作で使用した。 pPT0340由来のプラスミドDNAをBanII RENで消化し、該消化により得られたフ ラグメントをアガロースゲル電気泳動により分離した。156bpの該SELP0K遺伝子 フラグメント（第17表参照）を、切断し、ウルトラフリー(Ultrafree)-MCフィル タ、次いでバイオ−スピン６カラムを使用して精製した。 この精製されたフラグメントを、BanII RENで予め消化しておいたプラスミドp PT0358とライゲーションし、次いでプロバインドフィルタおよびマイクロコン-3 0フィルタに通した。次に、この消化により得たフラグメントを、アガロースゲ ル電気泳動により分離した。次いで、このプラスミドDNAを切断し、ウルトラフ リー-MCフィルタ、次いでバイオ−スピン６カラムを使用することにより精製し た(実施例１参照)。 このライゲーション反応生成物により、大腸菌株HB101を形質転換した。形質 転換体をクロラムフェニコールに対する耐性につき選別した。個々の形質転換体 由来のプラスミドDNAを精製し、SELP0K多重DNAの挿入により増大したサイズに関 して分析した。種々のサイズの挿入片をもつ幾つかのクローンを得た。それぞれ 該SELP0K遺伝子モノマーの18、２および６繰り返し体を含む、プラスミドpPT035 9、pPT0360およびpPT0374を使用して、以下の構築操作を行った。 pPT0359およびpPT0374由来のプラスミドDNAを、BanI RENで消化し、この消化 により得られたフラグメントを、アガロースゲル電気泳動により分離した。約28 00bpおよび1000bpの、該SELP0K遺伝子フラグメントを切断し、NACSカラムによっ て精製した。次いで、これらの精製したフラグメントを、予めBanI RENで消化し ておいたプラスミドpPT0317とライゲーションし、次いでプロバインドフィルタ およびバイオ−スピン６カラムに通した。次に、このDNAをシュリンプのアルカ リンホスファターゼ(SAP)で処理し、プロバインドフィルタおよびバイオ−スピ ン６カラムに通した(実施例１参照)。 これらライゲーション反応生成物により、大腸菌株HB101を形質転換した。形 質転換体をカナマイシンに対する耐性につき選別した。個々の形質転換体由来の プラスミドDNAを精製し、SELP0K多重DNAの挿入によって増大したサイズについて 分析した。幾つかのクローンを得た。プラスミドpPT0364およびpPT0375を選択し 、SELP0Kの発現のために使用した。SELP0K 発現の分析 プラスミドpPT0364およびpPT0375を含む大腸菌株HB101を、実施例１に記載の ように成育させた。これら細胞により生成されたタンパクを、SDS-PAGEにより分 析し、ELP抗体に対する反応性を検出した。何れの分析においても、強力な反応 性のバンドが観測され、これらはそれぞれ見掛けの分子量約95kDおよび35kDを有 していた。 SELP0K-CS1 ポリマーの構築 プラスミドpPT0360をBanI RENで消化し、この消化により得られたフラグメン トをアガロースゲル電気泳動により分離した。約300bpのこのSELP0K遺伝子フラ グメントを切断し、ウルトラフリー-MCフィルタ、次いでバイオ−スピン６カラ ムを使用して精製した。この精製したフラグメントを、FoKI RENで予め消化して おいた、プラスミドpPT0134(PCT/US92/09485参照)とライゲーションし た。この酵素を、65℃にて20分間加熱不活性化し、このライゲーション反応混合 物を、次にプロバインドフィルタに通した。次に、該DNAをシュリンプのアルカ リンホスファターゼ(SAP)で処理し、プロバインドフィルタおよび次いでバイオ −スピン６カラムに通した。 このライゲーション反応生成物により、大腸菌株HB101を形質転換した。形質 転換体をクロラムフェニコールに対する耐性について選別した。個々の形質転換 体由来のプラスミドDNAを精製し、DraI RENを使用して消化することにより分析 した。一つのプラスミドpPT0363は、該正確な制限パターンを示し、従ってこれ を引き続きDNA構築のために使用した。 第18表に示したような一本のオリゴヌクレオチドストランドを、アプライドバ イオシステムズ社製のDNA合成装置モデル381Aおよびグレンリサーチにより供給 されている2000・合成カラムを使用して、合成した。この合成後に、該141個のD NAフラグメントを脱保護し、水酸化アンモニウム中で55゜Ｃにて６時間処理する ことにより、該カラム担体から開裂した。 該PCR反応を、SELP8K遺伝子モノマーの構築体につき上記したものと同一の、 ２つのDNAプライマーを使用して実施し、該反応生成物を精製した。次いで、該D NAを再懸濁し、BsrFIおよびEcoNI RENで消化した。この消化したDNAを、プロバ インドおよびマイクロコン-30フィルタおよびバイオ−スピン６カラムで処理し 、次いで予めBsrFI RENで消化した、pPT0363とライゲーションし、プロバインド フィルタおよびバイオ−スピン６カラムで処理し、更にEcoNI RENで消化した。 この消化により得られたフラグメントを、アガロースゲル電気泳動により分離し た。約2000bpの大きなDNAバンドを切断し、ウルトラフリー-MCを、 次にバイオ−スピン６カラムを使用して精製した(実施例１参照)。 このライゲーション反応の生成物により大腸菌株HB101を形質転換した。個々 の形質転換体由来のプラスミドDNAを精製し、Asp700IおよびEcoO109I RENを使用 して消化することにより分析した。該正確な制限パターンを示す該クローン由来 のプラスミドDNAを精製し、DNA配列決定により分析した。プラスミドpPT0368(第 19表参照)は、該所定の配列を含み、従ってこれを後のDNA構築操作で使用した。 pPT0368のプラスミドDNAを、BanII RENで消化し、この消化により得られたフ ラグメントをアガロースゲル電気泳動により分離した。174bpの該SELP0K-CS1遺 伝子フラグメントを切断し、ウルトラフリー-MCフィルタ、次いでバイオ−スピ ン６カラムを使用して精製した。この精製したフラグメントを、BanII REN で予め消化しておいた、プラスミドpPT0358とライゲーションし、次いでプロバ インドフィルタおよびマイクロコン-30フィルタに通した。引き続き、該消化し たフラグメントをアガロースゲル電気泳動により分離した。次いで、該プラスミ ドDNAを切断し、ウルトラフリー-MCフィルタ、次いでバイオ−スピン６カラムを 使用して精製した(実施例１参照)。 このライゲーション反応生成物により、大腸菌株HB101を形質転換した。形質 転換体をクロラムフェニコールに対する耐性につき選別した。個々の形質転換体 由来のプラスミドDNAを精製し、SELP0K-CS1多重DNA挿入により増大したサイズに ついて分析した。1000bp〜約3000bpの範囲の挿入片サイズをもつ、幾つかのクロ ーンを得た。該SELP0K-CS1遺伝子モノマーの16個の繰り返し体を含むプラスミド pPT0369を、後の構築操作で使用した。 pPT0369由来のプラスミドDNAをBanI RENで消化し、プロバインドフィルタで処 理し、次に該消化により得られたフラグメントをアガロースゲル電気泳動により 分離した。約2800bpの該SELP0K-CS1遺伝子フラグメントを切断し、ウルトラフリ ー-MCフィルタで精製し、バイオ−スピン６カラムを使用して脱塩した。次いで 、該精製したフラグメントを、予めBanI RENで消化しておいた、プラスミドpPT0 317とライゲーションし、次にプロバインドフィルタおよびバイオ−スピン６カ ラムに通した。次いで、このDNAをシュリンプのアルカリンホスファターゼ(SAP) で処理し、プロバインドフィルタ、および次にバイオースピン６カラムに通した (実施例１参照)。 これらのライゲーション反応生成物により、大腸菌株HB101を形質転換した。 形質転換体をカナマイシンに対する耐性につき選別した。個々の形質転換体由来 のプラスミドDNAを精製し、SELP0K-CS1多重DNA挿入により増大したサイズについ て分析した。幾つかのクローンを得た。プラスミドpPT0370を選択して、SELP0K- CS1の発現のために使用した。SELP0K-CS1 発現の分析 プラスミドpPT0370を含む大腸菌株HB101を、実施例１に記載したように成 育させた。これら細胞により生成されるタンパクを、SDS-PAGEで分析し、ELP抗 体に対する反応性を検出した。どの分析においても、強力な反応性バンドが観測 され、その見掛けの分子量は約90kDであった。 上記結果から明らかな如く、高度に反復性の配列を調製し、クローニングし、 かつ発現のために使用して、天然の生成物、例えば絹および他のタンパク並びに 抗原とよく似た種々の生成物を製造することができる。更に、種々の宿主内で、 誘導可能な条件下で、該ペプチドの発現を調節するための新規な系を提供する。 このように、新規な諸特性を与える、新規なタンパク様生成物を提供することが でき、あるいは天然産の製品の諸特性を厳密に模倣することができる。 本明細書において述べられた全ての刊行物および特許出願は、本発明が関与す る分野における当業者の熟練のレベルを示すものである。全ての刊行物および特 許出願は、各個々の刊行物または特許出願が、具体的かつ個別的に参考文献とし て組み入れられるべく明示されたと同程度に、本発明の参考文献として組み入れ られるものである。 以上、本発明を十分に説明したが、当業者には、添付した請求の範囲の精神並 びに範囲を逸脱することなしに、多くの変更並びに改良を、該説明に加えること が可能であることは、明白であろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 カッペロ ジョセフ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92122 サン ディエゴ レノールト ス トリート 2958 (72)発明者 クリスマン ジョン ダブリュー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92126 サン ディエゴ ニュー セイラ ム 8476―＃73 (72)発明者 ドーマン マリー エイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92117 サン ディエゴ ガリーティン ウェイ 4925

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．約３〜約15のコドンを含む繰り返し単位を有し、かつ少なくとも約30kDのタ ンパクをコードする、合成DNA配列を調製する方法であって、前記方法が (1) 一本鎖オリゴマーの少なくとも２つの異なる対を合成する工程と、ここで一対の 前記オリゴマーの各々は、任意の突出した末端を除いて、オーバーラップしてお り、 (2) 前記一本鎖オリゴマーの各対をハイブリダイズさせ、二本鎖セグメントを 生成する工程と、 (3) クローニングベクター内で、前記セグメントまたはその増幅した複製体を 結合して、モノマーを形成する工程であって、前記結合されたセグメントは読み 取り枠内にある、前記工程と、 (4) 制限酵素による消化によって、前記モノマーを、前記クローニングベクタ ーから切取る工程と、 (5) 前記モノマーをオリゴマー化して、少なくとも２つのモノマーを含むマル チマーを生成する工程と、 を含むことを特徴とする、上記方法。 ２．少なくとも一つの制限酵素が、非対称共通配列位置または前記共通配列から 遠く離れたサイトにおいて切断を行う、請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．モノマーが、相互に相補性である突出末端を有する、請求の範囲第１項に記 載の方法。 ４．オリゴマー対が、同一のアミノ酸配列をコードする、少なくとも２つの異な る対を含む、請求の範囲第１項に記載の方法。 ５．オリゴマー対が、異なるアミノ酸配列をコードする、少なくとも２つの異な る対を含む、請求の範囲第１項に記載の方法。 ６．オリゴマー対の数が、２〜４の範囲内にあり、かつ少なくとも一つのオリゴ マーが同一のストランド上に突出した末端をもつ、請求の範囲第１項に記載の方 法。 ７．繰り返し単位が、４〜12個のコドンをもつ、請求の範囲第１項に記載の方法 。 ８．モノマーの少なくとも一部を、オリゴマー化する前に配列決定して、前記マ ルチマーを製造する、請求の範囲第１項に記載の方法。 ９．約３〜15個のコドンを含む繰り返し単位を有し、かつ少なくとも約30kDのタ ンパクをコードする合成DNA配列の製造方法であって、前記方法が (1) 一本鎖オリゴマーの少なくとも３つの異なる対を合成する工程であって、 一対の前記オリゴマーの各々は、任意の突出末端を除いて、オーバーラップして いるものである、前記工程と、 (2) 前記一本鎖オリゴマーの各対をハイブリダイズさせ、各々21〜90個の塩基 を含む二本鎖セグメントを生成することにより、少なくとも３つのセグメントを 生成する工程であって、各セグメントは、異なる核酸配列を有し、かつ隣接する セグメントに対して相補性末端を有するものである、前記工程と、 (3) クローニングベクター内で前記セグメントまたはその増幅された複製体を 結合して、モノマーを生成する工程であって、前記結合したセグメントが読み取 り枠内にあるものである、前記工程と、 (4) 制限酵素による消化によって、前記モノマーを、前記クローニングベクタ ーから切り出す工程と、 (5) 前記モノマーをオリゴマー化して、少なくとも２つのモノマーを含むマル チマーを生成する工程と、 を含むことを特徴とする上記方法。 10．オリゴマー化する前に、前記モノマーを分析する付随的な工程をも含む、請 求の範囲第９項に記載の方法。 11．少なくとも一つの繰り返し単位が、 Ｇαβ，GAGAGS，GVGVP，VPGVG，SGAGAG，およびAGAGSG （ここで、αおよびβは任意のアミノ酸であり、αおよびβは前記コードされる タンパクが数基準で約10〜45％のプロリンを含むように選択される）からなる 一つのアミノ酸配列をコードする、請求の範囲第９項に記載の方法。 12．約３〜15個のコドンを含む繰り返し単位を有し、かつ少なくとも約30kDのタ ンパクをコードするDNA配列の製造方法であって、前記方法が (1) 約30〜100個の塩基を含む一本鎖オリゴマーの、少なくとも３つの異なる 対を合成する工程であって、一対の前記オリゴマーの各々が、任意の突出末端を 除いて、オーバーラップしている、前記工程と、 (2) 前記オリゴマー対をハイブリダイズさせ、セグメントを生成する工程と、 (3) 第一のセグメントを、直線状化したクローニングベクターに挿入する工程 と、 (4) 前記第一セグメントを配列決定して、前記配列の忠実度を保証する工程と 、 (5) 前記セグメントの末端近傍を開裂する制限酵素で、前記ベクターを直線状 化し、かつ前記クローニングベクターを前記前者のセグメントの末端近傍のサイ トにおいて切取りを行う制限酵素によって消化することにより、前記前者のセグ メントの末端に、付随的なセグメントを付加し、各連続するセグメントを、前記 前者のセグメントと共に読み取り枠内に挿入し、かつ前記後者のセグメントを含 む前記クローニングベクターをクローニングして、モノマーを生成する工程と、 (6) 前記クローニングベクターから前記モノマーを切り取る工程と、 (7) 前記モノマーをオリゴマー化して、少なくとも２つのモノマーを含む、少 なくとも一つのマルチマーを生成する工程とを含み、 前記セグメントおよびベクターの前記配列が、前記セグメントの挿入および制限 酵素を用いた制限酵素消化による前記モノマーの切取りを可能とするように選択 され、前記制限酵素は非対称の共通配列位置においてまたは前記共通配列の遠位 において開裂する、ことを特徴とする上記方法。 13．オリゴマー化前に、前記モノマーを分析する付随的工程を含む、請求の範囲 第12項に記載の方法。 14．少なくとも一つの前記繰り返し単位が、 Ｇαβ，GAGAGS，GVGVP，VPGVG，SGAGAG，およびAGAGSG （ここで、αおよびβは任意のアミノ酸であり、αおよびβは前記コードされる タンパクが数基準で約10〜45％のプロリンを含むように選択される）からなるア ミノ酸配列をコードする、請求の範囲第12項に記載の方法。 15．約３〜15個のコドンを含む繰り返し単位を有し、かつ少なくとも約30kDのタ ンパクをコードする合成DNA配列の製造方法であって、前記方法が (1) 一本鎖オリゴマーの少なくとも２つの異なる対を合成する工程であって、 一対の前記オリゴマーの各々が、任意の突出末端を除いてオーバーラップしてい る、前記工程と、 (2) 前記一本鎖オリゴマーの各対をハイブリダイズさせ、二本鎖セグメントを 生成する工程と、 (3) クローニングベクター内で第一セグメントをクローニングし、かつ前記ク ローニングした前記第一のセグメントを分析して、前記配列の忠実度を決定して 、誤った配列をもつ全てのセグメントを廃棄する工程と、 (4)(a)読み取り枠内で、各続きのセグメントを、前のセグメントに付加して、 モノマーを生成し、かつ各続きのセグメントの前記配列の忠実度を測定するか、 あるいは (b) クローニングベクター内で、各続きのセグメントをクローニングし、かつ 各続きのセグメントを分析して、前記配列の忠実度を測定し、前記セグメントま たはその増幅された複製体を、クローニングベクター内で結合して、モノマーを 生成する工程であって、前記結合したセグメントが読み取り枠内にある、前記工 程と、 (5) 制限酵素による消化によって、前記モノマーを前記クローニングベクター から切取る工程と、 (6) 前記モノマーをオリゴマー化して、少なくとも２つのモノマーを含むマル チマーを生成する工程と、 を含むことを特徴とする上記方法。 16．オリゴマー化前に、前記モノマーを分析する付随的工程を含む、請求の範囲 第15項に記載の方法。 17．少なくとも一つの前記繰り返し単位が、 Ｇαβ，GAGAGS，GVGVP，VPGVG，SGAGAG，およびAGAGSG （ここで、αおよびβは任意のアミノ酸であり、αおよびβは前記コードされる タンパクが数基準で約10〜45％のプロリンを含むように選択される）からなるア ミノ酸配列をコードする、請求の範囲第15項に記載の方法。 18．約３〜15個のコドンを含む繰り返し単位を有し、かつ少なくとも約30kDのタ ンパクをコードする合成DNA配列の製造方法であって、前記方法が (1) 一本鎖オリゴマーの、少なくとも２つの異なる対を合成する工程であって 、一対の前記オリゴマーの各々が、任意の突出した末端を除きオーバーラップし ている、前記工程と、 (2) 一本鎖オリゴマーの各対をハイブリダイズさせ、二本鎖セグメントを生成 する工程と、 (3) 予め合成したモノマーから、少なくとも一つの二本鎖セグメントを単離す る工程と、 (4) クローニングベクター内で、前記セグメントまたはその増幅された複製体 を結合する工程であって、前記結合されたセグメントが読み取り枠内にある、前 記工程と、 (5) 制限酵素による消化によって、前記モノマーを、前記クローニングベクター から切取る工程と、 (6) 前記モノマーをオリゴマー化して、少なくとも２つのモノマーを含むマルチ マーを生成する工程と、 を含み、合成されたセグメントを配列決定して、複製の忠実度を保証することを 特徴とする上記方法。 19．オリゴマー化前に、前記モノマーを分析する付随的工程を含む、請求の範囲 第18項に記載の方法。 20．少なくとも一つの前記繰り返し単位が、 Ｇαβ，GAGAGS，GVGVP，VPGVG，SGAGAG，およびAGAGSG （ここで、αおよびβは任意のアミノ酸であり、αおよびβは前記コードされる タンパクが数基準で約10〜45％のプロリンを含むように選択される）からなる アミノ酸配列をコードする、請求の範囲第18項に記載の方法。 21．約３〜15個のコドンを含む繰り返し単位を有し、かつ少なくとも約30kDのタ ンパクをコードする合成DNA配列の製造方法であって、前記方法が (1) プライマー結合部位を側方に有する約３〜15個のコドンの繰り返し単位を 含有する、約100〜300個の塩基を含むモノマーをコードする、１本鎖を合成する 工程と、 (2) 相補鎖を調製し、得られるdsDNAモノマーを、ポリメラーゼ連鎖反応によ り増幅する工程であって、前記反応が、前記１本鎖の配列の前記繰り返し部分と ハイブリダイズしない配列を含み、更に制限サイトの共通配列を含まず、または その一部を含む配列を有する、15〜50ntのプライマーを使用し、前記１本鎖が、 前記共通配列を完成し、前記プライマーは、前記制限サイトの一部を含み、前記 プライマーは、前記dsDNAの各端部について異なっており、前記相補性プライマ ーとハイブリダイズした際に少なくとも85℃のTm、少なくとも40%のGCを有する ことにより特徴付けられ、かつ前記Tmは、前記２つのプライマー間で２℃以下だ け異なるものである、前記工程と、 (3) 前記dsDNAモノマーをクローニングし、かつ正確な前記配列をもつモノマ ーにつき選別する工程と、 (4) 前記モノマーをオリゴマー化して、少なくとも２つのモノマーを含む少な くとも一つのマルチマーを生成する工程と、 を含むことを特徴とする、上記方法。 22．少なくとも一つの繰り返し単位が、 Ｇαβ，GAGAGS，GVGVP，VPGVG，SGAGAG，およびAGAGSG （ここで、αおよびβは任意のアミノ酸であり、αおよびβは前記コードされる タンパクが数基準で約10〜45％のプロリンを含むように選択される）からなるア ミノ酸配列をコードする、請求の範囲第21項に記載の方法。 23．更に、突出末端を与える制限酵素により前記プライマーを除去し、かつ突出 末端を与える制限酵素と共にクローニングした後、前記dsDNAモノマーを切り取 る工程をも含む、請求の範囲第21項に記載の方法。 24．約３〜15個のコドンを含む繰り返し単位を有し、かつ少なくとも約30kDのタ ンパクをコードする合成DNA配列の製造方法であって、前記方法が (1) 一本鎖オリゴマーの、少なくとも２つの異なる対を合成する工程であって 、一対の前記オリゴマーの各々が任意の突出末端を除きオーバーラップする、前 記工程と、 (2) 一本鎖オリゴマーの各対をハイブリダイズサせて、二本鎖セグメントを生 成する工程、 (3) クローニングベクター内で、前記セグメントまたはその増幅された複製体 を結合して、モノマーを形成する工程であって、前記結合したセグメントが読み 取り枠内にある、前記工程と、 (4) 制限酵素による消化によって、前記モノマーを前記クローニングベクター から切り取る工程、 (5) 前記モノマーをオリゴマー化して、少なくとも２つのモノマーを含むマル チマーを生成する工程であって、前記セグメントおよびベクターの配列が、前記 セグメントの挿入および制限酵素での消化による前記モノマーの切取りを可能と するように選択される、前記工程と、 (6) 発現宿主内での発現機能のある、発現ベクター内に前記マルチマーを挿入 する工程、 (7) 前記発現ベクターを前記発現宿主に組み込み、かつ前記発現宿主を成育さ せ、前記タンパク質ポリマーを発現させる工程、 を含むことを特徴とする、上記方法。 25．発現されたタンパクポリマーを精製する付随的工程をも含む、請求の範囲第 24項に記載の方法。 26．少なくとも一つの繰り返し単位が、 Ｇαβ，GAGAGS，GVGVP，VPGVG，SGAGAG，およびAGAGSG （ここで、αおよびβは任意のアミノ酸であり、αおよびβは前記コードされる タンパクが数基準で約10〜45％のプロリンを含むように選択される）からなる一 つのアミノ酸配列をコードする、請求の範囲第24項に記載の方法。 27．前記発現宿主が、大腸菌である、請求の範囲第24項に記載の方法。 28．約３〜15個のコドンを含む繰り返し単位を有し、かつ少なくとも約30kDのタ ンパクをコードする合成DNA配列の製造方法であって、前記方法が (1) プライマー結合サイトと隣接する約３〜15個のコドンの繰り返し単位を含 有する、約100〜300個の塩基を含むモノマーをコードする、１本鎖を合成する工 程と、 (2) 相補性鎖を調製し、得られるdsDNAモノマーを、前記１本鎖の配列の繰り 返し部分とはハイブリダイズせず、末端に近接して制限部位を含まない、あるい は一部を含む配列を有する20〜45ntのプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反 応により増幅する工程であって、前記プライマーは前記dsDNAの各末端について 異なっており、少なくとも40%のGC、少なくとも85℃のTmを有することにより特 徴付けられ、かつTmは前記２つのプライマー間で２℃以下だけ異なっている、前 記工程と、 (3) 前記dsDNAモノマーをクローニングし、かつ前記正確な配列をもつモノマ ーについて選別する工程と、 (4) 前記モノマーをオリゴマー化して、少なくとも２つのモノマーを含むマル チマーを生成する工程と、 (5) 発現宿主内での発現に関して機能性の、発現ベクター内に前記マルチマー を挿入する工程と、 (6) 前記発現ベクターを前記発現宿主に組み込み、かつ前記発現宿主を成育さ せ、前記タンパク質ポリマーを発現させる工程と、 を含むことを特徴とする、上記方法。 29．発現されたタンパクポリマーを精製する付随的工程をも含む、請求の範囲第 28項に記載の方法。 30．少なくとも一つの繰り返し単位が、 Ｇαβ，GAGAGS，GVGVP，VPGVG，SGAGAG，およびAGAGSG （ここで、αおよびβは任意のアミノ酸であり、αおよびβは前記コードされる タンパクが数基準で約10〜45％のプロリンを含むように選択される）からなる アミノ酸配列をコードする、請求の範囲第28項に記載の方法。 31．発現宿主が、大腸菌である、請求の範囲第28項に記載の方法。 32．約３〜15個のコドンを含む繰り返し単位を有し、かつ少なくとも約30kDのタ ンパクをコードする合成DNA配列の製造方法であって、前記方法が (1) モノマーの第一のセグメントをコードする１本鎖を合成する工程であって 、前記モノマーが、約３〜15個のコドンの繰り返し単位を含有する、約100〜300 個の塩基を含むものである、前記工程と (2) 相補鎖を調製し、得られる第一のdsDNAセグメントを、前記１本鎖の配列 の繰り返し部分とはハイブリダイズせず、末端に近接して制限部位を含まない、 あるいは一部を含む配列を有する20〜45ntのプライマーを使用するポリメラーゼ 連鎖反応により増幅する工程であって、プライマーが制限部位の一部を含む場合 は前記１本鎖が前記共通配列を完成し、前記プライマーは、少なくとも40%のGC を有し、相補性プライマーとハイブリッド化した場合に、少なくとも85℃のTmを もつことにより特徴付けられ、かつ前記２つのプライマー間でTmは２℃以下だけ 異なっている、前記工程と、 (3) 第一のクローニングベクター内で、前記第一のdsDNAセグメントをクロー ニングし、正確な配列をもつ第二の二本鎖DNAセグメントについて選別する工程 、 (4) 制限酵素での消化により、前記第一のクローニングベクターから、前記 第二の二本鎖セグメントを切取る工程、 (5) 予め合成したモノマーから、第三の二本鎖セグメントを単離する工程、 (6) 第二のクローニングベクター内で、前記第二および第三の二本鎖セグメン トまたはその増幅した複製体を結合してモノマーを生成する工程であって、前記 結合したセグメントが、読み取り枠内にあり、かつ前記モノマーが、約３〜15個 のコドンの繰り返し単位を含有する、約100〜300個の塩基を含むものである、前 記工程と、 (7) 制限酵素での消化により、前記第二のクローニングベクターから、前記モ ノマーを切取る工程、および (8) 前記モノマーをオリゴマー化して、少なくとも２つのモノマーを含むマル チマーを生成する工程、 を含むことを特徴とする、上記方法。 33．前記予め合成したモノマーが、以下の工程を含む方法により合成される、請 求の範囲第32項に記載の方法： (1) 一本鎖オリゴマーの、少なくとも２つの異なる対を合成する工程であって 、一対の前記オリゴマー各々が任意の突出する末端を除いてオーバーラップして いるものである、前記工程、 (2) 一本鎖オリゴマーの各対をハイブリダイズさせ、二本鎖セグメントを生成 する工程、 (3) クローニングベクター内で、前記セグメントまたはその増幅した複製体を 結合して、モノマーを形成する工程であって、前記結合したセグメントが読み取 り枠内にある、前記工程、 (4) 制限酵素での消化により、前記モノマーを、前記クローニングベクターか ら切取る工程、および (5) 前記モノマーをオリゴマー化して、少なくとも２つのモノマーを含むマル チマーを生成する工程。 34．予め合成したモノマーが、以下の工程を含む方法により合成される、請求の 範囲第32項に記載の方法： (1) プライマー結合サイトに隣接する、約３〜15個のコドンの繰り返し単位を 含有する、約100〜300個の塩基を含むモノマーをコードする、１本鎖を合成する 工程、 (2) 相補鎖を調製し、かつ前記得られるdsDNAモノマーを、前記１本鎖の配列 の繰り返し部分とはハイブリダイズせず、末端に近接して制限部位を含まない、 あるいは一部を含む配列を有する20〜45ntのプライマーを使用するポリメラーゼ 連鎖反応により増幅する工程であって、プライマーが制限部位の一部を含む場合 は前記１本鎖が共通配列を完成させるものであり、、前記プライマーは、前記ds DNAの各末端について異なっており、、少なくとも40%のGCを有し、前記相補性プ ライマーとハイブリッド化した場合に少なくとも85℃のTmをもつことに より特徴付けられ、Tmは前記２つのプライマー間で２℃以下だけ異なるものであ る、前記工程、 (3) 前記dsDNAモノマーをクローニングし、かつ前記正確な配列をもつモノマ ーについて選別する工程、および (4) 前記モノマーをオリゴマー化して、少なくとも２つのモノマーを含む、少 なくとも一つのマルチマーを生成する工程。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008048732A (ja) * 2006-07-28 2008-03-06 Kao Corp ジピコリン酸又はその塩の製造方法
JP2013106599A (ja) * 2011-11-24 2013-06-06 Sanyo Chem Ind Ltd 細胞集合体培養用基材及び細胞集合体の生産方法

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6018030A (en) * 1986-11-04 2000-01-25 Protein Polymer Technologies, Inc. Peptides comprising repetitive units of amino acids and DNA sequences encoding the same
CA2379823A1 (en) * 1999-07-16 2001-01-25 Human Genome Sciences, Inc. Real-time, in situ biomanufacturing process monitoring and control in response to ir spectroscopy
US6737519B1 (en) 1999-07-30 2004-05-18 Genome Therapeutics Corporation Human genes relating to respiratory diseases and obesity
US6838553B1 (en) 1999-10-05 2005-01-04 Academia Sinica Peptide repeat immunogens
AU2001281464A1 (en) 2000-03-13 2001-09-24 Monsanto Technology Llc Recombinant proteins containing repeating units
US6852834B2 (en) 2000-03-20 2005-02-08 Ashutosh Chilkoti Fusion peptides isolatable by phase transition
US20050255554A1 (en) * 2000-03-20 2005-11-17 Ashutosh Chilkoti Fusion peptides isolatable by phase transition
JP2001352990A (ja) * 2000-06-16 2001-12-25 Japan Science & Technology Corp 多機能塩基配列及びそれを含む人工遺伝子
GB0025144D0 (en) * 2000-10-13 2000-11-29 Medical Res Council Concatenated nucleic acid sequences
IL141392A0 (en) 2001-02-12 2002-03-10 Gene Bio Applic Ltd Orientation-directed construction of plasmids
EP1448089A4 (en) 2001-11-01 2008-06-04 Spine Wave Inc DEVICES AND METHODS FOR SPINACH RECOVERY
US7799833B2 (en) 2001-11-01 2010-09-21 Spine Wave, Inc. System and method for the pretreatment of the endplates of an intervertebral disc
US7789913B2 (en) 2004-06-29 2010-09-07 Spine Wave, Inc. Methods for injecting a curable biomaterial into an intervertebral space
US20070098702A1 (en) * 2005-02-17 2007-05-03 University Of Maryland, Baltimore Recombinant protein polymer vectors for systemic gene delivery
GB2424886A (en) 2005-04-04 2006-10-11 Dxs Ltd Polynucleotide primers against epidermal growth factor receptor and method of detecting gene mutations
US8841255B2 (en) 2005-12-20 2014-09-23 Duke University Therapeutic agents comprising fusions of vasoactive intestinal peptide and elastic peptides
CA2634034A1 (en) 2005-12-20 2007-06-28 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
US20130172274A1 (en) 2005-12-20 2013-07-04 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
US7709227B2 (en) * 2006-01-04 2010-05-04 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Multimeric ELP fusion constructs
US9131671B2 (en) * 2008-02-01 2015-09-15 Entogenetics, Inc. Methods, compositions and systems for production of recombinant spider silk polypeptides
EP3412300A1 (en) 2008-06-27 2018-12-12 Duke University Therapeutic agents comprising elastin-like peptides
CA2804755C (en) * 2009-08-14 2018-06-05 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Modified vasoactive intestinal peptides
US9561262B2 (en) 2011-06-06 2017-02-07 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Use of modified vasoactive intestinal peptides in the treatment of hypertension
EP2668962B1 (en) * 2012-05-29 2016-10-26 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Protein assembler
AR091774A1 (es) 2012-07-16 2015-02-25 Dow Agrosciences Llc Proceso para el diseño de las secuencias de adn repetidas, largas, divergentes de codones optimizados
CA2947982C (en) 2014-05-08 2022-11-29 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating cystic fibrosis
US10688156B2 (en) 2015-02-09 2020-06-23 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating muscle disease and disorders
US20180271939A1 (en) * 2017-03-24 2018-09-27 Milton J. Silverman, JR. Genetic method to kill cancer cells by suffocation
EP3862030A4 (en) * 2018-10-05 2022-08-31 Hiroshima University MENISCIAL REGENERATION MATERIAL
CN113454399A (zh) 2018-12-27 2021-09-28 天酷系统股份有限公司 冷却面板系统
US11359841B2 (en) 2019-04-17 2022-06-14 SkyCool Systems, Inc. Radiative cooling systems

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0293443B1 (en) * 1986-11-04 2003-02-26 Protein Polymer Technologies, Inc. Construction of synthetic dna and its use in large polypeptide synthesis
US5641648A (en) * 1986-11-04 1997-06-24 Protein Polymer Technologies, Inc. Methods for preparing synthetic repetitive DNA
JPH02502604A (ja) * 1987-01-07 1990-08-23 アライド・コーポレーション ペプチドオリゴマーの微生物生産法
US5089406A (en) * 1987-01-07 1992-02-18 Allied-Signal Inc. Method of producing a gene cassette coding for polypeptides with repeating amino acid sequences
ATE161879T1 (de) * 1988-11-09 1998-01-15 Protein Polymer Tech Inc Funktionelles, durch ein rekombinantes verfahren hergestelltes synthetisches proteinpolymer
US5023171A (en) * 1989-08-10 1991-06-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Method for gene splicing by overlap extension using the polymerase chain reaction
US5637459A (en) * 1990-06-11 1997-06-10 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chimeric selex
WO1993003151A1 (en) * 1991-08-10 1993-02-18 Medical Research Council Treatment of cell populations
WO1993010154A1 (en) * 1991-11-12 1993-05-27 Protein Polymer Technologies, Inc. High molecular weight collagen-like protein polymers
WO1994012632A1 (en) * 1992-11-27 1994-06-09 University College London Improvements in nucleic acid synthesis by pcr
DE4428651C1 (de) * 1994-08-12 1996-02-29 Inst Molekulare Biotechnologie Verfahren zur Herstellung und Amplifikation von Nukleinsäuren

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008048732A (ja) * 2006-07-28 2008-03-06 Kao Corp ジピコリン酸又はその塩の製造方法
JP2013106599A (ja) * 2011-11-24 2013-06-06 Sanyo Chem Ind Ltd 細胞集合体培養用基材及び細胞集合体の生産方法

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