JPS62181789A - バチルスの制御領域のクロ−ニング及び解析のためのプラスミド - Google Patents

バチルスの制御領域のクロ−ニング及び解析のためのプラスミド

Info

Publication number
JPS62181789A
JPS62181789A JP61265399A JP26539986A JPS62181789A JP S62181789 A JPS62181789 A JP S62181789A JP 61265399 A JP61265399 A JP 61265399A JP 26539986 A JP26539986 A JP 26539986A JP S62181789 A JPS62181789 A JP S62181789A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
sequence
plasmid
promoter
region
bacillus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP61265399A
Other languages
English (en)
Inventor
ヤン　ヘンドリック　ヴァン　エー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gist Brocades NV
Original Assignee
Gist Brocades NV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gist Brocades NV filed Critical Gist Brocades NV
Publication of JPS62181789A publication Critical patent/JPS62181789A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/832—Bacillus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の分野） プラスミドは、グラム陽性細菌、特にバチルス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）中の遺伝子の制御領域を単離し、評価する
のに提供される。合成制御領域は、便利な制限部位と組
合せて提供され、これにより、バチルス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）中で機能する、プロモーター配列、リボソーム結
合部位配列及びシグナル配列の少なくとも１つを含む種
々のカセットを作ることができ、これらのうちの１つ以
上の領域を評価すべき領域と置換することができる。多
数の制限部位は、１つの領域の他の領域への置換を容易
にする。
（発明の背景） 微生物において遺伝子操作技術を使用するのに、大腸菌
以後、バチルス属も近年の発展的研究課題となってきて
いる。例えば、“遺伝子発現の実験操作”（アカデミツ
ク・プレス、３３〜５１頁、１９８３年）におけるドウ
ブナウ（Ｄｕｂｎａｕ）及び、“バイオテクノロジー及
び遺伝子操作”（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ
　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）　、２巻
、１２６〜１５５頁（１９８４）におけるトイ（Ｄｏｉ
）の報告を参照せよ。バチルスは現在、発酵工業におい
て長い期間にわたって利用されている。
バチルスは、安価な基礎物質で良好の生育を示し、大腸
菌と異なり、いかなる内毒素も産生じないというような
多くの利点をもつ。さらに、バチルスは生育培地中にタ
ンパク質を分泌することができ、特にプロテアーゼやア
ミラーゼのようなある種の酵素がバチルスにより、しば
しば大量に産生される。これらの酵素は、発酵培地から
比較的安価にそして容易に単離することができる。
同種もしくは異種ペプチドの産生に対する宿主としての
バチルスの魅力のために、興味あるペプチドの効果的な
翻訳及び分泌を促す、転写及び翻訳の制御と会合してい
る特別な配列を利用できることは実質的な商業的興味を
そそる。それゆえ、その配列の効果的なスクリーニング
を促すであろう、バチルスもしくはその他のもの由来の
これらの配列を単離し、そして解析する方法に実質的な
興味がもたれる。
（関連文献の記述） Ｓ、オーレウス（Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ）のためのプラス
ミドは、枯草菌（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ）中、染色体
外に維持されうる。（アーリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）、
プロシーディンゲス・イン・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエンス、（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、）アメリカ、（１９７７年）、７４巻、１６
８０〜１６８２頁）。
種々の真核及び原核生物の異種タンパク質が、通常は低
い発現レベルではあるが、枯草菌（Ｂ。
５ｕｂｔｉｌｉｓ）にクローン化されている。例えば、
ジャーナル・オブ・バタテリオロジー（Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　、１６２巻５２１〜５２８頁
（１９８５年）のコバセビック等（Ｋｏｖａｃｅｖｉｃ
　ｅｔ　ａｌ）、同誌、１５７巻７１８〜７２６頁（１
９８４年）のサウンダ−ｘ　（Ｓａｕｎｄｅｒｓ）等、
１９８４年、アメリカ、スタンフォードにおける第３回
バチルスの遺伝学とバイオテクノロジーに関する国際会
議におけるオームラ（Ｏｈｍｕｒａ）等、ＦＥＭＳレタ
ー（Ｌｅｔｔｅｒｓ）、２３巻、６５〜７０頁（１９８
４年）のラン・トス）　レム（Ｌｕｎｄｓｔｒｉ５ｍ）
、ジーン（Ｇｅｎｅ）　２２巻、２２９〜２３５頁（１
９８３年）のパルバ（ｐａｌｖａ）等、ウィルス・リサ
ーチ（Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ、）　　２巻、６９〜８３頁
（１９８５年）のランドストレム（Ｌｕｎｄｓｔｒ’６
ｍ）等、ネーチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　　２９３巻４
８１〜４８３頁（１９８１年）のハープイー（）ｔａｒ
ｄｙ）等、ネーチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　　３０２巻
５４３〜５４５頁（１９８３年）のモスバク（Ｍｏ　ｓ
　ｂ　ａ　ｃ　ｈ）等、Ｎ５Ｃ３ｅｒ、４巻、２５４〜
２６１頁（１９８２年）のチャング（Ｃｈａｎｇ）等、
ジー７　（Ｇｅｎｅ）　　１６巻１９９〜２０６頁（１
９８１年）のウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）等、及
びモレキユラー・アンド・ジェネラル、ジェネティクｘ
　（Ｍｏｌ、　Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）１９５巻２４６
〜２５１頁（１９８４年）のフロック（Ｆｌｏｃｋ）等
の報告を参照せよ。
経済的に許容できる発現レベルに到達するために、その
クローニングシステムに改良を加える必要がある。これ
に関連して、特に、異種遺伝子の転写効率を改善するた
めのプロモーターの修正、翻訳効率を改善するためのリ
ボソーム結合部位（シャイン・ダルガルノ）の修正、そ
して望ましい異種タンパク質産物の分泌を改善するため
のシグナル配列の修正に考慮が払われうる。
野生の遺伝子よりはむしろ、１つの遺伝子に、合成もし
くは天然のプロモーターを結合するための種々の提案が
なされてきている。例えば、ジャーナル・オブ・バタテ
リオロジ−（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）１４６巻
１１６２〜１１６５頁（１９８１年）ウィリアムス（Ｗ
ｉｌｌｉａｍｓ）等、ジーン（Ｇｅｎｅ）、２２巻４７
〜５７頁（１９８３年）のプラスミドｐＰＬ６０３に関
して述べたショナー（Ｓｃｈｏｎｅｒ）等、ネーチャー
　（Ｎａｔｕｒｅ）　　２９４巻３０９〜３１１頁（１
９８１年）のゴールドファーブ（Ｇｏｌｄｆａｒｂ　）
等（プラスミドｐＧＲ７１）、ジー７　（Ｇｅｎｅ）　
　２６巻３１３〜３１５頁（１９８３年）のバンド（Ｂ
ａｎｄ）等（プラスミドｐＣＰＰ　３−４　）　、及び
ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ、）１５７巻９６５〜９６７頁（１９８４年）
のドネリー（Ｄｏｎｅｌｌｙ）とソネンシェイ７　（Ｓ
ｏｎｎｅｎｓｈｅ＋ｎ）（プラスミドｐｃＥＤ　６　）
の報告を参照せよ。
しかし、これらのプラスミドは、それらが相当大きく、
そして僅か１又は２ケのプロモーター挿入部位しか含ん
でいないという欠点をもっている。
さらに、それらは全んどすべて、指示酵素としてクロラ
ムフェニコール・アセチル惨トランスフェラーゼに基づ
くものであり、誘導シャイン・ダルガルボ配列（ｐＰＬ
６０３）、もしくは不活性シャイン・ダルガルボ配列（
ｐＧＲ７１）を含んでいる。
結果的に、融合タンパク質が、クロラムフェニコール・
アセチル−トランスフェラーゼと共に形成されたとき、
換言すれば、バチルスのシャイン、ダルガルボ配列もと
もにクローン化され、しかもその読み枠が、クロラムフ
ェニコール・アセチル・トランスフェラーゼと同じであ
るならば、プロモーターを単離することができる。
シャイン・ダルガルノ配列及び開始コドンに関する議論
に対しては、エンボ・ジャーナル（Ｅ’ｌＢ口Ｊ、）３
巻６２３〜６２９頁（１９８４年）のフイ（Ｈ旧）等、
ＤＮＡ、２巻２３１〜２３５頁（１９８３年）のデーボ
ーア（Ｄｅ、　Ｂｏｅｒ）等、バイオケミストリー・ソ
サイヤティー、シンポジウム（８ｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｏ
ｃ、Ｓｙｍｐ、）　４８巻、２３３〜２４５頁（１９８
４年）のバンド（Ｂａｎｄ）及びヘナー（Ｈｅｎｎｅｒ
）の報告及びＥＰＡ１１６４１１号を参照せよ。
ジー７　（Ｇｅｎｅ）　、３６巻２１１〜２１３頁（１
９８５年）のスタンセンス（Ｓｔａｎｓｓｅｎｓ）等は
シャイン・ダルガルノ領域の上流の配列の修正の効果を
述べている。ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（
Ｊ、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、９３巻９２７〜９３０頁
（１９８３年）のイワクラ（Ｉｗａｋｕｒａ）等はｄｈ
ｆｒ遺伝子を採用したプラスミド・ベクターの構築につ
いて述べている。アグルカルチュラル・アンド・バイオ
ロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａ
ｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　
、４８巻、３１４５〜３１４６頁（１９８４年）は、Ｐ
、アエルジノサ（Ｐ、ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）における
プロモーター・クローニング・ベクターの構築について
述べている。
ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　、９５巻、８７〜９３頁（１９８
４年）のオームラ（Ｏｈｍｕｒａ）等は、アルファーア
ミラーゼのプロモーターとシグナル配列を使用した枯草
菌（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ）の分泌ベクターシステム
について述べている。ジー７　（Ｇｅｎｅ）　、１５巻
、２９７〜３０５頁（１９８１年）のエンガーーバルク
（Ｅｎｇｅｒ−Ｖａｌｋ）等はプロモーターをクローニ
ングするためのベクターについて述べている。ジェネチ
力（Ｇｅｎｅｔｉｋａ）　　（モスクワ）、１７巻２１
００〜２１０４頁（１９８１年）のツォイ（Ｔｓｏｉ）
等は、大腸菌細胞におけるＢ、スワングシエンシス（Ｂ
、ｔｈｕｒｉｎｇｓｉｅｎｓｉｓ）のＤ　Ｎ　Ａのプロ
モーター断片のクローニングと発現について述べている
。
モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス（
Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）　　１３５巻、３３９
〜３４６頁（１９８２）のモラ７　（！、１ｏｒａｎ）
等は、枯草菌（８，５ｕｂｔｉｌｉｓ）における転写及
び翻訳の開始の信号となるヌクレオチド配列について述
べている。また、ＥＰＡ　１３４０４８号も参照せよ。
（発明の要約） 新規なり　Ｎ　Ａ配列及び配列組合せが、バチルス中で
プロモーターとして機能しく尋るＤＮＡ配列の単離のた
めに提供される。該配列は、機能的シグナル配列を含む
構造遺伝子及び合成リボソーム結合部位によって特徴付
けられる。構造遺伝子によってコードされる遺伝子産生
物は、シグナル配列の援助によって、宿主生物から分泌
される。その活性は、利用可能な１カ所切断（ｕｎ　１
ｑｕｅ）制限部位の１つを好ましくは用いて、容易に分
析できる。
ただし、該リボソーム結合部位の上流にはＤＮＡフラグ
メントが挿入されている。上記配列は、さらに転写、翻
訳及び分泌に関する制限領域、及びこれらの領域を広げ
る１力所切断制限部位の存在によって交換し得る構造遺
伝子自身によって特徴付けられる。
ｐＦＲＯＭ５４は、適正な配列と間隔のプロモーターの
存否に関するフラグメントのスクリーニングに有用なプ
ロモーターのないプラスミドである。
（特別な具体例の記述） 制御ドメインが存在する新しいＤＮＡ配列が与えられた
。そのドメインは、機能的要素のサブユニットと同様に
、ドメインの個々の機能要素の挿入及び交換が許される
。そのドメインは、オペレーター、エンハンサ−、アク
チベーター、又はそれに類するような、制御に影響を与
える要素を含む、翻訳及び転写制御要素を供給する。特
に興味深いものは、転写の制御、翻訳の制御、リボソー
ム結合部位及び開始コドンの両方、分泌のためのシグナ
ル配列、及び、好ましくはシングル配列を有する読み枠
中の構造遺伝子（該シングル配列はペプチド開裂のため
の処理シグナルを含むかあるいは含まない）を提供する
ドメインである。
その構築物は、バチルスのσ５Ｓ、σ３４、σ３２、σ
２９、σ２８又は他のＲＮＡポリメラーゼに結合する選
ばれたプロモーター配列を含み、ベクターへの導入及び
切り出しのために便利な制限部位を含んでいる。また、
多くの便利な制限部位をもつ、シャインダルガルノ配列
を含み、ベクターへの導入及びそれからの切り出しが可
能となっている。
分泌のためのシグナル配列は、下流の挿入と同様に、そ
して、目的の構造遺伝子のシグナル配列の読み枠で、そ
のシグナル配列の挿入や切り出しのだめの制限部位が与
えられている。
複製システムＰＵＢＩＩＯと同様に、便利なバチルスｆ
ｆ１ｌｌシステムが用いられる。市販のベクターは、通
常、例えば、カナマイシン、クロラムフ工二コーノペテ
トラサイクリン、ストレプトマイシン、その他のような
抗生物質、重金属又はそれに類するような細胞毒性の物
質に対する耐性を与えるか、もしくは、栄養要求性の宿
主に相補性を与える、選択のためのマーカーを含んでい
る。１つ以上のマーカーが共存することもあるし、特に
シャトルベクターが用いられているときは、そのベクタ
ーは、２つ以上の宿主で複製が可能である。
便利なことに、そのベクターは、大腸菌（ｐ、ｃｏｌｉ
）における複製のための複製システムを含むこともでき
、その構築物の形成に含まれる各操作ステップの後に、
そのＤＮＡのクローニング及び拡張が可能である。
バチルス種のうちの適した宿主微生物は、枯草菌（Ｂ、
５ｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ、リチｓニホルミス（Ｂ。
１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ、アミロリクエファ
シェンス（Ｂ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）
　、Ｂ、ステアロサーモフィラス（８，ｓｔｅａｒｏｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｙｌｕｓ）である。
特別な制御領域又はシグナル配列を与える、本配列の少
なくとも１つ、望ましくは２つが、評価される配列と組
合わされて用いられる。考えられる最初の配列としては
、プロモーター配列がある。
この領域は、σ’−ＲＮＡポリメラーゼの結合に関係し
ている。ここでＸは、以前に示されたＲＮＡポリメラー
ゼのうちどれに当るかを意味している。
その配列は合成されるときもあるし、野生型のものであ
るかもしれない。例えば、σ”−ＲＮＡポリメラーゼに
対する、１つの合成プロモーターは、次の配列をもって
いる。
ＡＡＴＴＣＴＴＧＡＣＡＡＡＧＣＴＴＣＴＣＧＡＧＡＣ
ＴＧＡＴＡＴＡＡＴＧＡＧＣＴＧＡＡＣＴＧＴＴＴＣＧ
ＡＡＧＡＧＣＴＣＴＧＡＣＴＡＴＡＴＴＡＣσ５ｓ−Ｒ
ＮＡポリメラーゼにより認識される、本合成配列は、い
くつかの重要な特徴を有しており、制限酵素ＨｉｎｄＩ
［Ｉ又はＸｈｏｌによる消化により、各々−１０領域、
−３５領域の個々の置換が可能となっている。その全合
成プロモーターは、εｃｏ　Ｒ１とＳｓｔ　Ｉの消化に
より置換することができる。
σ”−ＲＮＡポリメラーゼに対する第２の合成プロモー
ターは、次のような配列をもっている。
ＡＡＴＴＣＡＧＧＡＴＴＴＡＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＣＧ
ＡＧＧＧＡＡＴＴＧＴＴＴＧＡＧＣＴＧＴＣＣＴＡＡＡ
ＴＡＣＴＴＣＧＡＡＧＡＧＣＴＣＣＣＴＴＡＡＣＡＡＡ
にの配列は、σ”−ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター
のときに述べたのと同様の利点をもっている。
その他のよく用いられるプロモーターには、１９８５年
１１月５日に６９９．８５号としてＣＢＳに保管された
；プラスミドｐＰＲＯＭ３−４ｃ中にみられる野生型プ
ロモーターのような、野生型プロモーターがあり、その
プロモーターはＢ、リチェニホルミス（Ｂ、、ｌｉｃｈ
ｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　）由来の染色体プロモーター配列
をもつ。上記プラスミドは、プラスミドｐＰＲＯＭ５４
から誘導されたものであり、そこでは、Ｂ、リチェニホ
ルミス （Ｂ、、　ｌｉｃＭｎｉｆｏｒｍｉｓ　）のブ０％−タ
ーの挿入が、本来のプロモーター及びシャイン・ダルガ
ルノ配列をもつプラスミドｐＧＢ３３と比較したとき、
枯草菌中でのアルファ・アミラーゼ産出が３５％増加さ
せた。バクテリオファージのプロモーター配列から誘導
される、もう１つのプロモーターが、１９８６年１１月
５日、ＣＢＳの第６９９．８５号に保管されたプラスミ
ド９ＦＲＯＭ　　５ＰＯ２中に存在する。このプラスミ
ドも、プラスミドｐＰＬ６０８由来のバクテリオファー
ジの配列中のプロモーター配列を挿入することによって
、プラスミドｐＰＲＯＭ５４から誘導したものであり、
前述の１９８１年のウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）
等により報告されている。そのバクテリオファージの挿
入は、天然のプロモーターより、枯草菌中でのアルファ
・アミラーゼ産出が３７％増加させる。
これら種々のプロモーター配列は、バチルス宿主中での
プロモーター効率を測定することを目的にして、種々の
生物から由来する他のプロモーター配列と置換される。
このように、合成又は天然の、プロモーター配列もしく
は、−１０領域又は−３５領域のコンセンサス配列のよ
うなプロモークー配列の領域が、本発明に従って与えら
れる他の１つ以上の配列に、そのような配列を連結する
ことにより、評価する目的で組み込まれる。
次の興味ある領域は、シャイン・ダルガルノ配列又はリ
ボゾーム結合領域である。この目的に対し、うまく用い
ることができる合成領域は次の配列をもっている。
ＧへＴＣＣへ人ＧＧＡＧＧＴへへＴ ＧＴＴＣＣＴＣ［：へＣＴＡＧＡＴＣ 本発明で用いられる第３の配列は、成熟したアルファ・
アミラーゼをコードする領域、もしくは、ハイブリッド
遺伝子を作るべく他の遺伝子にうまく結合した、アルフ
ァ・アミラーゼのシグナル配列である。便利な制限部位
が、アルファ・アミラーゼのシグナル配列と、アルファ
・アミラーゼ遺伝子の他の部分の間に与えられ、成熟し
たアルファ・アミラーゼをコードする領域の置換が可能
となっている。
用いられるそのフラグメントの各々は、個々のフラグメ
ントの導入と切り出しを許す１つ以上の制限お位を供給
する。このように、ポリリンカー又は、好ましくは１ケ
所切断制限部位である、１つ以上の制限部位が、便利な
配列の挿入又は切り出しのために、それら領域内及び領
域間に存在する。通常、そのポリリンカーは、少なくと
も２ケの制限部位をもち、通常は約６ケ以上の制限部位
はもたず、さらに一般的には約４ケ以上の制限部位は有
さず、しばしば、１ケ所切断制限部位である。典型的な
制限酵素認識部位は従来から示されているものである。
本発明の構築物は、従来の方法に従って調製することが
できる。上記領域を他の配列で置換することは、そのよ
うな他の配列の修正を必要とするかもしれない。その修
正とは、制限部位の導入又は除去を起こす、リンカ−、
アダプター、試験管内突然変異、リセクション、修復、
プライマー修復、又はそれに類するものの使用、修正し
た末端、その他のものを含んでいる。各々の操作の後、
通常は、大腸菌（ε、ｃｏｌｉ）のような便利な宿主中
で、その新しい構築物をクローン化し、その新しい構築
物を単離し、制限地図、配列決定又はそれに類するもの
で、正しい配列の存在を確かめることが望ましい。ひと
たび、その構築物が完成してしまえば、それは、バチル
ス宿主中での複製を可能にするベクターに移されるか、
さもなくば、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）中でのクロー
ニング及び、バチルス宿主への直接移すことができるよ
う、シャトルベクターが、その構築物に使用される。
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）中のプロモーター領域
の機能のためのＤＮＡフラグメントをスクリーニングす
るためのフィッシング（ｆｉｓｈｉｎｇ　）プラスミド
の構造に特別の興味がある。このフィッシングプラスミ
ドは、プロモーター領域を検出するための２つの必要領
域を有する。第一の領域はプロモータースクリーニング
領域であり、第２の領域は、形質転換体選択領域である
。スクリーニング領域は、転写の方向にあり、１又は複
数の１力所切断制限部位、通常は６未満の制限部位を有
し、かつ転写禁止活性が欠失している約４〜ｔｏｏｂｐ
の領域を含む。制限部位領域よりも下流は、約５〜５０
ｂｐのリボソーム結合部位領域であり、シャインーダル
ガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）　：ｌ　：／
−（！　７サス（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ　）配列の一端に
非コードヌクレオチドを含んでいる。この配列は天然に
より生じるものでもよく、又合成でもよい。リボゾーム
結合領域の次に、分泌のためのシグナル配列を有する構
造遺伝子が続いている。この構造遺伝子は、内因性宿主
物質からの重大な干渉の可能性なしに、簡単な化学反応
により容易に検出できる生産物を表示する。アミラーゼ
とヨー素の組合せにより検出できるα−アミラーゼに特
別興味があり、ここで、色の消失によりα−アミラーゼ
の発現及び制限部位領域のプロモーターの存在が示され
る。
第２領域は、形質転換体の選択を規定する。この領域は
、抗生物質抵抗を示す遺１云子を通常コードするので、
細胞毒には畝らない量の抗生物質を含む媒地中で生育す
ると、このプラスミドを有する形質転換体のみが生き残
る。適当な遺伝子によりネオマイシン、テトラサイクリ
ン、ペニシリン、カナマイシン等に対する抵抗性が付与
できる。
スクリーニング及び選択領域は、両方ともバチルス中の
複製システム機能にくみこまれ得る。クローニングのた
めに大腸菌（ε、ｃｏｌｉ）の複製システムのように、
他の機能領域をプラスミド中に存在させることができる
。
バチルス中に転写禁止可能な領域をもつ、バチルス、他
の宿主、例えば細菌からのフラグメント化Ｄ　Ｎ　Ａを
、フィッジング又はスクリーニング方は、伴いうる。こ
のフラグメントは、機械的に、又は１又は複数の制限酵
素、特に制限部位領域に存在する制限部位に対して相補
的末端を有する酵素を用いることにより製造できる。２
０ｂｐぐらい小さいフラグメント及び約５にｂｐ以下の
もの、通常は２Ｋｂｐ以下のものを、スクリーニングの
ために、通常的５０ｂｐ〜ｌ　ｋｂｐのものが得られる
。このフラグメントは、従来法によりフィッシングプラ
スミド中に挿入される。次に得られたプラスミドライブ
ラリーを宿主バチラス中に形質転換し、その形質転換体
を抗生物質に対する抵抗性を用いて選択する。
次に生き残ったバチルス形質転換体を、アミロースを有
するクローンとヨー素に接触させて活性ブロモ−クーを
スクリーニングし、濁りのない領域で囲まれているクロ
ーンを単離する。バチルスのトランスフォーメーション
は、従来法に従って行った。例えば、ジャーナル・オブ
・バクテリオロジ−（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　３
１巻、７４１〜７４６頁（１９６１年）のアナグツスト
ポウロス（Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ　）とスピ
ジゼン（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ　）の報告を参照せよ。さら
に形質転換体は、そのマーカーの性質に従って選択する
ことができる。
本構築物を使うことにより、構造遺伝子がその発現及び
分泌能力の評価をうけ、望ましい産物を効率よく産生ず
るために、制御領域と構造遺伝子が混合され、組み合せ
られる。ペプチドの分泌を含む産生は他の制御及び機能
配列に対して測定及び比較した。次に示す実施例は、説
明のためで、制限のために提示したものではない。
実施例■ 染色体ＤＮＡの単離 １９８３年７月６日、ＣＢＳの第４７０．８３号に保管
にされた（ＥＰＡ１３４０４８参照）、Ｂ。
リチニホルミス（Ｂ、　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　
）　Ｔ　５株の染色体ＤＮＡを、通気下、３７℃で一晩
培養した３１の培地から単離した。その細胞を、ツルバ
ール（Ｓｏｒｖａｌｌ　）　ＣＴ　Ｓ　Ａ　Ｏ−ターで
ｔｏｏｏｏｒｐｍ。
１０分間遠心し、２５重量パーセントのスクロースと、
５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ８，０）を含む１０ｍ１の
スクロース−トリス・バッファに９ＦＲｔシ、０、５　
ｍ　ｌのりゾチーム溶液（２０ｍｇ／ｍｌ１）を加え、
３７℃で１５分間インキュベーションすることにより溶
菌した。２ｍｆのＥＤＴＡ（０，５Ｍ）を加えたあと、
ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加えた。それから
、そのサスペンションを（１：１）のフェノール−クロ
ロホルム混合液で抽出した。その上澄水層を取り、注意
深く２倍容のエタノールを重層し、その後、ガラス棒を
つかって、ＤＮＡを単離した。その蒸留水溶液に１０ｍ
ｇ／ｍｊ！のリボヌクレアーゼを添加後、その混合物を
（１：ｌ）のフェノール−クロロホルムで抽出した。そ
して、２倍容のエタノールで沈殿させた生成物をＴＥバ
フフｙ（１０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ８，０）及び１ｎ
＋ＭＥＤＴＡ）に溶かした。
実施例■ プラスミドＤＮＡの単離 ＣＢＳ第４６６．８３号に保管されている（ＥＰＡ１３
４０４８参照）、プラスミドｐＧＢ３３を含む枯草菌（
Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）　１−８５を最小培地１βで１
晩培養し、ｌｏｍｇ、’ｍ１のナオマイシンを加えた。
ツルバール（Ｓｏｒｖａｌｌ　）モデル、ＧＳＡＯ−タ
ーで５００　Ｏｒｐｍ　　１５分間遠心し、１５ｍｊ’
のスクロース−トリスに再懸濁した後、その細胞を溶菌
し、ＥＤＴＡとＳＤＳで処理した（実施例■参照）。塩
化ナトリウムをＩＭとなるように加え、その分解物を４
℃で一晩放置し、ひきつづいて、ツルバール（Ｓｏｒｖ
ａｌｌ　）　Ｓ　Ｓ　３４型ローターで１２．５０Ｏｒ
ｐｍ　、１５分間遠心した。その上清の上部７０％（体
積）をＤＮａｓｅフリーのＲＮａｓｅ２０μｇ／ｍβで
３７℃、３０分間処理し、（１：１）のフェノール−ク
ロロホルム混合液で抽出し、その次に純粋なりロロホル
ムで抽出した。そのＤＮＡを、抽出上清に０．２倍容の
５ＭＮａＣｊ！と、０．２５倍容の４０重量パーセント
のポリエチレングリコール６０００を加えて沈殿させた
。沈殿と遠心（７／ｌ／バー／Ｉ／　（Ｓｏｒｖａｌｌ
　）　Ｓ　Ｓ　３４型ローター、１２．５０Ｏｒｐｍ　
、３０分）後、そのＤＮＡを２〜３ｍｌのＴＥバッフフ
ァ実施例■参照）に溶かし、４　ＮＮａＯＨをつかって
ｐＨ１２，０に１０−１５分保った。その後、ｐＨを８
．５にもどし、その混合物をフェノールで抽出した。エ
タノール沈殿後、そのプラスミドＤＮＡを少量のＴＥバ
ブフファ溶かした。
実施例■ オリゴヌクレオチドの合成 次にあげるオリゴヌクレオチド配列は、バイオサーチ・
シンセシス・オートメーション・マシーン（Ｂｉｏｓｅ
ａｒｃｈ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ
　Ｍａｃｈｉｎｅ）により合成し、ＨＰＬＣ，フェノー
ル−クロロホルム（１：　１）抽出及びエタノール沈殿
により精製した。
Ａ）　　５　　’−ＧＡＴＣＣＡ八ＧＧＡＧＧＴへＡＴ
−３’Ｂ）　５　’　−ＣＴＡＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴ
ＴＧ−３’Ｃ）　５　’　−ＡＡＴＴＣＴＴＧＡＣＡＡ
ＡＧ［”ＴＴＣ−３’Ｄ）　　５　　’　−ＴＣＧＡＧ
ＡＡＧＣＴＴＴＧＴＣ八八Ｇ−３′ε）　　５　　へ人
−ＴＣＧＡＧＡＣＴＧＡＴ八ＴＡＡＴＧＡＧＣＴへ３　
　’Ｆ）　　５　　’　−ＣＡＴＴ八ＴＡへＣＡＧＴＣ
−３’Ｇ）　５　’　−ＡＡＴＴＣＡＧＧＡＴＴＴＡＴ
ＧＡＡＧＣＴＴＣ−３’Ｈ）　５　’−ＴＣＧＡＧＡＡ
ＧＣＴＴＣＡＴＡＡＡＴＣＣＴＧ−３’１）　５　’　
−ＴＣＧＡＧＧＧＡＡＴＴＧＴＴＴＧＡＧＣＴ−３’Ｊ
）　５　’　−ＣＡＡＡＣＡＡＴＴＣＣＣ−３’これら
のオリゴヌクレオチドは、次にあげるＤＮＡ配列の合成
のために用いた。
Ａ１合成シャイン・ブルガルノ配列 オリゴヌクレオチドΔとＢを５０μβ中各５μｇ混合し
、それを、１ｍＭ　ＡＴＰ　６０　μβ、Ｎ０ｘ）キナ
ーゼ・ミックス５μβ（０，５Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７
，０）　、Ｏ，ＬＭ　ＭｇＣｌ２．５０ｍＭジチオスレ
イトール、１ｍＭスペルミジン、１ｍＭＥＤＴＡ）及び
Ｔ４−キナーゼ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ、１０ｕ／μｊり
３μｌとともに、３７℃、１時間インキニベーションす
ることにより連結した。
その連結したオリゴヌクレオチドを、１００℃で５分間
インキュベーションし、６５℃で３０分間インキュベー
ションすることによりアニールした。フェノール−クロ
ロホルム（１：　１）テの精製と、エタノール沈殿の後
に、そのＤＮＡを少量のＴＥバッフファ溶かした。
Ｂ、σ”−ＲＮＡポリメラーゼにより認識される合成プ
ロモーター配列 Ａでの記述と同様に、オリゴヌクレオチドＣ１ＤＳＥ及
びＦの混合物から出発して、σ５５　　ＲＮＡポリメラ
ーゼによって認識される合成プロモーター配列を辱だ。
口、σ”　　ＲＮＡポリメラーゼにより認識される合成
プロモーター配列 Ａでの記述と同様に、オリゴヌクレオチドＧ１ＨＳ　Ｉ
及びＪの混合物から出発して、σ”−ＲＮＡポリメラー
ゼにより認識される合成プロモーター配列を得た。
実施例■ 枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）　１−８５　（実施例
■参照）由来のｐＧＢ３３．１５μｇを、その認識部位
が、配列解析（図１参照）からも分るように、Ｂ、リチ
ェニホルミ：ｘ、　（Ｂ、ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ
　）のアルファ。
アミラーゼ遺伝子の間に精確に位置する、制限酵素Ｎｄ
ｅｌで切断した。フェノール−クロロホルム（１：　１
）抽出と、エタノール沈殿の後、その消化したプラスミ
ドＤＮＡを５９μｌのＢａ１３１ミツクス（１２０μＡ
の１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８，１）、？２μＡの
１００＋ｎ？、ｌ　ＭｇＣｆｚ　、７２　ｔ−ｔβの１
００ｍＭ　ＣａＣｊ！２、°ｌ　２０　ｐｉの１ＭＮａ
Ｃ１’。
１５６μｌの水及び１μβのＢａＣ３１エンドヌクレア
ーゼ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ　、Ｌ、２ｕ／ｌり　）に溶
かした。１５℃、３．５分間の後に、その物質を再度フ
ェノール−クロロホルム（１：１）で抽出し、エタノー
ルで再沈殿させた。再溶解した後、そのＤＮＡを制限酵
素Ｐｓｔ　Ｉで消化し、フェノール−クロロホルム（１
：　１）で抽出、エタノール沈殿後、２０１ｎλ１トリ
ス−塩酸（ｐＨ７，６）、１０ｍＭＭｇＣｊ’２．１０
ｍＭジチオスレイトール、０．５ｍＭＡＴＰ、１μｌの
大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ　）ファージＭ１３ｍｐｌＯ（制
限酵素Ｈｉｎｃ　■とｐｓｔＩで消化したもの）及びｌ
μｌのＴ４リガーゼ（ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ　）　ｌ　ｕ　／　ｐ　１　）を含む２０ｐｌのリ
ガーゼ・ミックスに溶解し、連結を４℃、１晩かけて行
った。（図２参照） 形質転換及び大腸菌（１１：、　ｃｏｌｉ　）中のホワ
イト・プラークの選択の後、多くの組換えＤＮＡファー
ジを単離し、“グイデオキシチェーン・ターミネータ−
法”をつかって、配列決定した。Ｂａβ３１により短く
された殆どの組換え体の中に（図２参照）制限酵素１３
ａｍ）（ｌ及びＸｂａＩで消化した後、合成シャインダ
ルガルノ配列（実施例■参照）が°挿入され、その後、
この構築物は配列決定された。
つづいて、このシャイン・ダルガルノ配列を含むフラグ
メントを制限酵素ＥｃｏＲ１とＰｓｔｌ（図２参照）で
切断し、Ｂ、リチェニホルミス（Ｂ、ｌｉｃｈｅｎｉｆ
ｏｒｍｉｓ　）のアルファ’アミラーゼ遺伝子本来の制
御シグナルを持つ、ＥｃｏＲ１−Ｐｓｔ■フラグメント
に置換えた。このようにして得られたプラスミド、ｐＰ
ＲＯＭ５４は、５．２ｋｂｐの大きさである。そのプラ
スミドの構造は、図３に示した。枯草［（Ｂ、５ｕｂｔ
ｉｌｉｓ）　Ｉ　Ａ　４０　（ａｍＶ″″、１ｙｓ−、
ｍｅｔ−、ｔｒｐ−）中のプラスミドｐＰＲＯＭ５４は
、１９８５年１１月５日、ＣＢＳの第６９６．８５号に
保管された。
実施例Ｖ 染色体プロモーター配列を含むρＦＲＯＭプラスミドの
構築 Ｂ、リチェニホルミス（Ｂ、ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉ
ｓ　）　Ｔ　５株（実施例Ｉ参照χから単離した染色体
ＤＮＡ　５μｇを、ＲｓａＩ、Ｈａｅ［Ｉ、ＡｌｕＩ、
）ｌｉｎｃ　Ｉｆ及びＥｃｏＲＶで切断し、フェノール
・クロロホルムによる精製及び、エタノール沈殿の後に
、ＳｍａＩで切断したｐＰＲＯＭ５４　（実施例ＴＶ）
１μｇに連結した。別の、Ｂ、リチェニホルミス （Ｂ、ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　）　Ｔ　５株の染
色体ＤＮＡをＥｃｏ”条件下、ＥｃｏＲｌで消化し、精
製、沈殿後、ＥｃｏＲｌで線状にしたｐＦＲＯＭ５４１
μｇと連結した。その連結した混合物を、ジャーナル・
オブ・バタテリオロジー（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　
）　、８１巻、７４１〜７４６頁（１９８１年）に報告
されている。アナクツストポウロス（Ａｎａｇｎｏｓｔ
ｏｐｏｕｌｏｓ　）とスピジゼン（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ　
）によって述べられた方法を用い、枯草菌（Ｂ、５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ）　Ｉ　Ａ　４０　（ａｍＶ−１ｌｙｓ　−
、ｍｅｔ　−、ｔｒｐ″″）にトランスフオームした。
まず形質転換体は、０．０２％（Ｗ／Ｖ）のカザミノ酸
（ディ７＝２　（Ｄｉｆｃｏ　）及び１０／Ｊｇ／ｍＺ
のネオマイシンを添加した最小寒天培地上で、ネオマイ
シン／カナマイシン耐性により選択した。
つづいて、プレート上に０．６％（Ｗ／Ｖ）のＫｌと、
０．３％（Ｗ／Ｖ）の■２の溶液を注ぐこと：：よりで
きるハローを探すことにより行う、アルファ・アミラー
ゼの合成に対してなされる能力に関する選択により、そ
れらの形質転換体についてプロモーター配列の存否の解
析がなされる。このようにして選ばれた形質転換体は、
本来のアルファ・アミラーゼ制御領域の影響下での産生
と比較して、アルファ・アミラーゼの発酵生産に用いら
れる。この選択された形質転換体は、組換えＤＮＡプラ
スミド源としても使われる。その選択された形質転換体
の１つは、プラスミドｐ　ＦＲＯＭ３−４０を含んでい
る。
枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）　ｌ　Ａ　４０　（ａ
ｍ３１−１ｌｙｓ−５ｍｅｔ−１ｔｒｐ−）中のこのプ
ラスミドは、１９８５年１１月５日、ＣＢＳの第６９９
．８５号に保管された。
実施例■ ２８０ｂｐノＳ　Ｐ　０２７　ｙ−ジ・プロモーター・
フラグメントをもつ、ｐＰＬ６０８．５μｇ（ウィリア
ムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）等、ジャーナル・オブ・バク
テリオロジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　）　１４
６巻、１１６２〜１１６５頁（１９８１年））を、Ｅｃ
ｏＲＩで切断し、精製及び沈殿後、ＥｃｏＲＩで線状に
したｐＦＲＯＭ５４．１μｇと連結した。
連結した混合物を、枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）　
Ｉ　Ａ４０（ａｍｙ　−、ｌｙｓ　−、ｍｅｔ　−、ｔ
ｒｐ　−）にトランスフオームした。得られた形質転換
体を実施例■で述べられた方法で選択した。選ばれた形
質転換体は、プラスミドｐＰＲＯＭｓＰＯ□を含んでい
る。
この形質転換体は、本来のアルファ・アミラーゼ遺伝子
の影響下での産生と比較した、アルファ・アミラーゼの
発酵生産に用い、また、組換えプラスミドｐＰＲＯＭ５
５ｓを作るのにも使用する。
枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）　Ｉ　Ａ　４０　（ａ
ｍｙ−１ｌｙｓ−１ｍｅｔ　−、ｔｒｐ　−）中のプラ
スミドＩ）ＦＲＯＭ５５ｓは１９８５年１１月５日ＣＢ
Ｓの第６９７．８５号に保管された。
この操作と同様に、合成オリゴヌクレオチド６１Ｈ１Ｉ
ｕびＪから出発して（実施例■参照）、組換えプラスミ
ドｐＰＲＯＭ３７Ｓを含む、バチルス１Ａ４０形質転換
体が得られ、そのプラスミドは、合成プロモーター配列
に関して、ｐＰＲＯＭ５５ｓと異なっている（図４と５
を比較せよ。）。
実施例■ 実施例■、■及び■中に述べた遺伝子操作により得られ
た枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ　）株及び出発プラス
ミドｐＧＢ３３をもつ枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）
株を、０．４％のズルコウスキー（Ｚｕｌｋｏｗｓｋｉ
　）　・スターチを補った液体ハート・インフュージョ
ン培地中で、３７℃、５日間培養した。アルファ・アミ
ラーゼを単離し、標準操作法に従って精製した。
出発プラスミドｐＧＢ３３（未修正のアルファ・アミラ
ーゼ遺伝子をもつ）を有する本来の枯草菌（Ｂ、５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ　）株と比較した。生産されたアルファ・ア
ミラーゼ量を表１に示した。
表　　　１ 本発明に従って、機能配列が容易に単離され、設計した
構築物中に、制御領域、シグナル配列、又は構造遺伝子
を置換もしくは挿入することによって評価することがで
きる。それから、生成した構築物はバチルス宿主中に導
入され、発現及び分泌の効率が測定される。このように
して、バチルス・ライブラリーもしくは、バチルス中で
機能する制御領域をもつ、その他の宿主からのライブラ
リーが、バチルス中での使用のためにスクリーニングさ
れる。このように、プロモーター、リボソーム結合部位
及びシグナル配列は１．ウィルス、微生物、ホ乳類細胞
やそれに類するもののような巾広い種々の宿主由来のも
のが評価されうる。
上述の発明は、明確な理解という目的のため、説明や実
施例により、ある程度詳細に述べられているが、付記し
た特許請求の範囲内で変化や修正が行ないうろことは明
らかであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、予想されたシグナル配列のアミノ配列をもつ、
Ｂ、リチェニホルミス（Ｂ、　Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍ
ｉｓ）のアルファ・アミラーゼのプロモーター領域のヌ
クレオチド配列、シャイン・ダルガルノ配列及びシグナ
ル配列を示しである。 図２は、図式で、天然のアルファ・アミラーゼのシャイ
ン・ダルガルノ配列及びプロモーター配列の除去、並び
にＭ１３ｍｐｌＯ中への合成シャイン・ダルガルノ配列
の組込みを示しである。 図３はプラスミドｐＰＲＯＭ５４を描いである。 図４はプラスミドｐＰＲＯＭ５５　ｓを描いである。 図５はプラスミドｐＰＲＯＭ３７ｓを描いである。 図面のｊ’Ｎ’　ｆｆ！：’内、゛；に′〈央なし）Ｆ
ＩＧ、４ ＦＩＧ、５ １、事件の表示　　昭和６１年特許願第２６５３９９号
３、補正をする者 事件との関係　　出願人 名　称　　　ギスト　ブロ力デス　ナームローゼフェン
ノートチャップ ４、代理人 ”Ｊ ５、補正命令の日付　　　昭和６２年１月２７日願書に
最初に添付した明細書及び図面の浄書（内容に変更なし
）

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）少なくとも１つの制限部位を含み、代用の要素と
    して、即ち （イ）プロモーター領域として、ｐＰＲＯＭ３−４Ｃ中
    のＢ．リチェニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍ
    ｉｓ）のプロモーター配列、ｐＰＲＯＭ　ＳＰ０２のバ
    クテリオファージのプロモーター、もしくは、合成プロ
    モーター領域の−１０及び−３５配列、 （ロ）もし、上記プロモーター領域が存在しないときは
    、リボソーム結合部位が合成されたものであるという条
    件での、リボソーム結合部位、及び （ハ）合成プロモーター領域の−１０及び−３５のコン
    センサス配列の間に１ヵ所切断制限部位をもち、プロモ
    ーター領域と、開始コドンの隣りで、シグナル配列の３
    ′端に位置するリボゾーム結合部位との間に存在するバ
    チルス中で機能を示すシグナル配列、ただし上記要素の
    うちの１つ１ヵ所切断制限部位により置換えることがで
    きるという条件で、上記要素のうちの少なくとも２つが
    本来の結合をしておらず、その場合に、上記シグナル配
    列が、アルファ−アミラーゼのシグナル配列で、しかも
    成熟したアルファアミラーゼをコードする構造遺伝子に
    、同じ読み枠で結合している、を含むドメインを有する
    ハイブリッド遺伝子を発現するための、制御もしくはシ
    グナル配列を評価するのに有用な、バチルス中で複製可
    能なプラスミド。
  2. （２）上記ドメインが少なくとも次の配列のうち１つを
    含む、特許請求の範囲第１項記載のプラスミド。 Ａ）５′−ＧＡＴＣＣＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴ−３′ Ｂ）５′−ＣＴＡＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴＧ−３′ Ｃ）５′−ＡＡＴＴＣＴＴＧＡＣＡＡＡＧＣＴＴＣ−３
    ′ Ｄ）５′−ＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＴＴＧＴＣＡＡＧ−３
    ′ Ｅ）５′−ＴＣＧＡＧＡＣＴＧＡＴＡＴＡＡＴＧＡＧＣ
    Ｔ−３′ Ｆ）５′−ＣＡＴＴＡＴＡＴＣＡＧＴＣ−３′ Ｇ）５′−ＡＡＴＴＣＡＧＧＡＴＴＴＡＴＧＡＡＧＣＴ
    ＴＣ−３′ Ｈ）５′−ＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＴＣＡＴＡＡＡＴＣＣ
    ＴＧ−３′ Ｉ）５′−ＴＣＧＡＧＧＧＡＡＴＴＧＴＴＴＧＡＧＣＴ
    −３′ Ｊ）５′−ＣＡＡＡＣＡＡＴＴＣＣＣ−３′
  3. （３）上記プロモーターが少なくとも３つの１ヵ所切断
    制限部位を含む配列で置換えられた特許請求の範囲第１
    項記載のプラスミド。
  4. （４）上記プロモーターが特異的にσ＾５＾５−ＲＮＡ
    ポリメラーゼに結合する、特許請求の範囲第１項記載の
    プラスミド。
  5. （５）上記プロモーターが配列 【遺伝子配列があります】 をもつ、特許請求の範囲第４項記載のプラスミド。
  6. （６）上記プロモーターが、特異的にσ＾３＾７−ＲＮ
    Ａポリメラーゼに結合する、特許請求の範囲第１項記載
    のプラスミド。
  7. （７）上記プロモーターが、配列 【遺伝子配列があります】 をもつ、特許請求の範囲第６項記載のプラスミド。
  8. （８）上記プラスミドがｐＵＢ１１０の複製システムを
    含む、特許請求の範囲第１項記載のプラスミド。
  9. （９）上記プラスミドが、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
    ）に抗生物質耐性を与える、少なくとも１つの遺伝子を
    含む、特許請求の範囲第１項記載のプラスミド。
  10. （１０）上記リボソーム結合部位が、配列 【遺伝子配列があります】 をもつ、特許請求の範囲第１項記載のプラスミド。
  11. （１１）基本的に、ｐＰＲＯＭ５４、ｐＰＲＯＭ　ＳＰ
    Ｏ２、ｐＰＲＯＭ３７ｓ、ｐＰＲＯＭ５５ｓ、ｐＰＲＯ
    Ｍ１．１、ｐＰＲＯＭ２．６、ｐＰＲＯＭ１１．１、ｐ
    ＰＲＯＭ１４．３、ｐＰＲＯＭ１７．４、ｐＰＲＯＭ１
    ７．５、ｐＰＲＯＭ２３、２５、ｐＰＲＯＭ２３、２６
    もしくはｐＰＲＯＭ３−４Ｃからなる、特許請求の範囲
    第１項記載のプラスミド。
  12. （１２）全ての要素ではないが、そのうちの少なくとも
    １つが、同じ機能をもつ異なる配列で置換した、特許請
    求の範囲第１１項記載のプラスミド。
  13. （１３）上記シグナル配列と同じ読み枠で、１つの構造
    遺伝子が上記配列と結合する、特許請求の範囲第１項記
    載のプラスミド。
  14. （１４）特許請求の範囲第１項から第１３項までに記載
    されるプラスミドを含むバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
    宿主。
  15. （１５）特許請求の範囲第１項から第１３項までに記載
    されるプラスミドを含む枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕ
    ｂｔｉｌｉｓ）宿主。
  16. （１６）バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主中で、１つ
    のペプチドの産生に機能を示す１つ以上の要素の効率を
    決定するための方法であって、 １）代用の要素として （イ）、プロモーター領域として、ｐＰＲＯＭ３−４Ｃ
    中のＢ．リチェニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒ
    ｍｉｓ）のプロモーター配列、ｐＰＲＯＭ　ＳＰ０２の
    バクテリオファージのプロモーター配列、又は、合成プ
    ロモーター領域の−１０及び−３５配列、 （ロ）リボソーム結合部位、 （ハ）合成プロモーター領域の−１０及び−３５コンセ
    ンサス配列の間に１ヶ所切断制限部位をもち、プロモー
    ター領域と、開始コドンに隣接し、シグナル配列の３′
    端に位置するリボソーム結合部位との間に存在するシグ
    ナル配列、ただし上記要素のうち全てではないが少なく
    とも１つが上記機能性要素と置き換えることができ、か
    つ構造遺伝子が上記シグナル配列と同じ読み枠であるよ
    うなシグナル配列、 を含むドメインを有するバチルス中で複製可能なプラス
    ミドを含有する上記宿主を適当な栄養培地で生育させる
    こと、 ２）上記機能要素を置換する前の、同条件下で、上記ド
    メインを使って産生されるペプチド量と比較して、ペプ
    チド産生量を測定すること、を含む方法。
  17. （１７）約５ｋｂｐ以下の転写開始領域を有する宿主か
    らＤＮＡを断片にしてＤＮＡ断片を調製し、該ＤＮＡ断
    片を、少なくとも１つの１ヶ所切断制限部位を有し、か
    つスクリーニング領域の上流領域である制限部位領域で
    の形質転換体選択のための手段を有するバチルス（Ｂａ
    ｃｉｌｌｕｓ）中の複製可能なプラスミド中に挿入して
    （ただし、上記スクリーニング領域が転写方向に、上記
    制限部位領域、リボソーム結合部位領域及びシグナル配
    列を有しかつバチルス中で分泌可能な構造遺伝子を含む
    ）化学反応によって容易に検出できる産生物を産生し、 上記プラスミドを有するバチルス細胞を形質転換して形
    質転換体を産生し、かつ上記選択手段によって形質転換
    体を選択し、 上記化学反応の手段によって上記産生物の分泌のための
    形質転換体をスクリーニングして転写開始能力を有する
    上記制限部位で断片の存在を決定する、 ことを含む、バチルス中の転写開始能を有する配列の存
    在を検出する方法。
  18. （１８）リボソーム結合部位領域が合成領域であり、上
    記構造遺伝子がアルファーアミラーゼをコードする特許
    請求の範囲第１７項記載の方法。
JP61265399A 1985-11-08 1986-11-07 バチルスの制御領域のクロ−ニング及び解析のためのプラスミド Pending JPS62181789A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL8503074 1985-11-07
NL8503074 1985-11-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPS62181789A true JPS62181789A (ja) 1987-08-10

Family

ID=19846830

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP61265399A Pending JPS62181789A (ja) 1985-11-08 1986-11-07 バチルスの制御領域のクロ−ニング及び解析のためのプラスミド

Country Status (9)

Country Link
US (1) US5024943A (ja)
EP (1) EP0224294B1 (ja)
JP (1) JPS62181789A (ja)
AT (1) ATE56989T1 (ja)
DE (1) DE3674548D1 (ja)
DK (1) DK533286A (ja)
ES (1) ES2031818T3 (ja)
FI (1) FI864547A (ja)
PT (1) PT83714B (ja)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5278066A (en) * 1985-08-09 1994-01-11 Gist-Brocades Nv Molecular cloning and expression of gene encoding lipolytic enzyme
US6238889B1 (en) 1986-12-16 2001-05-29 Dsm N.V. Molecular cloning and expression of the Pro8 isoform of human IL-3
US5830735A (en) * 1987-03-06 1998-11-03 Gist-Brocades Nv Method for producing lipolytic enzymes using transformed Pseudomonas
US5304637A (en) * 1987-07-13 1994-04-19 Gist-Brocades N.V. Expression and purification of human interleukin-3 and muteins thereof
US6384194B1 (en) 1987-12-16 2002-05-07 Dsm N.V. Expression and purification of human interleukin-3 and muteins thereof
EP0424473B1 (en) * 1988-07-05 1996-05-08 Baylor College Of Medicine Methods for identification of bacteria
ES2117625T3 (es) * 1989-06-29 1998-08-16 Genencor Int Alfa-amilasas microbianas mutantes con estabilidad termica, acida y/o alcalina incrementada.
US8232081B2 (en) 1999-09-21 2012-07-31 Basf Se Methods and microorganisms for production of panto-compounds
JP5392957B2 (ja) * 1999-09-21 2014-01-22 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア パント−化合物を産生するための方法および微生物
JP2011522546A (ja) * 2008-06-06 2011-08-04 ダニスコ・ユーエス・インク バチルスサブティリス由来の変異体アルファアミラーゼおよびその使用方法
MX2010013108A (es) * 2008-06-06 2010-12-21 Danisco Inc Produccion de glucosa a partir de almidon usando alfa-amilasas de bacillus subtilis.
JP5599113B2 (ja) * 2008-06-06 2014-10-01 ダニスコ・ユーエス・インク 糖化酵素組成物及びその糖化方法
US8871441B2 (en) * 2008-08-21 2014-10-28 Novozymes A/S Microfluidic device screening method
WO2010056653A2 (en) 2008-11-11 2010-05-20 Danisco Us Inc. Proteases comprising one or more combinable mutations
CN102209782A (zh) 2008-11-11 2011-10-05 丹尼斯科美国公司 包含枯草杆菌蛋白酶变体的组合物和方法
RU2011123911A (ru) 2008-11-11 2012-12-20 ДАНИСКО ЮЭс ИНК. Композиции, содержащие варианты сериновых протеаз, и способы
CN101434308B (zh) * 2008-11-12 2010-08-25 中材科技股份有限公司 桶
IN2012DN02731A (ja) 2009-10-23 2015-09-11 Danisco Us Inc

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2048894A (en) * 1979-05-11 1980-12-17 Gist Brocades Nv Plasmid
US4711843A (en) * 1980-12-31 1987-12-08 Cetus Corporation Method and vector organism for controlled accumulation of cloned heterologous gene products in Bacillus subtilis
FI64813C (fi) * 1980-12-31 1984-01-10 Ilkka Antero Palva Foerfarande foer producering av ett utvalt aeggviteaemne och vid foerfarandet anvaenda rekombinantplasmidvektorer
US4624926A (en) * 1981-01-02 1986-11-25 The Research Foundation Of State University Of New York Novel cloning vehicles for polypeptide expression in microbial hosts
GR82200B (ja) * 1983-07-06 1984-12-13 Gist Brocades Nv

Also Published As

Publication number Publication date
FI864547A0 (fi) 1986-11-07
ATE56989T1 (de) 1990-10-15
PT83714B (pt) 1988-08-17
FI864547A (fi) 1987-05-09
EP0224294A1 (en) 1987-06-03
DK533286A (da) 1987-05-09
PT83714A (en) 1986-12-01
EP0224294B1 (en) 1990-09-26
ES2031818T3 (es) 1993-01-01
US5024943A (en) 1991-06-18
DE3674548D1 (de) 1990-10-31
DK533286D0 (da) 1986-11-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6808896B2 (en) Method for stable chromosomal multi-copy integration of genes
JPS62181789A (ja) バチルスの制御領域のクロ−ニング及び解析のためのプラスミド
US7083980B2 (en) Tn5 transposase mutants and the use thereof
US4868111A (en) Gram-positive expression control sequences
US4965197A (en) Coryneform expression and secretion system
Kollek et al. Isolation and characterization of the minimal fragment required for autonomous replication (“Basic replicon”) of a copy mutant (pKN 102) of the antibiotic resistance factor R1
Kodaira et al. The dnaX gene encodes the DNA polymerase III holoenzyme τ subunit, precursor of the γ subunit, the dnaZ gene product
Yamagata et al. Cloning and characterization of the 5'region of the cell wall protein gene operon in Bacillus brevis 47
Baty et al. Extracellular release of colicin A is non‐specific.
WO1995025743A1 (en) Enhanced secretion of polypeptides
US5089406A (en) Method of producing a gene cassette coding for polypeptides with repeating amino acid sequences
US5726039A (en) Vectors and transformed host cells for recombinant protein production at reduced temperatures
EP0546049B1 (en) A method for rapid selection of efficient secretion vectors
Tanaka et al. prtR enhances the mRNA level of the Bacillus subtilis extracellular proteases
EP0228726B1 (en) Method for preparing proteins using transformed lactic acid bacteria
JPH05292952A (ja) 化学物質の生合成による製造方法
US5654169A (en) Vectors and transformed host cells for recombinant protein production at reduced temperatures
WO1988005082A1 (en) Microbial production of peptide oligomers
Kopylova-Sviridova et al. Synthesis of proteins coded by plasmid vectors of pCV series (Apr, Tcr) and their recombinant derivatives (pDm) in E. coli minicells
EP0109428B1 (en) Cloning vector with indicator genes which have been inactivated by frameshift
CA2507307C (en) Increased production of secg protein in bacillus subtilis
CA1275954C (en) 3'-expression enhancing fragments and method
JPH02107191A (ja) 化合物製造生合成法
DK1297170T3 (en) A process for stable chromosomal integration of multiple copies of the genes
US20110033909A1 (en) Means and methods for cloning nucleic acid sequences