JP2011522546A - バチルスサブティリス由来の変異体アルファアミラーゼおよびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】バチルスサブティリス(Bacillus subtilis)由来のアルファアミラーゼ(AmyE)、その変異体、同をコードする核酸および該核酸を含む宿主細胞が提供される。AmyEまたはその変異体を使用する方法、たとえばデンプンの液化および/または糖化が開示される。かかる方法は、エタノールの生産または高フルクトースコーンシロップの生産に有用な糖をもたらすことができる。ある場合には、該アミラーゼは低pHでカルシウムの不存在下および/またはグルコアミラーゼの不存在下に用いられることができる。
【選択図】図2
Description
本出願は、2008年6月6日に出願された米国特許仮出願番号第61/059,513号および61/059,618号の優先権を主張し、これらの内容はその全体が参照によって本明細書に取り込まれる。
AmyE(配列番号1)またはAmyEの切断変異体(配列番号2)から選択された親α−アミラーゼポリペプチドと少なくとも60%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 5 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, および 425からなる群から選択された1以上の位置における修飾を含み、
該修飾は、酵素性能を改善する少なくとも1の特性について1.0超の性能指数(PI)を有する変異体ポリペプチドを生成する。
K, 166M, 166N, 166Q, 166R, 166S, 166T, 166V, 166W, 166Y, 167A, 167C, 167D, 167E, 167F, 167G, 167H, 167I, 167K, 167L, 167M, 167Q, 167R, 167S, 167T, 167V, 167W, 167Y, 168C, 168E, 168F, 168G, 168I, 168K, 168L, 168M, 168N, 168S, 168T, 168V, 168W, 168Y, 169L, 170C, 170G, 170V, 171A, 171C, 171E, 171F, 171G, 171H, 171I, 171L, 171M, 171N, 171Q, 171R, 171V, 172A, 172C, 172E, 172F, 172P, 173I, 173M, 173V, 173Y, 174D, 174E, 174G, 174H, 174L, 174Q, 174V, 174Y, 175H, 175M, 175W, 175Y, 176E, 176F, 176I, 176K, 176L, 176V, 176Y, 177C, 177G, 177M, 177Q, 177S, 178C, 178G, 178M, 178S, 178T, 179A, 179C, 179G, 179H, 179I, 179L, 179M, 179P, 179S, 179T, 179V, 179W, 179Y, 180A, 180D, 180M, 180N, 180Y, 181A, 181C, 181L, 181M, 181V, 182A, 183C, 183M, 184A, 184C, 184D, 184E, 184F, 184G, 184H, 184I, 184K, 184L, 184M, 184N, 184Q, 184R, 184S, 184T, 184V, 184W, 184Y, 185C, 185E, 185N, 185S, 185T, 186E, 187A, 187C, 187D, 187E, 187F, 187H, 187I, 187K, 187L, 187M, 187N, 187P, 187Q, 187R, 187S, 187T, 187V, 187W, 187Y, 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416Y, 417A, 417C, 417D, 417F, 417G, 417H, 417I, 417K, 417M, 417N, 417P, 417Q, 417S, 417W, 417Y, 418C, 418D, 418E, 418F, 418H, 418I, 418K, 418N, 418Q, 418R, 418T, 418W, 418Y, 419C, 419D, 419E, 419F, 419G, 419H, 419I, 419L, 419P, 419Q, 419S, 419T, 419Y, 420D, 420E, 420F, 420G, 420H, 420I, 420K, 420L, 420M, 420N, 420Q, 420R, 420S, 420T, 420V, 420W, 420Y, 421A, 421C, 421G, 421I, 421L, 421M, 421S, 421T, 422A, 422F, 422G, 422H, 422I, 422M, 422N, 422Q, 422S, 422V, 422W, 422Y, 423A, 423D, 423G, 423H, 423I, 423K, 423P, 423Q, 423R, 423T, 423V, 423W, 424D, 424E, 424G, 424I, 424K, 424M, 424N, 424Q, 424R, 424S, 424T, 424V, 424W, 424Y, 425A, 4251, 425K, 425L, 425M, 425S, 425T, 425V, 425 W, および 425Yからなる群から選択された1以上の位置における、親ポリペプチド中に存在する1以上のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に変える置換である。
8P, 308Q, 308R, 308S, 308T, 308V, 308W, 308Y, 309D, 309E, 309F, 309H, 309K, 309R, 309S, 310A, 311A, 311H, 311K, 311R, 312D, 312F, 312G, 312H, 312I, 312K, 312L, 312M, 312P, 312Q, 312R, 312S, 312T, 312V, 312W, 312Y, 313A, 313D, 313E, 313F, 313K, 313L, 313N, 313Q, 313R, 313S, 313W, 313Y, 314A, 314F, 314H, 314K, 314L, 314M, 314Q, 314R, 314S, 314T, 314W, 314Y, 315K, 315N, 315P, 315T, 316Y, 317A, 317C, 317E, 317F, 317H, 317K, 317L, 317R, 317S, 317T, 317V, 317W, 317Y, 318D, 318F, 318H, 318I, 318K, 318L, 318M, 318N, 318R, 318S, 318T, 318V, 318W, 318Y, 319G, 319L, 319N, 319Q, 319V, 319W, 320C, 320F, 320G, 320I, 320K, 320L, 320M, 320P, 320Q, 320T, 320V, 320Y, 321C, 321D, 321E, 321F, 321G, 321H, 321I, 321K, 321L, 321R, 321S, 321T, 321V, 321W, 322L, 322M, 322V, 324A, 324F, 324G, 324H, 324I, 324K, 324L, 324M, 324N, 324Q, 324R, 324S, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325C, 325D, 325G, 325H, 325I, 325K, 325L, 325M, 325N, 325P, 325T, 325V, 327C, 327D, 327G, 327H, 327N, 327T, 328D, 328E, 328F, 328L, 328N, 328Q, 328Y, 329F, 329H, 329Q, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331G, 331I, 331L, 331Q, 331S, 331T, 331V, 331Y, 332A, 332C, 332G, 332Q, 332S, 333C, 333G, 333H, 333K, 333L, 333M, 333R, 333S, 333W, 333Y, 334D, 334H, 334I, 334L, 334M, 334N, 334R, 334T, 335V, 336A, 336C, 336F, 336G, 336I, 336M, 336N, 336Q, 336R, 336V, 336W, 336Y, 337H, 337N, 337S, 337V, 337W, 337Y, 338G, 338I, 338L, 338M, 338S, 338T, 339C, 340F, 340H, 340K, 340L, 340M, 340N, 340S, 340T, 340V, 340W, 341A, 341L, 341Y, 342A, 342K, 342N, 342R, 342Y, 343A, 343D, 343E, 343F, 343H, 343K, 343L, 343M, 343Q, 343S, 343T, 343W, 343Y, 344A, 344D, 344E, 344F, 344G, 344I, 344K, 344L, 344M, 344N, 344Q, 344R, 344S, 344T, 344W, 344Y, 345C, 345E, 345F, 345G, 345H, 345I, 345N, 345Q, 345S, 345T, 345V, 346C, 346D, 346E, 346I, 346K, 346L, 346M, 346N, 346S, 346T, 346V, 346Y, 347D, 347F, 347H, 347I, 347K, 347L, 347M, 347Q, 347R, 347S, 347T, 347V, 347W, 348F, 348H, 348I, 348K, 348R, 348S, 348T, 348V, 348W, 348Y, 349A, 349F, 349G, 349I, 349K, 349M, 349N, 349R, 349S, 349V, 349W, 349Y, 350D, 351A, 351D, 351G, 351H, 351K, 351L, 351M, 351P, 351Q, 351R, 351T, 351V, 351W, 351Y, 352A, 352H, 352Q, 352T, 352Y, 353A, 353D, 353E, 353G, 353I, 353K, 353L, 353M, 353Q, 353V, 353W, 353Y, 355C, 355F, 355I, 355L, 355M, 355V, 355Y, 356D, 356F, 356G, 356I, 356K, 356L, 356P, 356Q, 356T, 356W, 356Y, 357A, 357H, 357I, 357K, 357L, 357N, 357Q, 357R, 357S, 357T, 357V, 357W, 357Y, 358C, 358D, 358F, 358G, 358H, 358I, 358K, 358L, 358M, 358Q, 358R, 358S, 358T, 358V, 358Y, 359D, 359E, 359H, 359L, 359M, 359P, 359Q, 359R, 359T, 359V, 359W, 360F, 360P, 360T, 361C, 361L, 361M, 361N, 361Q, 361S, 361T, 361V, 362A, 362C, 362I, 362L, 362V, 362Y, 363D, 363G, 363H, 363Q, 363R, 363S, 363V, 363W, 363Y, 364A, 364C, 364G, 364I, 364L, 364M, 364Q, 364S, 364T, 364V, 365C, 365I, 365K, 365L, 365N, 365R, 365S, 365V, 366A, 366K, 367L, 367M, 367N, 367R, 367S, 367T, 367W, 367Y, 368G, 368I, 368K, 368L, 368R, 368T, 368V, 368W, 369C, 369D, 369E, 369F, 369G, 369I, 369K, 369L, 369N, 369Q, 369S, 369T, 369V, 369Y, 371A, 371C, 371F, 371I, 371L, 371M, 371N, 371S, 371T, 371Y, 372A, 372C, 372I, 372L, 372N, 372S, 372T, 373A, 373C, 373F, 373I, 373M, 373T, 373V, 374C, 374G, 374I, 374M, 374S, 374T, 374V, 375A, 375C, 375D, 375F, 375H, 375L, 375M, 375Q, 375S, 375T, 375Y, 376G, 376I, 376S, 376T, 376V, 377F, 377H, 377L, 377T, 377W, 377Y, 378C, 378E, 378F, 378G, 378H, 378I, 378K, 378L, 378M, 378N, 378Q, 378R, 378T, 378V, 378W, 378Y, 379A, 379G, 379H, 379I, 379K, 379L, 379Q, 379T, 379Y, 380C, 380E, 380F, 380G, 380H, 380L, 380M, 380N, 380P, 380Q, 380R, 380T, 380V, 380W, 380Y, 381G, 381I, 381Q, 381R, 381S, 381T, 381W, 381Y, 382A, 382C, 382F, 382I, 382K, 382Q, 382R, 382T, 382W, 382Y, 383A, 383F, 383L, 383P, 383Q, 383V, 384A, 384G, 384H, 384I, 384K, 384P, 384Q, 384V, 384W, 385C, 385F, 385H, 385I, 385K, 385L, 385N, 385P, 385Q, 385R, 385S, 385V, 385W, 385Y, 386D, 386F, 386G, 386H, 386L, 386N, 386R, 386S, 386T, 386V, 386W, 386Y, 387I, 387L, 388A, 388C, 388G, 388H, 388L, 388P, 388S, 388T, 388W, 388Y, 389C, 389F, 389I, 389M, 389Q, 389V, 390F, 390I, 390K, 390L, 390N, 390R, 390S, 390T, 390V, 390W, 390Y, 391F, 391K, 391N, 391P, 391R, 391T, 391W, 391Y, 392A, 392C, 392D, 392E, 392F, 392H, 392K, 392L, 392N, 392Q, 392R, 392S, 392V, 392Y, 393A, 393C, 393D, 393F, 393G, 393H, 393I, 393L, 393Q, 393S, 393T, 393V, 393W, 393Y, 394A, 394C, 394F, 394H, 394I, 394K, 394L, 394Q, 394V, 394W, 395F, 395G, 395H, 395K, 395L, 395Q, 395R, 395S, 395T, 395V, 395W, 395Y, 396C, 396D, 396S, 397C, 397D, 397F, 397G, 397H, 397I, 397L, 397P, 397S, 397T, 397V, 397W, 398C, 398G, 398N, 398S, 398T, 398V, 399C, 399F, 399I, 399K, 399L, 399R, 399S, 399T, 399V, 399W, 399Y, 400C, 400D, 400E, 400F, 400G, 400H, 400I, 400K, 400L, 400M, 400Q, 400R, 400S, 400T, 400V, 400W, 400Y, 401A, 401C, 401D, 401E, 401F, 401I, 401K, 401L, 401M, 401N, 401Q, 401R, 401S, 401T, 401V, 401W, 401Y, 402A, 402C, 402D, 402E, 402F, 402G, 402H, 402I, 402K, 402L, 402M, 402N, 402P, 402Q, 402R, 402T, 402V, 402W, 402Y, 403A, 403C, 403H, 403I, 403M, 403V, 403W, 403Y, 404F, 404H, 404M, 404R, 404T, 404V, 404W, 404Y, 405G, 405Q, 405S, 405T, 406L, 406T, 407F, 407G, 407H, 407I, 407K, 407M, 407Q, 407R, 407S, 407T, 407V, 407W, 407Y, 408D, 408E, 408F, 408N, 408V, 409C, 409F, 409I, 409L, 409R, 409T, 409V, 409W, 409Y, 410V, 411E, 411F, 411M, 411Q, 411R, 411S, 411Y, 412N, 412T, 413C, 413F, 413G, 413I, 413L, 413P, 413R, 413S, 413V, 413W, 413Y, 414H, 414L, 414N, 414Q, 414T, 414V, 414W, 415D, 415E, 415G, 415I, 415R, 415V, 415W, 416F, 416L, 416Q, 416Y, 417A, 417C, 417D, 417F, 417G, 417H, 417I, 417K, 417M, 417N, 417Q, 418D, 418F, 418H, 418I, 418K, 418N, 418W, 418Y, 419E, 419F, 419H, 419I, 419L, 419S, 419T, 420D, 420E, 420F, 420G, 420H, 420I, 420K, 420L, 420Q, 420S, 420T, 420V, 420W, 420Y, 421C, 421L, 421M, 421S, 421T, 422F, 422I, 422S, 422W, 423D, 423I, 423Q, 423R, 423T, 424M, 424Q, 424R, 424V, 424Y, 425A, 425I, 425K, 425L, 425V, および 425Yからなる群から選択された1以上の位置における、親ポリペプチド中に存在する1以上のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に変える置換である。
ある実施態様では、酵素性能を改善する特徴は、熱安定性の向上、比活性の向上およびタンパク質発現の向上からなる群から選択される。
1 LTAPSIKSGT ILHAWNWSFN TLKHNMKDIH DAGYTAIQTS PINQVKEGNQ
51 GDKSMSNWYW LYQPTSYQIG NRYLGTEQEF KEMCAAAEEY GIKVIVDAVI
101 NHTTSDYAAI SNEVKSIPNW THGNTQIKNW SDRWDVTQNS LLGLYDWNTQ
151 NTQVQSYLKR FLDRALNDGA DGFRFDAAKH IELPDDGSYG SQFWPNITNT
201 SAEFQYGEIL QDSASRDAAY ANYMDVTASN YGHSIRSALK NRNLGVSNIS
251 HYASDVSADK LVTWVESHDT YANDDEESTW MSDDDIRLGW AVIASRSGST
301 PLFFSRPEGG GNGVRFPGKS QIGDRGSALF EDQAITAVNR FHNVMAGQPE
351 ELSNPNGNNQ IFMNQRGSHG VVLANAGSSS VSINTATKLP DGRYDNKAGA
401 GSFQVNDGKL TGTINARSVA VLYPDDIAKA PHVFLENYKT GVTHSFNDQL
451 TITLRADANT TKAVYQINNG PETAFKDGDQ FTIGKGDPFG KTYTIMLKGT
501 NSDGVTRTEK YSFVKRDPAS AKTIGYQNPN HWSQVNAYIY KHDGSRVIEL
551 TGSWPGKPMT KNADGIYTLT LPADTDTTNA KVIFNNGSAQ VPGQNQPGFD
601 YVLNGLYNDS GLSGSLPH
1 LTAPSIKSGT ILHAWNWSFN TLKHNMKDIH DAGYTAIQTS PINQVKEGNQ
51 GDKSMSNWYW LYQPTSYQIG NRYLGTEQEF KEMCAAAEEY GIKVIVDAVI
101 NHTTSDYAAI SNEVKSIPNW THGNTQIKNW SDRWDVTQNS LLGLYDWNTQ
151 NTQVQSYLKR FLDRALNDGA DGFRFDAAKH IELPDDGSYG SQFWPNITNT
201 SAEFQYGE IL QDSASRDAAY ANYMDVTASN YGHSIRSALK NRNLGVSNIS
251 HYASDVSADK LVTWVESHDT YANDDEESTW MSDDDIRLGW AVIASRSGST
301 PLFFSRPEGG GNGVRFPGKS QIGDRGSALF EDQAITAVNR FHNVMAGQPE
351 ELSNPNGNNQ IFMNQRGSHG VVLANAGSSS VSINTATKLP DGRYDNKAGA
401 GSFQVNDGKL TGTINARSVA VLYPD
1 MFEKRFKTSL LPLFAGFLLL FHLVLSGPAA ANAETANKSN KVTASSVKNG
51 TILHAWNWSF NTLTQNMKDI RDAGYAAIQT SP INQVKEGN QGDKSMSNWY
101 WLYQPTSYQI GNRYLGTEQE FKDMCAAAEK YGVKVIVDAV VNHTTSDYGA
151 ISDEIKRIPN WTHGNTQIKN WSDRWDITQN ALLGLYDWNT QNTEVQAYLK
201 GFLERALNDG ADGFRYDAAK HIELPDDGNY GSQFWPNITN TSAEFQYGEI
251 LQDSASRDTA YANYMNVTAS NYGHSIRSAL KNRILSVSNI SHYASDVSAD
301 KLVTWVESHD TYANDDEEST WMSDDDIRLG WAVIGSRSGS TPLFFSRPEG
351 GGNGVRFPGK SQIGDRGSAL FKDQAITAVN QFHNEMAGQP EELSNPNGNN
401 QIFMNQRGSK GVVLANAGSS SVTINTSTKL PDGRYDNRAG AGSFQVANGK
451 LTGTINARSA AVLYPDD IGN APHVFLENYQ TEAVHSFNDQ LTVTLRANAK
501 TTKAVYQINN GQETAFKDGD RLTIGKEDP I GTTYNVKLTG TNGEGASRTQ
551 EYTFVKKDPS QTNI IGYQNP DHWGNVNAYI YKHDGGGAIE LTGSWPGKAM
601 TKNADGIYTL TLPANADTAD AKVIFNNGSA QVPGQNHPGF DYVQNGLYNN
651 SGLNGYLPH
1 MLTFHRI IRK GWMFLLAFLL TASLFCPTGQ HAKAAAPFNG TMMQYFEWYL
51 PDDGTLWTKV ANEANNLSSL GITALWLPPA YKGTSRSDVG YGVYDLYDLG
101 EFNQKGTVRT KYGTKAQYLQ AIQAAHAAGM QVYADVVFDH KGGADGTEWV
151 DAVEVNPSDR NQEISGTYQI QAWTKFDFPG RGNTYSSFKW RWYHFDGVDW
201 DESRKLSRIY KFIGKAWDWE VDTENGNYDY LMYADLDMDH PEVVTELKNW
251 GKWYVNTTNI DGFRLDAVKH IKFSFFPDWL SYVRSQTGKP LFTVGEYWSY
301 DINKLHNYIT KTNGTMSLFD APLHNKFYTA SKSGGAFDMR TLMTNTLMKD
351 QPTLAVTFVD NHDTEPGQAL QSWVDPWFKP LAYAF ILTRQ EGYPCVFYGD
401 YYGIPQYNIP SLKSKIDPLL IARRDYAYGT QHDYLDHSD I IGWTREGVTE
451 KPGSGLAALI TDGPGGSKWM YVGKQHAGKV FYDLTGNRSD TVTINSDGWG
501 EFKVNGGSVS VWVPRKTT
CTTACAGCACCGTCGATCAAAAGCGGAACCATTCTTCATGCATGGAATTGGTCGTTCAATACGT TAAAACACAATATGAAGGATATTCATGATGCAGGATATACAGCCATTCAGACATCTCCGATTAA CCAAGTAAAGGAAGGGAATCAAGGAGATAAAAGCATGTCGAACTGGTACTGGCTGTATCAGCCG ACATCGTATCAAATTGGCAACCGTTACTTAGGTACTGAACAAGAATTTAAAGAAATGTGTGCAG CCGCTGAAGAATATGGCATAAAGGTCATTGTTGACGCGGTCATCAATCATACCACCAGTGATTA TGCCGCGATTTCCAATGAGGTTAAGAGTATTCCAAACTGGACACATGGAAACACACAAATTAAA AACTGGTCTGATCGATGGGATGTCACGCAGAATTCATTGCTCGGGCTGTATGACTGGAATACAC AAAATACACAAGTACAGTCCTATCTGAAACGGTTCTTAGACAGGGCATTGAATGACGGGGCAGA CGGTTTTCGATTTGATGCCGCCAAACATATAGAGCTTCCAGATGATGGCAGTTACGGCAGTCAA TTTTGGCCGAATATCACAAATACATCAGCAGAGTTCCAATACGGAGAAATCCTTCAGGATAGTG CCTCCAGAGATGCTGCATATGCGAATTATATGGATGTGACAGCGTCTAACTATGGGCATTCCAT AAGGTCCGCTTTAAAGAATCGTAATCTGGGCGTGTCGAATATCTCCCACTATGCATCTGATGTG TCTGCGGACAAGCTAGTGACATGGGTAGAGTCGCATGATACGTATGCCAATGATGATGAAGAGT CGACATGGATGAGCGATGATGATATCCGTTTAGGCTGGGCGGTGATAGCTTCTCGTTCAGGCAG TACGCCTCTTTTCTTTTCCAGACCTGAGGGAGGCGGAAATGGTGTGAGGTTCCCGGGGAAAAGC CAAATAGGCGATCGCGGGAGTGCTTTATTTGAAGATCAGGCTATCACTGCGGTCAATAGATTTC ACAATGTGATGGCTGGACAGCCTGAGGAACTCTCGAACCCGAATGGAAACAACCAGATATTTAT GAATCAGCGCGGCTCACATGGCGTTGTGCTGGCAAATGCAGGTTCATCCTCTGTCTCTATCAAT ACGGCAACAAAATTGCCTGATGGCAGGTATGACAATAAAGCTGGAGCGGGTTCATTTCAAGTGA ACGATGGTAAACTGACAGGCACGATCAATGCCAGGTCTGTAGCTGTGCTTTATCCTGATGATAT TGCAAAAGCGCCTCATGTTTTCCTTGAGAATTACAAAACAGGTGTAACACATTCTTTCAATGAT CAACTGACGATTACCTTGCGTGCAGATGCGAATACAACAAAAGCCGTTTATCAAATCAATAATG GACCAGAGACGGCGTTTAAGGATGGAGATCAATTCACAATCGGAAAAGGAGATCCATTTGGCAA AACATACACCATCATGTTAAAAGGAACGAACAGTGATGGTGTAACGAGGACCGAGAAATACAGT TTTGTTAAAAGAGATCCAGCGTCGGCCAAAACCATCGGCTATCAAAATCCGAATCATTGGAGCC AGGTAAATGCTTATATCTATAAACATGATGGGAGCCGAGTAATTGAATTGACCGGATCTTGGCC TGGAAAACCAATGACTAAAAATGCAGACGGAATTTACACGCTGACGCTGCCTGCGGACACGGAT ACAACCAACGCAAAAGTGATTTTTAATAATGGCAGCGCCCAAGTGCCCGGTCAGAATCAGCCTG GCTTTGATTACGTGCTAAATGGTTTATATAATGACTCGGGCTTAAGCGGTTCTCTTCCCCAT
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SVSMVYQTLE QLRSQTPLSL NQPAGSVQLK IPGCNDQTAE GYCPLSTFTR
VVSQSVEPGC QLQ
定義および略号
1.1.定義
1.2.略号
以下の略号が特に指定されない限り適用される。
AE アルコールエトキシレート
AEO アルコールエトキシレート
AEOS アルコールエトキシサルフェート
AES アルコールエトキシサルフェート
AGU グルコミラーゼ活性単位
AkAA アスペルギルスカワチ(Aspergillus kawachii)α−アミラーゼ
AmyE バチルスサブティリスα−アミラーゼ
AmyS ゲオバチルスステアロサーモフィルスα−アミラーゼ
AS アルコールサルフェート
BAA 細菌α−アミラーゼ
cDNA 相補的DNA
CMC カルボキシメチルセルロース
DE デキストロース同等物
DI 蒸留された、脱イオンされた
DNA デオキシリボ核酸
DP3 3の副単位を有する重合度
DPn nの副単位を有する重合度
DSまたはds 乾燥固形分
DTMPA ジエチルトリアミン五酢酸
EC 酵素分類のための酵素番号
EDTA エチレンジアミン四酢酸
EDTMPA エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸
EO エチレンオキシド
F&HC 布地および家庭用品
GAU グルコアミラーゼ単位
HFCS 高フルクトーストウモロコシシロップ
HFSS 高フルクトースデンプンベースシロップ
IPTG イソプロピルβ−D−チオガラクトース
LA ルリア寒天
LB ルリアブロス
LU リパーゼ単位
L1T 位置1におけるロイシン(L)残基がトレオニン(T)残基で置き換えられること。ここでアミノ酸は当分野で普通に知られた単文字略号によって表示される。
MW 分子量
NCBI 米国立生物工学情報センター
nm ナノメートル
NOBS ノナノイルオキシベンゼンスルフォネート
NTA ニトリロ三酢酸
OD 光学密度
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
PEG ポリエチレングリコール
pI 等電点
ppm 100万分の1部
PVA ポリ(ビニルアルコール)
PVP ポリ(ビニルピロリドン)
RAU 参照アミラーゼ単位
RNA リボ核酸
SAS 2級アルカンスルホネート
1×SSC 0.15MのNaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.0
SSF 同時の糖化および発酵
SSU 可溶性デンプン単位、1分間当たり1mgのグルコースが放出される還元力と同等
TAED テトラアセチルエチレンジアミン
TNBS トリニトロベンゼンスルホン酸
TrGA トリコデルマリーゼイグルコアミラーゼ
w/v 重量/体積
w/w 重量/重量
wt 野生型
μL マイクロリットル
μNm マイクロニュートン×メートル
2.AmyEポリペプチド
2.1.親AmyEポリペプチド
2.2.AmyE変異体
5, 66, 67, 69, 70, 71, 72, 74, 77, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 86, 87, 88, 89, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 110, 111, 113, 114, 117, 121, 122, 126, 128, 129, 130, 131, 135, 136, 138, 139, 140, 141, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 164, 165, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 183, 184, 186, 189, 191, 193, 194, 196, 197, 198, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 215, 216, 217, 220, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 235, 236, 237, 238, 239, 241, 242, 244, 246, 249, 256, 258, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 278, 279, 280, 281, 285, 286, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 312, 315, 316, 322, 326, 329, 330, 332, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 348, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 387, 389, 391, 392, 394, 396, 397, 398, 399, 402, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425)。
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A, 403C, 403E, 403G, 403H, 403I, 403M, 403N, 403Q, 403S, 403T, 403V, 403W, 403Y, 404D, 404E, 404F, 404G, 404H, 404I, 404L, 404M, 404N, 404P, 404R, 404T, 404V, 404W, 404Y, 405E, 405F, 405G, 405H, 405I, 405K, 405Q, 405S, 405T, 406D, 406F, 406L, 406T, 406Y, 407A, 407C, 407E, 407F, 407G, 407H, 407I, 407K, 407M, 407N, 407P, 407Q, 407R, 407S, 407T, 407V, 407W, 407Y, 408A, 408D, 408E, 408F, 408H, 408I, 408K, 408N, 408P, 408Q, 408S, 408T, 408V, 408Y, 409A, 409C, 409D, 409E, 409F, 409H, 409I, 409L, 409M, 409Q, 409R, 409T, 409V, 409W, 409Y, 410F, 410G, 410I, 410K, 410Q, 410S, 410T, 410V, 410W, 410Y, 411A, 411D, 411E, 411F, 411G, 411H, 411I, 411L, 411M, 41 IN, 411Q, 41 IR, 411S, 411V, 411W, 411Y, 412A, 412D, 412E, 412H, 412I, 412K, 412L, 412M, 412N, 412R, 412S, 412T, 412V, 412Y, 413C, 413E, 413F, 413G, 413I, 413L, 413M, 413N, 413P, 413R, 413S, 413V, 413W, 413Y, 414A, 414C, 414E, 414F, 414G, 414H, 414L, 414M, 414N, 414P, 414Q, 414T, 414V, 414W, 415D, 415E, 415F, 415G, 415H, 415I, 415K, 415P, 415Q, 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05T, 305V, 307C, 307N, 308C, 308F, 308G, 308H, 308I, 308K, 308L, 308M, 308N, 308P, 308Q, 308R, 308S, 308T, 308V, 308W, 308Y, 309D, 309E, 309F, 309H, 309K, 309R, 309S, 310A, 311A, 311H, 311K, 311R, 312D, 312F, 312G, 312H, 312I, 312K, 312L, 312M, 312P, 312Q, 312R, 312S, 312T, 312V, 312W, 312Y, 313A, 313D, 313E, 313F, 313K, 313L, 313N, 313Q, 313R, 313S, 313W, 313Y, 314A, 314F, 314H, 314K, 314L, 314M, 314Q, 314R, 314S, 314T, 314W, 314Y, 315K, 315N, 315P, 315T, 316Y, 317A, 317C, 317E, 317F, 317H, 317K, 317L, 317R, 317S, 317T, 317V, 317W, 317Y, 318D, 318F, 318H, 318I, 318K, 318L, 318M, 318N, 318R, 318S, 318T, 318V, 318W, 318Y, 319G, 319L, 319N, 319Q, 319V, 319W, 320C, 320F, 320G, 320I, 320K, 320L, 320M, 320P, 320Q, 320T, 320V, 320Y, 321C, 321D, 321E, 321F, 321G, 321H, 321I, 321K, 321L, 321R, 321S, 321T, 321V, 321W, 322L, 322M, 322V, 324A, 324F, 324G, 324H, 324I, 324K, 324L, 324M, 324N, 324Q, 324R, 324S, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325C, 325D, 325G, 325H, 325I, 325K, 325L, 325M, 325N, 325P, 325T, 325V, 327C, 327D, 327G, 327H, 327N, 327T, 328D, 328E, 328F, 328L, 328N, 328Q, 328Y, 329F, 329H, 329Q, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331G, 331I, 331L, 331Q, 331S, 331T, 331V, 331Y, 332A, 332C, 332G, 332Q, 332S, 333C, 333G, 333H, 333K, 333L, 333M, 333R, 333S, 333W, 333Y, 334D, 334H, 334I, 334L, 334M, 334N, 334R, 334T, 335V, 336A, 336C, 336F, 336G, 336I, 336M, 336N, 336Q, 336R, 336V, 336W, 336Y, 337H, 337N, 337S, 337V, 337W, 337Y, 338G, 338I, 338L, 338M, 338S, 338T, 339C, 340F, 340H, 340K, 340L, 340M, 340N, 340S, 340T, 340V, 340W, 341A, 341L, 341Y, 342A, 342K, 342N, 342R, 342Y, 343A, 343D, 343E, 343F, 343H, 343K, 343L, 343M, 343Q, 343S, 343T, 343W, 343Y, 344A, 344D, 344E, 344F, 344G, 344I, 344K, 344L, 344M, 344N, 344Q, 344R, 344S, 344T, 344W, 344Y, 345C, 345E, 345F, 345G, 345H, 345I, 345N, 345Q, 345S, 345T, 345V, 346C, 346D, 346E, 346I, 346K, 346L, 346M, 346N, 346S, 346T, 346V, 346Y, 347D, 347F, 347H, 347I, 347K, 347L, 347M, 347Q, 347R, 347S, 347T, 347V, 347W, 348F, 348H, 348I, 348K, 348R, 348S, 348T, 348V, 348W, 348Y, 349A, 349F, 349G, 349I, 349K, 349M, 349N, 349R, 349S, 349V, 349W, 349Y, 350D, 351A, 351D, 351G, 351H, 351K, 351L, 351M, 351P, 351Q, 351R, 351T, 351V, 351W, 351Y, 352A, 352H, 352Q, 352T, 352Y, 353A, 353D, 353E, 353G, 353I, 353K, 353L, 353M, 353Q, 353V, 353W, 353Y, 355C, 355F, 355I, 355L, 355M, 355V, 355Y, 356D, 356F, 356G, 356I, 356K, 356L, 356P, 356Q, 356T, 356W, 356Y, 357A, 357H, 357I, 357K, 357L, 357N, 357Q, 357R, 357S, 357T, 357V, 357W, 357Y, 358C, 358D, 358F, 358G, 358H, 358I, 358K, 358L, 358M, 358Q, 358R, 358S, 358T, 358V, 358Y, 359D, 359E, 359H, 359L, 359M, 359P, 359Q, 359R, 359T, 359V, 359W, 360F, 360P, 360T, 361C, 361L, 361M, 361N, 361Q, 361S, 361T, 361V, 362A, 362C, 362I, 362L, 362V, 362Y, 363D, 363G, 363H, 363Q, 363R, 363S, 363V, 363W, 363Y, 364A, 364C, 364G, 364I, 364L, 364M, 364Q, 364S, 364T, 364V, 365C, 365I, 365K, 365L, 365N, 365R, 365S, 365V, 366A, 366K, 367L, 367M, 367N, 367R, 367S, 367T, 367W, 367Y, 368G, 368I, 368K, 368L, 368R, 368T, 368V, 368W, 369C, 369D, 369E, 369F, 369G, 369I, 369K, 369L, 369N, 369Q, 369S, 369T, 369V, 369Y, 371A, 371C, 371F, 371I, 371L, 371M, 371N, 371S, 371T, 371Y, 372A, 372C, 372I, 372L, 372N, 372S, 372T, 373A, 373C, 373F, 3731, 373M, 373T, 373V, 374C, 374G, 374I, 374M, 374S, 374T, 374V, 375A, 375C, 375D, 375F, 375H, 375L, 375M, 375Q, 375S, 375T, 375Y, 376G, 376I, 376S, 376T, 376V, 377F, 377H, 377L, 377T, 377W, 377Y, 378C, 378E, 378F, 378G, 378H, 378I, 378K, 378L, 378M, 378N, 378Q, 378R, 378T, 378V, 378W, 378Y, 379A, 379G, 379H, 379I, 379K, 379L, 379Q, 379T, 379Y, 380C, 380E, 380F, 380G, 380H, 380L, 380M, 380N, 380P, 380Q, 380R, 380T, 380V, 380W, 380Y, 381G, 381I, 381Q, 381R, 381S, 381T, 381W, 381Y, 382A, 382C, 382F, 382I, 382K, 382Q, 382R, 382T, 382W, 382Y, 383A, 383F, 383L, 383P, 383Q, 383V, 384A, 384G, 384H, 384I, 384K, 384P, 384Q, 384V, 384W, 385C, 385F, 385H, 385I, 385K, 385L, 385N, 385P, 385Q, 385R, 385S, 385V, 385W, 385Y, 386D, 386F, 386G, 386H, 386L, 386N, 386R, 386S, 386T, 386V, 386W, 386Y, 387I, 387L, 388A, 388C, 388G, 388H, 388L, 388P, 388S, 388T, 388W, 388Y, 389C, 389F, 389I, 389M, 389Q, 389V, 390F, 390I, 390K, 390L, 390N, 390R, 390S, 390T, 390V, 390W, 390Y, 391F, 391K, 391N, 391P, 391R, 391T, 391W, 391Y, 392A, 392C, 392D, 392E, 392F, 392H, 392K, 392L, 392N, 392Q, 392R, 392S, 392V, 392Y, 393A, 393C, 393D, 393F, 393G, 393H, 393I, 393L, 393Q, 393S, 393T, 393V, 393W, 393Y, 394A, 394C, 394F, 394H, 394I, 394K, 394L, 394Q, 394V, 394W, 395F, 395G, 395H, 395K, 395L, 395Q, 395R, 395S, 395T, 395V, 395W, 395Y, 396C, 396D, 396S, 397C, 397D, 397F, 397G, 397H, 397I, 397L, 397P, 397S, 397T, 397V, 397W, 398C, 398G, 398N, 398S, 398T, 398V, 399C, 399F, 399I, 399K, 399L, 399R, 399S, 399T, 399V, 399W, 399Y, 400C, 400D, 400E, 400F, 400G, 400H, 400I, 400K, 400L, 400M, 400Q, 400R, 400S, 400T, 400V, 400W, 400Y, 401A, 401C, 401D, 401E, 401F, 401I, 401K, 401L, 401M, 401N, 401Q, 401R, 401S, 401T, 401V, 401W, 401Y, 402A, 402C, 402D, 402E, 402F, 402G, 402H, 402I, 402K, 402L, 402M, 402N, 402P, 402Q, 402R, 402T, 402V, 402W, 402Y, 403A, 403C, 403H, 403I, 403M, 403V, 403W, 403Y, 404F, 404H, 404M, 404R, 404T, 404V, 404W, 404Y, 405G, 405Q, 405S, 405T, 406L, 406T, 407F, 407G, 407H, 407I, 407K, 407M, 407Q, 407R, 407S, 407T, 407V, 407W, 407 Y, 408D, 408E, 408F, 408N, 408V, 409C, 409F, 409I, 409L, 409R, 409T, 409V, 409W, 409Y, 410V, 411E, 411F, 411M, 411Q, 411R, 411S, 411Y, 412N, 412T, 413C, 413F, 413G, 413I, 413L, 413P, 413R, 413S, 413V, 413W, 413Y, 414H, 414L, 414N, 414Q, 414T, 414V, 414W, 415D, 415E, 415G, 415I, 415R, 415V, 415W, 416F, 416L, 416Q, 416Y, 417A, 417C, 417D, 417F, 417G, 417H, 417I, 417K, 417M, 417N, 417Q, 418D, 418F, 418H, 418I, 418K, 418N, 418W, 418Y, 419E, 419F, 419H, 419I, 419L, 419S, 419T, 420D, 420E, 420F, 420G, 420H, 420I, 420K, 420L, 420Q, 420S, 420T, 420V, 420W, 420Y, 421C, 421L, 421M, 421S, 421T, 422F, 422I, 422S, 422W, 423D, 423I, 423Q, 423R, 423T, 424M, 424Q, 424R, 424V, 424Y, 425A, 425I, 425K, 425L, 425V, および 425Yによって例示される。
3.AmyEポリペプチドの生産
3.1.ポリヌクレオチドおよびベクター
3.2 AmyEポリペプチドの発現および宿主生物
配列MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETANKSNE(配列番号9)
を有する付加的なN末端アミノ酸とともに天然に発現される。シグナル配列は、あるいは、異なるAmyE由来またはさらには異なるタンパク質由来のバチルスサブティリス種シグナル配列であってもよい。さらに、シグナル配列は異なる種、たとえばバチルスリケニフォルミス由来であってもよい。シグナル配列は、たとえば特定の宿主細胞中でAmyEまたはその変異体の最適な発現をもたらすように選択されることができる。成熟AmyEは、シグナル配列ではないN末端から付加配列をタンパク質分解的に切断した結果として生成されることができる。たとえば、バチルスリケニフォルミス由来の31アミノ酸残基シグナル配列(「LATリーダー配列」)は、AmyE配列とフレーム内で融合されることができる。たとえば、AmyEをコードする核酸は、図2に示された発現ベクター中のバチルスリケニフォルミスシグナル配列に機能しうるように連結されている。
4.AmyEポリペプチドの精製
5.AmyEポリペプチドの組成物および使用方法
5.1.デンプン処理組成物および方法
5.1.1.概説
5.1.2. デンプン組成物
5.1.3.液化および糖化
5.1.4.糖化によって生産されたグルコースのさらなる処理
5.1.5.AmyEアミラーゼの利点
5.1.6.AmyEとグルコアミラーゼおよび他の酵素との組み合わせ
5.2.洗浄組成物および食器洗い組成物ならびに方法
5.3.洗濯洗剤組成物および方法
5.4.AmyEポリペプチドと組み合わされて用いられる酵素
5.5.AmyEポリペプチドの洗浄性能を測定するアッセイ
5.6.布地サイズ剤除去組成物および方法
5.7.ベーキングおよび食品調製のための組成物および方法
実施例
以下の一般的方法がプラスミドの構築およびタンパク質の発現に用いられた。
1.1.プラスミドの構築
配列番号10:プライマーPSTAMYE-F’
5 '-CTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCTTC AGC ACTT-ACAGCACCGTCGATCAAAAGCGGAAC-3’
配列番号11:プライマーAMYENOPST-R’
5'-CTGGAGGCACTATCCTGAAGGATTTCTCCGTATTG- GAACTCTGCTGATGTATTTGTG-3'
配列番号12:プライマーAMYENOPST-F’
5'-CACAAATACATCAGCAGAGTTCCAATACGGAGAAA-TCCTTCAGGATAGTGCCTCC AG-3’
配列番号13:プライマーHPAIAMYE-R’
5'-CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAATGGGGAAGA-GAACCGCTTAAGCCCGAGTC-3’
配列番号14:プライマーHPAIAMYE-R’
5'-CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAATCAGGATAA-AGC ACAGCTAC AG ACCTGG-3’
配列番号15:プライマーAMYE SEQ-F’
5'-TACACAAGTACAGTCCTATCTG-3’
配列番号16:プライマーAMYE SEQ-F’
5'-CATCCTCTGTCTCTATCAATAC-3’
1.2.タンパク質の発現
以下のアッセイが以下に記載された実施例に用いられた。以下に示される手順からの偏差は個々の実施例に示される。これらの実験では、反応終了後の生成産物の吸光度を測定するために、分光光度計が用いられた。
2.1.アミラーゼ活性アッセイ
2.2.粘度測定アッセイ
2.3.熱安定性を測定するための示差走査熱量計法(DSC)
2.4.96ウェルマイクロタイタープレートにおけるBradfordアッセイ
2.5.HPLC測定によるグルコースの生成
マルトースおよびマルトヘプタオースの加水分解
不溶性デンプンの加水分解
HPLC検出方法
2.6.マルトースおよびマルトヘプタオース基質を用いるグルコース生成
2.7.三重アッセイ
2.8 粘度低下速度測定のための高処理量粘度測定アッセイ
2.9 液化後粘度測定のための高処理量粘度測定アッセイ
完全長AmyE(配列番号1)、AmyE−tr(配列番号2)およびこれらの変異体の比活性およびpH最適値が、実施例2.1に記載されたアッセイを用いて測定された。比活性は、50℃ならびにpH4.5、5.0および5.6で30分間にわたってRBBトウモロコシデンプン基質から放出された染料の量を分光光度法で測定することによって決定された。図3は、AmyE−trおよびAmy31AがpH5および5.6と比較してpH4.5においてもっとも高い比活性を有することを示す。AmyEは、pH5においてpH5.6におけるよりも高い比活性を示す。
トウモロコシデンプン基質の粘度を低減するAmyE、AmyE−trおよびこれらの変異体の能力は、実施例2.2に記載されたアッセイ方法を用いて測定された。粘度は、各酵素についてpH4.5および5.8において時間の関数として測定された。図4Aおよび4Bは、それぞれ、AmyE−trおよびAmyEがpH4.5および5.8の双方において基質の粘度を低減することを示す。より低い最終粘度はpH5.8で観察されたけれども、ピーク粘度は同じであった。図4Cおよび4Dは、それぞれ、Amy31AがpH4.5およびpH5.8で、よりよい性能を有することを示す。
AmyE、AmyE−trおよびこれらの変異体の熱安定性が、実施例2.3に記載された示差走査熱量計法(DSC)を用いてCa2+の存在および不存在下に測定されて、Ca2+が酵素の安定性に寄与しているか否かが決定された。DSCは熱的高次構造破壊過程が不可逆であることを明らかにした。図5Aは、2mMのCa2+ありおよびなしでのAmyEおよびAmyE−trについてのDSC高次構造破壊曲線を示す。図5Bは、完全長Amy31A変異体についてのDSC高次構造破壊曲線を示す。カルシウムが熱融点に何らの効果も有しないことは、AmyE、AmyE−trおよびAmy31AのいずれもCa2+を結合せず、mM濃度領域においてCa2+によって安定化されないことを示唆する。図5Cに示されたように、ゲオバチルスステアロサーモフィルスα−アミラーゼ(AmyS)について対照的な結果が得られた。表1は試験された酵素の融点をまとめている。Ca2+の添加はAmyE、AmyE−trまたはAmy31Aの熱安定性を有意に変化させないが、他方、Ca2+はAmySの熱安定性を有意に増加した。
AmyE−tr(配列番号2)およびAmyE−trの位置Q153(C、F、I、K、NおよびV)の6のAmyE変異体がマルトースおよびマルトヘプタオース基質をpH5.6においてグルコースに転化する能力が、実施例2.3に記載されたグルコース生成アッセイを用いて試験された。生成されたグルコースは1,2および3日後に測定された。AmyE−trおよびAmyE変異体は1ppmで用いられた。切断されたAmyS(配列番号4)が同様な施量で比較のために用いられた。
AmyE−tr(配列番号2)、AmySおよびAmyE変異体Q153Kがマルトヘプタオース(DP7)をグルコース(DP1)に転化する能力が試験された。この反応の産物が実施例2.2に記載されたHPLC方法を用いて分析された。代表的な溶出プロファイルが図8〜10に示される。
この実施例は位置変異体のライブラリーの構築および発現に関する。
8.1 位置ライブラリーの構築
8.2.タンパク質の発現
アミラーゼ位置変異体は、比活性および熱安定性を測定するためのデンプン加水分解アッセイを用いて評価された。AmyE変異体はまた、染み除去性能を測定するための洗浄スウォッチアッセイを用いても分析された。AmyE変異体のpH安定性は、マルトヘプタオース基質へのアミラーゼ活性を測定することによって評価された。AmyE変異体のそれぞれの熱安定性は、熱応力の前後のマルトヘプタオース基質へのアミラーゼ活性を測定することによって決定された。
9.1.比活性および熱安定性の測定
9.2.染み除去性能の測定
9.3.pH安定性の測定
9.4.熱安定性の測定
実施例9における手順を用いて、AmyE−trの相対性能または活性が、実施例6に記載されたように生成されたAmyE変異体と比較された。6以上の構成員を有する全部で140の位置変異体が評価された。
アップ突然変異体:PI>1
中性突然変異体:PI>0.5
非有害突然変異体:PI>0.05
有害突然変異体:PI≦0.05
完全制限位置:タンパク質および活性について中性突然変異体なし
非完全制限位置:試験された特性のうちの1について少なくとも1の中性突然変異体
非制限位置:少なくとも1の特性について≧20%の中性突然変異体
この実施例では、Illinois River Energy(IRE)液化物(31%DS)に基づく慣用のエタノール発酵における切断AmyEの性能を評価するための実験が、慣用のエタノール発酵アッセイを用いて実施された。手短にいうと、400ppmの尿素を有する31%DSのIllinois River Energy(IRE)液化物のバッチが調製され、5NのH2SO4で1のバッチのpHが4.3に調整され、残りがpH5.8に調整された。100gの基質がフラスコ(125ml三角フラスコ)ごとに用いられた。酵素が指示通りに施量された。発酵物が0.2mlの10(w/v)%の(DI水中で約45分間前水和された)Red Star Ethanol Red酵母を植菌された。フラスコは48時間の発酵の間、撹拌棒にて320rpmで撹拌されながら32℃において温置された。生産されたエタノールの量がHPLC分析によって測定された。切断AmyE(配列番号2)の性能が、pH4.3およびpH5.8においてSPEZYME(商標)Xtraアミラーゼ(配列番号4)と比較された。切断AmyEおよびSPEZYME(商標)Xtraアミラーゼは0.2mg/DSgで施量された。
この実施例では、pH4.3およびpH5.8において不溶性顆粒(未調理)デンプンをエタノールに加水分解する完全長AmyE(配列番号1)および切断AmyE(配列番号2)の能力を比較するための実験が、実施例11に記載された全粉砕トウモロコシに基づくエタノール発酵アッセイを用いて実施された。
この実験では、pH4.5およびpH5.6においてマルトースをグルコースに転化するバチルスサブティリスアルファアミラーゼの能力を測定するための実験が、実施例2に記載されたグルコース生成アッセイを用いて実施された。反応は2、5および8日後に分析された。
この実験では、不溶性顆粒(未調理)デンプンを加水分解する完全長AmyE(配列番号1)の能力を測定するための実験が実施された。不溶性デンプンから生産された糖の検出のために用いられるHPLCの方法は以下の通りである。
位置ライブラリーが、Geneart(Geneart社、独国、Resenburg、D−93053、Josef−Engert−strasse 11)によって完全長AmyE(配列番号1)中の295部位において構築された。表3は、位置ライブラリーがつくられた各残基を示す。残基は配列番号1中のそれらの位置を基準に数えられる。
実施例8および9に記載された手順を用いて、完全長AmyEおよび切断AmyEの相対性能または活性が、完全長AmyEおよび切断AmyE中に生成された変異体と比較された。表4はAmyE完全長変異体の部位評価選抜の結果をまとめており、表5はAmyE切断変異体の部位評価選抜の結果をまとめている。列1は野生型酵素中のアミノ酸を示す。列2はこの検討で調べられた位置における変異体を表している。それ以降の列は、試験された特性についての変異体の性能指数値を示す。試験された特性は以下の通りであった。すなわち、Bradfordアッセイ(発現)によるタンパク質の測定、粘度低下速度(ピーク粘度)、液化後粘度の低下(最終粘度)、重合度(ヨウ素)、生成された還元末端(還元末端)、存在する全グルコース(グルコース)、pH5.8におけるマルトヘプタオースの加水分解(DP7pH5.8)、pH5.8におけるマルトヘプタオースの加水分解を用いた(60℃において30分間の)熱安定性(DP7pH5.8加熱)、pH4におけるマルトヘプタオースの加水分解(DP7pH4)、pH5.8におけるマルトトリオースの加水分解を用いた(60℃において30分間の)熱安定性(DP3HS)、トウモロコシ粉基質上30分間の比活性(トウモロコシ粉30分間)、pH8における米デンプン染みマイクロスウォッチアッセイ(洗剤pH8)およびpH10における米デンプン染みマイクロスウォッチアッセイ(洗剤pH10)。性能指数(Pi)は変異体と親タンパク質との性能の比と定義される。
完全制限位置:試験されたいずれの特性についても中性突然変異体なし
非完全制限位置:試験された特性のうちの1について少なくとも1の中性突然変異体
比制限位置:少なくとも1の特性について≧20%の中性突然変異体
α−アミラーゼの作用によるトウモロコシ粉の粘度低下が、HAAKE Viscotester550計器を用いて監視された。基質スラリーは、30%トウモロコシ粉乾燥固形分を用いてバッチ様式で毎日足される。pHは硫酸を用いて5.8に調整された。50gのスラリー(15g乾燥固形分)が検量され、撹拌されながら10分間前温置されて70℃まで加熱された。α−アミラーゼを添加すると、75rpmの回転速度で温度は70℃から85℃まで直ちに上昇した。スラリーと酵素との混合物の温度が85℃に達した後、その温度が一定に保持され、粘度がさらに30分間監視された。粘度は反応全体を通して監視され、μNm単位で報告された。
超高感度走査高処理量マイクロ熱量計VP−Cap DSC(MicroCal社、米国、マサチューセッツ州、Northampton)を用いて、過剰熱容量曲線が測定された。DSC測定の標準的な手順および該技術の理論はすでに公表されている(Freire, E. (1995) Differential Scanning Calorimetry Methods. Mol. Biol. 41: 191-218)。約500μLの0.5mg/mlのAmyE−trまたは切断AmyE変異体が30〜120℃の温度範囲にわたって走査された。この同じサンプルがそれからこの過程の可逆性を確認するために再走査された。用いられた緩衝液は10mM酢酸ナトリウム、pH4.0またはpH5.8であった。凝集から生じるかもしれない何らかの人為的な影響を最小限にするために、200℃/時の走査速度が用いられた。DSC曲線の熱的中点(Tm)が熱安定性の指標として用いられた。表11は、pH4.0およびpH5.8で試験された野生型切断AmyEおよび切断AmyE変異体のTm値を示す。
以下の実施例はパンの老化を低減するためにAmyEポリペプチドを用いる方法に関する。
A.ベーキング試行の処方
B.堅さ、弾力性および一体性を評価する手順
C.堅さの評価の手順
D.AmyE変異体ポリペプチドで処理された食品の改善された取扱い特性
Claims (25)
- デンプン転化方法においてデンプンを液化しおよび糖化する方法であって、
デンプン基質をAmyEポリペプチドに接触させて反応混合物を形成し、該反応混合物中で該デンプン基質を液化しおよび糖化してグルコースを生産する工程を含み、
該液化および糖化がpHの調整なしに同じ反応混合物中で実施される、方法。 - 糖化が、グルコアミラーゼ活性を有するさらなるポリペプチドの不存在下に実施される、請求項1に記載の方法。
- 液化が、グルコアミラーゼポリペプチドの活性に適したpHにおいて実施される、請求項1に記載の方法。
- pHが5.0以下である、請求項3に記載の方法。
- pHが4.5以下である、請求項3に記載の方法。
- pHが4.0以下である、請求項3に記載の方法。
- グルコアミラーゼ活性を有するさらなるポリペプチドが、デンプン基質をAmyEポリペプチドに接触させる前に、反応混合物に添加される、請求項1に記載の方法。
- グルコアミラーゼ活性を有するさらなるポリペプチドが、デンプン基質をAmyEポリペプチドに接触させた後に、反応混合物に添加される、請求項1に記載の方法。
- グルコアミラーゼ活性を有するさらなるポリペプチドが、デンプン基質をAmyEポリペプチドに接触させるのと同時に、反応混合物に添加される、請求項1に記載の方法。
- 液化および糖化によって生産されたグルコースを発酵させてアルコールを生産する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- アルコールがエタノールである、請求項10に記載の方法。
- 糖化と発酵との少なくとも一部が、同じ反応混合物中で同時に行われる、請求項11に記載の方法。
- 液化および糖化によって生産されたグルコースをグルコースイソメラーゼに接触させてフルクトースを生産する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 外因性カルシウムが反応混合物に添加されない、請求項1に記載の方法。
- 反応混合物中のカルシウム濃度が約8ppm未満である、請求項1に記載の方法。
- 液化および糖化によって生産されたグルコースをグルコースイソメラーゼに接触させて、反応混合物中のカルシウムの量を低減することなく、フルクトースを生産する工程をさらに含む、請求項14に記載の方法。
- AmyEポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、請求項1に記載の方法。
- AmyEポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、請求項1に記載の方法。
- AmyEポリペプチドが、C末端デンプン結合ドメインの欠失を含む、請求項1に記載の方法。
- AmyEポリペプチドが、α−アミラーゼ活性および酵素性能を改善する少なくとも1の変えられた特性を有する変異体ポリペプチドであって、該変異体ポリペプチドが、
AmyE(配列番号1)またはAmyEの切断変異体(配列番号2)から選択された親α−アミラーゼポリペプチドと少なくとも60%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 5 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, および 425からなる群から選択された1以上の位置における修飾を含み、
該修飾が酵素性能を改善する少なくとも1の特性について1.0超の性能指数(PI)を有する変異体ポリペプチドを生成する、変異体ポリペプチドである、請求項1に記載の方法。 - 修飾が、IA, 1C, 1D, 1E, 1F, 1G, 1H, 1K, 1M, 1N, 1Q, 1R, 1S, 1T, 1V, 1W, 1Y, 2A, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H, 2I, 2K, 2L, 2M, 2N, 2P, 2Q, 2R, 2S, 2V, 2W, 2Y, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H, 3I, 3K, 3L, 3M, 3N, 3P, 3Q, 3R, 3S, 3V, 3W, 3Y, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4K, 4L, 4M, 4N, 4Q, 4S, 4T, 4V, 4W, 4Y, 5A, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H, 5I, 5K, 5L, 5N, 5R, 5V, 5W, 5Y, 6C, 6D, 6E, 6H, 6K, 6L, 6M, 6N, 6P, 6Q, 6R, 6S, 6T, 6V, 6W, 7A, 7C, 7D, 7E, 7F, 7G, 7H, 7I, 7L, 7M, 7N, 7P, 7Q, 7R, 7S, 7T, 7W, 7Y, 8A, 8C, 8E, 8F, 8G, 8H, 8I, 8K, 8L, 8M, 8N, 8P, 8Q, 8R, 8T, 8V, 8W, 8Y, 9A, 9C, 9D, 9E, 9F, 9H, 9I, 9K, 9M, 9N, 9P, 9R, 9S, 9T, 9V, 9W, 9Y, 1OA, 10I, 1OL, 1OM, ION, 1OP, 1OQ, 1OS, 10V, 11A, 11F, 11G, 11H, 11M, 11S, 11V, 11W, 11Y, 12I, 12M, 12V, 13A, 13C, 13D, 13E, 13F, 13G, 13I, 13L, 13M, 13Q, 13T, 13V, 13W, 13Y, 14C, 14F, 14G, 14M, 14N, 14S, 14T, 14V, 15A, 15F, 16A, 16D, 16E, 16F, 16G, 16H, 16I, 16L, 16M, 16Q, 16S, 16T, 16V, 17A, 17F, 17I, 17M, 17Q, 17Y, 18A, 18C, 18D, 18E, 18G, 18H, 18M, 18N, 18Q, 18R, 18T, 19A, 19C, 19H, 19L, 19M, 19N, 19S, 19W, 19Y, 2OA, 2OC, 2OD, 2OF, 2OG, 2OH, 20I, 2OK, 2OL, 2OM, 2OP, 2OQ, 2OR, 2OS, 2OT, 20V, 2OW, 2OY, 21A, 21C, 21D, 21E, 21H, 21I, 21K, 21L, 21M, 21N, 21Q, 21R, 21S, 21V, 22I, 22M, 22Q, 22S, 22T, 22V, 23A, 23C, 23D, 23E, 23F, 23G, 23H, 23I, 23L, 23M, 23N, 23R, 23S, 23T, 23V, 23W, 23Y, 24A, 24C, 24D, 24F, 24G, 24L, 24N, 24P, 24Q, 24R, 24S, 24T, 24V, 24Y, 25A, 25C, 25D, 25E, 25F, 25G, 25H, 25I, 25K, 25L, 25R, 25S, 25T, 25V, 25W, 25Y, 26A, 26F, 26I, 26L, 26V, 27A, 27C, 27D, 27E, 27F, 27G, 27H, 27I, 27L, 27M, 27N, 27P, 27Q, 27R, 27S, 27T, 27V, 27W, 27Y, 28A, 28C, 28F, 28G, 28H, 28I, 28K, 28L, 28M, 28N, 28P, 28Q, 28R, 28S, 28T, 28V, 28W, 28Y, 29A, 29C, 29F, 29L, 29M, 29T, 29V, 3OA, 3OC, 3OD, 3OE, 3OF, 3OG, 30I, 3OK, 3OL, 3OM, 3ON, 3OP, 3OQ, 3OR, 3OS, 3OT, 30V, 3OW, 3OY, 31A, 31C, 31E, 31F, 31G, 31H, 31I, 31K, 31L, 31M, 31N, 31Q, 31S, 31T, 31V, 31W, 31Y, 32D, 32F, 32G, 32H, 32K, 32L, 32M, 32Q, 32S, 32T, 32V, 32Y, 33A, 33C, 33D, 33E, 33F, 33H, 33I, 33K, 33L, 33M, 33P, 33Q, 33S, 33T, 33W, 33Y, 34A, 34F, 34I, 34P, 34W, 35A, 35C, 35F, 35G, 35H, 35I, 35L, 35M, 35N, 35P, 35Q, 35R, 35S, 35V, 35W, 35Y, 36C, 36D, 36E, 36F, 36H, 36I, 36K, 36L, 36M, 36N, 36Q, 36R, 36S, 36T, 36Y, 37L, 37M, 37N, 37V, 38A, 38C, 38D, 38E, 38H, 38L, 38M, 38N, 38P, 38V, 39A, 39C, 39I, 39L, 39M, 39N, 39P, 39S, 39V, 4OA, 4OD, 4OM, 4ON, 4OP, 4OQ, 4OT, 40V, 4OW, 41A, 41C, 41E, 41G, 41N, 41S, 41V, 42A, 42L, 42M, 42P, 42V, 43A, 43G, 43H, 43L, 43M, 43Q, 43S, 43T, 43V, 44A, 44C, 44D, 44E, 44F, 44G, 44H, 44I, 44K, 44L, 44M, 44N, 44P, 44R, 44S, 44T, 44V, 44W, 44Y, 45A, 45C, 45F, 45G, 45H, 45I, 45L, 45M, 45N, 45P, 45Q, 45S, 45T, 45Y, 46A, 46C, 46D, 46E, 46F, 46H, 46I, 46L, 46M, 46N, 46Q, 46R, 46S, 46T, 46V, 46W, 46Y, 47A, 47C, 47D, 47F, 47G, 47H, 47I, 47K, 47L, 47N, 47P, 47R, 47S, 47T, 47V, 47Y, 48A, 48C, 48D, 48E, 48F, 48H, 48I, 48K, 48L, 48N, 48P, 48S, 48T, 48V, 48W, 49A, 49C, 49D, 49F, 49G, 49H, 49I, 49K, 49L, 49P, 49Q, 49R, 49S, 49T, 49V, 49W, 49Y, 5OA, 5OC, 5OE, 5OF, 5OG, 5OH, 50I, 5OK, 5OL, 5OM, 5ON, 5OP, 5OR, 5OS, 5OT, 50V, 5OW, 5OY, 5 IA, 51C, 51D, 51E, 51F, 51H, 51I, 51K, 51L, 51M, 51N, 51P, 51Q, 51R, 51S, 51T, 51V, 51W, 52A, 52C, 52E, 52F, 52G, 52H, 52I, 52K, 52L, 52M, 52N, 52P, 52Q, 52R, 52S, 52T, 52V, 52W, 52Y, 53A, 53C, 53E, 53F, 53G, 53H, 53I, 53L, 53N, 53P, 53R, 53S, 53T, 53V, 53W, 53Y, 54A, 54C, 54D, 54F, 54G, 54H, 54I, 54L, 54M, 54N, 54P, 54Q, 54R, 54T, 54V, 54W, 54Y, 55A, 55C, 55D, 55E, 55F, 55G, 55H, 55I, 55N, 55P, 55Q, 55S, 55T, 55Y, 56A, 56D, 56E, 56F, 56G, 56I, 56K, 56L, 56M, 56N, 56P, 56Q, 56R, 56T, 56V, 56W, 56Y, 57A, 57C, 57D, 57E, 57F, 57H, 57I, 57K, 57L, 57M, 57Q, 57R, 57S, 57T, 57V, 57W, 57Y, 58A, 58F, 58H, 59A, 59C, 59D, 59E, 59F, 59G, 59H, 59K, 59L, 59N, 59P, 59R, 59S, 59T, 59V, 59W, 6OA, 6OC, 6OD, 6OE, 6OG, 60I, 6OK, 6OL, 6OM, 6ON, 6OQ, 6OR, 6OT, 60V, 61C, 61D, 61E, 61F, 61M, 61S, 61T, 61V, 62A, 62C, 62D, 62F, 62G, 62H, 62I, 62K, 62L, 62Q, 62S, 62T, 62V, 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- 修飾が、L142F、L142G、L142Q、L142S、L142W、L142Y、A214I、A214V、S245Y、Q126F、Q126L、Q126P、Q126V、S131LおよびS245Iからなる群から選択された置換である、請求項20に記載の方法。
- 修飾が、W60L、W60M、W60N、I100F、I100M、S105M、S105W、G207A、T270A、T270E、T270L、T270N、T270VおよびT279Aからなる群から選択された置換である、請求項20に記載の方法。
- AmyEポリペプチドを含んでいない同等のパン生地に観察される老化の量と比較して、老化を低減するのに十分な量のAmyEポリペプチドをパン生地に添加する工程を含む、パンの老化を低減する方法。
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