JPH08103278A - 活性型ヒトａｌｔの製造方法 - Google Patents
活性型ヒトａｌｔの製造方法Info
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- JPH08103278A JPH08103278A JP6268119A JP26811994A JPH08103278A JP H08103278 A JPH08103278 A JP H08103278A JP 6268119 A JP6268119 A JP 6268119A JP 26811994 A JP26811994 A JP 26811994A JP H08103278 A JPH08103278 A JP H08103278A
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- human alt
- alt
- human
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 ヒトＡＬＴ（ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔ
ｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）のアミノ酸配列のＮ末端領域を
コードする塩基配列をアミノ酸置換が起こらないように
改変し、同時にその遺伝子の上流および下流に制限酵素
部位を付加させた改変型ヒトＡＬＴ遺伝子。 【効果】 改変型ヒトＡＬＴ遺伝子をベクターに連結し
てなる組換えプラスミドで形質転換したＥ．ｃｏｌｉを
培養することにより、活性型のヒトＡＬＴを効率的に製
造できる。
ｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）のアミノ酸配列のＮ末端領域を
コードする塩基配列をアミノ酸置換が起こらないように
改変し、同時にその遺伝子の上流および下流に制限酵素
部位を付加させた改変型ヒトＡＬＴ遺伝子。 【効果】 改変型ヒトＡＬＴ遺伝子をベクターに連結し
てなる組換えプラスミドで形質転換したＥ．ｃｏｌｉを
培養することにより、活性型のヒトＡＬＴを効率的に製
造できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトＡＬＴ（アラニン
アミノトラスフェラーゼ：ａｌａｎｉｎｅａｍｉｎｏ
ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、特に、充分に酵素活性を保
持する活性型のヒトＡＬＴの製造に関するものである。
アミノトラスフェラーゼ：ａｌａｎｉｎｅａｍｉｎｏ
ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、特に、充分に酵素活性を保
持する活性型のヒトＡＬＴの製造に関するものである。
【０００２】更に詳細には、本発明は、ヒトＡＬＴのア
ミノ酸配列のＮ末端領域をコードする塩基配列をアミノ
酸置換が起こらないように改変し、同時にその遺伝子の
上流および下流に制限酵素部位を付加させた改変型ヒト
ＡＬＴ遺伝子を有する新規なプラスミド、及びこのプラ
スミドで形質転換された大腸菌、及びこの大腸菌を用い
てヒトＡＬＴを活性型酵素として発現させる製法に関す
るものである。
ミノ酸配列のＮ末端領域をコードする塩基配列をアミノ
酸置換が起こらないように改変し、同時にその遺伝子の
上流および下流に制限酵素部位を付加させた改変型ヒト
ＡＬＴ遺伝子を有する新規なプラスミド、及びこのプラ
スミドで形質転換された大腸菌、及びこの大腸菌を用い
てヒトＡＬＴを活性型酵素として発現させる製法に関す
るものである。
【０００３】
【従来の技術】ヒトＡＬＴは、ウイルス性肝炎や肝硬変
などの肝疾患において血清中に逸脱する酵素で、臨床化
学的に重要である。その血清診断において、ＡＬＴ活性
の測定値の施設間差を少なくするなどの標準化は重要課
題の一つである。現在、そのための標準品としてブタ心
臓由来の粗精製品が使用されているが、基質特異性やＫ
ｍ値などの酵素化学的性質はヒト酵素と異なり、ヒト由
来の活性型酵素の製品化が望まれていた。
などの肝疾患において血清中に逸脱する酵素で、臨床化
学的に重要である。その血清診断において、ＡＬＴ活性
の測定値の施設間差を少なくするなどの標準化は重要課
題の一つである。現在、そのための標準品としてブタ心
臓由来の粗精製品が使用されているが、基質特異性やＫ
ｍ値などの酵素化学的性質はヒト酵素と異なり、ヒト由
来の活性型酵素の製品化が望まれていた。
【０００４】一方、近年遺伝子工学技術により、異種生
物由来蛋白を微生物に生産させることが可能になり、実
用化されてきている。例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９
８，１０５６，１９７８には、プラスミドｐＢＲ３２２
にラクトースプロモーターをつないだプラスミドを導入
した大腸菌内で動物蛋白が生産されることが記載されて
いる。ヒトＡＬＴの場合、その遺伝子がクローニングさ
れ、大腸菌での発現が試みられているが、充分に酵素活
性を保持するＡＬＴ蛋白の発現についての報告は知られ
ていない。
物由来蛋白を微生物に生産させることが可能になり、実
用化されてきている。例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９
８，１０５６，１９７８には、プラスミドｐＢＲ３２２
にラクトースプロモーターをつないだプラスミドを導入
した大腸菌内で動物蛋白が生産されることが記載されて
いる。ヒトＡＬＴの場合、その遺伝子がクローニングさ
れ、大腸菌での発現が試みられているが、充分に酵素活
性を保持するＡＬＴ蛋白の発現についての報告は知られ
ていない。
【０００５】
【本発明が解決しようとする課題】臨床検査分野におい
て、ＡＬＴ活性の測定値の施設間差を少なくするなどの
標準化は重要課題の一つである。現在、そのための標準
品としてブタ心臓由来の粗精製品が使用されているが、
基質特異性やＫｍ値などの酵素化学的性質はヒト酵素と
異なる。従ってヒト由来の活性型酵素が望まれるが、ヒ
ト組織から本酵素を大量に供給することは困難であっ
た。
て、ＡＬＴ活性の測定値の施設間差を少なくするなどの
標準化は重要課題の一つである。現在、そのための標準
品としてブタ心臓由来の粗精製品が使用されているが、
基質特異性やＫｍ値などの酵素化学的性質はヒト酵素と
異なる。従ってヒト由来の活性型酵素が望まれるが、ヒ
ト組織から本酵素を大量に供給することは困難であっ
た。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒトＡＬ
Ｔのアミノ酸配列のＮ末端領域をコードする塩基配列を
アミノ酸置換が起こらないように改変し、同時にその遺
伝子の上流および下流に制限酵素部位を付加させた改変
型ヒトＡＬＴ遺伝子、その改変型ヒトＡＬＴ遺伝子をベ
クタープラスミドに連結した組換えプラスミド、その組
換えプラスミドで形質転換された大腸菌、および形質転
換された大腸菌を用いてヒトＡＬＴを活性型酵素として
発現させる製法について検討した。まず、クローニング
されたヒトＡＬＴをコードする遺伝子を含有するプラス
ミドを鋳型としてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈ
ａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により、Ｎ末端に相当する
塩基配列をアミノ酸置換が起こらないように改変させ、
同時にその遺伝子の上流および下流に制限酵素部位を付
加させたＡＬＴ遺伝子を増幅した。次いでその改変型ヒ
トＡＬＴ遺伝子が組込まれたプラスミドを得、その組換
え体プラスミドで形質転換された大腸菌を創製した。そ
の形質転換された大腸菌を培養して、ヒトＡＬＴを活性
型酵素として現実に発現させ、本発明を完成した。
Ｔのアミノ酸配列のＮ末端領域をコードする塩基配列を
アミノ酸置換が起こらないように改変し、同時にその遺
伝子の上流および下流に制限酵素部位を付加させた改変
型ヒトＡＬＴ遺伝子、その改変型ヒトＡＬＴ遺伝子をベ
クタープラスミドに連結した組換えプラスミド、その組
換えプラスミドで形質転換された大腸菌、および形質転
換された大腸菌を用いてヒトＡＬＴを活性型酵素として
発現させる製法について検討した。まず、クローニング
されたヒトＡＬＴをコードする遺伝子を含有するプラス
ミドを鋳型としてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈ
ａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により、Ｎ末端に相当する
塩基配列をアミノ酸置換が起こらないように改変させ、
同時にその遺伝子の上流および下流に制限酵素部位を付
加させたＡＬＴ遺伝子を増幅した。次いでその改変型ヒ
トＡＬＴ遺伝子が組込まれたプラスミドを得、その組換
え体プラスミドで形質転換された大腸菌を創製した。そ
の形質転換された大腸菌を培養して、ヒトＡＬＴを活性
型酵素として現実に発現させ、本発明を完成した。
【０００７】すなわち、本発明は、ヒトＡＬＴのアミノ
酸配列のＮ末端領域をコードする塩基配列をアミノ酸置
換が起こらないように改変させ、同時にその遺伝子の上
流および下流に制限酵素部位を付加させたＡＬＴ遺伝子
をＰＣＲ法により増幅し、ベクタープラスミドに連結し
た組換えプラスミド、およびヒトＡＬＴのアミノ酸配列
のＮ末端領域をコードする塩基配列をアミノ酸置換が起
こらないように改変させ、同時にその遺伝子の上流およ
び下流に制限酵素部位を付加させたＡＬＴ遺伝子をＰＣ
Ｒにより増幅し、ベクタープラスミドに連結した組換え
プラスミドで形質転換された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ）を要旨とするものである。
酸配列のＮ末端領域をコードする塩基配列をアミノ酸置
換が起こらないように改変させ、同時にその遺伝子の上
流および下流に制限酵素部位を付加させたＡＬＴ遺伝子
をＰＣＲ法により増幅し、ベクタープラスミドに連結し
た組換えプラスミド、およびヒトＡＬＴのアミノ酸配列
のＮ末端領域をコードする塩基配列をアミノ酸置換が起
こらないように改変させ、同時にその遺伝子の上流およ
び下流に制限酵素部位を付加させたＡＬＴ遺伝子をＰＣ
Ｒにより増幅し、ベクタープラスミドに連結した組換え
プラスミドで形質転換された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ）を要旨とするものである。
【０００８】本発明のプラスミドを得るには、例えばＢ
ｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１
９−６２９，１９６３に記載の方法に従い、ヒトＡＬＴ
遺伝子とプロモーター及びベクターとしての役割を有す
るＤＮＡとをＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９６，１７１−
１８４，１９７４に記載の方法で制限酵素で消化し、次
いでリガーゼを用いて結合することにより調製できる。
ｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１
９−６２９，１９６３に記載の方法に従い、ヒトＡＬＴ
遺伝子とプロモーター及びベクターとしての役割を有す
るＤＮＡとをＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９６，１７１−
１８４，１９７４に記載の方法で制限酵素で消化し、次
いでリガーゼを用いて結合することにより調製できる。
【０００９】上記のベクターとしての役割を有するＤＮ
Ａとしては、例えば大腸菌由来のｐＢＲ３２２などのＤ
ＮＡがあげられる。プロモーターとしては例えばタック
プロモーター、トリプトファンプロモーター、ラムダ・
ピーエルプロモーター、ラムダ・ピーアールプロモータ
ー、ラクトースプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが
あげられる。また制限酵素としては、例えばＥｃｏＲ
Ｉ，ＢａｍＨＩがあげられ、リガーゼとしては、例えば
Ｔ４ＤＮＡリガーゼがあげられる。
Ａとしては、例えば大腸菌由来のｐＢＲ３２２などのＤ
ＮＡがあげられる。プロモーターとしては例えばタック
プロモーター、トリプトファンプロモーター、ラムダ・
ピーエルプロモーター、ラムダ・ピーアールプロモータ
ー、ラクトースプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが
あげられる。また制限酵素としては、例えばＥｃｏＲ
Ｉ，ＢａｍＨＩがあげられ、リガーゼとしては、例えば
Ｔ４ＤＮＡリガーゼがあげられる。
【００１０】本発明に用いられる改変型ヒトＡＬＴ遺伝
子は、クローニングされたヒト肝臓由来のＡＬＴ遺伝子
を鋳型としてＰＣＲで増幅することができる。この時Ｎ
末端領域をコードする塩基配列を改変させるために用い
るセンスプライマーは、ヒトＡＬＴ遺伝子の塩基配列に
基づき、アミノ酸置換が起こらないように一部使用コド
ンを換えて設計した塩基配列である。一方、アンチセン
スプライマーはＣ末端領域に相当する塩基配列に基づい
て設計した塩基配列である。この改変型ヒトＡＬＴ遺伝
子を発現ベクターｐＴＲＰに導入することにより、ヒト
ＡＬＴを大腸菌の微生物菌体内で生産させる組換えプラ
スミドｐＴＲＡＬ−１１２を作製することができる。本
発明の改変型ヒトＡＬＴ遺伝子を有する組換えプラスミ
ドを大腸菌に形質転換することにより、その微生物菌体
内でヒトＡＬＴを生産する形質転換体を得ることができ
る。
子は、クローニングされたヒト肝臓由来のＡＬＴ遺伝子
を鋳型としてＰＣＲで増幅することができる。この時Ｎ
末端領域をコードする塩基配列を改変させるために用い
るセンスプライマーは、ヒトＡＬＴ遺伝子の塩基配列に
基づき、アミノ酸置換が起こらないように一部使用コド
ンを換えて設計した塩基配列である。一方、アンチセン
スプライマーはＣ末端領域に相当する塩基配列に基づい
て設計した塩基配列である。この改変型ヒトＡＬＴ遺伝
子を発現ベクターｐＴＲＰに導入することにより、ヒト
ＡＬＴを大腸菌の微生物菌体内で生産させる組換えプラ
スミドｐＴＲＡＬ−１１２を作製することができる。本
発明の改変型ヒトＡＬＴ遺伝子を有する組換えプラスミ
ドを大腸菌に形質転換することにより、その微生物菌体
内でヒトＡＬＴを生産する形質転換体を得ることができ
る。
【００１１】上記クローニングされたヒト肝臓由来のＡ
ＬＴ遺伝子としては、例えばプラスミドｐＨＧＴ−３９
（図２）が挙げられる。また、上記センスプライマー及
びアンチセンスプライマーとしては、例えば次のような
配列を使用することができる。
ＬＴ遺伝子としては、例えばプラスミドｐＨＧＴ−３９
（図２）が挙げられる。また、上記センスプライマー及
びアンチセンスプライマーとしては、例えば次のような
配列を使用することができる。
【００１２】 センスプライマー： 5′-GGGAATTCATGGCATCACGTCGAGGTAATCGATCTCAAGCGGTGAGGCATGG-3′ ＥｃｏＲＩ アンチセンスプライマー 5′-GGGGATCCTCAGGAGTACTCGAGGGTGAACTTGGCATGGAAC-3′ ＢａｍＨＩ
【００１３】このようにして作製された大腸菌形質転換
体を適当な培地条件で培養することにより、ヒトＡＬ
Ｔ、特に充分に酵素活性を有する活性型のヒトＡＬＴを
大量生産することが可能である。培養後のヒトＡＬＴの
単離は、例えば菌体を超音波等の手段を用いて破砕し、
分離精製することにより行うことができる。
体を適当な培地条件で培養することにより、ヒトＡＬ
Ｔ、特に充分に酵素活性を有する活性型のヒトＡＬＴを
大量生産することが可能である。培養後のヒトＡＬＴの
単離は、例えば菌体を超音波等の手段を用いて破砕し、
分離精製することにより行うことができる。
【００１４】また、大腸菌の宿主−ベクター系のみなら
ず、枯草菌、酵母、及びチャイニーズハムスター卵母細
胞（ＣＨＯ細胞）等の宿主−ベクター系も利用可能であ
り、これらの系を用いてヒトＡＬＴの大量生産が行うこ
とができる。
ず、枯草菌、酵母、及びチャイニーズハムスター卵母細
胞（ＣＨＯ細胞）等の宿主−ベクター系も利用可能であ
り、これらの系を用いてヒトＡＬＴの大量生産が行うこ
とができる。
【００１５】
【実施例】次に本発明を実施例により具体的に説明す
る。
る。
【００１６】
【実施例１】 （ａ）改変型ヒトＡＬＴ遺伝子のＰＣＲによる増幅 クローニングされたヒト肝臓由来のＡＬＴ遺伝子を有す
るプラスミドｐＨＧＴ−３９を鋳型として、次のセンス
プライマー及びアンチセンスプライマーを用い、改変型
ヒトＡＬＴ遺伝子を増幅した。
るプラスミドｐＨＧＴ−３９を鋳型として、次のセンス
プライマー及びアンチセンスプライマーを用い、改変型
ヒトＡＬＴ遺伝子を増幅した。
【００１７】 センスプライマー 5′-GGGAATTCATGGCATCACGTCGAGGTAATCGATCTCAAGCGGTGAGGCATGG-3′ ＥｃｏＲＩ
【００１８】 アンチセンスプライマー 5′-GGGGATCCTCAGGAGTACTCGAGGGTGAACTTGGCATGGAAC-3′ ＢａｍＨＩ
【００１９】センスプライマーは、ヒトＡＬＴのアミノ
酸配列のＮ末端領域をコードする塩基配列に基づき、ア
ミノ酸置換が起こらないように一部使用コドンを換えて
設計した塩基配列である。一方、アンチセンスプライマ
ーはそのＣ末端領域をコードする塩基配列に基づいて設
計した塩基配列である。さらに両プライマーの５′末端
にはそれぞれＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩの制限酵素部位を
付加させた。上記のプライマーの下線は変換された塩基
および付加した制限酵素部位を示す。ＰＣＲにおける増
幅の反応組成は、５０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2，
０．０１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン，ｄＮＴＰを各１００μ
Ｍ、プライマー各０．５μＭ、クローニングされたヒト
ＡＬＴ遺伝子を有するプラスミド（ｐＨＧＴ−３９）４
０ｐｇ，２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（ＰＥＲＫＩＮ
ＥＬＭＥＲ ＣＥＴＵＳ社製）を含む１００μｌおよ
びこれに重層する１００μＭのミネラルオイルから成
る。
酸配列のＮ末端領域をコードする塩基配列に基づき、ア
ミノ酸置換が起こらないように一部使用コドンを換えて
設計した塩基配列である。一方、アンチセンスプライマ
ーはそのＣ末端領域をコードする塩基配列に基づいて設
計した塩基配列である。さらに両プライマーの５′末端
にはそれぞれＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩの制限酵素部位を
付加させた。上記のプライマーの下線は変換された塩基
および付加した制限酵素部位を示す。ＰＣＲにおける増
幅の反応組成は、５０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2，
０．０１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン，ｄＮＴＰを各１００μ
Ｍ、プライマー各０．５μＭ、クローニングされたヒト
ＡＬＴ遺伝子を有するプラスミド（ｐＨＧＴ−３９）４
０ｐｇ，２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（ＰＥＲＫＩＮ
ＥＬＭＥＲ ＣＥＴＵＳ社製）を含む１００μｌおよ
びこれに重層する１００μＭのミネラルオイルから成
る。
【００２０】反応条件は、デナチュレーションステップ
が９４℃１分、アニーリングステップが５５℃１分、ポ
リメラーゼ反応ステップが７２℃１分１５秒である。こ
のインキュベーションを３５サイクル行った。
が９４℃１分、アニーリングステップが５５℃１分、ポ
リメラーゼ反応ステップが７２℃１分１５秒である。こ
のインキュベーションを３５サイクル行った。
【００２１】この反応液のフェノール抽出によって夾雑
蛋白質の除去を行った後、冷エタノールによりＰＣＲ増
幅産物を含むＤＮＡ画分を沈殿させ、回収した。さらに
アガロース電気泳動により約１．５ｋｂの改変型ヒトＡ
ＬＴ遺伝子の増幅を確認した（図１）。
蛋白質の除去を行った後、冷エタノールによりＰＣＲ増
幅産物を含むＤＮＡ画分を沈殿させ、回収した。さらに
アガロース電気泳動により約１．５ｋｂの改変型ヒトＡ
ＬＴ遺伝子の増幅を確認した（図１）。
【００２２】（ｂ）ヒトＡＬＴの発現を目的とした組換
えプラスミドｐＴＲＡＬの調製 発現ベクターとしてはトリプトファンプロモーター、シ
ャインダルガノ配列（ＳＤ配列）、ＥｃｏＲＩおよびＢ
ａｍＨＩを含むマルチクローニング部位を有する約２．
９ｋｂのｐＴＲＰを用いた。このｐＴＲＰ １μｇおよ
び（ａ）の方法で増幅させた改変型ヒトＡＬＴ遺伝子断
片２μｇ各々に制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＧＩＢＣＯ ＢＲ
Ｌ社製）とＢａｍＨＩ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を加
え、１０ｍＭのＭｇＣｌ2，０．１ｍＭのＮａＣｌを含
むｐＨ７．２に調製した５０ｍＭトリス緩衝液１００μ
ｌ中で、３７℃２時間反応させた。この反応液各々をア
ガロースゲル電気泳動にかけ、Ｇｌａｇｇ Ｍａｘ TM
ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｐｉｎ Ｃａｔｒｉ
ｄｇｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）によ
り各々２．９ｋｂおよび１．５ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩ断片をアガロースゲルから抽出した。
えプラスミドｐＴＲＡＬの調製 発現ベクターとしてはトリプトファンプロモーター、シ
ャインダルガノ配列（ＳＤ配列）、ＥｃｏＲＩおよびＢ
ａｍＨＩを含むマルチクローニング部位を有する約２．
９ｋｂのｐＴＲＰを用いた。このｐＴＲＰ １μｇおよ
び（ａ）の方法で増幅させた改変型ヒトＡＬＴ遺伝子断
片２μｇ各々に制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＧＩＢＣＯ ＢＲ
Ｌ社製）とＢａｍＨＩ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を加
え、１０ｍＭのＭｇＣｌ2，０．１ｍＭのＮａＣｌを含
むｐＨ７．２に調製した５０ｍＭトリス緩衝液１００μ
ｌ中で、３７℃２時間反応させた。この反応液各々をア
ガロースゲル電気泳動にかけ、Ｇｌａｇｇ Ｍａｘ TM
ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｐｉｎ Ｃａｔｒｉ
ｄｇｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）によ
り各々２．９ｋｂおよび１．５ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩ断片をアガロースゲルから抽出した。
【００２３】次に、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩで消化した
約１．５ｋｂの改変型ヒトＡＬＴ遺伝子および約２．９
ｋｂのｐＴＲＰを各々１０ｎｇを混合し、ＤＮＡライゲ
ーションキット（宝酒造社製）により改変型ヒトＡＬＴ
遺伝子とｐＴＲＰを連結させ、組換えプラスミドｐＴＲ
ＡＬ−１１２を得た。その後、この反応液を用いてＴＳ
Ｓ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｔｏｒａｇｅ
ｓｏｌｕｔｉｏｎ）法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，２１７２−２１７５，１９
８９）に従い、大腸菌ＪＭ１０１株を形質転換させた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（ト
リプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）１０ｇ，酵母エキス（Ｄｉ
ｆｃｏ社製），ＮａＣｌ ５ｇ，粉末寒天１５ｇを１Ｌ
の蒸留水に溶解させた培地（ｐＨ７．４））に出現した
アンピシリン耐性株を培養し、ＢｉｍｂｏｉｍとＤｏｌ
ｙらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，
７，１５１３−１５２３，１９７９）によりプラスミド
ＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断後、ア
ガロースゲル電気泳動により、１．５ｋｂの改変型ヒト
ＡＬＴ遺伝子が発現ベクターｐＴＲＰに正しく挿入され
ていることを確認した。図２に組換えプラスミドｐＴＲ
ＡＬ−１１２の作製法を示す。発現ベクターｐＴＲＰの
構造を図３に示し、その全塩基配列を図４、図５に示
す。
約１．５ｋｂの改変型ヒトＡＬＴ遺伝子および約２．９
ｋｂのｐＴＲＰを各々１０ｎｇを混合し、ＤＮＡライゲ
ーションキット（宝酒造社製）により改変型ヒトＡＬＴ
遺伝子とｐＴＲＰを連結させ、組換えプラスミドｐＴＲ
ＡＬ−１１２を得た。その後、この反応液を用いてＴＳ
Ｓ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｔｏｒａｇｅ
ｓｏｌｕｔｉｏｎ）法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，２１７２−２１７５，１９
８９）に従い、大腸菌ＪＭ１０１株を形質転換させた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（ト
リプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）１０ｇ，酵母エキス（Ｄｉ
ｆｃｏ社製），ＮａＣｌ ５ｇ，粉末寒天１５ｇを１Ｌ
の蒸留水に溶解させた培地（ｐＨ７．４））に出現した
アンピシリン耐性株を培養し、ＢｉｍｂｏｉｍとＤｏｌ
ｙらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，
７，１５１３−１５２３，１９７９）によりプラスミド
ＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断後、ア
ガロースゲル電気泳動により、１．５ｋｂの改変型ヒト
ＡＬＴ遺伝子が発現ベクターｐＴＲＰに正しく挿入され
ていることを確認した。図２に組換えプラスミドｐＴＲ
ＡＬ−１１２の作製法を示す。発現ベクターｐＴＲＰの
構造を図３に示し、その全塩基配列を図４、図５に示
す。
【００２４】（ｃ）大腸菌における組換え活性型ヒトＡ
ＬＴの発現 （ｂ）に示した方法で調製された組換えプラスミドｐＴ
ＲＡＬ−１１２をＴＳＳ法に従って、大腸菌ＪＭ１０１
株に導入し、得られた大腸菌組換え体ＪＭ１０１（ｐＴ
ＲＡＬ−１１２）が発現するヒトＡＬＴの分析を以下の
ように行った。得られた組換え体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０１／ｐＴＲＡＬ−１１２と
命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ
ＢＰ−４８１８として国際寄託した。
ＬＴの発現 （ｂ）に示した方法で調製された組換えプラスミドｐＴ
ＲＡＬ−１１２をＴＳＳ法に従って、大腸菌ＪＭ１０１
株に導入し、得られた大腸菌組換え体ＪＭ１０１（ｐＴ
ＲＡＬ−１１２）が発現するヒトＡＬＴの分析を以下の
ように行った。得られた組換え体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０１／ｐＴＲＡＬ−１１２と
命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ
ＢＰ−４８１８として国際寄託した。
【００２５】大腸菌組換え体ＪＭ１０１（ｐＴＲＡＬ−
１１２）（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８１８）を２００ｍｌの
ＬＢ液体培地に植菌し、３０℃で１８時間後、対数増殖
期後期に達したところで１４ＬのＬＢ液体培地に移し
た。同様に３０℃で１８時間後、対数増殖期後期に達し
たところで遠心操作（１０，０００×ｇ，１０分）によ
り集菌した。得られた湿菌体をその重量の３倍量のリン
酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ６．５）に懸濁し、超音波処
理により菌体を破砕した後、遠心操作（１０，０００×
ｇ，１０分）により無細胞抽出液を調製した。
１１２）（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８１８）を２００ｍｌの
ＬＢ液体培地に植菌し、３０℃で１８時間後、対数増殖
期後期に達したところで１４ＬのＬＢ液体培地に移し
た。同様に３０℃で１８時間後、対数増殖期後期に達し
たところで遠心操作（１０，０００×ｇ，１０分）によ
り集菌した。得られた湿菌体をその重量の３倍量のリン
酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ６．５）に懸濁し、超音波処
理により菌体を破砕した後、遠心操作（１０，０００×
ｇ，１０分）により無細胞抽出液を調製した。
【００２６】この無細胞抽出液のＡＬＴ活性を測定した
ところ、０．１７４Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎの活性を
示した。一方、大腸菌宿主ＪＭ１０１株におけるＡＬＴ
活性は検出できず、組換え体ＪＭ１０１（ｐＴＲＡＬ−
１１２）で検出された活性が組換えヒトＡＬＴ由来のも
のであることが確認できた。また、この無細胞抽出液１
０μｌにその２倍量のサンプル処理液（５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８），６％ＳＤＳ，２０％グリ
セロール，２００ｍＭジチオスレイトール，３ｍＭフェ
ニルメタンスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ））を加
え、６０℃で３０分間加熱処理し、Ｌａｅｍｍｌｉらの
方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５，１９７
０）に従って、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動にかけた。泳動後、ゲルをクマシーブリリアントブル
ーＲ−２５０で染色した。その結果、分子量約５５ｋの
ヒトＡＬＴのバンドが検出され、さらにこの蛋白バンド
は抗ヒトＡＬＴ抗体と特異的な交差反応を示した。従っ
て、この大腸菌組換え体ＪＭ１０１（ｐＴＲＡＬ−１１
２）は、効率よく組換えヒトＡＬＴを活性型酵素として
発現していることが確認された。
ところ、０．１７４Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎの活性を
示した。一方、大腸菌宿主ＪＭ１０１株におけるＡＬＴ
活性は検出できず、組換え体ＪＭ１０１（ｐＴＲＡＬ−
１１２）で検出された活性が組換えヒトＡＬＴ由来のも
のであることが確認できた。また、この無細胞抽出液１
０μｌにその２倍量のサンプル処理液（５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８），６％ＳＤＳ，２０％グリ
セロール，２００ｍＭジチオスレイトール，３ｍＭフェ
ニルメタンスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ））を加
え、６０℃で３０分間加熱処理し、Ｌａｅｍｍｌｉらの
方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５，１９７
０）に従って、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動にかけた。泳動後、ゲルをクマシーブリリアントブル
ーＲ−２５０で染色した。その結果、分子量約５５ｋの
ヒトＡＬＴのバンドが検出され、さらにこの蛋白バンド
は抗ヒトＡＬＴ抗体と特異的な交差反応を示した。従っ
て、この大腸菌組換え体ＪＭ１０１（ｐＴＲＡＬ−１１
２）は、効率よく組換えヒトＡＬＴを活性型酵素として
発現していることが確認された。
【００２７】
【発明の効果】本発明の組換えプラスミドは、ヒトＡＬ
Ｔのアミノ酸配列のＮ末端領域をコードする塩基配列を
ＰＣＲによって改変し、その改変型遺伝子をトリプトフ
ァンプロモーターの制御下におくことによって、効率よ
く組換えヒトＡＬＴを大腸菌体内に活性型酵素として発
現することができる。またこの得られた組換えヒトＡＬ
Ｔは天然に存在するヒト肝臓由来のＡＬＴと同一であ
り、これを精製後、血清診断において肝疾患時に血清中
の逸脱してくるＡＬＴ量を正確に定量するための標準品
として利用することができる。
Ｔのアミノ酸配列のＮ末端領域をコードする塩基配列を
ＰＣＲによって改変し、その改変型遺伝子をトリプトフ
ァンプロモーターの制御下におくことによって、効率よ
く組換えヒトＡＬＴを大腸菌体内に活性型酵素として発
現することができる。またこの得られた組換えヒトＡＬ
Ｔは天然に存在するヒト肝臓由来のＡＬＴと同一であ
り、これを精製後、血清診断において肝疾患時に血清中
の逸脱してくるＡＬＴ量を正確に定量するための標準品
として利用することができる。
【図１】ＰＣＲにより増幅された改変型ヒトＡＬＴ遺伝
子産物のアガロースゲル電気泳動図である。実施例１に
示したセンスプライマーおよびアンチセンスプライマ
ー、また鋳型として、クローニングされたヒト肝臓由来
のＡＬＴ遺伝子を有するプラスミドｐＨＧＴ−３９を用
いてＰＣＲを行った。レーン１は１ｋｂ ＤＮＡラダー
（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、レーン２はＰＣＲ増幅産
物である。
子産物のアガロースゲル電気泳動図である。実施例１に
示したセンスプライマーおよびアンチセンスプライマ
ー、また鋳型として、クローニングされたヒト肝臓由来
のＡＬＴ遺伝子を有するプラスミドｐＨＧＴ−３９を用
いてＰＣＲを行った。レーン１は１ｋｂ ＤＮＡラダー
（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、レーン２はＰＣＲ増幅産
物である。
【図２】ＰＣＲにより改変されたヒトＡＬＴ遺伝子を有
する大腸菌の組換えプラスミドｐＴＲＡＬ−１１２の構
築方法を示す図である。
する大腸菌の組換えプラスミドｐＴＲＡＬ−１１２の構
築方法を示す図である。
【図３】発現ベクターｐＴＲＰを示す。
【図４】発現ベクターｐＴＲＰの全塩基配列を示す。
【図５】同上続きを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/573 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 船津 雅彦 熊本市清水町大窪668 財団法人 化学及 血清療法研究所内 (72)発明者 江藤 晶 熊本市清水町大窪668 財団法人 化学及 血清療法研究所内
Claims (6)
- 【請求項１】 ヒトＡＬＴ（アラニン アミノトランス
フェラーゼ）のアミノ酸配列のＮ末端領域をコードする
塩基配列をアミノ酸置換が起こらないように改変し、同
時にその遺伝子の上流及び下流に制限酵素部位を付加さ
せた改変型ヒトＡＬＴ遺伝子。 - 【請求項２】 ヒトＡＬＴ遺伝子を有するプラスミドを
鋳型として、センスプライマー ５′−ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡＴＣＡ ＣＧＴＣＧＡＧＧＴＡＡＴＣＧＡＴＣＴＣＡＡ ＧＣＧＧＴＧＡＧＧＣＡＴＧＧ−３′ 及びアンチセンスプライマー ５′−ＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＧＡＧＴＡＣＴ ＣＧＡＧＧＧＴＧＡＡＣＴＴＧＧＣＡＴＧＧ ＡＡＣ−３′ を用い、ＰＣＲ（ポリメラーゼ チェイン リアクショ
ン）を行って得られた改変型ヒトＡＬＴ遺伝子。 - 【請求項３】 請求項１又は請求項２に記載の改変型ヒ
トＡＬＴ遺伝子をベクタープラスミドに連結してなる組
換えプラスミド。 - 【請求項４】 組換えプラスミドが改変型ヒトＡＬＴ遺
伝子を含有する塩基配列を含有してなる組換えプラスミ
ドｐＴＲＡＬ−１１２であることを特徴とする請求項３
に記載の組換えプラスミド。 - 【請求項５】 請求項３又は請求項４に記載の組換えプ
ラスミドで形質転換された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）。 - 【請求項６】 請求項５に記載の形質転換体を培養し、
該形質転換体の菌体及び／又は培養液から分離、精製す
ることを特徴とする活性型ヒトＡＬＴの製造方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26811994A JP3315827B2 (ja) | 1994-10-07 | 1994-10-07 | 活性型ヒトａｌｔの製造方法 |
| US08/941,647 US5952211A (en) | 1994-10-07 | 1997-09-30 | Method for producing active human alanine aminotransferase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26811994A JP3315827B2 (ja) | 1994-10-07 | 1994-10-07 | 活性型ヒトａｌｔの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08103278A true JPH08103278A (ja) | 1996-04-23 |
| JP3315827B2 JP3315827B2 (ja) | 2002-08-19 |
Family
ID=17454160
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26811994A Expired - Fee Related JP3315827B2 (ja) | 1994-10-07 | 1994-10-07 | 活性型ヒトａｌｔの製造方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5952211A (ja) |
| JP (1) | JP3315827B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6316238B1 (en) | 1997-01-09 | 2001-11-13 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Process for producing activated human ALT |
| US6352847B1 (en) | 1998-06-09 | 2002-03-05 | Japan As Represented By Director General Of Agency Of Industrial Science And Technology | Ammonia elimination liquid reagent |
| JP2012095674A (ja) * | 2012-02-20 | 2012-05-24 | National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology | 動物細胞用新規発現ベクター |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002055712A2 (en) * | 2001-01-16 | 2002-07-18 | Bayer Ag | Regulation of human alanine aminotransferase |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5240831A (en) * | 1991-01-10 | 1993-08-31 | Board Of Regents, The University Of Texas | Methods and compositions for the expression of biologically active eukaryotic cytochrome p45os in bacteria |
| US5420027A (en) * | 1991-01-10 | 1995-05-30 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for the expression of biologically active fusion proteins comprising a eukaryotic cytochrome P450 fused to a reductase in bacteria |
| JPH0568548A (ja) * | 1991-08-06 | 1993-03-23 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | ヒトａｌｔをコードする遺伝子断片 |
-
1994
- 1994-10-07 JP JP26811994A patent/JP3315827B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-09-30 US US08/941,647 patent/US5952211A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6316238B1 (en) | 1997-01-09 | 2001-11-13 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Process for producing activated human ALT |
| US6352847B1 (en) | 1998-06-09 | 2002-03-05 | Japan As Represented By Director General Of Agency Of Industrial Science And Technology | Ammonia elimination liquid reagent |
| JP2012095674A (ja) * | 2012-02-20 | 2012-05-24 | National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology | 動物細胞用新規発現ベクター |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5952211A (en) | 1999-09-14 |
| JP3315827B2 (ja) | 2002-08-19 |
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