JPS62501538A - ａｒａＢプロモーターを含有する複製可能な発現ビヒクル - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

１２、第６項に記載のビヒクルで形質転換された細菌。 １３、生活活性を有するヘテロローガスペプチドを発現する様に形質転換された 細菌内で該ペプチドを生産する方法であって。 ａ）生物活性を有するペプチドをコードしているヘテロローガス遺伝子に機能的 に結合しているａｒａＢプロモーターを含有しているポリヌクレオチド分子を複 製可能な発現ビヒクルに挿入し、 ｂ）該ポリヌクレオチド分子を含有している発現ビヒクルで、該ペプチドを発現 し得る細菌を形質転換し、Ｃ）形質転換された細菌を培養条件下で培養し、ｄ） 該培養から該ペプチドを回収することからなる方法。 １４、ある種の細菌にとってヘテロローガスな遺伝子に機能的に結合しているａ ｒａＢプロモーターを含有しており、生物活性を有するヘテロローガスペプチド をコードしているポリヌクレオチド分子で形質転換した該細菌を培養することに より該ヘテロローガスペプチドを生産する方法であって、 ａ）該細菌にとってヘテロローガスな遺伝子に機能的に結合しているａｒａＢプ ロモーターを含有しており、生物活性を有するペプチドをコードしているポリヌ ク１／オチド分子で形質転換した細菌を培養培地中、選択的増殖条件下、指数的 成長期に達するまでインキュベートし、 ｂ）工程ａ）の培養を新たな培養培地に移し、十分な時間該培養をインキュベー トシて更に増殖させ、Ｃ）工程ｂ）の培養を生産培地に接種し、最大細菌増殖を 達成するための発酵条件下、選択された細胞密度を達成するに十分な時間該培養 をインキュベートシｄ）有意な量の該ヘテロローガスペプチドを該培地中で生産 させるのに有効ｆａ　ｍのし一アラビノースを添加し、そして ｅ）該ヘテロローガスペプチドを回収することからなる方法。 １５、セクロピンをコードしている第２遺伝子配列と機能的に結合している、本 来セクロピン感受性である細菌に対する生成する融合タンパク質の殺菌作用を抑 制し得るポリペプチドをコードしている第１遺伝子配列を含有している遺伝子構 築物。 １６、誘導プロモーターと機能的に結合しているセクロピンをコードしている遺 伝子配列を含有している遺伝子構築物。 １７、機能的に結合している誘導プロモーターを更に含有している第１５項に記 載の遺伝子構築物。 】８．セクロピンをコードしている遺伝子配列が合成配列である第１５項、第１ ６項または第１７項のいずれかに記載の遺伝子構築物。 １９、ポリペプチドが先導ポリペプチドである第１５項に記載の遺伝子構築物。 ２０、ポリペプチドをコードしている遺伝子配列が約３００〜５，０００　塩基 対からなる第１５項に記載の遺伝子構築物。 ２１、セクロピンがセクロピンＡ％ＢまたはＣである第１５項、第１６項または 第１７項のいずれかに記載の遺伝子構築物。 ２２、ポリペプチドをコードしている遺伝子配列がａｒａＢ遺伝子をコードして いる第１５項に記載の遺伝子構築物。 ２３、第１５項または第１６項のいずれかに記載の遺伝子構築物を含んでいる、 宿主内で複製可能なビヒクル。 ２４、細菌内で発現し得る第２３項に記載のビヒクル。 ２５、セクロビンがＡ、ＢまたはＤである第２３項に記載のビヒクル。 ２６、第１５項、第１６項または第１７項のいずれかに記載の遺伝子構築物で形 質転換された宿主。 ２７、セクロピン感受性細菌である第２６項記載の宿主。 ２８、セクロビンがＡ、ＢまたはＤである第２６項に記載の宿主。 ２９、宿主内で発現し得るビヒクルで形質転換されたセクロピン感受性宿主であ って、該ビヒクルが、生成する発現融合生産物中、該宿主に対するセクロピンの 遺伝子配列を含有していることを特徴とする宿主。 △ ３０、セフＣ１ｔ：”ンをコードしている第１セグメントおよびポリペプチドを コードしている第２セグメントを含有している融合タンパク質であって、該融合 タンパク質が該セクロピンの殺菌性を実質的に欠如する様に含有している融合タ ンパク質。 ３１、セクロビンがＡ、ＢまたはＤである第３０項に記載の融合タンパク質。 ３２、両セグメントの間に選択的開裂部位を持っている第３０項に記載の融合タ ンパク質。 ３３、生物学的方法でセクロビンを生産する方法であって、セクロピンをコード している第１．遺伝子配列を。 異なったポリペプチドをコードしている第２遺伝子配列と機能的に結合させて融 合遺伝子を形成し、該融合遺伝子をセクロピン感受性宿主に形質転換し。 該形質転換宿主を培養して該宿主に対して毒性を持たないタンパク質複合体、を 生産せしめ、次いで該タンパク質複合体からセクロビンを回収することからなる 方法。 ３４、タンパク質複合体を、セクロピンと異なったポリペプチドに開裂させる工 程を更に含んでなる第１８項に記載の方法。 明　細　書 ａｒａ　Ｂプロモーター、および微生物学的方法によるセクロピン類を含むポリ ペプチド類の製造法 関連出願 この出願は、１９８５年１月２８日に出願された米国特許第６９５，３０９号の 一部継続出願である。 技術分野 本発′明は、組換えＤＮＡ工学および、形質転換された宿主における異種遺伝子 の発現にａｒａ　Ｂプロモーターを使用することに関する。さらに、この特許は 、殺菌性ペプチドであるセクロピンおよびその類縁物質をコードしている遺伝子 の修飾、クローニング、および発現に関するものである。 技術的背景 ＤＮＡ分子にコードされている遺伝情報は、ＤＮＡのｍ　−ＲＮ　Ａへの転写お よびそれに続（ｍ−ＲＮＡのポリペプチドまたは蛋白質への翻訳を含む一連の過 程で発現される。ポリペプチドを形成するための、コード化された情報の発現は 、ＲＮＡポリメラーゼが結合し、転写を開始させるＤＮＡ上の領域、即しプロモ ータ部位で開始される。異種遺伝子の発現のための組換えＤＮＡ法に使用される プロモー・−ターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）やラクトース（β −ガラクトシダーゼ）のプロモータ・−系〔チャック（Ｃｈａｎｇ）ら、ネイチ ャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２７５：６１５（１９７８）；イタクラ（Ｉｔａｋｕｒ ａ　）ら、サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ　）、１９８：１０５６（１９７７）ｉ ゴーデル（Ｇｏｃｄｄｅｌ　）ら、Ｎａｔｕｒｅ　１２８１　：５４４（１９７ ９））および、トリプトファン（ｔｒｐ）　プ０　モ９−系（Ｇｏｅｄｄｅｌ　 ら、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、８：４０５７（１９８０）：　Ｅ　Ｐ Ｏ特許出願公開第００３６７７６　号〕が含まれる。他の知られたプロモーター には、バクテリオファージスプロモーター、（ＰＬ）および（ＰＲ）、ｈｕｔ　 、　コリシンＥ１、ガラクトース、アルカリフォスファターゼ、キシロースＡお よび、アラビノースオペロン中に位置している。エシエリヒノースオベロン（ａ ｒａ　ＢＡＤ　）は、研究されている。Ｓ。 チフィムリウム中のし一アラビノースオペロンは、特に興味深い。その配列は、 以下に開示されている：ホルウイ７　（Ｉ（ｏｒｗｉｔｚ　、　Ａ、　）らの１ Ｓ、チフイムリウムＬＴ２中のａｒａ　ＢＡＤ　−ａｒａ　Ｃコントロール領域 のＤＮＡ配列１、ジーン（Ｇｅｎｅ　）、１４：３０９−３１９（１９８１）お よび、リン（Ｌｉｎ、　Ｈ，−Ｃ，）らによルｌＳ、チフィムリウムＬＴ２のａ ｒａＢＡＤオペロン、１．ａｒａＢノヌクレオチド配列および、その生成物リブ ロキナーゼの一次構造”　Ｇｅｎｅ　、　３４　：　１１１−１２２　（１９８ ５）　；Ｉｌ、’　ａｒａＡのヌクレオチド配列および、その生成物Ｌ−アラビ ノースイソメラーゼの一次構造”　Ｇｅｎｅ、　３４８１２３−１２８（１９８ ５）　１ＩＩ１．　’　ａｒａＤとソノ側面領域ノヌクレオチド配列および、そ の生成物■、−リブロース−５−フォスフエイト−４−エピメラーゼの一次構造 ”　Ｇｅｎｅ　。 ３４　：　１２９−１３４（１９８５）などの一連の文献に開示されている。ａ ｒａＢＡＤオペロンは、Ｌ−アラビノースの初期代謝に関与している３つの構造 遺伝子を含んでいる〔リー、ヤーーハウ（Ｌｅｅ、　Ｊａｒ　−Ｈｏｗ　）らの １Ｓ。 チフイムリウムｌ、Ｔ２ａｒａ突然変異の遺伝子的特徴付け１、ジャーナル・オ ブ・バクテリオロジ−（Ｊ、　ｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）、１５８：３ ４４−４６（１９８４））。Ｌ　−７ラヒノースは、ａｒａ　Ａ遺伝子産物であ る■、−アラビノースイソメラーゼにより、まず、Ｌ−リブロースに変換される 。それから、Ｌ−リブロースは、ａｒａＢ遺伝子産物であるリブロキナーゼによ りＬ−リブロース−産物であるし一リブロースー５−フォスフエイト−４−エピ メラーゼは、Ｌ−リブロース−５−フォスフエイトのＤ−キシロース−５−ホス フェイトへの変換を触媒し５、次いでこの後者がベントースリン酸化系路に物に よって調和をもってコントロールされる。 本明細書および請求の範囲に記載した１つの態様では、ａｒａ　Ｂプロモーター を、セクロビンをコードしている遺伝子と機能的に連結し、セクロピンタンパク 質の発現のため適当な宿主に挿入しているので、セクロピンについての背景技術 文献を概観することは価値あることである。 セクロピア蛾と数種の鱗翅類のこん虫の免疫機構は、主として、最近抗菌ペプチ ド類として見出されたセクロビン類が関与している有効な体液性応答によって特 徴付けられる〔ボーマン、Ｈ，Ｇ、　（Ｂｏｍａｎ、　Ｈ，Ｇ、）とステイナー 、Ｈ（５ｔｅｉｎｅｒ、Ｈ，）　（７）カレ７）　・トヒ７り７．　・イン・ミ クロバイオロジー・アンド・イムノロジ＝（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　Ｉ ｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　）、９４／９ ５　ニア５−９１　（１９８１））。３つの主要なセクロピン、ＡＳＢおよびＤ が免疫性血液とリンパがら精製されており、それらの配列が明らかにされたしス テイナー（５ｔｅｉｎｅｒ　）らのネイチャー（Ｎａｃｕｒｅ　）、２９２：２ ４６−２４８（１９８１）ｉキュー（Ｑｕ）らのヨーロピアン・ジャーナル・オ ブ・バイオケミストリー（ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ）、１２７：２１９−２２４（１９８２）；フルトマルク、Ｄ　 （Ｈｕｌｔｍａｒｋ　、　Ｄ　）　（７）イビッド（ｉｂｉｄ）１２７：２０７ −２１７（１９８２）；およびフルトマルクの米国特許第４，３５５，１０４号 〕。これらすべてのセクロピンは、互いに高度の配列ホモロギー（相同性）をも った小さな塩基性ペプチドである。アンセレア・ベルニおよびＤのアミノ酸配列 は以下の通りである：Ａ、ｐ、セクｏピアＢ　Ｈ２Ｎ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ −１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ　−Ｈ，ｃ　、　セ’ｌ　ＯビアＢ　Ｈ２Ｎ −Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−１１ｃ−Ｇｌ　 ｕ　−Ｌｙ　ｓ　−Ｍｅ　ｔ　−Ｇｌ　ｙ　−Ａｒｇ　−Ｈ，Ｃ，セクロビ７Ａ 　８２Ｎ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−１１ｅ −Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｈ，ｃ、セフ０ビアＤ　Ｈ２Ｎ− Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ　−Ｇｌ　ｕ　−Ｌ ｙ　ｓ　−Ｖａ　１−Ｇｌｙ−Ｇｔ　ｎ　−Ａ、ｐ、セクロピ７Ｄ　Ｈ２Ｎ−Ｔ ｒｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｃ；１　ｕ、−Ａｒ ｇ　−Ａｌ　ａ−Ｇｌ　ｙ　−Ｃ１ｎ　−Ａ、ｐ、−１ｚりｏビアＢ　Ａｓｎ− １ｉｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｕｙ−１１ｅＡｓｎ−１１ｅ−Ａｒ、Ｃ，セクロピ ７ＲＡｓｎ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｕｙ−１１ｅ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ａｒ 　ａ−Ｇｌ　ｙ−Ｐｒｏ　−Ａｌ　ａ−Ｉ　ｌ　ｅ　−Ａｌ　ａ　−Ｈ，、Ｃ， セクロピ７Ａ　Ａｓｎ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ａｓｎ−１ １ｅ−Ａｒ　ａ−Ｇｌ　ｙ−Ｐｒｏ　−Ａｌ　ａ−Ｖａｌ　−Ａｌ　ａ−Ｈ，Ｃ ，セクロピ７Ｄ　Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａ１．ａ−Ｖａｌ−１１ｅ −５ｅｒ−Ａｌ　ａ　−Ｇｌ　ｙ−Ｐｒ　ｏ−Ａｌ　ａ　−Ｖａ　１−Ａｌ　ｇ −Ａ　、ｐ　、セクロビ７Ｄ　Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−１１ ｅ−１１ｅ−５ｅｒ−Ａｌ　ａ−Ｇｌ　ｙ−Ｐｒｏ−Ａｌ　ａ　−Ｖａ　Ｉ　− Ａｌ　ａ　−ＨｏＣ，セクロピンＢ　Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ −Ｌｙｓ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｌｅｕ−９ｅｒ−ＣＯ−Ｒ Ｈ，Ｃ，セクロビンＡ　Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｆｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇ ｉｎ−１１ｅ−Ａｌ　ａ　−Ｌｙ　ｓ−ω−Ｋ Ｈ，ｃ、　セ’）ＯビアＤ　Ｔｈｒ−Ｖａｔ−Ａｌａ−Ｇｉｎ−Ａｌａ−丁’ｈ ｒ　−Ａｌ　ａ−Ｌｅｕ　−Ａｌ　ａ　−Ｌｙ　ｓ　−Ｃｏ−Ｒ Ｈ，Ｃ，セクロビ７Ｄ　Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａ ｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌ　ａ　−Ｌｙ　ｓ　−ＣＯ−Ｒ セクロビンは、その構造が蜂毒液であるメリチンに似ているが、メリチンよりも 広い抗菌スペクトラムを有していて、培養肝細胞、羊の赤血球、または、こん虫 細胞を溶解しない。上に示したように、全てのヤクロピンのカルボキシ末端は封 鎖されていて、ヤクロピンＡの場合は、封鎖している基は、１級アミド基である 〔アンドリュー（Ａｎｄｒｅｕ　）らのプロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショ ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシイズ、Ｕ　Ｓ　Ａ　（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ ｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ ｓ、　Ｕ　Ｓ　Ａ　）、８０８６４７５−６４７９（１９８３））。 ヤクロビンＡとその数種の関連ペプチドは、近年、固相法によって合成されてい て、それらは、化学的および物理的判定規準では、天然のヤクロビンＡとまった く識別できない（Ａｎｄｒｅｕ　ら、同上）。 興味あることに、カルボキシ末端のテトラペプチドイミドは、Ｅ、コリに対して の抗菌活性にとってさほど重要性をもっていないが、試験した他の３つの細菌で は、抗菌活性はセクロビンＡの抗菌活性より３％から２０％低下した。 セクロピンは、グラム陰性菌およびダラム陽性菌などを含む様々な細菌に対して 抗菌性を有している。セクロピンの作用機序に関して得られた資料により、セク ロピンは、細菌の細胞貫膜を破壊することが判明した〔スタイナー（５ｔｅｉｎ ｅｒ　）らのＮａｔｕｒｅ、　２９２　：２４６−２４８（１９８１））。その 文献より、細菌種が異なればセクロビンに対する感受性も異なり、各々のセクロ ピンが固有の活性スペクトラムを有することは明白である。 たとえば、バシルスーメガテリウム（Ｂａｃｉｌ　ｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕ ｍ）は、セクロピンＡとＢに対して高感受性であるが、セクロピンＤに対しては 比較的耐性である。グラム陰性菌もダラム陽性菌もセクロピンに対して、μモル 濃度の範囲で感受性を示すことがわかった。セクロピンに対する感受性の高い細 菌は、Ｅ、コリ、シュードモナス骨アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａ ｒｅｒｕｇｉｎｏｓａ　）、Ｓ、７　Ｊｌ／　セフ。 は全部て１２個のアミノ酸置換を示すが、９種の異なる細菌種に対する活性は非 常に似ている。このことは、多くのアミノ酸を、ペプチドの生物活性を変えるこ となく置換し得ることを示している。同様に、中国のすとは、４つの部位で異っ ている。しかし、その内の３つの置換は、Ｈ，ｃｅｃｒｏｐｉａ　Ａ形に存在す る対応アミノ酸の置換である。４番目の置換は、Ｈ，ｃｅｃｒｏｐｉａ　ＡとＢ が異なっている部位でのものであり、保存的置換である。 よって、保存的アミノ酸置換によってつくられたセクロピンの特異な誘導体が、 その生物活性を持ち続けることは明らかである。セクロビンＤでみられるような 非保存的置換は、ペプチドの活性を変えてしまう可能性がある。セクロビンＤは 、セクロピンＡおよびＢとほとんど同程度のＥ、コリに対する活性をもっている が、他の８種の細菌種に対しては、明らかに活性が低くなっている。 セクロビンやその類縁体の高い有用性および、組換えＤＮＡ法によってタンパク 質を生産できるという大きな屁望から、遺伝子組換え法によ、るセクロピンの生 産系を提供することは価値あることであると考えられる。 発明の開示 いるヘテロローガス（異種）遺伝子と機能的に結合さに於けるプロモーターとし て使用し得ることがわかった。ヘテロローガス遺伝子の発現をコントロールする Ｌ−アラビノースで誘導し得る。例えば、生産されるポリペプチド類は培養培地 に［、−アラビノースを添加するまでは合成されない。即ち、Ｌ−アラビノース の非存在下では、ポリペプチドを生成するヘテロローガス遺伝子の発現はない。 Ｌ−アラビノースで誘導されることにより、λｒａ　Ｂプロモーターで開始され るメツセンジャーＲＮＡの一部としてポリペプチドが転写される。いったん誘導 されれば、ポリペプチドは迅速に、かつ効率的に生産される。さらに、発酵期間 は他の系と比較して短い。重要なことは発現の程度が増大すること、即ち、ヘテ ロローガスポリペプチドの生産が非常に改良されることであり、従って産業上利 用することを望ましいものにしている。最後に、発現された融合ポリペプチドは 、宿主細胞内で細胞封入体を形成し、これは、サイズが増大しているにもかかわ らず非常に安定であり、ヘテロローガスタンパク質の精製が容易である。 従って本発明は、宿主内で発現し得るポリヌクレオチド分子であって、該宿主に とってヘテロローガスな遺伝子と機能的に結合しているａｒａ　Ｂプロモーター の配列を含有しているポリヌクレオチド分子を提供するものである。ポリヌクレ オチド（類）をコードしているヘテロローガス遺伝子は、生物学的に活性である （生物活性を有する）。本発明はまた、該ポリヌクレオチド分子を含有１７てい る、複製および発現可能なビヒクル、該ビヒクルで形質転換された宿主、および 、最終的な発現およびヘテロローガスなペプチド（類）を回収するために該宿主 を培養するための発酵法を提供するものである。 本発明はまた、組換えＤＮＡ法によりセクロビンペプチドおよびその類似体を生 産するための方法、およびその方法に使用する手段を提供するものである。セク ロピン（類）は上記ａｒａ　Ｂプロモーターまたはその他のプロモーターを使っ て発現させることができる。 特に本発明は、セクロビン様殺菌作用を有するペプチドをコードしている遺伝子 配列を提供するものである。単独で、あるいは他のペプチドまたはアミノ酸残基 と一緒にセクロビンペプチドを含有

【７ているもつと長い配列の一部として提供 されるこれらの遺伝子配列は、それらを発現宿主としてのＥ、　ｃｏｌｉ　（大 腸菌）に最も受け入れられ易くする様にコンピュータを使った方法で設計するの が理想的である。 具体的には、本発明は、異なったポリペプチドをコードしている第２遺伝子配列 と機能的に結合しているセクロビンをコードしている第１遺伝子配列の融合配列 である遺伝子構築物であって、セクロピン感受性宿主内で発現し得る遺伝子構築 物を提供するものである（ここで、異なったポリペプチドとは、セクロビン感受 性宿主に対する該発現された融合産物の殺菌作用を抑制し得るものである）。 本発明のもう１つの目的は、誘導し得るプロモーター配列に機能的に結合してい るセクロビンをコードしている遺伝子配列を含有している、セクロピン感受性宿 主内で発現し得る遺伝子構築物を提供するものである。 本発明はまた、上記遺伝子構築物を含有している複製および発現可能なビヒクル 、該ビヒクルで形質転換された宿主、および該ビヒクル、構築物ならびに宿主を 使ってセクロピンを生産する方法を提供するものである。 更に本発明は、セクロビンとポリペプチドとの融合タンパク質であって、細菌宿 主に対する殺菌作用が減少したタンパク質を提供するものである。 セクロピンをコードしている遺伝子配列は、発現宿主としての大腸菌に最も受け 入れられやすくする様に、好ましくはコンピュータを使った方法で設計する。ま た、自己相補性を最小にし、挿入を容易にするために配列の内部または外側に制 限エンドヌクレアーゼ部位を避ける様にあるいは設ける様に、そして所望の発現 ビヒクルとの相補性を最小にする様に設計する。ポリヌクレオチド配列をこの様 な最適１４【状態にするこトニより、本発明は、大抵の場合、セクロビン源とし て用いられる各種の天然の遺伝子とは構造的に異なっている合成配列を提供する 。 第１図は大腸菌内での発現に使用する合成遺伝子およびセクロビンＡのヌクレオ チド配列およびアミノ酸配列を示す。 第２図はプラスミドｐ　Ｍ　Ｉ４５およびＭ１３ｍｐ９　がら（Ｄプラスミドル 　Ｉ　Ｎ　Ｇ　ｌの組立てを示している。ＰＩＮＣＩはａｒａ１３およびａｒａ 　Ｃ遺伝子の両名を持っている。この図はまた、プラスミドｐ　Ｉ　Ｎ　Ｇ　ｌ からのプラスミドｐＣＡｉＡ、ｐｃＡＩＢおよび１）ＣＡｌ’　の組立てをも示 （７ている。 第３図はｐ　Ｍ　Ｈ５およびｐｃＡｌ、Ａ、ｐｃＡＩＢ並びにｐｃＡｌ’　から のプラス・ミドｐＣＡ３’％ＰＣＡ３Ａ、ＰＣＡ３ＢおよびＰＣＡ２′　並びに １ＦｃＡ２Ａの組立てを示している。ｐｃＡｌ（またはｐｃＡＩＡおよびＩＢ） 、ＰＣＡ２′（またはｐＣＡ２Ａ）およびｐ　ＣＡ’３’　（またはｐＣＡ３Ａ およびｐＣＡ３Ｂ）間の違いは、セクロビンＡ遺伝子と、ａｒａ遺伝子間のＲａ ｍ　ＨＩ部位との間の種々の長さにあり、ｐｃＡｌ’（またはｐｃＡＩＡおよび ＩＢ）では５００ｂｐ、ＰＣＡ２’（またはＰＣＡ２Ａ、）では１２５３ｂｐ、 およびｐＣＡ３’（またはＰＣＡ３Ａおよび３Ｂ）テハ１５５ｏｂＰテある。 第４図はプラスミドｐ１９Ｇの組立を示している。 第５図はｐＣＡ３Ａからのプラスミドｐ　ＣＡ　３　Ａ　−−１の組立を示して いる。この図はまた、ｐ　ＣＡ　３　Ａ　−−１およびｐ’１９　Ｃ（第４図） からのプラスミドｐＣＡ３Ｄの組立をも示している。 第６図はセクロピンＡ、大腸菌内で発現させるための第２の化学的に合成された 遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示している。 第７図は野生型およびミュータント（突然変異）セクロピンＡのヌクレオチド配 列およびアミノ酸配列を示している：ζこで、 （１）はＣＡ野生型（ｐＣＡ３Ｄ）、 （２）はＣＡミュータントＡ　（ｐＣＡ３Ａ　）、（３）はＣＡミュータントＢ 　（ｐＣＡ３Ｂ　）であり、ミューチージョンの位置を示している。 第８図はａｒａ　Ｂ　−ｈ　ＴＧ　Ｆ融合体を含有しているプラスミドｐｈＴＧ Ｆ５の組立を示す。 第９図はプラスミドｐＴＧＦ５８の組立を示す。 第１０図はヒトの合成カルシトニン遺伝子を持っている２つのプラスミドＰ１１ ５およびＰ３１８の組立を示している。 第１１図は、融合ポリペプチド、リブロキナーゼ−ヒトカルシトニン（ｈＣＴ） の遺伝子を含んでいるプラスミドｐＨＣＴ１の組立を示す。 第１２図はカルシトニン−ペプチド遺伝子のクローニングおよび発現のためのビ ヒクルとして用いられるプラスミドＰＩＮＧＩの組立を示している。ＰＩＮＧＩ は以下の記載に於いては、組換えＤＮＡ技術で用いられる多くの用語が多数使用 されている。明細書および請求の範囲を明瞭にかつ統一的に理解できる様に、ま たこの様な用語の範囲を明硅にする為にも、以下に用語の定義を行なう。 オペロン　ポリペプチド発現のための構造遺伝子およびその発現を調節している コントロール領域を含んでいる遺伝子。 オペレーター　特定のリプレッサーと相互作用し得るＤＮＡ配列であり、その相 互作用により隣接遺伝子（群）の機能がコントロールサレル。 プロモーター　ＲＮＡポリメラーゼが結合し、隣接遺伝子（群）の転写を開始さ せる、コントロール領域内のＤＮＡ配列。 アクチベーター　ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成の開始に必要なタンパク 。 ＤＮＡ配列であり、これにより隣接遺伝子がコントロールされる。 ポリヌクレオチド分子　糖と燐酸残基の交互連結で構成される骨格により互いに 連結しているヌクレオチドの線状配列であり、本明細書に於いては、ＤＮＡおよ びＲＮＡポリマーの両者を含んでいる。 構造遺伝子　鋳型またはメツセンジャーＲＮＡを介して、特定のペプチドに特徴 的なアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ配列。 ヘテロローガス（異種）遺伝子　外来性の、即ち宿主とは異なる供給体に由来す る遺伝子であるか、または化学的に合成された遺伝子であり、宿主とは異なる種 の供給体を含んでいる。この遺伝子は、発現ビヒクルによる形質転換を受ける住 換によって通常生産されないポリペプチドをコードしている。 生物系内で生じる目的の効果を達成する性質またはそのプロセスを意味する。 機能的な結合　本明細書では、プロモーターがヘテロローガス遺伝子によってコ ードされているポリペプチドの発現の開始をコントロールすることを意味してい る。 発現　構造遺伝子によりポリペプチドが生産されるプロセスを発現という。これ には、遺伝子のメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写とＩｎＲＮＡのポリ ペプチドへの翻訳が含まれる。 ラスミドまたはファージＤＮＡまたはその他のＤＮＡ配列であり、ＤＮＡの必須 の生物学的機能を失なうことなく、決定可能な様にそのＤＮＡ配列を切断し得る １つまたはそれ以上のエンドヌクレアーゼ認識部位によって特徴づけられ、かつ 、形質転換細胞の同定に使用するのに適当な表現型選択マーカーを含んでいるも のをいう。マーカーは、例えばテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性で ある。「ベクター」という用語がクローニングベクターの代りに用いられること がある。 発現コントロール配列　構造遺伝子と機能的に結合された場合、この構造遺伝子 の発現をコントロールまたは調節するヌクレオチド配列。これにはファージラム ダの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｆｄ　 外皮タンパク質のコントロール領域、および原核性または真核性細胞の遺伝子の 発現をコントロールすることが知られているその他の配列が含まれる。 発現ビヒクル　クローニングビヒクルに似たビヒクルであるが、通常ある種の調 節配列のコントロール下で、宿主内に於いて、与えられた構造遺伝子を発現する ことができるビヒクルをいう。 宿主　複製可能な発現ビヒクルの受容体となる全ゆる生物を意味し、これには細 菌および酵母が含まれる。 当業界で認められている殺菌活性測定法で測定した場合、インビボまたはインビ トロで該活性が認められる、全ゆる昆虫類由来のポリペプチドを含んでいる。 本発明に於いてセクロピンという用語は、適当な系で殺菌活性を示す、天然セク ロピンの全ゆる類似体、同族体、ミュータント、異性体または誘導体についても 用いられる。この用語は更に、天然のアミノ酸より少ない数のフラグメント、例 えば天然のセクロピンまたはその類似体の部分的フラグメントをも意味する。 更にまた、この用語は、天然のセクロピンまたはその　゛類似体の配列と、１ま たはそれ以上のその周辺アミノ酸、好ましくはカルボキシ末端のアミノ酸、を含 んでいる、セクロピン様殺菌活性を有する産物をも意味する。また、この用語は 、天然のアミノ酸より少ない数のセクロピンであるが、殺菌活性を示すものも含 むものとする。 ある種のセクロピンをこの定義の範囲内に入れるホモロギー（相同性）の程度は 、殺菌活性に関与しているセクロピンの領域に応じてかわる。この定義の範囲内 に入る為には、殺菌活性を示すのに必須である領域は高いホモロギーを示すが、 殺菌作用を示す構造を維持したり、リセブター結合を行なうの関与しない配列は 、比較的低いホモロギーを示すものであってもよい。 更に、機能的に類似し７ている側鎖を置換しても、臨界領域は殺菌活性を示し、 本明細書で定義した意味でホモローガスである。［機能的に類似」という用語は 、側鎖の優勢な特性、例えば塩基性、中性または酸性、立体障害の有無などをい う。一般に、セクロビンとして定義されるペプチドは、本明細書の「技術的背景 」の項に示したセクロピン類と実質的に相同（ホモローガス）である領域を含ん でいる。カルボキシ末端領域に比較してアミノ末端領域でのホモロギーはさほど 必要ではない。 「殺菌作用（活性）」という用語は、先に定義した活性を意味し、それは天然の セクロピン種の活性より大きくても、あるいは小さくてもよい。具体的には、天 然柱の約１％から、天然のセクロビンの活性より実質的に高い（例えば１０倍、 ｉｏｏ倍またはそれ以上）活性の範囲の殺菌作用を持ったセクロビンベグチドが 含まれる。 本発明は、宿主にとってヘテロローガス（異種）遺伝子に機能的に結合させたａ ｒａ　Ｂプロモーターノ配列を含んでいる該宿主内で発現し得るポリヌクレオチ ド分子を提供するものである。異種遺伝子は、生物活性をもつポリペプチドをコ ードしている。本発明はまた、る。即ち、コードされたポリペプチドを生成する だめの異種遺伝子の発現は、■、−アラビノースの添加によにポジティブコント ロール系である。Ｌ−アラビノースの添加がなければ、異種ポリペプチドは発現 または合成されない。ひとたび誘導されれば、生物活性ポリペプチドである生産 物は、迅速に、能率的に製造される。これらポリペプチド生産物は、典型的には 、宿主細胞中で細胞封入体として形成される。細胞封入体は、細胞密度の増加と 共に急速に増大する。細胞封入体は、宿主細胞中では、非常に安定に存在する。 この特徴により、再現性よく高収率で生産され、発酵の監視が容易になる。進行 中の発酵を終わらせるための正確な決定は、細胞封入体の大きさと飽和した増殖 に基づいて簡単に行なうことができる。 モ３０　モ２０　モ１〇　七１ ＴＡＴＴＣＡＡＴＧｍＣＧＡ、ＣＡＴｒＣＣＡＧＣＣＡＴＡＧＴｒＡＴＡＧＡＣ ＡＣｒ丁Ｃ丁ＣＴｒＡ（：ＴＴＡＡＴＩＴＴＡＴＣＧＣＣｒＧＡＡＣＴＴ；ＴＡ ＣＧ　Ｃｒ丁ｒｌＧＴＴＡ　ＣＡＡＡＧ　ＣＣＣｒ１ＴｒＣＡＣＡＡＧＣＣＧＧ Ｇ丁ＴＣＡＴＡ（ｆ；ＴＧＣＩＴＴＣＡＴＣＡＡＧ　ＣＧＣＡＡＡＧＴＣｒ丁Ｇ ＣＧＧＡＧＡＣＧＧＡＡＧＣｒＣｒＧＴ　ＣＧＴＣＣＩＧＧＴＣＧＡＴＡＴＧＧ Ａ　ＣＡＡＴＴ丁ＧπｒｃＴｒＧＴｃＴＧＡＡＣＡＴ　ＣＧＧＧＧＧＧＴＡＧＡ ＧＡＡＡＴＣ−３’ａｒａ　Ｂ遺伝子の一部分であるａｒａ　Ｂプロモーターは 、Ｌ−アラビノースオペロン中に位置している。Ｌ−アイムリウムで分離された 。Ｌ２かし、本発明の実施におに限定するものではない。他の供給源は、■、− アラビノースオペロンをコードしている遺伝子を含んだどんの供給源には、シュ ードモナス、シトロバクタ−、キサントモナスおよび、エルウィニアの細菌群が 含まれる。 更に、ａｒａ　Ｂプロモーターは、天然起源よりもむしろ、例えば実験室での操 作によって合成されてもよい。 換言すれば、この概念は９、人工的に合成されたもの、あるいは、人工的に減成 された産物をも意味している。 このように、天然のａｒａ　Ｂプロモーターの完全な配列が、ある生物種のゲノ ムＤＮＡ中に組込まれて存在していても、その生物のゲノムＤＮＡから分離され たａｒａ　Ｂプロモーターに相当する分離された配列は、先導ポリペプチドに相 当する隣接配列、および開始並びに停止信号が付いていようといよまいと、天然 に存在するものではなく、１合成１されたものと考える。その上、遺伝子コード には同義性があるので、そのアミノ酸配列がわかっていても、必ずしも、また、 決定的には、それをコードしている天然の遺伝子配列を決める訳にはいかない。 どんな合成配列を作成する場合でも、最善の方法は４つかまたはそれ以上の過程 からなり、それは、ａｒａ　Ｂプロモーターの合成に適用できると共に、異種ポ リペプチドを含むペプチド配列の合成にも適用できる。まず、所望の配列に対し 、その配列中の各アミノ酸に対する可能なりＮＡコドンのリストをつくる。そし て、これらコドンを、細菌または酵母で使用される頻度に従って順番に並べる。 コドンの予備的順序は、酵母にツいティ、ベネッシｊ−７（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ 　）　とハル（ＨａＨ）とのジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー 　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２ ５７：３０２６−３０３１（１９８２）、細菌については、フィールス（Ｆｉｅ ｒｓ）、Ｗ、ネイチャー（１’ＪａＬｕｒｅ　）、２６０．５００（１９７６） の文献に基いて行なってよい。さらに、これら文献の技術以上の精密な配列化を 推薦する。 どのコドンを選択するかに影響する第２の要因は、クローニング過程に於いて制 限酵素の使用を容易になる様な、遺伝子クローニング過程で使用する制限酵素部 位が存在するか存在しないかという点である。公知であるエンドヌクレアーゼ部 位の配列（ひとつの部位が４〜６個のヌクレオチドで成り立っている）を１宿主 に好まれる“−欠配列と比較することで、この要因を最も適止化できる。制限酵 素であるエンドヌクレアーゼ部位のリストは、たとえば、ロバート（Ｒｏｈｅｒ ｔｓ　）、Ｒ，Ｊ　、のヌクレイツク・アシッド・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡ ｃｉｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）、１１　：　１（１９８３）、ｒ　１．３５−　 ｒ　１３７に開示されている。 特定のコドンの選択に影響を与える３番目の要因は、合成されたＤＮＡフラグメ ントの内部の二次構造を最小限にする必要があることである。それは、折りたた まれてしまい、近接したＤＮＡフラグメントとのアニーリングが阻止されること を避けるためである。この要因には、意図した遺伝子中の互いに隣接し合ってい るセグメントを除き、セグメントが、互いに過度に相補的となることを避ける様 に配列設計を検索することである。相補性を調べること（即ち、その回避）は、 設計された遺伝子配列と提供される複製ビヒクル（プラスミドやファージ）の間 でも実施することができる。 最適化させる４番目の要因は、転写が早く終わるのを避けるために、特に、ＧＣ 塩基対の豊富な配列が前にある場合は、ＡＴ塩基対の豊富な配列（約５またはそ れ以上）を回避することである。 コドンの選択に影響を与える５番目の要因は、情報を安定させるためにＲＮａｓ ｅ部位を避けることである。 最後に、もし、２つの可能なコドンのいずれを使用してもよい場合は、微生物ゲ ノム中で発現を最大にするものを使用するのが適当である〔たとえば、フイール ス（Ｆｉｅｒｓ　）らのＮａｔｕｒｅ　２６０．５００．（１９７６）ｉ米国特 許第４，３６６，２４６号、６巻、を参照〕。 細菌や酵母での発現を最も効果的にするために、必要な比較を行なうようコンピ ューターにプログラムすることが最も好ましい。 本発明の具体例をひとつ挙げれば、誘導ａｒａ　Ｂプロモーターを生物活性をも つポリペプチドをコードしている遺伝子配列に機能的に連結させる。そして、得 られた遺伝子構築物を発現ビヒクルに導入するか、または、その一部とする。次 いで発現ビヒクルを適当な宿主を形質転換するために使用する。その宿主を、発 育を最適にするように選ばれた培養条件下で発酵する。 ａｒａ　Ｂプロモーターは、異種遺伝子の発現を開始させる様にプロモーターを 誘導するし一アラビノースで処理されるまでは不活性である。その働きの順序は 、ｍＲＮＡへの遺伝子の転写とそれに続くポリペプチド産物への翻訳である。 本発明におけるもう一つの具体例では、ａｒａ　Ｂプロモーターを生物活性をも つ異種ポリペプチドをコードしている遺伝子配列に機能的に連結し、そして、こ の遺伝子配列をもう一つのポリペプチドをコードしている２番目の遺伝子配列に 連結させる。発現により、融合体、即ち２番目のポリペプチドのアミノ酸配列と 所望の異種ポリペプチドのアミノ酸配列を含む前駆体タンパク質であって所望の アミノ酸配列に隣接した選択的開裂部位を含有しているタンパク質が得られる。 開裂部位は、従来技術で知られている好ましいいずれの部位でもよいが、メチオ ニンが好ましい。所望の異種遺伝子は、実際に選ばれた開裂部位に相当する開裂 部位を、その内部に持っていないことが好ましい。 他の知られティる開裂部位には、Ａｓｎ−Ｃｙｌｙ　、　Ａｓｐ−Ｐｒｏ、■、 ｙｓ　、　Ａｒｇ、およびＬｙｓ−Ａｒｇがある。 融合または前駆体タンパク質の選択的開裂は、主として、発現ビヒクルの複製環 境の外で行なう。この翻訳後の段階で、選択的処理により融合または前駆体りン パク質が切断される。たとえば、メチオニンを開裂部位とする場合、融合または 前駆体タンパク質は、所望の異種ポリペプチドを切断するために、臭化シアノジ エンで処理される。他の知られた開裂部位の場合、切断のための処置にはヒドロ キシルアミン、酸、トリプシンおよび、Ｌｙｓ−Ａｒｇ開裂酵素などが使用され る。 融合した、機能的に連結した遺伝子を調製する方法、および、細菌中でそれを発 現させる方法は公知のもので、たとえば、米国特許第４，３６６．２４６（その 引用は割愛する）に開示されている。 本明細書に記載された遺伝子構築物と方法は、細菌宿主において異種ポリペプチ ドを発現させるのに使用およびＭＣ１０６１株（ＡＴＣＣ３９４５０）は特に有 用である。使用し得るその他の微生物株としてＥ、ｅｏｌｉＸ１７７６（ＡＴＣ Ｃ３１５３７）が挙げられるが、これに眼用いることもできる。 一般に、宿主細胞Ｊ・相容性（適合性）のある種由来のレプリコンおよびコント ロール配列を含んでいるプラスミドベクターが、これらの宿主との関連で用いら れる。ベクターは通常、複製部位と共に、形質転換された細胞に表現型選択性を 伺与し得る特定の遺伝子を持っている。例えば、Ｅ、ｃｏｌｉは通常、Ｅ、　ｃ ｏｌｉ種由来のプラスミ　ド、ＰＢＲ３２２Ｃポリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ　）　 ら、ジれる。ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子 を含んでおり、形質転換された細胞ラスミドまたはその他の微生物プラスミドは 、微生物によって、それ自身のタンパク質を発現するのに使用し得るプロモータ ーを含んでるか、あるいは含む様に改良されなければならない。 ａｒａ　Ｂプロモーターは、生物活性を有するヘテロローガス（異種）ポリペプ チドまたはタンパク質をコードしている遺伝子配列と機能的に結合することがで きる。この様なポリペプチドまたはタンパク質の例には酵素、ホルモン、ヘモグ ロビン、抗体、構造タンパク質、σ−１β−およびｒ−インターフェロン、イン ターロイキン、インスリンおよび組織プラスミノーゲンアクチベーターなどが含 まれる。特定の例としてヒト腫瘍成長因子、カルシトニンおよびセクロビンが挙 げられる。 形質転換された宿主を、当技術分野で知られている方法に従って発酵し、培養し て最適の細胞増殖を達成することができる。下記の本発明による好ましい発酵法 および生産方法を使ってヘテロローガスポリペプチドを大量に生産することがで きる。さらに、ヘテロローガス遺伝子と機能的に結合させたａｒａ　Ｂプロモー ターを使うことにより、ヘテロローガス遺伝子の発現程度が増大する。 好ましい発酵法は以下の通りである。形質転換された宿主、好ましくは細菌、よ り好ましくはＥ、ｃｏｌｉを、細菌の増殖に必要な栄養物質を含んでいる培養培 地に入れる。この様な物質には、炭素および窒素源、鉱物、アミノ酸、ブηン類 、ピリミジン類およびビタミン類などが含まれる。好ましい培養培地はまた、表 現型マーカー耐性に必要な量の代謝産物を含んでおり、この様な代謝産物として は例えばテトラサイクリンまたはアンピシリンが挙げられる。最大増殖率が得ら れる様に選択した培養条件下で宿主を増殖させる。温度条件は宿主によるが、通 常最適範囲は約り０℃〜約４０℃であり、形質転換されたＥ、　ｃｏｌｉについ ては３７℃が最も好ましい。酸素も培地に供給する。後期指数的成長相まで宿主 を増殖させてから新しい培養培地に移す。 次いで宿主を生産（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏ口）培養培地に接種する。 この工程中、細菌は、もはや分裂しないが生存してい密度に達するのに十分な時 間は培地、宿主の遺伝子型、温度および空気導入度によってかわる。 当初、生産工程での発酵および培養条件は、先に培養工程で述べた条件と同じで ある。ただし、溶存酸素が増殖中に消費されるので、最小溶存酸素（Ｄ、　Ｏ， ）を３０％に維持するために、撹拌と空気導入率を増大させる。好ましいｐＨ域 は約６〜８である。上記の生産培ｐＨの酸および塩基調節は不要である。しかし 、他の宿主については、培地ｐＨの調節は必要となろう。最適細ヘテロローガス 遺伝子を誘導してポリペプチドが生産される様′に、Ｌ−アラビノースを添加す る。既述した様に、ポリペプチドは、宿主内に於いて細胞封入体を形成する。こ のペプチドは、濾過または沈殿の様な既知の方法で回収する。得られた、発現さ れたヘテロロー・ガスペプチドが融合タンパク質である場合は、その融合タンパ ク質を回収し、形質転換後工程で処理し、所Ｊ、のヘテロローガスポリペプチド を分離するこ、とができる。次いでこのヘテロローガスポリペプチドを回収し、 既知の方法で精製する。 ａｒａ　Ｂプロモーターは、便宜上、セクロピンを含ンでいる本発明の各種態様 に関連して記載されているが、ａｒａＢプロモーターは、生物活性を有する全ゆ るポリペプチドまたはタンパク質をコードしている遺伝子配列に機能的に結合さ せてもよいと理解されなければならない。 ２、セクロビン感受性宿主を使用するセクロピンの微生物学的製造法 本発明の１つの目的は、セクロピン感受性宿主を使用してセクロビンを微生物学 的に製造する方法を提供することにある。本発明の１つの思想は、セクロピンを コードしている遺伝子配列を発現させると共に、その生産物の殺菌作用を回避す る、または遅らせることにある。 １つの態様に於いては、セクロビンをコードしている遺伝子配列を誘導し得るプ ロモーターに連結し、得られた遺伝子構築物を発現ビヒクルに導入する。次いで この発現ビヒクルを使って適当な宿主を形質転換し、この宿主を、プロモーター が活性化されない通常の条件下で発酵させる。適当な時期が経過【７たら、例え ば細胞が定常期になったら、例えば塩濃度、光、代謝産物の存在または非存在、 金属などの外部環境因子を変えることによりプロモーターを誘導する。この変化 により、セクロビン遺伝子配列のｍ　ＲＮ　Ａへの転写、次いでその翻訳が起こ り殺菌性のセクロビンが得られる。 得られたセクロビンは殺菌性があり細菌宿主を破壊するが、この様な破壊は発酵 サイクルの後期まで起らない。調節されたプロモーターの例は、ラムグーＰＬお よびＰＲ，ｌａｃ　、　ｇａｌ　、　ｔｒｐ　、　ａｒａ　、　ｈｕｔなどであ るｏ“第２の好ましい態様においては、セクロピンをコードしている遺伝子配列 を機能的に、該セクロビン以外のポリペプチドに結合させ、セクロピンおよび付 加したポリペプチドの両アミノ酸配列から成り、かつ目的のセクロピンアミノ酸 配列に隣り合って選択的な切断部位を含有する、融合あるいは前駆体タンパク質 が発現によって得られるようにするならば、得られた融合タンパク質は殺菌性で はないということが見い出された。次いで、殺菌活性のセクロピンを翻訳後に選 択切断して単離することができる。 最も一般的には、発現担体の複製環境外で、たとえば微生物培養物を集めた後に 切断を行なう。従ってこの付加的なポリペプチドは、細胞外切断までの間、セク ロピンからその殺菌効果を失なわしめ、十分長期にわたって宿主を生存させて高 レベルの目的生産物を生じさぜる。このセクロビンは、余分のポリペプチドを切 り落とす際に用いる選択的切断部位に対応する内部切断部位を欠いていることが 好ましいが、これは必ずし５も絶対条件ではない。セクロピンはメチオニンヲ含 有していないので、セクロピン配列に隣り合ったメチオニンの所で臭化シアン切 断するのが有効である。 この余分のポリペプチドをコードしている遺伝子配列をセクロビンの構造遺伝子 より先に転写させるのが好ましいが、セクロビンのＣ末端に隣り合った位置で余 分のポリペプチドを発現させることも可能であるので、必ずしもこうである必要 はない。 この余分の隣接ポリペプチドの性質には限定はなく、既知の構造、酵素、ホルモ ンまたはその他の生理学的な関連タンパク質の一部、全部または繰り返し単位の いずれであってもよい。また、非機能的なポリペプチドであってもよい。いずれ の特定の理論に拘束されることもなく、融合タンパク質を長くすると全体のポリ ペプチドの立体配置を変えることによってセクロビンの殺菌性をどういうわけか １遮蔽する１ものと本発明者等は考えている。余分な隣接ポリペプチドをコード している遺伝子配列は、好ましくはその長さが少なくとも約３００塩基対以」二 であるべきであり、より好ましくは約４００　ｈｐ〜５　ｋｂであり、最も好ま しくは４００　ｂｐ〜２　ｋｂである。これは、好ましくは約１００〜１７００ アミノ酸残基の余分のポリペプチドに対応する。 多数の余分のポリペプチドを、所望のセクロビンペプチド配列に融合することが できる。ζ−のポリペプチド遺伝子配列は、有機合成によって（この場合、最適 方法が推奨されるであろう）調製するこ吉ができるが適当なｍＲＮＡの逆転写の ような方法によって調製されることもあるであろう。ポリペプチドの遺伝子配列 と構造セクロピンペプチドの遺伝子配列との酵素的結合をＣＤＮＡの調製後に行 なう。酵素的結合は、制限エンドヌクレアーゼ認識部位の２本鎖の１つからなる 接着末端を供給するか、あるいは平滑ライゲーションのどちらかによって行なう ことができる。余分のポリペプチドの例はベーターガラクトシダーゼあるいはり プロキナーゼ（ａｒａＢ遺伝子によってコードされている）である。酵素および 構造タンパク質が好ましい。用いることが可能なその他の産物は、以下に挙げる 遺伝子１ａｃＡ１ｓｅｒＡ、ｐｕｒＡ、　ｔｒｐＡ、　ｔｒｐＢ　、　ｔｒｐｃ 、　ｔｒｐＤ。 ｔｒｐ　Ｅ　、　ｔｙｒＡ等。この余分のポリペプチドは普通グリのその他のプ ロモーターを用いることができる。 本発明のさらに別の態様においては、セクロピン遺伝子配列を、融合産物におい てセクロピンの殺菌活性を聞書あるいは不活性化することができる余分のポリペ プチドの配列に機能的に結合させ、さらに誘導プロモーターに結合させる。この 方法では、融合タンパク質性で得られる効果と誘導プロモーターの使用”Ｃ得ら れる効果の両刀を都合よく、かつ同時に利用することができる。 本発明はセクロピン感受性の宿ｆ（たとえば、細菌宿主）においてセクロピンを 産生させる方法に関するものであるが、本発明で調製した遺伝子構築物およびそ の関連方法を、その他の非セクロピン感受性宿主においてセクロピンを発現させ るために用、いることもできる。これらの非セクロピン感受性宿主には酵母およ び補乳動物細胞培養物が含まれる。有用な酵母、哺乳動物宿主およびベクターは 当業界ではよく知られており、言及がなされている（た乏えば、欧州特許公開０ ０９３６１９．１９８３年１１月９日発行）。細菌性宿主には、ａｒａＢプロモ ーターを有する既述の宿主、ならびにシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 　）、シトロバクタ−（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　）、クサントモナス（Ｘａｎ ｔｈｏｍｏｎａｓ　）およびエルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ　）などの属の細菌宿 主が含まれる。 しうるすべてのプラスミドベクターを用いることができる。 別の好ましいセクロピン用プロモーターはラムダ（ＰＬ）である。セクロビン用 遺伝子構築物および余分のポリペプチドを、バクテリオファージラムダ（ＰＬ） の左側のプロモーターの制御下に置くことができる。このプロモーターは制御さ れつる最も強力な既知プロモーターの１つである。制御はラムダリプレッサーに よって発揮され、隣接制限部位が知られている。ＣＩ遺伝子の温度感受性対立遺 伝子を、セクロピンの完全配列を含有するベクターあるいは別のベクター上に配 置することができる。温度が４２℃まで上昇したときに、このリプレッサーは不 活性化され、プロモーターはその最大レベルで発現される。これらの条件下で産 生じたｍＲＮＡ量は、ＰＬプロモーター由来の新しく合成したＲＮＡを約１０％ 含有する細胞を生じるに十分であるはすである。この方法において、機能的なセ クロピン融合構築物配列がリポソーム結合配列に隣接し、モしてラムダＰＬプロ モーターから糧々の距離にあるクローンバンクを作成することが可能である。次 いでこれらのクローンをスクリーニングし、最大の収量を与えるクローンを選別 することができる。 また、このセクロピン配列の発現を、形質転換されていない状態では微生物にホ モローガス°相同°であってもよい他のレギユロンの制御下で行なうこともでき る。たとえば、Ｅ、コリの染色体ＤＮＡはラクトースあるいはｌａｃオペロンを 含有し、これは酵素ベーターガラクトシダーゼを同化することによってラクトー ス消化を仲介する。このυ玉制御要素を、Ｅ、コリに感染するバクテリオファー ジラムダｐｌａｃ５から得ることができる。このファージのＩａｃオペロンを、 同一の細菌種から形質導入して得る。ことができる。本発明の方法に用いるのに 適したレギユロンを、微生物本来のプラーター−オペレータ〃でＩＰＴＧで誘起 することができる。 本発明において特に興味深いことは、セクロビンペプチドをコードしている合成 ポリヌクレオチド配列を提供することである。本発明の好ましい態様においては 、セクロピンペプチドの合成配列（隣接配列があってもなくても）を、その発現 体が種々の宿主（たとえば酵母および細菌、特に後者）と共存しうるように最適 なものにする。特に、Ｅ、コリにおいて供与配列すべての発現′を最適化するこ とは極めて重要である。従って、上記のような最適化操作を行なった後には、隣 接配列を有するかあるいは有しないセクロビンペプチドの実際の遺伝子配列は、 通常、元の種における天然の配列とは異なっている。 さらに、融合産物のための所望の遺伝子の設計には、メチオニン（臭化シアンで 切断可能）、トリプトファン（Ｏ−ヨードソ安息香酸で切断可能）、グルタミン 酸〔スタフ（５ｔａｐｈ、　）プロテアーゼで切断可能〕等の切断部位のアミノ 酸のためのコドンを導入するのが好ましい。 本発明のある態様においては、融合産物の所望のＤＮＡ配列におけるコドンのす べてについて、特定部位の突然変異誘発によって意図した所で突然変異誘発を行 なうことができる。従って、所望のＤＮＡ配列を合成した後に、切断しつる部位 をこの配列に導入することができる。特定部位の突然変異誘発は既知であり、ワ レイス等が言及している（　（Ｗａｌｌａｃｅ　ｅｔ　ａｌ　、　）　、サイエ ンス（５ｃｉｅｎｃ　）、２０９：１３９６〜１４００（１９８０）、参考のた めに本明細書中に入れた〕。 セクロピンペプチドにおいて潜在的なＣ−末端残基に続いているアミノ酸残基あ るいは残基群には、上記のように、先導ポリペプチド（それが存在する場合）と 同一または異なる構造および種々の長さのさらに別のポリペプチド（１トレイリ ング（ｔｒａ、ｉｌｉｎｇ　）　’ポリペプチド）が続いていてもよい。このよ うな場合、Ｃ−末端アミノ酸残基とトレイリングポリペプチド配列の間に同一ま たは異なる選択切断部位を与えるのが都合よい。これらの切断部位は、先導ポリ ペプチドとセクロビンペブナドの構造遺伝子との間に存在するものと同一であっ て、同一でなくてもよい。 換言すれば、余分のポリペプチドは先導ポリペプチド、トレイリングポリペプチ ドまたはその両者として存在することができる。 所望のセクロビンペプチドの構造遺伝子をそのまま発現用担体に挿入しようとす る場合は、この遺伝子の前には１開始１コドンが存在し、そしてトレイリング配 列が続いている場合には、１またはそれ以上の終止あるいは停止コドンが存在す る。発現産物がセクロビンペプチドおよびポリペプチドの一部あるいは全体の両 者からなる融合タンパク質であるときには、この開始コドンはポリペプチドのＮ −末端の前に置かれていてよい（ポリペプチドが先導である場合）。 ポリヌクレオチドの合成法は当業界でよく知られている。参照文献としては、た とえばイタクラ等〔Ｉｔａｋｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、、ジャーナル拳オブ・アメリ カン・ケミカル−ソ＋：ｒ−ｆイ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　 Ｃｈｅｍｉｃａ１本発明方法によって得たセクロピンを、特定の応用分野に向け られた広範な抗微生物剤として用いることができる。このような応用分野には、 たとえば加工食品製品の防腐剤〔対象徴生物＝（１）クロストリジウム・ボツリ ナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｈｏＬｕｌｉｎｕｍ　）、（２）ラクトバシリ （Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ　）、（３）ミクロコッチ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｉ 　）　）　；口腔内衛生製品の抗カリエス剤〔対象微生物：ストレブトコッ力ス ーミュータンｘ　（５ｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ　）　）　；膣酵 母感染の治療に有用な薬物〔対象徴生物：カンジダ−７ルビカフ　ス（Ｃａｎｄ ｉｄａ　ａｌｂｉｅ２Ｌｎｓ　）　）および防臭剤中の抗微生物剤〔対象徴生物 ：　（１１ミクロコッチ（Ｍｉｅｒｏｅｏｃｃｉ　）、（２）ジフテロイズ（Ｄ ｉｐｈｃｈｅｒｏｉｄｓ　）　）としてセクロピンを使用することが含まれる。 上記の応用分野についてのセクロピン様ペプチドの相対的な効果を、セクロピン ペプチドの１つに対するいずれかの微生物の感受性を測定することによって、当 業者は容易に概算することができる。試験管内で用いられる同一の細菌スクリー ニングを用いて投与量および濃度を決めることができる。 ここまで、本発明を一般的に記載したが、特定の実施例について言及することに より本発明はさらによく理解されるであろう。この実施例は説明のためにだけ挙 げたものであって、他に指定がない限り本発明を限定しようとするものではない 。 方法 アミノ酸組成 減圧下、１１０℃で２４時間、５，５ＭのＨＣＩ　（ビアー　ス（Ｐｉｅｒｃｅ 　）　］　ヲ用いてセクロビンポリペプチドの加水分解を行なった。試料を減圧 下、４０℃で乾燥し、ヘックマン鴫モデル６３００試料緩衝液（Ｂｅｃｋｒｎａ ｎ　Ｍｃｘｉｅｌ　。 低ｐＨクエン酸塩）２００μｅ中に再懸濁した。 ベックマン・モデル６３００分析機を用いてアミノ酸分析を行なった。ポストカ ラム（ＰＯ３ｔＣＯ１ｔｌｒｎｎ　）　ニンヒドリンを検知に用いた。ヒユーレ ット・パラカード（）１ｅｗｌｅｔ、　Ｐａｃｋａｒｄ、　、　ＨＰ　）積分器 モデル３３９ｏを用いてテータを記録した。個々のピークを５４０および４４０ ｎｍにおけるシグナルの合計として記録した。それぞれのアミノ酸を含有するベ ックマン標準を用いて積分器を補正し、マツコラクジラミオグロビン〔アプライ ド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｒｎｓ　）　〕を用 いて検量が正確であることを確認した。 アプライド・バイオシステムズ・モデル４７０Ａタンパク質シークエネーター（ アミノ酸配列分析装置）を、すべてのタンパク質配列決定に用いた。配列決定法 の細目は７７カピラーーフツド（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ−Ｈｏｏｄ　）のプロ グラムに従った。この系には、メタノール性ＨＣ１による切断を用いる非減圧プ ログラムを用いた。 データ供与用のＨＰモデル３３９０Ａ積分器を備えたＩ（Ｐモデル１０９０Ａ　 ＨＰＬＣを用いてＰＴＨの測定を行なった。ＩＢＭシアノ−プロピルカラムをＰ ＴＨアミ／酸）分ｇＩＲ−用いた。緩衝液は５悌テトラヒドロフランを含有する ３　Ｑ　ｍＭのＮａＨＡｅ（ｐＨ５，１）テアツタ。 流速はｌｄ／分、温度は３７℃であった。 減圧下で乾燥した後、試料を３３％アセトニ）　ＩＪル水溶液３０μｅで３０分 間溶解１７た。使用［７たＰ　Ｔ　Ｈ標準はピアース・ケミカル社（Ｐｉｅｒｃ ｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）から入手した。 （１丈下金匂） 実施例１ 合成セクロピンＡ（ＣＡ）遺伝子の合成およびクローニング Ａ、ＣＡ遺伝子の合成 ＣＡをコードする遺伝子を、高度に発現されたイー・コリ蛋白に通常みられるコ ドンを導入するようにコンピュータでデザインした。該遺伝子の末端に４ｂｐ分 の突出部を入れ、それぞれＳａｌ工およびＥｃｏＲ工部位リゲーす（結合）でき るようにした。各種サイズの融合蛋白を構築できるように、５ａｌ−工　部位の つぎにＢａｍＨ工部位を含めた。さらに、コンピュータープログラムを用いて、 前述したような最適の方法を採択した。その遺伝子を２３〜３７塩基長さの８個 のオリゴヌクレオチドに分割した。 その８個の一本線ＤＮＡフラグメントを、イトウらの固相ホスホトリ、ｒ−７， チル法［Ｎｕｅｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ８巻、５４９１　（１ ９８２））によって合成した。 下記のような種々の変更および改良を行なった。 （１）カップリング反応をゆるやかに振盪させながら３７℃で４０分間行なった 。 （２）最終カップリング反応後、ＤＮＡの脱保護基を行なうために、ＤＮＡ樹脂 （１０〜）を０１５Ｍ２−ピリジンアルドキシム−テトラメチルグアニジニウム のピリジン−水（８：　２　ｖ／ｖ　）溶液（２−）と振数させながら３７℃で ６０分間反応させた。溶液を合せ、蒸発させたのち、密封アンプル中でＮＨ４Ｏ Ｈ（２８％、３−）にて６０℃で３６時間処理した。アンモニアを蒸発させたの ち、溶液をエーテルで３回抽出し、ついで蒸発させた。ＤＮＡを精製するために 、その残渣を５０ｍＭ　）リエチルアンモニウム重炭酸塩ｐＨ７，５（ＴＥＡＢ ）０．１ｍ！、に溶かし、セファデックスＧ　−５０のカラム（Ｉ　Ｘ　５０　 Ｃ１ｌ＋　）に通した。１−ずつのフラクションを採取した。主に２５　Ｑ　ｎ ｍに鋭い吸収ビ・−りを有する最初の数フラクションに目的物質が含まれていた 。これらのフラクションを蒸発させ、ついで高速液体クロマトグラフィ（Ｉ（Ｐ ＬＣ）にてさらに精製した。このＨＰ　Ｌ　Ｃ精製は、ボンダパック（Ｂｏｎｄ ａｐａｋ　）　ｃｉ　８（Ｗａｔｅｒｓ社）カラムにて１０ｍλ■酢酸トリエチ ルアンモニウム緩衝液（ｐＨ７，ｓ）中アセトニトリル（１０〜４０％）のリニ アグラジェントを用いて５５℃で行なった。そのＤＭＴ基を８０％酢酸（０，１ １１）にて室温で２５分間処理して加水分解し、ついで蒸発、さらに水０．１　 ｍｌを加えて蒸発させて酢酸を完全に除去した。 Ｂ、ＣＡ遺伝子のリゲイションによる組立て化学的に合成したフラグメント１〜 ８の５　’　ＯＨ末端を、別々に、下記組成の溶液（１０μｌ）中でりん酸化し た。 ７０ｍＭ）　リ　ス　−ＨＣｌ　（ｐ　Ｈ７，６）１０　＋ｎ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃ ｌ　２ ５ｍＭジチオスレイトール ６６μＭガンマー３２Ｐ　−ＡＴＰ　（１μＣｉ）ＤＮＡ４００ｎｇおよび Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ２単位 この反応は２５℃で１５分間行ない、ｌＱｍＭ非標識ＡＴＰｌ−を加えてさらに １５分間反応を続けた。 純度をチェックするために、りん酸化ＤＮＡ１０％を、７Ｍ尿素のが右下にポリ アクリルアミドゲル（１５％）電気泳動にて標準的な方法で分析した。 りん酸化ＤＮＡフラグメント２．３．４．５．６および７の４００　ｎｇを９５ ℃で５分間加熱してＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを不活化した。ついでこれに 、非りん酸化フラグメント１および８の４００　ｎｇを加え、９５℃でさらに５ 分間加熱し、ついで２５℃までゆっくり（１０分間当りｉ　’Ｃ）　、！＝冷却 した。この８個（７）　Ｄ　Ｎ　Ａ　７　ラグメントを全ｆｆ１ｌｏｏＩｌｌに て６６　ｍＭ　トリ　ス　−Ｉ（Ｃｌ　（ｐＨ７，５）　、６．６　ｒｎＭ　Ｍ ｇＣｚ　２　、１９ｍＭジチオスレイトール、０．４ｍＭ　ＡＴＰおよびＴ４１ ）ＮＡソリガーゼ単位の存在下に２５℃で２時間リゲートした。 Ｃ，プラスミドｐｌＮＧ１、ｐｃＡＩＡ、ｐｃＡＩＢおよびｐｃＡｌ’の構築 その構築工程を第２図に示す。 ｐ　Ｍ　Ｈ６はホルビツツらの文献［：　Ｈｏｒｗｉｉｚ　、　Ａ、　）Ｉ。 ｅｔａｌ、Ｇｅｎｅ、１４，３０９−３１９（１９８１）］に記載されており、 Δ４１３ｍｐ　９　は市販されている。 １、上記Ｂ工程で得られたＣＡ遺伝子のフラグメントを、予め制限酵素エンドヌ クレアーゼ二重およびしてｐ　Ｉ　Ｎ　Ｇ　１　を保持する形質転換体を減じた 。 ２．５ｍ、ａｆｉ処理プラスミドをイー・コリＭＣ１０６１に導入（形質転換） した。 ３、　ＣＡ遺伝子フラグメントを保有するプラスミドを含むコロニーを、合成り ＮＡフラグメン１−７（第１図）をプローブとして用いてコロニーハイブリダイ ゼーションにより同定した。ＣＡフラグメントを含む３個の別々のコロニーが１ ０００　コロニー中に見つかった。単離したプラスミドを各々Ｓａｌ工およびＥ Ｃ０ＲＩＩ：で消化し切取ったフラグメントのサイズをチェックした。ＣＡ挿入 体の塩基配列分析を、サンジャーら〔Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　ＰＮＡＳ　 、　７４　、５４６３−５４６７（１９７７）〕のジデオキシ鎖末端法の変法（ Ｗａｌｌａｃｅ　ｅｔ　ａｌ。 Ｇｅｎｅ、　１６　、２１−２６　（１９８１））によって行なった。 ２個の配列を決定し、第７（２）および７（３）図に示した。 これらの配列を含むプラスミドをｐｃＡＩＡおよびｐＣＡＩＢ（第２図）と命名 した。これらの配列はそれぞれ！ｆｉ　７　（２１および７（３）図中に矢印で 示す位置で天然のＣＡ配列とは異なっていた。 天然体の配列を生ぜしめるために種々の方法、例えンをスクリーニングする方法 などを用いることができる。所望の天然型配列を含むプラスミドをｐｃＡｌ’　 （第２図）と命名した。 以下の記載において、プライム符号（パ）を付したプラスミドは天然型ＣＡ配列 のものを意味し、プライム符号のないプラスミドはミュータントｐｃＡＩＡまた はｐＣＡＩＢから誘導されたものを意味する。 Ｄ、プラスミドｐ　ＣＡ　２’％ＰＣＡ２Ａ％　ｌ）　ＣＡ　３　’、ｐＣＡ３ ＡおよびｐＣＡ３Ｂの構築 これを第３図に示す。ｐＣＡｌ　（またはｐｃＡＩＡて、フラグメント１を得る 。この６のは一方の端が平トＴ４リゲーションにて結合させ、Ｉ）ＣＡ３’（ま たはｐＣＡ３　またはｐｃＡ３Ｂ　）を得る。このフラグメント１をまた、ｐ　 Ｍ　Ｈ５をＩ（ｇｉＡＪ消化、平滑末端形成および５ｓｔＪ処理に付して得られ るフラグメントと１゛４リゲーシヨンにて結合させ、ＰＣＡ２’（またはｐＣＡ ２Ａ）を得る。 上記結合生成物を用い゛Ｃイー・・コｌＪＭｃ１０６１を形質転換させて所望の 生成物を得る。前記ミニ分解法によりプラスミドを単離する。単離プラスミドを （ね。 ぞれＢａｍＨｌおよびＰｓｃｌ：で消化する。Ｂａｍ１４：［７ラ／ｙ”ｊント ’の正しいサイズおよび方向を有する各グループのプラスミドをＰＧＡ１　（ま たはＰＣＡ２Ａ）およびｐＣＡ３’（またはｐＣＡ３ＡまたはＰＣＡ３Ｂ）（！ ：命名プラスミドｐｃＡＩＡ、ＰＣＡ２Ａ、ＰＣＡ３Ａ、ＰＣＡ３ＢおよびｐＣ Ａ３Ｄ　（注：ｐＣＡ３Ｄ　は、以下、野生型ＣＡ含有プラスミドｐ　ＣＡ　３ ’を示すためにも用いる）中にａｒａＢ　＋　ＣＡ融合遺伝子を含有するイー・ コリ細胞を、１．５％トリプトン、１．０％酵母エキスおよび０．５％ＮａＣｌ ！（ＴＹＦ、　）　ならびにアンピシリン５０μｇ１ｍｌを含む培地中３７℃で 生育させた。細胞密度０Ｄ６ｏｏ＝０．２にて培養物をＬ−アラビノース最終濃 度０．５　Ｘにて処理し、υ二Ｂ　−ＣＡ融合蛋白の発現をもたらし、細胞密度 が０Ｄ６００−１．５〜１．７に達しタトきに、ベックマンＪＳ−４．２０−タ ー中４℃、４０００”−’Ｐｍにて２０分間遠心分離により収集した。 該細胞を原培養液量の半分倍量の５ＱｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ６，６）に再懸濁 させて洗浄した。プラスミドｐｃＡＩＡ、ｐＣＡ２ＡおよびｐＣＡ３Ａを含有す る洗浄した細胞ペレットを１７１０ｆｆｌのりん酸緩？ＪｉＴ液および１５ｆ１ ドデシル硫酸ナトリウノ、　（Ｓ　Ｄ　Ｓ　）で抽出し、１０％ポリアクリル了 ミドＳＤＳ変性ゲルにて分析した。この分析により、プラスミドルＣＡ３Ａ含有 イ・−・・コリ培養液はｐＣＡＩＡまたはＰＣＡ２Ａで形質転換した培養液のい ずれよりも多聞のａ　賢Ｂ　−ＣＡ蛋白の生成が認められＡ＝。 Ｆ、プラスミドｐ　ＣＡ　３　Ａ　、ｐ　ＣＡ　３　Ｂ　およびｐ　ＣＡ３Ｄを 含有する誘導イー・コリ細胞の分画工程Ｅで得られた洗浄ペレットを原註の】／ １０量のりん酸緩衝液に再懸濁［−２，０℃に冷却し、フレンチ圧力セル中で細 胞を破砕した。ローター中で４℃。 ４０００ｒ［３ｍで２０分間遠心分離して細胞中の成分を分離した。得られた上 清液および４０００ｒＰｍ分離ペレットを１０％ポリアクリルアミドＳ　Ｉ）　 Ｓ変性ゲルにて分析したところ、ｐ　ＣＡ　３　Ａ、３Ｂおよび３ＤのＧ０合成 ＣＡの精製 （ａ）　臭化シアンによる開裂 を含有する該４にペレットフラクションを９０％ギ酸と混合し、蛋白含量０．７ 〜１．１７１１！ｉ’／ｒｎｔの７０％ギ酸溶液を得た。１０倍量（重量）の臭 化シアン（アセトニトリル中１ｇｍ／、、ｚ含有液）を加えた。その反応液を窒 素でフラッシュし、室温で一夜培養した。 ２、　ギ酸および臭化シアンを窒素気流下に除去した。 残渣を７０％ギ酸に溶かし、さらに２回、窒素気流下で乾燥した。 ３．０．１％トリフルオロ酢酸水溶液を加え、開裂したＣＡを、タンパク質ｘｒ ｒｑ／ｒｎｔの濃度で完全に溶解した。 ｆｂｌ　臭化シアンフラグメントの高速液体クロマトグラフィー 臭化シアン開裂融合タンパク質をＨＰＬＣでクロマトグラフし１分子ＯＣＡ部分 由来のフラグメントを回およびアセトニトリル中０．１％”ｒＦＡ　（バッファ ーＢ）により、グラディエンドを行った。開始溶出液は２０％バッファーＢを含 有していた：試料注入から２分後に、６０分間に及ぶ２０％Ｂから６０％Ｂへの グラディエンドを開始した。流速は１．　＋ｎｉ７’分であった。溶離像（プロ フィール）を２８０　ｎｍにおいて監視した。 溶離した臭化シアン開裂融合タンパク質のクロマトグラｌ、における種々のビ・ −りを集めて後述（実施例４）の細菌活性試験に付した。 Ｈ，突然変異セクロビンポリベブチドをコードするＣＡ３Ａ 表　エ イ−・コリ内でｐＣＡ３Ａによって産生されたセクロピンーＡのアミノ酸組成 突然変異体Ａ アミノ酸　実験値　理論値” Ａ　Ｓ　Ｐ　２１ｇ　３ Ａｌａ　３．０　３ Ｐｈｅ　１．１　Ｉ Ｍｅｔ　Ｑ　Ｏ Ｔ　ｙ　ｒ　０．１　０ Ｈｉｓ　Ｑ、４　Ｏ Ｎ、Ｄ、−測定せず。 来理論値：各突然変異体クローンのＤＮＡ配列決定により得た値。 核酸配列およびアミノ酸配列は第７図に示され”Ｃいる。 実施例２ 他の突然変異体セクロビンポリベブチドの例示実施例１、Ｆ−Ｇに記載の如く、 プラスミドｐＣＡ３Ｂの細胞を分画し、ＣＡ配列を検出し１合成ＣＡを精製、分 析した。表■に示したアミノ酸組成および配列データーは、第２のクローンも突 然変異体セクロピンをコードしているＣＡ遺伝子配列を含有していることを示し ている。 表　■ イー・コリ内でｐＣＡ３Ｂによって産生きれたセクロピンーＡのアミノ酸組成 Ａ　Ｓ　Ｐ　２．３　２ Ｔｈｒ　１．０　１ Ｇｌｕ　４．２　４ Ａｌａ　５．Ｑ　５ Ｐｈｅ　□、ｇ　Ｉ Ｍｅｔ　Ｏ０ Ｔｙｒ　Ｏ０ Ｉ−１ｉ　ｓ　０．１　Ｏ Ｎ、Ｄ、　＝１測定せず。 米理論値：各突然変異体クローンのＤＮＡ配列決定により得られた値。 核酸配列およびアミノ酸配列は第７図に示されている。 実施例３ 野生型セクロビンＡをコードしているプラスミドＰＣＡ３Ｄの組立て 組立て図は第４および第５図に示されている。 Ａ、ｐ１９Ｇの組立て １、　プラスミドｐ１．ＮＧｌ　をエンドヌクレアーゼ化合フェノール／クロロ ホルム（比１：１）抽出によって停止させ、水性残渣をエーテルで洗浄した後、 バイオ−ゲル（Ｂｌｏ−Ｇｅ１　）　ｐ　−１０カラムに通してフェノール／ク ロロホルムを除去した。Ｆｏｋ　ｌ消化の結果、“ＣＴＡＣ“５′突出部（オー バーハング）が生じた。この７６塩基対のＢａｒｎ　Ｈ■、Ｆｏｋ　ｌ　フラグ メントはａｒａＢ　プロモーターを含有している。 ２、Ｎ末端に”ＧＡＴＧ’″５′突出部、Ｃ末端にＡＴＴＴの突出したシヱに■ 部位を生成させるために、２個のＤＮＡフラグメント＆１および＆５をｊλｎｎ −１およびｎｎ−５（配列は第６図に記載）で置き換える外は実施例１、スデツ プＢに記載の方法と同様の方法を用いて新規ｆｉＣＡ遺伝子フラグメント（第６ 図参照）を組立てだ。 ３、ＰＢＲ３２２をエンドヌクレアーゼＲａｍ　ＨＪおよびＥｃｏＲ］：で完全 に消化した。生じた消化を前記の如（にして停止させた。 ４、上記ステップ１で得たＢａｍＨ■−Ｆｏｋ　ｌフラグメントと、上記ステッ プ２で得た新規なＣＡ遺伝子を、ｐＢＲ１３２２の大きい方のＢａｍＨ■−Ｅｃ ｏＲＪ　７ラグメントにリゲートさせた。 ５゜　リゲート産物をエンドヌクレアーイトｌ１ｎｄＮテ消化し、ｐＢＲ３２２ を担っている形質転換体の数を１０６１を形質転換した。 ７、ＣＡ遺伝子フラグメントを担っているプラスミドを含有するコロニーを、合 成りＮＡフラグメント７（第６図）をプローブとして用いるコロ、−一ハイブリ ダイゼーションにより同定した。ｉ、ｏｏｏ　個のコロニー中に、ＣＡフラグメ ントを含有している３個の独立したコロニーが見い出された。単離した各プラス ミドグメントを放出し得るプラスミドをｐ１９ｃ　と命名した。ザンガ＝ら（Ｓ ａｎｇｅｒ　ｃｔ　ａｌ、　）のジデオキシ鎖末〕を幾分改良し、た方法〔ワラ スら（Ｗａｌｌａｃｅ　ｅｔ　ａＸ、　）、ＣＡ挿人体のヌクシン４１ド配列を 分相したｐ１９ｃはＣＡ遺伝須の正値な配列を含有し−（：いた。ＣＡ遺伝子は 、ａｒａＢブロモ−タ・＝の下流側に直結し°Ｃおり。 両者の間にはａｒａ　Ｒ暗号配列が存在しでい４ｆかった。 Ｂ、ｐｃＡＯの組立て このプラスミドをＰｖｕ　■消化に付し、次のリゲーション工程においで、切り 取ったフラグメントがプラスミドとリリゲート（再結合）する機会を減少させた 。。 リゲートさせた後、ｐＩＮＣ；）を担っている形質転換体の数を減少させるため に制限エンドヌクレアーゼ５川ａ工で消化した。 に導入（トランスホーム）した。 ４、ＣＡ遺伝子フラグメントを担っているプラスミドを含有するコロニーをプラ スミドの特性化によってズを調べた。正しいサイズを有するプラスミドをｐＣＡ Ｏと命名した。ジデオキシ鎖末端決定法によりＣＡ挿人体のヌクレオチド配列決 定を行った。ｐｃＡＯはＣＡ遺伝子の正しい配列を含有していた。このｐｃＡＯ 後方に直結して存在していた。 Ｃ，プラスミドｐＣＡ３Ａ−−１の組立てこの組立ての目的は、１個のＸｍｎ　 １部位を除くために、ｐＣＡ３ＡからＡｖａ　ニー　Ｐｖｕ　■　領域を欠失さ せることにある。この欠失により、イー・コリ細胞内でのプラスミドのコピー数 を増加させるとさもできる。 Ｐｖｕ■で消化した後、ｄＮＴＰの存在Ｆ、ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウフ ラグメントで充填し、平滑末端を形成させた。 ２、　ステップ１で得たプラスミドを再すゲートシ、元のｐＣＡ３Ａを含む形質 転換体の数を減少させるためにＡｖａ■とＰｖｕｌｆｉで消化した。 ３、　このＡνａｆｉ％Ｐ　ｖ　１３１１処理シラスミドをイー・コリＭＣ：１ ０６１に導入した。 ４、Ａｖａ　■−ＰＶＩＪＩＩ領域を欠失したプラスミドを含有しているコロニ ーを、合成りＮＡフラグメント５’　−ＴＣＡＴＣＡＧＣＧＴＧＧ’Ｉ’ＣＧ　 −３’　をプＯ−ブとして用いるコロニーハイブリダ・ｆビージョンによって同 定すた。 ５Ｑコｏ、＝−中に、Ａｖａ：［−Ｐｖｕｌｉ欠失を伴ナー〕た４６個の独立の コロニーかり、い出された。単離した各グラスミドＸｍａｉで消化し、切除フラ グメントのサイズを調べた。正しいサイズを有するグラスミドの１つをＰＣＡ３ Ａ−−１，１！：命名した。 Ｄ、プラスミドｐ　ＣＡ　３１）の最終的な組立てｐ１９ｃは野生型セクロビン Ａ配列を含有しているが、ａｒａＢ、Ｊ：の融合タンパク質を生成するために、 そのＮ末端における通常の制限部位を欠除され′Ｃいる。 ｐＣＡ３Ａは突然変異体ａｒａＢ−ＣＡ融合タンパク質を生成させるためにＣＡ Ａ伝子のＣ末端付近に存在している２個の塩基対が欠失されている。 これらの２個のプラスミドを結合させ、と１と融合した野生型ＣＡＡ伝子を有す るプラスミドを組立て、ａｒａＢ−ＣＡ融融合タンパ性質生産する。 この組立て模式図を第５図に示す。 １、　プラスミドＰ１９Ｃ（ｌｕｇ）をエンドヌクレアーゼＸｍｎ１で完全に消 化し、６５℃で１０分間加熱することにより消化を停止させた。 ２、　プラスミドｐＣＡ３Ａ−−１’（０，１ｕｇ）をエンドヌクレアーゼＸｍ ｎ１で完全に消化し、６５℃で１０分間加熱することにより消化を停止させた。 ３、　ステップＤ、１およびり、２て得たＩ）　Ｎ　Ａを混合し、リゲートさせ た。 ４、リゲート産物をＰｖｕｌｉで消化し、Ｐ１９Ｃを担った形質転換体の数を減 少させた。 ５、Ｐｖｕｌ）−処理プラスミドをイー・コリＭＣ１０６１に導入した。 る、。ニーを、前記の如きＩ）　Ｎ　Ａ配列決定法により同定した。分析した７ 個のコロニーの内、野生型の配列を有する１個のコロニーを得、ｐＣＡ３Ｄと命 名した。 イー・コリ内においてｐＣＡ３Ｄにより生産された野生型セクロビン−Ａのアミ ノ酸組成 アミノ酸　実験値　予測値 Ｓｅｔ　０．３　０ Ｃｙｓ　Ｑ　Ｏ Ｍｅｔ　Ｑ　Ｑ Ｎ、Ｄ、＝測定せず。 核酸配列およびアミノ酸配列を第７図に示す。 実施例４ 殺菌活性の検定 被検生物の生存し得る細胞約１０７を含有するＴＹＥ培地６ｒｎｌを用いて寒天 平板（直径８　ｃｍ　）を調製した。 この平板に、直径’１ｍｍのウェルをパンチ形成した。 被検物質を５　Ｑ　ｍＭりん酸バッファー（ｐ）Ｉ　６．６　）に溶かし、各ウ ェルに３μｊづつ適用した。２５℃で一夜インキユベーションした後、ウェル周 囲の阻止帯またはかさくｈａｌｏ）の直径を測定した。かさ形成の標準をめるた めに、ＣＡ　１−３３　タンパク質を用いた。ウェルに（？：Ａｌ−３３をｌｏ ｇおよび３ｕｇ入れると、イー・コリ株ＪＦ　５６８を注入した培地上でそれぞ れ、直径８ｍｒｎおよび１１ｍｍ　のかさが生じた。 質１０μｇおよび３０μｇはそれぞれ、直径７ｍｍおよびＩｇｍｍのかさを形成 した。 ＨＰ　Ｌ　Ｃで分画した臭化シアン消化融合タンパク質をもこの検定法に適用し た。様々なピークを試験したところ、１つの特異的なピークが生物活性を示した 。 他の細菌株および酵母株もこの検定法により試験した。 臭化シアンで消化した、あるいは消化していない融合タンパク質試料をイー・コ リ株ＪＦ５６８の試験において記載した鼠で適用し、形成されたかさの直径を測 定した。 得られたセクロピン全てに関して得られた結果を表■に示す。 表　■ かさ形成作用として測定した、種々の細菌株に対するＣＮＢｒ消化ｐＣＡ３Ａ、 ｐＣＡ３Ｂ、ｐＣＡ３Ｄ融合タン融合タンパ体質単離体）およびアンピシリン（ ７５゜ｎｇ）の生物活性 スタフィロコッカス・アウレウス （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）　ＮＥＮＥＮＥｌｌ、”スト レプトコッカス・フェカリス （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）　ＮＥＮＥＮＥ７．０サル モネラ・デルビイ （Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｄｅｒｂｙ）　”０”　５’　”シス−トモナスＰＳ −９ｊ。 （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ＰＳ−９）　２’　２”　”ＯＮＥクレブシーラ・ ニューモニエ （Ｋｌ　ｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　）　４°５４°０　４．５ 　ＮＥエルウィニア・カロトボーラ　ＥＣ （Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ　ＥＣ）　”　４・５”５”’ストレ プトコッカス・ピオゲネス （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）　ＮＥＮＥＮＥ”キセノハ ブダス・ネマトフイラス （Ｘｅｎｏｈａｂｄｕｓ　ｎｅｍａｃｏｐｈｉｌｌｕｓ）　３’　３．０”５１ ２’セラチア・マーセラセンス （Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｅｎｓ）　”　１．０”　ＮＥイー・コリ５ ５０６ （Ｅ、ｃｏｌｉ　５５０６）　”０”５”　”５イー・コリ　５５０６　ＤＲ （Ｅ、　ｃｏｌｉ　５５Ｑ５ＤＲ）　７・０７・０　６．５　４．５実施例５ セクロピンおよび腫瘍増殖因子の発酵による生産この実施例では、大腸菌内にお ける。　ａｒａＢプロ七−ターのコントロール下でのｇ−ＴＧＦ（腫瘍増殖因子 ）およびセクロビンの発酵による製造について記載（ｐＴＧＦｓｓ）、あるいは 、旦す−セクロピン融合遺伝子を制御するプラスミド（（支持されたａｒａＢプ ロモーター（１）ＣＡ３Ｄ）を含有しＣいる。培養を、アンピシリン（ｏ、ｘｇ ／ｒ）含有ＴＹＥ培妬培地培地１００ｒｎ！中７℃、２５Ｏｒｐｍにおいて増殖 させた。培養を指数的生長相（約２００Ｋｌｅｃｉ単位、赤色フィルター）まで 増殖させた。次いで培養を調製したＣのＴＹＥ培地９００ｆｆＩｌの入った４１ の遮断（バッフル）振盪フラスコに移した。さらに３時間インキュベーションを 続けた後、生産培地９ｊに接種した。生産培地は表Ｖに記載した成分を金山して いる。 カゼイン加水分解物　３０　グリセリン　１６酵母エキｘ　Ｉ　ＣａＣｌ２：　 ２Ｈ２００，０２２ＫＨ２ＰＯ４３Ｍｇ５０．４ニアＨ２００，２５Ｎａ２ＨＰ Ｏ４６チアミン−Ｈ（：ｌ　Ｏ，０１ＮａＣ１０，５７：／ピシリン　０．１最 初、生産用発酵条件を３７℃、８００ｒｐｍ、およびｌｖｖｍ（１分間当りの容 器容量）にセットした。増殖時期には溶存酸素が消費されるので、それに応じて 、最少溶存酸素（Ｄ、０．）を３０％に維持するために攪拌速度と通気率を増加 した。この培地のｐ　Ｈは終始、イー・コリの増殖に適したｐＨ６，５−６，８ に自律調節されていたので、培地のｐＨを酸または塩基で調節する必要はなかっ た。生産培地への接種から約４時間後、細胞密度は０−Ｄ−６００＝１０　とな り、この時点でＬ−アラビノース（５０ｇ）を加えてセクロビン融合タンパク質 の合成を誘導した。発現ベクターの安定性をさらに確かなものとするために、Ｏ ９Ｄ、６００　＝　２０の時点でブロス中にアンピシリン１ｇを補給した。 α−ＴＧＦおよびセクロピンーａｒａＢ融合タンパク質は、いずれもイー・フリ 細胞の不溶性画分中にのみ位置していた。顕微鏡的検査により、この不溶性の封 入体は、誘導後１時間後に細胞内に形成され１発酵の間中安定的に維持されるこ とが分った。９５％以上ノ細胞が、細胞密度が増加し続けるのに伴ない、迅速に 大きくなる封入体を少くとも１個含有していた。細胞塊の収率は１１当りｘ３． １ｇ（乾重け）であった。細胞塊の約３０％が融合タンパク質であった。 ａ　ｒａ　Ｂ　−ｈ　ＴＧＦ　融合タンパク質の発現がＳ、チフィムリウムａｒ ａＢプロモーターの制御）に起こるイー・コリベクターの組立で ａｒａＢプロモーターは二８遺伝Ｐ産物により、正の制御を受ける。Ｌ−アラビ ノ−ストａｒａＣタンパク質との相互反応により土すエ」　プロモーターの発現 に必要な活性化因子（アクティベーター）が生成される。 ｓ、チフイムリウム（Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｔ晋力偲）３農」およびａｒａＣの遺 伝子を含有するプラスミドを用いてａｒａＢ−ｈＴＧＦ（ヒト腫瘍増殖因子σ） 発現ベクターを組立てた。プラスミドの組立て方法を第８図に示す。最終的なプ ラスミドｐｈＴＧＦ５は５４８アミノ酸のタンパク質をコードしているａｒａＢ 、−ｈＴＧＦ融合物を含有している。ｐｈＴＧＦ５を含有しているイー・コリ株 ＭＣ１０６１を、カゼイン加水分解物（０，５％）とチアミン（ｉ　ｕｇ／ｍｌ ）を補充した最小グリセリン（１％）培地中で増殖させた。培地の密度がＡ　６ ００　＝　０．２に達したとき、■、−アラビノースを１％になる様に加え、５ 時間インキュベーションを続けた後、培養物を収集（収穫）した。全細胞性タン パク質の約１０％を表わす５５ＫＤａｌタンパク質が５ＤＳ＝ＰＡＧＥ　によっ て検出された。 実施例７ 一３′ 転写ターミネータ−は、ＲＮＡ　ポリメラーゼに転写を終了させるＤＮＡ　配列 である。ａｒａ　Ｂ　−＋１ＴＩＣＦ遺伝子の３′末端に転写ターミネータ−を 置くことにより、その転写ターミネータ−から下流の所望しない遺伝子産物の発 現が阻止される。第９図に示したプラスミド構築状参照。最終的なプラスミドｐ ｈＴＧＦ５８は、ａｒａ　Ｂ　−ｈ　ＴＧ　Ｆ遺伝子ノ３′−末端ニ挿入すレタ イー、コリｒｒｎＢ遺伝子転写ターミネータ−を含んでいる。 ｐｈＴＧＦ５８またはｐｈＴＧＦ５　（親プラスミド）のいずれかを含んでいる イー・コリＭＣ１０６１株から分離された、部分的に純化したａｒａ　Ｂ　−ｈ 　ＴＧ　Ｆタンパク質を、Ｓ、Ｄ　Ｓ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した 後比較すると、主要な夾雑タンパク質、ベーターラクタマーゼ、はｐ　ｈ　ＴＧ Ｆ’　５８−含有細胞に於いて、有意に減Ａ、ヒトカルシトニン遺伝子（ｈＣＴ ）カルシトニンまたはチ［フカルシトニン（ＣＴ）ｊ；ｉ。 甲状腺から分泌される低カルシウムホルモンにつけられた名称である。ＣＴは、 骨吸収活性を減少させる。 ＣＴはまた、腎臓に作用して尿中カルシウムを増大させ、燐酸を減少させる。血 中カルシウムが高まるトＣＴが急速に放出されるのは、ＣＴｌ−の主目的は、高 等動物を急性高カルシウム症状から保護することにあることを示している。ＣＴ における研究は、ベゲット病（Ｐａｇｅｔ’ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ　）のコントＣ １−＃　、促進された骨改造の問題、における使用を調べることである。 カルシトニンのヒト遺伝子の配列は、次の通りである〔フレイブ（Ｃｒａｉｇ　 ）　ら、ネーチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、２９５３４５−３４７　（１９８２） 　）。 Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　 Ｇｌｙ”ＩＹ：ＪＣＧＧＴ　ＡＡＴ　Ｃ１℃ＡＧＴ　ＡＣＴ　ＴＧＣＡＴＣＣＴ ＣＧＧＣＴｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　 Ｐｈｅ　ＨｉｓＡＣＡ　ＴＡＣＡＣＧ　ＣＡＧ　ＧＡＣＴＴＣＡＡＣＡＡＧ　Ｔ ｎ”　ＣＡＣＴｈｒ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｇｉ ｙ　Ｖａｔ　ＧｕｙＡＣＧ　ＴｒＣＣＣＣＣＡＡ　ＡＣｒ　Ｃ，ＣＡ　ＡπＧＧ Ｇ　ＧＴｒαＡＡｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ ＧＣＡ　ＣＣＴ　ＧＧＡ Ｂ、誘導領域、ムラ」構造遺伝子およびｈＣＴ　遺伝子を保持しているプラスミ ドの構築 第１０図にその構築を示したプラスミドＰ１１５は、正しいカルシトニン遺伝子 配列を含んでいる。このプラスミドを、第１１図に示す様に、エンドヌクレアー 遺伝子を保持しているプラスミド（プラスミドｐＩＮＧ１、第１２図参照）に結 合させた。 ｐｌＮｃ；ｌ構築の出発物質として、無傷のａｒａ　Ｃおよ３１９　（１９８１ ））を使用した。構築法を第１２図に示した。このプラスミドｐＭｆ（５を制限 エンドヌクレアラ（Ｖｉｅｉｒａ　）およびメッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ　）、 ジーン制限エンドヌクレアーゼは共に平滑末端フラグメントを生成するので、ｐ ＩＮＧｌの７６０塩基対７ラグメントをプラスミド＃１１５　からのＭｓｔＩ− ＰＳｔエフラグメントで置き換えてｐｈｅＴＩ　を生成させた。プラスミド＃１ １５は、λｆｓｔＩ−Ｐｓｔｌ’フラグメント内に位置する化学合成されたｈＣ Ｔを持っている。ＭｓｔＩおよび肋ｒａ工末端の結合でｈｃＴ　遺伝子をａｙａ Ｂ遺伝に融合し、ａｒａＢ　−ｈＣＴタンパク融合物を作成した。 Ｃ，ｐｈ、ｃＴｌ　を含有するイー・コリ細胞の増殖ｐｈｅＴ１　を含んでいる 。形質転換イー・コリ細胞を、振盪しながら、１０　１０．乙４密度になるまで 、３７℃で増殖させ、さらに１〜６時間増殖さぜる間、Ｌ−アラビ／−ス（１％ ｗｔ／ｖｏｌ）を添加することにより、た。収集した細胞を超音波処理（５秒、 ３回）し、ａｒａＢ−カルシトニンの濃度を、抗−ｈＣＴ　抗体を使ってＥＬＩ ＳＡ　法により分析した。 上記の発明は、理解を助ける目的で例示によって詳しく述べたが、請求の範囲に よって限定されこそすれ、その発明の範囲内に於いてそれを変換および改良し得 ることはいうまでもない。 ＦＩ６．２ ５ｆ７−ｙＥ／ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、　１０ 国際調査報告 １ＡＩｕｎａｌｌａＬｌｌｌ　ＡｏＩｌｌｋａＵｍ　ＮａＰｃＴ／υ５９６１０ Ｑ１３１”””１１１１”’　Ａ””””　Ｆ’ｌ：Ｔ／ｌｌｓ　８６１００１ ３１ＰＣＴ／ＵＳ８６１００１３１ Ｘ、Ｃｌａｉｍｓ　１−１４　ａｒｅ　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ｐｏｌｙｎｕｃｌｅ ｏセｉｄｅ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｈｉＣｌｅｓ、　 ｂａｃｔｅｒｉａ　ａｎｄ　ａ　＋ｎｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ 　ａ　ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｐ■垂狽奄р■ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　ｔｈ＠ａｒａ　Ｂ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｃｌａｓｓｉｆｉ ｅｄ　ｉｎ　５３６／２７．４３５／３１７．２５３　ａｎ■ ６１３　ｒｅｓｐｅｃｔｌｖｅｌｙ。 Ｈ，Ｃｌａｉｍｇ　１５−２１．　２３−２９　ａ、ｎｄ　３３　ａｒｅ　ｄｒ ａｗｎ　ｔｏ　ａ　ｇａｎｓｔｉｅ　ｃａｎｓヒｒｕＣ七。 ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｈｉｃｌｅｓ、ｂａｃセｅｌａ　ａｎｄ　ａ　ｍｅ ｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｃｅｃｒｏｐＬｎB ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｉｎ　５３６／２７．　４３５／３１７．　２５３　ａ ｎｄ　６８　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ。 ＩＩｌ、Ｃｌａｉｍｓ　３０−３２　ａｒａ　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ　ｅｕｓＬ ｏｎｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｉｎＣｌａｉｍ　２２　ｉ　ａ　 ｌｉｎｋｉｎｇ　ｃｌａｉｍ　ａｎｄ　ｗｏｕｌｄ　ｂｅ　ａｘａｍｉｎａｂｌ ｅ　ｗｉセｈ　ｅｉｔｈｅｒＧｒｏｕｐ　工Ｏｒ　Ｈ。

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. １．生物活性を有するポリペプチドをコードしており、宿主にとつてヘテロロー ガスである遺伝子と機能的に結合しているａｒａＢプロモーターの配列を含有し ている該宿主内で発現し得るポリヌクレオチド分子。
2. ２．該遺伝子が、酵素類、ホルモン類、抗体群、ヘモグロビンおよび構造タンバ ク質群からなる群から選ばれるポリペプチドである第１項に記載の分子。
3. ３．該遺伝子がセクロピンをコードしている第１項に記載の分子。
4. ４．ＤＮＡ分子である第１項に記載の分子。
5. ５．２本鎖ＤＮＡ分子である第１項に記載の分子。
6. ６．第１項に記載の分子を含有している複製可能な発現ビヒクル。
7. ７．プラスミドである第６項に記載のビヒクル。
8. ８．バクテリオフアージである第６項に記載のビヒクル。
9. ９．表現型選択マーカーを更に含有している第７項に記載のプラスミドビヒクル 。
10. １０．該マーカーが抗生物質耐性である第９項に記載のプラスミド。
11. １１．第１項に記載のポリヌクレオチド分子で形質転換された細菌。
12. １２．第６項に記載のビヒクルで形質転換された細菌。
13. １３．生活活性を有するヘテロローガスペプチドを発現する様に形質転換された 細菌内で該ペプチドを生産する方法であつて、 ａ）生物活性を有するペプチドをコードしているヘテロローガス遺伝子に機能的 に結合しているａｒａＢプロモーターを含有しているポリヌクレオチド分子を複 製可能な発現ビヒクルに挿入し、 ｂ）該ポリヌクレオチド分子を含有している発現ビヒクルで、該ペプチドを発現 し得る細菌を形質転換し、ｃ）形質転換された細菌を培養条件下で培養し、ｄ） 該培養から該ペプチドを回収することからなる方法。
14. １４．ある種の細菌にとつてヘテロローガスな遺伝子に機能的に結合しているａ ｒａＢプロモーターを含有しており、生物活性を有するヘテロローガスペプチド をコードしているポリヌクレオチド分子で形質転換した該細菌を培養することに より該ヘテローガスペプチドを生産する方法であつて、 ａ）該細菌にとつてヘテロローガスな遺伝子に機能的に結合しているａｒａＢプ ロモーターを含有しており、生物活性を有するペプチドをコードしているポリヌ クレオチド分子で形質転換した細菌を培養培地中、選択的増殖条件下、指数的成 長期に達するまでインキユベートし、 ｂ）工程ａ）の培養を新たな培養培地に移し、十分な時間該培養をインキユベー トして更に増殖させ、ｃ）工程ｂ）の培養を生産培地に接種し、最大細菌増殖を 達成するための発酵条件下、選択された細胞密度を達成するに十分な時間該培養 をインキユベートし、ｄ）有意な量の該ヘテロローガスペプチドを該培地中で生 産させるのに有効な量のＬ−アラビノースを添加し、そして ｅ）該ヘテロローガスペプチドを回収することからなる方法。
15. １５．セクロピンをコードしている第２遺伝子配列と機能的に結合している、本 来セクロピン感受性である細菌に対する生成する融合タンパク質の殺菌作用を抑 制し得るポリペプチドをコードしている第１遺伝子配列を含有している遺伝子構 築物。
16. １６．誘導プロモーターと機能的に結合しているセクロピンをコードしている遺 伝子配列を含有している遺伝子構築物。
17. １７．機能的に結合している誘導プロモーターを更に含有している第１５項に記 載の遺伝子構築物。
18. １８．セクロピンをコードしている遺伝子配列が合成配列である第１５項、第１ ６項または第１７項のいずれかに記載の遺伝子構築物。
19. １９．ポリペプチドが先導ポリペプチドである第１５項に記載の遺伝子構築物。
20. ２０．ポリペプチドをコードしている遺伝子配列が約３００〜５，０００塩基対 からなる第１５項に記載の遺伝子構築物。
21. ２１．セクロピンがセクロピンＡ、ＢまたはＣである第１５項、第１６項または 第１７項のいずれかに記載の遺伝子構築物。
22. ２２．ポリペプチドをコードしている遺伝子配列がａｒａＢ遺伝子をコードして いる第１５項に記載の遺伝子構築物。
23. ２３．第１５項または第１６項のいずれかに記載の遺伝子構築物を含んでいる、 宿主内で複製可能なビヒクル。
24. ２４．細菌内で発現し得る第２３項に記載のビヒクル。
25. ２５．セクロピンがＡ、ＢまたはＤである第２３項に記載のビヒクル。
26. ２６．第１５項、第１６項または第１７項のいずれかに記載の遺伝子構築物で形 質転換された宿主。
27. ２７．セクロピン感受性細菌である第２６項記載の宿主。
28. ２８．セクロピンがＡ、ＢまたはＤである第２６項に記載の宿主。
29. ２９．宿主内で発現し得るビヒクルで形質転換されたセクロピン感受性宿主であ つて、該ビヒクルが、生成する発現融合生産物中、該宿主に対するセクロピンの 殺菌作用を抑制し得るポリペプチドをコードしている遺伝子配列と機能的に結合 しているセクロピンをコードしている遺伝子配列を含有していることを特徴とす る宿主。
30. ３０．セクロピンをコードしている第１セグメントおよびポリペプチドをコード している第２セグメントを含有している融合タンパク質であつて、該融合タンパ ク質が該セクロピンの殺菌性を実質的に欠如する様に含有している融合タンパク 質。
31. ３１．セクロピンがＡ、ＢまたはＤである第３０項に記載の融合タンパク質。
32. ３２．両セグメントの間に選択的開裂部位を持つている第３０項に記載の融合タ ンパク質。
33. ３３．生物学的方法でセクロピンを生産する方法であつて、セクロピンをコード している第１遺伝子配列を、異なつたポリペプチドをコードしている第２遺伝子 配列と機能的に結合させて融合遺伝子を形成し、該融合遺伝子をセクロピン感受 性宿主に形質転換し、該形質転換宿主を培養して該宿主に対して毒性を持たない タンパク質複合体を生産せしめ、次いで該タンパク質複合体からセクロピンを回 収することからなる方法。
34. ３４．タンパク質複合体を、セクロピンと異なつたポリペプチドに開裂させる工 程を更に含んでなる第１８項に記載の方法。