JPH0928380A

JPH0928380A - ニトリラーゼ遺伝子発現に関わる調節因子およびその遺伝子

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Publication number: JPH0928380A
Application number: JP7185626A
Authority: JP
Inventors: Akira Shimizu; 昌清水; Tatsuhiko Kobayashi; 達彦小林
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1995-07-21
Filing date: 1995-07-21
Publication date: 1997-02-04
Anticipated expiration: 2015-07-21
Also published as: EP0759474A3; JP3709422B2; US5830693A; DE69635178T2; EP0759474B1; DE69635178D1; EP0759474A2

Abstract

(57)【要約】【解決手段】配列番号１で表されるアミノ酸配列を実
質的に含み、ニトリラーゼ遺伝子プロモーターを活性化
する作用を有する調節因子、該調節因子を実質的にコー
ドするＤＮＡを含む調節因子遺伝子、並びに前記調節因
子遺伝子、プロモーター領域を含むニトリラーゼ遺伝子
及びロドコッカス属に属する微生物の菌体内で複製増殖
可能なＤＮＡ領域を含む組換え体プラスミド、並びに前
記組換え体プラスミドにより形質転換された形質転換
体。【効果】本発明により、ニトリラーゼ遺伝子プロモー
ターを活性化する作用を有する調節因子を実質的にコー
ドするＤＮＡを含む調節因子遺伝子、該調節因子遺伝子
を含む組換え体プラスミド、及び該プラスミドにより形
質転換された形質転換体が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ニトリラーゼ遺伝
子の発現に関わる調節因子及び該調節因子をコードする
遺伝子ＤＮＡに関する。詳しくは、ロドコッカス・ロド
クロウスＪ１株に由来し、ニトリラーゼ遺伝子のプロモ
ーターを活性化する作用を有する調節因子、並びに該調
節因子をコードする遺伝子ＤＮＡ、ニトリラーゼ遺伝子
プロモーター及びニトリラーゼ遺伝子を含む組換え体プ
ラスミド、並びに該組換え体プラスミドＤＮＡにより形
質転換された形質転換体に関する。

【０００２】

【従来の技術】ニトリル化合物から対応する有機酸を製
造する際の触媒として、微生物又は微生物由来の酵素
（例えばニトリラーゼ）を用いることにより、温和な条
件で有機酸を生成させることができる（特開昭58-20199
2号公報、特開昭同61-40795号公報、特開平2-84198号公
報、3-251192各公報参照）。

【０００３】クローン化されたニトリラーゼ遺伝子を有
する組換え体によるニトリルの加水分解では、菌体内に
同遺伝子を多コピー存在させることができるため、微生
物の触媒能力を従来の方法と比べ飛躍的に増大させるこ
とが期待できる。既に、本発明者らはより高い触媒活性
を持つ微生物触媒を調製する目的で、ロドコッカス・ロ
ドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）Ｊ１株のニト
リラーゼ遺伝子をクローニングし、大腸菌ラクトースプ
ロモーターの下流に該遺伝子を挿入したプラスミドを作
製している（J. Biol. Chem. 267, 20746-20751 (199
2)）。該プラスミドが導入された大腸菌は、ＩＰＴＧ
（イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトシド）存在下で培
養することにより高いニトリラーゼ活性を示した。

【０００４】さらに、微生物触媒として利用価値を高め
るために、より機能性に優れたロドコッカス属に属する
微生物の組換え体を作製した。すなわち、ニトリラーゼ
遺伝子部分をロドコッカス属細菌−大腸菌複合プラスミ
ドベクター（特開平5-64589号及び特開平5-68566号公報
参照）に組み込み、これをロドコッカス属に属する微生
物に導入した。

【０００５】しかし、ニトリラーゼ遺伝子部分が導入さ
れただけの形質転換体では、ニトリラーゼ活性は得られ
なかった。そこで、ニトリラーゼ活性を得ることができ
るロドコッカス属に属する微生物の形質転換体の開発が
望まれていた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ロドコッカ
ス・ロドクロウスＪ１株に由来し、ニトリラーゼ遺伝子
プロモーターを活性化する作用を有する調節因子、並び
に該調節因子をコードする遺伝子ＤＮＡ、ニトリラーゼ
遺伝子プロモーター及びニトリラーゼ遺伝子を含む組換
え体プラスミド、並びに該組換え体ＤＮＡにより形質転
換された形質転換体を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ロドコッ
カス属に属する微生物を宿主とした場合に遺伝子の発現
が認められないのは、ニトリラーゼ遺伝子のプロモータ
ーが機能しておらず、プロモーターが機能するために必
要な調節因子をコードする遺伝子が形質転換体内に含ま
れていないためであると考えた。そこで、本発明者ら
は、かかる調節因子をコードする遺伝子がＪ１株染色体
ＤＮＡ上のいずれかの位置に存在するのではないかと考
え、鋭意研究を行った。その結果、ニトリラーゼ構造遺
伝子の下流にその存在を見いだし、かかる調節因子をコ
ードする遺伝子を含む組換え体を作製した結果、形質転
換されたロドコカッス属に属する微生物においてニトリ
ラーゼ遺伝子を発現させ、高いニトリラーゼ活性を得る
ことに成功し、本発明を完成するに至った。

【０００８】すなわち、本発明は、配列番号１で表され
るアミノ酸配列を実質的に含み、ニトリラーゼ遺伝子プ
ロモーターを活性化する作用を有する調節因子である。
該調節因子は、ニトリル類、例えばイソバレロニトリル
の存在により上記活性化作用が増強されるものである。
さらに、本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列
を実質的にコードするＤＮＡを含む調節因子遺伝子であ
る。

【０００９】さらに、本発明は、前記調節因子遺伝子、
プロモーター領域を含むニトリラーゼ遺伝子及びロドコ
ッカス属に属する微生物の菌体内で複製増殖可能なＤＮ
Ａ領域を含む組換え体プラスミドである。ロドコッカス
属に属する微生物の菌体内で複製増殖可能なＤＮＡ領域
としては、プラスミドpRC001、pRC002、pRC003及びpRC0
04からなる群から選ばれるものが挙げられる。

【００１０】ここで、アミノ酸配列を「実質的に含み」
又は「実質的にコードする」とあるのは、このペプチド
がニトリラーゼ遺伝子プロモーターを活性化する機能を
有する限り、そのアミノ酸配列におけるアミノ酸のいく
つかについて欠失、置換、付加等があってもよいことを
示すものである。従って、配列番号１で表されるアミノ
酸配列のうち、第１番目のアミノ酸であるメチオニン(M
et)が欠失等しているものなどもこのアミノ酸配列の変
化によるポリペプチドに包含される。さらに、ポリペプ
チドをコードする本発明のＤＮＡは、配列番号２で表さ
れる塩基配列を有するものの他、縮重コドンにおいての
み異なる同一のポリペプチドをコードする縮重異性体を
も包含するものである。

【００１１】さらに、本発明は、前記組換え体プラスミ
ドにより形質転換された形質転換体である。以下、本発
明を詳細に説明する。本発明の遺伝子は、ニトリラーゼ
遺伝子プロモーターを活性化させる作用を有する調節因
子（以下「調節因子」という）をコードする遺伝子を含
み、以下の工程により調製される。

【００１２】(1) ニトリラーゼ遺伝子および調節因子を
コードする遺伝子を含むプラスミドの作製ロドコッカッス・ロドクロウスＪ１株（以下「Ｊ１株」
という）由来のニトリラーゼ遺伝子は既に公知であり
（J. Biol. Chem. 267, 20746-20751 (1992)）、該遺伝
子は、ベクターpUC19 に挿入されたプラスミドpNJ10 と
して得られている。ニトリラーゼ遺伝子は、このプラス
ミドpNJ10 を適当な制限酵素、例えばPstIなどを用いて
消化することにより調製することができる。調製された
遺伝子断片中には、ニトリラーゼ遺伝子及び調節因子を
コードする遺伝子が含まれている。

【００１３】一方、ニトリラーゼ遺伝子を含む断片を連
結させるためのプラスミドとしては、例えば、複合プラ
スミドであるpK1、pK2、pK3又はpK4が挙げられる。ここ
で、pK1 は、大腸菌用プラスミドベクターpHSG299 と、
ロドコッカス属に属する微生物の菌体内で複製増殖可能
なＤＮＡ領域であるプラスミドpRC001とを結合させた複
合プラスミドであり、プラスミドpRC001の代わりにプラ
スミドpRC002、pRC003、pRC004を連結させた複合プラス
ミドがそれぞれpK2、pK3、pK4である（特開平5-68566号
公報参照）。本発明では、複合プラスミドpK4 を例示し
て説明する。

【００１４】次に、前記ニトリラーゼ遺伝子及び調節因
子をコードする遺伝子を含む断片と前記複合プラスミド
とを連結させる。連結は、公知のいずれの方法により行
ってもよい。例えば、市販のライゲーションキット（TA
KARAライゲーションキット（宝酒造社製））を用いて連
結させることができる。このようにして得られたプラス
ミドＤＮＡは、ニトリラーゼ遺伝子及び調節因子をコー
ドする遺伝子を含有するが、調節因子をコードする遺伝
子の存在位置は明らかではない。

【００１５】そこで、上記プラスミドＤＮＡを各種制限
酵素で処理して種々の長さをもつＤＮＡ断片を調製し、
得られるＤＮＡ断片をロドコッカス属に属する微生物に
導入して形質転換させ、いずれの長さのＤＮＡ断片を有
する形質転換体がニトリラーゼ遺伝子を発現するかを調
べることによりその存在位置を知ることができる。この
場合、ニトリラーゼをコードする遺伝子及び調節因子を
コードする遺伝子を含む遺伝子断片は、前記プラスミド
に正方向又は逆方向に２分の１の確率で連結させること
ができる。

【００１６】なお、Ｊ１株は、FERM BP-1478として工業
技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。ま
た、ニトリラーゼ遺伝子および調節因子をコードする遺
伝子を含むプラスミドpNJ10は、これを有する組換え体
E. coli JM109/pNJ10（FERM P-15048）として、複合プ
ラスミドベクターpK4はこれを有する組換え体R. rhodoc
hrous ATCC 12674/pK4（FERM BP-3731）として寄託され
ている。 (2) ロドコッカス属形質転換体の作製およびニトリラー
ゼ活性測定まず、(1) で調製されたプラスミドＤＮＡをロドコッカ
ス属に属する微生物、例えば、ロドコッカス・ロドクロ
ウス（ATCC12674）株に導入する。すなわち、ロドコッ
カス・ロドクロウス（ATCC12674）株の対数増殖期の細
胞を遠心分離により集菌し、洗浄後プラスミドＤＮＡと
混合する。次いで、公知方法、例えばエレクトロポレー
ション法等を用いてプラスミドＤＮＡを菌体内に導入す
る。形質転換体のスクリーニングは、カナマイシンを含
む培地で培養することにより行うことができ、カナマイ
シン耐性のコロニーとして目的とする形質転換体を得る
ことができる。

【００１７】次に、得られた上記形質転換体を、ポリペ
プトン、酵母エキス、麦芽エキス等を含む通常の培養培
地中で培養して菌懸濁液を得、該菌懸濁液に基質である
ベンゾニトリルを添加し、生成する安息香酸をHPLC等で
測定する。ニトリラーゼ遺伝子が発現した場合は、産生
されたニトリラーゼの働きによりベンゾニトリルは安息
香酸に変換される。従って、その生成の有無によりニト
リラーゼ遺伝子の発現を確認することができ、ひいては
調節因子遺伝子の発現の有無（ニトリラーゼ遺伝子プロ
モーターの活性化）を確認することができる。

【００１８】さらに、Ｊ１株ニトリラーゼの良好な誘導
物質として知られるイソバレロニトリルを添加すること
により、より高いニトリラーゼ活性を得ることができ
る。 (3) 塩基配列の決定 (2) により活性の認められた形質転換体から遺伝子を取
り出し、その塩基配列を決定する。塩基配列の決定法
は、公知方法のいずれでもよく、例えば、チェーンター
ミネーション法（Sanger F. Science 214, 1205-1210
(1980)）等により行うことができる。

【００１９】ここで、取り出した遺伝子のうち、BsmI部
位からニトリラーゼ遺伝子下流のPvuI部位までの塩基配
列（1286bp) は既に明らかとなっているため（J. Biol.
Chem. 267, 20746-20751 (1992)）、PvuI部位から更に
下流のEcoRI部位までの塩基配列を決定する。さらに、
決定された塩基配列をもとに、本発明の調節因子のアミ
ノ酸配列を推定することができる。

【００２０】

〔実施例１〕

(1) ニトリラーゼ遺伝子および調節遺伝子を含むプラス
ミドの作製Ｊ１株ニトリラーゼ遺伝子断片を含むプラスミドから該
遺伝子断片（5.4 kbのPstI断片）を切り出し、これを複
合プラスミドベクターpK4のPstI部位に挿入することに
より組換え体プラスミドを作成した。また、前記5.4 kb
の PstI断片よりも更に短い領域を挿入したプラスミド
も作製した。

【００２１】まず、Ｊ１株ニトリラーゼ遺伝子を含む5.
4 kbの PstI断片をベクターpUC19に挿入して得られたプ
ラスミドpNJ10（J. Biol. Chem. 267, 20746-20751 (19
92)）から、5.4 kbの PstI断片を切り出した。一方、Ps
tI切断pK4は以下のように調製した。pK4 10μLに対し、
制限酵素用緩衝液（10倍濃度）３μL、制限酵素PstIを
２μL、滅菌水15μLを加え、37℃で２時間反応させた。
反応液に等量のTE飽和フェノールを加えて撹拌後遠心
し、上層（水層）と下層に分離させた。上層についてこ
の操作を２回繰り返した後、同量のクロロホルムを加
え、同様の抽出操作を２回繰り返した。上層に３μLの
３M酢酸ナトリウムと90μLのエタノールを加え、-80℃
にて30分間放置後遠心し、乾燥してTEに溶解した。

【００２２】次に、TAKARAライゲーションキット（宝酒
造社製）を用いて、5.4 kb PstI断片を含むＤＮＡ断片
画分３μLを、前記PstI切断pK4 １μLと４℃で一晩反応
させることにより、5.4 kb PstI断片のpK4への挿入を行
った。反応終了後、本反応液を用いて大腸菌JM109株の
形質転換を行った。こうして得られた複数の形質転換体
からBirnboim and Doly (Nucleic Acids Res. 7, 1513
(1979))の方法によりプラスミドを調製し、pYHJ10、お
よび挿入断片がpYHJ10の挿入方向とは逆向きであるpYHJ
10Rを得た。

【００２３】また、同様にして、前記5.4 kbの PstI断
片よりも更に短い領域を挿入したプラスミドpYHJ20〜50
および挿入断片がそれぞれ逆向きであるpYHJ20R〜50Rを
作製した。用いた制限酵素及び手法は以下の通りであ
る。 pYHJ20及びpYHJ20R：Pst-EcoT22I断片をpK4のPstI部位
に挿入した。

【００２４】pYHJ30及びpYHJ30R：pNJ10をPstIで切断
後、T4 DNA polymeraseで末端平滑化した。次いでNaeI
で切断し、電気泳動（0.7 ％アガロース）により断片を
分離回収し、pK4をPstIで切断後、T4 DNA polymeraseで
末端平滑化した部位へ挿入した。 pYHJ40及びpYHJ40R：pNJ10をNheI、EcoT22Iで切断後、T
4 DNA polymeraseで末端平滑化した。電気泳動（0.7 ％
アガロース）により断片を分離回収し、pK4をPstIで切
断後、T4 DNA polymeraseで末端平滑化した部位へ挿入
した。

【００２５】pYHJ50及びpYHJ50R：pNJ10をNheIで切断
後、T4 DNA polymeraseで末端平滑化した。次いでNaeI
で切断し、電気泳動（0.7 ％アガロース）により断片を
分離回収し、pK4をPstIで切断後、T4 DNA polymeraseで
末端平滑化した部位へ挿入した。 (2) ロドコッカス属形質転換体の作製およびニトリラー
ゼ活性測定こうして得られたプラスミドをロドコッカス・ロドクロ
ウスATCC12674株に導入し、それぞれの形質転換体のニ
トリラーゼ活性を測定した。

【００２６】まず、プラスミドの菌体への導入は以下の
ように行った。ロドコッカス・ロドクロウスATCC12674
株の対数増殖期の細胞を遠心分離により集菌し、氷冷し
た滅菌水にて３回洗浄し、15％ PEG 6000（ポリエチレ
ングリコール6000）溶液に懸濁した（菌体濃度10⁹細胞/
mL 以上）。プラスミドＤＮＡ１μg を菌体懸濁液100μ
L に加え混合し、氷冷した。ジーンパルサー用のチャン
バーにＤＮＡと菌体の混合液を入れ、氷冷した後、静電
容量25μF、抵抗 400オーム、電場強度20 kV/cmで電気
パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷冷下10分間
静置し、37℃で５分間熱処理後、ＭＹ培地１mlを加え、
25℃で３時間振とうした。得られた処理液を50μg/mlカ
ナマイシン入りＭＹ寒天培地に塗布し、28℃で２日間培
養した。出現したコロニーが明らかにカナマイシン耐性
であることを、別に作成したカナマイシン入りＭＹ寒天
培地に塗布することにより確認した。

【００２７】こうして作製したロドコッカス属細菌の形
質転換体を、グリセロール 10 g、ポリペプトン５g、酵
母エキス３g、麦芽エキス３g、KH₂PO₄ １g 、K₂HPO₄ １
g、CoCl₂・6H₂O 0.01g、(pH7.0) / Lからなる培地にて2
8℃で２日間培養した。また、Ｊ１株ニトリラーゼの良
好な誘導物質として知られるイソバレロニトリル（0.5
及び１g /L）を添加した培養も同様に行った。

【００２８】培養液より遠心分離により集菌し、10mMリ
ン酸カリウム緩衝液(pH7.5)で洗浄後、１mMジチオスレ
イトールを含む0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)に菌
体を懸濁した。ニトリラーゼ活性測定は以下のように行
った。適当に水で希釈した菌体懸濁液0.25 mLに、0.1 m
Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を0.25mL、12 mMのベン
ゾニトリルを0.5 mLそれぞれ加え、20℃にて10分間反応
後、１N HCl を0.1 mL加えることにより反応を停止させ
た。酵素反応により生成した安息香酸をHPLCにより分析
した。

【００２９】測定結果を図１に示す。図１中、Ｊ１株Ｄ
ＮＡ断片上における２本の矢印（大矢印）は、ニトリラ
ーゼ遺伝子及び本発明において見いだされた調節遺伝子
の位置及び方向を示す。また、各プラスミドにおいて記
された領域はベクターpK4に挿入されたＪ１株由来のＤ
ＮＡ領域を示し、矢印（小矢印）はベクターpK4上のlac
プロモータの位置及び方向を示す。

【００３０】また、図１中のニトリラーゼ活性の強さ
は、「＋」が弱く、「＋＋＋」が最も強いことを意味す
る。「−」は活性が検出されなかったことを示す。プラ
スミドpYHJ10およびpYHJ10Rを有する形質転換体におい
てニトリラーゼ活性が検出され、特にイソバレロニトリ
ルを加えた場合には高い活性が認められた。ニトリラー
ゼ遺伝子の1.4 kb下流から先を欠失させたプラスミド
（pYHJ20およびpYHJ20R）や、さらにニトリラーゼ遺伝
子の上流側も欠失させたプラスミド（pYHJ40およびpYHJ
40R）を有する形質転換体においても同様の結果が得ら
れた。しかし、ニトリラーゼ遺伝子の約0.5 kb下流から
先を欠失させたプラスミド（pYHJ30およびpYHJ30R）で
は活性は全く検出されなかった。

【００３１】以上より、ニトリラーゼ構造遺伝子のすぐ
下流に、調節因子の遺伝子が存在することが明らかとな
った（図１参照）。pYHJ10R〜50Rを有する形質転換体に
ついて、どのプラスミドを有する形質転換体が高い活性
を有するか、その定量的試験を上記ニトリラーゼ活性測
定と同様の方法で行った。

【００３２】その結果を表１に示す。表１より、pYHJ20
Rを有する形質転換体が最も高い活性を示した。

【００３３】

【表１】 (3) 塩基配列の決定ニトリラーゼ遺伝子下流のPvuI部位までの塩基配列は既
に明らかとなっているため（J. Biol. Chem. 267, 2074
6-20751 (1992)）、PvuI部位よりEcoRI部位までの約1.4
kbの塩基配列を決定した。塩基配列の決定はTth DNA p
olymeraseを用いたチェーンターミネーション法（Sange
r F. Science 214, 1205-1210 (1980)）により行っ
た。

【００３４】結果を配列番号３に示す。配列番号３の塩
基配列を調べた結果、その配列中には、配列番号１に示
されるアミノ酸配列を持つ、唯一の長いオープンリーデ
ィングフレームが見いだされた。このオープンリーディ
ングフレームの塩基配列を配列番号２に示す。また、配
列番号２に示す塩基配列から推定されるアミノ酸配列を
配列番号１に示す。

【００３５】

【発明の効果】本発明により、ニトリラーゼ遺伝子プロ
モーターを活性化する作用を有する調節因子、該調節因
子を実質的にコードするＤＮＡを含む遺伝子、該遺伝子
を含む組換え体プラスミド、及び該プラスミドにより形
質転換された形質転換体が提供される。

【００３６】該形質転換体よりニトリラーゼが生産され
る。また、本調節遺伝子とニトリラーゼ遺伝子プロモー
ターの利用により、異種タンパク質の高発現化にも応用
できる。

【００３７】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：３１９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源生物名：ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rh
odochrous）株名：Ｊ１配列： Met Asn Thr Phe Phe Ser Ser Asp Gln Val Ser Ala Pro Asp Arg 1 5 10 15 Val Ala Leu Trp His Asp Val Ile Cys Arg Ser Tyr Val Pro Leu 20 25 30 Asn Ile Thr Leu Thr Ser Glu Gln Pro Phe Ile Gly Thr Val Ser 35 40 45 Thr Gly Asn Leu Gly Thr Val Arg Ile Ala Thr Ser Ser Ser Leu 50 55 60 Pro Gln Gln Ile Thr Arg Thr Arg Arg Leu Ile Arg Gln Asp Glu 65 70 75 Arg Glu Tyr Leu Met Val Gly Val Gln Ser Ala Gly His Ala Leu 80 85 90 Val Gln Gln His Gly Arg Thr Ala Arg Val Gly Arg Gly Gly Leu 95 100 105 Val Phe Trp Asp Thr Arg His Pro Tyr Asp Ile Leu Phe Pro Thr 110 115 120 Asp Trp Arg Met Ser Val Phe Gln Phe Pro Arg Tyr Ser Phe Gly 125 130 135 Phe Thr Glu Asp Phe Ile Gly Arg Met Thr Ala Val Asn Val Gly 140 145 150 Gly Asp Arg Gly Ile Gly Arg Val Val Ser Ser Phe Met Thr Ser 155 160 165 Ile Asn Asp Ala Thr Asp Ala Gly Asp Leu Ala Glu Val Ala Ser 170 175 180 Leu His Asn Ser Ala Val Asp Leu Leu Ser Ala Ala Ile Arg Thr 185 190 195 Glu Leu Ala Asp Gln Ala Ala Ala Ser Asp Gly Leu Leu Glu Cys 200 205 210 Val Leu Ala Tyr Ile Arg Gln Asn Leu Ala Asp Pro Asn Leu Cys 215 220 225 Ala Ser Gln Ile Ala Ala Glu His Asn Val Ser Val Arg Thr Leu 230 235 240 His Arg Leu Phe Ser Ala Thr Gly Gln Gly Val Ala Glu His Ile 245 250 255 Arg Asn Leu Arg Leu Glu Arg Ile Lys Thr Glu Leu Ala Asp Pro 260 265 270 Thr Ser Arg Arg Tyr Thr Ile Ser Ala Leu Ala Arg Lys Trp Gly 275 280 285 Phe Leu Asp Pro Ser Thr Phe Ser Arg Ala Phe Lys Asp Ala Tyr 290 295 300 Gly Ile Thr Ala Arg Glu Trp Ala Ala Ser Ala Ser Ala Ser Pro 305 310 315 Thr Glu Val Ser 319

【００３８】配列番号：２配列の長さ：９６０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状起源生物名：ロドコッカスロドクロウス（Rhodococcus rh
odochrous）株名：Ｊ１配列： ATG AAC ACT TTC TTC TCC TCA GAC CAG GTC TCG GCG CCC GAT CGC 45 GTC GCG CTC TGG CAC GAT GTC ATC TGC CGT AGC TAT GTC CCG CTC 90 AAC ATC ACC CTC ACG AGC GAG CAA CCC TTC ATC GGT ACG GTC TCG 135 ACG GGC AAC TTG GGC ACG GTA CGT ATC GCG ACG TCC TCG TCA CTG 180 CCC CAA CAG ATC ACC CGC ACT CGT CGC TTG ATC AGG CAG GAC GAG 225 CGT GAG TAC CTC ATG GTT GGG GTG CAG TCC GCC GGC CAT GCA CTC 270 GTG CAG CAG CAC GGC AGA ACT GCA CGA GTC GGT CGC GGT GGA CTG 315 GTC TTC TGG GAC ACC CGC CAT CCC TAC GAC ATC CTC TTC CCG ACA 360 GAC TGG AGG ATG AGC GTA TTC CAG TTC CCG CGA TAC TCT TTC GGC 405 TTC ACC GAA GAC TTC ATC GGC AGG ATG ACC GCG GTG AAC GTC GGG 450 GGC GAT CGC GGT ATC GGC CGA GTG GTT TCA TCC TTC ATG ACA AGC 495 ATC AAC GAT GCG ACC GAC GCA GGA GAC TTG GCG GAG GTA GCT TCA 540 CTC CAC AAC AGT GCT GTC GAT CTT CTG TCA GCG GCG ATA CGG ACC 585 GAG CTT GCC GAT CAA GCC GCC GCC TCC GAC GGC CTA CTC GAG TGT 630 GTG CTC GCG TAT ATC CGA CAG AAC CTG GCC GAC CCG AAC CTG TGT 675 GCC TCA CAG ATC GCG GCG GAA CAC AAC GTC TCT GTG CGG ACC CTC 720 CAC CGA CTG TTC TCG GCC ACG GGA CAG GGC GTG GCC GAA CAC ATC 765 CGT AAC CTC CGA CTC GAG CGC ATC AAG ACT GAG CTG GCA GAC CCA 810 ACG AGC CGG CGA TAT ACG ATC AGC GCT TTG GCG AGA AAA TGG GGG 855 TTC CTC GAT CCC TCA ACG TTC TCA CGC GCG TTC AAA GAC GCC TAC 900 GGC ATC ACT GCC CGA GAG TGG GCG GCT TCT GCA TCA GCA TCA CCG 945 ACG GAG GTT TCG TAG 960

【００３９】配列番号：３配列の長さ：1390 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状起源生物名：ロドコッカスロドクロウス（Rhodococcus rh
odochrous）株名：Ｊ１配列： CGATCGCAGC GAGGCTGCCC GCCGGTAACC CCGATAGGTC CACACCACGT 50 ATCCGGCCGG TTACACCTTC TCGACAGGGG CAATCGAGAC CGAGCCCGGC 100 ATCGCGATTA CGGCTACCCT GAAAAGAGCA ATGAACGGGG TGAGCACCAG 150 GTAGGTCGAT GAACACTTTC TTCTCCTCAG ACCAGGTCTC GGCGCCCGAT 200 CGCGTCGCGC TCTGGCACGA TGTCATCTGC CGTAGCTATG TCCCGCTCAA 250 CATCACCCTC ACGAGCGAGC AACCCTTCAT CGGTACGGTC TCGACGGGCA 300 ACTTGGGCAC GGTACGTATC GCGACGTCCT CGTCACTGCC CCAACAGATC 350 ACCCGCACTC GTCGCTTGAT CAGGCAGGAC GAGCGTGAGT ACCTCATGGT 400 TGGGGTGCAG TCCGCCGGCC ATGCACTCGT GCAGCAGCAC GGCAGAACTG 450 CACGAGTCGG TCGCGGTGGA CTGGTCTTCT GGGACACCCG CCATCCCTAC 500 GACATCCTCT TCCCGACAGA CTGGAGGATG AGCGTATTCC AGTTCCCGCG 550 ATACTCTTTC GGCTTCACCG AAGACTTCAT CGGCAGGATG ACCGCGGTGA 600 ACGTCGGGGG CGATCGCGGT ATCGGCCGAG TGGTTTCATC CTTCATGACA 650 AGCATCAACG ATGCGACCGA CGCAGGAGAC TTGGCGGAGG TAGCTTCACT 700 CCACAACAGT GCTGTCGATC TTCTGTCAGC GGCGATACGG ACCGAGCTTG 750 CCGATCAAGC CGCCGCCTCC GACGGCCTAC TCGAGTGTGT GCTCGCGTAT 800 ATCCGACAGA ACCTGGCCGA CCCGAACCTG TGTGCCTCAC AGATCGCGGC 850 GGAACACAAC GTCTCTGTGC GGACCCTCCA CCGACTGTTC TCGGCCACGG 900 GACAGGGCGT GGCCGAACAC ATCCGTAACC TCCGACTCGA GCGCATCAAG 950 ACTGAGCTGG CAGACCCAAC GAGCCGGCGA TATACGATCA GCGCTTTGGC 1000 GAGAAAATGG GGGTTCCTCG ATCCCTCAAC GTTCTCACGC GCGTTCAAAG 1050 ACGCCTACGG CATCACTGCC CGAGAGTGGG CGGCTTCTGC ATCAGCATCA 1100 CCGACGGAGG TTTCGTAGGA AGAGCCCGGT CTCCGGCCTG CCCTTGTTCG 1150 CTTGCGCACC GTTCGGTCCG TCGCTTCCGA TGAAGCCGGA GCCGGCAGGT 1200 TGGCTTCCTC CCGCGATCCG ATCGCTCGGG GATTGTCCGG GGCACCGCTG 1250 GTGACCTCCA GTGCTGCTCC GGCCTGGTGT CCGCGATCGG TGTGCCCCTG 1300 CCCCGATGCA TCCGGGCCGT GATGCCAGTG CTCGGCAGGA CCCACCGGCG 1350 ACGACGGCCA GCATGACCCA TGGACCGGTC GGTCGAATTC 1390

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｊ１株ニトリラーゼ遺伝子周辺の制限酵素地
図、本発明において作製されたプラスミド、およびそれ
らのプラスミドを含む形質転換体のニトリラーゼ活性を
示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/78 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１で表されるアミノ酸配列を実
質的に含み、ニトリラーゼ遺伝子プロモーターを活性化
する作用を有する調節因子。
【請求項２】ニトリル類の存在により、ニトリラーゼ
遺伝子プロモーターを活性化する作用が増強される請求
項１記載の調節因子。
【請求項３】ニトリル類がイソバレロニトリルである
請求項２記載の調節因子。
【請求項４】配列番号１で表されるアミノ酸配列を実
質的にコードするＤＮＡを含む調節因子遺伝子。
【請求項５】配列番号１で表されるアミノ酸配列を実
質的にコードするＤＮＡが配列番号２で表されるもので
ある請求項４記載の調節因子遺伝子。
【請求項６】請求項４又は５記載の調節因子遺伝子、
プロモーター領域を含むニトリラーゼ遺伝子及びロドコ
ッカス属に属する微生物の菌体内で複製増殖可能なＤＮ
Ａ領域を含む組換え体プラスミド。
【請求項７】ロドコッカス属に属する微生物の菌体内
で複製増殖可能なＤＮＡ領域が、プラスミドpRC001、pR
C002、pRC003及びpRC004からなる群から選ばれるもので
ある、請求項６記載の組換え体プラスミド。
【請求項８】請求項６又は７記載の組換え体プラスミ
ドにより形質転換された形質転換体。