JP2842693B2 - 宿主細胞中でのタンパク質の過剰発現のための方法およびｄｎａ発現システム - Google Patents
宿主細胞中でのタンパク質の過剰発現のための方法およびｄｎａ発現システムInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、細菌宿主細胞中でのタンパク質の過剰発現
を可能にする組換え発現システムに関する。
を可能にする組換え発現システムに関する。
背景技術 細菌宿主細胞における組換えヘテロローガス（hetero
logous）タンパク質の生成が、しばしば商業的に引き合
う量のタンパク質を生成するために試みられる。産業用
の目的のために、１〜10％またはそれより多い総タンパ
ク質のレベルで、ヘテロローガスタンパク質の発現を得
ることが、しばしば望まれている。したがって、これら
のタンパク質の過剰発現が不可欠である。あいにく、大
腸菌（E.coli）などの細菌宿主細胞は、このようなタン
パク質を生成する際に、しばしば理想的ではない。タン
パク質は、過剰発現するとき、しばしば折り畳まれて不
溶性の「封入体」を形成し、または細胞に致死的であり
得る。封入体は細胞の細胞質中に見られる。封入体は、
溶解および遠心分離により細胞から単離され得るが、そ
れに続くタンパク質の精製には、封入体を溶解する工程
およびタンパク質を再生する工程が包含される。再生は
必ずしも効果的または有効ではない。種々の手段がこれ
らの問題を解決するために求められてきた。しかし、普
遍的に有用な方法はない。
logous）タンパク質の生成が、しばしば商業的に引き合
う量のタンパク質を生成するために試みられる。産業用
の目的のために、１〜10％またはそれより多い総タンパ
ク質のレベルで、ヘテロローガスタンパク質の発現を得
ることが、しばしば望まれている。したがって、これら
のタンパク質の過剰発現が不可欠である。あいにく、大
腸菌（E.coli）などの細菌宿主細胞は、このようなタン
パク質を生成する際に、しばしば理想的ではない。タン
パク質は、過剰発現するとき、しばしば折り畳まれて不
溶性の「封入体」を形成し、または細胞に致死的であり
得る。封入体は細胞の細胞質中に見られる。封入体は、
溶解および遠心分離により細胞から単離され得るが、そ
れに続くタンパク質の精製には、封入体を溶解する工程
およびタンパク質を再生する工程が包含される。再生は
必ずしも効果的または有効ではない。種々の手段がこれ
らの問題を解決するために求められてきた。しかし、普
遍的に有用な方法はない。
細菌中で外来タンパク質の可溶性蓄積を改善する１つ
の方法は、融合タンパク質としてそれらを発現すること
であり、融合パートナーはあらゆる他のタンパク質であ
り得る。その後、融合パートナーは酵素的または化学的
手段により目的のタンパク質から開裂される。例えば、
ユビキチン（ubiquitin）融合タンパク質の場合は、目
的のタンパク質はユビキチンヒドロラーゼによりユビキ
チンから開列される。次いで、開列したユビキチンは目
的のタンパク質から離れて精製される。
の方法は、融合タンパク質としてそれらを発現すること
であり、融合パートナーはあらゆる他のタンパク質であ
り得る。その後、融合パートナーは酵素的または化学的
手段により目的のタンパク質から開裂される。例えば、
ユビキチン（ubiquitin）融合タンパク質の場合は、目
的のタンパク質はユビキチンヒドロラーゼによりユビキ
チンから開列される。次いで、開列したユビキチンは目
的のタンパク質から離れて精製される。
ユビキチン融合タンパク質をコードするベクターの使
用は、酵母中でのヘテロローガスな遺伝子の発現を数百
倍にまで増加させることが見いだされた。Eckerら（198
9）J.Biol.Chem. 264:7715−7719。
用は、酵母中でのヘテロローガスな遺伝子の発現を数百
倍にまで増加させることが見いだされた。Eckerら（198
9）J.Biol.Chem. 264:7715−7719。
Bachmairらの国際公開第WO 88/02406号には、ユビキ
チン融合タンパク質中のユビキチンのカルボキシ末端に
融合したタンパク質のアミノ末端アミノ酸残基の重要性
が記載されている。プロリンを除くすべてのアミノ酸残
基は、融合タンパク質からのユビキチンの開裂を可能に
する。目的のタンパク質のための規定されたアミノ末端
を生成するので、特異的開裂は重要である。Varshavsky
ら（1991）J.Biol.Chem.，266:12021−12028は、この機
能を行い得る酵母由来のユビキチンヒドロラーゼを記載
している。Liuらの国際公開第WO 89/12678号には、異な
るユビキチンヒドロラーゼについての精製スキームが記
載されている。
チン融合タンパク質中のユビキチンのカルボキシ末端に
融合したタンパク質のアミノ末端アミノ酸残基の重要性
が記載されている。プロリンを除くすべてのアミノ酸残
基は、融合タンパク質からのユビキチンの開裂を可能に
する。目的のタンパク質のための規定されたアミノ末端
を生成するので、特異的開裂は重要である。Varshavsky
ら（1991）J.Biol.Chem.，266:12021−12028は、この機
能を行い得る酵母由来のユビキチンヒドロラーゼを記載
している。Liuらの国際公開第WO 89/12678号には、異な
るユビキチンヒドロラーゼについての精製スキームが記
載されている。
ペプチジル−プロリル シス−トランスイソメラーゼ
（PPI）は、プロリン残基のアミノ側のペプチド結合の
ローテーションを触媒し、そしてインビボのタンパク質
の折り畳みを容易にする。PPIの１つのファミリーは
「シクロフィリン（cyclophilin）」と呼ばれる。シク
ロフィリンは、免疫抑制剤であるシクロスポリンＡに高
親和性で結合する。他のPPIは、免疫抑制剤であるFK506
に結合するFKBPである。Standaertら（1990）Nature，3
46:671−674。さらに他のPPIは、ラピマイシンおよびFK
506の両方に結合する酵母RBPIである。Koltinら（199
1）Mol.Cell.Biol.，11:1718−1723。
（PPI）は、プロリン残基のアミノ側のペプチド結合の
ローテーションを触媒し、そしてインビボのタンパク質
の折り畳みを容易にする。PPIの１つのファミリーは
「シクロフィリン（cyclophilin）」と呼ばれる。シク
ロフィリンは、免疫抑制剤であるシクロスポリンＡに高
親和性で結合する。他のPPIは、免疫抑制剤であるFK506
に結合するFKBPである。Standaertら（1990）Nature，3
46:671−674。さらに他のPPIは、ラピマイシンおよびFK
506の両方に結合する酵母RBPIである。Koltinら（199
1）Mol.Cell.Biol.，11:1718−1723。
シクロフィリンをコードする遺伝子は、ヒト、ラッ
ト、ハムスター、酵母、Neurospora crassa、Drosophil
a melanogaster、およびトマトを含む種々の生物体中で
発現される。大腸菌（E.coli）で発現されるトマトシク
ロフィリン遺伝子によりコードされるタンパク質は、主
に封入体中で見られたが、いくつかの活性は可溶性画分
中で検出された。Gasserら（1990）Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,87:9519−9523。大腸菌（E.coli）中でのヒトシ
クロフィリンのクローニングおよび発現もまた報告され
ている。Holtzmanら（1991）J.Biol.Chem.,266:2474−2
479。大腸菌（E.coli）中でのクローン化ヒトシクロフ
ィリンの発現は、可溶性画分中にシクロフィリンの40％
が生じることを示した。Liuら（1990）Proc.Natl.Acad.
Sci.USA，87:2304−2308。
ト、ハムスター、酵母、Neurospora crassa、Drosophil
a melanogaster、およびトマトを含む種々の生物体中で
発現される。大腸菌（E.coli）で発現されるトマトシク
ロフィリン遺伝子によりコードされるタンパク質は、主
に封入体中で見られたが、いくつかの活性は可溶性画分
中で検出された。Gasserら（1990）Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,87:9519−9523。大腸菌（E.coli）中でのヒトシ
クロフィリンのクローニングおよび発現もまた報告され
ている。Holtzmanら（1991）J.Biol.Chem.,266:2474−2
479。大腸菌（E.coli）中でのクローン化ヒトシクロフ
ィリンの発現は、可溶性画分中にシクロフィリンの40％
が生じることを示した。Liuら（1990）Proc.Natl.Acad.
Sci.USA，87:2304−2308。
「ロタマーゼ（rotamase）」という大腸菌（E.coli）
PPIは、分泌されたタンパク質の再折り畳みにおいて機
能すると考えられる周辺質空間（periplasmic space）
に局在されていることが見いだされている。LiuおよびW
alsh（1990）Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87:4028−403
2。LiuおよびWalshは大腸菌（E.coli）PPIをクローン化
しそして過剰発現させた；彼らは、それがヒトシクロフ
ィリンとホモローガス（homologous）であるがシクロス
ポリンＡに感受性ではないことを見いだした。さらに、
この大腸菌（E.coli）遺伝子は、このタンパク質が分泌
されることを示すシグナルペプチドをコードする。
PPIは、分泌されたタンパク質の再折り畳みにおいて機
能すると考えられる周辺質空間（periplasmic space）
に局在されていることが見いだされている。LiuおよびW
alsh（1990）Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87:4028−403
2。LiuおよびWalshは大腸菌（E.coli）PPIをクローン化
しそして過剰発現させた；彼らは、それがヒトシクロフ
ィリンとホモローガス（homologous）であるがシクロス
ポリンＡに感受性ではないことを見いだした。さらに、
この大腸菌（E.coli）遺伝子は、このタンパク質が分泌
されることを示すシグナルペプチドをコードする。
発明の要旨 本発明は、組換えDNAベクターおよびその使用方法に
関する。このベクターは、細菌宿主細胞中でのタンパク
質の過剰発現を可能にする。このベクターは、必要に応
じてユビキチンに融合した目的のタンパク質をコードす
る第１の遺伝子、および細胞質ペプチジル−プロリル
シス−トランスイソメラーゼをコードする第２の遺伝子
を含む。第１および第２の遺伝子の同時発現は、目的の
タンパク質の過剰発現を可能にする。試験したすべての
場合において、タンパク質の可溶性の程度もまた上昇し
た。
関する。このベクターは、細菌宿主細胞中でのタンパク
質の過剰発現を可能にする。このベクターは、必要に応
じてユビキチンに融合した目的のタンパク質をコードす
る第１の遺伝子、および細胞質ペプチジル−プロリル
シス−トランスイソメラーゼをコードする第２の遺伝子
を含む。第１および第２の遺伝子の同時発現は、目的の
タンパク質の過剰発現を可能にする。試験したすべての
場合において、タンパク質の可溶性の程度もまた上昇し
た。
図面の簡単な説明 図１は、大腸菌（E.coli）W3110DE3中でのヘテロロー
ガスな遺伝子発現に使用したプラスミドベクターを示
す、線図である。図１は実施例１で説明されている。
ガスな遺伝子発現に使用したプラスミドベクターを示
す、線図である。図１は実施例１で説明されている。
図２は、大腸菌（E.coli）W3110DE3中でのヘテロロー
ガスな遺伝子発現に使用したベクターを示す、線図であ
る。図２は実施例１で説明されている。
ガスな遺伝子発現に使用したベクターを示す、線図であ
る。図２は実施例１で説明されている。
図３は、示されたような種々の組換えDNA構築物を有
する大腸菌（E.coli）W3110DE3の平均世代時間を要約し
ている。図３は実施例２で説明されている。
する大腸菌（E.coli）W3110DE3の平均世代時間を要約し
ている。図３は実施例２で説明されている。
図４〜９は、IPTGでの誘導前（０）または誘導後
（２）の全細胞抽出物（WCL）、ならびに可溶性画分
（Ｓ）および不溶性画分（Ｉ）を含む誘導された細胞か
らの抽出物のクーマシー染色ゲルを示す。それに含まれ
ている中央のＭのパネルは分子量マーカーである。図４
は、プラスミド16926（左のパネル）および16927（右の
パネル）を用いて得られた結果を示し、これは30℃培養
物からのユビキチン−IGF−Ｉ融合タンパク質の可溶性
を証明する。
（２）の全細胞抽出物（WCL）、ならびに可溶性画分
（Ｓ）および不溶性画分（Ｉ）を含む誘導された細胞か
らの抽出物のクーマシー染色ゲルを示す。それに含まれ
ている中央のＭのパネルは分子量マーカーである。図４
は、プラスミド16926（左のパネル）および16927（右の
パネル）を用いて得られた結果を示し、これは30℃培養
物からのユビキチン−IGF−Ｉ融合タンパク質の可溶性
を証明する。
図５は、プラスミド12880を用いて得られた結果を示
し、これは、30℃培養物からのmet−IGFBP−３融合タン
パク質の可溶性を証明する。
し、これは、30℃培養物からのmet−IGFBP−３融合タン
パク質の可溶性を証明する。
図６は、プラスミド12875を用いて得られた結果を示
し、これは、30℃培養物からのユビキチン−IGFBP−３
融合タンパク質の優れた可溶性を証明する。
し、これは、30℃培養物からのユビキチン−IGFBP−３
融合タンパク質の優れた可溶性を証明する。
図７は、プラスミド16921を用いて得られた結果を示
し、これは、30℃培養物からのタイプII TGF−βレセプ
ターの可溶性細胞外ドメインとのユビキチンの融合の高
い可溶性を証明する。
し、これは、30℃培養物からのタイプII TGF−βレセプ
ターの可溶性細胞外ドメインとのユビキチンの融合の高
い可溶性を証明する。
図８は、プラスミド16918を用いて得られた結果を示
し、これは、37℃培養物からのmet−TGF−β２融合タン
パク質の比較的低い可溶性を証明する。
し、これは、37℃培養物からのmet−TGF−β２融合タン
パク質の比較的低い可溶性を証明する。
図９は、プラスミド16920を用いて得られた結果を示
し、これは、ユビキチン−TGF−β２融合物が、特にシ
クロフィリン遺伝子を用いたときに、より可溶性である
ことを証明する。
し、これは、ユビキチン−TGF−β２融合物が、特にシ
クロフィリン遺伝子を用いたときに、より可溶性である
ことを証明する。
図10は、ユビキチンヒドロラーゼYUH−１でのユビキ
チン−TGF−β２の開裂前後のクーマシー染色ゲルを示
し、これは、ユビキチン−TGF−β２融合タンパク質が
ユビキチンヒドロラーゼYUH−１で開裂されることを証
明する。
チン−TGF−β２の開裂前後のクーマシー染色ゲルを示
し、これは、ユビキチン−TGF−β２融合タンパク質が
ユビキチンヒドロラーゼYUH−１で開裂されることを証
明する。
発明の詳細な説明 これまでは細菌宿主細胞内で可溶性形態で過剰発現お
よび蓄積され得なかった遺伝子が、現在では、本明細書
中に記載されているようなベクターによりコードされる
とき、非常によく発現され得ることを、見い出した。
よび蓄積され得なかった遺伝子が、現在では、本明細書
中に記載されているようなベクターによりコードされる
とき、非常によく発現され得ることを、見い出した。
本発明は、必要に応じてユビキチンに融合した目的の
タンパク質をコードする第１の遺伝子、および細胞質ペ
プチジル−プロリル シス−トランスイソメラーゼ（PP
I）をコードする第２の遺伝子を含む組換えDNAベクター
を包含する。第１および第２の遺伝子の同時発現は、目
的のタンパク質の過剰発現を可能にする。DNAベクター
は、実質的に純粋なポリヌクレオチドである。
タンパク質をコードする第１の遺伝子、および細胞質ペ
プチジル−プロリル シス−トランスイソメラーゼ（PP
I）をコードする第２の遺伝子を含む組換えDNAベクター
を包含する。第１および第２の遺伝子の同時発現は、目
的のタンパク質の過剰発現を可能にする。DNAベクター
は、実質的に純粋なポリヌクレオチドである。
「単離された」または「実質的に純粋な」ポリヌクレ
オチドは、例えば、RNA、DNA、または混合されたポリマ
ーなどの、天然の配列が自然に伴う他のポリヌクレオチ
ド配列から実質的に分離されているポリヌクレオチドで
ある。この用語は、天然に存在する環境から取り出され
たポリヌクレオチド配列を含み、そして組換えまたはク
ローン換DNA単離物および化学的に合成されたアナログ
またはヘテロローガスシステムにより生物学的に合成さ
れたアナログを含む。
オチドは、例えば、RNA、DNA、または混合されたポリマ
ーなどの、天然の配列が自然に伴う他のポリヌクレオチ
ド配列から実質的に分離されているポリヌクレオチドで
ある。この用語は、天然に存在する環境から取り出され
たポリヌクレオチド配列を含み、そして組換えまたはク
ローン換DNA単離物および化学的に合成されたアナログ
またはヘテロローガスシステムにより生物学的に合成さ
れたアナログを含む。
ポリヌクレオチドは、天然の状態でまたは当業者に公
知の方法により操作されるとき、そのポリヌクレオチド
が転写および／または翻訳されてポリペプチドまたはそ
のフラグメントを生成し得る場合に、ポリペプチドを
「コードする」という。このようなポリヌクレオチドの
アンチセンス鎖もまた、ポリペプチドをコードするとい
う。
知の方法により操作されるとき、そのポリヌクレオチド
が転写および／または翻訳されてポリペプチドまたはそ
のフラグメントを生成し得る場合に、ポリペプチドを
「コードする」という。このようなポリヌクレオチドの
アンチセンス鎖もまた、ポリペプチドをコードするとい
う。
ポリヌクレオチド配列は、他のポリヌクレオチド配列
と機能的関係に置かれているとき、作動可能に連結され
ている。例えば、プロモーターがコーディング配列の転
写または発現に影響を与える場合、プロモーターはコー
ディング配列に作動可能に連結されている。一般に、作
動可能に連結されているとは、連結された配列が、隣接
し、そして２つのタンパク質コーディング領域を接合す
るために必要なところでは、隣接しおよび読み取り枠が
合っていることの両方をいう。しかし、エンハンサーな
どの特定の遺伝要素が、離れて、すなわち隣接せずに作
動可能に連結され得ることは、周知である。
と機能的関係に置かれているとき、作動可能に連結され
ている。例えば、プロモーターがコーディング配列の転
写または発現に影響を与える場合、プロモーターはコー
ディング配列に作動可能に連結されている。一般に、作
動可能に連結されているとは、連結された配列が、隣接
し、そして２つのタンパク質コーディング領域を接合す
るために必要なところでは、隣接しおよび読み取り枠が
合っていることの両方をいう。しかし、エンハンサーな
どの特定の遺伝要素が、離れて、すなわち隣接せずに作
動可能に連結され得ることは、周知である。
用語「組換え」ポリヌクレオチドとは、遺伝子工学的
手法によるまたは化学的合成による、ポリヌクレオチド
の単離されたセグメントの人工的操作により達成された
配列の、２つの別の分離されたセグメントの組み合せに
より作られているポリヌクレオチドをいう。そのように
することにより、所望の機能のポリヌクレオチドセグメ
ントを共に連結して所望の機能の組み合せを生成し得
る。
手法によるまたは化学的合成による、ポリヌクレオチド
の単離されたセグメントの人工的操作により達成された
配列の、２つの別の分離されたセグメントの組み合せに
より作られているポリヌクレオチドをいう。そのように
することにより、所望の機能のポリヌクレオチドセグメ
ントを共に連結して所望の機能の組み合せを生成し得
る。
大量のポリヌクレオチドは適切な宿主細胞中での複製
により生成され得る。タンパク質またはそのフラグメン
トをコードする天然または合成DNAフラグメントは、原
核生物または真核生物細胞中に導入されおよび複製され
得る、組換えポリヌクレオチド構築物、代表的にはDNA
構築物中に導入される。通常、この構築物は、酵母また
は細菌などの単細胞宿主中での複製に適切である；きさ
き、この構築物はまた、真核生物細胞のゲノム内に、組
み込まれまたは組み込まれることなく導入されることが
意図され得る。
により生成され得る。タンパク質またはそのフラグメン
トをコードする天然または合成DNAフラグメントは、原
核生物または真核生物細胞中に導入されおよび複製され
得る、組換えポリヌクレオチド構築物、代表的にはDNA
構築物中に導入される。通常、この構築物は、酵母また
は細菌などの単細胞宿主中での複製に適切である；きさ
き、この構築物はまた、真核生物細胞のゲノム内に、組
み込まれまたは組み込まれることなく導入されることが
意図され得る。
ポリヌクレオチドはまた、BeaucageおよびCarruthers
（1981）Tet.Lett.，22:1859−1862に記載されたホスホ
ールアミダイト法およびMatteucciら（1981）J.Am.Che
m.Soc.，103:3185に従ったトリエステル法の含むがこれ
らに限定されない化学的合成法により生成され得る。二
本鎖フラグメントは、相補鎖を合成して適切な条件下で
鎖を共にアニールすることによる、あるいは適切なプラ
イマー配列とともにDNAポリメラーゼを用いて相補鎖を
加えることによるいずれかの化学的合成の一本鎖生成物
から得られ得る。
（1981）Tet.Lett.，22:1859−1862に記載されたホスホ
ールアミダイト法およびMatteucciら（1981）J.Am.Che
m.Soc.，103:3185に従ったトリエステル法の含むがこれ
らに限定されない化学的合成法により生成され得る。二
本鎖フラグメントは、相補鎖を合成して適切な条件下で
鎖を共にアニールすることによる、あるいは適切なプラ
イマー配列とともにDNAポリメラーゼを用いて相補鎖を
加えることによるいずれかの化学的合成の一本鎖生成物
から得られ得る。
宿主中への導入のために調製されたDNA構築物は、代
表的には、所望のポリペプチドをコードする意図された
DNAフラグメントを含む、宿主により認識される複製シ
ステムを含み、そして好ましくは、ポリペプチドをコー
ドするセグメントに作動可能に連結された転写および翻
訳開始調節配列も含む。発原システム（発現ベクター）
には、例えば、複製起点または自己複製配列（ARS）お
よび発現制御配列、プロモーター、エンハンサーおよび
必要なプロセシング情報部位（リボソーム結合部位、RN
Aスプライス部位、ポリアデニル化部位、転写終止配
列、およびmRNA安定化配列など）が含まれ得る。シグナ
ルペプチドもまた、適切な場所では、同一または関連し
た種の分泌されたオリペプチド由来で含まれ得、タンパ
ク質が細胞膜を横切りおよび／または留まる、あるいは
細胞から分泌されることを可能にする。
表的には、所望のポリペプチドをコードする意図された
DNAフラグメントを含む、宿主により認識される複製シ
ステムを含み、そして好ましくは、ポリペプチドをコー
ドするセグメントに作動可能に連結された転写および翻
訳開始調節配列も含む。発原システム（発現ベクター）
には、例えば、複製起点または自己複製配列（ARS）お
よび発現制御配列、プロモーター、エンハンサーおよび
必要なプロセシング情報部位（リボソーム結合部位、RN
Aスプライス部位、ポリアデニル化部位、転写終止配
列、およびmRNA安定化配列など）が含まれ得る。シグナ
ルペプチドもまた、適切な場所では、同一または関連し
た種の分泌されたオリペプチド由来で含まれ得、タンパ
ク質が細胞膜を横切りおよび／または留まる、あるいは
細胞から分泌されることを可能にする。
適切なプロモーターおよび他の必要なベクター配列が
宿主中で機能的であるように選択される。細胞株および
発現ベクターの作動可能な組み合せの例は、以下に記載
されているが、これらに限定されない：Molecular Clon
ing:A Laboratory Manual，第２版，第１〜３巻,Sambro
okら編,Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）
またはCurrent Protocols in Molecular Biology,F.Aus
ubelら編,Greene Publishing and Wiley−Interscienc
e:New York（1987および周期的に更新）；およびMetzge
rら（1988），Nature，334:31−36。細菌、酵母、哺乳
動物、昆虫、植物、または他の細胞中での発現に有用な
多くのベクターが当業者に公知であり、Stratagene、Ne
w England Biolabs、Promega Biotech、およびその他を
含むがこれらに限定されない供給業者から得られ得る。
さらに、構築物は、遺伝子の多数のコピーが得られ得る
ように増幅可能な遺伝子（例えば、DHFR）に接合され得
る。適当なエンハンサーおよび他の発現制御配列につい
ては、Enhancers and Eukaryotic Gene Expression,Col
d Spring Harbor Press,N.Y.（1983）も参照のこと。こ
のような発現ベクターは自律複製し得るが、それらは、
あまり好まれないが、当該技術分野で公知の方法によっ
て、宿主細胞のゲノム中に挿入されることにより複製し
得る。
宿主中で機能的であるように選択される。細胞株および
発現ベクターの作動可能な組み合せの例は、以下に記載
されているが、これらに限定されない：Molecular Clon
ing:A Laboratory Manual，第２版，第１〜３巻,Sambro
okら編,Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）
またはCurrent Protocols in Molecular Biology,F.Aus
ubelら編,Greene Publishing and Wiley−Interscienc
e:New York（1987および周期的に更新）；およびMetzge
rら（1988），Nature，334:31−36。細菌、酵母、哺乳
動物、昆虫、植物、または他の細胞中での発現に有用な
多くのベクターが当業者に公知であり、Stratagene、Ne
w England Biolabs、Promega Biotech、およびその他を
含むがこれらに限定されない供給業者から得られ得る。
さらに、構築物は、遺伝子の多数のコピーが得られ得る
ように増幅可能な遺伝子（例えば、DHFR）に接合され得
る。適当なエンハンサーおよび他の発現制御配列につい
ては、Enhancers and Eukaryotic Gene Expression,Col
d Spring Harbor Press,N.Y.（1983）も参照のこと。こ
のような発現ベクターは自律複製し得るが、それらは、
あまり好まれないが、当該技術分野で公知の方法によっ
て、宿主細胞のゲノム中に挿入されることにより複製し
得る。
発現およびクローニングベクターは、選択可能なマー
カー、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存または
増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子、をおそら
く含むが、このようなマーカー遺伝子は宿主細胞中に同
時に導入された他のポリヌクレオチド配列上に保持され
得る。マーカー遺伝子を発現するこのような宿主細胞の
みが、選択的条件下で生存および／または増殖する。代
表的な選択遺伝子には、（ａ）抗生物質または他の毒性
物質（例えば、アンピシリン（ampicillin）、テトラサ
イクリン（tetracycline）など）に対する耐性を与え；
（ｂ）栄養要求性欠失を相補し；または（ｃ）複合培地
から得られない重要な栄養物を供給するタンパク質が含
まれるが、これらに限定されない。適切な選択可能なマ
ーカーの選択は、宿主細胞に依存し、そして種々の宿主
についての適当なマーカーは当該技術分野で公知であ
る。
カー、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存または
増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子、をおそら
く含むが、このようなマーカー遺伝子は宿主細胞中に同
時に導入された他のポリヌクレオチド配列上に保持され
得る。マーカー遺伝子を発現するこのような宿主細胞の
みが、選択的条件下で生存および／または増殖する。代
表的な選択遺伝子には、（ａ）抗生物質または他の毒性
物質（例えば、アンピシリン（ampicillin）、テトラサ
イクリン（tetracycline）など）に対する耐性を与え；
（ｂ）栄養要求性欠失を相補し；または（ｃ）複合培地
から得られない重要な栄養物を供給するタンパク質が含
まれるが、これらに限定されない。適切な選択可能なマ
ーカーの選択は、宿主細胞に依存し、そして種々の宿主
についての適当なマーカーは当該技術分野で公知であ
る。
目的のポリヌクレオチドを含むベクターは、当該技術
分野で公知の任意の方法により宿主細胞中に導入され得
る。これらの方法は、細胞宿主のタイプによって変化
し、塩化カルシウム（calcium chloride）、塩化ルビジ
ウム（rubiium chloride）、リン酸カルシウム（calciu
m phosphate）、DEAE−テキストラン（DEAE−dextra
n）、他の物質、およびウイルスによる感染を用いるト
ランスフェクションを含むが、これらに限定されない。
分野で公知の任意の方法により宿主細胞中に導入され得
る。これらの方法は、細胞宿主のタイプによって変化
し、塩化カルシウム（calcium chloride）、塩化ルビジ
ウム（rubiium chloride）、リン酸カルシウム（calciu
m phosphate）、DEAE−テキストラン（DEAE−dextra
n）、他の物質、およびウイルスによる感染を用いるト
ランスフェクションを含むが、これらに限定されない。
本発明の大量のポリヌクレオチドおよびポリペプチド
は、適合可能な宿主細胞中のベクターまたは他の発現伝
達体（vehicle）中で本発明のポリヌクレオチドを発現
することにより調製され得る。最も通常に用いられる原
核生物宿主は、大腸菌（Escherichia coli）株である
が、Bacillus subtilisなどの他の原核生物もまた用い
られ得る。
は、適合可能な宿主細胞中のベクターまたは他の発現伝
達体（vehicle）中で本発明のポリヌクレオチドを発現
することにより調製され得る。最も通常に用いられる原
核生物宿主は、大腸菌（Escherichia coli）株である
が、Bacillus subtilisなどの他の原核生物もまた用い
られ得る。
目的のタンパク質をコードする遺伝子は、好ましくは
キメラであり、すなわち、それらは融合タンパク質をコ
ードする。好ましくは、キメラ遺伝子はユビキチンおよ
び目的のタンパク質を含む融合タンパク質をコードす
る。より好ましくは、キメラ遺伝子は、ユビキチン−TG
F−β融合タンパク質、ユビキチン−IGF融合タンパク
質、ユビキチン−IGFBP−３融合タンパク質、またはユ
ビキチン−ｓβ−RII融合タンパク質（すなわち、タイ
プII TGF−βレセプタータンパク質の可溶性細胞外ドメ
インとの融合）をコードする。ユビキチンキメラ遺伝子
は、ユビキチンがタンパク質のアミノ末端部分であり、
そしてユビキチンの開裂が目的のタンパク質を得るよう
に作動可能に連結される。
キメラであり、すなわち、それらは融合タンパク質をコ
ードする。好ましくは、キメラ遺伝子はユビキチンおよ
び目的のタンパク質を含む融合タンパク質をコードす
る。より好ましくは、キメラ遺伝子は、ユビキチン−TG
F−β融合タンパク質、ユビキチン−IGF融合タンパク
質、ユビキチン−IGFBP−３融合タンパク質、またはユ
ビキチン−ｓβ−RII融合タンパク質（すなわち、タイ
プII TGF−βレセプタータンパク質の可溶性細胞外ドメ
インとの融合）をコードする。ユビキチンキメラ遺伝子
は、ユビキチンがタンパク質のアミノ末端部分であり、
そしてユビキチンの開裂が目的のタンパク質を得るよう
に作動可能に連結される。
他のPPIの例としては、シクロフィリン、FKP、RBPI、
およびロタマーゼが挙げられるが、これらに限定されな
い。PPIは、種々の供給原から得られ得、これには、ヒ
ト、ラット、ハムスター、酵母、Neurospora crassa、D
rosophila melanogaster、およびトマトが挙げられるが
これらに限定されない。好ましくは、PPIは大腸菌（E.c
oli）から得られるロタマーゼである。
およびロタマーゼが挙げられるが、これらに限定されな
い。PPIは、種々の供給原から得られ得、これには、ヒ
ト、ラット、ハムスター、酵母、Neurospora crassa、D
rosophila melanogaster、およびトマトが挙げられるが
これらに限定されない。好ましくは、PPIは大腸菌（E.c
oli）から得られるロタマーゼである。
本発明はまた、細菌宿主中での目的のタンパク質の過
剰発現の方法を包含する。この方法には、宿主細胞中で
目的のタンパク質をコードする遺伝子を発現させる工
程、および該宿主細胞中で細胞質PPIをコードする遺伝
子を同時に発現させる工程を包含する。PPIが一旦発現
すると細胞質に留まることが好ましい。これは、細胞質
で通常見られるPPIを発現させることにより、あるいはP
PIの分泌形態のシグナルペプチドを除去または無能にす
ることにより達成され得る。次いで、細胞を処理して目
的のタンパク質を回収し得、そしてタンパク質をさらな
る精製技法にかけ得る。
剰発現の方法を包含する。この方法には、宿主細胞中で
目的のタンパク質をコードする遺伝子を発現させる工
程、および該宿主細胞中で細胞質PPIをコードする遺伝
子を同時に発現させる工程を包含する。PPIが一旦発現
すると細胞質に留まることが好ましい。これは、細胞質
で通常見られるPPIを発現させることにより、あるいはP
PIの分泌形態のシグナルペプチドを除去または無能にす
ることにより達成され得る。次いで、細胞を処理して目
的のタンパク質を回収し得、そしてタンパク質をさらな
る精製技法にかけ得る。
好ましくは、宿主細胞は大腸菌（E.coli）株であり、
より好ましくは大腸菌（E.coli）W3110DE3である。目的
のタンパク質をコードする遺伝子は、好ましくはキメラ
である。好ましくは、キメラ遺伝子は、ユビキチンおよ
び目的のタンパク質を含む融合タンパク質をコードす
る。より好ましくは、キメラ遺伝子は、ユビキチン−TG
F−β融合タンパク質、ユビキチン−IGF融合タンパク
質、ユビキチン−IGFBP−３融合タンパク質、またはユ
ビキチン−ｓβ−RII融合タンパク質をコードする。好
ましくは、PPIはシグナルペプチドを欠く大腸菌（E.col
i）ロタマーゼである。
より好ましくは大腸菌（E.coli）W3110DE3である。目的
のタンパク質をコードする遺伝子は、好ましくはキメラ
である。好ましくは、キメラ遺伝子は、ユビキチンおよ
び目的のタンパク質を含む融合タンパク質をコードす
る。より好ましくは、キメラ遺伝子は、ユビキチン−TG
F−β融合タンパク質、ユビキチン−IGF融合タンパク
質、ユビキチン−IGFBP−３融合タンパク質、またはユ
ビキチン−ｓβ−RII融合タンパク質をコードする。好
ましくは、PPIはシグナルペプチドを欠く大腸菌（E.col
i）ロタマーゼである。
本発明の融合ポリペプチドおよびPPIを製造するため
に用いる組換え核酸配列は、天然または合成の配列から
誘導され得る。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列お
よび／またはそれらのフラグメントは、GENBANKおよび
／またはSwiss Prote in Databaseから、以下のデータ
ベースアクセス番号を用いて得られ得る： コドンを最適化した遺伝子が用いられ得る。
に用いる組換え核酸配列は、天然または合成の配列から
誘導され得る。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列お
よび／またはそれらのフラグメントは、GENBANKおよび
／またはSwiss Prote in Databaseから、以下のデータ
ベースアクセス番号を用いて得られ得る： コドンを最適化した遺伝子が用いられ得る。
本発明はさらに、細菌宿主中で、可溶性、またはより
可溶性のタンパク質を製造する方法を包含する。この方
法は、宿主細胞中で目的のタンパク質をコードする遺伝
子を発現させる工程、およびペプチジル−プロリル シ
ス−トランスイソメラーゼをコードする遺伝子を同時に
発現させる工程を包含する。次いで、細胞を処理して目
的のタンパク質を回収し得、そしてタンパク質をさらな
る精製技法にかけ得る。ユビキチン融合タンパク質の場
合、タンパク質は従来の精製方法により精製され、次い
で、ユビキチンが目的のタンパク質から開裂され、そし
て得られる２種の分子はさらなる精製により互いに分離
される。
可溶性のタンパク質を製造する方法を包含する。この方
法は、宿主細胞中で目的のタンパク質をコードする遺伝
子を発現させる工程、およびペプチジル−プロリル シ
ス−トランスイソメラーゼをコードする遺伝子を同時に
発現させる工程を包含する。次いで、細胞を処理して目
的のタンパク質を回収し得、そしてタンパク質をさらな
る精製技法にかけ得る。ユビキチン融合タンパク質の場
合、タンパク質は従来の精製方法により精製され、次い
で、ユビキチンが目的のタンパク質から開裂され、そし
て得られる２種の分子はさらなる精製により互いに分離
される。
以下の実施例は、本発明を例示することを意図し、限
定するものではない。他に記載がなければ、DNAクロー
ニングおよび発現方法は、本質的にSambrookら（1989）
に記載されているとおりである。
定するものではない。他に記載がなければ、DNAクロー
ニングおよび発現方法は、本質的にSambrookら（1989）
に記載されているとおりである。
実施例１ ユビキチン融合タンパク質をコードするベクター 本研究に用いた発現ベクターは、遺伝子が、翻訳カッ
プラー、および成熟ヒトIGF−１（70アミノ酸、）、IGF
BP−３（264アミノ酸）、TGF−β２（112アミノ酸）、
またはタイプII TGF−βレセプターの可溶性細胞外ドメ
イン（136アミノ酸）をコードする開始コドンの下流に
挿入されること以外は、Squiresら（1988）J.Biol.Che
m.，263:16297−16302に記載のpJU1003と同様であっ
た。
プラー、および成熟ヒトIGF−１（70アミノ酸、）、IGF
BP−３（264アミノ酸）、TGF−β２（112アミノ酸）、
またはタイプII TGF−βレセプターの可溶性細胞外ドメ
イン（136アミノ酸）をコードする開始コドンの下流に
挿入されること以外は、Squiresら（1988）J.Biol.Che
m.，263:16297−16302に記載のpJU1003と同様であっ
た。
これらのプラスミドもまた、（ａ）pJU1003中のtet遺
伝子の５′末端に合成16塩基対（bp）アダプター配列を
含まない、および（ｂ）pBR322由来の骨格中の唯一のPv
u II部位にDNA挿入物（pSC101のpar遺伝子座を有する38
5bpフラグメント）を含む点で、pJU1003とは異なる。Me
acockおよびCohen（1980）Cell，20:529−542。
伝子の５′末端に合成16塩基対（bp）アダプター配列を
含まない、および（ｂ）pBR322由来の骨格中の唯一のPv
u II部位にDNA挿入物（pSC101のpar遺伝子座を有する38
5bpフラグメント）を含む点で、pJU1003とは異なる。Me
acockおよびCohen（1980）Cell，20:529−542。
各遺伝子は、発現のために、（１）コーディング配列
に結合したメチオニン開始コドン有する、または（２）
遺伝子配列の上流に読み取り枠が合って挿入された酵母
ユビキチンの76コドンを有する、２つの別々の構造で調
製される（図１）。
に結合したメチオニン開始コドン有する、または（２）
遺伝子配列の上流に読み取り枠が合って挿入された酵母
ユビキチンの76コドンを有する、２つの別々の構造で調
製される（図１）。
必要に応じて、各遺伝子の構造は、ロタマーゼ遺伝子
が独立のポリペプチドとして発現されるが同じプロモー
ターの制御下にあるような下流に、シグナル配列のない
大腸菌（E.coli）周辺質ロタマーゼのコーディング配列
を置くことにより、さらに改変される。ロタマーゼ遺伝
子のシグナルペプチドはLiuおよびWalsh（1990）Proc.N
atl.Acad.Sci.USA，87:4028−4032に記載されているよ
うに欠失され、そして開始メチオニンコドンで置換され
る（図２）。
が独立のポリペプチドとして発現されるが同じプロモー
ターの制御下にあるような下流に、シグナル配列のない
大腸菌（E.coli）周辺質ロタマーゼのコーディング配列
を置くことにより、さらに改変される。ロタマーゼ遺伝
子のシグナルペプチドはLiuおよびWalsh（1990）Proc.N
atl.Acad.Sci.USA，87:4028−4032に記載されているよ
うに欠失され、そして開始メチオニンコドンで置換され
る（図２）。
このように、各遺伝子は、４つの可能な構造で発現さ
れる。さらに、遺伝子が欠失され、そしてリンカー で置換されているベクター12886および12887が、コント
ロールとして用いられる。プラスミドの名称を表１に示
す： 簡単にいえば、酵母ユビキチンおよびロタマーゼの配
列は、適当なゲノムDNAからPCR媒介増幅を用いて得られ
た。IGFBP−３のcDNAクローンを、Sprattら（1990）Gro
wth Factors ３:63−72に記載されているように単離
し、アミノ末端の３分の１の遺伝子を、天然の遺伝子と
同様のアミノ酸をコードするが大腸菌（E.coli）での発
現に最適化されたコドンを用いる合成DNA配列で置換す
ることにより、さらに改変した。IGF−１配列を合成DNA
から新規に（de nova）構築し、そしてまた大腸菌（E.c
oli）について最適化したコドンを用いた。TGF−β２配
列は、Dr.Michael Sporn,NIHから得たcDNAクローンのPC
R媒介改変により得た。ｓβ−RIII配列は、Dr.Herb Li
n,MITからのcDNAクローンであるpH2−3FFに同様に由来
した。すべてのPCR由来のDNAは、使用の前に配列決定し
た。
れる。さらに、遺伝子が欠失され、そしてリンカー で置換されているベクター12886および12887が、コント
ロールとして用いられる。プラスミドの名称を表１に示
す： 簡単にいえば、酵母ユビキチンおよびロタマーゼの配
列は、適当なゲノムDNAからPCR媒介増幅を用いて得られ
た。IGFBP−３のcDNAクローンを、Sprattら（1990）Gro
wth Factors ３:63−72に記載されているように単離
し、アミノ末端の３分の１の遺伝子を、天然の遺伝子と
同様のアミノ酸をコードするが大腸菌（E.coli）での発
現に最適化されたコドンを用いる合成DNA配列で置換す
ることにより、さらに改変した。IGF−１配列を合成DNA
から新規に（de nova）構築し、そしてまた大腸菌（E.c
oli）について最適化したコドンを用いた。TGF−β２配
列は、Dr.Michael Sporn,NIHから得たcDNAクローンのPC
R媒介改変により得た。ｓβ−RIII配列は、Dr.Herb Li
n,MITからのcDNAクローンであるpH2−3FFに同様に由来
した。すべてのPCR由来のDNAは、使用の前に配列決定し
た。
大腸菌（E.coli）Ｋ−12株W3110を、B.Bachmann,ECGS
C,Yale Universityから得た。これを、StudierおよびMo
ffat（1986）J.Mol.Biol.，189:113−130に記載のよう
にDE3欠陥ファージで溶原化した。W3110DE3はそのよう
な溶原菌の１種であった。これを、記載の全ての実験に
ついて、宿主株として用いた。
C,Yale Universityから得た。これを、StudierおよびMo
ffat（1986）J.Mol.Biol.，189:113−130に記載のよう
にDE3欠陥ファージで溶原化した。W3110DE3はそのよう
な溶原菌の１種であった。これを、記載の全ての実験に
ついて、宿主株として用いた。
各プラスミドを、カルシウム媒介形質転換およびアン
ピシリン耐性についての選択により、W3110DE3中に導入
した。
ピシリン耐性についての選択により、W3110DE3中に導入
した。
実施例２ ユビキチン融合タンパク質を発現する株の増殖素度への
ロタマーゼ同時発現の影響 上記プラスミドの１種を含む各細菌株を、テトラサイ
クリン（15μg/ml）を含む5mlのLuria Broth中に接種
し、37℃で好気的に一晩飽和になるまで増殖させた。こ
の新鮮な培養物の2mlを、テトラサイクリンおよびさら
に0.2％グルコースを含む100mlのLB中に希釈し、そして
数時間好気培養し、そして培養物の光学濃度を対数増殖
期を通じて600nmで追跡した。平均世代時間は、増殖の
みのこの期の間の細胞濃度の半対数プロットから計算し
た。17株について得た値を図３に示す。
ロタマーゼ同時発現の影響 上記プラスミドの１種を含む各細菌株を、テトラサイ
クリン（15μg/ml）を含む5mlのLuria Broth中に接種
し、37℃で好気的に一晩飽和になるまで増殖させた。こ
の新鮮な培養物の2mlを、テトラサイクリンおよびさら
に0.2％グルコースを含む100mlのLB中に希釈し、そして
数時間好気培養し、そして培養物の光学濃度を対数増殖
期を通じて600nmで追跡した。平均世代時間は、増殖の
みのこの期の間の細胞濃度の半対数プロットから計算し
た。17株について得た値を図３に示す。
図３で見られるように、各場合（全部で４つの遺伝
子）において、ユビキチン融合構築物は宿主株の世代時
間を顕著に増加させ、この株は同じオペロン中で目的の
遺伝子の下流にロタマーゼ遺伝子を含有することにより
弱くなった。
子）において、ユビキチン融合構築物は宿主株の世代時
間を顕著に増加させ、この株は同じオペロン中で目的の
遺伝子の下流にロタマーゼ遺伝子を含有することにより
弱くなった。
実施例３ 融合タンパク質の溶解性 いくつかの細胞を30℃で増殖し、600nmでの光学濃度
が0.4に達するまでの初期対数増殖を通じて追跡した以
外は、細胞を実施例２に記載のように増殖した。この時
点で、1mlのアリコートを取り出し、そしてこれらの細
胞を遠心分離により採取した（０時点）。イソプロピル
チオガラクトピラノシド（isopropyl−thiogalactopyra
noside）（IPTG）を最終濃度が0.4mMになるように添加
して、組換え遺伝子の発現を開始し、そして培養物のイ
ンキュベーションを２時間続けた。細胞の第２のアリコ
ートを２時間の時点で取り出した。培養物の残りを遠心
分離により採取し、50mM Tris−Cl、pH8.0、2mM EDTA
（破砕緩衝液）で再懸濁し、そしてBranson振動器（２
×30秒バースト）を用いる音波処理により、細胞を破砕
した。必要に応じて、破砕緩衝液に0.2mg/mlのニワトリ
リゾチームを添加することにより、溶菌を増強した。Be
ckman TJ−６遠心分離機で４℃にて15分間3000rpmでの
遠心分離の後、可溶性画分（上清）を得た。ペレット
を、分析のために、等容量の破砕緩衝液でさらに再懸濁
した。
が0.4に達するまでの初期対数増殖を通じて追跡した以
外は、細胞を実施例２に記載のように増殖した。この時
点で、1mlのアリコートを取り出し、そしてこれらの細
胞を遠心分離により採取した（０時点）。イソプロピル
チオガラクトピラノシド（isopropyl−thiogalactopyra
noside）（IPTG）を最終濃度が0.4mMになるように添加
して、組換え遺伝子の発現を開始し、そして培養物のイ
ンキュベーションを２時間続けた。細胞の第２のアリコ
ートを２時間の時点で取り出した。培養物の残りを遠心
分離により採取し、50mM Tris−Cl、pH8.0、2mM EDTA
（破砕緩衝液）で再懸濁し、そしてBranson振動器（２
×30秒バースト）を用いる音波処理により、細胞を破砕
した。必要に応じて、破砕緩衝液に0.2mg/mlのニワトリ
リゾチームを添加することにより、溶菌を増強した。Be
ckman TJ−６遠心分離機で４℃にて15分間3000rpmでの
遠心分離の後、可溶性画分（上清）を得た。ペレット
を、分析のために、等容量の破砕緩衝液でさらに再懸濁
した。
全細胞抽出物を、サンプル緩衝液に全細胞を再懸濁し
て５分間煮沸することにより、12または18％ポリアクリ
ルアミドゲルでの電気泳動用に調製した。可溶性および
不溶性画分サンプルを、1/10容量の10×サンプル緩衝液
を添加し、65℃で15分間インキュベートすることにより
調製した（１％SDS、10％グリセロールおよび0.1％ブロ
モフェノールブルー）。Laemmli（1970）Nature,227:68
0−685に記載の方法に従って、ゲルを泳動した。
て５分間煮沸することにより、12または18％ポリアクリ
ルアミドゲルでの電気泳動用に調製した。可溶性および
不溶性画分サンプルを、1/10容量の10×サンプル緩衝液
を添加し、65℃で15分間インキュベートすることにより
調製した（１％SDS、10％グリセロールおよび0.1％ブロ
モフェノールブルー）。Laemmli（1970）Nature,227:68
0−685に記載の方法に従って、ゲルを泳動した。
結果は、すべての場合において、ユビキチン融合物
が、特に細胞が30℃で増殖するときに、可溶性画分の所
望のタンパク質の蓄積を増強することを示した。各場合
において、主な誘導されたタンパク質の同一性を、ウエ
スタンブロッティングにより確認した（データは示して
いない）。
が、特に細胞が30℃で増殖するときに、可溶性画分の所
望のタンパク質の蓄積を増強することを示した。各場合
において、主な誘導されたタンパク質の同一性を、ウエ
スタンブロッティングにより確認した（データは示して
いない）。
図４は、ベクター16926および16927により発現される
ユビキチン−IGF融合物が非常に可溶性であることを示
す（誘導後に観察される15kDの主要タンパク質生成物の
少なくとも90％が可溶性画分にある）。ユビキチン融合
物がロタマーゼと同時に発現したとき、溶解性はさらに
増大した。met−IGF（ユビキチンを含まない）を同様の
システムで発現したとき、IGFは可溶性画分で見られ得
なかった（データは示していない）。
ユビキチン−IGF融合物が非常に可溶性であることを示
す（誘導後に観察される15kDの主要タンパク質生成物の
少なくとも90％が可溶性画分にある）。ユビキチン融合
物がロタマーゼと同時に発現したとき、溶解性はさらに
増大した。met−IGF（ユビキチンを含まない）を同様の
システムで発現したとき、IGFは可溶性画分で見られ得
なかった（データは示していない）。
図５および６は、ユビキチン融合パートナーにより与
えられたIGFBP−３の溶解性の劇的な改良を示す。図５
では、met−IGFBP−３生成物（29kD）は最初は不溶性画
分中に見られ得る。図６では、ユビキチン−IGFBP−３
融合物（37kD）は最初は可溶性画分にある。
えられたIGFBP−３の溶解性の劇的な改良を示す。図５
では、met−IGFBP−３生成物（29kD）は最初は不溶性画
分中に見られ得る。図６では、ユビキチン−IGFBP−３
融合物（37kD）は最初は可溶性画分にある。
タンパク質の溶解性に対するユビキチン融合物の劇的
な効果のさらに他の例を、図７に示す。ユビキチン−ｓ
β−RII融合タンパク質（24kD）は最初は可溶性画分に
蓄積する。この場合、ユビキチン融合物は非常に可溶性
であり、ロタマーゼについての効果は認められ得ない。
な効果のさらに他の例を、図７に示す。ユビキチン−ｓ
β−RII融合タンパク質（24kD）は最初は可溶性画分に
蓄積する。この場合、ユビキチン融合物は非常に可溶性
であり、ロタマーゼについての効果は認められ得ない。
成熟TGF−β２は、正しく折り畳まれている場合でさ
え、水性の環境で有名な不溶性タンパク質として、当該
技術分野で周知である。例えば、37℃でmet−TGF−β２
タンパク質として発現したとき、このタンパク質は完全
に不溶性である（図８）。図８の左のパネルは、リゾチ
ームを用いて細胞を溶菌したときに得られた結果を示
し；右のパネルはリゾチームを用いない同様の実験を示
す。対照的に、TGF−β２がユビキチンに融合するとき
（図９の20kDのバンド）、TGF−β２は、特にロタマー
ゼと同時発現するときに可溶性画分に大部分が蓄積され
る（右のパネル）。
え、水性の環境で有名な不溶性タンパク質として、当該
技術分野で周知である。例えば、37℃でmet−TGF−β２
タンパク質として発現したとき、このタンパク質は完全
に不溶性である（図８）。図８の左のパネルは、リゾチ
ームを用いて細胞を溶菌したときに得られた結果を示
し；右のパネルはリゾチームを用いない同様の実験を示
す。対照的に、TGF−β２がユビキチンに融合するとき
（図９の20kDのバンド）、TGF−β２は、特にロタマー
ゼと同時発現するときに可溶性画分に大部分が蓄積され
る（右のパネル）。
ユビキチン融合物はまた、TobiasおよびVarshafsky
（1991）J.Biol.Chem. 266:12021−12028;およびMiller
ら（1989）Biotechnology ７:698−704に記載の方法に
従って、酵素的に開裂されて、所望の分子を遊離した。
１つの例を図10に示す。それは、図９のユビキチン−TG
F−β２融合タンパク質の開裂が、所望の２つのフラグ
メント、TGF−β２（12.5kD）およびユビキチン（8kD）
を生成することを示す。図10は、ユビキチンヒドロラー
ゼYUH−１での開裂の前後のユビキチン−TGF−β２融合
物でのクーマシー染色ゲルを示す。出利のパネルは分子
量マーカーを示す。中央および右のパネルは、それぞれ
YUH−１開裂をしないおよびした結果を示す。タンパク
質のバンドは、おおよその予測サイズである：ユビキチ
ンヒドロラーゼ（約30kD）、融合タンパク質（約20k
D）、TGF−β２（約12.5kD）、およびユビキチン（約8k
D）。この結果は、開裂が精確であり、目的のタンパク
質を与えることを証明する。
（1991）J.Biol.Chem. 266:12021−12028;およびMiller
ら（1989）Biotechnology ７:698−704に記載の方法に
従って、酵素的に開裂されて、所望の分子を遊離した。
１つの例を図10に示す。それは、図９のユビキチン−TG
F−β２融合タンパク質の開裂が、所望の２つのフラグ
メント、TGF−β２（12.5kD）およびユビキチン（8kD）
を生成することを示す。図10は、ユビキチンヒドロラー
ゼYUH−１での開裂の前後のユビキチン−TGF−β２融合
物でのクーマシー染色ゲルを示す。出利のパネルは分子
量マーカーを示す。中央および右のパネルは、それぞれ
YUH−１開裂をしないおよびした結果を示す。タンパク
質のバンドは、おおよその予測サイズである：ユビキチ
ンヒドロラーゼ（約30kD）、融合タンパク質（約20k
D）、TGF−β２（約12.5kD）、およびユビキチン（約8k
D）。この結果は、開裂が精確であり、目的のタンパク
質を与えることを証明する。
本明細書で記載したすべての刊行物および特許出願
は、各個々の刊行物または特許出願が参考として援用し
ていることを特におよび個別に示していると同様の範囲
まで、参考として本明細書中に援用される。
は、各個々の刊行物または特許出願が参考として援用し
ていることを特におよび個別に示していると同様の範囲
まで、参考として本明細書中に援用される。
本発明は現在十分に記載されており、添付の請求の範
囲の意図または範囲から離れることなく、それに多くの
変更および改変がなされ得ることが、当業者には明らか
である。
囲の意図または範囲から離れることなく、それに多くの
変更および改変がなされ得ることが、当業者には明らか
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ Ｈ // Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 特開 平３−228675（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−49683（ＪＰ，Ａ) 米国特許5084384（ＵＳ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ（1989）Ｖｏｌ．86，ｐ. 2540−2544 Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ. （1992）Ｖｏｌ．90，ｐ．１−７ Ｃｅｌｌ（1992）Ｖｏｌ．68，ｐ. 775−785 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（1990）Ｖ ｏｌ．265，Ｎｏ．21，ｐ．12642− 12649 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/62 - 15/86 C12P 21/00 - 21/06 C07K 19/00 C07K 14/65 C07K 14/245 C07K 14/495 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (17)
- 【請求項１】ユビキチンと目的のタンパク質との融合タ
ンパク質をコードする第１の遺伝子および細胞質ペプチ
ジル−プロリル シス−トランスイソメラーゼをコード
する第２の遺伝子を含む組換えDNAベクターであって、
該ベクターが該第１および第２の遺伝子を同時発現させ
得、 ここで、該組換えDNAベクターを有する宿主細胞の平均
世代時間は、該第１の遺伝子を発現するが該第２の遺伝
子を発現しないこと以外は同一の宿主細胞の平均世代時
間と比べて減少する、ベクター。 - 【請求項２】前記ペプチジル−プロリル シス−トラン
スイソメラーゼ遺伝子が機能的シグナルペプチドを欠く
大腸菌（E.coli）ロタマーゼをコードする、請求項１に
記載のベクター。 - 【請求項３】前記目的のタンパク質が、トランスフォー
ミング成長因子−β（TGF−β）である、請求項１に記
載のベクター。 - 【請求項４】前記目的のタンパク質が、インスリン様成
長因子（IGF）である、請求項１に記載のベクター。 - 【請求項５】前記目的のタンパク質が、インスリン様成
長因子結合タンパク質−３（IGFBP−３）である、請求
項１に記載のベクター。 - 【請求項６】前記目的のタンパク質が、タイプII TGF−
βレセプターの可溶性細胞外ドメイン（ｓβ−RII）で
ある、請求項１に記載のベクター。 - 【請求項７】以下の工程を包含する、大腸菌（E.coli）
宿主細胞中でユビキチン融合タンパク質を発現させる方
法： a.該宿主中で該ユビキチン融合タンパク質をコードする
第１のクローン化遺伝子を発現させる工程；および b.細胞質ペプチジル−プロリル シス−トランスイソメ
ラーゼをコードする第２のクローン化遺伝子を同時に発
現させる工程； これにより、該宿主細胞の平均世代時間が、該第１の遺
伝子を発現するが該第２の遺伝子を発現しないこと以外
は同一の宿主細胞の平均世代時間と比べて減少する、方
法。 - 【請求項８】前記ペプチジル−プロリル シス−トラン
スイソメラーゼ遺伝子が機能的シグナルペプチドを欠く
大腸菌（E.coli）ロタマーゼをコードする、請求項７に
記載の方法。 - 【請求項９】前記第１の遺伝子がユビキチンをコードす
るDNAおよびTGF−βをコードするDNAからなり、該遺伝
子の発現によりユビキチン−TGF−β融合タンパク質が
生成する、請求項７に記載の方法。 - 【請求項１０】前記第１の遺伝子がユビキチンをコード
するDNAおよびIGFをコードするDNAからなり、該遺伝子
の発現によりユビキチン−IGF融合タンパク質を生成す
る、請求項７に記載の方法。 - 【請求項１１】前記第１の遺伝子がユビキチンをコード
するDNAおよびIGFBP−３をコードするDNAからなり、該
遺伝子の発現によりユビキチン−IGFBP−３融合タンパ
ク質を生成する、請求項７に記載の方法。 - 【請求項１２】前記第１の遺伝子がタイプII TGF−βレ
セプターの可溶性細胞外ドメイン（ｓβ−RII）をコー
ドするDNAからなり、該遺伝子の発現によりユビキチン
−ｓβ−RII融合タンパク質を生成する、請求項７に記
載の方法。 - 【請求項１３】以下の工程を包含する、可溶性タンパク
質の製造方法： a.大腸菌（E.coli）宿主細胞中でユビキチン融合タンパ
ク質をコードする第１のクローン化遺伝子を発現させる
工程；および b.細胞質ペプチジル−プロリル シス−トランスイソメ
ラーゼをコードする第２のクローン化遺伝子を同時に発
現させる工程であって、これにより、該宿主細胞の平均
世代時間が、該第１の遺伝子を発現するが該第２の遺伝
子を発現しないこと以外は同一の宿主細胞の平均世代時
間と比べて減少する、工程；および c.該融合タンパク質からユビキチン部分を開裂して該可
溶性タンパク質を得る工程。 - 【請求項１４】前記ペプチジル−プロリル シス−トラ
ンスイソメラーゼ遺伝子が機能的シグナルペプチドを欠
く大腸菌（E.coli）ロタマーゼをコードする、請求項13
に記載の方法。 - 【請求項１５】前記第１の遺伝子がユビキチンをコード
するDNAおよびTGF−βをコードするDNAからなり、該遺
伝子の発現によりユビキチン−TGF−β融合タンパク質
が生成する、請求項13に記載の方法。 - 【請求項１６】前記第１の遺伝子がユビキチンをコード
するDNAおよびIGFをコードするDNAからなり、該遺伝子
の発現によりユビキチン−IGF融合タンパク質を生成す
る、請求項13に記載の方法。 - 【請求項１７】前記第１の遺伝子がユビキチンをコード
するDNAおよびIGFBP−３をコードするDNAからなり、該
遺伝子の発現によりユビキチン−IGFBP−３融合タンパ
ク質を生成する、請求項13に記載の方法。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US3759793A | 1993-03-26 | 1993-03-26 | |
| US08/037,597 | 1993-03-26 | ||
| US08/101,506 | 1993-08-02 | ||
| US08/101,506 US5459051A (en) | 1993-03-26 | 1993-08-02 | Methods and vectors for over-expression of ubiquitin fusion proteins in host cells |
| US101,506 | 1993-08-02 | ||
| US37,597 | 1993-08-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08510899A JPH08510899A (ja) | 1996-11-19 |
| JP2842693B2 true JP2842693B2 (ja) | 1999-01-06 |
Family
ID=26714286
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6522225A Expired - Lifetime JP2842693B2 (ja) | 1993-03-26 | 1994-03-25 | 宿主細胞中でのタンパク質の過剰発現のための方法およびｄｎａ発現システム |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5459051A (ja) |
| EP (1) | EP0710286A4 (ja) |
| JP (1) | JP2842693B2 (ja) |
| AU (1) | AU674741B2 (ja) |
| CA (1) | CA2159079C (ja) |
| WO (1) | WO1994023040A1 (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5710044A (en) * | 1995-02-27 | 1998-01-20 | Abbott Laboratories | Plasmid for expressing phosphorylated recombinant proteins in a bacterial system |
| US5770720A (en) * | 1995-08-30 | 1998-06-23 | Barnes-Jewish Hospital | Ubiquitin conjugating enzymes having transcriptional repressor activity |
| US6319503B1 (en) * | 1998-02-19 | 2001-11-20 | Proteinix Company | Heat shock fusion-based vaccine system |
| US6077689A (en) | 1997-12-24 | 2000-06-20 | Amgen Inc. | Enhanced solubility of recombinant proteins |
| US6417330B1 (en) | 1998-06-01 | 2002-07-09 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Insulin-like growth factor binding protein variants |
| GB9821198D0 (en) | 1998-09-30 | 1998-11-25 | Danisco | Enzyme |
| US7262005B1 (en) | 2000-02-04 | 2007-08-28 | Aurora Biosciences Corporation | Methods of protein destabilization and uses thereof |
| US6632638B1 (en) | 2000-11-17 | 2003-10-14 | Amgen, Inc. | Enhanced solubility of recombinant proteins using Uracil DNA glycosylase inhibitor |
| ES2391623T3 (es) | 2001-06-22 | 2012-11-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Complejo soluble que contiene una glicoproteína de superficie retroviral |
| WO2003010204A1 (en) * | 2001-07-26 | 2003-02-06 | Advanced Protein Technologies Corp. | Process for preparation of polypeptides of interest from fusion peolypeptides |
| JP5918295B2 (ja) * | 2014-04-14 | 2016-05-18 | 佛教慈濟醫療財團法人大林慈濟醫院 | 融合蛋白質、その製造方法、及び融合蛋白質により抗原ペプチドを小胞体に輸送する方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4886747A (en) * | 1985-03-22 | 1989-12-12 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding TGF-β and its uses |
| JP2612874B2 (ja) * | 1986-10-02 | 1997-05-21 | マサチユセツツ・インスチチユート・オブ・テクノロジー | タンパク質の代謝的安定性を調節する方法 |
| US5084384A (en) * | 1987-04-23 | 1992-01-28 | Monsanto Company | Secretion of insulin-like growth factor-I |
| US5108919A (en) * | 1988-06-24 | 1992-04-28 | Genentech, Inc. | Dna sequences encoding yeast ubiquitin hydrolase |
| CA2002011A1 (en) * | 1988-11-14 | 1990-05-14 | Anthony F. Purchio | Normal human growth regulatory receptor for tgf-beta |
| EP0647713B1 (en) * | 1989-07-19 | 1998-05-13 | Tonen Corporation | Peptidyl prolyl-cis.trans-isomerase |
| US5187151A (en) * | 1991-02-12 | 1993-02-16 | Genentech, Inc. | Use of binding protein with igf-i as an anabolic growth promoting agent |
-
1993
- 1993-08-02 US US08/101,506 patent/US5459051A/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-03-25 AU AU64166/94A patent/AU674741B2/en not_active Ceased
- 1994-03-25 JP JP6522225A patent/JP2842693B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-25 WO PCT/US1994/003293 patent/WO1994023040A1/en not_active Application Discontinuation
- 1994-03-25 EP EP94911714A patent/EP0710286A4/en not_active Withdrawn
- 1994-03-25 CA CA002159079A patent/CA2159079C/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Ｃｅｌｌ（１９９２）Ｖｏｌ．６８，ｐ．７７５−７８５ |
| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）Ｖｏｌ．２６５，Ｎｏ．２１，ｐ．１２６４２−１２６４９ |
| Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９２）Ｖｏｌ．９０，ｐ．１−７ |
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）Ｖｏｌ．８６，ｐ．２５４０−２５４４ |
Also Published As
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| US5459051A (en) | 1995-10-17 |
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| WO1994023040A1 (en) | 1994-10-13 |
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