JPH10503090A - 低温での組換え蛋白質産生のためのベクターおよび形質転換宿主細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は発現ベクターに関し、その核酸配列は、ベクターが細菌宿主中にあって温度が約２０℃未満に下がった時に、ベクターに含有される遺伝子でコードされたリコンビナトペプチドまたは蛋白質の産生をコントロールすることができる、プロモーターを有する。本発明はまた、前記ベクターを含有する宿主細胞、およびリコンビナント蛋白質を産生する方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 低温での蛋白質産生のためのベクターおよび形質転換宿主細胞 本願は１９９４年７月２１日に出願された米国特許願第０８／２７８，２８１ 号の一部継続出願である。発明の技術分野 本発明は発現ベクターに関し、そのベクターの核酸配列は、ベクターがバクテ リア宿主に入り温度が約２０℃未満に下げられた時に、ベクターに含まれている 遺伝子によってコードされた組換えペプチドまたは蛋白質の産生を制御できるプ ロモーターを含有する。本発明はまた、このベクターを含む形質転換宿主細胞、 ならびに組換え蛋白質を産生する方法にも関する。発明の背景 遺伝子工学は、異種遺伝子、それら遺伝子のｃＤＮＡ配列またはそれらの一部 をクローニングする方法、ならびにそれらを大腸菌等の細菌宿主細胞中に導入す る方法を提供するものである。宿主細胞中での異種蛋白質の産生レベルは、適切 に配列された転写および翻訳調節配列によって異なり、それらが異種遺伝子、遺 伝子フラグメント、各種遺伝子融合物またはそれらの突然変異物によってコード された望ましい蛋白質またはペプチドの発現の調節を可能とする。 転写（すなわち、ｍＲＮＡの産生をもたらすプロセス）は遺伝子の発現におけ る主要ステップの１つである。転写の開始は、遺伝子発現を調節する特定のプロ モーターで起きる。プロモーターはリプレッサーによりマイナス側に、またアク チベーター蛋白質によりプラス側に調節される。転写の開始はいくつかのステッ プに分けることかできる（ブック[Buc]ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８ ５）２４：２７１２）。効果的に作用するためには、プロモーターは３つの要素 で構成される。コア配列はＲＮＡポリメラーゼにより認識される。この領域はＵ ＳＲ（即ち上流領域）ならびにＤＳＲ（即ち下流領域）に隣接して(flanked)い る。ＵＳＲは特定のアクチベーター蛋白質に結合することが示され ている（アジャ[Adhya]ら、Ｇｅｎｅ（１９９３）１３２：１）。 遺伝子の活性化には一般に２つの形態が考えられている。ＤＮＡ結合アクチベ ーターはＲＮＡポリメラーゼに直接接触し、それによってＲＮＡポリメラーゼの 結合と異性化を容易にする。もう１つは、結合アクチベーターがプロモーターの 構造を変化させ、それによって転写開始をしやすくする。 望ましい異種遺伝子を維持し、またその遺伝子を細菌宿主細胞中に高レベルで 発現させて高純度の蛋白質を得るためには、細胞量(cell mass)が増加する発酵 の第１段階では遺伝子の発現を止め、最大の遺伝子発現および蛋白質産生が必要 な第２発酵段階で遺伝子の発現を進行させるように調節されたプロモーターの支 配下に遺伝子を置くことが必須である。 多数のプロモーターとリボソーム結合部位を利用しての蛋白質産生については すでに文献に記述されている。たとえば、調節された遺伝子発現のためのｐＬプ ロモーターの使用が、いくつかの文献の主題となっている（バーナード[Bernard ]ら、Ｇｅｎｅ（１９７０）５：５９；デロム[Derom]ら、Ｇｅｎｅ（１９８２） １７：４５；ゲイセン[Gheysen]ら、Ｇｅｎｅ（１９８２）１７：５５；ヘッジ ペス[Hedgpeth]ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９７８）１６３：１９７ ；ルモー[Remaut]ら、Ｇｅｎｅ（１９８１）１５：８１；およびデリネック[Der yneck]ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８０）２８７）。高レベルの蛋白質合成を得るた めに、たとえばｃＩＩの産生のために使用されるファージλｃＩＩ翻訳開始領域 のように、多くのリボソーム結合部位が利用されている（オッペンハイム[Oppen heim]ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８２）１５８：３２７；シマタケ[Shim atake]ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：１２８）。同じく、ヒト成長ホル モン（ｈＧＨ）およびウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）の産生については、特に米国 特許第４，９９７，９１６号に記述がある。 大腸菌中での真核蛋白質の産生の大きな問題点の１つは、望ましい蛋白質が封 入体(inclusion bodies)と呼ばれる不活性な凝集物の形で得られることが多いこ とである。封入体は、もし何らかの方法によってｉｎ ｖｉｔｒｏで望ましいペ プチドを活性な蛋白質の形に再生できるならば、蛋白質の精製を容易なものとす ることができる（たとえば、米国特許第４，９９７，９１６号参照）。ただし、 ｉｎ ｖｉｔｒｏの再生が極めて非効率的な蛋白質もある。 封入体の形成にはいくつかの要因が関与すると考えられる。これらの中で最も 重要なことは、発酵プロセスにおける遺伝子発現の誘発に続く単種類の蛋白質の 合成を迅速に行うことと、発酵を起こさせる温度である。高温においては、各分 子の再生の速度は遅くなる。不完全に折畳まれた蛋白質が高濃度で存在すると、 疎水ドメインの分子間相互作用のために、蛋白質が凝集することになる。天然蛋 白質の産生においては、蛋白質を完全に活性な形状に折畳むのに、これらの疎水 ドメインが重要な役割を果たす。 現在のところ、発酵プロセスの段階で蛋白質の産生を天然型に仕向ける公知の 方法はない。いくつかの蛋白質（たとえば、ｈＧＨおよびｂＧＨ）については、 凝集物を解離させて望ましい蛋白質に再生することが可能であるが、その他のも のについては再生の方法は知られていない。しかしながら、シャペローニン蛋白 質複合体はｉｎ ｖｉｖｏでの解離を容易にさせることが知られている。このプ ロセスは生物化学の実験室などで行うような小規模でも実施することができる。 低温で大腸菌の中に発現された蛋白質は溶解性が増すことが示されている。（ シェイン[Schein]ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：２９１； ７：シェイン、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８９）７：１１４１）。た とえば、インターフェロン（ＩＦＮ−α２）が３７℃で細菌培養中に発現された 場合、蛋白質の９５％は封入体中に認められる。対照的に、同じ培養物を３０℃ で増殖させた場合、蛋白質の僅か２７％だけが不溶性のものとなる。同様の結果 がＩｆＮ−γでも得られており、またシラノ[Shirano]ら（ＦＥＢＳ（１９９０ ）１：１２８）は大腸菌中の溶解性リポキシゲナーゼの発現が約１５℃では低レ ベルであることを示している。 したがって、生物学的に活性な真核蛋白質を細菌細胞から単離させるベクター の必要性がある。そのようなベクターを提供するとともに、真核蛋白質を細菌細 胞から生物学的に活性な形で産生および単離する方法を提供するのが本発明の目 的の１つである。本発明の別の目的は、天然の形の望ましい蛋白質を産生するた めの宿主−ベクター系を提供することにある。 本発明のこれらおよびその他の目的と利点、並びにそれ以外の発明的特徴は、 以下の本発明の説明から明らかになるであろう。 発明の概要 本発明は発現ベクターを提供するものであり、そのベクターの核酸配列は、ベ クターが細菌宿主に入り温度が約２０℃未満に下げられた時に、ベクターに含ま れている遺伝子によってコードされた組換えペプチドまたは蛋白質の産生を制御 することができるプロモーターを含有するものである。 本発明はまた、これらのベクターを含む形質転換宿主細胞、特に形質転換大腸 菌宿主細胞にも関する。 さらに、本発明はこれらのベクター中に含まれる遺伝子によってコードされた 望ましい蛋白質を、天然の活性な形で産生する方法にも関する。 図面の簡単な説明 図１は、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位に隣接するヌクレオチドを含むｐＬ プロモーター領域のＤＮＡ配列を示す。この配列はまた配列番号１として規定さ れている。 図２は、野生型ｐＬプロモーターを含むプラスミドｐＨＧ８７の制限地図を示 す。 図３は、突然変異ｐＬプロモーターｐＬ−９Ｇ−５０を含むプラスミドｐＨＧ ９１の制限地図を示す。このプロモーターの配列はまた配列番号２として規定さ れている。 図４の（Ａ）はプラスミドｐＨＧ９１Ｋ中の突然変異ｐＬプロモーターｐＬ− ９Ｇ−５０の存在と、複交差組換えによるファージλＢ２９９への挿入を示し、 また（Ｂ）は得られたベクター・ラムダＡ０１１０７（λＡ０１１０７）を示す 。 図５は、本発明に基づく発現ベクターの構築に用いられたカナマイシン耐性（ Ｋｍ^R）プラスミドｐＩＫ８６の制限地図を示す。 図６は、ＥＬ ｃｓｐＡプロモーターを含むプラスミドｐＩＫ−ＥＬの制限地 図を示す。 図７は、“ＥＬ”で示された矢印の間のヌクレオチドをほぼ包含する ＥＬ ｃｓｐＡプロモーターのＤＮＡ配列を示す。ｐＩＫ−ＥＬに含まれたＥＬ ｃｓｐ Ａプロモーターの配列は、配列番号３に規定されている。 図８は、Ｌ ｃｓｐＡプロモーターを含むプラスミドｐＩＫ−Ｌの制限地図を 示す。 図９は、“Ｌ”で示された矢印の間のヌクレオチドをほぼ包含するＬ ｃｓｐ ＡプロモーターのＤＮＡ配列を示す。ｐＩＫ−Ｌに含まれたＬ ｃｓｐＡプロモ ーターの配列は、配列番号４に規定されている。 図１０は、Ｍ ｃｓｐＡプロモーターを含むプラスミドｐＩＫ−Ｍの制限地図 を示す。 図１１は、“Ｍ”で示された矢印の間のヌクレオチドをほぼ包含するＭ ｃｓ ｐ ＡプロモーターのＤＮＡ配列を示す。ｐＩＫ−Ｍに含まれたＭ ｃｓｐＡプロ モーターの配列は、配列番号５に規定されている。 図１２は、Ｓ ｃｓｐＡプロモーターを含むプラスミドｐＩＫ−Ｓの制限地図 を示す。 図１３は、“Ｓ”で示された矢印の間のヌクレオチドを包含するＳ ｃｓｐＡ プロモーターのＤＮＡ配列を示す。ｐＩＫ−Ｓに含まれたＳ ｃｓｐＡプロモー ターの配列は、配列番号６に規定されている。 図１４は、（Ａ）プラスミドｐＩＫ８６中のｃｓｐＡプロモーターの存在と、 複交雑組換えによるファージλＢ２９９への挿入を示し、（Ｂ）得られたベクタ ー・ラムダＰｃｓｐＡ（λＰｃｓｐＡ）を示す。 図１５は、ｌａｃＺリポーター遺伝子に融合され、かつｐＬプロモーターのプ ラス側レギュレーターである宿主組込み因子の存在下（すなわちｈｉｐ⁺、●） または非存在下（すなわちｈｉｐ^-、○）で細菌染色体へ組込まれたｐＬ−９Ｇ −５０プロモーターの温度応答性を示す。 図１６は、ｌａｃＺリポーター遺伝子に融合され、かつ宿主組込み因子の存在 下（すなわちｈｉｐ⁺、●）または非存在下（すなわちｈｉｐ^-、○）で細菌染色 体へ組込まれたｐＬ−９Ｇ−５０プロモーターの温度応答性を示す。培養物を３ ７℃から約１５−１６℃へ移行した場合の（ａ）β−ｇａｌレベルと（ｂ）細胞 密度。培養物を約１５−１６℃から３７℃へ移行した場合の（ｃ）β−ｇａｌ レベルと、（ｄ）細胞密度。 図１７は、約１５−１６℃において種々のｃｓｐＡプロモーターの支配下でのｌａｃ Ｚの発現を示す：（□）内因性ｃｓｐＡ ｍＲＮＡ；（●）ＥＬ−ｌａｃ Ｚ ｍＲＮＡ；（■）Ｍ−ｌａｃＺ ｍＲＮＡ；（▲）Ｓ−ｌａｃＺ ｍＲＮＡ。 図１８は、プラスミドｐＨＧ３０９（プラスミドｐＨＧ８７の誘導体）および ｐＬ−ｐｌａｃ（ｌａｃリプレッサーに応答し、ｐＬプロモーター要素により強 化されたもの）の部分制限地図を示す。 図１９は、３７℃および１５℃における、種々のｃｓｐＡプロモーターの支配 下でのｌａｃＺの酵素活性およびメッセンジャーＲＮＡレベルで見た発現を示す 。 発明の詳細な説明 本発明は、低温（すなわち約２０℃未満の温度）で細菌宿主細胞中に二次クロ ーン遺伝子を高レベルで発現し、また蛋白質を天然の活性な形で産生させること ができる発現ベクターに関する。 本発明は、温度を約１５−２０℃に下げた場合に蛋白質折畳みの速度は僅かし か影響されないの対し、生物化学的反応である転写および蛋白質合成の速度は著 しく低下する（たとえば１／５から１／１０）、という仮定に基づいたものであ る。本発明の説明にあるように、このような条件を採用することによって、個々 の蛋白質にはその再生に十分な時間が独立した形で与えられ、望ましい蛋白質の 最終収率を低下させることなく、活性蛋白質を得ることができ、また集塊の形成 を防止することができる。 このように、本発明は細菌宿主細胞中に天然の活性な真核蛋白質を産生させる ことができるベクターを提供するものである。 そのようなベクターを含む細菌宿主細胞中での発酵は２段階プロセスに基づい て行われる。第１段階では約３７−４３℃の高温で急速な細菌の成長が行われ、 その間ベクターに含まれている二次クローン遺伝子の発現はごく低レベルでしか 起こらない。第２段階においては、低温への移行によって二次クローン遺伝子の 発現が増加する。発酵後に、純粋で水溶性かつ高度に活性な蛋白質を単離するこ とができる。宿主細胞を低温へ移行させることによって起きる蛋白質の増産には 特別に設計された発現系を利用することが必要であり、これが本発明の主題であ る。これらのベクターは、約２０℃未満の温度での遺伝子発現と蛋白質またはペ プチドの産生を増加させることができる。 細菌増殖のために高温を採用することにより、望ましい遺伝子を含む細胞は望 ましいペプチドを発現することなく急速に増殖する。この発酵システムで低温へ 切替えると、異種蛋白質をコードする遺伝子の発現が開始される。低温で望まし い蛋白質の合成速度を精密に調整すると、溶解性で生物学的に活性な蛋白質が高 レベルで得られる。この発現系は一般的に使用できるもので、ウイルス蛋白質類 、特にウイルス（中でもＡ型肝炎等の肝炎ウイルス）に対するワクチンを調製す るのに有用な蛋白質類、インスリン、ＩＬ１〜１３（特にＩＬ−２α）をはじめ とするインターロイキン等のサイトカイン類、インターフェロン類、凝固因子遺 伝子類（凝固因子Ｉ〜ＸIII、特にＶIII）、ホルモン類（卵胞刺激ホルモンなど ）、β−グルコセレブロシダーゼやその他の成長因子類等のあらゆるグルコセレ ブロシダーゼ類、ならびに基本的にはあらゆる望ましい蛋白質またはペプチドに 使用できる。 本発明のベクターは、望ましい蛋白質またはペプチドをコードする遺伝子、な らびに低温で非常に活性なプロモーターを含む核酸配列を包含するものである。 これらのベクターが細菌宿主細胞に導入されると、望ましい蛋白質またはペプチ ドの高レベルの産生を低温で可能にする。これら蛋白質またはペプチドは天然の 活性な形で得られ、したがって蛋白質再生のような追加の操作は不要である。 このように、本発明は遺伝子と、ベクターが細菌宿主に入り温度が約２０℃未 満に下げられた時に、ベクターに含まれている遺伝子にコードされた組換えペプ チドまたは蛋白質の産生を制御することかできるプロモーターを含む核酸配列を 包含する発現ベクターを提供するものである。 本発明において、プロモーターはＲＮＡポリメラーゼの結合を指揮し、それに よって新生ｍＲＮＡ合成を促進させるＤＮＡ配列である。真核プロモーターのＤ ＮＡ配列は原核プロモーターのＤＮＡ配列とは異なるものであり、これは真核信 号は原核系中では認識されない、また原核信号は真核系中では認識されない、 ということを意味する。このように、本発明のプロモーターはベクターに含まれ ている遺伝子の転写を可能とするが、さらに約２０℃未満の温度での転写を増強 させるものである。 一般にベクターに挿入される遺伝子は異種（すなわち、ベクターが導入される 特定の宿主中には通常は発現されない遺伝子）であるが、好ましくは真核由来の 遺伝子である。この遺伝子は全体または部分を合成したものでもよい。遺伝子に コードされる蛋白質またはペプチドは、蛋白質の全長、ポリペプチド、またはキ メラ蛋白質でもよい。 また、本発明のベクターは細菌宿主中で複製する（すなわち、自律的あるいは 宿主ゲノムの一部として）能力がなければならず、ペプチドまたは蛋白質の産生 を細菌宿主中で行わせる能力のあるものでなければならない。したがってベクタ ーは、ペプチドまたは蛋白質の産生を宿主中で行わせるための適当な制御要素（ たとえば、プロモーターやリボソーム結合部位）を含むものであることが望まし い。 ある場合には、ベクター中に含まれかつ蛋白質やペプチドをコードする遺伝子 が適当な調節要素を含んだものとし、これらの要素がベクターに存在しなくても よいようにする。別のケース（真核蛋白質が原核宿主中で産生されるような場合 ）では、本発明のベクターがこうした追加の要素を含むものであることが望まし い。異種遺伝子が宿主中で適当に発現され、温度が２０℃未満に下げられた時に 蛋白質が翻訳されるように、すべての適切な転写および翻訳信号がベクターに正 しく配列されていることが望ましい。 したがって、本発明の発現ベクターはさらに（ＡＴＧコドンのような）開始コ ドンを、ペプチドや蛋白質の翻訳がその開始コドンから行われるように配置して 含むことが望ましい。さらに望ましいのは、この開始コドンが前記プロモーター と前記遺伝子の間に配置されたものである。 また、本発明の発現ベクターはリボソーム結合部位を、前記ペプチドや蛋白質 の翻訳を制御できるように、好ましくはプロモーターと翻訳開始コドンの間に配 置して含むものが望ましい。 こうした追加の制御要素をベクター上に存在させるのは、原核細胞中での翻訳 は転写と同じように、真核細胞の信号にうまく応答して進行しないという事実か ら必要とされるものである。たとえば、原核細胞中での翻訳の開始にはＡＴＧコ ドンのような開始コドンの存在を必要とする。もし異種ＤＮＡがそのようなコド ンを含まない場合、本発明のベクター中に一以上のそのようなコドンを含ませる ことができる。好ましくは開始コドンは翻訳が開始される配列の上流と、サブク ローニングされたフラグメントがそれらのコントロール下に置かれた時に低温で の転写を増強させる本発明のプロモーターの下流に配置するのが望ましい。 同様に、本発明のベクターはまた、リボソーム結合部位（すなわち“Ｓｈｉｎ ｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列”；シャイン[Shine]ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７５） ２５４：３４）を包含させることもできる。原核細胞における効率的な翻訳は、 １６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の３’末端に相補性を示し、かつｒＲＮＡ とのデュープレックス化(duplexing)によってｍＲＮＡのリボソームへの結合を 促進する配列に依存することが知られており、このようにしてリボソームのｍＲ ＮＡ上の正しい配置が可能となる。したがって、リボソーム結合部位が本発明の ベクターの翻訳開始コドンの上流かつサブクローニングされたフラグメントで低 温の転写を増強するプロモーターの下流に含まれることが望ましい。 好ましくは、本発明のベクターはさらに、その他のコントロール要素を含む追 加の操作可能結合(operably-bound)ＤＮＡ配列を包含する。たとえば遺伝子発現 の停止に関わるリプレッサー部位と、遺伝子発現の増強に関わるエンハンサーと が本発明に包含される(contemplated)。 本発明のベクターは、好ましくは単鎖または二重鎖のＤＮＡを包含する核酸配 列を包含する。ベクターは、プラスミド、コスミド（すなわち、ｃｏｓ部位を包 含するプラスミド）またはバクテリオファージ類とすることができる。本発明の 好ましい実施態様においては、ベクターはプラスミド、またはバクテリオファー ジを包含するか、あるいはプラスミド：バクテリアファージ同時組込み体で、そ れらがさらに細菌染色体に挿入されたものを包含してもよい。 本発明の好ましいベクターでバクテリオファージを含むものは：λｐｃｓｐＡ （ＡＴＣＣ No.７５７１８として寄託されたλＡ０１１３１）およびλＡ０１ １０７（ＡＴＣＣ No.７５７１７として寄託されたもの）である。 その他の好ましいベクターとしては、ｐＨＧ８７およびｐＨＧ９１などが挙げら れるが、これらに限定されない。 大腸菌等の原核細胞種は約１０℃で増殖を停止するのに対し、本発明のベクタ ーを用いれば、約２０℃未満（すなわち、約１５−１６℃）の温度で、ベクター に含まれる遺伝子（たとえばリポーター遺伝子ｌａｃＺ）にコードされたペプチ ドまたは蛋白質の高度な産生が可能である。 低温は遺伝子発現レベルを調節する方法を与えるものであり、これによって発 現速度を抑え、かつ適切な蛋白質折畳みに必要な最大時間を与えて、蛋白質凝集 を防止する温度を、熟練技術者が見つけることができることとなる。別の言い方 をすれば、細胞増殖速度は低温で減速されるが、それにつれて個々の蛋白質分子 の再生に与えられる相対的な時間が長くなるということである。 本明細書で述べた発現システムは、二種類の異なるプロモーターと調節要素の 組合わせをベースとしたものである。一実施態様においては、本発明の発現ベク ターは、ファージλの低温感受性ｐＬプロモーターを含有する。ファージλのｐ Ｌプロモーター及び熱感受性を有するそのｃＩリプレッサー突然変異体の使用に ついては多くの文献記載がある。典型的には、まず細胞を３０℃で培養して高細 胞量まで至らしめる。その段階で細胞を４２℃に移行させ、ｐＬプロモーターの 酵素抑制を高め、当該ｐＬプロモーターのコントロール下において、サブクロー ニングされた遺伝子の高発現を得る（例えばGiladiら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． （１９９２）２２７：９８５−９９０；Giladiら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１ ９９２）２２４：９３７−９４８；Ptashne、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｗiｔｃｈ： Ｐｈａｇｅ Ｌａｍｂｄａ ａｎｄ Ｈｉｇｈｅｒ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ （Ｃ ｅｌｌ Ｐｒｅｓｓ ＆ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂ ｌｉｃａｔｉｏｎｓ、マサチューセッツ州、ケンブリッジ（１９９２））参照） 。 しかしながら、本発明は、低温下（即ち、約２０℃より低い温度）で最も高活 性を有するｐＬ突然変異体プロモーターを包含するものである。加えて、本発明 においては、野性型で改良されたｐＬプロモーター突然変異体（例えばｐＬ−９ Ｇ−５０）もまた約２０℃より低い温度で高活性を有することが見いだされた。 従来知られた組換えＤＮＡ技法によって多くのｐＬ誘導体を構築し、下記実施 例２に記載のようにして低温に対するプロモーターの応答を試験した。転写開始 部位の範囲−４〜＋４での３塩基対突然変異体（ＧＣＡＣＡＴＣＡからＧＧＡＣ ＡＡＧＡへの配列変化）は、冷感応答を低下させた。この範囲内の他の部位での その他のヌクレオチド置換（特に太文字で示した部位）も同様な結果を提供する はずである。冷感応答(cold response)における同様の低下は、ｐＬプロモータ ーの−１０領域での配列がＧＡＴＡＣＴからＴＡＴＡＡＴへと変化したときにも 得られた。この範囲内の他の部位でのその他のヌクレオチド置換（特に太文字で 示した部位）も同様な結果を提供するはずである。−９Ｇの突然変異（ＧＡＴＡ ＣＴからＧＡＴＧＣＴへの配列変化）は、低温移行時に顕著な応答をもたらした 。この範囲内の他の部位でのその他のヌクレオチド置換（特に太文字で示した部 位）も同様な結果を提供するはずである。 ｐＨＧ３０９は−４０から−７０に亘るヌクレオチドの内部欠失が導入された ｐＬプロモーター誘導体であり、これは、低温応答能を保持するが、ＩＨＦがな くても完全な活性が得られる。−４０から−７８の欠失を得るためには、ＰＣＲ を２回続けて行う。第一回目の反応においては、プライマー＃１８１５（５’− ＴＣＡＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＣＴＡＣＣ−３’）及び＃２３１９（５’−ＴＡＴ ＧＴＣＡＡＣＡＣＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＴＧ−３’）を用いて、−１３０から− ７９までのｐＬフラグメント（その３’末端に−３９から−２８までの１２個の 付加的な塩基対を有する）を作成する。第二回目の反応においては、プライマー ＃２０１１（５’−ＡＡＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＣＴＴＣＧＴＴＴ−３’）及び第 一回目のＰＣＲ反応の生成物が用いられる。このプロモーターは、多コピープラ スミド上に存在する場合には、培養条件にもよるが、−９Ｇ−５０突然変異体よ りも約７〜１５倍高活性であることが判明した（β−ガラクトシダーゼ活性によ るアッセイ）。これと同じ領域により少ない欠失を有するその他の突然変異体（ オープン・リーディング・フレームが保持される限り）も同様に低温応答性を保 持し且つＩＨＦが無くとも完全な活性が得られるであろうと考えられる。 ｐＬ−Ｐｌａｃキメラプロモーターも同様にして生成した。即ち、第一回目の ＰＣＲ反応において、プラーマー＃１８１５及びキメラプライマー＃４４０２ （５’−ＡＣＧＡＧＣＣＧＧＡＡＧＣＡＴＡＡＡＧＴＧＴＡＡＡＴＧＴＴＴＴＴ ＴＡＴＡＴＧＡＡ−３’）をｐＬ鋳型上で用いた。第二回目の反応においては、 初回の反応の生成物を上流プライマーとして用いた。ユニバーサルなＭ１３プラ イマーを利用すると共に、Ｐｌａｃプロモーターを鋳型とした。この融合生成物 においては、発現はｌａｃＩリプレッサーで調節し、ＩＰＴＧによって誘発させ た。ｐＬの−１３０から−７９までの領域はＰｌａｃ（−３６〜＋８４）と融合 させた。このプロモーターの低温応答は未試験である。 また別の態様においては、本発明の発現ベクターはｃｓｐＡプロモーターを包 含する。このプロモーターは低温応答性が高く、また、細菌染色体中の元来の位 置においては、合成された細菌蛋白の１３％を超える合成を指向する（タナベら 、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９２）１７４：３８６７；Ｇｏｌｄｓｔｅｉ ｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９０）８７．２８３）。この ｃｓｐ Ａ遺伝子は、文献記載が細菌についてなされている、主要な低温ショック (cold shock)遺伝子である（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ．（１９９０）８７：２８３；Ｊｏｎｅｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ ｏｌ．（１９９２）１７４：３９０３；タナベら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（ １９９２）１７４：３８６７）。 転写の増進に携わる領域の数を同定できるように、ｃｓｐＡ遺伝子のプロモー ター領域を切断した。このプロモーターは強いので、或る一定のクローンは高温 でのみ保持される。本発明における、ｌａｃＺの発現に対するｃｓｐＡプロモー ターの影響は、実施例に記載のように確認された。 −３５領域における自発的突然変異（−３６におけるＴ：ＡからＣ：Ｇへの突 然変異）は、高温と低温の間の発現の区分をより拡大させる（図１９参照）。こ の位置におけるどのヌクレオチドの置換も同じ結果をもたらすことが予想される 。さらに、−３５部位±５のその他の突然変異もまた同様の結果をもたらすこと が予想される。 従って、本発明の好ましいベクターはｐＬプロモーター又はＰｃｓｐＡプロモ ーターを包含する。このｐＬプロモーター又はＰｃｓｐＡプロモーターは更に一 以上の突然変異を包含しても良い。本発明においては、突然変異はＤＮＡ配列の 変更をもたらすが、この突然変異は、塩基配列における付加、欠失、あるいは置 換からなるものであることができる。本発明におけるＰｃｓｐＡプロモーターの 幾つかの突然変異は、例えばｐＩＫ−ＬやｐＩＫ−Ｍ中に存在する。同様に、本 発明のＰｃｓｐＡはｐＬ−９Ｇ−５０中に含有される。 本発明におけるその他の好ましいベクターは、そのプロモーターが次の配列、 即ち配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、あるいは 配列番号６で表される配列を有するものを包含する。 その他の好ましいベクターとしては次のものが挙げられる：ＡＴＣＣに寄託さ れＮｏ．７５７１７を付与された細胞株内に含まれるλＡ０１１０７；ＡＴＣＣ に寄託されＮｏ．７５７１８を付与された細胞株内に含まれるλＰｃｓｐＡ；Ａ ＴＣＣに寄託されＮｏ．７５７１９を付与された細胞株内に含まれるｐＩＫ−Ｍ ；ＡＴＣＣに寄託されＮｏ．７６７２０を付与された細胞株内に含まれるｐＩＫ −ＥＬ；及びプラスミドｐＩＫ−ＬとｐＩＫ−Ｐ。 本発明は、更に望ましい天然活性形態の蛋白質を生産するための宿主ベクター 系に関し、この系は、適切な細菌性の宿主（好ましくは大腸菌）内に含有される 本発明の発現ベクターを包含する。 また、ｐＬプロモーターの発現は、ＨＩＦによって有効に調節される。このＨ ＩＦは、大腸菌宿主細胞の天然成分である。従って、ｐＬプロモーターを含有す る本発明ベクターには、公知の宿主組込み因子であるＨＩＦを含有するＨＩＦ⁺ 大腸菌株を使用することが好ましい。 一般に、より好ましい大腸菌株は、蛋白質産生レベルおよび／または安定性を 向上させる突然変異を含む株や、望ましい遺伝子産物の折り畳みを矯正する株で ある。そのような株は、例えば、ｌｏｎまたはｈｆｌ遺伝子に欠陥を有する突然 変異体であって、これらは蛋白質分解を低減させることによって安定性を向上さ せることができる。その他、ｒｅｃＡやその他の組み換え／修復遺伝子に突然変 異を有する株も好ましく使用することが出来る。これらの突然変異は、細菌宿主 に含まれる真核ＤＮＡの組み換え（除去を含む）に関して知られているものであ る。 従って、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列 番号５、あるいは配列番号６で表される配列を包含するプロモーターを有するベ クターを含有する細菌を提供する。 同様に、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列 番号５、あるいは配列番号６で表される配列を包含するプロモーターを有するベ クターを含有する核酸を提供する。 天然活性形態のβ−ｇａｌの産生に用いることができるその他の好ましい宿主 −ベクター系は、λＰｃｓｐＡ若しくはλＡ０１１０７発現ベクターを適切な大 腸菌（特にＡ７５０６株）に有するものである。 好ましい宿主−ベクター系においては、望ましい蛋白質あるいはペプチドをコ ードする遺伝子は、ファージλ発現ベクターを用いて、適切な大腸菌宿主細胞染 色体に組み込まれる。染色体への組み込みの結果、遺伝子が融合した単一のコピ ーが得られ、これは非常に安定で、且つ抗生物質を用いない発酵プロセスを可能 とする。 本発明の方法を用いて細菌染色体に遺伝子を安定に導入できる。そのような条 件のもとでは、ｐＬプロモーターは、ｃＩリプレッサー無しでも細胞内に維持す ることが可能である。細胞を高温で培養すると、低レベルの発現が見られ、一方 、細胞を低温に移行させると高レベルの発現が見られる。 プラスミドの使用を可能ならしめ且つ蛋白質産生を一層向上させるべく系をさ らに改良するために、高温で活性を有するが低温では有しない突然変異体リプレ ッサーを、大腸菌染色体に導入するかまたはプラスミドベクター内にサブクロー ニングすることができる。このような突然変異体リプレッサーが供給された場合 には、細胞培養物はより低温に移行せしめられる前に３７℃で生育させてクロー ニングされた遺伝子を発現せしめることができるであろう。そのような系はプラ スミドとして利用することができる。より高い蛋白質安定性を得るためには、宿 主は、温度を低下させる前に４２℃で培養しなければならない可能性がある。お そらく、発現されるべき遺伝子ごとに特定の生育条件を開発する必要があろう。 このように、相同的組換えは本質的ではない。 ｐＬプロモーターとは異なり、ｃｓｐＡプロモーターの正あるいは負のレギュ レーターは同定されていない。本発明による適切なプロモーター構築物を用いる と、プロモーター活性を直接操作することができる。適切な融合物を担持する細 胞を３７℃あるいはそれ以上の温度で培養すると、培養温度の変化（例えば温度 を約２０℃未満に下げるなど）によって融合物がもたらされる。 本発明は更に、発現ベクター内のサブクローニングされた遺伝子によってコー ドされる望ましい蛋白質を産生する方法を提供するものであって、本方法は、発 現ベクターを適切な宿主細胞（好ましくは細菌宿主細胞）に導入し、培地中の細 胞を維持し、次いで産生された蛋白質を単離することを含む。 細胞増殖は、細胞を１５℃〜４５℃の間で培養することにより容易に行うこと ができる。好ましくは、細胞は約３７℃で適切な期間培養維持することによって 生育させ、次いで約２０℃未満の温度（１０℃〜２０℃）で適切な期間培養維持 して蛋白質を産生させる。細胞を高温で培養した後、低温に移すが、この間、４ 時間毎に（７２時間経過後まで）サンプリングして活性の最高値を決定する。サ ンプルはまた、蛋白質ゲル電気泳動法によっても評価する。 蛋白質の単離には、蛋白質精製のために本分野で知られているいずれの技法を も利用することができる。例えば、クロマトグラフィー、遠心分離、差分溶解度 法、等電点電気泳動法などである。しかしながら、好ましくは、異種(foreign) 蛋白質を適切な手段によって細菌宿主細胞から得て、その蛋白質を天然活性形態 で回収することが好ましい。細胞は、標準的手続きによって収穫、溶解させる。 蛋白質のｉｎ ｖｉｔｒｏでの凝集を防ぐためには、特定の緩衝条件が要求され ることもあり得る。 本発明においては、標準的な富化培地や最少培地を用いることができる。上記 のように、適切なベクターを用いれば、抗生物質を培養培地に添加することは不 要であって、これはある種の蛋白質の産生においては特に有利な点である。 以下の実施例は本発明を更に詳述するものであるが、当然ながらそれらは本発 明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。 実施例１： 実験に使用した材料および方法 菌株、ファージおよびプラスミド 本実験では、標準的な分子および遺伝子技法、即ち、菌株・ファージ・プラス ミドの発生、ゲル電気泳動、クローニングおよび配列等のＤＮＡ操作、プライマ ー伸張アッセイなどの技法を利用した。これらは当業者に知られており、かつ標 準的な実験マニュアル（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、「分子クローニング：実 験マニュアル 、第２版（コールドスプリングハーバー社、ニューヨーク州、１９ ９２年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「分子生物学における現代の実験計画」（１９８ ７年）；Ｍｉｌｌｅr、「細菌遺伝学概説（コールドスプリングハーバー社、ニ ューヨーク州、１９９２年））に詳細に記載されている。分子操作に使用する制 限酵素および他の酵素は市販のものを購入し、その使用説明書どおりに使用した 。菌株の培養、ファージの維持、増殖および力価の測定には、標準試薬、培地お よび培養法を利用した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、「分子クローニング：実験マニュ アル 、第２版（コールドスプリングハーバー社、ニューヨーク州、１９９２年） ；Ｍｉｌｌｅr、「分子遺伝学実験（コールドスプリングハーバー・ラボラトリ ープレス、ニューヨーク州、コールドスプリングハーバー、１９７２年）。好ま しいものとして、バクト・トリプトン（１０ｇ／ｌ）、バクト・イースト抽出物 （５ｇ／ｌ）およびＮａＣｌ（１０ｇ／ｌ）を含むルリア−ベルタニ（ＬＢ）培 地を細胞を増殖するために使用した。 Ｅ．ｃｏｌｉの菌株Ａ７５０６は、λＡ０１１０７プロファージを担持するＣ ＳＨ５０（ａｒａΔ（ｌａｃ−ｐｒｏ）ｓｔｒＡ ｔｈｉ；Ｍｉｌｌｅｒ著の分 子遺伝学実験法 （コールドスプリングハーバー・ラボラトリーズプレス、ニュー ヨーク州、コールドスプリングハーバー、１９７２年）に記載されている）の誘 導体である。Ａ７５０６のｈｉｐ３：：ｃａｔ誘導体である菌株Ａ７５０７、お よびＡ７５０７のｈｉｍＡ８２：Ｔｎ１０誘導体であるＡ７５３３をＰｌｖｉｒ 形質導入により発生させた。 菌株Ａ６８２６はＣＳＨ５０誘導体である。菌株ＣＳＨ５０は補助物質（ビタ ミンＢ₁とプロリン）を含む最少培地プレート上で緩慢に増殖することが判明し た。ＣＳＨ５０の急速増殖コロニーを分離し、精製し、Ａ６８２６と名付けた。 菌株７８３３はＡ６８２６のλｃｓｐＡ ＥＬ−ｌａｃＺ誘導体であり、菌株７ ８３２はＡ６８２６のλｃｓｐＡ Ｓ−ｌａｃＺ誘導体である。 Ｅｃｏ ＲＩおよびＢａｍ ＨＩ部位に隣接(flanking)するヌクレオチドを含 むｐＬプロモーター領域に相当するＤＮＡ配列を図１に示し、配列番号１として 記載した。プラスミドｐＨＧ８７は図２に示すように、野性型ｐＬプロモーター からなるフラグメントを含む。 プラスミドｐＨＧ９１の制限酵素地図を図３に示す。プラスミドｐＨＧ９１は 突然変異体ｐＬプロモーターｐＬ−９Ｇ−５０を含む。この突然変異体プロモー ターの配列は、塩基対２２０における（Ａ：Ｔ）から（Ｇ：Ｃ）への突然変異、 および塩基対１７７〜１８０におけるＡＡＴＴに代わるＧＧＣＣ配列を特徴とす るもので、配列番号２として記載される。 プラスミドｐＨＧ９１は、ｐＬ−９Ｇ−５０プロモーターを、プラスミドｐＨ Ｇ８６に存在するｌａｃＺリポーター遺伝子に融合させることにより得られた（ Ｇｉｌａｄｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９２）２２４：９３７−９４８ ）。次いでカナマイシン耐性遺伝子（Ｋｍ^R）をｐＨＧ９１のｂｌａ遺伝子内に 位置するＰｓｔ Ｉ制限部位内に挿入し、プラスミドｐＨＧ９１Ｋを生成させた 。全長形態のとき、ｌａｃＺ遺伝子はβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）をコ ードし、ｂｌａ遺伝子（ａｍｐと表記されることもある）はβ−ラクタマーゼを コードし、宿主細胞にアンピシリン耐性を付与する。 ファージλＡ０１１０７は、図４に示すように、ファージλＢ２９９とプラス ミドｐＨＧ９１Ｋの組換え産物である。ファージλＢ２９９（国立衛生研究所の 分子遺伝学研究室の微生物遺伝学部門、Ｒ．ワイセンバーグ製造）は、トランケ ートされたｌａｃＺおよびｂｌａ遺伝子に隣接するｓｕｐＦ遺伝子を担持する。 ファージλＢ２９９とプラスミドｐＨＧ９１Ｋとの組換えにより、ｓｕｐＦ遺伝 子を、ファージλＡ０１１０７におけるｐＨＧ９１ＫからのｐＬ−ｌａｃＺ融合 によって置き換えることができる。 プラスミドｐｈｉｐ⁺、ｐＲ８７ＧおよびｐＡ９０ＤはｐＥＭＢＬ１８誘導体 であり、野性型ｈｉｐ遺伝子およびその突然変異体対立遺伝子βＲ８７およびβ Ａ９０Ｄを担持する（Ｍｅｎｅｇｅｒｉｔｓｋｙら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（ １９９３）２３１：６４６−６５７）。 ｃｓｐＡプロモーターフラグメント（−２１４〜＋９５の位置から３０９ｂｐ の長さ；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、ＰＮＡＳ（１９９０）８７：２８３− ２８７）は複製連鎖反応（ＰＣＲ；ＰＣＲプロトコル−方法と応用へのガイド、 Ｉｎｎｉｓら、アカデミックプレス社（１９９０））を使用してクローニングし 、プラスミドｐＨＧ８６のレポーターｌａｃＺ遺伝子の上流部に挿入した。プラ スミドｐＩＫ８６（図５に示す）はＫｍ^Rをｂｌａ遺伝子に挿入することにより ｐＨＧ８６から構成した。次いで、異なる大きさのｃｓｐＡプロモーター領域部 分を有する一群の構成物をｐＩＫ８６から作った。ｐｃｓｐＡプロモーター領域 を担持する異なる大きさのフラグメントは、ｃｓｐＡクロモソーム領域を担持す るラムダファージを使用したＰＣＲによりそれぞれ発生させた。２つのプライマ ー、すなわち、５’領域のプライマー相同染色体であってＥｃｏＲＩ制限部位を 担持するもの；および３’領域のプライマー相同染色体であってＢａｍＨＩ制限 部位を担持するもの、を使用した。かくして、生成したｃｓｐＡプロモーター構 成物の制限酵素地図を決定した。 ｃｓｐＡプロモーター領域を含むプラスミドの中で、ｐＩＫ−ＥＬは、図６に 示すように、最大の上流ｃｓｐＡプロモーター領域を含む。ｐＩＫ−ＥＬベクタ ーにおいてサブクローニングされたｃｓｐＡフラグメントの配列を図７におよび 配列番号３として示す。図８に示すように、より小さなｃｓｐＡプロモーターフ ラグメントはｐＩＫ−Ｌ中にサブクローニングした。ｐＩＫ−Ｌベクターにおい てサブクローニングしたｃｓｐＡフラグメントの配列は図９におよび配列番号４ として示した。同様に、ｐＩＫ−Ｍは、図１０に示すように、さらに小さなｃｓ ｐ Ａフラグメントを含む。ｐＩＫ−Ｍベクターにおいてサブクローニングしたｃ ｓｐ Ａフラグメントの配列は、図１１におよび配列番号５として示した。最少のｃｓｐ Ａプロモーターフラグメントは、図１２に示すように、ｐＩＫ−Ｓ中にサ ブクローニングした。ｐＩＫ−Ｓベクター中でサブクローニングしたｃｓｐＡフ ラグメントの配列は図１３におよび配列番号６として示す。 ｃｓｐＡは強力なプロモーターであるから、高温下でｓｃｐＡプロモーターに よって駆動された発現レベルを減少させるために、図１４に示すように、これら の構成物を引き続き相同染色体組換えによりファージλに転移させた。このファ ージはその後Ｅ．ｃｏｌｉ染色体中に組み込んだ。プラスミドとλＢ２９９間の すべての交差は、菌株Ａ６８２６において行った。 ＤＮＡフラグメントの調製 プライマー伸張アッセイに使用したＤＮＡフラグメントは、Ｔａｑポリメラー ゼ（プロメガ社、ウィスコンシン州マディスン）を使用するＰＣＲにより得られ た。２７５−ｂｐ ｐＬ ＤＮＡフラグメントを得るため、プライマー１９２１ ５’−ＡＡＧＡＡＴＴＣＧＧＧＴＴＴＴＣＴＴＴ−３’（配列番号７に記載する ように、ｐＬは−２２８〜−２１７に位置する）、プライマー１５２６ ５’− ＡＡＧＡＧＣＧＴＣＡＣＣＴＴＣ−３’（配列番号８に記載するようにｐＬは＋ ４０〜＋２６に位置する）、およびテンプレートとしてのプラスミドｐＨＧ２４ ４ ＤＮＡを使用した（Ｇｉｌａｄｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９２）２２４ ：９３７−９４８）。すべてのＤＮＡフラグメントは、（γ³²Ｐ）ＡＴＰ により末端を標識し（アマーシャム社、イリノイ州アーリントンハイツ）、５％ のポリアミドゲル上で精製した。 酵素アッセイ β−ｇａｌ特異活性のアッセイは、ミラー法（Ｍｉｌｌｅr、分子遺伝学にお ける実験法 （コールドスプリングハーバー・ラボラトリープレス、ニューヨーク 州コールドスプリングハーバー、１９７２））により行った。 実施例２： ｐＬプロモーターの温度反応 無毒化したｐＬ−９Ｇ−５０プロモーターによって引き起こされた遺伝子発現 に対しての温度の影響をテストするために、このプロモーターをｌａｃＺ遺伝子 に融合し、ファージλを使用してＥ．ｃｏｌｉ染色体のａｔｔ部位に挿入し、菌 株Ａ７５０６を生成した。 菌株Ａ７５０６の培養物をＬＢ培地中で飽和するまで種々の温度で生育させ、 β−ｇａｌ活性についてアッセイを行った。図１５から分かるように、細胞中に 存在するβ−ｇａｌのレベルは、低い温度（即ち、約２０℃未満）では非常に高 く、温度上昇とともに急激に減少した。菌株Ａ７５０７の培養物を使用した場合 にはこのような温度の影響は観察されなかった。菌株Ａ７５０７は、宿主組み込 みファクターである、ｐＬプロモーターの正のレギュレーターを生成しない菌株 Ａ７５０６のｈｉｐ誘導体である。菌株Ａ７５０７では、全ての温度でβ− ｇａｌのレベルか低かった。 これらの結果は、ｐＬ−９Ｇ−５０プロモーターによって引き起こされた遺伝 子発現は低い温度で引き起こされることを確認するものである。 実施例３： 温度シフトの実験 無毒化したｐＬ−９Ｇ−５０プロモーターの温度変化に対する応答を調べるた めに、菌株Ａ７５０６の染色体内に存在する上記プロモーターのｌａｃＺ融合に ついての温度シフト実験を行った。 これらの実験のために、菌株Ａ７５０６（ｈｉｐ⁺）と菌株Ａ７５０７（ｈｉ ｐ^-）の培養物を、３７℃または約１５〜１６℃の温度で急激に生育させ、その 後、他方の温度に移した（即ち、３７℃で生育させた培養物を約１５〜１６℃に 移し、約１５〜１６℃で生育させた培養物を３７℃に移した）。温度シフトの後 、異なる時刻にβ−ｇａｌのレベルと細胞密度を測定した。 急激に生育させたＡ７５０６細胞を３７℃から１５〜１６℃に移した時、図１ ６ａに示すようにβ−ｇａｌの劇的な増加が観察された。この増加は、図１６ｂ に示すように低温ショックが原因の細胞生育の大きな遅れにも関わらず生じ、野 性種のｈｉｐ遺伝子の存在に依存した。これは、同じ条件のＡ７５０７細胞では 観察されなかった。 これに対し、急激に生育させたＡ７５０６細胞を１５〜１６℃から３７℃に移 した時、図１６ｃに示すようにβ−ｇａｌの特異活性の急速な停止が観察された 。このβ−ｇａｌの特異活性の減少は、（図１６ｄに示すように）細胞分裂によ る現存の酵素の希釈と相関がある。多分、高い温度への移動の後、ｐＬからの転 写が急激に停止したためであろう。 これらの結果は、ｐＬ−９Ｇ−５０プロモーターは、３７℃から約１５〜１６ ℃への移動により、高いレベルでの遺伝子の発現を引き起こすことができること を確認するものである。 実施例４： プロモーターの活性に対する温度の影響 ｐＬ−９Ｇ−５０プロモーターおよびＰｃｓｐＡプロモーターのそれぞれをオ ペロン融合でｌａｃＺ遺伝子に融合させ、相同組み換えによりファージλＢ２９ ９に移し、上記のように細菌の染色体のａｔｔ部位に挿入した。その真正のオペ ロンからのｐｌａｃ活性を測定するために菌株Ｎ９９をコントロールとして採用 した（ウエシマら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８９年）２１５：１８ ５〜１８９）。これらの実験は、ｐＬプロモーターの温度反応がそのプロモータ ーに特有のものであるか否かを判定するために行った。 これらの実験のために、細胞培養物をＬＢ培地中で飽和するまで３７℃または 約１５〜１６℃で生育させ、その後、β−ｇａｌ活性についてアッセイを行った 。結果を表１にまとめる。 これらの結果は、ｐＬ−９Ｇ−５０だけでなくＰｃｓｐＡプロモーターも、低 い温度（即ち、約２０℃未満）で高レベルの遺伝子発現を引き起こし得ることを 確認するものである。約１５〜１６℃でこれらのプロモーターによって引き起こ される発現は、強力なプロモーターｐｌａｃによって引き起こされた発現に近づ く。これに対し、１５〜１６℃におけるｐｌａｃの発現は、３７℃に比較して約 １０〜２０％減少する。 これらの結果は、低い温度でｐＬプロモーターについて観察された高い酵素の レベルは、酵素の安定性が増したこと、またはタンパクの翻訳がより効率的にな ったことに起因するものでなく、ｐＬの転写が増加したことに起因することを示 唆するものである。ｐｌａｃプロモーターとは逆に、ｃｓｐＡプロモーターの１ ５〜１６℃における活性は３７℃における活性の２０倍以上であった。ｐＬプロ モーターはＰｃｓｐＡと同じ温度活性化プロフィルを示したことは注目に値す る。この温度反応はｐＬプロモーターの内在性の特性であり、個々のプロモータ ーの温度に対する反応は固有のもので、これはプロモーターのＤＮＡ配列内に埋 め込まれているようである。低い温度に対するｐＬプロモーターの反応の程度、 即ち３７℃に比べ１５〜１６℃で１４倍高くなるのは、ｃｓｐＡプロモーターと 類似している。しかし、これら２種のプロモーターＤＮＡ配列の間に、なぜこれ らが低い温度においてより活性が高いかを示す類似性はない。 したがって、ｐＬ−９Ｇ−５０プロモーターおよびＰｃｓｐＡプロモーターの 遺伝子発現を引き起こす作用は、細菌細胞の生育と複製が最適化される温度（即 ち、約３７℃）で最小となる。これは、細菌細胞の生育と複製が最少となる温度 （即ち、約２０℃以下）では、最大の遺伝子の発現を得るためにプロモーターを 採用できることを実証するものである。実施例５： ファージλとプラスミドとの間の組み換えによる単一コピー染色体 融合 種々のｐＩＫ−ｃｓｐＡ構築物について実施例４に類似した実験を行った結果 、これらも強力なプロモーターであり、事実、ＥＬ構築物およびＬ構築物は、宿 主内に維持するのが困難であることが確認された。多分、遺伝子の発現が高レベ ルである結果としての致死率によるものであろう。高い温度においてｃｓｐＡ構 築物によって引き起こされる発現のレベルを低減するために、（図１４Ａ〜Ｂに 示すように）相同組み換えによって構造体をファージλＢ２９９に移した。そし て、得られたファージを組み合わせ細菌染色体とし、細胞当たり単一のコピーが 得られた。 表２から分かるように、β−ｇａｌのレベルに反映される、種々のｃｓｐＡプ ロモーターによって引き起こされる遺伝子の発現は温度によって調節され、得ら れた菌株はｌａｃＺ遺伝子融合の単一のコピーしか含んでいないのにも関わらず 、これらの菌株における遺伝子の発現はかなり高い。 単一コピー系は極めて安定で、抗生物質を使用することなく醗酵手続きを実施 できる。ｐＬプロモーターについての上に示したものと類似した結果は、リプレ ッサーの不在下では維持できないｐＬの野性種のプロモーターを、単一コピーに おけるｌａｃＺの発現に向けることができることを示している。 これらの結果は、種々のｃｓｐＡプロモーター（およびｐＬ−９Ｇ−５０プロ モーター）は、低い温度において遺伝子の発現を効果的に引き起こし、細菌染色 体中に組み込まれた単一コピーの存在のみによって翻訳されたタンパクのレベル が高くなることを確認するものである。 実施例６： 低い温度でのｌａｃＺ発現に対するＰｃｓｐＡの影響 ｌａｃＺ発現に対するＰｃｓｐＡプロモーターの影響をテストするために、Ｅ Ｌ−ｌａｃＺ融合（即ち、菌株Ａ７８３３）、Ｍ−ｌａｃＺ融合（即ち、菌株Ａ ７８３１）およびＳ−ｌａｃＺ融合（即ち、菌株Ａ７８３２）を細菌染色体中の 単一コピーとしてファージλ上に有する細胞を試験した。 これらの試験のために、ＬＢ中で培養物を３７℃で成育させ、約１５〜１６℃ に移し、この時を時刻零とした。１時間、２時間、４時間および６時間の間隔で サンプルを取り出し、ＲＮＡを分離し、標識化プライマーと逆転写酵素を用いた プライマー伸張によりアッセイを行った。転写開始部位に対応するバンドの放射 能を測定した。 図１７から分かるように、低い温度への移送後１時間が経過しただけで内因性 のｃｓｐＡ ｍＲＮＡ（即ち、□）が高レベルで現れる。これに対し、ＥＬ−ｌ ａｃ Ｚ（即ち、●）とＭ−ｌａｃＺ（即ち、■）のｍＲＮＡは、長期に亘って高 レベルが維持される。Ｓ−ｌａｃＺ（即ち、▲）ｍＲＮＡの規定レベルだけは全 ての温度で観察された。 これらの結果は、ＥＬプロモーターとＭプロモーターは、低い温度で遺伝子発 現を引き起こすのに使用でき、これらのプロモーターによる発現の増加は転写さ れたｍＲＮＡのレベル増加に反映されることを確認するものである。 本明細書で引用された参考文献は、その全てを本明細書の一部を構成するもの としてここに参照する。 好適な実施例に重点を置いて本発明を述べたが、当技術分野における改良に起 因する変形を含め好適な実施例の変形を使用でき、またこれらの変形を包含する ために本明細書に詳細に記載された以外の方法で本発明を実施することを意図す るものであることは当業者にとって明らかである。従って、本発明は、以下の請 求の範囲によって定義された発明の精神および範囲に含まれる全ての変形例を含 むものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ジラディ，ヒラ イスラエル メヴァッセレト ジオン 97706，ハシャロム ストリート 25， ピー．オー．ボックス 570 (72)発明者 ゴールデンバーグ，ダニエル イスラエル マアレ アドミン 97500, ハキノール ストリート ９／１ (72)発明者 コビ，シミ イスラエル エルサレム 93784，イース ト タルピヨット，アニュッセイ マッシ ュハッド ストリート １／６ (72)発明者 アザール，イディット イスラエル レホボット 76232， ハッ ショームリーム ストリート ５／10

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．核酸配列を有する発現ベクターであって、前記核酸配列は、遺伝子と、前 記ベクターが細菌宿主中にあると共に温度を約２０℃未満に低下させた条件の下 で、前記遺伝子でコードされたペプチドまたは蛋白質の産生をコントロールする ことができるプロモーターと、を有するものである発現ベクター。 ２．核酸配列が、プロモーターと遺伝子の間に位置する開始コドンを更に有し 、当該開始コドンにてペプチドまたは蛋白質の翻訳が開始される請求項１記載の ベクター。 ３．核酸配列が、リボソーム結合部位を更に有し、ペプチドまたは蛋白質の翻 訳をコントロールするものである、請求項２記載のベクター。 ４．リボソーム結合部位が、プロモーターと開始コドンの間に位置する、請求 項３記載のベクター。 ５．核酸配列が、他のコントール要素を含有する、操作可能に結合した付加的 なＤＮＡ配列を更に有する、請求項４記載のベクター。 ６．ベクターが環状で二重鎖ＤＮＡを有するものである、請求項１記載のベク ター。 ７．ベクターがバクテリオファージを有するものである、請求項１記載のベク ター。 ８．プロモーターがｐＬ及びＰｃｓｐＡプロモーターからなる群から選択され るものである、請求項１記載のベクター。 ９．プロモーターがｐＬプロモーターである、請求項８記載のベクター。 １０．プロモーターがＰｃｓｐＡプロモーターである、請求項８記載のベクター 。 １１．ｐＬプロモーターが一種以上の突然変異を有する、請求項９記載のベクタ ー。 １２．プロモーターが配列番号１の配列を有する、請求項１記載のベクター。 １３．プロモーターが配列番号２の配列を有する、請求項１記載のベクター。 １４．プロモーターが配列番号３の配列を有する、請求項１記載のベクター。 １５．プロモーターが配列番号４の配列を有する、請求項１記載のベクター。 １６．プロモーターが配列番号５の配列を有する、請求項１記載のベクター。 １７．プロモーターが配列番号６の配列を有する、請求項１記載のベクター。 １８．λＡ０１１０７を細胞株ＡＴＣＣ Ｎｏ．７５７１７内に有する、請求項 １記載のベクター。 １９．λＰｃｓｐＡを細胞株ＡＴＣＣ Ｎｏ．７５７１８内に有する、請求項１ 記載のベクター。 ２０．プラスミドｐＩＫ−Ｍを細胞株ＡＴＣＣ Ｎｏ．７５７１９内に有する、 請求項１記載のベクター。 ２１．プラスミドｐＩＫ−ＥＬを細胞株ＡＴＣＣ Ｎｏ．７６７２０内に有する 、請求項１記載のベクター。 ２２．請求項１２のベクターを有する宿主細胞。 ２３．請求項１３のベクターを有する宿主細胞。 ２４．請求項１４のベクターを有する宿主細胞。 ２５．請求項１５のベクターを有する宿主細胞。 ２６．請求項１６のベクターを有する宿主細胞。 ２７．請求項１７のベクターを有する宿主細胞。 ２８．請求項１２のベクターを有する核酸。 ２９．請求項１３のベクターを有する核酸。 ３０．請求項１４のベクターを有する核酸。 ３１．請求項１５のベクターを有する核酸。 ３２．請求項１６のベクターを有する核酸。 ３３．請求項１７のベクターを有する核酸。 ３４．請求項１記載の発現ベクターを適切な宿主細胞に導入し、当該細胞を培養 で維持して蛋白質を生成させ、次いで当該蛋白質を単離することを含む蛋白質を 生産する方法。 ３５．細胞を培養にて約３７℃で適切な期間維持して増殖させ、次いで約２０℃ 未満の温度で適切な期間培養を維持して蛋白質を生成させる請求項３４記載の方 法。 ３６．プロモーターがｐＬプロモーターであって、図１に示す−４〜＋４の領域 がＧＣＡＣＡＴＣＡからＧＧＡＣＡＡＧＡに突然変異したものである、請求項８ 記載のベクター。 ３７．プロモーターがｐＬプロモーターであって、図１に示す−１０の領域がＣ ＡＴＡＣＴからＴＡＴＡＡＴに突然変異したものである、請求項８記載のベクタ ー。 ３８．プロモーターがｐＬプロモーターであって、図１に示す−４０〜−７８の 領域が除去されたものである、請求項８記載のベクター。 ３９．プロモーターがｐＬプロモーターであって、図１に示す−９の領域がＣＡ ＴＡＣＴからＧＡＴＧＣＴに突然変異したものである、請求項８記載のベクター 。