JP3793812B2 - 低温での組み換えタンパク質の発現に適した新規発現ベクター - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、Rhodococcus属細菌中で外来遺伝子を誘導発現し得る発現ベクターに関する。
【0002】
また、本発明は、低温において宿主細胞中で組み換えタンパク質を発現することができる誘導型発現ベクターおよび該ベクターを用いて低温で組み換えタンパク質を発現させる方法に関する。さらに、本発明は約15℃を超える中高温条件下では発現産物が宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質をコードする遺伝子を、低温条件下で増殖可能なRhodococcus属細菌で誘導発現し得るRhodococcus属細菌用誘導型発現ベクターおよび該ベクターを含む低温条件下で増殖可能なRhodococcus属細菌を用いて約15℃を超える中高温条件下では発現産物が宿主細胞の増殖を阻害する組み換えタンパク質を低温で発現させる方法に関する。
【0003】
【従来の技術】
現在、真核生物由来のタンパク質を組み換え体として大量調製するためには大腸菌を宿主とした発現システムが広く用いられている(Weickert et al., Curr. Opin. Biotechnol. 7 494-499 (1996)、 Baneyx, Curr. Opin. Biotechnol. 10 411-421 (1999))。大腸菌は中温菌で、18℃から37℃で生育するが、組み換えタンパク質を発現させるための培養温度も上記温度範囲内でなければならない。しかし、真核生物由来のタンパク質がその活性を示すのもまた同じ温度範囲内であり、そのため、いくつかのタンパク質は組み換え体として大腸菌内で発現させると、大腸菌の生育を阻害してしまい、その結果、有意な量の組み換えタンパク質が得られないことがある。
【0004】
大腸菌以外ではSaccharomyces cerevisiaeやPichia pastoris (Cereghino and Cregg, Curr. Opin. Biotechnol. 10 422-427 (1999))、Sf9細胞(Miller, Curr. Opin. Genet. Dev. 3 97-101 (1993))など真核細胞を宿主として用いた発現システムが知られているが、これらも培養温度が30℃前後でないと組み換えタンパク質を効率よく発現させることが出来ず、同様の理由からその調製が困難な場合がある。例えば、組み換えタンパク質の産生に通常用いられている昆虫細胞Sf9を用いて外来タンパク質の産生を行う場合、その産生のための至適温度は約28℃であり、最低温度は約18℃である(Agathos et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 589 372-398(1990)、Faber et al., Yeast 11 1331-1344 (1995))。また、酵母(Pichia pastoris)を用いて外来タンパク質の産生を行う場合、その産生のための至適温度は約30℃であり、最低温度は約15℃である(Brock et al., J. Membr. Biol. 180 147-161 (2001)、Sarramegna et al., Protein Expr. Purif. 24 212-220 (2002))。すなわち、昆虫細胞Sf9の好適生育温度範囲は約18℃以上であり、酵母の好適生育温度範囲は約15℃以上である。またこれらを宿主とした場合、いくつかのタンパク質は糖鎖などの修飾を受けてしまい、その後の立体構造解析などの機能解析に不都合なことがある。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、大腸菌をはじめとする他の組み換えタンパク質発現システムで発現させることが出来ないタンパク質を発現させることを目的とする。例えば、15℃を超える中高温条件下で大腸菌等の形質転換宿主細胞中で発現させることができないタンパク質を低温で発現させることを目的とする。
また、本発明は、Rhodococcus属細菌を用いて外来の組み換えタンパク質を誘導発現させることを目的とする。
【0006】
【課題を解決するための手段】
上記問題を解決するためには、組み換えタンパク質の活性を抑制するために、低温で発現させることが有効だと考えられる。大腸菌においては、低温誘導性プロモーターを用いた15〜16℃での発現システムが、最も低い温度で組み換えタンパク質を産生させた例である(特公平10-503090、 Mujacic et al., Gene 238 325-332 (1999))。また、上述のように昆虫細胞や酵母でも15℃〜18℃での組み換えタンパク質の産生が従来知られていた最も低い温度での組み換えタンパク質の産生である。従って、従来の公知の宿主細胞を用いての組み換えタンパク質を発現させ得る最低温度である15℃〜18℃以下、好ましくは4℃前後で発現させることが有効であると考えられた。しかし、15℃以下、特に4℃前後では上述の宿主細胞はいずれも生育が困難であり、タンパク質の産生も不可能であるため、約15℃以下の低温、特に4℃前後でも生育できる細菌を宿主とした発現システムを用いれば良いと考えられる。そこで、本発明者らは、Rhodococcus属細菌を宿主とした、広範な温度域(4℃から32℃前後)において、外来蛋白質を発現せしめる誘導型発現ベクターを構築することによって、かかる問題を解決しようとした。
【0007】
Rhodococcus erythropolis(Larkin et al., Antonie van Leeuwenhoek 74 133-153 (1998))は4℃から35℃までの広範な温度域で生育する放線菌で、同菌と大腸菌との両細胞種で自律複製可能な複合ベクター(De Mot et al., Microbiology 143 3137-3147 (1997))も開発されており遺伝子工学の研究も容易である。またRhodococcus属細菌全般でも、大腸菌との複合ベクターが開発されており(特開平5-64589、特開平8-56669)、外来遺伝子を構成的に発現せしめる汎用的発現ベクターも存在する(特開平10-248578)。
【0008】
しかし、効率よく迅速に低温でタンパク質を発現させるためには、容易に、厳密に、強力にタンパク質の発現調節が出来る誘導型発現ベクターの開発が不可欠である。すなわち、まず発現を抑制した状態で、30℃において細胞を増殖させ、その後温度を例えば4℃に下げて発現を誘導するのである。しかし、これまでに同菌においてそのような誘導型発現ベクターの報告がなく、他種の細菌由来の発現誘導システムを流用することが有効だと考えられた。
【0009】
Streptomyces coelicolorはRhodococcus erythropolisと同じく放線菌の一種で、同菌では抗生物質チオストレプトンの添加によって発現が誘導される一連の遺伝子群が知られていた(Murakami et al., J. Bacteriol. 171 1459-1466 (1989))。そのうちの一つTipA遺伝子は253アミノ酸からなるタンパク質をコードしており、このTipAタンパク質はチオストレプトンと共有結合し、自身のプロモーター領域にTipA-チオストレプトン複合体として作用し、自身の構造遺伝子からの転写を強力に促進することが知られていた(Holmes et al., EMBO J. 12 3183-3191 (1993)、 Chiu et al., Biochemistry 35 2332-2341 (1996))。また、このTipA遺伝子プロモーターとTipA構造遺伝子を用いた誘導型発現ベクターも開発されており、Streptomyces属内で外来タンパク質を発現させた例がある(Enguita et al., FEMS Microbiol. Lett. 137 135-140 (1996))。Rhodococcus erythropolisにおいても、TipA構造遺伝子、並びにTipA遺伝子プロモーターの下流に標的タンパク質の構造遺伝子を連結した遺伝子群を導入したベクターを構築すれば、このStreptomyces属細菌同様に、誘導型発現ベクターになりうると考えられるが、その報告はなかった。
【0010】
また、約15℃以下の低温、特に4℃で組み換えタンパク質を生産可能になれば、宿主の増殖を阻害するタンパク質を生産させるだけでなく、以下に述べるような利点もあると考えられる。
【0011】
大腸菌で組み換えタンパク質を37℃で発現させると、封入体と呼ばれる不活性なタンパク質の凝集を作る場合がある。しかし、同一のタンパク質でも発現時の温度を30℃以下にすると活性のある可溶性のタンパク質が生産される例が多数知られている(Schein and Noteborn, Bio/Technology 6 291-294 (1988)、 Piatak et al., J. Biol. Chem. 263 4837-4843 (1988)、 Schirano and Shibata, FEBS Lett. 271 128-130 (1990)、 Vasnia and Baneyx, Protein Expr. Purif. 9 211-218 (1997)、 Lin et al., Protein Expr. Purif. 1 169-176 (1990))。従って、約15℃以下の低温、特に4℃前後での発現システムが構築されればこの可溶化の問題も解決されると考えられる。
【0012】
さらに、好適生育温度範囲が20℃以下の細菌である好冷菌、低温環境下に生存する変温動物、低温環境下に生存する植物由来のタンパク質も約15℃以下の低温、特に4℃前後での生産が好ましいと考えられる。これは、これらのタンパク質は温度が高い場合、活性のあるタンパク質として発現されないことがあると考えられるからである。これに関しては、好冷菌由来のα-amylaseを好冷菌を宿主として発現させた例が唯一存在するものの(Tutino at al., Extremophiles 5 257-264 (2001))、発現誘導型のベクターではなく、迅速に大量生産させるのは困難だと考えられる。
【0013】
そこで本発明者らは、Rhodococcus属細菌中で外来タンパク質を誘導発現し得る発現ベクターおよび約15℃以下の低温で外来タンパク質を誘導発現し得る発現ベクターの構築について鋭意検討を行い本発明を完成させるに至った。
【0014】
すなわち、本発明は以下の通りである。
(1) 宿主細胞中で外来遺伝子を誘導物質により誘導発現し得る発現ベクターであって、該宿主以外の宿主の好適生育温度範囲以下の温度で発現し得る発現ベクター。
(2) 宿主細胞中で外来遺伝子を誘導物質により誘導発現し得る発現ベクターであって、15℃以下の温度で発現し得る発現ベクター。
(3) 4℃で発現し得る(1)または(2)の発現ベクター。
(4) 宿主細胞がRhodococcus属細菌である、(1)から(3)のいずれかの発現ベクター。
(5) Rhodococcus属細菌がR. erythropolis、R. fasciansおよびR. opacusからなる群から選択される、(4)の発現ベクター。
【0015】
(6) 誘導物質がチオストレプトンである、(1)から(5)のいずれかの発現ベクター。
(7) 外来遺伝子が、15℃を超える中高温条件下で宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質をコードする、(1)〜(6)のいずれかの発現ベクター。
(8) 誘導物質により発現を調節し得るプロモーター配列、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位を含む(1)〜(7)のいずれかの発現ベクター。
(9) (1)〜(8)のいずれかの発現ベクターを含む形質転換体。
(10) (1)〜(8)のいずれかの発現ベクターを用いてタンパク質を産生する方法。
【0016】
(11) 宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に該宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質をコードする遺伝子を、該宿主細胞の好適生育温度範囲より低い好適生育温度範囲を有する他の宿主細胞中で誘導物質により誘導発現し得る誘導型発現ベクター。
(12) 4℃で発現し得る(11)の発現ベクター。
(13) 宿主細胞がRhodococcus属細菌である、(11)または(12)の発現ベクター。
(14) Rhodococcus属細菌がR. erythropolis、R. fasciansおよびR. opacusからなる群から選択される、(13)の発現ベクター。
(15) 誘導物質がチオストレプトンである、(11)から(14)のいずれかの発現ベクター。
【0017】
(16) 誘導物質により発現を調節し得るプロモーター配列、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位を含む(11)〜(15)のいずれかの発現ベクター。
(17) (11)〜(16)のいずれかの発現ベクターを含む形質転換体。
(18) (11)〜(16)のいずれかの発現ベクターを用いてタンパク質を産生する方法。
(19) Rhodococcus属細菌中で外来遺伝子を誘導物質により誘導発現し得る発現ベクター。
(20) Rhodococcus属細菌がR. erythropolis、R. fasciansおよびR. opacusからなる群から選択される、(19)の発現ベクター。
【0018】
(21) 誘導物質がチオストレプトンである、(19)または(20)の発現ベクター。
(22) TipA遺伝子プロモーター配列、外来遺伝子を導入可能な第1のマルチクローニング部位および転写終結配列を含む発現カセット、第2のプロモーター配列およびTipA遺伝子を含む誘導カセット、Rhodococcus属細菌用プラスミドの自律複製に必須なDNA領域ならびにチオストレプトン耐性遺伝子を含む、(19)〜(21)のいずれかの発現ベクター。
(23) (19)〜(22)のいずれかの発現ベクターを含むRhodococcus属細菌形質転換体。
(24) (19)〜(22)のいずれかの発現ベクターを用いてタンパク質を産生する方法。
(25) 15℃を超える中高温条件下では発現産物が宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質をコードする遺伝子を、低温条件下で増殖可能なRhodococcus属細菌で誘導発現し得るRhodococcus属細菌用誘導型発現ベクター。
【0019】
(26) TipA遺伝子プロモーター配列、外来遺伝子を導入可能な第1のマルチクローニング部位および転写終結配列を含む発現カセット、第2のプロモーター配列およびTipA遺伝子を含む誘導カセット、Rhodococcus属細菌用プラスミドの自律複製に必須なDNA領域ならびにチオストレプトン耐性遺伝子を含む、外来遺伝子を低温条件下で増殖可能なRhodococcus属細菌内で誘導発現し得るRhodococcus属細菌用誘導型発現ベクター。
(27) さらに大腸菌用プラスミドの自律複製に必須なDNA領域を含み、大腸菌中で複製可能な(26)のRhodococcus属細菌用誘導型発現ベクター。
(28) TipA遺伝子プロモーターがTipA-LG10プロモーターである(26)または(27)のRhodococcus属細菌用誘導型発現ベクター。
(29) 配列番号106に表される塩基配列を有するpTip-NH1、配列番号107に表される塩基配列を有するpTip-NH2、配列番号108に表される塩基配列を有するpTip-CH1、配列番号109に表される塩基配列を有するpTip-CH2、配列番号110に表される塩基配列を有するpTip-LNH1、配列番号111に表される塩基配列を有するpTip-LNH2、配列番号112に表される塩基配列を有するpTip-LCH1、配列番号113に表される塩基配列を有するpTip-LCH2、pTip-CH1.1、pTip-CH2.1、pTip-LCH1.1およびpTip-LCH2.1からなる群から選択される(26)から(28)のいずれかのRhodococcus属細菌用誘導型発現ベクター。
(30) Rhodococcus属細菌がR. erythropolis、R. fasciansおよびR. opacusからなる群から選択される、(25)〜(29)のいずれかのRhodococcus属細菌用誘導型発現ベクター。
【0020】
(31) (25)から(30)のいずれかのRhodococcus属細菌用誘導型発現ベクターを含むRhodococcus属細菌形質転換体。
(32) 外来遺伝子として15℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質をコードする遺伝子を含む(25)〜(30)のいずれかのRhodococcus属細菌用誘導型発現ベクターを低温で増殖可能なRhodococcus属細菌に導入し、低温条件下でチオストレプトンを含む培地を用いて前記Rhodococcus属細菌用誘導型発現ベクター導入細菌を培養することを含む、15℃を超える中高温条件下では発現産物が宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質を低温で産生させる方法。
(33) 15℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、15℃を超える中高温条件下では宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質である、(32)のタンパク質を低温で産生させる方法。
(34) 15℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、大腸菌で15℃を超える中高温で発現させた場合に不活性な封入体を作るタンパク質である、(32)のタンパク質を低温で産生させる方法。
(35) 好冷菌または低温環境下に生存する動物もしくは植物由来のタンパク質をコードする遺伝子を含む(25)〜(30)のいずれかのRhodococcus属細菌用誘導型発現ベクターを低温で増殖可能なRhodococcus属細菌に導入し、低温条件下でチオストレプトンを含む培地を用いて前記Rhodococcus属細菌用誘導型発現ベクター導入細菌を培養することを含む、好冷菌または低温環境下に生存する動物もしくは植物由来のタンパク質を低温で産生させる方法。
【0021】
(36) 外来遺伝子を含む(25)〜(30)のいずれかのRhodococcus属細菌用誘導型発現ベクターを低温で増殖可能なRhodococcus属細菌に導入し、15℃を超える中高温条件下および低温条件下でチオストレプトンを含む培地を用いて前記Rhodococcus属細菌用誘導型発現ベクター導入細菌を培養し、15℃以下の低温条件下でのみ発現される遺伝子を選択することを含む、15℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質をスクリーニングする方法。
(37) 15℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、15℃を超える中高温条件下では宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質である、(36)の15℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質をスクリーニングする方法。
(38) 大腸菌に導入し15℃を超える中高温で発現させよとした場合に、発現しないかまたは大腸菌の増殖を阻害する遺伝子を選択し、次いで該遺伝子を外来遺伝子として含む(25)〜(30)のいずれかのRhodococcus属細菌用誘導型発現ベクターを低温で増殖可能なRhodococcus属細菌に導入し、低温条件下でチオストレプトンを含む培地を用いて前記Rhodococcus属細菌用誘導型発現ベクター導入細菌を培養したときに発現しうる遺伝子を選択することを含む、15℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質をスクリーニングする方法。
(39) 15℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、大腸菌の増殖を30℃以上で阻害するタンパク質である、(38)のタンパク質をスクリーニングする方法。
(40) 15℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、大腸菌で15℃を超える中高温で発現させた場合に封入体を作るタンパク質である、(38)のタンパク質をスクリーニングする方法。
【0022】
(41) 15℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、15℃を超える中高温条件下では宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質である、(38)の15℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質をスクリーニングする方法。
(42) (36)から(41)のいずれかのスクリーニングする方法により得られた15℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質。
以下、本発明を詳細に説明する。
【0023】
【発明の実施の形態】
1.本発明の発現ベクターの構築
本発明の発現ベクターは、低温で増殖可能な細胞中で自律複製可能で、該ベクター中に組込まれた外来遺伝子を誘導的に発現し得るベクター、すなわち誘導型発現ベクターである。
【0024】
低温で増殖可能な細胞は限定されず、低温で増殖できる細胞ならば大腸菌、酵母等のいずれの微生物、昆虫細胞、哺乳類細胞等も使用しうる。確実に低温で増殖し得るという点でRhodococcus属に属する細菌、好ましくはR. erythropolis、R. fascians、R. opacus等が挙げられる。これら3種類のRhodococcus属細菌のうち、R. erythropolisが4℃での増殖速度が最も大きく他の2種はそれよりも劣る。しかし、本発明のベクターを用いたタンパク質の産生においては、細胞を増殖に適した温度で増殖させた後に、該細胞を低温に移して誘導的に発現させタンパク質を産生させ得る。従って、4℃で組み換え外来タンパク質を発現産生可能な限り増殖速度は問題とならず、R. erythropolis、R. fascians、R. opacusの3種のRhodococcus属に属する種すべてを好適に用い得る。
【0025】
低温とは、通常の細菌の至適増殖温度よりも低い温度をいい、4℃から18℃、好ましくは4℃から15℃、特に好ましくは4℃前後の温度をいう。通常の細菌の好適生育温度範囲は細菌の種類によっても異なるが約15℃から約40℃または約18℃から約40℃であり、本明細書においては約15℃を超える温度を中高温という。
【0026】
外来遺伝子とは、本発明のベクターを用いて発現産生させようとする標的タンパク質をコードする遺伝子であり、宿主細胞以外の生物由来のタンパク質をコードする遺伝子をいう。本発明のベクターに組込む外来遺伝子は、約15℃を超える中高温で発現させることが困難であるかまたは不可能なタンパク質をコードする遺伝子である。約15℃を超える中高温で発現させることが困難であるかまたは不可能なタンパク質とは約15℃を超える中高温で発現させようとしても、発現効率が低いか全く発現しないタンパク質をいう。このようなタンパク質として宿主細胞の至適生育温度範囲内の温度で発現できないが同一のまたは異なる種類の宿主細胞を用いた場合にその微生物の好適生育温度範囲内の温度よりも低温で発現できるタンパク質、宿主微生物の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に該宿主細胞にとって致死性となるが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度よりも低温ではそれらの宿主細胞に致死性でないタンパク質、宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に該宿主細胞の増殖を阻害するが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度よりも低温ではそれらの宿主細胞の増殖を阻害しないタンパク質、宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に封入体と呼ばれる不活性なタンパク質の凝集を作るが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度よりも低温でそれらの宿主細胞で発現させた場合に活性のある可溶性タンパク質となるタンパク質、好適生育温度範囲が20℃以下である好冷菌、低温環境下に生存する変温動物、低温環境下に生存する植物由来のタンパク質等をコードする遺伝子が挙げられる。
【0027】
ある遺伝子を大腸菌に基づく発現系で約15℃を超える中高温で発現させようとしたとき、または該遺伝子を本発明の発現ベクターに含ませRhodococcus属細菌で約15℃を超える中高温で発現させようとしたときに、発現しないかまたは発現量が外来遺伝子を本発明の発現ベクターに含ませRhodococcus属細菌で低温で発現させたときの発現量より有意に低い場合に、該タンパク質は約15℃を超える中高温で発現させることが困難であるかまたは不可能なタンパク質であるといえる。
【0028】
例えば、通常組み換えタンパク質の発現産生によく用いられる大腸菌を用いて発現させようとした場合に、大腸菌の好適生育温度範囲である18℃から37℃で発現できないか、大腸菌に致死的となるか、大腸菌の増殖を阻害するか、大腸菌内で凝集し不活性な封入体を作るタンパク質をコードする遺伝子を、Rhodococcus erythropolisに導入してRhodococcus erythropolisを4℃から18℃の低温で増殖させることにより前記タンパク質を効率的に大量に産生させることができる。また、Rhodococcus erythropolisを用いて約15℃を超える温度で発現させようとした場合に、発現できないか、Rhodococcus erythropolisに致死的となるか、Rhodococcus erythropolisの増殖を阻害するようなタンパク質を、Rhodococcus erythropolisを用いて4℃から15℃の低温で増殖させても前記タンパク質を効率的に大量に産生させることができる。
【0029】
約15℃を超える中高温条件下で宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質の種類は限定されないが、例えば後述の実施例に記載のタンパク質を例示することができる。これらのタンパク質をコードする遺伝子は、後述のプロモーターの下流にマルチクローニング部位を含ませておきその部位にコードする遺伝子を組込めばよい。
【0030】
外来遺伝子を誘導的に発現し得るベクターとは、一定の処理を施すことにより組込まれた外来遺伝子の発現が誘導されるベクターをいう。例えば、特定の調節物質で発現を誘導し得るプロモーターをベクターに組込むことにより誘導型発現ベクターを構築することが可能である。このようなプロモーターとして宿主細胞の培養培地中に誘導物質である薬剤を導入することにより特異的に誘導するプロモーターがあり、例えばチオストレプトン誘導性プロモーターであるTipA遺伝子プロモーターが挙げられる。このような誘導性プロモーターを組込んだベクターを導入した宿主細胞を15℃から18℃以上の細胞の増殖に適した温度で十分増殖させた後に、タンパク質の発現を誘導する薬剤を添加することにより目的のタンパク質を大量に発現させることができる。さらに、TipAタンパク質をコードするTipA遺伝子、TipA遺伝子の発現を誘導するThcA遺伝子プロモーター等の適当なプロモーターを組込めばよい。宿主細胞がRhodococcus属に属する細菌である場合、該細菌はチオストレプトンに対して感受性であるため、チオストレプトンに対しての耐性を付与するチオストレプトン耐性遺伝子等を組込む。
また、本発明の発現ベクターは、薬剤耐性遺伝子を含んでいてもよい。
【0031】
さらに、複数の宿主細胞に適合させるために複合ベクター(シャトルベクター)であってもよい。例えば、大腸菌およびRhodococcus属に属する細菌のいずれにも導入可能でこれらの宿主細胞中で外来遺伝子を発現しうるベクターが挙げられる。このようなベクターを構築する場合、それぞれの宿主細胞でプラスミドの自律複製に必須なDNA領域を組込んでおく必要がある。例えば、大腸菌とRhodococcus属に属する細菌に適した複合ベクターの場合、大腸菌用プラスミドの自律複製に必須なDNA領域としてColE1配列を、Rhodococcus属に属する細菌用プラスミドの自律複製に必須なDNA領域としてRepAおよびRepB遺伝子を組込めばよい。このような複合ベクターは大腸菌を用いて大量に複製することが可能である。
【0032】
本発明の発現ベクターは、少なくとも第1のプロモーター活性を有するDNA配列、外来遺伝子を組込むための第1のマルチクローニング部位を含む。さらに、第1のプラスミドの自律複製に必須なDNA領域、第1の薬剤耐性遺伝子、第1のマルチクローニング部位に連結された外来遺伝子、第1の転写終結配列を含む。第1のプロモーター活性を有するDNA配列としてTipA遺伝子プロモーターが挙げられ、TipA遺伝子プロモーターを含む場合、TipA遺伝子、およびTipA遺伝子を発現させるためのThcA遺伝子プロモーター等の第2のプロモーター配列、TipA遺伝子下流の第2の転写終結配列を含む。TipA遺伝子プロモーターはTipA-LG10プロモーター等のその配列を改変させたものでもよい。さらに、TipA遺伝子プロモーター誘導発現系を含む場合であって、宿主細胞がRhodococcus属細菌である場合には、Rhodococcus属細菌にチオストレプトンに対する耐性を付与するためにチオストレプトン耐性遺伝子を含んでいる必要がある。
【0033】
プロモーター活性を有するDNA配列、外来遺伝子および転写終結配列は発現カセット(Expression cassette)を構成し、TipA遺伝子およびTipA遺伝子発現用プロモーターは誘導カセット(Inducer cassette)を構成する。
【0034】
本発明のRhodococcus属細菌用発現ベクターは、タンパク質自体が15℃を超える中高温で発現可能なものならば低温ばかりでなく15℃を超える中高温においても該タンパク質を発現させ得る。
【0035】
本発明の発現ベクターとして、図9に記載のpTipベクターが挙げられ、マルチクローニング部位の構造により図9aに示すようにpTip-NH1、pTip-NH2、pTip-CH1、pTip-CH2、pTip-LNH1、pTip-LNH2、pTip-LCH1およびpTip-LCH2、がある。pTip-NH1、pTip-NH2、pTip-CH1、pTip-CH2、pTip-LNH1、pTip-LNH2、pTip-LCH1およびpTip-LCH2ベクターの配列はそれぞれ、配列番号106〜113に示される。さらに、本発明の発現ベクターとして、pTip-CH1、pTip-CH2、pTip-LCH1、pTip-LCH2において、マルチクローニング部位のXhoI部位以降の読み枠を市販のpETベクター(Novagen社)の読み枠と一致させるためにBglIIとXhoI部位を分けたpTip-CH1.1、pTip-CH2.1、pTip-LCH1.1、pTip-LCH2.1がある。
本発明のベクターは、後述の実施例の記載および図1から図8のベクター構築図に従えば容易に構築することができる。
【0036】
2.本発明のベクターの使用
本発明の発現ベクターを用いて、約15℃を超える中高温で発現させることが困難であるかまたは不可能なタンパク質を産生させることができる。このようなタンパク質として、宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現できないが同一のまたは異なる種類の宿主細胞を用いた場合にその細胞の好適生育温度範囲内の温度よりも低温で発現できるタンパク質、宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に該宿主細胞にとって致死性となるが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度よりも低温ではそれらの宿主細胞に致死性でないタンパク質、宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に該宿主細胞の増殖を阻害するが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の至適温度よりも低温ではそれらの宿主細胞の増殖を阻害しないタンパク質、宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に封入体と呼ばれる不活性なタンパク質の凝集を作るが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の至適温度よりも低温でそれらの宿主細胞で発現させた場合に活性のある可溶性タンパク質となるタンパク質、好適生育温度範囲が20℃以下である好冷菌、低温環境下に生存する変温動物、低温環境下に生存する植物由来のタンパク質が挙げられる。
【0037】
これらのタンパク質をコードする遺伝子を本発明の発現ベクターのマルチクローニング部位に適当な制限酵素を用いて組込み、該ベクターで宿主細胞を形質転換し、宿主細胞を低温条件下で培養することにより前記タンパク質を発現させることができる。宿主細胞は、低温で増殖し得る細胞である必要があり、Rhodococcus属に属する細菌、好ましくはR. erythropolis、R. fascians、R. opacus等が挙げられる。これらの細胞は低温で増殖可能であるが、増殖に好適な温度は15℃以上、さらに好適な温度は18℃以上、特に好適な温度は約30℃前後であり、遺伝子を組込んだタンパク質を発現させる前に、増殖に適した温度で十分増殖させたのちに、低温条件下に移しベクター中に含まれる誘導型プロモーターの機能を利用して適当な薬剤を用いてタンパク質を発現させることができる。
【0038】
本発明のベクターが、TipA遺伝子プロモーターを含む場合、チオストレプトンを培地に添加することによりタンパク質の発現が誘導される。この際チオストレプトンは、終濃度0.1μg/ml以上、好ましくは1μg/ml以上となるように添加すればよい。ただし、10μg/mlを越えると生育が悪くなる。
【0039】
本発明のベクターを用いて、約15℃を超える中高温で発現させることが困難であるかまたは不可能なタンパク質をスクリーニングすることができる。このようなタンパク質として、宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現できないが同一のまたは異なる種類の宿主細胞を用いた場合にその細胞の好適生育温度範囲内の温度よりも低温で発現できるタンパク質、宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に該宿主細胞にとって致死性となるが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度よりも低温ではそれらの宿主細胞に致死性でないタンパク質、宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に該宿主細胞の増殖を阻害するが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の至適温度よりも低温ではそれらの宿主細胞の増殖を阻害しないタンパク質、宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に封入体と呼ばれる不活性なタンパク質の凝集を作るが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の至適温度よりも低温でそれらの宿主細胞で発現させた場合に活性のある可溶性タンパク質となるタンパク質が挙げられる。
【0040】
例えば、適当な動物種の適当な組織からpoly(A)+RNAを抽出し、cDNAを合成し、発現ベクターに組込む。次いで、該ベクターを用いて大腸菌等の宿主細胞を形質転換し、発現ライブラリーを構築し、30℃で増殖発現させた場合に、増殖が阻害されるクローンから組込まれた遺伝子を単離することにより、宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に該宿主細胞にとって致死性となるが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度よりも低温ではそれらの宿主細胞に致死性でないタンパク質または宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に該宿主細胞の増殖を阻害するが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の至適温度よりも低温ではそれらの宿主細胞の増殖を阻害しないタンパク質をコードする遺伝子を選択する。この際、発現ベクターに適当な薬剤で誘導されるプロモーターを組込んでおき薬剤で発現を誘導した場合に宿主細胞の増殖が阻害され、誘導しない場合には宿主細胞が増殖するようなクローンを選択すればよい。次いで、単離した遺伝子を本発明の発現ベクターに組込んで、該組み換え発現ベクターでRhodococcus erythropolisを形質転換し、4℃から15℃の低温で増殖発現させ、増殖が阻害されることなく前記遺伝子を発現するクローンを選択することにより、上記タンパク質をコードする遺伝子をスクリーニングすることができる。また、cDNAライブラリーの遺伝子を本発明の発現ベクターに組込んで、該組み換え発現ベクターでRhodococcus erythropolisを形質転換し、低温または約15℃を超える中高温で培養し、増殖が阻害されることなく組込んだ遺伝子を発現するクローンを選択するか、または発現誘導させたときに発現される遺伝子を組込んだクローンを選択することにより上記タンパク質をコードする遺伝子をスクリーニングすることができる。
【0041】
前記スクリーニングにより得られた約15℃を超える中高温で発現させることが困難であるかまたは不可能なタンパク質も本発明に包含される。このようなタンパク質として、後述の実施例に記載されたタンパク質が例示できる。
【0042】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例1〕
Rhodococcus erythropolis由来の、Rhodococcus属細菌内で自律複製可能なプラスミドの分離とその一部DNA配列の決定
Rhodococcus erythropolisと大腸菌の複合ベクターを作成するために、まずRhodococcus属細菌内に存在する小型の内在性プラスミドを検索した。すると、Rhodococcus erythropolis JCM2895 株にその存在が確認された。このプラスミドにpRE2895と名前を付けた。以下にプラスミドの分離と、そのDNA配列決定について具体的に述べる。
【0043】
Rhodococcus erythropolis JCM2895株を5mlのLB培地(1% Difco Bacto Tryptone、0.5% Difco Yeast Extract、1.0% 塩化ナトリウム)にて、30℃で30時間培養した菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN社製)を用いてpRE2895を精製した。この際、Buffer P1 250μlに懸濁後、Buffer P2 250μlを加える前に、5μlのリゾチーム(100mg/ml)を加え37℃で30分インキュベートした点を除いては、使用説明書通りに作業した。
【0044】
上記DNAサンプルを制限酵素EcoRIで処理し、1.0%アガロースゲル電気泳動(100V、30分)に供したところ、約5.4kbのDNA断片1本の存在が確認された。
この約5.4kbのDNA断片をゲルから切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いて、使用説明書通りに精製した。得られたEcoRI断片を常法(Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)に従って、プラスミドpBluescript II SK (+)(STRATAGENE社製)のEcoRI部位にサブクローンし、このプラスミドにpHN79と名前を付けた。
【0045】
pHN79をReverse、M13-20 両プライマー(共にSTRATAGENE社製)を用い、DNAシークエンサーABI PRISM(R) 3100 Genetic Analyzer(ABI社製)を用いて、使用説明書に準じて、pHN79の塩基配列を約400塩基ずつそれぞれ決定した。相同性検索の結果、pHN79にサブクローンされたRhodococcus erythropolis JCM2895株由来のDNA領域はその99.8%の配列がGenBankに受入番号AF312210として登録されている5403塩基対の環状DNA、pN30と一致した。
【0046】
分離したpRE2895は全塩基配列を決定しなかったが、pN30との相同性は極めて高く、また制限酵素切断地図もpN30の配列から予想されるものと一致したことから、これらの相同性はプラスミド全体にわたっていると予想された。また、pN30はMycobacterium fortuitum 002株から分離された内在性プラスミドpAL5000 (Rauzer et al., Gene 71 315-321 (1988)、 Stolt and Stoker, Microbiology 142 2795-2802 (1996))、 Rhodococcus erythropolis NI86/21株から分離されたpFAJ2600(De Mot et al., Microbiology 143 3137-3147 (1997))と相同性が高く、類似の機構で自律複製していると考えられた。pAL5000は推定RepA遺伝子、推定RepB遺伝子、推定複製開始点を含む領域のみで各細菌内で自律複製するために十分であるため、本発明者らが分離したpRE2895も同様の領域のみを発現ベクター中に組み込めば、Rhodococcus属細菌内で自律複製するために十分と考えられた。
【0047】
〔実施例2〕
ベクタープラスミドpHN136の構築
実施例1で分離したpRE2895の一部と大腸菌内で自律複製可能なプラスミドの一部を用いて両菌の複合ベクターを作成するため以下の作業を行った(図1)。
【0048】
プラスミドpBluescript II SK (-) (STRATAGENE社製)をテンプレートとして、配列表中の配列番号1、2に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー(以下プライマーと略記)を用いて、ポリメラーゼチェーンリアクション法(以下、PCRと略記: Saiki et al., Science, 239 487-491 (1988))によるDNAの増幅を行った。なお、用いたPCR用の酵素はPfu turbo (STRATAGENE社製)である。その結果、アンピシリン耐性遺伝子(図中においてはAmprと表記)と大腸菌内で自律複製させるために必要なColE1配列領域を含む2.0kbの増幅されたDNAを得た。このDNA断片を制限酵素SacIとBsrGIで二重消化し、1.0%アガロースゲル電気泳動(100V、30分)に供し、該DNA断片を切り出し、QIAquick Gel Extraction Kitを用いて、使用説明書に準じて精製した。
【0049】
一方、pN30(実施例1)の配列をもとにRhodococcus属細菌内で自律複製するために必要と思われる領域を増幅するプライマーを設計した。なお、同プライマーの配列は配列表中の配列番号3、4で示される。プラスミドpHN79をテンプレートとして、両プライマーを用いてPCRによる増幅を行ったところ1.9kbの増幅されたDNAを得た。このDNA断片を制限酵素BsrGIとSacIで二重消化し、1.0%アガロースゲル電気泳動(100V、30分)に供し、該DNA断片を切り出し、上述の方法と同様に精製した。
【0050】
上記2つの精製されたDNA断片をDNA Ligation Kit Ver.2(宝酒造社製)を用いて、使用説明書通りにライゲーションし、得られたプラスミドにpHN129と名前を付けた。
【0051】
次にpHN129に存在する制限酵素認識部位BamHI、SalIを除去するため以下の作業をおこなった。まず、pHN129をテンプレートとして、配列表中の配列番号5、6に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。このPCR断片をBglIIとPstIで二重消化して得られた0.5kbのDNA断片をpHN129のBamHI、PstI部位にサブクローンした。結果、BglIIとBamHIで連結された部分においては推定RepA遺伝子のオープンリーディングフレーム(以下ORFと略記)内であるが、コードされるアミノ酸が置換されることなく、BamHI認識部位が除去された。またSalI認識部位はBamHI認識部位のごく近傍に存在したが、配列番号5に記載のプライマー中において、SalI認識部位が除かれ、かつ、コードされるアミノ酸が置換されないよう設計されていることから、BamHI認識部位と同時にSalI認識部位も除去されている。このプラスミドにpHN135と名前を付けた。
【0052】
次にpHN135に存在する制限酵素認識部位BglIIを除去するため以下の作業をおこなった。まず、プラスミドpHN135をテンプレートとして、配列表中の配列番号5、6に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。このPCR断片をPstIとBamHIで二重消化して得られた0.5kbのDNA断片をpHN135のPstI、BglII部位にサブクローンした。結果、BamHIとBglIIで連結された部分においては推定RepB遺伝子のORF部分であるが、コードされるアミノ酸が置換されることなく、BglII認識部位が除去された。この結果得られたプラスミドにpHN136と名前をつけた。
【0053】
〔実施例3〕
ベクタープラスミドpHN143の構築
タンパク質の発現誘導には抗生物質チオストレプトンを用いるが、Rhodococcus erythropolisは同物質に対して感受性であるために、耐性を付与させなければならない。そこでStreptomyces azureusが持つチオストレプトン耐性遺伝子、tsr遺伝子(Bibb et al., Mol. Gen. Genet. 199 26-36 (1985):図中においては、Thiorと表記する)を複合ベクター中に組み込むこととした。なお、この遺伝子がRhodococcus erythropolis内で機能し、チオストレプトン耐性を付与することはすでに報告されている(Shao and Behki, Lett. Appl. Microbiol. 21 261-266 (1995))。以下に、同遺伝子の分離について具体的に述べる(図2)。
【0054】
まず、PCRのテンプレートに使用するStreptomyces azureus JCM4217株のゲノムDNAを以下のように調製した。5mlのSB培地(1% Difco Bacto Tryptone、0.5% Difco Yeast Extract、0.5% 塩化ナトリウム、0.1% Glucose、5mM塩化マグネシウム、0.5% グリシン)にて30℃で培養した同菌株を500μlのSETバッファー(75mM 塩化ナトリウム、25mM EDTA(pH8.0)、20mM Tris-HCl(pH7.5))に懸濁した。そこに、5μlのリゾチーム溶液(100mg/ml)を加え、37℃で30分インキュベートした。そして、14μlのプロテアーゼK溶液(20mg/ml)と60μlの硫酸ドデシルナトリウム溶液(10%)を加え、よく混合した後55℃で2時間インキュベートした。その後、200μlの塩化ナトリウム溶液(5M)と500μlのクロロホルムを加え、20分間室温で回転撹拌した。遠心分離し、700μlの上清をとった。これをイソプロパノール沈殿後、乾燥させ、50μlのTE溶液(10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA (pH8.0))に溶解した。
【0055】
上記のように精製したStreptomyces azureus JCM4217株のゲノムDNAをテンプレートとして、配列表中の配列番号7、8に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、チオストレプトン耐性遺伝子を含む1.1kbの増幅されたDNAを得た。なおこのDNA断片はプラチナ Pfx DNA ポリメラーゼ(Gibco BRL社製)を用いたため、その末端は平滑末端である。このDNA断片を精製し、常法(Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)に従い5'末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した後、プラスミドpGEM-3Zf(+)(Promega社製)のHincII部位にサブクローンした(サブクローンされた向きはDNAの5'方向からHindIII認識部位-tsr遺伝子ORF-EcoRI認識部位である)。このプラスミドにpHN137と名前を付けた。
【0056】
次にpHN137に存在する制限酵素認識部位SalIを除去するため以下の作業をおこなった。まず、プラスミドpHN137をテンプレートとして、配列表中の配列番号9、10に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。なおこのPCRにはプラチナPfx DNAポリメラーゼを用いた。このPCR断片の片方の末端をHindIIIで消化して得られた0.6kbのDNA断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の5'末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。一方、プラスミドpHN137をテンプレートとして、配列表中の配列番号11、12に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。なおこのPCRにはプラチナPfx DNAポリメラーゼを用いた。このPCR断片の片方の末端をEcoRIで消化して得られた0.5kbのDNA断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の5'末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。これら2つのPCR断片を同時にプラスミドpGEM-3Zf(+)のHindIII、EcoRI部位にサブクローンした結果、平滑末端同士で連結された部分においてはtsr遺伝子のORF部分であるが、コードされるアミノ酸が置換されることなく、SalI認識部位が除去された。このプラスミドにpHN143と名前を付けた。
【0057】
〔実施例4〕
ベクタープラスミドpHN62の構築
チオストレプトンによって誘導型発現をさせるためにはRhodococcus属細菌内にTipAタンパク質を存在させなければならない。そのために、Rhodococcus erythropolisから構成的なプロモーターを分離し、その下流にTipAタンパク質をコードする構造遺伝子を連結した(図3)。構成的に機能するプロモーターとしてはRhodococcus erythropolisのアルデヒドデヒドロゲナーゼ様タンパク質をコードするThcA遺伝子(Nagy et al., J. Bacteriol. 177 676-687 (1995))のプロモーター配列を用いた。
【0058】
テンプレートに使用するStreptomyces coelicolor A3(2)株のゲノムDNAはStreptomyces azureusからゲノムDNAを調製したときと同様に作業し、精製した。また、Rhodococcus erythropolis JCM3201株のゲノムDNAは5mlのLB培地で培養した点を除いてはStreptomyces azureusからゲノムDNAを調製したときと同様に作業し、精製した。
【0059】
上述のように精製したStreptomyces coelicolor A3(2)株のゲノムDNAをテンプレートとして、配列表中の配列番号13、14に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。なおこのPCRにはプラチナPfx DNAポリメラーゼを用いた。その結果、TipA遺伝子のORF並びにその下流の転写終結配列を含むDNA(図中においてはTipAと表記)を得た。
【0060】
このPCR断片の片方の末端をBglIIで消化して得られた0.9kbのDNA断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の5'末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。一方、上述のように精製したRhodococcus erythropolis JCM3201株のゲノムDNAをテンプレートとして、配列表中の配列番号15、16に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、アルデヒドデヒドロゲナーゼ様タンパク質をコードするThcA遺伝子(Nagy et al., J. Bacteriol. 177 676-687 (1995))のプロモーター配列(図中においてはALDHpと表記)を含むDNAを得た。なおこのPCRにはプラチナPfx DNAポリメラーゼを用いた。このPCR断片の片方の末端をXbaIで消化して得られた0.2kbのDNA断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の5'末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。これら2つのPCR断片を同時にプラスミドpGEM-3Zf(+)のXbaI、BamHI部位にサブクローンした結果、ThcA遺伝子のプロモーター配列のすぐ下流にTipA遺伝子のORF並びに転写終結配列を含むプラスミドが作成され、pHN33と名前を付けた。
【0061】
次にpHN33に存在する制限酵素NcoI認識部位2カ所(以下、NcoI(1)、NcoI(2)と表記する)を除去するため以下の作業をおこなった。
まず、プラスミドpHN33をテンプレートとして、配列表中の配列番号9、17に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。なおこのPCRにはプラチナPfx DNAポリメラーゼを用いた。このPCR断片の片方の末端をXbaIで消化して得られた0.5kbのDNA断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の5'末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。一方、プラスミドpHN33をテンプレートとして、配列表中の配列番号18、12に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。なおこのPCRにはプラチナPfx DNAポリメラーゼを用いた。このPCR断片の片方の末端をKpnIで消化して得られた0.6kbのDNA断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の5'末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。これら2つのPCR断片を同時にプラスミドpGEM-3Zf(+)のXbaI、KpnI部位にサブクローンした結果、平滑末端同士で連結された部分においてはTipA遺伝子のORF部分であるが、コードされるアミノ酸が置換されることなく、NcoI(1)認識部位が除去された。このプラスミドにpHN50と名前を付けた。
【0062】
次にpHN33に存在する制限酵素認識部位NcoI(2)を除去するため以下の作業をおこなった。まず、プラスミドpHN33をテンプレートとして、配列表中の配列番号9、19に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。なおこのPCRにはプラチナPfx DNAポリメラーゼを用いた。このPCR断片の片方の末端をXbaIで消化して得られた0.8kbのDNA断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の5'末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。一方、プラスミドpHN33をテンプレートとして、配列表中の配列番号20、12に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。なおこのPCRにはプラチナPfx DNAポリメラーゼを用いた。このPCR断片の片方の末端をKpnIで消化して得られた0.3kbのDNA断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の5'末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。これら2つのPCR断片を同時にプラスミドpGEM-3Zf(+)のXbaI、KpnI部位にサブクローンした結果、平滑末端同士で連結された部分においてはTipA遺伝子のORF部分であるが、コードされるアミノ酸が置換されることなく、NcoI(2)認識部位が除去された。このプラスミドにpHN51と名前を付けた。
【0063】
最後に以下の作業を行った。pHN50をXbaIとSacIで二重消化して得られた0.7kbのDNA断片とpHN51をSacIとKpnIで二重消化した0.4kbの断片を同時にプラスミドpGEM-3Zf(+)のXbaI、KpnI部位にサブクローンした。結果、NcoI(1)とNcoI(2)両方の制限酵素部位を欠いたTipA遺伝子を持つプラスミドを取得し、これにpHN62と名前をつけた。
【0064】
〔実施例5〕
ベクタープラスミドpHN153の構築
目的のタンパク質を誘導的に発現せしめることができるかどうか確認するために、TipA遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝子としてThermoplasma acidophilum由来のプロリンイミノペプチダーゼ(Tamura et al., FEBS Lett. 398 101-105 (1996):以下PIPと略記する)をコードする遺伝子のORF(図中においてはPIP ORFと表記)を連結し、さらにその下流に転写のリードスルーを抑制するために転写終結配列を連結した。以下に具体的に述べる(図4)。
【0065】
実施例4にて精製したStreptomyces coelicolor A3(2)株のゲノムDNAをテンプレートとして、配列表中の配列番号21、22に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、TipA遺伝子のプロモーター配列(図中においてはTipApと表記)を含む0.2kbの増幅されたDNAを得た。なおこのPCRにはプラチナPfx DNAポリメラーゼを用いた。この断片を精製し、常法により5'末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した後、プラスミドpBluescript II SK (+)のSmaI部位にサブクローンした(サブクローンされた向きはDNAの5'方向からKpnI認識部位-TipA遺伝子プロモーター配列-SacI認識部位である)。このプラスミドにpHN150uと名前を付けた。
【0066】
次に、プラスミドpRSET-PIP (Tamura et al., FEBS Lett. 398 101-105 (1996):以下PIPと略記する)をテンプレートとして、配列表中の配列番号23,24に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。なお、配列表中の配列番号24のプライマーはPIP遺伝子の終止コドンを除いて、かつタンパク質の精製を容易にするために6×HisタグがPIPタンパク質のC末端に付くように設計されている。6×Hisタグは、6つの連続したヒスチジン残基から成る連続配列で、これを融合したタンパク質は、ニッケルイオン等に高い親和性を示すようになる。従って、ニッケルイオン等を用いた金属キレートクロマトグラフィーで精製が容易になる(Crowe et al., Methods Mol. Biol. 31 371-387 (1994))。このPIP 遺伝子を含む0.9kbのDNA断片を制限酵素NcoIとSpeIで二重消化し、pHN150uのNcoI、SpeI部位にサブクローンした結果、TipA遺伝子のプロモーター配列のすぐ下流にPIP遺伝子のORFを含むプラスミドが作成され、pHN151uと名前を付けた。
【0067】
次に、実施例4にて精製したRhodococcus erythropolis JCM3201株のゲノムDNAをテンプレートとして、配列表中の配列番号25,26に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、ThcA遺伝子の転写終結配列(Nagy et al., J. Bacteriol. 177 676-687 (1995): 図中においてはALDHtと表記)を含むDNAを得た。この0.2kbのDNA断片を制限酵素SpeIとXbaIで二重消化し、pHN151uのSpeI、XbaI部位にサブクローンした。その結果、TipA遺伝子のプロモーター配列のすぐ下流にPIP遺伝子のORFを含み、またそのすぐ下流にThcA遺伝子の転写終結配列を含むプラスミドが作成され、pHN153と名前を付けた。
【0068】
〔実施例6〕
ベクタープラスミドpHN169の構築
Rhodococcus erythropolisをプラスミドで形質転換するためには適当な形質転換マーカーが必要になる。そこでRhodococcus属細菌内で機能する強力なプロモーターの下流に薬剤耐性遺伝子を連結し、使用することとした。プロモーターとしては、Streptomyces属細菌由来の Elongation factor TuをコードするTuf1遺伝子プロモーターを用いることとしたが、これは同プロモーターが強力に下流の遺伝子を転写せしめるとの報告があるからである(Wezel et al., Biochim. Biophys. Acta 1219 543-547 (1994))。また、薬剤耐性遺伝子は入手が容易なテトラサイクリン耐性遺伝子を用いた。以下に具体的に述べる(図5)。
【0069】
実施例4にて精製したStreptomyces coelicolor A3(2)株のゲノムDNAをテンプレートとして、配列表中の配列番号27、28に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、Tuf1遺伝子のプロモーター配列(図中においてはTuf1pと表記)を含む0.2kbの増幅されたDNAを得た。なおこのPCRにはプラチナPfx DNAポリメラーゼを用いた。この断片を精製し、常法により5'末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した後、プラスミドpBluescript II SK (+) のHincII部位にサブクローンした(サブクローンされた向きはDNAの5'方向からKpnI認識部位-Tuf1遺伝子プロモーター配列-EcoRI認識部位である)。このプラスミドにpHN158と名前を付けた。
【0070】
次に、プラスミドpACYC184(Rose, Nucleic Acids Res. 16 355 (1988))をテンプレートとして、配列表中の配列番号29、30に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、テトラサイクリン耐性遺伝子(図中においてはTetrと表記)を含むDNAを得た。この1.3kbのDNA断片を制限酵素XhoIとSpeIで二重消化し、pHN158のSalI、SpeI部位にサブクローンした結果、Tuf1遺伝子のプロモーター配列のすぐ下流にテトラサイクリン耐性遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN159と名前を付けた。
【0071】
次にpHN159に存在する制限酵素認識部位BamHIを除去するため以下の作業をおこなった。まず、プラスミドpHN159をテンプレートとして、配列表31、32に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。なおこのDNA断片はPfu turbo DNA ポリメラーゼを用いたため、その末端は平滑末端である。このPCR断片の片方の末端をXhoIで消化して得られた0.5kbのDNA断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の5'末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。一方、プラスミドpHN159をテンプレートとして、配列表中の配列番号33、34に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。なおこのPCRにはPfu turbo DNAポリメラーゼを用いた。このPCR断片の片方の末端をNotIで消化して得られた1.1kbのDNA断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の5'末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。これら2つのPCR断片を同時にプラスミドpBluescript II SK (+)のXhoI、NotI部位にサブクローンした結果、平滑末端同士で連結された部分においてはテトラサイクリン耐性遺伝子のORF部分であるが、コードされるアミノ酸が置換されることなく、BamHI部位が除去された。このプラスミドにpHN165と名前を付けた。
【0072】
次にpHN159に存在する制限酵素認識部位SalIを除去するため以下の作業をおこなった。まず、プラスミドpHN159をテンプレートとして、配列表中の配列番号31、35に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。なおこのPCRにはPfu turbo DNAポリメラーゼを用いた。このPCR断片の片方の末端をXhoIで消化して得られた0.8kbのDNA断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の5'末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。一方、プラスミドpHN159をテンプレートとして、配列表中の配列番号36、34に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。なおこのPCRにはPfu turbo DNA ポリメラーゼを用いた。このPCR断片の片方の末端をNotIで消化して得られた0.8kbのDNA断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の5'末端をT4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。これら2つのPCR断片を同時にプラスミドpBluescript II SK (+) のXhoI、NotI部位にサブクローンした結果、平滑末端同士で連結された部分においてはテトラサイクリン耐性遺伝子のORF部分であるが、コードされるアミノ酸が置換されることなく、SalI認識部位が除去された。このプラスミドにpHN166と名前を付けた。
【0073】
最後に以下の作業を行った。pHN166をSphIとSpeIで二重消化して得られた0.9kbのDNA断片をpHN165のSphI、SpeI部位にサブクローンした。結果、BamHIとSalI両方の制限酵素認識部位を欠くテトラサイクリン耐性遺伝子クローンを取得し、このプラスミドにpHN169と名前をつけた。
【0074】
〔実施例7〕
ベクタープラスミドpHN170、pHN171の構築
実施例2から6までに分離してきた遺伝子群を連結し、Rhodococcus属細菌内で誘導可能な発現ベクターを構築するために以下の作業を行った(図6)。
【0075】
pHN143をSacIで消化して得られた1.1kbのDNA断片をpHN136のSacI部位にサブクローンした(サブクローンされた向きはDNAの5'方向から推定RepB遺伝子ORF-tsr遺伝子ORF-アンピシリン耐性遺伝子ORFである)。その結果できたプラスミドにpHN144と名前をつけた。
【0076】
次に、pHN62をXbaIとKpnIで二重消化して得られた1.1kbのDNA断片をpHN144のXbaI、KpnI部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにpHN152と名前をつけた。
【0077】
次に、pHN153をBsrGIとXbaIで二重消化して得られた1.2kbのDNA断片をpHN152のBsrGI、SpeI部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにpHN154と名前をつけた。
【0078】
次に、pHN169をXbaIとSpeIで二重消化して得られた1.6kbのDNA断片をpHN154のXbaI部位にサブクローンした(サブクローンされた向きはDNAの5'方向からtsr遺伝子ORF-テトラサイクリン耐性遺伝子ORF-ThcA遺伝子プロモーター配列である)。その結果TipA遺伝子プロモーターの制御下に置かれたPIP遺伝子を含むプラスミドが作成され、できたプラスミドにpHN170と名前をつけた。
【0079】
また組み換えタンパク質の高発現化のため、TipA遺伝子プロモーター下流のリボソーム結合部位を翻訳効率の良いとされるラムダファージgene10由来の配列(Gold and Stormo, Methods Enzymol. 185 89-93 (1990))に変化させた(図6)。以下に具体的に述べる。
【0080】
プラスミドpHN170をテンプレートとして、配列表中の配列番号21,37に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、TipA遺伝子プロモーターとラムダファージgene10由来リボソーム結合部位からなるハイブリッドプロモーター(以下TipA-LG10プロモーターと表記する: 図中に置いてはTipA-LG10pと表記)を得た。この0.2kbのDNA断片を制限酵素BsrGIとNcoIで二重消化し、pHN170のBsrGI、NcoI部位にサブクローンした。その結果TipA-LG10プロモーターの制御下に置かれたPIP遺伝子を含むプラスミドが作成され、できたプラスミドにpHN171と名前をつけた。図22にTipAプロモーター配列を、図23にTipAプロモーターのTipA-LG10プロモーターへの改変のためのリボソーム結合部位(RBS)配列の改良を示す。
【0081】
〔実施例8〕
ベクタープラスミドpTip-NH1、pTip-CH1、pTip-LNH1、pTip-LCH1の構築
実施例7で述べたプラスミドからレポーターであるPIP遺伝子を除き、マルチクローニング部位を導入するため以下の作業を行った(図7)。
【0082】
配列表中の配列番号38、39に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチドはマルチクローニング部位になる配列を含み、お互いに相補的な配列を持つ。これら2つを等モル量ずつ混合し、70℃で10分処理し、20分かけて室温に冷却し、2本鎖化させた。その結果、その末端はNcoIとSpeIで二重消化されたベクターと連結可能な状態になり、この2本鎖化した合成DNA(図中においてはMCS Linker NNcoと表記)をpHN170のNcoI、SpeI部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにpTip-NH1と名前をつけた。また、配列表中の配列番号40、41に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチド(マルチクローニング部位になる配列を含み、お互いに相補的な配列を持つ)を同様に2本鎖化させた合成DNA(図中においてはMCS Linker CNcoと表記)をpHN170のNcoI、SpeI部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにpTip-CH1と名前をつけた。
【0083】
実施例7で述べたTipA遺伝子プロモーター配列とラムダファージgene10由来リボソーム結合部位からなるハイブリッドDNAを制限酵素BsrGIとNcoIで二重消化し、pTip-NH1とpTip-CH1のBsrGI、NcoI部位にそれぞれサブクローンした。結果得られたプラスミドにpTip-LNH1、pTip-LCH1とそれぞれ名前を付けた。
【0084】
〔実施例9〕
ベクタープラスミドpTip-NH2、pTip-CH2、pTip-LNH2、pTip-LCH2の構築
実施例8で述べたプラスミドpTip-NH1、pTip-CH1、pTip-LNH1、pTip-LCH1において、マルチクローニング部位の最も上流のNcoI部位をNdeIに変更するために以下の作業を行った(図8)。
【0085】
プラスミドpHN170をテンプレートとして、配列表中の配列番号21、42に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、TipA遺伝子プロモーターを含むDNAを得た。この0.2kbのDNA断片を制限酵素BsrGIとNdeIで二重消化し、pHN170のBsrGI、NdeI部位にサブクローンした。結果得られたプラスミドにpHN183と名前を付けた。
【0086】
配列表中の配列番号43、44に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチドはマルチクローニング部位になる配列を含み、お互いに相補的な配列を持つ。これら2つを等モル量ずつ混合し、70℃で10分処理し、20分かけて室温に冷却し、2本鎖化させた。その結果、その末端はNdeIとSpeIで二重消化されたベクターと連結可能な状態になり、この2本鎖化した合成DNA(図中においてはMCS Linker NNdeと表記)をpHN183のNdeI、SpeI部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにpTip-NH2と名前をつけた。また、配列表中の配列番号45、46に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチド(マルチクローニング部位になる配列を含み、お互いに相補的な配列を持つ)を同様に2本鎖化させた合成DNA(図中においてはMCS Linker CNdeと表記)をpHN183のNdeI、SpeI部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにpTip-CH2と名前をつけた。
【0087】
プラスミドpTip-LNH1をテンプレートとして、配列表中の配列番号21、47に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、TipA遺伝子プロモーターとラムダファージgene10由来リボソーム結合部位からなるハイブリッドDNAを得た。この0.2kbのDNA断片を制限酵素BsrGIとNdeIで二重消化し、pTip-NH2とpTip-CH2のBsrGI、NdeI部位にそれぞれサブクローンした。結果得られたプラスミドにpTip-LNH2、pTip-LCH2とそれぞれ名前を付けた。
【0088】
実施例8,9で作成したプラスミドのマップと、マルチクローニング部位周辺の配列をまとめて図9に示す。該図中、実線の矢印はTipA遺伝子プロモーター中に存在するInverted repeat配列を示す。斜線の矢印はThcA遺伝子転写終結配列に存在するInverted repeat配列を示す。また、原核生物のプロモーター領域に一般的に存在し、遺伝子の転写に重要な-10領域、-35領域、RBSは四角で囲んである。またRBSの中でも最も重要なSD配列(Shine and Dalgarno, Eur. J. Biochem. 57 221-230 (1975))は下線を引いてある。
【0089】
〔実施例10〕
ベクタープラスミドpTip-CH1.1、pTip-CH2.1、pTip-LCH1.1、pTip-LCH2.1の構築
実施例8及び9で述べたプラスミドpTip-CH1、pTip-CH2、pTip-LCH1、pTip-LCH2において、マルチクローニング部位のXhoI部位以降の読み枠を市販のpETベクター(Novagen社)の読み枠と一致させるために以下の作業を行った(図10)。
【0090】
プラスミドpTip-CH1をテンプレートとして、配列表中の配列番号21、104に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、TipA遺伝子プロモーターとマルチクローニング部位を含むDNAを得た。この0.3kbのDNA断片を制限酵素BsrGIとSpeIで二重消化し、pTip-CH1のBsrGI、SpeI部位にサブクローンした。結果得られたプラスミドにpTip-CH1.1と名前を付けた。
【0091】
プラスミドpTip-CH2をテンプレートとして、配列表中の配列番号21、104に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、TipA遺伝子プロモーターとマルチクローニング部位を含むDNAを得た。この0.3kbのDNA断片を制限酵素BsrGIとSpeIで二重消化し、pTip-CH1のBsrGI、SpeI部位にサブクローンした。結果得られたプラスミドにpTip-CH2.1と名前を付けた。
【0092】
プラスミドpTip-LCH1をテンプレートとして、配列表中の配列番号21、104に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、TipA-LG10プロモーターとマルチクローニング部位を含むDNAを得た。この0.3kbのDNA断片を制限酵素BsrGIとSpeIで二重消化し、pTip-CH1のBsrGI、SpeI部位にサブクローンした。結果得られたプラスミドにpTip-LCH1.1と名前を付けた。
【0093】
プラスミドpTip-LCH2をテンプレートとして、配列表中の配列番号21、104に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、TipA-LG10プロモーターとマルチクローニング部位を含むDNAを得た。この0.3kbのDNA断片を制限酵素BsrGIとSpeIで二重消化し、pTip-CH1のBsrGI、SpeI部位にサブクローンした。結果得られたプラスミドにpTip-LCH2.1と名前を付けた。
【0094】
〔実施例11〕
ベクタープラスミドpHN172、pHN173の構築
発現の誘導が厳密に調節されているかを調べるために以下のようなコントロール実験用プラスミドを作成した(図11)。
【0095】
pHN169をXbaIとSpeIで二重消化して得られた1.6kbのDNA断片をpHN144のXbaI部位にサブクローンした(サブクローンされた向きはDNAの5'方向からtsr遺伝子ORF-テトラサイクリン耐性遺伝子ORF-アンピシリン耐性遺伝子ORFである)。その結果できたプラスミドにpHN172と名前をつけた。
【0096】
次に、pHN153をBsrGIとXbaIで二重消化して得られた1.2kbのDNA断片をpHN144のBsrGI、SpeI部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにpHN164と名前をつけた。次いで、pHN169をXbaIとSpeIで二重消化して得られた1.6kbのDNA断片をpHN164のXbaI部位にサブクローンした(サブクローンされた向きはDNAの5'方向からtsr遺伝子ORF-テトラサイクリン耐性遺伝子ORF-アンピシリン耐性遺伝子ORFである)。その結果できたプラスミドにpHN173と名前をつけた。
【0097】
pHN170は、TipA遺伝子プロモーター、その下流にPIP ORF、さらにその下流にThcA遺伝子転写終結配列、の3因子が連結された遺伝子カセット(以下Expression cassetteと表記)と、ThcA遺伝子プロモーター、その下流にTipA遺伝子、の2因子が連結された遺伝子カセット(以下Inducer cassetteと表記)両方をもつ。pHN173はExpression cassetteのみをもち、pHN172は両cassetteを持たない。
【0098】
〔実施例12〕
Rhodococcus属細菌の形質転換
Rhodococcus erythropolis JCM3201株をLB培地100mlにて対数増殖期に至るまで30℃で振とう培養する。培養液を30分間氷冷し、遠心分離し、菌体を回収する。これに100mlの氷冷滅菌水を加え、よく撹拌し、再び遠心分離し、菌体を回収する。これに100mlの氷冷10%グリセリン溶液を加え、よく撹拌し、遠心分離し、菌体を回収する。この氷冷10%グリセリン溶液での洗浄をもう一度繰り返し、菌体を5mlの氷冷10%グリセリン溶液に懸濁する。400μlずつ分注し、液体窒素で瞬間冷凍し、使用するまで-80℃にて保存した。-80℃から菌体を取り出し、氷上にて融解し、プラスミドpHN170、またはpHN172、またはpHN173を3μl (それぞれ約300ng)加えた。この菌体とDNAの混合液をエレクトロポレーションキュベット(Bio-Rad社:0.2cm ギャップキュベット)に移し、同社の遺伝子導入装置ジーンパルサーIIを用いて、電場強度12.5kV/cmで、パルスコントローラーの設定はキャパシタンス25μF、外部抵抗400Ωにてそれぞれ電気パルスを与えた。電気パルス処理した菌体とDNAの混合液を1mlのLB培地に混合し、30℃にて4時間培養した後集菌し、20μg/mlテトラサイクリン入りLB寒天培地(寒天は濃度1.8%)に塗布し、30℃にて3日培養し、それぞれの形質転換体を得た。
【0099】
〔実施例13〕
Rhodococcus属細菌におけるPIP活性の測定1
構築された発現ベクターにはレポーター遺伝子としてPIP遺伝子が組み込まれており、チオストレプトンによる誘導性、誘導の強さなどを、PIPの酵素活性を測定することで、確認することができる。菌体中に存在するPIPの量は人工基質H-Pro-βNA(Bachem社製)を加水分解する活性を調べることで容易に定量が可能である。
【0100】
実施例12にて作成したRhodococcus erythropolis JCM3201株の形質転換体を8μg/mlのテトラサイクリンを含むLB培地で30℃にて培養し、600nmの波長で測定したオプティカルデンシティー(O.D.600)が0.6になった時点で、終濃度1μg/mlになるようにチオストレプトン(溶媒はジメチルスルホオキサイド)を加え、PIPの発現を誘導させた。
【0101】
16時間後に培養液の一部を取り出し、8μg/mlのテトラサイクリンを含むLB培地で200μlにメスアップし、60℃にて1分加温する。そこにPIPの基質として2μlのH-Pro-βNA(100mM:溶媒はジメチルスルホオキサイド)を加え60℃にて20分インキュベートする(PIPは60℃が至適温度)。PIPよってH-Pro-βNAから加水分解されて遊離したβNAを観察するために、発色剤として134μlのFast Garnet GBC Salt 溶液(和光純薬社製で濃度0.5mg/ml : 1M酢酸ナトリウムバッファー(pH4.2)、10% Triton X-100が溶媒)を加える。PIPが発現していなければ上記混合液は黄色を呈するが、発現していれば赤色を呈する。また、呈色した赤色を吸光分光光度計を用い、550nmでの吸光度(A550)を測定し、PIP活性を定量した。測定はFastGarnet GBC Saltを加えた後、滅菌水666μlを加え希釈して行った。
【0102】
その際、550nmでは細胞のオプティカルデンシティーも測定してしまうので、550nmでの細胞のオプティカルデンシティー(O.D.550)は別測定し、測定時に使用したO.D.550に相当する値をA550の値から差し引いて補正した値をAc550とする。すなわち、Ac550=A550?O.D.550×PIPの活性測定に使用した培養液量(ml)で計算される。ユニット値は「20分間の測定で得られる、培養液1mlあたり、O.D.600=1あたりのAc550の値」とし、「Ac550÷PIPの活性測定に使った培養液量(ml)÷O.D.600」で計算した。
【0103】
pHN170で形質転換した細胞において、チオストレプトンを加えずに培養した場合は黄色を呈したが、加えた場合赤色を呈した。pHN172、pHN173で形質転換した細胞においては、チオストレプトンの有無に関わらず、黄色を呈した。
【0104】
実施例12にて作成したRhodococcus erythropolis JCM3201株の形質転換体を8μg/mlのテトラサイクリンを含むLB培地で30℃にて培養し、O.D.600が2.0になったら、直ちに4℃に温度を下げ、菌体を馴化させるために、1時間振とう培養した。そこに終濃度1μg/mlになるようにチオストレプトンを加え、PIPの発現を誘導させた。40時間後に培養液の一部を取り出し、上記30℃と同様の実験を行った。
【0105】
pHN170で形質転換した細胞において、チオストレプトンを加えずに培養した場合は黄色を呈したが、加えた場合赤色を呈した。pHN172、pHN173で形質転換した細胞においては、チオストレプトンの有無に関わらず、黄色を呈した。
【0106】
以上の結果をまとめて図12に示す。
図12に示すようにRhodococcus erythropolis JCM3201株をpHN170、pHN172、pHN173で形質転換し、30℃、4℃でPIPを発現させた時と発現させない時、それぞれのPIP活性を測定した。図12には終濃度1μg/mlのチオストレプトンを加えたか否か(+または-)、活性値、培養温度、活性測定に使用した培養液量、形質転換したプラスミド、プラスミドの持つ「Cassette」の有無(+または-)が示されている。
この結果から、広範な温度域において、チオストレプトンによって誘導可能な発現ベクターが構築されたことが確認された。
【0107】
〔実施例14〕
Rhodococcus属細菌におけるPIP活性の測定2
実施例12にて作成したRhodococcus erythropolis JCM3201株をpHN170、pHN171で形質転換体した細胞のPIP活性を実施例13に準じて測定した。
【0108】
図13に終濃度1μg/mlのチオストレプトンを加えてから時間を追ってPIP活性を測定した結果を示す。該図はRhodococcus erythropolis JCM3201株をpHN170で形質転換し、30℃、4℃でPIPを発現させた時の活性を時間を追って測定したものを示す。図13中、縦軸はPIPの活性値(ユニット)、横軸は終濃度1μg/mlのチオストレプトンを加えてからの時間(分)を示す。4℃の「○」はO.D.600が1.0の時に発現誘導開始させた時、「□」はO.D.600が2.0の時に発現誘導開始させた時の活性を示す。30℃の「○」はO.D.600が0.6の時に発現誘導開始させた時、「□」はO.D.600が1.0の時に発現誘導開始させた時の活性を示す。
【0109】
また、図14に加えるチオストレプトンの終濃度を変化させて測定した結果を示すが、発現誘導時間は4℃がO.D.600=2.0で誘導開始し、2400分(40時間)で、30℃がO.D.600= 0.6で誘導開始し、960分(16時間)である。図14に示す実施例においては、Rhodococcus erythropolis JCM3201株をpHN170で形質転換し、30℃、4℃でPIPを発現させた時の活性を加えるチオストレプトンの濃度を変えて測定したものを示す。図14中、縦軸はPIPの活性値(ユニット)、横軸は培地中に添加したチオストレプトンの終濃度(μg/ml)を示す。
【0110】
この結果から、発現誘導には30℃でも4℃でも、1μg/mlのチオストレプトンで十分なことが判明した。また、発現誘導の時期によるが、30℃の場合は500から1000分(約8-16時間)程度、4℃の場合は3000分(50時間)からそれ以上で細胞あたりのPIPの発現量は最大に達することが示された。
【0111】
〔実施例15〕
Rhodococcus属細菌におけるPIP活性の測定3
Rhodococcus erythropolis JCM3201株、Rhodococcus fascians JCM10002株、Rhodococcus opacus DSM44193株において実施例12と同様にpHN170による形質転換を行った。その結果、pHN170によってRhodococcus erythropolisのみならず、Rhodococcus fascians、Rhodococcus opacusをも形質転換することができた。従って、pHN170中に導入された、Rhodococcus erythropolis JCM2895株由来の自律複製起点はRhodococcus fascians、Rhodococcus opacusにおいても機能することが示された。また、これらの形質転換体を用いて、実施例13に準じてPIP活性を測定した。なお、いずれの菌株においても、発現誘導時間は4℃がO.D.600=2.0で誘導開始し、2400分(40時間)で、30℃がO.D.600= 0.6で誘導開始し、960分(16時間)である。結果を図15に示す。図15には、Rhodococcus erythropolis JCM3201株、Rhodococcus fascians JCM10002株、Rhodococcus opacus DSM44193株をpHN170で形質転換し、30℃、4℃でPIPを発現させた時と発現させない時、それぞれのPIP活性を測定した。図には終濃度1μg/mlのチオストレプトンを加えたか否か(+または-)、活性値、培養温度、活性測定に使用した培養液量、pHN170で形質転換された宿主、が示されている。
【0112】
pHN170で形質転換されたすべてのRhodococcus属細菌において、チオストレプトンを加えずに培養した場合は黄色を呈したが、加えた場合赤色を呈した。しかし、Rhodococcus fascians JCM10002株、Rhodococcus opacus DSM44193株においてはRhodococcus erythropolis JCM3201株に比べて発現は低かった。
【0113】
〔実施例16〕
Rhodococcus属細菌における外来タンパク質の発現と精製1
pHN170(実施例7に記載)、pHN171(実施例7に記載)を用いて、実施例12と同様にRhodococcus erythropolis JCM3201株を形質転換し、実施例13に準じてPIPを30℃、4℃でそれぞれ発現させた。ここでは、終濃度1μg/mlのチオストレプトンを加えた後、時間を追って菌体を回収し、PIPの精製を行った。PIPのC末端には6×Hisタグがついており、Ni-NTA Superflow(Qiagen社製)を用いて、その使用説明書に準じて精製を行った。
【0114】
以下に具体的な精製法を示すが、精製の作業は4℃で行った。タンパク質を発現させた菌体 (20ml培養液分) を回収し、1mlのNT-Buffer(50mM Tris-HCl (pH8.0)、100mM塩化ナトリウム、1mMジチオスレイトール)に懸濁し、1gのガラスビーズ(直径0.105-0.125ミリメートル)を加えた。これをFast-prep FP120(SAVANT社製)にて6m/秒の速度、20秒間往復振とうさせることで、細胞を破壊した。20,000×gにて遠心し、その上清700μlに、予めNT-Bufferで平衡化されたNi-NTA Superflowをベッド体積40μlになるように加えた。これを1時間回転撹拌しながらNi-NTA Superflowビーズと6×Hisタグのついたタンパク質とを結合させた。このビーズをNT-Bufferで4回洗浄した後、120μlのNTE-Buffer (50mM Tris-HCl(pH7.0)、 100mM塩化ナトリウム、1mMジチオスレイトール、400mMイミダゾール)に3回懸濁することで、ビーズから6×Hisタグのついたタンパク質を溶出させた。
【0115】
上記サンプルのうち10μlを常法に従い、12% SDSポリアクリルアミド電気泳動に供した結果を図16に示す。Rhodococcus erythropolis JCM3201株をpHN170 (TipA遺伝子プロモーターからの発現:左2枚の図)、pHN171(TipA-LG10プロモーターからの発現:右2枚の図)で形質転換し、4℃(上2枚の図)、30℃(下2枚の図)でPIPを発現させた。終濃度1μg/mlのチオストレプトンを加えてから、時間を追って菌体を回収し、PIPのC末端につけられた6×Hisタグを利用してNi-NTA Superflowを用いて精製した。菌体を回収した時間は4℃においては、0分(一番左のレーン)、180分(左から2番目のレーン)、420分(左から3番目のレーン)、1080分(左から4番目のレーン)、1440分(左から5番目のレーン)、1860分(左から6番目のレーン)、2520分(左から7番目のレーン)、3060分(左から8番目のレーン)で、30℃においては、0分(1番左のレーン)、120分(左から2番目のレーン)、240分(左から3番目のレーン)、420分(左から4番目のレーン)、540分(左から5番目のレーン)、720分(左から6番目のレーン)、900分(左から7番目のレーン)、1440分(左から8番目のレーン)である。図16の各図中、一番右のレーンは誘導せずに(すなわちチオストレプトンを加えずに)培養を続けた菌体から精製したサンプルを示す。30℃においては、TipA遺伝子プロモーターからの発現に比べるとTipA-LG10プロモーターからの発現は若干低かったが、4℃においては、逆にTipA-LG10プロモーターからの発現の方が高かった。また、TipA-LG10プロモーターにおいても発現の誘導は厳密にコントロールされていた。
両プロモーターからの発現量の詳細な比較は実施例18に詳しく述べる。
【0116】
〔実施例17〕
Rhodococcus属細菌における外来タンパク質の発現と精製2
pHN170(実施例7に記載)、pHN171(実施例7に記載)を用いて、実施例12と同様にRhodococcus erythropolis JCM3201株を形質転換し、実施例13に準じてPIPを32℃、30℃、15℃、4℃でそれぞれ発現させた。なお、発現誘導時間は4℃がO.D.600=2.0で誘導開始し、2400分(40時間)で、15℃がO.D.600=1.0で誘導開始し、1500分(25時間)で、30℃がO.D.600=0.6で誘導開始し、960分(16時間)で、32℃がO.D.600= 0.6で誘導開始し、960分(16時間)である。加えたチオストレプトンは終濃度1μg/mlである。精製は実施例16と同様に行った。
【0117】
上記サンプルのうち10μlを常法に従い、12% SDSポリアクリルアミド電気泳動に供した結果を図17に示す。Rhodococcus erythropolis JCM3201株をpHN170(TipA遺伝子プロモーターからの発現:レーン1、3、5、7)、pHN171(TipA-LG10プロモーターからの発現:レーン2、4、6、8)で形質転換し、4℃(レーン7、8)、15℃(レーン5、6)、30℃(レーン3、4)、32℃(レーン1、2)、でPIPを発現させた。PIPのC末端につけられた6×Hisタグを利用してNi-NTA Superflowを用いて精製した。
【0118】
32℃から4℃の広範な温度域において、TipA遺伝子プロモーター、並びにTipA-LG10プロモーターからのPIPの発現が確認された。32℃、30℃においてはTipAプロモーターからのPIPの発現量の方が多かったが、15℃、4℃においてはTipA-LG10プロモーターからの発現の方が多かった。
【0119】
〔実施例18〕
Rhodococcus属細菌における外来タンパク質の発現と精製3
PIP以外のタンパク質も該発現ベクターを用いて、発現させることができるかどうか調べるために、以下の実験を行った。
【0120】
プラスミドpRSET-ATPIPをテンプレートとして、配列表中の配列番号48、49に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、Arabidopsis thaliana由来PIP遺伝子(Tamura et al., FEBS Lett. 398 101-105 (1996):以下AtPIPと略記)を含むDNAを得た。この1.0kbのDNA断片を制限酵素NcoIとXhoIで二重消化し、pTip-CH1、並びにpTip-LCH1のNcoI、XhoI部位にそれぞれサブクローンした結果、TipA遺伝子プロモーターもしくはTipA-LG10プロモーターの制御下に置かれたAtPIP遺伝子(6×HisタグをC末端に持つ)を含むプラスミドが作成され、pHN176、pHN177とそれぞれ名前を付けた。
【0121】
プラスミドpTrc99a-GFPをテンプレートとして、配列表中の配列番号50、51に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、Aequorea victoria由来蛍光緑色タンパク質をコードする遺伝子(以下GFPと略記)を含むDNAを得た。0.8kbのDNA断片を制限酵素BspHIとSmaIで二重消化し、pTip-NH1並びにpTip-LNH1のNcoI、SnaBI部位にそれぞれサブクローンした結果、TipA遺伝子プロモーターもしくはTipA-LG10プロモーターの制御下に置かれたGFP(6×HisタグをN末端に持つ)遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN187、pHN186とそれぞれ名前を付けた。
【0122】
プラスミドpGEX-2T(アマシャムバイオサイエンス社)をテンプレートとして、配列表中の配列番号52、53に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、グルタチオン-S-トランスフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子(以下GSTと略記)を含むDNAを得た。0.7kbのDNA断片を制限酵素NcoIとXhoIで二重消化し、pTip-NH2、並びにpTip-LNH2のNcoI、XhoI部位にそれぞれサブクローンした結果、TipA遺伝子プロモーターもしくはTipA-LG10プロモーターの制御下に置かれたGST遺伝子(6×HisタグをN末端に持つ)を含むプラスミドが作成され、pHN282、pHN283とそれぞれ名前を付けた。
【0123】
pHN170(実施例7に記載)、pHN171(実施例7に記載)、pHN176、pHN177、pHN187、pHN186、pHN282、pHN283を用いて、実施例12と同様にRhodococcus erythropolis JCM3201株を形質転換し、実施例13に準じてPIP、AtPIP、GFP、GST各タンパク質を30℃、4℃でそれぞれ発現させた。いずれも、発現誘導時間は4℃がO.D.600=2.0で誘導開始し、2400分(40時間)で、30℃がO.D.600=0.6で誘導開始し、960分(16時間)で、加えたチオストレプトンは終濃度1μg/mlである。なお、4℃では50ml、30℃では20mlの培養液から精製を行った。
上記4種のタンパク質には全て6×Hisタグがついており、実施例16に準じて精製を行った。
【0124】
上記サンプルのうち10μlを常法に従い、12% SDSポリアクリルアミド電気泳動に供した結果を図18に示す。Rhodococcus erythropolis JCM3201株をpHN170(TipA遺伝子プロモーターの下流にPIP:レーン1、9)、pHN171(TipA-LG10プロモーターの下流にPIP:レーン2、10)、pHN176(TipA遺伝子プロモーターの下流にAtPIP:レーン3、11)、pHN177(TipA-LG10プロモーターの下流にAtPIP:レーン4、12)、pHN187(TipA遺伝子プロモーターの下流にGFP:レーン5、13)、pHN186(TipA-LG10プロモーターの下流にGFP:レーン6、14)、pHN282(TipA遺伝子プロモーターの下流にGST:レーン7、15)、pHN283(TipA-LG10プロモーターの下流にGST:レーン8、16)で形質転換し、4℃(レーン9から16)30℃(レーン1から8)で各タンパク質を発現させた。各タンパク質の末端につけられた6×Hisタグを利用してNi-NTA Superflowを用いて精製した。
【0125】
また、デンシトメーターにてバンドの密度を測定し、定量した結果を図19に示すが、これは図18で示されたSDSポリアクリルアミド電気泳動像のバンドから定量したものである。該図では、それぞれの外来タンパク質が1リットルの培養液からどれだけ精製されたかを示す。単位はmgで示されている。一番右のカラム(倍率)は、TipA遺伝子プロモーターを用いて発現させた場合に比べて、TipA-LG10プロモーターを用いて発現させた場合、何倍のタンパク質が精製されるか示されている。この結果、4℃において、TipA遺伝子プロモーターよりもTipA-LG10プロモーターから発現させる方が、得られる組み換えタンパク質の量が多いことがわかった。しかし、30℃の場合は必ずしもTipA-LG10プロモーターから発現させる方が、得られる組み換えタンパク質の量が多いとは限らなかった。
【0126】
〔実施例19〕
大腸菌に対して30℃で増殖阻害効果を示すマウス由来タンパク質の分離
具体的にどの遺伝子が発現されると宿主に対して増殖阻害効果を示すのかを調べるために、マウス肝臓由来のPoly(A)+RNA(STRATAGENE社製)を用いて大腸菌用発現ライブラリーを構築した。以下に具体的に述べる。
【0127】
大腸菌用発現ベクターはアラビノース誘導性ベクターを用いることとした。まず該ベクター、pBAD/HisA(Invitrogen社製)において、cDNAの導入を容易にするために、マルチクローニング部位を改変したpBAD-Linkerを作成した。以下にその作成過程を述べる。配列表中の配列番号54、55に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチド(EcoRI、BglII、XhoI認識部位からなるクローニング配列を含み、お互いに相補的な配列を持つ)を等モル量ずつ混合し、70℃で10分処理し、20分かけて室温に冷却し、2本鎖化させた。結果、その末端はNcoIとHindIIIで二重消化されたベクターと連結可能な状態になり、これをpBAD/HisAのNcoI、HindIII部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにpBAD-Linkerと名前をつけた。
【0128】
STRATAGENE社製cDNA synthesis kitを用い、その使用説明書に従って、上記Poly(A)+RNAより2本鎖cDNAを合成した。次いで、このcDNAをpBAD-LinkerのEcoRI、XhoI部位にライゲーションした。このライゲーション産物を常法に従い、大腸菌TOP10(Invitrogen社製)に形質転換し、50μg/mlアンピシリン入りLB寒天培地上にて、5万個の形質転換体を得た。その寒天培地のレプリカを50μg/mlアンピシリンと0.2% L-アラビノースを含んだLB寒天培地にGenHunter社製Easy Transfer Replica Plating Deviceを用いて作成し、タンパク質の発現を誘導させ、30℃にて一晩インキュベートした。その結果、アラビノースを含まない培地上では生育できるが、アラビノースを含む培地上では生育できないコロニーが426個選別された。
【0129】
この426個のTOP10形質転換体を1.5mlの50μg/mlアンピシリン入りLB培地にて培養した後、常法に従いプラスミドを分離、精製した。得られたプラスミドは制限酵素EcoRI、XhoIの二重消化後、1%アガロース電気泳動に供し、マウス由来のcDNA断片の長さを見積もった。さらに、得られたプラスミドは配列表中の配列番号56記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチド用い、DNAシークエンサーABI PRISM(R) 3100 Genetic Analyzerにて、マウス由来cDNA部分の塩基配列を約500塩基決定した。その結果を図20に示す。該図はBLASTプログラムを用いて、決定されたDNA配列を元に相同性検索を行い、遺伝子を同定した結果を示す。
【0130】
〔実施例20〕
Rhodococcus属細菌、並びに大腸菌における外来タンパク質の発現と精製
実施例19にて分離した遺伝子のうち、Serum amyloid A (Saa1)、NADH dehydorogenase 1 alpha subcomplex 4、 Cytochrome b5 like 、RIKEN1500015G18、Transferrin、Apolipoprotein A-V、 Pantotenate kinase 1β、Peroxiredoxin 4、 RIKEN1300017J02 (Transferrin Homolog)をRhodococcus erythropolis JCM3201と大腸菌TOP10を宿主として発現させた。また、以下の4群、10種類のタンパク質も同様に発現させた。1群)大腸菌で発現させると不活性な封入体となることが知られている3種類のプロテアーゼ、Cathepsin D、Prothrombin、Kallikrein 6、2群)その生理活性から大腸菌での発現が困難だと予想される2種類のDNAse、LSDNAse、DLAD、3群)他のグループの研究で、その細胞増殖阻害活性により大腸菌での発現が困難だとされているもの、HMG-1、Kid1、Bax alpha、4群)他のグループの研究で、低温依存的に可溶化されるとされているもの、Glucokinase、 p37A。なお、Rhodococcus erythropolisにおいては30℃と4℃で、大腸菌は30℃で組み換えタンパク質をそれぞれ発現させた。以下に詳しく述べる。
【0131】
プラスミドLE20をテンプレートとして、配列表中の配列番号57、58に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、マウス由来Serum Amyloid Protein A タンパク質(Meeker et al., Proteins 30 381-387 (1998))をコードするSaa1遺伝子(GenBank受入番号M11131)を含むDNAを得た。このDNA断片を制限酵素NdeIとXhoIで二重消化し、pTip-LNH1のNdeI、XhoI部位にサブクローンした結果、TipA-LG10プロモーターの制御下に置かれたSaa1遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN205と名前を付けた。また、プラスミドLE20をテンプレートとして、配列表中の配列番号59、60に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、マウス由来Saa1遺伝子を含むDNAを得た。このDNA断片を制限酵素XhoIとKpnIで二重消化し、pBAD/HisAのXhoI、KpnI部位にサブクローンした結果、アラビノース誘導性プロモーターの制御下に置かれたSaa1遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN193と名前を付けた。
【0132】
プラスミドL113をテンプレートとして、配列表中の配列番号61、62に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、マウス由来NADH dehydrogenase 1 alpha subcomplex 4をコードする遺伝子(Walker et al., J. Mol. Biol. 226 1051-1072 (1992):GenBank受入番号BC011114:以下NADH4と略記)を含むDNAを得た。このDNA断片を制限酵素NdeIとEcoRIで二重消化し、pTip-LNH1のNdeI、EcoRI部位にサブクローンした結果、TipA-LG10プロモーターの制御下に置かれたNADH4遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN206と名前を付けた。また、プラスミドL113をテンプレートとして、配列表中の配列番号63、62に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、マウス由来NADH4遺伝子を含むDNAを得た。このDNA断片を制限酵素XhoIとEcoRIで二重消化し、pBAD/HisAのXhoI、EcoRI部位にサブクローンした結果、アラビノース誘導性プロモーターの制御下に置かれたNADH遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN195と名前を付けた。
【0133】
プラスミドL3をテンプレートとして、配列表中の配列番号64、65に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、マウス由来Cytochrome b5 likeタンパク質をコードする遺伝子(GenBank受入番号AK002426:以下Cytochrome b5lと略記)を含むDNAを得た。このDNA断片を制限酵素NdeIとEcoRIで二重消化し、pTip-LNH1のNdeI、EcoRI部位にサブクローンした結果、TipA-LG10プロモーターの制御下に置かれたCytochrome b5l遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN208と名前を付けた。また、プラスミドL3をテンプレートとして、配列表中の配列番号66、65に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、マウス由来Cytochrome b5l遺伝子を含むDNAを得た。このDNA断片を制限酵素XhoIとEcoRIで二重消化し、pBAD/HisAのXhoI、EcoRI部位にサブクローンした結果、アラビノース誘導性プロモーターの制御下に置かれたCytochrome b5l遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN199と名前を付けた。
【0134】
プラスミドLE123をテンプレートとして、配列表中の配列番号67、68に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、マウス由来機能不明な推定上のタンパク質をコードする遺伝子(GenBank受入番号NM#025439:以下LE123と略記)を含むDNAを得た。このDNA断片を制限酵素NdeIとEcoRIで二重消化し、pTip-LNH1のNdeI、EcoRI部位にサブクローンした結果、TipA-LG10プロモーターの制御下に置かれたLE123遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN287と名前を付けた。また、プラスミドLE123をテンプレートとして、配列表中の配列番号69、68に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、マウス由来LE123遺伝子を含むDNAを得た。このDNA断片を制限酵素XhoIとEcoRIで二重消化し、pBAD/HisAのXhoI、EcoRI部位にサブクローンした結果、アラビノース誘導性プロモーターの制御下に置かれたLE123遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN276と名前を付けた。
【0135】
プラスミドLE280をテンプレートとして、配列表中の配列番号70、71に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、マウス由来Transferrinをコードする遺伝子(Mason et al., Protein Expr. Purif. 23 142-150 (2001):GenBank受入番号BC022986)を含むDNAを得た。このDNA断片を制限酵素NdeIとHindIIIで二重消化し、pTip-LNH1のNdeI、HindIIIで部位にサブクローンした結果、TipA-LG10プロモーターの制御下に置かれたTransferrin遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN289と名前を付けた。また、プラスミドLE280をテンプレートとして、配列表中の配列番号72、71に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、マウス由来Transferrin遺伝子を含むDNAを得た。このDNA断片を制限酵素XhoIとHindIIIで二重消化し、pBAD/HisAのXhoI、HindIII部位にサブクローンした結果、アラビノース誘導性プロモーターの制御下に置かれたTransferrin遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN277と名前を付けた。
【0136】
プラスミドLE295をテンプレートとして、配列表中の配列番号73、74に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、マウス由来Apolipoprotein A-Vをコードする遺伝子(van der Vliet et al., J. Biol. Chem. 276 44512-44520 (2001):GenBank受入番号NM#080434:以下Apoa5と略記)を含むDNAを得た。このDNA断片を制限酵素NcoIとEcoRIで二重消化し、pTip-LNH2のNcoI、EcoRI部位にサブクローンした結果、TipA-LG10プロモーターの制御下に置かれたApoa5遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN288と名前を付けた。また、プラスミドLE295をテンプレートとして、配列表中の配列番号75、74に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、マウス由来Apoa5遺伝子を含むDNAを得た。このDNA断片を制限酵素XhoIとEcoRIで二重消化し、pBAD/HisAのXhoI、EcoRI部位にサブクローンした結果、アラビノース誘導性プロモーターの制御下に置かれたApoa5遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN281と名前を付けた。
【0137】
マウス肝臓Poly(A)+RNAを用いて、配列表中の配列番号76、77に記載のプライマーにて、RT-PCR (Larrick, Trends Biotechnol. 10 146-152 (1992))による増幅を行った。RT-PCRにはSTRATAGENE社製のProSTAR Ultra HF RT-PCR Systemを用い、その使用説明書通りに行った(以下全てのRT-PCRは同キットを用いて行った)。その結果、マウス由来Cathepsin D遺伝子(Grusby et al., Nucleic Acids Res. 18 4008 (1990)、Babe et al., Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 17 213-252 (2000):GenBank受入番号X52886)を含むDNAを得た。このDNA断片を制限酵素NcoIとXhoIで二重消化し、pTip-LCH1のNcoI、XhoI部位にサブクローンした結果、TipA-LG10プロモーターの制御下に置かれたCathepsin D遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN270と名前を付けた。また、pHN270をNcoIとSalIで二重消化して得られた1.2kbのDNA断片をpBAD/HisAのNcoI、XhoI部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにpHN273と名前をつけた。
【0138】
マウス肝臓Poly(A)+RNAを用いて、配列表中の配列番号78、79に記載のプライマーにて、RT-PCRによる増幅を行った。その結果、マウス由来Prothrombin遺伝子(Degen et al., DNA Cell Biol.9 487-498 (1990):GenBank受入番号X52308)を含むDNAを得た。このDNA断片を制限酵素NcoIとXhoIで二重消化し、pTip-LCH1のNcoI、XhoI部位にサブクローンした結果、TipA-LG10プロモーターの制御下に置かれたProthrombin遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN271と名前を付けた。
【0139】
マウス肝臓Poly(A)+RNAを用いて、配列表中の配列番号80、81に記載のプライマーにて、RT-PCRによる増幅を行った。その結果、マウス由来Kallikrein 6遺伝子(Evans et al., J. Biol. Chem. 262 8027-8034 (1987)、Babe et al., Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 17 213-252 (2000):GenBank受入番号NM#010639)を含むDNAを得た。このDNA断片を制限酵素NcoIとXhoIで二重消化し、pTip-LCH1のNcoI、XhoI部位にサブクローンした結果、TipA-LG10プロモーターの制御下に置かれたKallikrein6遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN272と名前を付けた。また、pHN272をNcoIとSalIで二重消化して得られた0.7kbのDNA断片をpBAD/HisAのNcoI、XhoI部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにpHN275と名前をつけた。
【0140】
マウス肝臓Poly(A)+RNAを用いて、配列表中の配列番号82、83に記載のプライマーにて、RT-PCRによる増幅を行った。その結果、マウス由来LSDNAse遺伝子(Baron et al., Gene 215 291-301 (1998):GenBank受入番号AF047355)を含むDNAを得た。このDNA断片を制限酵素NdeIとXhoIで二重消化し、pTip-LNH1のNdeI、XhoI部位にサブクローンした結果、TipA-LG10プロモーターの制御下に置かれたLSDNAse遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN299と名前を付けた。
【0141】
マウス肝臓Poly(A)+RNAを用いて、配列表中の配列番号84、85に記載のプライマーにて、RT-PCRによる増幅を行った。その結果、マウス由来DLAD遺伝子(Shiokawa and Tanuma, Nucleic Acids Res. 27 4083-4089 (1999):GenBank受入番号AF128888)を含むDNAを得た。このDNA断片を制限酵素NcoIとEcoRIで二重消化し、pTip-LNH2のNcoI、EcoRI部位にサブクローンした結果、TipA-LG10プロモーターの制御下に置かれたDLAD遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN284と名前を付けた。
【0142】
マウス肝臓Poly(A)+RNAを用いて、配列表中の配列番号86、87に記載のプライマーにて、RT-PCRによる増幅を行った。その結果、マウス由来HMG-1遺伝子(Pauken et al., Mamm. Genome 5 91-99 (1994)、Lee et al., Gene 225 97-105 (1998):GenBank受入番号U00431)を含むDNAを得た。このDNA断片を制限酵素NcoIとEcoRIで二重消化し、pTip-LNH2のNcoI、EcoRI部位にサブクローンした結果、TipA-LG10プロモーターの制御下に置かれたHMG-1遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN285と名前を付けた。また、プラスミドpHN285をテンプレートとして、配列表中の配列番号88、87に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、マウス由来HMG-1遺伝子を含むDNAを得た。このDNA断片を制限酵素XhoIとEcoRIで二重消化し、pBAD/HisAのXhoI、EcoRI部位にサブクローンした結果、アラビノース誘導性プロモーターの制御下に置かれたHMG-1遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN305と名前を付けた。
【0143】
マウス肝臓Poly(A)+RNAを用いて、配列表中の配列番号89、90に記載のプライマーにて、RT-PCRによる増幅を行った。その結果、マウス由来Kid1遺伝子(Tekki-Kessaris et al., Gene 240 13-22 (1999)、Suter-Crazzolara and Unsicker Bio/Technology 19 202-204 (1995):GenBank受入番号AF184111)を含むDNAを得た。このDNA断片を制限酵素NcoIとHindIIIで二重消化し、pTip-LNH2のNcoI、HindIII部位にサブクローンした結果、TipA-LG10プロモーターの制御下に置かれたKid1遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN286と名前を付けた。
【0144】
マウス肝臓Poly(A)+RNAを用いて、配列表中の配列番号91、92に記載のプライマーにて、RT-PCRによる増幅を行った。その結果、マウス由来Bax alpha遺伝子(Oltvai et al., Cell 74 609-619 (1993)、Donnelly et al., Protein Expr. Purif. 22 422-429 (2001):GenBank受入番号L22472)を含むDNAを得た。このDNA断片を制限酵素NdeIとEcoRIで二重消化し、pTip-LNH1のNdeI、EcoRI部位にサブクローンした結果、TipA-LG10プロモーターの制御下に置かれたBax alpha遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN217と名前を付けた。また、プラスミドpHN217をテンプレートとして、配列表中の配列番号93、92に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、マウス由来Bax alpha遺伝子を含むDNAを得た。このDNA断片を制限酵素XhoIとEcoRIで二重消化し、pBAD/HisAのXhoI、EcoRI部位にサブクローンした結果、アラビノース誘導性プロモーターの制御下に置かれたBax alpha遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN212と名前を付けた。
【0145】
マウス肝臓Poly(A)+RNAを用いて、配列表中の配列番号94、95に記載のプライマーにて、RT-PCRによる増幅を行った。その結果、マウス由来Glucokinase遺伝子(Lin et al., Protein Expr. Purif. 1 169-176(1990):GenBank受入番号BC011139)を含むDNAを得た。このDNA断片を制限酵素NdeIとXhoIで二重消化し、pTip-LNH1のNdeI、XhoI部位にサブクローンした結果、TipA-LG10プロモーターの制御下に置かれたGlucokinase遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN298と名前を付けた。また、pHN298をNcoIとXhoIで二重消化して得られた1.4kbのDNA断片をpBAD/HisAのNcoI、XhoI部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにpHN306と名前をつけた。
【0146】
pET22b-Dmp37Aを用いて、配列表中の配列番号105、96に記載のプライマーにて、PCRによる増幅を行った。その結果、Drosophila melanogaster由来p37Aをコードする遺伝子(Holzl et al., J. Cell Biol. 150 119-129 (2000):GenBank受入番号AF145312)を含むDNAを得た。このDNA断片を制限酵素NdeIとXhoIで二重消化し、pTip-LCH2のNdeI、XhoI部位にサブクローンした結果、TipA-LG10プロモーターの制御下に置かれたp37A遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN291と名前を付けた。また、プラスミドpHN291をテンプレートとして、配列表中の配列番号97、25に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、Drosophila melanogaster由来p37A遺伝子を含むDNAを得た。このDNA断片を制限酵素SalIで消化後、NcoIで部分消化し(p37A内部のNcoIで切断しないように)、pBAD/HisAのNcoI、XhoI部位にサブクローンした結果、アラビノース誘導性プロモーターの制御下に置かれたp37A遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN308と名前を付けた。
【0147】
プラスミドLE59をテンプレートとして、配列表中の配列番号98、99に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、マウス由来Pantothenate kinase 1 betaタンパク質をコードする遺伝子(Rock et al., J. Biol. Chem. 275 1377-1383 (2000):GenBank受入番号AF200357:以下PanKと略記)を含むDNAを得た。このDNA断片を制限酵素XhoIとEcoRIで二重消化し、pBAD/HisAのXhoI、EcoRI部位にサブクローンした結果、アラビノース誘導性プロモーターの制御下に置かれたPanK遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN279と名前を付けた。
【0148】
マウス肝臓Poly(A)+RNAを用いて、配列表100、101に記載のプライマーにて、RT-PCRによる増幅を行った。その結果、マウス由来Peroxiredoxin 4をコードする遺伝子(GenBank受入番号BC019578)を含むDNAを得た。このDNA断片を制限酵素XhoIとKpnIで二重消化し、pBAD/HisAのXhoI、KpnI部位にサブクローンした結果、アラビノース誘導性プロモーターの制御下に置かれたPeroxiredoxin 4遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN278と名前を付けた。
【0149】
プラスミドLE156をテンプレートとして、配列表中の配列番号102、103に記載のプライマーを用いて、PCRによる増幅を行った。その結果、マウス由来Transferrin様タンパク質をコードする遺伝子(GenBank受入番号AK005035:以下TFLと略記)を含むDNAを得た。このDNA断片を制限酵素XhoIとEcoRIで二重消化し、pBAD/HisAのXhoI、EcoRI部位にサブクローンした結果、アラビノース誘導性プロモーターの制御下に置かれたTFL遺伝子を含むプラスミドが作成され、pHN280と名前を付けた。
【0150】
また、上述したタンパク質のうち、シグナルペプチドを持つものは全てシグナルペプチドをコードするDNA配列を除いてサブクローンされている。また、Prothrombinは成熟Thrombinになる直前の「Prethrombin-2」をコードするDNA配列(Soejima et al., J. Biochem. 130 269-277 (2001))がサブクローンされている。
【0151】
pHN171(実施例7に記載)、pHN205、pHN206、pHN208、pHN287、pHN289、pHN288、pHN270、pHN271、pHN272、pHN299、pHN284、pHN285、pHN286、pHN217、pHN298、pHN291を用いて、実施例12と同様にRhodococcus erythropolis JCM3201株を形質転換し、実施例13に準じて各タンパク質を30℃、4℃でそれぞれ発現させた。
【0152】
これらのタンパク質には全て6×Hisタグが末端についており、実施例16と同様に精製を行った。またこれに加え、今回は細胞破壊後に20,000×gにて遠心してできた沈殿(実施例16に記載)からも精製を行った。具体的に以下に沈殿物からの精製法を示すが、その作業は室温で行った。1mlのDN-Buffer(50mM Tris-HCl(pH8.0)、8M尿素)に沈殿物を懸濁し、20,000×gにて遠心し、その上清700μlに、予めDN-Bufferで平衡化されたNi-NTA Superflowをベッド体積40μlになるように加えた。これを1時間回転撹拌しながらNi-NTA Superflowビーズと6×Hisタグのついたタンパク質とを結合させた。このビーズをDN-Bufferで4回洗浄した後、120μlのDNE-Buffer(50mM Tris-HCl (pH7.0)、8M尿素、400mMイミダゾール)に3回懸濁することで、ビーズから6×Hisタグのついたタンパク質を溶出させた。
【0153】
pBAD/His/lacZ(Invitrogen社)、pHN193、pHN195、pHN199、pHN276、pHN277、pHN281、pHN273、pHN275、pHN305、pHN212、pHN306、pHN308、pHN279、pHN278、pHN280を用い、Invitrogen社のpBAD/Hisキットの使用説明書の通りに、大腸菌にてタンパク質の発現を行った。
【0154】
以下に具体的な精製法を示す。タンパク質を発現させた菌体を回収し、1mlのNT-Bufferに懸濁した。これを超音波発生器 UD-20(TOMY社製)を用いて細胞を破壊した。20,000×gにて遠心し、その上清900μlに、予め、NT-Bufferで平衡化されたNi-NTA Superflowをベッド体積40μlになるように加えた。これを1時間回転撹拌しながらNi-NTA Superflowビーズと6×Hisタグのついたタンパク質とを結合させた。このビーズをNT-Bufferで4回洗浄した後、120μlのNTE-Bufferに3回懸濁することで、ビーズから6×Hisタグのついたタンパク質を溶出させた。上記の作業はすべて4℃で行った。
【0155】
また、細胞破壊後、20,000×gにて遠心してできた沈殿からも精製を行ったが、その作業工程は上述した方法と同様である。
【0156】
上記サンプルのうち10μlを常法に従い12% SDSポリアクリルアミド電気泳動に供し、デンシトメーターにてバンドの密度を測定し、定量した結果を図21に示す。該図において、左から2番目のカラムは発現させたタンパク質の名前を示す。左から3番目のカラムは発現させたタンパク質のN末端、C末端どちらに6×Hisタグを付けたかを示す。左から4番目のカラムは、シグナル配列等を含めた完全長のタンパク質の推定分子量(kDa)を示すが、括弧内の数字は実際に発現させたタンパク質部分の推定分子量を示す。左から5、9番目のカラムはタンパク質を発現させた時に用いたプラスミドの名前を示す。左から6、8、10番目のカラムは1リットルの培養液あたり、得られた組み換えタンパク質の質量を示すが(単位はミリグラム)、20,000×gでの上清画分(Sup)から精製したときと、沈殿画分(Ppt)から精製したときとに分けて示してある。左から7、11番目のカラム中の+、-はそれぞれの形質転換体を発現誘導剤(Rhodococcus erythropolisの場合は1μg/mlのチオストレプトン、大腸菌の場合は0.2% L-アラビノース)を含んだ寒天培地上に塗布した時の、増殖の速度を表している。最も早く増殖した形質転換体が+++で、全く増殖しなかった形質転換体が-である。また、用いた宿主、発現誘導時の温度が最上部に示されている。N.D. (Not Detected)は検出限界以下だったことを示す。
【0157】
表1に実施例で用いた各プラスミドのリストを、表2に実施例で用いた菌株のリストを示す。
【0158】
【表1】
【0159】
【表2】
【0160】
【発明の効果】
実施例13から18並びに実施例20に示されるように、本発明の発現ベクターを用いることにより、4℃という低温条件下で外来遺伝子のコードするタンパク質を発現産生させることが可能である。
【0161】
【配列表】
【0162】
【配列表フリーワード】
配列1〜105:プライマー
配列106〜113:ベクター
【図面の簡単な説明】
【図1】誘導型発現ベクターのバックボーンになるプラスミドpHN136の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対(キロベースペアー:kb)を示す。
【図2】チオストレプトン耐性遺伝子を持つプラスミドpHN143の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対(キロベースペアー:kb)を示す。CIAPはCalf Intestine Alkaline Phosphataseを、Blu.は平滑末端(Blunt end)を意味する。
【図3】 Inducer cassetteを持つプラスミドpHN62の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対(キロベースペアー:kb)を示す。Blu.は平滑末端(Blunt end)を意味する。
【図4】 Expression cassetteを持つプラスミドpHN153の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対(キロベースペアー:kb)を示す。CIAPは(Calf Intestine Alkaline PhosphataseをBlu.は平滑末端(Blunt end)を意味する。
【図5】テトラサイクリン耐性遺伝子を持つプラスミドpHN169の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対(キロベースペアー:kb)を示す。CIAPはCalf Intestine Alkaline Phosphataseを、Blu.は平滑末端(Blunt end)を意味する。
【図6】 PIPをレポーター遺伝子として持つ誘導型発現ベクタープラスミドpHN170、pHN171の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置を示す。数字は塩基対(キロベースペアー:kb)を示す。CIAPはCalf Intestine Alkaline Phosphataseを意味する。
【図7】マルチクローニング部位を持つ誘導型発現ベクタープラスミドpTip-NH1、pTip-CH1、pTip-LNH1、pTip-LCH1の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対(キロベースペアー:kb)を示す。
【図8】マルチクローニング部位を持つ誘導型発現ベクタープラスミドpTip-NH2、pTip-CH2、pTip-LNH2、pTip-LCH2の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対(キロベースペアー:kb)を示す。
【図9a】a)pTip-NH1、pTip-CH1、pTip-LNH1、pTip-LNH1、pTip-NH2、pTip-CH2、pTip-LNH2、pTip-LCH2のマップを示す図である。各領域の機能と、プラスミドのマップを示す。
【図9b】b)pTip-NH1、pTip-LNH1のTipA遺伝子プロモーター配列、またはTipA-LG10プロモーター配列から、マルチクローニング部位、ThcA遺伝子転写終結配列までのDNA配列を示す。
【図9c】c)pTip-CH1、pTip-LCH1のTipA遺伝子プロモーター配列、またはTipA-LG10プロモーター配列から、マルチクローニング部位、ThcA遺伝子転写終結配列までのDNA配列を示す。
【図9d】d)pTip-NH2、pTip-LNH2のTipA遺伝子プロモーター配列、またはTipA-LG10プロモーター配列から、マルチクローニング部位、ThcA遺伝子転写終結配列までのDNA配列を示す。
【図9e】e)pTip-CH2、pTip-LCH2のTipA遺伝子プロモーター配列、またはTipA-LG10プロモーター配列から、マルチクローニング部位、ThcA遺伝子転写終結配列までのDNA配列を示す。
【図10】 pTip-CH1.1、pTip-LCH1.1、pTip-CH2.1およびpTip-LCH2.1のマップを示す図である。
【図11】 PIP活性測定のためのコントロールプラスミドpHN172、pHN173の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置を示す。数字は塩基対(キロベースペアー:kb)を示す。また、CIAPはCalf Intestine Alkaline Phosphataseを意味する。pHN170は、「Expression cassette」と「Inducer cassette」両方をもつのに対して、pHN173は「Expression cassette」のみをもち、pHN172は両cassetteを持たない。
【図12】誘導型発現ベクターを用いたPIP活性の測定1の結果を示す図である。
【図13】誘導型発現ベクターを用いたPIP活性の測定2aの結果を示す図である。
【図14】誘導型発現ベクターを用いたPIP活性の測定2bを示す図である。
【図15】誘導型発現ベクターを用いたPIP活性の測定3の結果を示す図である。
【図16】誘導型発現ベクターを用いた外来タンパク質の精製1の結果を示す図である。
【図17】誘導型発現ベクターを用いた外来タンパク質の精製2の結果を示す図である。
【図18】誘導型発現ベクターを用いた外来タンパク質の精製3aの結果を示す図である。
【図19】誘導型発現ベクターを用いた外来タンパク質の精製3bの結果を示す図である。
【図20】大腸菌の増殖を30℃で阻害するタンパク質のリストを示す図である。
【図21】Rhodococcus erythropolis、大腸菌を宿主とした外来タンパク質の発現を示す図である。
【図22】 TipA遺伝子プロモーター配列を示す図である。
【図23】 TipA遺伝子プロモーター中のRBS配列(WT RBS)のLG10 RBSへの改良を示す図である。
Claims (15)
- TipA-LG10プロモーター配列、外来遺伝子を導入可能な第1のマルチクローニング部位および転写終結配列を含む発現カセット、第2のプロモーター配列およびTipA遺伝子を含む誘導カセット、Rhodococcus属細菌用プラスミドの自律複製に必須なDNA領域ならびにチオストレプトン耐性遺伝子を含む、外来遺伝子を低温条件下で増殖可能なRhodococcus属細菌内で誘導発現し得るRhodococcus属細菌用誘導型発現ベクター。
- さらに大腸菌用プラスミドの自律複製に必須なDNA領域を含み、大腸菌中で複製可能な請求項1記載のRhodococcus属細菌用誘導型発現ベクター。
- 配列番号110に表される塩基配列を有するpTip-LNH1、配列番号111に表される塩基配列を有するpTip-LNH2、配列番号112に表される塩基配列を有するpTip-LCH1、配列番号113に表される塩基配列を有するpTip-LCH2、pTip-LCH1.1およびpTip-LCH2.1からなる群から選択される請求項1または2に記載のRhodococcus属細菌用誘導型発現ベクター。
- Rhodococcus属細菌がR. erythropolis、R. fasciansおよびR. opacusからなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載のRhodococcus属細菌用誘導型発現ベクター。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のRhodococcus属細菌用誘導型発現ベクターを含むRhodococcus属細菌形質転換体。
- 外来遺伝子として15℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質をコードする遺伝子を含む請求項1〜4のいずれか1項に記載のRhodococcus属細菌用誘導型発現ベクターを低温で増殖可能なRhodococcus属細菌に導入し、低温条件下でチオストレプトンを含む培地を用いて前記Rhodococcus属細菌用誘導型発現ベクター導入細菌を培養することを含む、15℃を超える中高温条件下では発現産物が宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質を低温で産生させる方法。
- 15℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、15℃を超える中高温条件下では宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質である、請求項6記載のタンパク質を低温で産生させる方法。
- 15℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、大腸菌で15℃を超える中高温で発現させた場合に不活性な封入体を作るタンパク質である、請求項6記載のタンパク質を低温で産生させる方法。
- 好冷菌または低温環境下に生存する動物もしくは植物由来のタンパク質をコードする遺伝子を含む請求項1〜4のいずれか1項に記載のRhodococcus属細菌用誘導型発現ベクターを低温で増殖可能なRhodococcus属細菌に導入し、低温条件下でチオストレプトンを含む培地を用いて前記Rhodococcus属細菌用誘導型発現ベクター導入細菌を培養することを含む、好冷菌または低温環境下に生存する動物もしくは植物由来のタンパク質を低温で産生させる方法。
- 外来遺伝子を含む請求項1〜4のいずれか1項に記載のRhodococcus属細菌用誘導型発現ベクターを低温で増殖可能なRhodococcus属細菌に導入し、15℃を超える中高温条件下および低温条件下でチオストレプトンを含む培地を用いて前記Rhodococcus属細菌用誘導型発現ベクター導入細菌を培養し、15℃以下の低温条件下でのみ発現される遺伝子を選択することを含む、15℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質をスクリーニングする方法。
- 15℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、15℃を超える中高温条件下では宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質である、請求項10記載の15℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質をスクリーニングする方法。
- 大腸菌に導入し15℃を超える中高温で発現させよとした場合に、発現しないかまたは大腸菌の増殖を阻害する遺伝子を選択し、次いで該遺伝子を外来遺伝子として含む請求項1〜4のいずれか1項に記載のRhodococcus属細菌用誘導型発現ベクターを低温で増殖可能なRhodococcus属細菌に導入し、低温条件下でチオストレプトンを含む培地を用いて前記Rhodococcus属細菌用誘導型発現ベクター導入細菌を培養したときに発現しうる遺伝子を選択することを含む、15℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質をスクリーニングする方法。
- 15℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、大腸菌の増殖を30℃以上で阻害するタンパク質である、請求項12記載のタンパク質をスクリーニングする方法。
- 15℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、大腸菌で15℃を超える中高温で発現させた場合に封入体を作るタンパク質である、請求項12記載のタンパク質をスクリーニングする方法。
- 15℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、15℃を超える中高温条件下では宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質である、請求項12記載の15℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質をスクリーニングする方法。
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