DE19926770A1

DE19926770A1 - Nukleinsäurefragment und Vektor, enthaltend eine Halogenase, sowie ein Verfahren zur Halogenierung chemischer Verbindungen

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Publication number: DE19926770A1
Application number: DE19926770A
Authority: DE
Inventors: Stefan Pelzer; Petra Huber; Roderich Suessmuth; Juergen Recktenwald; Dorothe Heckmann; Wolfgang Wohlleben
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1999-06-11
Filing date: 1999-06-11
Publication date: 2000-12-14
Also published as: JP2006075168A; CA2376446A1; US6566110B1; AU4758100A; CN1370229A; WO2000077182A1; US6794170B2; EP1185629A1; JP2003502034A; WO2000077182A9; US20030096335A1; AU776205B2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Halogenierung, dadurch gekennzeichnet, daß eine chemische Verbindung in Gegenwart einer Halogenase halogeniert wird, wobei eine Halogenase von der DOLLAR A (a) in SEQ ID NO: 1 genannten oder einer aufgrund des degenerierten genetischen Codes davon abgeleiteten Sequenz codiert wird oder von DOLLAR A (b) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein funktionelles Fragment von (a) oder DOLLAR A (c) einer mit (a) oder (b) unter Standardbedingungen hybridisierenden Sequenz codiert wird oder von einer DOLLAR A (d) Sequenz codiert wird, die mit der unter (a) genannten Sequenz eine über 30%ige Identität oder über 60%ige Ähnlichkeit aufweist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Halogenierung chemischer Verbindungen. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Nukleinsäurefragment, einen Vektor und Organismen enthaltend eine Halogenase bzw. ein Halogenasegen.

In der chemischen Synthese sind Halogenierungsreaktionen seit langem bekannt. Sie dienen der Herstellung einer Vielzahl von halogenierten organischen Verbindungen. Von Nachteil bei diesen Synthesereaktionen ist, daß für die Synthese spezielle Anlagen benötigt werden. Diese Anlagen müssen besonders gegen Korrosion geschützt werden, da die Reaktionsprodukte häufig sehr korrosiv sind. Häufig bilden sich während der Synthese neben dem ge wünschten Produkt Nebenprodukte, die zu Produktverunreinigungen führen. Diese Nebenprodukte müssen, falls sie im Endprodukt nicht tolerierbar sind, aufwendig abgereinigt werden. Viele der Nebenprodukte sind darüber hinaus toxisch. In einer Reihe von Reaktionen kann es zur Dioxinbildung kommen.

Eine Alternative zur chemischen Halogenierung stellt die enzymatische Synthese dar. Sie ist in der Regel sehr selektiv, das heißt es werden in der Regel keine Nebenprodukte gebildet.

Aus der Literatur sind mit den sogenannten Haloperoxidasen Enzyme bekannt, die in Gegenwart eines Halogenions und Wasserstoff peroxid organische Verbindungen halogenieren. Beispiele für derartige Enzyme sind die Haloperoxidase aus Streptomyces aureo faciens (Kren et al., Liebigs Ann./Red., 1997, 11: 2379-83), aus Rhodococcus erythropolis (Schrijver et al., Appl. Environ. Micro biol., 1997, 63, 5: 1911-1916), aus Amycolatopsis orientalis (von Wageningen et al., Chem. Biol., 1998, 5: 155-162), aus Caldarino myces fumago (Hohaus et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1997, 36, No. 18: 2012-2013), aus Streptomyces lividans oder Serratia marcescens (von Pee, K. H., Ann. Rev. Microbiol., 1996, 50: 375-99).

Es ist nicht absolut klar, ob die Halogenierungsreaktion die eigentliche Enzymreaktion dieser Haloperoxidasen darstellt oder aber ob es nur eine Nebenreaktion ist. Sehr häufig zeigen die Enzyme eine geringe Substrat- und Cosubstrataffinität und eine für Enzyme geringe Spezifität.

Neben den Haloperoxidasen sind weitere halogenierende Enzyme aus der Literatur bekannt. So beschreibt Kirner et al. (J. Bacteriol., 1998, Vol. 180, No. 7, p. 1939-1943) bzw. Hohaus et al. (Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1997, 36, No. 18, 2012-2013) eine Halogenase, die ein Chloroatom in 7-Position des Tryptophans einführt.

Weitere Enzyme werden in Hammer et al. (Appl. Environ. Micro biol., 1997, Vol. 63, No. 6, 2147-2154), de Schrijver et al. (Appl. Environ. Microbiol., 1997, Vol. 63, No. 5, 1911-1916), Nowak-Thompson et al. (J. Bacteriol., 1999, 181: 2166-2174), Solenberg et al. (Chem. Biol., 4, 1997: 195-202) und Dairi et al. (Biosci., Biotechnol. Biochem. 59, 1995, 1099-1106) beschrieben.

GenBank (Y 16952) ist ein 9,9 kb langes Amycolatopsis mediterranei DNA-Fragment zu entnehmen. Pelzer et al. beschreiben im GenBank-Eintrag zwei Funktionen dieser DNA. Sie codiert für Oxygenasen und Glycosyltransferasen. Weitere Funktionen werden nicht genannt.

Keines der Enzyme wird bisher zur technischen Herstellung von halogenierten organischen Verbindungen verwendet. Es bestand daher die Aufgabe, ein Enzym für die technische Synthese halo genierter organischer Verbindungen bereitzustellen.

Diese Aufgabe wurde durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Halogenierung gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine chemische Verbindung in Gegenwart einer Halogenase halogeniert wird, wobei die Halogenase von der

a) in SEQ ID NO: 1 genannten oder einer aufgrund des degenerier ten genetischen Codes davon abgeleiteten Sequenz codiert wird oder von
b) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein funktionelles Fragment von (a) oder
c) einer mit (a) oder (b) unter Standardbedingungen hybridi sierenden Sequenz codiert wird oder von einer
d) Sequenz codiert wird, die mit der unter (a) genannten Sequenz eine über 30%ige Identität oder über 60%ige Ähnlichkeit auf weist.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Halogenase läßt sich in dem Fachmann bekannter Weise aus Organismen isolieren. Bevorzugt läßt sie sich aus Organismen isolieren, die haloge nierte Verbindungen, beispielsweise Glykopeptid-Antibiotika, synthetisieren. Beispiele für derartige Organismen finden sich bei den Bacteria und Eucarya wie Algen wie Ascophyllum oder Synechocystis, Flechten, Pilze wie Caldariomyces, Hefen und Bakterien wie gram-positive Bakterien wie die Actinomycetales, die Bacillalas oder gram-negative Bacterien wie Pseudomonas. Die Halogenase läßt sich vorteilhaft auch aus nocardioformen Actinomyceten oder Streptomyceten isolieren.

Besonders bevorzugt läßt sich die Halogenase oder die Halogenasen (im folgenden bzw. für die Anmeldung soll singula und plural als Synonym gelten) aus Glykopeptid-Antibiotika produzierenden Mitgliedern der Familie der Pseudonocardiaceae und verwandten Bakterien isolieren, wie aus den Gattungen Pseudonocardia, Saccharomonospora, Saccharopolyspora. Amycolatopsis, Thermo crispum, Pseudoamycolata, Kibdelosporangium, Amycolata, Actino polyspora, Actinokineospora oder Actinobispora, beispielhaft seien die Gattungen und Arten Nocardia mediterranei, Amycola topsis mediterranei, Streptomyces mediterranei, Nocardia spec., Amycolatopsis spec., Streptomyces spec., Nocardia orientalis, Amycolatopsis orientalis, Streptomyces orientalis, Streptomyces toyocaensis oder Streptomyces viridochromogenes. Ganz besonders bevorzugt seien Amycolatopsis orientalis C329.4, A82846 und ATCC19795 und Amycolatopsis mediterranei DSM 5908 genannt. Auch aus Organismen der Gattung Streptomyces, speziell der Gattung und Art Streptomyces mediterranei, läßt sich das Enzym vorteilhaft isolieren.

Weiterhin läßt sich die Halogenase bzw. die Nukleinsäure, die für die Halogenase codiert, aus den Gattungen Rhodococcus, Thermo monospora, Bacillus, Serratia, Actionosporangium, Actinomadura, Actinoplanes oder Micromonospora isolieren.

Das Gen für die Halogenase läßt sich aus einer Genbank dieser Organismen über verschiedene dem Fachmann bekannte Techniken iso lieren. Eine dieser Techniken ist beispielsweise das "Fischen" des Gens über die Hybridisierung mit der in SEQ ID NO: 1 genann ten Sequenz oder Teilen dieser Sequenz aus der Genbank.

Ein entsprechendes Versuchsprotokoll ist beispielsweise den Lehrbüchern von Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning:
A laboratory manual, Cold Spring, Harbor Laboratory Press, von F. M. Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, oder von D. M. Glover et a., DNA Cloning, Vol. 1 (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9) zu entnehmen. Als weitere Methode sei die PCR-Klonierungstechnik genannt (siehe Beispiele).

In Pelzer et al. (J. Biotechnol., 56 [1997], 115-128) wird unter Punkt 2.4 die Herstellung einer Gen-(DNA)bibliothek für Amycolatopsis mediterranei beschrieben. Weitere Methoden für andere Organismen sind dem Fachmann bekannt und können Lehr büchern wie Sambrook et al. (1989) entnommen werden.

Für das erfindungsgemäße Verfahren können prinzipiell alle Organismen verwendet werden die mindestens eine Genkopie der Halogenase enthalten.

Dies können Organismen sein, die das Gen natürlicherweise ent halten, oder die das Gen in klonierter Form enthalten. Dabei kann das Gen in den natürlichen Wirtsorganismus oder aber in einen anderen Organismus eingebracht worden sein.

Bevorzugt werden Wirtsorganismen verwendet, die eine vorteilhafte gute bzw. hohe Verträglichkeit gegenüber organischen Lösungs mitteln, gegenüber den umzusetzenden Substanzen, gegenüber erhöhten Temperaturen und veränderten Drücken aufweisen. Vor teilhaft werden Organismen verwendet, in die mindestens ein Halogenasegen eingebracht wurde.

Wirte, die diese neben anderen vorteilhaften Bedingungen er füllen, lassen sich in fast allen Bereichen des Tier-, Pflanzen- und Bakterienreiches finden.

Vorteilhafte Mikroorganismen, die als Wirtsorganismen fungieren können, lassen sich unter den Pilzen, Hefen und Bakterien finden.

Als prokaryontische Wirtsorganismen im erfindungsgemäßen Ver fahren kommen prinzipiell alle gram-negativen oder gram-positiven Bakterien in Frage. Als gram-negative Bakterien seien beispiel haft die Enterobacteriaceae wie die Gattungen Escherichia, Aerobacter, Enterobacter, Citrobacter, Shigella, Klebstella, Serratia, Erwinia oder Salmonella oder die Pseudomonadaceae wie die Gattungen Pseudomonas, Xanthomonas, Burkholderia, Gluconobacter, Nitrosomonas, Nitrobacter, Methanomonas, Comamo nas, Cellulomonas oder Acetobacter genannt.

Als gram-positive Bakterien seien beispielhaft die Endosporen bildenden gram-positiven aeroben oder anaeroben Bakterien wie die Gattungen Bacillus, Sporolactobacillus oder Clostridium, die coryneformen Bakterien wie die Gattungen Arthrobacter, Cellulo monas, Curtobacterium, Corynebacterium, Brevibacterium, Micro bacterium oder Kurthia oder die Actinomycetales wie die Familien Pseudonocardiaceae, Streptomycineae oder Nocardiaceae mit den Gattungen wie Mycobacterium, Rhodococcus, Streptomyces, Nocardia, Amycolatopsis, Pseudonocardia, Saccharomonospora, Saccharo polyspora oder Thermocrispum genannt. Bevorzugt werden Bakterien der Gattungen Escherichia, Salmonella, Pseudomonas, Comamonas, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Brevibacterium, Strepto myces, Actinomyces, Mycobacterium, Gordona, Micrococcus, Rhodococcus, Nocardia oder Amycolatopsis verwendet.

Besonders bevorzugt werden Gattungen und Arten wie Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Pseudomonas mendocina, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mutabilis, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas fluorescens, Comamonas acidovorans, Comamonas testosteroni, Bacillus subtilis, Bacillus sphaericus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus megaterium, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Streptomyces sp., Streptomyces lividans, Amycolatopsis mediterranei, Amycolatopsis orientalis, Nocardia mediterranei oder Nocardia orientalis verwendet.

Vorteilhaft werden Organismen verwendet, für die die zum Ein bringen genetischer Information erforderlichen Methoden schon vorhanden sind, wie beispielsweise für Escherichia, Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia oder Amycolatopsis.

Die taxonomische Stellung der aufgeführten Gattungen unterlag in den letzten Jahren einem starken Wandel und befindet sich noch immer im Fluß, da falsche Gattungs- und Artnamen korrigiert werden. Aufgrund dieser in der Vergangenheit häufig erforder lichen taxonomischen Umgruppierungen der genannten Gattungen innerhalb der bakteriellen Systematik sind auch andere als die oben genannten Familien, Gattungen und Arten für das erfindungs gemäße Verfahren geeignet, sowohl als Ausgangsorganismus zur Isolierung der Halogenase bzw. des Halogenasegens als auch zum Einbringen der DNA.

Als eukaryontische Wirtsorganismen des erfindungsgemäßen Ver fahrens kommen prinzipiell alle Organismen in Frage wie Pilze, Hefen, Pflanzen, pflanzliche Zellen oder tierische Zellen. Als Hefen seien die Gattungen Ehodotorula, Yarrowia, Sporobolomyces, Candida, Hansenula, Pichia, Saccharomyces oder Schizosaccharo myces bevorzugt genannt. Besonders bevorzugt sind die Gattungen und Arten Rhodotorula rubra, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula graminis, Yarrowia lipolytica, Sporobolomyces salmonicolor, Sporobolomyces shibatanus, Saccharomyces cerevisiae, Candida boidinii, Candida bombicola, Candida cylinderacea, Candida para psilosis, Candida rugosa, Candida tropicalis, Pichia methanolica oder Pichia pastoris.

Als Pilze seien Aspergillus, Canninghamella, Beauveria, Mucor, Neurospora, Penicillium oder Rhizoctonia beispielhaft genannt. Vorteilhaft werden als Pilze folgende Gattung und Art im erfindungsgemäßen Verfahren verwandt: Aspergillus awamori, Aspergillus candidus, Aspergillus ficuum, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Beauveria bassiana, Beauveria brongniartii, Beauveria densa, Beauveria nivea, Mucor miehei, Mucor rouxii, Mucor sp., Neurospora crassa, Penicillinum chrysogenum, Penicillinum notatum, Rhizoctonia repens oder Rhizoctonia solani.

Auch Pflanzen wie Arabidopsis thaliana oder Lavendula vera sind geeignet. Besonders bevorzugt werden pflanzliche Zellkulturen, Protoplasten aus Pflanzen oder Kaluskulturen.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird eine chemische Verbindung wie oben beschrieben in Gegenwart einer Halogenase zur entsprechenden halogenierten Verbindung umgesetzt.

Die Halogenase wird dabei (a) von der in SEQ ID NO: 1 genannten Sequenz oder einer aufgrund des degenerierten genetischen Codes davon abgeleiteten Sequenz codiert oder (b) von einer Nuklein säuresequenz, die für ein funktionelles Fragment von [a] oder (c) einer mit [a] oder [b] unter Standardbedingungen hybridisierenden Sequenz codiert oder (d) von einer Sequenz, die mit der unter [a] genannten Sequenz eine über 30%ige Identität oder über 60%ige Ähnlichkeit aufweist.

Diese unter (a) bis (d) genannten Sequenzen lassen sich prinzipiell über alle dem Fachmann bekannten Methoden in die verwendeten Organismen einführen, vorteilhaft werden sie über Transformation, Transfektion, Elektroporation, mit der sog. Partikelgun oder über Mikroinjektion in die Organismen bzw. deren Zellen eingebracht. Für Mikroorganismen kann der Fachmann entsprechende Methoden den Lehrbüchern von Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, von F. M. Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, von D. M. Glover et al., DNA Cloning Vol. 1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), von Kaiser et al. (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory Press oder Guthrie et al. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press entnehmen.

Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird ebenfalls als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, die Verwendung einer Genkanone, die Elektro poration, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium ver mittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agro bacteriurn tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Die Trans formation von Pflanzen mit Agrobacterium tumefaciens wird bei spielsweise von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 beschrieben.

Die genetisch veränderten Pflanzenzellen können über alle dem Fachmann bekannten Methoden regeneriert werden. Entsprechende Methoden können den oben genannten Schriften von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer entnommen werden.

Die in die Organismen eingebrachte Nukleinsäure kann dabei in den Organismen als extrachromosomales Element oder integriert in das Genom vorliegen.

Die Integration in das Genom kann beispielsweise über heterologe oder homologe Rekombination erfolgen.

Vorteilhafterweise werden die Nukleinsäuren zusammen mit einem mindestens einem Reportergen in ein DNA-Konstrukt kloniert, das in die Organismen eingebracht wird. Dieses Reportergen sollte eine leichte Detektierbarkeit über einen Wachstums-, Fluoreszenz-, Chemo- oder Biolumineszenzassay oder über eine photometrische Messung ermöglichen. Beispielhaft seien als Reportergene Hydrolasegene, Fluoreszenzproteingene, Biolumin eszenzgene, Glucosidasegene, Peroxidasegen oder Gene wie das Luciferasegen, β-Galactosidasegen, gfp-Gen, Lipasegen, Esterasegen, Peroxidasegen, β-Lactamasegen, Acetyl-, Phospo- oder Adenyltransferasegen genannt. Diese Gene ermöglichen eine leichte Meßbarkeit und Quantifizierbarkeit der Transcriptions aktivität und damit der Expression der Gene.

Anstelle der Reportergene oder des Reportergens kann aber auch vorteilhaft ein Antibiotika- oder sonstiges Resistenzgen oder ein Biosynthesegen verwendet werden.

In Pelzer et al. wird ein spezielles Genklonierungssystem für den Glycopeptidantibiotika-Produzenten Amycolatopsis mediterranei beschrieben, speziell für den Stamm DSM5908.

Pelzer et al. beschreibt ein modifiziertes direktes Trans formationsverfahren zum Einbringen von DNA. Die Effizienz der DNA-Aufnahme hängt vom Alter der Kultur ab. Die besten Ergebnisse lassen sich mit Myzel aus der frühen stationären Phase (52 bis 55 Stunden) erzielen. Auf die Arbeit von Pelzer et al. (J. Bio technol. 56 [1997], 115-128) wird an dieser Stelle ausdrücklich bezug genommen.

Als weitere vorteilhafte Methoden zum Einbringen von Nuklein säuren in beispielsweise Actinomyceten wie Streptomyceten seien beispielhaft die Konjugation (Muth, G., Brolle, D. F., Wohlleben, W., 1999, Genetics of Streptomyces genannt. In "Mannual of Industrial Microbiology and Biotechnology", Eds. Demain, A. L. and Davies, J. E., ASM Press, Washington, D. C.), und die PEG-induzierte Protoplastentransformation (Hopwood, D. A. et al., 1985, Genetic manipulation of Streptomyces; a laboratory manual, The John Innes Foundation, Norwich, U. K. und W. Wohlleben und G. Muth, 1993, Streptomyces plasmid vectors, p. 147-175, In K. G. Harley, ed., Plasmids: A practical approach, Oxford University Press, Oxford und Muth, G., Brolle, D. F., Wohlleben, W., 1999, s.o.) genannt. Beide Methoden können, wie dem Fachmann bekannt ist, leicht auf andere Actinomycetales-Stämme übertragen werden.

Vorteilhaft wird zur Umgehung des bei Actinomyceten häufig vor handenen starken Restriktionssystems die zu transformierende Nukleinsäure vor der eigentlichen Transformation durch Hitze denaturierung in Anwesenheit oder Abwesenheit des Phagen f1-origins (Hillemann et al., 1991, Nucleic Acids Res. 194, 727-731) oder durch alkalische Denaturierung/Renaturierung (Oh und Chater, 1997, J. Bacteriol., 179, 122-127) in Einzel strang-DNA überführt.

Zur Umgehung der Restriktion durch den Wirtsorganismus kann die DNA gerade bei Actinomyceten vorteilhaft durch interspezifische Konjugation von beispielsweise Escherichia coli auf Actinomyceten übertragen werden. Auch seltene Actinomyceten-Stämme sind so zugänglich (Baltz, R. H., 1998, Trends in Microbiology, 6, 76, 83, Flett et al., 1997, FEMS Microbiol. Lett., 155, 223-229). Auch mit Hilfe der Elektroporation können Nukleinsäuren vorteilhaft in Actinomyceten-Stämme eingebracht werden (Muth, G., Brolle, D. F., Wohlleben, W., 1999, s. o.; English et al., 1998, J. Ind. Micro biology and Biotechnology, 21, 219-224; Lal, R. et al., 1991, Appl. Environ. Microbiol. 57, 665-671). Weiterhin sei als vor teilhafte Variante der Elektroporation auch die Electroduction erwähnt. Sie ermöglicht einen schnellen direkten DNA-Transfer von E. coli nach Actinomyceten durch Elektroporation mit Hilfe von Shuttle-Vektoren (Muth, G., Brolle, D. F., Wohlleben, W., 1999).

Neben einzelnen Zellen kann auch Myzel bei Amycolatopsis und Nocardia unter Zugabe von CsCl₂, Kalbsthymus-DNA und PEG vorteil haft transformiert werden (Pelzer et al., 1997; J. und R. Hütter, 1991, J. Bacteriol., 173, 6325-6331, Vrijbloed, J. W. et al., 1995, Plasmid 34, 96-104; Kumar, C. V. et al., 1995, Appl. Environ. Microbiol. 60, 4086-4093).

Unter einer Nukleinsäuresequenz, die für ein funktionelles Frag ment von (a) codieren, sind Sequenzen zu verstehen, die gegenüber (a) verkürzt sind, aber noch die enzymatische Aktivität aufwei sen. Diese Sequenzen können am 3'- oder 5'-Ende der Sequenz ver kürzt worden sein. Es ist auch möglich, daß Teile innerhalb der codierenden Sequenz im Leseraster entfernt wurden, ohne daß die enzymatische Aktivität verloten gegangen ist.

In der Regel sind die funktionellen Fragmente gegen der Sequenz (a) um 5 bis 30% verkürzt, bevorzugt um 10 bis 20%. Theoretisch sind auch gegenüber der Sequenz (a) verlängerte Sequenzen denk bar.

Unter Sequenzen, die unter Standardbedingungen mit den unter (a) und (b) genannten Sequenzen hybridisieren, sind Sequenzen zu ver stehen, die beispielsweise bei Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5xSSC (1xSSC 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat; pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid wie beispielsweise 42°C in 5xSSC und 50% Formamid hybridisieren.

Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind einschlägigen Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 zu entnehmen.

Zur Hybridisierung werden vorteilhaft kurze spezifische Oligo nukleotide mit einer Länge von mindestens 20 bis 25 Nukleotiden verwendet. Bevorzugt werden Oligonukleotide von mindestens 25 Nukleotiden verwendet. Aber auch längere Oligonukleotide 50 bis 200 Nukleotide oder noch längere Teile bis zur gesamten Nukleinsäuresequenz [siehe (a) und (b)] können vorteilhaft ver wendet werden.

Unter Nukleinsäuren sind im erfindungsgemäßen Verfahren bei spielsweise DNA, cDNA, RNA oder mRNA zu verstehen. Weiterhin sind darunter auch die Homologen dieser Nukleinsäuresequenzen zu verstehen.

Unter Homologen sind beispielsweise die eukaryontischen oder prokaryontischen Homologen, verkürzte Sequenzen oder Einzel strang-DNA zu verstehen. Diese können zur codierenden oder nicht codierenden Sequenz homolog sein.

Für das erfindungsgemäße Verfahren können auch vorteilhaft Halogenasen verwendet werden, die von einer Sequenz codiert werden, die zu der in SEQ ID NO: 1 genannten Sequenz eine über 30%ige, bevorzugt 50%ige, besonders bevorzugt 60%ige, ganz besonders bevorzugt über eine 95%ige Identität oder über eine 60%ige, bevorzugt 70%ige, besonders bevorzugt 80%ige, ganz besonders bevorzugt 97%ige Ähnlichkeit über die gesamte Länge auf der von der Sequenz abgeleiteten Aminosäureebene aufweisen (Blast-Programm, W. Gish und D. J. States, Nat. Genet., 3, 1993: 266-272).

Diese Sequenzen sind vorteilhaft aus SEQ ID NO: 1 über Deletion, Insertion und/oder Substitution von Nukleotiden erhältlich, wobei auch hier wie in allen anderen Fällen die enzymatische Aktivität aus den Sequenzen abgeleiteten Halogenaseproteinen erhalten bleibt.

Vorteilhaft werden im erfindungsgemäßen Verfahren chemische Verbindungen der folgenden allgemeinen Struktur I mit der oben genannten Halogenase umgesetzt:

wobei die Variablen und Substituenten in Formel I folgende Bedeutung haben:
R¹ = Wasserstoff, Hydroxy-, substituiertes oder unsubsti tuiertes, verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₁₀-Alkyl-, C₂-C₁₀-Alkenyl-, C₁-C₁₀-AlkoXy-, C₂-C₁₀-Alkenyloxy-, R⁶R⁷N-,

R² = Wasserstoff, Hydroxy-, substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₁₀-Alkyl, C₁-C₁₀-Alkoxy-, C₂-C₁₀-Alkenyl-, C₂-C₁₀-Alkenyloxy-, R⁶R⁷N-;
R³ = Wasserstoff, Hydroxy-, substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₁₀-Alkyl-, C₁-C₁₀-Alkoxy-, C₂-C₁₀-Alkenyl-, C₂-C₁₀-Alkenyloxy-, C₁-C₁₀-Alkylcarbonyl-, C₂-C₁₀-Alkenylcarbonyl-, Aryl-, Hetaryl-,

R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander Wasserstoff, Hydroxy-, Halogen-, Nitro-, Cyano-, substituiertes oder unsubstituiertes, ver zweigtes oder unveräweigtes C₁-C₁₀-Alkyl-, C₁-C₁₀-Alkoxy-, C₂-C₁₀-Alkenyl-, C₂-C₁₀-Alkenyloxy-, substituiertes oder un substituiertes C₃-C₁₀-Cycloalkyl-, Aryl-, Hetaryl-, R⁶R⁷N- und wobei zwei Reste R⁴ und R⁵ an benachbarten Kohlenstoffatomen zusammen einen weiteren substituierten oder unsubstituierten aromatischen, gesättigten oder teilweise gesättigten Ring mit 5 bis 6 Atomen im Ring bilden können, der ein oder mehrere Heteroatome wie O, N oder S enthalten kann;
R⁶ und R⁷ unabhängig voneinander Wasserstoff oder substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₁₀-Alkyl-;
R⁸ = substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unver zweigtes C₁-C₁₀-Alkyl-, C₂-C₁₀-Alkenyl-, substituiertes oder unsubstituiertes Aryl-;
R⁹ = substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unver zweigtes C₁-C₁₀-Alkyl-, C₂-C₁₀-Alkenyl-, substituiertes oder unsubstituiertes Aryl-, Hetaryl-;
X = -CH- oder N;
Y = 0 oder N;
m = 0 oder 1;
n = 0, 1, 2 oder 3;
p = 0 oder 1.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I werden in Gegenwart der Halogenase zu den halogenierten Verbindungen der folgenden allgemeinen Formel II umgesetzt:

wobei die Variablen und Substituenten in Formel II die unter Formel I genannte Bedeutung haben und Hal Chlor, Fluor, Brom oder Iod, bevorzugt Chlor oder Brom, bedeutet.

In der Regel sind für die Reaktion genügend Halogenatome in der Reaktionslösung vorhanden. Vorteilhaft wird jedoch ein Halogen donor zur Reaktionslösung gegeben.

Als Halogendonor können prinzipiell alle Halogen-haltigen organischen oder anorganischen Verbindungen dienen. Der Ein fachheit halber und aus Kostengründen werden anorganische Ver bindungen bevorzugt. Vorteilhafterweise werden Halogene in Form ihrer Salze der Reaktionslösung zugegeben. Beispielhaft seien die Alkali- und/oder Erdalkalisalze der Halogene genannt.

R¹ bezeichnet in den Verbindungen der Formel (= Struktur) I und II wasserstoff, Hydroxy-, substituiertes oder un substituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₁₀-Alkyl-, C₂-C₁₀-Alkenyl-, C₁-C₁₀-Alkoxy-, C₂-C₁₀-Alkenyloxy-, R⁶R⁷N-,

Als Alkylreste seien substituierte oder unsubstituierte ver zweigte oder unverzweigte C₁-C₁₀-Alkylketten wie beispielsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, 1-Methylethyl, n-Butyl, 1-Methylpropyl-, 2-Methylpropyl, 1,1-Dimethylethyl, n-Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3-Methylbutyl, 2,2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, n-Hexyl, 1,1-Dimethylpropyl, 1,2-Dimethylpropyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl, 1,1-Dimethyl butyl, 1,2-Dimethylbutyl, 1,3-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 2,3-Dimethylbutyl, 3,3-Dimethylbutyl, 1-Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1,1,2-Trimethylpropyl, 1,2,2-Trimethylpropyl, 1-Ethyl-1-methyl propyl, 1-Ethyl-2-methylpropyl, n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl oder n-Decyl genannt. Bevorzugt sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, n-Butyl, i-Propyl oder i-Butyl. Besonders bevorzugt sind Methyl und Ethyl.

Als Alkenylreste seien substituierte oder unsubstituierte, ver zweigte oder unverzweigte C₂-C₁₀-Alkenylketten, wie beispielsweise Ethenyl, Propenyl, 1-Butenyl, 2-Butenyl, 3-Butenyl, 2-Methyl propenyl, 1-Pentenyl, 2-Pentenyl, 3-Pentenyl, 4-Pentenyl, 1-Methyl-1-butenyl, 2-Methyl-1-butenyl, 3-Methyl-1-butenyl, 1-Methyl-2-butenyl, 2-Methyl-2-butenyl, 3-Methyl-2-butenyl, 1-Methyl-3-butenyl, 2-Methyl-3-butenyl, 3-Methyl-3-butenyl, 1,1-Dimethyl-2-propenyl, 1, 2-Dimethyl-1-propenyl, 1,2-Dimethyl- 2-propenyl, 1-Ethyl-1-propenyl, 1-Ethyl-2-propenyl, 1-Hexenyl, 2-Hexenyl, 3-Hexenyl, 4-Hexenyl, 5-Hexenyl, 1-Methyl-1-pentenyl, 2-Methyl-1-pentenyl, 3-Methyl-1-pentenyl, 4-Methyl-1-pentenyl, 1-Methyl-2-pentenyl, 2-Methyl-2-pentenyl, 3-Methyl-2-pentenyl, 4-Methyl-2-pentenyl, 1-Methyl-3-pentenyl, 2-Methyl-3-pentenyl, 3-Methyl-3-pentenyl, 4-Methyl-3-pentenyl, 1-Methyl-4-pentenyl, 2-Methyl-4-pentenyl, 3-Methyl-4-pentenyl, 4-Methyl-4-pentenyl, 1,1-Dimethyl-2-butenyl, 1,1-Dimethyl-3-butenyl, 1,2-Dimethyl- 1-butenyl, 1,2-Dimethyl-2-butenyl; 1,2-Dimethyl-3-butenyl, 1,3-Dimethyl-1-butenyl, 1,3-Dimethyl-2-butenyl, 1,3-Dimethyl- 3-butenyl, 2, 2-Dimethyl-3-butenyl, 2, 3-Dimethyl-1-butenyl, 2,3-Dimethyl-2-butenyl, 2,3-Dimethyl-3-butenyl, 3,3-Dimethyl- 1-butenyl, 3,3-Dimethyl-2-butenyl, 1-Ethyl-1-butenyl, 1-Ethyl-2- butenyl, 1-Ethyl-3-butenyl, 2-Ethyl-1-butenyl, 2-Ethyl-2-butenyl, 2-Ethyl-3-butenyl, 1,1,2-Trimethyl-2-propenyl, 1-Ethyl-1-methyl- 2-propenyl, 1-Ethyl-2-methyl-1-propenyl, 1-Ethyl-2-methyl-2- propenyl, 1-Heptenyl, 2-Heptenyl, 3-Heptenyl, 4-Heptenyl, 5-Heptenyl, 6-Heptenyl, 1-Octenyl, 2-Octenyl, 3-Octenyl, 4-Octenyl, 5-Octenyl, 6-Octenyl, 7-Octenyl, 1-Nonenyl, 2-Nonenyl, 3-Nonenyl, 4-Nonenyl, 5-Nonenyl, 6-Nonenyl, 7-Nonenyl, 8-Nonenyl, 1-Decenyl, 2-Decenyl, 3-Decenyl, 4-Decenyl, 5-Decenyl, 6-Decenyl, 7-Decenyl, 8-Decenyl oder 9-Decenyl, und deren verzweigtkettige Homologen genannt.

Als Alkoxyreste seien substituierte oder unsubstituierte, ver zweigte oder unverzweigte C₁-C₁₀-Alkoxyketten wie beispielsweise Methoxy, Ethoxy, Propoxy, 1-Methylethoxy, Butoxy, 1-Methyl propoxy, 2-Methylpropoxy, 1,1-Dimethylethoxy, Pentoxy, 1-Methyl butoxy, 2-Methylbutoxy, 3-Methylbutoxy, 1,1-Dimethylpropoxy, 1,2-Dimethylpropoxy, 2,2-Dimethylpropoxy, 1-Ethylpropoxy, Hexoxy, 1-Methylpentoxy, 2-Methylpentoxy, 3-Methylpentoxy, 4-Methylpent oxy, 1,1-Dimethylbutoxy, 1,2-Dimethylbutoxy, 1,3-Dimethylbutoxy, 2,2-Dimethylbutoxy, 2,3-Dimethylbutoxy, 3,3-Dimethylbutoxy, 1-Ethylbutoxy, 2-Ethylbutoxy, 1,1,2-Trimethylpropoxy, 1,2,2-Tri methylpropoxy, 1-Ethyl-1-methylpropoxy, 1-Ethyl-2-methylpropoxy, Hexyloxy, Heptyloxy, Octyloxy, Nonyloxy oder Decyloxy und deren verzweigtkettige Homologen genannt.

Als Alkenyloxyreste seien substituierte oder unsubstituierte, verzweigte oder unverzweigte C₂-C₁₀-Alkenyloxyketten, wie beispielsweise Ethenyloxy, Propenyloxy, 1-Butenyloxy, 2-Butenyloxy, 3-Butenyloxy, 2-Methylpropenyloxy, 1-Pentenyloxy, 2-Pentenyloxy, 3-Pentenyloxy, 4-Pentenyloxy, 1-Methyl-1- butenyloxy, 2-Methyl-1-butenyloxy, 3-Methyl-1-butenyloxy, 1-Methyl-2-butenyloxy, 2-Methyl-2-butenyloxy, 3-Methyl-2- butenyloxy, 1-Methyl-3-butenyloxy, 2-Methyl-3-butenyloxy, 3-Methyl-3-butenyloxy, 1,1-Dimethyl-2-propenyloxy, 1,2-Dimethyl- 1-propenyloxy, 1,2-Dimethyl-2-propenyloxy, 1-Ethyl-1-propenyloxy, 1-Ethyl-2-propenyloxy, 1-Hexenyloxy, 2-Hexenyloxy, 3-Hexenyloxy, 4-Hexenyloxy, 5-Hexenyloxy, 1-Methyl-1-pentenyloxy, 2-Methyl-1- pentenyloxy, 3-Methyl-1-pentenyloxy, 4-Methyl-1-pentenyloxy, 1-Methyl-2-pentenyloxy, 2-Methyl-2-pentenyloxy, 3-Methyl-2- pentenyloxy, 4-Methyl-2-pentenyloxy, 1-Methyl-3-pentenyloxy, 2-Methyl-3-pentenyloxy, 3-Methyl-3-pentenyloxy, 4-Methyl-3- pentenyloxy, 1-Methyl-4-pentenyloxy, 2-Methyl-4-pentenyloxy, 3-Methyl-4-pentenyloxy, 4-Methyl-4-pentenyloxy, 1, 1-Dimethyl- 2-butenyloxy, 1,1-Dimethyl-3-butenyloxy, 1,2-Dimethyl-1-butenyl oxy, 1,2-Dimethyl-2-butenyloxy, 1,2-Dimethyl-3-butenyloxy, 1,3-Di-methyl-1-butenyloxy, 1,3-Dimethyl-2-butenyloxy, 1,3-Di methyl-3-butenyloxy, 2,2-Dimethyl-3-butenyoxyl, 2,3-Dimethyl- 1-butenyloxy, 2,3-Dimethyl-2-butenyloxy, 2,3-Dimethyl-3-butenyl oxy, 3,3-Dimethyl-1-butenyloxy, 3,3-Dimethyl-2-butenyloxy, 1-Ethyl-1-butenyloxy, 1-Ethyl-2-butenyloxy, 1-Ethyl-3-butenyloxy, 2-Ethyl-1-butenyloxy, 2-Ethyl-2-butenyloxy, 2-Ethyl-3-butenyloxy, 1,1,2-Trimethyl-2-propenyloxy, 1-Ethyl-1-methyl-2-propenyloxy, 1-Ethyl-2-methyl-1-propenyloxy, 1-Ethyl-2-methyl-2-propenyloxy, 1-Heptenyloxy, 2-Heptenyloxy, 3-Heptenyloxy, 4-Heptenyloxy, 5-Heptenyloxy, 6-Heptenyloxy, 1-Octenyloxy, 2-Octenyloxy, 3-Octenyloxy, 4-Octenyloxy, 5-Octenyloxy, 6-Octenyloxy, 7-Octenyloxy, 1-Nonenyloxy, 2-Nonenyloxy, 3-Nonenyloxy, 4-Nonenyloxy, 5-Nonenyloxy, 6-Nonenyloxy, 7-Nonenyloxy, 8-Nonenyloxy, 1-Decenyloxy, 2-Decenyloxy, 3-Decenyloxy, 4-Decenyloxy, 5-Decenyloxy, 6-Decenyloxy, 7-Decenyloxy, 8-Decenyloxy oder 9-Decenyloxy, und deren verzweigtkettige Homologen genannt.

Als Substituenten der genannten Reste von R¹ kommen prinzipiell alle denkbaren Substituenten in Frage, die die Halogenasereaktion nicht behindern, beispielsweise ein oder mehrere Substituenten wie Halogen, wie Fluor, Chlor oder Brom, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Alkoxy, Benzyloxy, Phenyl oder Benzyl.

R² bezeichnet in den Verbindungen der Formel I und II Wasser stoff, Hydroxy-, substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₁₀-Alkyl, C₁-C₁₀-Alkoxy-, C₂-C₁₀-Alkenyl-, C₂-C₁₀-Alkenyloxy-, R⁶R⁷N-;

Als Alkylreste seien substituierte oder unsubstituierte ver zweigte oder unverzweigte C₁-C₁₀-Alkylketten wie beispielsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, 1-Methylethyl, n-Butyl, 1-Methylpropyl-, 2-Methylpropyl, 1,1-Dimethylethyl, n-Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3-Methylbutyl, 2,2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, n-Hexyl, 1,1-Dimethylpropyl, 1,2-Dimethylpropyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl, 1,1-Dimethyl butyl, 1,2-Dimethylbutyl, 1,3-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 2,3-Dimethylbutyl, 3,3-Dimethylbutyl, 1-Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1,1,2-Trimethylpropyl, 1,2,2-Trimethylpropyl, 1-Ethyl-i-methyl propyl, 1-Ethyl-2-methylpropyl, n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl oder n-Decyl genannt. Bevorzugt sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, n-Butyl, i-Propyl oder i-Butyl.

Als Alkenylreste seien substituierte oder unsubstituierte, ver zweigte oder unverzweigte C₂-C₁₀-Alkenylketten, wie beispielsweise Ethenyl, Propenyl, 1-Butenyl, 2-Butenyl, 3-Butenyl, 2-Methyl propenyl, 1-Pentenyl, 2-Pentenyl, 3-Pentenyl, 4-Pentenyl, 1-Methyl-1-butenyl, 2-Methyl-1-butenyl, 3-Methyl-1-butenyl, 1-Methyl-2-butenyl, 2-Methyl-2-butenyl, 3-Methyl-2-butenyl, 1-Methyl-3-butenyl, 2-Methyl-3-butenyl, 3-Methyl-3-butenyl, 1,1-Dimethyl-2-propenyl, 1,2-Dimethyl-1-propenyl, 1,2-Dimethyl- 2-propenyl, 1-Ethyl-1-propenyl, 1-Ethyl-2-propenyl, 1-Hexenyl, 2-Hexenyl, 3-Hexenyl, 4-Hexenyl, 5-Hexenyl, 1-Methyl-1-pentenyl, 2-Methyl-1-pentenyl, 3-Methyl-1-pentenyl, 4-Methyl-1-pentenyl, 1-Methyl-2-pentenyl, 2-Methyl-2-pentenyl, 3-Methyl-2-pentenyl, 4-Methyl-2-pentenyl, 1-Methyl-3-pentenyl, 2-Methyl-3-pentenyl, 3-Methyl-3-pentenyl, 4-Methyl-3-pentenyl, 1-Methyl-4-pentenyl, 2-Methyl-4-pentenyl, 3-Methyl-4-pentenyl, 4-Methyl-4-pentenyl, 1,1-Dimethyl-2-butenyl, 1,1-Dimethyl-3-butenyl, 1,2-Dimethyl- 1-butenyl, 1,2-Dimethyl-2-butenyl, 1,2-Dimethyl-3-butenyl, 1,3-Dimethyl-1-butenyl, 1,3-Dimethyl-2-butenyl, 1,3-Dimethyl- 3-butenyl, 2,2-Dimethyl-3-butenyl, 2,3-Dimethyl-1-butenyl, 2,3-Dimethyl-2-butenyl, 2,3-Dimethyl-3-butenyl, 3,3-Dimethyl- 1-butenyl, 3,3-Dimethyl-2-butenyl, 1-Ethyl-1-butenyl, 1-Ethyl-2- butenyl, 1-Ethyl-3-butenyl, 2-Ethyl-1-butenyl, 2-Ethyl-2-butenyl, 2-Ethyl-3-butenyl, 1,1,2-Trimethyl-2-propenyl, 1-Ethyl-1-methyl- 2-propenyl, 1-Ethyl-2-methyl-1-propenyl, 1-Ethyl-2-methyl-2- propenyl, 1-Heptenyl, 2-Heptenyl, 3-Heptenyl, 4-Heptenyl, 5-Heptenyl, 6-Heptenyl, 1-Octenyl, 2-Octenyl, 3-Octenyl, 4-Octenyl, 5-Octenyl, 6-Octenyl, 7-Octenyl, 1-Nonenyl, 2-Nonenyl, 3-Nonenyl, 4-Nonenyl, 5-Nonenyl, 6-Nonenyl, 7-Nonenyl, 8-Nonenyl, 1-Decenyl, 2-Decenyl, 3-Decenyl, 4-Decenyl, 5-Decenyl, 6-Decenyl, 7-Decenyl, 8-Decenyl oder 9-Decenyl, und deren verzweigtkettige Homologen genannt.

Als Alkenyloxyreste seien substituierte oder unsubstituierte, verzweigte oder unverzweigte C₂-C₁₀-Alkenyloxyketten, wie beispielsweise Ethenyloxy, Propenyloxy, 1-Butenyloxy, 2-Butenyloxy, 3-Butenyloxy, 2-Methylpropenyloxy, 1-Pentenyloxy, 2-Pentenyloxy, 3-Pentenyloxy, 4-Pentenyloxy, 1-Methyl-1- butenyloxy, 2-Methyl-1-butenyloxy, 3-Methyl-1-butenyloxy, 1-Methyl-2-butenyloxy, 2-Methyl-2-butenyloxy, 3-Methyl-2- butenyloxy, 1-Methyl-3-butenyloxy, 2-Methyl-3-butenyloxy, 3-Methyl-3-butenyloxy, 1,1-Dimethyl-2-propenyloxy, 1,2-Dimethyl- 1-propenyloxy, 1,2-Dimethyl-2-propenyloxy, 1-Ethyl-1-propenyloxy, 1-Ethyl-2-propenyloxy, 1-Hexenyloxy, 2-Hexenyloxy, 3-Hexenyloxy, 4-Hexenyloxy, 5-Hexenyloxy, 1-Methyl-1-pentenyloxy, 2-Methyl-1- pentenyloxy, 3-Methyl-1-pentenyloxy, 4-Methyl-1-pentenyloxy, 1-Methyl-2-pentenyloxy, 2-Methyl-2-pentenyloxy, 3-Methyl-2- pentenyloxy, 4-Methyl-2-pentenyloxy, 1-Methyl-3-pentenyloxy, 2-Methyl-3-pentenyloxy, 3-Methyl-3-pentenyloxy, 4-Methyl-3- pentenyloxy, 1-Methyl-4-pentenyloxy, 2-Methyl-4-pentenyloxy, 3-Methyl-4-pentenyloxy, 4-Methyl-4-pentenyloxy, 1,1-Dimethyl- 2-butenyloxy, 1,1-Dimethyl-3-butenyloxy, 1,2-Dimethyl-1-butenyl oxy, 1,2-Dimethyl-2-butenyloxy, 1,2-Dimethyl-3-butenyloxy, 1,3-Di-methyl-1-butenyloxy, 1,3-Dimethyl-2-butenyloxy, 1,3-Di methyl-3-butenyloxy, 2,2-Dimethyl-3-butenyoxyl, 2,3-Dimethyl- 1-butenyloxy, 2,3-Dimethyl-2-butenyloxy, 2,3-Dimethyl-3-butenyl oxy, 3,3-Dimethyl-1-butenyloxy, 3,3-Dimethyl-2-butenyloxy, 1-Ethyl-1-butenyloxy, 1-Ethyl-2-butenyloxy, 1-Ethyl-3-butenyloxy, 2-Ethyl-1-butenyloxy, 2-Ethyl-2-butenyloxy, 2-Ethyl-3-butenyloxy, 1,1,2-Trimethyl-2-propenyloxy, 1-Ethyl-1-methyl-2-propenyloxy, 1-Ethyl-2-methyl-1-propenyloxy, 1-Ethyl-2-methyl-2-propenyloxy, 1-Heptenyloxy, 2-Heptenyloxy, 3-Heptenyloxy, 4-Heptenyloxy, 5-Heptenyloxy, 6-Heptenyloxy, 1-Octenyloxy, 2-Octenyloxy, 3-Octenyloxy, 4-Octenyloxy, 5-Octenyloxy, 6-Octenyloxy, 7-Octenyloxy, 1-Nonenyloxy, 2-Nonenyloxy, 3-Nonenyloxy, 4-Nonenyloxy, 5-Nonenyloxy, 6-Nonenyloxy, 7 -Nonenyloxy, 8-Nonenyloxy, 1-Decenyloxy, 2-Decenyloxy, 3-Decenyloxy. 4-Decenyloxy, 5-Decenyloxy, 6-Decenyloxy, 7-Decenyloxy, 8-Decenyloxy oder 9-Decenyloxy, und deren verzweigtkettige Homologen genannt.

Als Substituenten der genannten Reste von R² kommen prinzipiell alle denkbaren Substituenten in Frage, die die Halogenasereaktion nicht behindern, beispielsweise ein oder mehrere Substituenten wie Halogen, wie Fluor, Chlor oder Brom, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Alkoxy, Benzyloxy, Phenyl oder Benzyl.

R³ bezeichnet in den Verbindungen der Formel I und II Wasser stoff, Hydroxy-, substituiertes oder unsubstituiertes, ver zweigtes oder unverzweigtes C₁-C₁₀-Alkyl-, C₁-C₁₀-Alkoxy-, C₂-C₁₀-Alkenyl-, C₂-C₁₀-Alkenyloxy-, C₁-C₁₀-Alkylcarbonyl-, C₂-C₁₀-Alkenylcarbonyl-, Aryl-, Hetaryl-,

Als Alkylreste seien substituierte oder unsubstituierte ver zweigte oder unverzweigte C₁-C₁₀-Alkylketten wie beispielsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, 1-Methylethyl, n-Butyl, 1-Methylpropyl-, 2-Methylpropyl, 1,1-Dimethylethyl, n-Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3-Methylbutyl, 2,2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, n-Hexyl, 1,1-Dimethylpropyl, 1,2-Dimethylpropyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl, 1,1-Dimethyl butyl, 1,2-Dimethylbutyl, 1,3-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 2,3-Dimethylbutyl, 3,3-Dimethylbutyl, 1-Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1,1,2-Trimethylpropyl, 1,2,2-Trimethylpropyl, 1-Ethyl-1-methyl propyl, 1-Ethyl-2-methylpropyl, n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl oder n-Decyl genannt. Bevorzugt sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, n-Butyl, i-Propyl oder i-Butyl.

Als Alkenyloxyreste seien substituierte oder unsubstituierte, verzweigte oder unverzweigte C₂-C₁₀-Alkenyloxyketten, wie beispielsweise Ethenyloxy, Propenyloxy, 1-Butenyloxy, 2-Butenyloxy, 3-Butenyloxy, 2-Methylpropenyloxy, 1-Pentenyloxy, 2-Pentenyloxy, 3-Pentenyloxy, 4-Pentenyloxy, 1-Methyl-1- butenyloxy, 2-Methyl-1-butenyloxy, 3-Methyl-1-butenyloxy, 1-Methyl-2-butenyloxy, 2-Methyl-2-butenyloxy, 3-Methyl-2- butenyloxy, 1-Methyl-3-butenyloxy, 2-Methyl-3-butenyloxy, 3-Methyl-3-butenyloxy, 1,1-Dimethyl-2-propenyloxy, 1,2-Dimethyl- 1-propenyloxy, 1,2-Dimethyl-2-propenyloxy, 1-Ethyl-1-propenyloxy, 1-Ethyl-2-propenyloxy, 1-Hexenyloxy, 2-Hexenyloxy, 3-Hexenyloxy, 4-Hexenyloxy, 5-Hexenyloxy, 1-Methyl-1-pentenyloxy, 2-Methyl-1- pentenyloxy, 3-Methyl-1-pentenyloxy, 4-Methyl-1-pentenyloxy, 1-Methyl-2-pentenyloxy, 2-Methyl-2-pentenyloxy, 3-Methyl-2- pentenyloxy, 4-Methyl-2-pentenyloxy, 1-Methyl-3-pentenyloxy, 2-Methyl-3-pentenyloxy, 3-Methyl-3-pentenyloxy, 4-Methyl-3- pentenyloxy, 1-Methyl-4-pentenyloxy, 2-Methyl-4-pentenyloxy, 3-Methyl-4-pentenyloxy, 4-Methyl-4-pentenyloxy, 1,1-Dimethyl- 2-butenyloxy, 1,1-Dimethyl-3-butenyloxy, 1,2-Dimethyl-1-butenyl oxy, 1,2-Dimethyl-2-butenyloxy, 1,2-Dimethyl-3-butenyloxy, 1,3-Di-methyl-1-butenyloxy, 1,3-Dimethyl-2-butenyloxy, 1,3-Di methyl-3-butenyloxy, 2,2-Dimethyl-3-butenyoxyl, 2,3-Dimethyl- 1-butenyloxy, 2,3-Dimethyl-2-butenyloxy, 2,3-Dimethyl-3-butenyl oxy, 3,3-Dimethyl-1-butenyloxy, 3,3-Dimethyl-2-butenyloxy, 1-Ethyl-1-butenyloxy, 1-Ethyl-2-butenyloxy, 1-Ethyl-3-butenyloxy, 2-Ethyl-1-butenyloxy, 2-Ethyl-2-butenyloxy, 2-Ethyl-3-butenyloxy, 1,1,2-Trimethyl-2-propenyloxy, 1-Ethyl-1-methyl-2-propenyloxy, 1-Ethyl-2-methyl-1-propenyloxy, 1-Ethyl-2-methyl-2-propenyloxy, 1-Heptenyloxy, 2-Heptenyloxy, 3-Heptenyloxy, 4-Heptenyloxy, 5-Heptenyloxy, 6-Heptenyloxy, 1-Octenyloxy, 2-Octenyloxy, 3-Octenyloxy, 4-Octenyloxy, 5-Octenyloxy, 6-Octenyloxy, 7-Octenyloxy, 1-Nonenyloxy, 2-Nonenyloxy, 3-Nonenyloxy, 4-Nonenyloxy, 5-Nonenyloxy, 6-Nonenyloxy, 7-Nonenyloxy, 8-Nonenyloxy, 1-Decenyloxy, 2-Decenyloxy, 3-Decenyloxy, 4-Decenyloxy, 5-Decenyloxy, 6-Decenyloxy, 7-Decenyloxy, 8-Decenyloxy oder 9-Decenyloxy, und deren verzweigtkettige Homologen genannt.

Als Alkylcarbonylreste seien verzweigte oder unverzweigte C₁-C₁₀-Alkylketten, wie beispielsweise Methylcarbonyl, Ethyl carbonyl, n-Propylcarbonyl, 1-Methylethylcarbonyl, n-Butyl carbonyl, 1-Methylpropylcarbonyl, 2-Methylpropylcarbonyl, 1,1-Di methylethylcarbonyl, n-Pentylcarbonyl, 1-Methylbutylcarbonyl, 2-Methylbutylcarbonyl, 3-Methylbutylcarbonyl, 2,2-Dimethylpropyl carbonyl, 1-Ethylpropylcarbonyl, n-Hexylcarbonyl, 1,1-Dimethyl propylcarbonyl, 1,2-Dimethylpropylcarbonyl, 1-Methylpentyl carbonyl, 2-Methylpentylcarbonyl, 3-Methylpentylcarbonyl, 4-Methylpentylcarbonyl, 1,1-Dimethylbutylcarbonyl, 1,2-Dimethyl butylcarbonyl, 1,3-Dimethylbutylcarbonyl, 2,2-Dimethylbutyl carbonyl, 2,3-Dimethylbutylcarbonyl, 3,3-Dimethylbutylcarbonyl, 1-Ethylbutylcarbonyl, 2-Ethylbutylcarbonyl, 1,1,2-Trimethyl propylcarbonyl, 1,2,2-Trimethylpropylcarbonyl, 1-Ethyl-1-methyl propylcarbonyl, 1-Ethyl-2-methylpropylcarbonyl, n-Heptylcarbonyl, n-Octylcarbonyl, n-Nonylcarbonyl oder n-Decylcarbonyl genannt.

Als Alkenylcarbonylreste seien verzweigte oder unverzweigte C₂-C₁₀-Alkenylketten, wie beispielsweise Ethenylcarbonyl, Propenylcarbonyl, 1-Butenylcarbonyl, 2-Butenylcarbonyl, 3-Butenylcarbonyl, 2-Methylpropenylcarbonyl, 1-Pentenylcarbonyl, 2-Pentenylcarbonyl, 3-Pentenylcarbonyl, 4-Pentenylcarbonyl, 1-Methyl-1-butenylcarbonyl, 2-Methyl-1-butenylcarbonyl, 3-Methyl- 1-butenylcarbonyl, 1-Methyl-2-butenylcarbonyl, 2-Methyl-2- butenylcarbonyl, 3-Methyl-2-butenylcarbonyl, 1-Methyl-3-butenyl carbonyl, 2-Methyl-3-butenylcarbonyl, 3-Methyl-3-butenylcarbonyl, 1,1-Dimethyl-2-propenylcarbonyl, 1,2-Dimethyl-1-propenylcarbonyl, 1,2-Dimethyl-2-propenylcarbonyl, 1,2-Dimethyl-1-propenylcarbonyl, 1-Ethyl-2-propenylcarbonyl, 1-Hexenylcarbonyl, 2-Hexenylcarbonyl, 3-Hexenylcarbonyl, 4-Hexenylcarbonyl, 5-Hexenylcarbonyl, 1-Methyl-1-pentenylcarbonyl, 2-Methyl-1-pentenylcarbonyl, 3-Methyl-1-pentenylcarbonyl, 4-Methyl-1-pentenylcarbonyl, 1-Methyl-2-pentenylcarbonyl, 2-Methyl-2-pentenylcarbonyl, 3-Methyl-2-pentenylcarbonyl, 4-Methyl-2-pentenylcarbonyl, 1-Methyl-3-pentenylcarbonyl, 2-Methyl-3-pentenylcarbonyl, 3-Methyl-3-pentenylcarbonyl, 4-Methyl-3-pentenylcarbonyl, 1-Methyl-4-pentenylcarbonyl, 2-Methyl-4-pentenylcarbonyl, 3-Methyl-4-pentenylcarbönyl, 4-Methyl-4-pentenylcarbonyl, 1,1-Dimethyl-2-butenylcarbonyl, 1,1-Dimethyl-3-butenylcarbonyl, 1,2-Dimethyl-1-butenylcarbonyl, 1,2-Dimethyl-2-butenylcarbonyl, 1,2-Dimethyl-3-butenylcarbonyl, 1,3-Dimethyl-1-butenylcarbonyl, 1,3-Dimethyl-2-butenylcarbonyl, 1,3-Dimethyl-3-butenylcarbonyl, 2,2-Dimethyl-3-butenylcarbonyl, 2,3-Dimethyl-1-butenylcarbonyl, 2,3-Dimethyl-2-butenylcarbonyl, 2,3-Dimethyl-3-butenylcarbonyl, 3,3-Dimethyl-1-butenylcarbonyl, 3,3-Dimethyl-2-butenylcarbonyl, 1-Ethyl-1-butenylcarbonyl, 1-Ethyl-2-butenylcarbonyl, 1-Ethyl- 3-butenylcarbonyl, 2-Ethyl-1-butenylcarbonyl, 2-Ethyl-2-butenyl carbonyl, 2-Ethyl-3-butenylcarbonyl, 1,1,2-Trimethyl-2-propenyl carbonyl, 1-Ethyl-1-methyl-2-propenylcarbonyl, 1-Ethyl-2-methyl- 1-propenylcarbonyl, 1-Ethyl-2-methyl-2-propenylcarbonyl, 1-Heptenylcarbonyl, 2-Heptenylcarbonyl, 3-Heptenylcarbonyl, 4-Heptenylcarbonyl, 5-Heptenylcarbonyl, 6-Heptenylcarbonyl, 1-Octenylcarbonyl, 2-Octenylcarbonyl, 3-Octenylcarbonyl, 4-Octenylcarbonyl, 5-Octenylcarbonyl, 6-Octenylcarbonyl, 7-Octenylcarbonyl, Nonenylcarbonyl oder Dekenylcarbonyl, genannt.

Als Substituenten der genannten Reste von R³ kommen prinzipiell alle denkbaren Substituenten in Frage, die die Halogenasereaktion nicht behindern, beispielsweise ein oder mehrere Substituenten wie Halogen, wie Fluor, Chlor oder Brom, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Alkoxy, Benzyloxy, Phenyl oder Benzyl.

Als Arylreste seien beispielsweise Phenyl, Methoxyphenyl oder Naphthyl oder aromatische Ringe oder Ringsysteme mit 6 bis 18 Kohlenstoffatomen im Ringsystem sowie bis zu 24 weiteren C-Atomen, die weitere nicht aromatische Ringe oder Ringsysteme mit 3 bis 8 C-Atomen im Ring bilden können, zu verstehen, die ggf. mit einem oder mehreren Resten wie Halogen, wie Fluor, Chlor oder Brom, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Alkyl, Alkoxy, oder anderen Resten substituiert sein können, genannt. Bevorzugt sind ggf. substituiertes Phenyl, Methoxyphenyl und Naphthyl.

Als Hetarylreste seien einfache oder kondensierte aromatische Ringsysteme mit einem oder mehreren heteroaromatischen 3- bis 7-gliedrigen Ringen, die ein oder mehrere Heteroatome wie N, O oder S enthalten können, und die ggf. mit einem oder mehreren Resten wie Halogen wie Fluor, Chlor oder Brom, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Thio, Alkyl, Alkoxy oder weiteren aromatischen oder weiteren gesättigten oder ungesättigten nicht aromatischen Ringen oder Ringsystemen substituiert sein können, genannt.

R⁴ und R⁵ bezeichnen in den Verbindungen der Formel I und II unabhängig voneinander Wasserstoff, Hydroxy-, Halogen-, Nitro-, Cyano-substituiertes oder unsubstituiertes, ver zweigtes oder unverzweigtes C₁-C₁₀-Alkyl-, C₁-C₁₀-Alkoxy-, C₂-C₁₀-Alkenyl-, C₂-C₁₀-Alkenyloxy-, substituiertes oder un substituiertes C₃-C₁₀-Cycloalkyl-, Aryl, Hetaryl-, R⁶R⁷N- und wobei zwei Reste R⁴ und R⁵ an benachbarten Kohlenstoffatomen zusammen einen weiteren substituierten oder unsubstituierten aromatischen, gesättigten oder teilweise gesättigten Ring mit 5 bis 6 Atomen im Ring bilden können, der ein oder mehrere Heteroatome wie O, N oder S enthalten kann.

Halogen bedeutet Fluor, Brom oder Chlor, bevorzugt Chlor.

Als Alkenylreste seien substituierte oder unsubstituierte, ver zweigte oder unverzweigte C₂-C₁₀-Alkenylketten, wie beispielsweise Ethenyl, Propenyl, 1-Butenyl, 2-Butenyl, 3-Butenyl, 2-Methyl propenyl, 1-Pentenyl, 2-Pentenyl, 3-Pentenyl, 4-Pentenyl, 1-Methyl-1-butenyl, 2-Methyl-1-butenyl, 3-Methyl-1-butenyl, 1-Methyl-2-butenyl, 2-Methyl-2-butenyl, 3-Methyl-2-butenyl, 1-Methyl-3-butenyl, 2-Methyl-3-butenyl, 3-Methyl-3-butenyl, 1,1-Dimethyl-2-propenyl, 1,2-Dimethyl-1-propenyl, 1,2-Dimethyl- 2-propenyl, 1-Ethyl-1-propenyl, 1-Ethyl-2-propenyl, 1-Hexenyl, 2-Hexenyl, 3-Hexenyl, 4-Hexenyl, 5-Hexenyl, 1-Methyl-1-pentenyl, 2-Methyl-1-pentenyl, 3-Methyl-1-pentenyl, 4-Methyl-1-pentenyl, 1-Methyl-2-pentenyl, 2-Methyl-2-pentenyl, 3-Methyl-2-pentenyl, 4-Methyl-2-pentenyl, 1-Methyl-3-pentenyl, 2-Methyl-3-pentenyl, 3-Methyl-3-pentenyl, 4-Methyl-3-pentenyl, 1-Methyl-4-pentenyl, 2-Methyl-4-pentenyl, 3-Methyl-4-pentenyl, 4-Methyl-4-pentenyl, 1,1-Dimethyl-2-butenyl, 1,1-Dimethyl-3-butenyl, 1,2-Dimethyl- 1-butenyl, 1,2-Dimethyl-2-butenyl, 1,2-Dimethyl-3-butenyl, 1,3-Dimethyl-1-butenyl, 1,3-Dimethyl-2-butenyl, 1,3-Dimethyl- 3-butenyl, 2,2-Dimethyl-3-butenyl, 2,3-Dimethyi-1-butenyl, 2,3-Dimethyl-2-butenyl, 2,3-Dimethyl-3-butenyl, 3,3-Dimethyl- 1-butenyl, 3,3-Dimethyl-2-butenyl, 1-Ethyl-1-butenyl, 1-Ethyl-2- butenyl, 1-Ethyl-3-butenyl, 2-Ethyl-1-butenyl, 2-Ethyl-2-butenyl, 2-Ethyl-3-butenyl, 1,1,2-Trimethyl-2-propenyl, 1-Ethyl-1-methyl- 2-propenyl, 1-Ethyl-2-methyl-1-propenyl, 1-Ethyl-2-methyl-2- propenyl, 1-Heptenyl, 2-Heptenyl, 3-Heptenyl, 4-Heptenyl, 5-Heptenyl, 6-Heptenyl, 1-Octenyl, 2-Octenyl, 3-Octenyl, 4-Octenyl, 5-Octenyl, 6-Octenyl, 7-Octenyl, 1-Nonenyl, 2-Nonenyl, 3-Nonenyl, 4-Nonenyl, 5-Nonenyl, 6-Nonenyl, 7-Nonenyl, 8-Nonenyl, 1-Decenyl, 2-Decenyl, 3-Decenyl, 4-Decenyl, 5-Decenyl, 6-Decenyl, 7-Decenyl, 8-Decenyl oder 9-Decenyl, und deren verzweigtkettige Homologen genannt.

Als Cycloalkylreste seien beispielhaft substituierte oder unsub stituierte verzweigte oder unverzweigte C₃-C₁₀-Cycloalkylketten mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen im Ring oder Ringsystem wie Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl, 1-Methylcyclopropyl, 1-Ethylcyclopropyl, 1-Propylcyclopropyl, 1-Butylcyclopropyl, 1-Pentylcyclopropyl, 1-Methyl-1-Butylcyclo propyl, 1,2-Dimethylcyclypropyl, 1-Methyl-2-Ethylcyclopropyl, Cyclooctyl, Cyclononyl oder Cyclodecyl genannt. Die Cycloalkyl reste können auch Heteroatome wie S, N und O im Ring enthalten.

Unter Aryl sind beispielsweise einfache oder kondensierte aroma tische Ringsysteme, die ggf. mit einem oder mehreren Resten wie Halogen wie Fluor, Chlor oder Brom, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Thio, Alkyl, Alkoxy, Aryl, Hetaryl oder weiteren gesättigten oder ungesättigten nicht aromatischen Ringen oder Ringsystemen substituiert sein können, zu verstehen. Bevorzugt sind ggf. substituierte Phenyl, Methoxyphenyl und Naphthyl.

Unter Hetaryl sind beispielsweise einfache oder kondensierte aromatische Ringsysteme mit einem oder mehreren hetero aromatischen 3- bis 7gliedrigen Ringen, die ein oder mehrere Heteroatome wie N, O oder S enthalten können, und die ggf. mit einem oder mehreren Resten wie Halogen wie Fluor, Chlor oder Brom, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Thio, Alkyl, Alkoxy oder weiteren aromatischen oder weiteren gesättigten oder unge sättigten nicht aromatischen Ringen oder Ringsystemen substi tuiert sein können, zu verstehen.

Als Substituenten der genannten Reste von R⁴ und R⁵ kommen prinzipiell alle denkbaren Substituenten in Frage beispielsweise ein oder mehrere Substituenten wie Halogen wie Fluor, Chlor oder Brom, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Alkoxy, Benzyloxy, Phenyl oder Benzyl.

R⁶ und R⁷ bezeichnen im Substituent R⁶R⁷N- unabhängig voneinander Wasserstoff oder substituiertes oder unsubstituiertes, verzweig tes oder unverzweigtes C₁-C₁₀-Alkyl.

Als Alkylreste seien substituierte oder unsubstituierte ver zweigte oder unverzweigte C₁-C₁₀-Alkylketten wie beispielsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, 1-Methylethyl, n-Butyl, 1-Methylpropyl-, 2-Methylpropyl, 1, 1-Dimethylethyl, n-Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3-Methylbutyl, 2,2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, n-Hexyl, 1,1-Dimethylpropyl, 1,2-Dimethylpropyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl, 1,1-Dimethyl butyl, 1,2-Dimethylbutyl, 1,3-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 2,3-Dimethylbutyl, 3,3-Dimethylbutyl, 1-Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1,1,2-Trimethylpropyl, 1,2,2-Trimethylpropyl, 1-Ethyl-1-methyl propyl, 1-Ethyl-2-methylpropyl, n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl oder n-Decyl genannt. Bevorzugt sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, n-Butyl, i-Propyl oder i-Butyl.

Als Substituenten der genannten Reste von R⁶ und R⁷ kommen prinzipiell alle denkbaren Substituenten in Frage, die die Halogenasereaktion nicht behindern, beispielsweise ein oder mehrere Substituenten wie Halogen, wie Fluor, Chlor oder Brom, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Alkoxy, Benzyloxy, Phenyl oder Benzyl.

R⁸ bezeichnet im Substituent

substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unver zweigtes C₁-C₁₀-Alkyl-, C₂-C₁₀-Alkenyl-, substituiertes oder unsubstituiertes Aryl-.

Als Alkylreste seien substituierte oder unsubstituierte ver zweigte oder unverzweigte C₁-C₁₀-Alkylketten wie beispielsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, 1-Methylethyl, n-Butyl, 1-Methylpropyl-, 2-Methylpropyl, 1,1-Dimethylethyl, n-Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3-Methylbutyl, 2,2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, n-Hexyl, 1,1-Dimethylpropyl, 1,2-Dimethylpropyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl, 1,1-Dimethyl butyl, 1,2-Dimethylbutyl, 1,3-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 2,3-Dimethylbutyl, 3,3-Dimethylbutyl, 1-Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1,1,2-Trimethylpropyl, 1,2,2-Trimethylpropyl, 1-Ethyl-1-methyl propyl, 1-Ethyl-2-methylpropyl, n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl oder n-Decyl genannt. Bevorzugt sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, n-Butyl, 1-Propyl oder i-Butyl.

Als Alkenylreste seien substituierte oder unsubstituierte, ver zweigte oder unverzweigte C₂-C₁₀-Alkenylketten, wie beispielsweise Ethenyl, Propenyl, 1-Butenyl, 2-Butenyl, 3-Butenyl, 2-Methyl propenyl, 1-Pentenyl, 2-Pentenyl, 3-Pentenyl, 4-Pentenyl, 1-Methyl-1-butenyl, 2-Methyl-1-butenyl, 3-Methyl-1-butenyl, 1-Methyl-2-butenyl, 2-Methyl-2-butenyl, 3-Methyl-2-butenyl, 1-Methyl-3-butenyl, 2-Methyl-3-butenyl, 3-Methyl-3-butenyl, 1,1-Dimethyl-2-propenyl, 1, 2-Dimethyl-1-propenyl, 1,2-Dimethyl- 2-propenyl, 1-Ethyl-1-propenyl, 1-Ethyl-2-propenyl, 1-Hexenyl, 2-Hexenyl, 3-Hexenyl, 4-Hexenyl, 5-Hexenyl, 1-Methyl-1-pentenyl, 2-Methyl-1-pentenyl, 3-Methyl-1-pentenyl, 4-Methyl-1-pentenyl, 1-Methyl-2-pentenyl, 2-Methyl-2-pentenyl, 3-Methyl-2-pentenyl, 4-Methyl-2-pentenyl, 1-Methyl-3-pentenyl, 2-Methyl-3-pentenyl, 3-Methyl-3-pentenyl, 4-Methyl-3-pentenyl, 1-Methyl-4-pentenyl, 2-Methyl-4-pentenyl, 3-Methyl-4-pentenyl, 4-Methyl-4-pentenyl, 1,1-Dimethyl-2-butenyl, 1,1-Dimethyl-3-butenyl, 1,2-Dimethyl- 1-butenyl, 1,2-Dimethyl-2-butenyl, 1,2-Dimethyl-3-butenyl, 1,3-Dimethyl-1-butenyl, 1,3-Dimethyl-2-butenyl, 1,3-Dimethyl- 3-butenyl, 2,2-Dimethyl-3-butenyl, 2,3-Dimethyl-1-butenyl, 2,3-Dimethyl-2-butenyl, 2,3-Dimethyl-3-butenyl, 3,3-Dimethyl- 1-butenyl, 3,3-Dimethyl-2-butenyl, 1-Ethyl-1-butenyl, 1-Ethyl-2- butenyl, 1-Ethyl-3-butenyl, 2-Ethyl-1-butenyl, 2-Ethyl-2-butenyl, 2-Ethyl-3-butenyl, 1,1,2-Trimethyl-2-propenyl, 1-Ethyl-1-methyl- 2-propenyl, 1-Ethyl-2-methyl-1-propenyl, 1-Ethyl-2-methyl-2- propenyl, 1-Heptenyl, 2-Heptenyl, 3-Heptenyl, 4-Heptenyl, 5-Heptenyl, 6-Heptenyl, 1-Octenyl, 2-Octenyl, 3-Octenyl, 4-Octenyl, 5-Octenyl, 6-Octenyl, 7-Octenyl, 1-Nonenyl, 2-Nonenyl, 3-Nonenyl, 4-Nonenyl, 5-Nonenyl, 6-Nonenyl, 7-Nonenyl, 8-Nonenyl, 1-Decenyl, 2-Decenyl, 3-Decenyl, 4-Decenyl, 5-Decenyl, 6-Decenyl, 7-Decenyl, 8-Decenyl oder 9-Decenyl, und deren verzweigtkettige Homologen genannt.

R⁹ bezeichnet im Substituent

substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unver zweigtes C₁-C₁₀-Alkyl-, C₂-C₁₀-Alkenyl-, substituiertes oder unsubstituiertes Aryl-, Hetaryl-.

Als Alkylreste seien substituierte oder unsubstituierte ver zweigte oder unverzweigte C₁-C₁₀-Alkylketten wie beispielsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, 1-Methylethyl, n-Butyl, 1-Methylpropyl-, 2-Methylpropyl, 1,1-Dimethylethyl, n-Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3-Methylbutyl, 2,2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, n-Hexyl, 1,1-Dimethylpropyl, 1,2-Dimethylpropyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl, 1,1-Dimethyl butyl, 1,2-Dimethylbutyl, 1,3-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 2,3-Dimethylbutyl, 3,3-Dimethylbutyl, 1-Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1,1,2-Trimethylpropyl, 1,2,2-Trimethylpropyl. 1-Ethyl-1-methyl propyl, 1-Ethyl-2-methylpropyl, n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl oder n-Decyl genannt. Bevorzugt sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, n-Butyl, i-Propyl oder 1-Butyl.

Als Alkenylreste seien substituierte oder unsubstituierte, ver zweigte oder uiwerzweigte C₂-C₁₀-Alkenylketten, wie beispielsweise Ethenyl, Propenyl, 1-Butenyl, 2-Butenyl, 3-Butenyl, 2-Methyl propenyl, 1-Pentenyl, 2-Pentenyl, 3-Pentenyl, 4-Pentenyl, 1-Methyl-1-butenyl, 2-Methyl-1-butenyl, 3-Methyl-1-butenyl, 1-Methyl-2-butenyl, 2-Methyl-2-butenyl, 3-Methyl-2-butenyl, 1-Methyl-3-butenyl, 2-Methyl-3-butenyl, 3-Methyl-3-butenyl, 1,1-Dimethyl-2-propenyl, 1,2-Dimethyl-1-propenyl, 1,2-Dimethyl- 2-propenyl, 1-Ethyl-1-propenyl, 1-Ethyl-2-propenyl, 1-Hexenyl, 2-Hexenyl, 3-Hexenyl, 4-Hexenyl, 5-Hexenyl, 1-Methyl-1-pentenyl, 2-Methyl-1-pentenyl, 3-Methyl-1-pentenyl, 4-Methyl-1-pentenyl, 1-Methyl-2-pentenyl, 2-Methyl-2-pentenyl, 3-Methyl-2-pentenyl, 4-Methyl-2-pentenyl, 1-Methyl-3-pentenyl, 2-Methyl-3-pentenyl, 3-Methyl-3-pentenyl, 4-Methyl-3-pentenyl, 1-Methyl-4-pentenyl, 2-Methyl-4-pentenyl, 3-Methyl-4-pentenyl, 4-Methyl-4-pentenyl, 1,1-Dimethyl-2-butenyl, 1,1-Dimethyl-3-butenyl, 1,2-Dimethyl- 1-butenyl, 1,2-Dimethyl-2-butenyl, 1,2-Dimethyl-3-butenyl, 1,3-Dimethyl-1-butenyl, 1,3-Dimethyl-2-butenyl, 1,3-Dimethyl- 3-butenyl, 2,2-Dimethyl-3-butenyl, 2,3-Dimethyl-1-butenyl, 2,3-Dimethyl-2-butenyl, 2,3-Dimethyl-3-butenyl, 3,3-Dimethyl- 1-butenyl, 3,3-Dimethyl-2-butenyl, 1-Ethyl-1-butenyl, 1-Ethyl-2- butenyl, 1-Ethyl-3-butenyl, 2-Ethyl-1-butenyl, 2-Ethyl-2-butenyl, 2-Ethyl-3-butenyl, 1,1,2-Trimethyl-2-propenyl, 1-Ethyl-1-methyl- 2-propenyl, 1-Ethyl-2-methyl-1-propenyl, 1-Ethyl-2-methyl-2- propenyl, 1-Heptenyl, 2-Heptenyl, 3-Heptenyl, 4-Heptenyl, 5-Heptenyl, 6-Heptenyl, 1-Octenyl, 2-Octenyl, 3-Octenyl, 4-Octenyl, 5-Octenyl, 6-Octenyl, 7-Octenyl, 1-Nonenyl, 2-Nonenyl, 3-Nonenyl, 4-Nonenyl, 5-Nonenyl, 6-Nonenyl, 7-Nonenyl, 8-Nonenyl, 1-Decenyl, 2-Decenyl, 3-Decenyl, 4-Decenyl, 5-Decenyl, 6-Decenyl, 7-Decenyl, 8-Decenyl oder 9-Decenyl, und deren verzweigtkettige Homologen genannt.

Als Substituenten der genannten Reste von R⁸ und R⁹ kommen prinzipiell alle denkbaren Substituenten in Frage, die die Halogenasereaktion nicht behindern, beispielsweise ein oder mehrere Substituenten wie Halogen, wie Fluor, Chlor oder Brom, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Alkoxy, Benzyloxy, Phenyl oder Benzyl.

Für das erfindungsgemäße Verfahren kann ein Organismus ver wendet werden, der mindestens ein Gen für die oben beschriebene Halogenase enthält. Bevorzugt wird ein Mikroorganismus verwendet.

Das Verfahren kann vorteilhaft mit einem Rohextrakt eines Halogenase enthaltenden Organismus oder mit einem angereinigten oder gereinigten Enzym durchgeführt werden.

Wie oben beschrieben, wird der Reaktion vorteilhaft ein Halogen donor zugesetzt. Unter Halogen sind bevorzugt Chlor oder Brom zu verstehen. Fluor und Iod sind weniger bevorzugt, da sie toxisch wirken können, so daß die Organismen in ihrer Aktivität behindert werden oder aber sogar abgetötet werden. Die Reaktion ist aber auch mit Fluor und Iod möglich.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit wachsenden oder ruhenden Zellen durchgeführt werden.

Zur Halogenierung mit wachsenden Organismen werden die für die Halogenierung verwendeten Organismen in einem Medium angezogen, das das Wachstum dieser Organismen, bevorzugt Mikroorganismen, ermöglicht.

Dieses Medium kann ein synthetisches oder ein natürliches, komplexes Medium sein. Je nach Organismus werden dem Fachmann bekannte Medien verwendet. Für das Wachstum der Mikroorganismen enthalten die verwendeten Medien in der Regel eine Kohlenstoff quelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und gegebenen falls geringe Mengen an Vitamine und Spurenelemente.

Vorteilhafte Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Zucker wie Mono-, Di- oder Polysaccharide wie Glucose, Fructose, Mannose, Xylose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder Cellulose, komplexe Zucker quellen wie Melasse, Zuckerphosphate wie Fructose-1,6-bis phosphat, Zuckeralkohole wie Mannit, Polyole wie Glycerin, Alkohole wie Methanol oder Ethanol, Carbonsäuren wie Citronen säure, Milchsäure oder Essigsäure, Fette wie Sojaöl oder Rapsöl, Aminosäuren wie ein Aminosäurengemisch beispielsweise sog. Casamino acids (Difco) oder einzelne Aminosäuren oder Amino zucker, die letztgenannten können auch gleichzeitig als Stick stoffquelle verwendet werden.

Vorteilhafte Stickstoffquellen sind organische oder anorganische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispiele sind Ammoniumsalze wie NH₄Cl oder (NH₄)₂SO₄, Nitrate, Harnstoff, oder komplexe Stickstoffquellen wie Mais quellwasser, Bierhefeautolysat, Sojabohnenmehl, Weizengluten, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Caseinhydrolysat, Hefe oder Kartoffelprotein, die häufig auch gleichzeitig als Stickstoff quelle dienen können.

Beispiele für anorganische Salze sind die Salze von Calcium, Magnesium, Natrium, Cobalt, Molybdän, Mangan, Kalium, Zink, Kupfer und Eisen. Als Anion dieser Salze sind besonders das Chlor-, Sulfat- und Phosphation zu nennen.

Gegebenenfalls werden dem Nährmedium weitere Wachstumsfaktoren zugesetzt, wie beispielsweise Vitamine oder Wachstumsförderer wie Biotin, Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nicotinsäure, Pantothenat oder Pyridoxin, Aminosäuren wie Alanin, Cystein, Prolin, Asparaginsäure, Glutamin, Serin, Phenylalanin, Ornithin oder Valin, Carbonsäuren wie Citronensäure, Ameisensäure, Pimelinsäure oder Milchsäure, oder Substanzen wie Dithiothreitol.

Das Mischungsverhältnis der genannten Nährstoffe hängt vom Organismus sowie von der Art der Fermentation ab und wird im Einzelfall festgelegt. Die Mediumkomponenten können alle zu Beginn der Fermentation vorgelegt werden, nachdem sie falls erforderlich getrennt sterilisiert oder gemeinsam sterilisiert wurden, oder aber je nach Bedarf während der Fermentation kontinuierlich oder diskontinuierlich nachgegeben werden.

Die Züchtungsbedingungen werden so festgelegt, daß die Organismen optimal wachsen und daß die bestmöglichen Ausbeuten erreicht werden. Bevorzugte Züchtungstemperaturen liegen bei 15°C bis 40°C. Besonders vorteilhaft sind Temperaturen zwischen 25°C und 37°C. Vorzugsweise wird der pH-Wert in einem Bereich von 3 bis 9 fest gehalten. Besonders vorteilhaft sind pH-Werte zwischen 5 und 8. Im allgemeinen ist eine Inkubationsdauer von wenigen Stunden bis zu einigen Tagen bevorzugt von 8 Stunden bis zu 21 Tagen, be sonders bevorzugt von 4 Stunden bis 14 Tagen ausreichend. Inner halb dieser Zeit reichert sich die maximale Menge an Produkt im Medium an.

Wie Medien vorteilhaft optimiert werden können, kann der Fach mann beispielsweise dem Lehrbuch Applied Microbiol Physiology, "A Practical Approach (Eds. P. M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL- Press, 1997, Seiten 53-73, ISBN 0 19 963577 3) entnehmen. Vorteilhafte Medien und Anzuchtbedingungen sind für hier Amycolatopsis Nadkarini et al. (J. Antibiot, 1994, 334-341) auf Seite 336 und 337, oder DE 42 26 192 Beispiel 16 + 17 (Seiten 11 und 12), EP-A-0 468 504 Beispiel 1-4 (Seiten 4-6) und Seite 2 (Zeilen 20-40) und EP-B0 521 408 Beispiel 1 zu entnehmen. Die zu halogenierende Verbindung kann dem Medium gleich zu Beginn der Fermentation zugesetzt werden oder im Laufe der Fermentation kontinuierlich oder diskontinuierlich. Der Umsatz kann mit üblichen Analysenmethoden, beispielsweise Dünnschichtchromato graphie, HPLC oder GC, verfolgt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann kontinuierlich oder diskonti nuierlich in batch- oder fed-batch-Weise durchgeführt werden.

Während der Fermentation kann der pH-Wert, je nach Organismus, geregelt oder nicht geregelt werden. In der Regel erfolgt die Fermentation bei einem pH-Wert zwischen 5 und 9, bevorzugt 6 und 9.

Eine Analysenmethode für Glycopeptid-Antibiotika ist Nadkarini et al. (J. Antibiotics 1994: 334-341) beispielhaft zu entnehmen.

Wird das erfindungsgemäße Verfahren mit freien Enzymen (Roh extrakt oder gereinigtes Enzym) durchgeführt, so kann vorteilhaft in einem weiteren Temperaturbereich gearbeitet werden. Dieser Temperaturbereich ist einerseits durch die Reaktionsgeschwindig keit vorgegeben, das heißt sehr niedrige Temperaturen führen zu einer geringen Reaktionsgeschwindigkeit, andererseits wird es durch die Temperaturbeständigkeit des Enzyms vorgegeben, das heißt hohe Temperaturen führen zur Denaturierung des Enzyms. Aus diesen Gründen ist ein Temperaturbereich zwischen 5 bis 80°C, bevorzugt von 10 bis 60°C, besonders bevorzugt von 20 bis 40°C vorteilhaft. Für das Verfahren eignen sich auch ruhende Zellen, die gegebenenfalls ebenso wie die Enzyme auch vorteilhaft immobilisiert werden können. Für eine bessere Umsetzung werden die Zellmembranen destabilisiert, so daß die Edukte und das Produkt leichter an den Reaktionsort (Enzym) gelangen können. Die Destabilisierung kann beispielsweise über verschiedene Alkali- oder Erdalkalisalze wie Lithium, Rubidium- oder Calcium salze oder über eine Behandlung mit Lösungsmitteln erfolgen.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Halogenasen bzw. Halogenasegene gehören zu den NADH-abhängigen Halogenasen, die sich aufgrund ihrer Regio- und/oder Stereoselektivität von den Haloperoxidasen unterscheiden.

Sie zeigen außerdem eine breite Substratspezifität. Sie halo genieren bevorzugt aromatische Reste.

Die bevorzugte Halogenase aus Amycolatopsis mediterranei hat 491 Aminosäuren (SEQ ID NO: 2). Ihr Gen wurde mit bhaA bezeich net. Das Enzym hat eine NADH/FAD-Bindungsstelle. Im N-Terminus des bhaA-Gens befindet sich ein Sequenzmotiv (β), welches vermutlich an der ADP-Bindung FAD- und NAD-abhängiger Enzyme beteiligt ist. In Position 304 des Proteins ist ein Asp-Rest konserviert, der eine FAD-Bindung ermöglichen kann. bhaA kann also auch FAD möglicherweise binden. Mit wachsenden Zellen ist die für die Reaktion erforderliche Bereitstellung von NADH bzw. NAD⁺ kein Problem, da dies aus dem Stoffwechsel des wachsenden Organismus erfolgen kann. Auch die Bereitstellung anderer erforderlicher Faktoren stellt kein Problem dar.

Wird mit ruhenden Zellen oder Enzympräparationen im erfindungs gemäßen Verfahren gearbeitet, so ist es von Vorteil, weitere Substanzen und Cofaktoren der Reaktionslösung zuzusetzen.

Im einfachsten Fall ist dies bei ruhenden Zellen der Zusatz einer Kohlenstoffquelle, über die die Reduktionsäquivalente regeneriert werden könnten.

Wird das erfindungsgemäße Verfahren mit freien oder immmobili sierten Enzymen durchgeführt, so wird vorteilhaft mindestens ein natürlicher oder synthetischer Elektronendonator der Reaktions lösung zugesetzt wie beispielsweise NADH, Methyl- oder Benzyl viologen.

Diese Elektronendonatoren werden vorteilhaft entweder ständig der Reaktionslösung zugesetzt oder aber in einer weiteren Reaktion regeneriert. Dies kann beispielsweise in einer elektro chemischen oder enzymatischen Reaktion erfolgen. Derartige Regenerierungsreaktionen werden beispielsweise in EP-B-0 023 346, DE 29 30 087 C2, DE 33 07 094 A1 oder DE 36 31 228 A1 be schrieben.

So wird in DE 29 30 087 C2 beispielsweise die Regenerierung von NADH aus NAD mittels der Formiatdehydrogenase in Gegenwart von Formiat beschrieben. Vorteilhaft wurde das Molekulargewicht des NAD⁺/NADH mittels Polyethylenglykol so erhöht, daß es in einem Membranreaktor zurückgehalten werden kann und so der Reaktion auf Dauer zur Verfügung steht (siehe DE 29 30 087 C2, Spalten 1 und 2). Gleiches wird in EP-B-0 023 346 und DE 33 07 094 A1 beschrieben.

In DE 35 31 228 wird die Regenerierung von NAD⁺ mit Viologenen (CAV und CYV) beschrieben. Eine weitere vorteilhafte Ausführungs form ist die Coexpression eines Cofaktor regenerierenden Enzyms, beispielsweise der Formiatdehydrogenase mit der Halogenase oder die Cokultivierung mit Organismen, die eine Regenerierung er möglichen.

Auf die vorgenannten Schriften zur Regenerierung wird an dieser Stelle ausdrücklich bezug genommen.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorteilhaft in Gegenwart eines Puffers oder unter pH kontrollierten Bedingungen durch geführt, im Falle, daß freie oder immobilisierte Enzyme verwendet werden.

Das Verfahren wird bei einem pH-Wert zwischen 4 und 10, bevorzugt zwischen 5 und 9, besonders bevorzugt zwischen 6 und 9, durch geführt.

Vorteilhaft werden der Reaktionslösung C₁-C₈-Mono- oder Dicarbon säuren wie Essigsäure, Propionsäure oder Citronensäure zugesetzt. Diese können gleichzeitig zur Herstellung des Reaktionspuffers verwendet werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Nukleinsäure fragment enthaltend eine Halogenase

a) die von der in SEQ ID NO: 1 genannten oder einer aufgrund des degenerierten genetischen Codes davon abgeleiteten Sequenz codiert wird oder
b) einer Nukleinsäureseguenz, die für ein funktionelles Fragment von (a) oder
c) einer mit (a) oder (b) unter Standardbedingungen hybridi sierenden Sequenz codiert oder
d) die für eine Sequenz codiert, die mit der unter (a) genannten Sequenz eine über 30%ige Identität oder über 60%ige Ähnlich keit aufweist, und

die mit einem oder mehreren homologen oder heterologen Regula tionssignalen zur Erhöhung der Genexpression und/oder Protein expression funktionell verknüpft ist und/oder dessen natürliche Regulation ausgeschaltet ist.

Unter dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragment sind die ge nannten Halogenasesequenzen oder deren funktionelle Äquivalente zu verstehen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung der Genexpression funktionell verknüpft wurden. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nucleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so daß die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Genkonstrukt kann aber auch in einer weniger bevorzugten Form einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Sequenz SEQ ID No: 1 oder deren funktionelle Äquivalente (siehe S. 32a bis d) inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regu lation wurde nicht entfernt. Stattdessen wurde die natürliche Regulationssequenz so mutiert, daß keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird. Diese veränderten Promo toren können auch allein vor die natürlichen Gene zur Steigerung der Aktivität gebracht werden. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nucleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteil hafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Es können ein oder mehrere Kopien des Halogenasegens im Genkonstrukt enthalten sein.

Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Ver fahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacI^q-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-P_R- oder im λ-P_L-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH oder in den Pflanzenpromotoren CaMV/35S [Franck et al., Cell 21(1980) 285-294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, LEB4, nos oder im Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor enthalten. In diesem Zusammenhang sind auch die Promotoren der Pyruvatdecarboxylase und der Methanol oxidase aus beispielsweise Hansenula vorteilhaft. Weitere vor teilhafte Pflanzenpromotoren sind beispielsweise ein durch Benzensulfonamid-induzierbarer (EP 388186), ein durch Tetra zyklin-induzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397-404), ein durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (WO9321334) Promotor. Vorteilhaft sind insbesonders solche pflanzliche Promotoren, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen die Biosynthese von Purinen bzw. dessen Vorstufen statt findet. Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine blatt spezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445-245). Auch der Promotor der Phosphoribosylpyrophosphat Amidotransferase aus Glycine max (siehe auch Genbank Accession Nummer U87999) oder einen anderen Nodien-spezifischen Promotor wie in EP 249676 können vorteilhaft verwandt werden.

Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten für das erfindungs gemäße Verfahren verwendet werden. Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.

Im Nukleinsäurefragment (= Genkonstrukt) können wie oben be schrieben noch weitere Gene, die in die Organismen eingebracht werden sollen, enthalten sein. Diese Gene können unter getrennter Regulation oder unter der gleichen Regulationsregion wie die Halogenase-Gene liegen. Bei diesen Genen handelt es sich bei spielsweise um weitere Biosynthesegene, die eine gesteigerte Synthese beispielsweise von Glykopeptid-Antibiotika oder der Synthese neuer Hydridantibiotika ermöglichen oder um Cofaktor regenerierende Enzyme. Bevorzugt enthält das Nucleinsäurefragment SEQ ID NO: 1.

Das Nukleinsäurefragment wird zur Expression in den oben ge nannten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen Vektor wie beispielsweise einem Plasmid, einem Phagen oder sonstiger DNA inseriert, das eine optimale Expression der Gene im Wirt ermög licht. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III¹¹³-B1, λgt11 oder pBdCI, in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALSl, pIL2 oder pBB116, in Hefen 2 µM, pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHlac⁺, pBIN19, pAK2004 oder pDH51 oder Derivate der vorstehend genannten Plasmide. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Geeignete pflanzliche Vektoren werden unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S. 71-119 beschrieben.

Vorteilhafterweise enthält das Nukleinsäurefragment zur Expression der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3' und/oder 5' Terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtsorganismus und Gen oder Gene für eine optimale Expression ausgewählt werden. Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann bei spielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder daß es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugs weise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beein flussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regu latorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptions ebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

Durch verschiedene Mutagenesemethoden, beispielsweise site directed mutagenesis, error prone PCR und/oder gene shuffling kann die Substratspezifität erhöht und/oder in der gewünschten Richtung verändert werden.

Es kann auch vorteilhaft die Enzymaktivität erhöht werden. Eine Erhöhung der Enzymaktivität oder der Substratspezifität kann beispielsweise durch eine Veränderung des katalytischen Zentrums erreicht werden. Eine Erhöhung kann auch erreicht werden, indem man das Enzym so verändert, daß Inhibitoren des Enzyms nicht mehr oder nur noch sehr schwach binden.

Für die Veränderung des Enzyms vorteilhafte Methoden sind wie oben erwähnt beispielsweise die site directed mutagenesis (siehe D. M. Glover et al., DNA Cloning, Vol. 1, 1995, IRL Press, Kapitel 6, Seite 193ff, ISBN 019-963476-9), die zufällige Mutagenese mit PCR unter Verwendung von dITP (Spee et al., Nucleic Acids Res., Vol. 21, No. 3, 1993: 777-778) oder die "in vitro" Rekombinationstechnik (Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol. 91, 1994: 10747-10751).

In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann das erfindungsgemäße Genkonstrukt auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäure fragment als Vektor bestehen.

Als Vektor kann auch ein beliebiges Plasmid (insbesondere aber ein Plasmid, das den Replikationsursprung des 2 µm Plasmids aus S. cerevisiae trägt) verwendet werden, das in der Zelle autonom repliziert, aber auch wie oben beschrieben ein lineares DNA-Fragment, das in das Genom des Wirtes integriert. Diese Integration kann über hetero- oder homologe Rekombination er folgen. Bevorzugt wie erwähnt jedoch über homologe Rekombination (Steiner et al., Genetics, Vol. 140, 1995: 973-987).

Weitere für die Gattungen Streptomyces, Rhodococcus, Nocardia oder Amycolatopsis geeignete vorteilhafte Vektoren werden bei spielsweise in Matsushima et al. (J. Bacteriol., Vol. 169, No. 5, 1987: 2298-2300, Tabelle 1), de Schrijver et al. (Appl. Environ. Microbiol., Vol. 63, No. 5, 1997: 1911-1916, Tabelle 1) oder Bierman et al. (Gene 116, 1992: 43-49, Tabelle 1) beschrieben.

Für eine optimale Expression der heterologen Halogenasegene in Organismen ist es vorteilhaft, die Nukleinsäuresequenzen ent sprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage" zu verändern. Der "codon usage" läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.

Eine Erhöhung der Genexpression der Halogenasegene kann auf verschiedenen Ebenen erfolgen, wie durch Erhöhung der Genkopien zahl oder der Verstärkung der Genexpression durch Veränderung der regulatorischen Elemente. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorzugsweise auf der Transcrptionsebene (z. B. Verwendung stärkerer Promotoren und/oder Enhancer) oder auf Translationsebene erfolgen (z. B. Erhöhung der Stabilität des mRNA). Durch die tiberexpression kann vorteilhaft eine voll ständige Klonierung der Glykopeptid-Antibiotika erreicht werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die in SEQ ID NO: 1 genannte Sequenz, sowie die davon abgeleitete Proteinsequenz (SEQ ID NO: 2).

Eine Überexpression soll hier beispielhaft für Amycolatopsis beschrieben werden. Das bhaA-Gen wird nach Amplifikation zur Erzeugung geeigneter Schnittstellen hinter den starken Erythromicin-Promotor (ermE) kloniert. Dieser funktioniert gut in Amycolatopsis. Weitere geeignete Promotoren sind der konstitutive Phagenpromotor SF 14 des Phagen 718 Labes et al. (Microbiology 147, 1997: 1503-1512) oder der induzierbare tipA-Promotor (Thio strepton Murakaine et al., 1989, J. Bacteriol. 171, 1459-66, Takano et al., 1995, Gene, 166: 133-137). Die Expression des Gens erfolgt mit replikativen Vektoren oder durch integrative Vektoren. Die Expression durch integrative Vektoren beispiels weise über die Attachment site des Phagen phiC31 (Muth, G., Brolle, G. F., Wohlleben, W., 1999) hat eine Reihe von Vorteile, so wird die Herstellung von Produkten, z. B. Antibiotika nicht negativ beeinflußt, eine Stabilisierung der Gene über Anti biotikazusatz zum Medium ist nicht erforderlich. Ein vorteil haftes Plasmid für die Integration ist beispielsweise pSET152 (Bierman et al., 1992, Gene 116, 43-49). Als vorteilhafte replikative Amycolato 15491 00070 552 001000280000000200012000285911538000040 0002019926770 00004 15372psis-Vektoren seien pMEA100 (Moretti, P. et. al., 1985, Plasmid, 14, 126-133), pMEA300 (Vrijbloed, J. W. et al., 1995; Plasmid, 34, 96-104) oder pA387 (Lal, R. et al., 1991, Appl. Environ. Microbiol. 57, 665-67) und deren Derivate genannt.

Auch eine Expression mit dem melC-Promotor (Schmitt John, T. and Engels, J. W., 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 36, 493-498) beispielsweise mit dem Plasmid pIJ702 (Katz, E. et al., 1982, J. Gen. Microbiol., 192, 2703-2714) oder hinter dem ermE-Promotor (Bibb, M. J. and Janssen, G. R. Unusual features of transcription and translation of antibiotic resistance genes in antibiotic producing Streptomyces, In Proceedings of the fith International Symposium on the genetics of Industrial Microorganismus, pp. 309-318, Edited by M. Alacevic, D. Hranneli and Z. Toman, Karlovac, Yugoslavia: Ojnejin Prica Printing Works) mit Plasmid pM4 (Quiros, L. M. et al., 1998, Mol. Microbiol., 28, 1177-1185) ist vorteilhaft möglich.

Zur Erfindung gehören auch Organismen, die SEQ ID NO: 1 oder das oben beschriebene Nukleinsäurefragment oder den beschriebenen Vektor enthalten.

Beispiele Beispiel 1 Identifizierung und Isolierung des Balhimycin- Halogenasegens bhaA

Der Balhimycin-Biosynthesegencluster wurde mit einem reversen Genetikansatz identifiziert und kloniert.

Von Glykosyltransferasen (GtfA-GtfE), deren Gene aus den Glykopeptid-Antibiotika-Produzenten A. orientalis A82846 und A. orientalis C329.4 isoliert wurden und die an der Biosynthese der Glykopeptid-Antibiotika Chloroeremomycin (A82846B) und Van comycin beteiligt sind (Solenberg et al., 1997), wurden die konservierten Primer Gly1 und Gly7 abgeleitet [Sequenz von Primer Gly1: 5'-TCCCCCCGGGIWSSCGCGGIGACGTSGA-3'; Sequenz von Primer Gly7: 5'-TCCCCCCGGGTGGTGGATSRCSGCSGCSACSCGICCGAA-3' (I: Inosin; S. C/G; W: A/T)]. Mit Hilfe der PCR-Reaktion (siehe unten) konnte ein Internes, ca. 900 bp großes Glykosyltrans ferasegenfragment ('bgtfB') aus dem Chromosom des Balhimycin- Produzenten A. medtiterranei DSM5908 amplifiziert werden.

PCR-Reaktion

PCR-Gerät: RoboCycler Gradient 40 Thermocycler (Stratagene)
Kit: Expand High Fidelity PCR System (Boehringer)

PCR Reaktionsansatz (100 µl)

50 pmol Primer Gly1
50 pmol Primer Gly7
0,1 µg genomische DNA von A. mediterranei DSM5908
200 µM dNTPs (each)
10 µl 10 X Reaktionspuffer
1,5 mM MgCl₂

3 µl MSO
3,5 U Tag DNA Polymerase

PCR-Programm

Dieses Fragment wurde nach Konstruktion einer Cosmid-Genbank von A. mediterranei in den Cosmid-Vektor pOJ446 (Konstruktion der Genbank wie bei Gaisser, S. et al., 1997, J. Bacteriol. 179: 6271-6278) in Sothern-Hybridisierungsexperimenten (Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory) zur Identifizierung des vermeintlichen Balhi mycin-Biosynthesegenclusters eingesetzt. Auf diese Weise konnte das Cosmid 16.1, mit einem Insert von ca. 36 kb identifiziert werden. Nach Sequenzanalysen wurde festgestellt, daß der zur Gen sonde homologe Bereich, für insgesamt drei Glykosyltransferase gene (bgtfA-bgtfC) kodiert, deren abgeleitete Genprodukte höchste Ähnlichkeit zu Glykosyltransferasen aufweisen (GtfA-GtfC), die zuvor aus anderen Glykopeptid-Antibiotika-Produzenten isoliert wurden (Solenberg et al. 1997, s.o.)

Durch verschiedene Geninaktivierungsexperimente konnte eindeutig gezeigt werden, daß verschiedene Gene des Cluster auf 16.1, wie Gene für Glykosyltransferasen und Cytochrom P450-abhängige Mono oxygenasen an der Balhimycin-Biosynthese beteiligt sind. Damit war der Nachweis für die Identifizierung des Balhimycin-Bio synthesegenclusters erbracht.

Die Exprimente wurde wie in Pelzer et al., (Antimicrob. Agents Chemother. July 1999, Vol 43, No. 7, in press und J. Biotechnol., 56, 1977, 115-128) beschrieben durchgeführt.

Nach Identifizierung des Halogenasegens bhaA (siehe Beispiel 2) zeigte sich, daß bhaA von drei Oxygenasegenen (oxyA-C) und den drei Glykosyltransferasegenen (bgtfAC) flankiert ist. Das Gen konnte auf einem ca. 3 kb großen BamHI-Fragment, das zuvor in den Vektor pVCl9 subkloniert worden war, lokalisiert werden.

Die doppelsträngige Sequenzierung (Sanger, F. S. et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 74: 5463-5467) des Fragments ergab eine Größe von 3088 bp mit einem durchschnittlichen GIC-Gehalt von 68,8%. Die ORF-Analyse (Staden, R., and M.c Lachlan, A. D., 1982, Nucleic Acids Res., 10: 141-156) der Nukleotidsequenz führte zur Identifizierung von drei offenen Leserahmen (siehe Fig. 1). Flankiert von einem Teil des Oxygenasegens oxyc und von einem Teil des Glykosyltransferasegens bgtfA befindet sich das Gen bhaA auf dem Fragment. Das Gen besitzt ein ATG-Startcodon und ein TGA-Stopcodon. Ein Streptomyceten-typischer Promotor konnte in dieser Sequenz nicht gefunden werden. Die potentielle RBSC = Ribosomen-Bindungsstelle AGAGG befindet sich 11 Nukleotide vor dem Startcodon (Sequenz des bhaA-Gens siehe Fig. 2. Das Gen wird durch das jeweils fett hervorgehobene Start- und Stopcodon definiert).

Beispiel 2 Nachweis der Funktion des bdaA-Gens

Der Funktionsnachweis des bhaA-Gens gelang durch Erzeugung einer in frame Deletionsmutante. Die Deletion in frame erfolgte um einen eventuellen polaren Effekt auf folgende Gene durch Fremd- DNA, die bei Gendisruptions- oder Genreplacement-Experimenten häufig zu beobachten sind, auszuschließen. Die Erzeugung der in frame Deletionsmutante erfolgte in 2 Schritten.

Zunächst wurde die Genreplacement-Mutante PH3 (siehe Fig. 5, Erzeugung der gene replacement Mutante PH3) erzeugt, die aus schließlich zur Herstellung der in frame Deletionsmutante PH4 (siehe Fig. 6, Erzeugung der in frame Deletionsmutante PH4) genutzt wurde (siehe Fig. 3, Konstruktion von Plasmiden zum Gen austausch und "in frame"-Deletion des Balhimycin-Halogenasegens bhaA, + Fig. 4, Kontruktion von Plasmiden zum Genaustausch und "in frame"-Deletion des Balhimycin-Halogenasegens bhaA). Aus gangsplasmid für die notwendigen Vektorkonstruktionen war ein pVC18-Derivat (pVC18B3.0), das das 3088bp große BamHI-Fragment trägt, auf dem u. a. das bhaA-Gen lokalisiert ist (siehe Fig. 3, Konstruktion von Plasmiden zum Genaustausch und "in frame"- Deletion des Balhimycin-Halogenasegens bhaA). Alle DNA-Iso lierungen, Restriktionsspaltungen und Klonierungen wurden, wenn nicht anders beschrieben, wie bei Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, F., 1989, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, beschrieben durchgeführt.

Dieses Plasmid wurde durch einen Mlul-Verdau linearisiert. Die Schnittstelle ist singulär und liegt etwa in der Mitte des Fragments. Die Einführung einer 969 bp in frame Deletion im bhaA-Gen erfolgte nun mit Hilfe einer PCR-Reaktion. Dazu wurden 2 Primer (Primer 2 und 3) so konzipiert, daß zum einen die in frame Deletion eingeführt wurde und daß zusätzlich durch die Primer eine singuläre BglII-Schnittstelle entstand (s. Fig. 3). Die Primer hatten folgende Sequenz:
Primer 2: 5'-CTCACAGATCTGATACCGCGGGAAA-3'
Primer 3: 5'-CTACCAGATCTACGTGAACGAGGAG-3'
PCR-Gerät: Thermocycler PTC100 von MJ Research
Kit: Expand High Fidelity PCR System (Boehringer)

PCR Reaktionsansatz (50 µl) Master-Mix 1 (25 µl)

200 µM dNTP-Mix
200 nM Primer 2
200 nM Primer 3
1-10 ng Template DNA
1,5 µl DMSO

Master-Mix 2 (25 µl)

5 µl 10 X PCR-Puffer 2
0,75 µl Enzym-Mix

Master-Mix 1 und 2 zusammenpipettieren

PCR-Programm

Das PCR-Fragment wurde religiert, so daß der Vektor pUC18BΔ entstand (Fig. 4). Gleichzeitig wurde zur Erzeugung der gene replacement Mutante PH3 das Chloramphenicol-Resistenzgen cat (Gil et al., 1985, Gene 38, 1-8) als BcII-Fragment in die BgIII- Schnittstelle inseriert. Dieser Vektor bekam die Bezeichnung pUCBcat (Fig. 4). Zum Einsatz in A. mediterranei DSM5908 wurden beide Inserts als EcoRI/Sphl-Fragment in den im Balhimycin- Produzenten nichtreplikativen und zu Geninaktivierungen einsetz baren Vektor pSP1 (Pelzer et al., 1997) kloniert, so daß die Plasmide pPH4 (Deletionskonstrukt) und pPH3 (Gene replacement- Konstrukt) entstanden (Fig. 4).

Zunächst wurde die gene replacement Mutante PH3 erzeugt. Dazu wurde der Balhimycin-Produzent mit dem Plasmid pPH3 mit Hilfe der "Direkten Transformation" (Pelzer et al., 1997) transformiert. Durch geeignete Selektion (Chloramphenicol-Resistenz und Erythro mycin-Sensitivität, Fig. 5) konnte die gene replacement Mutante PH3 identifiziert und durch Southern-Hybridisierungen (Sambrook, s. o.) verifiziert werden.

Diese gene replacement-Mutante PH3 wurde dann mit dem Deletions plasmid pPH4 transformiert. Die Primärselektion erfolgte zunächst auf eine Integration des gesamten Vektors über homologe Rekombi nation (Chloramphenicol-Resistenz und Erythromycin-Resistenz, Fig. 6). Anschließend wurde der Selektionsdruck zur Vektor eliminierung durch homologe Rekombination entfernt. So wurden Chloramphenicol-sensitive und Erythromycin-sensitive Kolonien gefunden. Durch Southern-Hybridisierungen konnte die Mutante PH4 als korrekte in frame Deletionsmutante im bhaA-Gen verifiziert werden.

HPLC-MS Untersuchungen und Analyse des Isotopenmusters ergaben, daß PH4 nur noch unchlorierte Balhimycin-Derivate erzeugte. Damit konnte gezeigt werden, daß BhaA für beide Chlorierungen an AS- Position 2 und 6 verantwortlich ist (siehe folgende Beispiele).

Beispiel 3 Biosynthese-Metabolite der Mutante PH4 a) Ergebnisse der Analytik mit Elektrospray-Massenspektrometrie Mutante pH4

Das Produktspektrum des Klons pH4 entsprach abgesehen von der fehlenden Chlorierung dem des Wildtyps. Es wurden jedoch in den Kulturfiltraten dieser Mutante unglykosylierte Verbindungen (Verb. 7^Δ, 8^Δ, 9^Δ) detektiert, die im Produktspektrum des Wild typs nicht nachgewiesen wurden. Fig. 7 gibt die Struktur des Balhimycins wieder.

Tabelle 1

Produktspektrum der mit HPLC-Es-MS identifizierten Verbindungen des Wildtyps und der Mutanten. Die nicht-chlorierten Biosyntheseprodukte sind mit "Δ" bezeichnet.

Die Ergebnisse der Untersuchung der Kulturfiltrate mit HPLC-MS zeigte, daß durch die "inframe"-Mutation die Chlorierung nicht mehr erfolgt. Der Nachweis mit Massenspektrometrie über die charakteristischen Isotopenverteilungen ist chemisch eindeutig. Alle detektierten Verbindungen der Mutante PH4 wiesen eine Massendifferenz von 68 amu = 2 Cl-Atome gegenüber den detektier ten Verbindungen des Wildtyps auf.

Aus den MS-Analysen konnten nur qualitative, allenfalls halb quantitative Schlußfolgerungen über die Menge der einzelnen produzierten Metabolite gezogen werden. Dennoch ließ sich aus den Intensitäten der Molekülionen eine gewisse Tendenz bezüglich der Quantität der Biosyntheseprodukte ablesen.

Fig. 8

Es-Massenspektren von Dechlorobalhimycin (Mutante PH4) und Balhimycin (Wildtyp). Die charakteristischen Isoto penmuster beweisen die Inaktivierung der Halogenase BhaA. Linienspektren entsprechen den theoretisch erwarteteen Isotopenverteilungen.

b) Optimierte Aufreinigung Vorreinigung der Peptide

Zur Entfernung des zur Selektion eingesetzten Erythromycins wurden die filtrierten Kulturüberstände je dreimal mit dem Volumen des Kulturfiltrats mit Ethylacetat ausgeschüttelt. Vor dem Auftragen auf die XAD16-Säule wurden die Kulturüberstände nochmals über eine Porzellanfritte (Filter G3) filtriert und mit dem in Tabelle 2 angegebenen Stufengradienten eluiert. Die Fraktionen wurden mit HPLC-MS auf den Gehalt an Rohpeptid untersucht, das Lösungsmittel am Vakuum entfernt und gefrier getrocknet.

Tabelle 2

Parameter für die chromatographische Trennung an XAD-Adsorberharz

Präparative RP 18-HPLC

Die Rohpeptidfraktionen wurden im Anfangsgradienten (H₂O : ACN (9 : 1); 0,1% TFA) gelöst und filtriert (Millex© -GV; 0,22 µm; Millipore). Die nach der Trennung aufgefangenen Fraktionen wurden mit Es-MS analysiert, gefriergetrocknet und vereinigt.

Analysenparameter

Cromatograph: Waters 600 Multisolvent Delivery System (Waters)
Detektor: Lamda-Max, Model 481 (Waters)
Säule: Nucleosil RP-C18, 5 µm, 20 × 250 mm (Grom, Herrenberg)
Probenaufgabeventil: Altex 210 Valve (Beckmann)
Auftragsmenge: 10 mg Rohpeptid
Trennparameter
Fließmittel
A: Wasser (0,1% TFA)
B: Acetonitril (0,1% TFA)
Flußrate: 10 ml/min
Detektionswellenlänge: 214 nm

Tabelle 3

Gradient zur Trennung der Dechloro-Metabolite

HD-Metabolite

c) Elektrospray-Massenspektrometrie

Die Es-MS-Spektren wurden auf einem API-III Triple Quadrupol Massenspektrometer (Sciex, Thornhill, Kanada) aufgenommen. Sofern nicht anderes vermerkt, wurden die Proben in ACN/H₂O (1 : 1, 0,1% Ameisensäure) gelöst und die Spektren im Positivionenmodus auf genommen. Die Probenzuführung erfolgte über eine Microbore-Pumpe (140A Solvent Delivery System, ABI, Weiterstadt) mit einer Fluß rate von nach Split von 5 µ1/min. Zur Detektion diente ein UV- Detektor (Linear UVVIS 204, Linear Instruments, Reno, Nevada). Als mobile Phase diente 0,1% Trifluoressigsäure (Laufmittel A) und ACetonitril mit 0,1% Trifluoressigsäure (Laufmittel B). Die Trennungen erfolgten auf einer analytischen Säule (Nucleosil RP-C18, 5 µm, 2 × 100 mm, Grom, Herrenberg).

Dechlorobalhimycin

Für die Detektion der Dechlorobalhimycin-Metabolite wurde ein optimaler Gradient verwendet (Tabelle 4).

Tabelle 4

Optimierter Gradient für die HPLC-MS-Analytik von Dechlorobalhimycin-Derivaten

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zur Halogenierung, dadurch gekennzeichnet, daß eine chemische Verbindung in Gegenwart einer Halogenase halogeniert wird, wobei die Halogenase von der

a) in SEQ ID NO: 1 genannten oder einer aufgrund des degenerierten genetischen Codes davon abgeleiteten Sequenz codiert wird oder von
b) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein funktionelles Fragment von (a) oder
c) einer mit (a) oder (b) unter Standardbedingungen hybridisierenden Sequenz codiert wird oder von einer
d) Sequenz codiert wird, die mit der unter (a) genannten Sequenz eine über 30%ige Identität oder über 60%ige Ähnlichkeit aufweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als chemische Verbindung eine Verbindung der allgemeinen Struktur I verwendet wird:
wobei die Variablen und Substituenten in Formel I folgende Bedeutung haben:
R¹ = Wasserstoff, Hydroxy-, substituiertes oder unsubsti tuiertes, verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₁₀-Alkyl-, C₂-C₁₀-Alkenyl-, C₁-C₁₀-Alkoxy-, C₂-C₁₃-Alkenyloxy-, R⁶R⁷N-,
R² = Wasserstoff, Hydroxy-, substituiertes oder unsubsti tuiertes, verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₁₀-Alkyl, C₁-C₁₀--Alkoxy-, C₂-C₁₀-Alkenyl-, C₂-C₁₀-Alkenyloxy-, R⁶R⁷N-;
R³ = Wasserstoff, Hydroxy-, substituiertes oder unsubsti tuiertes, verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₁₀-Alkyl-, C₁-C₁₀-Alkoxy-, C₂-C₁₀-Alkenyl-, C₂-C₁₀-Alkenyloxy-, C₁-C₁₀--Alkylcarbonyl-, C₂-C₁₀-Alkenylcarbonyl-, Aryl-, Hetaryl-,
R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander Wasserstoff, Hydroxy-, Halogen-, Nitro-, Cyano-, substituiertes oder unsubsti tuiertes, verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₁₀-Alkyl-, C₁-C₁₀-Alkoxy-, C₂-C₁₀-Alkenyl-, C₂-C₂₀-Alkenyloxy-, substituiertes oder unsubstituiertes C₃-C₁₀--Cycloalkyl-, Aryl-, Hetaryl-, R⁶R⁷N- und wobei zwei Reste R⁴ und R⁵ an benachbarten Kohlenstoffatomen zusammen einen weiteren substituierten oder unsubstituierten aromatischen, ge sättigten oder teilweise gesättigten Ring mit 5 bis 6 Atomen im Ring bilden können, der ein oder mehrere Heteroatome wie O, N oder S enthalten kann;
R⁶ und R⁷ unabhängig voneinander Wasserstoff oder substituier tes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₁₀-Alkyl-;
R⁸ = substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₁₀-Alkyl-, C₂-C₁₀-Alkenyl-, substituier tes oder unsubstituiertes Aryl-;
R⁹ = substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₁₀-Alkyl-, C₂-C₁₀-Alkenyl-, substituier tes oder unsubstituiertes Aryl-, Hetaryl-;
X = -CH- oder N;
Y = 0 oder N;
m = 0 oder 1;
n = 0, 1, 2 oder 3;
p = 0 oder 1.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß für das Verfahren ein Mikroorganismus, der eine Halogenase enthält, oder ein freies Enzym verwendet wird.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekenn zeichnet, daß im Verfahren mindestens ein natürlicher oder synthetischer Elektronendonator verwendet wird.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeich net, daß der oder die Elektronendonator(en) im Verfahren in einer weiteren Reaktion regeneriert werden.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekenn zeichnet, daß als Mikroorganismus Bakterien, Pilze, Hefen, pflanzliche oder tierische Zellen verwendet werden.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeich net, daß im Verfahren Organismen der Gattung Amycolatopsis, Nocardia, Rhodococcus, Corynebacterium, Brevibacterium, Clostridium, Micrococcus, Streptomyces, Mycobacterium, Gordona, Actinomyces, Escherichia, Salmonella, Bacillus, Pseudomonas, Hansenula, Candida, Pichia, Rhodotolura, Sporobolomyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Yarrowia, Aspergillus, Beauveria, Canninghamella, Mucor, Neurospora, Penicillium oder Rhizoctonia verwendet werden.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeich net, daß das Verfahren mit ruhenden oder wachsenden Zellen durchgeführt wird.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeich net, daß als Halogendonator anorganische halogenierte Ver bindungen verwendet werden.

10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeich net, daß das Verfahren in Gegenwart eines Puffers oder unter pH kontrollierten Bedingungen durchgeführt wird.

11. Nukleinsäurefragment, enthaltend eine Halogenase,

a) die von der in SEQ ID NO: 1 genannten oder einer aufgrund des degenerierten genetischen Codes davon abgeleiteten Sequenz codiert wird oder
b) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein funktionelles Fragment von (a) oder
c) einer mit (a) oder (b) unter Standardbedingungen hybridisierenden Sequenz codiert oder
d) die für eine Sequenz codiert, die mit der unter (a) genannten Sequenz eine über 30%ige Identität oder über 60%ige Ähnlichkeit aufweist, und

die mit einem oder mehreren homologen oder heterologen Regulationssignalen zur Erhöhung der Genexpression und/oder Proteinexpression funktionell verknüpft ist und/oder dessen natürliche Regulation ausgeschaltet ist.

12. Vektor, enthaltend ein Nukleinsäurefragment gemäß Anspruch 11.

13. Organismus, enthaltend ein Nukleinsäurefragment gemäß Anspruch 11 oder einen Vektor gemäß Anspruch 12.

14. Verwendung eines Proteins, das durch ein Halogenasegen mit der in SEQ ID NO: 1 genannten Sequenz, ein Nuklein säurefragment gemäß Anspruch 11 oder einen Vektor gemäß Anspruch 12 codiert wird, in der chemischen Synthese.