CN103695384A - 一种催化碳-氟和碳-氯键形成的卤化酶 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，涉及通过基因重组技术获得具有催化C-F键和C-Cl键形成的卤化酶。以来源于巴西诺卡菌的卤化酶基因为原始基因，根据卤化酶基因在大肠杆菌体内表达的密码子偏好，进行优化，合成以大肠杆菌为表达宿主的优化卤化酶基因序列；将优化卤化酶基因序列重组到克隆载体pUC57simple，经NdeI和HindⅢ双酶切之后，连接到具有同样内切酶位点的表达载体pET28a(+)片段上，获得表达载体pWHU2401；将表达载体pWHU2401转化大肠杆菌感受态细胞，获得能够异源表达卤化酶的工程菌，放大发酵，纯化，从而获得卤化酶。本发明的卤化酶能够特异性合成5’-FDA，催化活性跟已知的卤化酶FlA活性相当。在加入L-氨基酸氧化酶时，该卤化酶也能催化形成5’-ClDA。

Description

一种催化碳-氟和碳-氯键形成的卤化酶

 

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及通过基因重组技术获得具有催化C-F键和C-Cl键形成的卤化酶。

背景技术

卤化酶是一大类能催化卤素离子（包括F^-，Cl^-，Br^-，I^-）形成稳定碳卤键的酶，从催化的机制来分可以分为血红素依赖、黄素依赖、酮戊二酸依赖、钒依赖以及SAM依赖的卤化酶（C. T. Walsh, Chemistry & Biology, 2008, 15, 99-109），其中又以能催化形成C-F键的卤化酶尤为重要。

有机氟化合物被广泛应用于药物，医学检测，农药以及材料，在药用化合物中引入氟原子往往能提高药物的活性及稳定性。据统计，大约有20 %-30 %的商品药含有氟原子(T. Furuya, et al., Nature, 2011,473, 470-477)，因此，有机含氟化合物越来越被人们所重视。然而，自然界中存在的含氟有机物数量少之又少，只在非洲大陆的少数植物和链霉菌Streptomyces cattleya体内发现少量的高毒含氟化合物。究其原因，是因为在自然界中，CaF₂等含氟无机物溶解性很差，绝大多数是以沉淀的形式存在，因此，氟元素不能被生命体很好的利用。当前，仅仅依靠所发现的极少量的天然含氟有机化合物，是远远不能满足生产和生活的需求的。尽管过去几十年，人们已经开发出一些化学合成有机含氟化合物的方法，但由于氟原子的特殊化学性质，使得这些方法往往要在苛刻、高毒的化学环境中才能完成有机化合物的氟化，而且选择性也不尽人意。

与化学合成相比，酶催化合成的具有催化条件温和，选择性高，绿色环保等优点。目前，酶催化技术已经被广泛应用于化学品，医药中间体的生产。其发展潜力巨大。目前，已知催化氟离子形成C-F键的卤化酶（fluorinase，E.C.2.5.1.63）仅有一例：2002年，O’Hagan等人报道了从链霉菌S. cattleya分离的卤化酶FlA能催化F^-和SAM形成5’-FDA(O’Hagan, et al., Nature, 2001, 416, 279)。通过进一步对FlA纯化和晶体解析，该研究表明，连接N端和C端的环形区域（loop）为F^- 和SAM提供反应所必须的空间区域。FlA第158位的丝氨酸残基对F^-的结合和去溶剂化起到了关键的作用，使得F^-能够选择性亲核进攻SAM的5’位，形成5’-FDA。

发明内容

    本发明所要解决的技术问题在于提供一种催化碳-氟和碳-氯键形成的卤化酶。

为达到上述目的，本发明采用以下技术手段：

首先，以来源于巴西诺卡菌的卤化酶基因为原始基因，根据卤化酶基因在大肠杆菌体内表达的密码子偏好，进行优化，合成以大肠杆菌为表达宿主的优化卤化酶基因序列；

其次，将优化卤化酶基因序列重组到克隆载体pUC57 simple，经NdeI和HindⅢ 双酶切之后，连接到具有同样内切酶位点的表达载体pET28a(+)片段上，获得表达载体pWHU2401；

最后，将表达载体pWHU2401转化大肠杆菌感受态细胞，获得能够异源表达卤化酶的工程菌，放大发酵，纯化，从而获得卤化酶。

本发明还对获得的卤化酶的性能进行了测定，包括最适pH，米氏常数K _m ，转化常数k _cat 和对除F^-以外的其他卤素离子的活性。测定结果显示，我们获得的卤化酶能够特异性合成5’-氟5’-脱氧腺嘌呤核苷（5’-FDA），催化活性跟已知的卤化酶FlA活性相当。在加入L-氨基酸氧化酶时，该卤化酶也能催化形成5’-氯-5’-脱氧腺嘌呤核苷（5’-ClDA）。

本发明中，我们利用基因工程的方法，克隆了来源于巴西诺卡菌的新颖卤化酶基因nobA，通过蛋白表达我们获得了高活性的卤化酶，体外活性测试证实了其能催化氟离子和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）形成5’-FDA（图2）。此外，在氨基氧化酶的存在下，我们发现，NobA还可以催化氯离子和和SAM形成5’-ClDA（图5）。这一发明报道了有史以来的第二例催化碳-氟键形成的卤化酶，填补了国内关于这类酶研究的空白。

附图说明

图1是纯化的卤化酶NobA聚丙烯酰胺SDS-PAGE电泳图。其中1代表蛋白标准分子量，2 代表卤化酶。

图2 是卤化酶对NaF和SAM催化活性的HPLC及质谱检测图。(-)NaF代表不加NaF的对照实验；(-)SAM代表不加SAM的对照实验；(-)NobA代表不加卤化酶的对照实验；NobA reaction代表实验组，5’-FDA代表5’-FDA的HPLC峰。活性测试表明，在SAM和NaF的存在下NobA可以催化形成5’-FDA。

图3 是卤化酶NobA的最适pH优化图。

图4是卤化酶NobA对NaF和SAM的动力学常数测定图。其中A代表NaF的动力学常数图，B代表SAM的动力学常数图。

图5是卤化酶NobA催化NaCl形成5’-ClDA的HPLC及质谱图。

图6 是二价金属离子对卤化酶NobA活性的相对影响图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。

本发明以来源于巴西诺卡菌（Nocardia brasiliensis ，保藏于ATCC，保藏编号 700358）的卤化酶基因为原始基因，根据核苷酸在大肠杆菌体内表达的密码子偏好，进行优化，合成了以大肠杆菌为表达宿主的优化卤化酶基因。选择合适的酶切位点，构建重组质粒，再将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞。并挑选单菌落培养，放大发酵，纯化，获得的卤化酶性能进行了测定，包括催化最适pH，动力学常数，对Cl^- 离子的活性等。

本发明使用的菌株和质粒为：包含来源于巴西诺卡菌的卤化酶nobA基因的质粒nobA/pUC57 simple, 大肠杆菌BL21(DE₃)，质粒pET28a(+)购自TaKaRa，大肠杆菌DH5α购自Invitrogen，BL21 (DE₃)购自Novagen。

本发明使用的酶和试剂为：限制性内切酶（NdeI和HindIII），T4连接酶购自TakaRa公司，所有化学试剂购自Thermo Fisher公司，Santa Cruz公司、上海生物工程股份有限公司、国药集团化学试剂有限公司。

 

本实施例中酶的相关检测项目的测定方法：

1）  酶浓度测定方法（Bradford法）：

取28 μL BSA蛋白质标准液（5 mg/ml）,用1 X PBS稀释至700 μL，终浓度为200 μg/ml。

 

	0	1	2	3	4	5	6	7
									1 × PBS	300	285	270	240	210	180	150	75
稀释的BSA标准液（μL）	0	15	30	60	90	120	150	225
									蛋白终浓度（μg/ml）	0	10	20	40	60	80	100	150

将目标蛋白分别用1×PBS 稀释10倍，50倍，100倍，在酶标板上取2排，各11个孔，分别加入20 μL上述标准蛋白溶液，及100倍，50倍，10倍的目标蛋白溶液。混匀后，室温静置5 min，期间震荡混匀1-2次。

在酶标仪上测各样品的光谱吸收A₅₉₅。

以0-7号BSA标准蛋白的的样品A₅₉₅平均值为纵坐标，对应蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。

根据标准曲线计算NobA蛋白浓度。

2) 酶活性检测

按照邓海等人（Hai Deng, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 759 –762）建立的测定方法，测定酶活性，其具体操作步骤如下：

100 μL体系，磷酸缓冲液（pH 7.5）的浓度为20 mM，SAM浓度为1 mM，NaF浓度为20 mM，卤化酶浓度为5 μM， 26 ℃ 反应，用10 μL 100 %三氯乙酸（TCA）失活蛋白，13000 rpm离心10 min之后上清做HPLC或质谱检测。HPLC条件为：Inertsil ODS-3 色谱柱 (5 μm, 4.6 × 250 mm, GL Science Inc)。进样30μL，流速为1 mL/min，检测波长269 nm，5 % 到20 % 乙腈(v/v) 20 min, 20 % 到 5 % 乙腈 (v/v) 1 min, 然后用5 % 乙腈 (v/v)平衡 4 min。质谱条件为：离子源: HESI，毛细管温度(℃): 300.00，APCI 气化温度 (℃): 40.00，鞘气流速:30.00，辅助器流速: 5.00, 正离子模式, 离子源电压 (kV):     4.00, 源电流 (μA):100.00, 毛细管电压 (V):    35.00, 透镜电压 (V): 110.00。

3)      酶催化最适pH测定方法

100 μL体系，20 mM NaF，1 mM SAM，20 mM不同pH的缓冲液(醋酸钠pH 4.5–5.5, 磷酸钠 pH 6.0–7.0, Tris-HCl pH 7.5–9.0, 甘氨酸–氢氧化钠 pH 9.5–10.0), 5 μM NobA，26 ℃反应30 min，加内标SAH(S-腺苷-L-高半胱氨酸)，HPLC检测。

4)      酶对底物NaF及SAM的动力学常数测定方法：

20 mM磷酸缓冲液（pH 6.5），酶的终浓度为0.2 μM，控制NaF浓度为5mM，SAM浓度从0.1 mM到1 mM变化，每个浓度的反应液每隔10 min取样50 μL，用100 % TCA失活蛋白之后，用SAH作为内标测产物5’-FDA的含量，每个浓度的SAM获得一个速率数值，最后以SAM浓度为横坐标，该浓度下的酶催化反应速率为纵坐标作图，同理，在相同的磷酸缓冲液及酶浓度下，控制SAM的浓度为0.2 mM，F-浓度从1 mM到20 mM变化，分别用Origin计算NaF和SAM的K _m 及K _cat 。

5)      二价金属离子对酶活性影响测定方法：

100 μL体系，20 mM NaF, 1 mM SAM，20 mM Tris-HCl(pH 6.5), 加入1 mM不同的二价金属离子（Mg²⁺, Mn²⁺, Fe²⁺, Cu²⁺ or Zn²⁺），或1 mM EDTA除去金属离子，不加任何金属离子的反应液作为对照组，NobA的浓度为5 μM，26 ℃反应60 min，SAH作内标，HPLC检测。

6)        酶对其他卤素离子（Cl^-, Br^-, I^-）活性：

100 μL体系，20 mM NaCl(或NaBr,NaI)，20 mM磷酸缓冲液，5 μMNobA, 37 ℃反应12 h, SAH作内标，LC-MS检测。

 

实施例1. 确定卤化酶基因序列

1.1  卤化酶原始基因的获得

利用FramePlot 4.0beta(http://nocardia.nih.go.jp/fp4/)和NCBI数据库BLAST方法(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)获得来源于巴西诺卡菌的卤化酶原始基因序列信息（SEQ ID No 1）。

1.2  卤化酶大肠杆菌优化表达序列的获得

将巴西诺卡菌来源的卤化酶基因在金斯瑞生物科技有限公司，利用Optimum Gene^TM算法，进行大肠杆菌优化表达基因的合成，获得与原始序列同一性为82 %的卤化酶基因序列（SEQ ID No 2）。并构建在pUC57 simple质粒上。

 

实施例2. 卤化酶表达质粒的构建

先用限制性内切酶NdeI和HindⅢ对连有卤化酶基因的质粒nobA/pUC57 simple和质粒pET28a(+)进行双酶切，电泳回收900bp的卤化酶DNA片段和pET28a(+)载体大片段，然后用TaKaRa公司T4聚合酶solution I连接载体与片段，16 ℃反应过夜。接着转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并涂布于加入卡那霉素抗生素的LB选择性平板上，37 ℃倒置培养15 h。能在加入卡那霉素的LB平板上长出的可能是转化有重组质粒的转化子，挑选单菌落接种于含有卡那霉素的液体LB培养基，37 ℃，220 rmp摇床培养15 h，对有可能含有卤化酶基因的pET28a(+)质粒进行扩增。然后用质粒抽提试剂盒抽提质粒，并用NdeI和HindIII双酶切进行验证。电泳有900 bp条带的质粒为正确质粒。

 

实施例3. 工程菌的获得

将验证正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE₃)感受态细胞，获得基因工程菌pWHU2401/BL21(DE₃)，最后将获得的工程菌，涂布于加入卡那霉素抗生素的的LB选择性平板上，37 ℃倒置培养约20 h，能在加入卡那霉素抗生素的的LB平板上长出来的就是转化有重组质粒的转化子。

实施例4.工程菌发酵培养

从LB选择性培养平板上挑单菌落，接种3 ml LB液体培养基中，加入卡那霉素，至终浓度为50 μg/ml，于37 ℃，220 rmp摇床培养过夜；

取8 ml培养过夜的培养液，接种至800ml的LB液体培养基中，于37 ℃，220 rpm培养至OD₆₀₀=0.6，菌体冷却至室温，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG), 使终浓度为0.1mM，25 ℃，220 rmp培养10h。

实施例5. 酶的纯化

实施例4培养的菌体6000 rpm，4 ℃离心10 min，菌体重悬于15ml破菌缓冲液（25 mM HEPES, pH 7.5, 300 mM NaCl, 5mM咪唑，10% 甘油），超声破菌，细胞裂解液15000 rpm, 4 ℃, 离心30 min。按照每1L菌液用2 ml Ni-NTA 琼脂糖树脂的比例加入1.6ml Ni-NTA 琼脂糖树脂于细胞裂解上清液中，4 ℃晃动1 h，使蛋白和树脂充分结合。蛋白树脂结合物在重力作用下用不同浓度的咪唑缓冲液A（25 mM HEPES, pH 7.5, 300 mM NaCl, 10 % 甘油）洗脱，收集洗脱液，用12 % 丙烯酰胺SDS-PAGE胶检测蛋白大小及纯度，将纯度大于90 %的蛋白缓冲液合并并回收。纯化之后的卤化酶，按照GE Healthcare公司的操作说明，用PD-10的凝胶柱换到蛋白保存缓冲液B（25 mM HEPES, pH 7.5, 50 mM NaCl, 10 % 甘油），然后用10 KDa(GE Healthcare)超滤管浓缩，之后用液氮速冻保存在-80 ℃。得到的酶序列如SEQ ID No 3所示。

 

实施例6.蛋白浓度测定与蛋白多聚体测定。

牛血清白蛋白作为标准品，会根据Bradford检测法计算。得到浓度为μM的卤化酶。为了测定卤化酶的多聚体，根据不同分子量的标准蛋白（碳酸酐酶 (29 kDa), 牛血清清蛋白(66 kDa), 乙醇脱氢酶(150 kDa), β-淀粉酶(200 kDa), 脱铁铁蛋白 (443 kDa), 和甲状腺球蛋白(669 kDa)在AKTA FPLC 纯化系统 (Amersham Pharmacia Biotech)，Superdex 200 凝胶柱 (Amersham Pharmacia Biotech)的保留时间不同，以及卤化酶蛋白的出峰时间，推测卤化酶蛋白为六聚体。

 

实施例6.纯化后卤化酶的性质测定

参照前述方法，测定酶活性，最适pH，金属离子对酶活性影响，动力学常数，酶对其他卤素离子（Cl^-, Br^-,I^-）的活性。

1.1    酶产量及浓度测定

酶浓度测定方法，见前文提到的“酶浓度测定方法（Bradford法）”，结果为该卤化酶产量为7.9 mg/L, 超滤浓缩之后浓度为187 μM.

6.2 活性测试

酶活性测定方法，见上文提到的“酶活性检测”，测定结果见图2。

如图2显示，该卤化酶可以催化NaF和SAM形成5’-FDA。

6.3最适pH测定

最适pH测定方法，见上文提到的“酶催化最适pH测定方法”，测定结果见图3。

如图3显示，该卤化酶的催化最适pH为6.5。

6.4酶对底物NaF及SAM的动力学常数测定

酶对底物NaF及SAM的动力学常数测定方法，见上文提到的“酶对底物NaF及SAM的动力学常数测定方法”,测定结果见图4。

如图4显示，该卤化酶对底物NaF及SAM的米氏常数K _m 分别为4153 μM, 416 μM。K _cat 分别为0.073 min^-1, 0.139 min^-1。

6.5 酶对其他卤素离子（Cl^-, Br^-, I^-）活性

酶对其他卤素离子（Cl^-, Br^-, I^-）活性测定方法，见上文提到的“酶对其他卤素离子（Cl^-, Br^-, I^-）活性”，测定结果见图5。

如图5显示，该卤化酶对Cl^-活性很低，但在L-氨基酸氧化酶存在下，可以催化C-Cl键生成，但速率很慢。

6.6二价金属离子对酶活性影响

二价金属离子对酶活性影响测定方法，见上文提到的“二价金属离子对酶活性影响测定方法”。测定结果见图6。

如图6显示，Cu²⁺, Fe²⁺, Zn²⁺对该卤化酶活性有较大影响，EDTA能提高该卤化酶的活性，Mg²⁺和Mn²⁺对该卤化酶活性影响不大。

 

综上所述，通过以上步骤获得的卤化酶，能催化NaF或NaCl和SAM形成5’-FDA或5’-ClDA。

Claims (6)

1.一种卤化酶基因，核苷酸序列如SEQ ID No 2所示。

2.一种卤化酶，氨基酸序列如SEQ ID No 3所示。

3.权利要求2所述的卤化酶在催化F^-和SAM形成5’-FDA上的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，反应体系pH为6.5。

5.权利要求2所述的卤化酶和氨基氧化酶在催化氯离子和SAM形成5’-ClDA上的应用。

6.权利要求2所述卤化酶的制备方法，其特征在于：

首先，以来源于巴西诺卡菌的卤化酶基因为原始基因，根据卤化酶基因在大肠杆菌体内表达的密码子偏好，进行优化，合成以大肠杆菌为表达宿主的优化卤化酶基因序列；

其次，将优化卤化酶基因序列重组到克隆载体pUC57 simple，经NdeI和HindⅢ双酶切之后，连接到具有同样内切酶位点的表达载体pET28a(+)片段上，获得表达载体pWHU2401；

最后，将表达载体pWHU2401转化大肠杆菌感受态细胞，获得能够异源表达卤化酶的工程菌，放大发酵，纯化，从而获得卤化酶。

Images