CN1370229A - 含卤化酶的载体和核酸片段,及卤化化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种卤化方法,其包含在有卤化酶参与的情况下卤化化合物,其中该卤化酶是(a)由SEQ ID NO:1中详列的序列,或是一种以遗传密码的简并性为基础,从其得来的序列编码的,或是(b)由一种核酸序列编码的,该核酸序列编码(a)的功能片段,或(c)由一种序列编码的,该序列在标准条件下与(a)或(b)杂交,或是(d)由一种序列编码的,该序列具有与(a)下详列的序列相比,超过30%的同一性或超过60%的相似性。
Description
本发明涉及一种化合物的酶促卤化方法。本发明更进一步涉及含卤化酶或卤化酶基因的核酸片段,载体和生物。
长期以来,卤化反应在化学合成中是已知的。它们用于制备大量卤化的有机化合物。这些合成反应的缺点是需要特殊的植物用于该合成。必须特别保护这些植物不受腐蚀,这是因为反应产物常常是高度腐蚀性的。在合成过程中,不仅形成所需要的产物,而且还常常形成导致污染产物的副产物。如果这些副产物在最终的产物中不被容许,则它们必须经过复杂的除去。此外,许多副产物均是有毒的。二氧芑的形成可发生在许多反应中。
化学卤化的其中一个选择是酶促合成。它通常是高度选择性的,即,通常没有副产物形成。
文献中公开了被称作卤过氧化物酶的酶,其在有卤素离子和过氧化氢参与的情况下卤化有机化合物。这种酶的实施例是来源于生金色链霉菌(Kren等,Liebigs Ann./Red.,1997,11:2379-83),红城红球菌(Schrijver等,Appl.Environ.Microbiol.,1997,63,5:1911-1916),东方拟无枝酸菌(van Wageningen等,Chem.Biol.,1998,5:155-162),烟色卡尔黑霉(Hohaus等,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,1997,36,No.18:2012-2013),变青链霉菌或褐色沙雷氏菌(von Pée,K.H.,Ann.Rev.Microbiol.,1996,50:375-99)的卤过氧化物酶。
卤化反应到底是这些卤过氧化物酶的真实酶促反应,还是它仅仅是一个副反应还不完全清楚。该酶经常显示较低的底物和共同底物亲和力,及对于酶较低的特异性。
除卤过氧化物酶之外,文献中还公开了其它卤化酶。因而,Kirner等(J.Bacteriol.,1998,Vol.180,No.7,p.1939-1943)和Hohaus等(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,1997,36,No.18,2012-2013)描述了一种卤化酶,其将氯原子引入到色氨酸的7位中。
此外,在Hammer等(Appl.Environ.Microbiol.,1997,Vol.63,No.6,2147-2154),de Schrijver等(Appl.Environ.Microbiol.,1997,Vol.63,No.5,1911-1916),Nowak-Thompson等(J.Bacteriol.,1999,181:2166-2174),Solenberg等(Chem.Biol.,4,1997:195-202)和Dairi等(Biosci.,Biotechnol.Biochem.59,1995,1099-1106)中描述了更多的酶。
在GenBank中发现了一9.9kb长的地中海拟无枝酸菌DNA的片段(Y16952)。Pelzer等描述了GenBank记录中的此DNA的两个功能。它编码加氧酶和糖基转移酶。其中没有提到其它功能。
以前,还没有酶用于卤化的有机化合物的工业制备。因此本发明的一个目的是提供一种用于工业合成卤化的有机化合物的酶。
我们已经发现,此目的可以通过本发明的卤化方法而达到,该方法包含在有卤化酶参与的情况下卤化化合物,其中该卤化酶是(a)由SEQ ID NO:1中详列的序列,或是一种以遗传密码的简并性为基础,从其得来的序列编码的,或是(b)由一种核酸序列编码的,该核酸序列编码(a)的功能片段,或(c)由一种序列编码的,该序列在标准条件下与(a)或(b)杂交,或是(d)由一种序列编码的,该序列具有与(a)下详列的序列超过30%的同一性或超过60%的相似性(hnlichkeit)。
用于本发明方法中的卤化酶可以按照技术人员已知的方法从生物体中分离。优选地,它可以从合成卤化化合物,例如糖肽抗生素的生物体中分离。这种生物体的实施例可以在细菌和,真核生物如藻类,像Ascophyllum或Synechocystis,地衣,真菌如卡尔黑霉属,酵母和,细菌如革兰氏阳性菌,像放线菌目,芽孢杆菌目或革兰氏阴性菌如假单胞菌属中找到。卤化酶还可以从诺卡菌形放线菌纲或链霉菌纲中分离。
可以且特别优选从产生糖肽抗生素的假诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)家族成员,和相关的细菌中,如假诺卡氏菌属(Pseudoncardia),糖单孢菌属(Saccharomonospora),糖多孢菌属(Saccharopolyspora),无枝酸菌属(Amycolatopsis),热密卷菌属(Thermocrispum),Pseudoamycolata,拟孢囊菌属(Kibdelosporangium),假诺卡氏菌属(Amycolata),放线多孢菌属(Actiopolyspora),放线动孢菌属(Actinokineospora)或双孢放线菌属中分离卤化酶(在下文和申请中,认为单数和复数是同义词),所提到的实施例是下列属和种,即地中海拟诺卡氏菌(Nocardiamediterranei),地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediter βanei),地中海拟链霉菌(Streptomyces mediterranei),诺卡氏菌(Nocardia Spec.),拟无枝酸菌(Amycolatopsis spec.),拟链霉菌(Streptomyces spec.),东方拟诺卡氏菌(Nocardia orientalis),东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis),东方拟链霉菌(Streptomyces orientalis),丰加链霉菌(Streptomyces toyocaensis)或绿产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)。特别优选是由东方拟无枝酸菌C329.4,A82846和ATCC19795和地中海拟无枝酸菌DSM 5908生产的。该酶还可从链霉菌属,特别是地中海拟链霉菌生物中分离。
此外,卤化酶或编码卤化酶的核酸可以从红球菌属(Rhodococcus),高温单孢菌属(Thermomonospora),芽孢杆菌属(Bacillus),沙雷氏菌属(Serratia),链霉菌属(Actinosporangium),马杜拉放线菌属(Actinomadura),游动放线菌属(Actinoplanes)或小单孢菌属(Micromonospora)中分离出来。
卤化酶的基因可以用技术人员已知的各种技术从这些生物体的基因文库中分离出来。这些技术其中之一是,例如,经由与SEQ ID NO:1中详列的序列或此序列的一部分杂交,而从基因文库“钓取”基因。
在教科书,例如Sambrook,J.等(1989)Molecular cloning:Alaboratory manual,Cold Spring,Harbor Laboratory Press,F.M.Ausubel等(1994)Current protocols in molecularbiology,John Wiley和Sons,或D.M.Glover等,DNA Clong,Vol.1(1995),IRL Press(ISBN 019-963476-9)中找到了适当的试验方案。所提及的其它方法是PCR克隆技术(见实施例)。
Pelzer等(J.Biotechnol.,56[1997],115-128)在第2.4节中描述了地中海拟无枝酸菌基因(DNA)文库的制备。其它生物的更多方法对于技术人员来说是已知的,且可以在教科书,如Sambrook等(1989)中找到。
原则上,所有含至少一个卤化酶基因复制的生物体均可用于本发明的方法中。
这些可以是天然包含基因的生物,或包含克隆形式基因的生物。此外,可能基因已经引入到天然宿主生物或其它生物中去了。
优选使用的宿主生物是对有机溶剂,所反应的物质,升高温度和改变压力具有有利的,符合要求的,且高度耐受性的那些。有效使用的生物体是其中至少引入一种卤化酶基因的那些。
事实上,在动物,植物和细菌界的所有领域内均可以找到满足这些和其它有效条件的宿主。
宿主生物的有利微生物可以在真菌,酵母和细菌中找到。
适于本发明方法的原核宿主生物原则上是所有革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。革兰氏阴性菌的实施例是肠杆菌科,如埃希氏菌属,气杆菌属,肠杆菌属,柠檬酸杆菌属,志贺氏菌属,克雷伯氏菌属,沙雷氏菌属,欧文氏菌属或沙门氏菌属,或假单胞菌科,如假单胞菌属,黄单胞菌属,伯克霍尔德氏菌属,葡糖菌属,亚硝化单胞菌属,硝化杆菌属,甲烷单胞菌属,丛毛单胞菌属,纤维单胞菌属或醋杆菌属。
革兰氏阳性菌的实施例可以是形成内孢子的革兰氏阳性需氧或厌氧菌,如芽孢杆菌属,芽孢乳杆菌属或梭菌属,coryneform细菌,如节杆菌属,纤维单胞菌属,短小杆菌属,棒杆菌属,短杆菌属,微杆菌属,库特氏杆菌属或放线菌目如假单胞菌科,链霉菌科,诺卡氏菌科,如分枝杆菌属,红球菌属,链霉菌属,诺卡氏菌属,无枝酸菌属,假诺卡氏菌属,糖单胞菌属,糖多胞菌属,热密卷菌属。优选使用的细菌是埃希氏菌属,沙门氏菌属,假单胞菌属,丛毛单胞菌属,芽孢杆菌属,梭菌属,棒杆菌属,短杆菌属,链霉菌属,放线菌属,分枝杆菌属,Gordona,微球菌属,红球菌属,诺卡氏菌属或无枝酸菌属的那些。
特别优选使用的属和种是如大肠埃希氏菌,鼠伤寒沙门氏菌,门多萨假单胞菌,铜绿假单胞菌,易变假单胞菌,绿针假单胞菌,荧光假单胞菌,食酸丛毛单胞菌,睾丸酮丛毛单胞菌,枯草芽孢杆菌,球形芽孢杆菌,嗜热脂肪芽孢杆菌,短小芽孢杆菌,地衣芽孢杆菌,解淀粉芽孢杆菌,巨兽芽孢杆菌,蜡样芽孢杆菌,苏云金芽孢杆菌,sp.链霉菌,变青链霉菌,地中海拟无枝酸菌,东方拟无枝酸菌,地中海拟诺卡氏菌,东方拟无枝酸菌的那些。
有效使用的生物体是用于下列情况的那些,即其中需引入遗传信息的方法是已经得到的,如埃希氏菌属,芽孢杆菌属,假单胞菌属,链霉菌属,诺卡氏菌属或无枝酸菌属。
由于校正了错误的属和种的名称,因而上述属的分类学位置在近些年中已经发生了较大的变化,且仍然在变化。由于在细菌分类内所述属的分类学重新组合,其在过去常常是必需的,还适于本发明方法的是除了上述那些之外的科,属,种,其均用于分离卤化酶或卤化酶基因,并用于引入DNA的原始生物。
原则上,本发明方法中的适当真核宿主生物是所有的生物,如真菌,酵母,植物,植物细胞或动物细胞。优选的酵母可以是红酵母属,Yarrowia,掷孢酵母属,假丝酵母属,汉逊氏酵母属,毕赤氏酵母属,糖酵母属或裂殖糖酵母属。特别优选的属和种是深红酵母,胶粘红酵母,纤细红酵母,Yarrowia lipolytica,赭色掷孢酵母,shibatanus掷孢酵母,啤酒糖酵母,博伊丁氏假丝酵母,bombicola假丝酵母,cylindracea假丝酵母,近平滑假丝酵母,皱摺假丝酵母,热带假丝酵母,甲醇毕赤氏酵母或巴斯德毕赤氏酵母。
真菌的实施例是曲霉属,Canninghamella,白僵菌属,毛霉菌属,脉孢霉属,青霉属或丝核菌属。有效用于本发明方法中的真菌是下列的属和种:泡盛曲霉,白色曲霉,无花果曲霉,黄曲霉,黑曲霉,土曲霉,白僵菌,brongniartii白僵菌,densa白僵菌,雪白白僵菌,米赫毛霉,鲁克氏毛霉,sp.毛霉,粗糙脉孢菌,产黄青霉,特异青霉,repens丝核菌或茄属丝核菌。
植物,如Arabidopsis thaliana或Lavendula vera也是适宜的。植物细胞培养物,来源于植物的原生质体,或愈伤组织培养物是特别优选的。
在本发明的方法中,上述化合物是在有卤化酶参与的情况下转化成相应的卤化化合物的。
这种情况中的卤化酶是(a)由SEQ ID NO:1中详列的序列编码的,或是一种以遗传密码的简并性为基础,从其得来的序列编码的,或是(b)由一种核酸序列编码的,该核酸序列编码(a)的功能片段,或(c)由一种序列编码的,该序列在标准条件下与(a)或(b)杂交,或是(d)由一种序列编码的,该序列具有与(a)下详列的序列超过30%的同一性或超过60%的相似性。
在(a)和(d)下详列的这些序列原则上可通过技术人员已知的方法将其引入到生物体中,例如可使用基因枪或微量注射,通过转化,转染,电穿孔将它们引入到生物体或其细胞中。适于微生物的方法可由技术人员在教科书中找到,如Sambrook,J.等(1989)Molecularcloning:A laboratory manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,F.M.Ausubel等(1994)Current protocols in molecularbiology,John Wiley和Sons,D.M.Glover等,DNA CloningVol.1,(1995),IRL Press(ISBN 019-963476-9),Kaiser等(1994)Methods in Yeast Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press或Guthrie等Guide to Yeast Genetics和MolecularBiology,Methods in Enzymology,1994,Academic Press。
外源基因到植物基因组中的转移也被称作转化。在这种情况中,可使用所述的转化方法和为了瞬时或稳定的转化,而使来源于植物组织或植物细胞的植物再生的方法。适当的方法是用聚乙二醇-诱导的DNA摄取,利用基因枪,电穿孔,在含DNA的溶液中培养干胚胎,微量注射和土壤杆菌属介导的基因转移来转化原生质体。所述方法在B.Jenes等,Techniques for Gene Transfer,in:TransgenicPlants,Vol.1,Engineering and Utilization,edited by S.D.Kung和R.Wu,Academic Press(1993),128-143,和Potrykus,Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225中描述。优选将所表达的构造克隆成适于转化根癌土壤杆菌,例如pBin19的载体(Bevan等,Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。Hfgen和Willmitzer,Mucl.Acids Res.(1988)16,9877描述了用根癌土壤杆菌转化植物的方法。
通过技术人员已知的方法可使基因修饰的植物细胞再生。适当的方法可以在上述S.D.Kung和R.Wu,Potrykus或Hfgen和Willmitzer的出版物中找到。
此外,引入到生物体中的核酸可作为染色体外遗传因子存在于生物体中,或被整合到基因组中。
通过异源或同源重组,可以整合到基因组中。
有利地,核酸连同至少一种报道基因一起被克隆成引入到生物体中的DNA构造。通过生长,荧光,化学发光或生物发光测定法,或通过光度测量可以很容易地检测此报道基因。报道基因的实施例是水解酶基因,荧光蛋白基因,生物发光基因,葡萄糖甙酶基因,过氧化物基因或以下基因,如荧光素酶基因,β-半乳糖苷酶基因,gfp基因,脂肪酶基因,酯基因,过氧化物酶基因,β-内酰胺酶基因,乙酰基转移酶,磷酸转移酶或腺嘌呤基转移酶基因。这些基因可以很容易地测量并量化转录活性,且因而表达基因。
代替报道基因或基因,然而,也可以有效地使用抗生素或其它抗性基因或生物合成基因。
Pelzer等描述了一种相对于糖肽抗生素-生产者地中海拟无枝酸菌,特别是相对于菌株DSM5908的特异性基因克隆系统。
Pelzer等描述了一种改进的,引入DNA的直接转化方法。DNA摄取的效率取决于培养物的寿命。使用来源于较早的稳定期(52-55小时)的菌丝体可以获得最好的结果。Pelzer等(J.Biotechnol.56[1997],115-128)的文章在此引入作为参考。
其它将核酸引入到放线菌纲,如链霉菌纲中的方法是接合(Muth,G.,Brolle,D.F.,Wohlleben,W.,1999,Genetics ofStreptomyces.In“Manual of Industrial Microbiology andBiotechnology”,Eds.Demain,A.L.和Davies,J.E.,ASM Press,Washington,D.C.),和PEG-诱导的原生质体转化(Hopwood,D.A.等,1985,Genetic manipulation of Streptomyces;a laboratorymanual,The John Innes Foundation,Norwich,U.K.和W.Wohlleben和G.Muth,1993,Streptomyces plasmid vectors,p.147-175,InK.G.Harley,ed.,Plasmids:A practical approach,OxfordWohlleben,W.,1999,见上面)。如技术人员所熟知的那样,所有的方法均可以很容易地应用到其它放线菌目的菌株上。
为了回避常存在于放线菌纲中的强限制系统,可在真正的转化之前,在有或没有噬菌体f1起源参与的情况下,通过热变性(Hillemann等,1991,Nucleic Acids Res.194,727-731),或通过碱变性/复性(Oh和Chater,1997,J.Bacteriol.,179,122-127)将已经转移的核酸转化成单-链DNA。
为了避免宿主生物体的限制,特别有利地,可以通过大肠埃希氏菌与放线菌纲的接合,用放线菌纲转化DNA。甚至稀有的放线菌属的菌株也可以在此方法中使用(Baltz,R.H.,1998,Trends inMicrobiology,6,76,83,Flett等,1997,FEMS Microbiol.Lett.,155,223-229)。也可以通过电穿孔将核酸引入到放线菌属的菌株中(Muth,G.,Brolle,D.F.,Wohlleben,W.,1999,见上述;English等,1998,J.Ind.Microbiology and Biotechnology,21,219-224;R.等,1991,Appl.Environ.Microbiol.57,665-671)。上述也可以由electroduction作为电穿孔的有效变体而产生。通过使用穿梭载体的电穿孔可快速直接地将DNA从大肠埃希氏菌转移到放线菌纲(Muth,G.,Brolle,D.F.,Wohlleben,W.,1999)中。
除了单细胞之外,也可以通过加入CaCl2,小牛胸腺DNA和PEG,在无枝酸菌属和诺卡氏菌属中转化菌丝体(Pelzer等,1997;MadonJ.和R.Hütter,1991,J.Bacteriol.,173,6325-6331,Vrijbloed,J.W.等,1995,Plasmid 34,96-104;Kumar,C.V.等,1995,Appl.Environ.Microbiol.60,4086-4093)。
编码方法(a)功能片段的核酸序列比(a)要短,但仍然具有酶活性。这些序列可能已经在序列的3’或5’端被截断了。在读框中的编码序列内被删除的那部分可能没有失去酶活性。
与序列(a)相比,通常,截断5-30%,优选10-20%的该功能片段。比序列(a)长的序列在理论上也是可理解的。
在标准条件下与(a)和(b)中详列的序列杂交的序列指的是,例如,在42-58℃,具有0.1-5×SSC(1×SSC 0.15M NaCl,15mM柠檬酸钠;pH7.2)浓度的缓冲液中,或附带地在有50%甲酰胺参与的情况下,如42℃,在5×SSC和50%甲酰胺中杂交的序列。
DNA杂交的试验条件可以在相关的遗传学教科书,如Sambrook等,“Molecular Cloning”,Cold Spring Harbor Laboratory,1989中找到。
可使用至少20-25个核苷酸长的短特异性寡核苷酸杂交。至少含25个核苷酸的是优选使用的。然而,使用含50-200个核苷酸的较长寡核苷酸,或甚至直到整个核酸序列的更长部分[见(a)和(b)]也是可能的且有利的。
本发明方法中的核酸指的是,例如,DNA,cDNA,RNA或mRNA。它们还包括这些核酸序列的同系物。
同系物是指,例如,真核或原核同系物,截断的序列或单链DNA。这些可能与编码或非编码序列同源。
也可以在本发明的方法中使用卤化酶,该卤化酶是由这样一种序列编码的,其与SEQ ID NO:1中详列的序列,在来源于该序列的氨基酸整个长度上,具有超过30%,优选50%,特别优选60%,尤其特别优选超过95%的同一性,或超过60%,优选70%,特别优选80%,尤其特别优选97%的相似性(Blast-Programm,W.Gish und D.J.States,Nat.Genet.,3,1993:266-272)。
这些序列是通过核苷酸的缺失,插入和/或置换从SEQ ID NO:1获得的,且在此情况和所有其它情况中,保留来源于该序列的卤化酶蛋白的酶活性。
在本发明的方法中,可使用上述卤化酶有效地转化下列通式结构I的化合物:其中通式I中的变量和取代基具有下列含义:R1=氢,羟基,取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷基,C2-C10链烯基,C1-C10烷氧基,C2-C10链烯氧基,R6R7N-,
R2=氢,羟基,取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷基,C1-C10烷氧基,C2-C10链烯基,C2-C10链烯氧基,R6R7N-;R3=氢,羟基,取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷基,C1-C10烷氧基,C2-C10链烯基,C2-C10链烯氧基,C1-C10烷基羰基,C2-C10链烯基羰基,芳基,杂芳基,R4和R5彼此独立地是氢,羟基,卤素,硝基,氰基,取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷基,C1-C10烷氧基,C2-C10链烯基,C2-C10链烯氧基,取代或未取代的C3-C10环烷基,芳基,杂芳基,R6R7N-,且其中两个基团R4和R5上的相邻碳原子可以共同形成另一取代或未取代的,芳香的,饱和或部分饱和的具有5-6个原子的环,该环中还可以包含一个或多个杂原子如O,N或S;R6和R7彼此独立地是氢或取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷基;R8=取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷基,C2-C10链烯基,取代或未取代的芳基;R9=取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷基,C2-C10链烯基,取代或未取代的芳基,杂芳基;X=-CH-或N;Y=O或N;m=0或1;n=0,1,2或3;p=0或1。
通常,反应所需的卤原子存在于反应溶液中。然而,可将卤素供体加入到反应溶液中。
原则上,可以使用所有含卤素的有机化合物或无机化合物作为卤素的供体。为了更简便且节省开支,无机化合物是优选的。卤素最好是以其盐的形式加入到反应溶液中的。其实施例是卤素的碱盐和/或碱土金属盐。
烷基可以是取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷基链,如甲基,乙基,正-丙基,1-甲基乙基,正-丁基,1-甲基丙基,2-甲基丙基,1,1-二甲基乙基,正-戊基,1-甲基丁基,2-甲基丁基,3-甲基丁基,2,2-二甲基丙基,1-乙基丙基,正-己基,1,1,-二甲基丙基,1,2-二甲基丙基,1-甲基戊基,2-甲基戊基,3-甲基戊基,4-甲基戊基,1,1-二甲基丁基,1,2-二甲基丁基,1,3-二甲基丁基,2,2-二甲基丁基,2,3-二甲基丁基,3,3-二甲基丁基,1-乙基丁基,2-乙基丁基,1,1,2-三甲基丙基,1,2,2-三甲基丙基,1-乙基-1-甲基丙基,1-乙基-2-甲基丙基,正-庚基,正-辛基,正-壬基或正-癸基。甲基,乙基,正-丙基,正-丁基,异-丙基或异-丁基是优选的。甲基和乙基是特别优选的。
链烯基可以是取代或未取代的,支链或无支链的C2-C10链烯基链,如乙烯基,丙烯基,1-丁烯基,2-丁烯基,3-丁烯基,2-甲基丙烯基,1-戊烯基,2-戊烯基,3-戊烯基,4-戊烯基,1-甲基-1-丁烯基,2-甲基-1-丁烯基,3-甲基-1-丁烯基,1-甲基-2-丁烯基,2-甲基-2-丁烯基,3-甲基2-丁烯基,1-甲基-3-丁烯基,2-甲基-3-丁烯基,3-甲基-3-丁烯基,1,1-二甲基-2-丙烯基,1,2-二甲基-1-丙烯基,1,2-二甲基-2-丙烯基,1-乙基-1-丙烯基,1-乙基-2-丙烯基,1-己烯基,2-己烯基,3-己烯基,4-己烯基,5-己烯基,1-甲基-1-戊烯基,2-甲基-1-戊烯基,3-甲基-1-戊烯基,4-甲基-1-戊烯基,1-甲基-2-戊烯基,2-甲基-2-戊烯基,3-甲基-2-戊烯基,4-甲基-2-戊烯基,1-甲基-3-戊烯基,2-甲基-3-戊烯基,3-甲基-3-戊烯基,4-甲基-3-戊烯基,1-甲基-4-戊烯基,2-甲基-4-戊烯基,3-甲基-4-戊烯基,4-甲基-4-戊烯基,1,1-二甲基-2-丁烯基,1,1-二甲基-3-丁烯基,1,2-二甲基-1-丁烯基,1,2-二甲基-2-丁烯基,1,2-二甲基-3-丁烯基,1,3-二甲基-1-丁烯基,1,3-二甲基-2-丁烯基,1,3-二甲基-3-丁烯基,2,2-二甲基-3-丁烯基,2,3-二甲基-1-丁烯基,2,3-二甲基-2-丁烯基,2,3-二甲基-3-丁烯基,3,3-二甲基-1-丁烯基,3,3-二甲基-2-丁烯基,1-乙基-1-丁烯基,1-乙基-2-丁烯基,1-乙基-3-丁烯基,2-乙基-1-丁烯基,2-乙基-2-丁烯基,2-乙基-3-丁烯基,1,1,2-三甲基-2-丙烯基,1-乙基-1-甲基-2-丙烯基,1-乙基-2-甲基-1-丙烯基,1-乙基-2-甲基-2-丙烯基,1-庚烯基,2-庚烯基,3-庚烯基,4-庚烯基,5-庚烯基,6-庚烯基,1-辛烯基,2-辛烯基,3-辛烯基,4-辛烯基,5-辛烯基,6-辛烯基,7-辛烯基,1-壬烯基,2-壬烯基,3-壬烯基,4-壬烯基,5-壬烯基,6-壬烯基,7-壬烯基,8-壬烯基,1-癸烯基,2-癸烯基,3-癸烯基,4-癸烯基,5-癸烯基,6-癸烯基,7-癸烯基,8-癸烯基,或9-癸烯基,及其支链同系物。
烷氧基可以是取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷氧基链,如甲氧基,乙氧基,丙氧基,1-甲基乙氧基,丁氧基,1-甲基丙氧基,2-甲基丙氧基,1,1-二甲基乙氧基,戊氧基,1-甲基丁氧基,2-甲基丁氧基,3-甲基丁氧基,1,1-二甲基丙氧基,1,2-二甲基丙氧基,2,2-二甲基丙氧基,1-乙基丙氧基,己氧基,1-甲基戊氧基,2-甲基戊氧基,3-甲基戊氧基,4-甲基戊氧基,1,1-二甲基丁氧基,1,2-二甲基丁氧基,1,3-二甲基丁氧基,2,2-二甲基丁氧基,2,3-二甲基丁氧基,3,3-二甲基丁氧基,1-乙基丁氧基,2-乙基丁氧基,1,1,2-三甲基丙氧基,1,2,2-三甲基丙氧基,1-乙基-1-甲基丙氧基,1-乙基-2-甲基丙氧基,己基氧,庚基氧,辛基氧,壬基氧或癸基氧及其支链同系物。
链烯氧基可以是取代或未取代的,支链或无支链的C2-C10链烯氧基链,如乙烯氧基,丙烯氧基,1-丁烯氧基,2-丁烯氧基,3-丁烯氧基,2-甲基丙烯氧基,1-戊烯氧基,2-戊烯氧基,3-戊烯氧基,4-戊烯氧基,1-甲基-1-丁烯氧基,2-甲基-1-丁烯氧基,3-甲基-1-丁烯氧基,1-甲基-2-丁烯氧基,2-甲基-2-丁烯氧基,3-甲基-2-丁烯氧基,1-甲基-3-丁烯氧基,2-甲基-3-丁烯氧基,3-甲基-3-丁烯氧基,1,1-二甲基-2-丙烯氧基,1,2-二甲基-1-丙烯氧基,1,2-二甲基-2-丙烯氧基,1-乙基-1-丙烯氧基,1-乙基-2-丙烯氧基,1-己烯氧基,2-己烯氧基,3-己烯氧基,4-己烯氧基,5-己烯氧基,1-甲基-1-戊烯氧基,2-甲基-1-戊烯氧基,3-甲基-1-戊烯氧基,4-甲基-1-戊烯氧基,1-甲基-2-戊烯氧基,2-甲基-2-戊烯氧基,3-甲基-2-戊烯氧基,4-甲基-2-戊烯氧基,1-甲基-3-戊烯氧基,2-甲基-3-戊烯氧基,3-甲基-3-戊烯氧基,4-甲基-3-戊烯氧基,1-甲基-4-戊烯氧基,2-甲基-4-戊烯氧基,3-甲基-4-戊烯氧基,4-甲基-4-戊烯氧基,1,1-二甲基-2-丁烯氧基,1,1-二甲基-3-丁烯氧基,1,2-二甲基-1-丁烯氧基,1,2-二甲基-2-丁烯氧基,1,2-二甲基-3-丁烯氧基,1,3-二甲基-1-丁烯氧基,1,3-二甲基-2-丁烯氧基,1,3-二甲基-3-丁烯氧基,2,2-二甲基-3-丁烯氧基,2,3-二甲基-1-丁烯氧基,2,3-二甲基-2-丁烯氧基,2,3-二甲基-3-丁烯氧基,3,3-二甲基-1-丁烯氧基,3,3-二甲基-2-丁烯氧基,1-乙基-1-丁烯氧基,1-乙基-2-丁烯氧基,1-乙基-3-丁烯氧基,2-乙基-1-丁烯氧基,2-乙基-2-丁烯氧基,2-乙基-3-丁烯氧基,1,1,2-三甲基-2-丙烯氧基,1-乙基-1-甲基-2-丙烯氧基,1-乙基-2-甲基-1-丙烯氧基,1-乙基-2-甲基-2-丙烯氧基,1-庚烯氧基,2-庚烯氧基,3-庚烯氧基,4-庚烯氧基,5-庚烯氧基,6-庚烯氧基,1-辛烯氧基,2-辛烯氧基,3-辛烯氧基,4-辛烯氧基,5-辛烯氧基,6-辛烯氧基,7-辛烯氧基,1-壬烯氧基,2-壬烯氧基,3-壬烯氧基,4-壬烯氧基,5-壬烯氧基,6-壬烯氧基,7-壬烯氧基,8-壬烯氧基,1-癸烯氧基,2-癸烯氧基,3-癸烯氧基,4-癸烯氧基,5-癸烯氧基,6-癸烯氧基,7-癸烯氧基,8-癸烯氧基,9-癸烯氧基,及其支链同系物。
所述R1的取代基原则上是所有可想到的取代基,其不会阻碍卤化酶的反应,例如一种或多种取代基,如卤素,如氟,氯或溴,氰基,硝基,氨基,羟基,烷基,环烷基,芳基,烷氧基,苄氧基,苯基或苄基。
通式I和II化合物中的R2是氢,羟基,取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷基,C1-C10烷氧基,C2-C10链烯基,C2-C10链烯氧基,R6R7N-;
烷基可以是取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷基链,如甲基,乙基,正-丙基,1-甲基乙基,正-丁基,1-甲基丙基,2-甲基丙基,1,1-二甲基乙基,正-戊基,1-甲基丁基,2-甲基丁基,3-甲基丁基,2,2-二甲基丙基,1-乙基丙基,正-己基,1,1,-二甲基丙基,1,2-二甲基丙基,1-甲基戊基,2-甲基戊基,3-甲基戊基,4-甲基戊基,1,1-二甲基丁基,1,2-二甲基丁基,1,3-二甲基丁基,2,2-二甲基丁基,2,3-二甲基丁基,3,3-二甲基丁基,1-乙基丁基,2-乙基丁基,1,1,2-三甲基丙基,1,2,2-三甲基丙基,1-乙基-1-甲基丙基,1-乙基-2-甲基丙基,正-庚基,正-辛基,正-壬基或正-癸基。甲基,乙基,正-丙基,正-丁基,异-丙基或异-丁基是优选的。
链烯基可以是取代或未取代的,支链或无支链的C2-C10链烯基链,如乙烯基,丙烯基,1-丁烯基,2-丁烯基,3-丁烯基,2-甲基丙烯基,1-戊烯基,2-戊烯基,3-戊烯基,4-戊烯基,1-甲基-1-丁烯基,2-甲基-1-丁烯基,3-甲基-1-丁烯基,1-甲基-2-丁烯基,2-甲基-2-丁烯基,3-甲基2-丁烯基,1-甲基-3-丁烯基,2-甲基-3-丁烯基,3-甲基-3-丁烯基,1,1-二甲基-2-丙烯基,1,2-二甲基-1-丙烯基,1,2-二甲基-2-丙烯基,1-乙基-1-丙烯基,1-乙基-2-丙烯基,1-己烯基,2-己烯基,3-己烯基,4-己烯基,5-己烯基,1-甲基-1-戊烯基,2-甲基-1-戊烯基,3-甲基-1-戊烯基,4-甲基-1-戊烯基,1-甲基-2-戊烯基,2-甲基-2-戊烯基,3-甲基-2-戊烯基,4-甲基-2-戊烯基,1-甲基-3-戊烯基,2-甲基-3-戊烯基,3-甲基-3-戊烯基,4-甲基-3-戊烯基,1-甲基-4-戊烯基,2-甲基-4-戊烯基,3-甲基-4-戊烯基,4-甲基-4-戊烯基,1,1-二甲基-2-丁烯基,1,1-二甲基-3-丁烯基,1,2-二甲基-1-丁烯基,1,2-二甲基-2-丁烯基,1,2-二甲基-3-丁烯基,1,3-二甲基-1-丁烯基,1,3-二甲基-2-丁烯基,1,3-二甲基-3-丁烯基,2,2-二甲基-3-丁烯基,2,3-二甲基-1-丁烯基,2,3-二甲基-2-丁烯基,2,3-二甲基-3-丁烯基,3,3-二甲基-1-丁烯基,3,3-二甲基-2-丁烯基,1-乙基-1-丁烯基,1-乙基-2-丁烯基,1-乙基-3-丁烯基,2-乙基-1-丁烯基,2-乙基-2-丁烯基,2-乙基-3-丁烯基,1,1,2-三甲基-2-丙烯基,1-乙基-1-甲基-2-丙烯基,1-乙基-2-甲基-1-丙烯基,1-乙基-2-甲基-2-丙烯基,1-庚烯基,2-庚烯基,3-庚烯基,4-庚烯基,5-庚烯基,6-庚烯基,1-辛烯基,2-辛烯基,3-辛烯基,4-辛烯基,5-辛烯基,6-辛烯基,7-辛烯基,1-壬烯基,2-壬烯基,3-壬烯基,4-壬烯基,5-壬烯基,6-壬烯基,7-壬烯基,8-壬烯基,1-癸烯基,2-癸烯基,3-癸烯基,4-癸烯基,5-癸烯基,6-癸烯基,7-癸烯基,8-癸烯基,或9-癸烯基,及其支链同系物。
烷氧基可以是取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷氧基链,如甲氧基,乙氧基,丙氧基,1-甲基乙氧基,丁氧基,1-甲基丙氧基,2-甲基丙氧基,1,1-二甲基乙氧基,戊氧基,1-甲基丁氧基,2-甲基丁氧基,3-甲基丁氧基,1,1-二甲基丙氧基,1,2-二甲基丙氧基,2,2-二甲基丙氧基,1-乙基丙氧基,己氧基,1-甲基戊氧基,2-甲基戊氧基,3-甲基戊氧基,4-甲基戊氧基,1,1-二甲基丁氧基,1,2-二甲基丁氧基,1,3-二甲基丁氧基,2,2-二甲基丁氧基,2,3-二甲基丁氧基,3,3-二甲基丁氧基,1-乙基丁氧基,2-乙基丁氧基,1,1,2-三甲基丙氧基,1,2,2-三甲基丙氧基,1-乙基-1-甲基丙氧基,1-乙基-2-甲基丙氧基,己基氧,庚基氧,辛基氧,壬基氧或癸基氧及其支链同系物。
链烯氧基可以是取代或未取代的,支链或无支链的C2-C10链烯氧基链,乙烯氧基,丙烯氧基,1-丁烯氧基,2-丁烯氧基,3-丁烯氧基,2-甲基丙烯氧基,1-戊烯氧基,2-戊烯氧基,3-戊烯氧基,4-戊烯氧基,1-甲基-1-丁烯氧基,2-甲基-1-丁烯氧基,3-甲基-1-丁烯氧基,1-甲基-2-丁烯氧基,2-甲基-2-丁烯氧基,3-甲基-2-丁烯氧基,1-甲基-3-丁烯氧基,2-甲基-3-丁烯氧基,3-甲基-3-丁烯氧基,1,1-二甲基-2-丙烯氧基,1,2-二甲基-1-丙烯氧基,1,2-二甲基-2-丙烯氧基,1-乙基-1-丙烯氧基,1-乙基-2-丙烯氧基,1-己烯氧基,2-己烯氧基,3-己烯氧基,4-己烯氧基,5-己烯氧基,1-甲基-1-戊烯氧基,2-甲基-1-戊烯氧基,3-甲基-1-戊烯氧基,4-甲基-1-戊烯氧基,1-甲基-2-戊烯氧基,2-甲基-2-戊烯氧基,3-甲基-2-戊烯氧基,4-甲基-2-戊烯氧基,1-甲基-3-戊烯氧基,2-甲基-3-戊烯氧基,3-甲基-3-戊烯氧基,4-甲基-3-戊烯氧基,1-甲基-4-戊烯氧基,2-甲基-4-戊烯氧基,3-甲基-4-戊烯氧基,4-甲基-4-戊烯氧基,1,2-二甲基-2-丁烯氧基,1,1-二甲基-3-丁烯氧基,1,2-二甲基-1-丁烯氧基,1,2-二甲基-2-丁烯氧基,1,2-二甲基-3-丁烯氧基,1,3-二甲基-1-丁烯氧基,1,3-二甲基-2-丁烯氧基,1,3-二甲基-3-丁烯氧基,2,2-二甲基-3-丁烯氧基,2,3-二甲基-1-丁烯氧基,2,3-二甲基-2-丁烯氧基,2,3-二甲基-3-丁烯氧基,3,3-二甲基-1-丁烯氧基,3,3-二甲基-2-丁烯氧基,1-乙基-1-丁烯氧基,1-乙基-2-丁烯氧基,1-乙基-3-丁烯氧基,2-乙基-1-丁烯氧基,2-乙基-2-丁烯氧基,2-乙基-3-丁烯氧基,1,1,2-三甲基-2-丙烯氧基,1-乙基-1-甲基-2-丙烯氧基,1-乙基-2-甲基-1-丙烯氧基,1-乙基-2-甲基-2-丙烯氧基,1-庚烯氧基,2-庚烯氧基,3-庚烯氧基,4-庚烯氧基,5-庚烯氧基,6-庚烯氧基,1-辛烯氧基,2-辛烯氧基,3-辛烯氧基,4-辛烯氧基,5-辛烯氧基,6-辛烯氧基,7-辛烯氧基,1-壬烯氧基,2-壬烯氧基,3-壬烯氧基,4-壬烯氧基,5-壬烯氧基,6-壬烯氧基,7-壬烯氧基,8-壬烯氧基,1-癸烯氧基,2-癸烯氧基,3-癸烯氧基,4-癸烯氧基,5-癸烯氧基,6-癸烯氧基,7-癸烯氧基,8-癸烯氧基,9-癸烯氧基,及其支链同系物。
所述R2的取代基原则上是所有可想到的取代基,其不会阻碍卤化酶的反应,例如一种或多种取代基,如卤素,如氟,氯或溴,氰基,硝基,氨基,羟基,烷基,环烷基,芳基,烷氧基,苄氧基,苯基或苄基。
通式I和II中的R3可以是氢,羟基,取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷基,C1-C10烷氧基,C2-C10链烯基,C2-C10链烯氧基,C1-C10烷基羰基,C2-C10链烯基羰基,芳基,杂芳基,
烷基可以是取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷基链,如甲基,乙基,正-丙基,1-甲基乙基,正-丁基,1-甲基丙基,2-甲基丙基,1,1-二甲基乙基,正-戊基,1-甲基丁基,2-甲基丁基,3-甲基丁基,2,2-二甲基丙基,1-乙基丙基,正-己基,1,1,-二甲基丙基,1,2-二甲基丙基,1-甲基戊基,2-甲基戊基,3-甲基戊基,4-甲基戊基,1,1-二甲基丁基,1,2-二甲基丁基,1,3-二甲基丁基,2,2-二甲基丁基,2,3-二甲基丁基,3,3-二甲基丁基,1-乙基丁基,2-乙基丁基,1,1,2-三甲基丙基,1,2,2-三甲基丙基,1-乙基-1-甲基丙基,1-乙基-2-甲基丙基,正-庚基,正-辛基,正-壬基或正-癸基。甲基,乙基,正-丙基,正-丁基,异-丙基或异-丁基是优选的。
链烯基可以是取代或未取代的,支链或无支链的C2-C10链烯基链,如乙烯基,丙烯基,1-丁烯基,2-丁烯基,3-丁烯基,2-甲基丙烯基,1-戊烯基,2-戊烯基,3-戊烯基,4-戊烯基,1-甲基-1-丁烯基,2-甲基-1-丁烯基,3-甲基-1-丁烯基,1-甲基-2-丁烯基,2-甲基-2-丁烯基,3-甲基2-丁烯基,1-甲基-3-丁烯基,2-甲基-3-丁烯基,3-甲基-3-丁烯基,1,1-二甲基-2-丙烯基,1,2-二甲基-1-丙烯基,1,2-二甲基-2-丙烯基,1-乙基-1-丙烯基,1-乙基-2-丙烯基,1-己烯基,2-己烯基,3-己烯基,4-己烯基,5-己烯基,1-甲基-1-戊烯基,2-甲基-1-戊烯基,3-甲基-1-戊烯基,4-甲基-1-戊烯基,1-甲基-2-戊烯基,2-甲基-2-戊烯基,3-甲基-2-戊烯基,4-甲基-2-戊烯基,1-甲基-3-戊烯基,2-甲基-3-戊烯基,3-甲基-3-戊烯基,4-甲基-3-戊烯基,1-甲基-4-戊烯基,2-甲基-4-戊烯基,3-甲基-4-戊烯基,4-甲基-4-戊烯基,1,1-二甲基-2-丁烯基,1,1-二甲基-3-丁烯基,1,2-二甲基-1-丁烯基,1,2-二甲基-2-丁烯基,1,2-二甲基-3-丁烯基,1,3-二甲基-1-丁烯基,1,3-二甲基-2-丁烯基,1,3-二甲基-3-丁烯基,2,2-二甲基-3-丁烯基,2,3-二甲基-1-丁烯基,2,3-二甲基-2-丁烯基,2,3-二甲基-3-丁烯基,3,3-二甲基-1-丁烯基,3,3-二甲基-2-丁烯基,1-乙基-1-丁烯基,1-乙基-2-丁烯基,1-乙基-3-丁烯基,2-乙基-1-丁烯基,2-乙基-2-丁烯基,2-乙基-3-丁烯基,1,1,2-三甲基-2-丙烯基,1-乙基-1-甲基-2-丙烯基,1-乙基-2-甲基-1-丙烯基,1-乙基-2-甲基-2-丙烯基,1-庚烯基,2-庚烯基,3-庚烯基,4-庚烯基,5-庚烯基,6-庚烯基,1-辛烯基,2-辛烯基,3-辛烯基,4-辛烯基,5-辛烯基,6-辛烯基,7-辛烯基,1-壬烯基,2-壬烯基,3-壬烯基,4-壬烯基,5-壬烯基,6-壬烯基,7-壬烯基,8-壬烯基,1-癸烯基,2-癸烯基,3-癸烯基,4-癸烯基,5-癸烯基,6-癸烯基,7-癸烯基,8-癸烯基,或9-癸烯基,及其支链同系物。
烷氧基可以是取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷氧基链,如甲氧基,乙氧基,丙氧基,1-甲基乙氧基,丁氧基,1-甲基丙氧基,2-甲基丙氧基,1,1-二甲基乙氧基,戊氧基,1-甲基丁氧基,2-甲基丁氧基,3-甲基丁氧基,1,1-二甲基丙氧基,1,2-二甲基丙氧基,2,2-二甲基丙氧基,1-乙基丙氧基,己氧基,1-甲基戊氧基,2-甲基戊氧基,3-甲基戊氧基,4-甲基戊氧基,1,1-二甲基丁氧基,1,2-二甲基丁氧基,1,3-二甲基丁氧基,2,2-二甲基丁氧基,2,3-二甲基丁氧基,3,3-二甲基丁氧基,1-乙基丁氧基,2-乙基丁氧基,1,1,2-三甲基丙氧基,1,2,2-三甲基丙氧基,1-乙基-1-甲基丙氧基,1-乙基-2-甲基丙氧基,己基氧,庚基氧,辛基氧,壬基氧或癸基氧,及其支链同系物。
链烯氧基可以是取代或未取代的,支链或无支链的C2-C10链烯氧基链,如乙烯氧基,丙烯氧基,1-丁烯氧基,2-丁烯氧基,3-丁烯氧基,2-甲基丙烯氧基,1-戊烯氧基,2-戊烯氧基,3-戊烯氧基,4-戊烯氧基,1-甲基-1-丁烯氧基,2-甲基-1-丁烯氧基,3-甲基-1-丁烯氧基,1-甲基-2-丁烯氧基,2-甲基-2-丁烯氧基,3-甲基-2-丁烯氧基,1-甲基-3-丁烯氧基,2-甲基-3-丁烯氧基,3-甲基-3-丁烯氧基,1,1-二甲基-2-丙烯氧基,1,2-二甲基-1-丙烯氧基,1,2-二甲基-2-丙烯氧基,1-乙基-1-丙烯氧基,1-乙基-2-丙烯氧基,1-己烯氧基,2-己烯氧基,3-己烯氧基,4-己烯氧基,5-己烯氧基,1-甲基-1-戊烯氧基,2-甲基-1-戊烯氧基,3-甲基-1-戊烯氧基,4-甲基-1-戊烯氧基,1-甲基-2-戊烯氧基,2-甲基-2-戊烯氧基,3-甲基-2-戊烯氧基,4-甲基-2-戊烯氧基,1-甲基-3-戊烯氧基,2-甲基-3-戊烯氧基,3-甲基-3-戊烯氧基,4-甲基-3-戊烯氧基,1-甲基-4-戊烯氧基,2-甲基-4-戊烯氧基,3-甲基-4-戊烯氧基,4-甲基-4-戊烯氧基,1,2-二甲基-2-丁烯氧基,1,1-二甲基-3-丁烯氧基,1,2-二甲基-1-丁烯氧基,1,2-二甲基-2-丁烯氧基,1,2-二甲基-3-丁烯氧基,1,3-二甲基-1-丁烯氧基,1,3-二甲基-2-丁烯氧基,1,3-二甲基-3-丁烯氧基,2,2-二甲基-3-丁烯氧基,2,3-二甲基-1-丁烯氧基,2,3-二甲基-2-丁烯氧基,2,3-二甲基-3-丁烯氧基,3,3-二甲基-1-丁烯氧基,3,3-二甲基-2-丁烯氧基,1-乙基-1-丁烯氧基,1-乙基-2-丁烯氧基,1-乙基-3-丁烯氧基,2-乙基-1-丁烯氧基,2-乙基-2-丁烯氧基,2-乙基-3-丁烯氧基,1,1,2-三甲基-2-丙烯氧基,1-乙基-1-甲基-2-丙烯氧基,1-乙基-2-甲基-1-丙烯氧基,1-乙基-2-甲基-2-丙烯氧基,1-庚烯氧基,2-庚烯氧基,3-庚烯氧基,4-庚烯氧基,5-庚烯氧基,6-庚烯氧基,1-辛烯氧基,2-辛烯氧基,3-辛烯氧基,4-辛烯氧基,5-辛烯氧基,6-辛烯氧基,7-辛烯氧基,1-壬烯氧基,2-壬烯氧基,3-壬烯氧基,4-壬烯氧基,5-壬烯氧基,6-壬烯氧基,7-壬烯氧基,8-壬烯氧基,1-癸烯氧基,2-癸烯氧基,3-癸烯氧基,4-癸烯氧基,5-癸烯氧基,6-癸烯氧基,7-癸烯氧基,8-癸烯氧基,9-癸烯氧基,及其支链同系物。
烷基羰基可以是支链或无支链的C1-C10烷基羰基链,如甲基羰基,乙基羰基,正-丙基羰基,1-甲基乙基羰基,正-丁基羰基,1-甲基丙基羰基,2-甲基丙基羰基,1,1-二甲基乙基羰基,正-戊基羰基,1-甲基丁基羰基,2-甲基丁基羰基,3-甲基丁基羰基,2,2-二甲基丙基羰基,1-乙基丙基羰基,正-己基羰基,1,1-二甲基丙基羰基,1,2-二甲基丙基羰基,1-甲基戊基羰基,2-甲基戊基羰基,3-甲基戊基羰基,4-甲基戊基糖基,1,1-二甲基丁基羰基,1,2-二甲基丁基羰基,1,3-二甲基丁基羰基,2,2-二甲基丁基羰基,2,3-二甲基丁基糖基,3,3-二甲基丁基羰基,1-乙基丁基羰基,2-乙基丁基羰基,1,1,2-三甲基丙基羰基,1,2,2-三甲基丙基羰基,1-乙基-1-甲基丙基羰基,1-乙基-2-甲基丙基羰基,正-庚基羰基,正-辛基羰基,正-壬基羰基,或正-癸基羰基。
链烯基羰基可以是支链或无支链的C2-C10链烯基羰基链,如乙烯基羰基,丙烯基羰基,1-丁烯基羰基,2-丁烯基羰基,3-丁烯基羰基,2-甲基丙烯基羰基,1-戊烯基羰基,2-戊烯基羰基,3-戊烯基羰基,4-戊烯基羰基,1-甲基-1-丁烯基羰基,2-甲基-1-丁烯基羰基,3-甲基-1-丁烯基羰基,1-甲基-2-丁烯基羰基,2-甲基-2-丁烯基羰基,3-甲基-2-丁烯基羰基,1-甲基-3-丁烯基羰基,2-甲基-3-丁烯基羰基,3-甲基-3-丁烯基羰基,1,1-二甲基-2-丙烯基羰基,1,2-二甲基-1-丙烯基羰基,1,2-二甲基-2-丙烯基羰基,1-乙基-1-丙烯基羰基,1-乙基-2-丙烯基羰基,1-己烯基羰基,2-己烯基羰基,3-己烯基羰基,4-己烯基羰基,5-己烯基羰基,1-甲基-1-庚烯基羰基,2-甲基-1-庚烯基羰基,3-甲基-1-庚烯基羰基,4-甲基-1-庚烯基羰基,1-甲基-2-庚烯基羰基,2-甲基-2-庚烯基羰基,3-甲基-2-庚烯基羰基,4-甲基-2-庚烯基羰基,1-甲基-3-庚烯基羰基,2-甲基-3-庚烯基羰基,3-甲基-3-庚烯基羰基,4-甲基-3-庚烯基羰基,1-甲基-4-庚烯基羰基,2-甲基-4-庚烯基羰基,3-甲基-4-庚烯基羰基,4-甲基-4-庚烯基羰基,1,1-二甲基-2-丁烯基羰基,1,1-二甲基-3-丁烯基羰基,1,2-二甲基-1-丁烯基羰基,1,2-二甲基-2-丁烯基羰基,1,2-二甲基-3-丁烯基羰基,1,3-二甲基-1-丁烯基羰基,1,3-二甲基-2-丁烯基羰基,1,3-二甲基-3-丁烯基羰基,2,2-二甲基-3-丁烯基羰基,2,3-二甲基-1-丁烯基羰基,2,3-二甲基-2-丁烯基羰基,2,3-二甲基-3-丁烯基羰基,3,3-二甲基-1-丁烯基羰基,3,3-二甲基-2-丁烯基羰基,1-乙基-1-丁烯基羰基,1-乙基-2-丁烯基羰基,1-乙基-3-丁烯基羰基,2-乙基-1-丁烯基羰基,2-乙基-2-丁烯基羰基,2-乙基-3-丁烯基羰基,1,1,2-三甲基-2-丙烯基羰基,1-乙基-1-甲基-2-丙烯基羰基,1-乙基-2-甲基-1-丙烯基羰基,1-乙基-2-甲基-2-丙烯基羰基,1-庚烯基羰基,2-庚烯基羰基,3-庚烯基羰基,4-庚烯基羰基,5-庚烯基羰基,6-庚烯基羰基,1-辛烯基羰基,2-辛烯基羰基,3-辛烯基羰基,4-辛烯基羰基,5-辛烯基羰基,6-辛烯基羰基,7-辛烯基羰基,壬烯基羰基或癸烯基羰基。
所述R3的取代基原则上是所有可想到的取代基,其不会阻碍卤化酶的反应,例如一种或多种取代基,如卤素,如氟,氯或溴,氰基,硝基,氨基,羟基,烷基,环烷基,芳基,烷氧基,苄氧基,苯基或苄基。
芳基的实施例可以是,例如,苯基,甲氧苯基或萘基或芳香的环或环系统,其环系统中含有6-18个碳原子,直到24个其它的碳原子,其可形成其它具有3-8个碳原子的非芳香环或环系统,任选地,它们可被一个或多个基团,如卤素,如氟,氯或溴,氰基,硝基,氨基,羟基,烷基,烷氧基,或其它基团取代。任选取代的苯基,甲氧苯基和萘基是优选的。
杂芳基可以是单的或稠合的芳香环系统,其具有一个或多个杂芳香的3-到7-节环,其可以包含一个或多个杂原子,如N,O或S,且其任选地可被一个或多个基团,如卤素,如氟,氯或溴,氰基,硝基,氨基,羟基,巯基,烷基,烷氧基或其它芳香的,或其它饱和或不饱和的非芳香环或环系统取代。
通式I和II化合物中的R4和R5是,彼此独立地,氢,羟基,卤素,硝基,氰基,取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷基,C1-C10烷氧基,C2-C10链烯基,C2-C10链烯氧基,取代或未取代的C3-C10环烷基,芳基,杂芳基,R6R7N-,且其中两个基团R4和R5的相邻碳原子可以共同形成其它取代或未取代的芳香的,饱和或部分饱和的环,其环中具有5-6个原子,其可以包含一个或多个杂原子,如O,N或S。
卤素是氟,溴或氯,优选氯。
烷基可以是取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷基链,如甲基,乙基,正-丙基,1-甲基乙基,正-丁基,1-甲基丙基,2-甲基丙基,1,1-二甲基乙基,正-戊基,1-甲基丁基,2-甲基丁基,3-甲基丁基,2,2-二甲基丙基,1-乙基丙基,正-己基,1,1-二甲基丙基,1,2-二甲基丙基,1-甲基戊基,2-甲基戊基,3-甲基戊基,4-甲基戊基,1,1-二甲基丁基,1,2-二甲基丁基,1,3-二甲基丁基,2,2-二甲基丁基,2,3-二甲基丁基,3,3-二甲基丁基,1-乙基丁基,2-乙基丁基,1,1,2-三甲基丙基,1,2,2-三甲基丙基,1-乙基-1-甲基丙基,1-乙基-2-甲基丙基,正-庚基,正-辛基,正-壬基或正-癸基。甲基,乙基,正-丙基,正-丁基,异-丙基或异-丁基是优选的。
链烯基可以是取代或未取代的,支链或无支链的C2-C10链烯基链,如乙烯基,丙烯基,1-丁烯基,2-丁烯基,3-丁烯基,2-甲基丙烯基,1-戊烯基,2-戊烯基,3-戊烯基,4-戊烯基,1-甲基-1-丁烯基,2-甲基-1-丁烯基,3-甲基-1-丁烯基,1-甲基-2-丁烯基,2-甲基-2-丁烯基,3-甲基2-丁烯基,1-甲基-3-丁烯基,2-甲基-3-丁烯基,3-甲基-3-丁烯基,1,1-二甲基-2-丙烯基,1,2-二甲基-1-丙烯基,1,2-二甲基-2-丙烯基,1-乙基-1-丙烯基,1-乙基-2-丙烯基,1-己烯基,2-己烯基,3-己烯基,4-己烯基,5-己烯基,1-甲基-1-戊烯基,2-甲基-1-戊烯基,3-甲基-1-戊烯基,4-甲基-1-戊烯基,1-甲基-2-戊烯基,2-甲基-2-戊烯基,3-甲基-2-戊烯基,4-甲基-2-戊烯基,1-甲基-3-戊烯基,2-甲基-3-戊烯基,3-甲基-3-戊烯基,4-甲基-3-戊烯基,1-甲基-4-戊烯基,2-甲基-4-戊烯基,3-甲基-4-戊烯基,4-甲基-4-戊烯基,1,1-二甲基-2-丁烯基,1,1-二甲基-3-丁烯基,1,2-二甲基-1-丁烯基,1,2-二甲基-2-丁烯基,1,2-二甲基-3-丁烯基,1,3-二甲基-1-丁烯基,1,3-二甲基-2-丁烯基,1,3-二甲基-3-丁烯基,2,2-二甲基-3-丁烯基,2,3-二甲基-1-丁烯基,2,3-二甲基-2-丁烯基,2,3-二甲基-3-丁烯基,3,3-二甲基-1-丁烯基,3,3-二甲基-2-丁烯基,1-乙基-1-丁烯基,1-乙基-2-丁烯基,1-乙基-3-丁烯基,2-乙基-1-丁烯基,2-乙基-2-丁烯基,2-乙基-3-丁烯基,1,1,2-三甲基-2-丙烯基,1-乙基-1-甲基-2-丙烯基,1-乙基-2-甲基-1-丙烯基,1-乙基-2-甲基-2-丙烯基,1-庚烯基,2-庚烯基,3-庚烯基,4-庚烯基,5-庚烯基,6-庚烯基,1-辛烯基,2-辛烯基,3-辛烯基,4-辛烯基,5-辛烯基,6-辛烯基,7-辛烯基,1-壬烯基,2-壬烯基,3-壬烯基,4-壬烯基,5-壬烯基,6-壬烯基,7-壬烯基,8-壬烯基,1-癸烯基,2-癸烯基,3-癸烯基,4-癸烯基,5-癸烯基,6-癸烯基,7-癸烯基,8-癸烯基,或9-癸烯基,及其支链同系物。
烷氧基可以是取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷氧基链,如甲氧基,乙氧基,丙氧基,1-甲基乙氧基,丁氧基,1-甲基丙氧基,2-甲基丙氧基,1,1-二甲基乙氧基,戊氧基,1-甲基丁氧基,2-甲基丁氧基,3-甲基丁氧基,1,1-二甲基丙氧基,1,2-二甲基丙氧基,2,2-二甲基丙氧基,1-乙基丙氧基,己氧基,1-甲基戊氧基,2-甲基戊氧基,3-甲基戊氧基,4-甲基戊氧基,1,1-二甲基丁氧基,1,2-二甲基丁氧基,1,3-二甲基丁氧基,2,2-二甲基丁氧基,2,3-二甲基丁氧基,3,3-二甲基丁氧基,1-乙基丁氧基,2-乙基丁氧基,1,1,2-三甲基丙氧基,1,2,2-三甲基丙氧基,1-乙基-1-甲基丙氧基,1-乙基-2-甲基丙氧基,己基氧,庚基氧,辛基氧,壬基氧或癸基氧,及其支链同系物。
链烯氧基可以是取代或未取代的,支链或无支链的C2-C10链烯氧基链,如乙烯氧基,丙烯氧基,1-丁烯氧基,2-丁烯氧基,3-丁烯氧基,2-甲基丙烯氧基,1-戊烯氧基,2-戊烯氧基,3-戊烯氧基,4-戊烯氧基,1-甲基-1-丁烯氧基,2-甲基-1-丁烯氧基,3-甲基-1-丁烯氧基,1-甲基-2-丁烯氧基,2-甲基-2-丁烯氧基,3-甲基-2-丁烯氧基,1-甲基-3-丁烯氧基,2-甲基-3-丁烯氧基,3-甲基-3-丁烯氧基,1,1-二甲基-2-丙烯氧基,1,2-二甲基-1-丙烯氧基,1,2-二甲基-2-丙烯氧基,1-乙基-1-丙烯氧基,1-乙基-2-丙烯氧基,1-己烯氧基,2-己烯氧基,3-己烯氧基,4-己烯氧基,5-己烯氧基,1-甲基-1-戊烯氧基,2-甲基-1-戊烯氧基,3-甲基-1-戊烯氧基,4-甲基-1-戊烯氧基,1-甲基-2-戊烯氧基,2-甲基-2-戊烯氧基,3-甲基-2-戊烯氧基,4-甲基-2-戊烯氧基,1-甲基-3-戊烯氧基,2-甲基-3-戊烯氧基,3-甲基-3-戊烯氧基,4-甲基-3-戊烯氧基,1-甲基-4-戊烯氧基,2-甲基-4-戊烯氧基,3-甲基-4-戊烯氧基,4-甲基-4-戊烯氧基,1,2-二甲基-2-丁烯氧基,1,1-二甲基-3-丁烯氧基,1,2-二甲基-1-丁烯氧基,1,2-二甲基-2-丁烯氧基,1,2-二甲基-3-丁烯氧基,1,3-二甲基-1-丁烯氧基,1,3-二甲基-2-丁烯氧基,1,3-二甲基-3-丁烯氧基,2,2-二甲基-3-丁烯氧基,2,3-二甲基-1-丁烯氧基,2,3-二甲基-2-丁烯氧基,2,3-二甲基-3-丁烯氧基,3,3-二甲基-1-丁烯氧基,3,3-二甲基-2-丁烯氧基,1-乙基-1-丁烯氧基,1-乙基-2-丁烯氧基,1-乙基-3-丁烯氧基,2-乙基-1-丁烯氧基,2-乙基-2-丁烯氧基,2-乙基-3-丁烯氧基,1,1,2-三甲基-2-丙烯氧基,1-乙基-1-甲基-2-丙烯氧基,1-乙基-2-甲基-1-丙烯氧基,1-乙基-2-甲基-2-丙烯氧基,1-庚烯氧基,2-庚烯氧基,3-庚烯氧基,4-庚烯氧基,5-庚烯氧基,6-庚烯氧基,1-辛烯氧基,2-辛烯氧基,3-辛烯氧基,4-辛烯氧基,5-辛烯氧基,6-辛烯氧基,7-辛烯氧基,1-壬烯氧基,2-壬烯氧基,3-壬烯氧基,4-壬烯氧基,5-壬烯氧基,6-壬烯氧基,7-壬烯氧基,8-壬烯氧基,1-癸烯氧基,2-癸烯氧基,3-癸烯氧基,4-癸烯氧基,5-癸烯氧基,6-癸烯氧基,7-癸烯氧基,8-癸烯氧基,9-癸烯氧基,及其支链同系物。
环烷基的实施例可以是取代或未取代的,支链或无支链的C3-C10环烷基链,其环或环系统中含有3-7个碳原子,如环丙基,环丁基,环戊基,环己基,环庚基,1-甲基环丙基,1-乙基环丙基,1-丙基环丙基,1-丁基环丙基,1-戊基环丙基,1-甲基-1-丁基环丙基,1,2-二甲基环丙基,1-甲基-2-乙基环丙基,环辛基,环壬基,或环癸基。环烷基的环中还可以包含杂原子,如S,N和O。
芳基是指,例如,单的或稠合的芳香环系统,任选地其可被一个或多个基团,如卤素,如氟,氯或溴,氰基,硝基,氨基,羟基,巯基,烷基,烷氧基,芳基,杂芳基或其它饱和或不饱和的非芳香环或环系统取代。任选取代的苯基,甲氧苯基和萘基是优选的。
杂芳基是指,例如,单的或稠合的芳香环系统,其具有一个或多个杂芳香的3-到7-节环,其可以包含一个或多个杂原子,如N,O或S,且其任选地可被一个或多个基团,如卤素,如氟,氯或溴,氰基,硝基,氨基,羟基,巯基,烷基,烷氧基或其它芳香的,或其它饱和或不饱和的非芳香环或环系统取代。
所述R4和R5的取代基原则上是所有可想到的取代基,例如,一个或多个取代基如卤素,如氟,氯或溴,氰基,硝基,氨基,羟基,烷基,环烷基,芳基,烷氧基,苄氧基,苯基或苄基。
取代基R6R7N-中的R6和R7是,彼此独立地,氢或取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷基。
烷基可以是取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷基链,如甲基,乙基,正-丙基,1-甲基乙基,正-丁基,1-甲基丙基,2-甲基丙基,1,1-二甲基乙基,正-戊基,1-甲基丁基,2-甲基丁基,3-甲基丁基,2,2-二甲基丙基,1-乙基丙基,正-己基,1,1-二甲基丙基,1,2-二甲基丙基,1-甲基戊基,2-甲基戊基,3-甲基戊基,4-甲基戊基,1,1-二甲基丁基,1,2-二甲基丁基,1,3-二甲基丁基,2,2-二甲基丁基,2,3-二甲基丁基,3,3-二甲基丁基,1-乙基丁基,2-乙基丁基,1,1,2-三甲基丙基,1,2,2-三甲基丙基,1-乙基-1-甲基丙基,1-乙基-2-甲基丙基,正-庚基,正-辛基,正-壬基或正-癸基。甲基,乙基,正-丙基,正-丁基,异-丙基或异-丁基是优选的。
所述R6和R7的取代基原则上是所有可想到的取代基,其不会阻碍卤化酶的反应,例如一个或多个取代基,如卤素,如氟,氯或溴,氰基,硝基,氨基,羟基,烷基,环烷基,芳基,烷氧基,苄氧基,苯基或苄基。取代基中的R8是取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷基,C2-C10链烯基,取代或未取代的芳基。
烷基可以是取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷基链,如甲基,乙基,正-丙基,1-甲基乙基,正-丁基,1-甲基丙基,2-甲基丙基,1,1-二甲基乙基,正-戊基,1-甲基丁基,2-甲基丁基,3-甲基丁基,2,2-二甲基丙基,1-乙基丙基,正-己基,1,1-二甲基丙基,1,2-二甲基丙基,1-甲基戊基,2-甲基戊基,3-甲基戊基,4-甲基戊基,1,1-二甲基丁基,1,2-二甲基丁基,1,3-二甲基丁基,2,2-二甲基丁基,2,3-二甲基丁基,3,3-二甲基丁基,1-乙基丁基,2-乙基丁基,1,1,2-三甲基丙基,1,2,2-三甲基丙基,1-乙基-1-甲基丙基,1-乙基-2-甲基丙基,正-庚基,正-辛基,正-壬基或正-癸基。甲基,乙基,正-丙基,正-丁基,异-丙基或异-丁基是优选的。
链烯基可以是取代或未取代的,支链或无支链的C2-C10链烯基链,如乙烯基,丙烯基,1-丁烯基,2-丁烯基,3-丁烯基,2-甲基丙烯基,1-戊烯基,2-戊烯基,3-戊烯基,4-戊烯基,1-甲基-1-丁烯基,2-甲基-1-丁烯基,3-甲基-1-丁烯基,1-甲基-2-丁烯基,2-甲基-2-丁烯基,3-甲基2-丁烯基,1-甲基-3-丁烯基,2-甲基-3-丁烯基,3-甲基-3-丁烯基,1,1-二甲基-2-丙烯基,1,2-二甲基-1-丙烯基,1,2-二甲基-2-丙烯基,1-乙基-1-丙烯基,1-乙基-2-丙烯基,1-己烯基,2-己烯基,3-己烯基,4-己烯基,5-己烯基,1-甲基-1-戊烯基,2-甲基-1-戊烯基,3-甲基-1-戊烯基,4-甲基-1-戊烯基,1-甲基-2-戊烯基,2-甲基-2-戊烯基,3-甲基-2-戊烯基,4-甲基-2-戊烯基,1-甲基-3-戊烯基,2-甲基-3-戊烯基,3-甲基-3-戊烯基,4-甲基-3-戊烯基,1-甲基-4-戊烯基,2-甲基-4-戊烯基,3-甲基-4-戊烯基,4-甲基-4-戊烯基,1,1-二甲基-2-丁烯基,1,1-二甲基-3-丁烯基,1,2-二甲基-1-丁烯基,1,2-二甲基-2-丁烯基,1,2-二甲基-3-丁烯基,1,3-二甲基-1-丁烯基,1,3-二甲基-2-丁烯基,1,3-二甲基-3-丁烯基,2,2-二甲基-3-丁烯基,2,3-二甲基-1-丁烯基,2,3-二甲基-2-丁烯基,2,3-二甲基-3-丁烯基,3,3-二甲基-1-丁烯基,3,3-二甲基-2-丁烯基,1-乙基-1-丁烯基,1-乙基-2-丁烯基,1-乙基-3-丁烯基,2-乙基-1-丁烯基,2-乙基-2-丁烯基,2-乙基-3-丁烯基,1,1,2-三甲基-2-丙烯基,1-乙基-1-甲基-2-丙烯基,1-乙基-2-甲基-1-丙烯基,1-乙基-2-甲基-2-丙烯基,1-庚烯基,2-庚烯基,3-庚烯基,4-庚烯基,5-庚烯基,6-庚烯基,1-辛烯基,2-辛烯基,3-辛烯基,4-辛烯基,5-辛烯基,6-辛烯基,7-辛烯基,1-壬烯基,2-壬烯基,3-壬烯基,4-壬烯基,5-壬烯基,6-壬烯基,7-壬烯基,8-壬烯基,1-癸烯基,2-癸烯基,3-癸烯基,4-癸烯基,5-癸烯基,6-癸烯基,7-癸烯基,8-癸烯基,或9-癸烯基,及其支链同系物。
芳香基是指,例如,单的或稠合的芳香环系统,其任选地可被一个或多个基团取代,如卤素,如氟,氯或溴,氰基,硝基,氨基,羟基,巯基,烷基,烷氧基,芳基,杂芳基或其它饱和或不饱和的非芳香环或环系统。任选取代的苯基,甲氧苯基和萘基是优选的。
取代基中的R9是取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷基,C2-C10链烯基,取代或未取代的芳基,杂芳基。
烷基可以是取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷基链,如甲基,乙基,正-丙基,1-甲基乙基,正-丁基,1-甲基丙基,2-甲基丙基,1,1-二甲基乙基,正-戊基,1-甲基丁基,2-甲基丁基,3-甲基丁基,2,2-二甲基丙基,1-乙基丙基,正-己基,1,1-二甲基丙基,1,2-二甲基丙基,1-甲基戊基,2-甲基戊基,3-甲基戊基,4-甲基戊基,1,1-二甲基丁基,1,2-二甲基丁基,1,3-二甲基丁基,2,2-二甲基丁基,2,3-二甲基丁基,3,3-二甲基丁基,1-乙基丁基,2-乙基丁基,1,1,2-三甲基丙基,1,2,2-三甲基丙基,1-乙基-1-甲基丙基,1-乙基-2-甲基丙基,正-庚基,正-辛基,正-壬基或正-癸基。甲基,乙基,正-丙基,正-丁基,异-丙基或异-丁基是优选的。
链烯基可以是取代或未取代的,支链或无支链的C2-C10链烯基链,如乙烯基,丙烯基,1-丁烯基,2-丁烯基,3-丁烯基,2-甲基丙烯基,1-戊烯基,2-戊烯基,3-戊烯基,4-戊烯基,1-甲基-1-丁烯基,2-甲基-1-丁烯基,3-甲基-1-丁烯基,1-甲基-2-丁烯基,2-甲基-2-丁烯基,3-甲基2-丁烯基,1-甲基-3-丁烯基,2-甲基-3-丁烯基,3-甲基-3-丁烯基,1,1-二甲基-2-丙烯基,1,2-二甲基-1-丙烯基,1,2-二甲基-2-丙烯基,1-乙基-1-丙烯基,1-乙基-2-丙烯基,1-己烯基,2-己烯基,3-己烯基,4-己烯基,5-己烯基,1-甲基-1-戊烯基,2-甲基-1-戊烯基,3-甲基-1-戊烯基,4-甲基-1-戊烯基,1-甲基-2-戊烯基,2-甲基-2-戊烯基,3-甲基-2-戊烯基,4-甲基-2-戊烯基,1-甲基-3-戊烯基,2-甲基-3-戊烯基,3-甲基-3-戊烯基,4-甲基-3-戊烯基,1-甲基-4-戊烯基,2-甲基-4-戊烯基,3-甲基-4-戊烯基,4-甲基-4-戊烯基,1,1-二甲基-2-丁烯基,1,1-二甲基-3-丁烯基,1,2-二甲基-1-丁烯基,1,2-二甲基-2-丁烯基,1,2-二甲基-3-丁烯基,1,3-二甲基-1-丁烯基,1,3-二甲基-2-丁烯基,1,3-二甲基-3-丁烯基,2,2-二甲基-3-丁烯基,2,3-二甲基-1-丁烯基,2,3-二甲基-2-丁烯基,2,3-二甲基-3-丁烯基,3,3-二甲基-1-丁烯基,3,3-二甲基-2-丁烯基,1-乙基-1-丁烯基,1-乙基-2-丁烯基,1-乙基-3-丁烯基,2-乙基-1-丁烯基,2-乙基-2-丁烯基,2-乙基-3-丁烯基,1,1,2-三甲基-2-丙烯基,1-乙基-1-甲基-2-丙烯基,1-乙基-2-甲基-1-丙烯基,1-乙基-2-甲基-2-丙烯基,1-庚烯基,2-庚烯基,3-庚烯基,4-庚烯基,5-庚烯基,6-庚烯基,1-辛烯基,2-辛烯基,3-辛烯基,4-辛烯基,5-辛烯基,6-辛烯基,7-辛烯基,1-壬烯基,2-壬烯基,3-壬烯基,4-壬烯基,5-壬烯基,6-壬烯基,7-壬烯基,8-壬烯基,1-癸烯基,2-癸烯基,3-癸烯基,4-癸烯基,5-癸烯基,6-癸烯基,7-癸烯基,8-癸烯基,或9-癸烯基,及其支链同系物。
芳香基是指,例如,单的或稠合的芳香环系统,其任选地可被一个或多个基团取代,如卤素,如氟,氯或溴,氰基,硝基,氨基,羟基,巯基,烷基,烷氧基,芳基,杂芳基或其它饱和或不饱和的非芳香环或环系统。任选取代的苯基,甲氧苯基和萘基是优选的。
杂芳基是指,例如,单的或稠合的芳香环系统,其具有一个或多个杂芳香的3-到7-节环,其可以包含一个或多个杂原子,如N,O或S,且任选地,其可被一个或多个基团,如卤素,如氟,氯或溴,氰基,硝基,氨基,羟基,巯基,烷基,烷氧基或其它芳香的或其它饱和或不饱和的非芳香环或环系统取代。
所述R8和R9的取代基原则上是所有可想到的取代基,其不会阻碍卤化酶的反应,例如,一个或多个取代基如卤素,如氟,氯或溴,氰基,硝基,氨基,羟基,烷基,环烷基,芳基,烷氧基,苄氧基,苯基或苄基。
可将包含至少一种卤化酶基因的生物用于本发明的方法中。微生物是优选使用的。
该方法可用含卤化酶生物的粗提物进行,或可用部分或完全纯化的酶进行。
如上所述,可将卤素供体加入到反应中。卤素优选指的是氯或溴。氟和碘是较少优选的,因为它们可能具有毒效,以致可能损害,甚或杀死具有活性的生物。然而,该反应也可以用氟和碘进行。
本发明的方法可以用生长细胞或静息细胞进行。
对于用生长生物进行卤化来说,用于卤化的生物是在使这些生物体,优选微生物生长的培养基中培养的。
此培养基可以是合成的或天然的复合培养基。所用培养基应当是技术人员已知的那些,且适于该生物。用于微生物生长的培养基通常包含碳源,氮源,无机盐和,适当的,少量的维生素和微量元素。
碳源的实施例是糖,如单糖,双糖,或多糖,如葡萄糖,果糖,甘露糖,木糖,半乳糖,核糖,山梨糖,核酮,乳糖,麦芽糖,蔗糖,棉子糖,淀粉或纤维素,复合糖源如糖蜜,糖磷酸盐,如果糖1,6-二磷酸盐,糖醇如甘露糖醇,多元醇如甘油,醇如甲醇或乙醇,羧酸如柠檬酸,乳酸或醋酸,脂肪如大豆油或菜子油,氨基酸如氨基酸混合物,例如酪蛋氨基酸(Difco)或单氨基酸或氨基糖,且后者同时可用作氮源。
有效的氮源可以是有机或无机的氮化合物或含这些化合物的材料。实施例是铵盐,如NH4Cl或(NH4)2SO4,硝酸盐,尿素,或复合氮源,如玉米浸泡液,啤酒酵母自溶物,大豆粗粉,小麦麸质,酵母提取物,肉类提取物,酪蛋白水解物,酵母或马铃薯蛋白,其也常作为碳源。
无机盐的实施例是钙,镁,钠,钴,钼,锰,钾,锌,铜和铁的盐。盐酸盐,硫酸盐和磷酸盐离子作为这些盐中的阴离子而被特别地提到。
还可将其它的生长因子适当地加入到营养培养基中,如维生素或生长助催化剂,如生物素,核黄素,维生素B1,叶酸,烟酸,泛酸盐,或维生素B6,氨基酸如丙氨酸,半胱氨酸,脯氨酸,天冬氨酸,谷酰胺,丝氨酸,苯丙氨酸,鸟氨酸或缬氨酸,羧酸如柠檬酸,甲酸,庚二酸,或乳酸,或如二硫苏糖醇的物质。
所述营养物的混合比例取决于生物体和发酵的类型,且其是根据各种不同的情况而确定的。在分别或一起灭菌之后,如果需要,培养基组分可能在发酵开始时全部存在,或在发酵的过程中,根据需要而连续或分批地加入。
为了使生物能够最佳地生长,并得到最好的收率,还应当确定培养条件。优选的培养温度是15℃-40℃。25℃-37℃间的温度是特别有益的。优选将PH保持在3-9之间,5-8之间的PH值是特别有益的。通常,充足的培养时间是几小时到几天之间,优选8小时-21天,特别优选4小时-14天。在此时间内,最大量的产物积聚在培养基中。
技术人员根据教科书的教导可以找到优化培养基的有效方法,例如,Applied Microbial Physiology,A Practical Approach(Eds.P.M.Rhodes,P.F.Stanbury,IRL-Press,1997,第53-73页,ISBN 0 19 963577 3)。无枝酸菌属的有益培养基和培养条件可以在Nadkarni等(J.Antibiot,1994,334-341)第336-337页,或DE42 26192,实施例16+17(第11和12页),EP-A-0 468 504,实施例1-4(第4-6页)和第2页(第20-40行)和EP-B0 521 408,实施例1中找到。可将卤化的化合物在发酵一开始就加入到培养基中,或在发酵的过程中连续或分批地加入到培养基中。接下来可以使用常规的分析方法,例如,薄层色谱法,HPLC或GC进行转化。
本发明方法可连续地进行,或以分批或补料-分批模式分批地进行。
在发酵过程中,可根据生物来决定控制或不控制pH值。发酵通常是在pH 5-9之间,优选6-9之间进行的。
糖肽抗生素的分析方法可以在Nadkarni等(J.Antibiotics1994:334-341)中找到。
如果本发明的方法是用游离酶(粗提物或纯化酶)进行的,那么可以在较宽的温度范围内操作。一方面,此温度范围是由反应速率决定的,即非常低的温度导致低反应速率,另一方面,它是由酶的温度稳定性决定的,即高温导致酶变性。因为这些原因,5-80℃,优选10-60℃,特别优选20-40℃是有利的。静息细胞也适于该方法,且适当地,就像酶,可被有效地固定。为了更好地转化,可使细胞膜去稳定,以便前体和产物可更容易地到达反应位点(酶)。去稳定作用可用各种碱金属或碱土金属盐,如锂,铷或钙盐进行,或通过用溶剂处理而进行。
用于本发明方法中的卤化酶属于NADH-依赖的卤化酶,根据它们的区域-和/或立体选择性,其与卤过氧化物酶不同。
此外,它们显示了较宽的底物特异性。它们优选卤化芳香残基。
来源于地中海拟无枝酸菌的优选卤化酶具有491个氨基酸(SEQID NO:2)。它的基因被称作bhaA。该酶具有NADH/FAD结合位点。在bhaA基因的N端有一序列基序(β&β折叠),推测其涉及FAD-和NAD-依赖酶的ADP结合。可进行FAD结合的Asp残基保存在蛋白的304位中。因而bhaA也可以结合FAD。用生长细胞来提供反应所必需的NADH或NAD+不成问题,这是因为其可以从生长生物的代谢而进行。其它必需因素的提供也没有提出问题。
如果将静息细胞或酶制剂用于本发明的方法中,则可将其它物质和辅因子有利地加入到反应溶液中。
在最简单的情况中,用静息细胞,通过加入碳源可再生还原等价体。
如果本发明的方法是用游离酶或固定酶进行的,那么将至少一种天然或合成的电子供体,如NADH,甲基-或苄基紫精加入到反应溶液中是有利的。
这些电子供体或连续地加入到反应溶液中,或在其他的反应中再生。其可在电化学或酶反应中进行。在EP-B-0 023 346,DE 29 30 087C2,DE33 07 094 A1或DE36 31 228 A1中描述了这些类型的再生反应。
因此,DE29 30 087 C2描述了,例如,在有甲酸盐参与的情况下,使用脱氢酶从NAD再生NADH的方法。NAD+/NADH的分子量可使用聚乙二醇有效地增加,以便它可保留在膜反应器中,并可永久地用于该反应(见DE 29 30 087 C2,第1和2栏)。在EP-B-0 023 346和DE 33 07 094 A1中描述了相同的内容。
DE 36 31 228描述了用紫萝碱(CAV和CYV)再生NAD+的方法。其它有效的实施方案是辅因子-再生酶,例如甲酸盐脱氢酶与卤化酶的共表达,或与可再生的生物共培养。
上述关于再生的出版物均引入此处作为参考。
本发明方法是在使用游离或固定酶,控制pH的条件下,或在有缓冲液参与的情况下进行的。
本发明的方法是在4-10,优选5-9,特别优选6-9的pH下进行的。
可将C1-C8-单-或二羧酸,如醋酸,丙酸或柠檬酸加入到反应溶液中。这些可以在同一时间内使用,以产生反应缓冲液。
本发明进一步涉及一种含卤化酶的核酸片段,其是(a)由SEQ ID NO:1中详列的序列编码的,或是一种以遗传密码的简并性为基础,从其得来的序列编码的,或是(b)由一种核酸序列编码的,该核酸序列编码(a)的功能片段,或(c)由一种序列编码的,该序列在标准条件下与(a)或(b)杂交,或是(d)由一种序列编码的,该序列具有与(a)下详列的序列超过30%的同一性或超过60%的相似性,且其是功能性连接到一个或多个同源或异源的调节信号上的,以增加基因表达和/或蛋白表达,和/或切断它的天然调节。
本发明的核酸片段指的是所述卤化酶序列或它们的功能等价体,其是功能性连接到一个或多个调节信号上的,以增加基因表达。这些调节序列是,例如,结合诱导物或阻抑物的序列,并因而控制核酸的表达。除了这些新的调节序列,或代替这些序列之外,可以对存在于真实结构基因前的这些序列的天然调节进行适当地基因修饰,以便切断天然调节,并增加基因的表达。然而,该基因构造也可以是较少优选的形式,具有更简单的结构,即没有插入到序列SEQ ID NO:1前的附加调节信号或其功能等价体(见第32页a-d),且天然启动子与其调节没有缺失。反而,天然调节序列已经突变,这样调节就不再发生,且基因表达增加。这些修饰启动子也可以位于自己的天然基因的前面以增加活性。该基因构造可以附加包含一个或多个功能性连接到启动子上的增强子序列,其可增加核酸序列的表达。也可以在DNA序列的3’端附加插入有益的序列,如其它的调节因子或终止子。卤化酶基因的一个或多个复制可能存在于基因构造中。
存在于启动子,如cos,tac,trp,tet,trp-tet,lpp,lac,lpp-lac,lacIq,T7,T5,T3,gal,trc,ara,SP6,λ-PR中,或存在于λ-PL启动子中的本发明方法的有益调节序列可用于葛兰氏阴性菌中。此外,有益的调节序列存在于,例如,葛兰氏阳性启动子amy和SPO2中,存在于酵母或真菌启动子ADC1,MFα,AC,P-60,CYC1,GAPDH,TEF,rp28,ADH中或存在于植物启动子CaMV/35S[Franck等,Cell 21(1980)285-294],PRP1[Ward等,Plant.Mol.Biol.22(1993)],SSU,Ocs,Lib4,usp,STLS1,B33,LEB4,nos中,或存在于遍在或菜豆蛋白启动子中。来源于,例如汉逊氏酵母属的甲醇氧化酶和丙酮酸脱羧酶的启动子在此关系中也是有益的。其它有益的植物启动子的实施例是苯磺酰胺诱导的(EP 388186),四环素诱导的(Gatz等,(1992)Plant J.2,397-404),脱落酸诱导的(EP335528)和乙醇-或环己酮诱导的(WO9321334)启动子。特别有益的植物启动子是确定在组织或植物部分中表达的那些,其中进行嘌呤及其前体的生物合成。上述应当是由确保叶-特异性表达的启动子所组成的。所述的那些是来源于马铃薯的胞质FEPase启动子,或来源于马铃薯的ST-LSI启动子(Stockhaus等,EMBO J.8(1989)2445-245)。使用来源于甘氨酸max的磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶的启动子(见GenbankAccession Number U87999)或EP 249676中的其它节-特异性启动子也可以,而且是有益的。
原则上,所有具有像上述那些调节序列的天然启动子均可用于本发明的方法中。附带地,且有益的,还可以使用合成启动子。
该核酸片段(=基因构造)还可以,如上所述,包含其它引入到生物体中的基因。这些基因作为卤化酶基因可处于分离调节下,或处于相同的调节区域下。这些基因是,例如,其它生物合成的基因,其可增加糖肽抗生素的合成,或新的氢化物抗生素的合成,或辅因子-再生酶的合成。该核酸片段优选包含SEQ ID NO:1。
为了表达,该核酸片段被插入到上述宿主生物中,有益地,插入到载体如质粒,噬菌体或其它DNA中,其可在宿主中最佳地表达基因。适当质粒的实施例是大肠埃希氏菌中的pLG338,pACYC184,pBR322,pUC18,pUC19,pKC30,pRep4,pHS1,pHS2,pPLc236,pMBL24,pLG200,pUR290,pIN-III113-B1,λgt11或pBdCI,链霉菌属中的pIJ101,pIJ364,pIJ702或pIJ361,芽孢杆菌属中的pUB110,pc194或pBD214,棒杆菌属中的pSA77或pAJ667,真菌中的pALS1,pIL2或pBB116,酵母中的2μ,pAG-1,YEp6,YEp13或pEMBLYe23或植物中的pLGV23,pGHlac+,pBIN19,pAK2004或pDH51或上述质粒的衍生物。所述质粒代表可能质粒的一小部分选择。其它质粒对于技术人员来说也是熟知的,且可在书中找到,例如,Clong Vectors(Eds.Pouwels P.H.等Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985,ISBN 0 444 904018)。适当的植物载体在inter alia“Methodsin Plant Molecular Biology and Biotechnology”(CRC Press),chapters6/7,pp.71-119中描述。
该核酸片段还包含存在于3’和/或5’端调节序列中的其它基因的表达,从而增加表达,其是为了所选择宿主生物体和基因的最佳表达而选择的。
这些调节序列可进行基因的定向表达和蛋白表达。这意味着,例如,该基因只在诱导之后,根据宿主生物表达和/或超表达,或立即表达和/或超表达。
此外,优选该调节序列或因子对引入基因的表达具有有益的效果,并从而增加表达。因而,调节因子的强化可通过使用强转录信号,如启动子和/或增强子,在转录水平进行。然而,除此之外,也可以通过提高mRNA的稳定性来提高翻译。
通过各种诱变方法,例如,定点诱变,易错聚合酶链反应和/或基因改组,可按照所期望的方向增加和/或改变底物的特异性。
也可以增加酶的活性。通过修饰催化位点可增加酶活性和底物特异性。该增加也可以通过修饰酶而获得,以便酶的抑制物不再结合或仅仅微弱的结合。
修饰酶的有效方法是上述,例如,定点诱变(见D.M.Glover等,DNA Cloning,Vol.1,1995,IRL Press,chapter 6,pages 193 etseq.,ISBN 019-963476-9),使用dITP的PCR随机诱变(Spee等,Nucleic Acids Res.,Vol.21,No.3,1993:777-778)或体外重组技术(Stemmer,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,Vol.91,1994:10747-10751)。
在载体的其它实施方案中,本发明的基因构造也可以插入到线形DNA形式的微生物中,或通过异源或同源重组而整合到宿主生物体的基因组中。此线形DNA作为载体可能是由线性化的质粒或仅仅是核酸片段所组成的。
也可以使用任一质粒(特别是藏匿来源于啤酒糖酵母的2μ质粒复制起点的质粒),其在细胞中经过自主复制,和,如上所述,整合到宿主基因组中的线形DNA片段作为载体。此整合可通过异源或同源重组而进行,如上所述,优选通过同源重组进行(Steiner等,Genetics,Vol.140,1995:973-987)。
在Matsushima等(J.Bacteriol.,Vol.169,No.5,1987:2298-2300,表1),de Schrijver等(Appl.Environ.Microbiol.,Vol.63,No.5,1997:1911-1916,表1)或Bierman等(Gene116,1992:43-49,表1)中描述了适于链霉菌属,红球菌属,诺卡氏菌属或无枝酸菌属的其它载体。
为了最佳表达生物体中的异源基因,可修饰核酸序列,以使其适于生物体中特异性密码子的使用。该密码子的使用可以通过相关生物体中其它已知基因的计算机分析而很容易地确定。
卤化酶基因表达水平的增加可以在各种水平进行,如增加基因拷贝数,或通过修饰调节因子而增强基因表达。因而,调节因子的强化优选在转录水平(例如,较强启动子和/或增强子的使用)或在翻译水平(例如增加mRNA的稳定性)进行。也可以通过超表达而获得完整的糖肽抗生素的克隆。
本发明进一步涉及在SEQ ID NO:1中详列的序列,和从其衍生的蛋白序列(SEQ ID NO:2)。
超表达是通过无枝酸菌属的实施例描述的。在扩增之后克隆bhaA基因,以产生适当的强红霉素启动子(ermE)的卵裂位点下游。后者可较好地作用于无枝酸菌属。其它适当的启动子是噬菌体718的构成噬菌体启动子SF14(Labes等,Microbiology 147,1997:1503-1512)或硫链丝菌素-诱导的tipA启动子(Murakami等,1989,J.Bacteriol.171,1459-66,Takano等,1995,Gene,166:133-137)。基因表达是用复制载体或整合载体进行的。用整合载体,例如经由噬菌体phiC31附着位点的表达(Muth,G.,Brolle,G.F.,Wohlleben,W.,1999)具有许多优点;因而,对于产物,例如,抗生素的制备没有不利的效果,且不需要通过将抗生素加入到培养基中而使基因稳定。对于整合有益的质粒是,例如,pSET152(Bierman等,1992,Gene116,43-49)。有益的复制无枝酸菌属载体是pMEA100(Moretti,P等,1985,Plasmid,14,126-133),pMEA300(Vrijbloed,J.W.等,1995,Plasmid,34,96-104)或pA387(Lal,R.等,1995,Appl.Environ.Microbiol. 57,665-67)及其衍生物。
也可以用melC启动子(Schmitt John,T.和Engles,J.W.,1992,Appl.Microbiol.Biotechnol.36,493-498),例如,用质粒pIJ702(Katz,E.等,1982,J.Gen.Microbiol.,192,2703-2714)或ermE启动子的下游(Bibb,M.J.和Janssen,G.R.Unusual featuresof transcription and translation of antibiotic resistancegenes in antibiotic producing Streptomyces,Inproceedings ofthe fifth International Symposium on the genetics ofIndustrial Microorganismus,pp.309-318,Edited byM.Alacevic,D.Hranneli和Z.Toman,Karlovac,Yugoslavia:Ojnejin Prica Printing Works),用质粒pM4(Quiros,L.M.等,1998,Mol.Microbiol.,28,1177-1185)表达。
本发明还包括含SEQ ID NO:1或上述核酸片段或所述载体的生物。
实施例实施例1:balhimycin卤化酶基因bhaA的分离和鉴定
balhimycin生物合成基因聚簇是使用反向遗传学方法克隆和鉴定的。保守引物Gly1和Gly7均来源于糖基转移酶(GtfA-GtfE),它的基因是从糖肽抗生素-生产者东方拟无枝酸菌A82846和东方拟无枝酸菌C329.4分离的,且其涉及糖肽抗生素chloroeremomycin(A82846B)和万古霉素(Solenberg等,1997)的生物合成[引物Gly1的序列:5′-TCCCCCCGGGIWSSCGCGGIGACGTSGA-3′;引物Gly7的序列:5′-TCCCCCCGGGTGGTGGATSRCSGCSGCSACSCGICCGAA-3′(I:肌苷;S:C/G;W:A/T)]。也可以借助于PCR(见下面)从balhimycin的生产者地中海拟无枝酸菌DSM5908的染色体扩增约900bp大小的内部糖基转移酶基因片段。PCR:PCR设备:RoboCycler Gradient 40 Thermocycler
(Stratagene)试剂盒:Expand High Fidelity PCR System(Boehringer)PCR混合物(100μl):50pmol的引物Gly150pmol的引物Gly70.1μg来源于地中海拟无枝酸菌DSM5908的基因组DNA200μM的dNTPs(每份)10μl的10×反应缓冲液1.5μl的MgCl23μl的MSO3,5U的Taq DNA聚合酶PCR程序:变性: 95. 5分钟聚合酶的加入: 72. 10分钟变性: 94. 70秒退火: 59-63. 70秒延伸: 72. 90秒35次循环延伸: 72. 10分钟
在从DNA杂交试验(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989).Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2nd edn.ColdSpring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory)中的粘粒载体pOJ446(Gaisser,S等,1997,J.Bacteriol.179:6271-6278中的基因文库结构)中的地中海拟无枝酸菌构造粘粒基因文库后,使用此片段鉴定推定的balhimycin生物合成基因的聚簇。也可以用这种方法鉴定具有约36kb插入片段的粘粒16.1。在序列分析中发现,与基因探针同源的区域可编码全部三种糖基转移酶基因(bgtfA-bgtfC),从其衍生的产物的基因显示了与预先从其它糖肽抗生素生产者(Solenberg等,1997,见上述)分离出来的糖基转移酶(GtfA-GtfC)非常高的相似性。
通过各种基因灭活试验可明确地显示,16.1上的聚簇中的各基因,如糖基转移酶的基因和细胞色素P450-依赖的单加氧酶的基因涉及balhimycin的生物合成。这提供了balhimycin生物合成基因聚簇的鉴定证据。
可按照Pelzer等(Antimicrob.Agents Chemother.July 1999,Vol 43,No.7,in press and J.Biotechnol.,56,1977,115-128)中的描述进行该试验。
在鉴定了卤化酶基因bhaA之后(见实施例2),发现bhaA与三种加氧酶基因(oxyA-C)和三中糖基转移酶基因(bgtfA-C)是侧面连接的。可将该基因定位于BamHI片段,该片段约3kb大小,且预先被亚克隆成载体pVC19。
片段的双链测序揭示了具有68.8%的平均G/C含量,且大小为3088bp(Sanger,F.S.等,1977,Proc.Natl.Acad.Sci,USA,74:5463-5467)。核苷酸序列的ORF分析(Staden,R.,和Mc Lachlan,A.D.,1982,Nucleic Acids Res.,10:141-156)可鉴定三种可读框(见图1)。基因bhaA位于这样一种片段上,其中该片段与加氧酶基因oxyC的一部分和糖基转移酶基因bgtfA的一部分侧面连接。该基因具有ATG起始密码子和TGA终止密码子。在此序列中找不到典型的链霉菌属启动子。有效的RBS(=核糖体结合位点)AGAGG位于起始密码子前的11个核苷酸上(见bhaA基因的序列图2。该基因是通过起始密码子和终止密码子定义的,其各自被emboldened)。实施例2:bhaA基因功能的证实
bhaA基因的功能是通过生产符合读框的缺失突变体加以证实的。为了预先排除对下列来源于外源DNA的基因的任何极性效果而生产符合读框的缺失,其经常可在基因破坏或基因置换试验中观察到。该符合读框的缺失突变体是在第2步中产生的。
首先,生产基因置换突变体PH3(见图5,基因置换突变体PH3的产生),并将其专门用于制备符合读框的缺失突变体PH4(见图6,符合读框的缺失突变体PH4的产生)(见图3,balhimycin卤化酶基因bhaA符合读框的缺失和基因置换的质粒的构造,+图4,balhimycin卤化酶基因bhaA符合读框的缺失和基因置换的质粒的构造)。构造必需载体的起始质粒是pVC18衍生物(pVC18B3.0),其载有大小为3088bp,且位于bhaA基因上的BamHI片段,inter alia(见图3,balhimycin卤化酶基因bhaA符合读框的缺失和基因置换的质粒的构造)。除非另有所述,否则按Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,F.,1989,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2ndedn,Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory进行所有DNA的分离,限制切割和克隆。
此质粒是通过MluI消化而线性化的。切割位点是唯一的,且约位于片段的中部。969bp符合读框的缺失在bhaA基因中的引入是借助于PCR进行的。按下列方法设计两种引物(引物2和3),首先,引入符合读框的缺失并,附带地,通过引物生产唯一的BglII切割位点(见图3)。
该引物具有下列序列:
引物2:5′-CTCACAGATCTGATACCGCGGGAAA-3′
引物3:5′-CTACCAGATCTACGTGAACGAGGAG-3′
PCR设备:Thermocycler PTC100 von MJ Research
试剂盒:Expand High Fidelity PCR System(Boehringer)
PCR混合物(50μl):
主混合物1(25μl):
200μM dNTP混合物
200nM引物2
200nM引物3
1-10ng的模板DNA
1.5μl的DMSO
主混合物2(25μl):
5μl的10×PCR缓冲液2
0.75μl的酶混合物
将主混合物和2一起移液
PCR程序:
变性: 94. 3分钟
退火: 65. 30秒
延伸: 68. 4分钟
变性: 94. 45秒
10次循环
退火: 65. 30秒
延伸: 68. 4分钟+20秒/循环
变性: 94. 45秒
15次循环
延伸: 72. 7分钟
将PCR片段重新连接以生产载体pUC18BΔ(图4)。同时,为了生产基因置换突变体PH3,把氯霉素抗性基因猫(Gil等,1985,Gene38,1-8)作为BclI片段插入到BglII卵裂位点中。该载体被称作pUC8cat(图4)。为了插入到地中海拟无枝酸菌DSM908中,将这两个插入片段作为EcoRI/SphI片段克隆成载体pSPl(Pelzer等,1997),其在balhimycin生产者中是不复制的,且可用于基因灭活,从而产生质粒pPH4(缺失构造)和pPH3(基因置换构造)(图4)。
首先生产基因置换突变体PH3。这是通过直接转化方法,用质粒PH3转化balhimycin生产者而进行的(Pelzer等,1997)。可以通过适当的选择(氯霉素抗性和红霉素敏感性,图5)鉴定置换突变体PH3并通过DNA杂交证实它(Sambrook,见上述)。
然后用缺失质粒pPH4转化此基因置换突变体PH3。原始选择是通过同源重组整合全部载体(氯霉素抗性和红霉素抗性,图6)。然后除去同源重组所致的载体消除选择压力。以此方法找到了氯霉素-敏感的和红霉素-敏感的群体。通过DNA杂交可以证实突变体PH4是bhaA基因中正确的符合读框的缺失突变体。
HPLC/MS研究和同位素模式的分析揭示了PH4现在仅生产非氯化的balhimycin衍生物。此方法显示BhaA可在AA的2位和6位氯化(见下列实施例)。实施例3突变体PH4的生物合成代谢a)电喷射质谱的分析结果突变体PH4
除了缺乏氯化之外,克隆PH4的产物光谱与野生型的相对应。然而,未糖基化的化合物(化合物7Δ,8Δ,9Δ)是在此突变体的培养基滤液中检测到的,而不是在野生型的产物光谱中检测。图7表示balhimycin的结构。表1:通过HPLC/ES-MS鉴定的野生型和突变体的化合物产物光谱。未氯化的生物合成产物用“Δ”标记。
“Δ”=高离子强度;“+”=中等离子强度;“○”=低离子强度
代码 | 代谢物 | M.W. | Wt | PH4 |
(1) | Balhimycin | 1445,4 | + | |
(1Δ) | 脱氯balhimycin | 1377,5 | + | |
(2) | Balhimycin V | 1586,5 | +(1604,5) | |
(2Δ) | 1518,6 | ○(1536,4) | ||
(3) | 甲基Balhimycin | 1459,4 | + | |
(3Δ) | 1391,5 | + | ||
(5) | M43C | 1318,4 | + | |
(5Δ) | 1250,4 | + | ||
(6) | Desvancosaminvancomycin | 1304,3 | + | |
(6Δ) | 1236,4 | |||
(7) | 甲基糖苷配基 | 1156,3 | ||
(7Δ) | 1088,4 | + | ||
(8) | HD-1142 | 1142,3 | ||
(8Δ) | 1074,4 | + | ||
(9) | HD-1128 | 1128,3 | ||
(9Δ) | 1060,4 | + |
使用HPLC/MS的培养物滤液的研究结果表明氯化由于符合读框的突变而不再发生。经由特征性同位素分布的质谱检测在化学上是清楚的。来源于突变体PH4的所有检测的化合物均显示与所检测的野生型化合物相比,68amu=2个Cl原子的质量差值。
MS分析只能得出定性,或所产生的各产物最多半定量的结论。然而,从分子离子的强度可检测生物合成产物的量。
图8:脱氯balhimycin(突变体PH4)和balhimycin(野生型)的ES质谱。特征性的同位素模式证明了卤化酶BhaA的灭活作用。线光谱与理论上所期望的同位素分布相对应。b)最佳的纯化肽的纯化
为了除去用于选择的红霉素,用等体积的醋酸乙酯提取过滤的培养物上清液三次。在装填XAD16柱前,再通过瓷玻璃(过滤器G3)过滤培养物的上清液,并按照表2所示进行梯度洗脱。真空除去溶剂,并冷冻干燥之后,通过HPLC/MS分析该部分粗肽的含量。
表2:在XAD吸附树脂上进行色谱分离的参数
制备性的RP 18 HPLC
参数 | 脱氯代谢物 |
柱 | XAD-16 |
柱床体积 | 500ml |
平衡缓冲液 | H2O |
样品 | 培养基中有400ml |
洗脱剂(逐级梯度洗脱) | 水/甲醇(1l洗脱剂/步) |
I | 0%甲醇 |
II | 10%甲醇 |
II | 20%甲醇 |
IV | 40%甲醇 |
V | 60%甲醇 |
VI | 80%甲醇 |
VII | 100%甲醇 |
部分数: | 7 |
流速 | 4柱床体积/h |
将粗肽部分溶解在原始的梯度中(H2O∶ACN(9∶1);0.1%TFA)中,并过滤(Millex-GV;0.22μm;Millipore)。用ES-MS分析分离之后收集的部分,冷冻干燥并组合。分析参数色谱 Waters 600 Multisolvent Delivery System
(Waters)检测器 Lamda-Max,Model 481(Waters)柱 Nucleosil RP-C18,5μm;20×250mm
(Grom,Herrenberg)样品装填阀门 Altex 210 Valve(Beckmann)装填量 10mg的粗肽分离参数洗脱剂 A:水(0.1%TFA)
B:乙腈2(0.1%TFA)流速 10ml/min检测波长 214nm
表3:分离脱氯代谢物的梯度HD代谢物
c)电喷射光谱
t/min | %A | %B |
0 | 90 | 10 |
12 | 80 | 20 |
41 | 80 | 20 |
42 | 78 | 22 |
47 | 76 | 24 |
57 | 74 | 26 |
62 | 70 | 30 |
67 | 68 | 32 |
90 | 100 | 0 |
在API-III三倍四极质谱仪(Sciex,Thornhill,Canada)上记录ES质谱。除非另有说明,将样品溶解在CAN/H2O(1∶1,0.1%甲酸)中,该光谱是以阳离子模式记录的。分离之后,通过微孔泵(140A,solventDelivery System,ABI,Weiterstadt),以5μl/min的流速装填样品。用UV检测器(Linear UVVIS 204,Linear Instruments,Reno,Nevada)检测。所用的流动相是0.1%三氟醋酸(洗脱剂A)和具有0.1%三氟醋酸的乙腈(洗脱剂B)。在分析柱上进行分离(Nucleosil RP-C18,5μm,2×100mm,Grom,Herrenberg)。脱氯balhimycin
用于检测脱氯balhimycin代谢物的最佳梯度(表4)
表4:用于脱氯balhimycin衍生物HPLC/MS分析的最佳梯度
t(min) | 0 | 1 | 15 | 17 |
H2O | 95 | 83 | 80 | 0 |
ACN | 5 | 17 | 20 | 100 |
序列表<110>BASF Aktiengesellschaft<120>含卤化酶的核酸片段和载体
及卤化化合物的方法<130>卤化酶NAE990440<140>NAE 990440<141>1999-06-11<160>2<170>PatentIn Vers.2.0<210>1<211>1620<212>DNA<213>地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)<220><221>CDS<222>(84)..(1559)<400>1atcgggttcc ggtcacctgg tagcgcaatc cgggttgaaa accagcctcg gcaatttgac 60actcgacaga ggaatggtgg gag atg tcg gtc gaa gac ttc gac gtg gtg gtg 113
Met Ser Val Glu Asp Phe Asp Val Val Val
1 5 10gcg ggc ggc ggg ccg ggt ggt tcg acg gtg gcc acg ctg gtg gcc atg 161Ala Gly Gly Gly Pro Gly Gly Ser Thr Val Ala Thr Leu Val Ala Met
15 20 25cag gga cac cgg gtg ctg ctg ctg gag aaa gag gtt ttc ccg cgg tat 209Gln Gly His Arg Val Leu Leu Leu Glu Lys Glu Val Phe Pro Arg Tyr
30 35 40cag atc ggt gag tcg ctg ctg ccc gcc acg gtg cac ggc gtg tgc cgg 257Gln Ile Gly Glu Ser Leu Leu Pro Ala Thr Val His Gly Val Cys Arg
45 50 55atg ctc ggc atc tcc gac gag ctg gcc aat gcc ggg ttc ccg atc aag 305Met Leu Gly Ile Ser Asp Glu Leu Ala Asn Ala Gly Phe Pro Ile Lys
60 65 70cgc ggc ggc acg ttc cgc tgg ggc gcc cgg ccg gag ccg tgg acg ttc 353Arg Gly Gly Thr Phe Arg Trp Gly Ala Arg Pro Glu Pro Trp Thr Phe 75 80 85 90cac ttc ggc atc tcg gcc aag atg gcc ggc tcg acg tcg cac gcc tac 401His Phe Gly Ile Ser Ala Lys Met Ala Gly Ser Thr Ser His Ala Tyr
95 100 105cag gtc gag cgg gcg cgg ttc gac gag atg ctg ctg aac aac gcc aag 449Gln Val Glu Arg Ala Arg Phe Asp Glu Met Leu Leu Asn Asn Ala Lys
110 115 120cgc aag ggc gtg gtc gtg cgg gag ggg tgc gcg gtc acc gat gtg gtg 497Arg Lys Gly Val Val Val Arg Glu Gly Cys Ala Val Thr Asp Val Val
125 130 135gaa gac ggc gag cgg gtc acc ggt gcg cgg tac acc gat ccc gac ggc 545Glu Asp Gly Glu Arg Val Thr Gly Ala Arg Tyr Thr Asp Pro Asp Gly140 145 150acc gag cgg gaa gtg tcg gcg cgg ttc gtg atc gac gcg tcg ggc aac 593Thr Glu Arg Glu Val Ser Ala Arg Phe Val Ile Asp Ala Ser Gly Asn155 160 165 170aag agc cgg ctc tac acc aag gtc ggc ggt tcg cgg aac tat tcg gag 641Lys Ser Arg Leu Tyr Thr Lys Val Gly Gly Ser Arg Asn Tyr Ser Glu
175 180 185ttc ttc cgc agc ctc gcg ctg ttc ggt tac ttc gag ggt ggc aag cgg 689Phe Phe Arg Ser Leu Ala Leu Phe Gly Tyr Phe Glu Gly Gly Lys Arg
190 195 200ctg ccc gag ccg gtc tcc ggg aac atc ctg agt gtg gcc ttc gac agc 737Leu Pro Glu Pro Val Ser Gly Asn Ile Leu Ser Val Ala Phe Asp Ser
205 210 215ggc tgg ttc tgg tac atc ccg ctg agc gac acg ctg acc agc gtc ggc 785Gly Trp Phe Trp Tyr Ile Pro Leu Ser Asp Thr Leu Thr Ser Val Gly220 225 230gcg gtg gtg cgc cgg gag gac gcc gag aag atc cag ggt gac cgg gag 833Ala Val Val Arg Arg Glu Asp Ala Glu Lys Ile Gln Gly Asp Arg Glu235 240 245 250aag gcc ctc aac acg ctg atc gcc gag tgc ccg ctg atc tcg gaa tac 881Lys Ala Leu Asn Thr Leu Ile Ala Glu Cys Pro Leu Ile Ser Glu Tyr
255 260 265ctc gcg gac gcg acc cgg gtg acg acc ggc cgg tac ggg gaa ctg cgc 929Leu Ala Asp Ala Thr Arg Val Thr Thr Gly Arg Tyr Gly Glu Leu Arg
270 275 280gtc cgc aag gac tac tcc tac cag cag gag acc tac tgg cgg ccg ggc 977Val Arg Lys Asp Tyr Ser Tyr Gln Gln Glu Thr Tyr Trp Arg Pro Gly
285 290 295atg atc ctg gtc ggc gac gcc gcg tgt ttc gtg gac ccg gtg ttc tcc 1025Met Ile Leu Val Gly Asp Ala Ala Cys Phe Val Asp Pro Val Phe Ser300 305 310tcc ggt gtg cac ctg gcg acc tac agc gcg ctg ctc gcg gcc cgg tcg 1073Ser Gly Val His Leu Ala Thr Tyr Ser Ala Leu Leu Ala Ala Arg Ser315 320 325 330atc aac agc gtc ctc gcc ggc gac ctg gac gag aag acc gcg ctg aac 1121Ile Asn Ser Val Leu Ala Gly Asp Leu Asp Glu Lys Thr Ala Leu Asn
335 340 345gag ttc gag ctg cgg tat cgc cgt gag tac ggc gtg ttc tac gag ttc 1169Glu Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Arg Glu Tyr Gly Val Phe Tyr Glu Phe
350 355 360ctc gtg tcc ttc tac cag atg aac gtg aac gag gag tcg tac ttc tgg 1217Leu Val Ser Phe Tyr Gln Met Asn Val Asn Glu Glu Ser Tyr Phe Trp
365 370 375cag gcc aag aag gtc acg cag aac cag agc acc gac gtc gag tcg ttc 1265Gln Ala Lys Lys Val Thr Gln Asn Gln Ser Thr Asp Val Glu Ser Phe380 385 390gtc gag ctg atc ggc gga gtg tcg tcc ggg gag acc gcg ctg acg gcc 1313Val Glu Leu Ile Gly Gly Val Ser Ser Gly Glu Thr Ala Leu Thr Ala395 400 405 410gcc gac cgc atc gcc gcg cgc agt gcc gag ttc gcc gcg gcg gtg gac 1361Ala Asp Arg Ile Ala Ala Arg Ser Ala Glu Phe Ala Ala Ala Val Asp
415 420 425gag atg gcg ggc ggg gac ggc gac aac atg gtg ccg atg ttc aag tcg 1409Glu Met Ala Gly Gly Asp Gly Asp Asn Met Val Pro Met Phe Lys Ser
430 435 440acg gtg gtc cag cag gcg atg cag gaa gcg ggc cag gtg cag atg aag 1457Thr Val Val Gln Gln Ala Met Gln Glu Ala Gly Gln Val Gln Met Lys
445 450 455gcg ctg ctc ggc gag gac gcc gaa ccc gag ctg ccc ctg ttc ccc ggt 1505Ala Leu Leu Gly Glu Asp Ala Glu Pro Glu Leu Pro Leu Phe Pro Gly460 465 470ggc ctg gtg acc tcg ccc gaa cgg atg aag tgg ctg cct cac cac cct 1553Gly Leu Val Thr Ser Pro Glu Arg Met Lys Trp Leu Pro His His Pro475 480 485 490gcg tga agcctgtgcg cgccggccgt tcgcgggtgg ccgggacctg cggaacaacc 1609Alatatggaaaaa c 1620<210>2<211>491<212>PRT<213>地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)<400>2Met Ser Val Glu Asp Phe Asp Val Val Val Ala Gly Gly Gly Pro Gly1 5 10 15Gly Ser Thr Val Ala Thr Leu Val Ala Met Gln Gly His Arg Val Leu
20 25 30Leu Leu Glu Lys Glu Val Phe Pro Arg Tyr Gln Ile Gly Glu Ser Leu
35 40 45Leu Pro Ala Thr Val His Gly Val Cys Arg Met Leu Gly Ile Ser Asp
50 55 60Glu Leu Ala Asn Ala Gly Phe Pro Ile Lys Arg Gly Gly Thr Phe Arg65 70 75 80Trp Gly Ala Arg Pro Glu Pro Trp Thr Phe His Phe Gly Ile Ser Ala
85 90 95Lys Met Ala Gly Ser Thr Ser His Ala Tyr Gln Val Glu Arg Ala Arg
100 105 110Phe Asp Glu Met Leu Leu Asn Asn Ala Lys Arg Lys Gly Val Val Val
115 120 125Arg Glu Gly Cys Ala Val Thr Asp Val Val Glu Asp Gly Glu Arg Val130 135 140Thr Gly Ala Arg Tyr Thr Asp Pro Asp Gly Thr Glu Arg Glu Val Ser145 150 155 160Ala Arg Phe Val Ile Asp Ala Ser Gly Asn Lys Ser Arg Leu Tyr Thr
165 170 175Lys Val Gly Gly Ser Arg Asn Tyr Ser Glu Phe Phe Arg Ser Leu Ala
180 185 190Leu Phe Gly Tyr Phe Glu Gly Gly Lys Arg Leu Pro Glu Pro Val Ser
195 200 205Gly Asn Ile Leu Ser Val Ala Phe Asp Ser Gly Trp Phe Trp Tyr Ile210 215 220Pro Leu Ser Asp Thr Leu Thr Ser Val Gly Ala Val Val Arg Arg Glu225 230 235 240Asp Ala Glu Lys Ile Gln Gly Asp Arg Glu Lys Ala Leu Asn Thr Leu
245 250 255Ile Ala Glu Cys Pro Leu Ile Ser Glu Tyr Leu Ala Asp Ala Thr Arg
260 265 270Val Thr Thr Gly Arg Tyr Gly Glu Leu Arg Val Arg Lys Asp Tyr Ser
275 280 285Tyr Gln Gln Glu Thr Tyr Trp Arg Pro Gly Met Ile Leu Val Gly Asp290 295 300Ala Ala Cys Phe Val Asp Pro Val Phe Ser Ser Gly Val His Leu Ala305 310 315 320Thr Tyr Ser Ala Leu Leu Ala Ala Arg Ser Ile Asn Ser Val Leu Ala
325 330 335Gly Asp Leu Asp Glu Lys Thr Ala Leu Asn Glu Phe Glu Leu Arg Tyr
340 345 350Arg Arg Glu Tyr Gly Val Phe Tyr Glu Phe Leu Val Ser Phe Tyr Gln
355 360 365Met Asn Val Asn Glu Glu Ser Tyr Phe Trp Gln Ala Lys Lys Val Thr370 375 380Gln Asn Gln Ser Thr Asp Val Glu Ser Phe Val Glu Leu Ile Gly Gly385 390 395 400Val Ser Ser Gly Glu Thr Ala Leu Thr Ala Ala Asp Arg Ile Ala Ala
405 410 415Arg Ser Ala Glu Phe Ala Ala Ala Val Asp Glu Met Ala Gly Gly Asp
420 425 430Gly Asp Asn Met Val Pro Met Phe Lys Ser Thr Val Val Gln Gln Ala
435 440 445Met Gln Glu Ala Gly Gln Val Gln Met Lys Ala Leu Leu Gly Glu Asp450 455 460Ala Glu Pro Glu Leu Pro Leu Phe Pro Gly Gly Leu Val Thr Ser Pro465 470 475 480Glu Arg Met Lys Trp Leu Pro His His pro Ala
485 490
Claims (14)
1.一种卤化方法,其包含在有卤化酶参与的情况下卤化化合物,其中该卤化酶是(a)由SEQ ID NO:1中详列的序列,或是一种以遗传密码的简并性为基础,从其得来的序列编码的,或是(b)由一种核酸序列编码的,该核酸序列编码(a)的功能片段,或(c)由一种序列编码的,该序列在标准条件下与(a)或(b)杂交,或是(d)由一种序列编码的,该序列具有与(a)下详列的序列,超过30%的同一性或超过60%的相似性。
2.如权利要求1的方法,其中所用的化合物是通式结构I的化合物:其中通式I中的变量和取代基具有下列含义:R1=氢,羟基,取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷基,C2-C10链烯基,C1-C10烷氧基,C2-C10链烯氧基,R6R7N-,
R2=氢,羟基,取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷基,C1-C10烷氧基,C2-C10链烯基,C2-C10链烯氧基,R6R7N-;R3=氢,羟基,取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷基,C1-C10烷氧基,C2-C10链烯基,C2-C10链烯氧基,C1-C10烷基羰基,C2-C10链烯基羰基,芳基,杂芳基,R4和R5彼此独立地是氢,羟基,卤素,硝基,氰基,取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷基,C1-C10烷氧基,C2-C10链烯基,C2-C10链烯氧基,取代或未取代的C3-C10环烷基,芳基,杂芳基,R6R7N-,且其中两个基团R4和R5的相邻碳原子可共同形成另一取代或未取代的,芳香的,饱和或部分饱和的具有5-6个原子的环,该环中还可以包含一个或多个杂原子,如O,N或S;R6和R7彼此独立地是氢或取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷基;R8=取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷基,C2-C10链烯基,取代或未取代的芳基;R9=取代或未取代的,支链或无支链的C1-C10烷基,C2-C10链烯基,取代或未取代的芳基,杂芳基;X=-CH-或N;Y=O或N;m=0或1;n=0,1,2或3;p=0或1。
3.如权利要求1或2的方法,其中将含卤化酶或游离酶的微生物用于该方法中。
4.如权利要求1-3的方法,其中将至少一种天然或合成的电子供体用于该方法中。
5.如权利要求1-4的方法,其中在其它反应的过程中有电子供体的再生。
6.如权利要求1-5的方法,其中将细菌,真菌,酵母,植物或动物细胞用作微生物。
7.如权利要求1-6的方法,其中将无枝酸菌属,诺卡氏菌属,红球菌属,棒杆菌属,短杆菌属,梭菌属,微球菌属,链霉菌属,分枝杆菌属,戈登氏菌属,放线菌属,埃希氏菌属,沙门氏菌属,芽孢杆菌属,假单胞杆菌属,汉逊氏酵母属,假丝酵母属,毕赤氏酵母属,红酵母属,掷孢酵母属,糖酵母属,裂殖糖酵母属,Yarrowia,曲霉属,白僵菌属,Canninghamella,毛霉菌属,脉孢霉属,青霉属或丝核菌属的生物用于该方法中。
8.如权利要求1-7的方法,其中该方法是用静息细胞或生长细胞进行的。
9.如权利要求1-8的方法,其中将无机的卤化物用作卤素供体。
10.如权利要求1-9的方法,其中该方法是在有缓冲液参与的情况下,或在pH-控制的条件下进行的。
11.一种含卤化酶的核酸片段,其中的卤化酶是(a)由SEQ ID NO:1中详列的序列,或是一种以遗传密码的简并性为基础,从其得来的序列编码的,或是(b)由一种核酸序列编码的,该核酸序列编码(a)的功能片段,或(c)由一种序列编码的,该序列在标准条件下与(a)或(b)杂交,或是(d)由一种序列编码的,该序列具有与(a)下详列的序列超过30%的同一性或超过60%的相似性。
该核酸片段由一种或多种同源或异源调节信号有功能地连接,该调节信号用以提高基因表达或蛋白表达和/或其天然调节被消除。
12.一种含权利要求11的核酸片段的载体。
13.一种含权利要求11的核酸片段或权利要求12的载体的生物。
14.由卤化酶基因编码的蛋白在化学合成中的用途,其中的卤化酶基因具有SEQ ID NO:1中详列的序列,权利要求11的核酸片段,或权利要求12的载体。
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