JP2002516108A - リボフラビンの遺伝的製法 - Google Patents
リボフラビンの遺伝的製法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、リボフラビンの遺伝的製法に関する。生物、殊に細菌、真菌、酵母及び植物中でのリボフラビン生合成の遺伝子又はその組み合わせ及びその発現のの特異的選択により、それら生物中でのリボフラビン生産性が高められる。更に本発明は、配列番号１、配列番号３又は配列番号５の配列を有する遺伝子を含有する核酸フラグメント又はそれらの均等物、この核酸フラグメントを含有する発現ベクター及び少なくとも１個の核酸フラグメント又は少なくとも１個のベクターを含有する生物に関する。
Description
【０００１】 本発明は、リボフラビンの遺伝的製法に関する。生物、殊に細菌、真菌、酵母
及び植物中のリボフラビン生合成の遺伝子又はそれらの組み合わせ及びその発現
の特別な選択により、これら生物中でのリボフラビン生産性が増大される。
及び植物中のリボフラビン生合成の遺伝子又はそれらの組み合わせ及びその発現
の特別な選択により、これら生物中でのリボフラビン生産性が増大される。
【０００２】 更に、本発明は配列番号１、配列番号３又は配列番号５の配列を有する遺伝子
又はそれらの機能的均等物を含有する核酸フラグメント、この核酸フラグメント
を含有する発現ベクター及び少なくとも１個の核酸フラグメント又は少なくとも
１個のベクターを含有する生物に関する。
又はそれらの機能的均等物を含有する核酸フラグメント、この核酸フラグメント
を含有する発現ベクター及び少なくとも１個の核酸フラグメント又は少なくとも
１個のベクターを含有する生物に関する。
【０００３】 ビタミンＢ２（リボフラビンとも称される）は、全ての植物及び多くの微生物
により製造される。ヒト及び動物はこれを合成することができないので、これは
ヒト及び動物にとって必須である。リボフラビンは代謝において重要な役割を演
じる。例えば、これは、炭水化物の利用に寄与する。ビタミンＢ２欠乏症は、口
腔及び咽頭の粘膜の炎症、皮下脂肪及び類似皮膚病変のそう痒症及び炎症、結膜
の炎症、視力低下及び角膜の濁りに結びついている。乳児及び子供においては、
成長の停止及び体重の減少もあり得る。従って、ビタミンＢ２は、例えばビタミ
ン欠乏症用のビタミン製剤及び動物飼料添加剤としての大きい経済的重要性を有
する。これは種々の食料品に添加される。更に、これは、例えばマヨネーズ、ア
イスクリーム、プデイング等中で食品着色料としても使用されている。
により製造される。ヒト及び動物はこれを合成することができないので、これは
ヒト及び動物にとって必須である。リボフラビンは代謝において重要な役割を演
じる。例えば、これは、炭水化物の利用に寄与する。ビタミンＢ２欠乏症は、口
腔及び咽頭の粘膜の炎症、皮下脂肪及び類似皮膚病変のそう痒症及び炎症、結膜
の炎症、視力低下及び角膜の濁りに結びついている。乳児及び子供においては、
成長の停止及び体重の減少もあり得る。従って、ビタミンＢ２は、例えばビタミ
ン欠乏症用のビタミン製剤及び動物飼料添加剤としての大きい経済的重要性を有
する。これは種々の食料品に添加される。更に、これは、例えばマヨネーズ、ア
イスクリーム、プデイング等中で食品着色料としても使用されている。
【０００４】 ビタミンＢ２は化学的に又は微生物学的に製造されている（例えばKurth et a
l., 1996, Riboflavin in Ullmann's Encyclopedia of industrial chemistry,V
CH Weinheim)。化学的製造法の際には、リボフラビンは、通例、多工程で純品最
終製品として得られ、この際、比較的経費のかかる出発物質、例えばＤ−リボー
スを使用しなければならない。
l., 1996, Riboflavin in Ullmann's Encyclopedia of industrial chemistry,V
CH Weinheim)。化学的製造法の際には、リボフラビンは、通例、多工程で純品最
終製品として得られ、この際、比較的経費のかかる出発物質、例えばＤ−リボー
スを使用しなければならない。
【０００５】 リボフラビンの化学的合成の一つの選択は、微生物によるビタミンＢ２の発酵
的製造である。この場合の出発物質は、成長性の原料、例えば糖又は植物油であ
る。真菌類、例えばエレモテシウム アシビイ又はアシビア ゴシピイの発酵に
よるリボフラビンの製造は公知である（The Merck Index, Windholz et al., ed
s. Merck & Co., 1183頁, 1983)が、酵母類、例えばカンジダ、ピチア及びサッ
カロマイセス又は細菌、例えばバシルス、クロストリジア又はコリネバクテリア
もリボフラビン生産体として記載されている。ＥＰ−Ａ−０４０５３７０及びＥ
Ｐ−Ａ−０８２１０６３明細書中には組み換え細菌菌株を用いるリボフラビンの
製造を記載しており、その際、この菌株は、バシルス スブチリスからリボフラ
ビン生合成遺伝子での形質転換により得られている。
的製造である。この場合の出発物質は、成長性の原料、例えば糖又は植物油であ
る。真菌類、例えばエレモテシウム アシビイ又はアシビア ゴシピイの発酵に
よるリボフラビンの製造は公知である（The Merck Index, Windholz et al., ed
s. Merck & Co., 1183頁, 1983)が、酵母類、例えばカンジダ、ピチア及びサッ
カロマイセス又は細菌、例えばバシルス、クロストリジア又はコリネバクテリア
もリボフラビン生産体として記載されている。ＥＰ−Ａ−０４０５３７０及びＥ
Ｐ−Ａ−０８２１０６３明細書中には組み換え細菌菌株を用いるリボフラビンの
製造を記載しており、その際、この菌株は、バシルス スブチリスからリボフラ
ビン生合成遺伝子での形質転換により得られている。
【０００６】 特許ＷＯ９５／２６４０６又はＷＯ９３／０３１８３及びＤＥ４４２０７８５
明細書中には、真核生物アシビア ゴシピイ又はサッカロマイセス セレビジア
エからのリボフラビン生合成のための特異的な遺伝子のクローニング及びこの遺
伝子で形質転換された微生物及びこのような微生物のリボフラビン合成のための
使用を記載している。
明細書中には、真核生物アシビア ゴシピイ又はサッカロマイセス セレビジア
エからのリボフラビン生合成のための特異的な遺伝子のクローニング及びこの遺
伝子で形質転換された微生物及びこのような微生物のリボフラビン合成のための
使用を記載している。
【０００７】 双方の生物中で６酵素が、グアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）及びリブロ
ース−５−ホスフェートから出発するリボフラビンの形成に触媒作用する。この
際、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ−ＩＩ（ｒｉｂ１−遺伝子産生物）がＧＴＰを
２，５−ジアミノ−６−（リボシルアミノ）−４（３Ｈ）−ピリミジノン−５−
ホスフェートに変換させる。後者化合物は、次いで、２，５−ジアミノ−６−（
リボシルアミノ）−４（３Ｈ）−ピリミジノン−５−ホスフェートレダクターゼ
（ｒｉｂ７遺伝子産生物）により還元されて、２，５−ジアミノ−６−リビチル
アミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジン−５−ホスフェートにされ、次いで
、特異的なデアミナーゼ（ｒｉｂ２−遺伝子産生物）により脱アミノされて、５
−アミノ−６−リビチルアミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン−５
−ホスフェートにされる。次いで、このホスフェートは、非特異的ホスファター
ゼにより除去される。
ース−５−ホスフェートから出発するリボフラビンの形成に触媒作用する。この
際、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ−ＩＩ（ｒｉｂ１−遺伝子産生物）がＧＴＰを
２，５−ジアミノ−６−（リボシルアミノ）−４（３Ｈ）−ピリミジノン−５−
ホスフェートに変換させる。後者化合物は、次いで、２，５−ジアミノ−６−（
リボシルアミノ）−４（３Ｈ）−ピリミジノン−５−ホスフェートレダクターゼ
（ｒｉｂ７遺伝子産生物）により還元されて、２，５−ジアミノ−６−リビチル
アミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジン−５−ホスフェートにされ、次いで
、特異的なデアミナーゼ（ｒｉｂ２−遺伝子産生物）により脱アミノされて、５
−アミノ−６−リビチルアミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン−５
−ホスフェートにされる。次いで、このホスフェートは、非特異的ホスファター
ゼにより除去される。
【０００８】 リブロース−５−ホスフェートは、リボフラビン生合成の最終酵素的工程にお
ける第２の出発物質であるＧＴＰと共に、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン
−４−ホスフェート−シンターゼ（ｒｉｂ３−遺伝子産生物）により３，４−ジ
ヒドロキシ−２−ブタノン−４−ホスフェート（ＤＢＰ）に変換される。
ける第２の出発物質であるＧＴＰと共に、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン
−４−ホスフェート−シンターゼ（ｒｉｂ３−遺伝子産生物）により３，４−ジ
ヒドロキシ−２−ブタノン−４−ホスフェート（ＤＢＰ）に変換される。
【０００９】 ＤＢＰ及び５−アミノ−６−リビチルアミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミ
ジンジオンの双方は、６，７−ジメチル−８−リビチルルマジンの酵素合成の出
発物質である。この反応は、ｒｉb4−遺伝子産生物（ＤＭＲＬ−シンターゼ）で
促進される。ＤＭＲＬは、引き続きリボフラビン−シンターゼ（ｒｉｂ５−遺伝
子産生物）により、リボフラビンに変換される（Bacher et al.,（１９９３） B
ioorg. Chem. Front. Vol. 3, Springer Verlag) 。
ジンジオンの双方は、６，７−ジメチル−８−リビチルルマジンの酵素合成の出
発物質である。この反応は、ｒｉb4−遺伝子産生物（ＤＭＲＬ−シンターゼ）で
促進される。ＤＭＲＬは、引き続きリボフラビン−シンターゼ（ｒｉｂ５−遺伝
子産生物）により、リボフラビンに変換される（Bacher et al.,（１９９３） B
ioorg. Chem. Front. Vol. 3, Springer Verlag) 。
【００１０】 リボフラビンの製造のこれらの進歩にも関わらず、増加性需要に適合し、リボ
フラビンの製造をより有効にするために、なおビタミンＢ２生産性が改善され、
増加されるべき必要性が存在する。
フラビンの製造をより有効にするために、なおビタミンＢ２生産性が改善され、
増加されるべき必要性が存在する。
【００１１】 従って、本発明の課題は、ビタミンＢ２生産性を更に改善することである。こ
の課題は、リボフラビンを合成することのできる生物を用いるリボフラビンの増
加製造法により、ここで、酵素３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン−４−ホス
フェート−シンターゼ、ジメチル−８−リビチルルマジン−シンターゼ及びリボ
フラビン−シンターゼ又はそれらの機能的類縁体の活性をこの生物中で増加させ
ることにより解決されることを発見した。リボフラビンのこの増加製造法は、リ
ボフラビンを合成することができ、付加的に酵素３，４−ジヒドロキシ−２−ブ
タノン−４−ホスフェート−シンターゼ（＝ｒｉｂ３−遺伝子産生物）、ジメチ
ル−８−リビチルルマジン−シンターゼ（＝ｒｉｂ４−遺伝子産生物）及びリボ
フラビン−シンターゼ（＝ｒｉｂ５−遺伝子産生物）又はそれらの機能的類縁体
をコードする遺伝子の組み合わせを含有する生物を用いて実施するのが有利であ
る。
の課題は、リボフラビンを合成することのできる生物を用いるリボフラビンの増
加製造法により、ここで、酵素３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン−４−ホス
フェート−シンターゼ、ジメチル−８−リビチルルマジン−シンターゼ及びリボ
フラビン−シンターゼ又はそれらの機能的類縁体の活性をこの生物中で増加させ
ることにより解決されることを発見した。リボフラビンのこの増加製造法は、リ
ボフラビンを合成することができ、付加的に酵素３，４−ジヒドロキシ−２−ブ
タノン−４−ホスフェート−シンターゼ（＝ｒｉｂ３−遺伝子産生物）、ジメチ
ル−８−リビチルルマジン−シンターゼ（＝ｒｉｂ４−遺伝子産生物）及びリボ
フラビン−シンターゼ（＝ｒｉｂ５−遺伝子産生物）又はそれらの機能的類縁体
をコードする遺伝子の組み合わせを含有する生物を用いて実施するのが有利であ
る。
【００１２】 ビタミンＢ２生産性を高めるために、天然の酵素活性の増加及び前記の遺伝子
発現を増加するための前記の遺伝子組み合わせの導入の組み合わせも更に有利で
ある。
発現を増加するための前記の遺伝子組み合わせの導入の組み合わせも更に有利で
ある。
【００１３】 本発明の方法のために好適な生物又は宿主生物は、原則的にはリボフラビンを
合成することのできる全ての生物である。本来リボフラビンを合成することがで
きる生物が有利である。しかしながら、完全なビタミンＢ２合成遺伝子の導入に
基づきリボフラビンを合成することのできる生物も本発明による方法のために好
適である。細菌、酵母、真菌又は植物が本発明による方法のために好適である。
記載可能な例は、真核生物、例えばIndian Chem. Engr. Section B, vol. 37, N
o. 1,2(1995) ,15頁，第６表に記載されている真菌、例えばアシビア又はエレモ
テシウム、酵母、例えばカンジダ、サッカロマイセス又はピチア又は植物、例え
ばシロイスナズナ、トマト、馬鈴薯、トウモロコシ、ダイズ、ヒマ種子、小麦、
大麦、ライ麦、イネ、粟、棉、甜菜、ひまわり、亜麻、大麻、カノーラ（Canola
)、カラスムギ、たばこ、アルファルファ、レタス又は種々の樹木、ナッツ及び
ツタ類又は原核生物、例えばグラム陽性菌又はグラム陰性菌、例えばコリネバク
テリウム、ブレビバクテリウム、バシルス、クロストリジウム、シアノバクター
、エセリキア又はクレブシエラである。有利な生物は、コリネバクテリウム、ブ
レビバクテリウム、バシルス、エセリキア、アシビア、エレモテシウム、カンジ
ダ又はサッカロマイセス属のもの又は植物、例えばトウモロコシ、ダイズ、ヒマ
種子、大麦、小麦、馬鈴薯又はトマトの群から選択される。特に有利な生物は、
アシビア ゴシピイ、エレモテシウム アシビイ、サッカロマイセス セレビジ
アエ、カンジダ フラベリ、カンジダ ファマータ、コリネバクテリウム アン
モニアゲネス又はバシルス スブチリスの種属のものである。特に好適な植物は
トウモロコシ、ダイズ、ヒマ種子、大麦、小麦、馬鈴薯及びトマトである。
合成することのできる全ての生物である。本来リボフラビンを合成することがで
きる生物が有利である。しかしながら、完全なビタミンＢ２合成遺伝子の導入に
基づきリボフラビンを合成することのできる生物も本発明による方法のために好
適である。細菌、酵母、真菌又は植物が本発明による方法のために好適である。
記載可能な例は、真核生物、例えばIndian Chem. Engr. Section B, vol. 37, N
o. 1,2(1995) ,15頁，第６表に記載されている真菌、例えばアシビア又はエレモ
テシウム、酵母、例えばカンジダ、サッカロマイセス又はピチア又は植物、例え
ばシロイスナズナ、トマト、馬鈴薯、トウモロコシ、ダイズ、ヒマ種子、小麦、
大麦、ライ麦、イネ、粟、棉、甜菜、ひまわり、亜麻、大麻、カノーラ（Canola
)、カラスムギ、たばこ、アルファルファ、レタス又は種々の樹木、ナッツ及び
ツタ類又は原核生物、例えばグラム陽性菌又はグラム陰性菌、例えばコリネバク
テリウム、ブレビバクテリウム、バシルス、クロストリジウム、シアノバクター
、エセリキア又はクレブシエラである。有利な生物は、コリネバクテリウム、ブ
レビバクテリウム、バシルス、エセリキア、アシビア、エレモテシウム、カンジ
ダ又はサッカロマイセス属のもの又は植物、例えばトウモロコシ、ダイズ、ヒマ
種子、大麦、小麦、馬鈴薯又はトマトの群から選択される。特に有利な生物は、
アシビア ゴシピイ、エレモテシウム アシビイ、サッカロマイセス セレビジ
アエ、カンジダ フラベリ、カンジダ ファマータ、コリネバクテリウム アン
モニアゲネス又はバシルス スブチリスの種属のものである。特に好適な植物は
トウモロコシ、ダイズ、ヒマ種子、大麦、小麦、馬鈴薯及びトマトである。
【００１４】 本発明によるｒｉｂ遺伝子、ｒｉｂ３、ｒｉｂ４及びｒｉｂ５の組み合わせ及
び／又は遺伝子及びそれらの遺伝子産生物の活性の増加は、著しく増加したリボ
フラビン生産性をもたらす。記載の遺伝子は、原則的に当業者に公知の全ての方
法で使用される生物中に導入でき、これは、有利に、形質転換、トランスフェク
シヨン、いわゆる粒子ガンを用いる電気穿孔又はマイクロインジェクシヨンによ
り生物又はそれらの細胞中に導入される。微生物に対して適当な方法は、当業者
により、教科書Sambrook, J. et. al., (1989)による Molecular cloning: A la
boratory manual, Cold Spring Habor Laboratory Press, F.M. Ausubel et al
.,(1994) によるCurrent protocols in molecular biology,John Wiley and Son
s, D.M. Glover et al.,によるDNA Cloning Vol. 1, (1995), IRL Press (ISBN
019-963476-9), Kaiser et al., (1994)による Methods in Yeast Genetics, C
old Spring Harbor Laboratory Press 又は Guthrie et al., によるGuide to Y
east Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology ,1994, Academ
ic Press 中に見つけることができる。記載できる有利な方法の例は、例えばド
イツ特許出願ＤＥ１９８０１１２０.２に記載されているようなｕｒａ−３遺伝
子、殊にアシビアのｕｒａ−３遺伝子を用いる相同又は非相同組み換えによる及
び／又は後に記載のＲＥＭＩ−法（＝制限酵素介在組み換え）によるＤＮＡの導
入が挙げられる。
び／又は遺伝子及びそれらの遺伝子産生物の活性の増加は、著しく増加したリボ
フラビン生産性をもたらす。記載の遺伝子は、原則的に当業者に公知の全ての方
法で使用される生物中に導入でき、これは、有利に、形質転換、トランスフェク
シヨン、いわゆる粒子ガンを用いる電気穿孔又はマイクロインジェクシヨンによ
り生物又はそれらの細胞中に導入される。微生物に対して適当な方法は、当業者
により、教科書Sambrook, J. et. al., (1989)による Molecular cloning: A la
boratory manual, Cold Spring Habor Laboratory Press, F.M. Ausubel et al
.,(1994) によるCurrent protocols in molecular biology,John Wiley and Son
s, D.M. Glover et al.,によるDNA Cloning Vol. 1, (1995), IRL Press (ISBN
019-963476-9), Kaiser et al., (1994)による Methods in Yeast Genetics, C
old Spring Harbor Laboratory Press 又は Guthrie et al., によるGuide to Y
east Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology ,1994, Academ
ic Press 中に見つけることができる。記載できる有利な方法の例は、例えばド
イツ特許出願ＤＥ１９８０１１２０.２に記載されているようなｕｒａ−３遺伝
子、殊にアシビアのｕｒａ−３遺伝子を用いる相同又は非相同組み換えによる及
び／又は後に記載のＲＥＭＩ−法（＝制限酵素介在組み換え）によるＤＮＡの導
入が挙げられる。
【００１５】 ＲＥＭＩ−技術は、ＤＮＡ構造の制限のために使用された制限エンドヌクレア
ーゼと一緒の同じ制限エンドヌクレアーゼで両方の末端で切断された線状ＤＮＡ
構造の、生物中への共形質転換(Kotransformation)に基づく。次いで、制限エン
ドヌクレアーゼは、この制限酵素と一緒にＤＮＡ構造が導入された生物のゲノム
ＤＮＡを切断する。このことは、細胞特有の修復機構の活性化をもたらす。この
修復機構は、ゲノムＤＮＡのエンドヌクレアーゼにより惹起されたストランド破
断を修復し、この際に、特定の頻度で、ゲノム中への共形質転換されたＤＮＡ構
造の導入に結びついてもいる。この場合には、通常は、このＤＮＡの両末端での
制限切断位置が保留される。
ーゼと一緒の同じ制限エンドヌクレアーゼで両方の末端で切断された線状ＤＮＡ
構造の、生物中への共形質転換(Kotransformation)に基づく。次いで、制限エン
ドヌクレアーゼは、この制限酵素と一緒にＤＮＡ構造が導入された生物のゲノム
ＤＮＡを切断する。このことは、細胞特有の修復機構の活性化をもたらす。この
修復機構は、ゲノムＤＮＡのエンドヌクレアーゼにより惹起されたストランド破
断を修復し、この際に、特定の頻度で、ゲノム中への共形質転換されたＤＮＡ構
造の導入に結びついてもいる。この場合には、通常は、このＤＮＡの両末端での
制限切断位置が保留される。
【００１６】 これらの技術は、ブレーカー（Broeker)等により真菌の挿入突然変異に関して
記載された（Mol Gen Genet, 248,1995: 547-552)。Schiestl and Petes (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA,88，1991: 7585-7589)は、サッカロマイセスにおいて非
相同組み換えが起こるか否かを明白にする方法を用いた。この方法はブラウン（
Ｂｒｏｗｎ）等により誘導可能なリポーター遺伝子の安定な形質転換及び調節さ
れた発現のために記載された（Mol. Gen. Genet. 251, 1996: 75-80)。この系は
、従来は、物質代謝経路の最適化のため又は蛋白質の市場的過剰発現のための遺
伝技術用具としてはなお使用されていなかった。
記載された（Mol Gen Genet, 248,1995: 547-552)。Schiestl and Petes (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA,88，1991: 7585-7589)は、サッカロマイセスにおいて非
相同組み換えが起こるか否かを明白にする方法を用いた。この方法はブラウン（
Ｂｒｏｗｎ）等により誘導可能なリポーター遺伝子の安定な形質転換及び調節さ
れた発現のために記載された（Mol. Gen. Genet. 251, 1996: 75-80)。この系は
、従来は、物質代謝経路の最適化のため又は蛋白質の市場的過剰発現のための遺
伝技術用具としてはなお使用されていなかった。
【００１７】 リボフラビン合成の例で、ＲＥＭＩ−法を用いて生合成遺伝子が前記の生物の
ゲノム中に組み込むことができることが明らかになり、それに伴って殊に生合成
経路による一次又は二次代謝の代謝産物、例えばアミノ酸、例えばリシン、メチ
オニン、スレオニン又はトリプトファン、ビタミン、例えばビタミンＡ、Ｂ２、
Ｂ６、Ｂ１２、Ｃ、Ｄ、Ｅ又はＦ、Ｓ−アデノシルメチオニン、ビオチン、パン
トテン酸又は葉酸、カロテノイド、例えばβ−カロテン、リコペン、カンタキサ
ンチン、アスタキサンチン又はゼアキサンチン又は蛋白質、例えばヒドロラーゼ
、例えばリパーゼ、エステラーゼ、アミダーゼ、ニトリラーゼ、プロテアーゼ、
メデイエーター、例えばサイトカイン、即ちリンホトカイン、例えばＭＩＦ、Ｍ
ＡＦ、ＴＮＦ、インターロイキン、例えばインターロイキン１、インターフェロ
ン、例えばγ−インターフェロン、ｔＰＡ、ホルモン、例えばプロテオホルモン
、グリコホルモン、オリゴ−又はポリペプチドホルモン、例えばバソプレシン、
エンドルフィン、エンドスタチン、アンギオスタチン、成長因子、エリスロポエ
チン、トランスクリプシヨン因子、インテグリン、例えばＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ
又はαｖβＩＩＩ、レセプター、例えば種々のグルタメートレセプター、アンギ
オゲネシス因子、例えばアンギオテンシンの生産法を最適化することができるこ
とが明らかになった。
ゲノム中に組み込むことができることが明らかになり、それに伴って殊に生合成
経路による一次又は二次代謝の代謝産物、例えばアミノ酸、例えばリシン、メチ
オニン、スレオニン又はトリプトファン、ビタミン、例えばビタミンＡ、Ｂ２、
Ｂ６、Ｂ１２、Ｃ、Ｄ、Ｅ又はＦ、Ｓ−アデノシルメチオニン、ビオチン、パン
トテン酸又は葉酸、カロテノイド、例えばβ−カロテン、リコペン、カンタキサ
ンチン、アスタキサンチン又はゼアキサンチン又は蛋白質、例えばヒドロラーゼ
、例えばリパーゼ、エステラーゼ、アミダーゼ、ニトリラーゼ、プロテアーゼ、
メデイエーター、例えばサイトカイン、即ちリンホトカイン、例えばＭＩＦ、Ｍ
ＡＦ、ＴＮＦ、インターロイキン、例えばインターロイキン１、インターフェロ
ン、例えばγ−インターフェロン、ｔＰＡ、ホルモン、例えばプロテオホルモン
、グリコホルモン、オリゴ−又はポリペプチドホルモン、例えばバソプレシン、
エンドルフィン、エンドスタチン、アンギオスタチン、成長因子、エリスロポエ
チン、トランスクリプシヨン因子、インテグリン、例えばＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ
又はαｖβＩＩＩ、レセプター、例えば種々のグルタメートレセプター、アンギ
オゲネシス因子、例えばアンギオテンシンの生産法を最適化することができるこ
とが明らかになった。
【００１８】 このＲＥＭＩ−法を用いて、本発明による核酸フラグメント又は他の前記遺伝
子をゲノム中のトランスクリプシヨン活性部位に位置させることもできる。
子をゲノム中のトランスクリプシヨン活性部位に位置させることもできる。
【００１９】 この核酸は、有利に、このゲノム中に導入されるＤＮＡ構造中に、少なくとも
１つのレポーター遺伝子と共にクローニングされる。このレポーター遺伝子は、
成長−、蛍光−、ケモ−又はビオルミネセンスアッセイにより又は光度測定法で
容易に検出可能にすることができた。記載できるレポーター遺伝子の例は、抗生
物質抵抗遺伝子、ヒドロラーゼ遺伝子、フルオレッセンス蛋白質遺伝子、ビオル
ミネッセンス遺伝子、グルコシダーゼ遺伝子、ペルオキシダーゼ遺伝子又は生合
成遺伝子、例えばリボフラビン遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子、ｇｆｐ−遺伝子、リパーゼ遺伝子、エステラーゼ遺伝子、ペルオ
キシダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、アセチル−、ホスホ−又はアデニ
ルトランスフェラーゼ遺伝子である。これらの遺伝子は、トランスクリプシヨン
活性及び従って、遺伝子の発現の測定及び定量を容易にすることができる。従っ
て、２までの定数で異なる生産性を示すゲノム部位を同定することができる（図
１参照）。図１は、組み込みの後に得られた、種々のビタミンＢ２−（＝リボフ
ラビン）生産性を有するクローンＩＴＡ−ＧＳ−１５．２、ＩＴＡ−ＧＳ−１７
．１及びＩＴＡ−ＧＳ−０１を示している。
１つのレポーター遺伝子と共にクローニングされる。このレポーター遺伝子は、
成長−、蛍光−、ケモ−又はビオルミネセンスアッセイにより又は光度測定法で
容易に検出可能にすることができた。記載できるレポーター遺伝子の例は、抗生
物質抵抗遺伝子、ヒドロラーゼ遺伝子、フルオレッセンス蛋白質遺伝子、ビオル
ミネッセンス遺伝子、グルコシダーゼ遺伝子、ペルオキシダーゼ遺伝子又は生合
成遺伝子、例えばリボフラビン遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子、ｇｆｐ−遺伝子、リパーゼ遺伝子、エステラーゼ遺伝子、ペルオ
キシダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、アセチル−、ホスホ−又はアデニ
ルトランスフェラーゼ遺伝子である。これらの遺伝子は、トランスクリプシヨン
活性及び従って、遺伝子の発現の測定及び定量を容易にすることができる。従っ
て、２までの定数で異なる生産性を示すゲノム部位を同定することができる（図
１参照）。図１は、組み込みの後に得られた、種々のビタミンＢ２−（＝リボフ
ラビン）生産性を有するクローンＩＴＡ−ＧＳ−１５．２、ＩＴＡ−ＧＳ−１７
．１及びＩＴＡ−ＧＳ−０１を示している。
【００２０】 生合成遺伝子それ自体が検査を容易にすることができる場合には、例えばリボ
フラビンの場合におけるように、付加的レポーター遺伝子を免除することができ
る。
フラビンの場合におけるように、付加的レポーター遺伝子を免除することができ
る。
【００２１】 生物中に複数の遺伝子を導入すべき場合には、これらすべてを１レポーター遺
伝子と一緒に単一のベクター中で又は各々の遺伝子を１レポーター遺伝子と共に
各々１ベクター中でこの生物中に導入することができ、この際、種々のベクター
を同時に又は順次に導入することができる。このＲＥＭＩ法で、それぞれの活性
をコードする遺伝子フラグメントを使用することもできる。
伝子と一緒に単一のベクター中で又は各々の遺伝子を１レポーター遺伝子と共に
各々１ベクター中でこの生物中に導入することができ、この際、種々のベクター
を同時に又は順次に導入することができる。このＲＥＭＩ法で、それぞれの活性
をコードする遺伝子フラグメントを使用することもできる。
【００２２】 原則的に全ての公知制限酵素が生合成遺伝子を生物のゲノム中に組み込む本発
明の方法のために好適である。制限切断部位としての４塩基対のみを認識する制
限酵素は有利性が低い、それというのも、それらはゲノム中で又は組み込むべき
ベクター中で頻繁すぎて切断するからであり；６、７、８又はそれ以上の塩基対
を切断部位として認識する酵素が有利であり、可能な酵素のいくつかのみを挙げ
れば、例えばＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｂｇ１ＩＩ、ＳＰｈＩ、ＳｐｅＩ、Ｘｂ
ａＩ、ＸｈｏＩ、ＮｃｏＩ、Ｓａ１Ｉ、Ｃ１ａＩ、ＫｐｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、
ＳａｃＩ、ＰｓｔＩ、Ｂｐｎ１、ＮｏｔＩ、ＳｒｆＩ又はＳｆｉＩが挙げられる
。使用酵素が導入されるべきＤＮＡ中にもはや切断部位を有しない場合には、こ
れらは組み込みの効果を増加する利点を有する。通常、このＲＥＭＩバッチ中で
は、酵素５〜５００Ｕ、有利に１０〜２５０、特に有利に１０〜１００Ｕが使用
される。これらの酵素は、有利に、浸透性安定化のための物質、例えば糖、例え
ばサッカロース、トレハロース又はグルコース、ポリオール、例えばグリセリン
又はポリエチレングリコール、５〜９、有利に６〜８、特に有利に７〜８のｐＨ
範囲内で有利に緩衝する緩衝剤、例えばＴｒｉｓ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥ
Ｓ又はＰＩＰＥＳ及び／又は核酸を安定化する物質、例えば、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｃｏ
、Ｆｅ、Ｍｎ又はＭｏの無機又は有機の塩を含有する水溶液中で使用される。場
合によっては、他の物質、例えばＥＤＴＡ、ＥＤＤＡ、ＤＴＴ、β−メルカプト
エタノール又はヌクレアーゼ抑制物質を含有することもできる。しかしながら、
これら添加剤なしで、このＲＥＭＩ法を実施することも可能である。
明の方法のために好適である。制限切断部位としての４塩基対のみを認識する制
限酵素は有利性が低い、それというのも、それらはゲノム中で又は組み込むべき
ベクター中で頻繁すぎて切断するからであり；６、７、８又はそれ以上の塩基対
を切断部位として認識する酵素が有利であり、可能な酵素のいくつかのみを挙げ
れば、例えばＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｂｇ１ＩＩ、ＳＰｈＩ、ＳｐｅＩ、Ｘｂ
ａＩ、ＸｈｏＩ、ＮｃｏＩ、Ｓａ１Ｉ、Ｃ１ａＩ、ＫｐｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、
ＳａｃＩ、ＰｓｔＩ、Ｂｐｎ１、ＮｏｔＩ、ＳｒｆＩ又はＳｆｉＩが挙げられる
。使用酵素が導入されるべきＤＮＡ中にもはや切断部位を有しない場合には、こ
れらは組み込みの効果を増加する利点を有する。通常、このＲＥＭＩバッチ中で
は、酵素５〜５００Ｕ、有利に１０〜２５０、特に有利に１０〜１００Ｕが使用
される。これらの酵素は、有利に、浸透性安定化のための物質、例えば糖、例え
ばサッカロース、トレハロース又はグルコース、ポリオール、例えばグリセリン
又はポリエチレングリコール、５〜９、有利に６〜８、特に有利に７〜８のｐＨ
範囲内で有利に緩衝する緩衝剤、例えばＴｒｉｓ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥ
Ｓ又はＰＩＰＥＳ及び／又は核酸を安定化する物質、例えば、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｃｏ
、Ｆｅ、Ｍｎ又はＭｏの無機又は有機の塩を含有する水溶液中で使用される。場
合によっては、他の物質、例えばＥＤＴＡ、ＥＤＤＡ、ＤＴＴ、β−メルカプト
エタノール又はヌクレアーゼ抑制物質を含有することもできる。しかしながら、
これら添加剤なしで、このＲＥＭＩ法を実施することも可能である。
【００２３】 本発明による方法は、５〜８０℃、有利に１０〜６０℃、特に有利に２０〜４
０℃の温度で実施される。細胞膜を不安定化する全ての公知法、例えば、電気穿
孔、負荷ベヒクルとの融合又は種々のアルカリ金属−又はアルカリ土類金属塩、
例えばルチウム、ルビジウム又はカルシウム塩、有利にリチウム塩を用いる脱安
定化がこの方法のために好適である。
０℃の温度で実施される。細胞膜を不安定化する全ての公知法、例えば、電気穿
孔、負荷ベヒクルとの融合又は種々のアルカリ金属−又はアルカリ土類金属塩、
例えばルチウム、ルビジウム又はカルシウム塩、有利にリチウム塩を用いる脱安
定化がこの方法のために好適である。
【００２４】 核酸は単離の後に直接又は精製の後に本発明の方法のために使用することがで
きる。
きる。
【００２５】 図２及び３は、本発明によるｒｉｂ−遺伝子組み合わせを組み込むための本発
明による方法をまとめて図示している。酵素ＳｐｅＩがＤＮＡの切断のために使
用され、その存在下にＤＮＡが生物中に導入された。選択を容易にするために、
カナマイシン−抵抗遺伝子もこのフラグメント中に組み込まれ、これはＴＥＦプ
ロモーター配列（いわゆる直接繰り返し）でフランキングされる。この抵抗遺伝
子は、これら配列を介して再び組み換え除去されている（図３参照）。
明による方法をまとめて図示している。酵素ＳｐｅＩがＤＮＡの切断のために使
用され、その存在下にＤＮＡが生物中に導入された。選択を容易にするために、
カナマイシン−抵抗遺伝子もこのフラグメント中に組み込まれ、これはＴＥＦプ
ロモーター配列（いわゆる直接繰り返し）でフランキングされる。この抵抗遺伝
子は、これら配列を介して再び組み換え除去されている（図３参照）。
【００２６】 本発明によるこのｒｉｂ遺伝子の組み合わせの植物中への導入は、原則的に当
業者に公知の全ての方法で行うことができる。
業者に公知の全ての方法で行うことができる。
【００２７】 植物のゲノム中への異種遺伝子の移行は、形質転換と称される。この場合に、
植物組織又は植物細胞から植物の形質転換及び再生に関して記載されている方法
が一過性の又は安定な形質転換のために使用される。好適な方法は、ポリエチレ
ングリコール−誘導ＤＮＡ吸収によるプロトプラスト形質転換であり、遺伝子ガ
ン（Genkanon)の使用、電気穿孔、ＤＮＡ−含有溶液中の乾燥胚嚢のインキュベ
ーシヨン、マイクロインジェクシヨン及びアグロバクテリウム−介在遺伝子トラ
ンスファーである。記載の方法は、例えば次の文献に記載されている：B.Jenes
et al., Techniques for Gene Transfer, in :Transgenic Plants, Vol.1, Engi
neering and Utilization, ed. by S.D. Kung and R.Wu, Academic Press(1993)
128-143及びPotrykus Annu. Rev. Plant Phisiol. Plant Molec. Biol. 42(199
1) 205-225。発現されるべき構造は、有利に、アグロバクテリウム ツメファシ
エンスを形質転換するために好適であるベクター、例えばｐＢｉｎ１９中にクロ
ーニングされる（Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12(1984) 8711)。アグロバ
クテリウム ツメファシエンスを用いる植物の形質転換が、例えばHoefen及びWi
llmitzerにより、Nucl. Acid Res. (1988), 16, 9877中に記載されている。
植物組織又は植物細胞から植物の形質転換及び再生に関して記載されている方法
が一過性の又は安定な形質転換のために使用される。好適な方法は、ポリエチレ
ングリコール−誘導ＤＮＡ吸収によるプロトプラスト形質転換であり、遺伝子ガ
ン（Genkanon)の使用、電気穿孔、ＤＮＡ−含有溶液中の乾燥胚嚢のインキュベ
ーシヨン、マイクロインジェクシヨン及びアグロバクテリウム−介在遺伝子トラ
ンスファーである。記載の方法は、例えば次の文献に記載されている：B.Jenes
et al., Techniques for Gene Transfer, in :Transgenic Plants, Vol.1, Engi
neering and Utilization, ed. by S.D. Kung and R.Wu, Academic Press(1993)
128-143及びPotrykus Annu. Rev. Plant Phisiol. Plant Molec. Biol. 42(199
1) 205-225。発現されるべき構造は、有利に、アグロバクテリウム ツメファシ
エンスを形質転換するために好適であるベクター、例えばｐＢｉｎ１９中にクロ
ーニングされる（Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12(1984) 8711)。アグロバ
クテリウム ツメファシエンスを用いる植物の形質転換が、例えばHoefen及びWi
llmitzerにより、Nucl. Acid Res. (1988), 16, 9877中に記載されている。
【００２８】 本発明による発現ベクターで形質転換されたアグロバクテリアは、同様に植物
、例えば穀粒、トウモロコシ、大豆、イネ、棉、甜菜、カノーラ、ひまわり、亜
麻、大麻、馬鈴薯、たばこ、トマト、ヒマ種子、アルファルファ、レタス及び種
々の樹木、ナッツおよびツタ植物及び堅果の形質転換のために使用することがで
き、ここでは例えばアグロバクテリアの溶液中の巻き葉又は葉片を浴付けし、次
いで適当な媒体中で培養する。
、例えば穀粒、トウモロコシ、大豆、イネ、棉、甜菜、カノーラ、ひまわり、亜
麻、大麻、馬鈴薯、たばこ、トマト、ヒマ種子、アルファルファ、レタス及び種
々の樹木、ナッツおよびツタ植物及び堅果の形質転換のために使用することがで
き、ここでは例えばアグロバクテリアの溶液中の巻き葉又は葉片を浴付けし、次
いで適当な媒体中で培養する。
【００２９】 遺伝的に変えられた植物細胞は、当業者に公知の全ての方法で再生することが
できる。適当な方法は、Ｓ．Ｄ．Kung and R. Wu, Potrykus 又は Hoefgen and
Willmitzerによる前記の文献中に見つけることができる。
できる。適当な方法は、Ｓ．Ｄ．Kung and R. Wu, Potrykus 又は Hoefgen and
Willmitzerによる前記の文献中に見つけることができる。
【００３０】 細胞中でのｒｉｂ遺伝子産生物の酵素活性を高めるための多くの可能性がある
。
。
【００３１】 １つの可能性は、内因性ｒｉｂ−遺伝子３、４及び５を、それらが当初酵素が
有するものと比べて増大されたｒｉｂ３、４又は５−活性を有する酵素をコード
する様に変えることである。酵素活性の他の増加は、例えば触媒作用中心を変更
することにより高められた基質変換率を生じさせるか又は酵素阻害剤の作用を停
止させることにより達成することができ、即ち、それらは増大された特異活性を
有するか又はそれらの活性は阻止されないことを意味する。他の有利な態様では
、細胞での酵素合成の上昇を行うこともでき、例えば酵素合成を抑制する要因の
除去又は増強された合成を促進するファクター又は調節要素の活性を高めるか又
は有利には更なる遺伝子コピーの導入によって、高められた酵素活性を発揮させ
ることもできる。これらの手段により、特異活性を変化させることなく、細胞中
の遺伝子産生物の全体の活性が高められる。これらの方法の組み合わせも使用で
き、これは、特異活性を高め、全活性を高めることを意味する。原則的に、これ
ら変化を遺伝子の核酸配列、調節因子又はそれらのプロモーター中に導入するた
めの当業者に公知の全ての方法により起こさせることができる。この目的のため
に、配列を、例えば突然変異、例えばD.M.Glover et al., DNA Cloning Vol. 1
(1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9)第６章、１９３頁 以降に記載のよう
な” 部位−方向付けられた突然変異”に供することができる。
有するものと比べて増大されたｒｉｂ３、４又は５−活性を有する酵素をコード
する様に変えることである。酵素活性の他の増加は、例えば触媒作用中心を変更
することにより高められた基質変換率を生じさせるか又は酵素阻害剤の作用を停
止させることにより達成することができ、即ち、それらは増大された特異活性を
有するか又はそれらの活性は阻止されないことを意味する。他の有利な態様では
、細胞での酵素合成の上昇を行うこともでき、例えば酵素合成を抑制する要因の
除去又は増強された合成を促進するファクター又は調節要素の活性を高めるか又
は有利には更なる遺伝子コピーの導入によって、高められた酵素活性を発揮させ
ることもできる。これらの手段により、特異活性を変化させることなく、細胞中
の遺伝子産生物の全体の活性が高められる。これらの方法の組み合わせも使用で
き、これは、特異活性を高め、全活性を高めることを意味する。原則的に、これ
ら変化を遺伝子の核酸配列、調節因子又はそれらのプロモーター中に導入するた
めの当業者に公知の全ての方法により起こさせることができる。この目的のため
に、配列を、例えば突然変異、例えばD.M.Glover et al., DNA Cloning Vol. 1
(1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9)第６章、１９３頁 以降に記載のよう
な” 部位−方向付けられた突然変異”に供することができる。
【００３２】 Spee et al., (Nucleic Acids Reseach, Vol. 21, No. 3, 1993: 777-778)は
、ランダム突然変異生成のためにｄＩＴＰを用いるＰＣＲ法を記載している。
、ランダム突然変異生成のためにｄＩＴＰを用いるＰＣＲ法を記載している。
【００３３】 分子進化のためのインビトロな組み換え技術の使用がStemmerにより記載され
ている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA , Vol. 91, 1994: 10747-10751)。
ている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA , Vol. 91, 1994: 10747-10751)。
【００３４】 Moore et al.(Nature Biotechnology Vol.14,1996; 458-467)は、ＰＣＲ法と
組み換え法の組み合わせを記載している。
組み換え法の組み合わせを記載している。
【００３５】 変えられた核酸配列は、引き続きベクターを介して再び生物中に戻される。
【００３６】 この酵素活性を高めるために、天然遺伝子の前に変化したプロモーター領域を
配置して、この遺伝子の発現を高め、こうして最後に活性を上昇させることも可
能である。３’末端で、例えばｍＲＮＡの安定性を高め、それにより高められた
翻訳を可能にする配列を導入することも可能である。このことは、同様に結果と
して高い酵素活性をもたらす。
配置して、この遺伝子の発現を高め、こうして最後に活性を上昇させることも可
能である。３’末端で、例えばｍＲＮＡの安定性を高め、それにより高められた
翻訳を可能にする配列を導入することも可能である。このことは、同様に結果と
して高い酵素活性をもたらす。
【００３７】 更に、ｒｉｂ−遺伝子３、４及び５の遺伝子コピーを一緒にこの細胞中に導入
することが有利である。これら遺伝子コピーは、天然調節、修飾された調節の基
礎になることができ、この場合に、天然の調節領域は、それらが遺伝子の高めら
れた発現を可能にするがそれが異種遺伝子又は種類の異なる遺伝子の調節配列を
も利用できるように変えられた。
することが有利である。これら遺伝子コピーは、天然調節、修飾された調節の基
礎になることができ、この場合に、天然の調節領域は、それらが遺伝子の高めら
れた発現を可能にするがそれが異種遺伝子又は種類の異なる遺伝子の調節配列を
も利用できるように変えられた。
【００３８】 前記方法の組み合わせが特に有利である。
【００３９】 機能的類縁体とは、例えばｒｉｂ−遺伝子の機能的同族体又はそれらの酵素的
活性体、即ちｒｉｂ−遺伝子と同じ酵素反応を促進する酵素を意味する。これら
の遺伝子は同様にリボフラビン形成で有利な増加をもたらす。これらの機能的類
縁体は、有利に前記の方法で突然変異又は修飾されることも可能であり、これに
伴いそれらの活性は増加されうる。
活性体、即ちｒｉｂ−遺伝子と同じ酵素反応を促進する酵素を意味する。これら
の遺伝子は同様にリボフラビン形成で有利な増加をもたらす。これらの機能的類
縁体は、有利に前記の方法で突然変異又は修飾されることも可能であり、これに
伴いそれらの活性は増加されうる。
【００４０】 機能的類縁体は、有利に例えば真核又は原核生物に由来する遺伝子又は遺伝子
産生物であるのが有利である。挙げることのできる真核性物の例は、Indian Che
m Engr. Section B,Vol. 37, No. 1, 2(1995) 15頁、第６表に記載のもの、例
えば真菌、例えばエレモテシウム、酵母、例えばカンジダ、サッカロマイセス又
はピチア又は植物、例えばシロイスナズナ、トマト、馬鈴薯、トウモロコシ、大
豆、ヒマ種子、大麦、小麦、ライ麦、イネ、粟、棉、甜菜、ひまわり、亜麻、大
麻、カノーラ、オート麦、たばこ、アルファルファ、レタス又は種々の樹木、ナ
ッツ及び蔦類が挙げられる。原核生物としては、例えばグラム陽性菌又はグラム
陰性菌、例えばコリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、バシルス、クロスト
リジウム、シアノバクター又はエセリキアである。機能的類縁体は、有利に、真
菌、例えばエレモテシウム、酵母、例えばサッカロマイセス又はカンジダ、グラ
ム陽性菌、例えばバシルス又はコリネバクテリウム又はグラム陰性菌、例えばエ
セリキア コリーに由来する。有利な機能的類縁体は、エレモテシウム アシビ
イ、サッカロマイセス セレビジアエ、カンジダ フラベリ、カンジダ ファマ
タ、エセリキア コリー、コリネバクテリウム アンモニアゲネス又はバシルス
スブチリス属種の生物に由来する。
産生物であるのが有利である。挙げることのできる真核性物の例は、Indian Che
m Engr. Section B,Vol. 37, No. 1, 2(1995) 15頁、第６表に記載のもの、例
えば真菌、例えばエレモテシウム、酵母、例えばカンジダ、サッカロマイセス又
はピチア又は植物、例えばシロイスナズナ、トマト、馬鈴薯、トウモロコシ、大
豆、ヒマ種子、大麦、小麦、ライ麦、イネ、粟、棉、甜菜、ひまわり、亜麻、大
麻、カノーラ、オート麦、たばこ、アルファルファ、レタス又は種々の樹木、ナ
ッツ及び蔦類が挙げられる。原核生物としては、例えばグラム陽性菌又はグラム
陰性菌、例えばコリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、バシルス、クロスト
リジウム、シアノバクター又はエセリキアである。機能的類縁体は、有利に、真
菌、例えばエレモテシウム、酵母、例えばサッカロマイセス又はカンジダ、グラ
ム陽性菌、例えばバシルス又はコリネバクテリウム又はグラム陰性菌、例えばエ
セリキア コリーに由来する。有利な機能的類縁体は、エレモテシウム アシビ
イ、サッカロマイセス セレビジアエ、カンジダ フラベリ、カンジダ ファマ
タ、エセリキア コリー、コリネバクテリウム アンモニアゲネス又はバシルス
スブチリス属種の生物に由来する。
【００４１】 更に、配列番号１、配列番号３及び配列番号５の配列を有する遺伝子又はこれ
らの均等物の組み合わせが本発明による方法では有利である。
らの均等物の組み合わせが本発明による方法では有利である。
【００４２】 本発明による組み合わせで使用され、配列番号１、配列番号３及び配列番号５
の配列を有する遺伝子の機能的均等物とは、例えば誘導されたアミノ酸レベルで
少なくとも３５％相同、有利には少なくとも４０％相同、特に有利には少なくと
も４５％相同、非常に特別有利には５０％相同を有する対立遺伝子変異体（Alle
levariant)を意味する。記載の核酸から誘導されるアミノ酸配列は、配列番号２
、配列番号４及び配列番号６の配列と記載される。対立遺伝子変異体は、特に、
配列番号１、配列番号３及び配列番号５に記載の配列からの核酸の欠失、挿入又
は置換により得られる機能的変異体であり、この際、誘導された合成蛋白質の酵
素活性は保留されている。
の配列を有する遺伝子の機能的均等物とは、例えば誘導されたアミノ酸レベルで
少なくとも３５％相同、有利には少なくとも４０％相同、特に有利には少なくと
も４５％相同、非常に特別有利には５０％相同を有する対立遺伝子変異体（Alle
levariant)を意味する。記載の核酸から誘導されるアミノ酸配列は、配列番号２
、配列番号４及び配列番号６の配列と記載される。対立遺伝子変異体は、特に、
配列番号１、配列番号３及び配列番号５に記載の配列からの核酸の欠失、挿入又
は置換により得られる機能的変異体であり、この際、誘導された合成蛋白質の酵
素活性は保留されている。
【００４３】 このようなＤＮＡ配列は、配列番号１、配列番号３及び配列番号５に記載のＤ
ＮＡ配列又はこれら配列の一部分から出発し、例えば慣用のハイブリダイゼーシ
ヨン法又はＰＣＲ技術を用いて、アシビア ゴシピイ以外の真核生物又は原核生
物から前記のように単離することができる。これらのＤＮＡ配列は、標準的条件
下に記載の配列とハイブリダイズする。このハイブリダイゼーシヨンのために、
保存された領域の短いオリゴヌクレオチド（これは、当業者に公知の方法でＥ.
コリーおよびＢ.スブチリスからの相応する遺伝子との比較により測定できる）
を使用するのが有利である。
ＮＡ配列又はこれら配列の一部分から出発し、例えば慣用のハイブリダイゼーシ
ヨン法又はＰＣＲ技術を用いて、アシビア ゴシピイ以外の真核生物又は原核生
物から前記のように単離することができる。これらのＤＮＡ配列は、標準的条件
下に記載の配列とハイブリダイズする。このハイブリダイゼーシヨンのために、
保存された領域の短いオリゴヌクレオチド（これは、当業者に公知の方法でＥ.
コリーおよびＢ.スブチリスからの相応する遺伝子との比較により測定できる）
を使用するのが有利である。
【００４４】 標準的条件とは、例えば４２〜５８℃の温度、０.１〜５×ＳＳＣの濃度を有
する水性緩衝液（１×ＳＳＣ＝０.１５ＭＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウ
ム、ｐＨ７.２）中又は付加的に５０％フォルムアミドの存在下で、例えば４２
℃、５×ＳＳＣ、５０％フォルムアミドの存在下であると理解すべきである。Ｄ
ＮＡ−ハイブリダイゼーシヨンのための実験条件は、遺伝子技術の関連教科書、
例えば、Sambrook et al. "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laborato
ry, 1989 に記載されている。
する水性緩衝液（１×ＳＳＣ＝０.１５ＭＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウ
ム、ｐＨ７.２）中又は付加的に５０％フォルムアミドの存在下で、例えば４２
℃、５×ＳＳＣ、５０％フォルムアミドの存在下であると理解すべきである。Ｄ
ＮＡ−ハイブリダイゼーシヨンのための実験条件は、遺伝子技術の関連教科書、
例えば、Sambrook et al. "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laborato
ry, 1989 に記載されている。
【００４５】 更に、配列番号１、配列番号３及び配列番号５の配列の相同体とは、例えば、
真核性又は原核性相同体、短縮された配列又は１本鎖ＤＮＡであると理解すべき
である。
真核性又は原核性相同体、短縮された配列又は１本鎖ＤＮＡであると理解すべき
である。
【００４６】 配列番号１、配列番号３及び配列番号５の配列の相同体とは、付加的に誘導体
、例えばプロモーター変体を意味する。記載のヌクレオチド配列に共通する又は
個々に予め切断されているプロモーターは、１以上のヌクレオチド置換、挿入及
び／又は欠失により、但しこのプロモーターはその機能又は活性に逆に作用する
ことなし、変えることができる。更に、それらの配列を変更することによりプロ
モーターの活性を高めるか、又はそれらを完全に、異種生物からであってもよい
有効なプロモーターで置き換えることも可能である。
、例えばプロモーター変体を意味する。記載のヌクレオチド配列に共通する又は
個々に予め切断されているプロモーターは、１以上のヌクレオチド置換、挿入及
び／又は欠失により、但しこのプロモーターはその機能又は活性に逆に作用する
ことなし、変えることができる。更に、それらの配列を変更することによりプロ
モーターの活性を高めるか、又はそれらを完全に、異種生物からであってもよい
有効なプロモーターで置き換えることも可能である。
【００４７】 誘導体とは、有利に、開始コドンの前のそのヌクレオチド配列が、遺伝子発現
及び／又は蛋白質発現が変更され、有利に高められるように変えられた変体を意
味する。
及び／又は蛋白質発現が変更され、有利に高められるように変えられた変体を意
味する。
【００４８】 配列番号１、配列番号３及び配列番号５の配列又はそれらの機能的均等物はク
ロストリジウム、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、シアノバクター、
バシルス、エレモテシウム、エセリキア、ピチア、アシビア又はカンジダ属の微
生物又は植物、特に有利にバシルス スブチリス、コリネバクテリウム アンモ
ニアゲネス、エセリキア コリー、カンジダ フラベリ、カンジダ ファマタ属
種の微生物又はIndian Cehm Engr. Section B., Vol.37, No. 1,2 (1995)１５頁
第６表に記載の真菌類、例えばエレモテシウム アシビイ又はアシビア ゴシピ
イ、特に有利にエレモテシウム アシビイ又はアシビア ゴシピイ属菌株の微生
物から単離することが可能である。従って、例えば、バシルス スブチルスから
のｒｉｂ３、４、５に対して相同な遺伝子ｒｉｂＡ、ｒｉｂＨ及びｒｉｂＢ又は
これらからの遺伝子フラグメント又はＥ.コリーからのｒｉｂ３、４、５に対し
て相同な遺伝子ｒｉｂＢ、ｒｉｂＥ及びｒｉｂＣ又はそれらからの遺伝子のフラ
グメントを、本発明による方法でリボフラビン収率を高めるために、原核生物系
中で使用することができる。
ロストリジウム、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、シアノバクター、
バシルス、エレモテシウム、エセリキア、ピチア、アシビア又はカンジダ属の微
生物又は植物、特に有利にバシルス スブチリス、コリネバクテリウム アンモ
ニアゲネス、エセリキア コリー、カンジダ フラベリ、カンジダ ファマタ属
種の微生物又はIndian Cehm Engr. Section B., Vol.37, No. 1,2 (1995)１５頁
第６表に記載の真菌類、例えばエレモテシウム アシビイ又はアシビア ゴシピ
イ、特に有利にエレモテシウム アシビイ又はアシビア ゴシピイ属菌株の微生
物から単離することが可能である。従って、例えば、バシルス スブチルスから
のｒｉｂ３、４、５に対して相同な遺伝子ｒｉｂＡ、ｒｉｂＨ及びｒｉｂＢ又は
これらからの遺伝子フラグメント又はＥ.コリーからのｒｉｂ３、４、５に対し
て相同な遺伝子ｒｉｂＢ、ｒｉｂＥ及びｒｉｂＣ又はそれらからの遺伝子のフラ
グメントを、本発明による方法でリボフラビン収率を高めるために、原核生物系
中で使用することができる。
【００４９】 生物中の非相同遺伝子の最適発現を得るために、生物中で使用された特異的な
コドン使用頻度に相応して核酸配列を変えるのが有利である。このコドン使用頻
度は、容易に、関連生物中の他の公知遺伝子のコンピュータ評価により測定する
ことができる。
コドン使用頻度に相応して核酸配列を変えるのが有利である。このコドン使用頻
度は、容易に、関連生物中の他の公知遺伝子のコンピュータ評価により測定する
ことができる。
【００５０】 ｒｉｂ−遺伝子３、４及び５の遺伝子発現は、有利にｒｉｂ３、４、５遺伝子
コピー数を増加する及び／又はｒｉｂ３、４及び５遺伝子発現に有利な影響を有
する調節因子を強化することにより高めることができる。たとえば、調節因子の
強化は、有利に、強力な転写シグナル、例えばプロモーター又はエンハンサーを
用いることにより転写面上で行うことができる。しかしながら、これと並んで、
例えばｒｉｂ３、４及び５ｍＲＮＡの安定性を改善することにより、又はリボソ
ーム上でのこのｍＲＮＡのリーデイング効果を高めることにより、その翻訳を強
化することも可能である。
コピー数を増加する及び／又はｒｉｂ３、４及び５遺伝子発現に有利な影響を有
する調節因子を強化することにより高めることができる。たとえば、調節因子の
強化は、有利に、強力な転写シグナル、例えばプロモーター又はエンハンサーを
用いることにより転写面上で行うことができる。しかしながら、これと並んで、
例えばｒｉｂ３、４及び５ｍＲＮＡの安定性を改善することにより、又はリボソ
ーム上でのこのｍＲＮＡのリーデイング効果を高めることにより、その翻訳を強
化することも可能である。
【００５１】 これら遺伝子コピー数を増加するために、ｒｉｂ３、４および５又は相同遺伝
子を、例えば核酸フラグメント中に又は有利に各々のｒｉｂ遺伝子中に割り当て
られた調節遺伝子配列又は類似に作用するプロモーター活性を有するベクター中
に組み込むことができる。
子を、例えば核酸フラグメント中に又は有利に各々のｒｉｂ遺伝子中に割り当て
られた調節遺伝子配列又は類似に作用するプロモーター活性を有するベクター中
に組み込むことができる。
【００５２】 特に、遺伝子発現を強化するような調節配列が使用される。選択的に、記載の
遺伝子の各々を単一ベクター中に入れ、その都度の産生生物中に形質転換させる
ことも可能である。
遺伝子の各々を単一ベクター中に入れ、その都度の産生生物中に形質転換させる
ことも可能である。
【００５３】 本発明による核酸フラグメントとは、配列番号１、配列番号３及び配列番号５
のｒｉｂ遺伝子配列又は、有利に遺伝子発現を高めるために１以上の調節シグナ
ルと機能的に連結されたこれらの機能的均等物を意味する。これらの調節配列は
、例えばそれにインダクター又はレプレッサーが結合し、従ってこの核酸の発現
を調節する配列である。これらの新規調節配列に加えて、又はこれら配列の代わ
りに、これら配列の天然の調節が、実際の構造遺伝子の前になお存在することが
でき、かつ、場合によっては遺伝的に変えられていて良く、従って天然の調節が
スイッチオフされ、この遺伝子の発現が高められた。しかしながら、この遺伝子
構造は簡単な構造を有していてもよく、即ち、配列番号１、配列番号３又は配列
番号５の配列又はそれらの機能的均等物の前には付加的な調節シグナルは挿入さ
れておらず、その調節を有する天然のプロモーターは除去されなかった。その代
わりに、天然の調節配列が、調節がもはや行われず、遺伝子発現が高められるよ
うに変異された。これらの変えられたプロモーターは、活性を増加するために単
独で天然の遺伝子の前に入れることもできる。この遺伝子構造は、更に、核酸配
列の増加された発現を可能にするプロモーターと機能的に結合したいわゆる”エ
ンハンサー配列”１以上を含有することも有利である。このＤＮＡ配列の３’末
端に付加的に有利な配列、例えば更なる調節因子又はターミネーターを挿入する
こともできる。ｒｉｂ−遺伝子は、この遺伝子構造中の１以上のコピー中に含有
されうる。
のｒｉｂ遺伝子配列又は、有利に遺伝子発現を高めるために１以上の調節シグナ
ルと機能的に連結されたこれらの機能的均等物を意味する。これらの調節配列は
、例えばそれにインダクター又はレプレッサーが結合し、従ってこの核酸の発現
を調節する配列である。これらの新規調節配列に加えて、又はこれら配列の代わ
りに、これら配列の天然の調節が、実際の構造遺伝子の前になお存在することが
でき、かつ、場合によっては遺伝的に変えられていて良く、従って天然の調節が
スイッチオフされ、この遺伝子の発現が高められた。しかしながら、この遺伝子
構造は簡単な構造を有していてもよく、即ち、配列番号１、配列番号３又は配列
番号５の配列又はそれらの機能的均等物の前には付加的な調節シグナルは挿入さ
れておらず、その調節を有する天然のプロモーターは除去されなかった。その代
わりに、天然の調節配列が、調節がもはや行われず、遺伝子発現が高められるよ
うに変異された。これらの変えられたプロモーターは、活性を増加するために単
独で天然の遺伝子の前に入れることもできる。この遺伝子構造は、更に、核酸配
列の増加された発現を可能にするプロモーターと機能的に結合したいわゆる”エ
ンハンサー配列”１以上を含有することも有利である。このＤＮＡ配列の３’末
端に付加的に有利な配列、例えば更なる調節因子又はターミネーターを挿入する
こともできる。ｒｉｂ−遺伝子は、この遺伝子構造中の１以上のコピー中に含有
されうる。
【００５４】 本発明による方法の有利な調節配列は、例えばプロモーター、例えばｃｏｓ−
、ｔａｃ−、ｔｒｐ−、ｔｅｔ−、ｔｒｐ−ｔｅｔ−、ｌｐｐ−、ｌａｃ−、ｌ
ｐｐ−ｌａｃ−、ｌａｃＩｑ−、Ｔ７−、Ｔ５−、Ｔ３−、ｇａｌ−、ｔｒｃ−
、ａｒａ−、ＳＰ６−又はλ−ＰＲ−中又はλ−ＰＬプロモーター中に存在し、
これらは、有利にグラム陰性菌中で使用される。更なる有利な調節配列は、例え
ばグラム陽性プロモーターａｍｙ及びＳＰＯ２中、酵母−又は真菌プロモーター
ＡＤＣ１、ＭＦα、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８
、ＡＤＨ中又は植物プロモーターＣａＭＶ／３５Ｓ［Franck et al., Cell 21 (
1980), 285-294]、ＰＲＰ１[Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22(1993)]、ＳＳ
Ｕ、ＯＣＳ、ｌｉｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ＬＥＢ４、ｎｏｓ又はユ
ビクイチン−又はファセオリン−プロモーター中に存在する。この関係で、ピル
ベートデカルボキシラーゼ及び例えばハンセヌラからのメタノールオキシダーゼ
のプロモーターも有利である。更に有利な植物プロモーターは、例えばベンゼン
スルホンアミド−誘導可能な（ＥＰ３８８１８６）、テトラサイクリン−誘導可
能な（Gatz et al.,(1992) Plant J. 2397-404)、アブシシック酸−誘導可能な
（ＥＰ３３５５２８）又はエタノール−又はシクロヘキサノン−誘導可能な（Ｗ
Ｏ９３２１３３４）プロモーターである。特に有利な植物プロモーターは、その
中でプリン又はその前駆物質の生合成を行う組織又は植物部分中での発現を保証
するものである。特に葉−特異的発現を保証するプロモーターが挙げられる。馬
鈴薯からの細胞質ＦＢＰアーゼのプロモーター又は馬鈴薯からのＳＴ−ＬＳＩプ
ロモーターを特記すべきである（Stockhaus et al., EMBO J.8(1989) 244-245)
。グリシン マックスからのホスホリボシル−ピロホスフェートアミドトランス
フェラーゼのプロモーター（遺伝子ライブラリーアセッシヨン番号Ｕ８７９９９
も参照）又はＥＰ２４９６７６に記載のような他の結節−特異的プロモーターを
使用するのも可能かつ有利である。
、ｔａｃ−、ｔｒｐ−、ｔｅｔ−、ｔｒｐ−ｔｅｔ−、ｌｐｐ−、ｌａｃ−、ｌ
ｐｐ−ｌａｃ−、ｌａｃＩｑ−、Ｔ７−、Ｔ５−、Ｔ３−、ｇａｌ−、ｔｒｃ−
、ａｒａ−、ＳＰ６−又はλ−ＰＲ−中又はλ−ＰＬプロモーター中に存在し、
これらは、有利にグラム陰性菌中で使用される。更なる有利な調節配列は、例え
ばグラム陽性プロモーターａｍｙ及びＳＰＯ２中、酵母−又は真菌プロモーター
ＡＤＣ１、ＭＦα、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８
、ＡＤＨ中又は植物プロモーターＣａＭＶ／３５Ｓ［Franck et al., Cell 21 (
1980), 285-294]、ＰＲＰ１[Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22(1993)]、ＳＳ
Ｕ、ＯＣＳ、ｌｉｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ＬＥＢ４、ｎｏｓ又はユ
ビクイチン−又はファセオリン−プロモーター中に存在する。この関係で、ピル
ベートデカルボキシラーゼ及び例えばハンセヌラからのメタノールオキシダーゼ
のプロモーターも有利である。更に有利な植物プロモーターは、例えばベンゼン
スルホンアミド−誘導可能な（ＥＰ３８８１８６）、テトラサイクリン−誘導可
能な（Gatz et al.,(1992) Plant J. 2397-404)、アブシシック酸−誘導可能な
（ＥＰ３３５５２８）又はエタノール−又はシクロヘキサノン−誘導可能な（Ｗ
Ｏ９３２１３３４）プロモーターである。特に有利な植物プロモーターは、その
中でプリン又はその前駆物質の生合成を行う組織又は植物部分中での発現を保証
するものである。特に葉−特異的発現を保証するプロモーターが挙げられる。馬
鈴薯からの細胞質ＦＢＰアーゼのプロモーター又は馬鈴薯からのＳＴ−ＬＳＩプ
ロモーターを特記すべきである（Stockhaus et al., EMBO J.8(1989) 244-245)
。グリシン マックスからのホスホリボシル−ピロホスフェートアミドトランス
フェラーゼのプロモーター（遺伝子ライブラリーアセッシヨン番号Ｕ８７９９９
も参照）又はＥＰ２４９６７６に記載のような他の結節−特異的プロモーターを
使用するのも可能かつ有利である。
【００５５】 原則的に、前記のような調節配列を有する全ての天然のプロモーターを本発明
による方法で使用することが可能である。更に、合成プロモーターを使用するこ
とも有利である。
による方法で使用することが可能である。更に、合成プロモーターを使用するこ
とも有利である。
【００５６】 前記のように、核酸フラグメント（＝遺伝子構造）は、生物中に導入されるべ
き他の遺伝子を含有することもできる。これらの遺伝子は、ｒｉｂ遺伝子とは別
の調節領域又は同じ調節領域下に存在しうる。これらの遺伝子は、例えば増加さ
れた合成を可能にする他の生合成遺伝子である。
き他の遺伝子を含有することもできる。これらの遺伝子は、ｒｉｂ遺伝子とは別
の調節領域又は同じ調節領域下に存在しうる。これらの遺伝子は、例えば増加さ
れた合成を可能にする他の生合成遺伝子である。
【００５７】 発現のために、核酸フラグメントを前記の宿主生物中に、有利にベクター、例
えばプラスミド、ファージ又はその他のＤＮＡ（これらは宿主中の遺伝子の至適
発現を可能にする）に挿入する。好適なプラスミドの例は、Ｅ.コリー中のｐＬ
Ｇ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ
３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬ
Ｇ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１、λｇｔ１１又はｐＢｄ
ＣＩ、ストレプトマイセス中のｐＩＪ１０１、ｐＩＪ３６４、ｐＩＪ７０２又は
ｐＩＪ３６１、バシルス中のｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４又はｐＢＤ２１４、コリ
ネバクテリウム中のｐＳＡ７７又はｐＡＪ６６７、真菌中のｐＡＫＳ１、ｐＩＬ
２又はｐＰＢ１１６、酵母中の２μＭ、ｐＡＧ−１、ＹＥｐ６、ＹＥｐ１３又は
ｐＥＭＢＬＹｅ２３又は植物中のｐＬＧＶ２３、ｐＧＨｌａｃ＋、ｐＢＩＮ１９
，ＰＡＫ２００４又はｐＤＨ５１又は前記プラスミドの誘導体である。前記のプ
ラスミドは、可能なプラスミドの僅かな選択を表す。更なるプラスミドは、同業
者に周知であり、例えば文献Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al ,Els
evier, Amsterdam-New York- Oxford,1985, ISBN 0444904018) に記載されてい
る。好適な植物ベクターは特に”Methods in Plant Molecular Biology and Bio
technology"(CRC Press)、Chapters 6/7 ,７１−１１９頁に記載されている。
えばプラスミド、ファージ又はその他のＤＮＡ（これらは宿主中の遺伝子の至適
発現を可能にする）に挿入する。好適なプラスミドの例は、Ｅ.コリー中のｐＬ
Ｇ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ
３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬ
Ｇ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１、λｇｔ１１又はｐＢｄ
ＣＩ、ストレプトマイセス中のｐＩＪ１０１、ｐＩＪ３６４、ｐＩＪ７０２又は
ｐＩＪ３６１、バシルス中のｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４又はｐＢＤ２１４、コリ
ネバクテリウム中のｐＳＡ７７又はｐＡＪ６６７、真菌中のｐＡＫＳ１、ｐＩＬ
２又はｐＰＢ１１６、酵母中の２μＭ、ｐＡＧ−１、ＹＥｐ６、ＹＥｐ１３又は
ｐＥＭＢＬＹｅ２３又は植物中のｐＬＧＶ２３、ｐＧＨｌａｃ＋、ｐＢＩＮ１９
，ＰＡＫ２００４又はｐＤＨ５１又は前記プラスミドの誘導体である。前記のプ
ラスミドは、可能なプラスミドの僅かな選択を表す。更なるプラスミドは、同業
者に周知であり、例えば文献Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al ,Els
evier, Amsterdam-New York- Oxford,1985, ISBN 0444904018) に記載されてい
る。好適な植物ベクターは特に”Methods in Plant Molecular Biology and Bio
technology"(CRC Press)、Chapters 6/7 ,７１−１１９頁に記載されている。
【００５８】 核酸フラグメントは有利に他の含有遺伝子の発現のために、付加的に発現を高
めるための３’及び／又は５’末端調節配列を含有し、これらは選択された宿主
生物又は遺伝子に依存して最適発現を得るように選択される。
めるための３’及び／又は５’末端調節配列を含有し、これらは選択された宿主
生物又は遺伝子に依存して最適発現を得るように選択される。
【００５９】 これらの調節配列は、遺伝子及び蛋白質発現の所定の発現を可能にすべきであ
る。このことは、宿主生物に応じて、例えば誘導の後に初めて遺伝子が発現及び
／又は過剰発現されるか又は直ちに発現及び／又は過剰発現されることを意味す
る。
る。このことは、宿主生物に応じて、例えば誘導の後に初めて遺伝子が発現及び
／又は過剰発現されるか又は直ちに発現及び／又は過剰発現されることを意味す
る。
【００６０】 調節配列又は因子はこの際、有利に導入された遺伝子の遺伝子発現にプラスに
影響し、従ってこれを高めることができる。例えば、調節因子の増加は、有利に
強力な転写シグナル、例えばプロモーター及び／又はエンハンサーを使用するこ
とにより転写レベルで行うことができる。しかしながら、それと並んで、例えば
ｍＲＮＡの安定性を改善することにより翻訳を強化することも可能である。
影響し、従ってこれを高めることができる。例えば、調節因子の増加は、有利に
強力な転写シグナル、例えばプロモーター及び／又はエンハンサーを使用するこ
とにより転写レベルで行うことができる。しかしながら、それと並んで、例えば
ｍＲＮＡの安定性を改善することにより翻訳を強化することも可能である。
【００６１】 ベクターのもう一つの態様で、本発明による遺伝子構造は、有利に直鎖状ＤＮ
Ａの形で微生物中に導入することもでき、非相同又は相同的組み換えにより宿主
生物のゲノム中に組み込むことができる。この直鎖状ＤＮＡは、直線化されたプ
ラスミド又はベクターとしての核酸フラグメントのみから成っていてよい。
Ａの形で微生物中に導入することもでき、非相同又は相同的組み換えにより宿主
生物のゲノム中に組み込むことができる。この直鎖状ＤＮＡは、直線化されたプ
ラスミド又はベクターとしての核酸フラグメントのみから成っていてよい。
【００６２】 ベクターとして、細胞中でかつ、前記のように宿主ゲノム中に組み込む直鎖状
ＤＮＡフラグメント中でも自律的複製をする任意のプラスミド（但し、殊にＳ.
セレビジアエからの２μｍプラスミドの複製のオリジンを有するプラスミド）を
使用することも可能である。この組み込みは、非相同又は相同的組み換えにより
行うことができる。しかしながら、記載のように相同的組み換えによるのが有利
である（Steiner et al., Genetics, Vol. 140,1995: 973-987) 。この場合に、
遺伝子ｒｉｂ３、ｒｉｂ４又はｒｉｂ５は単独で異なる部位のゲノム中に又は異
なるベクター上に存在するか又はこのゲノム中又はベクター上に共通して存在す
ることができる。
ＤＮＡフラグメント中でも自律的複製をする任意のプラスミド（但し、殊にＳ.
セレビジアエからの２μｍプラスミドの複製のオリジンを有するプラスミド）を
使用することも可能である。この組み込みは、非相同又は相同的組み換えにより
行うことができる。しかしながら、記載のように相同的組み換えによるのが有利
である（Steiner et al., Genetics, Vol. 140,1995: 973-987) 。この場合に、
遺伝子ｒｉｂ３、ｒｉｂ４又はｒｉｂ５は単独で異なる部位のゲノム中に又は異
なるベクター上に存在するか又はこのゲノム中又はベクター上に共通して存在す
ることができる。
【００６３】 ｒｉｂ−遺伝子３、４及び５又はそれらの機能的均等物の組み合わせを含有す
る本発明の方法で使用される生物は、増加されたリボフラビン生産性を示す。
る本発明の方法で使用される生物は、増加されたリボフラビン生産性を示す。
【００６４】 本発明の方法では、リボフラビンを製造するために使用される生物をこれら生
物を成長させる培地中で培養させる。この培地は合成又は天然の培地であってよ
い。生物に依存して使用される培地は、当業者に公知である。微生物の成長のた
めに使用される培地は、炭素源、窒素源、無機塩及び適当な場合には少量のビタ
ミン及び微量成分を含有する。
物を成長させる培地中で培養させる。この培地は合成又は天然の培地であってよ
い。生物に依存して使用される培地は、当業者に公知である。微生物の成長のた
めに使用される培地は、炭素源、窒素源、無機塩及び適当な場合には少量のビタ
ミン及び微量成分を含有する。
【００６５】 有利な炭素源は、例えば糖類、例えば、単糖−、二糖−又は多糖類、例えばグ
ルコース、フラクトース、マンノース、キシロース、ガラクトース、リボース、
ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、サッカロース、ラフィノー
ス、デンプン又はセルロース、複合糖源、例えば糖蜜、糖ホスフェート、例えば
フルクトース−１，６−ビスホスフェート、糖アルコール、例えばマンニット、
ポリオール、例えばグリセリン、アルコール類、例えばメタノール又はエタノー
ル、カルボン酸、例えばクエン酸、乳酸又は酢酸、脂肪、例えば大豆油又はひま
し油、アミノ酸、例えばアミノ酸混合物、例えばいわゆるカサミノ酸（Ｄｉｆｃ
ｏ）又は個々のアミノ酸、例えばグリシン又はアスパラギン酸又はアミノ糖であ
り、後者は同時に、窒素源としても使用できる。
ルコース、フラクトース、マンノース、キシロース、ガラクトース、リボース、
ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、サッカロース、ラフィノー
ス、デンプン又はセルロース、複合糖源、例えば糖蜜、糖ホスフェート、例えば
フルクトース−１，６−ビスホスフェート、糖アルコール、例えばマンニット、
ポリオール、例えばグリセリン、アルコール類、例えばメタノール又はエタノー
ル、カルボン酸、例えばクエン酸、乳酸又は酢酸、脂肪、例えば大豆油又はひま
し油、アミノ酸、例えばアミノ酸混合物、例えばいわゆるカサミノ酸（Ｄｉｆｃ
ｏ）又は個々のアミノ酸、例えばグリシン又はアスパラギン酸又はアミノ糖であ
り、後者は同時に、窒素源としても使用できる。
【００６６】 有利な窒素源は有機又は無機の窒素化合物又はこれら化合物を含有する物質で
ある。例は、アンモニウム塩、例えばＮＨ４Ｃｌ又は（ＮＨ４）２ＳＯ４、硝酸
塩、尿素又は複合窒素源、例えばコーンステイープリカー、ブレワーズイースト
、大豆粉、小麦グルテン、酵母エキス、肉エキス、カゼイン加水分解物、酵母又
は馬鈴薯蛋白であり、これらは、屡々同時に炭素源としても役立つ。
ある。例は、アンモニウム塩、例えばＮＨ４Ｃｌ又は（ＮＨ４）２ＳＯ４、硝酸
塩、尿素又は複合窒素源、例えばコーンステイープリカー、ブレワーズイースト
、大豆粉、小麦グルテン、酵母エキス、肉エキス、カゼイン加水分解物、酵母又
は馬鈴薯蛋白であり、これらは、屡々同時に炭素源としても役立つ。
【００６７】 無機塩の例は、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデ
ン、マンガン、カリウム、亜鉛、銅及び鉄の塩である。これらの塩中のアニオン
としては特にクロリド、スルフェート又はホスフェートイオンが挙げられる。本
発明の方法での生産性を高めるための重要な要因は生産培地中のＦｅ２＋又はＦ
ｅ３＋−イオン濃度のコントロールである。
ン、マンガン、カリウム、亜鉛、銅及び鉄の塩である。これらの塩中のアニオン
としては特にクロリド、スルフェート又はホスフェートイオンが挙げられる。本
発明の方法での生産性を高めるための重要な要因は生産培地中のＦｅ２＋又はＦ
ｅ３＋−イオン濃度のコントロールである。
【００６８】 場合により、更なる成長因子がこの栄養培地に添加され、ここで適切なのは次
のものである：例えばビタミン又は成長促進剤、例えばビオチン、リボフラビン
、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸塩又はピリドキシン、アミノ酸、
例えばアラニン、システイン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン、セリン
、フェニルアラニン、オルニチン又はバリン、カルボン酸、例えばクエン酸、ギ
酸、ピメリン酸又は乳酸又はジチオスレイトールのような物質。
のものである：例えばビタミン又は成長促進剤、例えばビオチン、リボフラビン
、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸塩又はピリドキシン、アミノ酸、
例えばアラニン、システイン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン、セリン
、フェニルアラニン、オルニチン又はバリン、カルボン酸、例えばクエン酸、ギ
酸、ピメリン酸又は乳酸又はジチオスレイトールのような物質。
【００６９】 記載の栄養成分の混合割合は、発酵の種類に依存し、個々の場合に決定される
。培地成分は全て発酵の最初に存在させることができるが、必要な場合には別々
に滅菌又は一緒に滅菌された後に、又は引き続き必要に応じて、連続的に又は断
続的に発酵の間に添加することができる。
。培地成分は全て発酵の最初に存在させることができるが、必要な場合には別々
に滅菌又は一緒に滅菌された後に、又は引き続き必要に応じて、連続的に又は断
続的に発酵の間に添加することができる。
【００７０】 培養条件は、生物が最適に成長し、できるだけ最良の収率が得られるように決
められる。有利な培養温度は１５〜４０℃である。２５〜３７℃が特に有利であ
る。ｐＨは、３〜９の間に保持するのが有利である。５〜８のｐＨ値が特に有利
である。数時間〜数日、有利に８時間〜２１日、特に有利に４時間〜１４日で一
般に充分である。この時間の間に、生成物の最大量が培地中に集積される。
められる。有利な培養温度は１５〜４０℃である。２５〜３７℃が特に有利であ
る。ｐＨは、３〜９の間に保持するのが有利である。５〜８のｐＨ値が特に有利
である。数時間〜数日、有利に８時間〜２１日、特に有利に４時間〜１４日で一
般に充分である。この時間の間に、生成物の最大量が培地中に集積される。
【００７１】 培地の有利な至適化の可能性は、当業者によれば、例えば教科書Applied Micr
obiol Physiology,”A Practical Approach” (Eds. P. M. Rhodes, P.F. Stanb
ury,IRL-Press, 1997,５３−７３頁、ＩＳＢＮ０１９９６３５７７３）に見つけ
ることができる。有利な培地及び培養条件は、バシルス及び他の生物に関しては
例えば刊行物ＥＰ−Ａ−０４０５３７０、殊に実施例９中に、カンジダに関して
は、刊行物ＷＯ８８／０９８２２、殊に第３表中に、かつアシビアに関しては、
刊行物Schmidt et al., (Microbiology,142,1996:419−426）中に見つけること
ができる。
obiol Physiology,”A Practical Approach” (Eds. P. M. Rhodes, P.F. Stanb
ury,IRL-Press, 1997,５３−７３頁、ＩＳＢＮ０１９９６３５７７３）に見つけ
ることができる。有利な培地及び培養条件は、バシルス及び他の生物に関しては
例えば刊行物ＥＰ−Ａ−０４０５３７０、殊に実施例９中に、カンジダに関して
は、刊行物ＷＯ８８／０９８２２、殊に第３表中に、かつアシビアに関しては、
刊行物Schmidt et al., (Microbiology,142,1996:419−426）中に見つけること
ができる。
【００７２】 本発明の方法は、連続的に又はバッチ法で１つのバッチ中で又はフィード−バ
ッチ法で実施することができる。
ッチ法で実施することができる。
【００７３】 使用される生物の生産性の当初生産性に関係して、リボフラビン生産性は、本
発明の方法では種々に著しく高めることができる。この生産性は、通常は原初生
物を用いる場合と比べて少なくとも５％、有利に少なくとも１０％、特に有利に
は２０％、非常に特に有利には少なくとも１００％も増加することができる。
発明の方法では種々に著しく高めることができる。この生産性は、通常は原初生
物を用いる場合と比べて少なくとも５％、有利に少なくとも１０％、特に有利に
は２０％、非常に特に有利には少なくとも１００％も増加することができる。
【００７４】 実施例 アシビア ゴシピイ及びサッカロマイセス セレビジアエからのｒｉｂ−遺伝
子１、２、３、４、５及び７の単離は、特許ＷＯ９５／２６４０６及びＷＯ９３
／０３１８３明細書中に、殊にその実施例中に記載されており、相応して実施し
た。これら刊行物の内容を、ここに参考として記載する。
子１、２、３、４、５及び７の単離は、特許ＷＯ９５／２６４０６及びＷＯ９３
／０３１８３明細書中に、殊にその実施例中に記載されており、相応して実施し
た。これら刊行物の内容を、ここに参考として記載する。
【００７５】 配列番号１の配列は、形質転換のために必要な選択マーカーと共にｒｉｂ３、
ｒｉｂ４及びｒｉｂ５の遺伝子フラグメントを有するＤＮＡ構造を示す。
ｒｉｂ４及びｒｉｂ５の遺伝子フラグメントを有するＤＮＡ構造を示す。
【００７６】 一般的核酸プロセス、例えばクローニング、制限的切断、アガロースゲル電気
泳動、ＤＮＡフラグメントのリンケージ、微生物の形質転換、細菌の培養及び組
み換えＤＮＡの配列分析は、他に記載のない限り、Sambrook et sl., (1989) (C
old Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) に記載のように実
施した。
泳動、ＤＮＡフラグメントのリンケージ、微生物の形質転換、細菌の培養及び組
み換えＤＮＡの配列分析は、他に記載のない限り、Sambrook et sl., (1989) (C
old Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) に記載のように実
施した。
【００７７】 組み換えＤＮＡ分子のシーケンシングは、Ｓａｎｇｅｒの方法（Sanger et al
. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) を用いるＡＢＩ社から
のレーザー蛍光−ＤＮＡ−シーケンサーを用いて行った。ポリメラーゼ連鎖反応
から生じるフラグメントを、発現されるべき構造中のポリメラーゼ誤差を避ける
ためにシーケンシングし、チェックした。
. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) を用いるＡＢＩ社から
のレーザー蛍光−ＤＮＡ−シーケンサーを用いて行った。ポリメラーゼ連鎖反応
から生じるフラグメントを、発現されるべき構造中のポリメラーゼ誤差を避ける
ためにシーケンシングし、チェックした。
【００７８】 例１ ｒｉｂ３、ｒｉｂ４及びｒｉｂ５遺伝子コピーを含有するＤＮＡ構造（ベクタ
ーＴｅｆ−Ｇ４１８ ｒｉｂ３、４、５）のクローニング ｒｉｂ−遺伝子の発現構造：ｒｉｂ３（ベクターｐＪＲ８７４）、ｒｉｂ４（
ベクターｐＪＲ７６２）及びｒｉｂ５（ベクターｐＪＲ７３９）は、ＷＯ９５／
２６４０６明細書中に記載されている。ベクターｐＡＧ−１１０（Steiner and
Philipsen (1994) Mol. Gen. Genet., 242; 263-271) を、ＤｒａＩＩＩを用い
て切断し、クレノフポリメラーゼ及びデソキシヌクレオチドと共にインキュベー
トし（末端の充填）、沈殿させ、次いでＳａｌＩで切断した。Ｔｅｆプロモータ
ー及びカナマイシンー抵抗性遺伝子をを含有するＤＮＡフラグメントをＨｉｎｄ
ＩＩＩ−及びＳａｌＩ−切断ベクターブルースクリプトＫＳ−（ストラテジェン
）（このＨｉｎｄＩＩＩ末端は、クレノフポリメラーゼで充填されている）とリ
ゲートさせた。ベクターｐＢＳＴｅｆ−Ｇ４１８が生じた。
ーＴｅｆ−Ｇ４１８ ｒｉｂ３、４、５）のクローニング ｒｉｂ−遺伝子の発現構造：ｒｉｂ３（ベクターｐＪＲ８７４）、ｒｉｂ４（
ベクターｐＪＲ７６２）及びｒｉｂ５（ベクターｐＪＲ７３９）は、ＷＯ９５／
２６４０６明細書中に記載されている。ベクターｐＡＧ−１１０（Steiner and
Philipsen (1994) Mol. Gen. Genet., 242; 263-271) を、ＤｒａＩＩＩを用い
て切断し、クレノフポリメラーゼ及びデソキシヌクレオチドと共にインキュベー
トし（末端の充填）、沈殿させ、次いでＳａｌＩで切断した。Ｔｅｆプロモータ
ー及びカナマイシンー抵抗性遺伝子をを含有するＤＮＡフラグメントをＨｉｎｄ
ＩＩＩ−及びＳａｌＩ−切断ベクターブルースクリプトＫＳ−（ストラテジェン
）（このＨｉｎｄＩＩＩ末端は、クレノフポリメラーゼで充填されている）とリ
ゲートさせた。ベクターｐＢＳＴｅｆ−Ｇ４１８が生じた。
【００７９】 第２クローニング工程で、ｐＪＲ８７４をＰｖｕＩＩ及びＳａｌＩを用いて切
断した。次いで、ｒｉｂ３−遺伝子フラグメントをＳａｌｌで切断し、かつ脱ホ
スホリル化されたベクターｐＢＳＴｅｆ−Ｇ４１８とリゲートさせた。このフラ
グメント及びベクターのＳａｌＩ末端のみがリゲートされ得たので、非コンパチ
ブルＰｖｕＩＩ及びＳａｌＩ末端をクレノフポリメラーゼで充填し、引き続きリ
ゲートさせた。生じるベクターを、以後、Ｔｅｆ−Ｇ４１８−ｒｉｂ３と称する
。
断した。次いで、ｒｉｂ３−遺伝子フラグメントをＳａｌｌで切断し、かつ脱ホ
スホリル化されたベクターｐＢＳＴｅｆ−Ｇ４１８とリゲートさせた。このフラ
グメント及びベクターのＳａｌＩ末端のみがリゲートされ得たので、非コンパチ
ブルＰｖｕＩＩ及びＳａｌＩ末端をクレノフポリメラーゼで充填し、引き続きリ
ゲートさせた。生じるベクターを、以後、Ｔｅｆ−Ｇ４１８−ｒｉｂ３と称する
。
【００８０】 ベクターＴｅｆ−Ｇ４１８−ｒｉｂ３中でのｒｉｂ５−遺伝子のサブクローニ
ングのために、ベクターｐＪＲ７３９をＮｃｏＩ及びＮｏｔＩを用いて切断した
。末端をクレノフポリメラーゼで充填した。次いで、ｒｉｂ５−遺伝子フラグメ
ントを、その末端が同様に充填されているＳａｌＩで切断されたベクターＴｅｆ
−Ｇ４１８−ｒｉｂ３にサブクローニングさせた。ベクターＴｅｆ−Ｇ４１８−
ｒｉｂ３，５が生じた。
ングのために、ベクターｐＪＲ７３９をＮｃｏＩ及びＮｏｔＩを用いて切断した
。末端をクレノフポリメラーゼで充填した。次いで、ｒｉｂ５−遺伝子フラグメ
ントを、その末端が同様に充填されているＳａｌＩで切断されたベクターＴｅｆ
−Ｇ４１８−ｒｉｂ３にサブクローニングさせた。ベクターＴｅｆ−Ｇ４１８−
ｒｉｂ３，５が生じた。
【００８１】 最後のクローニング工程で、ベクターｐＪＲ７６２からのｒｉｂ４−遺伝子フ
ラグメントをプライマー
ラグメントをプライマー
【００８２】
【化１】
【００８３】 を用いるＰＣＲにより得た。このＰＣＲ−フラグメントをＮｈｅＩで切断し、Ｎ
ｈｅＩで切断され、かつアルカリホスファターゼ−処理されたベクターＴｅｆ−
Ｇ４１８−ｒｉｂ３，５中にサブクローニングした。
ｈｅＩで切断され、かつアルカリホスファターゼ−処理されたベクターＴｅｆ−
Ｇ４１８−ｒｉｂ３，５中にサブクローニングした。
【００８４】 生じたＤＮＡ構造は、ベクターＴｅｆ−Ｇ４１８−ｒｉｂ３，４，５である。
【００８５】 例２ 真菌アシビア ゴシピイ中でのＤＮＡ構造の形質転換 例１に記載のＤＮＡ構造（ベクターＴｅｆ−Ｇ４１８−ｒｉｂ３，４，５）を
制限酵素ＳｐｅＩで完全に切断し、このｒｉｂ−遺伝子配列を有する挿入物を、
アガロースゲル分別により精製した。この形質転換のために使用された挿入物は
配列番号７に記載されている。この挿入物中に存在するｒｉｂ−遺伝子３、４及
び５の誘導されたアミノ酸配列は、配列番号８（＝ｒｉｂ３）、配列番号９（＝
ｒｉｂ５）及び配列番号１０（＝ｒｉｂ４）の配列で記載される。
制限酵素ＳｐｅＩで完全に切断し、このｒｉｂ−遺伝子配列を有する挿入物を、
アガロースゲル分別により精製した。この形質転換のために使用された挿入物は
配列番号７に記載されている。この挿入物中に存在するｒｉｂ−遺伝子３、４及
び５の誘導されたアミノ酸配列は、配列番号８（＝ｒｉｂ３）、配列番号９（＝
ｒｉｂ５）及び配列番号１０（＝ｒｉｂ４）の配列で記載される。
【００８６】 ＭＡ２−培地（バクト−ペプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス１ｇ／ｌ、ミオ−イ
ノシトール０．３ｇ／ｌ及びＤ−グルコース１０ｇ／ｌ）にアシビア ゴシピイ
胞子を接種した。この培養物を４℃で１２時間、次いで２８℃で撹拌下に１３時
間インキュベートした。細胞懸濁液を遠心分離し、細胞ペレットを５０ｍＭ燐酸
カリウム緩衝液ｐＨ７、２５ｍＭＤＤＴの５ｍｌ中に入れた。２８℃で３０分間
熱処理の後に、細胞を再び遠心分離し、ＳＴＭ緩衝液（２７０ｍＭサッカロース
、１０ｍＭＴＲＩＳ−ＨＣｌ ｐＨ７.５、１ｍＭＭｇＣｌ）２５ｍｌ中に入れ
た。次いで、この懸濁液０.５ｍｌを前記のように精製された挿入物約３μｇ及
びＳｐｅＩ酵素４０Ｕと混合し、Biorad Gene Pulser （１００Ω、２０μＦ、
１.５ｋＶ）中で電気穿孔した。この電気穿孔の後に、細胞をＭＡ２−媒体１ｍ
ｌと混合し、ＭＡ２−寒天培養プレート上に塗布した。抗生物質選択のために、
このプレートに２８℃で５時間のインキュベーシヨンの後に、抗生物質Ｇ４１８
（２００μｇ／ｍｌ）を含有する低温融解アガロース５ｍｌの層で覆った。形質
転換体を、マイクロマニピュレーシヨンによりクローナル精製した（Steiner an
d Philipsen(1995) Geneticsm 140; 973-987) 。この構造物の引き続く組み込み
は、形質転換体のゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析により証明された。ゲノムＤＮＡの
単離は、Carle and Olson（Proc. Natl. Acad. Sci. 1985,82, 3756-3760) 及び
Wright and Ｐhilipsen（Gen, 1991,109, 99-105)による記載に従い実施した。
この構造に関して特異的なプライマーを用いるＰＣＲを、R.Saikiに従って実施
した（PCR Protocols, 1990, Academic Press, 13-20)。ＰＣＲフラグメントの
分析は、アガロ−スゲル上の分離により行った。引き続く形質転換体のゲノム中
へのＤＮＡの組み込みを、次のプライマーを用いて実施した：
ノシトール０．３ｇ／ｌ及びＤ−グルコース１０ｇ／ｌ）にアシビア ゴシピイ
胞子を接種した。この培養物を４℃で１２時間、次いで２８℃で撹拌下に１３時
間インキュベートした。細胞懸濁液を遠心分離し、細胞ペレットを５０ｍＭ燐酸
カリウム緩衝液ｐＨ７、２５ｍＭＤＤＴの５ｍｌ中に入れた。２８℃で３０分間
熱処理の後に、細胞を再び遠心分離し、ＳＴＭ緩衝液（２７０ｍＭサッカロース
、１０ｍＭＴＲＩＳ−ＨＣｌ ｐＨ７.５、１ｍＭＭｇＣｌ）２５ｍｌ中に入れ
た。次いで、この懸濁液０.５ｍｌを前記のように精製された挿入物約３μｇ及
びＳｐｅＩ酵素４０Ｕと混合し、Biorad Gene Pulser （１００Ω、２０μＦ、
１.５ｋＶ）中で電気穿孔した。この電気穿孔の後に、細胞をＭＡ２−媒体１ｍ
ｌと混合し、ＭＡ２−寒天培養プレート上に塗布した。抗生物質選択のために、
このプレートに２８℃で５時間のインキュベーシヨンの後に、抗生物質Ｇ４１８
（２００μｇ／ｍｌ）を含有する低温融解アガロース５ｍｌの層で覆った。形質
転換体を、マイクロマニピュレーシヨンによりクローナル精製した（Steiner an
d Philipsen(1995) Geneticsm 140; 973-987) 。この構造物の引き続く組み込み
は、形質転換体のゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析により証明された。ゲノムＤＮＡの
単離は、Carle and Olson（Proc. Natl. Acad. Sci. 1985,82, 3756-3760) 及び
Wright and Ｐhilipsen（Gen, 1991,109, 99-105)による記載に従い実施した。
この構造に関して特異的なプライマーを用いるＰＣＲを、R.Saikiに従って実施
した（PCR Protocols, 1990, Academic Press, 13-20)。ＰＣＲフラグメントの
分析は、アガロ−スゲル上の分離により行った。引き続く形質転換体のゲノム中
へのＤＮＡの組み込みを、次のプライマーを用いて実施した：
【００８７】
【化２】
【００８８】 全ての形質転換体において、ゲノム中への有効な組み込みが検出可能であった
。
。
【００８９】 例３ 組み換えアシビア ゴシピイクローン中でのリボフラビン測定 アシビア ゴシピイ Ｉｔａ−ＧＳ−０１（Schmidt, G., Stahmann,K.P.,Kae
sler, B.,& Sahm, H.(1996) Microbiology 142, 419-426) 及びこれから例１に
記載の構造を用いる形質転換により誘導された菌株Ｉｔａ−ＧＳ−０１＃１７.
１を寒天培地上、２８℃で４日間培養した。このプレートから媒体（酵母エキス
２７．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４０．５ｇ／ｌ、大豆油５０ｍｌ／ｌ、ｐＨ７.０）
１０ｍｌを有する１００ｍｌエーレンマイヤーフラスコ３本に接種した（１７.
１−１、１７.１−２、１７.１−３）。２８℃でシェーカー上１８０ｒｐｍで４
０時間のインキュベーシヨンの後に、培養液の各１ｍｌ部分をＹＰＤ培地（酵母
エキス１０ｇ／ｌ、バクトペプトン２０ｇ／ｌ、グルコース２０ｇ／ｌ）２０ｍ
ｌを含有する２５０ｍｌエーレンマイヤーフラスコ中に移行した。２８℃、３０
０ｒｐｍでインキュベーシヨン。１９０時間の後に各フラスコから試料１ｍｌを
取り出し、１Ｍ過塩素酸１ｍｌと混合した。試料を濾過し、ＨＰＬＣ分析により
リボフラビン含有率を測定した。この場合に、リボフラビン標準（１０ｍｇ／ｌ
、２０ｍｇ／ｌ、３０ｍｇ／ｌ、４０ｍｌ／ｌ、５０ｍｇ／ｌ）での検定を行っ
た。
sler, B.,& Sahm, H.(1996) Microbiology 142, 419-426) 及びこれから例１に
記載の構造を用いる形質転換により誘導された菌株Ｉｔａ−ＧＳ−０１＃１７.
１を寒天培地上、２８℃で４日間培養した。このプレートから媒体（酵母エキス
２７．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４０．５ｇ／ｌ、大豆油５０ｍｌ／ｌ、ｐＨ７.０）
１０ｍｌを有する１００ｍｌエーレンマイヤーフラスコ３本に接種した（１７.
１−１、１７.１−２、１７.１−３）。２８℃でシェーカー上１８０ｒｐｍで４
０時間のインキュベーシヨンの後に、培養液の各１ｍｌ部分をＹＰＤ培地（酵母
エキス１０ｇ／ｌ、バクトペプトン２０ｇ／ｌ、グルコース２０ｇ／ｌ）２０ｍ
ｌを含有する２５０ｍｌエーレンマイヤーフラスコ中に移行した。２８℃、３０
０ｒｐｍでインキュベーシヨン。１９０時間の後に各フラスコから試料１ｍｌを
取り出し、１Ｍ過塩素酸１ｍｌと混合した。試料を濾過し、ＨＰＬＣ分析により
リボフラビン含有率を測定した。この場合に、リボフラビン標準（１０ｍｇ／ｌ
、２０ｍｇ／ｌ、３０ｍｇ／ｌ、４０ｍｌ／ｌ、５０ｍｇ／ｌ）での検定を行っ
た。
【００９０】 リボフラビン測定のためのＨＰＬＣ−法のパラメータ： カラム ＯＤＳ Hypersil 5mm 200X 2.1mm (HP) 溶離液Ａ 水をＨ３ＰＯ４（８９％）３４０ｍｌでｐＨ２.３まで 溶離液Ｂ １００％ アセトニトリル 勾配 ０〜６分：Ｂ２％〜Ｂ５０％ ６〜６.５分：Ｂ５０％〜Ｂ２％ 停止時間 １０分 流速 ０.５ｍｌ／ｍｉｎ 検出 ２８０ｎｍ 温度 ４０℃ 注入 ２〜１０μｌ ｒｉｂ−遺伝子３、４及び５の付加的遺伝子コピーを含有するクローン１７の
全３バッチは当初菌株に比べて明白に増加されたリボフラビン生産性を示してい
る（図４）。
全３バッチは当初菌株に比べて明白に増加されたリボフラビン生産性を示してい
る（図４）。
【００９１】 図４は、種々のクローンのリボフラビン収率を示している。ｒｉｂ３、４及び
５遺伝子の導入により、非修飾菌株に比べて１５０％までのリボフラビン収率上
昇を達することができた。 配列表 （１）書誌的事項： （１）出願人： （Ａ）名称： ＢＡＳＦ Aktiengesellschaft （Ｂ）番地： Carl-Bosch-Strasse 38 （Ｃ）都市： Ludwigshafen （Ｄ）州： Rheinland-Pfalz （Ｅ）国： ドイツ連邦共和国 （Ｆ）郵便番号： D-67056 (ｉｉ）発明の名称：リボフラビンの遺伝的製法 （ｉｉｉ）配列の数： １０ （ｉｖ） コンピュータの記録方式： （Ａ）記録媒体：フロッピーデイスク （Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ ＰＣ 互換機 （Ｃ）システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウエア：ＰａｔｅｎｔＩｎ Ｒｅｌｅａｓｅ＃１.０， Ｖｅｒｓｉｏｎ ＃１．２５（ＥＰＯ） （２）配列番号１： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：６５５塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジイ：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類： ＤＮＡ（ゲノミック） （ｉｉｉ)ハイポセシス： Ｎｏ （ｉｉｉ）アンチセンス： Ｎｏ （ｖｉ） 原起源： （Ａ）微生物：アシビア ゴシピイ （ｖｉｉ）直接起源： （Ｂ）クローン：ＩＴＡ １７ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キイ： ＣＤＳ （Ｂ）位置： １１．．６４９ （ｘｉ）配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：
５遺伝子の導入により、非修飾菌株に比べて１５０％までのリボフラビン収率上
昇を達することができた。 配列表 （１）書誌的事項： （１）出願人： （Ａ）名称： ＢＡＳＦ Aktiengesellschaft （Ｂ）番地： Carl-Bosch-Strasse 38 （Ｃ）都市： Ludwigshafen （Ｄ）州： Rheinland-Pfalz （Ｅ）国： ドイツ連邦共和国 （Ｆ）郵便番号： D-67056 (ｉｉ）発明の名称：リボフラビンの遺伝的製法 （ｉｉｉ）配列の数： １０ （ｉｖ） コンピュータの記録方式： （Ａ）記録媒体：フロッピーデイスク （Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ ＰＣ 互換機 （Ｃ）システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウエア：ＰａｔｅｎｔＩｎ Ｒｅｌｅａｓｅ＃１.０， Ｖｅｒｓｉｏｎ ＃１．２５（ＥＰＯ） （２）配列番号１： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：６５５塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジイ：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類： ＤＮＡ（ゲノミック） （ｉｉｉ)ハイポセシス： Ｎｏ （ｉｉｉ）アンチセンス： Ｎｏ （ｖｉ） 原起源： （Ａ）微生物：アシビア ゴシピイ （ｖｉｉ）直接起源： （Ｂ）クローン：ＩＴＡ １７ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キイ： ＣＤＳ （Ｂ）位置： １１．．６４９ （ｘｉ）配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：
【００９２】
【外１】
【００９３】 （２）配列番号２： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２１２アミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）トポロジイ：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類： 蛋白質 （ｘｉ）配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：
【００９４】
【外２】
【００９５】 （２）配列番号３： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：５２９塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジイ：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類： ＤＮＡ（ゲノミック） （ｉｉｉ)ハイポセシス： Ｎｏ （ｉｉｉ）アンチセンス： Ｎｏ （ｖｉ） 原起源： （Ａ）微生物：アシビア ゴシピイ （ｖｉｉ）直接起源： （Ｂ）クローン：ＩＴＡ １７ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キイ： ＣＤＳ （Ｂ）位置： ８．．５２６ （ｘｉ）配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３
【００９６】
【外３】
【００９７】 （２）配列番号４： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１７２アミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）トポロジイ：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類： 蛋白質 （ｘｉ）配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４
【００９８】
【外４】
【００９９】 （２）配列番号５： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：７１２塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジイ：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類： ＤＮＡ（ゲノミック） （ｉｉｉ)ハイポセシス： Ｎｏ （ｉｉｉ）アンチセンス： Ｎｏ （ｖｉ） 原起源： （Ａ）微生物：アシビア ゴシピイ （ｖｉｉ）直接起源： （Ｂ）クローン：ＩＴＡ １７ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キイ： ＣＤＳ （Ｂ）位置： ５．．７１２ （ｘｉ）配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５
【０１００】
【外５】
【０１０１】 （２）配列番号６ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２３５アミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）トポロジイ：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類： 蛋白質 （ｘｉ）配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６
【０１０２】
【外６】
【０１０３】 （２）配列番号７： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：６３１７塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジイ：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類： ＤＮＡ（ゲノミック） （ｉｉｉ)ハイポセシス： Ｎｏ （ｉｉｉ）アンチセンス： Ｎｏ （ｖｉ） 原起源： （Ａ）微生物：アシビア ゴシピイ （ｖｉｉ）直接起源： （Ｂ）クローン：５ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キイ： ＣＤＳ （Ｂ）位置： ２３０６．．２９４４ （ｘｉ）特徴： Ａ）名称／キイ： ＣＤＳ （Ｂ）位置： ３５７５．．４２８２ （ｘｉ）特徴： Ａ）名称／キイ： ＣＤＳ （Ｂ）位置： ４７１７．．５２３５ （ｘｉ）配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７：
【０１０４】
【外７】
【０１０５】
【外８】
【０１０６】
【外９】
【０１０７】
【外１０】
【０１０８】 （２）配列番号８： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２１２アミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）トポロジイ：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類： 蛋白質 （ｘｉ）配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８
【０１０９】
【外１１】
【０１１０】 （２）配列番号９： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２３５アミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）トポロジイ：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類： 蛋白質 （ｘｉ）配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９：
【０１１１】
【外１２】
【０１１２】 （２）配列番号１０： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１７２アミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）トポロジイ：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類： 蛋白質 （ｘｉ）配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０
【０１１３】
【外１３】
【配列表】
【図１】 組み込みの後に得られたクローンＩＴＡ−ＧＳ−１５.２、ＩＴＡ−ＧＳ−１
７.１及びＩＴＡ−ＧＳ−０１のビタミンＢ２生産性を示すグラフ。
７.１及びＩＴＡ−ＧＳ−０１のビタミンＢ２生産性を示すグラフ。
【図２】 本発明によるｒｉｂ−遺伝子組み合わせを組み込む方法を示す図。
【図３】 本発明によるｒｉｂ−遺伝子組み合わせを組み込むもう一つの方法を示す図。
【図４】 種々のクローンのリボフラビン収率を示すグラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 25/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＵ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＧＥ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＴ，Ｌ Ｖ，ＭＫ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＵＡ，ＵＳ，ＺＡ (72)発明者 オスカー ツェルダー ドイツ連邦共和国 シュパイヤー ロスマ ルクトシュトラーセ 27 (72)発明者 ホセ ルイーズ レヴェルタ ドヴァル スペイン国 サラマンカ ４ エ グリリ ョ 11 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA05 BA77 CA01 DA11 HA20 4B064 AH02 CA05 CA19 CC24 DA01 DA10 4B065 AA58X AA58Y AB01 AC14 BA02 CA27 CA42 CA44
Claims (17)
- 【請求項１】 リボフラビンを合成することのできる生物を用いてリボフラ
ビンを増加製造する方法において、生物中で酵素３，４−ジヒドロキシ−２−ブ
タノン−４−ホスフェート−シンターゼ、ジメチル−８−リビチルルマジン−シ
ンターゼ及びリボフラビン−シンターゼ又はそれらの機能的類縁体の活性を高め
させることを特徴とする、リボフラビンを増加製造する方法。 - 【請求項２】 酵素３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン−４−ホスフェー
ト−シンターゼ、ジメチル−８−リビチルルマジン−シンターゼ及びリボフラビ
ン−シンターゼ又はそれらの機能的類縁体をコードする遺伝子の組み合わせを、
これら酵素の活性増加のために生物中に導入する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 生物として、細菌、酵母、真菌又は植物を用いる、請求項１
又は２に記載の方法。 - 【請求項４】 バシルス、クロストリジウム、エセリキア、ピチア、カンジ
ダ、シアノバクター、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、サッカロマイ
セス、エレモテシウム又はアシビア属又はシロイスナズナ、トマト、馬鈴薯、ト
ウモロコシ、ヒマ種子、小麦、大麦、ひまわり、キビ、ライ麦、オート麦、甜菜
、種々のマメ類又はダイズ等の植物の群から選択された生物を使用する、請求項
１から３までのいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項５】 バシルス、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、エセ
リキア、カンジダ、エレモテシウム又はアシビア属の群から選択された生物を使
用する、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項６】 配列番号１、配列番号３及び配列番号５の配列を有する遺伝
子又はそれらの機能的均等物を用いる、請求項１から５までのいずれか１項に記
載の方法。 - 【請求項７】 均等物は、これら配列によりコード化され、誘導されたアミ
ノ酸のレベルで３５％の相同性を有する、請求項１から６までのいずれか１項に
記載の方法。 - 【請求項８】 酵素３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン−４−ホスフェー
ト−シンターゼ、ジメチル−８−リビチルルマジン−シンターゼ及びリボフラビ
ン−シンターゼ又はそれらの機能的類縁体をコードする遺伝子は、真核又は原核
生物に由来する、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項９】 遺伝子又はその均等物は、バシルス、エセリキア、クロスト
リジウム、サッカロマイセス、カンジダ、エレモテシウム又はアシビアの群から
選択された生物に由来する、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１０】 遺伝子又はその均等物は少なくとも１つのベクター又は染
色体上に一緒に又は別々に局在されている、請求項１から９までのいずれか１項
に記載の方法。 - 【請求項１１】 配列番号１、配列番号３及び配列番号５の配列を有する遺
伝子又はそれらの機能的均等物を含有し、この際、遺伝子又はその均等物は１以
上の調節シグナルと機能的に連結している、核酸フラグメント。 - 【請求項１２】 請求項１１に記載の核酸フラグメントを含有する発現ベク
ター。 - 【請求項１３】 直鎖状核酸である、請求項１２に記載の発現ベクター。
- 【請求項１４】 請求項１１に記載の核酸フラグメント少なくとも１個又は
請求項１２に記載の発現ベクター少なくとも１個を含有する生物。 - 【請求項１５】 リボフラビンの増加製造のための、リボフラビンを合成す
ることのできる生物中での酵素３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン−４−ホス
フェート−シンターゼ、ジメチル−８−リビチルルマジン−シンターゼ及びリボ
フラビン−シンターゼ又はそれらの機能的類縁体をコードする遺伝子の組み合わ
せの使用。 - 【請求項１６】 アシビア ゴシピイ中での請求項１５に記載の使用。
- 【請求項１７】 少なくとも１個のリボフラビン合成遺伝子を制限酵素介在
組み込みによって生物のゲノム中に導入することを特徴とする、生物のゲノム中
に核酸を組み込む方法。
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