CN116463305B - 一种提高用于乙醇氧化的醇氧化酶表达量的方法、优化的核黄素生物合成基因 - Google Patents
一种提高用于乙醇氧化的醇氧化酶表达量的方法、优化的核黄素生物合成基因 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种提高用于乙醇氧化的醇氧化酶表达量的方法、优化的核黄素生物合成基因。本发明将毕赤酵母来源醇氧化酶PpAOX在大肠杆菌中进行异源表达，通过异源表达枯草杆菌来源核黄素合成操纵子提高大肠杆菌中FAD水平提高表达水平，利用融合SUMO标签提高其可溶性表达，实现了醇氧化酶在大肠杆菌中的高效表达。为实现醇氧化酶的大规模工业化生产，降低其应用成本提供重要的理论和技术基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种提高用于乙醇氧化的醇氧化酶表达量的方法、优化的核黄素生物合成基因。
背景技术
短链醇氧化酶（SCAOX，EC 1.1.3.13）是一种依赖黄素腺嘌呤核苷酸（Flavinadenine dinucleotide，FAD）氧化短链伯醇（C1~C8）生成相应的醛和过氧化氢的氧化还原酶。醇氧化酶对甲醇具有最高的亲和力，亲和力随烷基（R）基团链长的增加而降低。在甲基营养型酵母中，SCAOX参与甲醇代谢，将甲醇氧化成甲醛和过氧化氢。甲基营养型酵母新生成的醇氧化酶依靠其过氧化物酶体靶向信号（Peroxisome Targeting Signal，PTS），被运输到过氧化物酶体中发挥作用。
SCAOX蛋白单亚基的分子质量约为65~80 kDa，其活性功能体是含有8个FAD辅因子和8个亚基的同源八聚体。SCAOX的底物广泛、反应的不可逆性和辅因子循环使用的优势使得SCAOX已经在多个方面成功应用，如可用于研究蛋白向过氧化物酶体的转位，基于固定化SCAOX构建的生物反应器用于醇醛类物质分析检测、醇醛物质的生物转化、生物修复方面的醛类物质降解等。另外，其中具有乙醇和乙醛氧化活性的SCAOX具有解酒功能，具有广阔的应用前景和重要的经济价值。
然而，目前SCAOX大规模工业生产困难，目前商品化SCAOX主要来源于毕赤酵母，但其在毕赤酵母中的表达量低且为胞内表达，导致其生产及后续纯化成本较高。另外，由于其活性表达需要黄素腺嘌呤核苷酸辅酶和特殊的装配环境，在异源微生物细胞中也难以实现其活性重组表达，限制了其应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高醇氧化酶表达量的方法。
本发明的再一目的是提供优化的核黄素生物合成基因。
根据本发明的优化的核黄素生物合成基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1。
根据本发明的提高醇氧化酶表达量的方法，包括以下步骤：
将醇氧化酶与SUMO标签在大肠杆菌中融合表达，其中，所述大肠杆菌表达核黄素生物合成基因，所述核黄素生物合成基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述SUMO标签的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
根据本发明的提高醇氧化酶表达量的方法，其中，所述醇氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明将毕赤酵母来源醇氧化酶PpAOX在大肠杆菌中进行异源表达，通过异源表达枯草杆菌来源核黄素合成操纵子提高大肠杆菌中FAD水平提高表达水平，利用融合SUMO标签提高其可溶性表达，实现了醇氧化酶在大肠杆菌中的高效表达。为实现醇氧化酶的大规模工业化生产，降低其应用成本提供重要的理论和技术基础。
附图说明
图1显示大肠杆菌BL21/Rib operon和BL21/Rib operon-1菌株的菌落形态；
图2 显示醇氧化酶PpAOX在大肠杆菌中的重组表达及纯化，其中，
A图显示醇氧化酶PpAOX在不同大肠杆菌菌株中的表达情况，其中，M：蛋白Marker，1，2：Sumo-PpAOX融合蛋白在BL21/Rib operon-1菌株中的表达，3，PpAOX在BL21/Riboperon-1菌株中的表达，4：Sumo-PpAOX融合蛋白在BL21/Rib operon菌株中的表达；
B图显示镍柱亲和纯化Sumo-PpAOX融合蛋白，其中，M：蛋白Marker，1：Sumo-PpAOX融合蛋白在BL21/Rib operon-1菌株中的裂解上清，2：样品的流穿液，3：40 mM咪唑漂洗样品，4：50 mM 咪唑漂洗，5：60 mM咪唑漂洗，6：200 mM咪唑洗脱，7：300 mM咪唑洗脱，8：400mM咪唑洗脱。
图3显示重组醇氧化酶的活力检测，A：醇氧化酶的显色反应，CK：以水作为底物的对照体系，AOX：以乙醇作为底物的反应体系；B：GC-QQQ检测重组醇氧化酶氧化乙醛/乙醇的酶活力，CK：未加酶的对照体系；AOX：添加重组醇氧化酶的反应体系。
具体实施方式
以下实施例所用的质粒和菌株：用于质粒构建的大肠杆菌Mach1-T1菌株，用于蛋白表达的BL21（DE3）感受态细胞，高产核黄素的枯草芽抱杆菌RibH，该菌株是从枯草芽抱杆菌168菌株出发，通过诱变育种技术获得，pUC19和pET30a骨架质粒。
实施例
挑取枯草芽孢杆菌168和RibH单菌落，37 ℃，200 rpm震荡过夜培养，6000 rpm离心10分钟收集菌体，利用细菌基因组提取试剂盒提取其基因组DNA。以不同枯草芽孢杆菌菌株的基因组DNA作为模板，利用引物对rib-F（5’AGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGAAGGACAAATGAATAAAGATTGTATC3’）和rib-R（5’GCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCTGATCACAGCCTCTGCTTAATTATTG3’）扩增核黄素生物合成操纵子序列，并重组至pUC19的BamHI位点进行测序验证和后续转化。
来自突变体RibH的核黄素生物合成操纵子 rib operon-1的序列如SEQ ID NO：1所示；来自枯草芽孢杆菌168的核黄素生物合成操纵子 rib operon的序列如SEQ ID NO：2所示。
核黄素是醇氧化酶辅酶FAD的前体物质，为了提高大肠杆菌表达宿主中辅酶FAD的水平，从而促进醇氧化酶的活性表达。本发明分别从筛选得到的高产核黄素枯草芽孢杆菌和野生型枯草芽孢杆菌菌株中克隆核黄素合成操纵子序列rib operon-1和rib operon，并分别重组至pUC19质粒的BamHI位点，构建得到pUC19-rib operon和pUC19-rib operon-1。将核黄素高产菌株来源的rib operon-1进行测序验证。测序结果表明，rib operon-1与riboperon相比，在调控区域的终止子序列中有个8碱基的缺失，整个操纵子序列中有9个单碱基突变。
将质粒pUC19-rib operon和pUC19-rib operon-1分别转化大肠杆菌BL21 (DE3)菌株，构建获得核黄素生物合成基因高表达的大肠杆菌BL21/Rib operon和BL21/Riboperon-1菌株。LB平板培养条件下，BL21/Rib operon-1菌株的菌落颜色明显变黄，而BL21/Rib operon菌落颜色无明显变化（图1）。表明核黄素高产菌株来源的核黄素生物合成操纵子序列rib operon-1相较于野生型芽孢杆菌来源的rib operon在大肠杆菌中具有更强的核黄素合成能力。
根据大肠杆菌密码子偏好性优化毕赤酵母醇氧化酶AOX1编码序列和酿酒酵母SUMO编码序列并进行基因合成。毕赤酵母醇氧化酶AOX1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其优化的编码序列如SEQ ID NO：4所示，SUMO的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，其编码序列如SEQ ID NO：6所示。
（1）构建质粒pET30a-PpAox
利用引物对PPAOX-F（5’TTTAACTTTAAGAAGGAGATATACAATGGCTATCCCCGAAGAGTTTG3’）/PPAOX-R（5’CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGATTAGAATCTAGCAAGACCGG3’）分别扩增AOX编码序列，将其重组至质粒pET30a的NdeI/XhoI位点，构建得到质粒pET30a-PpAox。
（2）构建质粒pET30a-sumo-PpAox1
利用引物对Sumo-F（5’TTTAACTTTAAGAAGGAGATATACAATGAGTGATTCAGAAGTAAATC）/SumoR（5’GTAGGTAGCACCGCCGATC3’）和PPAOX-F1（5’TGAACAGATCGGCGGTGCTACCTACATGGCTATCCCCGAAGAGTTTG3’）/PPAOX-R（5’CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGATTAGAATCTAGCAAGACCGG）分别扩增SUMO和AOX编码序列，利用引物对Sumo-F/PPAOX-R通过Overlap PCR扩增得到SUMO和AOX融合表达序列，并将其重组至质粒pET30a的NdeI/XhoI位点，构建得到质粒pET30a-sumo-PpAox1。
3.大肠杆菌中重组蛋白表达
将上述得到的表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞，在添加有相应筛选抗生素的LB平板上筛选阳性克隆子。接单菌落到含有抗生素的液体LB培养基中，在37℃、200 rpm恒温摇床中过夜培养至饱和。过夜培养的菌液按照 1:50 的比例转接到新鲜的含有抗生素的液体LB培养基中，在37℃、200 rpm恒温摇床中培养至OD600为0.4~0.6，加入IPTG溶液（终浓度为0.1 mM），在16℃，200 rpm诱导表达24 h。记录发酵液中菌体的OD600，4℃、6,000 rpm离心10 min收集菌体，置于-80℃冰箱保存备用。
将毕赤酵母醇氧化酶PpAOX表达质粒pET30a-PpAox及Sumo-PpAOX融合表达质粒pET30a-sumo-PcAOX分别转化大肠杆菌BL21，BL21/Rib operon和BL21/Rib operon-1菌株，分别筛选转化子进行诱导表达。16℃，0.1 mM IPTG诱导培养过夜，收集菌体，并进行超声破碎。SDS-PAGE检测破碎上清中的目的蛋白。
结果显示：
单独的PpAOX和Sumo-PpAOX融合蛋白在未转化核黄素合成基因操纵子的BL21大肠杆菌宿主中均未检测到可溶性表达。
Sumo-PpAOX融合蛋白在BL21/Rib operon和BL21/Rib operon-1菌株中均可实现可溶性表达，且在BL21/Rib operon-1菌株中的表达水平明显提高。Sumo-PpAOX融合蛋白在BL21/Rib operon-1菌株中表达的可溶性蛋白经过镍柱亲和纯化，得到重组醇氧化酶蛋白（图2中B图）。
未与SUMO标签融合表达的PpAOX在BL21/Rib operon菌株中未检测到可溶性表达；在BL21/Rib operon-1菌株中可实现可溶性表达，但表达水平明显低于与SUMO标签的融合表达蛋白（图2中A图）。
显色法检测醇氧化酶活力反应体系中以2%乙醇和水（作为对照）作为底物，添加1%邻联茴香胺，0.3 mg/ml辣根过氧化物酶，50 mM pH 7.0 Tris-HCl Buffer为其缓冲体系。酶液加入反应体系中在37℃下反应3 min后加入1 ml 2 M H2SO4终止反应，测定OD540吸光度值。
为了检测重组醇氧化酶的酶活力，利用镍柱亲和纯化重组醇氧化酶。分别利用显色法和GC-QQQ技术检测重组醇氧化酶的催化活力。醇氧化酶可以通过消耗氧气来催化甲醇，乙醇及其他低级醇类，并将其氧化生成其相应的醛类和过氧化氢，过氧化氢可在辣根过氧化物酶的作用下将无色的还原型的邻联茴香胺转化为红色的氧化型邻联茴香胺。实验结果表明，添加重组醇氧化酶PpAOX的反应体系中，以2%乙醇作为底物时，可见明显的红色产物（图3中A图）。
将纯化后的重组醇氧化酶PpAOX（1mg/mL）和2%乙醇于pH 6.0柠檬酸缓冲液中37℃反应5分钟，TCA终止反应。应用三重四级杆气质联用仪（GC-QQQ）技术检测底物的转化和产物的生成。结果显示，反应结束后，与未加酶的对照体系相比，添加重组醇氧化酶的反应体系中乙醇含量明显下降，而乙酸含量增加，表明重组醇氧化酶具有较强的氧化乙醇的酶活力（图3中B图）。
以上实施例仅用于理解本申请的技术方案，不限定本申请的保护范围。
Claims (1)
1.一种提高醇氧化酶表达量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
将醇氧化酶与 SUMO 标签在大肠杆菌中融合表达， 其中， 所述大肠杆菌表达核黄素生物合成 基因，所述核黄素生物合成基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示，所述 SUMO标签的 氨基酸序列如 SEQ ID NO :5 所示；所述醇氧化酶的氨基 酸序列如 SEQ ID NO :3 所示。
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Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1303434A (zh) * | 1998-05-28 | 2001-07-11 | Basf公司 | 用于生产核黄素的遗传方法 |
| CN101014705A (zh) * | 2004-07-07 | 2007-08-08 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 改进的酶 |
| CN102209780A (zh) * | 2008-11-07 | 2011-10-05 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 经改进的核黄素生产 |
| CN103695493A (zh) * | 2013-12-24 | 2014-04-02 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一种2，3-环氧角鲨烯的生物合成方法 |
| CN105483071A (zh) * | 2015-12-29 | 2016-04-13 | 天津大学 | 一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株及构建及发酵方法 |
| CN108330136A (zh) * | 2017-05-05 | 2018-07-27 | 北京航空航天大学 | 一种构建产黄素单核苷酸的工程菌株的方法及其应用 |
| CN110945086A (zh) * | 2017-06-30 | 2020-03-31 | 陶氏环球技术有限责任公司 | 用于清除醛的涂层及其制备方法 |
| WO2021072146A2 (en) * | 2019-10-10 | 2021-04-15 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for converting methanol into hydrogen peroxide and carbon dioxide |
| CN116218831A (zh) * | 2022-12-22 | 2023-06-06 | 北京易醒生物科技有限公司 | 乙醇氧化酶稳定化纳米粒子及制备方法、应用和解酒药 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5837528A (en) * | 1989-06-22 | 1998-11-17 | Hoffmann La Roche, Inc. | Bacterial strains which overproduce riboflavin |
-
2023
- 2023-06-15 CN CN202310705892.4A patent/CN116463305B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1303434A (zh) * | 1998-05-28 | 2001-07-11 | Basf公司 | 用于生产核黄素的遗传方法 |
| CN101014705A (zh) * | 2004-07-07 | 2007-08-08 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 改进的酶 |
| CN102209780A (zh) * | 2008-11-07 | 2011-10-05 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 经改进的核黄素生产 |
| CN103695493A (zh) * | 2013-12-24 | 2014-04-02 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一种2，3-环氧角鲨烯的生物合成方法 |
| CN105483071A (zh) * | 2015-12-29 | 2016-04-13 | 天津大学 | 一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株及构建及发酵方法 |
| CN108330136A (zh) * | 2017-05-05 | 2018-07-27 | 北京航空航天大学 | 一种构建产黄素单核苷酸的工程菌株的方法及其应用 |
| CN110945086A (zh) * | 2017-06-30 | 2020-03-31 | 陶氏环球技术有限责任公司 | 用于清除醛的涂层及其制备方法 |
| WO2021072146A2 (en) * | 2019-10-10 | 2021-04-15 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for converting methanol into hydrogen peroxide and carbon dioxide |
| CN116218831A (zh) * | 2022-12-22 | 2023-06-06 | 北京易醒生物科技有限公司 | 乙醇氧化酶稳定化纳米粒子及制备方法、应用和解酒药 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Genetic Control of Biosynthesis and Transport of Riboflavin and Flavin Nucleotides and Construction of Robust Biotechnological Producers;Charles A. Abbas 等;《MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS》;第75卷(第2期);第321-360页 * |
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