CN116218831A - 乙醇氧化酶稳定化纳米粒子及制备方法、应用和解酒药 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及乙醇氧化酶稳定化纳米粒子及制备方法、应用和解酒药，乙醇氧化酶稳定化纳米粒子中，乙醇氧化酶负载于壳体中，所述的壳体包含第一链段和第二链段的交联结构，所述的第一链段的原料为壳聚糖及其衍生物中的一种或多种，所述的第二链段的原料为聚谷氨酸及其衍生物中的一种或多种；制备方法包括将乙醇氧化酶水溶液与三聚磷酸钠水溶液、第二链段原料的水溶液初步反应后，加入第一链段原料的醋酸溶液继续反应形成含有乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的混合液；上述乙醇氧化酶稳定化纳米粒子或制备方法可用于制造解酒用的药物中。本申请的乙醇氧化酶能够在体内的肠道位置稳定、持续地发挥对乙醇的氧化作用。

Description

乙醇氧化酶稳定化纳米粒子及制备方法、应用和解酒药
技术领域
本发明涉及装载于有机载体的酶及其制备方法，具体涉及乙醇氧化酶稳定化纳米粒子及制备方法、应用和解酒药。
背景技术
乙醇氧化酶(Alcohol Oxidase)由于可以氧化乙醇中的羟基，形成醛、酸，并相应产生过氧化氢，具有作为解酒药物成分的前景。然而由于其本身稳定性的缺陷，在体内易受到胃酸、蛋白水解酶、胰液等影响，现有技术依然无法很好的利用其特性来制造能够帮助人们解酒药物。
发明内容
本申请的主要目的在于提供一种乙醇氧化酶稳定化纳米粒子及其制备方法，以实现乙醇氧化酶能够在肠道内稳定、持续的发挥作用。
为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种乙醇氧化酶稳定化纳米粒子，乙醇氧化酶负载于壳体中，所述的壳体包含第一链段和第二链段的交联结构，
所述的第一链段的原料为壳聚糖及其衍生物中的一种或多种，
所述的第二链段的原料为聚谷氨酸及其衍生物中的一种或多种。
在本发明第一方面的一些实施例中，交联结构中具有第三链段，第三链段的原料为交联剂，所述的第三链段交联于第一链段与第二链段之间。
在本发明第一方面的一些实施例中，所述的交联剂采用戊二醛。
在本发明第一方面的一些实施例中，粒径范围在270nm～320nm之间。
在本发明第一方面的一些实施例中，所述的壳体中还含有十二烷基硫酸钠。
在本发明第一方面的一些实施例中，所述的壳体中还含有三聚磷酸钠。
在本发明第一方面的一些实施例中，含有所述第一链段占粒子总重量的12％～24％。所述第二链段占粒子总重量的16％～32％。
在本发明第一方面的一些实施例中，所述的壳聚糖及其衍生物的分子量为200000～1000000。
在本发明第一方面的一些实施例中，所述的聚谷氨酸及其衍生物的分子量为700000～1000000。
在本发明第一方面的一些实施例中，原料中包含8～20重量份的乙醇氧化酶、12～24重量份的壳聚糖、16～32重量份的聚谷氨酸。
在本发明第一方面的一些实施例中，原料中还包含8～16重量份的三聚磷酸钠。
在本发明第一方面的一些实施例中，原料中还包含2.75～5.5重量份的戊二醛。
在本发明第一方面的一些实施例中，原料中还包含3.25～6.5重量份的十二烷基硫酸钠。
本发明的第二方面涉及乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的制备方法，将乙醇氧化酶水溶液与三聚磷酸钠水溶液、第二链段原料的水溶液初步反应后，加入第一链段原料的醋酸溶液继续反应形成含有乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的混合液，
所述的第一链段原料为壳聚糖及其衍生物中的一种或多种，
所述的第二链段原料为聚谷氨酸及其衍生物中的一种或多种。
在本发明第二方面的一些实施例中，所述的壳聚糖及其衍生物的分子量为200000～1000000。
在本发明第二方面的一些实施例中，所述的聚谷氨酸及其衍生物的分子量为700000～1000000。
在本发明第二方面的一些实施例中，所述的第一链段原料的醋酸溶液的浓度为0.5～1.5mg/ml。
在本发明第二方面的一些实施例中，所述的第二链段原料的水溶液的浓度为1～5mg/ml。
在本发明第二方面的一些实施例中，所述的三聚磷酸钠水溶液的浓度为1～5mg/ml。
在本发明第二方面的一些实施例中，所述的乙醇氧化酶水溶液的浓度为0.5～1.5mg/ml。
在本发明第二方面的一些实施例中，在所述的混合液中还加入阴离子表面活性剂。
在本发明第二方面的一些实施例中，所述的阴离子表面活性剂采用十二烷基硫酸钠。
在本发明第二方面的一些实施例中，在所述的混合液中还加入交联剂。
在本发明第二方面的一些实施例中，所述的交联剂采用戊二醛。
在本发明第二方面的一些实施例中，还包括透析所述的混合液，以纯化其中乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的步骤。
在本发明第二方面的一些实施例中，包括低温保存乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的步骤。
在本发明第二方面的一些实施例中，用透析袋透析所述的混合液。
在本发明第二方面的一些实施例中，制备过程在冰水浴的环境下进行。
在本发明第二方面的一些实施例中，原料中包含8～20重量份的乙醇氧化酶、12～24重量份的壳聚糖、16～32重量份的聚谷氨酸。
在本发明第二方面的一些实施例中，原料中还包含8～16重量份的三聚磷酸钠。
在本发明第二方面的一些实施例中，原料中还包含2.75～5.5重量份的戊二醛。
在本发明第二方面的一些实施例中，原料中还包含3.25～6.5重量份的十二烷基硫酸钠。
本发明的第三方面涉及以上任一述乙醇氧化酶稳定化纳米粒子或制备方法在制造药物中的应用，所述的药物用于解酒。
本发明的第四方面一种解酒药，含有以上任一所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子。
本申请的乙醇氧化酶能够在体内的肠道位置稳定、持续地发挥对乙醇的氧化作用。
附图说明
图1a显示25℃下，PB缓冲溶液中(10mM，pH＝7.4)，乙醇氧化酶的粒径大小；图1b显示25℃下，PB缓冲溶液中(10mM，pH＝7.4)，乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①的粒径大小；图1c显示25℃下，PB缓冲溶液中(10mM，pH＝7.4)，乙醇氧化酶稳定化纳米粒子②的粒径大小；图1d显示25℃下，PB缓冲溶液中(10mM，pH＝7.4)，乙醇氧化酶稳定化纳米粒子③的粒径大小。
图2显示25℃下，PB缓冲溶液中(10mM，pH＝7.4)，乙醇氧化酶、乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①、乙醇氧化酶稳定化纳米粒子②及乙醇氧化酶稳定化纳米粒子③的表面电荷。
图3显示壳聚糖与乙醇氧化酶之间的荧光能量共振转移实验图。
图4显示25℃下，水溶液中，乙醇氧化酶、乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①及室温下放置24小时后乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①的相对酶活性。
图5a显示乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①、乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①经人工胃液处理20分钟及乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①经人工胰液处理20分钟后的圆二色谱图；图5b显示乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①经人工胰液处理20分钟后的相对酶活性。
图6显示CCK-8法测定乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的细胞毒性实验中，不同浓度乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①、乙醇氧化酶稳定化纳米粒子②及乙醇氧化酶稳定化纳米粒子③对于3T3细胞存活率影响的图。
图7显示给小鼠灌胃Cy5标记的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①，1小时、2小时及12小时的离体组织成像图。
图8显示给小鼠分别灌胃乙醇氧化酶、乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①3次后，不同组小鼠主要器官的H&E染色的显微镜照片。
图9显示给小鼠灌胃磷酸盐缓冲液和乙醇、酒大奇迹(市售产品)和乙醇、乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①和乙醇，不同组小鼠的清醒时间。
图10显示给小鼠灌胃磷酸盐缓冲液和乙醇、乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①和乙醇、乙醇氧化酶稳定化纳米粒子②和乙醇、乙醇氧化酶稳定化纳米粒子③和乙醇、乐宁(市售产品)和乙醇、肯迪醒(市售产品)和乙醇、姜小黄(市售产品)和乙醇、玖侣(市售产品)和乙醇，不同组小鼠的清醒时间。
图11显示给小鼠灌胃磷酸盐缓冲液和乙醇、乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①和乙醇、乙醇氧化酶稳定化纳米粒子②和乙醇、乙醇氧化酶稳定化纳米粒子③和乙醇、酒胆(市售产品)和乙醇、清凉饮料水(市售产品)和乙醇、Are you OK(市售产品)和乙醇、享苷欣复合饮(市售产品)和乙醇，一骑当先(市售产品)和乙醇，不同组小鼠的清醒时间。
具体实施方式
有鉴于乙醇氧化酶在体内应用受限于其本身结构易受到胃液、胰液影响的问题，提供一种乙醇氧化酶稳定化纳米粒子，乙醇氧化酶负载于壳体中，所述的壳体包含第一链段和第二链段的交联结构：
所述的第一链段的原料为壳聚糖及其衍生物中的一种或多种，
所述的第二链段的原料为聚谷氨酸及其衍生物中的一种或多种。
壳聚糖又称脱乙酰甲壳素，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-β-D葡聚糖，其分子结构中同时含有大量的羟基和氨基，可以进行酯化、醚化、羧基化、烷基化、季铵化等各种反应，形成壳聚糖衍生物，部分壳聚糖衍生物还能够提升自身亲水性、溶解性、生物相容性等性能。如羧甲基壳聚糖是壳聚糖羧甲基化形成的衍生物，其具有良好的水溶性、低毒性、良好的生物相容性，并能够维持壳聚糖原本的成膜球性。在一些实施例中，选用的聚糖及其衍生物的分子量为200000～1000000。
聚谷氨酸是谷氨酸的均聚物，可以通过微生物发酵生产，是一种天然的阴离子聚酰胺化合物，其通过谷氨酸的一个氨基和羧基之间的酰胺键连接形成，并且分子链上含有大量的羧基，具有较好的亲水性能。其不具有累积性、毒性和副作用，并且具有良好的生物相容性、生物降解性，无毒、无污染，是一种理想的生物材料。同样的，聚谷氨酸也可以经过已知的改性方式，提升自身性能。在一些实施例中，选用的聚谷氨酸及其衍生物的分子量为700000～1000000。
在上述乙醇氧化酶稳定化粒子中，第一链段的原料为壳聚糖及其衍生物中的一种或多种，主要是指可以通过壳聚糖、壳聚糖衍生物作为交联反应的原料形成上述交联结构中的第一链段；同样的，第二链段的原料为聚谷氨酸及其衍生物中的一种或多种，主要是指聚谷氨酸及其衍生物作为交联反应的原料形成上述交联结构中的第二链段。
经过实验证明，上述乙醇氧化酶稳定化纳米粒子于体外的活性相较于未进行包覆的乙醇氧化酶虽然降低了约10％左右(实施例7)，但是，前者在体内的活性则大大提升，在醉酒小鼠酒醒时间的实验中，灌注乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的小鼠的酒醒时间从8小时缩短至了3.4小时，缩短了一半以上的时间(实施例12)。申请者认为，这是由于壳体中的交联结构为乙醇氧化酶提供了良好的稳定性，能够防止胃液、胰液破坏其自身的二级结构(实施例8)，从而使得乙醇氧化酶稳定化纳米粒子能够最终达到并富集于肠道处，并持续一定的时间(实施例10在12小时左右)，对肠道中的乙醇实现持续的氧化。而在体外活性的降低则实际提高了乙醇氧化酶的体外稳定性，从而降低了保存的难度。除此以外，本申请的乙醇氧化酶具有优异的生物相容性(实施例9)，不会对于组织器官造成损伤(实施例11)。
在上述乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的壳体中，优选含有十二烷基硫酸钠。十二烷基硫酸钠可以在乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的制备过程中添加。申请人发现，十二烷基硫酸钠使得纳米粒子在酸性环境中具有更好的稳定性，其能够降低酸竞争结合乙醇氧化酶，提高乙醇氧化酶的稳定性，在对醉酒小鼠清醒时间的实验中(实施例13和实施例14)，粒子①至③均相比于其他市售解酒药物具有明显更短的清醒时间基础上，进一步对比粒子①至③可以发现，灌注含有十二烷基硫酸钠的粒子①和②显然具有更佳的作用，这也印证了十二烷基硫酸钠在降低酸竞争结合酶上的作用。
在上述交联结构中，还可以具有第三链段，第三链段的原料为交联剂，其可以在制备过程中添加，进一步的，添加的时机优选为在添加完第一链段原料和第二链段原料后添加。所述的第三链段交联于第一链段与第二链段之间。增加交联剂可以帮助第一链段与第二链段的进行交联，从而提高纳米粒子的稳定程度，其中一种可以实现第一链段和第二链段交联的交联剂选用戊二醛。
本申请还提供了乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的制备方法，将乙醇氧化酶水溶液与三聚磷酸钠水溶液、第二链段原料的水溶液初步反应后，加入第一链段原料的醋酸溶液继续反应形成含有乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的混合液，所述的第一链段原料为壳聚糖及其衍生物中的一种或多种，所述的第二链段原料为聚谷氨酸及其衍生物中的一种或多种。
在上述制备过程中，可通过调整壳聚糖及其衍生物的醋酸溶液、或聚谷氨酸及其衍生物的水溶液的浓度来调整所需要制备乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的粒径范围，两者即可以单独调节，也可以配合调节，一般认为，壳聚糖及其衍生物的醋酸溶液的浓度对于粒径调节的作用更大。在一些具体的实例中，所述的第一链段原料的醋酸溶液的浓度为0.5～1.5mg/ml；所述的第二链段原料的水溶液的浓度为1～5mg/ml；所述的乙醇氧化酶水溶液的浓度为0.5～1.5mg/ml。
添加交联剂能够帮助壳聚糖及其衍生物以及聚谷氨酸及其衍生物实现更好的交联，从而提高乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的稳定性。其中一种可以采用的交联剂为戊二醛，戊二醛能够与壳聚糖以及聚谷氨酸发生交联形成网状结构。在反应的过程中，两个壳聚糖分子链也可以通过戊二醛发生交联。在一些实施例中，戊二醛的浓度可以选择1～5mg/ml。
三聚磷酸钠和阴离子表面活性剂则帮助壳聚糖在溶液中析出形成微滴，所添加的三聚磷酸钠能够帮助壳聚糖进一步的析出，所添加的阴离子表面活性剂则能够辅助调节微滴的大小。一般的，阴离子表面活性剂可以自行选择。在此基础上，更进一步的，申请人发现，当阴离子表面活性剂选用十二烷基硫酸钠时，十二烷基硫酸钠还具有帮助壳聚糖结合，形成更加稳定核壳结构的作用。十二烷基硫酸钠会存在于纳米粒子的壳体之中，使得纳米粒子在酸性环境中具有更好的稳定性，其能够降低酸竞争结合乙醇氧化酶，提高乙醇氧化酶的稳定性，在对醉酒小鼠清醒时间的实验中(实施例13和实施例14)，粒子①至③均相比于其他市售解酒药物具有明显更短的清醒时间基础上，进一步对比粒子①至③可以发现，灌注含有十二烷基硫酸钠的粒子①和②显然具有更佳的作用，这也印证了十二烷基硫酸钠在降低酸竞争结合酶上的作用。在一些具体的实施例中，三聚磷酸钠水溶液的可选浓度为1～5mg/ml，十二烷基硫酸钠溶液的可选浓度为1～5mg/ml。
在一些制备的实施例中，所采用的原料中优选包含8～20重量份的乙醇氧化酶、12～24重量份的壳聚糖、16～32重量份的聚谷氨酸。除此以外，还可选的包含8～16重量份的三聚磷酸钠、2.75～5.5重量份的戊二醛、3.25～6.5重量份的十二烷基硫酸钠等。
最后，通过上述步骤制得含有乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的混合液经过透析纯化后，即可得到乙醇氧化酶稳定化纳米粒子。作为参考，所得到的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子可在低温(0～4℃)下进行保存。
经过试验证明，上述乙醇氧化酶稳定化纳米粒子以及通过上述制备方法制备得到的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子均可以在肠道中能够稳定存在，并发挥自身的活性进行解酒，因此，可被用于制造解酒药物。
为了更好的介绍本申请中乙醇氧化酶的技术效果，通过下述的各个具体实施例对于本申请作示例性的举例。
实施例1：乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①的制备
(1)配置母液：称取乙醇氧化酶1mg，用1mL蒸馏水溶解，得到1mg/mL的乙醇氧化酶溶液；分别称取1mg三聚磷酸钠、1mg聚谷氨酸(分子量为700000)、1mg十二烷基硫酸钠和3mg戊二醛，并分别加入1mL蒸馏水溶解，得到1mg/mL的三聚磷酸钠溶液、1mg/mL的聚谷氨酸溶液、1mg/mL十二烷基硫酸钠溶液及3mg/mL的戊二醛溶液；称取37.5mg分子量为1000000的壳聚糖于圆底烧瓶中，加入25mL 1％的醋酸溶液，搅拌至壳聚糖完全溶解，得到1.5mg/mL的壳聚糖溶液，并利用磷酸盐缓冲液调节壳聚糖溶液pH值为6.5；
(2)制备乙醇氧化酶稳定化纳米粒子：取500μL乙醇氧化酶溶液，加入500μL三聚磷酸钠溶液(1mg/mL)，冰水浴中搅拌30分钟；之后加入1mL聚谷氨酸溶液(1mg/mL)，冰水浴中继续搅拌1小时；随后加入500μL壳聚糖溶液(1.5mg/mL，pH 6.5)，冰水浴中搅拌2小时；紧接着加入200μL十二烷基硫酸钠溶液(1mg/mL)，冰水浴搅拌30分钟，最后加入50μL戊二醛(3mg/mL)，冰水浴搅拌30分钟，得到乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①；
(3)纯化乙醇氧化酶稳定化纳米粒子：将得到的酶稳定化溶液用截留分子量为10000Da的透析袋透析24小时，得到纯化后的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①，放置于4℃冰箱保存待用。
实施例2：乙醇氧化酶稳定化纳米粒子②的制备
(1)配置母液：称取乙醇氧化酶1mg，用1mL蒸馏水溶解，得到1mg/mL的乙醇氧化酶溶液；分别称取1mg三聚磷酸钠、1mg聚谷氨酸(分子量为700000)和1mg十二烷基硫酸钠，并分别加入1mL蒸馏水溶解，得到1mg/mL的三聚磷酸钠溶液、1mg/mL的聚谷氨酸溶液及1mg/mL十二烷基硫酸钠溶液；称取37.5mg分子量为1000000的壳聚糖于圆底烧瓶中，加入25mL1％的醋酸溶液，搅拌至壳聚糖完全溶解，得到1.5mg/mL的壳聚糖溶液，并利用磷酸盐缓冲液调节壳聚糖溶液pH值为6.5；
(2)制备乙醇氧化酶稳定化纳米粒子：取500μL乙醇氧化酶溶液，加入500μL三聚磷酸钠溶液(1mg/mL)，冰水浴中搅拌30分钟；之后加入1mL聚谷氨酸溶液(1mg/mL)，冰水浴中继续搅拌1小时；随后加入500μL壳聚糖溶液(1.5mg/mL，pH 6.5)，冰水浴中搅拌2小时；紧接着加入200μL十二烷基硫酸钠溶液(1mg/mL)，冰水浴搅拌30分钟，得到乙醇氧化酶稳定化纳米粒子②；
(3)纯化乙醇氧化酶稳定化纳米粒子：将得到的酶稳定化溶液用截留分子量为10000Da的透析袋透析24小时，得到纯化后的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子②，放置于4℃冰箱保存待用。
实施例3：乙醇氧化酶稳定化纳米粒子③的制备
(1)配置母液：称取乙醇氧化酶1mg，用1mL蒸馏水溶解，得到1mg/mL的乙醇氧化酶溶液；分别称取1mg三聚磷酸钠、1mg聚谷氨酸(分子量为700000)和3mg戊二醛，并分别加入1mL蒸馏水溶解，得到1mg/mL的三聚磷酸钠溶液、1mg/mL的聚谷氨酸溶液及3mg/mL的戊二醛溶液；称取37.5mg分子量为1000000的壳聚糖于圆底烧瓶中，加入25mL 1％的醋酸溶液，搅拌至壳聚糖完全溶解，得到1.5mg/mL的壳聚糖溶液，并利用磷酸盐缓冲液调节壳聚糖溶液pH值为6.5；
(2)制备乙醇氧化酶稳定化纳米粒子：取500μL乙醇氧化酶溶液，加入500μL三聚磷酸钠溶液(1mg/mL)，冰水浴中搅拌30分钟；之后加入1mL聚谷氨酸溶液(1mg/mL)，冰水浴中继续搅拌1小时；随后加入500μL壳聚糖溶液(1.5mg/mL，pH 6.5)，冰水浴中搅拌2小时；最后加入50μL戊二醛(3mg/mL)，冰水浴搅拌30分钟，得到乙醇氧化酶稳定化纳米粒子③；
(3)纯化乙醇氧化酶稳定化纳米粒子：将得到的酶稳定化溶液用截留分子量为10000Da的透析袋透析24小时，得到纯化后的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子③，放置于4℃冰箱保存待用。
实施例4：乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的粒径表征
测试工具：美国布鲁克海文BI-200SM广角激光散射仪，广角激光散射微量池。
实验步骤：将乙醇氧化酶和制备的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①、乙醇氧化酶稳定化纳米粒子②和乙醇氧化酶稳定化纳米粒子③通过针式注射器及亲水性滤膜(Millipore，0.45μm)依靠重力缓慢过滤至广角激光散射微量池中，在广角激光散射仪中测定上述样品纳米粒子的粒径分布。
测试结果如图1a、图1b、图1c、图1d所示，乙醇氧化酶在稳定化之前的粒径为11.4nm，酶稳定化后乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①、乙醇氧化酶稳定化纳米粒子②和乙醇氧化酶稳定化纳米粒子③粒径分别为278.5nm、299.1nm及314.4nm，相较于乙醇氧化酶，酶稳定化纳米粒径的增加表明大分子聚合物成功将乙醇氧化酶包裹。
实施例5：乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的电位表征
测试工具：美国布鲁克海文ZETAPALS，ZETA电位样品池。
实验步骤：将乙醇氧化酶和制备的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①、乙醇氧化酶稳定化纳米粒子②和乙醇氧化酶稳定化纳米粒子③通过针式注射器及亲水性滤膜(Millipore，0.45μm)依靠重力缓慢过滤至ZETA电位池中，在ZETAPALS仪器上(检测角度设定为90°，检测温度设定为37℃)测定上述样品纳米粒子的电位。所得数据通过仪器自带软件算法进行处理后直接记录，上述样品纳米粒子的电位均进行三次平行实验取平均值。
测试结果如图2所示，乙醇氧化酶在稳定化之前的电位为-10.63±1.33mV，酶稳定化处理后稳定化纳米粒子①、乙醇氧化酶稳定化纳米粒子②和乙醇氧化酶稳定化纳米粒子③电位分别为1.7±0.37mV、1.5±0.43mV、2.6±0.31mV，相较于乙醇氧化酶，乙醇氧化酶稳定化纳米粒子电位明显增加，这同样表明大分子聚合物成功将乙醇氧化酶包裹。
实施例6：荧光共振能量转移实验
为了验证壳聚糖对乙醇氧化酶的成功包裹，我们用荧光共振能量转移实验对此进行探究。
测试方法：荧光分光光谱法。
测试工具：荧光分光光度计型号为Varian Cary Eclipse，配有型号为CarySingle-cuvette Peltier的比色皿控温装置。测试选用石英比色皿为样品池，测试光路10mm。
试剂及来源：Cy3-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Cy3-NHS)/Cy5-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Cy5-NHS)购置于北京欧凯纳斯科技有限公司。
实验步骤：(1)预先将Cy5-NHS以及Cy3-NHS溶解在无水DMSO中，得到5mg/mL的储存溶液。将1.5mg/mL的壳聚糖和1mg/mL的乙醇氧化酶分别在冷水中预冷，分别滴加Cy5-NHS和Cy3-NHS(原料与荧光探针的摩尔比例为1:5)，冰水浴下避光搅拌2小时后，透析除去未反应的荧光小分子，得到连接Cy5的壳聚糖和连接Cy3的乙醇氧化酶；(2)制备乙醇氧化酶稳定化纳米粒子：取500μL连接Cy3的乙醇氧化酶溶液，加入500μL三聚磷酸钠溶液(1mg/mL)，冰水浴中搅拌30分钟；之后加入1mL聚谷氨酸溶液(1mg/mL)，冰水浴中继续搅拌1小时；随后加入500μL连接Cy5的壳聚糖溶液(1.5mg/mL，pH 6.5),冰水浴中搅拌2小时；紧接着加入200μL十二烷基硫酸钠溶液(1mg/mL)，冰水浴搅拌30分钟，最后加入50μL戊二醛，冰水浴搅拌30分钟，得到修饰荧光分子的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子；(3)在荧光分光光度计上测定515nm激发波长下530nm-750nm区间连接Cy3的乙醇氧化酶和修饰荧光分子的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的荧光强度。测试结果如图3所示，经过Cy3激发波长(515nm)的激光激发后，相较于乙醇氧化酶，乙醇氧化酶稳定化纳米粒子溶液中可以观察到明显的荧光共振能量转移现象，Cy5的发射峰(670nm处)有明显上升，表明了含有壳聚糖的壳体成功包裹在乙醇氧化酶表面形成了乙醇氧化酶稳定化纳米粒子。
实施例7：测定酶稳定化后乙醇氧化酶活性
为了探究基于原位包裹法将乙醇氧化酶稳定化后酶活性变化，以及在室温下的稳定性，我们利用乙醇氧化酶氧化乙醇产生过氧化氢，过氧化氢同辣根过氧化物酶、3,3’,5,5-四甲基联苯胺反应显色，来测定乙醇氧化酶和酶稳定化后酶活性，以及乙醇氧化酶稳定化纳米粒子在室温下放置12小时后酶活性。
测试方法：紫外-可见分光光谱法。
测试工具：美国赛默飞世尔NanoDrop One/One C微量紫外可见分光光度计。
试剂及来源：无水乙醇购置于天津渤化化学试剂有限公司、辣根过氧化物酶购置于上海源叶生物科技有限公司、3,3’,5-四甲基联苯胺盐酸盐购置于碧云天生物技术有限公司。
实验步骤：(1)用超纯水配置1mg/mL的3,3’,5,5-四甲基联苯胺盐酸盐溶液、1mg/mL的辣根过氧化物酶溶液及10mg/mL的乙醇水溶液。利用上述溶液配置显色溶液，其中3,3’,5,5-四甲基联苯胺、辣根过氧化物酶及乙醇的终浓度分别为0.02mg/mL，0.5mM，1mg/mL；(2)取150μL显色溶液，分别加入50μL乙醇氧化酶、乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①及室温下放置12h的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①，室温孵育15分钟后，在微量紫外可见分光光度计上620nm处检测吸光值的变化。
测试结果如图4所示，基于原位包裹法利用大分子聚合物稳定化乙醇氧化酶所得到的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①的酶活性为乙醇氧化酶活性的89.28％，室温放置12h的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①的酶活性为乙醇氧化酶活性的78.57％，相较于乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①酶活性下降了10.71％。
实施例8：测试乙醇氧化酶稳定化纳米粒子在人工胃液及人工胰液中的稳定性
胃液、胰液中的胃蛋白酶与胰蛋白酶等消化酶以及胃酸会破坏酶的二级结构，影响酶活性，限制酶在体内的应用。为了测试乙醇氧化酶稳定化纳米粒子在人工胃液及人工胰液中的稳定性，我们利用圆二色谱检测了人工胃液及人工胰液处理后的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的二级结构；同时我们利用乙醇氧化酶氧化乙醇产生过氧化氢，过氧化氢同辣根过氧化物酶、3,3’,5,5-四甲基联苯胺反应显色，来测定并比较乙醇氧化酶稳定化纳米粒子及人工胰液中乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的活性。
测试方法：紫外-可见分光光谱法、圆二色谱法。
测试工具：美国赛默飞世尔NanoDrop One/One C微量紫外可见分光光度计、日本分光J-715圆二色谱仪。
试剂及来源：无水乙醇购置于天津渤化化学试剂有限公司、辣根过氧化物酶购置于上海源叶生物科技有限公司、3,3’,5-四甲基联苯胺盐酸盐购置于碧云天生物技术有限公司、胃蛋白酶购置于上海麦克林生化科技有限公司、胰蛋白酶购置与上海麦克林生化科技有限公司。
实验步骤：(1)配置人工胃液：称取2.0g NaCl、3.2g胃蛋白酶于烧杯中，加入7mL浓盐酸和适量蒸馏水完全溶解，并定容至1000mL，通过针式注射器及亲水性滤膜(Millipore，0.22μm)过滤除菌；(2)配置人工胰液：称取6.8g磷酸二氢钾粉末溶于适量蒸馏水中，加入190mL 0.2mol/L氢氧化钠、400mL蒸馏水及10g胰蛋白酶，并用0.2mol/L氢氧化钠调节pH值至7.5，最后用蒸馏水定容至1000mL；(3)将人工胃液和人工胰液分别稀释至200μg/mL和20μg/mL，取100μL乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①溶液，以体积比1：10分别与人工胃液和人工胰液混合20分钟后，用磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)透析30分钟，并用尺寸排除柱(Sepharose6B)除去胃蛋白酶和胰蛋白酶；(4)用圆二色谱仪测试乙醇氧化酶及利用人工胃液和人工胰液处理的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的蛋白二级结构；(5)将人工胰液稀释至20μg/mL，取100μL乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①溶液，以体积比1：10与人工胰液混合20分钟，随后用磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)透析30分钟，并用尺寸排除柱(Sepharose 6B)除去胰蛋白酶；(6)用超纯水配置1mg/mL的3,3’,5,5-四甲基联苯胺盐酸盐溶液、1mg/mL的辣根过氧化物酶溶液及10mg/mL的乙醇水溶液。利用上述溶液配置显色溶液，其中3,3’,5,5-四甲基联苯胺、辣根过氧化物酶及乙醇的终浓度分别为0.02mg/mL，0.5mM，1mg/mL；(7)取150μL显色溶液，分别加入50μL乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①及胰蛋白酶处理的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①，室温孵育15分钟后，在微量紫外可见分光光度计上620nm处检测吸光值的变化。
测试结果如图5a所示，经过人工胃液和人工胰液处理20分钟后，乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①中乙醇氧化酶的蛋白质二级结构无显著变化，表明乙醇氧化酶经过酶稳定化处理后在人工胃液和人工胰液中结构稳定性较高；如图5b所示，经过人工胰液处理20分钟后的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①酶活性为处理前的79.31％。
实施例9：检测乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的细胞毒性
为了探究基于原位包裹法利用大分子聚合物将乙醇氧化酶稳定化后的生物相容性，我们采用CCK-8细胞毒性实验评估了乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①的生物相容性。
测试方法：细胞毒性CCK-8法。
测试工具：瑞士Tecan公司Spark多功能酶标仪。
试剂及其来源：鼠源3T3小鼠胚胎成纤维细胞购置于天津益博恒泰生物科技有限公司、胎牛血清和DMEM培养基购置与美国Thermo Fisher Scientific公司、CCK-8试剂盒购置于日本同仁公司、青霉素链霉素购置于天津百赛斯生物科技有限公司。
实验步骤：(1)培养基使用DMEM，加入10％胎牛血清与1％青霉素链霉素，将3T3小鼠胚胎成纤维细胞置于37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育，在实验前将细胞预培养至达到细胞汇合；收集3T3细胞，调整细胞悬液浓度，加入96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液，使待测细胞密度至10000每孔，边缘孔用无菌PBS填充；(2)铺上细胞的96孔板置于5％CO2，37℃细胞培养箱中孵育24小时，确认细胞贴壁；随后加入含有0、5、10、20、50、100μg/mL的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①、酶稳定化纳米粒子②及酶稳定化纳米粒子③的新鲜培养基200μL，在细胞培养箱中继续培养24小时及48小时；(3)小心吸去孔内培养基，并利用灭菌磷酸盐缓冲液漂洗3遍，每孔加入100μL新鲜配置的CCK-8工作液(1/10，v/v)，继续培养1.5小时；(4)终止培养，在多功能酶标仪上检测OD450 nm处各孔的吸光值，并通过下面公式计算细胞存活率：细胞存活率＝OD450(样品)/OD450(对照)×100％。
测试结果如图6a、图6b及图6c所示，与对照组相比，乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①组、酶稳定化纳米粒子②组及酶稳定化纳米粒子③组的细胞存活率均为90％以上，表明乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①、酶稳定化纳米粒子②及酶稳定化纳米粒子③对小鼠胚胎成纤维细胞没有明显的毒性作用，有着较好的生物相容性。
实施例10：探究乙醇氧化酶稳定化纳米粒子在体内分布
为了探究乙醇氧化酶稳定化纳米粒子通过口服方式在小鼠体内的分布情况及肠道富集能力，我们通过活体成像仪检测灌胃给药后乙醇氧化酶稳定化纳米粒子在小鼠体内的分布。
实验步骤：(1)制备乙醇氧化酶稳定化纳米粒子：取500μL连接Cy5的乙醇氧化酶溶液，加入500μL三聚磷酸钠溶液(1mg/mL)，冰水浴中搅拌30分钟；之后加入1mL聚谷氨酸溶液(1mg/mL)，冰水浴中继续搅拌1小时；随后加入500μL壳聚糖溶液(1.5mg/mL，pH6.5),冰水浴中搅拌2小时；紧接着加入200μL十二烷基硫酸钠溶液(1mg/mL)，冰水浴搅拌30分钟，最后加入50μL戊二醛(3mg/mL)，冰水浴搅拌30分钟，得到Cy5标记的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①；
(2)选取C57BL/6N(8周，雄性)小鼠并随机分成两组，通过灌胃的方式分别给药400μLCy5标记的乙醇氧化酶、Cy5标记的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①溶液；在灌胃Cy5标记的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①溶液1小时、2小时、12小时后对小鼠进行安乐死，收集主要器官和肠道进行离体荧光成像。
测试结果如图7所示，乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①在肠道处信号明显，表明乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①在肠道处有很好的富集能力，在肝脏或肾脏处没有乙醇氧化酶稳定化纳米粒子富集，同时乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①能够在肠道处停留12小时，而在12小时乙醇氧化酶在肠道处没有富集，说明乙醇氧化酶稳定化纳米粒子提高了乙醇氧化酶在肠道处的停留能力。
实施例11：检测乙醇氧化酶稳定化纳米粒子在小鼠体内毒性
为了评估乙醇氧化酶稳定化后在小鼠体内的安全性和潜在的毒性，我们通过检测给小鼠灌胃后的血常规、血生化指标并收集主要器官进行组织病理学分析来评估乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的体内毒性。
实验步骤：(1)从北京维通利华公司购置9只8周龄雄性C57BL/6N小鼠，并随机分成三组(每组3只)，并通过灌胃方式注入乙醇氧化酶及乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①，灌胃频率为每三天一次共三次；(2)在第三次结束后处死所有小鼠，收集小鼠血液并检测血液样品中白细胞数目、淋巴细胞数目、中性粒细胞数目、红细胞数目、血红蛋白浓度、平均血红蛋白、平均血红蛋白浓度、血小板数目、谷草转氨酶、肌酐、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶和血尿素氮等指标；并收集包括心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和肠在内的主要器官，并用苏木精-曙红进行染色并对其进行组织病理学分析。
测试结果如表1，给小鼠灌胃乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①后血常规各项指标均处于正常范围，且与对照组相比，没有明显差异，表明酶稳定化处理后不会造成毒性损伤；如图8所示，给小鼠灌胃乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①后在心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏及肠道处未观察到明显细胞凋亡及组织损伤，与对照组相比，乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①灌胃后的小鼠器官组织及细胞形态没有明显差异，表明基于原位包裹法酶稳定化处理后在小鼠体内毒性低，可以通过口服给药且具有一定安全性，同时不会对正常组织器官造成损伤。
表1小鼠灌胃乙醇氧化酶、乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①后血常规、血生化各项指标
Figure BDA0004013239000000141
实施例12：比较乙醇氧化酶稳定化纳米粒子与解酒产品解酒功能
为了比较乙醇氧化酶稳定化纳米粒子与市售解酒产品的解酒能力，我们通过给小鼠灌胃乙醇氧化酶稳定化纳米粒子及市售解酒产品后喂食乙醇，观察小鼠的行为状态并记录小鼠的清醒时间，来评估比较乙醇氧化酶稳定化纳米粒子与解酒产品的解酒能力。
实验步骤：(1)从北京维通利华公司购置20只8周龄雄性C57BL/6N小鼠，并随机分成四组(每组5只)，并在实验前禁食12小时；(2)实验开始前半小时前让小鼠自主进食，并在半小时后给四组小鼠分别灌胃磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、酒大奇迹(市售产品)及乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①；(3)灌胃半小时后，给四组小鼠再分别灌胃磷酸盐缓冲液、乙醇、乙醇、乙醇，灌胃乙醇量为小鼠每克体重6毫克乙醇；观察并记录各组小鼠清醒时间。
测试结果如图9所示，灌胃磷酸盐缓冲液和乙醇组小鼠的平均清醒时间为8.5小时，灌胃酒大奇迹(市售产品)和乙醇组小鼠的平均清醒时间为6.8小时，而灌胃乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①和乙醇组小鼠的平均清醒时间为3.4小时；表明乙醇氧化酶稳定化后能够有效缓解小鼠醉酒状态，较酒大奇迹具有更加高效的解酒效果。
实施例13：比较乙醇氧化酶稳定化纳米粒子与解酒产品解酒功能
为了比较乙醇氧化酶稳定化纳米粒子与市售解酒产品的解酒能力，我们通过给小鼠灌胃乙醇氧化酶稳定化纳米粒子及市售解酒产品后喂食乙醇，观察小鼠的行为状态并记录小鼠的清醒时间，来评估比较乙醇氧化酶稳定化纳米粒子与解酒产品的解酒能力。
实验步骤：(1)从北京维通利华公司购置54只8周龄雌性C57BL/6N小鼠，并随机分成9组(每组6只)，并在实验前禁食12小时；(2)实验开始前半小时前让小鼠自主进食，并在半小时后给9组小鼠分别灌胃磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①、乙醇氧化酶稳定化纳米粒子②、乙醇氧化酶稳定化纳米粒子③、乐宁(市售产品)、肯迪醒(市售产品)、姜小黄(市售产品)及玖侣(市售产品)；(3)灌胃半小时后，给9组小鼠再分别灌胃磷酸盐缓冲液、乙醇、乙醇、乙醇、乙醇、乙醇、乙醇、乙醇、乙醇，灌胃乙醇量为小鼠每克体重5毫克乙醇；观察并记录各组小鼠清醒时间。
测试结果如图10所示，灌胃磷酸盐缓冲液和乙醇组小鼠的平均清醒时间为8.5小时，灌胃乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①和乙醇组、乙醇氧化酶稳定化纳米粒子②和乙醇组及乙醇氧化酶稳定化纳米粒子③和乙醇组小鼠的平均清醒时间分别为2.4小时、2.75小时和3.5小时，灌胃乐宁(市售产品)和乙醇组、肯迪醒(市售产品)和乙醇组、姜小黄(市售产品)和乙醇组及玖侣(市售产品)和乙醇组小鼠的平均清醒时间分别为4.5小时、3.2小时、3.8小时和3小时。表明乙醇氧化酶稳定化后能够有效缓解小鼠醉酒状态，较市售产品具有更好的解酒效果；结果同时表明乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①和乙醇氧化酶稳定化纳米粒子②的酶稳定化处理较乙醇氧化酶稳定化纳米粒子③效果较好，具有更加高效的解酒效果。
实施例14：比较乙醇氧化酶稳定化纳米粒子与解酒产品解酒功能
为了比较乙醇氧化酶稳定化纳米粒子与市售解酒产品的解酒能力，我们通过给小鼠灌胃乙醇氧化酶稳定化纳米粒子及市售解酒产品后喂食乙醇，观察小鼠的行为状态并记录小鼠的清醒时间，来评估比较乙醇氧化酶稳定化纳米粒子与解酒产品的解酒能力。
实验步骤：(1)从北京维通利华公司购置60只8周龄雌性C57BL/6N小鼠，并随机分成10组(每组6只)，并在实验前禁食12小时；(2)实验开始前半小时前让小鼠自主进食，并在半小时后给9组小鼠分别灌胃磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①、乙醇氧化酶稳定化纳米粒子②、乙醇氧化酶稳定化纳米粒子③、酒胆(市售产品)、清凉饮料水(市售产品)、Are you OK(市售产品)、享苷欣复合饮(市售产品)及一骑当先(市售产品)；(3)灌胃半小时后，给10组小鼠再分别灌胃磷酸盐缓冲液、乙醇、乙醇、乙醇、乙醇、乙醇、乙醇、乙醇、乙醇、乙醇，灌胃乙醇量为小鼠每克体重5毫克乙醇；观察并记录各组小鼠清醒时间。
测试结果如图11所示，灌胃磷酸盐缓冲液和乙醇组小鼠的平均清醒时间为5.3小时，灌胃乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①和乙醇组、乙醇氧化酶稳定化纳米粒子②和乙醇组及乙醇氧化酶稳定化纳米粒子③和乙醇组小鼠的平均清醒时间分别为2.5小时、2.5小时和3.5小时，灌胃酒胆(市售产品)和乙醇组、清凉饮料水(市售产品)和乙醇组、Are you OK(市售产品)和乙醇组、享苷欣复合饮(市售产品)和乙醇组及一骑当先(市售产品)和乙醇组小鼠的平均清醒时间分别为5.8小时、4.5小时、6.1小时、6.5小时和6.7小时。表明乙醇氧化酶稳定化后能够有效缓解小鼠醉酒状态，较市售产品具有更好的解酒效果；结果同时表明乙醇氧化酶稳定化纳米粒子①和乙醇氧化酶稳定化纳米粒子②的酶稳定化处理较乙醇氧化酶稳定化纳米粒子③效果较好，具有更加高效的解酒效果。
本发明中的实施例仅用于对本发明进行说明，并不构成对权利要求范围的限制，本领域内技术人员可以想到的其他实质上等同的替代，均在本发明保护范围内。

Claims (34)

1.乙醇氧化酶稳定化纳米粒子，其特征在于乙醇氧化酶负载于壳体中，所述的壳体包含第一链段和第二链段的交联结构，
所述的第一链段的原料为壳聚糖及其衍生物中的一种或多种，
所述的第二链段的原料为聚谷氨酸及其衍生物中的一种或多种。
2.如权利要求1所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子，其特征在于交联结构中具有第三链段，第三链段的原料为交联剂，所述的第三链段交联于第一链段与第二链段之间。
3.如权利要求2所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子，其特征在于所述的交联剂采用戊二醛。
4.如权利要求1所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子，其特征在于粒径范围在270nm～320nm之间。
5.如权利要求1所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子，其特征在于所述的壳体中还含有十二烷基硫酸钠。
6.如权利要求1所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子，其特征在于所述的壳体中还含有三聚磷酸钠。
7.如权利要求1所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子，其特征在于含有所述第一链段占粒子总重量的12％～24％。所述第二链段占粒子总重量的16％～32％。
8.如权利要求1所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子，其特征在于所述的壳聚糖及其衍生物的分子量为200000～1000000。
9.如权利要求1所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子，其特征在于所述的聚谷氨酸及其衍生物的分子量为700000～1000000。
10.如权利要求1所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子，其特征在于原料中包含8～20重量份的乙醇氧化酶、12～24重量份的壳聚糖、16～32重量份的聚谷氨酸。
11.如权利要求10所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子，其特征在于原料中还包含8～16重量份的三聚磷酸钠。
12.如权利要求10所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子，其特征在于原料中还包含2.75～5.5重量份的戊二醛。
13.如权利要求10所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子，其特征在于原料中还包含3.25～6.5重量份的十二烷基硫酸钠。
14.乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的制备方法，其特征在于将乙醇氧化酶水溶液与三聚磷酸钠水溶液、第二链段原料的水溶液初步反应后，加入第一链段原料的醋酸溶液继续反应形成含有乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的混合液，
所述的第一链段原料为壳聚糖及其衍生物中的一种或多种，
所述的第二链段原料为聚谷氨酸及其衍生物中的一种或多种。
15.如权利要求14所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的制备方法，其特征在于所述的壳聚糖及其衍生物的分子量为200000～1000000。
16.如权利要求14所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的制备方法，其特征在于所述的聚谷氨酸及其衍生物的分子量为700000～1000000。
17.如权利要求14所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的制备方法，其特征在于所述的第一链段原料的醋酸溶液的浓度为0.5～1.5mg/ml。
18.如权利要求14所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的制备方法，其特征在于所述的第二链段原料的水溶液的浓度为1～5mg/ml。
19.如权利要求14所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的制备方法，其特征在于所述的三聚磷酸钠水溶液的浓度为1～5mg/ml。
20.如权利要求14所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的制备方法，其特征在于所述的乙醇氧化酶水溶液的浓度为0.5～1.5mg/ml。
21.如权利要求14所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的制备方法，其特征在于在所述的混合液中还加入阴离子表面活性剂。
22.如权利要求14所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的制备方法，其特征在于所述的阴离子表面活性剂采用十二烷基硫酸钠。
23.如权利要求14所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的制备方法，其特征在于在所述的混合液中还加入交联剂。
24.如权利要求23所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的制备方法，其特征在于所述的交联剂采用戊二醛。
25.如权利要求14所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的制备方法，其特征在于还包括透析所述的混合液，以纯化其中乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的步骤。
26.如权利要求25所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的制备方法，其特征在于包括低温保存乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的步骤。
27.如权利要求26所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的制备方法，其特征在于用透析袋透析所述的混合液。
28.如权利要求14所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的制备方法，其特征在于制备过程在冰水浴的环境下进行。
29.如权利要求14所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的制备方法，其特征在于原料中包含8～20重量份的乙醇氧化酶、12～24重量份的壳聚糖、16～32重量份的聚谷氨酸。
30.如权利要求14所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的制备方法，其特征在于原料中还包含8～16重量份的三聚磷酸钠。
31.如权利要求14所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的制备方法，其特征在于原料中还包含2.75～5.5重量份的戊二醛。
32.如权利要求14所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子的制备方法，其特征在于原料中还包含3.25～6.5重量份的十二烷基硫酸钠。
33.权利要求1～13任意所述乙醇氧化酶稳定化纳米粒子或权利要求14～32任意所述制备方法在制造药物中的应用，所述的药物用于解酒。
34.一种解酒药，其特征在于含有权利要求1～13任意所述的乙醇氧化酶稳定化纳米粒子。
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