JP3228941B2 - 臨床用のマイクロカプセル封入遺伝子操作微生物 - Google Patents
臨床用のマイクロカプセル封入遺伝子操作微生物Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 （ａ）発明の分野 本発明は、経口投与による臨床用のマイクロカプセル
封入遺伝子操作微生物を使用する新たな概念に関する。
封入遺伝子操作微生物を使用する新たな概念に関する。
（ｂ）先行技術の記述 分子生物学における最近の発達は、種々の遺伝子操作
微生物に多くの特定化された機能を与えてきた。残念な
がら、遺伝子操作微生物を患者の治療に使用することは
困難である。
微生物に多くの特定化された機能を与えてきた。残念な
がら、遺伝子操作微生物を患者の治療に使用することは
困難である。
微生物を人に非経口投与することは、たとえ極少量投
与しても非常にリスクがあり、危険である。
与しても非常にリスクがあり、危険である。
本発明によって、この問題は、遺伝子操作微生物をマ
イクロカプセルに封入し、経口的に投与することで解決
された。マイクロカプセルは、微生物の漏出を防止する
と共に、もし少量の漏出があっても、消化管は、非病原
性微生物を安全に含有できるので安全である。本発明
は、種々の遺伝子操作微生物を使用するためのモデル研
究を記述する。
イクロカプセルに封入し、経口的に投与することで解決
された。マイクロカプセルは、微生物の漏出を防止する
と共に、もし少量の漏出があっても、消化管は、非病原
性微生物を安全に含有できるので安全である。本発明
は、種々の遺伝子操作微生物を使用するためのモデル研
究を記述する。
更に詳細には、本発明は、実施例として、尿素やアン
モニアを除去するための遺伝子操作バクテリアの使用に
ついて示している。尿素及びアンモニアの除去は、腎不
全や肝不全の症例にそれぞれ必要である。尿毒症は、不
十分な腎機能により引き起こされる。腎臓が弱ると、尿
に通常排出される物質は、血液や体組織中に保持され
る。これは、血液中で通常測定可能な代謝物の濃度の増
加を引き起こす。例えば、血液尿素窒素（BUN）レベル
は、15mg％から100〜300mg％まで増加し、血清クレアチ
ニンは、1.0mg％から10〜25mg％まで増加した。同様
に、肝不全におけるアンモニアレベルの上昇は明白であ
る。高濃度のこれらの物質は、毒素又は毒物となり、器
官不全から脳機能障害に至る多くの疾病を引き起こす代
謝経路の妨害を切断する結果となる。オキシスターチ
（oxystarch）及びウレアーゼリン酸ジルコニウムの経
口給餌の使用を含め、いくつかの試みを、不必要な代謝
物を体液区画から除去するために適用したが、成功しな
かった。オキシスターチ及びウレアーゼリン酸ジルコニ
ウムの必要量は、患者の日常的な治療に使用するには多
すぎた。
モニアを除去するための遺伝子操作バクテリアの使用に
ついて示している。尿素及びアンモニアの除去は、腎不
全や肝不全の症例にそれぞれ必要である。尿毒症は、不
十分な腎機能により引き起こされる。腎臓が弱ると、尿
に通常排出される物質は、血液や体組織中に保持され
る。これは、血液中で通常測定可能な代謝物の濃度の増
加を引き起こす。例えば、血液尿素窒素（BUN）レベル
は、15mg％から100〜300mg％まで増加し、血清クレアチ
ニンは、1.0mg％から10〜25mg％まで増加した。同様
に、肝不全におけるアンモニアレベルの上昇は明白であ
る。高濃度のこれらの物質は、毒素又は毒物となり、器
官不全から脳機能障害に至る多くの疾病を引き起こす代
謝経路の妨害を切断する結果となる。オキシスターチ
（oxystarch）及びウレアーゼリン酸ジルコニウムの経
口給餌の使用を含め、いくつかの試みを、不必要な代謝
物を体液区画から除去するために適用したが、成功しな
かった。オキシスターチ及びウレアーゼリン酸ジルコニ
ウムの必要量は、患者の日常的な治療に使用するには多
すぎた。
マイクロカプセルに封入する考えは、生存及び非生存
のカプセルに封入した材料に特定の環境を提供するため
に確立されている（Chang,T.M.S.、Science、146,524〜
525頁、1964年）。以前の研究で、マイクロカプセル封
入遺伝子操作バクテリア大腸菌DH5は、in vitroで尿素
及びアンモニアを人工培地及び血漿から除去する優れた
能力を有していることが示された（Prakash,S.and Chan
g,T.M.S.、Biotechnology and Bioengineering、46、62
1〜626頁、1995年）。
のカプセルに封入した材料に特定の環境を提供するため
に確立されている（Chang,T.M.S.、Science、146,524〜
525頁、1964年）。以前の研究で、マイクロカプセル封
入遺伝子操作バクテリア大腸菌DH5は、in vitroで尿素
及びアンモニアを人工培地及び血漿から除去する優れた
能力を有していることが示された（Prakash,S.and Chan
g,T.M.S.、Biotechnology and Bioengineering、46、62
1〜626頁、1995年）。
驚くべきことに、本発明によって、これらマイクロカ
プセル封入遺伝子操作微生物は、ごく少量を経口で与え
た場合に、腎不全ラット（Prakash,S.、Chang,T.M.S.、
Nature Medicine 2（８）、883〜887頁、1996年）中の
全身の尿素及びアンモニアを効果的に除去できることが
はじめて証明された。この容量は、現在までに利用でき
るいかなる系よりも多かった。
プセル封入遺伝子操作微生物は、ごく少量を経口で与え
た場合に、腎不全ラット（Prakash,S.、Chang,T.M.S.、
Nature Medicine 2（８）、883〜887頁、1996年）中の
全身の尿素及びアンモニアを効果的に除去できることが
はじめて証明された。この容量は、現在までに利用でき
るいかなる系よりも多かった。
発明の概要 本発明の一つの目的は、マイクロカプセル封入遺伝子
操作微生物を経口給餌による種々の疾病の治療に使用す
る可能性を探索することにある。
操作微生物を経口給餌による種々の疾病の治療に使用す
る可能性を探索することにある。
本発明の別の目的は、特に、カプセル封入遺伝子操作
バクテリア細胞の、腎不全、肝不全、その他の疾病の治
療に対する可能性を探索することに向けられ、これは、
例えば、臨床実験において本発明を適用するのに役立つ
だろう。
バクテリア細胞の、腎不全、肝不全、その他の疾病の治
療に対する可能性を探索することに向けられ、これは、
例えば、臨床実験において本発明を適用するのに役立つ
だろう。
初期のin vitroの研究は、アルギン酸塩−ポリリジン
−アルギン酸塩（APA）カプセル封入遺伝子操作大腸菌D
H5細胞は、尿素も（アンモニアを生成せずに）アンモニ
アもともに反応培地及び血漿から除去するのに非常に効
果的であることを示した。しかしながら、当時、この細
胞を患者に非経口的な注射により安全に使用する方法は
なかった（Prakash,S、Chang,T.M.S.、Biotechnology a
nd Bioengineering、46、621〜626頁、1995年）。マイ
クロカプセルの製剤の工程要素及びin vitro実験での速
度論の詳細は、同じ論文に記述されている（Prakash,
S、Chang,T.M.S.、Biotechnology and Bioengineerin、
46、621〜626頁、1995年）。
−アルギン酸塩（APA）カプセル封入遺伝子操作大腸菌D
H5細胞は、尿素も（アンモニアを生成せずに）アンモニ
アもともに反応培地及び血漿から除去するのに非常に効
果的であることを示した。しかしながら、当時、この細
胞を患者に非経口的な注射により安全に使用する方法は
なかった（Prakash,S、Chang,T.M.S.、Biotechnology a
nd Bioengineering、46、621〜626頁、1995年）。マイ
クロカプセルの製剤の工程要素及びin vitro実験での速
度論の詳細は、同じ論文に記述されている（Prakash,
S、Chang,T.M.S.、Biotechnology and Bioengineerin、
46、621〜626頁、1995年）。
本発明によって、疾病により生ずる望ましくない化学
薬品及び／又はアミノ酸の除去のために患者に経口投与
する組成物が提供される。この組成物は、望ましくない
化学薬品及び／又はアミノ酸が除去できるように、患者
に経口投与するための医薬上許容できる担体と結合し
て、担持（entrap）され又はマイクロカプセルに封入さ
れた微生物を含む。
薬品及び／又はアミノ酸の除去のために患者に経口投与
する組成物が提供される。この組成物は、望ましくない
化学薬品及び／又はアミノ酸が除去できるように、患者
に経口投与するための医薬上許容できる担体と結合し
て、担持（entrap）され又はマイクロカプセルに封入さ
れた微生物を含む。
本発明の一の態様によれば、この組成物は、微生物を
保持でき、除去するための望ましくない分子がマイクロ
カプセル内に入ることができるようなマイクロカプセル
材料を使用してマイクロカプセルに封入した微生物を有
する。
保持でき、除去するための望ましくない分子がマイクロ
カプセル内に入ることができるようなマイクロカプセル
材料を使用してマイクロカプセルに封入した微生物を有
する。
本発明に使用されるマイクロカプセル化材料には、制
限がなく、ナイロン、シリコンゴム、ナイロン−ポリエ
チレンイミン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、キトサン
−アルギン酸塩、硫酸セルロース−ポリ（ジメチルジア
リル）−アンモニウムクロライド、ヒドロキシ−エチル
メタクリレートメチルメタクリレート、キトサン−カル
ボキシメチル−セルロース、アルギン酸塩−ポリリジン
−アルギン酸塩を含む。
限がなく、ナイロン、シリコンゴム、ナイロン−ポリエ
チレンイミン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、キトサン
−アルギン酸塩、硫酸セルロース−ポリ（ジメチルジア
リル）−アンモニウムクロライド、ヒドロキシ−エチル
メタクリレートメチルメタクリレート、キトサン−カル
ボキシメチル−セルロース、アルギン酸塩−ポリリジン
−アルギン酸塩を含む。
本発明の他の態様に従うと、この組成物は、微生物を
保持でき、除去するための望ましくない分子が侵入して
微生物と接触することができるような担持材料を使用し
て、担体中に担持された微生物を有する。
保持でき、除去するための望ましくない分子が侵入して
微生物と接触することができるような担持材料を使用し
て、担体中に担持された微生物を有する。
この微生物は、遺伝子操作されており、中でも、大腸
菌DH5細胞のようなものがある。
菌DH5細胞のようなものがある。
望ましくない化学薬品は、尿素及び／又はアンモニ
ア、フェニルアラニン、又はチロシンである。
ア、フェニルアラニン、又はチロシンである。
治療される疾病は、腎不全を引き起こす疾病、肝不全
を引き起こす疾病、上昇したアンモニアレベルによる高
アンモニア血症、フェニルケトン尿症、又はチロシン血
症、及び特に黒色腫がある。
を引き起こす疾病、上昇したアンモニアレベルによる高
アンモニア血症、フェニルケトン尿症、又はチロシン血
症、及び特に黒色腫がある。
図面の簡単な説明 図１は、尿毒症ラットモデルの尿素曲線のグラフであ
る。
る。
図２は、血漿尿素測定用の検量線を示す。
図３は、正常な対照ラットと実験尿毒症ラットのモデ
ルにおける血漿尿素の時間関数のグラフである。
ルにおける血漿尿素の時間関数のグラフである。
図４は、正常な対照ラットと実験尿毒症ラットのモデ
ルにおける重量曲線のグラフである。
ルにおける重量曲線のグラフである。
図５は、実験尿毒症ラットモデルにおけるAPA−カプ
セル封入バクテリアの尿素除去曲線のグラフである。
セル封入バクテリアの尿素除去曲線のグラフである。
図６は、尿素除去に対するAPA−カプセル封入遺伝子
操作バクテリアの経口給餌による処理の前、間、後にお
ける尿毒症ラットのアンモニア曲線のグラフである。
操作バクテリアの経口給餌による処理の前、間、後にお
ける尿毒症ラットのアンモニア曲線のグラフである。
図７は、実験尿毒症ラットモデルにおける遊離バクテ
リアの尿素除去曲線のグラフである。
リアの尿素除去曲線のグラフである。
図８は、遊離バクテリア及びAPA−カプセル封入バク
テリアの経口給餌による尿素除去の比較研究のグラフで
ある。
テリアの経口給餌による尿素除去の比較研究のグラフで
ある。
図９は、空のAPAマイクロカプセルと遺伝子操作バク
テリア大腸菌DH5細胞を含むAPAマイクロカプセルとを受
けている対照ラットと実験腎不全ラットの生存曲線を示
す。
テリア大腸菌DH5細胞を含むAPAマイクロカプセルとを受
けている対照ラットと実験腎不全ラットの生存曲線を示
す。
図10は、APA−カプセル封入バクテリア、ウレアーゼ
−リン酸ジルコニウム及びオキシスターチの尿素除去効
果の比較研究のグラフである。
−リン酸ジルコニウム及びオキシスターチの尿素除去効
果の比較研究のグラフである。
図11A及び11Bは、マイクロカプセル封入装置の構成の
模式的表示を示す。
模式的表示を示す。
発明の詳細な説明 遺伝子操作細胞を体に導入することの安全性の懸念か
ら、この細胞を医学的な治療に使用することは避けられ
てきた。この問題を解決するために、遺伝子操作細胞を
含む重合膜の人工細胞を、本発明によって調製した。経
口的に与えると、この細胞は、マイクロカプセル中にい
つでも残っていて、最後には、便中に排泄される。この
細胞が、腸を通る間、尿素のような小さな分子は、マイ
クロカプセル中に速やかに拡散し、遺伝子操作細胞と作
用する。この作用により、腎不全ラットにおける高い血
漿尿素レベルが正常なレベルに低下する。このことは、
数多くの医学的用途に、他のタイプの遺伝子操作細胞を
含む本発明を使用することに刺激的な意味を有するもの
である。
ら、この細胞を医学的な治療に使用することは避けられ
てきた。この問題を解決するために、遺伝子操作細胞を
含む重合膜の人工細胞を、本発明によって調製した。経
口的に与えると、この細胞は、マイクロカプセル中にい
つでも残っていて、最後には、便中に排泄される。この
細胞が、腸を通る間、尿素のような小さな分子は、マイ
クロカプセル中に速やかに拡散し、遺伝子操作細胞と作
用する。この作用により、腎不全ラットにおける高い血
漿尿素レベルが正常なレベルに低下する。このことは、
数多くの医学的用途に、他のタイプの遺伝子操作細胞を
含む本発明を使用することに刺激的な意味を有するもの
である。
本発明によって、マイクロカプセル封入遺伝子操作微
生物を特別な臨床的用途で使用し、及びマイクロカプセ
ル入りのものを経口投与で使用することが教示される。
生物を特別な臨床的用途で使用し、及びマイクロカプセ
ル入りのものを経口投与で使用することが教示される。
すなわち、本発明のマイクロカプセル封入遺伝子操作
微生物の、体からの尿素及びアンモニアの除去に対する
効率を、腎不全のモデル系を使用して試験した。この新
しいアプローチは、全身の尿素及びアンモニアを、現存
するいかなる系よりも低下させる能力を有していること
を示した。これは、唯一現在利用できるオキシスターチ
やウレアーゼ−リン酸ジルコニウムよりも数百倍以上効
率的である。
微生物の、体からの尿素及びアンモニアの除去に対する
効率を、腎不全のモデル系を使用して試験した。この新
しいアプローチは、全身の尿素及びアンモニアを、現存
するいかなる系よりも低下させる能力を有していること
を示した。これは、唯一現在利用できるオキシスターチ
やウレアーゼ−リン酸ジルコニウムよりも数百倍以上効
率的である。
この例に加えて、他のマイクロカプセル封入遺伝子操
作微生物は、経口投与で、例えばフェニルケトン尿症に
おけるフェニルアラニンのような一定の不必要なアミノ
酸を特異的に除去するために使用される。
作微生物は、経口投与で、例えばフェニルケトン尿症に
おけるフェニルアラニンのような一定の不必要なアミノ
酸を特異的に除去するために使用される。
本発明に従って使用される適当な微生物は、制限はな
く、尿素除去（UR）用としてクレブシエラ醸気菌、UR3
用としてプロテウス・ミラビリス、フェニルアラニン除
去（PR）用としてフェニルアラニンアンモニアリアーゼ
（PAL）酵素に対する遺伝子を有する大腸菌、PR5として
ロドスポリジウム・トルボイデス（Rhodosporidium tor
uboides）由来のPAL酵素に対する遺伝子を有する大腸
菌、UR6用としてプロビデンシア・スチュアーティル（p
rovidencia stuartil）、及びUR用としてバシラス・パ
スツール（Bacillus pasteuri）を含む。
く、尿素除去（UR）用としてクレブシエラ醸気菌、UR3
用としてプロテウス・ミラビリス、フェニルアラニン除
去（PR）用としてフェニルアラニンアンモニアリアーゼ
（PAL）酵素に対する遺伝子を有する大腸菌、PR5として
ロドスポリジウム・トルボイデス（Rhodosporidium tor
uboides）由来のPAL酵素に対する遺伝子を有する大腸
菌、UR6用としてプロビデンシア・スチュアーティル（p
rovidencia stuartil）、及びUR用としてバシラス・パ
スツール（Bacillus pasteuri）を含む。
本発明の一の態様に従って、アルギン酸塩−ポリリジ
ン−アルギン酸塩のマイクロカプセルが使用された。し
かしながら、微生物に対する他の多くのタイプのマイク
ロカプセルや担持の方法も使用できる。例えば、制限な
く、マイクロカプセルは、ナイロン、シリコンゴム、ナ
イロンポリエチレンイミン、ポリ乳酸、ポリグリコール
酸、キトサン−アルギン酸塩、硫酸セルロース−ポリ
（ジメチルジアリル）−アンモニウムクロライド、ヒド
ロキシ−エチルメタクリレートメチルメタクリレート、
キトサン−カルボキシメチル−セルロースから調製し
た。
ン−アルギン酸塩のマイクロカプセルが使用された。し
かしながら、微生物に対する他の多くのタイプのマイク
ロカプセルや担持の方法も使用できる。例えば、制限な
く、マイクロカプセルは、ナイロン、シリコンゴム、ナ
イロンポリエチレンイミン、ポリ乳酸、ポリグリコール
酸、キトサン−アルギン酸塩、硫酸セルロース−ポリ
（ジメチルジアリル）−アンモニウムクロライド、ヒド
ロキシ−エチルメタクリレートメチルメタクリレート、
キトサン−カルボキシメチル−セルロースから調製し
た。
本発明の臨床用のあらゆる可能性を評価するのに適し
た動物モデルが必要とされた。従って、一つの最初の目
標は、尿毒症に適した実験ラットモデルを入手すること
だった。２つの異なるアプローチを、適した動物モデル
を作るために使用し、モデルＡ及びＢとした。モデルを
作るために使用したラットは、300〜325gの雌ウィスタ
ーラットだった。手順の詳細を以下に示した。結果は
（図１）、モデルＡが良好に保たれている（stands bet
ter）ことを示す（ｐ＝0.0001323、自由度＝６、一組の
スチューデントｔ検定）。モデルＡは、右片側の腎摘出
及び一部の左片側動脈、左静脈、左尿管結紮を含む。
た動物モデルが必要とされた。従って、一つの最初の目
標は、尿毒症に適した実験ラットモデルを入手すること
だった。２つの異なるアプローチを、適した動物モデル
を作るために使用し、モデルＡ及びＢとした。モデルを
作るために使用したラットは、300〜325gの雌ウィスタ
ーラットだった。手順の詳細を以下に示した。結果は
（図１）、モデルＡが良好に保たれている（stands bet
ter）ことを示す（ｐ＝0.0001323、自由度＝６、一組の
スチューデントｔ検定）。モデルＡは、右片側の腎摘出
及び一部の左片側動脈、左静脈、左尿管結紮を含む。
化学薬品： アルギン酸（低粘度、Lot 611994）及びポリ−Ｌ−リ
ジン（MW16100、Lot 11H5516）を、Kelco及びSigma Che
mical co.（St,Louis,MO,USA）からそれぞれ購入した。
特別でない限り、化学薬品を商業的に入手し、かつ使用
前に更に精製せず、及びこれら化学薬品は、分析試薬級
だった。
ジン（MW16100、Lot 11H5516）を、Kelco及びSigma Che
mical co.（St,Louis,MO,USA）からそれぞれ購入した。
特別でない限り、化学薬品を商業的に入手し、かつ使用
前に更に精製せず、及びこれら化学薬品は、分析試薬級
だった。
微生物及び培養条件： クレブシエラ醸気菌からのウレアーゼ遺伝子を含む、
遺伝子操作バクテリア大腸菌DH5を使用した。ルリア−
ベルターニ（LB）増殖培地を、最初の細胞培養に使用し
た。LB培地に組成は、10.00g/lバクトトリプトン（bact
otryptone）（Difco製）、5.00g/lバクト酵母抽出物（D
ifco製）、10.00g/l塩化ナトリウム（Sigma製）であっ
た。pHを、1.00N NaOH約1.00mlを加えて7.5に調製し
た。培地を、その後、キャッスルラボクレーブ（Castle
Labclaves）中で30分間、121℃（250゜F）で撹拌し
た。培養は、37℃の16.00ml培養管中の5.0mlLBで、120r
pmにした軌道撹拌器で行った。バイオマスの生成が大規
模なので、マイクロカプセルに入れる目的で、100mlのL
B培地を含む250mlエルレンマイヤーフラスコを使用し
た。
遺伝子操作バクテリア大腸菌DH5を使用した。ルリア−
ベルターニ（LB）増殖培地を、最初の細胞培養に使用し
た。LB培地に組成は、10.00g/lバクトトリプトン（bact
otryptone）（Difco製）、5.00g/lバクト酵母抽出物（D
ifco製）、10.00g/l塩化ナトリウム（Sigma製）であっ
た。pHを、1.00N NaOH約1.00mlを加えて7.5に調製し
た。培地を、その後、キャッスルラボクレーブ（Castle
Labclaves）中で30分間、121℃（250゜F）で撹拌し
た。培養は、37℃の16.00ml培養管中の5.0mlLBで、120r
pmにした軌道撹拌器で行った。バイオマスの生成が大規
模なので、マイクロカプセルに入れる目的で、100mlのL
B培地を含む250mlエルレンマイヤーフラスコを使用し
た。
マイクロカプセル封入手順： 手短に言えば、大腸菌DH5細胞を含む、アルギン酸塩
−ポリ−Ｌ−リジン−アルギン酸塩（APA）−マイクロ
カプセルを、次のように調製した。
−ポリ−Ｌ−リジン−アルギン酸塩（APA）−マイクロ
カプセルを、次のように調製した。
バクテリア溶液を、オートクレーブしたアルギン酸ナ
トリウムの0.9％塩化ナトリウム溶液中で懸濁した。粘
性アルギン酸塩−バクテリア懸濁液は、注射ポンプ（コ
ンパクト注入ポンプ モデル975TM、Harvard App.Co.M
A）を使用して、23−ゲージ針を通して押し出した。16
ゲージ針を通過する圧縮空気を使用して、23−ゲージ針
の先端から出てくる液滴を剪断した。この２つの針を組
み合わせて、液滴針の集合を作っている（図11A、11
B）。液滴は、15分間静かに撹拌して塩化カルシウムの
氷冷溶液（1.4％）中ゲル化させた。塩化カルシウム中
でのゲル化後、アルギン酸塩のゲルビーズを、ポリリジ
ン（HEPESTM緩衝生理食塩水中で0.05％、pH7.20）で10
分間被覆した。このビーズは、その後、HEPESTMで洗浄
し、アルギン酸塩溶液（0.1％）で4.00分間被覆した。
アルギン酸塩−ポリ−Ｌ−リジン−アルギン酸塩のカプ
セルを、その後、3.00％クエン酸塩浴（1:1 HEPESTM緩
衝生理食塩水中で3.00％、pH7.20）で洗浄して、マイク
ロカプセル中でゲルを液化させた。マイクロカプセルの
形態を４℃で貯蔵し、実験に使用した。
トリウムの0.9％塩化ナトリウム溶液中で懸濁した。粘
性アルギン酸塩−バクテリア懸濁液は、注射ポンプ（コ
ンパクト注入ポンプ モデル975TM、Harvard App.Co.M
A）を使用して、23−ゲージ針を通して押し出した。16
ゲージ針を通過する圧縮空気を使用して、23−ゲージ針
の先端から出てくる液滴を剪断した。この２つの針を組
み合わせて、液滴針の集合を作っている（図11A、11
B）。液滴は、15分間静かに撹拌して塩化カルシウムの
氷冷溶液（1.4％）中ゲル化させた。塩化カルシウム中
でのゲル化後、アルギン酸塩のゲルビーズを、ポリリジ
ン（HEPESTM緩衝生理食塩水中で0.05％、pH7.20）で10
分間被覆した。このビーズは、その後、HEPESTMで洗浄
し、アルギン酸塩溶液（0.1％）で4.00分間被覆した。
アルギン酸塩−ポリ−Ｌ−リジン−アルギン酸塩のカプ
セルを、その後、3.00％クエン酸塩浴（1:1 HEPESTM緩
衝生理食塩水中で3.00％、pH7.20）で洗浄して、マイク
ロカプセル中でゲルを液化させた。マイクロカプセルの
形態を４℃で貯蔵し、実験に使用した。
マイクロカプセル貯蔵条件： マイクロカプセル封入の後、マイクロカプセルを、し
っかりと数回（２〜３回）滅菌水で洗浄した。このマイ
クロカプセルは、アグロバクテリウムと最小ブロス（AG
最小培地）中で、４〜10℃で再懸濁した。この培地は、
LB培地と異なり、大腸菌の増殖を補助しないが、生物学
的活性を維持するために必要な全ての成分を含んでい
る。使用前に、マイクロカプセルを通常の生理食塩水で
洗浄して実験に使用した。
っかりと数回（２〜３回）滅菌水で洗浄した。このマイ
クロカプセルは、アグロバクテリウムと最小ブロス（AG
最小培地）中で、４〜10℃で再懸濁した。この培地は、
LB培地と異なり、大腸菌の増殖を補助しないが、生物学
的活性を維持するために必要な全ての成分を含んでい
る。使用前に、マイクロカプセルを通常の生理食塩水で
洗浄して実験に使用した。
in vitroにおける尿素及びアンモニアの除去実験のため
の反応培地： 全ての実験における反応培地は、1.00g/lグルコー
ス、20.00mg/l硫酸マグネシウム、30.00mg/lリン酸水素
二カリウム、0.07mg/lビタミンB12を有していた。必要
であればろ過され、無菌化された尿素を、反応培地に加
えて尿素濃度を100mg/dlとした。牛由来血漿を、血漿の
尿素及びアンモニアの除去実験に使用し、ろ過滅菌尿素
を血漿に加えた。このようにして、in vitroにおいて尿
毒症患者の血漿の特徴を模倣した。
の反応培地： 全ての実験における反応培地は、1.00g/lグルコー
ス、20.00mg/l硫酸マグネシウム、30.00mg/lリン酸水素
二カリウム、0.07mg/lビタミンB12を有していた。必要
であればろ過され、無菌化された尿素を、反応培地に加
えて尿素濃度を100mg/dlとした。牛由来血漿を、血漿の
尿素及びアンモニアの除去実験に使用し、ろ過滅菌尿素
を血漿に加えた。このようにして、in vitroにおいて尿
毒症患者の血漿の特徴を模倣した。
尿毒症（ラット）の外科用モデル ２つの異なる外科用のモデルを開発し、モデルＡ及び
モデルＢとした。両モデルとも、300〜340gの雄ウィス
ターマウスを使用した。尿毒症ラットモデルを治療する
ために適用された外科的手順の詳細は、次の通りであ
る。
モデルＢとした。両モデルとも、300〜340gの雄ウィス
ターマウスを使用した。尿毒症ラットモデルを治療する
ために適用された外科的手順の詳細は、次の通りであ
る。
モデルA:2工程の手順で、一つは右腎摘出を行い、もう
一つは、左の動脈、静脈、尿管を部分的に結紮する手順
を必要とする。この手順の詳細は、次の通りである。
一つは、左の動脈、静脈、尿管を部分的に結紮する手順
を必要とする。この手順の詳細は、次の通りである。
ｉ）片側の（右）腎摘出： 麻酔された動物を、尾部を外科医に向けて腹を横にし
て置く。右背側の腰部の毛を刈り取り、皮膚を外科的に
洗浄して（scrub）入念にふき取った。２〜3cmの切り込
みを、尾部から動物の右側の肋骨胸郭までの皮膚に入れ
る。その後、２〜3cmの切り込みを、その下にある筋肉
壁に入れる。腎臓は、筋肉壁を通して貯蔵（pool）し、
腎臓の動脈、静脈、尿管を結紮し、腎臓を腎臓の間の血
管と尿管とに切り込みを入れて除去し、結紮した残りの
組織を腹膜腔に戻し、筋肉壁を縫合する。皮膚切開は、
２〜３の創傷クリップで閉じる。
て置く。右背側の腰部の毛を刈り取り、皮膚を外科的に
洗浄して（scrub）入念にふき取った。２〜3cmの切り込
みを、尾部から動物の右側の肋骨胸郭までの皮膚に入れ
る。その後、２〜3cmの切り込みを、その下にある筋肉
壁に入れる。腎臓は、筋肉壁を通して貯蔵（pool）し、
腎臓の動脈、静脈、尿管を結紮し、腎臓を腎臓の間の血
管と尿管とに切り込みを入れて除去し、結紮した残りの
組織を腹膜腔に戻し、筋肉壁を縫合する。皮膚切開は、
２〜３の創傷クリップで閉じる。
ii）片側（左）腎臓の動脈／静脈／尿管／結紮： ラットの左側を、左腎摘出を行うように準備する。切
り込み（２〜3cm）を筋肉壁に入れた後、左腎臓の動
脈、静脈、及び尿管を捜し出す。先の丸い（blunt）ピ
ンセットを使って、左腎臓の血管及び尿管を腹膜の結合
組織から分離、分別する。腎臓の血管及び尿管は、無菌
絹縫合を使用して部分的に結紮する。筋肉壁を縫合す
る。皮膚切開は、２〜３の金属創傷クリップで閉じる。
り込み（２〜3cm）を筋肉壁に入れた後、左腎臓の動
脈、静脈、及び尿管を捜し出す。先の丸い（blunt）ピ
ンセットを使って、左腎臓の血管及び尿管を腹膜の結合
組織から分離、分別する。腎臓の血管及び尿管は、無菌
絹縫合を使用して部分的に結紮する。筋肉壁を縫合す
る。皮膚切開は、２〜３の金属創傷クリップで閉じる。
モデルB:左腎動脈／静脈／尿管／結紮： 麻酔された動物を、尾部を外科医に向けて腹を横にし
て置く。左背側の腰部の毛を刈り取り、皮膚を外科的に
洗浄して入念にふき取った。２〜3cmの切り込みを、尾
部から動物の左側の肋骨胸郭までの皮膚に入れる。２〜
3cmの切り込みを、その下にある筋肉壁に入れ、左側の
動脈、静脈、及び尿管を探し出す。先の丸いピンセット
を使って、左腎臓の血管及び尿管を腹膜の結合組織から
分離、分別する。左側の腎臓の血管及び尿管は、無菌絹
縫合を使用いて結紮する。筋肉壁を縫合する。皮膚切開
は、２〜３の金属創傷クリップで閉じる。
て置く。左背側の腰部の毛を刈り取り、皮膚を外科的に
洗浄して入念にふき取った。２〜3cmの切り込みを、尾
部から動物の左側の肋骨胸郭までの皮膚に入れる。２〜
3cmの切り込みを、その下にある筋肉壁に入れ、左側の
動脈、静脈、及び尿管を探し出す。先の丸いピンセット
を使って、左腎臓の血管及び尿管を腹膜の結合組織から
分離、分別する。左側の腎臓の血管及び尿管は、無菌絹
縫合を使用いて結紮する。筋肉壁を縫合する。皮膚切開
は、２〜３の金属創傷クリップで閉じる。
考察： 本発明の主目的は、マイクロカプセル封入遺伝子操作
微生物を経口で与えて使用して、種々の疾病を治療す
る、新しいアプローチの可能性を探求することにある。
本研究の特別な目的は、腎不全や肝不全における尿素及
びアンモニアレベルの管理に適した手段を見いだすこと
にある。従って、本発明によって、APA膜中のクレブシ
エラ醸気菌からのウレアーゼ遺伝子を利用する尿素を含
む、カプセル封入遺伝子操作大腸菌DH5細胞を調製し、
経口投与でこの細胞を使用するために前もって作った。
微生物を経口で与えて使用して、種々の疾病を治療す
る、新しいアプローチの可能性を探求することにある。
本研究の特別な目的は、腎不全や肝不全における尿素及
びアンモニアレベルの管理に適した手段を見いだすこと
にある。従って、本発明によって、APA膜中のクレブシ
エラ醸気菌からのウレアーゼ遺伝子を利用する尿素を含
む、カプセル封入遺伝子操作大腸菌DH5細胞を調製し、
経口投与でこの細胞を使用するために前もって作った。
本発明に従って、マイクロカプセル封入遺伝子操作微
生物を経口的に使用して、腎不全ラットを治療し、ラッ
トの尿素及びアンモニアレベルを低下させることができ
ることが示される。更に、本発明者は、APA−カプセル
封入バクテリア及び遊離バクテリアの経口給餌はとも
に、実験尿毒症ラットモデルにおいて血漿尿素を減少す
ることもはじめて報告する。シングルプールモデルを使
用して、このラットモデルを評価する時、カプセル封入
バクテリアは、一般に使用されるオキシスターチ及びウ
レアーゼリン酸ジルコニウムよりも大きい効果で尿素を
除去できることがわかった。２日目の3.2±0.67尿素mg/
バイオマスmg、４日目の8.00±1.39mg/バイオマスmgの
量を、カプセル封入バクテリアに対して観測した。オキ
シスターチ及びウレアーゼリン酸ジルコニウムは、一方
で、0.103尿素mg/オキシスターチmg、0.033尿素mg/ウレ
アーゼ−リン酸ジルコニウムmgの除去能力を有している
にすぎない（Prakash、Chang、Biotechnology and Bioe
ngineering、46、621〜626頁、1995年）。また、現在の
オキシスターチ及びウレアーゼリン酸ジルコニウム系
は、実際の治療中に利用できる必要のない特別な条件下
で働く。例えば、オキシスターチは、特異的なpHでのみ
結合する尿素及びアンモニアの十分な容量を有してい
る。
生物を経口的に使用して、腎不全ラットを治療し、ラッ
トの尿素及びアンモニアレベルを低下させることができ
ることが示される。更に、本発明者は、APA−カプセル
封入バクテリア及び遊離バクテリアの経口給餌はとも
に、実験尿毒症ラットモデルにおいて血漿尿素を減少す
ることもはじめて報告する。シングルプールモデルを使
用して、このラットモデルを評価する時、カプセル封入
バクテリアは、一般に使用されるオキシスターチ及びウ
レアーゼリン酸ジルコニウムよりも大きい効果で尿素を
除去できることがわかった。２日目の3.2±0.67尿素mg/
バイオマスmg、４日目の8.00±1.39mg/バイオマスmgの
量を、カプセル封入バクテリアに対して観測した。オキ
シスターチ及びウレアーゼリン酸ジルコニウムは、一方
で、0.103尿素mg/オキシスターチmg、0.033尿素mg/ウレ
アーゼ−リン酸ジルコニウムmgの除去能力を有している
にすぎない（Prakash、Chang、Biotechnology and Bioe
ngineering、46、621〜626頁、1995年）。また、現在の
オキシスターチ及びウレアーゼリン酸ジルコニウム系
は、実際の治療中に利用できる必要のない特別な条件下
で働く。例えば、オキシスターチは、特異的なpHでのみ
結合する尿素及びアンモニアの十分な容量を有してい
る。
体液区画からアンモニアを速やかに除去することは、
肝不全の間の精神的なダメージを防止するために要求さ
れる。本発明によって、アンモニア除去は、カプセル封
入バクテリアで可能になることが示された。尿毒症ラッ
トの血漿アンモニア濃度は、尿素除去実験中に519〜560
±51μM/lから144±24.70μM/lまで減少した。これは、
約73.30±4.57の減少になる。
肝不全の間の精神的なダメージを防止するために要求さ
れる。本発明によって、アンモニア除去は、カプセル封
入バクテリアで可能になることが示された。尿毒症ラッ
トの血漿アンモニア濃度は、尿素除去実験中に519〜560
±51μM/lから144±24.70μM/lまで減少した。これは、
約73.30±4.57の減少になる。
尿素除去の点から、本発明のAPA−カプセル封入バク
テリア及び遊離バクテリアの性質は（図８）、遊離バク
テリアを越えるカプセル封入バクテリアの使用の利点を
明確に示している。治療の開始時期において、遊離バク
テリアは、マイクロカプセル封入バクテリアと比べて尿
素除去能力が低い。これは、最初の通過の間に遊離バク
テリアが死滅するためである。微生物の使用が要求され
ていかなる治療においても、微生物が、体内にとどまら
ないことを確認することは重要である。従って、マイク
ロカプセル封入微生物は、大便中に排泄される。このよ
うに、給餌をやめるとすぐに、尿毒症ラットの体で製造
された尿素によって尿素のレベルが治療前の尿毒症のレ
ベルまで増加する結果になった。一方で、遊離バクテリ
アに対する治療が中止されると、微生物は体内にとどま
り続け、数分は尿素レベルを低く維持し続ける（図
８）。さらに、カプセル封入微生物は、遊離微生物より
も速やかに除去されるという利点を示す。
テリア及び遊離バクテリアの性質は（図８）、遊離バク
テリアを越えるカプセル封入バクテリアの使用の利点を
明確に示している。治療の開始時期において、遊離バク
テリアは、マイクロカプセル封入バクテリアと比べて尿
素除去能力が低い。これは、最初の通過の間に遊離バク
テリアが死滅するためである。微生物の使用が要求され
ていかなる治療においても、微生物が、体内にとどまら
ないことを確認することは重要である。従って、マイク
ロカプセル封入微生物は、大便中に排泄される。このよ
うに、給餌をやめるとすぐに、尿毒症ラットの体で製造
された尿素によって尿素のレベルが治療前の尿毒症のレ
ベルまで増加する結果になった。一方で、遊離バクテリ
アに対する治療が中止されると、微生物は体内にとどま
り続け、数分は尿素レベルを低く維持し続ける（図
８）。さらに、カプセル封入微生物は、遊離微生物より
も速やかに除去されるという利点を示す。
この研究は、マイクロカプセルに封入した、一般的に
は遺伝子操作微生物、特に遺伝子操作バクテリアの経口
給餌の治療上の有効性を示す。本研究は、腎不全、肝不
全、その他の疾病の治療のための容易に投与できる経口
の形態として、遺伝子操作バクテリアを含む経口マイク
ロカプセルの発達の基礎も提供する。
は遺伝子操作微生物、特に遺伝子操作バクテリアの経口
給餌の治療上の有効性を示す。本研究は、腎不全、肝不
全、その他の疾病の治療のための容易に投与できる経口
の形態として、遺伝子操作バクテリアを含む経口マイク
ロカプセルの発達の基礎も提供する。
本発明は、次に示す実施例についての言及により更に
容易に理解できるが、これは、本発明を例証するのであ
って、本発明の範囲を限定するものではない。
容易に理解できるが、これは、本発明を例証するのであ
って、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１ マイクロカプセル封入遺伝子操作バクテリアの経口給餌
による尿素及びアンモニアの除去 実験手順： バクテリアは、LB培地で増殖させた。対数期のバクテ
リア細胞を、10000gで20分間、４℃で遠心分離して収穫
した。細胞の塊を５回滅菌した冷水で洗浄して培養成分
を除去した。細胞を秤量し、遊離バクテリアによる尿素
及びアンモニアの除去実験に使用した。マイクロカプセ
ル封入尿素及びアンモニアの除去実験のために、同量の
細胞を、マイクロカプセルに封入して使用した。全ての
実験にわたって、反応器の容量とマイクロカプセル封入
バクテリアの使用量との比を、一定に保った。
による尿素及びアンモニアの除去 実験手順： バクテリアは、LB培地で増殖させた。対数期のバクテ
リア細胞を、10000gで20分間、４℃で遠心分離して収穫
した。細胞の塊を５回滅菌した冷水で洗浄して培養成分
を除去した。細胞を秤量し、遊離バクテリアによる尿素
及びアンモニアの除去実験に使用した。マイクロカプセ
ル封入尿素及びアンモニアの除去実験のために、同量の
細胞を、マイクロカプセルに封入して使用した。全ての
実験にわたって、反応器の容量とマイクロカプセル封入
バクテリアの使用量との比を、一定に保った。
マイクロカプセルに封入したin vivo動物試験のため
に、対数期の遺伝子バクテリアを含むマイクロカプセル
を、5ml注射器に入れた0.8〜1.0ml滅菌通常生理食塩水
中で最初に懸濁した。浮いているマイクロカプセルを、
尿毒症ラットに曲がった12G−3 1/2ステンレス針を使っ
て、強制的に経口的に給餌した。kg体重あたり11.5±2.
25mgの対数期の遺伝子操作バクテリア大腸菌DH5細胞を
マイクロカプセルに入れたものを使用した。腎臓又は肝
臓の機能にいかなる副作用もないと報告されている適量
の薬剤を使って鎮静した後にラットの尾部から血液試料
を取り出すことによりサンプリングを行った。薬剤は、
ATRAVETTM（アセプロマジン）及びKETASETTM（ケタミ
ン）を、濃度75mg/kg及び５〜9mg/9kgで筋肉内にそれぞ
れ使用した。小さな23G1精度のGLIDETM針と、10ccの注
射器を使った。血液試料をEPPENDORFFTMを使って直ちに
遠心分離し、血漿を集めて尿素及びアンモニアについて
分析した。
に、対数期の遺伝子バクテリアを含むマイクロカプセル
を、5ml注射器に入れた0.8〜1.0ml滅菌通常生理食塩水
中で最初に懸濁した。浮いているマイクロカプセルを、
尿毒症ラットに曲がった12G−3 1/2ステンレス針を使っ
て、強制的に経口的に給餌した。kg体重あたり11.5±2.
25mgの対数期の遺伝子操作バクテリア大腸菌DH5細胞を
マイクロカプセルに入れたものを使用した。腎臓又は肝
臓の機能にいかなる副作用もないと報告されている適量
の薬剤を使って鎮静した後にラットの尾部から血液試料
を取り出すことによりサンプリングを行った。薬剤は、
ATRAVETTM（アセプロマジン）及びKETASETTM（ケタミ
ン）を、濃度75mg/kg及び５〜9mg/9kgで筋肉内にそれぞ
れ使用した。小さな23G1精度のGLIDETM針と、10ccの注
射器を使った。血液試料をEPPENDORFFTMを使って直ちに
遠心分離し、血漿を集めて尿素及びアンモニアについて
分析した。
尿素測定： 尿素濃度を、Sigma Chemical Co.USAから購入したBUN
キット及びPERKIN ELMER LAMBDATM4B紫外分光光度計を
使用した血液の定量測定に基づいて測定した。この方法
を使用すると、血清又は血漿尿素を除タンパクせずに測
定することができる。この方法において、尿素とジアセ
チルモノオキサミンとの反応は、桃色の色原体及びヒド
ロキシルアミンを与える。尿素濃度は、色生成強度と直
接比例し、この強度は、分光光度計で515〜540nmの間で
測定できる。この方法は、単純、迅速、高感度で、アン
モニウムイオンの存在に影響されない。尿素測定用の検
量線を、標準尿素溶液の既知量を使用し、540nmの光学
濃度で作成した（図２）。検量線を、全ての実験におい
て尿素を定量するために使用した。
キット及びPERKIN ELMER LAMBDATM4B紫外分光光度計を
使用した血液の定量測定に基づいて測定した。この方法
を使用すると、血清又は血漿尿素を除タンパクせずに測
定することができる。この方法において、尿素とジアセ
チルモノオキサミンとの反応は、桃色の色原体及びヒド
ロキシルアミンを与える。尿素濃度は、色生成強度と直
接比例し、この強度は、分光光度計で515〜540nmの間で
測定できる。この方法は、単純、迅速、高感度で、アン
モニウムイオンの存在に影響されない。尿素測定用の検
量線を、標準尿素溶液の既知量を使用し、540nmの光学
濃度で作成した（図２）。検量線を、全ての実験におい
て尿素を定量するために使用した。
アンモニア測定： アンモニア測定を、蛍光光散乱MULTISTATTMIII超遠心
分析機を使用して分析した。この系の使用は、計測研究
所（Instrumentation Laboratories）で、MULTISTATTMI
II plus（Spokane、Wash.）、吸光度モードの超遠心分
離分析機（MCA）（Sigma procedure、catalogue 170−U
V）で行った。この測定は、２−オキソグルタレートの
還元的アミノ化に基づき、グルタレート脱水素酵母（GL
DH）を使用して、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド（NADH）を還元した。NADHの酸化による340nmでの吸
光度の減少は、アンモニア濃度と比例する。この方法
は、その都度新しい検量線の準備が必要なので、検量線
はその都度準備される。
分析機を使用して分析した。この系の使用は、計測研究
所（Instrumentation Laboratories）で、MULTISTATTMI
II plus（Spokane、Wash.）、吸光度モードの超遠心分
離分析機（MCA）（Sigma procedure、catalogue 170−U
V）で行った。この測定は、２−オキソグルタレートの
還元的アミノ化に基づき、グルタレート脱水素酵母（GL
DH）を使用して、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド（NADH）を還元した。NADHの酸化による340nmでの吸
光度の減少は、アンモニア濃度と比例する。この方法
は、その都度新しい検量線の準備が必要なので、検量線
はその都度準備される。
結果： 本研究は、マイクロカプセル封入遺伝子操作微生物
の、経口給餌による種々の疾病の治療への使用を探索す
るために計画された。即ち、本研究は、マイクロカプセ
ル封入遺伝子操作バクテリア細胞の、臨床実験における
腎不全、肝不全及び他の疾病の治療に対する将来の可能
性を評価する。
の、経口給餌による種々の疾病の治療への使用を探索す
るために計画された。即ち、本研究は、マイクロカプセ
ル封入遺伝子操作バクテリア細胞の、臨床実験における
腎不全、肝不全及び他の疾病の治療に対する将来の可能
性を評価する。
以前のin vitroでの研究は、アルギン酸塩−ポリ−Ｌ
−リジン−アルギン酸塩（APA）カプセル封入遺伝子操
作大腸菌DH5細胞は、反応培地及び血漿の双方から尿素
及びアンモニアを除去するのに極めて効果的であること
が証明された（Prakash,S.及びChang,T.M.S.、Biotechn
ology and Bioenginerring、46、621〜616頁、1995
年）。マイクロカプセルの調製に含まれる工程の要素の
詳細と、尿素及びアンモニア除去のin vitroでの速度論
は、この論文に記述されている。
−リジン−アルギン酸塩（APA）カプセル封入遺伝子操
作大腸菌DH5細胞は、反応培地及び血漿の双方から尿素
及びアンモニアを除去するのに極めて効果的であること
が証明された（Prakash,S.及びChang,T.M.S.、Biotechn
ology and Bioenginerring、46、621〜616頁、1995
年）。マイクロカプセルの調製に含まれる工程の要素の
詳細と、尿素及びアンモニア除去のin vitroでの速度論
は、この論文に記述されている。
本発明の臨床用の可能性を評価するために、適した動
物モデルが要求される。従って、最初の目標は、尿毒症
に適した実験ラットモデルを得ることがあった。適した
尿毒症ラットモデルを作るために外科的方法が計画され
た。モデルを作るために使用されるラットは、300〜325
gの雄ウィスターラットである。結果は、製法が、尿毒
症ラットモデルを作るのに成功した方法であることを示
す。部分的結紮は、腎臓組織の破壊の程度が異なる結果
となった。これら実験ラットモデルの結果として、血漿
尿素濃度の大きな変化が観測され、血漿尿素が最低17.6
1±1.2mg/dl、最高172.28±40mg/dlだった。実験とし
て、血漿尿素が52.08±2.06mg/dlを有する動物のみを使
用した。この尿毒症ラットモデルは、正常ラットと比較
して高レベルの血漿を有ていた（図３）。さらに、上記
動物は、実験に十分な時間生存できる。このモデルは、
右腎摘出後、一部の左動脈、静脈、尿管を部分的に結紮
したものに基づいている。実験ラットの体重曲線は以下
の通りであり、その結果を図４に示す。本研究の主目的
は、実験において、カプセル封入遺伝子操作大腸菌DH5
の経口投与が全身の尿素レベルを減少できるか否かを見
るのに十分長く生存できる動物腎不全モデルを得ること
にあった。
物モデルが要求される。従って、最初の目標は、尿毒症
に適した実験ラットモデルを得ることがあった。適した
尿毒症ラットモデルを作るために外科的方法が計画され
た。モデルを作るために使用されるラットは、300〜325
gの雄ウィスターラットである。結果は、製法が、尿毒
症ラットモデルを作るのに成功した方法であることを示
す。部分的結紮は、腎臓組織の破壊の程度が異なる結果
となった。これら実験ラットモデルの結果として、血漿
尿素濃度の大きな変化が観測され、血漿尿素が最低17.6
1±1.2mg/dl、最高172.28±40mg/dlだった。実験とし
て、血漿尿素が52.08±2.06mg/dlを有する動物のみを使
用した。この尿毒症ラットモデルは、正常ラットと比較
して高レベルの血漿を有ていた（図３）。さらに、上記
動物は、実験に十分な時間生存できる。このモデルは、
右腎摘出後、一部の左動脈、静脈、尿管を部分的に結紮
したものに基づいている。実験ラットの体重曲線は以下
の通りであり、その結果を図４に示す。本研究の主目的
は、実験において、カプセル封入遺伝子操作大腸菌DH5
の経口投与が全身の尿素レベルを減少できるか否かを見
るのに十分長く生存できる動物腎不全モデルを得ること
にあった。
実験を、マイクロカプセル封入遺伝子操作細胞の、尿
毒症ラットにおける尿素除去への使用を評価するために
計画した。前述した実験モデルを、この研究に使用し
た。加えて、実験ラットをそれ自身対照として治療前の
尿素レベルをモニターする傍ら、正常ラット及びバクテ
リアの入っていない空マイクロカプセルを受け入れる尿
毒症ラットは、双方とも対照として使用した。全ての実
験研究の間で、対照ラットと腎摘出ラットに、22.5％の
タンパク質を含む通常飼料（Purina Mills,LaSalle,Q
c）を給餌した。対数期アルギン酸塩−ポリ−Ｌ−アル
ギン酸塩をマイクロカプセル封入バクテリアの11.15±
2.25mg/kg体重の量を、高レベルの血漿尿素（血漿尿素
濃度52.08±2.06％mg、9.10±0.71％mgの正常ラットの
血漿尿素と比較して）を有する26日齢の腎摘出ラット群
に毎日強制的に給餌した。図５の結果は、バクテリア
は、血漿尿素濃度を治療の最初の48時間で52.08±2.06
から37.53±3.31mg/dl、翌日には13.34±2.24mg/dl、７
日後には10.58±0.85mg/dlに低下することができたこと
を示す。毎日給餌治療を続けていれば、尿毒症ラットに
おける血漿尿素レベルを21日間は正常値に非常に近く維
持できた。高い尿素レベルに戻るのは、治療をやめたと
きに観測される。尿素レベルは、20.11±1.80mg/dlに戻
り、ちょうど次の日から７日までそれぞれ、24.52±3.2
5mg/dl、37.60±8.21mg/dl、47.57±2.26mg/dl、48.92
±2.09mg/dl、53.80±2.18mg/dl、53.69±2.59mg/dlに
戻った。２匹の動物が、治療停止により８日目に死ん
だ。解剖研究では、出血性腸、結合しつぶれた肺、及び
液体のたまった胸腔の症状を伴う典型的な尿毒症死を示
した。肺体液中の尿素濃度は、最高で177.21±12.90mg/
dl（ｎ＝２）に到達した。更に、全体の50％の動物が、
治療停止から最初の29日で死んだ。
毒症ラットにおける尿素除去への使用を評価するために
計画した。前述した実験モデルを、この研究に使用し
た。加えて、実験ラットをそれ自身対照として治療前の
尿素レベルをモニターする傍ら、正常ラット及びバクテ
リアの入っていない空マイクロカプセルを受け入れる尿
毒症ラットは、双方とも対照として使用した。全ての実
験研究の間で、対照ラットと腎摘出ラットに、22.5％の
タンパク質を含む通常飼料（Purina Mills,LaSalle,Q
c）を給餌した。対数期アルギン酸塩−ポリ−Ｌ−アル
ギン酸塩をマイクロカプセル封入バクテリアの11.15±
2.25mg/kg体重の量を、高レベルの血漿尿素（血漿尿素
濃度52.08±2.06％mg、9.10±0.71％mgの正常ラットの
血漿尿素と比較して）を有する26日齢の腎摘出ラット群
に毎日強制的に給餌した。図５の結果は、バクテリア
は、血漿尿素濃度を治療の最初の48時間で52.08±2.06
から37.53±3.31mg/dl、翌日には13.34±2.24mg/dl、７
日後には10.58±0.85mg/dlに低下することができたこと
を示す。毎日給餌治療を続けていれば、尿毒症ラットに
おける血漿尿素レベルを21日間は正常値に非常に近く維
持できた。高い尿素レベルに戻るのは、治療をやめたと
きに観測される。尿素レベルは、20.11±1.80mg/dlに戻
り、ちょうど次の日から７日までそれぞれ、24.52±3.2
5mg/dl、37.60±8.21mg/dl、47.57±2.26mg/dl、48.92
±2.09mg/dl、53.80±2.18mg/dl、53.69±2.59mg/dlに
戻った。２匹の動物が、治療停止により８日目に死ん
だ。解剖研究では、出血性腸、結合しつぶれた肺、及び
液体のたまった胸腔の症状を伴う典型的な尿毒症死を示
した。肺体液中の尿素濃度は、最高で177.21±12.90mg/
dl（ｎ＝２）に到達した。更に、全体の50％の動物が、
治療停止から最初の29日で死んだ。
類似の実験を、APAカプセル封入遺伝子操作大腸菌DH5
細胞によって尿素除去する間のアンモニアの結果を観測
するために行った。これは、肝不全におけるこの系の使
用の可能性を探索するためにも行った。結果（図６）
は、常に539±51mM存在するアンモニアレベルが、144±
24.70mMに減少し、治療の全期間において一定に残存し
ていたことを示す。
細胞によって尿素除去する間のアンモニアの結果を観測
するために行った。これは、肝不全におけるこの系の使
用の可能性を探索するためにも行った。結果（図６）
は、常に539±51mM存在するアンモニアレベルが、144±
24.70mMに減少し、治療の全期間において一定に残存し
ていたことを示す。
図７で得られたデータは、遊離バクテリアも血漿尿素
を減少させることができたことを示す。遊離細胞での実
験中、バクテリアの使用量は、APAマイクロカプセルに
封入した研究と同じだった。遊離バクテリアとAPAカプ
セル封入バクテリアとの尿素除去の速度を比較すると
（図８）、全体的な速度は、類似していることがわかっ
た。しかしながら、当初は、遊離バクテリアに除去され
る尿素の割合が、APAカプセル封入バクテリアに除去さ
れる割合より非常に小さかった。遊離バクテリアでは、
１日目に20.28±1.06％、２日目には68.29±4.30％除去
した（APAカプセル封入バクテリアの36.34±4.70％、8
0.49±2.96％と比較して）。更に、処理後期において、
APAカプセル封入バクテリア中の血漿尿素濃度の増加率
は、遊離バクテリアで観測されるよりも非常に高い。
を減少させることができたことを示す。遊離細胞での実
験中、バクテリアの使用量は、APAマイクロカプセルに
封入した研究と同じだった。遊離バクテリアとAPAカプ
セル封入バクテリアとの尿素除去の速度を比較すると
（図８）、全体的な速度は、類似していることがわかっ
た。しかしながら、当初は、遊離バクテリアに除去され
る尿素の割合が、APAカプセル封入バクテリアに除去さ
れる割合より非常に小さかった。遊離バクテリアでは、
１日目に20.28±1.06％、２日目には68.29±4.30％除去
した（APAカプセル封入バクテリアの36.34±4.70％、8
0.49±2.96％と比較して）。更に、処理後期において、
APAカプセル封入バクテリア中の血漿尿素濃度の増加率
は、遊離バクテリアで観測されるよりも非常に高い。
実験は、長期治療の効果をフォローするためにも計画
された。結果は、治療された実験ラットモデルに対する
生存曲線としてプロットする（図９）。結果は、全ての
治療された動物は、未治療動物の50％生存に比べて、治
療から最初の27日間生存していたことを示す。結果は、
また、治療した群の動物中で、非常に高い生存率を示
し、これは、マイクロカプセル封入遺伝子操作バクテリ
アを経口投与で受けている動物の治療した群において、
非常に低い生存を示す実験腎不全ラット群と比較して
も、87.5％に及ぶ高い生存率を示している。空のカプセ
ルしか受け取っていない実験腎不全ラット群は、最初の
21日で25％の動物が死に、29日後に50％が、41日後に75
％の動物が死んだ。
された。結果は、治療された実験ラットモデルに対する
生存曲線としてプロットする（図９）。結果は、全ての
治療された動物は、未治療動物の50％生存に比べて、治
療から最初の27日間生存していたことを示す。結果は、
また、治療した群の動物中で、非常に高い生存率を示
し、これは、マイクロカプセル封入遺伝子操作バクテリ
アを経口投与で受けている動物の治療した群において、
非常に低い生存を示す実験腎不全ラット群と比較して
も、87.5％に及ぶ高い生存率を示している。空のカプセ
ルしか受け取っていない実験腎不全ラット群は、最初の
21日で25％の動物が死に、29日後に50％が、41日後に75
％の動物が死んだ。
シングルプールモデルを使用して、APAカプセル封入
遺伝子操作バクテリアに除去された尿素を計算し、他の
入手可能な対応する経口吸収剤と比較した（図10）。計
算では、70kgの人へ4.2g/日のバイオマスを経口投与す
ると、血漿尿素濃度が100mg/dlから10mg/dlに低下する
ことを示す。これは、患者中の血漿尿素濃度を100mg/dl
から10mg/dlに低下させるために要求される、オキシス
ターチ約388g及びマイクロカプセル封入ウレアーゼリン
酸ジルコニウム1212gの量と比べて、はるかに少ない投
与量である。オキシスターチ及びマイクロカプセル封入
ウレアーゼリン酸ジルコニウムの要求される投与量は、
患者に日常的な毎日の使用に対する投与量としては多す
ぎて許容されない。一方で、発明者の研究では、非常に
少量のマイクロカプセル封入遺伝子操作大腸菌DH5細胞
が、尿毒症ラットにおいて正常な尿素レベルを維持でき
ることを示している。
遺伝子操作バクテリアに除去された尿素を計算し、他の
入手可能な対応する経口吸収剤と比較した（図10）。計
算では、70kgの人へ4.2g/日のバイオマスを経口投与す
ると、血漿尿素濃度が100mg/dlから10mg/dlに低下する
ことを示す。これは、患者中の血漿尿素濃度を100mg/dl
から10mg/dlに低下させるために要求される、オキシス
ターチ約388g及びマイクロカプセル封入ウレアーゼリン
酸ジルコニウム1212gの量と比べて、はるかに少ない投
与量である。オキシスターチ及びマイクロカプセル封入
ウレアーゼリン酸ジルコニウムの要求される投与量は、
患者に日常的な毎日の使用に対する投与量としては多す
ぎて許容されない。一方で、発明者の研究では、非常に
少量のマイクロカプセル封入遺伝子操作大腸菌DH5細胞
が、尿毒症ラットにおいて正常な尿素レベルを維持でき
ることを示している。
結論： 本実施例は、マイクロカプセルに封入し、遺伝子を操
作したバクテリア細胞の経口給餌により尿素及びアンモ
ニアを除去する新たな方法について記述した。
作したバクテリア細胞の経口給餌により尿素及びアンモ
ニアを除去する新たな方法について記述した。
このAPA−カプセル封入遺伝子操作大腸菌DH5細胞は、
尿毒症ラットモデルの体液区画からの尿素を効率的に低
下した。尿素減少は、マイクロカプセル封入が消化管に
おいて微生物を保護するので、マイクロカプセル封入工
程によって改善された。カプセル封入バクテリアは、最
初の48時間で全血漿尿素の36.34±4.70％を、２日目に
は血漿尿素の80.49±2.96％を減少できた。同様の条件
下で、同じバクテリアは、血漿アンモニアを48時間の治
療で519±51.26μM/Lから144.00±24.70μM/Lに低下で
きた。バクテリア細胞は、アンモニアを製造せず、この
細胞の代謝性窒素として尿素を使用する。本発明は、こ
の新しいアプローチが、尿素及びアンモニア除去に対し
て通常のオキシスターチ及びウレアーゼリン酸ジルコニ
ウムのアプローチよりも数百倍以上の効果があることを
示す。従って、本発明は、実験尿毒症ラットにおける尿
素及びアンモニア尿毒症の除去に対する、マイクロカプ
セル封入遺伝子操作バクテリア大腸菌DH5細胞の経口給
餌の初期治療の可能性を示す。本発明は、また、将来の
臨床用の遺伝子操作細胞の他のタイプを含む経口マイク
ロカプセルの発展に対する基礎を提供する。
尿毒症ラットモデルの体液区画からの尿素を効率的に低
下した。尿素減少は、マイクロカプセル封入が消化管に
おいて微生物を保護するので、マイクロカプセル封入工
程によって改善された。カプセル封入バクテリアは、最
初の48時間で全血漿尿素の36.34±4.70％を、２日目に
は血漿尿素の80.49±2.96％を減少できた。同様の条件
下で、同じバクテリアは、血漿アンモニアを48時間の治
療で519±51.26μM/Lから144.00±24.70μM/Lに低下で
きた。バクテリア細胞は、アンモニアを製造せず、この
細胞の代謝性窒素として尿素を使用する。本発明は、こ
の新しいアプローチが、尿素及びアンモニア除去に対し
て通常のオキシスターチ及びウレアーゼリン酸ジルコニ
ウムのアプローチよりも数百倍以上の効果があることを
示す。従って、本発明は、実験尿毒症ラットにおける尿
素及びアンモニア尿毒症の除去に対する、マイクロカプ
セル封入遺伝子操作バクテリア大腸菌DH5細胞の経口給
餌の初期治療の可能性を示す。本発明は、また、将来の
臨床用の遺伝子操作細胞の他のタイプを含む経口マイク
ロカプセルの発展に対する基礎を提供する。
本発明が、それ自身特別な態様について記述されてい
るが、更に修飾でき、この出願は、一般にこの発明の原
理に従い、及び本発明が関係する技術における公知又は
慣習的な経験からくるものとして、及びここで前述した
重要な特徴に適用され、従属請求項の範囲に従って、こ
の開示から出発するものを含む、いかなる改変、使用、
用途をもカバーするものである。
るが、更に修飾でき、この出願は、一般にこの発明の原
理に従い、及び本発明が関係する技術における公知又は
慣習的な経験からくるものとして、及びここで前述した
重要な特徴に適用され、従属請求項の範囲に従って、こ
の開示から出発するものを含む、いかなる改変、使用、
用途をもカバーするものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｐ 39/02 Ａ６１Ｐ 39/02 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 ＢＩＯＭＡＴ．，ＡＲＴ．ＣＥＬＬＳ ＆ ＩＭＭＯＢ．ＢＩＯＴＥＣＨ．, Ｖｏｌ．21，Ｎｏ．５（1993）Ｐ．629 −636 ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ａｎｄ ＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ，Ｖｏ ｌ．46（1995）Ｐ．621−626 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 35/74 ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ)
Claims (5)
- 【請求項１】疾病により生ずる望ましくない化学物質を
患者の体から除去するために該患者に経口投与する組成
物において、ナイロン、シリコンゴム、ナイロン−ポリ
エチレンイミン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、キトサ
ン−アルギン酸塩、硫酸セルロース−ポリ（ジメチルジ
アリル）−アンモニウムクロライド、ヒドロキシエチル
メタクリレートメチルメタクリレート、キトサン−カル
ボキシメチル−セルロース及びアルギン酸塩−ポリリジ
ン−アルギン酸塩からなる群から選ばれた材料によって
担持され又はマイクロカプセルに封入された遺伝子操作
大腸菌DH5微生物と、前記患者に経口投与するための医
薬上許容できる担体とを含み、前記担持され又はマイク
ロカプセルに封入された遺伝子操作大腸菌DH5微生物
が、前記望ましくない化学物質を除去でき；及び前記望
ましくない化学物質の除去が、望ましくない化学物質の
濃度を治療的に許容されるレベルまで低下することを特
徴とする組成物。 - 【請求項２】前記望ましくない化学物質が、尿素及び／
又はアンモニアである、請求項１に記載の組成物。 - 【請求項３】前記疾病が、腎不全を引き起こす疾病であ
る、請求項２に記載の組成物。 - 【請求項４】前記疾病が、肝不全を引き起こす疾病であ
る、請求項２に記載の組成物。 - 【請求項５】前記疾病が、高いアンモニアレベルを伴う
高アンモニア血症である、請求項２に記載の組成物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9601333.9 | 1996-01-23 | ||
| GBGB9601333.9A GB9601333D0 (en) | 1996-01-23 | 1996-01-23 | Microencapsulated genetically engineered microorganisms for clinical application |
| PCT/CA1997/000040 WO1997026903A1 (en) | 1996-01-23 | 1997-01-20 | Microencapsulated genetically engineered microorganisms for clinical application |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11502875A JPH11502875A (ja) | 1999-03-09 |
| JP3228941B2 true JP3228941B2 (ja) | 2001-11-12 |
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ID=10787433
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP52637197A Expired - Fee Related JP3228941B2 (ja) | 1996-01-23 | 1997-01-20 | 臨床用のマイクロカプセル封入遺伝子操作微生物 |
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| EP (1) | EP0876151A1 (ja) |
| JP (1) | JP3228941B2 (ja) |
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| WO2000065030A2 (en) * | 1999-04-28 | 2000-11-02 | Mcgill University | Microencapsulated genetically engineered e. coli dh 5 cells for the removal of undesired electrolytes and/or metabolites |
| US6706287B2 (en) * | 2001-05-15 | 2004-03-16 | Kibow Biotech Inc. | Prebiotic and probiotic compositions and methods for their use in gut-based therapies |
| US20040014704A1 (en) * | 2002-07-18 | 2004-01-22 | Gonzalo Hortelano | Oral administration of therapeutic agent coupled to transporting agent induces tolerance |
| US20040014698A1 (en) * | 2002-07-18 | 2004-01-22 | Gonzalo Hortelano | Oral administration of therapeutic agent coupled to transporting agent |
| US20040016013A1 (en) * | 2002-07-18 | 2004-01-22 | Gonzalo Hortelano | Transgenic animals produced using oral administration of a genetic agent coupled to a transporting agent |
| CA2517245C (en) * | 2003-02-28 | 2009-01-20 | Mcgill University | Cell and enzyme compositions for modulating bile acids, cholesterol and triglycerides |
| US7198785B2 (en) * | 2003-12-09 | 2007-04-03 | Brown University | Systems and methods related to degradation of uremic toxins |
| US20050208032A1 (en) * | 2004-01-16 | 2005-09-22 | Gonzalo Hortelano | Oral administration of therapeutic agent coupled to transporting agent |
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| US8715221B2 (en) * | 2006-03-08 | 2014-05-06 | Fresenius Medical Care Holdings, Inc. | Wearable kidney |
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| CN102475691B (zh) * | 2010-11-30 | 2014-04-16 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 海藻酸盐-壳聚糖酰基衍生物微胶囊及其制备和应用 |
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Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4391909A (en) * | 1979-03-28 | 1983-07-05 | Damon Corporation | Microcapsules containing viable tissue cells |
| US5286495A (en) * | 1992-05-11 | 1994-02-15 | University Of Florida | Process for microencapsulating cells |
-
1996
- 1996-01-23 GB GBGB9601333.9A patent/GB9601333D0/en active Pending
-
1997
- 1997-01-20 JP JP52637197A patent/JP3228941B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-01-20 WO PCT/CA1997/000040 patent/WO1997026903A1/en not_active Application Discontinuation
- 1997-01-20 EP EP97900520A patent/EP0876151A1/en not_active Ceased
- 1997-07-20 US US09/117,099 patent/US6217859B1/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ＢＩＯＭＡＴ．，ＡＲＴ．ＣＥＬＬＳ ＆ ＩＭＭＯＢ．ＢＩＯＴＥＣＨ．，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．５（１９９３）Ｐ．６２９−６３６ |
| ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ａｎｄ ＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ，Ｖｏｌ．４６（１９９５）Ｐ．６２１−６２６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1997026903A1 (en) | 1997-07-31 |
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| EP0876151A1 (en) | 1998-11-11 |
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