CN112426537A - 一种多肽纳米胶束及其制备方法和应用 - Google Patents

一种多肽纳米胶束及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种癌症治疗性多肽纳米胶束，所述多肽能够抑制肿瘤细胞的增殖，所述多肽纳米胶束是由聚乙二醇化磷脂(PEG‑PE)和多肽自组装形成，所述的聚乙二醇化磷脂为聚乙二醇通过共价键和磷脂分子上的含氮碱基结合形成的化合物。具体而言，本发明涉及一种利用PEG‑PE胶束提高多肽生物利用度的方法，并提供了多肽‑PEG‑PE纳米胶束的制备方法和在抑制恶性肿瘤细胞增殖的应用。PEG‑PE和多肽形成的纳米胶束在含血清溶液中具有较好的稳定性，与游离多肽相比，表现出更强的抑制肿瘤细胞增殖的的特性。本发明的多肽‑PEG‑PE纳米胶束为抑制肿瘤细胞增殖和治疗癌症提供可行的方法和技术。

Description

一种多肽纳米胶束及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体而言，涉及一种多肽纳米胶束，及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是目前全球发病和死亡的主要原因，探索与癌症发生、发展及治疗相关的分子标志物具有重要的意义。组蛋白甲基转移酶Zeste同源蛋白2增强子(enhancer of zestehomolog 2，EZH2)是多梳抑制复合体2(PRC2)的酶催化亚基，可通过对核小体组蛋白H3的27位赖氨酸(H3K27)进行甲基化修饰，进而导致下游靶基因的沉默，在细胞凋亡、细胞周期及细胞分化等重要生物学过程中发挥重要作用。现有研究表明EZH2在癌症中高表达，作为表观遗传修饰因子，影响癌细胞的增殖、转移及耐药等生物学行为，在癌症进展中发挥重要的调控作用。因此，发展EZH2的拮抗剂对抑制肿瘤细胞的增殖、提高癌症的治疗效果具有重要的意义。
由于多肽易于设计合成、在人体内易于代谢并且不会带来毒副作用和严重的免疫反应，因此开发EZH2的多肽拮抗剂为癌症治疗提供了新的有效手段和策略。然而，多肽药物通常存在口服给药生物活性低、易降解和体内半衰期短等问题，导致其临床应用受到极大限制，亟需开发新的制剂和改进工艺来改善多肽药物的体内外稳定性，这对于发展多肽药物的临床应用、治疗癌症具有重要的临床意义。
为了提高多肽药物的稳定性和生物利用度，迄今为止人们进行了许多载体方面的研究。例如：利用脂质体包载亲水性或亲脂性多肽虽然能够控制多肽循环的稳定性和生物分布，但是单位质量脂质体中可包载的多肽量通常较低，药物的生物利用度难以达到期望值。利用生物相容性可降解材料(例如聚乳酸或乳酸-乙醇酸共聚物)包裹多肽分子，制成微球制剂，通过高分子材料的降解来控制药物释放，维持有效的血药浓度。但多数微球制剂都存在药物突释及随后的低释现象，会造成血药浓度过高或者过低，此外，微球制剂在生产过程中也容易造成多肽的降解。因此，需要开发新的载体系统来提高多肽的包载量及维持释放期间的有效血药浓度。
聚合物胶束是一类受到广泛关注的新型药物载体，是由两亲性嵌段聚合物在合适的浓度和温度条件下自组装形成的的核-壳结构体系。聚合物型胶束制备工艺简单，生物相容性好，不仅可以有效解决某些药物水溶性差、体循环中降解较快、药物吸收困难及毒副作用大等问题，还能通过渗透滞留增强效应(EPR)实现其在肿瘤病灶区域的富集。聚合物胶束载药体系的疏水核及核壳层能够对水溶性较低的多肽或两亲性多肽具有较高的包载能力，胶束载体的亲水冠能保护多肽不受蛋白酶的降解，增加多肽的体内外稳定性；此外，聚合物胶束具有较好的生物相容性，多肽被胶束化后能够提高其在循环系统中的稳定时间，增加多肽的生物利用度。
发明内容
因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种多肽纳米胶束，及其制备方法和应用。
在阐述本发明内容之前，定义本文中所使用的术语如下：
术语“Biotin”是指：生物素。
术语“FITC”是指：异硫氰酸荧光素。
术语“PEG-PE”是指：聚乙二醇化磷脂。
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种多肽纳米胶束，所述多肽纳米胶束由聚乙二醇化磷脂和癌症靶向性多肽自组装形成，且所述癌症靶向性多肽是能够与过表达EZH2的癌症细胞或癌症组织靶向结合的多肽。
根据本发明第一方面的多肽纳米胶束，其中，所述癌症靶向性多肽选自以下一种或多种：以极性氨基酸为主的多肽、以疏水氨基酸为主的多肽、兼有极性氨基酸和疏水性氨基酸的多肽；
优选地，所述症靶向性多肽由5～100个、更优选为10～50个、进一步优选为30～40个氨基酸组成；
更优选地，所述癌症靶向性多肽为EZH2多肽；
进一步优选地，所述EZH2多肽的氨基酸序列为GRANSDCQTPIDDDPNRRPPRNVRYGRKKRRQRRR或RANSDALAPYIPDDPNIRPPRNVRYGRKKRRQRRR。
根据本发明第一方面的多肽纳米胶束，其中，所述EZH2多肽的N端通过探针或纳米材料标记；
优选地，标记所述EZH2多肽的探针选自以下一种或多种：生物素、荧光分子、量子点、放射性元素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶；和/或标记所述EZH2多肽的纳米材料选自以下一种或多种：纳米颗粒、纳米管、纳米线、石墨烯、二维纳米材料、荧光微球；
更优选地，所述EZH2多肽的N端通过生物素或异硫氰酸荧光素标记。
根据本发明第一方面的多肽纳米胶束，其中，
根据本发明第一方面的多肽纳米胶束，其中，所述聚乙二醇化磷脂分子中的聚乙二醇亲水嵌段的分子量为500～10000，优选为1500～5000，更优选为2000～3000；和/或
所述多肽纳米胶束的粒径为10-100nm；进一步优选为10-50nm；更优选为15-30nm。
根据本发明第一方面的多肽纳米胶束，其中，所述聚乙二醇化磷脂和所述癌症靶向性多肽的摩尔比为5～20:1；和/或
所述癌症靶向性多肽与PEG-PE的结合方式为物理结合。
本发明的第二方面提供了第一方面所述的多肽纳米胶束的制备方法，该制备方法可以包括以下步骤：
(1)分别制备聚乙二醇化磷脂分子溶液和多肽分子溶液；
(2)将步骤(1)制备的聚乙二醇化磷脂分子溶液和多肽分子溶液混匀、孵育、静置，获得所述多肽纳米胶束溶液。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，步骤(1)中，制备所述聚乙二醇化磷脂分子溶液和所述多肽分子溶液的溶剂选自以下一种或多种：磷酸盐缓冲液、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液、生理盐水、无菌超纯水；优选为磷酸盐缓冲液和/或无菌超纯水；
所述聚乙二醇化磷脂分子溶液浓度为1～20mM，优选为5～15mM，最优选为10mM；和/或
所述多肽分子溶液浓度为0.1～5mM，优选为0.5～5mM，最优选为1mM。根据本发明第二方面的制备方法，其中，步骤(2)中，所述孵育温度为20～60℃，孵育时间为10～60min；优选地，所述孵育温度为40～55℃，孵育时间为20～30min；和/或
所述静置为室温静置2～24小时。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，所述方法进一步包括以下步骤：
(3)将步骤(2)静置后所得多肽纳米胶束溶液除菌；
优选地，所述除菌为将静置后所得多肽纳米胶束溶液用0.22μm滤膜过滤。
本发明的第三方面提供了第一方面所述多肽纳米胶束或按照第二方面所述方法制备的多肽纳米胶束在制备用于治疗癌症的药物中的应用；
优选地，所述治疗癌症的药物为抑制癌症增殖药物；
更优选地，所述治疗癌症的药物为抑制与表达或过量表达EZH2的癌症细胞或癌症组织相关的癌症药物；
再优选地，所述癌症选自以下一种或多种：小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌或胃癌；
进一步优选地，所述癌症为小细胞肺癌或非小细胞肺癌。
为解决上述技术问题，本发明提供一种多肽纳米胶束及其制备方法和应用，所述多肽纳米胶束由聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和癌症靶向性多肽自组装形成，该PEG-PE纳米胶束提高了癌症靶向性多肽在含血清溶液中的生物稳定性，提高了多肽和靶点的结合效率而发挥抗癌症作用，具有抑制癌细胞增殖的作用。
本发明采用如下技术方案：
一种多肽纳米胶束，由聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和癌症靶向性多肽自组装形成，所述癌症靶向性多肽是能够与表达或过量表达EZH2的癌症细胞或癌症组织靶向结合的多肽。
上述多肽纳米胶束，其中：
所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)为聚乙二醇(亲水嵌段)通过共价键和磷脂分子(疏水嵌段)上的含氮碱基结合形成的化合物。
优选地，所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子中的聚乙二醇亲水嵌段的分子量为500～10000，进一步优选为1500～5000，更优选为2000～3000；最优选为2000。
优选地，所述多肽纳米胶束的粒径为10-100nm；进一步优选为10-50nm；更优选为15-30nm。
优选地，所述癌症靶向性多肽选自以极性氨基酸为主、以疏水氨基酸为主、或者兼有极性氨基酸和疏水性氨基酸的多肽中的一种或几种。
优选地，所述癌症靶向性多肽由5～100个氨基酸组成，进一步优选为10～50个氨基酸，更优选为30～40个氨基酸。
优选地，所述癌症靶向性多肽为EZH2-10-3、EZH2-10-10多肽或荧光探针(例如fluorescein isothiocyanate，FITC，异硫氰酸荧光素)标记的EZH2-10-3、EZH2-10-10多肽。
所述EZH2多肽由35个氨基酸组成。本发明发现，该EZH2靶向多肽能与高表达EZH2的肿瘤细胞结合，进而抑制肿瘤细胞的活性。
具体地，所述EZH2多肽的氨基酸序列：
EZH2-10-3:GRANSDCQTPIDDDPNRRPPRNVRYGRKKRRQRRR；
EZH2-10-10:RANSDALAPYIPDDPNIRPPRNVRYGRKKRRQRRR；
所述Biotin或FITC标记的EZH2多肽的氨基酸序列：
EZH2-10-3:Biotin-GRANSDCQTPIDDDPNRRPPRNVRYGRKKRRQRRR；
EZH2-10-10:Biotin-RANSDALAPYIPDDPNIRPPRNVRYGRKKRRQRRR；
FITC-EZH2-10-3:FITC-GRANSDCQTPIDDDPNRRPPRNVRYGRKKRRQRRR；
FITC-EZH2-10-10:FITC-RANSDALAPYIPDDPNIRPPRNVRYGRKKRRQRRR；
所述EZH2多肽或FITC标记的EZH2多肽可按现有常规技术人工合成，也可外购商品化产品，例如由安徽省国平药业有限公司合成的EZH2多肽或FITC标记的EZH2多肽，纯度为98％以上。
优选地，所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和所述癌症靶向性多肽的摩尔比为5～20:1，例如可以是20:1、10:1或5:1。
优选地，所述癌症靶向性多肽与PEG-PE的结合方式为物理结合。
优选地，所述多肽纳米胶束为溶液形式或冻干形式。
本发明还提供上述多肽纳米胶束的制备方法，包括如下步骤：
分别制备PEG-PE分子溶液和多肽分子溶液；将PEG-PE分子溶液和多肽分子溶液混匀、孵育、静置，获得多肽-PEG-PE纳米胶束溶液。
上述多肽纳米胶束的制备方法，其中：
优选地，制备PEG-PE分子溶液和多肽分子溶液的溶剂为磷酸盐缓冲液(即PBS溶液)、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液、生理盐水或无菌超纯水中的任意一种；更优选为无菌超纯水配制PEG-PE分子溶液，PBS溶液制备多肽分子溶液；
优选地，将上述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子配制成10mM溶液；将上述癌症靶向性多肽分子配制成1mM溶液；
优选地，所述混匀是将所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子溶液加入到所述癌症靶向性多肽分子溶液中，充分混匀，得混合溶液；
优选地，所述混合溶液中聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子和癌症靶向性多肽分子的摩尔比为5～20:1，例如可以是20:1、10:1或5:1；
优选地，所述孵育温度为20～60℃，孵育时间为10～60min；进一步优选地，所述孵育温度为40～55℃，孵育时间为20～30min；
优选地，所述静置为室温(一般15-25℃)静置2～24小时。
具体地，上述多肽纳米胶束的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制溶液：将上述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子用无菌超纯水配制成10mM溶液；将上述癌症靶向性多肽分子用磷酸盐缓冲液配制成1mM溶液；
(2)混匀：将所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子溶液加入到所述癌症靶向性多肽分子溶液中，充分混匀，得混合溶液；
(3)孵育：将步骤(2)中所得混合溶液于20～60℃水浴孵育10～60min；
优选地，所述孵育温度为40～55℃，孵育时间为20～30min。
(4)静置；优选地，所述静置为室温(一般15-25℃)静置2～24小时；获得多肽-PEG-PE纳米胶束溶液。
优选地，上述多肽纳米胶束的制备方法还进一步包括将静置后所得多肽-PEG-PE纳米胶束溶液除菌的步骤，进一步优选地，所述除菌为将步骤(4)静置后所得多肽-PEG-PE纳米胶束溶液用0.22μm滤膜过滤。
本发明所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)可由现有常规技术制备。
本发明还包括上述多肽纳米胶束以及上述制备方法所制备的多肽纳米胶束在制备治疗癌症药物中的应用；优选地，在制备抑制癌症增殖药物中的应用；进一步优选地，在制备抑制与高表达EZH2的癌症细胞或癌症组织相关的癌症转移药物中的应用。
优选地，所述与高表达EZH2的癌症细胞或癌症组织相关的癌症包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌或胃癌中的任意一种；进一步优选地，为小细胞肺癌或非小细胞肺癌。
本发明的多肽纳米胶束可以具有但不限于以下有益效果：
本发明所述多肽纳米胶束(即多肽-PEG-PE纳米胶束)具有提高多肽在含血清溶液中的生物稳定性以及入胞效率；提高了多肽和靶蛋白的结合效率。本发明多肽-PEG-PE纳米胶束在PBS溶液中得到了很好的分散，粒径均在30nm左右；与单独的多肽相比，所得到的多肽-PEG-PE纳米胶束具有更强的抑制癌细胞增殖的作用。该多肽及多肽-PEG-PE纳米胶束可以为抑制癌细胞增殖和治疗癌症提供可行的方法和技术。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了试验例1中PEG-PE胶束对多肽的包载效率及纳米胶束在PBS溶液中的动态光散射粒径分析；其中图1(a)为PEG-PE胶束对多肽EZH2-10-3及EZH2-10-10的包载效率；图1(b)、图1(c)、图1(d)分别为PEG-PE空胶束、M-EZH2-10-3纳米胶束和M-EZH2-10-10纳米胶束在PBS溶液中的动态光散射粒径分析。
图2示出了试验例1中纳米胶束的透射电镜图片；其中，图2(a)、图2(b)、图2(c)分别为PEG-PE空胶束、M-EZH2-10-3纳米胶束和M-EZH2-10-10纳米胶束透射电镜图片。
图3示出了试验例2中游离多肽FITC-EZH2-10-3和实施例3M-FITC-EZH2-10-3纳米胶束与H446细胞的亲和力检测。
图4示出了试验例3中游离多肽FITC-EZH2-10-3和实施例3M-FITC-EZH2-10-3纳米胶束与A549细胞的亲和力检测。
图5示出了试验例4中实施例1M-FITC-EZH2-10-3纳米胶束和游离的EZH2-10-3多肽对H446肿瘤细胞的生长抑制作用结果图。
图6示出了试验例5中实施例1M-FITC-EZH2-10-3纳米胶束和游离的EZH2-10-3多肽对A549肿瘤细胞的生长抑制作用结果图。
图7示出了试验例6中实施例2M-FITC-EZH2-10-10纳米胶束和游离的EZH2-10-10多肽对H446肿瘤细胞的生长抑制作用结果图。
图8示出了试验例7中实施例2M-FITC-EZH2-10-10纳米胶束和游离的EZH2-10-10多肽对A549肿瘤细胞的生长抑制作用结果图。
图9示出了试验例8中本发明游离多肽EZH2-10-3和实施例1中M-EZH2-10-3纳米胶束对H446皮下移植瘤的生长抑制作用结果图。
图10示出了试验例9中本发明游离多肽EZH2-10-3和实施例1中M-EZH2-10-3纳米胶束对A549皮下移植瘤的生长抑制作用结果图。
图11示出了试验例10中本发明游离多肽EZH2-10-10和实施例2中M-EZH2-10-10纳米胶束对H446皮下移植瘤的生长抑制作用结果图。
图12示出了试验例11中本发明游离多肽EZH2-10-10和实施例2中M-EZH2-10-10纳米胶束对A549皮下移植瘤的生长抑制作用结果图。
图13示出了试验例12中注射荷瘤H446裸鼠后其体重变化曲线图；其中，图13(a)和图13(b)分别为本发明游离多肽及纳米胶束注射荷瘤H446裸鼠后其体重变化曲线。
图14示出了试验例13中注射荷瘤H446裸鼠后其体重变化曲线图；其中，图14(a)和图14(b)分别为本发明游离多肽及纳米胶束注射荷瘤A549裸鼠后其体重变化曲线。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
除非特别指明，以下实施例中所用的人小细胞肺癌细胞系H446和非小细胞肺癌细胞系A549均购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。
除非特别指明，以下实施例中所用水溶液的溶剂均为无菌超纯水溶液。
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯试剂。
除非特别指明，以下实施例中所用的PBS溶液均为1×PBS溶液。
以下实施例中使用的试剂购买来源和仪器型号分别如下：
试剂购买来源：
PBS缓冲液、1640培养基、胎牛血清、双抗均购自Thermo Fisher Scientific；
CCK8试剂检测试剂盒购自Sigma；
PEG-PE购自Corden Pharma Switzerland LLC。
仪器型号：
纯水仪(德国Merck Millipore，型号Milli-Q Integral3)；
离心机(北京雷勃尔离心机有限公司，型号LD5-2A)；
多功能酶标仪(美国Molecular Devices，型号SpectraMax i3)
EZH2靶向多肽的合成：
EZH2靶向多肽的氨基酸序列：
EZH2-10-3:GRANSDCQTPIDDDPNRRPPRNVRYGRKKRRQRRR；
EZH2-10-10:RANSDALAPYIPDDPNIRPPRNVRYGRKKRRQRRR；
所述Biotin或FITC标记的EZH2多肽的氨基酸序列：
EZH2-10-3:Biotin-GRANSDCQTPIDDDPNRRPPRNVRYGRKKRRQRRR；
EZH2-10-10:Biotin-RANSDALAPYIPDDPNIRPPRNVRYGRKKRRQRRR；
FITC-EZH2-10-3:FITC-GRANSDCQTPIDDDPNRRPPRNVRYGRKKRRQRRR；
FITC-EZH2-10-10:FITC-RANSDALAPYIPDDPNIRPPRNVRYGRKKRRQRRR；
上述按照设计的序列合成多肽(由安徽省国平药业有限公司合成，纯度为98％)，在实验前制成合适浓度的母液。
多肽的溶解：用PBS溶解多肽粉末至浓度为1mM的母液，保证多肽充分溶解，置于-20℃保存备用或现配现用。
实施例1
本实施例用于说明本发明多肽纳米胶束及其制备方法。
一种多肽纳米胶束，由聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和Biotin标记的EZH2-10-3多肽自组装形成，其中，所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子中的聚乙二醇亲水嵌段的分子量为2000，聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和EZH2-10-3多肽的摩尔比为20:1，该多肽纳米胶束的粒径为10-30nm。
本实施例多肽纳米胶束的制备方法包括以下步骤：将Biotin标记的EZH2-10-3多肽分子用无菌PBS配制成1mM溶液，将PEG-PE分子用无菌超纯水配制成10mM溶液，取一定量的PEG-PE分子水溶液加入到EZH2靶向多肽水溶液中，使混合溶液中PEG-PE分子与EZH2靶向多肽分子的摩尔比为20:1；孵育：将所得混合溶液于55℃水浴孵育30min；静置：室温(25℃)静置2小时，得到多肽纳米胶束溶液。
实施例2
本实施例用于说明本发明多肽纳米胶束及其制备方法。
一种多肽纳米胶束，由聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和Biotin标记的EZH2-10-10多肽自组装形成，其中，所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子中的聚乙二醇亲水嵌段的分子量为2000，聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和EZH2-10-10多肽的摩尔比为20:1，该多肽纳米胶束的粒径为10-30nm。
本实施例多肽纳米胶束的制备方法与实施例1的区别仅在于Biotin标记的EZH2-10-3多肽替换为Biotin标记的EZH2-10-10。
实施例3
本实施例用于说明本发明多肽纳米胶束及其制备方法。
一种多肽纳米胶束，由聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和FITC标记的EZH2-10-3多肽自组装形成，其中，所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子中的聚乙二醇亲水嵌段的分子量为2000，聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和EZH2-10-3多肽的摩尔比为20:1，该多肽纳米胶束的粒径为10-30nm。
本实施例多肽纳米胶束的制备方法与实施例1的区别仅在于Biotin标记的EZH2-10-3多肽替换为FITC标记的EZH2-10-3。
实施例4
本实施例用于说明本发明多肽纳米胶束及其制备方法。
一种多肽纳米胶束，由聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和FITC标记的EZH2-10-3多肽自组装形成，其中，所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子中的聚乙二醇亲水嵌段的分子量为2000，聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和EZH2-10-3多肽的摩尔比为10:1，该多肽纳米胶束的粒径为10-30nm。
实施例5
本实施例用于说明本发明多肽纳米胶束及其制备方法。
一种多肽纳米胶束，由聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和FITC标记的EZH2-10-3多肽自组装形成，其中，所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子中的聚乙二醇亲水嵌段的分子量为2000，聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和EZH2-10-3多肽的摩尔比为5:1，该多肽纳米胶束的粒径为10-30nm。
实施例6
本实施例用于说明本发明多肽纳米胶束及其制备方法。
一种多肽纳米胶束，由聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和FITC标记的EZH2-10-10多肽自组装形成，其中，所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子中的聚乙二醇亲水嵌段的分子量为2000，聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和EZH2-10-10多肽的摩尔比为20:1，该多肽纳米胶束的粒径为10-30nm。
实施例7
本实施例用于说明本发明多肽纳米胶束及其制备方法。
一种多肽纳米胶束，由聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和FITC标记的EZH2-10-10多肽自组装形成，其中，所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子中的聚乙二醇亲水嵌段的分子量为2000，聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和EZH2-10-10多肽的摩尔比为10:1，该多肽纳米胶束的粒径为10-30nm。
实施例8
本实施例用于说明本发明多肽纳米胶束及其制备方法。
一种多肽纳米胶束，由聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和FITC标记的EZH2-10-10多肽自组装形成，其中，所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子中的聚乙二醇亲水嵌段的分子量为2000，聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和EZH2-10-10多肽的摩尔比为5:1，该多肽纳米胶束的粒径为10-30nm。
试验例1 PEG-PE空胶束、M-EZH2-10-3纳米胶束和M-EZH2-10-10纳米胶束的制备 及表征
用无菌的PBS缓冲液溶解多肽粉末至浓度为1mM的母液，保证多肽充分溶解，置于-20℃保存备用。用无菌水溶解PEG-PE粉末至浓度为10mM的储液，55℃水浴水化30min，室温静置过夜使其充分自组装，经0.22μm滤膜的针头过滤器过滤除菌，放置于4℃保存备用。
利用超滤及荧光法分析PEG-PE胶束对多肽的包载效率。用PBS缓冲液分别稀释FITC标记的多肽EZH2-10-3及EZH2-10-10多肽，其浓度分别为0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM及10μM，利用多功能酶标仪检测上述溶液中的荧光值，绘制两种多肽的质量-荧光值的标准曲线。将PEG-PE胶束和FITC标记的多肽的储液按照摩尔比5:1，10:1及20:1混合，55℃水浴水化30min，室温避光静置12h，形成稳定的纳米胶束。根据分子量的差别，分别将500μL的多肽纳米胶束样品M-FITC-EZH2-10-3纳米胶束(实施例3、4和5中的样品)及M-FITC-EZH2-10-10纳米胶束(实施例6、7和8中的样品)添加到100k的超滤管中，在10000rpm的转速下离心30分钟，未被包载的多肽会被分离至收集管中。收集离心管中的液体，取各组的分离液体，利用多功能酶标仪检测溶液中的荧光值。利用公式计算不同的包载率：包载效率(％)＝(1-未被包载量/完全包载量)*100％。经过计算，如图1(a)所示，摩尔比(PEG-PE:多肽)为5:1时，多肽EZH2-10-3的包载率达到92.39％，多肽EZH2-10-10的包载率达到95.6％；摩尔比(PEG-PE:多肽)为10:1时，多肽EZH2-10-3的包载率达94.89％，多肽EZH2-10-10的包载率达到97.64％；摩尔比(PEG-PE:多肽)为20:1时，多肽EZH2-10-3的包载率达到97.5％，多肽EZH2-10-10的包载率达到98.5％。结果表明PEG-PE胶束可以有效的包载靶向多肽EZH2-10-3和EZH2-10-10。
Biotin标记的EZH2-10-3多肽和Biotin标记的EZH2-10-10多肽为10μM，PEG-PE胶束浓度为200μM，分别将Biotin标记的EZH2-10-3多肽和EZH2-10-10多肽和PEG-PE溶液混匀后，40℃水浴30min，室温避光静置12h，形成稳定的PEG-PE空胶束、M-EZH2-10-3纳米胶束(实施例1中的样品)和M-EZH2-10-10(实施例2中的样品)纳米胶束。采用纯水分别稀释多肽纳米胶束和空胶束浓度至20μM，摇匀后取1mL置于1cm×1cm塑料样品池内，进行动态光散射(DLS，Zetasizer Nano ZS，Malvern，英国)测试，以PEG-PE空胶束溶液(20μM)作为空白对照，测量各样品的粒径分布情况。动态光散射反映了溶液中分子的粒径变化，如图1(b)所示，PEG-PE纯水溶液中的粒径为10-30nm；如图1(c)所示，M-EZH2-10-3纳米胶束的粒径为10-30nm；如图1(d)所示M-EZH2-10-10纳米胶束的粒径为10-30nm，说明EZH2靶向多肽和PEG-PE发生了物理结合，PEG-PE能够有效的包载靶向多肽。
Biotin标记的EZH2-10-3多肽和Biotin标记的EZH2-10-10多肽为10μM，PEG-PE胶束浓度为200μM，分别将Biotin标记的EZH2-10-3多肽和EZH2-10-10多肽和PEG-PE的溶液混匀后，40℃水浴30min，室温避光静置12h。将PEG-PE空胶束、M-EZH2-10-3纳米胶束(实施例1中的样品)和M-EZH2-10-10(实施例2中的样品)纳米胶束溶液混匀后，取10μL样品滴在经辉光放电处理后表面活化的镀碳膜铜网上，静置30min，滤纸吸干溶液，取5μL 2％醋酸双氧铀或2％磷酸钨染色液(使用之前以4000rpm的转速离心5min，除去未能完全溶解的染色液)染色60s，滤纸吸干染色液，用纯水洗3次，每次10s。用透射电子显微镜(transmissionelectron microscopy，TEM，HT7700，日立公司)观察样品，图2(a)-2(c)的样品是经2％醋酸双氧铀负染。透射电镜反映了样品的形貌和粒径大小，如图2(a)所示，PEG-PE空胶束是以球形结构存在，粒径分布较均一；如图2(b)所示，当PEG-PE胶束载入Biotin标记的EZH2-10-3多肽分子后，M-EZH2-10-3纳米胶束保持球形结构，粒径分布比较均一，粒径大小无明显变化。如图2(c)所示，当PEG-PE胶束载入Biotin标记的EZH2-10-10多肽分子后，M-EZH2-10-10纳米胶束同样保持球形结构，粒径分布均一，说明多肽能稳定地包载到PEG-PE胶束。
试验例2 H446肿瘤细胞系对游离多肽FITC-EZH2-10-3和M-FITC-EZH2-10-3纳米 胶束中的多肽摄取情况
以H446细胞系作为研究小细胞肺癌细胞系的模型体系。在康宁(Corning)24孔板中，每孔使用1mL 1640培养基(含10％胎牛血清FBS和1％青链霉素)培养1×105个细胞，将24孔板在37℃、5％CO2条件的孵箱中预培养24h，使细胞贴壁。向Corning 24孔板中每孔加入100μL FITC-EZH2-10-3和M-FITC-EZH2-10-3纳米胶束(实施例3的样品)的PBS溶液，用含10％胎牛血清的1640培养基稀释游离多肽和多肽纳米胶束使其最终浓度为10μM，PEG-PE胶束的浓度为20μM，空白对照组只加入100μL PBS溶液，将24孔细胞培养板在37℃孵箱中孵育3h。利用流式细胞仪(FCM，
Figure BDA0002780760950000131
acoustic focusing cytometer，AppliedBiosystems，Life Technologies，Carlsbad，CA)，设置发射波长488nm，检测波长535nm(1通道)。将阴性对照组细胞样品放置于仪器样品架并开始检测，根据细胞大小，在前向角信号(FSC)，侧向角信号(SSC)的散点图中设门，并在记录检测结果前设置阈值，使得荧光强度的数量统计峰图中，门中的细胞荧光强度高于阈值荧光强度以上的数量低于1％，设置完成后，计数10,000个细胞。在上述门设置以及计数条件下，依次检测空白对照组和实验组样品，记录相应的检测值，即高于阈值荧光强度的数量百分比及平均荧光强度。如图3所示，在相同的孵育条件下(含10％FBS的1640培养基)，单独的FITC-EZH2-10-3多肽与H446细胞的结合率(荧光强度)显著低于M-FITC-EZH2-10-3纳米胶束。该结果说明得益于PEG-PE能够显著增加FITC-EZH2-10-3多肽在含血清培养基中的稳定性，促进了FITC-EZH2-10-3多肽与EZH2的结合作用。
试验例3 A549肿瘤细胞系对游离多肽FITC-EZH2-10-3和M-FITC-EZH2-10-3纳米 胶束中的多肽摄取情况
以A549细胞系作为研究非小细胞肺癌细胞系的模型体系。在康宁(Corning)24孔板中，每孔使用1mL 1640培养基(含10％胎牛血清FBS和1％青链霉素)培养1×105个细胞，将24孔板在37℃、5％CO2条件的孵箱中预培养24h，使细胞贴壁。向Corning 24孔板中每孔加入100μL FITC-EZH2-10-3和M-FITC-EZH2-10-3纳米胶束(实施例3的样品)的PBS溶液，用含10％胎牛血清的1640培养基稀释游离多肽和多肽纳米胶束使其最终浓度为10μM，PEG-PE胶束的浓度为20μM，空白对照组只加入100μL PBS溶液，将24孔细胞培养板在37℃孵箱中孵育3h。利用流式细胞仪(FCM，
Figure BDA0002780760950000141
acoustic focusing cytometer，AppliedBiosystems，Life Technologies，Carlsbad，CA)，设置发射波长488nm，检测波长535nm(1通道)。将阴性对照组细胞样品放置于仪器样品架并开始检测，根据细胞大小，在前向角信号(FSC)，侧向角信号(SSC)的散点图中设门，并在记录检测结果前设置阈值，使得荧光强度的数量统计峰图中，门中的细胞荧光强度高于阈值荧光强度以上的数量低于1％，设置完成后，计数10,000个细胞。在上述门设置以及计数条件下，依次检测空白对照组和实验组样品，记录相应的检测值，即高于阈值荧光强度的数量百分比及平均荧光强度。如图4所示，在相同的孵育条件下(含10％FBS的1640培养基)，单独的FITC-EZH2-10-3多肽与A549细胞的结合率(荧光强度)显著低于M-FITC-EZH2-10-3纳米胶束。该结果说明得益于PEG-PE能够显著增加FITC-EZH2-10-3多肽在含血清培养基中的稳定性，促进了FITC-EZH2-10-3多肽与EZH2的结合作用。
试验例4 M-EZH2-10-3纳米胶束对H446肿瘤细胞的生长抑制情况
以H446作为研究EZH2高表达的人源小细胞肺癌细胞系的模型细胞。取对数生长期细胞，胰酶消化细胞，用1640完全培养基(含10％胎牛血清和1％青链霉素)将细胞稀释成8×104个细胞/mL，在96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液。将细胞置于37℃细胞培养孵箱中培养24小时待细胞完全贴壁后，向培养板孔中分别加入M-EZH2-10-3纳米胶束(实施例1中的样品)溶液200μL和游离的EZH2-10-3多肽溶液200μL(游离多肽浓度为0.1μM、1μM、2μM、5μM及10μM)，均用含10％胎牛血清的1640培养基稀释。PEG-PE的浓度为200μM，包载的多肽浓度分别为0.1μM、1μM、2μM、5μM及10μM，空白对照组只加入200μL含血清1640培养基。于37℃细胞培养孵箱中与细胞共同孵育48h后，移除上清，每孔加入110μLCCK8溶液(含有10μLCCK8检测试剂及100μL完全培养基)，放于37℃培养箱中孵育2h。用酶标仪测定在OD450 nm波长处的吸光值并计算细胞存活率。该实验结果表明，如图5所示，在H446细胞中加入不同浓度的多肽纳米胶束孵育后，与未经多肽处理的H446细胞相比，在H446细胞中加入0.1～10μM的M-EZH2-10-3纳米胶束后，随着多肽的浓度增加，H446细胞的存活率逐渐降低，而在游离的多肽EZH2-10-3的作用下H446细胞没有明显的毒性作用。说明相对于游离的EZH2-10-3，M-EZH2-10-3纳米胶束能增加游离多肽EZH2-10-3在含血清培养基中的稳定性，能显著抑制小细胞肺癌细胞系H446的生长。
试验例5 M-EZH2-10-3纳米胶束对A549肿瘤细胞的生长抑制情况
以A549作为研究EZH2高表达的人源非小细胞肺癌细胞系的模型细胞。取对数生长期细胞，胰酶消化细胞，用1640完全培养基(含10％胎牛血清和1％青链霉素)将细胞稀释成7×104个细胞/mL，在96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液。将细胞置于37℃细胞培养孵箱中培养24小时待细胞完全贴壁后，向培养板孔中分别加入M-EZH2-10-3纳米胶束(实施例1中的样品)溶液200μL和游离的EZH2-10-3多肽溶液200μL(游离多肽浓度为0.1μM、1μM、2μM、5μM及10μM)，均用含10％胎牛血清的1640培养基稀释。PEG-PE的浓度为200μM，包载的多肽浓度分别为0.1μM、1μM、2μM、5μM及10μM，空白对照组只加入200μL含血清1640培养基。于37℃细胞培养孵箱中与细胞共同孵育48h后，移除上清，每孔加入110μLCCK8溶液(含有10μLCCK8检测试剂及100μL完全培养基)，放于37℃培养箱中孵育2h。用酶标仪测定在OD450 nm波长处的吸光值并计算细胞存活率。该实验结果表明，如图6所示，在A549细胞中加入不同浓度多肽纳米胶束孵育后，与未经多肽处理的A549细胞相比，在A549细胞中加入0.1～10μM的M-EZH2-10-3纳米胶束后，随着多肽的浓度增加，A549细胞的存活率逐渐降低，而在游离的多肽EZH2-10-3的作用下A549细胞没有明显的毒性作用。说明相对于游离的EZH2-10-3，M-EZH2-10-3纳米胶束能增强游离多肽EZH2-10-3在含血清培养基中的稳定性，能显著抑制非小细胞肺癌细胞系A549的生长。
试验例6 M-EZH2-10-10纳米胶束对H446肿瘤细胞的生长抑制情况
以H446作为研究EZH2高表达的人源小细胞肺癌细胞系的模型细胞。取对数生长期细胞，胰酶消化细胞，用1640完全培养基(含10％胎牛血清和1％青链霉素)将细胞稀释成8×104个细胞/mL，在96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液。将细胞置于37℃细胞培养孵箱中培养24小时待细胞完全贴壁后，向培养板孔中分别加入M-EZH2-10-10纳米胶束(实施例2中的样品)溶液200μL和游离的EZH2-10-10多肽溶液200μL(游离多肽浓度为0.05μM、0.1μM、0.2μM、0.4μM及0.8μM)，均用含10％胎牛血清的1640培养基稀释。PEG-PE的浓度为20μM，包载的多肽浓度分别为0.05μM、0.1μM、0.2μM、0.4μM及0.8μM，空白对照组只加入200μL含血清1640培养基。于37℃细胞培养孵箱中与细胞共同孵育48h后，移除上清，每孔加入110μLCCK8溶液(含有10μLCCK8检测试剂及100μL完全培养基)，放于37℃培养箱中孵育2h。用酶标仪测定在OD450 nm波长处的吸光值并计算细胞存活率。该实验结果表明，如图7所示，在H446细胞中加入不同浓度的多肽纳米胶束孵育后，与未经多肽处理的H446细胞相比，在H446细胞中加入0.05～0.8μM的M-EZH2-10-10纳米胶束后，随着多肽的浓度增加，H446细胞的存活率逐渐降低，而在游离的多肽EZH2-10-10的作用下H446细胞没有明显的毒性作用。说明相对于游离多肽EZH2-10-10，M-EZH2-10-10纳米胶束能增强多肽EZH2-10-10在含血清培养基中的稳定性，能抑制小细胞肺癌细胞系H446的生长。
试验例7 M-EZH2-10-10纳米胶束对A549肿瘤细胞的生长抑制情况
以A549作为研究EZH2高表达的人源非小细胞肺癌细胞系的模型细胞。取对数生长期细胞，胰酶消化细胞，用1640完全培养基(含10％胎牛血清和1％青链霉素)将细胞稀释成7×104个细胞/mL，在96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液。将细胞置于37℃细胞培养孵箱中培养24小时待细胞完全贴壁后，向培养板孔中分别加入M-EZH2-10-10纳米胶束(实施例2中的样品)溶液200μL和游离的EZH2-10-10多肽溶液200μL(游离多肽浓度为0.05μM、0.1μM、0.2μM、0.4μM及0.8μM)，均用含10％胎牛血清的1640培养基稀释。PEG-PE的浓度为20μM，包载的多肽浓度分别为0.05μM、0.1μM、0.2μM、0.4μM及0.8μM，空白对照组只加入200μL含血清1640培养基。于37℃细胞培养孵箱中与细胞共同孵育48h后，移除上清，每孔加入110μLCCK8溶液(含有10μLCCK8检测试剂及100μL完全培养基)，放于37℃培养箱中孵育2h。用酶标仪测定在OD450 nm波长处的吸光值并计算细胞存活率。该实验结果表明，如图8所示，在A549细胞中加入不同浓度的多肽纳米胶束孵育后，与未经多肽处理的A549细胞相比，在A549细胞中加入0.05～0.8μM的M-EZH2-10-10纳米胶束后，随着多肽的浓度增加，A549细胞的存活率逐渐降低，而在游离的多肽EZH2-10-10的作用下A549细胞没有明显的毒性作用。说明相对于游离多肽EZH2-10-10，M-EZH2-10-10纳米胶束能增强多肽EZH2-10-10在含血清培养基中的稳定性，能显著抑制非小细胞肺癌细胞系A549的生长。
试验例8游离多肽EZH2-10-3及M-EZH2-10-3纳米胶束对H446皮下移植瘤的生长抑 制作用
取对数生长期H446小细胞肺癌细胞系，胰酶消化细胞，用1640完全培养基(含10％胎牛血清和1％青链霉素)将细胞稀释成1×107个细胞/mL，每只小鼠皮下接种2×106个细胞。当肿瘤体积生长到50mm3,开始给予EZH2-10-3及M-EZH2-10-3纳米胶束(实施例1的样品)，游离多肽的注射方式为瘤内注射，纳米胶束的注射方式为腹腔注射，多肽的剂量为30mg/kg，每天给药，连续给药17天。空白对照组为腹腔注射生理盐水。从第5天开始，每周两次用游标卡尺量老鼠肿瘤的长度(L)和宽度(D)，瘤体积＝1/2*L*D2。如图9所示，相比于空白对照组，游离多肽EZH2-10-3及M-EZH2-10-3纳米胶束均能抑制H446荷瘤裸鼠的肿瘤生长，其中M-EZH2-10-3纳米胶束对抑制肿瘤体积的增殖具有更显著的效果。
试验例9游离多肽EZH2-10-3及M-EZH2-10-3纳米胶束对A549皮下移植瘤的生长抑 制作用
取对数生长期A549细胞，胰酶消化细胞，用1640完全培养基(含10％胎牛血清和1％青链霉素)将细胞稀释成1×107个细胞/mL，每只小鼠皮下接种2×106个细胞。当肿瘤体积生长到50mm3,开始给予EZH2-10-3及M-EZH2-10-3纳米胶束(实施例1的样品)，游离多肽的注射方式为瘤内注射，纳米胶束的注射方式为腹腔注射，多肽的剂量为30mg/kg，每天给药，连续给药21天。空白对照组为腹腔注射生理盐水。从第8天开始，每周两次用游标卡尺量老鼠肿瘤的长度(L)和宽度(D)，瘤体积＝1/2*L*D2。如图10所示，相比于空白对照组，游离多肽EZH2-10-3及M-EZH2-10-3纳米胶束均能抑制A549荷瘤裸鼠的肿瘤生长，其中M-EZH2-10-3纳米胶束对抑制肿瘤体积的增殖具有更显著的效果。
试验例10游离多肽EZH2-10-10及M-EZH2-10-10纳米胶束对H446皮下移植瘤的生 长抑制作用
取对数生长期H446小细胞肺癌细胞系，胰酶消化细胞，用1640完全培养基(含10％胎牛血清和1％青链霉素)将细胞稀释成1×107个细胞/mL，每只小鼠皮下接种2×106个细胞。当肿瘤体积生长到50mm3,开始给予EZH2-10-10及M-EZH2-10-10纳米胶束(实施例2中的样品)，游离多肽的注射方式为瘤内注射，纳米胶束的注射方式为腹腔注射，多肽的剂量为30mg/kg，每天给药，连续给药17天。空白对照组为腹腔注射生理盐水。从第5天开始，每周两次用游标卡尺量老鼠肿瘤的长度(L)和宽度(D)，瘤体积＝1/2*L*D2。如图11所示，相比于空白对照组，游离多肽EZH2-10-10及M-EZH2-10-10纳米胶束均能抑制H446荷瘤裸鼠的肿瘤生长，其中M-EZH2-10-10纳米胶束对抑制肿瘤体积的增殖具有更显著的效果。
试验例11游离多肽EZH2-10-10及M-EZH2-10-10纳米胶束对A549皮下移植瘤的生 长抑制作用
取对数生长期A549非小细胞肺癌细胞系，胰酶消化细胞，用1640完全培养基(含10％胎牛血清和1％青链霉素)将细胞稀释成1×107个细胞/mL，每只小鼠皮下接种2×106个细胞。当肿瘤体积生长到50mm3,开始给予EZH2-10-10及M-EZH2-10-10纳米胶束(实施例2的样品)，游离多肽的注射方式为瘤内注射，纳米胶束的注射方式为腹腔注射，多肽的剂量为30mg/kg，每天给药，连续给药21天。空白对照组为腹腔注射生理盐水。从第8天开始，每周两次用游标卡尺量老鼠肿瘤的长度(L)和宽度(D)，瘤体积＝1/2*L*D2。如图12所示，相比于空白对照组，游离多肽EZH2-10-10及M-EZH2-10-10纳米胶束均能抑制A549荷瘤裸鼠的肿瘤生长，其中M-EZH2-10-10纳米胶束对抑制肿瘤体积的增殖具有更显著的效果。
试验例12 H446荷瘤裸鼠的体重变化图
取对数生长期H446细胞，胰酶消化细胞，用1640完全培养基(含10％胎牛血清和1％青链霉素)将细胞稀释成1×107个细胞/mL，每只小鼠皮下接种2×106个细胞。当肿瘤体积生长到50mm3,开始给予游离多肽EZH2-10-3及M-EZH2-10-3纳米胶束(实施例1的样品)，，游离多肽EZH2-10-10及M-EZH2-10-10纳米胶束(实施例2的样品)；游离多肽的注射方式为瘤内注射，纳米胶束的注射方式为腹腔注射，多肽的剂量为30mg/kg，每天给药，H446荷瘤小鼠连续给药17天。对照组为腹腔注射生理盐水。从第5天开始，每周两次称量老鼠体重。如图13a所示，相比于空白对照组，游离多肽EZH2-10-3及M-EZH2-10-3纳米胶束组H446荷瘤裸鼠的体重没有发生明显的变化；如图13b所示，相比于空白对照组，游离多肽EZH2-10-3及M-EZH2-10-3纳米胶束组的荷瘤裸鼠的体重同样没有发生明显的变化；该实验结果表明游离多肽及多肽纳米胶束在H446荷瘤裸鼠体内具有较好的生物相容性。
试验例13 A549荷瘤裸鼠的体重变化图
取对数生长期A549细胞，胰酶消化细胞，用1640完全培养基(含10％胎牛血清和1％青链霉素)将细胞稀释成1×107个细胞/mL，每只小鼠皮下接种2×106个细胞。当肿瘤体积生长到50mm3,开始给予游离多肽EZH2-10-3及M-EZH2-10-3纳米胶束(实施例1中的样品)，，游离多肽EZH2-10-10及M-EZH2-10-10纳米胶束(实施例2中的样品)；游离多肽的注射方式为瘤内注射，纳米胶束的注射方式为腹腔注射，多肽的剂量为30mg/kg，每天给药，连续给药21天。对照组为腹腔注射生理盐水。从第8天开始，每周两次称量老鼠体重。如图14a所示，相比于空白对照组，游离多肽EZH2-10-3及M-EZH2-10-3纳米胶束组A549荷瘤裸鼠的体重没有发生明显的变化；如图14b所示，相比于空白对照组，游离多肽EZH2-10-10及M-EZH2-10-10纳米胶束组的荷瘤裸鼠的体重同样没有发生明显的变化；该实验结果表明游离多肽及多肽纳米胶束在A549荷瘤裸鼠体内同样具有较好的生物相容性。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (10)

1.一种多肽纳米胶束，其特征在于，所述多肽纳米胶束由聚乙二醇化磷脂和癌症靶向性多肽自组装形成，且所述癌症靶向性多肽是能够与过表达EZH2的癌症细胞或癌症组织靶向结合的多肽。
2.根据权利要求1所述的多肽纳米胶束，其特征在于，所述癌症靶向性多肽选自以下一种或多种：以极性氨基酸为主的多肽、以疏水氨基酸为主的多肽、兼有极性氨基酸和疏水性氨基酸的多肽；
优选地，所述症靶向性多肽由5～100个、更优选为10～50个、进一步优选为30～40个氨基酸组成；
更优选地，所述癌症靶向性多肽为EZH2多肽；
进一步优选地，所述EZH2多肽的氨基酸序列为GRANSDCQTPIDDDPNRRPPRNVRYGRKKRRQRRR或RANSDALAPYIPDDPNIRPPRNVRYGRKKRRQRRR。
3.根据权利要求2所述的多肽纳米胶束，其特征在于，所述EZH2多肽的N端通过探针或纳米材料标记；
优选地，标记所述EZH2多肽的探针选自以下一种或多种：生物素、荧光分子、量子点、放射性元素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶；和/或标记所述EZH2多肽的纳米材料选自以下一种或多种：纳米颗粒、纳米管、纳米线、石墨烯、二维纳米材料、荧光微球；
更优选地，所述EZH2多肽的N端通过生物素或异硫氰酸荧光素标记。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽纳米胶束，其特征在于，所述聚乙二醇化磷脂分子中的聚乙二醇亲水嵌段的分子量为500～10000，优选为1500～5000，更优选为2000～3000；和/或
所述多肽纳米胶束的粒径为10-100nm；进一步优选为10-50nm；更优选为15-30nm。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽纳米胶束，其特征在于，所述聚乙二醇化磷脂和所述癌症靶向性多肽的摩尔比为5～20:1；和/或
所述癌症靶向性多肽与PEG-PE的结合方式为物理结合。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的多肽纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)分别制备聚乙二醇化磷脂分子溶液和多肽分子溶液；
(2)将步骤(1)制备的聚乙二醇化磷脂分子溶液和多肽分子溶液混匀、孵育、静置，获得所述多肽纳米胶束溶液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，制备所述聚乙二醇化磷脂分子溶液和所述多肽分子溶液的溶剂选自以下一种或多种：磷酸盐缓冲液、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液、生理盐水、无菌超纯水；优选为磷酸盐缓冲液和/或无菌超纯水；
所述聚乙二醇化磷脂分子溶液浓度为1～20mM，优选为5～15mM，最优选为10mM；和/或
所述多肽分子溶液浓度为0.1～5mM，优选为0.5～5mM，最优选为1mM。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述孵育温度为20～60℃，孵育时间为10～60min；优选地，所述孵育温度为40～55℃，孵育时间为20～30min；和/或
所述静置为室温静置2～24小时。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述方法进一步包括以下步骤：
(3)将步骤(2)静置后所得多肽纳米胶束溶液除菌；
优选地，所述除菌为将静置后所得多肽纳米胶束溶液用0.22μm滤膜过滤。
10.权利要求1至5中任一项所述多肽纳米胶束或按照权利要求6至9中任一项所述方法制备的多肽纳米胶束在制备用于治疗癌症的药物中的应用；
优选地，所述治疗癌症的药物为抑制癌症增殖药物；
更优选地，所述治疗癌症的药物为抑制与表达或过量表达EZH2的癌症细胞或癌症组织相关的癌症药物；
再优选地，所述癌症选自以下一种或多种：小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌或胃癌；
进一步优选地，所述癌症为小细胞肺癌或非小细胞肺癌。
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