CN112569189A - 一种同时调节肿瘤微环境和靶向杀伤肿瘤细胞的低毒仿生化纳米系统及构建方法 - Google Patents

一种同时调节肿瘤微环境和靶向杀伤肿瘤细胞的低毒仿生化纳米系统及构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明属中药制药技术领域，涉及中药有效成分的筛选及其制剂，尤其涉及一种同时调节肿瘤微环境和靶向杀伤胰腺癌细胞的低毒仿生化纳米系统及构建方法。本发明所述仿生化纳米系统LCP‑4F，粒径在15nm左右且均一稳定，在体外能高效被胰腺癌细胞摄取，并调节CAFs分泌的细胞因子，如纤连蛋白、成纤维肌动蛋白等。经体内药效实验表明，所述仿生化纳米系统能靶向并蓄积于肿瘤部位，具有良好的微环境调节和癌细胞杀伤效果；该仿生化纳米系统在调节肿瘤相关成纤维细胞过度激活的肿瘤微环境和杀伤癌细胞方面具有广大前景。

Description

一种同时调节肿瘤微环境和靶向杀伤肿瘤细胞的低毒仿生化 纳米系统及构建方法
技术领域
本发明属中药制药技术领域，涉及中药有效成分的筛选及其制剂，尤其涉及一种同时调节肿瘤微环境和靶向杀伤肿瘤细胞的低毒仿生化纳米系统及构建方法；所述肿瘤细胞尤其是胰腺癌细胞。
背景技术
现有技术公开了胰腺癌作为一种消化道恶性肿瘤，致死率高，患者的五年生存率不足6％且预后极差；其对治疗的耐受主要与免疫抑制性肿瘤微环境相关。研究显示，在肿瘤微环境中，间质细胞占了绝大多数，包括肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)、内皮细胞、周皮细胞、肿瘤相关巨噬细胞等；其中，CAFs含量最多，在胰腺癌的TME中大量异常活化，产生大量胶原纤维，分泌细胞外基质致使发生不规则沉积，形成较高的间质液压；分泌各种免疫抑制性细胞因子与肿瘤细胞相互作用，从而阻碍药物在肿瘤部位的递送，促使癌症的恶化和转移。此外，免疫抑制性M2型巨噬细胞也分泌一些免疫抑制性分子，影响肿瘤血管结构和通透性阻碍药物递送。临床实践显示，目前化疗联用方案能提高抗胰腺癌的疗效，但是肿瘤应答率仍然很低并且预后较差，因此，对于胰腺癌这种具有免疫抑制性肿瘤微环境的肿瘤来说，选用毒性较小的药物调节肿瘤微环境，抑制CAFs的异常激活，减少肿瘤细胞外基质的沉积，抑制巨噬细胞向M2型极化，联用化疗药物从而提高抗癌疗效，有较高的临床应用前景及转化价值。
有研究报道了从天然植物中提取的天然产物单体可改善肿瘤微环境、提高化疗药物的渗透与蓄积；以及，天然产物本身的溶解性较差，在体内循环的半衰期短，清除较快，无法蓄积于肿瘤部位。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种同时调节肿瘤微环境和靶向杀伤肿瘤细胞的低毒仿生化纳米系统及构建方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种同时调节肿瘤微环境和靶向杀伤肿瘤细胞的低毒仿生化纳米系统及构建方法；所述肿瘤细胞尤其是胰腺癌细胞。
本发明筛选获得天然产物大麻二酚，毒性较小，能有效的抑制但不会完全杀伤肿瘤微环境中过度激活的CAFs，减少相关细胞因子的释放，降低肿瘤间质压；同时减少巨噬细胞M2型的极化，促使肿瘤血管正常化，从而增加化疗药物的递送和在肿瘤部位的蓄积，增加化疗药物的药效。
本发明采用乳化溶媒蒸发法将疏水性天然药物包载与化疗药物包载于生物可降解的磷酸钙内核中，外层自组装包裹ApoAⅠ模拟肽可规避单核吞噬系统(Mononuclearphagocyte system,MPS)，提高药物在血液循环中的稳定性、延长循环时间，使其大量蓄积于肿瘤微环境中，发挥作用；且所述纳米系统自组装的载脂蛋白ApoAⅠ模拟肽能够靶向胰腺癌细胞，被高效的摄取进细胞内发挥作用。与传统化疗药物相比，基于磷酸钙内核的高密度脂蛋白仿生化纳米粒安全性好，细胞水平上显示该载药体统的细胞毒性较小；在动物水平上，多次给药载药纳米粒后荷瘤小鼠肾脏中没有出现明显的肾小球肿胀，说明其毒副作用较小，且生存期优于吉西他滨，能够高效低毒地发挥抗肿瘤作用，具有较高的临床应用前景及转化价值。
本发明所述的仿生化纳米系统，将筛选出的天然产物单体和化疗药物一起构建一种仿生化的纳米递送系统；即，采用反向微乳法将天然化合物和化疗药物包载于磷酸钙内核，随后通过薄膜水化法将磷脂包裹于内核外层以形成脂质体，再与ApoAⅠ模拟肽自组装形成均一稳定的仿生化纳米系统(LCP-4F)，以提高靶向肿瘤部位的效果，尤其提高对胰腺癌的疗效；
所述仿生化纳米系统，包载了具有调节肿瘤微环境作用的药物大麻二酚；
所述仿生化纳米系统，能高效包载天然化合物CBD，且可针对胰腺癌肿瘤微环境进行调节，且已被证实具有良好的生物安全性；
所述仿生化纳米系统，内层磷脂选用与多价离子具有很强络合能力的两亲性磷脂1,2-油酰磷脂酸(DOPA)，其磷酸极性头部在油水界面与磷酸钙纳米粒的钙离子络合，疏水性尾部分布在油相，在纳米粒表面形成一层疏水层以稳定纳米粒；
所述仿生化纳米系统，外层磷脂选用二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)；
所述仿生化纳米系统，载脂蛋白选用高密度脂蛋白ApoAⅠ蛋白的模拟肽，其与DMPC形成的脂质体自组装形成的高密度脂蛋白仿生结构能很好地模拟体内高密度脂蛋白的结构和功能特性，粒径较小、均一稳定，毒性较小，且在体内循环时间较长，生物相容性良好；所述ApoAⅠ模拟肽可高效靶向肿瘤细胞，介导纳米系统转运至细胞内。
本发明所述仿生化纳米系统，为一种核壳结构的仿生纳米粒子，由磷酸钙构成的内核载药，脂质双分子层与载脂蛋白自组装作为外壳；
所述仿生化纳米系统，能有效地抑制CAFs的激活，减少巨噬细胞向M2型转化，改善肿瘤微环境，使血管正常化；
所述仿生化纳米系统，采用多种体内外技术和评价手段，以具有Kras突变的胰腺癌细胞KPC细胞为模型评价其安全性，摄取效率及摄取机制，采用小动物活体成像技术考察其肿瘤靶向和蓄积能力，并评价其对胰腺癌靶向治疗的疗效和对主要脏器的毒性。
更具体的，本发明所述的仿生化纳米系统，以磷酸钙为内核，包载天然药物和化疗药物，通过疏水键结合的途径在外层包裹脂质体并自组装ApoAⅠ模拟肽，构建低毒的高密度脂蛋白仿生化纳米系统(LCP-4F)；该仿生化纳米系统的粒径在15nm左右，且均一稳定，
本发明采用的磷酸钙构建纳米粒内核，同时包载天然产物和化疗药物，具有较高的稳定性和包载效率；其制备方法为反相微乳法。
本发明中，所述脂质材料采用DOPA和DMPC；其中，DOPA为一种两亲性磷脂，与载药的磷酸钙内核的钙离子络合作为内层磷脂；DMPC通过薄膜水化法以疏水建与DOPA结合形成脂质双分子层，所得到的脂质体为核心含磷酸钙纳米粒的脂质体。
本发明所采用的载脂蛋白为全段的人重组ApoAⅠ蛋白，其与DMPC形成的脂质体自组装构建的仿生化纳米系统(LCP)可很好的模拟体内高密度脂蛋白在结构和功能上的特性，由于粒径较小(约15nm)，大部分可规避MPS的吞噬从而在体循环中长时间保持稳定，系统本身安全性好，且与单纯的脂质体相比可被肿瘤细胞更多地摄取，从而更高效的递送药物以实现杀伤肿瘤细胞的效果。
本发明所构建的仿生化纳米系统，自组装的ApoAⅠ蛋白能够靶向胰腺癌肿瘤细胞，更多地将制剂递送至肿瘤部位，并可被高效摄取进细胞内，在胞内转运后与溶酶体融合，载体的ApoAⅠ蛋白和脂质成分被溶酶体酶降解，磷酸钙颗粒由于溶酶体的酸性环境而解离，释放出大量钙离子改变溶酶体的渗透压，从而使溶酶体肿胀破裂，所载药物发生溶酶体逃逸，释放至胞浆发挥效应。
本发明采用的天然药物为大麻二酚，其可抑制CAFs的活化和减少M2型巨噬细胞所占比例，使肿瘤部位血管正常化以促进药物在肿瘤部位的渗透和蓄积。
本发明所采用的模型药物为天然药物单体大麻二酚，通过物理包载的方式将其包载于生物可降解的磷酸钙内核中。
本发明所用的鼠源成纤维细胞NIH3T3、巨噬细胞RAW264.7和鼠源胰腺癌细胞KPC均为本领域所公认且可市购获得。
本发明提供了所述仿生化纳米系统的制备方法，并提供了该仿生化纳米系统被摄取的机制；其中，
本发明所述仿生化纳米系统的构建方法，其包括步骤：
①采用反相微乳法制备包载大麻二酚和吉西他滨的磷酸钙内核；所述反相微乳由水溶液分散到含有壬基酚聚氧乙烯醚的环己烷油相溶液中制备得到，随后采用内层磷脂DOPA修饰，分散于氯仿中备用；
②薄膜水化法制备外层，即将预先制备的磷酸钙内核、脂质膜材料共同成膜，水化之后加入ApoAⅠ恒温摇床孵育，得到自组装的基于磷酸钙内核的高密度脂蛋白仿生化纳米粒。
本发明通过免疫印迹(Western Blot)实验和流式细胞术实验证明，所述仿生化纳米系统能抑制体内外CAFs的激活并减少M2型巨噬细胞；多次给药大麻二酚仿生纳米制剂可显著改善肿瘤微环境，促使血管正常化，进一步增加化疗药物吉西他滨在肿瘤部位的渗透和蓄积；本发明所述仿生纳米系统与单独给药吉西他滨相比生存期显著提高，所述仿生化纳米系统具有广大的应用前景；此外，所述仿生化纳米系统(LCP-4F)，粒径在15nm左右且均一稳定，在体外能高效被胰腺癌细胞摄取，并调节CAFs分泌的细胞因子(如纤连蛋白、成纤维肌动蛋白等)。本发明经体内药效实验表明，所述仿生化纳米系统能靶向并蓄积于肿瘤部位，具有良好的微环境调节和癌细胞杀伤效果；该仿生化纳米系统在调节肿瘤相关成纤维细胞过度激活的肿瘤微环境和杀伤癌细胞方面具有广大前景。
附图说明
图1.仿生化纳米递释系统的表征，其中，
(A)LCP-4F模式图，
(B)LCP-4F的透射电镜图，标尺：50nm，
(C)LCP的粒径分布，
(D)LCP-4F的粒径分布。
图2.胰腺癌细胞对仿生化纳米递释系统的摄取及摄取机制，其中，
(A)KPC细胞对LCP和LCP-4F的摄取定量结果，
(B)不同胞吞途径抑制剂对KPC细胞摄取LCP-4F的影响结果，
(C)KPC细胞摄取LCP和LCP-4F后，与大胞饮标记物右旋糖酐(Dextran)的共定位结果，标尺：10μm；
其中，各组与PBS组的显著性差异分析采用单因素方差分析法，n.s.代表p>0.05即无显著性差异，p<0.05表示存在显著性差异，*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001，****代表p<0.0001。
图3.大麻二酚对巨噬细胞的M2分型和CAFs细胞蛋白表达情况的影响，其中，
(A)大麻二酚游离药(CBD-Free)和大麻二酚制剂(CBD-NP)对激活后的巨噬细胞M2分型的影响结果，
(B)不同剂量的CBD-NP对于激活后的NIH3T3细胞中各蛋白表达情况的影响；
其中：各组与PBS组的显著性差异分析采用单因素方差分析法，n.s.代表p>0.05即无显著性差异，p<0.05表示存在显著性差异，*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001，****代表p<0.0001。
图4.仿生化纳米递释系统的体内分布，其中，
(A)LCP和LCP-4F在荷瘤小鼠肿瘤中随时间的分布，
(B)24小时后LCP和LCP-4F在小鼠肿瘤和主要器官中的分布，
(C)24小时后LCP和LCP-4F在小鼠肿瘤和主要器官中的分布定量图；
其中：各组与PBS组的显著性差异分析采用单因素方差分析法，n.s.代表p>0.05即无显著性差异，p<0.05表示存在显著性差异，*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001，****代表p<0.0001。
图5.仿生化纳米递释系统的体内药效学评价，其中，
(A)给药期间荷瘤C57小鼠的体重变化曲线，
(B)多次给药后荷瘤C57小鼠的生存期情况，
(C)多次给药后荷瘤C57小鼠肿瘤的马松染色和免疫印迹染色，分别为α-SMA、Fibronectin和CD31，标尺：100μm；
其中：各组与PBS组的显著性差异分析采用单因素方差分析法，n.s.代表p>0.05即无显著性差异，p<0.05表示存在显著性差异，*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001，****代表p<0.0001。
具体实施方式
实施例1：低毒仿生纳米系统的表征
制备低毒仿生化纳米系统，将14mL环己烷与6mL壬基酚聚氧乙烯醚搅拌均匀作为油相，600μL2.5 M的CaCl2溶液，搅拌加入油相中作为钙相，180μL 60mM的GEM和100μL40 mM的CBD混合后，加入12.5mM NaH2PO4(最终浓度)的溶液中达到600μL的体积，加入油相中作为磷相。两相分散均匀后钙相加到磷相中搅拌5min，随后加入DOPA反应1h。上述体系加入无水乙醇破乳30min，离心弃上清以洗去油相，离心参数为12500g,20min,4℃。同样条件再用无水乙醇洗沉淀两次，得到白色固体挥干10-20min，分散于氯仿中保存。随后用薄膜水化法制备脂质体，取500μLCaP-氯仿溶液加入1mg DMPC和2mL氯仿，在旋转蒸发仪上40℃旋蒸1h，加入2mL三蒸水水化完全。得到的脂质体在用100W功率探头超声6min后7000rpm离心7min，加入500μgApoAⅠ模拟肽4F肽，置于摇床上100rpm,37℃孵育即可形成同时载有CBD和GEM的低毒仿生化纳米系统，称为LCP-4F。其中不加4F肽的的脂质体称为LCP，只载有CBD药物的为CBD-4F，只载有GEM药物的为GEM-4F。载荧光探针的纳米粒是将荧光探针加入DMPC及磷酸钙纳米粒一起旋蒸即可，其他步骤同前；
结果如图1所示：其中，图1A显示了本低毒仿生化纳米系统的构建模式图；图1B显示了LCP-4F纳米粒的透射电镜图，由图中看出LCP-4F为规则的球形且均匀分布，结构与天然成熟的球形HDL相似；图1C显示了LCP的粒径分布，粒径为30.36nm±2.86nm；图1D显示了LCP-4F的粒径分布，粒径为14.21nm±1.53nm，LCP-4F的多分散系数更小，且比LCP的平均粒径要小，可能是由于多肽具有两亲性，其加入之后分子之间会发生排斥，为了维持制剂的稳定性，粒子表面曲率变大，每个粒子包裹的CaP核心会减少，因此粒径减小。
实施例2：胰腺癌细胞对仿生化纳米递释系统的摄取及摄取机制
选用KrasG12D突变的KPC细胞考察其对CBD-GEM-HDL(LCP-4F)及CBD-GEM-LNC(LCP)的摄取情况。仿生化纳米粒用细胞膜红色荧光探针(DiI)进行荧光标记。KPC细胞种96孔板24h后，吸出培养基，按预先设好的浓度梯度表加纳米粒，细胞摄取2h后吸出纳米粒，经过磷酸盐缓冲液(PBS)清洗、4％多聚甲醛固定15min和细胞核染料(Hoechst试剂)避光染核8min后，高内涵分析系统考察细胞摄取的定性和定量结果。另将KPC细胞培养于培养瓶中，加入DMPC为25μg/mL的LCP-4F或LCP，3h后透射电镜拍摄摄取情况；
选用带异硫氰酸荧光素标记的右旋糖酐(FITC-Dextran)作为大胞饮通路标记物，KCP细胞种培养皿24h，配制含1.3mg/mL FITC-Dextran的DMEM培养基，从中取1mL与50μLLCP-4F-DiI(DMPC浓度为25μg/mL)混合均匀，加入共聚焦小皿中，放进培养箱2h后固定染核，激光共聚焦观察两种细胞的摄取情况以及纳米粒与右旋糖酐的共定位情况；另将KPC细胞种96孔板孵育24h，加纳米粒之前先在每孔加入90μL各胞吞途径抑制剂孵育30min，再加110μL含LCP-4F-DiI的培养基(DMPC浓度为25μg/mL)，共孵育3h后弃培养基，分别经过PBS清洗、4％多聚甲醛固定15min和Hoechst试剂避光染核8min后，高内涵分析细胞摄取的定量结果；
KPC细胞对LCP与LCP-4F的摄取定量结果(如图2A)显示，LCP-4F处理组KPC细胞内荧光强度明显高于对照组LCP，且随着给药浓度的增加，细胞摄取LCP-4F呈浓度依赖性增加，结果表明，组装4F多肽能在一定程度上促进KPC细胞大量摄取纳米粒；摄取抑制实验结果表明(如图2B)，大胞饮通路抑制剂EIPA和阿米洛利对LCP-4F的细胞摄取具有最强的抑制作用，大约能够抑制40％的摄取；共聚焦实验显示(如图2C)，KPC细胞对LCP-4F的摄取量比LCP更多，并且LCP-4F与大胞饮标记物Dextran共定位明显，与另外两种转运途径标记物没有明显的共定位，表明KRAS突变的胰腺癌细胞可诱导大胞饮通路的激活介导大部分LCP-4F纳米粒的内吞；结果表明，Kras突变的胰腺癌细胞通过大胞饮机制摄取CaP-HDL纳米粒。
实施例3：大麻二酚对巨噬细胞的M2分型和CAFs的细胞蛋白表达情况的考察
为验证该仿生递送系统中的大麻二酚是否会影响肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞，考察了巨噬细胞在给药之后M2型所占比例的变化。未激活的RAW 264.7细胞为阴性对照组，用10ng/ml的IL-13活化的RAW264.7为M2型阳性对照组，对比含10μM大麻二酚的游离药和纳米制剂对巨噬细胞M2分型的抑制效果。具体是，RAW264.7细胞种6孔板，除阴性对照组外每孔各加刺激因子IL-1310ng/ml，置于培养箱贴壁24h后分别给大麻二酚浓度为10μM的CBD-Free和CBD-NP及等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)，12h后收集细胞，加荧光染料PE标记的M2型巨噬细胞标记物(CD206)染色30min，PBS清洗后流式细胞术扫描阳性细胞所占比例；
进一步考察大麻二酚对活化的CAFs中标记蛋白的影响，NIH3T3细胞种6孔板24h后，加含10ng/mLTGF-β的DMEM培养基刺激24h，分别以载药1μM、2μM、4μM、8μM大麻二酚的纳米制剂，不给刺激不给药物和只给刺激不给药物分别作为阴性和阳性对照组，于培养箱中孵育24h后，吸除上清，用PBS洗3遍后将6孔板置于冰上，每孔加入250μL的RIPA裂解液裂解30min，用细胞刮刀刮下细胞，将细胞碎片和裂解液加入1.5mL离心管，于4℃、12000rpm/min条件离心10min，将上清转移到新的预冷EP管中，弃去沉淀，用BCA试剂盒定量后加入适量的5x的上样缓冲液，涡旋混匀后于95℃干式加热器上加热5min，上样，
图3A结果显示，当采用IL-13孵育RAW264.7细胞24h后，CD206阳性的细胞从0.23％提高到25.6％，表明巨噬细胞已经转变为M2型；而给大麻二酚游离药和纳米制剂之后M2型所占比例明显下降，分别是16.3％和8.99％，大麻二酚纳米制剂组对M2型的抑制作用比游离药更强，说明该仿生纳米系统可显著降低巨噬细胞M2分型所占比例，
图3B结果显示，当用TGF-β孵育NIH3T3细胞24h后，成纤维细胞激活的蛋白肌动蛋白α(α-SMA)、成纤维细胞相关蛋白(FAP)以及纤维黏连蛋白(Fibronectin)的表达量大幅增加，提示成纤维细胞已经转变为CAFs；当给予不同剂量的大麻二酚纳米制剂孵育24h后，与阳性对照组相比，大麻二酚纳米制剂能够剂量依赖地降低α-SMA、FAP以及Fibronectin的表达量，
综上所述，大麻二酚能有效降低肿瘤微环境中巨噬细胞的M2分型所占比例，且纳米制剂的效果好于游离药；而且大麻二酚纳米制剂能抑制CAFs的激活和相关蛋白的表达，该抑制效果具有剂量依赖性。
实施例4：仿生化纳米递释系统的体内分布
原位胰腺癌动物模型的建立：取对数生长期的KPC细胞，用胰酶消化后离心，PBS清洗细胞两次后计数，将细胞的浓度调整为1×106cells/mL，置于冰盒备用。150μL 5％水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，医用胶带固定四肢，用碘酒涂腹部皮肤，用眼科剪于C57小鼠的左下腹脾脏附近剪开2-3cm的切口，翻至皮肤外，脾脏下即为胰脏。用移液枪重悬冰上的细胞，取50μL从胰脏尾端朝右前方向进针，可观察到胰腺明显充盈呈半透明状，慢慢移出针头，用蘸有生理盐水的棉签把胰脏、脾脏推回体内，在伤口处滴适量的抗生素，用生物可降解的缝合线先逐针缝合里面的肌肉层，再逐针缝合外层的皮肤，所有操作均在超净手术台中进行。接种后每天观察动物状态和伤口愈合情况，在接种后14天进行实验，
小动物活体成像实验中，纳米粒用细胞膜深红色荧光探针(DiR)作荧光标记，所制备的纳米粒分别称为CaP-LNC-DiR和CaP-HDL-DiR。用截留分子量10kD的超滤离心管将两种纳米粒分别浓缩至DMPC为4mg/mL。荷瘤裸鼠随机分为两组，每组6只，按20mg/kg DMPC的剂量给药。在给制剂4h,8h,12h和24h后分别进行活体成像，并在24h拍摄后用5％水合氯醛麻醉并固定C57小鼠，生理盐水灌流后取肿瘤组织及心、肝、脾、肺、肾，生理盐水冲洗后置于小动物活体成像仪采集图像，
图4A结果显示，给药后各时间点LCP-4F在肿瘤部位的荧光强度均高于对照组LCP，且在8h后信号明显增强，在处理24h后仍然较强，表明LCP-4F仿生化纳米载体与LCP相比更多地蓄积于肿瘤部位，并且有更长的体内循环时间。图4B为24h后小鼠的器官及肿瘤内仿生纳米载体的蓄积情况及定量图，结果显示，LCP-4F仿生化纳米载体比LCP更多地蓄积于肿瘤部位，更少地蓄积于肝脏。
实施例5：仿生化纳米递释系统的体内药效学评价
原位胰腺癌动物模型的建立方法同实施例4。荷瘤小鼠随机分为6组，每组6只，每两天分别尾静脉注射15mg/kg吉西他滨，含10mg/kg CBD的LCP、LCP-4F和相同剂量的GEM-4F、CBD-4F和同体积的PBS，共给药5次。在给药期间，对每组6只的C57小鼠记录体重。给药周期结束后，分别记录每只小鼠的生存周期，在小鼠死亡后，对其进行心脏灌流，取出主要脏器进行石蜡切片和免疫组化染色，
图5A所示的体重曲线结果表明，LCP-4F在给药期间不会导致C57小鼠体重下降，相比化疗药物吉西他滨，有较小的系统毒性；图5B中各组荷瘤C57小鼠的生存曲线显示，多次给药LCP-4F后荷瘤裸鼠的中位生存期为60.5天，长于吉西他滨组的33.5天，表明本仿生化纳米系统比传统化疗药物吉西他滨的药效更好；
图5C的马松染色和免疫印迹染色结果显示，LCP-4F组经过治疗后，肿瘤内部的胶原、α-SMA、Fibronectin都显著减少，且血管标记物CD31也有一定程度的减少；显示出对肿瘤微环境的显著改善，且对肿瘤也有更好的治疗效果。

Claims (9)

1.一种同时调节肿瘤微环境和靶向杀伤肿瘤细胞的低毒仿生化纳米系统，其特征在于，所述仿生化纳米系统为一种核壳结构的仿生纳米粒子，由磷酸钙构成的内核载药，脂质双分子层与载脂蛋白自组装作为外壳。
2.按权利要求1所述的同时调节肿瘤微环境和靶向杀伤肿瘤细胞的低毒仿生化纳米系统，其特征在于，所述仿生化纳米系统采用反向微乳法将天然化合物和化疗药物包载于磷酸钙内核，通过薄膜水化法将磷脂包裹于内核外层以形成脂质体，再与ApoAⅠ模拟肽自组装形成均一稳定的仿生化纳米系统LCP-4F。
3.按权利要求1所述的同时调节肿瘤微环境和靶向杀伤肿瘤细胞的低毒仿生化纳米系统，其特征在于，所述仿生化纳米系统包载具有调节肿瘤微环境作用的药物大麻二酚。
4.按权利要求1所述的同时调节肿瘤微环境和靶向杀伤肿瘤细胞的低毒仿生化纳米系统，其特征在于，所述仿生化纳米系统的内层磷脂采用与多价离子具有络合能力的两亲性磷脂1,2-油酰磷脂酸DOPA，其磷酸极性头部在油水界面与磷酸钙纳米粒的钙离子络合，疏水性尾部分布在油相，在纳米粒表面形成一层疏水层。
5.按权利要求1所述的同时调节肿瘤微环境和靶向杀伤肿瘤细胞的低毒仿生化纳米系统，其特征在于，所述仿生化纳米系统的外层磷脂采用二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC。
6.按权利要求1所述的同时调节肿瘤微环境和靶向杀伤肿瘤细胞的低毒仿生化纳米系统，其特征在于，所述仿生化纳米系统的载脂蛋白采用高密度脂蛋白ApoAⅠ蛋白的模拟肽，其与DMPC形成的脂质体自组装形成高密度脂蛋白仿生结构。
7.按权利要求6所述的同时调节肿瘤微环境和靶向杀伤肿瘤细胞的低毒仿生化纳米系统，其特征在于，所述的自组装形成高密度脂蛋白仿生结构，其粒径较小、均一稳定，毒性较小，在体内循环时间较长，生物相容性好。
8.按权利要求1所述的同时调节肿瘤微环境和靶向杀伤肿瘤细胞的低毒仿生化纳米系统，其特征在于，所述的肿瘤细胞为胰腺癌细胞。
9.权利要求1的同时调节肿瘤微环境和靶向杀伤肿瘤细胞的低毒仿生化纳米系统的构建方法，其特征在于，其包括步骤：
①采用反相微乳法制备包载大麻二酚和吉西他滨的磷酸钙内核；所述反相微乳由水溶液分散到含有壬基酚聚氧乙烯醚的环己烷油相溶液中制得，随后采用内层磷脂DOPA修饰，分散于氯仿中备用；
②薄膜水化法制备外层：将制得的磷酸钙内核、脂质膜材料共同成膜，水化后加入ApoAⅠ恒温摇床孵育，制得自组装的基于磷酸钙内核的高密度脂蛋白仿生化纳米粒。
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