CN110123761A - 一种仿生型高密度脂蛋白纳米粒及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物制剂领域，涉及一种仿生型高密度脂蛋白纳米粒及其制备和应用，具体涉及一种靶向SR‑B1受体的递送药物的仿生型高密度脂蛋白纳米粒及其制备与应用。所述的仿生型高密度脂蛋白纳米粒，主要包括以下几种成分：磷脂、载脂蛋白模拟肽与药物。载脂蛋白模拟肽与磷脂的质量比为：1:1～5，载脂蛋白模拟肽与药物的质量比为：1:0.02～0.6，载脂蛋白模拟肽为ApoA‑I模拟肽，所述的药物包括化疗药物、抗肝纤维化药物、基因类药物。本发明制备携载多西他赛的仿生型高密度脂蛋白纳米粒的过程简单，无有机溶剂残留，且形成的纳米粒稳定，实现肿瘤的低毒、靶向、高效治疗，可以为肿瘤的治疗提供一种新思路。

Description

一种仿生型高密度脂蛋白纳米粒及其制备和应用
技术领域
本发明属于药物制剂领域，涉及一种仿生型高密度脂蛋白纳米粒及其制备和应用，具体涉及一种靶向SR-B1受体的递送药物的仿生型高密度脂蛋白纳米粒及其制备与应用。
背景技术
乳腺癌是发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤，严重威胁全球女性身心健康甚至危及生命，其发病有年轻化的趋势，已成为当前社会的重大公共卫生问题。美国《2018癌症数据报告》提示乳腺癌、肺癌、结直肠癌是女性必须注意的对象，特别是乳腺癌，其占据新发病例的30％，在女性恶性肿瘤中发病率居首位。目前，乳腺癌的治疗方法主要有手术、化疗、放疗、内分泌治疗等多种手段，各种治疗手段均可取得良好治疗效果，但也都存在各种不足或缺点。化疗是一种应用抗癌药物抑制癌细胞分裂、破坏癌细胞的治疗方法，在乳腺癌临床治疗中具有重要作用，但化疗药物对肿瘤组织无选择性容易引起全身系统毒性，同时在肿瘤部位蓄积的化疗药物低于有效治疗剂量会导致肿瘤耐药现象的产生。因此，研究开发新的肿瘤治疗方法显得十分迫切和必要。近年来纳米材料在肿瘤治疗中显示出了巨大的潜力，由于其独特的物理、化学及生物学特性，可以显著降低化疗药物的不良反应，提高化疗效果，在生物医学领域逐渐成为一种新的研究热点。
抗肿瘤药物一般特异性差、选择性低、对正常组织不良反应大且易产生耐药性。纳米材料作为抗肿瘤药物载体可以有效避免上述缺点，同时还可以达到药物缓控释、靶向释放的作用。He等人应用氨基功能化的介孔二氧化硅纳米粒子(MSN-NH2)作为载体用于阿霉素盐酸盐(DOX)递送，不仅增加了肿瘤细胞对抗肿瘤药物DOX的摄取达到很好的肿瘤抑制作用，而且释放药物具有pH响应性，肿瘤偏酸性部位释放率高，减少药物在传递过程中的损失，显著降低药物对正常组织的毒性。此外，随着纳米技术的不断发展，靶向纳米材料不仅能够提高化疗药物的载药量及传递效率，同时药物传递的肿瘤靶向性也逐渐提高。
仿生型的纳米载体因其与体内内源性物质具有相似的结构及性质，良好的生物相容性、生物可降解性、无免疫原性、避免巨噬细胞的吞噬而延长药物在血液中的滞留时间等优势，近年来仿生型rHDL因其独特的优势在药物制剂的开发中受到越来越多的重视。
由于天然的HDL需从血浆中分离，其分离过程需要48小时，而且分离效果受到供体血浆水平和操作技巧的影响，纯化困难，而且天然HDL粒径组成不一，因此，限制了其在药学中的广泛应用。rHDL是由载脂蛋白和磷脂形成的仿生纳米粒，但载脂蛋白也存在需从血浆中分离，难于批量化生产，易聚集等诸多问题。因此，由ApoA-I功能模拟肽替代载脂蛋白，与各种天然或合成的磷脂在水性介质中自组装形成的圆盘状纳米粒子日益引起人们的广泛关注。
rHDL除具有以上优势外，作为运载体具有许多独特的优势：粒径小(﹤60nm)，其疏水性的内核包载脂溶性药物可以具有更好的稳定性，具有与天然HDL相似的结构和性质，能够特异性靶向于SR-BI受体。乳腺癌细胞对SR-BI受体高度表达，rHDL纳米粒可以特异性靶向于乳腺癌细胞，通过SR-BI介导的通路能有效地将药物转运至细胞质，而不会被胞内体摄取，从而提高靶向性，因此可利用rHDL纳米粒独特受体介导的机制作为基因或脂溶性药物的载体来构建具有靶向功能的给药系统。
发明内容
本发明的目的是制备一种可以递送化疗药物发挥抗肿瘤作用的仿生型高密度脂蛋白纳米粒，由于高密度脂蛋白可以特异性的结合肿瘤细胞上高表达的SR-B1受体，可以提高靶向性。制备的纳米粒能够提高药物在肿瘤细胞的浓度，降低其对正常组织的毒性。
本发明设计的仿生型高密度脂蛋白纳米粒，主要包括以下几种成分：磷脂、载脂蛋白模拟肽与药物，所述的高密度脂蛋白纳米粒具有圆盘状结构，类似于初生的高密度脂蛋白。
本发明中所述的载脂蛋白包括：ApoA-I、ApoA-II、ApoA-IV、ApoCs、ApoD、ApoE、ApoF、ApoH、ApoJ、ApoL-I、ApoM、ApoO。载脂蛋白模拟肽为以上载脂蛋白的模拟肽，优选为ApoA-I模拟肽，其可靶向于SR-BI受体高表达的肿瘤细胞以达到治疗作用。
所述磷脂为：神经鞘磷脂(SM)；PC系列磷脂(二肉豆蔻酰基卵磷脂(DMPC)、二棕榈酰基卵磷脂(DPPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂(POPC)、氢化大豆磷脂(HSPC))；PE系列磷脂(二芥酰基磷脂酰乙醇胺(DEPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇(DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇(DPPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE))；阳离子型磷脂(2-二油酰基羟丙基-3-N,N,N-三甲铵氯(DOTAP))中的一种或者几种。
所述的药物包括化疗药物、抗肝纤维化药物、基因类药物，所述的化疗药物为紫杉醇、多西紫杉醇、10-羟基喜树碱、多柔比星、伊达比星、表柔比星、米托蒽醌、卡培他滨、环磷酰胺、柔红霉素、阿霉素、去甲氧柔红霉素、阿克拉霉素、高三尖杉酯碱、甲氨蝶呤、长春新碱、长春地辛、依托泊苷、替尼泊苷、姜黄素、卡铂、顺铂中的一种或几种；所述的抗肝纤维化药物包括甘草次酸、阿魏酸、吡非尼酮、尼达尼布、索拉菲尼、伊马替尼、维生素E；所述的基因类药物包括siRNA。
载脂蛋白模拟肽与磷脂的质量比为：1:1～5，优选为：1:2～3。
载脂蛋白模拟肽与药物的质量比为：1:0.02～0.6，优选为：1:0.03～0.2。
作为优选，载脂蛋白ApoA-I模拟肽为ETC-642(22A)、FX-5A(5A)、18A、4F、6F或者ATI-5261。
作为优选，所述的化疗药物为多西他赛或者10-羟基喜树碱。
作为优选，本发明的仿生型高密度脂蛋白纳米粒中，药物为化疗药物多西他赛或者10-羟基喜树碱，磷脂为二肉豆蔻酰基卵磷脂(DMPC)、二棕榈酰基卵磷脂(DPPC)，载脂蛋白模拟肽为22A或5A，载脂蛋白模拟肽与磷脂的质量比为：1:2～3，载脂蛋白模拟肽与化疗药物的质量比为：1:0.03～0.2。
作为优选，所述纳米粒的粒径为8～100nm，优选为8～60nm，更优选为10～20nm。
本发明提供了携载化疗药物的仿生型高密度脂蛋白纳米粒的制备方法，以化疗药物为例，其具体步骤为：将磷脂溶于氯仿和甲醇的混合溶液中，超声分散，滴加化疗药物的有机溶液，混合均匀后，37～40℃旋转蒸发成膜后，放入真空干燥箱12～24h，除去多余的有机溶剂，缓冲液中进行水化，探头超声，滴入缓冲液溶解的载脂蛋白模拟肽溶液，涡旋使其混合混匀，加热(超过相变温度)10～20mim，冷却(低于相变温度)10～20min，循环3～4次，得到仿生型高密度脂蛋白纳米粒。
如上所述步骤中，氯仿和甲醇的体积比为：1:1～3；
所述化疗药物的有机溶液的质量体积浓度为1％～10％；
上述化疗药物的有机溶液为：化疗药物的甲醇、乙腈或氯仿溶液；
所述的缓冲液溶解的载脂蛋白模拟肽溶液的浓度为：1～10mg/mL；
所述的缓冲液为：磷酸盐缓冲液(PBS)或醋酸盐缓冲液中的一种；
上述制备的纳米粒粒径大约在10～100nm，最优的纳米粒粒径为10～20nm，载药量达0.8％以上，具有与天然HDL相似的性质。
本发明以人乳腺癌细胞(MCF-7)为模型细胞，细胞毒性实验显示空白载体，即使在最高浓度时，细胞存活率也均在95％以上，可以证明载体的安全性。而载药纳米粒的毒性实验证明其对肿瘤细胞具有较强的细胞毒性，相较于游离药物具有更低的IC50值，说明载药纳米粒对肿瘤具有更强的抑制作用。细胞摄取实验证明相比于SR-B1受体低表达的正常细胞，只有高表达SR-B1受体的肿瘤细胞才会摄取仿生高密度脂蛋白纳米粒，这证明所制纳米粒有明显的肿瘤靶向作用。药效实验进一步证明了载药纳米粒具有良好的抗肿瘤作用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明提供的载脂蛋白模拟肽可与肿瘤细胞表面的SR-BI受体特异性结合，使得该纳米粒对SR-BI受体高表达的肿瘤细胞具有靶向作用；
(2)本发明中的载脂蛋白模拟肽合成简单且易获得，采用模拟肽制备的纳米粒的粒径更接近于天然HDL的粒径，保留更多与天然HDL相似的性质。
(3)本发明制备携载多西他赛的仿生型高密度脂蛋白纳米粒的过程简单，无有机溶剂残留，且形成的纳米粒稳定，实现肿瘤的低毒、靶向、高效治疗，可以为肿瘤的治疗提供一种新思路。
附图说明
图1为实施例二中仿生型高密度脂蛋白载药纳米粒的粒径图；
图2为实施例二中仿生型高密度脂蛋白载药纳米粒的透射电镜图；
图3为实施例四中仿生型高密度脂蛋白载药纳米粒中多西他赛体外释放；
DTX-sol：多西他赛溶液 DTX-sHDL：多西他赛HDL纳米粒；
图4为实施例五中仿生型高密度脂蛋白载药纳米粒对MCF-7细胞的细胞毒；
sHDL：空白HDL纳米粒 DTX-sHDL：多西他赛HDL纳米粒
DTX：多西他赛游离药；
图5为实施例五中仿生型高密度脂蛋白载药纳米粒对HaCat细胞的细胞毒；
sHDL：空白HDL纳米粒 DTX-sHDL：多西他赛HDL纳米粒
DTX：多西他赛游离药；
图6为实施例六中仿生型高密度脂蛋白载药纳米粒的细胞摄取；
sHDL-FITC：标记FITC的空白HDL纳米粒
DTX sHDL-FITC：标记FITC的多西他赛HDL纳米粒；
图7为实施例七中仿生型高密度脂蛋白载药纳米粒的活体成像；
A：荷瘤小鼠不同时间的荧光成像；
B：荷瘤小鼠与正常小鼠的组织荧光分布；
图8为实施例八中仿生型高密度脂蛋白载药纳米粒的肿瘤抑制图；
Saline:生理盐水 sHDL：空白HDL纳米粒
DTX：多西他赛游离药 DTX–sHDL：多西他赛HDL纳米粒。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例一：仿生型高密度脂蛋白(rHDL)纳米粒的制备
1.1仿生型纳米载体的筛选
将磷脂溶于1:1的氯仿和甲醇的混合溶液中，超声分散，滴加多西他赛乙腈溶液，混合均匀后，37℃旋转蒸发成膜后，放入真空干燥箱12h，除去多余的有机溶剂，PBS中进行水化，探头超声，滴入PBS溶解的5A溶液，涡旋使其混合混匀，加热10mim，冷却10min，循环3次，得到仿生型高密度脂蛋白纳米粒。
由于不同的磷脂(DMPC、DPPC、HSPC、POPC)与5A模拟肽的结合能力不同可能会导致形成的纳米粒的稳定性有一定的差异，因此按照如上方法改变不同的磷脂，通过采用粒径、分子模拟、热力学研究来筛选出最优的磷脂种类，结果如表1所示。内源性的HDL粒径大约在8～14nm之间，制备的rHDL的粒径大小应与内源性HDL相近才能保证两者具有相似的性质与体内的转运途径；由分子模拟与热力学分析结果可以得知，分子之间的结合能越小，分子越稳定。综合以上实验结果分析：DMPC、DPPC、HSPC、POPC与载脂蛋白模拟肽5A均可以构成稳定的纳米粒，其中DMPC与模拟肽可以构成与内源性的HDL最相近的粒径，并且结合作用最强，因此在后续的实验过程中选用DMPC作为最优的磷脂种类。
表1不同磷脂类型构成的空白rHDL纳米粒的性质
1.2载药纳米粒的制备
将磷脂DMPC溶于1:1的氯仿和甲醇的混合溶液中，超声分散，滴加多西他赛溶液，混合均匀后，37℃旋转蒸发成膜后，放入真空干燥箱12h，除去多余的有机溶剂，PBS中进行水化，探头超声，滴入PBS溶解的5A溶液，涡旋使其混合混匀，加热10mim，冷却10min，循环3次，得到仿生型高密度脂蛋白纳米粒。
1.3载药纳米粒的处方筛选
通过粒径、包封率、载药量和rHDL的纯度进行载药纳米粒的处方筛选，分别采用不同的载脂蛋白模拟肽5A与磷脂比例进行评价，分析结果得到，当载脂蛋白模拟肽与磷脂的比例为1:1～1:5时，其粒径均在13nm左右，包封率均在50％以上，纯度在75％以上。而当其比例为1:2～1:3时，其包封率可达60％以上，纯度在80％以上，因此优选载脂蛋白模拟肽5A与磷脂1:3的比例进行后续实验研究。
表2载脂蛋白模拟肽5A与磷脂比例的质量评价
1.4不同多西他赛含量的性质评价
根据1.3获得的组方进行不同载药量的评价，分别加入1％，2％，3％，4％，10％的多西他赛制备载药纳米粒，采用微柱离心的方法，分离纳米粒与游离药物，HPLC进行多西他赛的含量测定，采用TSK-GEL SW凝胶色谱柱进行rHDL纳米粒的纯度测定，实验结果表明，当药物浓度为1％～10％时，其粒径均小于20mn,而当药物浓度为1～4％时，其包封率在50％以上，且纯度可达到90％以上，而当加入3％多西他赛时具有最高的包封率和载药量，因此采用3％作为多西他赛的最优的加入量。
表3不同多西他赛含量的性质评价
1.5不同制备方法对于载药纳米粒的影响
以DMPC与载脂蛋白模拟肽(5A)为例分别采用醋酸冷冻法、薄膜分散法两种方法制备rHDL纳米粒。
醋酸冷冻法：称取5mg 5A于小瓶中，加入适量的冰醋酸溶解，再将此溶液加入已称好15mg DMPC溶液和0.6mg的DTX乙腈溶液中，涡流至溶解，至水浴加热5分钟，放入液氮中冷冻，然后转移至真空干燥器中过夜。将所得干燥产品加入适量的pH7.4溶液溶解，即得rHDL。
薄膜分散法：将15mg DMPC溶于中甲醇:氯仿(1:1)的混合溶剂溶剂中，超声分散，滴加0.6mg的DTX乙腈溶液，混合均匀后，旋转蒸发成膜后，放入真空干燥箱除去多余有机溶剂，PBS水化后超声10min，滴入PBS溶解的5mg 5A溶液后涡旋使其混合混匀，得DTX-sHDL纳米粒。
薄膜分散与冷热循环相结合：将15mg DMPC溶于中甲醇:氯仿(1:1)的混合溶剂溶剂中，超声分散，滴加0.6mg的DTX乙腈溶液，混合均匀后，旋转蒸发成膜后，放入真空干燥箱除去多余有机溶剂，PBS水化后超声10min，滴入PBS溶解的5mg 5A溶液后涡旋使其混合混匀，加热冷却循环10min，循环3次，即得DTX-sHDL纳米粒。
由结果(表4)可以看出，醋酸冷冻法和薄膜分散法均可以得到粒径、包封率和纯度符合要求的纳米粒，两者制备的纳米粒的性质相近，但由于醋酸薄膜分散法制备过程中使用醋酸，因此对仪器的要求较高，易存在醋酸残留，因此最终选用薄膜分散法。
表4不同制备工艺合成的空白rHDL纳米粒的性质
进一步地，为了获得更高的包封率和载药量，本发明对其薄膜分散法的具体方法进行了研究，我们发现，由于磷脂在低于相变温度时，磷脂分子保持稳定；达到相变温度时，磷脂分子由原来排列紧密的全反式构象变为结构疏松的歪扭构象，膜的流动性和通透性增加。因此通过采用薄膜分散法结合冷热循环的方法制备的纳米粒，利用磷脂的这种性质通过结构的伸缩可以达到包裹更多药物的目的，试验结果表明，此方法制备的载药纳米粒的包封率及载药量更高，通过测定薄膜分散法及薄膜分散与冷热循环相结合的方法制备的载药纳米粒的包封率可以发现：薄膜分散与冷热循环相结合方法制备的纳米粒的包封率可以达到78.42％，而只采用薄膜分散法的包封率只有50.02％，且其粒径和纯度均符合要求，因此最终采用薄膜分散与冷热循环相结合的方法来制备rHDL纳米粒。
表5不同制备工艺合成的载药rHDL纳米粒的性质
实施例二：rHDL载药纳米粒的性质研究
包载多西他赛的最优处方为：DMPC 15mg，5A 5mg，DTX 0.6mg，PBS 1mL。制备工艺：将15mg DMPC溶于甲醇：氯仿(1:1)的混合溶剂溶剂中，超声分散，滴加0.6mg的DTX溶液，混合均匀后旋转蒸发成膜后，放入真空干燥箱除去多余有机溶剂，pH7.4的PBS水化后超声10min，滴入PBS溶解的5mg 5A溶液后涡旋使其混合混匀，加热冷却循环10min，循环3次，即得DTX-sHDL纳米粒。
包载10-羟基喜树碱(10-HCPT)的最优处方：15mg DPPC，5mg 22A，0.6mg 10-HCPT，PBS 1mL。制备工艺为：将15mg SM溶于甲醇：氯仿(1:1)的混合溶剂溶剂中，超声分散，滴加0.6mg的10-HCPT溶液，混合均匀后旋转蒸发成膜后，放入真空干燥箱除去多余有机溶剂，pH7.4的PBS水化后超声10min，滴入PBS溶解的5mg 5A溶液后涡旋使其混合混匀，加热冷却循环10min，循环3次，即得10-HCPT-sHDL纳米粒。
对上述DTX-rHDL纳米粒进行形貌学考察，纳米粒样品通过负染色法制样，透射电子显微镜(TEM)下观察粒子形貌(图1)，DTX-rHDL纳米粒子呈椭球形，分散均匀，粒径在12nm左右(图2)。采用动态光散射法对粒径及粒度分布进行测定，DTX-rHDL纳米粒子粒径分布呈单峰，粒径为(12.58±0.34)nm，表明制剂粒径较小，分布均匀，粒径分布范围窄。
对上述10-HCPT-rHDL纳米粒进行形貌学考察，透射电子显微镜观察rHDL与HCPT-HDL纳米粒子呈椭球形，分散均匀，粒径在10nm左右，采用马尔文激光粒度仪测定其粒径及粒度分布，最优空白和载药rHDL纳米粒子的粒径分布呈单峰，粒径分别为9.7±1.5nm和9.8±2.1nm。表明制剂粒径较小，分布均匀，粒径分布范围窄。载药rHDL处方的粒径与空白的相比，粒径变化不大，表明药物包载进rHDL纳米载体后，没有破坏其纳米结构。
实施例三：采用高效液相色谱法，GPC凝胶色谱柱测定rHDL
采用TSK-GEL SW凝胶色谱柱(300×7.5mm，10μm)；在220nm下检测，pH 7.4PBS的流动相以0.7mL·min-1的流速，室温下进样20μL的纳米粒溶液。分别对游离的5A模拟肽、空白的HDL和载药的HDL进行GPC凝胶色谱分析，结果显示保留时间大约为10.6min时的色谱峰为HDL，载药的HDL与空白的HDL相比，保留时间和峰面积没有发生明显变化，进一步表明药物的包载没有改变HDL的结构，仍能稳定存在。
实施例四：纳米粒的体外释放研究
精密移取1mL实施例二中的DTX-sHDL纳米粒于已经处理好的透析袋中，两端夹紧后放入装有100mL释放介质的烧杯中，37℃条件下置于磁力搅拌上搅拌，分别于1.5、1、2、4、6、8、10、12、24h取介质0.5mL，同时补加相同体积的新鲜释放介质进行药物含量的测定，计算累计释放量，绘制体外释放曲线，见图3。结果显示DTX-sol中药物在15h时已经释放完全，而DTX-sHDL纳米粒仅有50％的释放量，此外纳米粒在0.5h时无突释，48h后累积释放量高达97％，说明sHDL纳米粒具有延缓药物释放的作用且稳定性良好。
实施例五：MTT法的细胞毒实验
采用MTT方法评价实施例二中的DTX-rHDL纳米粒相对于游离DTX和空白rHDL对SR-B1高表达的乳腺癌细胞MCF-7和SR-B1低表达的HaCaT正常细胞的细胞毒作用，结果如图4和图5所示，由图4可以看出：空白载体对HaCaT正常细胞的存活率高于90％。因此可以认为，空白纳米粒对正常细胞的生长增殖无抑制作用，即载体具有良好的生物安全性，这可能与其载体材料无毒，生物相容性好，生物可降解的特性有关。由图5可以看出，游离DTX和DTX-rHDL纳米粒对MCF-7细胞的增殖具有明显的抑制作用，且随着浓度升高，抑制作用增强，且在相同浓度下，DTX-rHDL纳米粒对MCF-7细胞的增值抑制作用明显强于游离DTX。经计算，游离药物的IC50值载药的rHDL纳米粒是制剂的26倍，说明rHDL具有更强的杀死癌细胞的能力，其中空白的rHDL在高浓度时也有一定的杀死癌细胞的能力。实验证明rHDL纳米粒对正常的细胞的细胞毒性很低，而且包载化学药物之后增强了细胞毒性，从而增强了药效。
实施例六：细胞摄取实验
采用激光共聚焦显微镜对实施例二中的DTX-sHDL纳米粒的细胞摄取的结果进行观察，分别采用SR-B1受体高表达的乳腺癌细胞(MCF-7)和SR-B1受体低表达的成纤维细胞(HaCaT)对载药纳米粒的细胞摄取进行考察，结果见图6，结果显示：荧光强度具有时间依赖性，并且MCF-7细胞内的荧光强度远强于HaCaT细胞内的荧光强度。证明SR-B1受体高表达的细胞可以与HDL纳米粒的亲和力更强，因此肿瘤细胞对载药纳米粒的摄取更多。
实施例七：活体成像
将正常小鼠与接种肿瘤的小鼠分别尾静脉注射包载DiR的实施例二中的DTX-sHDL纳米粒，分别在不同时间点对小鼠进行活体成像的检测，考察纳米粒在小鼠肿瘤部位的浓集，12小时后，剥离出小鼠的主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)等，利用活体成像技术进行照射，考察纳米粒子的组织分布，见图7。对于接瘤的小鼠来说，纳米粒子在肿瘤中的荧光强度最强，而在正常组织中的分布较少，而对于正常小鼠来说，纳米粒子在不同组织中都有分布，因此可以表明纳米粒对肿瘤具有很好的靶向性。
实施例八：药效学实验
采用对数生长期的4T1细胞，将4T1细胞悬液接种于小鼠的右侧腋窝皮下，每只0.2mL，建立乳腺癌4T1瘤株腋下接种模型。接种后当肿瘤体积达到100mm3，将小鼠随机分为四组，每组每隔一天尾静脉注射给予生理盐水、空白载体、游离药物、载药制剂采用实施例二中的DTX-sHDL纳米粒，共10天，实验第十天，将实验小鼠处死，解剖分离小鼠肿瘤，肿瘤称重，计算两给药组的肿瘤抑制率。结果(图8)表明肿瘤大小制剂组的体积最小，重量最轻，均小于空白制剂和游离药物组。而且，制剂组的肿瘤抑制率可以达到80％。以上均证明载药仿生型高密度脂蛋白纳米粒具有良好的抗肿瘤效果。
实施例九：用于治疗肝纤维化的甘草次酸-rHDL纳米粒的制备
将磷脂DMPC溶于氯仿的中，超声分散，滴加甘草次酸乙腈溶液，混合均匀后，42℃旋转蒸发成膜后，放入真空干燥箱12h，除去多余的有机溶剂，PBS中进行水化，探头超声，滴入PBS溶解的22A溶液，涡旋使其混合混匀，加热10mim，冷却10min，循环3次，得到甘草次酸-rHDL纳米粒。分别制备不同小肽磷脂比的纳米粒，和不同甘草次酸含量的载药纳米粒，以粒径、包封率、和纯度为指标，考察纳米粒的性质，结果如表6所示，22A/磷脂的比例为1:2-1:6时，甘草次酸含量为2-4％时，其粒径均小于20nm，包封率可达50％以上，当22A/磷脂的比例为1:4，甘草次酸含量为2-4％时，其包封率可达80％以上。
表6.不同甘草次酸-rHDL纳米粒的粒径与包封率

Claims (10)

1.一种仿生型高密度脂蛋白纳米粒,其特征在于：包括载脂蛋白模拟肽、磷脂、药物，载脂蛋白模拟肽与磷脂的质量比为：1:1～5，优选为：1:2～3；载脂蛋白模拟肽与药物的质量比为：1:0.02～0.6，优选为1:0.03～0.2。
2.根据权利要求1所述的仿生型高密度脂蛋白纳米粒，其特征在于：所述的磷脂为神经鞘磷脂、二肉豆蔻酰基卵磷脂、二棕榈酰基卵磷脂、1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂、氢化大豆磷脂、二芥酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇、二棕榈酰基磷脂酰乙醇、二油酰磷脂酰乙醇胺、2-二油酰基羟丙基-3-N,N,N-三甲铵氯中的一种或者几种；所述的载脂蛋白模拟肽为ApoA-I模拟肽；所述的药物包括化疗药物、抗肝纤维化药物、基因类药物，所述的化疗药物为紫杉醇、多西紫杉醇、10-羟基喜树碱、多柔比星、伊达比星、表柔比星、米托蒽醌、卡培他滨、环磷酰胺、柔红霉素、阿霉素、去甲氧柔红霉素、阿克拉霉素、高三尖杉酯碱、甲氨蝶呤、长春新碱、长春地辛、依托泊苷、替尼泊苷、姜黄素、卡铂、顺铂中的一种或几种；所述的抗肝纤维化药物包括甘草次酸、阿魏酸、吡非尼酮、尼达尼布、索拉菲尼、伊马替尼、维生素E；所述的基因类药物包括siRNA。
3.根据权利要求1或2所述的仿生型高密度脂蛋白纳米粒，其特征在于：所述的磷脂为二肉豆蔻酰基卵磷脂或二棕榈酰基卵磷脂；所述的载脂蛋白模拟肽为ETC-642、FX-5A、FX-18A、4F、6F或者ATI-5261。
4.根据权利要求1所述的仿生型高密度脂蛋白纳米粒，其特征在于：化疗药物为多西他赛或者10-羟基喜树碱，磷脂为二肉豆蔻酰基卵磷脂或二棕榈酰基卵磷脂，载脂蛋白模拟肽为ETC-642或FX-5A，载脂蛋白模拟肽与磷脂的质量比为：1:2～3，载脂蛋白模拟肽与化疗药物的质量比为：1:0.03～0.2。
5.根据权利要求1所述的仿生型高密度脂蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于：
将磷脂溶于氯仿和甲醇的混合溶液中，超声分散，滴加药物的有机溶液，混合均匀后，37～40℃旋转蒸发成膜后，放入真空干燥箱12～24h，除去多余的有机溶剂，缓冲液中进行水化，探头超声，滴入缓冲液溶解的载脂蛋白模拟肽溶液，涡旋使其混合混匀，加热至超过相变温度10～20min，冷却至低于相变温度10～20min，循环3～4次，即得。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，氯仿和甲醇的体积比为：1:1～3。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述药物的有机溶液的质量体积浓度为1％～10％，有机溶剂为甲醇、乙腈或氯仿；所述的缓冲液溶解的载脂蛋白模拟肽溶液的浓度为：1～10mg/mL。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液PBS或者醋酸盐缓冲液。
9.权利要求1-4任何一项所述的仿生型高密度脂蛋白纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.权利要求1-4任何一项所述的仿生型高密度脂蛋白纳米粒在制备治疗肝部疾病药物中的应用。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111973759A (zh) * 2020-09-10 2020-11-24 吉林大学 一种诊疗一体化重组高密度脂蛋白的制备方法
CN112569207A (zh) * 2019-09-30 2021-03-30 复旦大学 一种载脂蛋白修饰的仿生纳米肿瘤疫苗及其制备方法和用途
CN112569189A (zh) * 2019-09-29 2021-03-30 复旦大学 一种同时调节肿瘤微环境和靶向杀伤肿瘤细胞的低毒仿生化纳米系统及构建方法
CN112999356A (zh) * 2019-12-19 2021-06-22 四川大学 一种清道夫受体-a靶向的脂肪酸修饰的白蛋白纳米粒及其制备方法和应用
CN113134097A (zh) * 2021-04-23 2021-07-20 南京中医药大学 一种生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒及其制备方法和应用
CN115998711A (zh) * 2022-12-26 2023-04-25 中国药科大学 一种逆转肿瘤耐药的靶向纳米递药系统及其制备方法与应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090110739A1 (en) * 2007-05-15 2009-04-30 University Of North Texas Health Science Center At Forth Worth Targeted cancer chemotherapy using synthetic nanoparticles
CN103816122A (zh) * 2014-01-16 2014-05-28 中国药科大学 一种靶向sr-bi受体的基因与化疗药物共传输抗肿瘤纳米粒的制备及应用
CN105903029A (zh) * 2007-12-12 2016-08-31 大学健康网络 高密度脂蛋白样肽磷脂支架（“hpps”）纳米颗粒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090110739A1 (en) * 2007-05-15 2009-04-30 University Of North Texas Health Science Center At Forth Worth Targeted cancer chemotherapy using synthetic nanoparticles
CN105903029A (zh) * 2007-12-12 2016-08-31 大学健康网络 高密度脂蛋白样肽磷脂支架（“hpps”）纳米颗粒
CN103816122A (zh) * 2014-01-16 2014-05-28 中国药科大学 一种靶向sr-bi受体的基因与化疗药物共传输抗肿瘤纳米粒的制备及应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MCMAHON ET AL ET AL: "Synthetic High-Density Lipoprotein-Like Nanoparticles as Cancer Therapy", 《CANCER TREAT RES》 *
PADMA KADIYALA ET AL: "High-Density Lipoprotein-Mimicking Nanodiscs for Chemo-immunotherapy against Glioblastoma Multiforme", 《ACS NANO》 *
R.M.STOEKENBROEK ET AL: "《Handbook of Experimental Pharmacology》", 1 December 2012, EUROPEAN COOPERATION IN SCIENCE AND TECHNOLOGY *
WALTER J ET AL: "Evaluation of synthetic/reconstituted high-density lipoproteins as delivery vehicles for paclitaxel", 《ANTI-CANCER DRUGS》 *
XUEQIN ZHANG ET AL: "Synthetic lipoprotein as nano-material vehicle in the targeted drug delivery", 《DRUG DELIVERY》 *
王亚燕等主编: "《消化疾病疗学》", 31 March 2019, 吉林科学技术出版社 *
蒋文等: "高密度脂蛋白作为肿瘤靶向载体的研究进展", 《现代肿瘤医学》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112569189A (zh) * 2019-09-29 2021-03-30 复旦大学 一种同时调节肿瘤微环境和靶向杀伤肿瘤细胞的低毒仿生化纳米系统及构建方法
CN112569207A (zh) * 2019-09-30 2021-03-30 复旦大学 一种载脂蛋白修饰的仿生纳米肿瘤疫苗及其制备方法和用途
CN112999356A (zh) * 2019-12-19 2021-06-22 四川大学 一种清道夫受体-a靶向的脂肪酸修饰的白蛋白纳米粒及其制备方法和应用
CN112999356B (zh) * 2019-12-19 2023-03-31 四川大学 一种清道夫受体-a靶向的脂肪酸修饰的白蛋白纳米粒及其制备方法和应用
CN111973759A (zh) * 2020-09-10 2020-11-24 吉林大学 一种诊疗一体化重组高密度脂蛋白的制备方法
CN113134097A (zh) * 2021-04-23 2021-07-20 南京中医药大学 一种生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒及其制备方法和应用
CN115998711A (zh) * 2022-12-26 2023-04-25 中国药科大学 一种逆转肿瘤耐药的靶向纳米递药系统及其制备方法与应用

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