CN113768878A - 一种榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及肿瘤化疗药物领域，针对克服卡巴他赛治疗胶质瘤时毒性大和靶向效率低的问题，提供一种榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体，每100mL含0.15～0.75g榄香烯、0.5～2.5mL无水乙醇、0.015～0.07g卡巴他赛、0.25～1g油、0.25～1g聚乙二醇衍生物、1～5g磷脂、0.05～0.2g胆固醇、0.025～0.1g DSPE‑PEG2000‑转铁蛋白、0.005～0.025g肿瘤细胞膜蛋白，余量为水。两种药物协同作用，提高药物的BBB透过率及胶质瘤细胞摄取率，同时减少了卡巴他赛毒副作用和榄香烯的刺激性。本发明还提供所述脂质体的制备方法和应用。

Description

一种榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及肿瘤化疗药物技术领域，尤其是涉及一种榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体及其制备方法。
背景技术
脑胶质瘤是人类最具威胁的疾病之一，预后极差、死亡率高。到目前为止，手术是最直接有效的治疗策略，可以显著减轻症状，延长胶质瘤患者的生存。然而，由于胶质瘤的异质性和浸润性特点，手术并不能完全切除，复发风险高。化疗也是必要的，然而，胶质瘤的化疗通常因血脑屏障(BBB)的选择性渗透性和药物对肿瘤组织的靶向性差而受阻。BBB上有一个ATP依赖的外排泵P-糖蛋白(P-gp)，它可以主动泵出底物，增加对细胞毒性药物的清除。特别是，抗癌药在穿越BBB后，难以靶向于胶质瘤区域从而吸附于其他正常区域，有可能降低疗效甚至造成神经毒性。因此，设计一种能够穿透BBB、逃逸流出机制和靶向进入胶质瘤的载体至关重要。
脂质体是由磷脂双层膜形成的球形囊泡，在生物相容性和穿越血脑屏障方面引起了广泛的关注。它们是神经胶质瘤治疗的常见载体。由于缺乏主动靶向和肿瘤靶向能力，限制了其在胶质瘤化疗中的应用。BBB上有多种胰岛素受体、转铁蛋白、内皮生长因子和氨基酸的过表达。受体介导的内吞作用是各种药物通过BBB的主要机制之一。这里，转铁蛋白(Tf)被用作靶向配体修饰脂质体，通过特异性识别Tf受体来增加BBB的穿透效应。虽然通过上述方法可以改善脑药物积累，但穿透BBB后靶向胶质瘤仍具有挑战性。
为了进一步提高抗癌药物的肿瘤聚集性，将胶质瘤细胞膜蛋白(CMP)包埋到Tf脂质体中，研制了仿生脂质体。近年来，基于癌细胞细胞膜(蛋白)的仿生纳米工程备受关注，并被应用于具有同源靶向和免疫逃逸功能的仿生脂质体的开发。由于脂质体与源癌细胞细胞膜的特异性同型结合，脂质体已经取得了很好的活性靶向性。此外，免疫系统在识别膜伪装脂质体方面存在困难，因为它们被视为具有长循环的源细胞。自2014年第一篇报道以来，基于CMP的仿生纳米工程已广泛应用于免疫治疗、生物成像、治疗学和胶质瘤光治疗学等生物医学领域。然而，用于胶质瘤化疗的主动靶向仿生脂质体很少报道。
卡巴他赛(CTX)是一种新型的半合成紫衫烷类化合物，分子式为C45H57NO14，分子量为835.94，几乎不溶于水，溶于乙醇。临床前动物研究表明卡巴他赛具有广谱的抗肿瘤活性，包括前列腺癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌等，且可以透过BBB。与其它紫杉醇类药物相比，CTX对胶质瘤有明显的抑制作用，但毒性较大。榄香烯(ELE)是疗效较好、副作用小的抗癌天然活性成分，从温莪术中提取分离得到，榄香烯包括α、β、γ、δ等多种榄香烯异构体。研究发现榄香烯可以对多种癌细胞产生抑杀作用，诱导肿瘤细胞分化和凋亡，抑制肿瘤细胞的浸润和远处转移，抑制肿瘤血管生成，提高机体抗肿瘤免疫反应。例如专利CN101921164A名称为(-)-β-榄香烯、(-)-β-榄香醛、(-)-β-榄香醇、(-)-β-氟化榄香烯及其类似物、中间体和组合物的合成及应用，公开了榄香烯针对癌症，尤其是对脑肿瘤、肺癌、卵巢癌、膀胱癌、子宫颈癌、结肠癌、乳腺癌和前列腺癌均有疗效。ELE是一种脂溶性小分子化合物，可通过BBB，在临床应用中对恶性胶质瘤起一定的疗效。
发明内容
本发明为了克服卡巴他赛用于治疗胶质瘤时毒性较大和靶向效率低的问题，提供一种榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体，将榄香烯、卡巴他赛、DSPE-PEG2000-转铁蛋白、细胞膜蛋白、TPGS等同时包封于脂质体中，使两种药物协同作用于脑胶质瘤细胞，提高药物的BBB透过率及胶质瘤细胞摄取率，靶向疗效得到明显增强；同时，显著减少了卡巴他赛毒副作用和榄香烯的刺激性，显著提高了安全性，有效避免了对正常脑细胞及其他组织器官的副作用。本发明还提供所述榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体，由以下组分组成：每100mL中，含0.15～0.75g榄香烯ELE、0.5～2.5mL无水乙醇、0.015～0.07g卡巴他赛CTX、0.25～1g油、0.25～1g聚乙二醇衍生物、1～5g磷脂、0.05～0.2g胆固醇、0.025～0.1g DSPE-PEG2000-转铁蛋白、0.005～0.025g肿瘤细胞膜蛋白，余量为水。
限制脑部肿瘤治疗的主要原因有P-gp泵外排、药物靶向性及中枢神经毒性等，因此如何提高药物、防止P-gp泵外排、增强肿瘤靶向性及提高安全性是一个很重要的问题，而本发明采用转铁蛋白能特异性识别血脑屏障上过表达的转铁蛋白受体；TPGS等聚乙二醇衍生物、转铁蛋白可以竞争性抑制底物结合，抑制P-gp的ATP酶；细胞膜蛋白能够同源靶向肿瘤细胞，增加药物的细胞摄取率，提高药物的抗肿瘤效果。
卡巴他赛是一种新型紫杉烷类抗肿瘤药物，结构上与多西他赛类似，是其7,10-OH被甲醚化的产物。它主要通过诱导有丝分裂增加，使异常有丝分裂阻滞延长、促进微管蛋白组装、抑制微管蛋白解聚、破坏肿瘤细胞分裂，从而抑制肿瘤细胞生长。卡巴他赛对细胞周期途径有着很强抑制作用，通过作用于细胞M期，阻滞肿瘤细胞的有丝分裂，促使其凋亡。由于结构上的甲醚化，使其与紫杉醇和多西他赛相比，与P-糖蛋白的亲和力更弱，因此对于药物耐受的肿瘤细胞具有更强的抑制作用。但是由于卡巴他赛水溶性差，市售制剂Jevtana加入大量聚山梨酯80和无水乙醇作为共溶剂，导致严重的副作用，包括全身性皮疹/红斑、低血压和支气管痉挛。
榄香烯(ELE)可以通过血脑屏障的阻碍，这是由于榄香烯是脂溶性小分子(分子量204.3)；通过影响外分泌体介导RNAS进行细胞间信息传递进一步影响细胞的生物学通路；通过下调线粒体的膜电位，诱导肿瘤细胞的凋亡；诱导细胞渗透性的改变，增强药物在细胞内的富集。本发明中榄香烯可以为α-榄香烯、β-榄香烯、γ-榄香烯、δ-榄香烯中的一种或几种。
榄香烯和卡巴他赛两者联用，并制成双靶向仿生脂质体，可以多靶点、多途径发挥协同作用，从而发挥联合增效和防止耐药作用。同时，由于卡巴他赛毒性大，榄香烯较安全，在保证疗效的情况下，可以大大减少卡巴他赛用量。榄香烯仍有一定的刺激性，因此将榄香烯包封在油中，减少其刺激性。所以该双靶向仿生脂质体在DSPE-PEG-转铁蛋白、细胞膜蛋白、油、磷脂、聚乙二醇衍生物、渗透压凋节剂的作用下显著增强疗效和防止耐药效果，同时显著降低毒性，对相关胶质瘤细胞具有所需的细胞毒性、细胞停滞或生物效应。
发明人发现，ELE和CTX以10:1的质量比封装在相同的纳米颗粒中具有协同作用，并降低毒性。当纳米颗粒的用量仅为常规CTX注射液的25％时，也可达到相同的效果。因此，ELE和CTX共埋入纳米颗粒有望获得最佳的抗胶质瘤效果。将脂质体与Tf偶联，并将CMP嵌入脂质体制备ELE和CTX脂质体(Tf-ELE/CTX@BLIP)，用于穿越BBB和小鼠原位胶质瘤的主动靶向化疗。发明人研究了Tf-ELE/CTX@BLIP在抑制P-gp、主动靶向、免疫逃逸、体外细胞毒性、促进细胞凋亡及其在体内的分布，还评价了Tf-ELE/CTX@BLIP对小鼠原位胶质瘤的抗肿瘤活性和毒性。
作为优选，油选自大豆油、中链甘油三酯MCT、棕榈油、椰子油、鱼油、氢化油和动物油中的一种或几种。
作为优选，磷脂选自大豆磷脂、蛋黄磷脂、氢化磷脂、合成磷脂中的一种或几种。
作为优选，聚乙二醇衍生物选自维生素E聚乙二醇琥珀酸酯TPGS或二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇。
作为优选，DSPE-PEG2000-转铁蛋白选自DSPE-PEG2000-转铁蛋白、DSPE-PEG3000-转铁蛋白、DSPE-PEG4000-转铁蛋白、DSPE-PEG5000-转铁蛋白中的一种或几种。
作为优选，肿瘤细胞膜蛋白选自RG2、C6、U251、U87、BT-325中的一种或几种。
本发明还提供上述榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体的制备方法，包括如下步骤：
(1)油相制备：按比例将油、磷脂、胆固醇、聚乙二醇衍生物、榄香烯、DSPE-PEG-转铁蛋白和卡巴他赛于70～100℃熔融得到油相；
(2)水相制备：将渗透压调节剂和水混合，在50～70℃下保温溶解得到水相；
(3)混合挤压：将上述油相加入水相中，高速剪切后再进行超声破碎，加入膜蛋白，反复挤压过滤膜，即得双靶向仿生脂质体。
作为优选，步骤(2)所述渗透压调节剂选自甘油、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、麦牙糖、甘露醇中的一种或几种。
作为优选，步骤(3)所述高速剪切的速率为8000～15000r/min，剪切时间20～40min；超声破碎条件为230～240W。
作为优选，步骤(3)所述滤膜为0.45μm和0.22μm的滤膜。
本发明还提供上述榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体的应用，用于脑胶质瘤的治疗，也可用于其他品系胶质瘤的治疗。
因此，本发明的有益效果为：
(1)将榄香烯、卡巴他赛、DSPE-PEG2000-转铁蛋白、肿瘤细胞膜蛋白、聚乙二醇衍生物等同时包封于脂质体中，使两种药物协同作用于脑胶质瘤细胞，提高药物的BBB透过率及胶质瘤细胞摄取率，靶向效率和疗效得到明显增强。同时，显著减少了卡巴他赛毒副作用和榄香烯的刺激性，显著提高了安全性，有效避免了对正常脑细胞及其他组织器官的副作用。本发明制得的双靶向仿生脂质体主要用于RG2同源性胶质瘤的治疗，也可用于其他品系胶质瘤的治疗。与现有技术相比，本发明所获得的榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体显著提高了抗耐药肿瘤疗效，显著提高了安全性；
(2)本发明制得的粒径适中，粒径分布均匀，稳定性好，十分便于临床使用；
(3)制备方法工艺简单，可重复性强，适合大规模生产。
附图说明
图1是本发明实施例1制得的榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体粒径和分布图。
图2是本发明实施例1制得的榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体Zeta电位图。
图3是本发明实施例1制得的榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体与对照制剂治疗后的肿瘤组织荧光定量。
图4是本发明实施例1制得的榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体与对照制剂治疗后的肿瘤荧光强度、生存期及体重变化。
图5是本发明实施例1制得的榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体与对照制剂治疗后的效果。
图6是本发明实施例1制得的榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体与对照制剂的安全性对比。
图3-6中，Control组，生理盐水。ELE solution组，榄香烯注射液，25mg/kg，隔天一次。CTX solution组，卡巴他赛注射液。ELE/CTX-LIP组，榄香烯卡巴他赛脂质体。ELE/CTX-BLIP组，榄香烯卡巴他赛仿生脂质体。Tf-ELE/CTX-LIP组，转铁蛋白修饰的榄香烯卡巴他赛靶向脂质体。Tf-ELE/CTX-BLIP组，榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体。CTX solution组，ELE/CTX-LIP组，ELE/CTX-BLIP组，Tf-ELE/CTX-LIP组和Tf-ELE/CTX-BLIP组第一次给药2.5mg/kg(以卡巴他赛计)，以后0.625mg/kg/次，隔天一次。
图7是本发明实施例1制得的榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体的同源靶向性与免疫逃逸；图中(A)流式细胞术分析和(B)Tf-ELE/CTX@BLIP作用于A549,LM-3,SPC-A-1,MDA-M-231,U251,C6和RG2 2h的Rho B平均荧光强度。(C)激光共聚焦成像和(D)流式细胞术分析检测Tf-ELE/CTX@BLIP，Tf-ELE/CTX@LIP，ELE/CTX@BLIP和ELE/CTX@LIP处理RG2神经胶质瘤细胞2h的Rho B平均荧光强度。(E)流式细胞术分析和(F)Tf-ELE/CTX@BLIP，Tf-ELE/CTX@LIP，ELE/CTX@BLIP和ELE/CTX@LIP处理2h后的RAW264.7细胞激光共聚焦成像。
图8是本发明实施例1制得的榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体的细胞毒性、促凋亡与P-gp抑制作用；图中(A)流式细胞术分析和(B)Tf-ELE/CTX@BLIP作用于A549,LM-3,SPC-A-1,MDA-M-231,U251,C6和RG2 2h的Rho B平均荧光强度。(C)激光共聚焦成像和(D)流式细胞术分析检测Tf-ELE/CTX@BLIP，Tf-ELE/CTX@LIP，ELE/CTX@BLIP和ELE/CTX@LIP处理RG2神经胶质瘤细胞2h的Rho B平均荧光强度。(E)流式细胞术分析和(F)Tf-ELE/CTX@BLIP，Tf-ELE/CTX@LIP，ELE/CTX@BLIP和ELE/CTX@LIP处理2h后的RAW264.7细胞激光共聚焦成像。(A)IC50，(B)细胞抑制率(CCTX＝50ng/mL)，(C)细胞抑制率(CCTX 0.4to 200ng/mL)。(D)RG2细胞经Tf-ELE/CTX@BLIP，Tf-ELE/CTX@LI，ELE/CTX@BLIP和ELE/CTX@LIP孵育48h的细胞凋亡情况。(E)Rho 123摄取共聚焦图像，(F)bEnd.3细胞经Tf-ELE/CTX@BLIP，Tf-ELE/CTX@LI，ELE/CTX@BLIP和ELE/CTX@LIP孵育2h的Rho 123摄取定量分析。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案做进一步说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的，实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1(榄香烯含量0.4％，无水乙醇1.25％，卡巴他赛0.04％，油0.5％，聚乙二醇衍生物0.5％，磷脂2.5％，胆固醇0.1％，DSPE-PEG2000-转铁蛋0.05％，肿瘤细胞膜蛋白0.025％)
一种榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体，以20mL计，原料组成为：卡巴他赛8mg、无水乙醇0.25mL、MCT 100mg、TPGS 100mg、大豆磷脂500mg、榄香烯80mg、DSPE-PEG2000-转铁蛋白10mg、胆固醇20mg、肿瘤细胞膜蛋白5mg、甘油520mg，其余为水。
上述榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体的制备方法为：
(1)油相制备：取卡巴他赛超声溶解于无水乙醇中，加入MCT、TPGS、大豆磷脂、榄香烯、胆固醇、DSPE-PEG2000-转铁蛋白，80℃水浴溶解；
(2)水相制备：取甘油溶于水中，60℃水浴溶解；
(3)混合挤压：将油相加入水相，60℃水浴10000r/min剪切30min，探头超声破碎；加入5mg肿瘤细胞膜蛋白通过挤压法反复挤压过0.45μm和0.22μm滤膜，即得榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体。
实施例2(榄香烯含量0.15％)
与实施例1的区别为榄香烯用量30mg。
实施例3(榄香烯含量0.75％)
与实施例1的区别为榄香烯用量150mg。
实施例4(卡巴他赛含量0.015％)
与实施例1的区别为卡巴他赛用量3mg。
实施例5(卡巴他赛含量0.07％)
与实施例1的区别为卡巴他赛用量14mg。
实施例6(无水乙醇含量0.5％)
与实施例1的区别为无水乙醇0.1mL。
实施例7(无水乙醇含量2.5％)
与实施例1的区别为无水乙醇0.5mL。
实施例8(MCT含量0.25％)
与实施例1的区别为MCT 50mg。
实施例9(MCT含量1％)
与实施例1的区别为MCT 200mg。
实施例10(TPGS含量0.25％)
与实施例1的区别为TPGS 50mg。
实施例11(TPGS含量1％)
与实施例1的区别为TPGS 200mg。
实施例12(大豆磷脂含量1％)
与实施例1的区别为大豆磷脂200mg。
实施例13(大豆磷脂含量5％)
与实施例1的区别为大豆磷脂1000mg。
实施例14(胆固醇含量0.05％)
与实施例1的区别为胆固醇10mg。
实施例15(胆固醇含量0.2％)
与实施例1的区别为胆固醇40mg。
实施例16(DSPE-PEG2000-转铁蛋白0.025％)
与实施例1的区别为DSPE-PEG2000-转铁蛋白5mg。
实施例17(DSPE-PEG2000-转铁蛋白0.1％)
与实施例1的区别为DSPE-PEG2000-转铁蛋白20mg。
实施例18(肿瘤膜蛋白0.0125％)
与实施例1的区别为肿瘤膜蛋白RG2 2.5mg。
实施例19(肿瘤膜蛋白0.005％)
与实施例1的区别为肿瘤膜蛋白RG2 1mg。
实施例20
一种榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体，以20mL计，原料组成为：卡巴他赛8mg、无水乙醇0.25mL、棕榈油和椰子油各50mg、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇100mg、DSPC合成磷脂500mg、榄香烯80mg、DSPE-PEG5000-转铁蛋白10mg、胆固醇20mg、肿瘤细胞膜蛋白C65mg、葡萄糖和蔗糖各260mg，其余用水补齐。
上述榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体的制备方法为：
(1)油相制备：取卡巴他赛超声溶解于无水乙醇中，加入棕榈油和椰子油、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、合成磷脂、榄香烯、胆固醇、DSPE-PEG5000-转铁蛋白，80℃水浴溶解；
(2)水相制备：葡萄糖和蔗糖、水，60℃水浴溶解；
(3)混合挤压：将油相加入水相，60℃水浴10000r/min剪切30min，探头超声破碎；加入5mg肿瘤细胞膜蛋白C6通过挤压法反复挤压过0.45μm和0.22μm滤膜，即得榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体。
结果测试
一、采用纳米粒径电位仪检测各实施例制得的榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体的粒径与电位，结果如表1所示。
表1：榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体3批粒径、分布和电位结果
项目 平均强度粒径(nm) 平均PI值
实施例1 135.1±4.2 0.263±0.018
实施例2 132.9±0.9 0.204±0.010
实施例3 118.2±0.5 0.207±0.006
实施例4 123.2±1.6 0.202±0.019
实施例5 153.8±3.1 0.216±0.020
实施例6 133.2±3.5 0.227±0.015
实施例7 121.6±1.7 0.205±0.01
实施例8 137.6±0.9 0.216±0.013
实施例9 134.9±3.0 0.190±.024
实施例10 137.8±2.3 0.209±0.006
实施例11 134.6±2.9 0.222±0.016
实施例12 118.1±2.7 0.208±0.013
实施例13 130.0±2.6 0.271±0.006
实施例14 145.0±2.0 0.293±0.012
实施例15 107.1±0.7 0.234±0.048
实施例16 138.6±2.1 0.280±0.016
实施例17 116.4±0.8 0.267±0.018
实施例18 119.3±1.3 0.239±0.011
实施例19 127.7±2.1 0.204±0.009
图1是实施例1制得的榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体的粒径和分布图，从表1和图1中可以看出，本发明制得的榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体粒径适中、粒径分布均匀。对实施例1中制得的榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体的Zeta电位值进行测试，结果如图2所示，从图2中可以看出，本发明制得的榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体的Zeta电位绝对值大于25mV，反映制剂物理稳定性较好。
二、实施例1制得的榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体的药效学42只荷瘤裸鼠随机分为7组，(1)对照组，也叫Control组(生理盐水)；(2)CTX solution组，卡巴他赛注射液；(3)ELE solution组，榄香烯注射液，25mg/kg，隔天一次；(4)ELE/CTX@LIP组，榄香烯卡巴他赛脂质体；(5)ELE/CTX@BLIP组，榄香烯卡巴他赛仿生脂质体；(6)Tf-ELE/CTX@LIP组，转铁蛋白修饰的榄香烯卡巴他赛靶向脂质体；(7)Tf-ELE/CTX@BLIP，榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体，每组6只。
通过尾静脉缓慢给药。第1、3、5、7、9、11天尾静脉注射。2、4、5、6、7组第一次给予2.5mg/kg(CTX)，后5次给予0.625mg/kg。在不同的治疗后，小鼠在第1、5、10、15天进行生物发光成像以测量肿瘤生长。记录每3d的体重和存活时间。根据MRI图像计算肿瘤体积(Vt)。a表示肿瘤长度，b表示肿瘤宽度，c表示核磁层高度(层数×每层厚度0.5mm)，[Vt＝a×b×c/2]。
各治疗组结果见附图3-6。结果表明，在治疗15天后，Tf-ELE/CTX@BLIP组的肿瘤荧光强度与其他组相比最小。定量分析显示，Tf-ELE/CTX@BLIP对肿瘤生长有抑制作用。肿瘤荧光强度分别比对照组，CTX solution组，ELE solution组，ELE/CTX@LIP组，ELE/CTX@BLIP组，Tf-ELE/CTX@LIP组降低65.2、12.5、22.1、6.6、2.6、1.5倍。这些结果与荧光图像一致，表明Tf-ELE/CTX@BLIP介导的化疗能显著抑制胶质瘤的生长。此外，对照组，CTX注射液组和ELE注射液组小鼠体重在第9天开始下降，其他组小鼠在治疗后15天内体重明显增加，这表明载药脂质体有助于小鼠的体重。ELE/CTX@LIP组中位生存时间为28天，验证了治疗效果优于对照组、CTX注射液组和ELE注射液组。ELE/CTX@BLIP组和Tf-ELE/CTX@LIP组小鼠的中位生存时间分别为31天和30天，表明CTX注射液和传统脂质体处理小鼠的生存时间延长。结果表明，靶向脂质体具有较好的抗胶质瘤作用。Tf-ELE/CTX@BLIP组的平均生存时间是33天，较ELE/CTX@LIP和Tf-ELE/CTX@LIP组延长了6.5％和10.0％，表明Tf/CMP对抗胶质瘤、为大脑积累和药物的同源神经胶质瘤靶向做出了一定的贡献。
通过MRI评估肿瘤进展。结果发现，Tf-ELE/CTX@BLIP治疗组的肿瘤区域少于其他组。接种胶质瘤细胞后，Tf-ELE/CTX@BLIP具有明显的抑瘤活性。简而言之，对照组和ELE注射液组携带胶质瘤小鼠脑组织可见不规则等长T1混合T2占位性病变，周围为斑片状和黄斑水肿区。邻近脑组织受肿瘤压迫，神经胶质增生，边界不清。左侧脑室变窄，中线向左移位。CTX溶液组小鼠脑损伤与对照组和ELE注射液组相似，但未见胶质细胞增生。ELE/CTX@LIP组与对照组和ELE注射组比较，病变类型相同，病变周围有水肿。肿瘤在邻近脑组织的压迫使左侧脑室变窄，中线向左侧移动。ELE/CTX@BLIP组和TF-ELE/CTX@LIP组脑组织病灶周围未见水肿，相邻脑组织未受压迫，中线清晰。TF-ELE/CTX@BLIP组小鼠边界和中线清晰可见，病灶周围无水肿，邻近脑组织无肿瘤压迫，肿瘤细胞的侵袭性生长受到明显抑制。
对Tf-ELE/CTX@BLIP处理组脑组织切片的H&E染色结果显示，对照组肿瘤组织质地致密，未见明显凋亡细胞，中央无坏死区域。与其他组相比，坏死面积小于总面积的1/4，这与存活时间较短相一致。游离ELE、CTX溶液组小鼠肿瘤体积减小，凋亡细胞数量少(ELE注射液组)或明显(CTX注射液组)，提示ELE、CTX有一定的抗胶质瘤作用。与游离ELE&CTX组相比，ELE/CTX@LIP、ELE/CTX@BLIP和Tf-ELE/CTX@LIP组小鼠胶质瘤体积进一步减小。质地疏松，有明显的凋亡细胞和中央坏死区。坏死面积接近总面积的1/2，显示强烈的抗胶质瘤作用。此外，Tf-ELE/CTX@BLIP组胶质瘤大小最小，坏死面积接近肿瘤总面积的3/4，说明主动靶向仿生纳米平台抗胶质瘤效果最好。
对脑组织进行TUNEL染色评价Tf-ELE/CTX@BLIP诱导细胞凋亡的能力。Tf-ELE/CTX@BLIP处理组细胞凋亡率最高，与细胞凋亡实验结果一致，说明Tf-ELE/CTX@BLIP在体内可以促进肿瘤细胞凋亡，而对照组的凋亡活性可以忽略不计。此外，还对P-gp的表达进行了评估。与对照组、ELE/CTX溶液组和经典脂质体相比，Tf-ELE/CTX@BLIP中P-gp的表达最低，提示Tf-ELE/CTX@BLIP不能诱导P-gp的阳性表达，可以绕过外排效应。
三、实施例1制得的榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体的主动靶向性和免疫逃逸能力Tf-ELE/CTX@BLIP对各种肿瘤细胞的亲和力对比：将包载荧光的Tf-ELE/CTX@BLIP与不同细胞系孵育，包括SPC-A-1细胞(人肺腺癌细胞)、A549细胞(肺癌细胞)、MDA-MB-231细胞(人乳腺癌细胞)、LM-3细胞(肝癌细胞)、U251细胞、C6细胞、RG2细胞。3万个细胞(2mL培养基)中被接种到6孔板中。孵育12h后，用Tf-RhoB@BLIP(RhoB＝20ug/mL)的新鲜培养基替换细胞培养液。2小时后，加胰酶消化收集细胞。结束后加入大量PBS置于离心管中离心，除去上清液，再加入大量PBS重复一次，除去可能未被细胞吞噬的荧光物质，并顺便除去消化液。洗净后加入1mL PBS，置成悬浮液，再转到流式管里进行流式细胞仪分析。同样地，接种到6孔板(3×105cells/well)的RG2细胞也与ELE/CTX@LIP、ELE/CTX@BLIP、Tf-ELE/CTX@LIP和Tf-ELE/CTX@BLIP B(RhoB＝20μg/mL)2h。细胞用4％多聚甲醛固定，与DAPI染色，用PBS三次洗净，最后用共焦激光扫描显微镜成像和流式细胞术分析。用ELE/CTX@LIP、ELE/CTX@BLIP、Tf-ELE/CTX@LIP和Tf-ELE/CTX@BLIP(Rho B＝20μg/mL)作用巨噬细胞RAW264.7细胞2h，采用CLSM和流式细胞术检测细胞摄取。
结果如图7所示。结果显示，Tf-ELE/CTX@BLIP在RG2细胞组的荧光强度是其他细胞系的1.21-2.02倍。RG2细胞较高的摄取效率证实了Tf-ELE/CTX@BLIP的同源靶向能力。此外，激光共聚焦结果显示在37℃作用2h后，较ELE/CTX@LIP、Tf-ELE/CTX@LIP、ELE/CTX@BLIP和Tf-ELE/CTX@BLIP相比，更多的Tf-ELE/CTX@BLIP进入RG2胶质瘤细胞胞浆，表现出更强的荧光信号，进一步表明Tf-ELE/CTX@BLIP具有同源靶向能力。流式细胞仪定量分析结果显示，Tf-ELE/CTX@BLIP作用下的细胞荧光强度比其他组高3.34-5.83倍，显示了其优异的活性靶向能力。
此外，采用CLSM成像和流式细胞仪检测RAW264.7巨噬细胞对Tf-ELE/CTX@BLIP、Tf-ELE/CTX@LIP、ELE/CTX@BLIP和ELE/CTX@LIP的内化情况，以检测其抗吞噬性能。结果显示，只有极少数的Tf-ELE、CTX@BLIP和ELE/CTX@BLIP被原始RAW264.7巨噬细胞吞噬，与Tf-ELE/CTX@LIP和ELE/CTX@LIP处理的细胞相比荧光强度弱1.83～1.92倍，表明仿生脂质体的良好的免疫逃逸能力。
四、实施例1制得的榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体的细胞毒性、促凋亡与P-gp抑制作用采用CCK-8法检测ELE/CTX@LIP、ELE/CTX@BLIP、Tf-ELE/CTX@LIP和Tf-ELE/CTX@BLIP对RG2细胞的细胞毒性。将RG2细胞(3000个/孔)接种于96孔板中。24h后，用ELE/CTX@LIP、ELE/CTX@BLIP、Tf-ELE/CTX@LIP和Tf-ELE/CTX@BLIP(CTX浓度为0.4～200ng/mL)处理细胞48h。未处理的细胞作为阴性对照。以培养基为空白对照，评价其细胞毒性。通过Spark多功能微孔板检测平台(Tecan，Switzerland)在450nm处测定吸光度，定量测定细胞活力。
流式细胞仪(CytoFLEX S，USA)检测凋亡细胞数量。ELE/CTX@LIP，ELE/CTX@BLIP，Tf-ELE/CTX@LIP和Tf-ELE/CTX@BLIP在等效于50ng/mL CTX的作用下孵育48h，然后用凋亡检测试剂盒(Genview，USA)处理10分钟。随后，FACS Calibur系统分析凋亡细胞的百分比。相比之下，未处理的细胞作为阴性对照。
bEnd.3细胞系培养如上所述。细胞被接种到6孔板块(5×105细胞/孔)预先处理12h。ELE/CTX@LIP，ELE/CTX@BLIP，Tf-ELE/CTX@LIP和Tf-ELE/CTX@BLIP(50ng/mL)和维拉帕米(0.625μg/mL)分别作用0.5h，再用P-gp底物罗丹明123(20μg/mL)作用2h。4％多聚甲醛固定细胞30min，PBS洗涤3次，最后用荧光显微镜和流式细胞仪测定。
结果如图8所示。CCK-8定量分析显示，ELE/CTX@LIP、ELE/CTX@BLIP、Tf-ELE/CTX@LIP和Tf-ELE/CTX@BLIP(CCTX 0.4～200ng/mL)组的IC50分别为54.25±4.90ng/mL、42.70±0.76、31.30±1.44和27.38±0.67。同时，Tf-ELE/CTX@BLIP、Tf-ELE/CTX@LIP、ELE/CTX@BLIP和ELE/CTX@LIP(CCTX＝50ng/mL)的细胞抑制率分别为56.50±0.86％、54.69±1.79％、52.41±1.50％和49.44±1.33％。Tf-ELE/CTX@BLIP对RG2细胞具有较高的细胞毒性，表明其在体内应用的潜在优势。
Annexin V-FITC/PI双染色法测定表明，与对照组(25.68％)相比，暴露在CTX注射液组(42.47％)和ELE+CTX组(67.89％)，Tf-ELE/CTX@BLIP组(60.97％)、ELE/CTX@BLIP组(56.02％)、Tf-ELE/CTX@LIP组(60.80％)和ELE/CTX@LIP组(42.49％)的RG2细胞凋亡数量显著增加，说明ELE+CTX能通过激活凋亡通道抑制胶质瘤细胞增殖，而通过脂质体与Tf偶联、CMP包埋的Tf-ELE/CTX@BLIP能增强促凋亡作用，与细胞毒性实验一致。
为了研究转铁蛋白修饰后脂质体穿过血脑屏障的运输，我们检测了在bEnd.3中罗丹明-123的积累。P-gp是血脑屏障的主要生理障碍之一(外排效应)。以P-gp外排抑制剂维拉帕米(Verapamil)为阳性对照，用P-gp的荧光底物罗丹明123研究外排效应。结果表明，经Tf-ELE/CTX@LIP和Tf-ELE/CTX@BLIP孵育后，与对照组相比，从bEnd.3外排的罗丹明-123显著减少，说明Tf-ELE/CTX@BLIP和Tf-ELE/CTX@LIP可以显著增加罗丹明-123穿过血脑屏障的通透性。流式细胞仪定量分析显示，Tf-ELE/CTX@BLIP和Tf-ELE/CTX@LIP作用的细胞荧光强度明显增加，显示外排效应抑制作用。
总之，榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体对脑胶质瘤具有较好的药效。与榄香烯注射液、卡巴他赛注射液、传统脂质体相比，有较大优势，疗效和安全性更好。将榄香烯与卡巴他赛同时包封于柔性脂质体中，可以使两种药物协同作用于肿瘤细胞，在加用一定量榄香烯并改良制剂的情况下，明显减少了卡巴他赛的用量，增强了疗效，减少了卡巴他赛毒副作用，提高了安全性，对胶质瘤具有较好的临床转化应用前景。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体，其特征在于，由以下组分组成：每100mL中，含0.15～0.75g榄香烯、0.5～2.5mL无水乙醇、0.015～0.07g卡巴他赛、0.25～1g油、0.25～1g聚乙二醇衍生物、1～5g磷脂、0.05～0.2g胆固醇、0.025～0.1g DSPE-PEG2000-转铁蛋白、0.005～0.025g肿瘤细胞膜蛋白，余量为水。
2.根据权利要求1所述的一种榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体，其特征在于，所述油选自中链甘油三酯、大豆油、棕榈油、椰子油、鱼油、氢化油和动物油中的一种或几种。
3.根据权利要求1或2所述的一种榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体，其特征在于，所述磷脂选自大豆磷脂、蛋黄磷脂、氢化磷脂、合成磷脂中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的一种榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体，其特征在于，所述聚乙二醇衍生物选自维生素E聚乙二醇琥珀酸酯或二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇。
5.根据权利要求1所述的一种榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体，其特征在于，所述DSPE-PEG2000-转铁蛋白选自DSPE-PEG2000-转铁蛋白、DSPE-PEG3000-转铁蛋白、DSPE-PEG4000-转铁蛋白、DSPE-PEG5000-转铁蛋白中的一种或几种。
6.根据权利要求1或5所述的一种榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体，其特征在于，所述细胞膜蛋白选自RG2、C6、U251、U87、BT-325中的一种或几种。
7.权利要求1-6任一榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)油相制备：按比例将油、磷脂、胆固醇、聚乙二醇衍生物、榄香烯、DSPE-PEG-转铁蛋白和卡巴他赛于70～100℃熔融得到油相；
(2)水相制备：将渗透压调节剂和水混合，在50～70℃下保温溶解得到水相；
(3)混合挤压：将上述油相加入水相中，高速剪切后再进行超声破碎，加入膜蛋白，反复挤压过滤膜，即得双靶向仿生脂质体。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述渗透压调节剂选自甘油、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、麦牙糖、甘露醇中的一种或几种。
9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述高速剪切的速率为8000～15000r/min，剪切时间20～40min；超声破碎条件为230～240W。
10.权利要求1-6任一榄香烯卡巴他赛双靶向仿生脂质体的应用，其特征在于，用于脑胶质瘤的治疗。
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