CN104225609B - 一种炎症靶向的中性粒细胞递药系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种炎症靶向的中性粒细胞递药系统及其应用。所述的递药系统由中性粒细胞以及以直接或间接地方式载到中性粒细胞内或表面的治疗性物质或者检测性物质组成。本发明将中性粒细胞作为药物的载体，能够将药物主动靶向到炎症部位，提高药物在炎症部位的浓度。到达炎症部位的中性粒细胞在细胞因子的刺激下，异常激活，快速解体以“天网”形式死亡，有利于将所荷载的药物快速释放到靶部位，提高治疗效果，降低毒副作用。

Description

一种炎症靶向的中性粒细胞递药系统及其应用
技术领域
本发明属于药物制剂领域，涉及一种炎症靶向的中性粒细胞递药系统及其应用，具体涉及一种以中性粒细胞为载体的靶向炎症部位的递送系统。
背景技术
炎症指生物组织受到外伤、出血、或病原感染等刺激，激发的生理反应，其中包括红肿、发热、疼痛等症状。炎症反应是先天免疫系统为移除有害刺激或病原体及促进修复的一种重要防御机制，根据发病的原因分为感染性炎症、非特异性炎症及变态反应性炎症。感染性炎症是由病毒、细菌或细菌产物造成的炎症，通常用抗生素或抗真菌药物来治疗；非特异性炎症是用某种致炎因子于动物体内或体外引起炎症或其某个阶段的细胞组织反应，如缺血再灌注性损伤、术后损伤等，需要系统性治疗；变态反应性炎症是多型变态反应的终末表现如狼疮性皮炎，需要抗免疫治疗。
目前，针对炎症组织全身给药后，由于其独特的病理特征，使得药物的靶向效率较低，全身毒副作用较大。炎症的病理特征主要包括局部组织变质、渗出和增生。由于炎症血管具有较高的通透性，血管内富含蛋白质的液体和白细胞渗出，导致炎症局部组织间质压升高。可见，炎症部位血管的高渗透性为药物从血管溢出并滞留于炎症部位提供了可能，但是由于较高的炎症组织间质压阻碍了药物进入炎症部位。由于抗炎药物较低的靶向性，使得一些感染性炎症如细菌性肺炎，治疗不及时，从而产生耐药性导致较高的死亡率。而对于一些炎症相关疾病的治疗，如缺血再灌注性脑损伤、术后肿瘤复发等，由于原发灶在周围被非特异性炎症组织所包围，治疗药物靶向效率降低，药效下降，副作用增加。
如何以最小的剂量达到最佳的诊断和治疗效果一直以来都是困扰药剂工作者们的关键性问题，随着纳米技术领域的发展和人们对生物体的不断深入了解，靶向递送系统应运而生。靶向递送系统主要分为三大类：被动靶向、主动靶向以及物理化学靶向。与以往的传递系统相比，虽然这些新兴的靶向递送系统已经有了质的飞跃，但是仍然存在靶向性差，毒副作用强，诊断治疗效果难以达到人们预期等的缺点，因此，极其需要寻找一种更为高效、低毒的靶向递送系统。
免疫细胞，包括单核吞噬细胞(树状突细胞，单核细胞和巨噬细胞)，中性粒细胞和淋巴细胞。炎症过程中免疫细胞的渗出是炎症反应最为重要的特征，而中性粒细胞作为炎症发生时的“防御卫士”，被趋化因子吸引能够第一时间到达炎症部位。目前，仍未见中性粒细胞作为载体用于炎症部位药物、探针和显影剂递送研究的相同或相近报导。药物或纳米制剂荷载到中性粒细胞内存在一些有待解决的科学问题，如药物荷载的方式，细胞荷载药物、探针和显影剂的量，所荷载药物在细胞内稳定性以及细胞载体固有生理活性的维持等问题。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了靶向炎症组织的荷载药物的中性粒细胞递药系统。
本发明的另一目的是提供该递药系统的应用。
本发明的又一目的是提供一种治疗炎症的药物。
一种炎症靶向的中性粒细胞递药系统，所述的递药系统由中性粒细胞以及以直接或间接地方式载到中性粒细胞内或表面的治疗性物质或者检测性物质组成。
其中，所述的治疗性物质包括但不限于药物(化学合成药物、天然药物或天然药物提取物)、具有治疗作用的DNA、RNA、蛋白质或多肽中的一种或多种；所述的检测性物质选自探针、显影剂中的一种或多种。
所述的间接地方式是指将纳米载体作为工具，将治疗性物质或者检测性物质先装载在纳米载体内，组成纳米制剂，再将纳米制剂荷载到中性粒细胞内或表面。
所述的纳米载体优选自正电性、负电性或近中性的粒径为1-1000nm纳米制剂。
所述的纳米载体包括但不限于金纳米粒/棒、磁性纳米粒、介孔二氧化硅纳米粒、石墨烯、脂质体、胶束、纳米乳、纳米球、纳米囊、微球、微丸或树枝状聚合物。
所述的药物选自传出神经系统药物、中枢神经系统药、心血管系统药、激素及呼吸消化系统药、抗菌或抗病毒药物、抗肿瘤药物、维生素中的一种或多种。
所述的药物优选自解热镇痛类药物、非甾体抗炎药物、抗肿瘤类药物、抗生素类药物、利尿药、降压药、降脂药、降血糖药、激素类药物或维生素类药物中的一种或多种。
所述的药物进一步优选地西泮、苯妥英钠、氯丙嗪、氟西汀、美沙酮、甲氯芬酯、氯贝胆碱、硫酸阿托品、异丙肾上腺素、马来酸氯苯那敏、盐酸普鲁卡因、盐酸普萘洛尔、盐酸维拉帕米、盐酸胺碘酮、氯沙坦、硝酸甘油、多巴酚丁胺、辛伐他汀、氯吡格雷、哌唑嗪、西咪替丁、地芬尼多、西沙比利、联苯双酯、阿司匹林、吲哚美辛、盐酸氮芥、氟尿嘧啶、紫杉醇、阿莫西林、四环素、氨基糖苷、罗红霉素、氯霉素、左氟沙星、异烟肼、磺胺嘧啶、氟康唑、盐酸金刚烷胺、磷酸氟喹、格列苯脲、氢氯噻嗪、前列腺素、胰岛素、雌二醇、维生素A、维生素C中的一种或多种。
本发明所述的炎症靶向的中性粒细胞递药系统在制备治疗或诊断炎症和/或炎症相关疾病的药物或试剂中的应用。
其中，所述的炎症包括感染性炎症、非特异性炎症、变态反应性炎症以及炎症相关性疾病。
所述的感染性炎症包括病毒、细菌或细菌产物造成的炎症；所述的非特异性炎症包括即物理性炎症，包括手术或外伤引起的红肿、疼痛等；变态反应性炎症包括狼疮性皮炎、过敏性哮喘、风湿性关节炎；炎症相关性疾病包括肿瘤术后复发的治疗、动脉粥样硬化、缺血缺氧性脑病。
本发明将治疗性物质或者检测性物质先包覆在不同电性的纳米载体中(正电性、负电性、近中性，1-1000nm)，再将载药纳米载体(即纳米制剂)荷载到中性粒细胞内/表面；或者直接将治疗性物质或者检测性物质荷载到中性粒细胞内/表面，成功制备了以中性粒细胞为载体的递送系统。将所制备的中性粒细胞递药系统静脉注射到人体内，血液循环过程中，受到炎症区域释放的趋化因子的刺激，穿过炎症部位血管，沿着趋化因子浓度梯度，主动定位到炎症部位，提高了炎症部位药物浓度，保障了药效的发挥。研究表明，感染性炎症、非特异性炎症、变态反应性炎症以及炎症相关性疾病如肿瘤手术所引起的急性炎症都与中性粒细胞募集有关，因此利用中性粒细胞作为递药系统治疗炎症或炎症相关的疾病如肿瘤手术后利用急性炎症治疗肿瘤的复发，可以有效提高药物在靶部位的蓄积，提高药物的药效，降低其毒副作用。综上所述，荷载治疗性物质或者检测性物质的中性粒细胞，在炎症因子的引诱下，可以将治疗性物质或者检测性物质成功递送到炎症相关疾病部位，进行疾病的治疗和诊断，抑制疾病的发生和发展。
一种治疗炎症和/或炎症相关疾病的药物，包含本发明所述的炎症靶向的中性粒细胞递药系统。
所述的中性粒细胞递药系统中的治疗性物质可以为常规给药途径中对炎症和/或炎症相关疾病有治疗作用的药物，包括但不限于神经系统类药物、心脑血管类药、血液、呼吸、消化系统药、内分泌系统以及免疫调节药物如免疫增强药干扰素、免疫抑制剂环孢素等。
一种诊断炎症和/或炎症相关疾病的试剂，包含本发明所述的炎症靶向的中性粒细胞递药系统。
所述的中性粒细胞递药系统中的诊断性物质包括但不限于探针如DNA探针、荧光探针，造影剂如X线观察常用的碘制剂、硫酸钡以及核磁成像造影剂如钆喷酸葡胺等。
本发明中所涉及的某些概念定义如下：
纳米载体：即纳米级药物载体，是一种属于纳米级微观范畴的亚微粒药物载体输送系统。将药物包封于亚微粒(即纳米载体)中，可以调节释药的速度，增加生物膜的透过性、改变在体内的分布、提高生物利用度等。
本发明所述的纳米制剂可按照现有技术中报道过的任何一种方法制备。
脂质体制备：
(1)药物分散于有机相的脂质体制备方法
适合制备脂溶性药物的脂质体，具体说来这一类方法包括薄膜分散法、注入法、前体脂质体法、超声分散法等方法。
(2)药物分散于水相的脂质体制备方法
适合制备水溶性药物的脂质体，但要求药物有比较好的稳定性，具体说来这一类方法包括反相蒸发法、复乳法、熔融法、冻融法、冷冻干燥法、表面活性剂处理法、钙融合法、离心法等方法。
炎症：具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应为炎症。
有益效果：
中性粒细胞是数量最多的白细胞，占白细胞的50％～70％，容易从患者体内获得，这为药物递送提供了丰富的后备军。
本发明以中性粒细胞为递药载体，首先，中性粒细胞保护所载药物、探针或显影剂等免受网状内皮系统清除，延长半衰期，有效控制释放，降低免疫原性和毒副作用。其次，中性粒细胞作为载体可以穿过疏水屏障顺利到达发病区域，提高靶部位的浓度。第三，由于中性粒细胞具有趋化性质，能够靶向到损伤、炎症和肿瘤部位释药。因此，中性粒细胞作为低毒的转运体，可以起到靶向递送、延长循环时间，降低细胞和组织的毒性的作用。
所以，鉴于中性粒细胞作为递药系统具有上述优点，将中性粒细胞作为药物的载体，能够将药物主动靶向到炎症部位，提高药物在炎症部位的浓度。到达炎症部位的中性粒细胞在细胞因子的刺激下，异常激活，快速解体以“天网”形式死亡，有利于将所荷载的药物快速释放到靶部位，提高治疗效果，降低毒副作用。
与现有技术相比，本发明具有的优点如下：
1.本发明成功制备的中性粒细胞递药系统，顺趋化因子浓度梯度到达炎症组织，成功解决了药物、探针或显影剂等的靶向性问题。
2.本发明所制备的中性粒细胞递药系统，通过纳米载体的介导，保证了中性粒细胞较高的载药量，并且避免了药物对中性粒细胞生理活性的影响。
3.本发明所制备的中性粒细胞递送系统，由于中性粒细胞是机体的一种天然免疫细胞，吞噬能力强，因此细胞所载药物、探针或显影剂的量很高。
4.本发明所使用的药物载体中性粒细胞，是人体内数量最多的免疫细胞，容易从患者体内获得，并且中性粒细胞在炎症部位异常激活后，会以独特的死亡方式裂解，能够将所荷载的药物快速、彻底的释放到炎症组织，这使得本发明具备较高的临床开发应用价值。
附图说明
图1瑞氏-吉姆萨对65％/78％Percoll分离层形态学鉴定。
图2不同表面电位载药脂质体的释放。
图3中性粒细胞对不同电性脂质体的摄取量。
图4三种电性紫杉醇脂质体在体外模拟不同生理病理条件下在中性粒细胞中的滞留。
图5术后脑胶质瘤模型小鼠给药后炎症部位荷载负电性、近中性、正电性纳米制剂的中性粒细胞递药系统相对于市售制剂的相对摄取率。
图6小鼠给药后市售制剂与荷载负电性、近中性、正电性纳米制剂的中性粒细胞递药系统靶向效率。
图7脑胶质瘤术后模型小鼠给药生理盐水、空白中性粒细胞、市售制剂泰素、荷载负电性、近中性、正电性纳米制剂的中性粒细胞递药系统生存期曲线。
图8三种电性左氧氟沙星脂质体在体外模拟不同生理条件下在中性粒细胞中的滞留
图9肺炎链球菌肺炎模型小鼠给药后炎症部位中性粒细胞递药系统相对于市售制剂的相对摄取率。
图10小鼠给药后市售制剂与中性粒细胞递药系统靶向效率。
图11肺炎链球菌肺炎模型小鼠给药生理盐水、空白中性粒细胞、市售制剂左氧氟沙星、载药中性粒细胞递药系统生存期曲线。
图12三种电性布洛芬脂质体在体外模拟不同生理条件下在中性粒细胞中的滞留
图13耳肿胀模型小鼠给药后炎症部位中性粒细胞递药系统相对于市售制剂的相对摄取率。
图14小鼠给药后市售制剂与中性粒细胞递药系统靶向效率。
图15耳肿胀模型小鼠小鼠给药生理盐水、空白中性粒细胞、市售制剂布洛芬、载药中性粒细胞递药系统耳肿胀程度。
图16三种电性布洛芬脂质体在体外模拟不同生理条件下在中性粒细胞中的滞留
图17佐剂性关节炎模型小鼠给药后炎症部位中性粒细胞递药系统相对于市售制剂的相对摄取率。
图18小鼠给药后市售制剂与中性粒细胞递药系统靶向效率。
图19佐剂性关节炎模型小鼠给药生理盐水、空白中性粒细胞、市售制剂布洛芬、载药中性粒细胞递药系统关节炎指数评分。
具体实施方式
以下结合各实施例对本发明的技术方案做进一步说明，实施例仅是举例说明本发明的技术方案及其效果，并不应作为对本发明保护范围的限制。
实施例1 荷载不同表面电位紫杉醇脂质体中性粒细胞递药系统对术后脑胶质瘤小鼠模型的靶向性及药效学评价
一、骨髓中性粒细胞的分离和纯化
将Percoll母液与10×PBS按9:1(v/v)制备成100％Percoll，以1×PBS稀释制备成55％、65％、68％(v/v)Percoll分离液。按照分离液密度先重后轻的顺序，缓慢均匀叠加制备55％、65％的两层Percoll分离液，将新鲜提取的小鼠胫骨骨髓细胞用1×PBS稀释制备成单细胞悬液，1:1(v/v)缓慢均匀加在之前制备55％、65％Percoll分离液顶部，1000g离心30min。提取55％、65％分离液夹层的骨髓细胞，加入一倍体积1×PBS洗涤并重悬，再缓慢叠加到68％的Percoll分离液上1000g离心30min，提取68％分离液层的骨髓细胞，加入一倍体积1×PBS洗涤，重复两次，RPMI1640培养基重悬制备小鼠骨髓中性粒细胞悬液，备用。
用红色荧光标记的细胞表面蛋白Gr-1抗体(北京达科为生物科技有限公司)对提取细胞进行染色；37℃、5％CO2孵育30min，流式细胞仪检验所提取细胞纯度。用台盼蓝对提取细胞进行活力检测细胞活力为98％左右；用瑞氏-吉姆萨染色液对提取细胞进行形态学纯度鉴定，结果如图1所示，分离得到的中性粒细胞细胞核大多呈成熟杆状或分叶状；用红色荧光标记的细胞表面蛋白Gr-1抗体对提取细胞进行染色，结果发现所提取中性粒细胞纯度高于90％。
二、紫杉醇-脂质体-中性粒细胞(PTX-Liposome-NEs)递药系统的制备
1.荷载紫杉醇的不同电性脂质体的制备
利用薄膜分散法制备荷载紫杉醇的三种不同电性的脂质体，制备步骤具体为：
精密称取处方量的下列各物质
1)正电性脂质体：大豆磷脂90mg+阳离子脂质10mg+胆固醇10mg+紫杉醇5mg；
2)近中性脂质体：中性脂质100mg+胆固醇10mg+紫杉醇5mg；
3)负电性脂质体：大豆磷脂100mg+胆固醇10mg+紫杉醇5mg；
将处方量各物质溶于氯仿/甲醇(2:1,v:v)混合溶剂中，混匀后，40℃水浴抽真空旋干成膜，并在真空干燥器中放置过夜以完全除去有机溶剂后，用超纯水37℃下水化脂膜，得到的脂质混悬液用超声波细胞粉粹机冰浴分散，分别过0.45μm和0.22μm微孔滤膜，制得三种不同电性的荷载紫杉醇的脂质体(PTX-Liposome)。
使用HPLC法测定PTX-Liposome的载药量和包封率，使用激光粒径分析仪测定粒径和电位，如表1所示。
表1
采用透析法测定体外释放，结果见图2。结果表明，所得脂质体在测定时间范围内释放缓慢，24h累计释放量不足20％，具有一定的缓释特性。
2.紫杉醇-脂质体-中性粒细胞递药系统(PTX-Liposome-NEs)的制备
取新鲜制备的中性粒细胞悬液以1×106个/孔、500μL接种于24孔板中，不含血清RPIM1640培养液37℃、5％CO2稳定培养1h，移去培养液，将三种不同电性的紫杉醇脂质体用不含血清RPIM1640培养液稀释成PTX 100μg/ml加入上述24孔板，于37℃孵育50min后，弃去含制剂的培养液，用4℃PBS洗三次，即得不同表面电位的紫杉醇脂质体-中性细胞递药系统。
使用HPLC测定中性粒细胞对不同电性脂质体的摄取量，结果见图3。结果表明，中性粒细胞对正电性脂质体的摄取量明显高于近中性和负电性的脂质体，为制备载药量较高的递药系统提供了保证。
体外利用Ph7.4RPMI1640培养基、10nM趋化三肽以及100nM佛波醇分别模拟正常生理条件、趋化过程以及炎症部位三种生理病理环境，使用HPLC测定了4h三种电性紫杉醇脂质体在不同生理病理条件下在中性粒细胞中的滞留，结果见图4。结果表明，细胞递药系统在趋化过程中药物累计释放量仅占总摄取量的5％，释放缓慢，而到达靶部位，中性粒细胞异常激活情况下，药物累计释放量占总摄取量的85％，保证了大部分药物能够到达靶部位并发挥疗效。
三、术后脑胶质瘤模型小鼠建立
将KM小鼠用水合氯醛腹腔注射麻醉后固定于立体定向头架，将小鼠脑胶质瘤细胞G422以微量注射器注射于小鼠右侧尾状核(手术暴露颅骨标志，以牙钻于前囟右旁开4mm，前1mm，孔径1.2mm，硬膜下进针深5mm)。缝合，消毒后放回笼内。
四、紫杉醇-脂质体-中性粒细胞递药系统(PTX-Liposome-NEs)的术后脑胶质瘤模型小鼠的相对摄取率和靶向效率。
1.给药方案
术后脑胶质瘤模型小鼠144只，随机分为4组，每组36只，给药前禁食不禁水过夜，4组荷瘤小鼠尾分别静脉注射紫杉醇市售制剂泰素(Taxol)和荷载不同表面电位载药脂质体的中性粒细胞递药系统，PTX剂量均为5mg/kg，分别于给药后0.167h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h、96h和120h时间点，每组取3只荷瘤小鼠，摘眼球取血后，处死小鼠，取心、肝、脾、肾、脑5个组织，用生理盐水洗净，并用滤纸吸干残留生理盐水后称重。各组织按下述方法处理，用HPLC方法测各时间点的各组织样品中所含PTX浓度。
2.样品处理
取荷瘤小鼠各组织样品(心、肝、脾、肺、肾、脑)，称重，置于采血管中，加入2mL的生理盐水，经组织匀浆器高速分散成组织匀浆液。取200μL各组织匀浆液加入200μL乙腈，涡旋5min后，10000×g离心10min，取上清液，HPLC进样，根据线性方程计算组织样品中PTX的含量。
3.HPLC方法
色谱柱：ODS-SP column(250mm×4.6mm×5μm,GL Sciences Inc.,Japan)
流动相：甲醇:水＝80:20(v:v)
检测波长：227nm
柱温：35℃
流速：1.0mL/min
进样量：20μL
组织匀浆的物质不干扰PTX的分离测定，PTX的保留时间约为8.1min。
5.小鼠体内分布结果
表2 泰素(Taxol)在各脏器中分布
表3 荷载正电性纳米制剂中性粒细胞递药系统在各脏器的分布
表4 荷载近中性纳米制剂中性粒细胞递药系统在各脏器的分布
表5 荷载负电性纳米制剂中性粒细胞递药系统在各脏器的分布
HPLC结果显示：市售制剂泰素在肝脏分布最多，其次为心、脾脏、肾脏，在脑中分布极少；与泰素相比，中性粒细胞递药系统组分布最多的器官为脑和脾脏，其次为肝脏和肾等器官，在其他器官分布较少；荷载不同电位纳米制剂中性粒细胞递药系统各组比较，各脏器中分布没有显著性差异。
5.靶向性评价
应用Kinetic 4.0药代动力学程序统计方法计算静脉注射泰素和荷载不同表面电位载药脂质体的中性粒细胞递药系统后组织中AUC0-∞、AUC0-120h等参数，计算相对摄取率(relative ratio,Re)、靶向效率(brain targeting efficiency,Te)。
相对摄取率(relative ratio,Re)是指荷载不同表面电位载药脂质体的中性粒细胞递药系统与泰素在脑中AUC的比值，相对摄取率越大，表明该制剂相对于泰素在脑组织的靶向性越强。靶向效率(brain targeting efficiency,Te)是指同一种制剂在脑中的AUC与其他组织中AUC的比值，Te大于1表示该制剂对于脑的选择性大于相比较的其他组织，Te越大，则表明相对于被比较的其他组织，该制剂对脑的选择性越强。
荷载不同表面电位载药脂质体的中性粒细胞递药系统与泰素相比的脑Re(0-t)和Re(0-Int)如图5所示，并且其Te均大于1(图6)，说明中性粒细胞递药系统具有很好的脑靶向性，能够快速的穿过血脑屏障(Brain-Blood-Barrier,BBB)，将药物有效传递到脑组织。
五、载药中性粒细胞递药系统对术后脑胶质瘤模型小鼠药效学评价
术后脑胶质瘤模型小鼠60只，随机分成5组，每组12只，分别为术后生理盐水组、市售制剂泰素组、荷载不同表面电位载药脂质体的中性粒细胞递药系统组。其中泰素组的给药剂量为5mg PTX/kg，荷载不同表面电位载药脂质体的中性粒细胞递药系统组每只静脉注射约5×106个NEs/只，给药剂量约5mg PTX/kg。所有动物分别在术后1、2、3、4、6、8、10给药，共给药7次。以原位接种小鼠脑胶质瘤G422记为第0天，记录个组小鼠的生存时间，绘制生存期曲线，结果见图7。由图7可见，荷载不同表面电位载药脂质体的中性粒细胞递药系统组能够显著延长术后脑胶质瘤模型小鼠的生存时间。证明本发明所制备的中性粒细胞递药系统有效的抑制炎症相关性疾病的发生及发展。
实施例2 荷载左氧氟沙星阳离子脂质体中性粒细胞递药系统对肺炎链球菌小鼠模型的靶向性及药效学评价
一、载药中性粒细胞递药系统的制备及表征
中性粒细胞的提取与纯化同实施例1，取10mg左氧氟沙星，制备荷载左氧氟沙星阳离子脂质体，方法同实施例1。
使用HPLC法测定载药量和包封率，使用激光粒径分析仪测定粒径和电位，如表6所示。
表6
使用HPLC测定三种电性左氧氟沙星脂质体在体外模拟不同生理条件下在中性粒细胞中的滞留，结果见图8由图可见，在模拟正常血液循环以及炎症因子趋化过程中，药物的释放量仅占总摄取量的7％，但在炎症部位，在中性粒细胞异常激活情况下，药物释放量占总摄取量的90％，证明在炎症部位药物可以快速而彻底的从细胞中释放出来。
二、炎症动物模型建立
肺炎链球菌肺炎小鼠模型：取体重18～22g清洁级雄性小鼠，以10％水合氯醛0.3ml/100g(300mg/kg)腹腔注射麻醉，从鼻腔滴入40μL制备好的106CFU/mL肺炎链球菌悬液。
三、中性粒细胞递药系统炎症模型小鼠靶向性研究
1.给药方案
取炎症小鼠72只，随机分为2组，每组36只，给药前禁食不禁水过夜，2组荷瘤小鼠尾分别静脉注射市售左氧氟沙星以及左氧氟沙星阳离子脂质体中性粒细胞递药系统，剂量均为左氧氟沙星10mg/kg，分别于给药后0.167h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h、96h和120h时间点，处死小鼠，取心、肝、脾、肾、肺5个组织，用生理盐水洗净，并用滤纸吸干残留生理盐水后称重。各组织按下述方法处理，用HPLC方法测各时间点的各组织样品中所含左氧氟沙星浓度。
2.样品处理
炎症小鼠各组织样品(心、肝、脾、肾、肺)，称重，置于采血管中，加入2mL的生理盐水，经组织匀浆器高速分散成组织匀浆液。取200μL各组织匀浆液加入200μL乙腈，涡旋5min后，10000×g离心10min，取上清液，HPLC进样，根据线性方程计算组织样品中左氧氟沙星的含量。
3.HPLC方法
色谱柱：ODS-SP column(250mm×4.6mm×5μm,GL Sciences Inc.,Japan)
流动相：甲醇:水＝80:20(v:v)以0.01mol/L磷酸二氢钾溶液(pH3.0)：乙腈＝45：55(v:v)甲醇:乙腈:(0.01mol/L)磷酸二氢钾:(0.5mol/L)溴化四丁基铵＝(10:10:80:4)磷酸调pH3.5
检测波长：294nm
柱温：室温
流速：1.0mL/min
进样量：20μL
组织匀浆的物质不干扰左氧氟沙星的分离测定，左氧氟沙星的保留时间约为5.6min。
6.小鼠体内分布结果
表7 左氧氟沙星在各脏器中分布
表8 左氧氟沙星阳离子脂质体中性粒细胞递药系统在各脏器的分布
由表7～8可知，市售左氧氟沙星注射剂在炎症模型小鼠体内情况，肝脏分布最多，其次为心、脾脏、肾脏，炎症部位分布较少；与市售左氧氟沙星注射剂相比，中性粒细胞递药系统分布最多的器官为肺和脾脏，其次为肝器官，在其他器官分布较少。
5.靶向性评价
应用Kinetic 4.0药代动力学程序统计方法计算静脉注射市售注射液左氧氟沙星、中性粒细胞递药系统后组织中AUC0-∞、AUC0-120h等参数，计算相对摄取率(relativeratio,Re)、靶向效率(brain targeting efficiency,Te)。
相对摄取率(relative ratio,Re)是指中性粒细胞递药系统与市售制剂左氧氟沙星在肺中AUC的比值，相对摄取率越大，表明该制剂相对于市售制剂在炎症组织的靶向性越强。靶向效率(brain targeting efficiency,Te)是指同一种制剂在肺中的AUC与其他组织中AUC的比值，Te大于1表示该制剂对于肺的选择性大于相比较的其他组织，Te越大，则表明相对于被比较的其他组织，该制剂对细菌感染性肺组织的选择性越强。
中性粒细胞递药系统与市售制剂左氧氟沙星相比的炎症部位Re(0-t)和Re(0-Int)如图9所示，并且其Te均大于1(图10)，说明中性粒细胞递药系统具有很好的炎症靶向性，能够快速的穿过炎症血管，将药物有效传递到炎症组织。
四、中性粒细胞递药系统对肺炎链球菌肺炎小鼠模型药效学评价
炎症模型小鼠48只，随机分成4组，每组12只，分别为术后生理盐水组、单纯中性粒细胞组、市售制剂组、中性粒细胞递药系统组，其中市售制剂组的给药剂量为10mg/kg，中性粒细胞递药系统组每只静脉注射约5×106个NEs/只，给药剂量约10mg/kg。所有动物分别在术后1、2、3、4、6、8、10给药，共给药7次。同时设给予相同细胞密度，相同生理盐水体积组作为空白对照。结果如图11所示。市售制剂左氧氟沙星对模型小鼠的生存期与生理盐水相仿，都在21天左右，而中性粒细胞递药系统有效延长了小鼠的生存期在42天，仍有小鼠存活。证明本发明所制备的中性粒细胞递药系统有效的抑制感染性炎症的发生及发展。
实施3 荷载布洛芬阳离子脂质体中性粒细胞递药系统对耳肿胀小鼠模型的靶向性及药效学评价
一、载药中性粒细胞递药系统的制备及表征
中性粒细胞的提取与纯化同实施例1，取5mg布洛芬，制备荷载布洛芬阳离子脂质体同实施例1。
使用HPLC法测定载药量和包封率，使用激光粒径分析仪测定粒径和电位，如表9所示。
表9
使用HPLC测定三种电性布洛芬脂质体在体外模拟不同生理条件下在中性粒细胞中的滞留，结果见图12由图可见，在模拟正常血液循环以及炎症因子趋化过程中，细胞递药系统在趋化过程中药物累计释放量仅占总摄取量的7％，释放缓慢，但在炎症部位，中性粒细胞异常激活情况下，药物释放量占总摄取量的87％，证明在炎症部位药物可以快速而彻底的从细胞中释放出来。
二、炎症动物模型建立
耳肿胀小鼠模型：取体重18～22g清洁级雄性小鼠，将已浸透二甲苯的直径为7mm的圆形滤纸片紧贴在小鼠右耳部15s。
三、中性粒细胞递药系统炎症模型小鼠靶向性研究
1.给药方案
取炎症小鼠72只，随机分为2组，每组36只，给药前禁食不禁水过夜，2组荷瘤小鼠尾分别静脉注射市售布洛芬以及布洛芬阳离子脂质体中性粒细胞递药系统，剂量均为布洛芬15mg/kg，分别于给药后0.167h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h、96h和120h时间点，摘眼球取血后，处死小鼠，取心、肝、脾、肾、耳5个组织，用生理盐水洗净，并用滤纸吸干残留生理盐水后称重。各组织按下述方法处理，用HPLC方法测各时间点的各组织样品中所含布洛芬浓度。
2.样品处理
取炎症小鼠各组织样品(心、肝、脾、肾、耳)，称重，置于采血管中，加入2mL的生理盐水，经组织匀浆器高速分散成组织匀浆液。取200μL各组织匀浆液加入200μL乙腈，涡旋5min后，10000×g离心10min，取上清液，HPLC进样，根据线性方程计算组织样品中PTX的含量。
3.HPLC方法
色谱柱：ODS-SP column(250mm×4.6mm×5μm,GL Sciences Inc.,Japan)
流动相：甲醇:水＝80:20(v:v)以0.01mol/L磷酸二氢钾溶液(pH3.0)：乙腈＝45：55(v:v)
检测波长：263nm
柱温：室温
流速：1.0mL/min
进样量：20μL
组织匀浆的物质不干扰布洛芬的分离测定，布洛芬的保留时间约为10.2min。
4.小鼠体内分布结果
表10 布洛芬在各脏器中分布
表11 布洛芬阳离子脂质体中性粒细胞递药系统在各脏器的分布
由上表可知，市售布洛芬注射剂在炎症模型小鼠体内情况，肝脏分布最多，其次为心、肺、脾脏、肾脏，炎症部位分布较少；与市售布洛芬注射剂相比，中性粒细胞递药系统分布最多的器官为炎症部位耳和脾脏，其次为肝脏和肺等器官，在其他器官分布较少。
5.靶向性评价
应用Kinetic 4.0药代动力学程序统计方法计算静脉注射布洛芬、中性粒细胞递药系统后组织中AUC0-∞、AUC0-120h等参数，计算相对摄取率(relative ratio,Re)、靶向效率(brain targeting efficiency,Te)。
相对摄取率(relative ratio,Re)是指中性粒细胞递药系统与市售制剂布洛芬在耳中AUC的比值，相对摄取率越大，表明该制剂相对于布洛芬在炎症组织耳的靶向性越强。靶向效率(brain targeting efficiency,Te)是指同一种制剂在耳中的AUC与其他组织中AUC的比值，Te大于1表示该制剂对于脑的选择性大于相比较的其他组织，Te越大，则表明相对于被比较的其他组织，该制剂对非特异性炎症部位耳的选择性越强。
中性粒细胞递药系统与市售制剂布洛芬相比的炎症部位Re(0-t)和Re(0-Int)如图13所示，并且其Te均大于1(图14)，说明中性粒细胞递药系统具有很好的炎症靶向性，能够快速的穿过炎症血管，将药物有效传递到炎症组织。
四、中性粒细胞递药系统对耳肿胀小鼠模型药效学评价
炎症模型小鼠48只，随机分成4组，每组12只，分别为术后生理盐水组、单纯中性粒细胞组、市售制剂组、中性粒细胞递药系统组，同时设原位瘤小鼠12只，为对照组。其中市售制剂组的给药剂量为15mg/kg，中性粒细胞递药系统组每只静脉注射约5×106个NEs/只，给药剂量约15mg/kg。所有动物分别在术后1、2、3、4、6、8、10给药，共给药7次。同时设给予相同细胞密度，相同生理盐水体积组作为空白对照。连续给药3d，给药3次后，脱颈处死小鼠，用7mm打孔器冲下左耳和右耳同一部位的圆片于分析天平上分别称重，以两耳重量的差值表示肿胀程度，比较药物的抗炎作用，如图15所示。与生理盐水组相比，给予市售制剂布洛芬和单纯中性粒细胞对耳肿胀程度并没显著性改善，而与载药中性粒细胞组相比耳肿胀程度显著性改善，t检验发现p<0.05。证明本发明所制备的中性粒细胞递药系统有效的抑制非特异性炎症的发生及发展。
实施4 荷载布洛芬阳离子脂质体中性粒细胞递药系统对佐剂性关节炎小鼠模型的靶向性及药效学评价
一、载药中性粒细胞递药系统的制备及表征
中性粒细胞的提取与纯化同实施例1，取10mg布洛芬，制备荷载布洛芬阳离子脂质体方法同实施例1。
使用HPLC法测定载药量和包封率，使用激光粒径分析仪测定粒径和电位，如表12所示。
表12
使用HPLC测定三种电性布洛芬脂质体在体外模拟不同生理条件下在中性粒细胞中的滞留，结果见图16由图可见，在模拟正常血液循环以及炎症因子趋化过程中，药物的累计释放量仅占总摄取量的8％，但在炎症部位，中性粒细胞异常激活情况下，药物累计释放量占总摄取量的91％，证明在炎症部位药物可以快速而彻底的从细胞中释放出来。
二、炎症动物模型建立
佐剂性关节炎小鼠模型：将卡介苗80℃水浴灭活1小时，与高压灭菌的石蜡充分研磨、混匀，制成10mg/ml完全弗氏佐剂(Complete Freund adjuvant，CFA)，于每只小鼠右后足跖皮内注射CFA 0.1ml致炎。
三、中性粒细胞递药系统炎症模型小鼠靶向性研究
1.给药方案
取炎症小鼠72只，随机分为2组，每组36只，给药前禁食不禁水过夜，2组荷瘤小鼠尾分别静脉注射市售左氧氟沙星以及布洛芬阳离子脂质体中性粒细胞递药系统，剂量均为布洛芬15mg/kg，分别于给药后0.167h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h、96h和120h时间点，摘眼球取血后，处死小鼠，取心、肝、脾、肾、右后足跖5个组织，用生理盐水洗净，并用滤纸吸干残留生理盐水后称重。各组织按下述方法处理，用HPLC方法测各时间点的各组织样品中所含布洛芬浓度。
2.样品处理
取荷瘤小鼠各组织样品(心、肝、脾、肾、右后足跖)，称重，置于采血管中，加入2mL的生理盐水，经组织匀浆器高速分散成组织匀浆液。取200μL各组织匀浆液加入200μL乙腈，涡旋5min后，10000×g离心10min，取上清液，HPLC进样，根据线性方程计算组织样品中布洛芬的含量。
3.HPLC方法
色谱柱：ODS-SP column(250mm×4.6mm×5μm,GL Sciences Inc.,Japan)
流动相：甲醇:水＝80:20(v:v)以0.01mol/L磷酸二氢钾溶液(pH3.0)：乙腈＝45：55(v:v)
检测波长：263nm
柱温：室温
流速：1.0mL/min
进样量：20μL
组织匀浆的物质不干扰布洛芬的分离测定，布洛芬的保留时间约为10.2min。
4.小鼠体内分布结果
表13 布洛芬在各脏器中分布
表14 布洛芬阳离子脂质体中性粒细胞递药系统在各脏器的分布
由上表可知，市售布洛芬注射剂在炎症模型小鼠体内情况，肝脏分布最多，其次为心、脾脏、肾脏，炎症部位分布较少；与市售布洛芬注射剂相比，中性粒细胞递药系统分布最多的器官为炎症部位足爪和脾脏，其次为肝脏器官，在其他器官分布较少。
5.靶向性评价
应用Kinetic 4.0药代动力学程序统计方法计算静脉注射布洛芬、中性粒细胞递药系统后组织中AUC0-∞、AUC0-120h等参数，计算相对摄取率(relative ratio,Re)、靶向效率(brain targeting efficiency,Te)。
相对摄取率(relative ratio,Re)是指中性粒细胞递药系统与市售制剂布洛芬在足爪中AUC的比值，相对摄取率越大，表明该制剂相对于布洛芬在炎症组织的靶向性越强。靶向效率(brain targeting efficiency,Te)是指同一种制剂在炎症部位足爪中的AUC与其他组织中AUC的比值，Te大于1表示该制剂对于炎症部位右后足跖的选择性大于相比较的其他组织，Te越大，则表明相对于被比较的其他组织，该制剂对非特异性炎症部位右后足跖的选择性越强。
中性粒细胞递药系统与市售制剂布洛芬相比的炎症部位Re(0-t)和Re(0-Int)如图17所示，并且其Te均大于1(图18)，说明中性粒细胞递药系统具有很好的炎症靶向性，能够快速的穿过炎症血管，将药物有效传递到炎症组织。
四、中性粒细胞递药系统对佐剂性关节炎小鼠模型药效学评价
炎症模型小鼠48只，随机分成4组，每组12只，分别为炎症模型建立后生理盐水组、单纯中性粒细胞组、市售制剂组、中性粒细胞递药系统组，其中市售制剂组的给药剂量为15mg/kg，中性粒细胞递药系统组每只静脉注射约5×106个NEs/只，给药剂量约15mg/kg。所有动物分别在术后1、2、3、4、6、8、10给药，共给药7次。同时设给予相同细胞密度，相同生理盐水体积组作为空白对照。给药后，每隔3天进行关节炎指数评分，观察每组大鼠的继发病变。
每只足爪的关节炎指数评分标准：0＝正常；1＝踝关节出现红斑和轻微肿胀；2＝踝关节到跖关节或掌关节红斑和轻微肿胀；3＝踝关节到跖趾关节或掌关节出现红斑和中度肿胀；4＝踝关节到趾关节出现红斑和重度肿胀。每只小鼠鼠最多评12分，结果如图19所示。对于关节炎指数评分出现的峰值以及出现峰值的时间，与生理盐水组相比，单纯给予中性粒细胞，两组的没有显著性差异，给予市售制剂布洛芬后，虽然出现的峰值数有所降低，出现峰值的时间有所延长，但是给予中性粒细胞递药系统后，其出现的峰值和峰值出现的时间都有的明显的下降和延长。证明本发明所制备的中性粒细胞递药系统有效的抑制变态反应性炎症的发生及发展。

Claims (8)

1.一种炎症靶向的中性粒细胞递药系统，其特征在于所述的递药系统由中性粒细胞以及以间接地方式载到中性粒细胞内或表面的治疗性物质或者检测性物质组成；所述的间接地方式是指将纳米载体作为工具，将治疗性物质或者检测性物质先装载在纳米载体内，制成纳米制剂，再将纳米制剂荷载到中性粒细胞内或表面；所述的纳米载体为脂质体；其中，所述的治疗性物质选自药物、DNA、RNA、蛋白质中的一种或多种；所述的检测性物质选自探针、显影剂中的一种或多种；所述的药物选自传出神经系统药物、中枢神经系统药、心血管系统药、呼吸系统药、消化系统药、抗菌或抗病毒药物、抗肿瘤药物中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的炎症靶向的中性粒细胞递药系统，其特征在于所述的纳米载体选自正电性、负电性或近中性的粒径为1-1000 nm的纳米制剂。
3.根据权利要求1所述的炎症靶向的中性粒细胞递药系统，其特征在于所述的药物选自地西泮、苯妥英钠、氯丙嗪、氟西汀、美沙酮、甲氯芬酯、氯贝胆碱、硫酸阿托品、异丙肾上腺素、马来酸氯苯那敏、盐酸普鲁卡因、盐酸普萘洛尔、盐酸维拉帕米、盐酸胺碘酮、氯沙坦、硝酸甘油、多巴酚丁胺、辛伐他汀、氯吡格雷、哌唑嗪、西咪替丁、地芬尼多、西沙比利、联苯双酯、阿司匹林、吲哚美辛、盐酸氮芥、氟尿嘧啶、紫杉醇、阿莫西林、四环素、氨基糖苷、罗红霉素、氯霉素、左氧氟沙星、异烟肼、磺胺嘧啶、氟康唑、盐酸金刚烷胺、磷酸氯喹、格列苯脲、氢氯噻嗪、前列腺素、胰岛素、雌二醇、维生素A或维生素C中的一种或多种。
4.权利要求1所述的炎症靶向的中性粒细胞递药系统在制备治疗或诊断炎症和/或炎症相关疾病的药物或试剂中的应用；所述的炎症相关疾病为动脉粥样硬化或缺血缺氧性脑病。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的炎症为感染性炎症、非特异性炎症、变态反应性炎症。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的感染性炎症为病毒、细菌或细菌产物造成的炎症；所述的非特异性炎症为物理性炎症，包括手术或外伤引起的红肿、疼痛；变态反应性炎症包括狼疮性皮炎、过敏性哮喘或风湿性关节炎。
7.一种治疗炎症和/或炎症相关疾病的药物，其特征在于包含权利要求1所述的炎症靶向的中性粒细胞递药系统；所述的炎症相关疾病为动脉粥样硬化或缺血缺氧性脑病。
8.一种诊断炎症和/或炎症相关疾病的试剂，其特征在于包含权利要求1所述的炎症靶向的中性粒细胞递药系统；所述的炎症相关疾病为动脉粥样硬化或缺血缺氧性脑病。
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