CN114558125B - 一种尿素酶驱动中性粒细胞递药系统及其合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种尿素酶驱动中性粒细胞递药系统及其合成方法。首先将尿素酶溶液与磺基NHS生物素溶液反应得到尿素酶‑生物素。再使用左旋聚赖氨酸溶液包被培养器皿，然后加入中性粒细胞溶液，离心使中性粒细胞旋转至左旋聚赖氨酸表面，去除上清液，依次加入磺基NHS生物素溶液、链霉亲和素溶液和尿素酶‑生物素进行细胞孵育，得到尿素酶修饰的中性粒细胞，将其从左旋聚赖氨酸表面分离出来，得到该递药系统。本发明利用生物素/链霉亲和素特异性结合的原理，将尿素酶固定在中性粒细胞一侧，尿素酶能迅速催化分解血液中大量存在的尿素，产生二氧化碳和氨气，从而推进中性粒细胞运动，结合中性粒细胞的血栓靶向性，能提高溶栓药物尿激酶的作用效率。
Description
技术领域
本发明涉及用于血栓治疗的系统领域，且特别涉及一种尿素酶驱动中性粒细胞递药系统及其合成方法。
背景技术
血栓是血流在心血管系统血管内面剥落处或修补处的表面所形成的小块。在可变的流体依赖型(variable flow dependent patterns)中，血栓由不溶性纤维蛋白,沉积的血小板，积聚的白细胞和陷入的红细胞组成。
尿激敏作为一种溶血栓药物，在静脉滴注后，直接作用于内源性纤维蛋白溶解系统能催化裂解纤溶酶原成纤溶酶，后者不仅能降解纤维蛋白凝块，亦能降解血循环中的纤维蛋白原、凝血因子Ⅴ和凝血因子Ⅷ等，从而发挥溶栓作用。但单纯的尿激敏存在血栓靶向性差的缺点。
中性粒细胞(neutrophils，NEs)是血液中数量最多的免疫白细胞，是急性炎症的主要反应细胞。中性粒细胞是天然的优良的药物载体。目前，利用中性粒细胞作为药物载体的应用较少，且大部分用于炎症或者肿瘤靶向治疗的药物载体。
近年来研究发现，中性粒细胞是血栓形成和发展的关键元素，且具有血栓主动靶向性。因此，中性粒细胞是优良的溶栓药物载体。但是，目前没有利用中性粒细胞作为溶栓药物载体，构建中性粒细胞递药系统，根据中性粒细胞的炎症趋化作用靶向血栓部位，受激活形成胞外诱捕网进行药物的定点释放，从而精准治疗血栓的研究应用。
发明内容
为了解决溶栓药物尿激酶的血栓靶向性差的问题，本发明拟构建尿素酶驱动中性粒细胞递药系统，将溶栓药物尿激酶精准靶向递送至血栓形成部位，并进行安全、高效溶栓。
本发明提出一种尿素酶驱动中性粒细胞递药系统的合成方法，包括以下步骤：
S1，将尿素酶(urease)溶液与磺基NHS生物素(sulfo-NHS-Biotin)溶液混合发生反应，得到尿素酶-生物素(Urease-Biotin)；
S2，使用左旋聚赖氨酸(PLL)溶液包被培养器皿，将中性粒细胞(neutrophils)溶液加入培养器皿中，离心使得中性粒细胞旋转至左旋聚赖氨酸表面，去除上清液，依次加入磺基NHS生物素溶液、链霉亲和素(streptavidin)溶液和步骤S1合成的尿素酶-生物素进行细胞孵育，得到尿素酶修饰的中性粒细胞，所述尿素酶修饰的中性粒细胞固定在所述左旋聚赖氨酸表面；
S3，将所述尿素酶修饰的中性粒细胞从所述左旋聚赖氨酸表面分离出来，得到所述尿素酶驱动中性粒细胞递药系统。
作为本发明的尿素酶驱动中性粒细胞递药系统的合成方法的进一步改进，步骤S1中：尿素酶溶液的体积为1mL、浓度为1mg/mL，磺基NHS生物素溶液的体积为1mL、浓度为166μM。
作为本发明的尿素酶驱动中性粒细胞递药系统的合成方法的进一步改进，步骤S1具体为：
将尿素酶溶液与磺基NHS生物素溶液混合，在0～10℃中搅拌反应10～60min，将反应后的液体进行透析得到所述尿素酶-生物素。
作为本发明的尿素酶驱动中性粒细胞递药系统的合成方法的进一步改进，步骤S1中，所述透析的过程为，用1kDa的透析袋装载反应后的液体，并浸入磷酸缓冲盐溶液中8～16h。
作为本发明的尿素酶驱动中性粒细胞递药系统的合成方法的进一步改进，步骤S1中，在透析后，还将得到的所述尿素酶-生物素分散在磷酸缓冲盐溶液中，于4℃中保存。
作为本发明的尿素酶驱动中性粒细胞递药系统的合成方法的进一步改进，步骤S2中：加入的所述中性粒细胞溶液的体积为400μL，加入的所述磺基NHS生物素溶液的浓度为166μM、体积为500μL，加入的所述链霉亲和素溶液的浓度为166μM、体积为500μL，加入的所述尿素酶-生物素的体积为500μL。
作为本发明的尿素酶驱动中性粒细胞递药系统的合成方法的进一步改进，步骤S2中，所述依次加入磺基NHS生物素溶液、链霉亲和素溶液和步骤S1合成的尿素酶-生物素进行细胞孵育，具体为：
在所述培养器皿中，先加入磺基NHS生物素溶液于36～37.5℃中培养0.5～1.5h，再加入链霉亲和素溶液于36～37.5℃中培养0.5～1.5h，最后加入尿素酶-生物素于36～37.5℃中培养0.5～1.5h。
作为本发明的尿素酶驱动中性粒细胞递药系统的合成方法的进一步改进，步骤S3具体为：
用移液管缓慢反复地吹打，将所述尿素酶修饰的中性粒细胞从所述左旋聚赖氨酸表面分离，然后使用磷酸缓冲盐溶液清洗所述尿素酶修饰的中性粒细胞两次，得到所述尿素酶驱动中性粒细胞递药系统。
作为本发明的尿素酶驱动中性粒细胞递药系统的合成方法的进一步改进，步骤S3还包括：
将得到的所述尿素酶驱动中性粒细胞递药系统悬浮在含青链霉素的培养液中，置于培养箱中继续培养。
本发明还提出一种尿素酶驱动中性粒细胞递药系统，根据以上所述的合成方法所制备得到，在所述递药系统中，所述尿素酶固定在所述中性粒细胞的一侧。
作为本发明的尿素酶驱动中性粒细胞递药系统的进一步改进，所述递药系统还包括纳米银和尿激敏，所述尿激敏负载在所述纳米银上，所述纳米银和所述尿激敏设置于所述中性粒细胞之中。
本发明的有益效果是：
(1)本发明采用中性粒细胞作为溶栓酶载体，主动靶向血栓部位，中性粒细胞可在血栓部位炎症信号刺激下迅速产生胞外诱捕网(NETs)并释放溶栓酶，从而起到高效溶栓的作用。该溶栓酶可以利用银纳米表面负载尿激酶形成高效的“纳米溶栓酶(Ag-UK)”。
(2)为加快中性粒细胞向血栓部位的靶向速率，本发明还利用生物素/链霉亲和素特异性结合的原理，在中性粒细胞(NEs)表面修饰尿素酶驱动马达UBSB(urease-biotin-streptavidin-biotin)或者是尿素酶(urease)，将尿素酶固定在中性粒细胞一侧，得到UBSB-NEs或Urease-NEs。只存在于细胞一侧的尿素酶迅速催化分解血液中大量存在的尿素，产生二氧化碳和氨气，从而以“喷气式马达”的方式反向推进中性粒细胞运动。
(3)将尿素酶驱动中性粒细胞递药系统UBSB-NEs或Urease-NEs(可以携带Ag-UK)静脉给药进入血管后，在尿素酶马达的驱动下，递药系统迅速靶向血栓部位，经炎症信号刺激产生胞外诱捕网NETs，释放Ag-UK纳米粒，并发挥其溶栓作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为尿素酶驱动中性粒细胞递药系统的合成及作用机制图。
图2为图1中尿素酶与磺基NHS生物素反应合成尿素酶-生物素的反应式。
图3为磺基NHS生物素的完整结构式。
图4为试验例1提供的提取中性粒细胞的显微染色图和分析图。
图5为试验例2提供的FITC荧光标记尿素酶驱动中性粒细胞递药系统的荧光成像图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明的实施方式整体描述如下。
请参阅图1，本发明提出的一种尿素酶驱动中性粒细胞递药系统的合成方法，包括以下步骤：
S1，将尿素酶(urease)溶液与磺基NHS生物素(sulfo-NHS-Biotin)溶液混合，在0～10℃中搅拌反应10～60min，将反应后的液体进行透析得到所述尿素酶-生物素(Urease-Biotin)。可选的，尿素酶溶液的体积为1mL、浓度为1mg/mL，磺基NHS生物素溶液的体积为1mL、浓度为166μM。所述透析的过程可以为，用1kDa的透析袋装载反应后的液体，并浸入磷酸缓冲盐溶液中8～16h。在透析后，还可以将得到的所述尿素酶-生物素分散在磷酸缓冲盐溶液中，于4℃中保存。
S2，使用左旋聚赖氨酸(PLL)溶液包被培养器皿(如12孔板)，将中性粒细胞(neutrophils)溶液加入培养器皿中，离心使得中性粒细胞旋转至左旋聚赖氨酸表面，去除上清液，在所述培养器皿中，先加入磺基NHS生物素(sulfo-NHS-Biotin)溶液于36～37.5℃中孵育细胞0.5～1.5h，再加入链霉亲和素(streptavidin)溶液于36～37.5℃中孵育细胞0.5～1.5h，最后加入步骤S1合成的尿素酶-生物素(Urease-Biotin)于36～37.5℃中孵育细胞0.5～1.5h，得到尿素酶修饰的中性粒细胞，所述尿素酶修饰的中性粒细胞固定在所述左旋聚赖氨酸表面。在经过以上步骤的孵育(Culture)后，如图1所示，固定在中性粒细胞一侧的一部分UBSB脱落BSB基团，剩余Urease直接固定在中性粒细胞的一侧。
可选的，步骤S2加入的磺基NHS生物素溶液和链霉亲和素溶液的浓度和体积均相同。例如，加入的所述中性粒细胞溶液的体积为400μL(109个细胞)，加入的所述磺基NHS生物素溶液的浓度为166μM、体积为500μL，加入的所述链霉亲和素溶液的浓度为166μM、体积为500μL，加入的所述尿素酶-生物素的体积为500μL。
S3，用移液管缓慢反复地吹打，将所述尿素酶修饰的中性粒细胞从所述左旋聚赖氨酸表面分离，然后使用磷酸缓冲盐溶液清洗所述尿素酶修饰的中性粒细胞两次，得到所述尿素酶驱动中性粒细胞递药系统。将得到的所述尿素酶驱动中性粒细胞递药系统悬浮在含青链霉素的培养液(青霉素和链霉素的混合液)中，置于培养箱中继续培养。
根据以上合成方法制备得到一种尿素酶驱动中性粒细胞递药系统UBSB-NEs和/或Urease-NEs，在所述递药系统中，所述尿素酶直接固定在所述中性粒细胞的一侧，或者通过BSB(biotin-streptavidin-biotin，生物素-链霉亲和素-生物素)间接固定在中性粒细胞的一侧。进一步的，通过其他步骤，所述递药系统还可以加入纳米银和尿激敏，所述尿激敏负载在所述纳米银上，所述纳米银和所述尿激敏设置于所述中性粒细胞之中，得到另一种尿素酶驱动中性粒细胞递药系统UBSB-NEs(Ag-UK)和/或Urease-NEs(Ag-UK)。
以下对本发明的实施方式进行举例说明。
实施例1
本实施例合成一种尿素酶驱动中性粒细胞递药系统，整体合成步骤请参考图1。
首先，如图2所示，将尿素酶(Urease)与磺基NHS生物素(sulfo-NHS-Biotin)反应合成Urease-Biotin(尿素酶-生物素)，具体为：将磺基NHS生物素(1mL；PBS，166μM；)与尿素酶Urease溶液(1mL，1mg/mL)混合，低温搅拌30min。反应结束后，用1kDa透析袋在PBS中透析12h。所得尿素酶-生物素(Urease-Biotin)分散在2mL PBS(磷酸缓冲盐溶液)中，4℃低温保存。其中，磺基NHS生物素(sulfo-NHS-Biotin)的完整结构式如图3所示。
然后，将尿素酶-生物素Urease-Biotin修饰中性粒细胞(Neutrophils)，具体为：首先将左旋多聚赖氨酸(PLL，100ug/mL)包被12孔板，过夜待用。然后，将400μL中性粒细胞溶液(109个细胞)添加到12孔板中，900RCF下离心5min，将细胞旋转至左旋多聚赖氨酸(PLL)表面。去除上清液，清洗平板。配制磺基NHS生物素(166μM)和链霉亲和素(166μM)各1mL。之后，如图1所示，将磺基NHS生物素(166μM，500μL)、链霉亲和素(166μM，500μL)和合成的尿素酶-生物素(Urease-Biotin,500μL)于37℃下依次孵育细胞1h。最后，用移液管缓慢反复地吹打，将产生的细胞马达与PLL表面分离，然后进行两次PBS清洗，得到所述尿素酶驱动中性粒细胞递药系统UBSB-NEs和/或Urease-NEs。将制备完成的细胞马达悬浮在RPMI1640+1％青链霉素中，置于培养箱中继续培养，待用。
实施例2
本实施例合成一种尿素酶驱动中性粒细胞递药系统UBSB-NEs(Ag-UK)和/或Urease-NEs(Ag-UK)，通过以下方法得到。
将尿激敏负载在纳米银表面，得到“纳米溶栓酶(Ag-UK)”，再将所述Ag-UK注入实施例1合成的UBSB-NEs和Urease-NEs之中，得到一种尿素酶驱动中性粒细胞递药系统UBSB-NEs(Ag-UK)和/或Urease-NEs(Ag-UK)。
试验例1
采用非连续密度梯度法，提取小鼠中性粒细胞，采用血球计数法对提取的中性粒细胞进行计数，并用台盼蓝活细胞染色试剂盒测定细胞的存活率。包括以下步骤：
(A)采用改良版吉姆萨染色试剂盒对提取的中性粒细胞进行染色，并在光学显微镜下观察，如图4中A分图所示，为中性粒细胞采用改良吉姆萨染色图。
(B)利用流式细胞仪判断中性粒细胞提取方法的细胞纯化效果，如图4中B分图所示，为中性粒细胞采用特异性抗体(CD11b，Ly6G)标记流式细胞分析图。
(C)用核酸染料DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)和Picogreen(双链DNA定量检测试剂盒)对中性粒细胞核进行染色，并在荧光显微镜下观察，如图4中C分图所示，标尺20μm，依次为中性粒细胞核酸染色(DAPI)荧光图、中性粒细胞核酸染色(Picogreen)荧光图、中性粒细胞的明视野图、中性粒细胞的叠加图层模式图。
以上结果显示，采用非连续密度梯度法，每只小鼠提取11.25×106个中性粒细胞，细胞活力为98.1％，提取纯度为90.6％。说明，该提取方法优良，能够从小鼠体内成功提取出大量优异的中性粒细胞。
试验例2
先将FITC(异硫氰酸荧光素)偶联尿素酶(urease)合成Urea-FITC。再按照实施例1的步骤，只将实施例1中的urease替换为Urea-FITC，进行合成反应和细胞孵育，制备得到FITC-UBSB-NEs和/或FITC-Urease-NEs。
为了方便对尿素酶驱动分子马达的表征，采用荧光显微镜观察尿素酶驱动中性粒细胞。结果如图5所示，分子马达UBSB成功的修饰在中性粒细胞(NEs)一侧，能够在尿素酶迅速催化分解血液中大量存在的尿素，释放氨气和二氧化碳的同时，以“喷气式马达”的方式反向推进中性粒细胞的朝炎症靶向运动。
将本发明的尿素酶驱动中性粒细胞递药系统UBSB-NEs(Ag-UK)和/或Urease-NEs(Ag-UK)静脉给药进入血管后，在尿素酶马达的驱动下，递药系统迅速靶向血栓部位，经炎症信号刺激产生NETs(胞外诱捕网)，释放Ag-UK纳米粒，并发挥其溶栓作用。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的权利范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.一种尿素酶驱动中性粒细胞递药系统在制备溶栓药物载体中的应用，其特征在于，所述尿素酶驱动中性粒细胞递药系统的合成方法包括以下步骤：
S1，将尿素酶溶液与磺基NHS生物素溶液混合发生反应，得到尿素酶-生物素；
S2，使用左旋聚赖氨酸溶液包被培养器皿，将中性粒细胞溶液加入培养器皿中，离心使得中性粒细胞旋转至左旋聚赖氨酸表面，去除上清液，依次加入磺基NHS生物素溶液、链霉亲和素溶液和步骤S1合成的尿素酶-生物素进行细胞孵育，得到尿素酶修饰的中性粒细胞，所述尿素酶修饰的中性粒细胞固定在所述左旋聚赖氨酸表面；
S3，将所述尿素酶修饰的中性粒细胞从所述左旋聚赖氨酸表面分离出来，得到所述尿素酶驱动中性粒细胞递药系统；
步骤S2中：加入的所述中性粒细胞溶液的体积为400μL，加入的所述磺基NHS生物素溶液的浓度为166μM、体积为500μL，加入的所述链霉亲和素溶液的浓度为166μM、体积为500μL，加入的所述尿素酶-生物素的体积为500μL；
步骤S2中，所述依次加入磺基NHS生物素溶液、链霉亲和素溶液和步骤S1合成的尿素酶-生物素进行细胞孵育，具体为：
在所述培养器皿中，先加入磺基NHS生物素溶液于36～37.5℃中培养0.5～1.5h，再加入链霉亲和素溶液于36～37.5℃中培养0.5～1.5h，最后加入尿素酶-生物素于36～37.5℃中培养0.5～1.5h。
2.根据权利要求1所述的一种尿素酶驱动中性粒细胞递药系统在制备溶栓药物载体中的应用，其特征在于，
步骤S1中：尿素酶溶液的体积为1mL、浓度为1mg/mL，磺基NHS生物素溶液的体积为1mL、浓度为166μM。
3.根据权利要求1所述的一种尿素酶驱动中性粒细胞递药系统在制备溶栓药物载体中的应用，其特征在于，
步骤S1具体为：
将尿素酶溶液与磺基NHS生物素溶液混合，在0～10℃中搅拌反应10～60min，将反应后的液体进行透析得到所述尿素酶-生物素。
4.根据权利要求3所述的一种尿素酶驱动中性粒细胞递药系统在制备溶栓药物载体中的应用，其特征在于，
步骤S1中，所述透析的过程为，用1kDa的透析袋装载反应后的液体，并浸入磷酸缓冲盐溶液中8～16h。
5.根据权利要求3或4所述的一种尿素酶驱动中性粒细胞递药系统在制备溶栓药物载体中的应用，其特征在于，
步骤S1中，在透析后，还将得到的所述尿素酶-生物素分散在磷酸缓冲盐溶液中，于4℃中保存。
6.根据权利要求1所述的一种尿素酶驱动中性粒细胞递药系统在制备溶栓药物载体中的应用，其特征在于，
步骤S3具体为：
用移液管缓慢反复地吹打，将所述尿素酶修饰的中性粒细胞从所述左旋聚赖氨酸表面分离，然后使用磷酸缓冲盐溶液清洗所述尿素酶修饰的中性粒细胞两次，得到所述尿素酶驱动中性粒细胞递药系统。
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