CN114699388B - 靶向治疗深部肿瘤的仿生纳米药物载体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种靶向治疗深部肿瘤的仿生纳米药物载体，其包括修饰后纳米颗粒和活性药物；所述修饰后纳米颗粒为对纳米颗粒利用杂合细胞膜包覆后，并将脲酶在一侧固定之后所得；所述杂合细胞膜至少包括癌细胞膜和白细胞膜，所述癌细胞膜和白细胞膜的膜蛋白重量比为2:1；所述纳米颗粒为利用4‑(4‑羧基苯基)卟啉作为配体所制备的金属有机框架纳米颗粒；所述活性药物为坦螺旋霉素和泛素化特异性蛋白酶抑制剂IU1‑47。本发明提供了一种可以增强基于TCPP声动治疗的技术方案，可以用于靶向治疗深部肿瘤，且具有良好的肿瘤治疗效果，提高了基于TCPP声动治疗技术的应用价值。

Description

靶向治疗深部肿瘤的仿生纳米药物载体及其制备方法
技术领域
本发明属于肿瘤治疗技术领域，涉及深部肿瘤靶向治疗技术，具体涉及一种靶向治疗深部肿瘤的仿生纳米药物载体及其制备方法。
背景技术
目前，对于肿瘤的治疗手段，除常规的化疗、手术切除和介入治疗外，研究人员还致力于研究基于纳米医学的非侵入性治疗方法，例如光热治疗和声动力治疗。声动力治疗主要通过低频超声激发声敏剂，通过穿孔、声化学和声致发光产生ROS杀伤肿瘤细胞，由于声动力治疗所用的超声波具有较强的组织穿透性，在治疗内脏部位深部肿瘤方面具有显著优势。
研究人员已经成功开发出多种无机纳米声敏剂，如二氧化钛纳米颗粒、金纳米颗粒、介孔二氧化硅纳米颗粒等，其多孔内部结构可实现药物共载进而实现联合治疗，同时还具有较好的声动力效果，但潜在的生物安全性(如增加现有癌症转移程度并促进新转移位点的出现)，及不可降解性等问题限制了其临床应用。有机声敏剂比无机声敏剂具有更佳的生物安全性及生物相容性，常见的有机声敏剂为血卟啉类衍生物、卟吩类衍生物及酞氰类衍生物。
4-(4-羧基苯基)卟啉(简称TCPP)已被研究人员作为声敏剂，合成了相关纳米颗粒以用于肿瘤的治疗，例如苏州大学刘庄教授等利用TCPP、过氧化氢酶装载入氟化壳聚糖制备了用于治疗肿瘤的纳米颗粒[1]。
然而，单纯的声动力治疗难以发挥较好的肿瘤治疗效果，常常需要与其它肿瘤治疗方式联合，例如浙江大学的黄品同等将化疗药为吉西他滨、阿霉素或柔红霉素与的声敏剂卟啉类、酞菁类或叶绿素衍生物类联用，获得了较好的肿瘤治疗效果[2]。
在此前的研究中，发明人制备了一种靶向递药仿生纳米马达，并申请了中国专利(申请号为202110630173.1)。在将该专利所得马达用于治疗深部肿瘤时，发明人采用ZrOCl2·8H2O、4-(4-羧基苯基)卟啉和苯甲酸作为原料溶解在二甲基甲酰胺中加热反应制备了纳米颗粒，其中的4-(4-羧基苯基)卟啉便为声敏剂。在该专利中，发明人将所得的纳米马达装载铁诱导细胞死亡诱导剂Erastin后，发现在抗肿瘤方面的效果得到了显著的增强。不过，该专利也发现，利用该专利的纳米马达装载其它药物时，并未观察到明显的协同作用，这提示该发明制备的纳米马达药物载体，在提高药物治疗效果方面，对药物具有一定的选择性。
在上述专利的研究基础上，发明人继续探索能与TCPP联用并显著增强对于深部肿瘤治疗效果的方案。
[1]G.Z.Li,S.P.Wang,D.H.Deng,Z.S.Xiao,Z.L.Dong,Z.P.Wang,Q.F.Lei,S.Gao,G.X.Huang,E.P.Zhang,G.H.Zeng,Z.Wen,S.Wu,Z.Liu,Fluorinated chitosan to enhancetransmucosal delivery of sonosensitizer-conjugated catalase for sonodynamicbladder cancer treatment post-intravesical instillation,Acs Nano,14(2020)1586-1599.
[2]黄品同,仝维鋆,陈继繁,等.一种具有亚细胞器靶向声动力联合化疗抗肿瘤功能的金属有机框架纳米粒子及其制备方法,CN113171455A[P].2021.
发明内容
针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种靶向治疗深部肿瘤的仿生纳米药物载体，以提高基于光敏剂4-(4-羧基苯基)的声动力治疗效果，具体为实现抗癌药物与基于光敏剂4-(4-羧基苯基)的声动力治疗的协同抗癌作用。如无特别说明，本发明所指的“药物载体”并非空白载体，而是包含药物和装载药物的纳米颗粒。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种靶向治疗深部肿瘤的仿生纳米药物载体，所述仿生纳米药物载体包括修饰后纳米颗粒和活性药物；
所述修饰后纳米颗粒为对纳米颗粒利用杂合细胞膜包覆后，并将脲酶在包覆所得物一侧固定之后所得；所述杂合细胞膜至少包括癌细胞膜和白细胞膜，所述癌细胞膜和白细胞膜的膜蛋白重量比为2:1；
所述纳米颗粒为利用4-(4-羧基苯基)卟啉作为配体所制备的金属有机框架纳米颗粒；
所述活性药物为坦螺旋霉素和泛素化特异性蛋白酶抑制剂IU1-47。
本发明上述方案是以中国专利(申请号为202110630173.1，下称该中国专利)所制备得到的其中一种纳米马达作为修饰后纳米颗粒，该修饰后纳米颗粒在运动功能稳定性和高效主动捕获CTC方面具有同样的优势，该优势的具体情况见该中国专利说明书中的描述。简单来说，该中国专利发现，在利用脲酶作为动力源时，对用于仿生的细胞膜的选择十分重要，其影响主要体现在自驱动运动功能稳定性、所得纳米马达在肿瘤的渗透性和CTC的主动捕获能力上。当采用其它细胞膜组合制备杂合细胞膜时，脲酶容易从所得纳米马达上脱落，导致自驱动运动功能下降；同时，也不具有令人满意的CTC主动捕获能力。同时，该中国专利在研究的过程中还发现，在固定脲酶的基础上，杂合细胞膜的选择对于CTC的主动捕获能力同样具有影响，当选择其它细胞膜组合制备杂合细胞膜时，CTC主动捕获效果将出现明显的降低。不过，在该中国专利中，发明人发现一般的抗癌药物无法与所得纳米马达发挥协同作用。
通过大量的研究工作，发明人发现当利用该中国专利的基于TCPP的纳米马达(即本发明的修饰后纳米颗粒)装载坦螺旋霉素(简称17-AAG)之后，在超声作用下，抗癌作用可以有小幅的提升，这表明基于TCPP的声动治疗能与17-AAG在抗癌方面具有一定的协同增效作用。此发现虽然令人鼓舞，但是抗癌效果的提升幅度有限，难以形成令人满意的实用价值。通过不断的尝试，发明人最终发现将坦螺旋霉素和泛素化特异性蛋白酶抑制剂IU1-47共同作物活性药物装载入本发明的修饰后纳米颗粒后，抗癌作用得到了大幅度的提升，获得了有一个具有高度实用价值的靶向治疗深部肿瘤的治疗技术。
目前，在利用17-AAG进行抗肿瘤的研究中，主要是针对17-AAG的溶解度等导致的载药方式缺陷[3-4]或与其它药物联用以获得协同增效方面。Swapnil S.Desale等人将阿霉素和17-AAG装载在多肽微纳米凝胶，并在治疗乳腺癌方面发挥了协同作用[5]；SarahTalamantez-Lyburn等人将Cul5 DNA和17-AAG装载在金纳米颗粒中后，可以提高17-AAG的抗癌活性[6]；Daniel R.Premkumar等人发现将ZD1839与17-AAG联用之后，在抑瘤方面可以获得协同作用[7]。
除了针对药物联用以获得抑瘤协同作用之外，研究者们还发现17-AAG的抑瘤效果的增强依赖于药物载体及用药方式的设计。例如，Zhino Moradi等人发现，将17-AAG与金纳米颗粒联用后，在辐照条件下，可以获得明显增强的抗癌效果[8]；Keishiro Tomoda等人将紫杉醇、17-AAG和雷帕霉素联用后，在辐照作用下，可以在毒性相差不大的情况下，获得显著的抑瘤效果[9]。
据发明人所知，目前尚未有利用IU1-47与17-AAG联用的报道；同时，发明人发现单纯利用IU1-47与17-AAG联用并未产生在抗癌方面的协同增效作用，仅在与本发明的声动治疗联用后，才发挥协同增效作用。这提示，本发明中基于TCPP的声动治疗与17-AAG产生的小幅协同增效作用，可能是与IU1-47联合产生更进一步协同增效作用的基础，也可能是17-AAG和IU1-47的同时存在，可以提高声敏效果。同时，遗憾的是，基于TCPP的声动治疗与17-AAG产生的小幅协同增效作用，并不能与其它常用抗癌药物产生进一步的协同增效作用。
作为本发明优选的技术方案，所述活性药物中，所述坦螺旋霉素和泛素化特异性蛋白酶抑制剂IU1-47的重量比为3～10:1；更优选地，所述活性药物中，所述坦螺旋霉素和泛素化特异性蛋白酶抑制剂IU1-47的重量比为5:1。
作为本发明的优选技术方案，所述纳米颗粒与所述活性药物的重量比为20～25:1；优选地，所述纳米颗粒与所述活性药物的重量比为25:1。
作为本发明的优选技术方案，所述纳米颗粒的制备方法为：将ZrOCl2·8H2O、4-(4-羧基苯基)卟啉和苯甲酸作为原料溶解在N,N-二甲基甲酰胺中加热搅拌，反应完成后依次用N,N-二甲基甲酰胺和无水乙醇离心洗涤数次即得。
作为本发明的优选技术方案，所述杂合细胞膜还包括红细胞膜，所述癌细胞膜、白细胞膜和红细胞膜的膜蛋白重量比为4:2:1。
作为本发明一种可实施的技术方案，所述杂合细胞膜通过将不同细胞膜通过聚碳酸酯多孔膜进行挤压融合而得。
作为本发明的优选技术方案，在将脲酶进行固定时，固定方法为先将经对纳米颗粒利用杂合细胞膜包覆后的所得物均匀吸附在聚赖氨酸修饰的细胞培养板上，再向培养板中加入N-羟基磺酸基琥珀生物素和链霉亲和素进行反应，然后加入生物素修饰的脲酶进行反应；所述生物素修饰的脲酶为将脲酶溶解于PBS缓冲液中并加入N-羟基磺酸基琥珀生物素反应所得。
作为本发明一种可实施的技术方案，所述癌细胞膜的获取方法为：1)在培养皿培养HepG 2细胞，消化后离心收集癌细胞，将其悬浮在Hepes B缓冲液与1％蛋白酶抑制剂混合物中，冰浴冷却5分钟后将细胞匀浆数次，去除细胞核，收集上清液；2)用Hepes B缓冲液配制重量体积百分数为30％40％和55％的蔗糖溶液，并按浓度由高到低加入离心管中，将收集的上清液缓慢加到蔗糖密度梯度柱中；3)在4℃下高速离心，收集所需的样品带，用Hepes C缓冲液反复吹均匀、离心和重悬，即得。
本发明的另外一个目的在于提供上述一种靶向治疗深部肿瘤的仿生纳米药物载体的制备方法，所述制备方法包括将所述活性药物覆载在所述修饰后纳米颗粒之上；进行所述覆载时，为将所述活性药物和所述修饰后纳米颗粒置于溶液中孵育，之后去除未覆载的活性药物，冻干后即得。
本发明还有一个目的在于提供上述一种靶向治疗深部肿瘤的仿生纳米药物载体在制备用于靶向治疗深部肿瘤的药物的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种可以增强基于TCPP声动治疗的技术方案，可以用于靶向治疗深部肿瘤，且具有良好的肿瘤治疗效果，提高了基于TCPP声动治疗技术的应用价值。
本部分参考文献：
[3]Saxena V,Hussain M D.Formulation and in vitro evaluation of 17-allyamino-17-demethoxygeldanamycin(17-AAG)loaded polymeric mixed micelles forglioblastoma multiforme[J].Colloids&Surfaces B Biointerfaces,2013,112:350-355.
[4]Saxena V,Hussain M D.Formulation and in vitro evaluation of 17-allyamino-17-demethoxygeldanamycin(17-AAG)loaded polymeric mixed micelles forglioblastoma multiforme[J].Colloids&Surfaces B Biointerfaces,2013,112:350-355.
[5]Polypeptide-based nanogels co-encapsulating a synergisticcombination of doxorubicin with 17-AAG show potent anti-tumor activity inErbB2-driven breast cancer models[J].Journal of Controlled Release:OfficialJournal of the Controlled Release Society,2015,208:59-66.
[6]Talamantez-Lyburn S,Brown P,Hondrogiannis N,et al.Goldnanoparticles loaded with cullin-5 DNA increase sensitivity to17-AAG incullin-5 deficient breast cancer cells[J].International JournalofPharmaceutics,2019,564:281-292.
[7]Premkumar D R,Arnold B,Pollack I F.Cooperative inhibitory effectof ZD1839(Iressa)in combination with 17-AAG on glioma cell growth[J].Molecular Carcinogenesis,2010,45(5):288-301.
[8]Moradi Z,Mohammadian M,Saberi H,et al.Anti-cancer effects ofchemotherapeutic agent；17-AAG,in combined with gold nanoparticles andirradiation in human colorectal cancer cells[J].DARU Journal ofPharmaceuticalSciences,2019.
[9]Tomoda K,Tam Y T,Cho H,et al.Triolimus:A Multi-Drug LoadedPolymeric Micelle Containing Paclitaxel,17-AAG,and Rapamycin as a NovelRadiosensitizer[J].MacromolecularBioscience,2017.
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
在本发明以下例子中，除了通过在相关物质后的括号中记载其缩写词含义之外，如无特别说明，其它的缩写词及其含义如下：
TCPP：meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine，中文名称4-(4-羧基苯基)卟啉；
Sulfo-NHS-biotin：N-羟基磺酸基琥珀生物素；
MOF-17-AAG-IU1-47@HM：包覆杂合细胞膜且装载有MOF、17-AAG和IU1-47；
MOF-17-AAG@HM/Ure：包覆杂合细胞膜且装载有MOF和17-AAG；
MOF-IU1-47@HM/Ure：包覆杂合细胞膜且装载有MOF和IU1-47；
MOF-17-AAG-IU1-47@HM/Ure：MOF-17-AAG-IU1-47@HM/Ure的MOF-17-AAG-IU1-47@HM；
Fe3O4-17-AAG-IU1-47@HM/Ure：在Fe3O4上包覆杂合细胞膜，并装载有17-AAG和IU1-47；
MMC：丝裂霉素；
CIS：顺铂。
下述实施例、对比实施例和实验例中，如无特别说明，IU1-47为发明人实验室合成所得(制备方法参考文献DOI：10.1074/jbc.m117.815126)，其余原料均为市售。其中，IU1-47的结构式如下：
Figure BDA0003554797090000101
实施例1
一种靶向治疗深部肿瘤的仿生纳米药物载体，所述仿生纳米药物载体包括修饰后纳米颗粒和活性药物；
所述修饰后纳米颗粒为对纳米颗粒利用杂合细胞膜包覆后，并将脲酶在一侧固定之后所得；所述杂合细胞膜由癌细胞膜和白细胞膜组成，所述癌细胞膜和白细胞膜的膜蛋白重量比为2:1；
所述纳米颗粒为利用4-(4-羧基苯基)卟啉作为配体所制备的金属有机框架纳米颗粒；
所述活性药物为坦螺旋霉素和泛素化特异性蛋白酶抑制剂IU1-47，所述坦螺旋霉素和泛素化特异性蛋白酶抑制剂IU1-47的重量比为5:1。
所述纳米颗粒的制备方法为：将ZrOCl2·8H2O、4-(4-羧基苯基)卟啉和苯甲酸作为原料溶解在N,N-二甲基甲酰胺中加热搅拌，反应完成后依次用N,N-二甲基甲酰胺和无水乙醇离心洗涤数次即得。
所述杂合细胞膜的制备方法为：按膜蛋白重量比2:1的比例，将癌细胞膜和白细胞膜混合。每个样品在室温下缓慢搅拌数分钟后进行超声处理3分钟，最后通过400nm和200nm聚碳酸酯多孔膜进行挤压融合，离心收集癌细胞-白细胞杂合膜。
在将脲酶进行固定时，固定方法为先将经对纳米颗粒利用杂合细胞膜包覆后的所得物均匀吸附在聚赖氨酸修饰的细胞培养板上，再向培养板中加入N-羟基磺酸基琥珀生物素和链霉亲和素进行反应，然后加入生物素修饰的脲酶进行反应；所述生物素修饰的脲酶为将脲酶溶解于PBS缓冲液中并加入N-羟基磺酸基琥珀生物素反应所得。
所述癌细胞膜的获取方法为：1)在培养皿培养HepG 2细胞，消化后离心收集癌细胞，将其悬浮在Hepes B缓冲液与1％蛋白酶抑制剂混合物中，冰浴冷却5分钟后将细胞匀浆数次，去除细胞核，收集上清液；2)用Hepes B缓冲液配制重量体积百分数为30％40％和55％的蔗糖溶液，并按浓度由高到低加入离心管中，将收集的上清液缓慢加到蔗糖密度梯度柱中；3)在4℃下高速离心，收集所需的样品带，用Hepes C缓冲液反复吹均匀、离心和重悬，即得。
上述技术方案的详细实现过程如下：
1)称取一定量ZrOCl2·8H2O、TCPP和苯甲酸作为原料溶解在DMF中加热搅拌，反应完成后将得到的MOF纳米颗粒依次用DMF和无水乙醇离心洗涤数次。将坦螺旋霉素和泛素化特异性蛋白酶抑制剂IU1-47，按照重量比5:1的比例，加入氯仿中振荡孵育，除去未载入的药物，并使得MOF纳米颗粒与所载药物的重量比为25:1；冷冻干燥即得载药纳米MOF(代号为MOF-17-AAG-IU1-47)。
2)配制Hepes B(2.38g/L Hepes，0.476g/LMgCl2，0.292g/L EDTA，0.154g/LDTT，0.746g/LKCl，pH 7.6)和Hepes C(11.914g/L Hepes，5.844g/LNaCl，13.492g/L KCl，pH7.6)缓冲液。在培养皿培养HepG 2细胞，消化后离心收集一定数量的癌细胞，悬浮在HepesB缓冲液与1％蛋白酶抑制剂混合物中，冰浴冷却5分钟后将细胞匀浆数次，去除细胞核。重复以上步骤，最终收集8-10mL上清液。用Hepes B缓冲液配制浓度为30％、40％、55％(w/v)的蔗糖溶液，并按浓度由高到低加入离心管中，将收集的上清液缓慢加到蔗糖密度梯度柱中。在4℃下高速离心，收集所需的样品带，用Hepes C缓冲液反复吹匀，离心。最后，将得到的癌细胞膜重新悬浮在Hepes C缓冲液中保存备用。白细胞膜的获取方法，在收集相应细胞后参照上述方法获得。
3)按膜蛋白比2:1的比例，将癌细胞膜、白细胞膜混合。每个样品在室温下缓慢搅拌数分钟后进行超声处理3分钟，最后通过400nm和200nm聚碳酸酯多孔膜进行挤压融合，离心收集癌细胞-白细胞杂合膜。
4)取适量浓度的MOF-17-AAG-IU1-47纳米粒子加入过量的癌细胞-白细胞杂合膜中，对混合物进行稀释后在冰浴中超声处理3分钟，随后通过400nm和200nm孔径的聚碳酸酯多孔膜。
5)将脲酶溶解于PBS缓冲液中(1mg/mL)，随后在酶溶液中加入等体积的Sulfo-NHS-biotin(16μM)室温反应半小时，过滤去除未反应的Sulfo-NHS-biotin，离心得到生物素修饰的脲酶(Urease-biotin)溶解于PBS缓冲液4℃保存备用。将步骤4)所得物悬浮液加入聚赖氨酸修饰的12孔细胞培养板，通过离心使步骤4)所得物均匀吸附在培养板底部，在室温下反应一个小时后移除上清液并用PBS冲洗数次。随后向培养板中逐次加入Sulfo-NHS-biotin(160μM)和链霉亲和素(160μM)室温反应1小时，用PBS冲洗每步反应。最后加入Urease-biotin室温反应1小时，通过生物素和链霉亲和素的生物亲和作用将脲酶固定于未封闭一侧，并用移液枪缓慢吹洗使其从培养板释放得到MOF-17-AAG-IU1-47@HM：。
实施例2
在制备杂合膜时，还加入红细胞膜，癌细胞膜、白细胞膜和红细胞膜的膜蛋白重量比为4:2:1。红细胞膜的获取方法，在收集相应细胞后参照癌细胞膜的获得方法获得。其余与实施例1一致。
实施例3
除了坦螺旋霉素和泛素化特异性蛋白酶抑制剂IU1-47的重量比为10:1，纳米颗粒与活性药物的重量比为20:1之外，其余与实施例1一致。
实施例4
除了坦螺旋霉素和泛素化特异性蛋白酶抑制剂IU1-47的重量比为3:1，纳米颗粒与活性药物的重量比为22:1之外，其余与实施例1一致。
对比实施例1
在实施例1的基础上，将基于TCPP制备的纳米颗粒替换为Fe3O4磁性纳米颗粒，其余与实施例1一致。
对比实施例2
在实施例1的基础上，活性药物仅为坦螺旋霉素，其余与实施例1一致。
对比实施例3
在实施例1的基础上，活性药物仅为泛素化特异性蛋白酶抑制剂IU1-47，其余与实施例1一致。
对比实施例4
在实施例1的基础上，将泛素化特异性蛋白酶抑制剂IU1-47替换为丝裂霉素，其余与实施例1一致。
对比实施例5
在实施例1的基础上，将泛素化特异性蛋白酶抑制剂IU1-47替换为顺铂，其余与实施例1一致。
实验例
1.对实施例1的杂合细胞膜的包覆表征及稳定性评价
为了表征杂合膜的形成，将DSPE-PEG-FITC染料和白细胞膜混合反应数小时，将DSPE-PEG-Cy5染料与癌细胞膜混合反应数小时，待荧光标记完成后通过离心去除多余染料。用相同方法将荧光标记后的细胞膜融合形成杂合细胞膜并滴至载玻片上，利用CLSM在488nm下激发FITC，收集525nm处的绿色荧光，在649nm激光下激发Cy5，收集670nm处的红色荧光，将未挤压融合的细胞膜作为对照，以荧光颜色叠加确定两种杂合膜的形成。
用磷钨酸对MOF-17-AAG-IU1-47@HM进行复染，通过TEM表征其形貌，观察杂合细胞膜对纳米载体的包覆情况。为了验证仿生纳米载体的核-壳结构，使用FITC对杂合细胞膜进行标记，通过CLSM观察TPCC和FITC的荧光分布。采用DLS测定了仿生纳米载体的水动力直径和Zeta电位，比较杂合细胞膜包覆前后的变化。经观察：(1)包覆细胞膜前后纳米载体的形貌发生明显变化，MOF-17-AAG-IU1-47@HM具备完整的核壳结构，同时可以观察到细胞膜厚度约为10nm；(2)脲酶均匀分布在MOF-17-AAG-IU1-47@HM的一侧；(3)细胞膜包覆和动力酶修饰使纳米载体的粒径略微增加；(4)由于膜蛋白和脲酶呈负电性导致细胞膜包覆和酶修饰改变了纳米载体的表面电位。
将仿生纳米药物载体分散于PBS缓冲液和牛血清溶液保存两周，通过DLS测定粒径变化验证其长期保存稳定性。同时，为了考察脲酶固定稳定性，将仿生纳米载体稀释分散于PBS缓冲液中，并置于摇床上(2000rpm/min)一段时间，记录所得仿生纳米药物载体自驱动运动功能的维持效果。进行长期保存性和自驱动运动功能稳定性评价时，以粒径变化10％为指标考察长期保存性；以将仿生纳米药物载体在摇床上震荡30分钟后，于微流控设备中观察还具有自驱动运动能力的仿生纳米药物载体数量占总数量的占比为标准，考察仿生纳米药物载体运动功能稳定性。经考察后，发现仿生纳米药物载体在保存8天之后，自驱动运动功能稳定性达到91％以上。
2.对实施例1的的仿生纳米药物载体的运动特征和渗透分布性评价
通过将MOF-17-AAG-IU1-47@HM/Ure加入不同浓度的尿素溶液中，并采集运动轨迹，本发明研究了实施例1仿生纳米药物载体的均方位移和扩散效率。结果表明其运动能力与尿素浓度呈正相关。
为了考察仿生纳米药物载体的渗透性，在Transwell的下室中培养HepG2细胞，上室中加入MOF-17-AAG-IU1-47@HM/Ure。通过细胞吞噬实验可以发现，在上室中加入脲酶后细胞对MOF-17-AAG-IU1-47@HM/Ure的吞噬明显增加，表明脲酶介导的运动特性有助于MOF-17-AAG-IU1-47@HM/Ure通过Transwell的多孔膜，具有促渗透效应。
3.抗肿瘤效果实验
原位肝癌动物模型的构建：将HepG2细胞复苏消化之后，将50μL含有5×105个细胞的悬浮液注射在小鼠的肝脏部位构建原位肝癌动物模型，待肿瘤长到50mm3左右开始进行动物实验。
分别使用生理盐水、坦螺旋霉素、IU1-47、MOF-17-AAG-IU1-47@HM/Ure(实施例1)、坦螺旋霉素+IU1-47、Fe3O4-AAG-IU1-47@HM/Ure(对比实施例1)、MOF-17-AAG@HM/Ure(对比实施例2)、MOF-IU1-47@HM/Ure(对比实施例3)、MOF-17-AAG-MMC@HM/Ure(对比实施例4)、MOF-17-AAG-CIS@HM/Ure(对比实施例5)对荷瘤小鼠进行为期2次间隔2天的同方式给药治疗(除生理盐水组之外，各组每次给药时，活性药物给药量为5mg/kg)，并每隔24小时使用超声进行治疗，记录18天内每3天肿瘤体积及小鼠体重及存活情况。治疗末期处死小鼠并取出肿瘤，记录肿瘤实验前后体积大小变化，以考察抗肿瘤效果。同时，记录第30天时，各组的存活率。其中，坦螺旋霉素+IU1-47组中，坦螺旋霉素与IU1-47的重量比为5:1。本实验中，活性药物指的是坦螺旋霉素、IU1-47、MMC及CIS按各组情况采用的其中一种或其组合。
以生理盐水组为基准，记录其它各组在18天后相对于生理盐水组而言，肿瘤增大幅度的相对值，计算方法为：将各组第18天的肿瘤体积减去第0天时的肿瘤体积，获得肿瘤增大值，并将其它各组的肿瘤体积增大值与生理盐水组的肿瘤增大值相比，获得相对应的百分数，每组实验进行10个重复，结果如表1所示。各组存活率如表2所示。
表1
Figure BDA0003554797090000171
Figure BDA0003554797090000181
表2
Figure BDA0003554797090000182
由表1可知，MOF-17-AAG@HM/Ure相对于坦螺旋霉素组而言，可以小幅提高抑瘤效果，当共同装载坦螺旋霉素和IU1-47(MOF-17-AAG-IU1-47@HM/Ure)之后，可以大幅度的提高抑瘤效果，并将存活率提升至90％。同时，还可知，当将IU1-47替换为其它常见抗癌药物与载坦螺旋霉素共同装载后，抑瘤效果相对于MOF-17-AAG@HM/Ure组而言，没有明显变化。
由表2可知，除了MOF-17-AAG-IU1-47@HM/Ure组之外，其余各组的存活率基本没区别。原因主要在于各组在抑瘤效果方面，没有明显差异，在此情况下，抑瘤效果方面的差异对在实验周期内的致死率影响不大。可以知晓的是，MOF-17-AAG-IU1-47@HM/Ure显著的提升了存活期(在实验周期30天情况下，可获得90％的存活率)。

Claims (7)

1.一种靶向治疗深部肿瘤的仿生纳米药物载体，其特征在于，所述仿生纳米药物载体包括修饰后纳米颗粒和活性药物；
所述修饰后纳米颗粒为对纳米颗粒利用杂合细胞膜包覆后，并将脲酶在包覆所得物一侧固定之后所得；所述杂合细胞膜至少包括癌细胞膜和白细胞膜，所述癌细胞膜和白细胞膜的膜蛋白重量比为2:1；所述癌细胞膜为HepG2癌细胞膜；
所述纳米颗粒为利用4-(4-羧基苯基)卟啉作为配体所制备的金属有机框架纳米颗粒，其制备方法为：将ZrOCl2·8H2O、4-(4-羧基苯基)卟啉和苯甲酸作为原料溶解在N,N-二甲基甲酰胺中加热搅拌，反应完成后依次用N,N-二甲基甲酰胺和无水乙醇离心洗涤数次即得；
所述活性药物为坦螺旋霉素和泛素化特异性蛋白酶抑制剂IU1-47；所述活性药物中，所述坦螺旋霉素和泛素化特异性蛋白酶抑制剂IU1-47的重量比为5:1；
所述纳米颗粒与所述活性药物的重量比为25:1。
2.根据权利要求1所述的仿生纳米药物载体，其特征在于，所述杂合细胞膜还包括红细胞膜，所述癌细胞膜、白细胞膜和红细胞膜的膜蛋白重量比为4:2:1。
3.根据权利要求1或2所述的仿生纳米药物载体，其特征在于，所述杂合细胞膜通过将不同细胞膜通过聚碳酸酯多孔膜进行挤压融合而得。
4.根据权利要求1所述的仿生纳米药物载体，其特征在于，在将脲酶进行固定时，固定方法为先将经对纳米颗粒利用杂合细胞膜包覆后的所得物均匀吸附在聚赖氨酸修饰的细胞培养板上，再向培养板中加入N-羟基磺酸基琥珀生物素和链霉亲和素进行反应，然后加入生物素修饰的脲酶进行反应；所述生物素修饰的脲酶为将脲酶溶解于PBS缓冲液中并加入N-羟基磺酸基琥珀生物素反应所得。
5.根据权利要求1所述的仿生纳米药物载体，其特征在于，所述癌细胞膜的获取方法为：1)在培养皿培养HepG2细胞，消化后离心收集癌细胞，将其悬浮在HepesB缓冲液与1％蛋白酶抑制剂混合物中，冰浴冷却5分钟后将细胞匀浆数次，去除细胞核，收集上清液；2)用HepesB缓冲液配制重量体积百分数为30％40％和55％的蔗糖溶液，并按浓度由高到低加入离心管中，将收集的上清液缓慢加到蔗糖密度梯度柱中；3)在4℃下高速离心，收集所需的样品带，用HepesC缓冲液反复吹均匀、离心和重悬，即得。
6.如权利要求1-5任一项所述一种靶向治疗深部肿瘤的仿生纳米药物载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将所述活性药物覆载在所述修饰后纳米颗粒之上；进行所述覆载时，为将所述活性药物和所述修饰后纳米颗粒置于溶液中孵育，之后去除未覆载的活性药物，冻干后即得。
7.如权利要求1-5所述的仿生纳米药物载体或根据权利要求6所述制备方法制备得到的仿生纳米药物载体在制备用于靶向治疗深部肿瘤的药物的应用。
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