CN109674764A - 一种抗肿瘤磁性载药杂化纳米胶囊及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤磁性载药杂化纳米胶囊及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：首先制备油酸包裹的磁性四氧化三铁纳米粒子(Fe3O4‑OA)，用TPGS和PEG通过缩合反应对肝素钠修饰以后，再利用超声乳化法制得包载Fe3O4‑OA和阿霉素磁性纳米胶囊，随后在胶囊外围修饰肿瘤穿膜肽iRGD赋予其肿瘤细胞靶向功能，最后用碳酸氢铵处理后形成磁性载药杂化纳米胶囊。该方法制备出的磁性载药杂化纳米胶囊靶向性强，在近红外激光照射下具有良好的刺激响应性能，可产生二氧化碳气体，实现其在肿瘤部位高选择性的快速释药，同时生物相容性好、安全性高，还有一定的磁响应行为。

Description

一种抗肿瘤磁性载药杂化纳米胶囊及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学材料技术领域，具体涉及一种抗肿瘤磁性载药杂化纳米胶囊及其制备方法。
背景技术
恶性肿瘤严重威胁着人类的生命健康。作为一类致命性的重大恶性疾病，由于其发病机制和病程进展复杂，同时还具有易转移、高度异常增殖等特点，已造成全球每年逾百万人的死亡。恶性肿瘤的发病率持续上升，极大地影响了居民的健康生活，同时也给家庭和社会带来沉重的经济负担。因此，肿瘤治疗是当前亟待解决的医疗和社会难题。肿瘤的通常治疗包括手术治疗，放射治疗和化学治疗等手段。其中化学治疗法是当今肿瘤临床治疗上的一种常用的手段，其治疗原理是通过利用药物分子来抑制肿瘤细胞的增殖、浸润和转移，并最终杀灭肿瘤细胞。其中阿霉素(DOX)具有广谱的恶性肿瘤治疗效果，这种蒽环霉素类的抗肿瘤药物，主要通过细胞膜进入细胞后作用于DNA进而杀死癌细胞。而DOX的毒性较大，对人体正常组织细胞会有明显的毒副作用。为了使药物更安全、有效地送达肿瘤部位并作用于肿瘤细胞，显著提升肿瘤治疗效果的同时也能减小对正常组织器官的损伤，纳米粒子等药物递送系统在用于抗肿瘤方面得到广泛关注和研究。将药物包载在纳米载体中，可避免药物与体内环境直接接触，可提升药物的稳定性，进一步在载体上修饰相关靶向分子，通过特异性识别肿瘤细胞而将含有药物的纳米载体富集到肿瘤部位，可提升药物的利用效率。但现有的纳米载药系统生物相容性不佳，药物的释放不能得到很好的控制，因此研究一种稳定高效、生物相容性能好的纳米药物递送系统对于肿瘤的治疗研究具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种抗肿瘤磁性载药杂化纳米胶囊及其制备方法，该纳米胶囊可通过近红外光照实现纳米胶囊体系温度的升高，达到有效可控的药物释放的目的，进而实现良好的抗肿瘤效果，同时安全性佳。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种抗肿瘤磁性载药杂化纳米胶囊，其制备方法包括以下步骤：
(1)制备Fe3O4-OA
在N2条件下，将Fe(acac)3、1,2-hexadecanediol、OA和oleylamine按摩尔比为1:1-2:2-3:4-5混合，在190-210℃保温1.5-2.5h，再将温度升至260-270℃保温 0.5-1.5h，然后冷却至室温后进行磁分离，制得Fe3O4-OA；
(2)制备TPGS-Cystamine-NH2
在N2条件下，将TPGS、丁二酸酐和DMAP按质量比为7-8:1:1-2混合，用无水二氯甲烷溶解，在室温下反应22-26h，然后过滤、透析、干燥，制得 TPGS-COOH；
将TPGS-COOH、EDC·HCl、NHS和胱胺盐酸按质量比为1-3:4-6:1:2-4混合，用水溶解，并调节pH至6-7，然后在磁力搅拌条件下反应46-50h，反应完毕后透析、干燥，制得TPGS-Cystamine-NH2；
(3)制备HO-PEG-Cystamine-NH2
将HO-PEG-COOH、EDC·HCl、NHS和胱胺盐酸按质量比为1-3:4-6:1:2-4 混合，用水溶解，并调节pH至6-7，然后在磁力搅拌条件下反应46-50h，反应完毕后透析、干燥，制得HO-PEG-Cystamine-NH2；
(4)制备Hep-TPGS-PEG-COOH
将肝素钠、TPGS-Cystamine-NH2、HO-PEG-Cystamine-NH2、EDC·HCl和 NHS按质量比为3-5:0.8-1.2:0.8-1.2:2-3:1-2混合，用水溶解，并调节pH至6-7，然后在磁力搅拌条件下反应46-50h，反应完毕后透析、干燥，制得 Hep-TPGS-PEG-OH；
在氮气条件下，将Hep-TPGS-PEG-OH、丁二酸酐和DMAP按质量比为 6-8:0.5-1.5:1-3混合，用DMF溶解，在室温反应22-26h，透析、干燥，制得 Hep-TPGS-PEG-COOH；
(5)制备磁性载药杂化纳米胶囊
将抗肿瘤药物溶于溶剂中，并加入三乙胺超声分散，接着加入Fe3O4-OA继续超声分散，得溶液1；
将Hep-TPGS-PEG-COOH溶于溶剂中，得溶液2；
将溶液1和溶液2混匀，进行超声乳化处理，超声完毕后，在避光黑暗条件下除去溶剂，然后加入EDC·HCl、NHS和胱胺盐酸盐振荡反应过夜，反应完全后，透析，向透析产物中加入iRGD、EDC·HCl和NHS，继续反应22-26h，然后在水中透析2天，再在2M碳酸氢铵溶液中放置22-26h，最后透析除去游离的碳酸氢铵，过滤，干燥，制得；其中抗肿瘤药物、Fe3O4-OA和HEP-TPGS-PEG-COOH的质量比为0.5-3:1-3:2-4；HEP-TPGS-PEG-COOH、胱胺盐酸盐、EDC·HCl和NHS的质量比为 0.8-1.5:0.005-0.01:0.002-0.005:0.0005-0.001；HEP-TPGS-PEG-COOH、iRGD、 EDC·HCl和NHS的质量比为8-12:7-8:2-3:0.8-1.2。
进一步地，步骤(1)中Fe(acac)3、1,2-hexadecanediol、OA和oleylamine 的摩尔比为1:1.29:2.61:4.23。
进一步地，步骤(1)中先在200℃保温2h，再将温度升至265℃保温1h。
进一步地，步骤(2)中TPGS、丁二酸酐和DMAP的质量比为7.69:1:1.31。
进一步地，步骤(2)中TPGS-COOH、EDC·HCl、NHS和胱胺盐酸的质量比为2:5:1:3。
进一步地，步骤(3)中HO-PEG-COOH、EDC·HCl、NHS和胱胺盐酸的质量比为2:5:1:3。
进一步地，步骤(4)中肝素钠、TPGS-Cystamine-NH2、 HO-PEG-Cystamine-NH2、EDC·HCl和NHS的质量比为4:1:1:2.24:1.36。
进一步地，步骤(4)中Hep-TPGS-PEG-OH、丁二酸酐和DMAP的质量比为6.25:1:1.25。
进一步地，步骤(5)中抗肿瘤药物为阿霉素，阿霉素盐酸盐、Fe3O4-OA和 HEP-TPGS-PEG-COOH的质量比为1:1.33:2.67；HEP-TPGS-PEG-COOH、胱胺盐酸盐、EDC·HCl和NHS的质量比为1:0.006:0.003:0.0006； HEP-TPGS-PEG-COOH、iRGD、EDC·HCl和NHS的质量比为10:7.5:2.5:1。
本发明提供的抗肿瘤磁性载药杂化纳米胶囊及其制备方法，具有以下有益效果：
本发明首先制备油酸包裹的磁性四氧化三铁纳米粒子(Fe3O4-OA)，用TPGS 和PEG通过缩合反应对肝素钠修饰以后，再利用超声乳化法制得包载Fe3O4-OA 和阿霉素磁性纳米胶囊。随后在胶囊外围修饰肿瘤穿膜肽iRGD赋予其肿瘤细胞靶向功能，最后用碳酸氢铵处理后形成磁性载药杂化纳米胶囊，在接受近红外激光照射后，温度升至41-42℃时，碳酸氢铵和阿霉素的复合物分解，药物在气体作用下被释放出来，产生相应药物疗效。
碳酸氢盐在受热条件下(42℃)产生CO2气体，可以帮助药物从纳米粒子内部释放出来；磁性四氧化三铁纳米粒子具有良好的光热转换性质，在近红外激光照射条件下，可迅速产生热量，使局部温度升高，可用作光热型响应剂来产生热量促进碳酸氢盐分解，产生二氧化碳气体进而使得药物在肿瘤部位有效释放，达到良好的抗肿瘤效果。
iRGD是一个基于二硫键循环的环形RGD肽，肿瘤细胞或者肿瘤新生血管内皮细胞常特异性高表达的某些整合素受体能以较高的亲和力结合RGD序列。在iRGD与肿瘤血管内皮细胞特异表达的整合素受体结合以后，会暴露出C-末端CendR基序(R/KXXR/K)能够特异性结合神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1， NRP-1)，而结合状态的NRP-1能够激发肿瘤组织的渗透性，因此iRGD修饰的载体系统可以将携带的药物渗入到深部肿瘤组织，达到一种特殊高效的药物渗透效果。
本发明以具有很好的生物安全性的天然聚合物肝素作为纳米胶囊的骨架材料，修饰的TPGS是一种安全的辅料，可有效抑制多药耐药；iRGD作为环形的 RGD肽，具有将纳米胶囊靶向至肿瘤细胞，并实现药物渗入到深部肿瘤组织的能力；这种集多功能组分构建的磁性载药杂化纳米胶囊，具有良好的光热响应行为，可实现其在肿瘤细胞内高选择性的有效药物释放，同时载药杂化纳米胶囊生物相容性好、安全性高，同时还有一定的磁响应行为。
附图说明
图1为抗肿瘤磁性载药杂化纳米胶囊的示意图；
图2为合成TPGS-COOH线路图；
图3为TPGS-Cystamine-NH2的合成线路图；
图4为合成HO-PEG-Cystamine-NH2合成路线图；
图5为利用TPGS和PEG修饰肝素钠的路线图；
图6为Hep-TPGS-PEG-COOH的核磁氢谱图；
图7为Hep-TPGS-PEG-COOH红外谱图；
图8为载药磁性杂化纳米胶囊的粒径分布图(a为HTP-NCs，b为 HTP-iRGD-NCs)和扫描电镜图(c为HTP-NCs，d为HTP-iRGD-NCs)；
图9为载药磁性杂化纳米胶囊的热重分析曲线图；
图10为载药磁性杂化纳米胶囊的磁响应行为图；
图11为Fe3O4-OA纳米粒子分散液在近红外光照下的温度变化行为曲线图；
图12为靶向载药磁性杂化纳米胶囊分散液在近红外光照下的热成像图及部分区域的温度值统计；
图13为载药磁性杂化纳米胶囊分散液在光照时温度变化(ΔT)随时间变化趋势图；；
图14为靶向载药磁性杂化纳米胶囊的体外药物释放行为图；
图15为两种空白纳米胶囊HTP-NCs(HTP-nanocapsules，a)和 HTP-iRGD-NCs(HTP-iRGD-nanocapsules，b)对293T细胞的毒性；不含药物的HTP-iRGD-NCs(c)和HTP-COOH(HEP-TPGS-PEG-COOH，d)对MCF-7细胞的毒性图；
图16为HTP-iRGD-NCs与MCF-7细胞作用后的激光共聚焦图；
图17为图16中DOX在细胞内荧光信号强度统计图；
图18为MCF-7细胞中DOX的累积情况细胞流式分析图；
图19为载药磁性杂化纳米胶囊对MCF-7细胞的毒性实验结果图。
具体实施方式
本发明以肝素和羧基化的TPGS，PEG2000为原料，通过缩合反应对肝素修饰TPGS和PEG。在此基础上，利用超声乳化法，通过一步实现Fe3O4-OA和 DOX的共同包载。为了使纳米胶囊能主动靶向到达肿瘤部位且较深入渗透到肿瘤组织中，在PEG 2000末端通过缩合反应引入了肿瘤穿膜肽iRGD。随后将纳米胶囊置于碳酸氢铵溶液中放置24h，最后利用透析袋透析后，过滤膜后得到近红外激光照射条件下可产生二氧化碳气体的磁性载药杂化纳米胶囊，示意图见图1。
本发明中所用物质的英文名称对应的中文名称如下：
Fe(acac)3：三乙酰丙酮铁；
1,2-hexadecanediol：1,2-十六烷二醇；
OA：油酸；
oleylamine：油胺；
TPGS：维生素E聚乙二醇琥珀酸酯；
DMAP：4-二甲氨基吡啶；
EDC·HCl：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；
NHS：N-羟基琥珀酰亚胺；
HO-PEG-COOH：羟基-聚乙二醇-羧基；
DCM：二氯甲烷；
DMF：N，N-二甲基甲酰胺。
实施例1 Fe3O4-OA的制备
在N2保护条件下，向三口瓶中加入Fe(acac)3、1,2-hexadecanediol、OA和oleylamine，最后加入二苄醚。利用砂浴加热，待温度缓慢升至200℃，保温2h，再缓慢升温至265℃，保温1h后，冷却至室温。将三口瓶中的反应物转移至锥形瓶，进行磁分离。磁分离完成后，将上清液倒掉，加入少量乙醇将黑色沉淀转移至离心管中进行离心(3000r/min，5min)。将离心所得上清液丢弃，向其中滴加少量正己烷，再将黑色沉淀转移至高速离心管进行离心(8000r/min，10min)。移取上层悬浮液至锥形瓶中，加入适量酒精后进行磁分离，待分离较完全后，再次离心操作(3000r/min，3min)。离心完毕后，倒掉上层清液，加入少量正己烷将产物分散并转移至储物瓶中，封口4℃保存；其中Fe(acac)3、 1,2-hexadecanediol、OA和oleylamine的物质的量之比为1:1.29:2.61:4.23。
实施例2 TPGS-Cystamine-NH2和HO-PEG-Cystamine-NH2的制备
称取TPGS、丁二酸酐和DMAP置于圆底烧瓶中，用无水二氯甲烷溶解后，在N2保护无水无氧条件下反应24h。反应完毕后，将反应液过滤，收集滤液。在透析袋(cut-off Mw＝1KDa)中，用50％乙醇透析48h后，再在去离子水中透析 48h，冷冻干燥后得到产物，命名为TPGS-COOH；其中TPGS、丁二酸酐和DMAP 的质量比为7.69:1:1.31。
上述获取的TPGS-COOH与EDC·HCl、NHS和胱胺盐酸在圆底烧瓶中用去离子水溶解，并调节pH至6-7之间，随后在磁力搅拌下反应48h。反应完毕后在去离子水中透析三天(cut-off Mw＝1KDa)，冷冻干燥得到白色产物，即为 TPGS-Cystamine-NH2。其中TPGS-COOH、EDC·HCl、NHS和胱胺盐酸的质量比为2:5:1:3。
HO-PEG-Cystamine-NH2的制备：在圆底烧瓶中用去离子水溶解 HO-PEG-COOH、EDC·HCl、NHS和胱胺盐酸，调节pH至6-7之间，磁力搅拌下反应48h，在去离子水中透析三天(cut-off Mw＝1KDa)，冷冻干燥得到 HO-PEG-Cystamine-NH2。其中HO-PEG-COOH、EDC·HCl、NHS和胱胺盐酸的质量比为2:5:1:3。
反应路线如图2-图4所示。
实施例3 Hep-TPGS-PEG-COOH的制备
将肝素钠、TPGS-Cystamine-NH2和HO-PEG-Cystamine-NH2加入圆底烧瓶中，再加入EDC·HCl和NHS，混匀，然后用去离子水溶解后，调节溶液的pH 至6-7。磁力搅拌反应48h后，将液体转移至透析袋(cut-off Mw＝3500Da)中用去离子水透析72h，最后冷冻干燥，得到Hep-TPGS-PEG-OH。其中肝素钠、 TPGS-Cystamine-NH2、HO-PEG-Cystamine-NH2、EDC·HCl和NHS的质量比为 4:1:1:2.24:1.36。
将上述制备的Hep-TPGS-PEG-OH与丁二酸酐和DMAP置于圆底支口瓶中，用无水DMF溶解，在室温下氮气保护反应24h，透析、冻干后得到支链上PEG 末端带有-COOH的肝素接枝修饰物Hep-TPGS-PEG-COOH，其中 Hep-TPGS-PEG-OH、丁二酸酐和DMAP的质量比为6.25:1:1.25。
Hep-TPGS-PEG-OH反应路线如图5所示，Hep-TPGS-PEG-COOH的1H-NMR扫描图如图6所示，红外谱图如图7所示。
实施例4靶向磁性载药杂化纳米胶囊的制备
取阿霉素盐酸盐(DOX·HCl)，分散于二氯甲烷(DCM)中，加入3倍当量的三乙胺后，超声分散20min，再加入Fe3O4-OA，超声使其分散在DCM中，得溶液1。
另称取HEP-TPGS-PEG-COOH，溶解在PBS中，得溶液2。
将上述得到的两种溶液混合(二氯甲烷与PBS的体积比为1:10-15，阿霉素盐酸盐、Fe3O4-OA和HEP-TPGS-PEG-COOH的质量比为1:1.33:2.67)后进行探头超声处理(冰浴冷却，功率950Watt,50％输出，开1.5s,闭2s，5min/次，进行三次)。超声完毕后，将乳浊液在室温下避光黑暗处将溶剂挥发，随后加入 EDC·HCl和NHS以及胱胺盐酸盐，在水浴恒温摇床上室温振荡反应过夜。其中， HEP-TPGS-PEG-COOH、胱胺盐酸盐、EDC·HCl和NHS的质量比为1:0.006:0.003:0.0006。反应完毕后，于透析袋中(cut-off MW＝3500D)用去离子水透析48h。再将产物转移至容器中，加入iRGD、EDC·HCl和NHS，置于水浴摇床中继续振荡反应24h。其中，HEP-TPGS-PEG-COOH、iRGD、EDC·HCl和NHS 的质量比为10:7.5:2.5:1。随后将溶液在中性水中透析两天除去残余的iRGD等物质，将透析袋移至碳酸氢铵溶液中(2M)静置24h，再次透析除去游离的碳酸氢铵，所得暗红色溶液用0.22μm过滤器过滤，冷冻干燥后得到含有磁性四氧化三铁纳米粒子的磁性载药杂化纳米胶囊，记为HTP-iRGD-NCs (HTP-iRGD-nanocapsules)。
不含iRGD的载药杂化纳米胶囊写作HTP-NCs(HTP-nanocapsules)；将未加阿霉素的纳米粒子作为空白对照即空白纳米粒子。
通过马尔文激光粒度仪测定载药杂化纳米粒子的粒径大小及分布，结果见图8。由图8可知靶向载药磁性杂化纳米胶囊HTP-iRGD-NCs的粒径在186.7nm 左右，不含iRGD的载药磁性杂化纳米胶囊HTP-NCs粒径在182.5nm左右，图 8c,d两图中纳米颗粒尺寸与DLS结果相符合。
本发明制得的靶向载药磁性杂化纳米胶囊HTP-iRGD-NCs的粒径符合药物递送系统的尺寸，其包载疏水药物后，在水中分散性好，该尺寸的纳米载体也有利于静脉注射，也利于被肿瘤细胞摄取。
实施例5热重分析
准备5mg实验样品，升温环境为氮气环境，温度变化的范围设置为室温 -1000℃，升温速率10℃/min。结果见图9。
如图9所示，当温度升高至1000℃时靶向载药磁性杂化纳米胶囊 HTP-iRGD-NCs残余质量百分比为21.32％，而根据制备过程中纳米胶囊所含组分分析，残余物质即为Fe3O4，表明载药杂化纳米胶囊为磁性杂化纳米胶囊。由此证明Fe3O4纳米粒子被有效包载在纳米胶囊中，含有Fe3O4纳米粒子的纳米胶囊就会具有光热转换的性能或者说具有可利用光热转换性能，具有促进药物可控释放的潜力。
实施例6磁响应性测定
在EP管中取1mL载药磁性纳米胶囊分散液(2mg/mL)，在其侧面放置一块永久磁铁，一段时间后观察液体中是否有红色物质在靠近磁铁一侧聚集。
如图10所示，EP管侧壁发现明显的红色物质聚集，表明外界磁场作用下纳米胶囊产生位移趋势，证明其内部含有磁性四氧化三铁纳米粒子存在，进一步说明上述方法所制备的载药杂化纳米胶囊为磁性载药纳米胶囊。
实施例7载药量测定
称取1-2mg的磁性载药杂化纳米胶囊并在1mL水中分散，取其中100μL在 42℃条件下孵育1h，加入二硫苏糖醇(DTT)溶液(50mM)，总体积保持为1mL，继续在室温下孵育2h后，取定量体积并按照一定比例稀释成1mL的DMF溶液，超声20min后利用荧光光度计测定其荧光强度(激发波长：480nm，发射波长： 590nm)。DOX的含量根据荧光强度-DOX浓度标准曲线计算。载药量(DLE)计算方法如下：
其中，W为稀释后DMF溶液中所含DOX的质量，n为稀释倍数，W0为称取的载药杂化纳米胶囊的质量。
根据荧光光度计所测得的上述DMF液体中荧光强度，利用已知DOX浓度标准曲线，结合上述计算式，靶向磁性载药杂化纳米胶囊HTP-iRGD-NCs的载药量为4.65％，磁性载药杂化纳米胶囊HTP-NCs的载药量为4.90％。
实施例8纳米胶囊的光热响应行为
将Fe3O4-OA分散在氯仿中，配置不同浓度的Fe3O4-OA分散液。近红外(NIR) 激光进行照射(5W/cm2，808nm)，用温度计记录其温度变化行为。
如图11所示，以浓度为500μg/mL实验组为例，在接受808nm近红外光照下，分散液温度能够迅速升至50℃以上(室温18℃)，表明Fe3O4-OA的确具有良好的光热转换性能。
将上述靶向磁性载药杂化纳米胶囊纳米胶囊制备成含有Fe3O4质量浓度为 400μg/mL的分散液，取1mL置于石英皿中，用近红外激光进行照射(光密度为 5W/cm2，波长为808nm)，在设定时间点用热像仪记录溶液的温度并进行成像记录，并采用热像仪配套软件(IRMeter)进行分析。
如图12所示，在5min以内，温度变化超过5℃(室温20℃)，测试时间内温度升高最大值近9℃。
进一步地，如图13所示，在模拟人体体温37℃条件下，采用同样的近红外光照条件，光照10min左右，靶向磁性载药杂化纳米胶囊分散液温度可达41℃，证明其具有良好的光热响应型能。
实施例9体外药物释放实验
将磁性载药杂化纳米胶囊HTP-iRGD-NCs分散在DTT溶液(20mM)中，置于37℃水浴环境下，在不同时间点通过荧光光度计检测(λex＝480nm,λem＝590nm) 所释放的DOX含量，光照时间保持0.5h，在最后检测完毕后，向分散液中加入 0.1M HCl并超声10min。每组的DOX释放效率利用荧光强度值进行计算，具体为：
其中，Ai表示具体时间点处所测荧光强度值，A0表示初始时刻荧光强度值， At为所有时间点测试完毕加入HCl后所测得的荧光强度值。
如图14所示，在10min的时间内，接受光照的实验组(HTP-iRGD-NCs+Laser) 在30min后药物释放量达到了41.78％，而未接受光照的实验组在30min后药物释放比例仅为13.26％，由此，磁性载药杂化纳米胶囊HTP-iRGD-NCs展现出快速的药物释放行为主要是由光照致热作用引起的，表明磁性载药杂化纳米胶囊 HTP-iRGD-NCs内部的Fe3O4的纳米胶囊能有效吸收近红外光谱能量，导致纳米胶囊所处环境温度升高使得碳酸氢盐迅速分解，释放二氧化碳，促进DOX的快速释放出来，是一种近红外光响应的释放可控的药物递送系统。
实施例10体外毒性实验
将293T细胞(人胚肾细胞)以6000个/孔的密度接种在96孔板中。在培养箱中培养24h后，移去原有培养基，加入含不同浓度空白胶囊或原料(HTP-COOH，即Hep-TPGS-PEG-COOH)的培养基(100μL/孔，5个平行样每组)，并继续培养 24h后移除培养基，加入PBS清洗两次，每孔再加100μL含10％(V/V)CCK-8试剂的培养基，在培养箱中孵育1.5h后，利用酶标仪检测每孔吸光值。细胞存活率计算方式如下：
其中，ODtest代表实验孔吸收值，OD0代表未加细胞仅有CCK8试剂和培养基的组别吸收值，ODcontrol代表含有细胞但所加材料浓度为0的组别吸收值。
由图15，浓度从5到50μg/mL空白纳米胶囊对正常组织细胞293T存活率均无明显的影响，空白纳米胶囊(HTP-iRGD-NCs)及制备纳米胶囊的原材料 HEP-TPGS-PEG-COOH均对肿瘤细胞MCF-7没有显示出明显的细胞毒性。上述结果表明纳米胶囊作为载体对正常细胞毒性低，具有良好的生物相容性，同时材料本身在一定的浓度范围内，也没有明显的肿瘤细胞生长抑制作用。
实施例11细胞摄取效果
激光共聚焦扫描显微镜：
将MCF-7细胞(人乳腺癌细胞)以1×104个/孔的密度接种在玻璃底培养皿中，培养24h后移去培养基，加入含磁性载药杂化纳米胶囊的新鲜培养基(DOX浓度为10μg/mL)。实验组近红外光照(808nm，5W/cm2，10min)完毕后，在培养箱中继续培养2h。在到达预定时间点后，取出培养皿，移去培养基，用PBS清洗三次，最后加入1mL的PBS，将玻底皿置于激光共聚焦扫描显微镜下进行观察。对照组则未进行光照处理。
细胞流式分析：
在6孔板中，按每孔2×105个MCF-7细胞的密度培养24h后，将培养基换成含有载药杂化纳米胶囊的新培养基(DOX浓度：10μg/mL)，近红外光照 10min(808nm，5W/cm2)后，继续培养2h，弃掉培养基，加入PBS清洗两次，用胰蛋白酶消化细胞并离心收集(1000rpm,5min，并用PBS清洗两次)。最后，将细胞重悬于300μL的PBS中，用流式细胞仪对细胞信号进行检测(激发波长: 480nm；发射波长:590nm)。对照组细胞则加相同浓度的DOX·HCl，空白组细胞只更换培养基，未添加其他物质，每组设置三个平行样。
激光共聚焦扫描显微镜结果如图16所示，肿瘤细胞MCF-7与 HTP-iRGD-NCs纳米胶囊孵育后，接受光照的细胞，内部红色信号强于未接受光照的细胞；
如图17所示，细胞内荧光信号值统计结果表明接收光照后细胞内药物荧光信号数值明显更高；
如图18所示，HTP-iRGD-NCs组细胞内的药物信号高于HTP-NCs组的细胞；
上述结果表明，光照可促发磁性载药杂化纳米胶囊内部的药物释放，使其包载的药物能快速释放进入细胞，同时肿瘤细胞能有效摄取磁性载药杂化纳米胶囊，并且靶向磁性载药杂化纳米胶囊HTP-iRGD-NCs上的iRGD序列能促使肿瘤细胞MCF-7的摄取效率提高。
实施例12体外抗肿瘤实验
将MCF-7细胞以每孔8000个的密度接种在96孔板中，在37℃，5％CO2的培养箱中培养24h后，移除原有培养基，加入含有不同药物浓度的磁性载药杂化纳米胶囊的新鲜培养基，实验组在37℃环境下接受光照(808nm，5W/cm2， 5min)后，移至培养箱中继续培养24h。对照组则一直在37℃环境的培养箱中培养，其他条件保持一致。细胞与杂化纳米胶囊作用24h后，移去原培养基，用 PBS清洗三遍，每孔加入含10％(V/V)CCK-8试剂的培养基(100μL)，在培养箱中孵育1.5h后，用酶标仪检测每孔吸光值，并计算细胞存活率。
如图19所示，在DOX浓度为5μg/mL的条件下，HTP-iRGD-NCs在近红外光照后，能使MCF-7细胞存活率降至40％左右；在10μg/mL的条件下，肿瘤细胞存活率可降至20％左右，单独的光照对细胞存活率无明显影响，证明磁性载药杂化纳米胶囊能在近红外光热刺激下释放抗肿瘤药物，有效抑制肿瘤细胞生长，具有良好的体外抗肿瘤效果。

Claims (10)

1.一种抗肿瘤磁性载药杂化纳米胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备Fe3O4-OA
在N2条件下，将Fe(acac)3、1,2-hexadecanediol、OA和oleylamine按摩尔比为1:1-2:2-3:4-5混合，在190-210℃保温1.5-2.5h，再将温度升至260-270℃保温0.5-1.5h，然后冷却至室温后进行磁分离，制得Fe3O4-OA；
(2)制备TPGS-Cystamine-NH2
在N2条件下，将TPGS、丁二酸酐和DMAP按质量比为7-8:1:1-2混合，室温下反应22-26h，然后过滤、透析、干燥，制得TPGS-COOH；
将TPGS-COOH、EDC·HCl、NHS和胱胺盐酸按质量比为1-3:4-6:1:2-4混合，用水溶解，并调节pH至6-7，然后在磁力搅拌条件下反应46-50h，反应完毕后透析、干燥，制得TPGS-Cystamine-NH2；
(3)制备HO-PEG-Cystamine-NH2
将HO-PEG-COOH、EDC·HCl、NHS和胱胺盐酸按质量比为1-3:4-6:1:2-4混合，用水溶解，并调节pH至6-7，然后在磁力搅拌条件下反应46-50h，反应完毕后透析、干燥，制得HO-PEG-Cystamine-NH2；
(4)制备Hep-TPGS-PEG-COOH
将肝素钠、TPGS-Cystamine-NH2、HO-PEG-Cystamine-NH2、EDC·HCl和NHS按质量比为3-5:0.8-1.2:0.8-1.2:2-3:1-2混合，用水溶解，并调节pH至6-7，然后在磁力搅拌条件下反应46-50h，反应完毕后透析、干燥，制得Hep-TPGS-PEG-OH；
在氮气条件下，将Hep-TPGS-PEG-OH、丁二酸酐和DMAP按质量比为6-8:0.5-1.5:1-3混合，室温反应22-26h，透析、干燥，制得Hep-TPGS-PEG-COOH；
(5)制备磁性载药杂化纳米胶囊
将抗肿瘤药物溶于溶剂中，并加入三乙胺超声分散，接着加入Fe3O4-OA继续超声分散，得溶液1；
将Hep-TPGS-PEG-COOH溶于溶剂中，得溶液2；
将溶液1和溶液2混匀，进行超声乳化处理，超声完毕后，在避光黑暗条件下除去溶剂，然后加入EDC·HCl、NHS和胱胺盐酸盐振荡反应过夜，反应完全后，透析，向透析产物中加入iRGD、EDC·HCl和NHS，继续反应22-26h，然后在水中透析2天，再在2M碳酸氢铵溶液中放置22-26h，最后透析除去游离的碳酸氢铵，过滤，干燥，制得；其中抗肿瘤药物、Fe3O4-OA和HEP-TPGS-PEG-COOH的质量比为0.5-3:1-3:2-4；HEP-TPGS-PEG-COOH、胱胺盐酸盐、EDC·HCl和NHS的质量比为0.8-1.5:0.005-0.01:0.002-0.005:0.0005-0.001；HEP-TPGS-PEG-COOH、iRGD、EDC·HCl和NHS的质量比为8-12:7-8:2-3:0.8-1.2。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤磁性载药杂化纳米胶囊的制备方法，其特征在于，步骤(1)中Fe(acac)3、1,2-hexadecanediol、OA和oleylamine的摩尔比为1:1.29:2.61:4.23。
3.根据权利要求1所述的抗肿瘤磁性载药杂化纳米胶囊的制备方法，其特征在于，步骤(1)中先在200℃保温2h，再将温度升至265℃保温1h。
4.根据权利要求1所述的抗肿瘤磁性载药杂化纳米胶囊的制备方法，其特征在于，步骤(2)中TPGS、丁二酸酐和DMAP的质量比为7.69:1:1.31。
5.根据权利要求1所述的抗肿瘤磁性载药杂化纳米胶囊的制备方法，其特征在于，步骤(2)中TPGS-COOH、EDC·HCl、NHS和胱胺盐酸的质量比为2:5:1:3。
6.根据权利要求1所述的抗肿瘤磁性载药杂化纳米胶囊的制备方法，其特征在于，步骤(3)中HO-PEG-COOH、EDC·HCl、NHS和胱胺盐酸的质量比为2:5:1:3。
7.根据权利要求1所述的抗肿瘤磁性载药杂化纳米胶囊的制备方法，其特征在于，步骤(4)中肝素钠、TPGS-Cystamine-NH2、HO-PEG-Cystamine-NH2、EDC·HCl和NHS的质量比为4:1:1:2.24:1.36。
8.根据权利要求1所述的抗肿瘤磁性载药杂化纳米胶囊的制备方法，其特征在于，步骤(4)中Hep-TPGS-PEG-OH、丁二酸酐和DMAP的质量比为6.25:1:1.25。
9.根据权利要求1所述的抗肿瘤磁性载药杂化纳米胶囊的制备方法，其特征在于，步骤(5)中抗肿瘤药物为阿霉素，阿霉素盐酸盐、Fe3O4-OA和HEP-TPGS-PEG-COOH的质量比为1:1.33:2.67；HEP-TPGS-PEG-COOH、胱胺盐酸盐、EDC·HCl和NHS的质量比为1:0.006:0.003:0.0006；HEP-TPGS-PEG-COOH、iRGD、EDC·HCl和NHS的质量比为10:7.5:2.5:1。
10.如权利要求1-9任一项所述的方法制备得到的抗肿瘤磁性载药杂化纳米胶囊。
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