CN109851799A - 一种c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束及制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种c(RGDfk)环肽‑壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束，将c(RGDfk)环肽嫁接至壳聚糖硬脂酸，得c(RGDfk)环肽‑壳聚糖硬脂酸嫁接物，四丁基碘化胺通过电荷相互作用与光敏剂吲哚菁绿络合，得到光敏剂疏水化吲哚菁绿，通过透析法包封疏水化吲哚菁绿，得c(RGDfk)环肽‑壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束。本发明提供的载药胶束具有脑胶质瘤细胞和新生血管内皮细胞双重靶向功能，可将光敏剂选择性递送，提高脑胶质瘤细胞及肿瘤新生血管内皮细胞光敏剂浓度，并增加光敏剂稳定性，经近红外激光照射后实现吲哚菁绿高效能光热转换和活性氧生成，诱导脑胶质瘤细胞凋亡并抑制肿瘤新生血管形成，提高光疗抗脑胶质瘤疗效。
Description
技术领域
本发明属制药领域，涉及脑胶质瘤细胞靶向及肿瘤新生血管内皮细胞靶向给药系统的构建，尤其涉及一种具有双重靶向脑胶质瘤细胞及肿瘤新生血管内皮细胞特性的c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束构建及其在载脑胶质瘤光疗药物中的应用。
背景技术
脑胶质瘤是成年人中最常见的颅内恶性肿瘤，具有高致死性，易复发再生。尽管目前手术治疗、放疗和化疗都取得了一定进步，但毒副作用严重，患者预后仍不理想，患者中值生存周期大多不足14个月，因此亟待寻找新型有效的治疗手段。
光疗是一种新型的非侵袭性的局部治疗手段，疗效显著、毒副作用小。但其氧气依赖性特性，会加剧肿瘤深部的缺氧程度。缺氧肿瘤细胞通过激活信号级联和释放促血管生成因子，如血管内皮生长因子等，触发血管再生，促进肿瘤生长，脑胶质瘤的血管化程度与肿瘤的生长和侵袭密切相关，导致光疗疗效下降。
新生血管为肿瘤的生长提供充足的营养；与正常血管相比，肿瘤新生血管在结构和功能上存在血管通透性高，基底膜不完整等特点，为肿瘤的侵袭和转移提供了条件，导致不良预后。
目前多采用抗体或小分子抑制剂与光疗联用，克服光疗过程中血管再生的缺陷。但抗体与小分子抑制剂作用温和短暂，长时间用药易产生耐药，难以达到理想的新生血管抑制作用。因此，亟待寻求新的方法解决脑胶质瘤光疗过程中血管无序增殖的问题。
肿瘤血管生成机制复杂，包括内皮细胞的激活和增殖，细胞外基质的降解及重塑，血管通透性的改变，新生血管的生成及重塑等。破坏肿瘤血管生成所需条件，如内皮细胞增殖，肿瘤新生血管形成将遭到抑制。
整合素αvβ3是一种粘附分子，在脑胶质瘤U87MG细胞和新生血管内皮细胞HUVEC表面高表达。c(RGDfk)环肽可与整合素αvβ3特异性结合，可用于双重靶向脑胶质瘤细胞和肿瘤新生血管内皮细胞。
双靶向功能配体与纳米给药系统结合，将高剂量光敏剂吲哚菁绿选择性递送至脑胶质瘤细胞和肿瘤新生血管内皮细胞，在近红外激发光照射条件下，可诱导脑胶质瘤细胞凋亡、抑制内皮细胞增殖，阻断肿瘤血管生成，提高脑胶质瘤的光疗治疗药效。由两亲性嵌段共聚物分子在水性介质中自聚集形成聚合物胶束，是一种新型纳米药物递送载体。因其具有具有低毒、易化学修饰、粒径可控、生物膜通透性和生物可降解等特性，被认为是一种具有广阔前景的新型靶向纳米给药系统。
壳聚糖硬脂酸嫁接物胶束是由聚阳离子天然高分子材料壳聚糖经脂肪酸修饰后所得，该嫁接物在水性介质中可通过自组装形成嫁接物胶束，具有快速的肿瘤细胞摄取功能。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物，其中壳聚糖的分子量为5～20kDa，脂肪酸的碳链长度为十八碳，壳聚糖的脱乙酰度为95％，氨基取代度为12.1％～13.7％，c(RGDfk)环肽的修饰比例为1.8～3.4％。其具有代表性的化学结构通式为：
本发明的第二个目的是提供所述c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物的制备方法，具体通过以下步骤实现。
(1)根据中国专利ZL200610051601.0提供的方法合成壳聚糖硬脂酸嫁接物：
取分子量为5～20kDa的壳聚糖，加蒸馏水超声溶解，制备壳聚糖水溶液。另按壳聚糖与硬脂酸的摩尔比为1：1～50取硬脂酸，按壳聚糖与碳二亚胺的摩尔比为1：1～50取碳二亚胺，混合，加入乙醇，于50℃～90℃下搅拌溶解。然后缓慢加入至50℃～90℃下预热的壳聚糖水溶液中，50℃～90℃下搅拌反应5～48小时，冷却至室温，将终反应液置于分子截留量为7000的透析袋中，蒸馏水透析72小时，透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳聚糖硬脂酸嫁接物；
(2)c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成：
取氨基聚乙二醇2000，溶于少量无水二甲亚砜，按氨基聚乙二醇2000：二琥珀酰亚胺的摩尔比为1：2取二琥珀酰亚胺，溶于适量无水二甲亚砜。将二琥珀酰亚胺的二甲亚砜溶液缓慢滴加至聚乙二醇2000的二甲亚砜溶液中，室温搅拌9小时，得反应液1。按聚乙二醇2000:c(RGDfk)环肽的摩尔比为1：1，取c(RGDfk)环肽溶于适量无水二甲亚砜，制备浓度为5.0mg/mL的溶液，将c(RGDfk)环肽的无水二甲亚砜溶液，缓慢滴加至反应液1，室温搅拌12小时，得反应液2。按壳聚糖硬脂酸上游离氨基：c(RGDfk)环肽的摩尔比为5：1～20：1取壳聚糖硬脂酸嫁接物，将反应液2缓慢滴加至壳聚糖硬脂酸水溶液中，室温搅拌24小时。将终反应液置于截留分子量为3500的透析袋中，蒸馏水透析48小时，冷冻干燥，得到c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸。
合成路线为：
合成路线中，1)为二琥珀酰亚胺的结构式，2)为c(RGDfk)环肽的结构式，3)为壳聚糖硬脂酸的结构式。
本发明所使用的壳聚糖脂肪酸嫁接物已为国家发明专利“荧光标记疏水改性壳聚糖聚合物及制备方法和应用”(专利号：ZL2005100507981)；和“表面修饰疏水改性壳聚糖聚合物给药胶团及其制备方法”(专利号：ZL200610051601.0)所涵盖。壳聚糖脂肪酸嫁接物中壳聚糖的分子量5～20kDa；脂肪酸的碳链长度为十八碳；壳聚糖的脱乙酰度为95％；氨基取代度为10.3％。
本发明的第三个目的是提供一种c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束的构建方法，包封的药物为光敏剂疏水化吲哚菁绿，通过以下方案实现：
(1)疏水化吲哚菁绿的制备：
取吲哚菁绿，溶于无水二甲亚砜中，制备浓度为20.0mg/mL的溶液，按吲哚菁绿：四丁基碘化胺的摩尔比为1:3，取四丁基碘化胺，溶于无水二甲亚砜中，制备浓度为20.0mg/mL的溶液。将吲哚菁绿的二甲亚砜溶液与四丁基碘化胺的二甲亚砜溶液混合均匀，室温水浴超声15分钟，即得疏水化吲哚菁绿母液，浓度为5mg/mL。
(2)c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束的制备:
称取c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶于蒸馏水中，探头超声30次，功率为400W，工作2s停3s，制备得嫁接物胶束溶液。取浓度为2mg/mL的c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物胶束溶液，按疏水化吲哚菁绿：嫁接物质量比5％～20％，加入浓度为5mg/mL的疏水化吲哚菁绿的二甲亚砜溶液，室温避光搅拌2小时，终反应液转移至截留分子量7000的透析袋中，蒸馏水透析24小时。收集透析后的产物，室温8000rpm离心10分钟，除去未被包封的疏水化吲哚菁绿，收集上清液即为c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束。
本发明的第四个目的是提供所述c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束在制备载脑胶质瘤细胞和肿瘤新生血管内皮细胞双重靶向抗肿瘤光疗药物中的应用。研究显示，c(RGDfk)环肽修饰壳聚糖硬脂酸嫁接物具有高效的脑胶质瘤细胞和肿瘤新生血管内皮细胞靶向能力，且在近红外激发光照射下，c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束具有显著诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤新生血管内皮细胞增殖的作用，具有显著抗肿瘤活性。
本发明提供一种c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束，进一步包封光敏剂疏水化吲哚菁绿，得脑胶质瘤细胞和新生血管内皮细胞双重靶向功能c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束。本发明提供的载药胶束具有脑胶质瘤细胞和新生血管内皮细胞双靶向的功能，可将光敏剂选择性递送至脑胶质瘤细胞及肿瘤新生血管内皮细胞，提高脑胶质瘤细胞及肿瘤新生血管内皮细胞光敏剂浓度，经近红外激光照射后实现吲哚菁绿高效能光热转换和活性氧生成，诱导脑胶质瘤细胞凋亡并抑制新生血管形成，极大提高光疗抗脑胶质瘤疗效。
附图说明
图1为c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物的核磁共振图谱，A为壳聚糖硬脂酸嫁接物、B为c(RGDfk)环肽、C为c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物。
图2为c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物在脑胶质瘤U87MG细胞上孵育1、4、8小时的摄取情况。
图3为c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物在人脐静脉内皮细胞HUVEC上孵育1、4、8小时的摄取情况。
图4为c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸载药胶束在近红外激光照射下的光热曲线。
图5为c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸载药胶束在近红外激光照射下产生活性氧的情况。
图6为c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸载药胶束在近红外激光照射下在U87MG细胞上的抗肿瘤药效。
图7为c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸载药胶束在近红外激光照射下抑制HUVEC增殖的情况。
具体实施方式
本发明通过实施例和附图作进一步的说明。
实施例1
(1)低分子量壳聚糖的制备
取分子量450kDa、脱乙酰度为95％的壳聚糖20g，分散于1000mL体积比0.9％的盐酸溶液中，60℃温度条件下水浴搅拌12小时，充分溶胀。向其中缓慢滴加重量比2％的壳聚糖酶，在60℃温度条件下发生酶解反应。采用凝胶渗透色谱法控制降解过程中壳聚糖分子量。降解完成后，在80℃温度条件下，加入重量/体积比5％活性炭，搅拌30分钟，冷却至室温，分别采用普通滤纸、0.45μm和0.22μm微孔滤膜逐步除去活性炭，经真空冷冻干燥得低分子量壳聚糖，所得壳聚糖的重均分子量为5～20kDa。
(2)壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取上述分子量为5～20kDa的壳聚糖，加蒸馏水超声溶解，制备壳聚糖水溶液。另按壳聚糖与硬脂酸的摩尔比为1：1～50取硬脂酸，按壳聚糖与碳二亚胺的摩尔比为1：1～50取碳二亚胺取碳二亚胺，混合，加入乙醇，于50℃～90℃下搅拌溶解。然后缓慢加入至50℃～90℃下预热的壳聚糖水溶液中，50℃～90℃下搅拌反应5～48小时，冷却至室温，将终反应液置于分子截留量为7000的透析袋中，蒸馏水透析72小时，透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳聚糖硬脂酸嫁接物。
(3)c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取氨基聚乙二醇2000，溶于少量无水二甲亚砜，按氨基聚乙二醇2000：二琥珀酰亚胺的摩尔比为1：2取二琥珀酰亚胺，溶于适量无水二甲亚砜。将二琥珀酰亚胺的二甲亚砜溶液缓慢滴加至聚乙二醇2000的二甲亚砜溶液中，室温搅拌9小时，得反应液1。按聚乙二醇2000:c(RGDfk)环肽的摩尔比为1：1，取c(RGDfk)环肽溶于适量无水二甲亚砜，制备浓度为5.0mg/mL的溶液，将c(RGDfk)环肽的无水二甲亚砜溶液，缓慢滴加至反应液1，室温搅拌12小时，得反应液2。按壳聚糖硬脂酸上游离氨基：c(RGDfk)环肽的摩尔比为20：1取壳聚糖硬脂酸嫁接物，将反应液2缓慢滴加至壳聚糖硬脂酸水溶液中，室温搅拌24小时。将终反应液置于截留分子量为3500的透析袋中，蒸馏水透析48小时，冷冻干燥，得到c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸。
采用三硝基苯磺酸法测定c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物及壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取等分子量壳聚糖10.0mg，蒸馏水溶解并定容至10mL，得到浓度为1.0mg/mL的壳聚糖储备液。分别移取0～1000μL不同体积壳聚糖储备液，定容至2mL，先后加入体积比0.1％三硝基苯磺酸溶液和重量/体积比4％的碳酸氢钠溶液各2mL。37℃恒温孵育2小时，加入2mL 2mol/L盐酸，水浴超声，于344nm处测定紫外吸光值，制备标准曲线。取嫁接物10.0mg，蒸馏水溶解并定容至10mL，同法操作，按标准曲线计算得，c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为12.1％，壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为10.3％，c(RGDfk)环肽修饰比例为1.8％。
实施例2
(1)低分子量壳聚糖的制备
取分子量450kDa、脱乙酰度为95％的壳聚糖20g，分散于1000mL体积比0.9％的盐酸溶液中，60℃温度条件下水浴搅拌12小时，充分溶胀。向其中缓慢滴加重量比2％的壳聚糖酶，在60℃温度条件下发生酶解反应。采用凝胶渗透色谱法控制降解过程中壳聚糖分子量。降解完成后，在80℃温度条件下，加入重量/体积比5％活性炭，搅拌30分钟，冷却至室温，分别采用普通滤纸、0.45μm和0.22μm微孔滤膜逐步除去活性炭，经真空冷冻干燥得低分子量壳聚糖，所得壳聚糖的重均分子量为5～20kDa。
(2)壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取上述分子量为5～20kDa的壳聚糖，加蒸馏水超声溶解，制备壳聚糖水溶液。另按壳聚糖与硬脂酸的摩尔比为1：1～50取硬脂酸，按壳聚糖与碳二亚胺的摩尔比为1：1～50取碳二亚胺，混合，加入乙醇，于50℃～90℃下搅拌溶解。然后缓慢加入至50℃～90℃下预热的壳聚糖水溶液中，50℃～90℃下搅拌反应5～48小时，冷却至室温，将终反应液置于分子截留量为7000的透析袋中，蒸馏水透析72小时，透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳聚糖硬脂酸嫁接物。
(3)c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取氨基聚乙二醇2000，溶于少量无水二甲亚砜，按氨基聚乙二醇2000：二琥珀酰亚胺的摩尔比为1：2取二琥珀酰亚胺，溶于适量无水二甲亚砜。将二琥珀酰亚胺的二甲亚砜溶液缓慢滴加至聚乙二醇2000的二甲亚砜溶液中，室温搅拌9小时，得反应液1。按聚乙二醇2000:c(RGDfk)环肽的摩尔比为1：1，取c(RGDfk)环肽溶于适量无水二甲亚砜，制备浓度为5.0mg/mL的溶液，将c(RGDfk)环肽的无水二甲亚砜溶液，缓慢滴加至反应液1，室温搅拌12小时，得反应液2。按壳聚糖硬脂酸上游离氨基：c(RGDfk)环肽的摩尔比为10:1取壳聚糖硬脂酸嫁接物，将反应液2缓慢滴加至壳聚糖硬脂酸水溶液中，室温搅拌24小时。将终反应液置于截留分子量为3500的透析袋中，蒸馏水透析48小时，冷冻干燥，得到c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸。
采用三硝基苯磺酸法测定c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物及壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取等分子量壳聚糖10.0mg，蒸馏水溶解并定容至10mL，得到浓度为1.0mg/mL的壳聚糖储备液。分别移取0～1000μL不同体积壳聚糖储备液，定容至2mL，先后加入体积比0.1％三硝基苯磺酸溶液和重量/体积比4％的碳酸氢钠溶液各2mL。37℃恒温孵育2小时，加入2mL 2mol/L盐酸，水浴超声，于344nm处测定紫外吸光值，制备标准曲线。取嫁接物10.0mg，蒸馏水溶解并定容至10mL，同法操作，按标准曲线计算得，c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为12.8％，壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为10.3％，c(RGDfk)环肽修饰比例为2.5％。
实施例3
(1)低分子量壳聚糖的制备
取分子量450kDa、脱乙酰度为95％的壳聚糖20g，分散于1000mL体积比0.9％的盐酸溶液中，60℃温度条件下水浴搅拌12小时，充分溶胀。向其中缓慢滴加重量比2％的壳聚糖酶，在60℃温度条件下发生酶解反应。采用凝胶渗透色谱法控制降解过程中壳聚糖分子量。降解完成后，在80℃温度条件下，加入重量/体积比5％活性炭，搅拌30分钟，冷却至室温，分别采用普通滤纸、0.45μm和0.22μm微孔滤膜逐步除去活性炭，经真空冷冻干燥得低分子量壳聚糖，所得壳聚糖的重均分子量为5～20kDa。
(2)壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取上述分子量为5～20kDa的壳聚糖，加蒸馏水超声溶解，制备壳聚糖水溶液。另按壳聚糖与硬脂酸的摩尔比为1：1～50取硬脂酸，按壳聚糖与碳二亚胺的摩尔比为1：1～50取碳二亚胺，混合，加入乙醇，于50℃～90℃下搅拌溶解。然后缓慢加入至50℃～90℃下预热的壳聚糖水溶液中，50℃～90℃下搅拌反应5～48小时，冷却至室温，将终反应液置于分子截留量为7000的透析袋中，蒸馏水透析72小时，透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳聚糖硬脂酸嫁接物。
(3)c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取氨基聚乙二醇2000，溶于少量无水二甲亚砜，按氨基聚乙二醇2000：二琥珀酰亚胺的摩尔比为1：2取二琥珀酰亚胺，溶于适量无水二甲亚砜。将二琥珀酰亚胺的二甲亚砜溶液缓慢滴加至聚乙二醇2000的二甲亚砜溶液中，室温搅拌9小时，得反应液1。按聚乙二醇2000:c(RGDfk)环肽的摩尔比为1：1，取c(RGDfk)环肽溶于适量无水二甲亚砜，制备浓度为5.0mg/mL的溶液，将c(RGDfk)环肽的无水二甲亚砜溶液，缓慢滴加至反应液1，室温搅拌12小时，得反应液2。按壳聚糖硬脂酸上游离氨基：c(RGDfk)环肽的摩尔比为5：1取壳聚糖硬脂酸嫁接物，将反应液2缓慢滴加至壳聚糖硬脂酸水溶液中，室温搅拌24小时。将终反应液置于截留分子量为3500的透析袋中，蒸馏水透析48小时，冷冻干燥，得到c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸。
采用三硝基苯磺酸法测定c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物及壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取等分子量壳聚糖10.0mg，蒸馏水溶解并定容至10mL，得到浓度为1.0mg/mL的壳聚糖储备液。分别移取0～1000μL不同体积壳聚糖储备液，定容至2mL，先后加入体积比0.1％三硝基苯磺酸溶液和重量/体积比4％的碳酸氢钠溶液各2mL。37℃恒温孵育2小时，加入2mL 2mol/L盐酸，水浴超声，于344nm处测定紫外吸光值，制备标准曲线。取嫁接物10.0mg，蒸馏水溶解并定容至10mL，同法操作，按标准曲线计算得，c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为13.7％，壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为10.3％，c(RGDfk)环肽修饰比例为3.4％。
(4)c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物的理化性质
核磁共振氢谱法测定c(RGDfk)环肽、壳聚糖硬脂酸嫁接物、c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物。称取c(RGDfk)环肽、壳聚糖硬脂酸嫁接物、c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物各10mg，分别用0.5mL D2O溶解，用核磁共振1H-NMR测定。结果参见图1，A为c(RGDfk)环肽、B为壳聚糖硬脂酸嫁接物、C为c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物。由图可确定c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成。
采用芘荧光法测定c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物在水性介质中临界胶束浓度。精密称定芘1.2mg，溶于丙酮并定容至100mL，得到浓度0.012mg/mL的芘/丙酮溶液。移取上述芘/丙酮溶液0.5mL至10mL玻璃试管中，55℃条件下避光过夜，挥干丙酮。加入不同浓度壳聚糖硬脂酸嫁接物溶液和c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物溶液各5mL，室温水浴超声30分钟。扫描芘发射光谱，激发波长337nm，激发光狭缝10nm，发射光狭缝2.5nm，工作电压700V，分别记录374nm处和385nm处荧光强度，经计算得，壳聚糖硬脂酸的临界胶束浓度为57.5μg/mL，c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸的临界胶束浓度为69.8μg/mL。
分别取c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物和壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶于蒸馏水，探头超声20次，功率为400W，工作2s间歇3s，得到浓度为1.0mg/mL的嫁接物溶液。微粒粒度与表面电位分析仪测得，壳聚糖硬脂酸嫁接物的粒径为64.3±1.6nm，Zeta电位为32.5±0.23mV。c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物的粒径为93.5±1.4nm，Zeta电位为28.3±0.93mV。
(5)c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物的细胞摄取研究
采用糖脂嫁接物荧光标记胶束进行细胞摄取研究。以罗丹明B异硫氰酸酯(RBITC)标记壳聚糖硬脂酸嫁接物及c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物。分别取壳聚糖硬脂酸嫁接物和c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物，蒸馏水溶解，探头超声20次，功率为400W，工作2s间歇3s，制得浓度为2.0mg/mL的糖脂嫁接物胶束溶液。缓慢滴加RBITC的乙醇溶液，室温避光搅拌过夜。反应结束后，反应液转移至截留分子量3500的透析袋中，蒸馏水透析24小时，得RBITC荧光标记的糖脂嫁接物溶液。
取生长状态良好的脑胶质瘤U87MG细胞，以5×104个/孔的密度将细胞接种至预先铺设玻片的24孔板，孵育过夜，待细胞贴壁后，分别加入等量RBITC荧光标记壳聚糖硬脂酸嫁接物溶液和c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物溶液，使每孔嫁接物浓度一致。在37℃、5％二氧化碳条件下继续孵育1、4、8小时。加入浓度为0.1mg/mL的核染试剂Hochest3334210μL/孔，孵育10分钟后，弃去培养基，PBS洗去细胞表面附着荧光物质，4％甲醛固定15分钟，甘油包埋于载玻片上，封片备用。激光共聚焦显微镜观察U87MG细胞对RBITC-壳聚糖硬脂酸嫁接物和RBITC-c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物摄取情况，拍摄荧光照片。用ImageJ软件半定量摄取情况，结果见图2。
取生长状态良好的人脐静脉内皮细胞HUVEC，以5×104个/孔的密度将细胞接种至预先铺设玻片的24孔板，孵育过夜，待细胞贴壁后，分别加入等量RBITC荧光标记壳聚糖硬脂酸嫁接物溶液和c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物溶液，使每孔嫁接物浓度一致。在37℃、5％二氧化碳条件下继续孵育1、4、8小时。加入浓度为0.1mg/mL的核染试剂Hochest33342 10μL/孔，孵育10分钟后，弃去培养基，PBS洗去细胞表面附着荧光物质，4％甲醛固定15分钟，甘油包埋于载玻片上，封片备用。激光共聚焦显微镜观察HUVEC对RBITC-壳聚糖硬脂酸嫁接物和RBITC-c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物摄取情况，拍摄荧光照片。用ImageJ软件半定量摄取情况，结果见图3。
图2和图3所示，经ImageJ软件分析计算得，与壳聚糖硬脂酸相比，脑胶质瘤U87MG细胞和人脐静脉内皮细胞HUVEC对c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物的细胞摄取明显提高。结果说明c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物具有脑胶质瘤细胞和肿瘤新生血管内皮细胞双靶向的功能。
(6)c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束的制备
疏水化吲哚菁绿的制备：取吲哚菁绿，溶于无水二甲亚砜中，制备浓度为20.0mg/mL的溶液，按吲哚菁绿：四丁基碘化胺的摩尔比为1:3，取四丁基碘化胺，溶于无水二甲亚砜中，制备浓度为20.0mg/mL的溶液。将吲哚菁绿的二甲亚砜溶液与四丁基碘化胺的二甲亚砜溶液混合均匀，室温水浴超声15分钟，即得疏水化吲哚菁绿母液，浓度为5mg/mL。
称取c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶于蒸馏水中，探头超声30次，功率为400W，工作2s停3s，制备得嫁接物胶束溶液。取浓度为2mg/mL的c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物胶束溶液，按疏水化吲哚菁绿：嫁接物质量比5％，加入浓度为5mg/mL的疏水化吲哚菁绿的二甲亚砜溶液，室温避光搅拌2小时，终反应液转移至截留分子量7000的透析袋中，蒸馏水透析24小时。收集透析后的产物，室温8000rpm离心10分钟，除去未被包封的疏水化吲哚菁绿，收集上清液即为c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束。
(7)紫外-可见分光光度法测定c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束中吲哚菁绿的含量。标准曲线的制备：取浓度为1mg/mL疏水化吲哚菁绿母液，用二甲亚砜：水体积比为9:1的混合溶媒稀释至不同浓度，分别为0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0μg/mL。测定784nm处紫外吸收值，以紫外吸收值为纵坐标，吲哚菁绿浓度为横坐标作图，即得标准曲线。
取c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束和壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束200μL，用二甲亚砜：水体积比为9:1的混合溶媒稀释100倍，水浴超声30分钟，紫外-可见分光光度仪测定吲哚菁绿784nm处紫外吸收值。
包封率＝载药嫁接物胶束样品中的吲哚菁绿质量/阿霉素投药质量×100％
载药量＝载药嫁接物胶束样品中的吲哚菁绿质量/(载药嫁接物胶束样品中的吲哚菁绿质量+嫁接物胶束的质量)×100％
经计算得到c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸载药胶束的载药量为3.9％，包封率为82.1％；壳聚糖硬脂酸载药胶束的载药量为4.2％，包封率为87.6％。
实施例4
(1)低分子量壳聚糖的制备
取分子量450kDa、脱乙酰度为95％的壳聚糖20g，分散于1000mL体积比0.9％的盐酸溶液中，60℃温度条件下水浴搅拌12小时，充分溶胀。向其中缓慢滴加重量比2％的壳聚糖酶，在60℃温度条件下发生酶解反应。采用凝胶渗透色谱法控制降解过程中壳聚糖分子量。降解完成后，在80℃温度条件下，加入重量/体积比5％活性炭，搅拌30分钟，冷却至室温，分别采用普通滤纸、0.45μm和0.22μm微孔滤膜逐步除去活性炭，经真空冷冻干燥得低分子量壳聚糖，所得壳聚糖的重均分子量为5～20kDa。
(2)壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取上述分子量为5～20kDa的壳聚糖，加蒸馏水超声溶解，制备壳聚糖水溶液。另按壳聚糖与硬脂酸的摩尔比为1：1～50取硬脂酸，按壳聚糖与碳二亚胺的摩尔比为1：1～50取碳二亚胺，混合，加入乙醇，于50℃～90℃下搅拌溶解。然后缓慢加入至50℃～90℃下预热的壳聚糖水溶液中，50℃～90℃下搅拌反应5～48小时，冷却至室温，将终反应液置于分子截留量为7000的透析袋中，蒸馏水透析72小时，透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳聚糖硬脂酸嫁接物。
(3)c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取氨基聚乙二醇2000，溶于少量无水二甲亚砜，按氨基聚乙二醇2000：二琥珀酰亚胺的摩尔比为1：2取二琥珀酰亚胺，溶于适量无水二甲亚砜。将二琥珀酰亚胺的二甲亚砜溶液缓慢滴加至聚乙二醇2000的二甲亚砜溶液中，室温搅拌9小时，得反应液1。按聚乙二醇2000:c(RGDfk)环肽的摩尔比为1：1，取c(RGDfk)环肽溶于适量无水二甲亚砜，制备浓度为5.0mg/mL的溶液，将c(RGDfk)环肽的无水二甲亚砜溶液，缓慢滴加至反应液1，室温搅拌12小时，得反应液2。按壳聚糖硬脂酸上游离氨基：c(RGDfk)环肽的摩尔比为5：1取壳聚糖硬脂酸嫁接物，将反应液2缓慢滴加至壳聚糖硬脂酸水溶液中，室温搅拌24小时。将终反应液置于截留分子量为3500的透析袋中，蒸馏水透析48小时，冷冻干燥，得到c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸。
采用三硝基苯磺酸法测定c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物及壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取等分子量壳聚糖10.0mg，蒸馏水溶解并定容至10mL，得到浓度为1.0mg/mL的壳聚糖储备液。分别移取0～1000μL不同体积壳聚糖储备液，定容至2mL，先后加入体积比0.1％三硝基苯磺酸溶液和重量/体积比4％的碳酸氢钠溶液各2mL。37℃恒温孵育2小时，加入2mL 2mol/L盐酸，水浴超声，于344nm处测定紫外吸光值，制备标准曲线。取嫁接物10.0mg，蒸馏水溶解并定容至10mL，同法操作，按标准曲线计算得，c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为13.7％，壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为10.3％，c(RGDfk)环肽修饰比例为3.4％。
(4)c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物的理化性质
核磁共振氢谱法测定c(RGDfk)环肽、壳聚糖硬脂酸嫁接物、c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物。称取c(RGDfk)环肽、壳聚糖硬脂酸嫁接物、c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物各10mg，分别用0.5mL D2O溶解，用核磁共振1H-NMR测定。结果参见图1，A为c(RGDfk)环肽、B为壳聚糖硬脂酸嫁接物、C为c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物。由图可确定c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成。
采用芘荧光法测定c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物在水性介质中临界胶束浓度。精密称定芘1.2mg，溶于丙酮并定容至100mL，得到浓度0.012mg/mL的芘/丙酮溶液。移取上述芘/丙酮溶液0.5mL至10mL玻璃试管中，55℃条件下避光过夜，挥干丙酮。加入不同浓度壳聚糖硬脂酸嫁接物溶液和c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物溶液各5mL，室温水浴超声30分钟。扫描芘发射光谱，激发波长337nm，激发光狭缝10nm，发射光狭缝2.5nm，工作电压700V，分别记录374nm处和385nm处荧光强度，经计算得，壳聚糖硬脂酸的临界胶束浓度为57.5μg/mL，c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸的临界胶束浓度为69.8μg/mL。
分别取c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物和壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶于蒸馏水，探头超声20次，功率为400W，工作2s间歇3s，得到浓度为1.0mg/mL的嫁接物溶液。微粒粒度与表面电位分析仪测得，壳聚糖硬脂酸嫁接物的粒径为64.3±1.6nm，Zeta电位为32.5±0.23mV。c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物的粒径为93.5±1.4nm，Zeta电位为28.3±0.93mV。
(5)c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物的细胞摄取研究
采用糖脂嫁接物荧光标记胶束进行细胞摄取研究。以罗丹明B异硫氰酸酯(RBITC)标记壳聚糖硬脂酸嫁接物及c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物。分别取壳聚糖硬脂酸嫁接物和c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物，蒸馏水溶解，探头超声20次，功率为400W，工作2s间歇3s，制得浓度为2.0mg/mL的糖脂嫁接物胶束溶液。缓慢滴加RBITC的乙醇溶液，室温避光搅拌过夜。反应结束后，反应液转移至截留分子量3500的透析袋中，蒸馏水透析24小时，得RBITC荧光标记的糖脂嫁接物溶液。
取生长状态良好的脑胶质瘤U87MG细胞，以5×104个/孔的密度将细胞接种至预先铺设玻片的24孔板，孵育过夜，待细胞贴壁后，分别加入等量RBITC荧光标记壳聚糖硬脂酸嫁接物溶液和c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物溶液，使每孔嫁接物浓度一致。在37℃、5％二氧化碳条件下继续孵育1、4、8小时。加入浓度为0.1mg/mL的核染试剂Hochest3334210μL/孔，孵育10分钟后，弃去培养基，PBS洗去细胞表面附着荧光物质，4％甲醛固定15分钟，甘油包埋于载玻片上，封片备用。激光共聚焦显微镜观察U87MG细胞对RBITC-壳聚糖硬脂酸嫁接物和RBITC-c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物摄取情况，拍摄荧光照片。用ImageJ软件半定量摄取情况，结果见图2。
取生长状态良好的人脐静脉内皮细胞HUVEC，以5×104个/孔的密度将细胞接种至预先铺设玻片的24孔板，孵育过夜，待细胞贴壁后，分别加入等量RBITC荧光标记壳聚糖硬脂酸嫁接物溶液和c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物溶液，使每孔嫁接物浓度一致。在37℃、5％二氧化碳条件下继续孵育1、4、8小时。加入浓度为0.1mg/mL的核染试剂Hochest33342 10μL/孔，孵育10分钟后，弃去培养基，PBS洗去细胞表面附着荧光物质，4％甲醛固定15分钟，甘油包埋于载玻片上，封片备用。激光共聚焦显微镜观察HUVEC对RBITC-壳聚糖硬脂酸嫁接物和RBITC-c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物摄取情况，拍摄荧光照片。用ImageJ软件半定量摄取情况，结果见图3。
图2和图3所示，经ImageJ软件分析计算得，与壳聚糖硬脂酸相比，脑胶质瘤U87MG细胞和人脐静脉内皮细胞HUVEC对c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物的细胞摄取明显提高。结果说明c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物具有脑胶质瘤细胞和肿瘤新生血管内皮细胞双靶向的功能。
c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束的制备
疏水化吲哚菁绿的制备：取吲哚菁绿，溶于无水二甲亚砜中，制备得到浓度为20.0mg/mL的溶液，按吲哚菁绿：四丁基碘化胺的摩尔比为1:3，取四丁基碘化胺，溶于无水二甲亚砜中，制备得到浓度为20.0mg/mL的溶液。将吲哚菁绿的二甲亚砜溶液与四丁基碘化胺的二甲亚砜溶液混合均匀，室温水浴超声15分钟，即得疏水化吲哚菁绿母液，浓度为5mg/mL。
称取c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶于蒸馏水中，探头超声30次，功率为400W，工作2s停3s，制备得嫁接物胶束溶液。取浓度为2mg/mL的c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物胶束溶液，按疏水化吲哚菁绿：嫁接物质量比10％，加入浓度为5mg/mL的疏水化吲哚菁绿的二甲亚砜溶液，室温避光搅拌2小时，终反应液转移至截留分子量7000的透析袋中，蒸馏水透析24小时。收集透析后的产物，室温8000rpm离心10分钟，除去未被包封的疏水化吲哚菁绿，收集上清液即为c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束。
紫外-可见分光光度法测定c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束中吲哚菁绿的含量。标准曲线的制备：取浓度为1mg/mL疏水化吲哚菁绿母液，用二甲亚砜：水体积比为9:1的混合溶媒稀释至不同浓度，分别为0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0μg/mL。测定784nm处紫外吸收值，以紫外吸收值为纵坐标，吲哚菁绿浓度为横坐标作图，即得标准曲线。
取c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束和壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束200μL，用二甲亚砜：水体积比为9:1的混合溶媒稀释100倍，水浴超声30分钟，紫外-可见分光光度仪测定吲哚菁绿784nm处紫外吸收值。
包封率＝载药嫁接物胶束样品中的吲哚菁绿质量/阿霉素投药质量×100％
载药量＝载药嫁接物胶束样品中的吲哚菁绿质量/(载药嫁接物胶束样品中的吲哚菁绿质量+嫁接物胶束的质量)×100％
经计算得到c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸载药胶束的载药量为7.1％，包封率为78.3％；壳聚糖硬脂酸载药胶束的载药量为7.6％，包封率为84.1％。
取等体积浓度为10.0μg/mL的吲哚菁绿、壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束和c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束水溶液，PBS作为对照组，置于保温箱中。近红外激光器进行辐射处理各样品，功率为2W/cm2，灵敏温度计在固定液面位置检测样品温度。灵敏温度计测得吲哚菁绿(10μg/mL)温度升高了21.8℃，c(RGDfk)-壳聚糖硬脂酸载药胶束(含等量吲哚菁绿：10μg/mL)温度升高了20.1℃，具有较好的光热特性。见图4。
取等体积浓度为10.0μg/mL的吲哚菁绿、壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束和c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束水溶液，分别向其中加入处方量活性氧探测探针1,3-二苯并呋喃。近红外激光器进行辐射处理各样品，辐射功率为2W/cm2。测定波长420nm处近红外激光辐射处理前后样品紫外吸收值，处理前后紫外吸收值的变化程度间接表示产生的活性氧(ROS)量。结果见图5。
图5所示，与游离吲哚菁绿相比，壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束和c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束产生活性氧明显提高。结果说明胶束结构具有提高吲哚菁绿稳定性的功能。
实施例5
(1)低分子量壳聚糖的制备
取分子量450kDa、脱乙酰度为95％的壳聚糖20g，分散于1000mL体积比0.9％的盐酸溶液中，60℃温度条件下水浴搅拌12小时，充分溶胀。向其中缓慢滴加重量比2％的壳聚糖酶，在60℃温度条件下发生酶解反应。采用凝胶渗透色谱法控制降解过程中壳聚糖分子量。降解完成后，在80℃温度条件下，加入重量/体积比5％活性炭，搅拌30分钟，冷却至室温，分别采用普通滤纸、0.45μm和0.22μm微孔滤膜逐步除去活性炭，经真空冷冻干燥得低分子量壳聚糖，所得壳聚糖的重均分子量为5～20kDa。
(2)壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取上述分子量为5～20kDa的壳聚糖，加蒸馏水超声溶解，制备壳聚糖水溶液。另按壳聚糖与硬脂酸的摩尔比为1：1～50取硬脂酸，按壳聚糖与碳二亚胺的摩尔比为1：1～50取碳二亚胺，混合，加入乙醇，于50℃～90℃下搅拌50分钟。然后缓慢加入至50℃～90℃下预热的壳聚糖水溶液中，50℃～90℃下搅拌反应5～48小时，冷却至室温，将终反应液置于分子截留量为7000的透析袋中，蒸馏水透析72小时，透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳聚糖硬脂酸嫁接物。
(3)c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取氨基聚乙二醇2000，溶于少量无水二甲亚砜，按氨基聚乙二醇2000：二琥珀酰亚胺的摩尔比为1：2取二琥珀酰亚胺，溶于适量无水二甲亚砜。将二琥珀酰亚胺的二甲亚砜溶液缓慢滴加至聚乙二醇2000的二甲亚砜溶液中，室温搅拌9小时，得反应液1。按聚乙二醇2000:c(RGDfk)环肽的摩尔比为1：1，取c(RGDfk)环肽溶于适量无水二甲亚砜，制备浓度为5.0mg/mL的溶液，将c(RGDfk)环肽的无水二甲亚砜溶液，缓慢滴加至反应液1，室温搅拌12小时，得反应液2。按壳聚糖硬脂酸上游离氨基：c(RGDfk)环肽的摩尔比为5：1取壳聚糖硬脂酸嫁接物，将反应液2缓慢滴加至壳聚糖硬脂酸水溶液中，室温搅拌24小时。将终反应液置于截留分子量为3500的透析袋中，蒸馏水透析48小时，冷冻干燥，得到c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸。
采用三硝基苯磺酸法测定c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物及壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取等分子量壳聚糖10.0mg，蒸馏水溶解并定容至10mL，得到浓度为1.0mg/mL的壳聚糖储备液。分别移取0～1000μL不同体积壳聚糖储备液，定容至2mL，先后加入体积比0.1％三硝基苯磺酸溶液和重量/体积比4％的碳酸氢钠溶液各2mL。37℃恒温孵育2小时，加入2mL 2mol/L盐酸，水浴超声，于344nm处测定紫外吸光值，制备标准曲线。取嫁接物10.0mg，蒸馏水溶解并定容至10mL，同法操作，按标准曲线计算得，c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为13.7％，壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为10.3％，c(RGDfk)环肽修饰比例为3.4％。
(4)c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物的理化性质
核磁共振氢谱法测定c(RGDfk)环肽、壳聚糖硬脂酸嫁接物、c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物。称取c(RGDfk)环肽、壳聚糖硬脂酸嫁接物、c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物各10mg，分别用0.5mL D2O溶解，用核磁共振1H-NMR测定。结果参见图1，A为c(RGDfk)环肽、B为壳聚糖硬脂酸嫁接物、C为c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物。由图可确定c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成。
采用芘荧光法测定c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物在水性介质中临界胶束浓度。精密称定芘1.2mg，溶于丙酮并定容至100mL，得到浓度0.012mg/mL的芘/丙酮溶液。移取上述芘/丙酮溶液0.5mL至10mL玻璃试管中，55℃条件下避光过夜，挥干丙酮。加入不同浓度壳聚糖硬脂酸嫁接物溶液和c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物溶液各5mL，室温水浴超声30min。扫描芘发射光谱，激发波长337nm，激发光狭缝10nm，发射光狭缝2.5nm，工作电压700V，分别记录374nm处和385nm处荧光强度，经计算得，壳聚糖硬脂酸的临界胶束浓度为57.5μg/mL，c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸的临界胶束浓度为69.8μg/mL。
分别取c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物和壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶于蒸馏水，探头超声20次，功率为400W，工作2s间歇3s，得到浓度为1.0mg/mL的嫁接物溶液。微粒粒度与表面电位分析仪测得，壳聚糖硬脂酸嫁接物的粒径为64.3±1.6nm，Zeta电位为32.5±0.23mV。c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物的粒径为93.5±1.4nm，Zeta电位为28.3±0.93mV。
(5)c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物的细胞摄取研究
采用糖脂嫁接物荧光标记胶束进行细胞摄取研究。以罗丹明B异硫氰酸酯(RBITC)标记壳聚糖硬脂酸嫁接物及c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物。分别取壳聚糖硬脂酸嫁接物和c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物，蒸馏水溶解，探头超声20次，功率为400W，工作2s间歇3s，制得浓度为2.0mg/mL的糖脂嫁接物胶束溶液。缓慢滴加RBITC的乙醇溶液，室温避光搅拌过夜。反应结束后，反应液转移至截留分子量3500的透析袋中，蒸馏水透析24小时，得RBITC荧光标记的糖脂嫁接物溶液。
取生长状态良好的脑胶质瘤U87MG细胞，以5×104个/孔的密度将细胞接种至预先铺设玻片的24孔板，孵育过夜，待细胞贴壁后，分别加入等量RBITC荧光标记壳聚糖硬脂酸嫁接物溶液和c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物溶液，使每孔嫁接物浓度一致。在37℃、5％二氧化碳条件下继续孵育1、4、8小时。加入浓度为0.1mg/mL的核染试剂Hochest3334210μL/孔，孵育10分钟后，弃去培养基，PBS洗去细胞表面附着荧光物质，4％甲醛固定15分钟，甘油包埋于载玻片上，封片备用。激光共聚焦显微镜观察U87MG细胞对RBITC-壳聚糖硬脂酸嫁接物和RBITC-c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物摄取情况，拍摄荧光照片。用ImageJ软件半定量摄取情况，结果见图2。
取生长状态良好的人脐静脉内皮细胞HUVEC，以5×104个/孔的密度将细胞接种至预先铺设玻片的24孔板，孵育过夜，待细胞贴壁后，分别加入等量RBITC荧光标记壳聚糖硬脂酸嫁接物溶液和c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物溶液，使每孔嫁接物浓度一致。在37℃、5％二氧化碳条件下继续孵育1、4、8小时。加入浓度为0.1mg/mL的核染试剂Hochest33342 10μL/孔，孵育10分钟后，弃去培养基，PBS洗去细胞表面附着荧光物质，4％甲醛固定15分钟，甘油包埋于载玻片上，封片备用。激光共聚焦显微镜观察HUVEC对RBITC-壳聚糖硬脂酸嫁接物和RBITC-c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物摄取情况，拍摄荧光照片。用ImageJ软件半定量摄取情况，结果见图3。
图2和图3所示，经ImageJ软件分析计算得，与壳聚糖硬脂酸相比，脑胶质瘤U87MG细胞和人脐静脉内皮细胞HUVEC对c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物的细胞摄取明显提高。结果说明c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物具有脑胶质瘤细胞和肿瘤新生血管内皮细胞双靶向的功能。
(6)c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束的制备
疏水化吲哚菁绿的制备：取吲哚菁绿，溶于无水二甲亚砜中，制备得到浓度为20.0mg/mL的溶液，按吲哚菁绿：四丁基碘化胺的摩尔比为1:3，取四丁基碘化胺，溶于无水二甲亚砜中，制备浓度为20.0mg/mL的溶液。将吲哚菁绿的二甲亚砜溶液与四丁基碘化胺的二甲亚砜溶液混合均匀，室温水浴超声15分钟，即得疏水化吲哚菁绿母液，浓度为5mg/mL。
称取c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶于蒸馏水中，探头超声30次，功率为400W，工作2s停3s，制备得嫁接物胶束溶液。取浓度为2mg/mL的c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物胶束溶液，按疏水化吲哚菁绿：嫁接物质量比20％，加入浓度为5mg/mL的疏水化吲哚菁绿的二甲亚砜溶液，室温避光搅拌2小时，终反应液转移至截留分子量7000的透析袋中，蒸馏水透析24小时。收集透析后的产物，室温8000rpm离心10分钟，除去未被包封的疏水化吲哚菁绿，收集上清液即为c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束。
(7)紫外-可见分光光度法测定c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束中吲哚菁绿的含量。标准曲线的制备：取浓度为1mg/mL疏水化吲哚菁绿母液，用二甲亚砜：水体积比为9:1的混合溶媒稀释至不同浓度，分别为0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0μg/mL。测定784nm处紫外吸收值，以紫外吸收值为纵坐标，吲哚菁绿浓度为横坐标作图，即得标准曲线。
取c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束和壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束200μL，用二甲亚砜：水体积比为9:1的混合溶媒稀释100倍，水浴超声30分钟，紫外-可见分光光度仪测定吲哚菁绿784nm处紫外吸收值。
包封率＝载药嫁接物胶束样品中的吲哚菁绿质量/阿霉素投药质量×100％
载药量＝载药嫁接物胶束样品中的吲哚菁绿质量/(载药嫁接物胶束样品中的吲哚菁绿质量+嫁接物胶束的质量)×100％
经计算得到c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸载药胶束的载药量为11.9％，包封率为71.5％；壳聚糖硬脂酸载药胶束的载药量为13.2％，包封率为79.3％。
分别取浓度为1.0mg/mL的壳聚糖硬脂酸载药胶束溶液和c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸载药胶束溶液，微粒粒度与表面电位分析仪测得，壳聚糖硬脂酸载药胶束的粒径为113±5.3nm，Zeta电位为28.5±0.46mV。c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸载药胶束的粒径为127±10.8nm，Zeta电位为25.0±0.92mV。
取等体积浓度为10.0μg/mL的吲哚菁绿、壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束和c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束水溶液，PBS作为对照组，置于保温箱中。近红外激光器进行辐射处理各样品，功率为2W/cm2，灵敏温度计在固定液面位置检测样品温度。灵敏温度计测得吲哚菁绿(10μg/mL)温度升高了21.8℃，c(RGDfk)-壳聚糖硬脂酸载药胶束(含等量吲哚菁绿：10μg/mL)温度升高了20.1℃，具有较好的光热特性。见图4。
取等体积浓度为10.0μg/mL的吲哚菁绿、壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束和c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束水溶液，分别向其中加入处方量活性氧探测探针1,3-二苯并呋喃。近红外激光器进行辐射处理各样品，辐射功率为2W/cm2。测定波长420nm处近红外激光辐射处理前后样品紫外吸收值，处理前后紫外吸收值的变化程度间接表示产生的活性氧(ROS)量。结果见图5。
图5所示，与游离吲哚菁绿相比，壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束和c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束产生活性氧明显提高。结果说明胶束结构具有提高吲哚菁绿稳定性的功能。
(8)c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束的细胞药效评价
c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束的抗肿瘤药效评价。取生长状态良好的U87MG细胞，以6×103个/孔的密度将细胞接种至96孔板中，在37℃、5％二氧化碳条件下孵育过夜。细胞贴壁后，向其中加入不同浓度梯度吲哚菁绿、壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束和c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束，以未加药处理的细胞作为阴性对照。孵育8小时后，弃去含有未摄取药物培养基，加入新鲜培养基，分别用近红外激光辐射处理(2W/cm2,3分钟)或不进行辐射处理。48小时后，每孔加入20.0μL四唑蓝，继续孵育4小时。弃去培养基，每孔加入200μL二甲亚砜。采用酶联检测仪测定570nm处吸光度。按下式计算细胞增殖抑制率：
细胞存活率(％)＝实验组吸光度/对照组吸光度×100％
在近红外激光照射下，吲哚菁绿、壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束和c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束对U87MG细胞的细胞存活率影响见图6。研究结果显示，c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束对U87MG细胞的抑制效果最显著，具有较好的抗肿瘤效果。
c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束的抑制肿瘤新生血管内皮细胞增殖评价。取生长状态良好的HUVEC细胞，以6×103个/孔的密度将细胞接种至96孔板中，在37℃、5％二氧化碳条件下孵育过夜。细胞贴壁后，向其中加入不同浓度梯度吲哚菁绿、壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束和c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束，以未加药处理的细胞作为阴性对照。孵育8小时后，弃去含有未摄取药物培养基，加入新鲜培养基，分别用近红外激光处理(2W/cm2,3分钟)或不进行辐射处理。48小时后，每孔加入20.0μL四唑蓝，继续孵育4小时。弃去培养基，每孔加入200μL二甲亚砜。采用酶联检测仪测定570nm处吸光度。
按下式计算细胞增殖抑制率：
细胞存活率(％)＝实验组吸光度/对照组吸光度×100％
在近红外激光照射下，吲哚菁绿、壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束和c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束对HUVEC细胞的细胞存活率影响见图7。研究结果显示，c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束对HUVEC细胞的增殖抑制效果最显著，具有较好的抑制肿瘤新生血管内皮细胞增殖效果。
Claims (5)
1.一种c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物，其中壳聚糖分子量为5～20kDa，脂肪酸的碳链长度为十八碳，壳聚糖的脱乙酰度为95％，脂肪酸取代壳聚糖的氨基比例为12.1％～13.7％，c(RGDfk)环肽嫁接壳聚糖氨基的比例为1.8％～3.4％，其具有代表性的化学结构通式为：
2.一种c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物的制备方法，通过以下步骤实现：
(1)根据中国专利ZL200610051601.0提供的方法合成壳聚糖硬脂酸嫁接物：
取分子量为5～20kDa的壳聚糖，加蒸馏水超声溶解，制备壳聚糖水溶液，另按壳聚糖与硬脂酸的摩尔比为1：1～50取硬脂酸，按壳聚糖与碳二亚胺的摩尔比为1：1～50取碳二亚胺，混合，加入乙醇，于50℃～90℃下搅拌溶解。然后缓慢加入至50℃～90℃下预热的壳聚糖水溶液中，50℃～90℃下搅拌反应5～48小时，冷却至室温，将终反应液置于分子截留量为7000的透析袋中，蒸馏水透析72小时，透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳聚糖硬脂酸嫁接物；
其特征在于，再通过以下步骤实现：
(2)c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成：
取氨基聚乙二醇2000，溶于少量无水二甲亚砜，按氨基聚乙二醇2000：二琥珀酰亚胺的摩尔比为1：2取二琥珀酰亚胺，溶于适量无水二甲亚砜。将二琥珀酰亚胺的二甲亚砜溶液缓慢滴加至聚乙二醇2000的二甲亚砜溶液中，室温搅拌2～9小时，得反应液1。按聚乙二醇2000:c(RGDfk)环肽的摩尔比为1：1，取c(RGDfk)环肽溶于适量无水二甲亚砜，制备浓度为5.0mg/mL的溶液，将c(RGDfk)环肽的无水二甲亚砜溶液，缓慢滴加至反应液1，室温搅拌1～12小时，得反应液2。按壳聚糖硬脂酸上游离氨基：c(RGDfk)环肽的摩尔比为5：1～20：1取壳聚糖硬脂酸嫁接物，将反应液2缓慢滴加至壳聚糖硬脂酸水溶液中，室温搅拌1～24小时。将终反应液置于截留分子量为3500的透析袋中，蒸馏水透析48小时，冷冻干燥，得到c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸；合成路线：
3.一种c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束的制备方法，其特征在于，该嫁接物包封的药物为光敏剂疏水化吲哚菁绿，通过以下步骤实现：
(1)疏水化吲哚菁绿的制备：
取吲哚菁绿，溶于无水二甲亚砜中，制备浓度为20.0mg/mL的溶液，按吲哚菁绿：四丁基碘化胺的摩尔比为1:1～1:3，取四丁基碘化胺，溶于无水二甲亚砜中，制备浓度为20.0mg/mL的溶液。将吲哚菁绿的二甲亚砜溶液与四丁基碘化胺的二甲亚砜溶液混合均匀，室温水浴超声15～30分钟，即得疏水化吲哚菁绿母液，浓度为5mg/mL。
(2)c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束的制备:
称取c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶于蒸馏水中，探头超声30次，功率为400W，工作2s停3s，制备得嫁接物胶束溶液。取浓度为2mg/mL的c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物胶束溶液，按疏水化吲哚菁绿：嫁接物质量比5％～20％，加入浓度为5mg/mL的疏水化吲哚菁绿的二甲亚砜溶液，室温避光搅拌0.5～2小时，终反应液转移至截留分子量7000的透析袋中，蒸馏水透析24小时。收集透析后的产物，室温8000rpm离心10分钟，除去未被包封的疏水化吲哚菁绿，收集上清液即为c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束，吲哚菁绿的重量百分含量为：3.9％～11.9％。
5.根据权利要求3所述方法制备的c(RGDfk)环肽-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束在制备载脑胶质瘤细胞和肿瘤新生血管内皮细胞双重靶向抗肿瘤光疗药物中的应用，其特征在于，所载药物是。
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