CN108578364A - 偶联物、靶向肿瘤活性氧响应性载药纳米胶束及其制备方法及应用 - Google Patents

偶联物、靶向肿瘤活性氧响应性载药纳米胶束及其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种靶向肿瘤活性氧响应性载药纳米胶束、该载药纳米胶束的制备方法和应用，以及该载药纳米胶束中间体RGD‑PEG‑酮缩硫醇‑蒽环类化疗药物偶联物及其制备方法。本发明的有益效果是：激光照射激活卟啉类光敏分子，触发活性氧自由基的大量产生，进而诱导载药纳米胶束体系中酮缩硫醇断裂，实现蒽环化疗药物在肿瘤部位的可控释放，增强药物疗效，降低药物的毒副作用；将PDT与化疗结合，具有显著的协同增效作用，提升了光动力疗法单独对抗肿瘤的效果，也降低了蒽环化疗药物对于重要脏器的毒副作用。

Description

偶联物、靶向肿瘤活性氧响应性载药纳米胶束及其制备方法 及应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其是涉及一种偶联物、靶向肿瘤活性氧响应性载药纳米胶束及其制备方法及应用。
背景技术
口腔鳞状上皮细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是一种最为常见的口腔恶性肿瘤，在世界范围内每年约有40万例新确诊的口腔鳞状细胞癌患者，其恶性程度高，5年生存率不到50％，严重威胁着人类的生命和健康。肿瘤传统治疗方法在治疗口腔颌面部肿瘤时弊端明显：手术切除将不可避免的影响颌面部的美观，甚至造成咀嚼、发音和吞咽等功能的损伤；鳞状细胞癌对化疗药物敏感性差，并且化疗还容易引起正常组织的损伤；口腔颌面部骨骼结构繁多，对于放射线有一定的阻射效应，效果也不显著。因此，一些免疫疗法、光动力疗法、声动力疗法等新型肿瘤治疗手段受到了越来越多的关注。
光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)已经被广泛应用于肿瘤治疗的临床实践与研究中，它是利用光敏剂在特定波长激光照射下产生的活性氧自由基来诱发细胞毒作用(破坏线粒体、溶酶体等亚细胞结构)，关闭肿瘤组织脉管系统并阻断肿瘤的营养供给，进而起到抑制肿瘤生长的作用。此外，PDT还可以激活机体的免疫系统和促发炎症反应，产生对肿瘤生长的长期抑制效应。相比于传统的治疗手段，PDT作为一种非介入性治疗方式能够尽可能地避免对正常组织副作用，实现对肿瘤的有效控制。然而，PDT用于肿瘤的治疗仍然存在着诸多局限：第一、绝大多数光敏剂具有较强的疏水性，难以在血液中通畅的运输；第二、光敏剂对肿瘤组织缺乏特异性识别能力，会对其所富集的正常组织细胞产生光毒性作用；第三、绝大多数光敏剂的激发光为波长小于700nm，其穿透能力有限，对于位置较深的肿瘤组织难以达到有效的治疗效果。
近年来，越来越多的研究表明利用多功能纳米载体能够将PDT与传统的化疗结合，具有显著的抗肿瘤疗效。除此以外，多功能纳米载体还为药物的靶向递送与可控释放提供了可能，不仅可以实现抗肿瘤协同增效作用，还能有效减少药物的毒副作用。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种高效靶向肿瘤的活性氧响应性载药纳米胶束及其制备方法及应用，以及该载药纳米胶束中间体偶联物及其制备方法。该纳米胶束不仅可以实现蒽环化疗药物和卟啉类光敏分子的共载，还可以通过EPR效应以及RGD多肽的主动靶向作用高效靶向递送药物至肿瘤部位，随后激光照射激活光敏剂产生大量活性氧自由基，损伤线粒体酶系统，破坏细胞内呼吸平衡，激活线粒体介导的细胞凋亡通路，进而诱导细胞凋亡；同时，富含活性氧的环境可触发载体内酮缩硫醇断键，释放蒽环化疗药物作用于肿瘤细胞，抑制DNA合成，扰乱细胞有丝分裂周期，从而在PDT的基础上进一步杀伤肿瘤。可见，该纳米载体能够通过共载化疗药物和光敏分子、靶向递送药物以及基于活性氧敏感的可控药物释放，实现光动力治疗与化疗的有效结合，进而发挥协同增效的抗肿瘤作用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：该高效靶向肿瘤的活性氧响应性载药纳米胶束以具有活性氧敏感键的酮缩硫醇(thioketals)为连接桥，将末端马来酰亚胺修饰的氨基化聚乙二醇(MAL-PEG-NH2,mPEG)和具有游离氨基的蒽环化疗药物通过酰胺键相连，并利用蒽环化疗药物与卟啉类光敏剂分子间的π-π共轭作用形成具有疏水性内核的纳米胶束。而后将环状RGD多肽c(RGDfC)分子中的半胱氨酸与纳米胶束外壳PEG分子中的马来酰亚胺发生加成反应，制备具有肿瘤靶向能力的载药纳米胶束。激光照射激发光敏剂活性产生活性氧，并进一步诱发酮缩硫醇断键，高效释放药物发挥抗肿瘤作用。此外，该载药纳米胶束具有肿瘤主动靶向性，能够高效递送药物至肿瘤病灶，减小药物对正常组织的毒性。
冷冻干燥后表现为红棕色的粉末状产物，水溶性较好，粒径约为180nm，在蒸馏水和含10％血清的磷酸盐缓冲液(PBS)中稳定性良好，电镜下观察具有经典的“核-壳”胶束结构，分布均匀。酮缩硫醇在富含活性氧的环境中发生断键，从而实现药物的可控释放。
所述携带氨基的蒽环化疗药物为阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、伊达比星或其组合。
所述卟啉类光敏剂为血卟啉、金丝桃素、原卟啉、苯并卟啉及其衍生物、血卟啉单甲醚、四羟基苯基二氢卟酚、二血卟啉醚或其组合。
高效靶向肿瘤的活性氧响应性载药纳米胶束的中间体RGD-PEG-酮缩硫醇-蒽环类化疗药物偶联物，所述偶联物以酮缩硫醇为连接桥，将末端马来酰亚胺修饰的氨基聚乙二醇和含氨基的蒽环化疗药物连接，所述末端马来酰亚胺修饰的氨基聚乙二醇和含氨基的蒽环化疗药物通过氨基分别与所述酮缩硫醇两端羧基反应形成酰胺键；末端马来酰亚胺修饰的氨基聚乙二醇上连接含巯基的环状RGD多肽，所述末端马来酰亚胺修饰的氨基聚乙二醇与所述含巯基的环状RGD多肽通过马来酰亚胺和巯基反应生成的硫氢键连接。
该靶向肿瘤活性氧响应性载药纳米胶束的制备方法：
1)活性氧敏感分子羧基化酮缩硫醇的合成。
①将蒸馏水、丙酮、巯基乙酸按照9:6:5的体积比混合，60℃油浴中冷凝条件下避光反应72h。
②旋转蒸发除去溶剂，得到固体粉末状样品，随后用蒸馏水冲洗，离心后弃去上清液，重复3～5次后真空干燥除去残留水分，即得羧基化酮缩硫醇。
2)RGD-PEG-酮缩硫醇-蒽环类化疗药物偶联物的合成。
①将羧基化酮缩硫醇和mPEG分别以5mg/ml和10mg/ml的浓度溶于二甲基亚砜(DMSO)，并按照为2:1的摩尔比混合，避光条件下搅拌反应24-48h，优选为36h，随后将溶液转移至透析袋(截留分子量为500)中并于蒸馏水中透析24-48h，优选为36h，每12h更换透析液，冷冻干燥后得到白色粉末状产物mPEG-酮缩硫醇。
②将具有游离氨基的蒽环化疗药物溶于DMSO中，按照2～3当量比加入三乙胺搅拌12-24h，优选为12h，进行脱盐处理；并与溶于DMSO中的mPEG-酮缩硫醇按照1:1的摩尔比混合，避光下搅拌24-48h，优选为36h，随后将溶液移入透析袋中透析12-24h，优选为12h，冷冻干燥后得到红色粉末状产物mPEG-酮缩硫醇-蒽环化疗药物偶联产物。
③将c(RGDfC)多肽溶于蒸馏水中(1mg/mL)，并与上述mPEG-酮缩硫醇-蒽环化疗药物偶联物按照1:1的摩尔比充分混合，氮气保护下避光反应12-24h，优选为12h，蒸馏水中透析纯化24-48h，优选为36h，而后冷冻干燥得到红色粉末状RGD-mPEG-酮缩硫醇-蒽环类化疗药物偶联物。
3)靶向肿瘤的活性氧响应性载药纳米胶束的制备。
将RGD-mPEG-酮缩硫醇-蒽环类化疗药物偶联物溶于DMSO中，浓度为10mg/mL；将卟啉类光敏剂溶于甲醇中，浓度为1mg/mL。两种溶液分别在避光条件下搅拌12-24h，优选为12h，随后按照1:4的蒽环化疗药物/卟啉类光敏剂比例进行混合，并在避光条件下搅拌12-24h后转移至透析袋(截留分子量为1000)，优选搅拌12h，在蒸馏水中透析纯化24-48h，优选为36h，最后冷冻干燥即得红褐色粉末状载药纳米胶束。
所述载药纳米胶束水溶性较好，粒径约为180nm左右，在蒸馏水和含10％血清的PBS中稳定性良好，电镜下观察具有经典的“核-壳”胶束结构，分布均匀；以过氧化氢和氯化铜模拟活性氧环境，通过核磁氢谱(1H NMR)考察发现RGD-mPEG-酮缩硫醇-蒽环类化疗药物分子中酮缩硫醇能够快速断键，并在随后的体外释放实验中表现出更多的药物(蒽环化疗药物和光敏剂)释放；细胞实验显示该载药纳米胶束能够被高表达整合素αvβ3的口腔鳞癌细胞摄取，同时在激光照射后表现出比游离蒽环化疗药物和不施加光照的载药纳米胶束更强的细胞毒性；小鼠体内实验显示，该载药纳米胶束在RGD多肽的作用下高效富集于小鼠的肿瘤病灶，并在激光照射后显著抑制了小鼠体内肿瘤的生长。
本申请以高分子材料聚乙二醇mPEG和RGD分别作为亲水骨架和肿瘤靶向因子，并以活性氧敏感键酮缩硫醇为可控开关，分别通过化学键和分子间π-π共轭作用连接蒽环化疗药物以及物理包覆卟啉类光敏分子，制备载药纳米胶束，从而实现两种药物的有效共载。该载药纳米胶束可通过实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR效应)以及RGD多肽的主动靶向作用，高效递送药物至肿瘤组织，随后激光照射激活光敏分子产生活性氧自由基，并进一步触发酮缩硫醇断键，释放蒽环化疗药物，发挥PDT与化疗的协同作用。
本发明具有的优点和积极效果是：
1)激光照射激活卟啉类光敏分子，触发活性氧自由基的大量产生，进而诱导载药纳米胶束体系中酮缩硫醇断裂，实现蒽环化疗药物在肿瘤部位的可控释放，增强药物疗效，降低药物的毒副作用；
2)将PDT与化疗结合，具有显著的协同增效作用，提升了PDT单独对抗肿瘤的效果，也降低了蒽环化疗药物对于重要脏器的毒副作用；
3)多肽RGD对载药纳米胶束的表面修饰显著提升了其对于整合素αvβ3阳性肿瘤细胞的靶向性；尾静脉注射6～8h后可高效富集于小鼠肿瘤组织，大大降低了药物对正常组织的毒性；
4)所使用的高分子材料、活性氧敏感键、αvβ3整合素配体RGD多肽均具有良好的生物相容性、可生物降解性、无毒，能够通过静脉注射给药；
5)PEG外壳显著增强了载药纳米胶束在血液中的稳定性，延长了药物的在血液循环中的时间；
6)制备方法简单、成本较低。
附图说明
图1是实施例1中RGD-PEG-酮缩硫醇-蒽环类化疗药物偶联物的制备示意图；
图2是实施例1中靶向肿瘤活性氧响应性载药纳米胶束的制备示意图；
图3是实施例1中mPEG、羧基化酮缩硫醇和蒽环化疗药物阿霉素(DOX)发生酰胺化反应后得到的链状两亲性骨架结构PTD的红外(IR)图谱；
图4是实施例1中PTD的核磁(1H NMR)图谱；
图5是实施例1中多肽c(RGDfC)通过化学键与PTD偶联后得到的RPTD的1H NMR图谱；
图6是实施例1中携载血卟啉(HP)的RPTD纳米胶束(RPTDH)的透射电镜照片；
图7是实施例1中载药纳米胶束RPTDH的粒径分布图；
图8是实施例1中HP、DOX与载药纳米胶束RPTDH的荧光发射光谱图；
图9是实施例1中人口腔上皮细胞(HOEC)对PTDH和载药纳米胶束RPTDH的摄取情况；
图10是实施例1中人口腔鳞状上皮细胞癌CAL-27细胞PTDH和载药纳米胶束RPTDH的摄取情况；
图11是实施例1中用单线态氧荧光探针(SOSG)检测到的载药纳米胶束RPTDH在不同时间激光照射后的活性氧产生情况；
图12是实施例1中用活性氧试剂盒DCFH-DA检测到的载药纳米胶束RPTDH与CAL-27细胞共孵育后在有无激光照射下的活性氧分布情况；
图13是实施例1中PTD在模拟活性氧环境(H2O2和CuCl2)中孵育48h后的1H NMR图谱；
图14是实施例1中载药纳米胶束RPTDH在不同pH释放介质以及有无激光照射条件下的体外释药曲线；
图15是实施例1中载药纳米胶束RPTDH在有无激光照射条件下对CAL-27细胞生长的抑制情况；
图16是实施例1中载药纳米胶束RPTDH在CAL-27荷瘤小鼠体内的组织分布；
图17是实施例1中载药纳米胶束RPTDH结合激光照射对CAL-27荷瘤小鼠体内肿瘤生长的抑制曲线；
图18是实施例1中载药纳米胶束RPTDH结合激光照射对CAL-27荷瘤小鼠治疗结束后的肿瘤照片。
具体实施方式
实施例1
下面通过实施例对本发明进行具体描述，它们只用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整，均属本发明保护范围。
实施例1：
1、PTD的合成与表征
①将羧基化酮缩硫醇和mPEG分别以5mg/ml和10mg/ml的浓度溶于DMSO中，然后按照2:1的摩尔比例混合，在严格避光条件下以500rpm旋转36h。随后将反应液转移至透析袋(截留分子量500)，并在蒸馏水中透析处理36h，每12h换水1次，以除去DMSO和未反应的羧基化酮缩硫醇，冷冻干燥后得到白色粉末状产物mPEG-酮缩硫醇(PT)。
②将盐酸阿霉素(DOX·HCI)以5mg/ml的浓度溶于DMSO中，加入三倍当量的三乙胺，以500rpm的转速在室温下避光搅拌12h，进行脱盐处理。以上制备步骤如图1所示。
③将上述经脱盐处理后的DOX加入以5mg/ml溶于DMSO的PT中，DOX与PT的摩尔比例为1:1.5，在严格避光条件下以500rpm旋转36h。随后将反应液转移至透析袋(截留分子量1000)，并在蒸馏水中透析处理36h，每12h换水1次，以除去DMSO和未反应的游离DOX，最后冷冻干燥后得到红色粉末状产物PTD。制备过程如图2所示，PTD的化学结构通过IR图谱(图3)和1H NMR谱(图4)进行表征。
2、多肽c(RGDfC)与PTD的偶联以及高效负载光敏剂血卟啉(HP)的载药纳米胶束RPTDH的制备与表征
①将多肽c(RGDfC)以1mg/ml的浓度溶于蒸馏水中，按照摩尔比1:1的比例加至PTD溶液中，充入氮气，并密闭避光的条件下反应12h，冷冻干燥得到红色粉末状产物RGD-PEG-酮缩硫醇-DOX(RPTD)。RPTD的1H NMR图谱如图5所示，可以观察到位于RGD中的-NH-特征峰、位于酮缩硫醇和mPEG分子中的-CH3和-CH2特征峰均在相应的位置出现；mPEG中马来酰亚胺的双键特征峰在与多肽c(RGDfC)发生迈克尔加成反应后消失，证明c(RGDfC)与mPEG成功的发生了化学结合。
②将RGD-mPEG-酮缩硫醇-DOX偶联物溶于DMSO中，浓度为10mg/mL；将血卟啉溶于甲醇中，浓度为1mg/mL。
将RPTD溶于DMSO中，浓度为10mg/mL；将血卟啉HP溶于甲醇中，浓度为1mg/mL；各自在避光条件下以500rpm的转速分散12h。将两种溶液按照DOX和HP质量比为1:4的比例进行混合，并在避光条件下搅拌12h后转移至透析袋(截留分子量为1000)，在蒸馏水中透析纯化36h，最后冷冻干燥即得红褐色粉末状载药纳米胶束RPTDH。在蒸馏水中，载药纳米胶束RPTDH的透射电镜照片与粒径分布情况如图6和图7所示，可以观察到其粒径小于200nm，分布均匀，呈典型的“核-壳”胶束结构。DOX、HP与RPTDH的荧光发射光谱如图8所示，与相同浓度的DOX及HP相比，载药纳米胶束RPTDH的荧光发射光谱图出现了显著的淬灭现象，证明DOX和HP分子间存在π-π共轭作用。
3、口腔鳞癌CAL-27细胞与人正常口腔上皮细胞HOEC对载药纳米胶束RPTDH的摄取能力检测
将置于DMEM FULL细胞培养液中的CAL-27和HOEC细胞常规消化、离心、重悬、计数，随后分别以8×104个/孔的密度接种于玻璃底12孔板之中，放入37℃，5％CO2培养箱中孵育24h，弃去培养基，分别加入1ml经DMEM FULL培养液稀释过的载药纳米胶束PTDH(未经RGD修饰)和RPTDH中，DOX和HP的浓度分别为1μg/ml和4μg/ml，而后继续孵育6h。弃去培养液，用冷PBS洗3次，4％多聚甲醛固定10min，再用以1:800稀释于PBS中的DAPI染色10min，最后于激光共聚焦显微镜下观察，通过载体中DOX自发红色荧光的情况判断两种细胞对载药纳米胶束PTDH和RPTDH的摄取能力。
HOEC和CAL-27细胞对于载药纳米胶束PTDH和RPTDH的摄取情况分别如图9和图10所示，可以观察到整合素αvβ3表达阴性的HOEC细胞对于PTDH和RPTDH的摄取量基本相当，而整合素αvβ3表达阳性的CAL-27细胞对于RPTDH的摄取量明显高于PTDH，说明作为整合素αvβ3的配体多肽RGD的修饰显著增强了载药纳米胶束RPTDH对于口腔鳞癌CAL-27细胞的识别、黏附以及入胞能力。
4、载药纳米胶束RPTDH结合激光照射后的体外活性氧生成能力的考察
①细胞外活性氧产量的检测
将DOX和HP固体粉末溶于高浓度DMSO后稀释于蒸馏水中，并将载药纳米胶束PTDH和RPTDH分散于蒸馏水中(DOX和HP的浓度分别约为1μg/ml和4μg/ml)。取配200μL制好的各样品溶液与阴性对照溶液PBS加至96孔板，每孔加入1μL单线态氧荧光探针试剂(SOSG)，而后用波长为635nm的激光以100mW/cm2的强度照射溶液，每2min取出10μL溶液稀释入2mL蒸馏水中，用荧光分光光度计检测SOSG的荧光强度。图11为荧光强度随光照时间变化曲线，PBS和游离DOX溶液的荧光强度没有随光照时间发生明显的变化，单游离HP、载药纳米胶束PTDH和RPTDH溶液的荧光强度随光照时间的显著增强，证明了HP对于该参数的激光具有较强的敏感性，能够诱发活性氧自由基的大量产生。
②细胞内活性氧产量的检测
将CAL-27细胞以8×104个/孔的密度接种于玻璃底12孔板之中，放入37℃，5％CO2培养箱中孵育24h，吸去培养基，并按以下分组给药：空白对照、游离DOX、HP+激光照射、PTDH±激光照射、RPTDH±激光照射，其中DOX和HP的浓度分别为1μg/ml和4μg/ml。药物与细胞共孵育2h后对相应组别的细胞施加强度为100mW/cm2的激光照射并持续10min，随后转入孵箱继续培养12h，弃去培养液后用冷PBS液洗3次，经过DCFH-DA染料染色、4％多聚甲醛固定以及DAPI染细胞核之后，将细胞置于激光共聚焦显微镜下观察胞内绿色荧光信号，其强度与活性氧产量成正相关。如图12所示，相比于DOX、PTDH、RPTDH治疗组，HP+激光照射、PTDH+激光照射、RPTDH+激光照射组细胞内生成了大量的活性氧自由基，且随着HP跟随载药纳米胶束入胞量的增多而增。以上数据说明载药纳米胶束RPTDH结合激光照射能够最大程度地提升CAL-27细胞内活性氧水平，即具有较高的光动力效应。
5、酮缩硫醇的活性氧响应性评价及载药纳米胶束RPTDH的释药性能考察
将含有10.8μmol酮缩硫醇基团的PTD固体粉末溶于800μL DMSO中，加入200μL蒸馏水，400mM H2O2和3.2μM CuCI2(模拟活性氧环境)，混匀后将溶液置于37℃恒温箱中避光震荡48h。随后将溶液转移至截留分子量为500的透析袋中透析处理12h以除去DMSO，最后将经过冷冻干燥得到的红色固体粉末溶于氘代DMSO溶剂，进行1HNMR检测。图13依次显示了PTD以及与H2O2和CuCI2共孵育之后的PTD的1H NMR谱图，可以观察到在化学位移未1.5ppm附近的甲基特征峰在经过H2O2和CuCI2孵育之后显著减弱，提示PTD中绝大部分酮缩硫醇在模拟的活性氧环境中发生了断键，证明了该敏感键可以为载药纳米胶束RPTDH的活性氧响应性可控释药提供可能。
取四份2mL载药纳米胶束RPTDH的分散液，对其中两份施加强度为100mW/cm2的激光照射，持续照射10min，随后将其置于截留分子量为3500的透析袋中，以光照与不光照为一组，将装载两组溶液的透析袋分别置于20mLpH6.5和7.4的PBS释放介质中，在37℃恒温箱中避光震荡(100rpm)。在规定时间点1,2,4,6,8,12,16和24h取释放介质500μL，并加入等体积的新鲜PBS。利用紫外分光光度计测定释放液在488nm处的吸光度，带入建好的游离DOX紫外吸光度与浓度关系的标准曲线中，计算释放液中DOX的浓度，DOX释放百分率按照以下公式计算：
释放百分率％＝(药物释放量/药物总含量)×100％
载药纳米胶束RPTDH在有无激光照射和不同pH条件下的释药曲线如图14所示，DOX的释放在激光照射后显著加快，且在pH6.5下释放量更高，提示酮缩硫醇在光照后产生的活性氧环境下发生了断键，从而促进了胶束中药物的释放，同时也说明该载药纳米胶束在弱酸性的肿瘤微环境中更容易发挥药效。
6、载药纳米胶束RPTDH结合激光照射对CAL-27细胞的毒性作用
将对数生长期的CAL-27细胞以6×103个/孔的密度接种于96孔板之中，放入37℃，5％CO2培养箱中孵育24h，吸去培养基，按照以下分组给药：HP+激光照射、PTDH±激光照射、RPTDH±激光照射。药物与细胞共孵育2h后对相应组别的细胞施加强度为100mW/cm2的激光照射，持续照射10min，随后转入孵箱中培养48h，向每孔加入20μL(5mg/mL)MTT溶液，继续放入孵箱中培养3h，弃去培养液和MTT试剂，每孔加入100μLDMSO，并置于摇床上以100rpm的转速震荡10min，最后用酶标仪检测样品在450nm处的光密度吸光度值即OD值。设置不加药组为空白对照，按照以下公式计算细胞存活率：
存活率＝(实验孔OD值/对照孔OD值)×100％
口腔癌CAL-27细胞经过不同处理后的细胞活性变化如图15所示，进一步计算HP+激光照射、PTDH、PTDH+激光照射、RPTDH和RPTDH+激光照射治疗组中DOX的IC50值，分别为4.7、7.3、2.4、5.6和1.7μg/mL。相比于单独的光动力治疗组或单独化疗组，载药纳米胶束RPTDH联合激光照射治疗表现出更显著的细胞生长抑制效果，IC50值明显降低。为评价该载药纳米胶束体系联合两种药物的协同抗肿瘤效果，利用以下公式计算协同指数(CI)：
CI＝IC50(RPTDH+激光照射组中HP浓度)/IC50(HP+激光照射组中HP浓度)+IC50(RPTDH+激光照射组中DOX浓度)/IC50(RPTDH组中DOX浓度)
计算结果为CI＝0.67，根据标准(CI>1为拮抗作用，CI＝1为叠加作用，CI<1为协同作用)判断，载药纳米胶束RPTDH结合激光照射后表现出显著的协同抗肿瘤作用，实现了PDT与化疗的有效结合。
7、载药纳米胶束RPTDH在CAL-27荷瘤小鼠体内的组织分布
①CY5.5对载药纳米胶束PTDH和RPTDH的标记：在PTD、RPTD与HP混合后反应的过程中加入适量的CY5.5近红外染料，搅拌12h后透析处理，使其与HP一起被包载入胶束的内部，从而实现CY5.5对载药纳米胶束PTDH与RPTDH的近红外标记,分别命名为PTDH/CY5.5与RPTDH/CY5.5。
②裸鼠口腔癌CAL-27移植瘤模型的建立：将对数生长期的CAL-27细胞常规消化，离心，吸取上清液。再用PBS重悬，离心，弃去上清液，该过程重复2次，以彻底除去培养液中的血清。随后进行细胞计数，调整细胞浓度至1×107个/mL，最后将其均匀分散于PBS溶液中，用注射器抽取细胞悬液，向每只裸鼠的右肩部皮下注射200μL。待经细胞接种的移植瘤生长为直径约为1cm的瘤块时，处死裸鼠，在无菌条件下分离瘤块，剥离坏死和脂肪组织后将其切成形状圆滑、大小均一的瘤块，立即放入无菌PBS中洗涤。用75％酒精棉球对要接种的裸鼠右肩部皮肤进行消毒，剪开大约1mm宽的小口，用无菌镊子夹持瘤块经皮肤开口处通入皮下，最后用无菌针线对皮肤开口处进行缝合，待经瘤块接种的移植瘤直径生长到约为5mm时，开始进行以下实验。
③组织分布观察：分别对4只裸鼠进行尾静脉注射200μL的无菌生理盐水、游离CY5.5、PTDH/CY5.5和RPTDH/CY5.5，其中CY5.5的给药剂量控制在10μg/只小鼠。随后利用小动物活体成像仪分别在注射后1、4、8与24h观察CY5.5在小鼠体内的分布。随后处死小鼠，分离重要脏器和肿瘤组织，半定量观察载药纳米胶束在小鼠各脏器和肿瘤组织中的分布。
活体成像的照片如图16所示，可以观察到游离CY5.5几乎没有在肿瘤中富集，24h后主要分布于肾脏，说明CY5.5在小鼠体内迅速代谢清除；纳米载药胶束PTDH和RPTDH给药组均表现出显著的肿瘤组织蓄积效果，并且在注射24h后蓄积量达到最大。相比于PTDH，RPTDH对肿瘤组织的蓄积能力更为显著。以上结果说明载药纳米胶束PTDH和RPTDH可以通过EPR效应携载药物富集于肿瘤组织；RGD的表面修饰赋予了载药纳米胶束对高表达αvβ3整合素肿瘤的特异性识别功能，在EPR效应的基础上能够更有效地蓄积于肿瘤部位。
8、载药纳米胶束RPTDH结合激光照射的体内抗肿瘤作用评价
将移植瘤块大小生长到直径大约为5mm的裸鼠随机分为7组(每组8只)，按照以下方式进行治疗：生理盐水对照组；游离DOX组；游离HP+激光照射组；PTDH组；PTDH+激光照射组；RPTDH组；RPTDH+激光照射组，以上分组中涉及到的DOX剂量均为3mg/kg，HP的剂量均为12mg/kg。每隔5天尾静脉给药1次，给药后24h进行激光照射，强度为100mW/cm2，持续10min。每两天检测肿瘤的体积，用游标卡尺测量瘤块的长(a)和宽(b)，并按照公式V＝ab2/2计算即得，绘制肿瘤生长曲线；同时对小鼠的体重进行称量。
如图17所示，游离DOX组和HP+激光照射组对肿瘤的生长显示出一定抑制效果；但相比之下，载药纳米胶束RPTDH联合激光照射对肿瘤的生长具有最强的抑制效应，说明该载药纳米胶束能够有效联合PDT与化疗治疗肿瘤。
实施例2：
1、mPEG-Thioketals-表阿霉素(EPB)PTE的制备
①将羧基化酮缩硫醇和mPEG分别以5mg/ml和10mg/ml的浓度溶于DMSO中，然后按照2:1的摩尔比例混合，在严格避光条件下以500rpm旋转36h。随后将反应液转移至透析袋(截留分子量500)，并在蒸馏水中透析处理36h，每12h换水1次，以除去DMSO和未反应的羧基化酮缩硫醇，冷冻干燥后得到白色粉末状产物mPEG-酮缩硫醇(PT)。
②将表阿霉素(EPB)以5mg/ml的浓度溶于DMSO中，加入三倍当量的三乙胺，以500rpm的转速在室温下避光搅拌12h，进行脱盐处理。
③将上述经脱盐处理后的EPB加入以5mg/ml溶于DMSO的PT中，EPB与PT的摩尔比例为1:1.5，在严格避光条件下以500rpm旋转36h。随后将反应液转移至透析袋(截留分子量1000)，并在蒸馏水中透析处理36h，每12h换水1次，以除去DMSO和未反应的游离EPB，最后冷冻干燥后得到红色粉末状产物PTE。
2、多肽c(RGDfC)与PTE的偶联以及高效负载光敏剂原卟啉(PP)的载药纳米胶束RPTEP的制备
①将多肽c(RGDfC)以1mg/ml的浓度溶于蒸馏水中，按照摩尔比1:1的比例加至PTE溶液中，充入氮气，并密闭避光的条件下反应12h，冷冻干燥得到红色粉末状产物RGD-PEG-酮缩硫醇-EPB(RPTE)。
②将RGD-mPEG-酮缩硫醇-EPB偶联物溶于DMSO中，浓度为10mg/mL；将PP溶于甲醇中，浓度为1mg/mL。
将RPTE溶于DMSO中，浓度为10mg/mL；将原卟啉PP溶于甲醇中，浓度为1mg/mL；各自在避光条件下以500rpm的转速分散12h。将两种溶液按照EPB和PP质量比为1:4的比例进行混合，并在避光条件下搅拌12h后转移至透析袋(截留分子量为1000)，在蒸馏水中透析纯化36h，最后冷冻干燥即得红褐色粉末状载药纳米胶束RPTEH。
实施例3：
1、mPEG-Thioketals-柔红霉素(DNR)PTD的制备
①将羧基化酮缩硫醇和mPEG分别以5mg/ml和10mg/ml的浓度溶于DMSO中，然后按照2:1的摩尔比例混合，在严格避光条件下以500rpm旋转36h。随后将反应液转移至透析袋(截留分子量500)，并在蒸馏水中透析处理36h，每12h换水1次，以除去DMSO和未反应的羧基化酮缩硫醇，冷冻干燥后得到白色粉末状产物mPEG-酮缩硫醇(PT)。
②将柔红霉素(DNR)以5mg/ml的浓度溶于DMSO中，加入三倍当量的三乙胺，以500rpm的转速在室温下避光搅拌12h，进行脱盐处理。
③将上述经脱盐处理后的DNR加入以5mg/ml溶于DMSO的PT中，DNR与PT的摩尔比例为1:1.5，在严格避光条件下以500rpm旋转36h。随后将反应液转移至透析袋(截留分子量1000)，并在蒸馏水中透析处理36h，每12h换水1次，以除去DMSO和未反应的游离DNR，最后冷冻干燥后得到红色粉末状产物PTD。
2、多肽c(RGDfC)与PTD的偶联以及高效负载光敏剂金丝桃素(Hy)的载药纳米胶束RPTDH的制备
①将多肽c(RGDfC)以1mg/ml的浓度溶于蒸馏水中，按照摩尔比1:1的比例加至PTD溶液中，充入氮气，并密闭避光的条件下反应12h，冷冻干燥得到红色粉末状产物RGD-PEG-酮缩硫醇-DNR(RPTD)。
②将RGD-mPEG-酮缩硫醇-DNR偶联物溶于DMSO中，浓度为10mg/mL；将卟啉类光敏剂溶于甲醇中，浓度为1mg/mL。
将RPTD溶于DMSO中，浓度为10mg/mL；将金丝桃素Hy溶于甲醇中，浓度为1mg/mL；各自在避光条件下以500rpm的转速分散12h。将两种溶液按照DNR和Hy质量比为1:4的比例进行混合，并在避光条件下搅拌12h后转移至透析袋(截留分子量为1000)，在蒸馏水中透析纯化36h，最后冷冻干燥即得粉末状载药纳米胶束RPTDH。
实施例4：
1、mPEG-Thioketals-伊达比星(IDA)PTI的制备
①将羧基化酮缩硫醇和mPEG分别以5mg/ml和10mg/ml的浓度溶于DMSO中，然后按照2:1的摩尔比例混合，在严格避光条件下以500rpm旋转36h。随后将反应液转移至透析袋(截留分子量500)，并在蒸馏水中透析处理36h，每12h换水1次，以除去DMSO和未反应的羧基化酮缩硫醇，冷冻干燥后得到白色粉末状产物mPEG-酮缩硫醇(PT)。
②将伊达比星(IDA)以5mg/ml的浓度溶于DMSO中，加入三倍当量的三乙胺，以500rpm的转速在室温下避光搅拌12h，进行脱盐处理。
③将上述经脱盐处理后的IDA加入以5mg/ml溶于DMSO的PT中，IDA与PT的摩尔比例为1:1.5，在严格避光条件下以500rpm旋转36h。随后将反应液转移至透析袋(截留分子量1000)，并在蒸馏水中透析处理36h，每12h换水1次，以除去DMSO和未反应的游离IDA，最后冷冻干燥后得到红色粉末状产物PTI。
2、多肽c(RGDfC)与PTI的偶联以及高效负载血卟啉单甲醚(HMME)的载药纳米胶束RPTIH的制备
①将多肽c(RGDfC)以1mg/ml的浓度溶于蒸馏水中，按照摩尔比1:1的比例加至PTI溶液中，充入氮气，并密闭避光的条件下反应12h，冷冻干燥得到橙红色粉末状产物RGD-PEG-酮缩硫醇-IDA(RPTI)。
②将RGD-mPEG-酮缩硫醇-IDA偶联物溶于DMSO中，浓度为10mg/mL；将卟啉类光敏剂溶于甲醇中，浓度为1mg/mL。
将RPTI溶于DMSO中，浓度为10mg/mL；将血卟啉单甲醚HMME溶于甲醇中，浓度为1mg/mL；各自在避光条件下以500rpm的转速分散12h。将两种溶液按照IDA和HMME质量比为1:4的比例进行混合，并在避光条件下搅拌12h后转移至透析袋(截留分子量为1000)，在蒸馏水中透析纯化36h，最后冷冻干燥即得粉末状载药纳米胶束RPTIH。
实施例5：
1、mPEG-Thioketals-阿霉素(DOX·HCI)PTD的制备
①将羧基化酮缩硫醇和mPEG分别以5mg/ml和10mg/ml的浓度溶于DMSO中，然后按照2:1的摩尔比例混合，在严格避光条件下以500rpm旋转36h。随后将反应液转移至透析袋(截留分子量500)，并在蒸馏水中透析处理36h，每12h换水1次，以除去DMSO和未反应的羧基化酮缩硫醇，冷冻干燥后得到白色粉末状产物mPEG-酮缩硫醇(PT)。
②将盐酸阿霉素(DOX·HCI)以5mg/ml的浓度溶于DMSO中，加入三倍当量的三乙胺，以500rpm的转速在室温下避光搅拌12h，进行脱盐处理。
③将上述经脱盐处理后的DOX加入以5mg/ml溶于DMSO的PT中，DOX与PT的摩尔比例为1:1.5，在严格避光条件下以500rpm旋转36h。随后将反应液转移至透析袋(截留分子量1000)，并在蒸馏水中透析处理36h，每12h换水1次，以除去DMSO和未反应的游离DOX，最后冷冻干燥后得到红色粉末状产物PTD。
2、多肽c(RGDfC)与PTD的偶联以及高效负载光敏剂四羟基苯基二氢卟酚(MTHPC)的载药纳米胶束RPTDM的制备与表征
①将多肽c(RGDfC)以1mg/ml的浓度溶于蒸馏水中，按照摩尔比1:1的比例加至PTD溶液中，充入氮气，并密闭避光的条件下反应12h，冷冻干燥得到红色粉末状产物RGD-PEG-酮缩硫醇-DOX(RPTD)。
②将RGD-mPEG-酮缩硫醇-DOX偶联物溶于DMSO中，浓度为10mg/mL；将血卟啉溶于甲醇中，浓度为1mg/mL。
将RPTD溶于DMSO中，浓度为10mg/mL；将四羟基苯基二氢卟酚MTHPC溶于甲醇中，浓度为1mg/mL；各自在避光条件下以500rpm的转速分散12h。将两种溶液按照DOX和MTHPC质量比为1:4的比例进行混合，并在避光条件下搅拌12h后转移至透析袋(截留分子量为1000)，在蒸馏水中透析纯化36h，最后冷冻干燥即得红褐色粉末状载药纳米胶束RPTDM。
实施例6：
1、mPEG-Thioketals-阿霉素(DOX·HCI)PTD的制备
①将羧基化酮缩硫醇和mPEG分别以5mg/ml和10mg/ml的浓度溶于DMSO中，然后按照2:1的摩尔比例混合，在严格避光条件下以500rpm旋转36h。随后将反应液转移至透析袋(截留分子量500)，并在蒸馏水中透析处理36h，每12h换水1次，以除去DMSO和未反应的羧基化酮缩硫醇，冷冻干燥后得到白色粉末状产物mPEG-酮缩硫醇(PT)。
②将盐酸阿霉素(DOX·HCI)以5mg/ml的浓度溶于DMSO中，加入三倍当量的三乙胺，以500rpm的转速在室温下避光搅拌12h，进行脱盐处理。
③将上述经脱盐处理后的DOX加入以5mg/ml溶于DMSO的PT中，DOX与PT的摩尔比例为1:1.5，在严格避光条件下以500rpm旋转36h。随后将反应液转移至透析袋(截留分子量1000)，并在蒸馏水中透析处理36h，每12h换水1次，以除去DMSO和未反应的游离DOX，最后冷冻干燥后得到红色粉末状产物PTD。
2、多肽c(RGDfC)与PTD的偶联以及高效负载光敏剂单酸环A(BPD-MA)的载药纳米胶束RPTDB的制备与表征
①将多肽c(RGDfC)以1mg/ml的浓度溶于蒸馏水中，按照摩尔比1:1的比例加至PTD溶液中，充入氮气，并密闭避光的条件下反应12h，冷冻干燥得到红色粉末状产物RGD-PEG-酮缩硫醇-DOX(RPTD)。
②将RGD-mPEG-酮缩硫醇-DOX偶联物溶于DMSO中，浓度为10mg/mL；将血卟啉溶于甲醇中，浓度为1mg/mL。
将RPTD溶于DMSO中，浓度为10mg/mL；将苯并卟啉衍生物单酸环A(BPD-MA)溶于甲醇中，浓度为1mg/mL；各自在避光条件下以500rpm的转速分散12h。将两种溶液按照DOX和BPD-MA质量比为1:4的比例进行混合，并在避光条件下搅拌12h后转移至透析袋(截留分子量为1000)，在蒸馏水中透析纯化36h，最后冷冻干燥即得红褐色粉末状载药纳米胶束RPTDB。
实施例7：
1、mPEG-Thioketals-阿霉素(DOX·HCI)PTD的制备
①将羧基化酮缩硫醇和mPEG分别以5mg/ml和10mg/ml的浓度溶于DMSO中，然后按照2:1的摩尔比例混合，在严格避光条件下以500rpm旋转36h。随后将反应液转移至透析袋(截留分子量500)，并在蒸馏水中透析处理36h，每12h换水1次，以除去DMSO和未反应的羧基化酮缩硫醇，冷冻干燥后得到白色粉末状产物mPEG-酮缩硫醇(PT)。
②将盐酸阿霉素(DOX·HCI)以5mg/ml的浓度溶于DMSO中，加入三倍当量的三乙胺，以500rpm的转速在室温下避光搅拌12h，进行脱盐处理。
③将上述经脱盐处理后的DOX加入以5mg/ml溶于DMSO的PT中，DOX与PT的摩尔比例为1:1.5，在严格避光条件下以500rpm旋转36h。随后将反应液转移至透析袋(截留分子量1000)，并在蒸馏水中透析处理36h，每12h换水1次，以除去DMSO和未反应的游离DOX，最后冷冻干燥后得到红色粉末状产物PTD。
2、多肽c(RGDfC)与PTD的偶联以及高效负载光敏剂二血卟啉醚的载药纳米胶束的制备与表征
①将多肽c(RGDfC)以1mg/ml的浓度溶于蒸馏水中，按照摩尔比1:1的比例加至PTD溶液中，充入氮气，并密闭避光的条件下反应12h，冷冻干燥得到红色粉末状产物RGD-PEG-酮缩硫醇-DOX(RPTD)。
②将RGD-mPEG-酮缩硫醇-DOX偶联物溶于DMSO中，浓度为10mg/mL；将血卟啉溶于甲醇中，浓度为1mg/mL。
将RPTD溶于DMSO中，浓度为10mg/mL；将二血卟啉醚溶于甲醇中，浓度为1mg/mL；各自在避光条件下以500rpm的转速分散12h。将两种溶液按照DOX和二血卟啉醚质量比为1:4的比例进行混合，并在避光条件下搅拌12h后转移至透析袋(截留分子量为1000)，在蒸馏水中透析纯化36h，最后冷冻干燥即得红褐色粉末状载药纳米胶束RGD-mPEG-酮缩硫醇-DOX-二血卟啉醚。
实施例2-7中的纳米载药颗粒的肿瘤细胞摄取能力、活性氧产量、体外释放、体内肿瘤靶向性和肿瘤治疗效果与实施例1中数据相仿，在此不重复叙述。
以上对本发明的7个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (10)

1.一种RGD-PEG-酮缩硫醇-蒽环类化疗药物偶联物，其特征在于：所述偶联物以酮缩硫醇为连接桥，将末端马来酰亚胺修饰的氨基聚乙二醇和含氨基的蒽环化疗药物连接，所述末端马来酰亚胺修饰的氨基聚乙二醇和含氨基的蒽环化疗药物通过氨基分别与所述酮缩硫醇两端羧基反应形成酰胺键；末端马来酰亚胺修饰的氨基聚乙二醇上连接含巯基的环状RGD多肽，所述末端马来酰亚胺修饰的氨基聚乙二醇与所述含巯基的环状RGD多肽通过马来酰亚胺和巯基反应生成的硫氢键连接。
2.一种靶向肿瘤活性氧响应性载药纳米胶束，其特征在于：所述载药纳米胶束以末端马来酰亚胺修饰的氨基聚乙二醇为亲水外壳、以卟啉类光敏剂和含氨基的蒽环化疗药物为疏水内核形成壳核结构，所述含氨基的蒽环化疗药物与所述末端马来酰亚胺修饰的氨基聚乙二醇以酮缩硫醇为连接桥连接，所述末端马来酰亚胺修饰的氨基聚乙二醇和含氨基的蒽环化疗药物分别通过氨基与所述酮缩硫醇两端羧基反应形成酰胺键；所述末端马来酰亚胺修饰的氨基聚乙二醇上连接含有巯基的环状RGD多肽，所述末端马来酰亚胺修饰的氨基聚乙二醇与所述含有巯基的环状RGD多肽通过马来酰亚胺和巯基反应生成的碳硫键连接。
3.根据权利要求2所述的靶向肿瘤活性氧响应性载药纳米胶束，其特征在于：所述卟啉类光敏剂与蒽环类化疗药物通过π-π共轭作用形成疏水内核。
4.根据权利要求2所述的靶向肿瘤活性氧响应性载药纳米胶束，其特征在于：所述含有巯基的环状RGD多肽为c(RGDfC)多肽。
5.根据权利要求2或3所述的靶向肿瘤活性氧响应性载药纳米胶束，其特征在于：所述卟啉类光敏剂为血卟啉、金丝桃素、原卟啉、苯并卟啉及其衍生物、血卟啉单甲醚、四羟基苯基二氢卟酚、二血卟啉醚或其组合。
6.根据权利要求2或3所述的靶向肿瘤活性氧响应性载药纳米胶束，其特征在于：所述携带氨基的蒽环化疗药物为阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、伊达比星或其组合。
7.一种RGD-PEG-酮缩硫醇-蒽环类化疗药物偶联物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
①将酮缩硫醇和末端马来酰亚胺修饰的氨基聚乙二醇按照2:1的摩尔比混合，避光条件下搅拌反应24-48h，优选为36h，随后透析24-48h，优选为36h，冷冻干燥后得到mPEG-酮缩硫醇；
②将含氨基的蒽环化疗药物进行脱盐处理，并与mPEG-酮缩硫醇按照1:1的摩尔比混合，避光下搅拌24-48h，优选为36h，随后透析24-48h，优选为36h，冷冻干燥后得到mPEG-酮缩硫醇-蒽环化疗药物偶联产物；
③将环状RGD多肽与mPEG-酮缩硫醇-蒽环化疗药物偶联物按照1:1的摩尔比充分混合，氮气保护下避光反应12-24h，优选为12h，透析纯化24-48h，优选为36h，冷冻干燥得到RGD-mPEG-酮缩硫醇-蒽环类化疗药物偶联物。
8.一种靶向肿瘤活性氧响应性载药纳米胶束的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)RGD-PEG-酮缩硫醇-蒽环类化疗药物偶联物的合成
①将酮缩硫醇和末端马来酰亚胺修饰的氨基聚乙二醇按照2:1的摩尔比混合，避光条件下搅拌反应24-48h，优选为36h，随后透析24-48h，优选为36h，冷冻干燥后得到mPEG-酮缩硫醇；
②将含氨基的蒽环化疗药物进行脱盐处理，并与mPEG-酮缩硫醇按照1:1的摩尔比混合，避光下搅拌24-48h，优选为36h，随后透析24-48h，优选为36h，冷冻干燥后得到mPEG-酮缩硫醇-蒽环化疗药物偶联产物；
③将环状RGD多肽与mPEG-酮缩硫醇-蒽环化疗药物偶联物按照1:1的摩尔比充分混合，氮气保护下避光反应12-24h，优选为12h，透析纯化24-48h，优选为36h，冷冻干燥得到RGD-mPEG-酮缩硫醇-蒽环类化疗药物偶联物；
2)靶向肿瘤的活性氧响应性载药纳米胶束的制备
将RGD-PEG-酮缩硫醇-蒽环类化疗药物偶联物和卟啉类光敏剂分别在避光条件下搅拌，随后按照1:4比例进行混合，并在避光条件下搅拌12-24h，优选为12h，随后透析，冷冻干燥，即得载药纳米胶束。
9.如权利要求2-6任一所述的靶向肿瘤活性氧响应性载药纳米胶束在制备靶向肿瘤递送药物中的应用。
10.如权利要求2-6任一所述的靶向肿瘤活性氧响应性载药纳米胶束在制备光动力/化疗肿瘤协同治疗药物中的应用。
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