CN107469081B - 靶向PEG修饰的金纳米棒与AlpcS4偶联的结合体及其制备、应用和抗肿瘤组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种靶向PEG修饰的金纳米棒与AlpcS4偶联的结合体及其制备、应用和抗肿瘤组合物，包括AlPcS4和PEG修饰的金纳米棒，其中，PEG修饰的金纳米棒为表面通过HS‑PEG‑COOH修饰的金纳米棒，HS‑PEG‑COOH的羧基通过酰胺键与多肽或者靶向短肽连接；AlPcS4通过静电吸附到金纳米棒表面；所述PEG修饰的金纳米棒表面等离子共振峰为750～850nm。该结合体可借助金纳米棒的被动靶向能力或者靶分子的主动靶向能力，提高AlPcS4的药物传递效率，并解决AlpcS4药物传送效率低、光动力效果有限、对肿瘤组织的选择性和富集能力有限的问题。

Description

靶向PEG修饰的金纳米棒与AlpcS4偶联的结合体及其制备、应 用和抗肿瘤组合物
技术领域
本发明涉及抗肿瘤药物研究领域，特别涉及一种靶向PEG修饰的金纳米棒与光敏剂AlpcS4偶联的结合体及其制备方法和应用、基于该组合体的抗肿瘤组合物。
背景技术
恶性肿瘤是严重危害人类生命健康的常见和重大疾病。常年来，因其死亡的人数比例居高不下。尤其是胃癌，占恶性肿瘤的第二位，新发率每年高达40万人之多，死亡率高达30万人之多，居世界首位。而其在西方国家发病率较低，季加孚指出全世界每年新增的胃癌病例近一半都出现在中国，比例高达47％，从而使得胃癌成为我国必须自主攻克的重大疾病之一。近年来，随着我国对胃癌基础研究和临床治疗的重视，以期攻克胃癌的各种基础研究和治疗策略取得了迅猛发展，新型药物和各种特异性治疗方案层出不穷，虽然治疗效果有所改进但是死亡率及转移复发率仍旧很高。随着癌症研究的不断深入，利用光照下可产生光敏化作用的光敏剂来破坏病变组织的微创疗法-光动力疗法，因其具有高效、安全、创伤小、副作用少、可协同性、可重复性和相对成本低等优点，成为最具前景的肿瘤治疗方法之一。
无疑光敏剂是光动力疗法的核心环节。具有近红外荧光特性的酞菁类金属配合物-四磺酸酞菁铝(AlPcS4)，由于具有较深的光组织穿透性、高的荧光量子产量、较强的光稳定性、表面可修饰性以及对目标组织的可视化示踪而成为了光敏剂的研究热点。目前其初步尝试应用于乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠癌等肿瘤光动力治疗研究方面，而针对胃癌的治疗研究方面几乎还是空白。而且从目前研究结果看，它对肿瘤组织的选择性和富集能力有限导致其不能完全根治肿瘤进而导致肿瘤复发从而大大阻碍了其向临床应用的推进。
近几年研究发现将光敏剂和纳米材料相结合，利用纳米材料增强的渗透和滞留(enhanced permeability and retention,EPR)效应可实现被动靶向提高光敏剂的药物传递效率，而且还可以提高光敏剂的单态氧产量有效提高光动力学效应，可结合纳米材料的光热效应和光敏剂的光动力效应更有效的实现肿瘤细胞杀伤。金纳米棒(AuNR)具有近红外吸收可调、形状可控、生物相容性好、制备简单、化学性质稳定和无光漂白现象以及光敏特性等优点，成为了一种非常有潜力的光动力治疗的探针。
此外，利用特异性分子的高度靶向识别能力，对结合体进行免疫修饰，可以使结合体更特异的聚集到肿瘤部位，进一步解决肿瘤组织选择性和富集能力有限的问题，更大程度的选择性杀伤肿瘤细胞最终达到提高光动力效果的目的。胃癌血管内皮细胞的特异性短肽GX1不仅能够特异性的聚集于人胃癌组织血管，并且具有分子量小、高灵敏、高选择性等优势，成为了胃癌特异性分子的理想选择。
除此之外，AlPcS4经激光照射后产生的活性氧是产生治疗作用的关键，而活性氧与细胞凋亡也密切相关。化疗药物诱导细胞凋亡已是临床治疗癌症的重要方式之一，但是化疗药物大的毒副作用，反复使用过程中的多药耐药现象导致治疗失败时有发生。因此将这些常规化疗药物(如VCR，MMC，CDDP)与光敏剂AlPcS4共同作用于胃癌细胞，利用光动力和化疗的协同作用，同时借助于AlPcS4的荧光特性，对胃癌的诊疗一体化进行研究有望改善这些化疗药物带来的毒副作用以及多药耐药问题同时解决AlPcS4光动力治疗无法将肿瘤细胞全部杀死从而导致肿瘤复发的问题，对解决胃癌临床治疗效果不佳、易复发等问题具有非常重要的意义。
除此之外，研究新的化疗药物，尤其是针对关键致癌位点(如肿瘤细胞内部某一蛋白分子，基因片段等)研发出来的相应化疗药物，因其在进入体内后只会特异性的选择与这些致癌位点相结合并发生作用，最终导致肿瘤细胞特异性死亡，而不损坏肿瘤组织周围的细胞，对攻克胃癌疾病临床所面临的难题也具有十分重要的意义。ApoG2是在一种天然的类似于BH3结构域的小分子化合物棉酚的衍生物。已证实其以小的毒副作用可靶向到胃癌组织中高表达的Bcl-2，Bcl-xL蛋白通过激活线粒体凋亡通路以及内质网应激凋亡通路等多途径诱导胃癌细胞凋亡，具有较强的抑瘤效果。但是其不能完全根治肿瘤进而导致肿瘤复发，限制了其朝临床转化的前景。因此，将ApoG2的化疗作用与AlPcS4的光动力治疗作用联合作用于胃癌细胞，有望将两者的优势进行互补，促进ApoG2和AlPcS4向临床转化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种PEG修饰的金纳米棒与光敏剂AlpcS4偶联的结合体，借助金纳米棒的被动靶向能力，提高AlPcS4的药物传递效率，并解决AlpcS4药物传送效率低、光动力效果有限、对肿瘤组织的选择性和富集能力有限的问题。
本发明的目的还在于提供一种靶向PEG修饰的金纳米棒与光敏剂AlpcS4偶联的结合体制备方法和应用，进一步使结合体更特异的聚集到肿瘤部位，进一步解决肿瘤组织选择性和富集能力有限的问题，更大程度的选择性杀伤肿瘤细胞。
本发明的目的还在于提供一种包含了靶向PEG修饰的金纳米棒与光敏剂AlpcS4偶联的结合体的抗肿瘤组合物。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种靶向PEG修饰的金纳米棒与光敏剂AlpcS4偶联的结合体AuNR-PEG-AlpcS4，包括靶向PEG修饰的金纳米棒和光敏剂AlPcS4；其中，靶向PEG修饰的金纳米棒为表面通过HS-PEG-COOH修饰的金纳米棒，HS-PEG-COOH的羧基通过酰胺键与多肽或短肽连接；
光敏剂AlPcS4通过静电吸附到靶向PEG修饰的金纳米棒表面；
靶向PEG修饰的金纳米棒表面的等离子共振峰为750～850nm。
优选地，所述多肽或短肽为带有正电性的多肽或短肽。
优选地，所述多肽为RRLAC多肽。
优选地，所述短肽为GX1短肽。
本发明还公开了一种靶向PEG修饰的金纳米棒与光敏剂AlpcS4偶联的结合体的制备方法，包括步骤：
1)采用金种子生长法制备金纳米棒；制备羧基通过多肽或者短肽修饰的HS-PEG-COOH；
2)制备PEG修饰的金纳米棒；
3)制备靶向PEG修饰的金纳米棒与光敏剂AlpcS4偶联的结合体。
优选地，在步骤1)中，制备羧基通过多肽或者短肽修饰的HS-PEG-COOH的方法为：HS-PEG-NHS与多肽或者短肽在溶剂中发生缩合反应，其中，按照摩尔量计，HS-PEG-NHS：多肽/短肽＝1：(0.025～0.8)。
优选地，在步骤1)中，金纳米棒的制备方法包括：
1-1)制备金种子溶液：将CTAB水溶液与HAuCl4的水溶液相混合，在搅拌条件下，向混合溶液中加入硼氢化钠水溶液，并搅拌1～5分钟；静置，得金种子溶液；
1-2)制备生长液：向CTAB水溶液中加入HAuCl4水溶液，随后依次加入AgNO3水溶液、维生素C溶液和1％的盐酸，制得生长液；
1-3)制备金纳米棒：将金种子溶液加入到生长液中，反应12～14小时。
1-4)分离金纳米棒：将1-3)反应液离心去除上清液，得金纳米棒。
进一步优选地，在步骤1-1)中，CTAB水溶液作为反应溶剂。更进一步优选地，CTAB水溶液的体积为HAuCl4水溶液体积的20～40倍。更进一步优选地，CTAB水溶液的浓度为70～120mM。
进一步优选地，在步骤1-1)中，HAuCl4水溶液的浓度为7～13mM。
进一步优选地，在步骤1-1)中，硼氢化钠水溶液的浓度为7～13mM。
进一步优选地，在步骤1-1)中，HAuCl4与硼氢化钠的摩尔比为1：(2～3)。
进一步优选地，在步骤1-2)中，CTAB水溶液作为反应溶剂。更进一步优选地，CTAB水溶液的浓度为70～120mM。更进一步优选地，CTAB水溶液的体积为HAuCl4水溶液体积的10～40倍。
进一步优选地，在步骤1-2)中，HAuCl4水溶液的浓度为7～13mM。
进一步优选地，在步骤1-2)中，AgNO3水溶液的浓度为7～13mM。
进一步优选地，在步骤1-2)中，按照摩尔量，HAuCl4：AgNO3＝1：(0.4～0.5)。
进一步优选地，在步骤1-2)中，按照摩尔量，HAuCl4：维生素C＝1：(1.1～1.3)。
进一步优选地，在步骤1-2)中，生长液的pH＝7.4。
优选地，在步骤2)中，将金纳米棒加入到经多肽或者短肽修饰的SH-PEG-COOH混合液中，按照摩尔量，HS-PEG-COOH：金纳米棒＝500：(1～20)。
优选地，在步骤3)中，将AlPcS4溶液加入到(靶向)PEG修饰的金纳米棒溶液中，搅拌2～6小时，利用葡聚糖凝胶层析柱分离，得(靶向)PEG修饰的金纳米棒与光敏剂AlpcS4偶联的结合体。
本发明还公开了所述的靶向PEG修饰的金纳米棒与光敏剂AlpcS4偶联的结合体在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选地，所述肿瘤为癌症。
一种抗肿瘤组合物，包括VCR，MMC，CDDP、ApoG2与所述的靶向PEG修饰的金纳米棒与光敏剂AlpcS4偶联的结合体，其中，其中，按质量比，VCR：结合体中的AlpcS4＝1：(5-160)，MMC：结合体中的AlpcS4＝1：(1-32)；按摩尔比，CDDP：结合体中的AlpcS4＝1：(1-4)，ApoG2：结合体中的AlpcS4＝1：(1-4)。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明公开的靶向PEG修饰的金纳米棒与光敏剂AlpcS4偶联的结合体，包括靶向PEG修饰的金纳米棒和光敏剂AlPcS4，其中，靶向PEG修饰的金纳米棒为表面通过HS-PEG-COOH修饰的金纳米棒，HS-PEG-COOH的羧基通过酰胺键与多肽或者短肽连接；AlPcS4通过静电吸附到金纳米棒表面；所述PEG修饰的金纳米棒表面等离子共振峰为750～850nm。基于纳米材料和光敏材料结合是提高光敏剂光动力学效应的有效方法，通过静电吸附反应制备出具有激发光处于近红外波段的AlPcS4的光敏剂与经PEG修饰的金纳米棒的稳定结合体，借助金纳米棒的被动靶向能力提高光敏剂的药物传递效率，提高单态氧产量进而有效提高光动力学效应，可结合AuNR的光热效应和光敏剂的光动力效应更有效的实现肿瘤细胞杀伤。有效解决AlpcS4药物传送效率低、光动力效果有限、对肿瘤组织的选择性和富集能力有限等问题导致其产生的光动力疗法对胃癌细胞杀伤效率低的问题。
进一步地，所述多肽为带有正电性的多肽。在合成过程中先对PEG正电性修饰，然后将未分离纯化的PEG对金纳米棒进行PEG化相比于金纳米棒先进行PEG化后进行正电性修饰使得PEG化的金纳米棒正电性更强，弥补PEG降低金纳米棒正电性的缺点，有利于后期静电吸附反应使得更多带负电荷的光敏剂结合到结合体上。
进一步地，所述短肽为GX1短肽。将GX1胃癌肿瘤标志物进行PEG化修饰,然后利用Au-S键结合方式，将PEG化的GX1短肽修饰到金纳米棒表面，制备出靶向型金纳米棒材料，进一步通过静电吸附反应制备出AlPcS4光敏剂与靶向金纳米棒的稳定结合体，在纳米材料和光敏材料结合可提高光敏剂光动力学效应的基础上，借助特异性分子的高度靶向识别能力使结合体更特异的聚集到肿瘤部位，进一步解决肿瘤组织选择性和富集能力有限的问题，更大程度的选择性杀伤肿瘤细胞。基于AlPcS4的荧光特性，利用荧光分子成像检测探针的靶向性，利用光热效应协同光动力效应对胃癌细胞进行灭活，最终形成可进行体内动态实时无创可视化监测的胃癌诊治体系，促进解决胃癌临床上难以早期观测，难以治疗的难题。
本发明提供的一种抗肿瘤组合物，将光动力治疗和化疗方法相结合有望提高肿瘤治疗效果，彻底灭活肿瘤细胞，防止肿瘤复发，提高患者的生存率。将AlpcS4与小剂量的临床化疗药物(如VCR，MMC，CDDP)联合作用于胃癌细胞，毒副作用显著降低、细胞灭活效果明显提高、细胞凋亡率明显增加。基于临床化疗药物除了大的毒副作用外，在反复使用过程中产生的多药耐药现象也是化疗方法不容忽视的问题。将针对关键致癌位点研发新化疗药物ApoG2协同AlpcS4光动力治疗对胃癌细胞进行协同治疗，规避传统化疗药物反复使用过程中所造成的多药耐药现象和作为非选择性药物的大的毒副作用，有望促进ApoG2和光动力治疗向胃癌临床治疗转化，提高胃癌治疗效果，为胃癌治疗提供新方法。
附图说明
图1为AlpcS4作用于SGC-7901细胞的暗毒性和光动力灭活效果图。
图2为AuNR的紫外吸收光谱(a)、电镜图(b)和光热效果图(c)。
图3为AlpcS4-AuNR结合体的吸收光谱图(a)，Zeta电位图(b)和稳定性图(c)。
图4为AlpcS4-AuNR结合体中AuNR促进AlpcS4传递效率图。
图5为AlpcS4-AuNR结合体细胞灭活效果(a)、活性氧物质浓度(b)和单态氧浓度增强效果对比图(c)。
图6为靶向型AlpcS4-AuNR结合体的吸收光谱图(a)，Zeta电位图(b)和稳定性(c)。
图7为靶向型AlpcS4-AuNR结合体中血管靶向短肽GX1的靶向特性图。
图8为靶向型AlpcS4-AuNR结合体细胞灭活效果(a)、活性氧物质浓度(b)和单态氧浓度增强效果对比图(c)。
图9为AlpcS4联合不同化疗药物协同作用于灭活胃癌细胞效果图，其中(a)为AlpcS4联合VCR协同作用灭活胃癌细胞效果图，(b)为AlpcS4联合MMC协同作用灭活胃癌细胞效果图，(c)为AlpcS4联合CDDP协同作用灭活胃癌细胞效果图，(d)为AlpcS4联合ApoG2协同作用灭活胃癌细胞效果图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
1、金纳米棒的制备和表征
本发明采用NaBH4为还原剂，CTAB为稳定剂的金种子生长法制备金纳米棒，具体合成如下：
金种子的制备：配制7.5ml 100mM CTAB水溶液，与250uL 10mM HAuCl4水溶液混合搅拌，搅拌过程中加入600uL 10mM NaBH4搅拌2分钟，27℃静置2h；生长液的制备：配制10ml100mM CTAB水溶液，向其中加入0.8mL 10mM HAuCl4水溶液，随后依次加入425uL 10mMAgNO3水溶液，90uL的100mM的维生素C溶液抗氧化，100uL的1％HCl；将105uL的种子溶液加入生长液中，反应12h-14h。
将制备的金纳米棒溶液12000rpm离心10min,去上清，加入去离子水重悬，重复多次后保存备用。利用吸收光谱仪、透射电镜和粒度仪表征金纳米棒的吸收光谱和形状尺寸，参见图2中(a)和(b)，结果表明，金纳米棒的吸收峰位于810nm处左右，长径比约为4.21:1，其中平均长度为38.35±3.58nm，宽度为9.09±1.23nm。参见图2中(c)，光热效果测评显示具有良好的光热特性，适用于光热杀伤和药物释放。
2、金纳米棒的PEG化
本发明选择带有双官能团的HS-PEG-NHS利用COOH和NH2的缩合反应将带有正电性的多肽RRLAC按照1:1的摩尔浓度修饰到PEG上，减小后期因PEG连接后AuNR电性的降低。然后利用PEG另一端的SH修饰金纳米棒的表面，最终制备出带有正电荷特性的PEG修饰的金纳米棒。经过PEG修饰后的金纳米棒空间稳定性显著提高，阻止了金纳米棒的团聚。其中制备过程优于传统的金纳米棒先PEG化然后再连接带有正电荷的多肽，使得PEG后的金纳米棒表面正电荷更强，更适用于后期的光敏剂偶合。
3、AlpcS4-AuNR结合体的制备和表征
将25ug-600ug不同浓度的AlpcS4加入到4.3nM上述制备好的PEG修饰好的金纳米棒溶液中搅拌4h，利用葡聚糖凝胶层析柱分离，获得纯化的AlpcS4-AuNR结合体。利用紫外吸收光谱和粒度仪进行表征和稳定性测试。结果显示600ug/ml的AlpcS4与PEG修饰好的金纳米棒溶液反应不会发生聚沉现象，而金纳米棒先PEG化再进行正电性修饰最后与AlpcS4静电吸附反应会发生聚沉现象，说明本专利提供的方法有效提高了光敏剂的载药量。参见图3，通过紫外吸收光谱分析，结合体稳定性良好，1个月内结合体中AlpcS4和金纳米棒吸收光谱无明显变化。
4、靶向AlpcS4-AuNR结合体的制备和表征
利用带有双官能团的HS-PEG-NHS利用COOH和NH2的缩合反应将胃癌血管靶向肽GX1按照1:1的摩尔浓度修饰到PEG上，然后利用PEG另一端的SH修饰金纳米棒的表面，最终制备出带有靶向特性的金纳米棒。将25ug-200ug不同浓度的AlpcS4加入到4.3nM上述制备好的靶向金纳米棒溶液中搅拌4h,利用葡聚糖凝胶层析柱分离，获得纯化的靶向AlpcS4-AuNR结合体。
利用紫外吸收光谱和粒度仪进行表征和稳定性测试，结果参见图6，图中(a)紫外吸收光谱光谱显示靶向AlpcS4-AuNR结合体AuNR吸收峰稍有红移，(b)Zeta电位从正变负，(c)1个月内靶向结合体中AlpcS4和金纳米棒吸收光谱无明显变化，稳定性良好，说明稳定的靶向结合体制备成功。
5、AlpcS4对胃癌细胞的灭活作用
将SGC-7901胃癌细胞用含10％的胎牛血清，100U/mL青霉素，100ug/mL链霉素的RPMI1640培养液置37℃，5％的CO2的培养箱培养待细胞融合率达80％左右时用0.25％胰蛋白酶消化铺板于96孔板，置于37℃5％的CO2的培养箱隔夜培养。然后，将不同浓度的AlpcS4溶液分别加入96孔板中，每浓度设3个复孔，另外设3个不加细胞只加培养基的空白对照孔。放回培养箱继续培养4h，PBS清洗后换新鲜培养液继续培养24h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，放回培养箱继续培养1h,最后在酶标仪上490nm处读出各孔的OD值，实验重复3次，计算细胞存活率。细胞存活率＝(OD(实验组值)-OD(空白对照组)/OD(阴性对照组值)-OD(空白对照组))×100％。根据细胞存活率，分析AlpcS4对SGC-7901细胞的毒性。选择导致细胞活性在80％以上的AlpcS4浓度作为SGC-7901细胞光动力治疗浓度，对铺于96孔板的SGC-7901细胞进行药物干预4h，结束后，PBS清洗换新鲜培养液，放置于635nm激光器下以100mw/cm2光照计量光照5min，放回培养箱继续培养24h。利用上述相同的步骤计算AlpcS4对SGC-7901细胞光动力治疗后的细胞存活率。参见图1，结果显示AlpcS4浓度即使增到64ug/ml的时候，细胞杀伤率也仅有60％左右，AlpcS4对胃癌细胞杀伤效率有待提高。
6、AlpcS4在胃癌细胞内的荧光定位和进入细胞前后荧光强度对比分析
将SGC-7901胃癌细胞用含10％的胎牛血清，100U/mL青霉素，100ug/mL链霉素的RPMI1640培养液置37℃，5％的CO2的培养箱培养待细胞融合率达80％左右时用0.25％胰蛋白酶消化铺板于6孔板，置于37℃5％的CO2的培养箱隔夜培养。
然后，将不同浓度的AlpcS4溶液分别加入6孔板中，放回培养箱继续培养4h，PBS清洗后胰酶消化离心去上清，用PBS重悬，在荧光分光光度计上测细胞内AlpcS4的荧光强度。
同时，测加入细胞之前的对应的AlpcS4荧光强度，对比AlpcS4进入SGC-7901细胞前后的荧光强度。待SGC-7901进入对数生长期后，将细胞铺入含有爬片的6孔板，隔夜培养。
然后，将不同浓度的AlpcS4溶液分别加入6孔板中，放回培养箱继续培养4h，然后PBS清洗，加入DAPI进行细胞核染色，染色结束后PBS清洗捞出细胞爬片放置于载玻片上用防荧光萃灭甘油封片载入荧光显微镜进行AlpcS4在细胞内位置的观察。结果显示不到30％的AlpcS4进入到细胞内部，因此，AlpcS4光敏剂药物传递效率不够是其对胃癌细胞光动力治疗效果不佳的主要原因之一。
7、AlpcS4-AuNR结合体的光动力效应研究
将AuNR，AlPcS4，AlPcS4-AuNR溶液用细胞培养液稀释成不同浓度的工作液备用。待培养的细胞处于对数生长期时，用含10％的胎牛血清的RPMI1640培养液将其稀释成5×104/mL的单细胞悬液，以1mL/孔加入24孔板，隔夜培养。实验分为激光照射组和对照组，每组中将稀释的不同浓度的工作液分别加入到相应孔板中。给予激光对照组808nm光热激发光源和670nm荧光激发光源分别照射细胞5min后，激光照射组和对照组继续培养细胞24h。培养结束后，利用CCK-8测细胞活性，Hoechst33258观测细胞凋亡形态，利用荧光分光光度计测定荧光强度变化。进而获得结合体使用的最佳时间和最佳剂量，评价结合体光热疗法协同光动力疗法对胃癌细胞的杀伤作用。利用单态氧检测试剂SOSGR检测结合体的单态氧产量，验证金纳米棒可通过提高光敏剂单态氧产量进而提高光动力治疗效果。细胞活性，荧光对比结果分析，细胞内单态氧和活性氧结果显示，金纳米棒可以有效增加光敏剂的载药率，参见图4，提高光敏剂单态氧和活性氧产率，细胞杀伤效率显著提高，见图5所示，其中(a)是杀伤效率，(b)是活性氧，(c)是单态氧。
8、靶向AlpcS4-AuNR结合体的靶向特性测试
将靶向AlPcS4-AuNR溶液用细胞培养液稀释成不同浓度的工作液备用。待SGC-7901进入对数生长期后，将细胞铺入含有爬片的6孔板，隔夜培养。然后，将不同浓度的靶向AlPcS4-AuNR溶液分别加入6孔板中，放回培养箱继续培养4h，然后PBS清洗，加入DAPI进行细胞核染色，染色结束后PBS清洗捞出细胞爬片放置于载玻片上用防荧光萃灭甘油封片载入荧光显微镜进行靶向AlPcS4-AuNR溶液在细胞内位置以及荧光强度随浓度的变化观察。将不同浓度的靶向AlPcS4-AuNR溶分别加入不含爬片的6孔板中，放回培养箱继续培养4h，PBS清洗后胰酶消化离心去上清，用PBS重悬，在荧光分光光度计上测808nm光热激发光源照射后细胞内AlpcS4的荧光强度变化。此外，待SGC-7901进入对数生长期后，重新将细胞铺入含有爬片的6孔板，隔夜培养。然后，在不同浓度的靶向AlPcS4-AuNR溶液分别加入6孔板之前将20-100ug的GX1短肽加入相应孔中孵育1h进行竞争抑制干预，放回培养箱继续培养4h，然后PBS清洗，加入DAPI进行细胞核染色，染色结束后PBS清洗捞出细胞爬片放置于载玻片上用防荧光萃灭甘油封片载入荧光显微镜进行靶向AlPcS4-AuNR溶液荧光强度随GX1干预的变化观察。将不同浓度的靶向AlPcS4-AuNR溶分别加入不含爬片的6孔板中，放回培养箱继续培养4h，PBS清洗后胰酶消化离心去上清，用PBS重悬，在荧光分光光度计上测GX1对细胞内AlpcS4的荧光强度变化。参见图7，经靶向分子修饰后，结合体被动靶向变成主动靶向，使得更多的光敏剂到达肿瘤部位。
9、靶向AlpcS4-AuNR结合体的光动力效应研究：将靶向AlPcS4-AuNR溶液用细胞培养液稀释成不同浓度的工作液备用。待培养的细胞处于对数生长期时，用含10％的胎牛血清的RPMI1640培养液将其稀释成5×104/mL的单细胞悬液，以1mL/孔加入24孔板，隔夜培养。实验分为激光照射组和对照组，每组中将稀释的不同浓度的工作液分别加入到相应孔板中。给予激光对照组808nm光热激发光源和670nm荧光激发光源分别照射细胞5min后，激光照射组和对照组继续培养细胞24h。培养结束后，利用CCK-8测细胞活性，Hoechst33258观测细胞凋亡形态。进而获得靶向结合体使用的最佳时间和最佳剂量，评价靶向结合体光热疗法协同光动力疗法对胃癌细胞的杀伤作用。利用单态氧检测试剂SOSGR检测靶向结合体的单态氧产量，验证具有靶向特性的金纳米棒对光动力治疗效果的影响。靶向修饰的结合体细胞内活性氧和单态氧产率比未靶向修饰的结合体提高了30％左右，毒性更小，杀伤效率更高，如图8所示，其中(a)是杀伤效率，(b)是活性氧，(c)是单态氧。
10、结合体联合临床化疗药物VCR、MMC和CDDP对胃癌细胞灭活效果：将不同浓度的临床化疗药物VCR、MMC和CDDP加入铺有SGC-7901胃癌细胞的96孔板中干预4h，PBS清洗后换新鲜培养液继续培养24h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，放回培养箱继续培养1h,最后在酶标仪上490nm处读出各孔的OD值，实验重复3次，计算细胞存活率。将存活率在50％左右的化疗药物浓度作为协同作用使用浓度，即VCR大约0.2ug/ml，MMC大约1ug/ml和CDDP大约10uM。将每种化疗药物与不同浓度的AlpcS4同时加入铺有SGC-7901胃癌细胞的96孔板中干预4h，PBS清洗后换新鲜培养液继续培养24h后，利用CCK-8进行协同效应评价。将每种化疗药物与不同浓度的结合体同时加入铺有SGC-7901胃癌细胞的6孔板中，放回培养箱继续培养4h，PBS清洗后胰酶消化离心去上清，用PBS重悬，在荧光分光光度计上测细胞内AlpcS4的荧光强度，评价化疗药物对AlpcS4细胞内荧光强度的影响。利用单态氧检测试剂SOSGR检测结合体的单态氧产量，利用DCFH-DA检测ROS浓度验证化疗药物对光敏剂单态氧产量的影响以及有毒物质ROS物质的影响。利用Hoechst33258进行细胞凋亡检测，评价结合体协同化疗药物对细胞凋亡通路的影响。结果参见图9，其中(a)为AlpcS4联合VCR协同作用灭活胃癌细胞效果图，(b)为AlpcS4联合MMC协同作用灭活胃癌细胞效果图，(c)为AlpcS4联合CDDP协同作用灭活胃癌细胞效果图，(d)为AlpcS4联合ApoG2协同作用灭活胃癌细胞效果图。结合体与低剂量的常规胃癌化疗药物CDDP，MMC，VCR联合作用于胃癌细胞，细胞活性明显降低，细胞凋亡率都有明显增加的同时显著降低了药物毒性。
11、结合体联合非小分子BCl-2抑制剂ApoG2对胃癌细胞灭活效果：将不同浓度的ApoG2加入铺有SGC-7901胃癌细胞的96孔板中干预4h，PBS清洗后换新鲜培养液继续培养24h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，放回培养箱继续培养1h,最后在酶标仪上490nm处读出各孔的OD值，实验重复3次，计算细胞存活率。将存活率在50％左右的ApoG2药物浓度作为协同作用使用浓度与不同浓度的结合体同时加入铺有SGC-7901胃癌细胞的96孔板中干预4h，PBS清洗后换新鲜培养液继续培养24h后，利用CCK-8进行协同效应评价。将ApoG2与不同浓度的结合体同时加入铺有SGC-7901胃癌细胞的6孔板中，放回培养箱继续培养4h，PBS清洗后胰酶消化离心去上清，用PBS重悬，在荧光分光光度计上测细胞内AlpcS4的荧光强度，评价ApoG2对AlpcS4细胞内荧光强度的影响。利用单态氧检测试剂SOSGR检测结合体的单态氧产量，利用DCFH-DA检测ROS浓度验证ApoG2对光敏剂单态氧产量的影响以及有毒物质ROS物质的影响。利用Hoechst33258进行细胞凋亡检测，评价结合体协同ApoG2对细胞凋亡通路的影响。结果显示结合体与ApoG2联合后也会促进细胞杀伤效果，改善细胞毒性，因此结合体与化疗药物联合是解决AlpcS4光动力治疗效果不好的有效解决方案。
综上所述，本发明改善了原有金纳米棒先PEG化在连接短肽最后偶合AlpcS4的串联方式，先将短肽或者多肽修饰到PEG上，然后与金纳米棒连接，将金纳米棒与短肽或者多肽修饰的PEG混合物最后以并联的方式与AlpcS4偶联，可有效的提高金纳米棒的稳定性和载药效率。

Claims (6)

1.一种靶向PEG修饰的金纳米棒与光敏剂AlpcS4偶联的结合体，其特征在于，包括靶向PEG修饰的金纳米棒和光敏剂AlPcS4；其中，靶向PEG修饰的金纳米棒为表面通过HS-PEG-COOH修饰的金纳米棒，HS-PEG-COOH的羧基通过酰胺键与多肽或短肽连接，所述多肽或短肽为带有正电性的多肽或短肽；
光敏剂AlPcS4通过静电吸附到靶向PEG修饰的金纳米棒表面；
靶向PEG修饰的金纳米棒表面的等离子共振峰为750~850nm；
所述多肽为RRLAC多肽，短肽为GX1短肽；
所述靶向PEG修饰的金纳米棒与光敏剂AlpcS4偶联的结合体由以下方法制成：
1）采用金种子生长法制备金纳米棒；制备羧基通过多肽或者短肽修饰的HS-PEG-COOH；
2）制备PEG修饰的金纳米棒；
3）制备靶向PEG修饰的金纳米棒与光敏剂AlpcS4偶联的结合体；
在步骤1）中，制备羧基通过多肽或者短肽修饰的HS-PEG-COOH的方法为：HS-PEG-NHS与多肽或者短肽在溶剂中发生缩合反应，其中，按照摩尔量计，HS-PEG-NHS：多肽/短肽=1：（0.025~0.8）；
在步骤3）中，将通过多肽或者短肽修饰的HS-PEG-COOH与金纳米棒在溶剂中发生免疫反应，其中，按照摩尔量计，HS-PEG-COOH：金纳米棒=500：（1~20）；然后将AlPcS4溶液加入到HS-PEG-COOH与金纳米棒反应的混合液中，搅拌4~12小时，利用葡聚糖凝胶层析柱分离，制得靶向PEG修饰的金纳米棒与光敏剂AlpcS4偶联的结合体AuNR-PEG-AlpcS4。
2.权利要求1所述的靶向PEG修饰的金纳米棒与光敏剂AlpcS4偶联的结合体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）采用金种子生长法制备金纳米棒；制备羧基通过多肽或者短肽修饰的HS-PEG-COOH；
2）制备PEG修饰的金纳米棒；
3）制备靶向PEG修饰的金纳米棒与光敏剂AlpcS4偶联的结合体；
在步骤1）中，制备羧基通过多肽或者短肽修饰的HS-PEG-COOH的方法为：HS-PEG-NHS与多肽或者短肽在溶剂中发生缩合反应，其中，按照摩尔量计，HS-PEG-NHS：多肽/短肽=1：（0.025~0.8）；
在步骤3）中，将通过多肽或者短肽修饰的HS-PEG-COOH与金纳米棒在溶剂中发生免疫反应，其中，按照摩尔量计，HS-PEG-COOH：金纳米棒=500：（1~20）；然后将AlPcS4溶液加入到HS-PEG-COOH与金纳米棒反应的混合液中，搅拌4~12小时，利用葡聚糖凝胶层析柱分离，制得靶向PEG修饰的金纳米棒与光敏剂AlpcS4偶联的结合体AuNR-PEG-AlpcS4。
3.如权利要求2所述的靶向PEG修饰的金纳米棒与光敏剂AlpcS4偶联的结合体的制备方法，其特征在于，在步骤1）中，采用金种子生长法制备金纳米棒的方法包括以下步骤：
1-1）制备金种子溶液：将CTAB水溶液与HAuCl4的水溶液相混合，在搅拌条件下，向混合溶液中加入硼氢化钠水溶液，并搅拌1~5分钟；静置，得金种子溶液；
1-2）制备生长液：向CTAB水溶液中加入HAuCl4水溶液，随后依次加入AgNO3水溶液、维生素C溶液和1%的盐酸，制得生长液；
1-3）制备金纳米棒：将金种子溶液加入到生长液中，反应12~14小时；
1-4）分离金纳米棒：将1-3）反应液离心去除上清液，得金纳米棒。
4.权利要求1所述的靶向PEG修饰的金纳米棒与光敏剂AlpcS4偶联的结合体在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为癌症。
6.一种抗肿瘤组合物，其特征在于，由VCR、MMC、CDDP或ApoG2与权利要求1所述的靶向PEG修饰的金纳米棒与光敏剂AlpcS4偶联的结合体组成；
其中，按质量比，VCR：结合体中的AlpcS4=1：（5-160），MMC：结合体中的AlpcS4=1：（1-32）；按摩尔比，CDDP：结合体中的AlpcS4=1：（1-4），ApoG2：结合体中的AlpcS4=1：（1-4）。
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