CN116041712B - 原卟啉修饰纤维素接枝聚乳酸及其肿瘤靶向立构复合载药纳米胶束和它们的制备方法与应用 - Google Patents

原卟啉修饰纤维素接枝聚乳酸及其肿瘤靶向立构复合载药纳米胶束和它们的制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开的原卟啉修饰纤维素接枝聚乳酸的结构通式如下：

Description

原卟啉修饰纤维素接枝聚乳酸及其肿瘤靶向立构复合载药纳 米胶束和它们的制备方法与应用
技术领域
本发明属于聚乳酸共聚物及其立构复合载药纳米胶束和制备方法与应用技术领域，具体涉及一种原卟啉修饰纤维素接枝聚乳酸、用其制备的含原卟啉修饰纤维素接枝聚乳酸的立构复合载药纳米胶束以及它们的制备方法与应用。
背景技术
癌症，是严重危害人类健康的全球性重大疾病。目前传统治疗癌症的方法主要包括手术切除、放射性疗法、化学疗法等。手术切除是通过直接切除肿瘤组织，临床上一般用于治疗实体肿瘤，治疗效果显著，但对于恶性、扩散性的肿瘤，单纯的手术切除是没有办法达到完全切除，且极易复发。放射性疗法是指用各种不同种类的射线照射肿瘤,以灭杀或抑制过度增殖的癌细胞的一种治疗方法，但是放射线杀灭癌细胞的效果受到组织敏感性，肿瘤含氧水平的影响，且肿瘤本身对化疗不敏感时不宜使用放射治疗。化学疗法是指通过化学药物进入血液和肿瘤组织来杀伤肿瘤细胞，其是目前是最常用的手段之一。但传统的化疗药物存在毒性大，选择性差，副作用强等问题，这是目前化疗患者的主要死亡原因。
近年来随着精准医学的发展，光动力疗法(Photodynamic therapy,PDT)因为能对肿瘤病灶部位进行局部选择性治疗，可以精准调控治疗部位而受到广泛关注。PDT是通过光敏剂聚集在肿瘤组织后，用特定波长的光照射肿瘤部位，其中的光敏剂吸收光子能量后部分电子被激发，受激发的光敏剂将能量传递给氧气，从而生成一些活性氧簇(radicaloxygen species,ROS)。ROS通过氧化作用来攻击细胞结构，造成细胞膜或蛋白的氧化损伤，当氧化损伤的积累到达一定程度时就能产生杀伤癌细胞的作用。但是由于光毒性，PDT能否精准靶向肿瘤部位避免正常组织的损伤也是其实际应用中的挑战。此外，PDT效果也受到肿瘤部位对ROS氧化损伤防御机制的影响。虽然卟啉类光敏剂由于具有强的单线氧产生效率及良好的荧光特性，是被广泛运用于光动力中的一类光敏剂，然而，由于卟啉的疏水性及刚性平面结构可以在水溶液中通过π-π堆积作用产生聚集，造成荧光淬灭及ROS生成减少，削弱了PDT的效率。有研究(H.Ding,B.D.Sumer,C.W.Kessinger,Y.Dong,G.Huang,D.A.Boothman,J.Gao,J.Control Release 2011,151,271.)报道将卟啉包载进入纳米载体中虽然可以提高卟啉的水溶性，但是也因为单纯的装载增加了卟啉的聚集，甚至更加剧了卟啉的荧光淬灭并减少了ROS的产生，影响了疗效。
发明内容
本发明首要的目的是为了解决以上技术问题，提供一种原卟啉修饰纤维素接枝聚乳酸。
本发明的另一目的是提供一种上述原卟啉修饰纤维素接枝聚乳酸的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种采用上述原卟啉修饰纤维素接枝聚乳酸制备立构复合载药纳米胶束的方法。
本发明的第四个目的是提供一种由上述方法制备的原卟啉修饰纤维素接枝聚乳酸立构复合载药纳米胶束。
本发明的第五个目的是提供一种上述立构复合载药纳米胶束的应用。
本发明提供的原卟啉修饰纤维素接枝聚乳酸的结构通式如下：
其中R＝H、且H的数量≥1，/>的数量≥1，/>的数量≥1；a为纤维素的重复单元数量且≥1，n为丙交酯的结构单元数量且≥1。
本发明提供的制备上述原卟啉修饰纤维素接枝聚乳酸的方法，该方法的工艺步骤和条件如下：
(1)将羰基二咪唑与原卟啉按摩尔比1～4：4～1加入有机溶剂中溶解，并于60～80℃下搅拌活化反应15～60分钟；
(2)在氮气保护下，先将纳米晶纤维素按质量分数为5～8％溶解在离子液体中，并于70～90℃下搅拌溶解，然后加入活化后的原卟啉继续反应12～24小时，之后将反应液滴加到无水乙醇中进行醇沉，分离、真空干燥即得原卟啉修饰的纳米晶纤维素(PpIX-NCC)；
(3)氮气保护下，先将原卟啉修饰的纳米晶纤维素与右旋丙交酯或左旋丙交酯按摩尔比1：10～1：20搅拌加入离子液体中至完全溶解，然后按原卟啉修饰的纳米晶纤维素骨架上羟基含量的0.25～2倍加入催化剂二甲氨基吡啶(DMAP)，于60～80℃下搅拌反应12-24小时，将反应液倒入纯水中沉析出，沉析物用有机溶剂溶解后用水透析至无有机溶剂残留，冻干即可得到纯化后的原卟啉修饰纤维素接枝右旋聚乳酸(PpIX-NCC-PDLA)或原卟啉修饰纤维素接枝左旋聚乳酸(PpIX-NCC-PLLA)。
以上方法中所用的纳米晶纤维素是参见文献(P.Ma,T.Shen,L.Lin,W.Dong,M.Chen,Carbohydr.Polym.2017，155，498-506.)所披露的方法进行制备的。
以上方法中所用的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃中的任一种，优选N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜。
以上方法中所用的离子液体为氯代1-烯丙基-3-甲基咪唑(Amim Cl)或氯代1-丁基-3-甲基咪唑(Bmim Cl)。
本发明提供的一种用上述原卟啉修饰纤维素接枝聚乳酸制备立构复合载药纳米胶束的方法，该方法的具体工艺步骤和条件如下：
(1)先将原卟啉修饰纤维素接枝左旋聚乳酸、叶酸修饰的聚乙二醇-右旋聚乳酸嵌段共聚物或原卟啉修饰纤维素接枝右旋聚乳酸、叶酸修饰的聚乙二醇-左旋聚乳酸嵌段共聚物按质量比1～4:4～1溶解在溶剂中，配成5～20mg/ml的共聚物溶液，然后将化疗药物a和抗肿瘤药物b按照各自与共聚物质量比0.08～0.11加入到上述溶液中混合溶解，得到同时含有共聚物和药物a和药物b的油相。
(2)将步骤(1)得到的油相在搅拌下按体积比1：10～20向水相中缓慢滴加，滴加完后于室温下以300～600rpm再持续搅拌20～60分钟，以促进胶束形成，水相为PBS磷酸盐缓冲液；
(3)将搅拌后收集到的溶液装入截留分子量为1000Da的透析袋中，在PBS磷酸盐缓冲液中透析，除去游离药物以及溶剂后即得到分散性良好，粒度均一的原卟啉修饰纤维素接枝聚乳酸共聚物的立构复合载药纳米胶束溶液。
上述方法中所用的叶酸修饰的聚乙二醇-右旋聚乳酸嵌段共聚物和叶酸修饰的聚乙二醇-左旋聚乳酸嵌段共聚物均为市购。
上述方法中所用的溶剂为正己醇、二甲基亚砜、四氢呋喃或N,N-二甲基甲酰胺中任一种，优选为二甲基亚砜和四氢呋喃。
上述方法中所述化疗药物a为阿霉素(DOX)、多西他赛(DTX)、紫杉醇或喜树碱中任一种；所述抗肿瘤药物b为MTH1蛋白抑制剂TH588或TH287。
上述方法制备的原卟啉修饰纤维素接枝聚乳酸共聚物的立构复合载药纳米胶束，以下简称“立构复合载药纳米胶束”。
本发明提供的一种由上述方法用原卟啉修饰纤维素接枝聚乳酸制备的立构复合载药纳米胶束，该胶束的平均粒径为120～190nm，形貌为规整球形，能有效靶向肿瘤细胞促进肿瘤细胞的摄取，4小时内小鼠乳腺癌细胞4T1对立构复合载药胶束的摄取率为99.80％；该立构复合载药纳米胶束在浓度500μg/ml下经光照后能将小鼠乳腺癌细胞4T1，小鼠黑色素瘤细胞B16F10和人卵巢癌细胞SKOV3的细胞活性均下降至20％以下；与未经叶酸修饰的立构复合纳米胶束相比ROS产生能力提升了2.6倍，光照处理部分的4T1细胞死亡率达到100％，小鼠4T1肿瘤模型显示立构复合载药胶束光照后的抑瘤率为96.8％。
本发明提供的上述立构复合载药纳米胶束的应用，其特征在于该应用是将立构复合载药纳米胶束用于装载化疗药物向体内靶向递送。
本发明与现有技术相比，具有以下积极效果：
1、由于本发明提供的立构复合载药纳米胶束属于纳米药物递送系统，因而不仅能在一定程度上增加光敏剂的溶解性，还能提高其在肿瘤部位的蓄积，以在光照的作用下产生大量ROS，使其与化疗药物一起产生协同抗肿瘤效果。
2、由于本发明提供的立构复合载药纳米胶束是将原卟啉修饰纤维素接枝的左或右旋聚乳酸与叶酸修饰的聚乙二醇-右或左旋聚乳酸嵌段共聚物形成的两亲性立构复合物和化疗药物制备而成，其中的两亲性高分子在水溶液中经过疏水-疏水相互作用，可将疏水结构聚集缠绕形成疏水核心，而将亲水性部分分布在疏水核外周形成亲水壳层来形成纳米颗粒，而中间的聚乳酸立构复合疏水核心因可通过疏水基团的相互作用、氢键、电荷的相互作用以及范德华力等形成紧密的内核，增强分子间的相互作用，从而使结构更加稳定，进一步可将水溶性差的药物包裹在疏水核中，因而可提高药物的水溶性，降低毒副作用，延长循环时间，完成体内药物递送。
3、由于本发明提供的立构复合载药纳米胶束中含有MTH1抑制剂，因而不仅削弱了给药部位肿瘤的氧化应激防御系统，增加了肿瘤细胞对ROS的敏感性，提高了ROS对肿瘤的杀伤效果，且在避免对周围正常组织产生的过度氧化刺激的同时也提升了光动力治疗的效果，达到协同增效的目的。
4、由于本发明提供的立构复合载药纳米胶束中采用直接将原卟啉修饰到纳米晶纤维素表面进而与聚乙二醇部分形成亲水性外壳，因而避免了直接将原卟啉包封于胶束内部，使得原卟啉的光敏特性得到一定程度的保护，避免了过度的荧光聚集淬灭效应。
5、由于本发明提供的立构复合载药纳米胶束表面所含有的叶酸分子和内部的化疗药物，因而使该胶束能精确稳定地靶向肿瘤细胞，实现安全高效的抗肿瘤效果，同时表现出明显增强的肿瘤摄取效果，ROS产生效率和抗肿瘤效果，是一种安全有效的新型抗肿瘤纳米制剂。
6、由于本发明提供的不管是原卟啉修饰纤维素接枝聚乳酸的制备方法，还是用其制备立构复合载药纳米胶束的方法的工艺均很简单、成熟，且操作也很简便，因而易于控制与产业化。
附图说明
图1为本发明实施例2制备的原卟啉修饰纤维素接枝右旋聚乳酸的核磁氢谱。
图2为傅里叶红外扫描图谱，其中A为右旋聚乳酸修饰的纤维素(NCC-PDLA)的红外扫描谱线，B为原卟啉的红外扫描谱线，C为本发明实施例2制备的原卟啉修饰纤维素接枝右旋聚乳酸的红外扫描谱线。由图中可以看出原卟啉修饰纤维素接枝右旋聚乳酸中同时有NCC-PDLA和原卟啉的吸收峰，证实原卟啉修饰纤维素接枝右旋聚乳酸已被成功合成。
图3为本发明实施例1制备的立构复合载药纳米胶束的形态表征：A为胶束的透射电镜照片；B为胶束的动态粒径及其分布图。从图中可以看到该胶束粒径均匀，平均粒径为139.7±2.3nm，形貌为规整球形。
图4为本发明实施例3制备的立构复合载药纳米胶束和对比例1制备的空白胶束的X射线衍射图谱。从X射线衍射图谱对比可以看到，对比例1制备的空白胶束由于只含有纯的右旋聚乳酸链段，因此仅呈现出同质结晶特征，而本发明实施例3制备的胶束则显示出有明显的立构复合结晶(SC)的特征峰，说明胶束制备过程中能自组装形成立构复合纳米胶束。
图5为在不同光照强度和时间下本发明实施例1制备的立构复合载药纳米胶束、对比例2及对比例3制备的胶束以及水的ROS产生情况曲线图。从曲线的荧光强度对比可见，实施例1制备的含有叶酸修饰的立构复合载药纳米胶束相比对比例2没有叶酸修饰的立构复合纳米胶束能产生更多的ROS。
图6为用流式细胞术检测的本发明实施例2、对比例2、对比例3制备的立构复合纳米胶束对小鼠乳腺癌细胞4T1的摄取效果图，以未经胶束给药处理组为对照组。由图中的流式结果可知经胶束处理4小时后，4T1细胞对含叶酸修饰的立构复合载药纳米胶束的摄取比不含叶酸修饰的立构复合载药纳米胶束更多。
图7为本发明实施例2制备的立构复合载药纳米胶束与小鼠乳腺癌细胞(4T1)孵育后进行的MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)检测，对细胞生长情况进行评估的测试结果柱状图，以生理盐水处理组为对照组。结果表明经光动力治疗之后随着胶束浓度上升，肿瘤细胞的生长受到了明显抑制。
图8为本发明实施例3制备的立构复合载药纳米胶束与小鼠黑色素瘤细胞(B16F10)孵育后进行的MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)检测，对细胞生长情况进行评估的测试结果柱状图，以生理盐水处理组为对照组。结果表明经光动力治疗之后随着胶束浓度上升，肿瘤细胞的生长受到了明显抑制。
图9为本发明中是实施例4制备的立构复合载药纳米胶束与人卵巢癌细胞(SKOV3)孵育后进行的MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)检测，对细胞生长情况进行评估的测试结果柱状图，以生理盐水处理组为对照组。结果表明经光动力治疗之后随着胶束浓度上升，肿瘤细胞的生长受到了明显抑制。
图10为本发明实施例3制备的立构复合载药纳米胶束、对比例3制备的空白胶束和未经胶束给药处理的对照组与4T1细胞孵育并经光照后的活死细胞荧光图。由图中可以看出，经光照后4T1细胞在光动力治疗下出现明显的死亡，并且载药之后的立构复合纳米胶束因化疗药与光动力治疗的协同治疗效果呈现出更加明显的细胞死亡。
图11为通过静脉注射本发明实施例3制备的立构复合载药纳米胶束后经光照或不经光照以及对比例3制备的空白胶束和生理盐水对照组对4T1乳腺癌细胞荷瘤balb/c小鼠肿瘤的抑制实验中肿瘤生长曲线。从图中可见对比例3制备的空白胶束经光照后由于产生的光动力治疗能明显抑制肿瘤生长，而实施例3制备的立构复合载药纳米胶束由于光动力治疗和化疗的协同作用，呈现出更强的肿瘤抑制效果。
具体实施方式
下面给出实施例以对本发明的上述内容作进一步的详细说明，有必要在此指出的是，以下实施例只对于本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述本发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
值得说明的是：1)以下实施例所得的胶束的X射线衍射图谱是用荷兰PANalytical公司的X射线衍射仪测得的；动态粒径分布是用马尔文激光粒度仪测得的；胶束的形貌表征是用美国FEI透射电子显微镜测得的。2)以下实施例所用的叶酸修饰的聚乙二醇-左旋聚乳酸嵌段共聚物购自西安凯新生物科技有限公司，所用的叶酸修饰的聚乙二醇-右旋聚乳酸嵌段共聚物购自湖南华腾制药有限公司。3)以下实施例所用的水相均为浓度10mM、pH 7.4的PBS磷酸盐缓冲液。4)以下实施例给出的立构复合载药胶束的粒径是通过马尔文粒度测定仪测定的。
实施例1
(1)将羰基二咪唑与原卟啉按摩尔比1：4加入N,N-二甲基甲酰胺中溶解，并于60℃下搅拌活化反应15分钟；在氮气保护下，先将纳米晶纤维素按质量分数为5％溶解在离子液体Amim Cl中，并于80℃下搅拌溶解，然后加入活化后的原卟啉继续反应12小时，继后将反应液滴加到无水乙醇中进行醇沉，分离、真空干燥即得原卟啉修饰的纳米晶纤维素(PpIX-NCC)；氮气保护下，先将原卟啉修饰的纳米晶纤维素与右旋丙交酯按摩尔比1：15搅拌加入离子液体Amim Cl中至完全溶解，然后按原卟啉修饰的纳米晶纤维素骨架上羟基含量的0.5倍加入催化剂二甲氨基吡啶(DMAP)，于60℃下搅拌反应12小时，将反应液倒入纯水中沉析出，沉析物用N,N-二甲基甲酰胺溶解后用水透析至无N,N-二甲基甲酰胺残留，冻干即可得到纯化后的原卟啉修饰纤维素接枝右旋聚乳酸(PpIX-NCC-PDLA)。
(2)先将原卟啉修饰纤维素接枝右旋聚乳酸、叶酸修饰的聚乙二醇-左旋聚乳酸嵌段共聚物按质量比1：4溶解在二甲基亚砜中，配成10mg/ml的共聚物溶液，然后将紫杉醇和TH287分别按照与共聚物质量比0.1和0.11加入到上述溶液中混合溶解，得到同时含有共聚物、紫杉醇和TH287的油相；将得到的油相在搅拌下按体积比1：10向水相中缓慢滴加，滴加完后于室温下以400rpm再持续搅拌20分钟，以促进胶束形成，水相为PBS磷酸盐缓冲液；将搅拌后收集到的溶液装入截留分子量为1000Da的透析袋中，在PBS磷酸盐缓冲液中透析，除去游离药物以及溶剂后即得到分散性良好，平均粒径为164.7±2.3nm的立构复合载药纳米胶束。
实施例2
(1)将羰基二咪唑与原卟啉按摩尔比1：1加入二甲基亚砜中溶解，并于80℃下搅拌活化反应30分钟；在氮气保护下，先将纳米晶纤维素按质量分数为8％溶解在离子液体BmimCl中，并于70℃下搅拌溶解，然后加入活化后的原卟啉继续反应18小时，继后将反应液滴加到无水乙醇中进行醇沉，分离、真空干燥即得原卟啉修饰的纳米晶纤维素(PpIX-NCC)；氮气保护下，先将原卟啉修饰的纳米晶纤维素与右旋丙交酯按摩尔比1：10搅拌加入离子液体Bmim Cl中至完全溶解，然后按原卟啉修饰的纳米晶纤维素骨架上羟基含量的0.25倍加入催化剂二甲氨基吡啶(DMAP)，于70℃下搅拌反应18小时，将反应液倒入纯水中沉析出，沉析物用二甲基亚砜溶解后用水透析至无二甲基亚砜残留，冻干即可得到纯化后的原卟啉修饰纤维素接枝右旋聚乳酸(PpIX-NCC-PDLA)。
(2)先将原卟啉修饰纤维素接枝右旋聚乳酸、叶酸修饰的聚乙二醇-左旋聚乳酸嵌段共聚物按质量比1：1溶解在四氢呋喃中，配成5mg/ml的共聚物溶液，然后将多西他赛和TH588分别按照与共聚物质量比0.09和0.11加入到上述溶液中混合溶解，得到同时含有共聚物、多西他赛和TH588的油相；将得到的油相在搅拌下按体积比1：15向水相中缓慢滴加，滴加完后于室温下以300rpm再持续搅拌40分钟，以促进胶束形成，水相为PBS磷酸盐缓冲液；将搅拌后收集到的溶液装入截留分子量为1000Da的透析袋中，在PBS磷酸盐缓冲液中透析，除去游离药物以及溶剂后即得到分散性良好，粒径为187.8±3.4nm的立构复合载药纳米胶束。
实施例3
(1)将羰基二咪唑与原卟啉按摩尔比4：1加入二甲基亚砜中溶解，并于70℃下搅拌活化反应60分钟；在氮气保护下，先将纳米晶纤维素按质量分数为7％溶解在离子液体AmimCl中，并于90℃下搅拌溶解，然后加入活化后的原卟啉继续反应24小时，继后将反应液滴加到无水乙醇中进行醇沉，分离、真空干燥即得原卟啉修饰的纳米晶纤维素(PpIX-NCC)；氮气保护下，先将原卟啉修饰的纳米晶纤维素与左旋丙交酯按摩尔比1：20搅拌加入离子液体Amim Cl中至完全溶解，然后按原卟啉修饰的纳米晶纤维素骨架上羟基含量的1倍加入催化剂二甲氨基吡啶(DMAP)，于80℃下搅拌反应24小时，将反应液倒入纯水中沉析出，沉析物用二甲基亚砜溶解后用水透析至无二甲基亚砜残留，冻干即可得到纯化后的原卟啉修饰纤维素接枝右旋聚乳酸(PpIX-NCC-PLLA)。
(2)先将原卟啉修饰纤维素接枝左旋聚乳酸、叶酸修饰的聚乙二醇-右旋聚乳酸嵌段共聚物按质量比4：1溶解在二甲基亚砜中，配成20mg/ml的共聚物溶液，然后将阿霉素和TH588分别按照与共聚物质量比0.09和0.11加入到上述溶液中混合溶解，得到同时含有共聚物、阿霉素和TH588的油相；将得到的油相在搅拌下按体积比1：20向水相中缓慢滴加，滴加完后于室温下以600rpm再持续搅拌60分钟，以促进胶束形成，水相为PBS磷酸盐缓冲液；将搅拌后收集到的溶液装入截留分子量为1000Da的透析袋中，在PBS磷酸盐缓冲液中透析，除去游离药物以及溶剂后即得到分散性良好，粒径为121.7±2.8nm的立构复合载药纳米胶束。
实施例4
(1)将羰基二咪唑与原卟啉按摩尔比1：2加入N,N-二甲基甲酰胺中溶解，并于65℃下搅拌活化反应40分钟；在氮气保护下，先将纳米晶纤维素按质量分数为7％溶解在离子液体Amim Cl中，并于75℃下搅拌溶解，然后加入活化后的原卟啉继续反应15小时，继后将反应液滴加到无水乙醇中进行醇沉，分离、真空干燥即得原卟啉修饰的纳米晶纤维素(PpIX-NCC)；氮气保护下，先将原卟啉修饰的纳米晶纤维素与左旋丙交酯按摩尔比1：10搅拌加入离子液体Bmim Cl中至完全溶解，然后按原卟啉修饰的纳米晶纤维素骨架上羟基含量的2倍加入催化剂二甲氨基吡啶(DMAP)，于65℃下搅拌反应16小时，将反应液倒入纯水中沉析出，沉析物用二甲基亚砜溶解后用水透析至无二甲基亚砜残留，冻干即可得到纯化后的原卟啉修饰纤维素接枝右旋聚乳酸(PpIX-NCC-PLLA)。
(2)先将原卟啉修饰纤维素接枝左旋聚乳酸、叶酸修饰的聚乙二醇-右旋聚乳酸嵌段共聚物按质量比2：1溶解在四氢呋喃中，配成15mg/ml的共聚物溶液，然后将喜树碱和TH287分别按照与共聚物质量比0.08和0.08加入到上述溶液中混合溶解，得到同时含有共聚物、喜树碱和TH287的油相；将得到的油相在搅拌下按体积比1：12向水相中缓慢滴加，滴加完后于室温下以600rpm再持续搅拌30分钟，以促进胶束形成，水相为PBS磷酸盐缓冲液；将搅拌后收集到的溶液装入截留分子量为1000Da的透析袋中，在PBS磷酸盐缓冲液中透析，除去游离药物以及溶剂后即得到分散性良好，粒径为132.8±3.1nm的立构复合载药纳米胶束。
实施例5
(1)将羰基二咪唑与原卟啉按摩尔比3：2加入N,N-二甲基甲酰胺中溶解，并于75℃下搅拌活化反应20分钟；在氮气保护下，先将纳米晶纤维素按质量分数为7％溶解在离子液体Amim Cl中，并于85℃下搅拌溶解，然后加入活化后的原卟啉继续反应20小时，继后将反应液滴加到无水乙醇中进行醇沉，分离、真空干燥即得原卟啉修饰的纳米晶纤维素(PpIX-NCC)；氮气保护下，先将原卟啉修饰的纳米晶纤维素与左旋丙交酯按摩尔比1：12搅拌加入离子液体Amim Cl中至完全溶解，然后按原卟啉修饰的纳米晶纤维素骨架上羟基含量的0.8倍加入催化剂二甲氨基吡啶(DMAP)，于75℃下搅拌反应20小时，将反应液倒入纯水中沉析出，沉析物用N,N-二甲基甲酰胺溶解后用水透析至无N,N-二甲基甲酰胺残留，冻干即可得到纯化后的原卟啉修饰纤维素接枝左旋聚乳酸(PpIX-NCC-PLLA)。
(2)先将原卟啉修饰纤维素接枝左旋聚乳酸、叶酸修饰的聚乙二醇-右旋聚乳酸嵌段共聚物按质量比3：2溶解在二甲基亚砜中，配成18mg/ml的共聚物溶液，然后将喜树碱和TH588分别按照与共聚物质量比0.1和0.09加入到上述溶液中混合溶解，得到同时含有共聚物、喜树碱和TH588的油相；将得到的油相在搅拌下按体积比1：18向水相中缓慢滴加，滴加完后于室温下以500rpm再持续搅拌50分钟，以促进胶束形成，水相为PBS磷酸盐缓冲液；将搅拌后收集到的溶液装入截留分子量为1000Da的透析袋中，在PBS磷酸盐缓冲液中透析，除去游离药物以及溶剂后即得到分散性良好，平均粒径为145.4±4.3nm的立构复合载药纳米胶束。
实施例6
(1)将羰基二咪唑与原卟啉按摩尔比2：3加入N,N-二甲基甲酰胺中溶解，并于60℃下搅拌活化反应50分钟；在氮气保护下，先将纳米晶纤维素按质量分数为5％溶解在离子液体Bmim Cl中，并于70℃下搅拌溶解，然后加入活化后的原卟啉继续反应14小时，继后将反应液滴加到无水乙醇中进行醇沉，分离、真空干燥即得原卟啉修饰的纳米晶纤维素(PpIX-NCC)；氮气保护下，先将原卟啉修饰的纳米晶纤维素与右旋丙交酯按摩尔比1：18搅拌加入离子液体Bmim Cl中至完全溶解，然后按原卟啉修饰的纳米晶纤维素骨架上羟基含量的1.2倍加入催化剂二甲氨基吡啶(DMAP)，于80℃下搅拌反应14小时，将反应液倒入纯水中沉析出，沉析物用N,N-二甲基甲酰胺溶解后用水透析至无N,N-二甲基甲酰胺残留，冻干即可得到纯化后的原卟啉修饰纤维素接枝右旋聚乳酸(PpIX-NCC-PDLA)。
(2)先将原卟啉修饰纤维素接枝右旋聚乳酸、叶酸修饰的聚乙二醇-左旋聚乳酸嵌段共聚物按质量比2：3溶解在二甲基亚砜中，配成12mg/ml的共聚物溶液，然后将多西他赛和TH287分别按照与共聚物质量比0.11和0.1加入到上述溶液中混合溶解，得到同时含有共聚物、多西他赛和TH287的油相；将得到的油相在搅拌下按体积比1：16向水相中缓慢滴加，滴加完后于室温下以450rpm再持续搅拌45分钟，以促进胶束形成，水相为PBS磷酸盐缓冲液；将搅拌后收集到的溶液装入截留分子量为1000Da的透析袋中，在PBS磷酸盐缓冲液中透析，除去游离药物以及溶剂后即得到分散性良好，平均粒径为154.6±3.8nm的立构复合载药纳米胶束。
对比例1
(1)将羰基二咪唑与原卟啉按摩尔比1：4加入二甲基亚砜中溶解，并于80℃下搅拌活化反应15分钟；在氮气保护下，先将纳米晶纤维素按质量分数为5％溶解在离子液体AmimCl中，并于85℃下搅拌溶解，然后加入活化后的原卟啉继续反应12小时，继后将反应液滴加到无水乙醇中进行醇沉，分离、真空干燥即得原卟啉修饰的纳米晶纤维素(PpIX-NCC)；氮气保护下，先将原卟啉修饰的纳米晶纤维素与右旋丙交酯按摩尔比1：10搅拌加入离子液体Amim Cl中至完全溶解，然后按原卟啉修饰的纳米晶纤维素骨架上羟基含量的0.5倍加入催化剂二甲氨基吡啶(DMAP)，于70℃下搅拌反应18小时，将反应液倒入纯水中沉析出，沉析物用二甲基亚砜溶解后用水透析至无二甲基亚砜残留，冻干即可得到纯化后的原卟啉修饰纤维素接枝右旋聚乳酸(PpIX-NCC-PDLA)。
(2)先将原卟啉修饰纤维素接枝右旋聚乳酸溶解在二甲基亚砜中，配成10mg/ml的共聚物溶液，得到含有共聚物的油相；将得到的油相在搅拌下按体积比1：10向水相中缓慢滴加，滴加完后于室温下以600rpm再持续搅拌20分钟，以促进胶束形成，水相为PBS磷酸盐缓冲液；将搅拌后收集到的溶液装入截留分子量为1000Da的透析袋中，在PBS磷酸盐缓冲液中透析，除去溶剂后即得到分散性良好，粒径为112.8±2.7nm的非立构复合纳米胶束。
对比例2
(1)将羰基二咪唑与原卟啉按摩尔比1:2加入二甲基亚砜中溶解，并于80℃下搅拌活化反应20分钟；在氮气保护下，先将纳米晶纤维素按质量分数为8％溶解在离子液体AmimCl中，并于85℃下搅拌溶解，然后加入活化后的原卟啉继续反应18小时，继后将反应液滴加到无水乙醇中进行醇沉，分离、真空干燥即得原卟啉修饰的纳米晶纤维素(PpIX-NCC)；氮气保护下，先将原卟啉修饰的纳米晶纤维素与左旋丙交酯按摩尔比1：10搅拌加入离子液体Amim Cl中至完全溶解，然后按原卟啉修饰的纳米晶纤维素骨架上羟基含量的0.25倍加入催化剂二甲氨基吡啶(DMAP)，于80℃下搅拌反应18小时，将反应液倒入纯水中沉析出，沉析物用二甲基亚砜溶解后用水透析至无二甲基亚砜残留，冻干即可得到纯化后的原卟啉修饰纤维素接枝右旋聚乳酸(PpIX-NCC-PLLA)。
(2)先将原卟啉修饰纤维素接枝左旋聚乳酸、聚乙二醇-右旋聚乳酸嵌段共聚物按质量比4：1溶解在二甲基亚砜中，配成20mg/ml的共聚物溶液，得到含有共聚物的油相；将得到的油相在搅拌下按体积比1：20向水相中缓慢滴加，滴加完后于室温下以600rpm再持续搅拌20分钟，以促进胶束形成，水相为PBS磷酸盐缓冲液；将搅拌后收集到的溶液装入截留分子量为1000Da的透析袋中，在PBS磷酸盐缓冲液中透析，除去游离药物以及溶剂后即得到分散性良好，粒径为105.7±3.6nm的立构复合纳米胶束。
对比例3
(1)将羰基二咪唑与原卟啉按摩尔比2:1加入二甲基亚砜中溶解，并于70℃下搅拌活化反应60分钟；在氮气保护下，先将纳米晶纤维素按质量分数为7％溶解在离子液体AmimCl中，并于90℃下搅拌溶解，然后加入活化后的原卟啉继续反应24小时，继后将反应液滴加到无水乙醇中进行醇沉，分离、真空干燥即得原卟啉修饰的纳米晶纤维素(PpIX-NCC)；氮气保护下，先将原卟啉修饰的纳米晶纤维素与左旋丙交酯按摩尔比1：20搅拌加入离子液体Amim Cl中至完全溶解，然后按原卟啉修饰的纳米晶纤维素骨架上羟基含量的1倍加入催化剂二甲氨基吡啶(DMAP)，于80℃下搅拌反应24小时，将反应液倒入纯水中沉析出，沉析物用二甲基亚砜溶解后用水透析至无二甲基亚砜残留，冻干即可得到纯化后的原卟啉修饰纤维素接枝右旋聚乳酸(PpIX-NCC-PLLA)。
(2)先将原卟啉修饰纤维素接枝左旋聚乳酸、叶酸修饰聚乙二醇-右旋聚乳酸嵌段共聚物按质量比2：1溶解在二甲基亚砜中，配成20mg/ml的共聚物溶液，得到含有共聚物的油相；将得到的油相在搅拌下按体积比1：15向水相中缓慢滴加，滴加完后于室温下以500rpm再持续搅拌60分钟，以促进胶束形成，水相为PBS磷酸盐缓冲液；将搅拌后收集到的溶液装入截留分子量为1000Da的透析袋中，在PBS磷酸盐缓冲液中透析，除去游离药物以及溶剂后即得到分散性良好，粒径为102.3±2.6nm的立构复合纳米胶束。
对比例4
(1)将羰基二咪唑与原卟啉按摩尔比2：1加入二甲基亚砜中溶解，并于75℃下搅拌活化反应15分钟；在氮气保护下，先将纳米晶纤维素按质量分数为7％溶解在离子液体BmimCl中，并于80℃下搅拌溶解，然后加入活化后的原卟啉继续反应18小时，继后将反应液滴加到无水乙醇中进行醇沉，分离、真空干燥即得原卟啉修饰的纳米晶纤维素(PpIX-NCC)；氮气保护下，先将原卟啉修饰的纳米晶纤维素与右旋丙交酯按摩尔比1：10搅拌加入离子液体Bmim Cl中至完全溶解，然后按原卟啉修饰的纳米晶纤维素骨架上羟基含量的0.25倍加入催化剂二甲氨基吡啶(DMAP)，于75℃下搅拌反应20小时，将反应液倒入纯水中沉析出，沉析物用二甲基亚砜溶解后用水透析至无二甲基亚砜残留，冻干即可得到纯化后的原卟啉修饰纤维素接枝右旋聚乳酸(PpIX-NCC-PDLA)。
(2)先将原卟啉修饰纤维素接枝右旋聚乳酸、叶酸修饰的聚乙二醇-右旋聚乳酸嵌段共聚物按质量比1：1溶解在四氢呋喃中，配成5mg/ml的共聚物溶液，然后将紫杉醇和TH588分别按照与共聚物质量比0.09和0.11加入到上述溶液中混合溶解，得到同时含有共聚物、紫杉醇和TH588的油相；将得到的油相在搅拌下按体积比1：15向水相中缓慢滴加，滴加完后于室温下以400rpm再持续搅拌30分钟，以促进胶束形成，水相为PBS磷酸盐缓冲液；将搅拌后收集到的溶液装入截留分子量为1000Da的透析袋中，在PBS磷酸盐缓冲液中透析，除去游离药物以及溶剂后即得到分散性良好，粒径为176.8±2.5nm的非立构复合载药纳米胶束。
为了考察本发明制备的立构复合载药纳米胶束的基本性能，本发明人对其作了以下测试：
1、体外检测立构复合载药纳米胶束活性氧产生情况
对上述实施例和对比例制备的纳米胶束在光照下产生活性氧(ROS)的情况进行测试。该测试是采用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)为ROS探针，预先使用氢氧化钠将DCFH-DA制备成DCFH，将制备的纳米胶束和DCFH溶液混合，使DCFH终浓度为10μM。用635nm激光分别光照0，1min，3min，5min，10min后检测425nm处的荧光强度，以水为对照记录荧光强度，结果见图5。
2、立构复合载药纳米胶束载药量及包封率检测
精密称取冷冻干燥之后的立构复合载药纳米胶束10mg，用乙腈溶解，超声15min后用乙腈定容至刻度，过0.22μm微孔滤膜，作为待测样品。按照色谱条件测定样品中药物的含量，并按照以下公式计算载药量和包封率，结果见表1。
载药量(％)＝立构复合载药纳米胶束中药物的质量/立构复合载药纳米胶束的总质量×100％包封率(％)＝立构复合载药纳米胶束中药物的质量/投药量×100％
表1.立构复合载药纳米胶束的载药量及包封率检测
3、立构复合载药纳米胶束的稳定性检测
将上述实施例2，对比例3，对比例4制备得到的胶束与小鼠血清等体积混合，使胶束终浓度为1mg/mL，并置于37℃恒温空气摇床中低速振摇，分别于0、2、4、8、12、24小时取样，经化学发光仪测定样品在750nm波长处的透光率，结果见表2。结果显示，对比例3制备得到的立构复合纳米胶束和实施例2制备的立构复合载药纳米胶束在血清中稳定性良好，24小时内没有明显聚集或沉淀形成，透光率均大于90％，而对比例4制备得到的非立构复合载药纳米胶束在孵育24小时内出现了聚集，导致透光率下降至81％。结果表明具有立构复合结构的空白纳米胶束或载药纳米胶束在血清中均具有更好的稳定性，而非立构复合载药纳米胶束的稳定性不如立构复合载药纳米胶束。
表2.立构复合载药纳米胶束在血清中孵育不同时间的透光率
4、立构复合载药纳米胶束的体内外抗肿瘤效果检测
检测例1
将4T1细胞用含有10％胎牛血清的1640培养基培养，接种到24孔板中。取相同浓度的实施例2、对比例2和对比例3的胶束加入孔板，以不用胶束处理的细胞作为对照组。药物作用4小时孵育完毕之后，弃去培养基，PBS清洗3次，加200微升胰酶消化收集细胞，离心并用PBS清洗3次，去上清，用200～300微升PBS重悬，用流式细胞仪检测分析不同时间点细胞摄取含PpIX胶束的含量，结果见图6。结果显示，与对照组相比，含有PpIX的立构复合纳米胶束处理组对4T1肿瘤细胞都有明显的摄取，其中对比例3和实施例2还因为含有叶酸修饰，所以胶束能更好地靶向肿瘤细胞，使4T1细胞摄取胶束效果更显著。
检测例2
将实施例2制得的纳米胶束用细胞培养基梯度稀释成浓度分别为500μg/ml，250μg/ml，125μg/ml,62.5μg/ml,31.25μg/ml的溶液，用于与4T1细胞、B16F10细胞、SKOV3细胞共同孵育，其中培养基为1640培养基加10％胎牛血清，孵育6小时后对每孔细胞进行635nm激光照射5分钟，以同等浓度PBS处理细胞为对照组。培养24小时之后作MTT染色分析，结果见图7。结果显示该立构复合载药纳米胶束对4T1细胞有明显的杀伤作用，且杀伤效果随着浓度增高而增强。
检测例3
将实施例3制得的纳米胶束用细胞培养基梯度稀释成浓度分别为500μg/ml，250μg/ml，125μg/ml,62.5μg/ml,31.25μg/ml的溶液，用于与B16F10细胞共同孵育，其中培养基为1640培养基加10％胎牛血清，孵育6小时后对每孔细胞进行635nm激光照射5分钟，以同等浓度PBS处理细胞为对照组。培养24小时之后作MTT染色分析，结果见图8。结果显示该立构复合载药纳米胶束对B16F10细胞有明显的杀伤作用，且杀伤效果随着浓度增高而增强。
检测例4
将实施例4制得的纳米胶束用细胞培养基梯度稀释成浓度分别为500μg/ml，250μg/ml，125μg/ml,62.5μg/ml,31.25μg/ml的溶液，用于与SKOV3细胞共同孵育，其中培养基为1640培养基加10％胎牛血清，孵育6小时后对每孔细胞进行635nm激光照射5分钟，以同等浓度PBS处理细胞为对照组。培养24小时之后作MTT染色分析，结果见图9。结果显示该立构复合载药纳米胶束对SKOV3细胞有明显的杀伤作用，且杀伤效果随着浓度增高而增强。
检测例5
将乳腺癌细胞4T1均匀铺在24孔板中，用含有10％胎牛血清的1640培养基进行培养，之后将对比例3、实施例3制得的立构复合纳米胶束与细胞共孵育6小时后对每孔细胞施加635nm激光照射5分钟，以未经制剂处理的细胞为对照组。光照之后再培养一小时后吸出培养基，用活/死细胞染色试剂盒对细胞进行染色，其中活细胞为绿色，死细胞为红色，结果见图10。结果显示，未经胶束处理的对照组细胞存活良好，对比例3出现大量死细胞，实施例3中死细胞比例占到100％，表明该立构复合载药纳米胶束经激光照之后具有良好的细胞杀伤效果。且光动力与化疗药达到了良好的协同抗肿瘤作用，杀伤效果达到100％。
检测例6
选取5-6周大的Balb/c雌性小鼠(体重18-22g)，按照喂养标准提供饲料和水。每只于背部皮下接种100μl 4T1细胞(约1×106个细胞)。当肿瘤长到100mm3时，将小鼠随机分为4组(每组5只)，其中包括(1)对照组(注射生理盐水)，(2)实施例3给药不光照组，(3)实施例3给药光照组，(4)对比例3给药加光照组。通过尾静脉给药12小时之后，用635nm激光(200mW/cm2)进行5分钟的光照处理。给药并光照之后每5天记录一次小鼠的肿瘤体积变化并拍照，结果见图11。肿瘤体积根据下列公式计算：
肿瘤体积(mm3)＝0.5×a×b2
其中a代表肿瘤最长径(mm)，b代表肿瘤最短径(mm)。
结果显示，与对照组相比，荷瘤小鼠注射给药实施例3制备的立构复合载药纳米胶束后能在光照之后明显抑制肿瘤生长，肿瘤体积有明显减小，抑瘤率为96.8％，抑瘤率计算公式为：
抑瘤率＝(对照组肿瘤平均体积-实验组肿瘤平均体积)/对照组肿瘤平均体积×100％
表3.不同给药组抑瘤率
MTH1基因是维持肿瘤增殖，存活以及促进肿瘤转移的关键基因，在多种肿瘤细胞中都有高表达，而在正常组织中不是必须的基因。MTH1酶能够保护肿瘤细胞免受ROS造成的氧化损伤，通过抑制MTH1酶的活性，能够破坏肿瘤组织的这种防护机制，放大ROS对肿瘤部位的氧化损伤，提高PDT的疗效，产生协同抗肿瘤效果。

Claims (8)

1.一种原卟啉修饰纤维素接枝聚乳酸，其特征在于该原卟啉修饰纤维素接枝聚乳酸的结构通式如下：
其中R＝H、且H的数量≥1，/>的数量≥1，/>的数量≥1；a为纤维素的重复单元数量且≥1，n为丙交酯的结构单元数量且≥1。
2.一种制备权利要求1所述的原卟啉修饰纤维素接枝聚乳酸的方法，其特征在于该方法的工艺步骤和条件如下：
(1)将羰基二咪唑与原卟啉按摩尔比1～4：4～1加入有机溶剂中溶解，并于60～80℃下搅拌活化反应15～60分钟；
(2)在氮气保护下，先将纳米晶纤维素按质量分数为5～8％溶解在离子液体中，并于70～90℃下搅拌溶解，然后加入活化后的原卟啉继续反应12～24小时，继后将反应液滴加到无水乙醇中进行醇沉，分离、真空干燥即得原卟啉修饰的纳米晶纤维素；
(3)氮气保护下，先将原卟啉修饰的纳米晶纤维素与右旋丙交酯或左旋丙交酯按摩尔比1：10～1：20搅拌加入离子液体中至完全溶解，然后按原卟啉修饰的纳米晶纤维素骨架上羟基含量的0.25～2倍加入催化剂二甲氨基吡啶，于60～80℃下搅拌反应12-24小时，将反应液倒入纯水中沉析出，沉析物用有机溶剂溶解后用水透析至无有机溶剂残留，冻干即可得到纯化后的原卟啉修饰纤维素接枝右旋聚乳酸或原卟啉修饰纤维素接枝左旋聚乳酸。
3.根据权利要求2所述的原卟啉修饰纤维素接枝聚乳酸的制备方法，其特征在于该方法中所用的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃中的任一种；所用的离子液体为氯代1-烯丙基-3-甲基咪唑或氯代1-丁基-3-甲基咪唑。
4.一种采用如权利要求1所述的原卟啉修饰纤维素接枝聚乳酸或根据权利要求2-3任一项所述方法制备得到的原卟啉修饰纤维素接枝聚乳酸制备立构复合载药纳米胶束的方法，其特征在于该方法的具体工艺步骤和条件如下：
(1)先将原卟啉修饰纤维素接枝左旋聚乳酸、叶酸修饰的聚乙二醇-右旋聚乳酸嵌段共聚物或原卟啉修饰纤维素接枝右旋聚乳酸、叶酸修饰的聚乙二醇-左旋聚乳酸嵌段共聚物按质量比1～4:4～1溶解在溶剂中，配成5～20mg/ml的共聚物溶液，然后将化疗药物a和抗肿瘤药物b按照各自与共聚物质量比0.08～0.11加入到上述溶液中混合溶解，得到同时含有共聚物和药物a和药物b的油相；
(2)将步骤(1)得到的油相在搅拌下按体积比1：10～20向水相中缓慢滴加，滴加完后于室温下以300～600rpm再持续搅拌20～60分钟，以促进胶束形成，水相为PBS磷酸盐缓冲液；
(3)将搅拌后收集到的溶液装入截留分子量为1000Da的透析袋中，在PBS磷酸盐缓冲液中透析，除去游离药物以及溶剂后即得到分散性良好，粒度均一的原卟啉修饰纤维素接枝聚乳酸共聚物的立构复合载药纳米胶束溶液。
5.根据权利要求4所述的制备立构复合载药纳米胶束的方法，其特征在于该方法中所用的溶剂为正己醇、二甲基亚砜、四氢呋喃或N,N-二甲基甲酰胺中任一种。
6.根据权利要求4或5所述的制备立构复合载药纳米胶束的方法，其特征在于该方法中，所述化疗药物a为阿霉素、多西他赛、紫杉醇或喜树碱中任一种；所述抗肿瘤药物b为MTH1蛋白抑制剂TH588或TH287。
7.一种由权利要求4所述方法制备的立构复合载药纳米胶束，其特征在于该胶束的平均粒径为120～190nm，形貌为规整球形，能有效靶向肿瘤细胞促进肿瘤细胞的摄取，4小时内小鼠乳腺癌细胞4T1对立构复合载药胶束的摄取率为99.80％；该立构复合载药纳米胶束在浓度500μg/ml下经光照后能将小鼠乳腺癌细胞4T1，小鼠黑色素瘤细胞B16F10和人卵巢癌细胞SKOV3的细胞活性均下降至20％以下；与未经叶酸修饰的立构复合纳米胶束相比ROS产生能力提升了2.6倍，光照处理部分的4T1细胞死亡率达到100％，小鼠4T1肿瘤模型显示立构复合载药胶束光照后的抑瘤率为96.8％。
8.一种权利要求7所述的立构复合载药纳米胶束的应用，其特征在于该应用是将立构复合载药纳米胶束用于装载化疗药物向体内靶向递送。
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