CN109078184B - 负载双药纳米颗粒及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及负载双药纳米颗粒及其制备方法与应用，该负载双药纳米颗粒为水包油包水型的纳米胶束，包含两亲性聚合物PEG‑PPS，疏水性药物和亲水性药物；由两亲性聚合物、疏水性药物、亲水性药物经乳化反应制得。本发明制备方法简单易行，解决了纳米载药体系中亲水性药物和疏水性药物的复配问题，并且通过本发明方法制得的负载双药的纳米颗粒通过体内纳米组合物分布检测，肿瘤组织免疫荧光染色，ATP含量检测，体内ROS活性氧检测，以及抗肿瘤实验等，显示出良好的光动力治疗效果。

Description

负载双药纳米颗粒及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及药物制备技术领域，具体涉及一种负载双药纳米颗粒及其制备方法与应用。
背景技术
光动力治疗作为一种非侵袭性的治疗手段已经被广泛的用于临床研究。通过激光照射，光敏剂将周围的氧气分子变成有毒的活性氧从而杀死肿瘤细胞。然而，由于肿瘤细胞快速的增殖，以及肿瘤组织不规则的脉管系统使得肿瘤组织呈现低氧特征，这对于氧气依赖的光动力治疗具有很大限制。此外，光动力治疗通过直接消耗氧气或者间接破坏肿瘤血管加剧了肿瘤部位的低氧。这反过来又影响了光动力治疗的治疗效率。在低氧情况下，癌症细胞会刺激HIF-1表达并调节一系列的信号级联放大反应来保护癌症细胞避免低氧引起的损伤。低氧诱导因子激活许多存活因子，这些存活因子调节着细胞的每一步新陈代谢。其中低氧诱导因子介导的糖酵解基因的产生对于细胞在低氧环境中的新陈代谢的适应尤为重要，它使得细胞内的葡萄糖代谢从在线粒体中的三羧酸循环变为无氧糖酵解，从而提高ATP的产量来补充低氧的细胞内的能量代谢需求。同时，代谢产生的中间产物能够降低低氧细胞内ROS的含量，保护细胞避免低氧引起的损伤。HIF-1也能够激活一些代谢酶的转录，降低细胞内氧化物的产生，增加抗氧化剂的产生来维持细胞内的氧化还原平衡。低氧作为肿瘤组织中最重要的一项特征，能够驱动癌症组织的入侵和转移。因此，结合抗HIF-1抑制剂与PDT有望通过打破肿瘤组织在低氧环境中的适应性从而提高光动力治疗效果。
强力霉素(Doxy)是一种广谱类的抗生素。Doxy能够抑制果糖二磷酸酶A(ALDOA)的表达从而降低HIF-1的活性。IR780，一种亲脂类阳离子染料，由于它能被近红外光所激活，因此被广泛用作光敏剂。同时，IR780表现出较低的黑暗毒性，较低的光淬灭性能以及较高的光稳定性。IR780与Doxy结合使用也许有希望提高肿瘤的治疗效率。但是，由于两种药物不同的物理化学性质，不同的半衰期，不同的肿瘤聚集含量，简单的将两种药物混合很难获得理想的治疗效果。因此，需要通过一个良好的药物递送体系来有效地递送IR780和Doxy以获得较好的治疗效果。
研究表明成功的药物递送依赖于理想的药物递送体系。理想的药物递送体系具有良好的肿瘤靶向性以及刺激响应的药物释放性能，有助于减小药物的毒副作用，提高药物的治疗效果。由于纳米粒子在肿瘤部位的渗透和滞留效应，基于纳米粒子的药物递送系统能够提高药物的药代动力学并有效聚集到肿瘤部位。癌症细胞中的ROS水平是正常细胞中的十倍以上，ROS刺激已经被广泛的用于癌症治疗。但是由于肿瘤的异质性，ROS介导的药物刺激响应依然有不足。光动力治疗通过时空可控的方式有效地提高了肿瘤细胞中ROS的浓度，因此，光动力辅佐的ROS响应性药物递送体系能够在癌症治疗中获得更加可控的药物释放性能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种负载双药纳米颗粒(也称纳米药物组合物)；本发明还提供该负载双药纳米颗粒的制备方法以及用于，尤其是在制备光动力治疗肿瘤的药物方面的应用。本发明根据两亲性聚合物通过双乳法形成水包油包水的纳米胶束的原理，将亲水性的药物和疏水性的药物分别包载在纳米囊的不同囊层，从而实现亲水性药物与疏水性药物的共递载，解决了纳米药物中亲水性药物与疏水性药物的复配问题。
为达到本发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种负载双药纳米颗粒，为水包油包水型的纳米胶束，包含：两亲性聚合物，疏水性药物和亲水性药物；所述两亲性聚合物为嵌段共聚物PEG-聚硫化丙烯(PPS)。
进一步地，所述负载双药纳米颗粒中，在油相环境中所述两亲性聚合物包裹所述疏水性药物形成纳米胶束；在水相环境中所述疏水性药物与所述两亲性聚合物形成纳米胶束包裹所述亲水药物形成杂合的纳米胶束。本发明将亲水性的药物和疏水性的药物分别包载在纳米囊的不同囊层，从而实现亲水性药物与疏水性药物的共递载。
进一步地，所述负载双药纳米颗粒由所述两亲性聚合物、疏水性药物、亲水性药物经乳化反应制得。
进一步地，所述嵌段共聚物PEG-聚硫化丙烯(简称PEG-PPS)，其PEG分子量范围为1000-5000Da；聚硫化丙烯(PPS)分子量范围为4500-45000Da。
进一步地，所述疏水性药物可选择具有良好光敏效果且水溶性较好的药物，优选IR780。和/或，
进一步地，所述亲水性药物可选择抑制果糖二磷酸酶A(ALDOA)的表达从而降低HIF-1的活性的抗生素，优选强力霉素(Doxy)。本发明研究发现，将强力霉素(Doxy)作为亲水性药物，使用包载亲水性药物的方法对其包载，能够得到良好的包载效果。
在本发明一个具体实施方式中，所述疏水性药物为IR780，所述亲水性药物为强力霉素(Doxy)。
进一步地，上述负载双药纳米颗粒中，所述两亲性聚合物、疏水性药物、亲水性药物的质量比为(10-1000):(1-50):(1-100)；优选为(100-500):(5-15):(11-55)；更优选为(150-200):(10-15):(20-25)。
进一步地，所述负载双药纳米颗粒的粒径范围为180-220nm，优选为196.8-206.2nm。
本发明还提供上述负载双药纳米颗粒的制备方法，包括经所述负载双药纳米颗粒由所述两亲性聚合物、疏水性药物、亲水性药物经乳化反应制得。具体包括以下步骤：
1)将两亲性聚合物和疏水性药物的溶液与亲水性药物溶液混合并乳化，得到第一乳液；
2)将所述第一乳液与乳化剂乳液混合并乳化，得到第二乳液，经分离，即得所述负载双药纳米颗粒。
本发明上述制备方法中，
步骤1)所述两亲性聚合物和疏水性药物的溶液中，所述两亲性聚合物的含量没有特别的要求，但是为了进一步提高所述负载双药纳米颗粒的使用效果，优选地，所述两亲性聚合物的浓度为10-50mg/ml，更优选为10mg/ml。
步骤1)所述两亲性聚合物和疏水性药物的溶液中，所述疏水性药物的含量没有特别的要求，但是为了进一步提高所述负载双药纳米颗粒的使用效果，优选地，所述疏水性药物的浓度为0.01-50mg/mL，优选为0.5-1.5mg/mL，更优选为1mg/mL。
作为优选技术方案，为了进一步提高所述负载双药纳米颗粒的使用效果，本发明制备方法步骤1)所述两亲性聚合物和疏水性药物的溶液中所述两亲性聚合物和所述疏水性药物的质量比为5:1-20:1；进一步优选为10:1。当质量比在此范围内时，生成的负载双药纳米颗粒具备更良好的活性，稳定性更好。
步骤1)中，所述亲水性药物的含量没有特别的要求，但是为了进一步提高所述负载双药纳米颗粒的使用效果，优选地，所述亲水性药物溶液的浓度为5-25mg/mL，进一步优选为10mg/mL。
步骤1)中，所述两亲性聚合物和疏水性药物的溶液与所述亲水性药物溶液的体积比没有特别的要求，但是为了进一步提高所述负载双药纳米颗粒的使用效果，作为优选技术方案，本发明所述的制备方法，步骤1)所制得的第一乳液中所述两亲性聚合物与所述亲水性药物的质量比为100:1-2:1，优选为2.5:1-10:1，更优选为9:1。当质量比在此范围内，可以保证生成的负载双药纳米颗粒具备更好的稳定性。
所述两亲性聚合物和疏水性药物溶解在有机溶剂中以形成溶液，所述有机溶剂能够溶解所述两亲性聚合物，但不溶于水，且在乳化条件下不与所述两亲性聚合物、所述疏水性药物和所述亲水性药物发生化学反应；优选选自二氯甲烷、三氯甲烷或甲基丁酮中的一种或多种，更优选为二氯甲烷和/或三氯甲烷。
步骤2)中，所述乳化剂可以为一般负载双药纳米颗粒制备领域常规的选择，作为优选技术方案，本发明所述的制备方法，步骤2)中所述乳化剂选自聚乙烯醇、泊洛沙姆(例如普兰尼克F68)、吐温80或十二烷基磺酸钠中的一种或多种，优选为聚乙烯醇和/或F68。在一个具体实施方案中，所述乳化剂为聚乙烯醇和/或F68，二者体积比为3:3-8:3，为提高纳米组合物的使用效果，二者体积比进一步优选为7:3。选用上述乳化剂，可以更好地针对本发明所述的亲水性药物、疏水性药物和两亲性聚合物以达到更好地乳化效果，从而进一步提高药物组合物的活性。
所述乳化剂乳液为乳化剂的水溶液，对乳化剂的含量没有特殊要求，为了进一步提高所述负载双药纳米颗粒的使用效果，优选地，所述乳化剂浓度为1％-4％，进一步优选为1％。
所述第一乳液与乳化剂乳液的体积比没有特殊要求，可以为一般药物组合物制备领域常规的选择，作为优选技术方案，本发明所述的制备方法，步骤2)中所述第一乳液与乳化剂乳液的体积比为1:2-1:20，优选为1:2-5(以1:3为最优)。
根据本发明，步骤1)和步骤2)中，作为优选技术方案，所述乳化的方法采用超声波细胞破碎机乳化法、高速剪切机乳化法或高压匀质机乳化法中的一种或多种，进一步优选为超声波乳化或高速剪切机乳化。
本发明所述的制备方法，步骤2)中，分离是指除去有机溶剂并分离的过程，其过程和方法没有特别的要求，作为优选技术方案，本发明所述的制备方法，步骤2)中除去有机溶剂的方法为使用减压旋蒸的方法除去有机溶剂；在步骤2)中，分离得到所述负载双药纳米颗粒的过程中，所述分离的方法没有特别的要求，优选地，所述的分离为通过离心去除上清液，得到药物组合物。
本发明的制备方法简单易行，解决了负载双药纳米颗粒中亲水性药物和疏水性药物的复配问题，并且通过本发明方法制得的负载双药纳米颗粒通过体外活性氧检测，动物实验等，显示出良好的光动力治疗效果。
本发明还提供按照上述方法所制备得到的负载双药的纳米颗粒。
本发明还提供所述负载上述双药纳米颗粒用于制备治疗肿瘤的药物的应用。采用上述负载双药纳米颗粒用于光动力治疗肿瘤，能够起到很好的抗肿瘤效果。
本发明所用原料均可市售购得，或按本领域常规方法制备。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳实例。
本发明中，同时包裹疏水的光敏剂IR780和亲水的Doxy于ROS响应的嵌段共聚物PEG-聚硫化丙烯(PPS)中，制备了一种刺激放大响应型纳米粒子(NPs/ID)。PEG-PPS良好的生物相容性和生物可降解性可以减少包裹的药物对正常细胞的毒副作用，避免纳米粒子中的药物在细胞外早释。同时，PEG-PPS形成的纳米粒子具有较高的稳定性，能够延长药物在血液中的循环时间，并且通过EPR效应聚集到肿瘤部位。进入癌症细胞以后，在近红外光的照射下，NPs/ID产生大量的ROS使得细胞内ROS浓度急剧增加，ROS然后激活NP/ID，刺激Doxy释放。更重要的是，释放的Doxy通过抑制癌症细胞中HIF-1的产生降低了细胞中ATP的含量，使得细胞能量不足，处于饥饿状态，通过饥饿治疗与光动力治疗的协同作用提高了癌症的治疗效率。更惊人的是，通过抑制HIF-1，Doxy破坏了癌症细胞内的氧化还原平衡，使得细胞内ROS水平进一步升高，促进了癌症细胞的光动力治疗效果。
本发明制备方法简单易行，解决了纳米载药体系中亲水性药物和疏水性药物的复配问题，并且通过本发明方法制得的负载双药的纳米颗粒通过体内纳米组合物分布检测，肿瘤组织免疫荧光染色，ATP含量检测，体内ROS活性氧检测，以及抗肿瘤实验等，显示出良好的光动力治疗效果。
附图说明
图1为实施例1得到的负载双药的纳米颗粒的透射电镜图；
图2为激光粒度仪测得的实施例1得到的负载双药纳米颗粒粒径图；
图3为连续一周激光粒度仪测得实施例1得到的负载双药纳米颗粒粒径柱状图；
图4为实验例1负载双药纳米颗粒在体内分布图；
图5为实验例2肿瘤组织的免疫荧光染色图；
图6为实验例3负载双药纳米颗粒在肿瘤体内ATP含量的检测；
图7为实验例4负载双药纳米颗粒在肿瘤体内光动力治疗实验数据图；
图8为实验例5负载双药纳米颗粒抗肿瘤效果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
以下所用两亲性聚合物为PEG-PPS，购自西安瑞禧生物科技有限公司；
聚乙烯醇，购自西陇化工化学试剂有限公司，型号为PVA-124，皂化度为85mol％；在25℃下的粘度为700mPa·s；
F68，购自西陇化工化学试剂有限公司；
DAPI染色液，购自上海碧云天生物技术有限公司；
ATP检测盒，购自上海碧云天生物技术有限公司；
DCFH-DA(2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐)荧光探针，购自上海碧云天生物技术有限公司；
透射电镜美国FEI，Tecnai G2 20S-TWIN，200kV；
Zeta电位仪Zetasizer NanoZS；
Maestro小动物荧光成像系统；
倒置荧光显微镜COIC，XDS-1B；
流式细胞仪加拿大Applied Biosystems；
实施例1
本实施例提供一种负载双药纳米颗粒及其制备方法。
1)将10mg的两亲性聚合物和1mg IR780溶于1mL二氯甲烷中，得到第一溶液；第二溶液为200μL 10mg/ml Doxy水溶液；将200μL第二溶液加入到第一溶液中，在冰浴中超声波乳化，功率为70W，时间为3分钟，得到第一乳液。
2)将聚乙烯醇配制成1％水溶液，F68配制成1％水溶液，二者混合得到第三溶液(聚乙烯醇溶液:F68溶液＝7:3，体积比)；把第一乳液加入到4ml的第三溶液中，利用超声波乳化，功率为200W，时间为5分钟，得到第二乳液。
3)室温下，旋转蒸发除去有机溶剂，得到旋蒸后的产物。将旋蒸后的产物在的13000r/min离心速度下离心10分钟后，收集沉淀，得到负载双药纳米颗粒。
在透射电镜下观察本实施例得到的负载双药纳米颗粒(见图1)，呈典型的圆球形，粒径大约200nm左右。
利用Zeta电位仪测得本实施例得到的负载双药纳米颗粒的粒径为201.5±4.7nm(见图2)。
利用Zeta电位仪连续一周每天对本实施例负载双药纳米颗粒的粒径测量得到负载双药纳米颗粒的稳定性图(见图3)。
实施例2
本实施例提供一种负载双药纳米颗粒及其制备方法。
1)将20mg的两亲性聚合物和1.1mg IR780溶于1mL二氯甲烷有中，得到第一溶液；第二溶液为220μL 10mg/ml Doxy水溶液；将200μL第二溶液加入到第一溶液中，在冰浴中超声波乳化，功率为70W，时间为3分钟，得到第一乳液。
2)将聚乙烯醇配制成1％水溶液，F68配制成1％水溶液，得到第三溶液(聚乙烯醇:F68＝7:3)；把第一乳液加入到4ml的第三溶液中，利用超声波乳化，功率为200W，时间为5分钟，得到第二乳液。
3)室温下，旋转蒸发除去有机溶剂，得到旋蒸后的产物。将旋蒸后的产物在的13000r/min离心速度下离心10分钟后，收集沉淀，得到负载双药纳米颗粒。
其表征信息与实施例1近似。
实验例1
本实验例提供实施例1所制备得到的负载双药纳米颗粒在体内分布情况。
20-22g的雌性BALB/c无胸腺裸鼠购于北京中国北京维通利华实验动物中心。所有的动物实验操作均遵循北京大学伦理道理委员会协议。通过在雌性BALB/c无胸腺裸鼠腋下接种1×107个MDA-MB-231细胞构建三阴性乳腺癌模型。当肿瘤长到约150mm3时，将接有MDA-MB-231肿瘤的小鼠随机分成4组(每组3只)。分别尾静脉注射IR780或NPs/ID(IR780的浓度为100mg/mL)。分别在给药后第3、5、8、12或24小时，使用Maestro小动物荧光成像系统记录小鼠的体内荧光分布。24小时以后，将小鼠猝死，并将肿瘤和各个器官取出，使用Maestro小动物荧光成像系统观察各个器官的荧光分布(见图4)。
实验例2
本实验例提供实施例1所制备得到的负载双药纳米颗粒肿瘤组织的免疫荧光染色图。
将接有MDA-MB-231肿瘤的小鼠随机分成4组(每组3只)。分别尾静脉注射PBS、Doxy、NPs/I、NPs/ID(IR780浓度为100mg/mL)。4小时以后，激光治疗组小鼠肿瘤用808nm激光照射20s(功率为2W/cm2)。24小时后，将小鼠猝死，并将肿瘤取出进行免疫荧光染色。首先将肿瘤组织进行冰冻切片，然后用4％的甲醛固定20分钟，PBS洗三次，在3％BSA中37℃下封闭1小时，孵育anti-HIF-1-a抗体(diluted1:200,abcam)，然后再孵育二抗(diluted 1:100,Santa Cruz Biotechnology,Inc.)。使用DAPI进行细胞核染色。用倒置荧光显微镜进行观察(见图5)。
实验例3
本实验例提供实施例1所制备得到的负载双药纳米颗粒在肿瘤体内ATP含量的检测。
将接有MDA-MB-231肿瘤的小鼠随机分成6组(每组3只)。分别尾静脉注射PBS、Doxy、NPs/I、NPs/ID(IR780浓度为100mg/mL)。4小时以后，激光治疗组小鼠肿瘤用808nm激光照射20s(功率为2W/cm2)。24小时后，将小鼠猝死，将肿瘤组织取出，使用ATP检测试剂盒将肿瘤组织裂解并测定其ATP含量(见图6)。
实验例4
本实验例提供实施例1所制备得到的负载双药纳米颗粒在肿瘤体内光动力治疗实验检测及数据。
将接有MDA-MB-231肿瘤的小鼠随机分成6组(每组3只)。分别尾静脉注射PBS、Doxy、NPs/I、NPs/ID(IR780浓度为100mg/mL)。4小时以后，激光治疗组小鼠肿瘤用808nm激光照射20s(功率为2W/cm2)。24小时后，将肿瘤组织取出，浸泡在含有0.1mg/mL胶原酶的krebs-ringer buffer溶液中，然后剪碎，放置在摇床中摇晃20min，使用筛网进行过滤，然后1500rpm条件下离心5min，用krebs-ringer buffer溶液进行清洗，然后用DCFH-DA进行染色。用加拿大Applied Biosystems流式细胞仪检测细胞内DCF的荧光强度(见图7)。
实验例5
本实验例提供实施例1所制备得到的负载双药纳米颗粒体内抗肿瘤实验数据。
通过在雌性BALB/c无胸腺裸鼠腋下接种1×107个MDA-MB-231细胞构建三阴性乳腺癌模型。当肿瘤长到约100mm3时，将接有MDA-MB-231肿瘤的小鼠随机分成6组(每组5只)。分别尾静脉注射生理盐水、Doxy、NPs/I、NPs/ID(IR780浓度为100mg/mL)。4小时以后，激光组的小鼠给予808nm激光照射20s(功率为2W/cm2)。用游标卡尺记录小鼠肿瘤的大小。肿瘤体积计算公式如下：V＝L×W2(见图8)。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (16)

1.一种负载双药纳米颗粒，为水包油包水型的纳米胶束，包含：两亲性聚合物，疏水性药物和亲水性药物；所述两亲性聚合物为嵌段共聚物PEG-聚硫化丙烯；所述疏水性药物为IR780，所述亲水性药物为强力霉素；所述两亲性聚合物、疏水性药物、亲水性药物的质量比为(10-1000):(1-50):(1-100)。
2.根据权利要求1所述的负载双药纳米颗粒，其特征在于，在油相环境中所述两亲性聚合物包裹所述疏水性药物形成纳米胶束；在水相环境中所述疏水性药物与所述两亲性聚合物形成纳米胶束包裹所述亲水药物形成杂合的纳米胶束；和/或，
所述负载双药纳米颗粒由所述两亲性聚合物、疏水性药物、亲水性药物经乳化反应制得。
3.根据权利要求1或2所述的负载双药纳米颗粒，其特征在于，所述嵌段共聚物PEG-聚硫化丙烯中PEG分子量范围为1000-5000Da；聚硫化丙烯分子量范围为4500-45000Da。
4.根据权利要求1或2所述的负载双药纳米颗粒，其特征在于，所述两亲性聚合物、疏水性药物、亲水性药物的质量比为(100-500):(5-15):(11-55)；和/或，
所述负载双药纳米颗粒的粒径范围为180-220nm。
5.根据权利要求1或2所述的负载双药纳米颗粒，其特征在于，所述两亲性聚合物、疏水性药物、亲水性药物的质量比为(150-200):(10-15):(20-25)；和/或，
所述负载双药纳米颗粒的粒径范围为196.8-206.2nm。
6.权利要求1-5任一项所述负载双药纳米颗粒的制备方法，包括经所述负载双药纳米颗粒由所述两亲性聚合物、疏水性药物、亲水性药物经乳化反应制得；包括以下步骤：
1)将两亲性聚合物和疏水性药物的溶液与亲水性药物溶液混合并乳化，得到第一乳液；
2)将所述第一乳液与乳化剂乳液混合并乳化，得到第二乳液，经分离，即得所述负载双药纳米颗粒。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，
所述两亲性聚合物和疏水性药物的溶液中，所述两亲性聚合物的浓度为10-50mg/ml；和/或，
所述两亲性聚合物和疏水性药物的溶液中，所述疏水性药物的浓度为0.5-1.5mg/mL；和/或，
所述两亲性聚合物和疏水性药物的溶液中所述两亲性聚合物和所述疏水性药物的质量比为5:1-20:1；和/或，
所述亲水性药物溶液的浓度为5-25mg/mL；和/或，
所述第一乳液中所述两亲性聚合物与所述亲水性药物的质量比为2.5:1-10:1。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，
所述两亲性聚合物和疏水性药物的溶液中，所述两亲性聚合物的浓度为10mg/ml；和/或，
所述两亲性聚合物和疏水性药物的溶液中，所述疏水性药物的浓度为1mg/mL；和/或，
所述两亲性聚合物和疏水性药物的溶液中所述两亲性聚合物和所述疏水性药物的质量比为10:1；和/或，
所述亲水性药物溶液的浓度为10mg/mL；和/或，
所述第一乳液中所述两亲性聚合物与所述亲水性药物的质量比为5:1。
9.根据权利要求6-8任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述乳化剂选自聚乙烯醇、泊洛沙姆、吐温80或十二烷基磺酸钠中的一种或多种。
10.根据权利要求6-8任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，步骤2)中所述乳化剂为聚乙烯醇和F68，二者体积比为3:3-8:3；和/或，
所述乳化剂的浓度为1％-4％。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，步骤2)中所述乳化剂为聚乙烯醇和F68，二者体积比为7:3；和/或，
所述乳化剂的浓度为1％。
12.根据权利要求6-8任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述第一乳液与乳化剂乳液的体积比为1:2-1:20。
13.根据权利要求6-8任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述第一乳液与乳化剂乳液的体积比为1:2-5。
14.根据权利要求6-8任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述第一乳液与乳化剂乳液的体积比为1:3。
15.权利要求6-14任一项所述方法制备的负载双药的纳米颗粒。
16.权利要求1-5、15任一项所述负载双药纳米颗粒在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
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