CN109464676A - 一种壳寡糖光敏靶向纳米粒的制备方法及产品 - Google Patents

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Abstract

本发明属于靶向缓释给药制剂领域，具体公开了一种壳寡糖光敏靶向纳米粒的制备方法及其产品，制备方法具体为：在碱性条件下，以BHP和壳寡糖为原料，在相转移催化剂的催化下制得卟啉修饰的壳寡糖衍生物；再将卟啉修饰的壳寡糖衍生物与络合剂溶解在水中，待完全溶解后，滴加具有抗肿瘤活性中药成分的乙醇水溶液，加入交联剂，避光反应后进行透析、冷冻干燥得到。本发明将抗肿瘤中药药效物质与光动力细胞杀伤力相结合，发挥两者的协同作用，既可提高药物稳定性及生物利用度，又可在光照下定向富集给药，缓释、控释、靶向释放药物，达到高效低毒的目的，为研制新型的抗肿瘤靶向药物新剂型提供了新方法。

Description

一种壳寡糖光敏靶向纳米粒的制备方法及产品
技术领域
本发明涉及靶向缓释给药制剂，具体涉及一种光敏靶向纳米粒的制备方法及产品。
背景技术
缓释给药制剂是近年来发展的新剂型，是将药物包载于天然或合成的高分子材料中制备而成，可提高药物稳定性及生物利用度，同时可以缓释、控释、靶向释放药物等。这一类药物的种类很多，有脂质体、固体脂质纳米粒、聚合物胶束、磁性纳米粒等。具有抗肿瘤活性的中药成分制备成缓释给药系统后，在提高溶解度和生物利用度，增强抗肿瘤活性等方面都有明显的作用，是成功的剂型改进。
壳聚糖是一类从虾、蟹等甲壳类动物中的甲壳素经化学方法脱乙酰基后提取的氨基高分子多糖，而壳寡糖是壳聚糖经降解之后得到的产物，壳寡糖是一种性能优良的生物高分子，具有良好的稳定性、水溶性和带正电性，分子量只有2000da左右，可溶于水，人体吸收较好，其功效是壳聚糖的十几倍，在医药保健品中使用广泛。壳寡糖具有广泛的生理活性，如抗炎、抗肿瘤、抗氧化和保肝等作用，是一类重要的药物控释载体材料，特别适用于多肽、蛋白质、核酸、疫苗等生物活性大分子药物的包埋和释放。目前，已有大量的体内、体外实验表明壳寡糖具有较强的抗肿瘤活性，作为负载抗肿瘤药物的载体，在抗肿瘤治疗上具有较为广阔的应用前景。
光动力疗法(Photodynamic Therapy,PDT)是近20年新发展起来的一种治疗恶性肿瘤的方法，与传统的抗癌疗法(如手术、化疗和放疗)相比，具有选择性高、对健康组织损害小、毒性低的优点，目前已发展为多种实体瘤的主要治疗手段。它是通过将光敏剂(Photosensitiser,PS)如卟啉注入患者体内，PS在避光条件下是无毒的，并能选择性地富集于肿瘤组织中，然后用可见光对病灶进行光照，从而生成细胞毒性物质——单线态氧，单线态氧对其肿瘤组织的生物分子造成杀伤效果从而杀死肿瘤细胞。单线态氧半衰期短，不会扩散至肿瘤细胞外，因此，光照后只有那些富集了PS的细胞被杀死，对周围正常组织的损害小。
卟啉类化合物是一种良好的光敏剂，它具有独特的大π共轭平面构型，对光具有很好的灵敏性。它是一类由四个吡咯环通过次甲基相连形成共轭骨架的大环化合物，它对迅速增殖的细胞有优先积聚作用，即对癌细胞有定位作用。同时由于其大共轭骨架的存在，当适当波长的光照射时能产生可见荧光，并能释放出单线态氧而对癌细胞起光氧化作用。卟啉的这两个特殊性质使它在在医学研究中可做为检测癌症的光敏剂和抗癌药物。
此前，中国专利文献CN103920149A公开了一种壳聚糖光敏微球的制备方法，其以5-对(6-溴己氨基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉(BHP)为原料，在相转移催化剂的催化下与壳聚糖反应生成卟啉侧基壳聚糖光敏新材料，选择具有抗肿瘤活性的中药成分与上述合成的卟啉侧基壳聚糖衍生物经乳化交联法制备得到壳聚糖光敏微球。
上述制备方法选用的壳聚糖分子量在几十万以上，粘度高，无法在生理pH条件下溶解，消化道内水解较难，B糖苷降解的壳聚糖酶的缺乏，也导致作为药物载体组成部分的壳聚糖分子在人体消化道吸收的困难，因此不利于人体的吸收，其制得的壳聚糖光敏微球的包封率和载药量都较低且药效有待提高。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种壳寡糖光敏靶向纳米粒的制备方法，制备了卟啉修饰的壳寡糖光敏新材料，并制备了具有抗肿瘤活性中药成分的光敏靶向纳米粒。
一种壳寡糖光敏靶向纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)在碱性条件下，以5-对(6-溴己氨基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉和壳寡糖为原料，在相转移催化剂的催化下制得卟啉修饰的壳寡糖衍生物；
(2)在搅拌条件下，将卟啉修饰的壳寡糖衍生物与络合剂溶解在水中，待完全溶解后，滴加含有抗肿瘤活性中药成分的乙醇水溶液，再加入交联剂，避光反应2～8h后进行透析、冷冻干燥，得到所述壳寡糖光敏靶向纳米粒。
壳寡糖是一种性能优良的生物高分子，其具有良好的稳定性、水溶性和带正电性，分子量小，人体吸收较好，这些特点使其在液态介质中可与带负电荷的聚合物、大分子甚至一些聚阴离子相互作用。因此，本发明选用壳寡糖与二溴己烷卟啉衍生物(BHP)相结合，先合成壳寡糖-BHP复合物，然后再在特定的反应条件下搅拌合成壳寡糖光敏靶向纳米粒，化学修饰后的壳寡糖纳米粒仍能保持良好的生物相容性、低毒性和稳定性。
本发明将壳寡糖制作成纳米尺寸能使药物在人体内更好的发挥药效，纳米粒具有在肿瘤细胞靶向定位和促进细胞吸收的功能，促进药物在细胞内的传递，从而提高药物对肿瘤组织的靶向性，可在增强疗效的同时减少副作用，因此纳米粒治疗系统可以显著增强治疗药物的抗癌作用，这主要取决于纳米粒的粒径大小和特殊的表面性质，肿瘤血管可以渗漏大分子，大小在几百纳米的纳米粒能够从血管里渗漏出来并在肿瘤内蓄积，还可在细胞外间隙进行有限的扩散。
动物实验模型数据显示，粒径较小且表面略带正或负电荷的纳米粒进入血液循环系统时，很容易到达肿瘤组织并在肿瘤组织内蓄积。因此，若粒径范围设计合理，可实现药物在肿瘤组织的缓释给药，提高药物的组织浓度，从而提高药物的利用率以及对肿瘤细胞的杀伤力。纳米粒载体参与药物的吸收过程，导致了纳米粒空间结构，载体材料理化性质等因素对细胞摄取机理与程度的直接影响，这些特点使药物能到达特定部位发挥作用，在光照及避光条件下，由卟啉修饰的壳寡糖分子组成的纳米粒对细胞杀伤率的影响明显高于等浓度的壳寡糖分子及BHP复合物，光照组杀伤效果更为显著。
所述步骤(1)具体为：将壳寡糖、碱、相转移催化剂溶于溶剂，搅拌至完全溶解得到反应液；再将5-对(6-溴己氨基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉溶于氯仿，逐滴加入反应液中，在20～80℃回流2～20h，冷却、抽滤、洗涤、干燥得到卟啉修饰的壳寡糖衍生物。
优选地，步骤(1)中，所述壳寡糖中氨基与相转移催化剂的摩尔比为1：0.5～10.0。
利用壳寡糖上的游离氨基与BHP上的卤代烃部分共价偶联，考虑到卟啉和壳寡糖分别处于有机相和无机相，在反应体系中引入相转移催化剂以提高产率，故考察相转移催化剂与壳寡糖中氨基的摩尔比对卟啉接枝率的影响，相转移催化剂与壳寡糖中氨基的摩尔比越大，卟啉的接枝率越高，可能原因为相转移催化剂与壳寡糖中氨基的摩尔比较大时，壳寡糖接触的卟啉越多，参与反应的几率越高。
步骤(1)中，所述的溶剂为氯仿或水；所述的碱为碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾中的任意一种。
步骤(1)中，所述的相转移催化剂为四丁基溴化胺、四丁基氯化铵、苄基三乙基氯化铵、三辛基甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵或十四烷基三甲基氯化铵中的任意一种。
步骤(2)中，所述的具有抗肿瘤活性中药成分为苦参碱、冬凌草甲素、喜树碱、紫杉醇中的任意一种。
步骤(2)中，所述卟啉修饰的壳寡糖衍生物与具有抗肿瘤活性中药成分的重量比为1：0.2～5.0。
这是由于投药量过少，纳米粒载药不充分，载药量和包封率较低，投药量越多，载药量就越大，但纳米粒的内部空间有限，所以能包埋的药物量也是有限的；当投药量过多时，会生成大量药物结晶，这些结晶颗粒过大，反而阻碍了纳米粒对药物的包埋，导致载药量和包封率下降；计算公式中，包封率的分母为投入的总药量，因此投药量过多，分母越大，当包埋的药物量达到极限时，包封率快速降低。
步骤(2)中，所述的络合剂为乙二胺四乙酸，乙二胺四乙酸二钠，柠檬酸，三乙醇胺中的任意一种。
步骤(2)中，所述透析时间为12～48h，优选为22～24h，这是由于在该透析时间内，可以充分去除乙醇和未反应的络合剂和具有抗肿瘤活性的中药成分，若络合剂去除不完全，则其中络合剂的离子带电性质会对纳米粒形成造成影响。
步骤(2)中，所述的交联剂为乙二醛、戊二醛饱和的甲苯溶液、戊二醛、环氧化合物中的任意一种或多种。交联剂优选为戊二醛水溶液，这是由于戊二醛的醛基可与壳寡糖的氨基通过生成席夫碱而发生交联，在此体系中其交联效果最好。
步骤(2)中，所述的交联剂的用量为2～40μg/mL，交联剂用量过少，则交联的深度不够，纳米粒不稳定；用量过深，则纳米粒易结团。随着交联剂用量的增加，载药量和包封率升高，可能与纳米粒载体间结合紧密有关，但交联剂加入过多后，纳米粒间的粘连程度增加，载药量和包封率降低。
步骤(2)中，所述搅拌的速度为200～2000r/min，搅拌速度优选为900～1100r/min，进一步优选为1000r/min，搅拌速度对产物粒径影响较大，在此搅拌速度范围内得到的纳米粒的球形完整，大小较均匀，粒径较小。
步骤(2)中，所述具有抗肿瘤活性中药成分的乙醇水溶液中乙醇与水的体积比为1：0.2～5.0，优选为1:1.5～2.5，进一步优选为1:2。
这是由于即使控制搅拌速度一定，若油水相比减小会导致的溶液总体积增大，壳寡糖在溶液中受到的实际搅拌速度变小，对粒径造成影响。实验表明，在其他因素不变的前提下，在油水相比为1:2时，纳米粒的球形完整，大小较均匀，粒径最小。
本发明还公开了由上述制备方法制得的壳寡糖光敏靶向纳米粒，所述纳米粒的包封率为8.00～50.00％，载药量为3.00～60.00％。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明将卟啉作为侧基引入壳寡糖制成新型光敏材料，在合成的BHP的基础上，将卟啉与在生理pH环境可溶的壳寡糖进行共价偶联合成卟啉修饰的壳寡糖光敏新材料，并以载药量和包封率为指标，对反应工艺进行了优化，成功运用非溶剂辅助络合-化学交联法将中药药效物质与上述新型光敏材料制备成光敏靶向纳米粒；
(2)本发明方法制得的纳米粒球形完整，大小较均匀，粒径较小，且其载药量、包封率均有较大提高；
(3)本发明方法制得的纳米粒，在光照及避光条件下，与等浓度的壳寡糖分子及BHP复合物相比，杀伤率均有明显的提高，光照组杀伤效果更为显著；
(4)本发明方法将原本作用机制单一的抗肿瘤中药药效物质与光动力细胞杀伤力相结合，发挥两者的协同作用，既可提高药物稳定性及生物利用度，又可在光照下定向富集给药，可以缓释、控释、靶向释放药物，达到高效低毒的目的，为研制新型的抗肿瘤靶向药物新剂型提供一种新方法。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1
(1)在三颈烧瓶中依次加入50mg壳寡糖、250mg碳酸钾，300mg四丁基溴化铵，加入1.5mL蒸馏水，搅拌至完全溶解；再将50mg 5-对(6-溴己氨基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉溶解在5mL氯仿中，逐滴加入至三颈烧瓶中，55℃回流5.5h，停止反应，冷却至室温，静置分离有机层和水层，取水层，加入10mL无水乙醇，混匀，抽滤分离沉淀，用二氯甲烷洗涤沉淀，产物真空干燥得到卟啉修饰的壳寡糖衍生物22mg；卟啉平均接枝率达42.8％。
UV-Vis(CHCl3)：422.00nm，516.50nm，556.00nm，592.00nm，650.00nm；
(2)取20mg卟啉修饰的壳寡糖衍生物与4mg乙二胺四乙酸二钠溶于4mL去离子水，置于磁力搅拌器(搅拌速度为1000r/min)搅拌至溶解，慢慢向其中滴加4mL 10mg/mL的冬凌草甲素-乙醇溶液(乙醇与水的体积比为1:2)，滴加结束后计时10min，随后加入12μL 25％戊二醛水溶液，避光搅拌4h，反应结束后将纳米粒溶液置于透析袋中透析24h，透析后的溶液冷冻干燥，制得冬凌草甲素卟啉壳寡糖光敏靶向纳米粒。
制得的冬凌草甲素卟啉壳寡糖光敏靶向纳米粒球形完整，大小较均匀，测得平均粒径为255nm。
纳米粒体外释放量的测定：将20.0mg冬凌草甲素卟啉壳寡糖光敏靶向纳米粒放入透析袋，用2.00mL超纯水溶解，在37℃下将透析袋置于一定量的超纯水中透析24h，精密吸取1.0mL透析液，同时补加1.0mL超纯水，吸取的透析液用0.45μm微孔滤膜过滤后进样分析，计算透析液中冬凌草甲素的含量，从而得到其24h药物累计释放量达82.44％。
经HPLC测得制得的冬凌草甲素卟啉壳寡糖光敏靶向纳米粒的包封率为23.02％，载药量为31.35％。
采用cck-8法测定对人乳腺癌细胞MCF-7的光动力杀伤率，体外光动力抗肿瘤活性实验表明，浓度为364μg/mL的冬凌草甲素光敏靶向纳米粒光照组对人乳腺癌细胞MCF-7的光动力杀伤率可达：95.05％。
实施例2
将实施例1中步骤(1)中的壳寡糖中氨基与相转移催化剂的摩尔比3：1，改为摩尔比为1：3，其他条件不变，可得卟啉修饰的壳寡糖衍生物，卟啉枝接率为31.62％。
实施例3
将实施例1中步骤(1)中的混合溶剂水与氯仿的体积比1.5：5，改为体积比为0.5：5，其他条件不变，可得卟啉修饰的壳寡糖衍生物，卟啉枝接率为20.78％。
实施例4
将实施例1中步骤(1)中的混合溶剂水与氯仿的体积比1.5：5，改为体积比为2.5：5，其他条件不变，可得卟啉修饰的壳寡糖衍生物，卟啉枝接率为17.66％。
实施例5
将实施例1中步骤(1)中的加入10mL无水乙醇，改为加入6mL无水乙醇，其他条件不变，可得到卟啉修饰的壳寡糖衍生物14mg。
实施例6
将实施例1中步骤(1)中的加入10mL无水乙醇，改为加入3mL无水乙醇，其他条件不变，可得到卟啉修饰的壳寡糖衍生物8mg。
卟啉修饰的壳寡糖衍生物有所降低，这是由于采用水溶醇沉法使药物在醇溶液中溶解度降低析出沉淀，进而得到卟啉修饰的壳寡糖衍生物，加入乙醇的量对产物的多少有影响，乙醇量越多，沉淀越完全，加入10mL无水乙醇即过量，产物沉淀完全。
实施例7
将实施例1中步骤(2)中的卟啉修饰的壳寡糖衍生物与冬凌草甲素的重量比1：2，改为重量比为1：1，其他条件不变，所得纳米粒包封率为26.30％，载药量为20.83％。
实施例8
将实施例1中步骤(2)中的卟啉修饰的壳寡糖衍生物与冬凌草甲素的重量比1：2，改为重量比为2：1，其他条件不变，所得纳米粒包封率为24.68％，载药量为10.99％。
实施例9
将实施例1中步骤(2)中的12μL 25％戊二醛水溶液，改为20μL 25％戊二醛水溶液，其他条件不变，所得纳米粒包封率为19.28％，载药量为27.82％。
实施例10
将实施例1中步骤(2)中的具有抗肿瘤活性的中药成分的乙醇溶液中乙醇与水的体积比为1:2，改为1:1，其他条件不变，所得纳米粒的平均粒径为354.6nm。
实施例11
将实施例1中步骤(2)中的具有抗肿瘤活性的中药成分的乙醇溶液中乙醇与水的体积比为1:2，改为2:1，其他条件不变，所得纳米粒的平均粒径为334.4nm。
实施例12
将实施例1中步骤(2)中的搅拌速度为1000r/min，改为搅拌速度为800r/min，其他条件不变，所得纳米粒的平均粒径为492.4nm。
实施例13
将实施例1中步骤(2)中的搅拌速度为1000r/min，改为搅拌速度为1200r/min，其他条件不变，所得纳米粒的平均粒径为339.7nm。
实施例14
将实施例1中步骤(2)中的纳米粒溶液置于超纯水中透析24h，改为透析12h，其他条件不变，体外释放量为72.66％。
对比例1
将实施例1中步骤(2)中滴加4mL 10mg/mL的冬凌草甲素-乙醇溶液，改为滴加4mL乙醇溶液，其他条件不变，制得卟啉壳寡糖光敏靶向纳米粒，测得纳米粒平均粒径168nm。
将不加具有抗肿瘤活性的中药成分的纳米粒作为空白纳米粒，具有抗肿瘤活性的中药成分的纳米粒的粒径较空白纳米粒稍大，这是因为包埋了药物会使最后得到的纳米粒粒径变大。

Claims (10)

1.一种壳寡糖光敏靶向纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)在碱性条件下，以5-对(6-溴己氨基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉和壳寡糖为原料，在相转移催化剂的催化下制得卟啉修饰的壳寡糖衍生物；
(2)在搅拌条件下，将卟啉修饰的壳寡糖衍生物与络合剂溶解在水中，待完全溶解后，滴加具有抗肿瘤活性中药成分的乙醇水溶液，再加入交联剂，避光反应2～8h后进行透析、冷冻干燥，得到所述壳寡糖光敏靶向纳米粒。
2.根据权利要求1所述的壳寡糖光敏靶向纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述壳寡糖中氨基与相转移催化剂的摩尔比为1：0.5～10.0。
3.根据权利要求1所述的壳寡糖光敏靶向纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的具有抗肿瘤活性中药成分为苦参碱、冬凌草甲素、喜树碱、紫杉醇中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的壳寡糖光敏靶向纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述透析时间为12～48h。
5.根据权利要求1所述的壳寡糖光敏靶向纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述交联剂为乙二醛、戊二醛饱和甲苯溶液、戊二醛水溶液、环氧化合物中的任意一种或多种。
6.根据权利要求1所述的壳寡糖光敏靶向纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述交联剂的用量为2～40μg/mL。
7.根据权利要求1或2所述的壳寡糖光敏靶向纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述卟啉修饰的壳寡糖衍生物与具有抗肿瘤活性的中药成分的重量比为1：0.2～5.0。
8.根据权利要求1所述的壳寡糖光敏靶向纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述搅拌的速度为200～2000r/min。
9.根据权利要求1所述的壳寡糖光敏靶向纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述具有抗肿瘤活性中药成分的乙醇水溶液中乙醇和水的体积比为1：0.2～5.0。
10.根据权利要求1～9任一项制得的壳寡糖光敏靶向纳米粒，其特征在于，所述纳米粒的包封率为8.00～50.00％，载药量为3.00～60.00％。
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