一种还原敏感型聚乙二醇-药物偶联物及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种还原敏感型聚乙二醇-药物偶联物及其制备方法。
背景技术
化疗是一种基本的肿瘤治疗方法,它是利用细胞毒药物杀死肿瘤细胞而达到治疗肿瘤目的的。临床上常用的细胞毒抗癌药物包括阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、喜树碱、10-羟基喜树碱、长春碱和长春新碱等。这些细胞毒药物不仅体内半衰期很短,难溶于水,选择性差,造成生物利用度低,而且对正常组织/细胞存在严重的毒副作用,疗效和毒副作用均与给药剂量正相关。因此,提高疗效、降低毒副作用一直是肿瘤化疗基础研究和临床应用所追求的目标。为实现这一目标,基于生物材料的药物递送体系近些年得到飞速发展。在形形色色的药物递送体系中,聚合物-药物偶联物因具有稳定性好、载药量高、制备工艺简单、循环寿命长等优点,一直是学者们关注的重点之一。
聚乙二醇是一种生物相容性优异的高分子,是美国FDA批准的可体内注射的药用聚合物之一,也是迄今为止已知的蛋白质吸附水平最低的聚合物。这使其在药物递送领域具有重要的科学意义和实际应用价值,受到国内外学者的广泛关注。目前,利用聚乙二醇对药物或药物载体进行修饰几乎是必不可少的步骤,尤其是化疗药物。这是因为聚乙二醇修饰的药物或载体具有很多优良的性能,如避免免疫系统调理的‘隐形’功能、增强的药物溶解性和稳定性、长的血浆循环时间以及在肿瘤微环境中的被动靶向作用等,这些均对提高肿瘤治疗效果、降低毒副作用具有至关重要的作用。此外,聚乙二醇还可通过肾脏排出体外,在体内不会蓄积。
聚乙二醇-药物偶联物作为一类简单而行之有效的药物递送体系,它可以提高载药量,提高药物水溶性和稳定性,显著降低药物的肾脏清除率,大大延长血液循环时间(药物半衰期),并通过EPR效应增强肿瘤处的积聚,因而一直是学者们关注的重点。然而,制约聚乙二醇-药物偶联物递送体系发展的瓶颈是聚乙二醇端基为反应活性较低的羟基,难以直接键接药物。因此,将聚乙二醇端羟基转变为活性更高的基团就成为聚乙二醇衍生物研究的热点。目前,文献已公开了多种不同端基的聚乙二醇衍生物及制备方法,如端氨基、端巯基、端羧基、端马来酰亚胺基、端醛基、端环氧基、端酰肼基、端叠氮基、端异氰酸酯基等。这些聚乙二醇衍生物已用于细胞毒类、基因类、多肽类和蛋白类药物递送体系的建立和修饰。如申请号为201210384370.0的中国专利公开了一种端羧基聚乙二醇通过酯键键接冬凌草甲素的前药及制备方法。申请号为201210469251.5的中国专利公开了一种端醛基聚乙二醇经还原胺化反应键接神经生长因子获得偶联物的制备方法。申请号为201110088986.9的中国专利公开了一种聚乙二醇-抗癌药偶联物,它是由端羧基聚乙二醇通过碳二亚胺反应键接含羟基的喜树碱/紫杉醇。申请号为201210128392.0的中国专利公开了一种通过酯键连接的聚乙二醇-紫杉醇偶联物,并用于装载游离紫杉醇。然而,这些聚乙二醇-药物偶联物的连接键稳定性较高,药物难以从聚乙二醇上脱除或释放速度很慢,影响药效发挥。
聚乙二醇修饰的药物递送体系因其独特的‘隐形’和被动靶向功能,是将药物准确高效递送至肿瘤组织乃至肿瘤细胞内的基本前提。然而,药物递送体系一旦进入肿瘤细胞内,若实现‘隐形’的聚乙二醇不及时除去,将会影响药物从内涵体向细胞质的转移速度,易被溶酶体所降解,成为影响疗效的关键因素之一。此外,PEG修饰药物时不可避免地会在一定程度上破坏或遮蔽药物的活性位点,影响其体内生物活性。解决此问题的关键在于,既要保证PEG化后的药物分子能在循环过程中稳定,又能在作用部位被及时释放出来。因此,开发能在细胞内脱除聚乙二醇的药物递送体系就成了提高抗癌药物疗效的新方向。
因此,开发新型的、适用于多种细胞毒药物的刺激响应性聚乙二醇-药物偶联物,对于提高抗癌药物疗效、降低毒副作用仍是十分必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速释放药物的还原敏感型聚乙二醇-药物偶联物及其制备方法。该方法适用药物品种多、原料易得、产率高、成本低。
为了达到上述目的,本发明的还原敏感型聚乙二醇-药物偶联物的结构通式如下所示:
其中,n为8~70;x=y,且x为1、2或3;R为细胞毒抗癌药物分子。
所述的细胞毒抗癌药物分子为阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、喜树碱、10-羟基喜树碱、长春碱或长春新碱。
一种该还原敏感型聚乙二醇-药物偶联物的制备方法,包括如下步骤:
1)含二硫键的二酰肼的合成:
将含二硫键的二元酸、一元醇、甲苯以及对甲苯磺酸加入反应器中,回流反应6~12小时,然后去除溶剂,再向反应器内的剩余物中加入水合肼水溶液,回流反应2~6小时,然后重结晶,即得含二硫键的二酰肼;其中,所加入的含二硫键的二元酸与一元醇的摩尔比为(1:10)~(1:30),含二硫键的二元酸与水合肼水溶液中的水合肼的摩尔比为1:(20~40),一元醇为甲醇或乙醇;
2)含二硫键的二异氰酸酯的合成:
将含二硫键的二酰肼溶于盐酸中,在冰盐水浴冷却下滴加亚硝酸钠水溶液,然后在室温下反应2~8小时,再加入与盐酸等体积的苯,搅拌后分出苯相,苯相干燥;将经过干燥的苯相于60~100℃下回流反应1~4小时,去除溶剂,即得含二硫键的二异氰酸酯;其中,所加入的含二硫键的二酰肼与亚硝酸钠水溶液中的亚硝酸钠的摩尔比为1:(5~15)
3)端异氰酸酯基聚乙二醇的合成:
在氮气保护下,将分子量为400~3000道尔顿的甲氧基聚乙二醇和含二硫键的二异氰酸酯加入无水甲苯中,于60~110℃下反应6~24小时,然后去除溶剂,反应器内的剩余物经纯化,即得端异氰酸酯基聚乙二醇;其中,所加入的甲氧基聚乙二醇和含二硫键的二异氰酸酯的摩尔比为(1:8)~(1:20);
4)还原敏感型聚乙二醇-药物偶联物的形成:
将端异氰酸酯基聚乙二醇和细胞毒抗癌药物溶于无水有机溶剂中,于40~60℃下反应12~36小时,得反应液;将反应液浓缩至三分之一体积,然后用pH值为7.4的PBS缓冲液稀释至浓缩前的反应液体积,得混合体系;混合体系在作为透析液的pH值为7.4的PBS缓冲液中透析,透析后将留在透析袋内的液体冷冻干燥,得到还原敏感型聚乙二醇-药物偶联物;其中,所加入的端异氰酸酯基聚乙二醇与药物的摩尔比为(1:5)~(1:15),无水有机溶剂为无水二甲亚砜、无水氯仿、无水二氯甲烷或无水丙酮。
所述的步骤1)中的含二硫键的二元酸为2,2'-二硫代二乙酸、3,3'-二硫代二丙酸或4,4'-二硫代二丁酸。
所述的步骤1)中的含二硫键的二元酸与对甲苯磺酸的摩尔比为1:0.01。
所述的步骤1)中的重结晶溶剂是由体积比为(20:80)~(5:95)的水和乙醇混合而成的,水合肼水溶液的质量浓度为50%-85%。
所述的步骤2)中盐酸的浓度为0.5~3mol/L,苯相采用无水硫酸钠干燥。
所述的步骤3)中的纯化是指,将反应器内的剩余物用二氯甲烷溶解,在-20℃~-10℃的无水乙醚中沉淀,反复重复该溶解-沉淀过程。
所述的步骤4)中细胞毒抗癌药物为阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、喜树碱、10-羟基喜树碱、长春碱或长春新碱。
所述的步骤4)中每升无水有机溶剂中加入5~20克的端异氰酸酯基聚乙二醇,透析是在室温、避光条件下进行的,透析2~4天,每天更换透析液4~8次。
进一步的,所述的步骤1)中每升甲苯中加入0.3~2mol含二硫键的二元酸。
进一步的,所述的步骤2)中每摩含二硫键的二酰肼溶于2-10mL的盐酸中,亚硝酸钠水溶液的质量浓度为20%~50%。
进一步的,所述的步骤2)中每升位于无水甲苯中加入0.04~0.12mol的甲氧基聚乙二醇。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
本发明的还原敏感型聚乙二醇-药物偶联物是通过对谷胱甘肽等还原性环境敏感的二硫键连接的,可在肿瘤细胞还原性环境中迅速断裂,快速释放药物,有利于药物从内涵体向细胞质的转移,避免溶酶体的降解作用,从而提高药物疗效;该偶联物具有两亲性质,在水介质中能形成纳米粒,不仅显著提高细胞毒药物的溶解性和稳定性,延长体内半衰期,还能通过肿瘤组织特殊的EPR效应实现在肿瘤处的积聚,即被动靶向作用;与药物键接之前,端异氰酸酯基聚乙二醇反应活性高,能与多种基团在相对温和的条件下发生反应,可键接多种不同结构的细胞毒药物;该两亲性偶联物自组装成纳米粒的特性可被开发用于物理包埋其他游离态药物,实现联合治疗;该聚乙二醇-药物偶联物的制备方法具有原料易得、反应条件温和、产率和产物纯度高等优点,利于批量生产。
附图说明
图1是实施例1制得的还原敏感型聚乙二醇-阿霉素偶联物纳米粒的透射电镜(TEM)照片(a)和动态光散射(DLS)法测得的粒径分布图(b)。
图2是实施例2制得的还原敏感型聚乙二醇-紫杉醇偶联物纳米粒的TEM照片(a)和动态光散射(DLS)法测得的粒径分布图(b)。
图3是实施例3制得的还原敏感型聚乙二醇-喜树碱偶联物纳米粒的TEM照片(a)和动态光散射(DLS)法测得的粒径分布图(b)。
具体实施方式
本发明首先将含二硫键的二元酸、一元醇在对甲苯磺酸的催化下回流反应,然后去除溶剂,再向其中加入水合肼水溶液,回流反应,然后重结晶,得到含二硫键的二酰肼;将含二硫键的二酰肼溶于盐酸中,在冰盐水浴冷却下滴加亚硝酸钠水溶液,然后在室温下反应,反应完成后再加入盐酸,搅拌后分出苯相,苯相干燥;将经过干燥的苯相回流反应,反应结束后去除溶剂,即得含二硫键的二异氰酸酯;将得到的含二硫键的二异氰酸酯对端甲氧基聚乙二醇改性,得到端异氰酸酯基聚乙二醇,然后将细胞毒抗癌药物键接于端异氰酸酯基聚乙二醇上,经透析和冻干得到还原敏感型聚乙二醇-药物偶联物;其中,含二硫键的二元酸为2,2'-二硫代二乙酸、3,3'-二硫代二丙酸或4,4'-二硫代二丁酸。
当以2,2'-二硫代二乙酸为原料时,得到的还原敏感型聚乙二醇-药物偶联物的结构式为:
R为阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、喜树碱、10-羟基喜树碱、长春碱或长春新碱。
当以3,3'-二硫代二丙酸为原料时,得到的还原敏感型聚乙二醇-药物偶联物的结构式为:
R为阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、喜树碱、10-羟基喜树碱、长春碱或长春新碱。
当以4,4'-二硫代二丁酸为原料时,得到的还原敏感型聚乙二醇-药物偶联物的结构式为:
R为阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、喜树碱、10-羟基喜树碱、长春碱或长春新碱。
下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细说明。
实施例1:
1)3,3'-二硫代二丙酰肼的合成:
将3,3'-二硫代二丙酸与乙醇加入盛有甲苯和对甲苯磺酸的反应器中,回流反应8小时,然后真空去除溶剂,再向反应器内的剩余物中加入质量浓度为50%的水合肼水溶液,回流反应4小时,然后用体积比为5:95的水和乙醇混合而成的溶剂重结晶,即得3,3'-二硫代二丙酰肼;其中,所加入的3,3'-二硫代二丙酸与乙醇的摩尔比为1:15,3,3'-二硫代二丙酸与水合肼水溶液中的水合肼的摩尔比为1:20,3,3'-二硫代二丙酸与对甲苯磺酸的摩尔比为1:0.01,每升甲苯中加入0.5mol的3,3'-二硫代二丙酸;
2)2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯的合成:
将3,3'-二硫代二丙酰肼溶于2mol/L的盐酸中,在冰盐水浴冷却下滴加质量浓度为20%的亚硝酸钠水溶液,滴加完成后,在室温下反应4小时,再加入与盐酸等体积的苯,剧烈搅拌后分出苯相,苯相经无水硫酸钠干燥;将经过干燥的苯相于80℃下回流反应2小时,真空去除溶剂,即得2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯;其中,所加入的3,3'-二硫代二丙酰肼与亚硝酸钠水溶液中的亚硝酸钠的摩尔比为1:10,每毫摩尔3,3'-二硫代二丙酰肼溶于2mL的盐酸中;
3)端异氰酸酯基聚乙二醇的合成:
在氮气保护下,将分子量为1200道尔顿的甲氧基聚乙二醇和2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯加入无水甲苯中,于60℃下反应24小时,然后真空去除溶剂,将反应器内的剩余物用二氯甲烷溶解,再在-20℃的无水乙醚中沉淀,该溶解-沉淀过程重复3次,即得端异氰酸酯基聚乙二醇;其中,所加入的甲氧基聚乙二醇和2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比为1:10,每升无水甲苯中加入0.08mol的甲氧基聚乙二醇;
4)还原敏感型聚乙二醇-阿霉素偶联物的形成:
将端异氰酸酯基聚乙二醇和阿霉素溶于无水二甲亚砜中,于40℃下反应12小时,得反应液;将反应液浓缩至三分之一体积后用pH值为7.4的PBS缓冲液稀释至浓缩前的反应液体积,得混合体系;在室温、完全避光的条件下,混合体系在作为透析液的pH值为7.4的PBS缓冲液中透析2天,每天更换透析液4次,透析后将留在透析袋内的液体冷冻干燥,得到还原敏感型聚乙二醇-阿霉素偶联物,产率为92%;其中,每升无水二甲亚砜中加入5克的端异氰酸酯基聚乙二醇,所加入的端异氰酸酯基聚乙二醇和阿霉素的摩尔比为1:5。
由图1(a)的TEM照片可以看出还原敏感型聚乙二醇-阿霉素偶联物在水介质中能自组装形成纳米粒;由图1(b)可以看出DLS法测得的粒径分布范围为10~80nm,集中于40nm,因此,TEM结果小于DLS法测得的结果,这是因为TEM和DLS分别反映的是干态和湿态胶束的尺寸大小,干态时由于体积收缩而小一些。
实施例2:
1)2,2'-二硫代二乙酰肼的合成:
将2,2'-二硫代二乙酸与甲醇加入盛有甲苯和对甲苯磺酸的反应器中,回流反应6小时,然后真空去除溶剂,再向反应器内的剩余物中加入质量浓度为85%的水合肼水溶液,回流反应5小时,然后用体积比为2:8的水和乙醇混合而成的溶剂重结晶,即得2,2'-二硫代二乙酰肼;其中,所加入的2,2'-二硫代二乙酸与甲醇的摩尔比为1:30,2,2'-二硫代二乙酸与水合肼水溶液中水合肼的摩尔比为1:25,2,2'-二硫代二乙酸与对甲苯磺酸的摩尔比为1:0.01,每升甲苯中加入1mol的2,2'-二硫代二乙酸;
2)1,1'-二硫代二甲基异氰酸酯的合成:
将2,2'-二硫代二乙酰肼溶于0.5mol/L的盐酸中,在冰盐水浴冷却下滴加质量浓度为50%的亚硝酸钠水溶液,滴加完成后,在室温下反应3小时,再加入与盐酸等体积的苯,剧烈搅拌后分出苯相,苯相经无水硫酸钠干燥;将经过干燥的苯相于90℃下回流反应2小时,真空去除溶剂,即得1,1'-二硫代二甲基异氰酸酯;其中,所加入的2,2'-二硫代二乙酰肼与亚硝酸钠水溶液中的亚硝酸钠的摩尔比为1:15,每毫摩尔2,2'-二硫代二乙酰肼溶于10mL的盐酸中;
3)端异氰酸酯基聚乙二醇的合成:
在氮气保护下,将分子量为600道尔顿的甲氧基聚乙二醇和1,1'-二硫代二甲基异氰酸酯加入无水甲苯中,于70℃下反应18小时,然后真空去除溶剂,将反应器内的剩余物用二氯甲烷溶解,再在-10℃的无水乙醚中沉淀,该溶解-沉淀过程重复3次,即得端异氰酸酯基聚乙二醇;其中,所加入的甲氧基聚乙二醇和1,1'-二硫代二甲基异氰酸酯的摩尔比为1:12,每升无水甲苯中加入0.12mol的甲氧基聚乙二醇;
4)还原敏感型聚乙二醇-紫杉醇偶联物的形成:
将端异氰酸酯基聚乙二醇和紫杉醇溶于无水丙酮中,于40℃反应20小时,得反应液;将反应液浓缩至三分之一体积后用pH值为7.4的PBS缓冲液稀释至浓缩前的反应液体积,得混合体系;在室温、完全避光的条件下,混合体系在作为透析液的pH值为7.4的PBS缓冲液中透析2天,每天更换透析液7次,透析后将留在透析袋内的液体冷冻干燥,得到还原敏感型聚乙二醇-紫杉醇偶联物。产率为88%;其中,每升无水丙酮中加入8克的端异氰酸酯基聚乙二醇,所加入的端异氰酸酯基聚乙二醇和紫杉醇的摩尔比为1:12。
由图2(a)的TEM照片可以看出还原敏感型聚乙二醇-紫杉醇偶联物在水介质中能自组装形成纳米粒,由图2(b)可以看出DLS法测得的粒径分布范围为20~70nm,集中于50nm,因此,TEM结果小于DLS法测得的结果,这是因为TEM和DLS分别反映的是干态和湿态胶束的尺寸大小,干态时由于体积收缩而小一些。
实施例3:
1)3,3'-二硫代二丙酰肼的合成:
将3,3'-二硫代二丙酸与甲醇加入盛有甲苯和对甲苯磺酸的反应器中,回流反应9小时,然后真空去除溶剂,再向反应器内的剩余物中加入质量浓度为70%的水合肼水溶液,回流反应3小时,然后用体积比为1:9的水和乙醇混合而成的溶剂重结晶,即得3,3'-二硫代二丙酰肼;其中,所加入的3,3'-二硫代二丙酸与甲醇的摩尔比为1:18,3,3'-二硫代二丙酸与水合肼水溶液中的水合肼的摩尔比为1:24,每升甲苯中加入1.5mol的3,3'-二硫代二丙酸;
2)2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯的合成:
将3,3'-二硫代二丙酰肼溶于3mol/L的盐酸中,在冰盐水浴冷却下滴加质量浓度为30%的亚硝酸钠水溶液,滴加完成后,在室温下反应5小时,再加入与盐酸等体积的苯,剧烈搅拌后分出苯相,苯相经无水硫酸钠干燥;将经过干燥的苯相于90℃下回流反应2小时,真空去除溶剂,即得2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯;其中,所加入的3,3'-二硫代二丙酰肼与亚硝酸钠水溶液中的亚硝酸钠的摩尔比为1:8,每毫摩尔3,3'-二硫代二丙酰肼溶于2mL的盐酸中;
3)端异氰酸酯基聚乙二醇的合成:
在氮气保护下,将分子量为2500道尔顿的甲氧基聚乙二醇和2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯加入无水甲苯中,于80℃反应15小时,然后真空去除溶剂,将反应器内的剩余物用二氯甲烷溶解,在-15℃的无水乙醚中沉淀,该溶解-沉淀过程重复3次,即得端异氰酸酯基聚乙二醇;其中,所加入的甲氧基聚乙二醇和2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比为1:13,每升无水甲苯中加入0.04mol的甲氧基聚乙二醇;
4)还原敏感型聚乙二醇-喜树碱偶联物的形成:
将端异氰酸酯基聚乙二醇和喜树碱溶于无水氯仿中,于60℃下反应36小时,得反应液;将反应液浓缩至三分之一体积后用pH值为7.4的PBS缓冲液稀释至浓缩前的反应液体积,得混合体系;在室温、完全避光的条件下,混合体系在作为透析液的pH值为7.4的PBS缓冲液中透析4天,每天更换透析液4次,透析后将留在透析袋内的液体冷冻干燥,得到还原敏感型聚乙二醇-喜树碱偶联物,产率为85%;其中,每升无水氯仿中加入5克的端异氰酸酯基聚乙二醇,所加入的端异氰酸酯基聚乙二醇和喜树碱的摩尔比为1:6。
由图3(a)的TEM照片可以看出还原敏感型聚乙二醇-喜树碱偶联物在水介质中能自组装形成纳米粒,由图3(b)可以看出DLS法测得的粒径分布范围为20~60nm,集中于35nm,TEM结果小于DLS法测得的结果,这是因为TEM和DLS分别反映的是干态和湿态胶束的尺寸大小,干态时由于体积收缩而小一些。
实施例4:
1)3,3'-二硫代二丙酰肼的合成:
将3,3'-二硫代二丙酸与甲醇加入盛有甲苯和对甲苯磺酸的反应器中,回流反应12小时,真空去除溶剂,再向反应器内的剩余物中加入质量浓度为65%的水合肼水溶液,回流反应6小时,然后用体积比为1:9的水和乙醇混合而成的溶剂重结晶,即得3,3'-二硫代二丙酰肼;其中,所加入的3,3'-二硫代二丙酸与甲醇的摩尔比为1:10,3,3'-二硫代二丙酸与水合肼水溶液中的水合肼的摩尔比为1:40,3,3'-二硫代二丙酸与对甲苯磺酸的摩尔比为1:0.01,每升甲苯中加入1mol的3,3'-二硫代二丙酸;
2)2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯的合成:
将3,3'-二硫代二丙酰肼溶于3mol/L的盐酸中,在冰盐水浴冷却下滴加质量浓度为40%的亚硝酸钠水溶液,滴加完成后,在室温下反应2小时,再加入与盐酸等体积的苯,剧烈搅拌后分出苯相,苯相经无水硫酸钠干燥;将经过干燥的苯相于60℃下回流反应4小时,真空去除溶剂,即得2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯;其中,其中,所加入的3,3'-二硫代二丙酰肼与亚硝酸钠水溶液中的亚硝酸钠的摩尔比为1:5,每毫摩尔3,3'-二硫代二丙酰肼溶于2.8mL的盐酸中;
3)端异氰酸酯基聚乙二醇的合成:
在氮气保护下,将分子量为800道尔顿的甲氧基聚乙二醇和2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯加入无水甲苯中,于80℃反应12小时,然后真空去除溶剂,将反应器内的剩余物用二氯甲烷溶解,在-18℃的无水乙醚中沉淀,该溶解-沉淀过程重复3次,得到端异氰酸酯基聚乙二醇;其中,所加入甲氧基聚乙二醇和2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比为1:8,每升无水甲苯中加入0.06mol的甲氧基聚乙二醇;
4)还原敏感型聚乙二醇-表阿霉素偶联物的形成:
将端异氰酸酯基聚乙二醇和表阿霉素溶于无水二甲亚砜中,于60℃反应12小时,得反应液;将反应液浓缩至三分之一体积后用pH为7.4的PBS缓冲液稀释至浓缩前的反应液体积,得混合体系;在室温、完全避光的条件下,混合体系在作为透析液的pH值为7.4的PBS缓冲液中透析3天,每天更换透析液6次,透析后将留在透析袋内的液体冷冻干燥,得到还原敏感型聚乙二醇-表阿霉素偶联物,产率为91%;其中,每升无水二甲亚砜中加入20克的端异氰酸酯基聚乙二醇,所加入的端异氰酸酯基聚乙二醇和表阿霉素的摩尔比为1:15。
实施例5:
1)4,4'-二硫代二丁酰肼的合成:
将4,4'-二硫代二丁酸与乙醇加入盛有甲苯和对甲苯磺酸的反应器中,回流反应12小时,真空去除溶剂,再向反应器内的剩余物中加入质量浓度为60%的水合肼水溶液,回流反应5小时,然后用体积比为15:85的水和乙醇混合而成的溶剂重结晶,即得4,4'-二硫代二丁酰肼;其中,所加入的4,4'-二硫代二丁酸与乙醇的摩尔比为1:30,4,4'-二硫代二丁酸与水合肼水溶液中的水合肼的摩尔比为1:40,4,4'-二硫代二丁酸与对甲苯磺酸的摩尔比为1:0.01,每升甲苯中加入0.5mol的4,4'-二硫代二丁酸;
2)3,3'-二硫代二丙基异氰酸酯的合成:
将4,4'-二硫代二丁酰肼溶于2mol/L的盐酸中,在冰盐水浴冷却下滴加质量浓度为35%的亚硝酸钠水溶液,滴加完成后,在室温下反应6小时,再加入与盐酸等体积的苯,剧烈搅拌后分出苯相,苯相经无水硫酸钠干燥;将经过干燥的苯相于60℃下回流反应4小时,真空去除溶剂,即得3,3'-二硫代二丙基异氰酸酯;其中,所加入的4,4'-二硫代二丁酰肼与亚硝酸钠水溶液中的亚硝酸钠的摩尔比为1:11,每毫摩尔4,4'-二硫代二丁酰肼溶于4mL的盐酸中;
3)端异氰酸酯基聚乙二醇的合成:
在氮气保护下,将分子量为2000道尔顿的甲氧基聚乙二醇和3,3'-二硫代二丙基异氰酸酯加入无水甲苯中,于85℃反应16小时,然后真空去除溶剂,将反应器内的剩余物用二氯甲烷溶解,在-20℃的无水乙醚中沉淀,该溶解-沉淀过程重复3次,得到端异氰酸酯基聚乙二醇;其中,所加入的甲氧基聚乙二醇和3,3'-二硫代二丙基异氰酸酯的摩尔比为1:10,每升无水甲苯中加入0.05mol的甲氧基聚乙二醇;
4)还原敏感型聚乙二醇-多西紫杉醇偶联物的形成:
将端异氰酸酯基聚乙二醇和多西紫杉醇溶于无水丙酮中,于50℃反应21小时,得反应液;将反应液浓缩至三分之一体积后用pH值为7.4的PBS缓冲液稀释至原体积,得混合体系;在室温、完全避光的条件下,混合体系在作为透析液的pH值为7.4的PBS缓冲液透析4天,每天更换透析液7次,透析后将留在透析袋内的液体冷冻干燥,得到还原敏感型聚乙二醇-多西紫杉醇偶联物,产率为86%;其中,每升无水丙酮中加入15克的端异氰酸酯基聚乙二醇,所加入的端异氰酸酯基聚乙二醇和多西紫杉醇的摩尔比为1:9。
实施例6:
1)2,2'-二硫代二乙酰肼的合成:
将2,2'-二硫代二乙酸与甲醇加入盛有甲苯和对甲苯磺酸的反应器中,回流反应6小时,然后真空去除溶剂,再向反应器内的剩余物中加入质量浓度为72%的水合肼水溶液,回流反应4小时,然后用体积比为1:9的水和乙醇混合而成的溶剂重结晶,即得2,2'-二硫代二乙酰肼;其中,所加入的2,2'-二硫代二乙酸与甲醇的摩尔比为1:10,2,2'-二硫代二乙酸与水合肼水溶液中水合肼的摩尔比为1:35,2,2'-二硫代二乙酸与对甲苯磺酸的摩尔比为1:0.01,每升甲苯中加入2mol的2,2'-二硫代二乙酸;
2)1,1'-二硫代二甲基异氰酸酯的合成:
将2,2'-二硫代二乙酰肼溶于1.5mol/L的盐酸中,在冰盐水浴冷却下滴加质量浓度为45%的亚硝酸钠水溶液,滴加完成后,在室温下反应6小时,再加入与盐酸等体积的苯,剧烈搅拌后分出苯相,苯相经无水硫酸钠干燥;将经过干燥的苯相于70℃下回流反应3小时,真空去除溶剂,即得1,1'-二硫代二甲基异氰酸酯;其中,所加入的2,2'-二硫代二乙酰肼与亚硝酸钠水溶液中的亚硝酸钠的摩尔比为1:7,每毫摩尔2,2'-二硫代二乙酰肼溶于2.8mL的盐酸中;
3)端异氰酸酯基聚乙二醇的合成:
在氮气保护下,将分子量为1200道尔顿的甲氧基聚乙二醇和1,1'-二硫代二甲基异氰酸酯加入无水甲苯中,于105℃反应6小时,然后真空去除溶剂,将反应器内的剩余物用二氯甲烷溶解,再在-20℃的无水乙醚中沉淀,该溶解-沉淀过程重复3次,即得端异氰酸酯基聚乙二醇;其中,所加入的甲氧基聚乙二醇和1,1'-二硫代二甲基异氰酸酯的摩尔比为1:8,每升无水甲苯中加入0.07mol的甲氧基聚乙二醇;
4)还原敏感型聚乙二醇-10-羟基喜树碱偶联物的形成:
将端异氰酸酯基聚乙二醇和10-羟基喜树碱溶于无水氯仿中,于60℃反应36小时,得反应液;将反应液浓缩至三分之一体积后用pH值为7.4的PBS缓冲液稀释至浓缩前的反应液体积,得混合体系;在室温、完全避光的下,混合体系在作为透析液的pH值为7.4的PBS缓冲液中透析3天,每天更换透析液7次,透析后将留在透析袋内的液体冷冻干燥,得到聚乙二醇-10-羟基喜树碱偶联物,产率为87%;其中,每升无水氯仿中加入8克聚乙二醇,所加入的端异氰酸酯基聚乙二醇和10-羟基喜树碱的摩尔比为1:12。
实施例7:
1)4,4'-二硫代二丁酰肼的合成:
将4,4'-二硫代二丁酸与乙醇加入盛有甲苯和对甲苯磺酸的反应器中,回流反应10小时,真空去除溶剂,再向反应器内的剩余物中加入质量浓度为60%的水合肼水溶液,回流反应2小时,然后用体积比为1:10的水和乙醇混合而成的溶剂重结晶,即得4,4'-二硫代二丁酰肼;其中,所加入的4,4'-二硫代二丁酸与乙醇的摩尔比为1:25,4,4'-二硫代二丁酸与水合肼水溶液中的水合肼的摩尔比为1:30,4,4'-二硫代二丁酸与对甲苯磺酸的摩尔比为1:0.01,每升甲苯中加入0.4mol的4,4'-二硫代二丁酸;
2)3,3'-二硫代二丙基异氰酸酯的合成:
将4,4'-二硫代二丁酰肼溶于2mol/L的盐酸中,在冰盐水浴冷却下滴加质量浓度为30%的亚硝酸钠水溶液,滴加完成后,在室温下反应8小时,再加入与盐酸等体积的苯,剧烈搅拌后分出苯相,苯相经无水硫酸钠干燥;将经过干燥的苯相于60℃下回流反应4小时,真空去除溶剂,即得3,3'-二硫代二丙基异氰酸酯;其中,所加入的4,4'-二硫代二丁酰肼与亚硝酸钠水溶液中的亚硝酸钠的摩尔比为1:11,每毫摩尔4,4'-二硫代二丁酰肼溶于2.5mL的盐酸中;
3)端异氰酸酯基聚乙二醇的合成:
在氮气保护下,将分子量为3000道尔顿的甲氧基聚乙二醇和3,3'-二硫代二丙基异氰酸酯加入无水甲苯中,于85℃反应16小时,然后真空去除溶剂,将反应器内的剩余物用二氯甲烷溶解,在-20℃的无水乙醚中沉淀,该溶解-沉淀过程重复3次,得到端异氰酸酯基聚乙二醇;其中,所加入的甲氧基聚乙二醇和3,3'-二硫代二丙基异氰酸酯的摩尔比为1:16,每升无水甲苯中加入0.04mol的甲氧基聚乙二醇;
4)还原敏感型聚乙二醇-长春碱偶联物的形成:
将端异氰酸酯基聚乙二醇和长春碱溶于无水丙酮中,于50℃反应21小时,得反应液;将反应液浓缩至三分之一体积后用pH值为7.4的PBS缓冲液稀释至原体积,得混合体系;在室温、完全避光的条件下,混合体系在作为透析液的pH值为7.4的PBS缓冲液透析4天,每天更换透析液7次,透析后将留在透析袋内的液体冷冻干燥,得到还原敏感型聚乙二醇-长春碱偶联物;其中,每升无水丙酮中加入7克的端异氰酸酯基聚乙二醇,所加入的端异氰酸酯基聚乙二醇和长春碱的摩尔比为1:9。
实施例8:
1)3,3'-二硫代二丙酰肼的合成:
将3,3'-二硫代二丙酸与甲醇加入盛有甲苯和对甲苯磺酸的反应器中,回流反应12小时,真空去除溶剂,再向反应器内的剩余物中加入质量浓度为65%的水合肼水溶液,回流反应6小时,然后用体积比为1:9的水和乙醇混合而成的溶剂重结晶,即得3,3'-二硫代二丙酰肼;其中,所加入的3,3'-二硫代二丙酸与甲醇的摩尔比为1:10,3,3'-二硫代二丙酸与水合肼水溶液中的水合肼的摩尔比为1:40,3,3'-二硫代二丙酸与对甲苯磺酸的摩尔比为1:0.01,每升甲苯中加入0.7mol的3,3'-二硫代二丙酸;
2)2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯的合成:
将3,3'-二硫代二丙酰肼溶于3mol/L的盐酸中,在冰盐水浴冷却下滴加质量浓度为45%的亚硝酸钠水溶液,滴加完成后,在室温下反应2小时,再加入与盐酸等体积的苯,剧烈搅拌后分出苯相,苯相经无水硫酸钠干燥;将经过干燥的苯相于100℃下回流反应1小时,真空去除溶剂,即得2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯;其中,其中,所加入的3,3'-二硫代二丙酰肼与亚硝酸钠水溶液中的亚硝酸钠的摩尔比为1:5,每毫摩尔3,3'-二硫代二丙酰肼溶于2.5mL的盐酸中;
3)端异氰酸酯基聚乙二醇的合成:
在氮气保护下,将分子量为400道尔顿的甲氧基聚乙二醇和2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯加入无水甲苯中,于110℃反应6小时,然后真空去除溶剂,将反应器内的剩余物用二氯甲烷溶解,在-18℃的无水乙醚中沉淀,该溶解-沉淀过程重复3次,得到端异氰酸酯基聚乙二醇;其中,所加入甲氧基聚乙二醇和2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比为1:20,每升无水甲苯中加入0.12mol的甲氧基聚乙二醇;
4)还原敏感型聚乙二醇-表阿霉素偶联物的形成:
将端异氰酸酯基聚乙二醇和表阿霉素溶于无水二甲亚砜中,于45℃反应30小时,得反应液;将反应液浓缩至三分之一体积后用pH为7.4的PBS缓冲液稀释至浓缩前的反应液体积,得混合体系;在室温、完全避光的条件下,混合体系在作为透析液的pH值为7.4的PBS缓冲液中透析3天,每天更换透析液8次,透析后将留在透析袋内的液体冷冻干燥,得到还原敏感型聚乙二醇-表阿霉素偶联物,产率为91%;其中,每升无水二甲亚砜中加入20克的端异氰酸酯基聚乙二醇,所加入的端异氰酸酯基聚乙二醇和表阿霉素的摩尔比为1:15。
实施例9:
1)4,4'-二硫代二丁酰肼的合成:
将4,4'-二硫代二丁酸与乙醇加入盛有甲苯和对甲苯磺酸的反应器中,回流反应10小时,真空去除溶剂,再向反应器内的剩余物中加入质量浓度为60%的水合肼水溶液,回流反应2小时,然后用体积比为1:10的水和乙醇混合而成的溶剂重结晶,即得4,4'-二硫代二丁酰肼;其中,所加入的4,4'-二硫代二丁酸与乙醇的摩尔比为1:25,4,4'-二硫代二丁酸与水合肼水溶液中的水合肼的摩尔比为1:30,4,4'-二硫代二丁酸与对甲苯磺酸的摩尔比为1:0.01,每升甲苯中加入0.3mol的4,4'-二硫代二丁酸;
2)3,3'-二硫代二丙基异氰酸酯的合成:
将4,4'-二硫代二丁酰肼溶于2mol/L的盐酸中,在冰盐水浴冷却下滴加质量浓度为30%的亚硝酸钠水溶液,滴加完成后,在室温下反应8小时,再加入与盐酸等体积的苯,剧烈搅拌后分出苯相,苯相经无水硫酸钠干燥;将经过干燥的苯相于60℃下回流反应4小时,真空去除溶剂,即得3,3'-二硫代二丙基异氰酸酯;其中,所加入的4,4'-二硫代二丁酰肼与亚硝酸钠水溶液中的亚硝酸钠的摩尔比为1:11,每毫摩尔4,4'-二硫代二丁酰肼溶于2.5mL的盐酸中;
3)端异氰酸酯基聚乙二醇的合成:
在氮气保护下,将分子量为3000道尔顿的甲氧基聚乙二醇和3,3'-二硫代二丙基异氰酸酯加入无水甲苯中,于85℃反应16小时,然后真空去除溶剂,将反应器内的剩余物用二氯甲烷溶解,在-20℃的无水乙醚中沉淀,该溶解-沉淀过程重复3次,得到端异氰酸酯基聚乙二醇;其中,所加入的甲氧基聚乙二醇和3,3'-二硫代二丙基异氰酸酯的摩尔比为1:16,每升无水甲苯中加入0.04mol的甲氧基聚乙二醇;
4)还原敏感型聚乙二醇-长春碱偶联物的形成:
将端异氰酸酯基聚乙二醇和长春碱溶于无水丙酮中,于50℃反应21小时,得反应液;将反应液浓缩至三分之一体积后用pH值为7.4的PBS缓冲液稀释至原体积,得混合体系;在室温、完全避光的条件下,混合体系在作为透析液的pH值为7.4的PBS缓冲液透析4天,每天更换透析液7次,透析后将留在透析袋内的液体冷冻干燥,得到还原敏感型聚乙二醇-长春碱偶联物;其中,每升无水丙酮中加入7克的端异氰酸酯基聚乙二醇,所加入的端异氰酸酯基聚乙二醇和长春碱的摩尔比为1:9。
肿瘤细胞独特的酸性和生物还原性微环境是目前各种快速释放药物设计的理论基础。肿瘤细胞内晚期内涵体的pH值可低至4.5,与正常组织的pH值=7.4有明显差异,而具有生物还原性的谷胱甘肽的浓度比血液循环系统高约1000倍(ZY Zhong,et al.Journal of Controlled Release,2011,152:2-12),它们是药物释放促发机制的研究热点。如申请号为201110113954.X的中国专利公开了一种通过酸敏感性的腙键连接的聚乙二醇-阿霉素偶联物,可响应内涵体酸性而快速释放药物,利于阿霉素向细胞质中的转移。通过酸敏感化学键如缩醛连接聚乙二醇和聚乙烯亚胺的基因药物载体,可在内涵体酸性环境中脱除聚乙二醇,使siRNA的沉默效率提高10~100倍(E Wagner.Accounts ofChemical Research,2012,45:1005-1013)。
而通过二硫键连接的聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物或聚乙二醇-聚酰胺嵌段共聚物胶束包埋阿霉素后,在癌细胞内会因二硫键断裂而快速释放阿霉素(Biomaterials,2009,30:6358-6366和Biomaterials,2010,31:7124)。申请号为201110122969.2的中国专利公开了一种利用3,3’-二硫代二丙酸改性的Pluronic通过酯键键接紫杉醇获得二硫键连接的聚合物-紫杉醇偶联物,可望能在癌细胞内快速释放药物,有效杀伤耐药细胞株。