CN104356196A

CN104356196A - 基于寡肽的还原敏感脂质衍生物及其在药物递送中的应用

Info

Publication number: CN104356196A
Application number: CN201410543515.6A
Authority: CN
Inventors: 张灿; 孙琼; 徐学凡; 康子圣; 尚云凯
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2014-10-14
Filing date: 2014-10-14
Publication date: 2015-02-18

Abstract

本发明涉及药用辅料与制剂领域。具体涉及一类基于寡肽的还原敏感脂质衍生物及其在药物递送中的应用。本发明的还原敏感脂质，其结构以谷氨酸为骨架，脂肪长链(十四或十八烷烃)为疏水部分，碱性氨基酸(赖氨酸或精氨酸)或小分子羧酸(六氢苯酸或丁二酸)为亲水部分，并以还原敏感键二硫键和组氨酸作为连接臂。本发明还原敏感脂质衍生物形成的脂质体与普通脂质体相比具有质子缓冲能力，有利于药物从内涵体中逃逸出来，发挥药效。其中的二硫键可在谷胱甘肽还原环境中发生断裂，导致脂质体不稳定，从而实现靶部位的药物释放。

Description

基于寡肽的还原敏感脂质衍生物及其在药物递送中的应用

技术领域

本发明涉及药用辅料与制剂领域。具体涉及一类还原敏感脂质衍生物及其制备方法，还涉及其作为纳米药物载体在制剂中的应用如组装成脂质体用于药物的递送。

背景技术

近年来，纳米生物技术的飞速发展使得纳米药物载体在人类重大疾病的预防、诊断和治疗等方面得到了广泛的关注和研究。纳米药物载体可以改变给药途径和药物在体内的分布，并具有靶组织选择性，提高药物的生物利用度，实现安全有效的靶向药物输送和治疗。理想的纳米药物载体必须具有良好的溶酶体逃逸功能，并在胞内实现药物的快速释放。

脂质体作为药物载体具有使药物靶向网状内皮系统、延长药效、降低药物毒性、提高疗效、避免耐受性、改变给药途径等优点。通过对脂质结构的改造，可以赋予脂质体多种性质和功能用于药物的高效递送，其中，还原敏感性型脂质体是基于细胞内外存在的巨大的还原势能梯度而设计的，其结构中含有二硫键，在胞质中，还原性谷光氨肽的的浓度大约为0.5－10mmol/L，而在细胞外，其浓度约为2－20μmol/L，二者相差3个数量级。因此，含有二硫键的还原敏感型脂质体在细胞外能够保持稳定，而在胞内的还原性环境中会发生谷胱甘肽(GSH)介导的巯基－二硫键交换反应使二硫键断裂，导致脂质体结构破坏，从而使药物从脂质体中迅速释放出来，实现药物的控制释放。与传统的脂质体相比，还原敏感型脂质体具有毒性低、促进药物的胞内释放、生物利用度高的特点。

发明内容

本发明公开了一类基于寡肽的还原敏感脂质，其结构以谷氨酸为骨架，脂肪长链(十四或十八烷烃)为疏水部分，碱性氨基酸(赖氨酸或精氨酸)或小分子羧酸(六氢苯酸或丁二酸)为亲水部分，并以还原敏感键二硫键和组氨酸作为连接臂。

本发明的基于寡肽的还原敏感脂质衍生物(I)的结构式如下：

本发明基于寡肽的还原敏感脂质衍生物制备方法包括：

a.将二乙胺盐酸盐、二碳酸二叔丁酯(Boc)₂O和三乙胺溶于甲醇(或乙醇)中，室温搅拌3h-6h，反应结束后，将反应液浓缩，加入1M NaH₂PO₄水溶液，用乙醚萃取，水层用1M氢氧化钠(氢氧化钾)水溶液调节pH至9，再用乙酸乙酯(或二氯甲烷)萃取，合并有机层，用水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩得无色油状物；将无色油状物，丁二酸酐(SA)和对二甲氨基吡啶(DMAP)溶解于二氯甲烷(或三氯甲烷)，室温下搅拌3h-6h。反应结束后，用1M KHSO₄水溶液洗涤，有机层用适量饱和食盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂后得无色油状1-(叔丁氧羰基)-8-(3-羧基丙酰基)胱胺1。

合成路线如下：

b.将谷氨酸和对甲苯磺酸溶于甲苯中，回流1h-3h。加入脂肪醇(十四醇或十八醇)，回流5h-15h。反应结束后，减压蒸馏去除甲苯。浓缩物甲醇(或乙醇，或丙酮)重结晶，将得到的白色粉末状固体溶解于适量二氯甲烷(或三氯甲烷，或乙酸乙酯)，用5％-15％碳酸氢钠溶液(或碳酸钠，或碳酸钾)水溶液洗涤，再用适量的饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，得白色粉末状固体谷氨酸脂肪醇酯2。

合成路线如下：

c.将化合物1，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和1-羟基苯并三氮唑(HOBt)溶于氯仿(或四氢呋喃，或N，N-二甲基甲酰胺)中，室温搅拌2h-4h；将化合物2和三乙胺溶于氯仿(或二氯甲烷)中，室温搅拌0.5h-2h后，加入上述混合溶液中，室温搅拌10h-15h。反应结束后，反应液用水洗涤，再用适量饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂后得白色固体，经柱层析纯化得白色固体，将其溶解于饱和HCl的乙酸乙酯溶液(HCl/EA)，0℃搅拌10h-15h，过滤干燥得白色蜡状固体2-(9-氧代-4,5-二硫-1,8-二氮杂十二烷基酰胺)戊二酸二脂肪醇酯3。

合成路线如下：

d.将N-叔丁氧羰基-N(咪唑)-(4-甲基苯磺酰基)-L-组氨酸(Boc-His(Tos)-OH)、EDCI和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶于氯仿中，室温搅拌1h-3h；将化合物3和三乙胺溶于氯仿(或四氢呋喃,或N，N-二甲基甲酰胺)中，室温搅拌0.5h-2h后，加入上述混合溶液中，室温搅拌10h-15h。反应结束后，反应液用水洗涤，再用适量饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂后得白色固体，经柱层析纯化得白色固体，将白色固体溶解在三氟醋酸/二氯甲烷的混合溶液中，室温搅拌3h-5h；反应结束后，加入5％-15％碳酸氢钠水溶液调节pH值至中性，加入适量二氯甲烷，充分搅拌后分层，用二氯甲烷(或氯仿)萃取，合并有机层，用适量饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂后得黄色固体，经柱层析纯化得白色固体2-(3,12-二羰基-2-((1-对甲苯磺酰基-咪唑-4-基)甲基)-7,8-二硫-1,4,11-三氮杂十五烷基)戊二酸二脂肪醇醇酯4。

合成路线如下：

e.将(S)-2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸(Boc-Lys(Boc)-OH)或N-叔丁氧羰基-N'-硝基-L-精氨酸(Boc-Arg(NO₂)-OH)，EDCI和NHS溶于氯仿(或四氢呋喃，或N,N-二甲基甲酰胺)中，室温搅拌1h-3h；将化合物4和三乙胺溶于氯仿(或二氯甲烷)中，室温搅拌0.5h-2h后，加入上述混合溶液中，室温搅拌10h-15h。反应结束后，反应液用水洗涤，再用适量饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂后得白色固体，经柱层析纯化得白色固体。将白色固体溶于四氢呋喃中，40℃搅拌下，加入1-羟基苯并三氮唑(HOBt)继续搅拌3h-6h。反应结束后，蒸去溶剂，经柱层析纯化得白色蜡状固体。将其溶解于饱和HCl的乙酸乙酯溶液，0℃搅拌10h-15h，或将白色蜡状固体溶于四氢呋喃，加入Pd/C，通氢气，室温搅拌10h-15h，抽滤浓缩，将浓缩物溶于饱和HCl的乙酸乙酯溶液，0℃搅拌10h-15h，过滤干燥得2-(6-氨基-7,10,19-三氧代-9-((1H-咪唑-4-基)甲基)-14,15-二硫-1,8,11,18-四氮杂二十二烷基酰胺)戊二酸双十四醇二酯或2-(6-胍基-7,10,19-三氧代-9-((1H-咪唑-4-基)甲基)-14,15-二硫-1,8,11,18-四氮杂二十二烷基酰胺)戊二酸二脂肪醇酯。

合成路线如下:

将化合物4、六氢苯酐HHPA或丁二酸酐SA和对二甲氨基吡啶(DMAP)溶解于二氯甲烷，室温下搅拌3h-6h。反应结束后，用1M KHSO4水溶液洗涤，有机层用适量饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂后得白色油状物。将该白色油状物)溶于四氢呋喃(或二氯甲烷)中，40℃搅拌下，加入1-羟基苯并三氮唑(HOBt)继续搅拌3h-6h。反应结束后，蒸去溶剂，得白色固体，经柱层析纯化得2-(2-(2-羧基环己甲酰氨基)-3,12-二氧代-1-(1H-咪唑-4-基)-7,8-二硫-4,11-二氮杂十五烷基酰胺)戊二酸双十四醇二酯或2-(2-(2-羧基丁酰胺基)-3,12-二氧代-1-(1H-咪唑-4-基)-7,8-二硫-4,11-二氮杂十五烷基酰胺)戊二酸双十四醇二酯。

合成路线如下：

本发明的基于寡肽的还原敏感脂质衍生物作为脂质体修饰剂可赋予脂质体阳离子性或两性离子性，从而用于基因药物或抗肿瘤药物的包载，实现药物在靶部位的释放，提高生物利用度。

本发明还公开了一种空白脂质体，含脂质体基质和本发明的的脂质衍生物(I)。所述脂质体基质为磷脂。脂质体基质还可以含胆固醇。

本发明还公开了一种药物脂质体，含药物、脂质体基质和本发明的的脂质衍生物(I)。所述脂质体基质为磷脂。脂质体基质还可以含胆固醇。

空白脂质体或药物脂质体中，还原敏感脂质衍生物与脂质体基质的重量比优选1:1-1:8。药物脂质体中的药物优选基因治疗药物或水溶性抗肿瘤药物。基因治疗药物优选siRNA和质粒。水溶性抗肿瘤药物优选阿霉素、氟尿嘧啶或盐酸阿糖胞苷。

基因治疗药物和还原敏感脂质衍生物的氮磷比优选1:3-1:10。水溶性抗肿瘤药物和还原敏感脂质衍生物的重量比优选1:40-1:60。

本发明的基于寡肽的还原敏感脂质衍生物可以在胞质谷胱甘肽还原环境中发生二硫键的断裂，导致脂质体结构的不稳定，从而将药物释放到胞质，发挥药效。

本发明的基于寡肽的还原敏感脂质衍生物可以制备得到还原敏感阳离子脂质体，试验显示其可以与siRNA发生静电相互作用而形成稳定的二元复合物(见实施例9)。且可以保护siRNA不被核酸酶降解(见实施例11)，提高siRNA的稳定性。本发明的基于寡肽的还原敏感脂质衍生物可以制备得到还原敏感两性离子脂质体，其可以用于抗肿瘤药物阿霉素的包载，且具有电荷反转的特性(见实施例13),即在血液循环中性pH条件下，脂质体表面带负电，可避免与血浆蛋白的结合，延长血液循环时间，提高肿瘤靶向性；当到达肿瘤弱酸性微环境时，可以发生电荷反转而带正电，从而有利于肿瘤细胞的摄取，提高药物在肿瘤细胞中的富集，提高药物的抗肿瘤作用。本发明的基于寡肽的还原敏感脂质衍生物形成的脂质体与普通脂质体相比还具有质子缓冲能力(见实施例15)，有利于药物从内涵体中逃逸出来，发挥药效。本发明的基于寡肽的还原敏感脂质衍生物中的二硫键可在谷胱甘肽还原环境中发生断裂，导致脂质体不稳定，从而实现靶部位的药物释放(见实施例12和实施例18)。

附图说明

图1是本发明还原敏感阳离子脂质体与siRNA形成二元复合物的凝胶电泳分析

图2是本发明还原敏感阳离子脂质体与siRNA形成二元复合物的粒径和电位

图3是本发明还原敏感阳离子脂质体在核酸酶存在下对siRNA的保护作用

图4是本发明还原敏感阳离子脂质体在谷胱甘肽作用下释放siRNA

图5是本发明还原敏感两性离子脂质体的降解动力学

图6是本发明还原敏感两性离子脂质体的质子缓冲能力

图7是本发明还原敏感两性离子脂质体在谷胱甘肽存在下对阿霉素的释放

具体实施方式

实施例1

2-(6-氨基-7,10,19-三氧代-9-((1H-咪唑-4-基)甲基)-14,15-二硫-1,8,11,18-四氮杂二十二烷基酰胺)戊二酸双十四醇二酯的合成

将胱胺二盐酸盐(3.0g，13.3mmol)溶于150mL甲醇中，加入三乙胺(5.79mL，39.9mmol)后，室温下缓慢滴加二碳酸二叔丁酯((Boc)₂O，2.9g，13.3mmol)的MeOH溶液，加完后室温搅拌5h。反应结束后，将反应液旋干，加入1M NaH₂PO₄水溶液60mL，用乙醚萃取(60mL×2)，水层用1M NaOH水溶液调节pH至9，再用乙酸乙酯萃取(40mL×2)，合并有机层，用水洗涤(60mL×2)，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，得白色油状物1.57g。将白色油状物(1.57g，6.23mmol)溶于80mL二氯甲烷中，室温搅拌下，将丁二酸酐(SA，0.62g，6.23mmol)和对二甲氨基吡啶(0.23g，1.87mmol)溶解于15mL二氯甲烷，将其加入反应瓶中，室温下搅拌5h。反应结束后，用1M KHSO₄水溶液洗涤(50mL×2)，有机层用适量饱和食盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂后得2.12g白色油状物A。将谷氨酸(2.9g，19.7mmol)和对甲苯磺酸(TsOH，2.22g，11.7mmol)溶于50mL甲苯中，回流1h。加入正十四醇(5.0g，23.3mmol)回流12h。反应结束后，减压蒸馏去除甲苯。浓缩物用35mL甲醇重结晶，将得到的白色粉末状固体溶解于适量二氯甲烷，用5％碳酸氢钠水溶液洗涤(10mL×2)，再用适量的饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，得3.42g白色粉末状固体B。将A(2.12g，6.0mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI，2.31g，12.0mmol)；1-羟基苯并三氮唑(HOBt，1.62g，12.0mmol)溶于80mL氯仿中，室温搅拌3h；将B(3.24g，6.0mmol)和三乙胺(3.36mL，24.0mmol)溶于40mL氯仿中，室温搅拌1h后，加入上述混合溶液中，室温搅拌12h。反应结束后，反应液用水洗涤(80mL×2)，再用适量饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂后得白色固体，经柱层析纯化(二氯甲烷︰甲醇＝60︰1)得白色固体4.1g。将白色固体(4.1g，4.7mmol)溶解于200mL饱和HCl的乙酸乙酯溶液，0℃搅拌12h，过滤干燥得3.3g白色蜡状固体C。将Boc-His(Tos)-OH(0.81g，2.0mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI，0.76g，4.0mmol)；N-羟基丁二酰亚胺(NHS，0.45g，4.0mmol)溶于40mL氯仿中，室温搅拌3h；将C(1.6g，2.0mmol)和三乙胺(1.1mL，8.7mmol)溶于20mL氯仿中，室温搅拌1h后，加入上述混合溶液中，室温搅拌12h。反应结束后，反应液用水洗涤(50mL×2)，再用适量饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂后得白色固体，经柱层析纯化(二氯甲烷︰甲醇＝50︰1)得白色固体1.7g。将白色固体(1.7g，1.5mmol)溶解在三氟醋酸(TFA，3mL)和3mL二氯甲烷的混合溶液中，室温搅拌4h；反应结束后，加入5％碳酸氢钠水溶液调节pH值至中性，加入适量二氯甲烷，充分搅拌后分层，用二氯甲烷萃取(15mL×3)，合并有机层，用适量饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂后得黄色固体，经柱层析纯化(二氯甲烷︰甲醇＝25︰1)得1.1g白色固体D。将Boc-Lys(Boc)-OH(0.5g，1.4mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI，0.54g，2.8mmol)；N-羟基丁二酰亚胺(NHS，0.32g，2.8mmol)溶于20mL氯仿中，室温搅拌3h；将D(1.5g，1.4mmol)和三乙胺(0.6mL，4.2mmol)溶于30mL氯仿中，室温搅拌1h后，加入上述混合溶液中，室温搅拌12h。反应结束后，反应液用水洗涤(30mL×2)，再用适量饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂后得白色固体，经柱层析纯化(二氯甲烷︰甲醇＝40︰1)得白色固体1.57g。将白色固体(1.57g，1.1mmol)溶于50mL四氢呋喃中，40℃搅拌下，加入1-羟基苯并三氮唑(HOBt，1.82g，13.5mmol)，继续搅拌5h。反应结束后，蒸去溶剂，得白色固体，经柱层析纯化(二氯甲烷︰甲醇＝15︰1)，得白色蜡状固体1.25g，将白色蜡状固体(1.25g，1.0mmol)溶解于20mL饱和HCl的乙酸乙酯溶液，0℃搅拌12h，过滤干燥得白色蜡状固体0.9g，收率：78.4％。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃+CD₃OD)δ:8.74(1H,s,NCHNH),7.72(1H,m,NC＝CHNH),4.94(1H,m,NHCOCHNHCO),4.49(1H,m,OCOCHNHCO),4.08(4H,m,COCH₂CH₂CH₂),3.52(m,4H,CONHCH₂CH₂S),3.37(1H,m,NHCOCHNH₂),2.94(1H,m,CONHCHCH₂C＝CH),2.83(3H,m,NH₂CHCH₂+CH₂SSCH₂),2.76(2H,m,CH₂SSCH₂),2.62(2H,m,CH₂NH₂),2.57(4H,m,NHCOCH₂CH₂CONH),2.51(3H,s,CH＝CCH₃),2.33(2H,m,CH₂OCOCH₂CH₂CH),2.18(2H,m,CH₂OCOCH₂CH₂CH),1.95(2H,m,NH₂CHCH₂),1.62(4H,m,COCH₂CH₂CH₂),1.54(2H,m,CH₂CH₂NH₂),1.26(46H,m,CH₂),0.86(6H,m,CH₂CH₃).

实施例2

2-(4-(2-(2-(2-(2-(1-氨基-4-胍基丁基胺)-3-(1H-咪唑-4-基)丙酰胺)乙基)二硫)乙胺基)-4-氧代丁酮氨基)戊二酸双十八醇二酯的合成

将谷氨酸(2.9g，19.7mmol)和对甲苯磺酸(TsOH，2.22g，11.7mmol)溶于50mL甲苯中，回流1h。加入正十八醇(6.3g，23.3mmol)回流12h。反应结束后，减压蒸馏去除甲苯。

浓缩物用35mL甲醇重结晶，将得到的白色粉末状固体溶解于适量二氯甲烷，用5％碳酸氢钠水溶液洗涤(10mL×2)，再用适量的饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，得4.3g白色粉末状固体E。

将A(2.12g，6.0mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI，2.31g，12.0mmol)；1-羟基苯并三氮唑(HOBt，1.62g，12.0mmol)溶于80mL氯仿中，室温搅拌3h；将E(3.92g，6.0mmol)和三乙胺(3.36mL，24.0mmol)溶于40mL氯仿中，室温搅拌1h后，加入上述混合溶液中，室温搅拌12h。反应结束后，反应液用水洗涤(80mL×2)，再用适量饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂后得白色固体，经柱层析纯化(二氯甲烷︰甲醇＝60︰1)得白色固体4.7g。将白色固体(4.7g，4.8mmol)溶解于200mL饱和HCl的乙酸乙酯溶液，0℃搅拌12h，过滤干燥得3.7g白色蜡状固体F。将Boc-His(Tos)-OH(0.81g，2.0mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI，0.76g，4.0mmol)；N-羟基丁二酰亚胺(NHS，0.45g，4.0mmol)溶于40mL氯仿中，室温搅拌3h；将F(1.77g，2.0mmol)和三乙胺(1.1mL，8.7mmol)溶于20mL氯仿中，室温搅拌1h后，加入上述混合溶液中，室温搅拌12h。反应结束后，反应液用水洗涤(50mL×2)，再用适量饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂后得白色固体，经柱层析纯化(二氯甲烷︰甲醇＝50︰1)得白色固体1.9g。将白色固体(1.9g，1.5mmol)溶解在三氟醋酸(TFA，3mL)和3mL二氯甲烷的混合溶液中，室温搅拌4h；反应结束后，加入5％碳酸氢钠水溶液调节pH值至中性，加入适量二氯甲烷，充分搅拌后分层，用二氯甲烷萃取(15mL×3)，合并有机层，用适量饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂后得黄色固体，经柱层析纯化(二氯甲烷︰甲醇＝25︰1)得1.2g白色固体G。将Boc-Lys(Boc)-OH(0.5g，1.6mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI，0.61g，3.2mmol)；N-羟基丁二酰亚胺(NHS，0.37g，3.2mmol)溶于20mL氯仿中，室温搅拌3h；将G(1.9g，1.6mmol)和三乙胺(0.5mL，4.8mmol)溶于30mL氯仿中，室温搅拌1h后，加入上述混合溶液中，室温搅拌12h。反应结束后，反应液用水洗涤(30mL×2)，再用适量饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂后得白色固体，经柱层析纯化(二氯甲烷︰甲醇＝40︰1)得白色固体1.64g。将白色固体(1.64g，1.1mmol)溶于50mL四氢呋喃中，40℃搅拌下，加入1-羟基苯并三氮唑(HOBt，1.78g，13.2mmol)，继续搅拌5h。反应结束后，蒸去溶剂，得白色固体，经柱层析纯化(二氯甲烷︰甲醇＝15︰1)，得白色蜡状固体1.18g，将白色蜡状固体(1.18g，1.3mmol)溶解于10mL四氢呋喃中，加入0.3g Pd/C，通入氢气，室温搅拌过夜，抽滤浓缩得到白色固体0.97g。将白色固体(0.97g，0.75mmol)溶于20mL饱和HCl的乙酸乙酯溶液，0℃搅拌12h，过滤干燥得白色蜡状固体0.73g，收率：81.1％。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃+CD₃OD)δ:8.74(1H,s,NCHNH),7.72(1H,m,NC＝CHNH),4.94(1H,m,NHCOCHNHCO),4.49(1H,m,OCOCHNHCO),4.08(4H,m,COCH₂CH₂CH₂),3.52(m,4H,CONHCH₂CH₂S),3.37(1H,m,NHCOCHNH₂),2.94(1H,m,CONHCHCH₂C＝CH),2.83(3H,m,NH₂CHCH₂+CH₂SSCH₂),2.76(2H,m,CH₂SSCH₂),2.62(2H,m,CH₂NH₂),2.57(4H,m,NHCOCH₂CH₂CONH),2.51(3H,s,CH＝CCH₃),2.33(2H,m,CH₂OCOCH₂CH₂CH),2.18(2H,m,CH₂OCOCH₂CH₂CH),1.95(2H,m,NH₂CHCH₂),1.62(4H,m,COCH₂CH₂CH₂),1.54(2H,m,CH₂NHCH＝NH),1.26(64H,m,CH₂),0.86(6H,m,CH₂CH₃).

实施例3

2-(2-(2-羧基环己甲酰氨基)-3,12-二氧代-1-(1H-咪唑-4-基)-7,8-二硫-4,11-二氮杂十五烷基酰胺)戊二酸双十四醇二酯

将D(1.0g，0.94mmol)溶于40mL二氯甲烷中，室温搅拌下，将六氢苯酐(0.15g，0.94mmol)和对二甲氨基吡啶(DMAP，0.04g，0.29mmol)溶解于5mL二氯甲烷，将其加入反应瓶中，室温下搅拌5h。反应结束后，用1M KHSO₄水溶液洗涤(20mL×2)，有机层用适量饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂后得白色油状物1.3g。再将该白色油状物(1.3g，1.08mmol)溶于30mL四氢呋喃中，40℃搅拌下，加入1-羟基苯并三氮唑(HOBt，1.76g，13.0mmol)，继续搅拌5h。反应结束后，蒸去溶剂，得白色固体，经柱层析纯化(二氯甲烷︰甲醇＝8︰1)得白色粉末状固体0.72g，收率：72.0％。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃+CD₃OD)δ:8.74(1H,s,NCHNH),7.72(1H,m,NC＝CHNH),4.94(1H,m,NHCOCHNHCO),4.49(1H,m,OCOCHNHCO),4.08(4H,m,COCH₂CH₂CH₂),3.52(m,4H,CONHCH₂CH₂S),3.37(1H,m,NHCOCHNH₂),2.94(1H,m,CONHCHCH₂C＝CH),2.76(2H,m,CH₂SSCH₂),2.62(2H,m,CH₂NH₂),2.57(4H,m,NHCOCH₂CH₂CONH),2.53(1H,m，CH-COOH)，2.33(2H,m,CH₂OCOCH₂CH₂CH),2.18(2H,m,CH₂OCOCH₂CH₂CH),1.95(2H,m,NH₂CHCH₂),1.79(2H,m,CH₂CH),1.62(4H,m,COCH₂CH₂CH₂),1.55(2H,m,CH₂CH),1.39,1.49(4H,m,CH₂),1.26(46H,m,CH₂),0.86(6H,m,CH₂CH₃).

实施例4

2-(2-(2-羧基丁二酰氨基)-3,12-二氧代-1-(1H-咪唑-4-基)-7,8-二硫-4,11-二氮杂十五烷基酰胺)戊二酸双十四醇二酯

将G(1.0g，0.85mmol)溶于40mL二氯甲烷中，室温搅拌下，将丁二酸酐(0.085g，0.85mmol)和对二甲氨基吡啶(DMAP，0.03g，0.25mmol)溶解于5mL二氯甲烷，将其加入反应瓶中，室温下搅拌5h。反应结束后，用1M KHSO₄水溶液洗涤(15mL×2)，有机层用适量饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂后得白色油状物1.2g。再将该白色油状物(1.2g，0.94mmol)溶于30mL四氢呋喃中，40℃搅拌下，加入1-羟基苯并三氮唑(HOBt，1.52g，11.3mmol)，继续搅拌5h。反应结束后，蒸去溶剂，得白色固体，经柱层析纯化(二氯甲烷︰甲醇＝8︰1)得白色粉末状固体0.82g，收率：78.0％。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃+CD₃OD)δ:8.74(1H,s,NCHNH),7.72(1H,m,NC＝CHNH),4.94(1H,m,NHCOCHNHCO),4.49(1H,m,OCOCHNHCO),4.08(4H,m,COCH₂CH₂CH₂),3.52(m,4H,CONHCH₂CH₂S),3.37(1H,m,NHCOCHNH₂),2.94(1H,m,CONHCHCH₂C＝CH),2.83(2H,m,CH₂SSCH₂),2.76(2H,m,CH₂SSCH₂),2.62(2H,m,CH₂NH₂),2.57(4H,m,NHCOCH₂CH₂CONH),2.4(4H,m,CH₂CH₂-COOH),2.33(2H,m,CH₂OCOCH₂CH₂CH),2.18(2H,m,CH₂OCOCH₂CH₂CH),1.26(64H,m,CH₂),0.86(6H,m,CH₂CH₃).

实施例5

取磷脂20mg，胆固醇10mg，实施例1合成的基于寡肽还原敏感阳离子脂质20mg溶于3mL氯仿与2mL甲醇的混合有机溶剂中。旋转蒸发15min除去有机溶剂，真空干燥过夜。将加入5mL水，在37℃下水合30min。探头超声10-30min。得到的脂质体溶液定依次过0.8μm，0.45μm，0.22μm滤膜，即得到脂质体溶液，其粒径和电位性质如表1所示。

表1基于寡肽还原敏感阳离子脂质体的性质

实施例6

取磷脂20mg，胆固醇10mg，实施例2合成的基于寡肽还原敏感阳离子脂质20mg溶于3mL氯仿与2mL甲醇的混合有机溶剂中。旋转蒸发15min除去有机溶剂，真空干燥过夜。将加入5mL水，在37℃下水合30min。探头超声10-30min。得到的脂质体溶液定依次过0.8μm，0.45μm，0.22μm滤膜，即得到脂质体溶液，其粒径和电位性质如表2所示。

表2基于寡肽还原敏感阳离子脂质体的性质

实施例7

取磷脂60mg，二油酰基磷脂酰乙醇胺40mg，实施例3合成的基于寡肽还原敏感两性离子脂质20mg溶于2mL氯仿与3mL甲醇的混合有机溶剂中。旋转蒸发15min除去有机溶剂，真空干燥过夜。将加入5mL水，在37℃下水合30min。探头超声10-30min。得到的脂质体溶液定依次过0.8μm，0.45μm，0.22μm滤膜，即得到两性离子脂质体溶液，其粒径和电位性质如表3所示。

表3基于寡肽还原敏感两性离子脂质体的性质

实施例8

取磷脂60mg，二油酰基磷脂酰乙醇胺40mg，实施例4合成的基于寡肽还原敏感两性离子脂质20mg溶于2mL氯仿与3mL甲醇的混合有机溶剂中。旋转蒸发15min除去有机溶剂，真空干燥过夜。将加入5mL水，在37℃下水合30min。探头超声10-30min。得到的脂质体溶液定依次过0.8μm，0.45μm，0.22μm滤膜，即得到两性离子脂质体溶液，其粒径和电位性质如表4所示。

表4基于寡肽还原敏感两性离子脂质体的性质

实施例9

将实施例5中的还原敏感阳离子脂质体，按照不同的氮磷比(N/P＝0.5，1，2，3，4)与siRNA进行混合，涡旋10s，室温放置30min，即得二元纳米复合物，进行凝胶阻滞电泳实验，紫外灯下观察，结果显示，当N/P大于等于3时，阳离子脂质体可以将siRNA完全包覆，见图1。

实施例10

将实施例6中的基于寡肽的还原敏感阳离子脂质体，按照不同的氮磷比(N/P＝0.5，1，2，3，4)与siRNA进行混合，涡旋10s，室温放置30min，即得二元纳米复合物，通过动态光散射测定二元复合物的粒径和电位，结果显示，随着N/P，的增加，二元复合物粒径先减小后增大，当N/P为4左右时，粒径最小，约为117nm，其表面电位由负变正，直至稳定至18mV左右，见图2。

实施例11

将实施例5中不同氮磷比(N/P＝0.5，1，2，3，4)的二元复合物中加入3U的核酸酶，37℃孵育2h，琼脂糖凝胶电泳考察还原敏感阳离子脂质体对siRNA的保护作用，并以裸siRNA进行对照，如图3所示，本发明的还原敏感阳离子脂质体可以保护siRNA不被核酸酶降解。

实施例12

将实施例6中不同氮磷比(N/P＝0.5，1，2，3，4)的还原敏感二元复合物置于浓度为10mM的谷胱甘肽水溶液中，37℃孵育1h，并以文献报道的非还原敏感阳离子脂质作为对照(参考文献Bioconjugate Chem.2008,19,1055–1063，选用名称为1a的阳离子脂质)对siRNA进行包覆(N/P＝0.5，1，2，3，4)，通过琼脂糖凝胶电泳考察二者对siRNA的释放情况，结果显示，在谷胱甘肽还原环境中，不同N/P的二元复合物均可以将siRNA释放出来，见图4a和4b。

实施例13

取将实施例7中还原敏感两性离子脂质体300μL，加入2.7mL pH的缓冲液(pH7.4的20mM Hepes溶液和pH 6.5、pH 5.5，pH 4.5的20mM HAC-NaAc溶液)稀释，采用动态光散射仪测定不同pH值条件下的粒径和Zeta电位。结果如表5所示，还原敏感两性离子脂质体在中性pH值条件下带负电，在弱酸性pH值条件下带正电，具有电荷反转的特性。

表5基于寡肽还原敏感两性离子脂质体的电荷反转性质

实施例14

取3mL实施例8中脂质体溶液(3份)加入3mL 20mM的谷胱甘肽溶液(GSH，pH 7.4，10mM Hepes),摇匀后氮气保护密封，37℃水浴。分别于0、0.25、0.5、1、2、4、7、9、12、18、24h精密吸取0.45mL样品，加入1mL甲醇，超声10min，破乳后，加入3mL二氯甲烷，涡旋5min，加入0.2mL饱和食盐水，静置10min，分层。取有机层真空挥干，加入0.2mL混合溶剂(乙腈:甲醇:二氯甲烷＝40:30:30，v:v:v)，涡旋3min，15000rpm离心10min，取上清液HPLC进样。另外3份加入3mL pH 7.4，10mM不含谷胱甘肽(GSH)的Hepes溶液。处理同上。绘制24h内，在0或10mM GSH存在时，脂质体降解曲线如图5所示，本发明的基于寡肽的还原敏感脂质可在谷胱甘肽还原环境中发生降解，24h内可降解约70％。

实施例15

取磷脂40mg，胆固醇10mg，溶于5ml氯仿与1ml甲醇的混合有机溶剂中。旋转蒸发15min除去有机溶剂，真空干燥过夜。将加入5ml水，在37℃下水合30min。探头超声10-30min。得到的脂质体溶液定依次过0.8μm，0.45μm，0.22μm滤膜，即得到普通脂质体溶液。取1mL普通脂质体溶液和1mL实施例5中还原敏感脂质体，分别加入4mL超纯水，用0.15M的NaOH调脂质体的pH至10，分别用等体积的0.01M的HCl溶液调脂质体的pH至3，同时测定pH值。绘制pH值随不同体积的HCl溶液加入之后的变化曲线，如图6所示，与普通脂质体相比，本发明的基于寡肽的还原敏感脂质体具有很好的质子缓冲能力。

实施例16

取60mg磷脂，40mg二油酰基磷脂酰乙醇胺和实施例3中还原敏感两性离子脂质20mg，溶于5mL氯仿:甲醇(2:3,v:v)混合溶剂中，37℃水浴旋蒸成膜，抽真空，除去有机溶剂，加入5mL 250mM(NH₄)₂SO₄溶液(pH 7.5)振荡水合，探头超声，依次过0.45μm和0.22μm滤膜，于900mL透析液(pH 7.6，25mM Hepes，0.1mM EDTA，10％蔗糖溶液)中透析24h后，移出脂质体，加入一定浓度的盐酸阿霉素溶液(pH 7.9，25mM Hepes，10％蔗糖溶液)，25℃孵育30min，过732强酸苯乙烯阳离子交换柱，pH 7.4Hepes溶液洗脱，除去游离盐酸阿霉素，即得阿霉素脂质体。通过动态光散射测定该阿霉素脂质体的粒径和电位，通过高效液相测定其载药量和包封率，结果如表6所示，包封率在90％以上，载药量为约为4.2％。

表6阿霉素两性离子脂质体的性质

实施例17

取60mg磷脂，40mg二油酰基磷脂酰乙醇胺和实施例4中还原敏感两性离子脂质20mg，溶于5mL氯仿:甲醇(2:3,v:v)混合溶剂中，37℃水浴旋蒸成膜，抽真空，除去有机溶剂，加入5mL 250mM(NH₄)₂SO₄溶液(pH 7.5)振荡水合，探头超声，依次过0.45μm和0.22μm滤膜，于900mL透析液(pH 7.6，25mM Hepes，0.1mM EDTA，10％蔗糖溶液)中透析24h后，移出脂质体，加入一定浓度的盐酸阿霉素溶液(pH 7.9，25mM Hepes，10％蔗糖溶液)，25℃孵育30min，过732强酸苯乙烯阳离子交换柱，pH 7.4Hepes溶液洗脱，除去游离盐酸阿霉素，即得阿霉素脂质体。通过动态光散射测定该阿霉素脂质体的粒径和电位，通过高效液相测定其载药量和包封率。结果如表7所示，包封率为92％，载药量约为3.3％。

表7阿霉素两性离子脂质体的性质

实施例18

将实施例16中的还原敏感阿霉素脂质体移入透析袋(MWCO 14,000)中，密封，置于含有30mL透析液(10mM,pH 7.4Hepes+10mM GSH)的棕色瓶中，充氮气，密封，以不含二硫键两性离子脂质为对照(参考文献Adv.Mater.2012,24,3659–3665)制备阿霉素脂质体。将二者置于37℃环境中，100rpm恒温振荡。在预设的不同时间点(2,4,6,8,10,12,24h)取样1mL,同时补充同体积的新鲜释放介质。HPLC测定盐酸阿霉素的量，处理数据，得到累积释放曲线。实验平行三份。如图7所示，在谷胱甘肽存在下，阿霉素可以从还原敏感脂质体中释放出来，24h累积释放百分比在90％以上。

Claims

1.一种通式(I)的基于寡肽的还原敏感脂质衍生物：

2.一种空白脂质体，其中含有脂质体基质和权利要求1的还原敏感脂质衍生物。

3.一种药物脂质体，含药物、脂质体基质和权利要求1的还原敏感脂质衍生物。

4.权利要求2或3的空白脂质体或药物脂质体，其中脂质体基质为磷脂和胆固醇。

5.权利要求2或3的空白脂质体或药物脂质体，其中还原敏感脂质衍生物与脂质体基质的重量比为1:1-1:8。

6.权利要求3的药物脂质体，其中药物是基因治疗药物或水溶性抗肿瘤药物。

7.权利要求6的药物脂质体，其中基因治疗药物是siRNA和质粒，水溶性抗肿瘤药物是阿霉素、氟尿嘧啶、盐酸阿糖胞苷。

8.权利要求6的药物脂质体，其中基因治疗药物和还原敏感脂质衍生物的氮磷比为1:3-1:10。

9.权利要求6的药物脂质体，其中水溶性抗肿瘤药物和还原敏感脂质衍生物的重量比为1:40-1:60。

10.权利要求1的还原敏感脂质衍生物用作脂质体修饰剂的用途。