CN111087317A - 不饱和阳离子脂质衍生物、制备方法以及在质粒递送系统中的应用 - Google Patents

不饱和阳离子脂质衍生物、制备方法以及在质粒递送系统中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及化学与制剂领域，具体涉及不饱和阳离子脂质衍生物及其制备方法和在质粒递送系统中的应用。本发明的阳离子脂质以正电性的赖氨酸作为亲水头基，以氨基酸作为骨架，以不饱和烷烃链作为疏水尾链，具有生物相容性好、安全性高等优势；合成方法简便快捷，合成成本低，有利于大规模生产。基于本发明设计的不饱和阳离子脂质构建的阳离子脂质体，能稳定荷载质粒不发生泄漏，在多种肿瘤细胞及原代细胞上的基因转染效率优于阳性对照Lipofectamine2000，并且对细胞无明显细胞毒作用。本发明将为质粒递送提供一类安全高效的阳离子脂质及非病毒载体平台。
Figure DDA0002280745170000011

Description

不饱和阳离子脂质衍生物、制备方法以及在质粒递送系统中 的应用
技术领域
本发明涉及化学与制剂领域，具体涉及不饱和伯胺类阳离子脂质衍生物、制备方法以及在质粒递送系统中的应用。
背景技术
基因治疗是将外源基因，如质粒(DNA)、小干扰RNA(siRNA)、mRNA等，导入靶细胞以纠正或补偿因基因缺陷或基因表达异常引起的疾病，包括遗传疾病、恶性肿瘤、代谢性疾病、心血管疾病以及自身免疫性疾病等。其中，质粒是一类能够进行自主复制的遗传单位，与其他基因治疗物质相比，具有持续表达等优势，因此受到广泛研究。
但是游离质粒因为其水溶性、负电性、易被核酸酶降解以及需入核表达等特点，直接注射难以发挥有效的治疗作用，因此亟需发展安全高效的递送载体以提高其基因转染效率。常见的递送载体包括病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体虽然转染效率高，但其潜在的免疫原性、致癌性等安全风险以及载量小等缺点限制了其临床应用。而非病毒载体具有安全性好、载量大、成本低及可大量制备等优点，得到广泛关注，但其转染效率较低仍然是限制其发展的主要原因。其中阳离子脂质体是一种类似于生物膜的具有双分子层结构的封闭囊泡，由阳离子脂质和辅助脂质(如磷脂，胆固醇等)制备而成。因其良好的生物相容性，受到越来越多的关注。目前FDA批准的第一个系统给药的siRNA药物就是以阳离子脂质体作为载体。
与递送siRNA类似，阳离子脂质体也可以利用其正电性与负电性的DNA通过静电作用形成稳定复合物用于DNA递送。但是由于DNA的分子量远大于siRNA以及其更强的负电荷，使得DNA与阳离子脂质体的相互作用更强，更难从载体中释放进入胞质并进入细胞核发挥作用，造成DNA的递送难度显著提高。因此需针对DNA设计适宜的安全高效载体。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一类尾链不饱和的阳离子脂质衍生物。
本发明的另一目的是提供该尾链不饱和的阳离子脂质衍生物的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
本发明公开一类尾链不饱和的阳离子脂质衍生物，具有通式(I)或(II)的结构。
Figure BDA0002280745150000021
其中，n＝1或2；
R1＝含1～3个不饱和键的C15～23直链烃基，或
Figure BDA0002280745150000022
R2＝氢、取代或未取代的C1-4烷基，所述的取代基选自苯基、苄基、芳香杂环、羟基、酰基、硫醇基。
所述的尾链不饱和的阳离子脂质衍生物，优选n＝1或2；
Figure BDA0002280745150000023
其中，
双键为Z构型或E构型；
Figure BDA0002280745150000024
该不饱和阳离子脂质衍生物以具有生物相容性的赖氨酸作为阳离子脂质分子的亲水部分，提供正电荷，与DNA静电结合以增强DNA递送过程中的稳定性。
以氨基酸作为不饱和阳离子脂质衍生物的骨架，用于增强该脂质分子的生物相容性。通式(I)的骨架是谷氨酸(或天冬氨酸)，可连接两条不饱和疏水链，通式(II)的骨架是甘氨酸(或苯丙氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，色氨酸，蛋氨酸，脯氨酸，丝氨酸，丝氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，酪氨酸)，可连接一条不饱和疏水链。
阳离子脂质分子的连接键为生物可降解的酯键，体内可被酯酶水解，从而赋予阳离子脂质生物可降解性。
以不饱和脂肪链(棕榈油醇，反式棕榈油醇，油醇，反式油醇，亚麻醇，反式亚麻醇，顺式1-十八碳三烯醇，反式1-十八碳三烯醇，顺式1-二十二碳烯醇，反式1-二十二碳烯醇或胆固醇)作为阳离子脂质分子的疏水部分，可用于自组装成阳离子脂质体。
本发明提供一种上述尾链不饱和阳离子脂质衍生物的合成方法。该合成方法高效快捷，收率高，合成成本低，合成过程环境友好，适宜工业化放大生产。
1)通式I所示阳离子脂质衍生物的合成方法，其合成步骤如下：
a.将二元羧基氨基酸(I-1)溶解于无水甲苯(或苯，或环己烷)，搅拌下加入对甲基苯磺酸，升温至110～150℃，回流反应1～3h。冷却至室温，加入不饱和脂肪醇，升温至100～150℃，回流反应6～20h。反应结束后，旋蒸除去甲苯(或苯，或环己烷)，浓缩后溶解于氯仿(或二氯甲烷，或乙酸乙酯)，用饱和碳酸氢钠(或碳酸钠，或碳酸钾)水溶液洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤后浓缩，柱层析纯化，得到不饱和脂肪醇-二元羧基氨基酸(I-2)。
不饱和脂肪醇-二元羧基氨基酸(I-2)合成反应式：
Figure BDA0002280745150000031
b.将Boc保护赖氨酸溶解于二氯甲烷(或四氢呋喃，或氯仿)，放置于0℃，搅拌下依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和无水1-羟基苯并三氮唑(HOBT)，转移至室温反应1～5h，加入不饱和脂肪醇-二元羧基氨基酸(I-2)和三乙胺(或N,N-二异丙基乙胺，或N-甲基吗啉)，搅拌下反应6～20h。反应结束后，依次用水，10％柠檬酸水溶液和饱和食盐水洗涤反应液，无水硫酸钠干燥，抽滤后浓缩，柱层析纯化，得到Boc保护赖氨酸-不饱和脂肪醇-二元羧基氨基酸(I-3)。
Boc保护赖氨酸-不饱和脂肪醇-二元羧基氨基酸(I-3)合成反应式：
Figure BDA0002280745150000041
c.将Boc保护赖氨酸-不饱和脂肪醇-二元羧基氨基酸(I-3)放置于0℃，缓慢滴加饱和氯化氢的二氧六环溶液(或乙酸乙酯溶液，或甲醇溶液)，搅拌下0℃反应6～20h。反应结束后，减压浓缩反应液，得到赖氨酸-不饱和脂肪醇-二元羧基氨基酸(I)。
赖氨酸-不饱和脂肪醇-二元羧基氨基酸(I)合成反应式：
Figure BDA0002280745150000042
2)通式II所示阳离子脂质衍生物的合成方法，其合成步骤如下：
a.将单羧基氨基酸(II-1)溶解于无水甲苯(或苯，或环己烷)，搅拌下加入对甲基苯磺酸，升温至110～150℃，回流反应1～3h。冷却至室温，加入不饱和脂肪醇，升温至100～150℃，回流反应6～20h。反应结束后，旋蒸除去甲苯(或苯，或环己烷)，浓缩后溶解于氯仿(或二氯甲烷，或乙酸乙酯)，用饱和碳酸氢钠(或碳酸钠，或碳酸钾)水溶液洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤后浓缩，柱层析纯化，得到不饱和脂肪醇-单羧基氨基酸(II-2)。
不饱和脂肪醇-单羧基氨基酸(II-2)合成反应式：
Figure BDA0002280745150000043
b.将Boc保护赖氨酸溶解于二氯甲烷(或四氢呋喃，或氯仿)，放置于0℃，搅拌下依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和无水1-羟基苯并三氮唑(HOB)，转移至室温反应1～5h，加入不饱和脂肪醇-单羧基氨基酸(II-2)和三乙胺(或N,N-二异丙基乙胺，或N-甲基吗啉)，搅拌下反应6～20h。反应结束后，依次用水，10％柠檬酸水溶液和饱和食盐水洗涤反应液，无水硫酸钠干燥，抽滤后浓缩，柱层析纯化，得到Boc保护赖氨酸-不饱和脂肪醇-单羧基氨基酸(II-3)。
赖氨酸-不饱和脂肪醇-单羧基氨基酸(II-3)合成反应式：
Figure BDA0002280745150000051
c.将Boc保护赖氨酸-不饱和脂肪醇-单羧基氨基酸(II-3)放置于0℃，缓慢滴加饱和氯化氢的二氧六环溶液(或乙酸乙酯溶液，或甲醇溶液)，搅拌下0℃反应6～20h。反应结束后，减压浓缩反应液，得到赖氨酸-不饱和脂肪醇-单羧基氨基酸(II)。
赖氨酸-不饱和脂肪醇-单羧基氨基酸(II)合成反应式：
Figure BDA0002280745150000052
本发明所述的尾链不饱和阳离子脂质衍生物在制备阳离子脂质体中的应用。
本发明所述的尾链不饱和阳离子脂质衍生物在制备质粒药物脂质体中的应用。
本发明公开的空白阳离子脂质体含有本发明所述的不饱和阳离子脂质衍生物和常用脂质，其特征是具有20～300nm的平均粒径，+10～+50mV的表面电位。
其中常用脂质为二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)，二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)，1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂(POPC)，二油酰基卵磷脂(DOPC)，二芥酰基卵磷脂(DEPC)，二棕榈酰基卵磷脂(DPPC)和胆固醇等，优选DOPE和胆固醇。其中不饱和阳离子脂质衍生物和常用脂质的摩尔比为10：1～1：10，优选5：1～1：5。
本发明公开的空白阳离子脂质体制备方法包括：薄膜分散法，过膜挤压法，French挤压法，逆向蒸发法和化学梯度法，优选薄膜分散法和过膜挤压法。
采用薄膜分散法制备空白阳离子脂质体的过程如下：称取适量磷脂，胆固醇和本发明所述的不饱和阳离子脂质衍生物的一种或多种，溶于氯仿/甲醇混合溶剂，减压蒸发成膜，真空干燥过夜除去残留的有机溶剂。室温下水化脂膜，将得到的脂质体混悬液采用超声波细胞粉碎机分散，并且依次通过0.8μm，0.45μm，0.22μm微孔滤膜，即得到空白阳离子脂质体溶液。
采用过膜挤出法制备空白阳离子脂质体的过程如下：称取适量磷脂，胆固醇和阳离子脂质的一种或多种，溶于氯仿/甲醇混合溶剂，减压蒸发成膜，真空干燥过夜除去残留的有机溶剂。室温下水化脂膜，将得到的脂质体混悬液，在0-70℃温度下依次挤过0.8μm、0.45μm、0.2μm的碳酸脂膜各3-15次，即得到空白阳离子脂质体溶液。
所述的空白离子脂质体在制备DNA药物中的应用；优选在制备质粒药物脂质体中的应用。
一种质粒药物脂质体，含有质粒(DNA)和本发明所述的空白阳离子脂质体，该质粒药物脂质体具有50～600nm的平均粒径，0～+40mV的表面电位。其中质粒(DNA)为不同分子量和不同形状的DNA，分子量大小为1000-10000bp，包括线性DNA和环状DNA。其中所述的空白阳离子脂质体中不饱和阳离子脂质衍生物和DNA的氮磷比为1:1～20:1，优选2:1～10:1。
本发明公开的质粒药物脂质体的制备过程如下：将上述制备得到的空白阳离子脂质体和质粒(DNA)按一定氮磷比(1:1～20:1)混合，室温静置15～120min，即得到质粒药物脂质体。
有益效果：
本发明针对DNA从载体中释放难、转染效率低的问题，设计合成了一系列具有酸性条件下促进膜融合能力的不饱和阳离子脂质衍生物及其递送载体。不饱和阳离子脂质衍生物主要由3部分组成：亲水头基、连接臂和疏水尾链。本发明选用正电性赖氨酸作为亲水头基，利用其正电荷与DNA复合，增加其在血液循环中的稳定性。疏水尾链选用不饱和烷基链，因为尾部不饱和脂质制备的不饱和脂质体分子层排列更为疏松，具有更高的膜流动性，从双层相向倒置六角相转变的相转化温度更低，膜融合能力增强，有利于细胞摄取。而且当该不饱和脂质体进入内涵体的酸性环境中，其正电性脂质可与负电性内涵体膜形成中性离子对，不仅能破坏内涵体膜的完整性，同时还能减弱正电性脂质体与负电性DNA之间的相互作用，促进DNA释放进入细胞质，继而进入细胞核发挥基因转染作用。此外，本发明以生物相容性较好的氨基酸为骨架，进一步提高了阳离子脂质的生物相容性。
本发明开发的不饱和阳离子脂质衍生物具有良好的生物相容性和可降解性；其正电性头基可以可稳定复合DNA，提高其在递送过程中的稳定性；且其尾链引入不同的不饱和键，可以通过酸性条件下的膜融合作用提高DNA在胞质中的释放；最终提高DNA的基因转染效率。
疏水链的链长，不饱和键的个数、位置对转染的效果会有很大影响，本发明从制备的难易程度、不饱和阳离子脂质衍生物的稳定性、原料价格等角度综合考虑，设计并合成了特定链长、不饱和键个数、特定不饱和键位置合成的不饱和阳离子脂质衍生物。利用该不饱和阳离子脂质衍生物制备的DNA药物脂质体能稳定荷载质粒DNA(见实施例21)，形成的质粒药物脂质体具有良好的体内外稳定性(见实施例23)，且能保护DNA不被核酸酶降解(见实施例24)。此外，以模型质粒为例，该质粒药物脂质体能高效转染多种细胞，如HEK293细胞(实施例25)、HepG2细胞(实施例26)、原代细胞(实施例27)等，转染效果优于阳性对照Lipofectamine2000，同时基因转染效果不受血清的影响(见实施例28)。并且本发明公开的空白阳离子脂质体对转染细胞不产生明显毒性(见实施例29)。本发明可为临床提供转染效率高，安全性佳的质粒药物递送载体。本发明提供的不饱和阳离子脂质衍生物及其载体平台对开发具有我国自主知识产权的生物功能载体材料及DNA递送载体具有重要意义。
附图说明
图1是本发明的阳离子脂质体的透射电镜图(TEM)；
图2是本发明的质粒药物脂质体的琼脂糖凝胶电泳图；
A图～F图依次为OA2-Glu-Lys、ODA2-Glu-Lys、OChol2-Asp-Lys、OA-Glu-Lys、ODA-Val-Lys、OChol-Ala-Lys阳离子脂质体制备的质粒药物脂质体的琼脂糖凝胶电泳图。
图3是本发明的质粒药物脂质体在不同氮磷比下的粒径和电位；横坐标表示氮磷比；
图4是本发明的质粒药物脂质体(OA2-Glu-Lys/GFP-DNA)的透射电镜(TEM)图；
图5是本发明的质粒药物脂质体(OA2-Glu-Lys/GFP-DNA)的体外稳定性；
图6是本发明的质粒药物脂质体(OA2-Glu-Lys/GFP-DNA)的核酸酶稳定性；
泳道1为Marker，泳道2为游离DNA，泳道3为游离DNA+DNaseⅠ，泳道4为质粒药物脂质体(OA2-Glu-Lys/GFP-DNA)不加DNaseⅠ和SDS，泳道5为质粒药物脂质体(OA2-Glu-Lys/GFP-DNA)加DNaseⅠ和SDS，泳道6为质粒药物脂质体(OA2-Glu-Lys/GFP-DNA)不加DNaseⅠ，加SDS。
图7是本发明的质粒药物脂质体转染HEK293细胞后绿色荧光蛋白的表达情况(倒置荧光显微镜)；
图8是本发明的质粒药物脂质体转染HEK293细胞后绿色荧光蛋白的表达情况(流式细胞仪)；
图9是本发明的质粒药物脂质体转染HepG2细胞后绿色荧光蛋白的表达情况(倒置荧光显微镜)；
图10是本发明的质粒药物脂质体转染HepG2细胞后绿色荧光蛋白的表达情况(流式细胞仪)；
图11是本发明的质粒药物脂质体转染小鼠原代肝实质细胞后绿色荧光蛋白的表达情况(倒置荧光显微镜)；
图12是本发明的质粒药物脂质体转染小鼠原代肝实质细胞后绿色荧光蛋白的表达情况(流式细胞仪)；
图13是本发明的质粒药物脂质体(OA2-Glu-Lys/GFP-DNA)在血清存在下转染HepG2细胞后绿色荧光蛋白的表达情况(流式细胞仪)；
图14是本发明的OA2-Glu-Lys阳离子脂质体对HepG2细胞存活率的影响。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明进一步解释，但这些实施例不对本发明构成任何限制。
实施例1
制备谷氨酸双油醇酯(OA2-Glu)，化学结构式如下：
Figure BDA0002280745150000081
将L-谷氨酸(5.00g，33.9mmol)溶解于200mL无水甲苯，搅拌下加入对甲基苯磺酸(6.44g，37.4mmol)，升温至140℃，回流反应2h。冷却至室温，加入油醇(19.2g，71.4mmol)，升温至150℃，回流反应过夜。反应结束后，旋蒸除去甲苯，得到深棕色油状物。溶解于300mL氯仿，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤(200mL×2)，饱和食盐水洗涤(200mL×1)，无水硫酸钠干燥，抽滤后浓缩得到深棕色油状物，经柱层析纯化(石油醚︰乙酸乙酯＝10︰1)得到无色透明油状物6.40g，收率：54％。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ(ppm)5.43–5.28(m,4H,CH2CHCHCH2),4.17–4.01(m,4H,COOCH2),3.52–3.44(m,1H,NH2CH),2.46(t,J＝7.2Hz,2H,CH2CO),2.09–1.93(m,8H,CH2CHCHCH2),1.77–1.70(m,2H,NH2CHCH2),1.69–1.55(m,4H,COOCH2CH2),1.35–1.22(m,44H,CH2(oleyl)),0.88(t,J＝6.7Hz,6H,CH2CH3).13C NMR(75MHz,CDCl3):δ(ppm)175.05(1C,CH2COOCH2),172.70(1C,NH2CHCO),129.47(2C,CH2CHCHCH2),129.25(2C,CH2CHCHCH2),64.73(1C,COOCH2),64.19(1C,COOCH2),53.26(1C,NHCH),31.40(2C,CH2CH2CH3),30.13(1C,CH2COOCH2),29.26(4C,CH2CHCHCH2),29.23(2C,CH2(oleyl)),29.19(2C,CH2(oleyl)),29.02(2C,CH2(oleyl)),28.91(2C,CH2(oleyl)),28.82(6C,CH2(oleyl)),28.72(2C,CH2(oleyl)),28.09(1C,NHCHCH2),26.71(1C,OCH2CH2),26.68(1C,OCH2CH2),25.40(1C,OCH2CH2CH2),25.36(1C,OCH2CH2CH2),22.18(2C,CH2CH3),13.61(2C,CH2CH3).HRMS,ESI+,m/z:Calcd for C41H78NO4[M+H]+,648.5931；found,648.5932.
实施例2
制备Boc基团保护的赖氨酸谷氨酸双油醇酯(OA2-Glu-Lys(Boc)2)，化学结构式如下：
Figure BDA0002280745150000091
将Boc-Lys(Boc)-OH(484mg，2.085mmol)溶解于30mL氯仿并放置于0℃，搅拌下依次加入EDCI(639mg，3.335mmol)和HOBT(451mg，3.335mmol)。加料完毕后转移至室温搅拌3h，得反应液A；将OA2-Glu(1.35g，2.085mmol)溶解于20mL氯仿，搅拌下加入三乙胺(872μL，6.254mmol)，室温搅拌1h，得反应液B。将反应液B缓慢滴入反应液A，室温搅拌过夜。反应结束后，用适量水洗涤两次，适量10％柠檬酸水溶液洗涤两次，适量饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，抽滤浓缩后得到粗产物黄白色油状物，经柱层析纯化(石油醚︰乙酸乙酯＝7︰1)得到无色透明油状物721mg，收率：35.4％。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ(ppm)6.82(brs,1H,BocNH),5.45–5.27(m,4H,CH2CHCHCH2),5.16(brs,1H,BocNH),4.71(brs,1H,BocNHCH),4.63–4.55(m,1H,NHCH),4.12(t,J＝6.9Hz,2H,COOCH2),4.05(t,J＝6.5Hz,2H,COOCH2),3.15–3.07(brs,2H,NHCH2),2.49–2.29(m,2H,CH2CO),2.27–2.15(m,1H,NHCHCH2),2.06–1.92(m,8H,CH2CHCHCH2),1.88–1.78(m,1H,NHCHCH2),1.73–1.54(m,4H,COOCH2CH2,2H,NHCH2CH2CH2CH2),1.46–1.42(m,18H,C(CH3)3,2H,NHCH2CH2),1.35–1.24(m,44H,CH2(oleyl),2H,NHCH2CH2CH2),0.88(t,J＝6.9Hz,6H,CH2CH3).13C NMR(75MHz,CDCl3):δ(ppm)172.41(1C,CH2COOCH2),171.54(1C,NHCHCO),171.16(1C,CHCONH),155.66(1C,(CH3)3COCO),155.19(1C,(CH3)3COCO),129.47(2C,CH2CHCHCH2),129.26(2C,CH2CHCHCH2),94.60(2C,C(CH3)3),65.32(1C,COOCH2),66.45(1C,COOCH2),53.82(1C,BocNHCH),51.19(1C,NHCH),39.34(1C,NHCH2),32.11(1C,CH2COOCH2),31.40(2C,CH2CH2CH3),29.71(1C,NHCH2CH2),29.26(4C,CH2CHCHCH2),29.20(1C,CH2(oleyl)),29.16(1C,CH2(oleyl)),29.02(2C,CH2(oleyl)),28.94(2C,CH2(oleyl)),28.82(8C,CH2(oleyl)),28.74(2C,CH2(oleyl)),28.07(1C,NHCHCH2),27.94(3C,(CH3)3C),27.80(3C,(CH3)3C),26.80(1C,NHCH2CH2CH2CH2),26.70(2C,OCH2CH2),25.39(1C,OCH2CH2CH2),25.30(1C,OCH2CH2CH2),22.18(2C,CH2CH3),21.95(1C,NHCH2CH2CH2),13.62(2C,CH2CH3).HRMS,ESI+,m/z:Calcd forC57H105N3O9Na[M+Na]+,998.7749；found,998.7747.
实施例3
制备赖氨酸谷氨酸双油醇酯(OA2-Glu-Lys)，化学结构式如下：
Figure BDA0002280745150000101
将OA2-Glu-Lys(Boc)2(481mg，0.493mmol)置于0℃，缓慢滴加氯化氢-1，4-二氧六环溶液(4.0M浓度)30ml。反应结束后，将反应液浓缩，得到黄色凝胶状固体335mg，收率：80.2％。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm)8.21(brs,2H,NH2),7.87(brs,2H,NH2),5.40–5.30(m,4H,CH2CHCHCH2),4.55–4.39(m,1H,NH2CH),4.14–3.99(m,4H,COOCH2),3.27–3.08(m,1H,NH2CH),2.68–2.40(m,2H,NH2CH2),2.19–2.10(m,2H,CH2CO),2.08–1.93(m,8H,CH2CHCHCH2,2H,NHCHCH2),1.76–1.55(m,4H,COOCH2CH2,2H,NHCH2CH2CH2CH2),1.36–1.25(m,44H,CH2(oleyl),2H,NH2CH2CH2CH2,2H,NH2CH2CH2),0.88(t,J＝7.1Hz,6H,CH2CH3).13C NMR(125MHz,CDCl3):δ(ppm)173.32(1C,CH2COOCH2),171.44(1C,NHCHCO),169.47(1C,CHCONH),129.91(2C,CH2CHCHCH2),129.69(2C,CH2CHCHCH2),65.95(1C,COOCH2),65.17(1C,COOCH2),53.19(1C,NH2CH),52.31(1C,NHCH),39.68(1C,NH2CH2),32.60(1C,CH2COOCH2),31.88(2C,CH2CH2CH3),30.87(1C,NH2CH2CH2CH2CH2),29.81(2C,CH2(oleyl)),29.75(4C,CH2CHCHCH2),29.66(2C,CH2(oleyl)),29.57(2C,CH2(oleyl)),29.51(2C,CH2(oleyl)),29.38(2C,CH2(oleyl)),29.36(2C,CH2(oleyl)),29.30(2C,CH2(oleyl)),29.29(2C,CH2(oleyl)),28.67(1C,NHCHCH2),27.24(1C,NH2CH2CH2),27.21(2C,OCH2CH2),25.99(2C,OCH2CH2CH2),22.64(2C,CH2CH3),21.55(1C,NH2CH2CH2CH2),14.06(2C,CH2CH3).HRMS,ESI+,m/z:Calcd for C47H90N3O5[M+H]+,776.6880；found,776.6860.
实施例4
制备谷氨酸双亚麻醇酯(ODA2-Glu)，化学结构式如下：
Figure BDA0002280745150000111
将L-谷氨酸(1.32g，8.942mmol)溶解于100mL无水甲苯，搅拌下加入对甲基苯磺酸(1.87g，9.836mmol)，升温至150℃，回流反应3h。冷却至室温，加入亚麻醇(5.0g，18.779mmol)，升温至150℃，回流反应过夜。反应结束后，旋蒸除去甲苯，得到深棕色油状物。溶解于200mL氯仿，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤(150mL×2)，饱和食盐水洗涤(150mL×1)，无水硫酸钠干燥，抽滤后浓缩得到深棕色油状物，经柱层析纯化(石油醚︰乙酸乙酯＝10︰1)得到无色透明油状物3.20g，收率：55％。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm)5.41–5.30(m,8H,CH2CHCHCH2),4.11(t,J＝6.9Hz,2H,COOCH2),4.06(t,J＝6.9Hz,2H,COOCH2),3.51–3.45(m,1H,NH2CH),2.77(t,J＝6.6Hz,4H,CHCHCH2CHCH),2.46(t,J＝7.6Hz,2H,CH2CO),2.09–2.02(m,8H,CH2CHCHCH2CHCHCH2,1H,NH2CHCH2),1.88–1.83(m,1H,NH2CHCH2),1.66–1.60(m,4H,COOCH2CH2),1.35–1.27(m,32H,CH2(linolylalcohol)),0.89(t,J＝6.9Hz,6H,CH2CH3).13C NMR(125MHz,CDCl3):δ(ppm)175.44(1C,CH2COOCH2),173.14(1C,NH2CHCO),130.17(2C,CH2CHCHCH2),130.03(1C,CH2CHCHCH2),130.01(1C,CH2CHCHCH2),128.02(2C,CH2CHCHCH2),127.60(2C,CH2CHCHCH2),64.20(1C,COOCH2),64.66(1C,COOCH2),53.78(1C,NHCH),31.50(2C,CH2CH2CH3),30.62(1C,CH2COOCH2),29.68(2C,CHCHCH2CHCH),29.61(4C,CH2CHCHCH2),29.39(1C,CH2(linolylalcohol)),29.37(1C,CH2(linolylalcohol)),29.31(2C,CH2(linolylalcohol)),29.20(4C,CH2(linolylalcohol)),28.60(1C,CH2(linolylalcohol)),28.58(1C,CH2(linolylalcohol)),27.18(1C,NHCHCH2),25.88(1C,OCH2CH2),25.84(1C,OCH2CH2),25.62(2C,OCH2CH2CH2),22.53(2C,CH2CH3),14.01(2C,CH2CH3).HRMS,ESI+,m/z:Calcd for C41H74NO4[M+H]+,644.5618；found,644.5601.
实施例5
制备Boc基团保护的赖氨酸谷氨酸双亚麻醇酯(ODA2-Glu-Lys(Boc)2)，化学结构式如下：
Figure BDA0002280745150000121
将Boc-Lys(Boc)-OH(366mg，1.058mmol)溶解于20mL氯仿并放置于0℃，搅拌下依次加入EDCI(325mg，1.693mmol)和HOBT(229mg，1.693mmol)。加料完毕后转移至室温搅拌3h，得反应液A；将ODA2-Glu(681mg，1.058mmol)溶解于20mL氯仿，搅拌下加入三乙胺(443μL，3.175mmol)，室温搅拌1h，得反应液B。将反应液B缓慢滴入反应液A，室温搅拌过夜。反应结束后，用适量水洗涤两次，适量10％柠檬酸水溶液洗涤两次，适量饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，抽滤浓缩后得到粗产物黄色油状物，经柱层析纯化(石油醚︰乙酸乙酯＝8︰1)得到无色透明油状物581mg，收率：56.5％。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm)6.78(d,J＝7.0Hz,1H,BocNH),5.41–5.30(m,8H,CH2CHCHCH2),5.12(brs,1H,BocNH),4.66(brs,1H,BocNHCH),4.61–4.56(m,1H,NHCH),4.13(t,J＝6.8Hz,2H,COOCH2),4.05(t,J＝6.8Hz,2H,COOCH2),3.14–3.08(brs,2H,NHCH2),2.77(t,J＝6.6Hz,4H,CHCHCH2CHCH),2.45–2.31(m,2H,CH2CO),2.25–2.15(m,1H,NHCHCH2),2.07–2.03(m,8H,CH2CHCHCH2CHCHCH2),1.86–1.81(m,1H,NHCHCH2),1.66–1.59(m,4H,COOCH2CH2,2H,NHCH2CH2CH2CH2),1.51–1.48(m,2H,NHCH2CH2),1.44(s,18H,C(CH3)3),1.35–1.24(m,32H,CH2(linolylalcohol),2H,NHCH2CH2CH2),0.89(t,J＝7.2Hz,6H,CH2CH3).13C NMR(125MHz,CDCl3):δ(ppm)172.84(1C,CH2COOCH2),172.00(1C,NHCHCO),171.60(1C,CHCONH),156.12(2C,(CH3)3COCO),130.18(2C,CH2CHCHCH2),130.02(2C,CH2CHCHCH2),128.02(2C,CH2CHCHCH2),127.90(2C,CH2CHCHCH2),65.78(1C,COOCH2),64.90(1C,COOCH2),54.35(1C,BocNHCH),51.71(1C,NHCH),39.87(1C,NHCH2),31.49(2C,CH2CH2CH3),30.31(1C,CH2COOCH2),29.66(2C,CHCHCH2CHCH),29.62(4C,CH2CHCHCH2CHCHCH2),29.40(2C,CH2(linolylalcohol)),29.37(2C,CH2(linolylalcohol)),29.31(2C,CH2(linolylalcohol)),29.21(2C,CH2(linolylalcohol)),29.16(2C,CH2(linolylalcohol)),28.57(1C,NHCH2CH2),28.49(1C,NHCHCH2),28.42(3C,(CH3)3C),28.29(3C,(CH3)3C),27.19(1C,NHCH2CH2CH2CH2),25.86(1C,OCH2CH2),25.77(1C,OCH2CH2),25.61(2C,OCH2CH2CH2),22.53(2C,CH2CH3),22.47(1C,NHCH2CH2CH2),14.00(2C,CH2CH3).HRMS,ESI+,m/z:Calcd for C57H101N3O9Na[M+Na]+,994.7436；found,994.7437.
实施例6
制备赖氨酸谷氨酸双亚麻醇酯(ODA2-Glu-Lys)，化学结构式如下：
Figure BDA0002280745150000131
将ODA2-Glu-Lys(Boc)2(581mg，0.598mmol)置于0℃，缓慢滴加氯化氢-1，4-二氧六环溶液(4.0M浓度)30ml。反应结束后，将反应液浓缩，得到黄色凝胶状固体378mg，收率：75.0％。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm)5.44–5.28(m,8H,CH2CHCHCH2),4.37–4.25(m,1H,NH2CH),3.88–3.60(m,4H,COOCH2),3.27–3.08(m,1H,NH2CH),2.85–2.70(m,4H,CHCHCH2CHCH),2.48–2.20(m,2H,NH2CH2),2.17–1.93(m,8H,CH2CHCHCH2,2H,NHCHCH2,2H,CH2CO),1.78–1.52(m,4H,COOCH2CH2,2H,NHCH2CH2CH2CH2),1.38–1.26(m,32H,CH2(linolylalcohol),2H,NH2CH2CH2CH2,2H,NH2CH2CH2),0.89(t,J＝5.9Hz,6H,CH2CH3).13C NMR(125MHz,CDCl3):δ(ppm)173.38(1C,CH2COOCH2),171.44(1C,NHCHCO),169.48(1C,CHCONH),130.18(2C,CH2CHCHCH2),130.00(2C,CH2CHCHCH2),128.04(2C,CH2CHCHCH2),127.90(2C,CH2CHCHCH2),65.53(2C,COOCH2),53.52(1C,NH2CH),52.56(1C,NHCH),40.28(1C,NH2CH2),31.90(1C,CH2COOCH2),31.51(2C,CH2CH2CH3),30.57(1C,NH2CH2CH2CH2CH2),29.76(2C,CHCHCH2CHCH),29.67(4C,CH2CHCHCH2CHCHCH2),29.52(2C,CH2(linolylalcohol)),29.47(2C,CH2(linolylalcohol)),29.41(2C,CH2(linolylalcohol)),29.33(4C,CH2(linolylalcohol)),28.82(1C,NHCHCH2),27.28(1C,NH2CH2CH2),27.19(2C,OCH2CH2),25.65(2C,OCH2CH2CH2),22.66(1C,NH2CH2CH2CH2),22.56(2C,CH2CH3),14.06(2C,CH2CH3).HRMS,ESI+,m/z:Calcd for C47H86N3O5[M+H]+,772.6567；found,772.6571.
实施例7
制备天冬氨酸双胆固醇酯(OChol2-Asp)，化学结构式如下：
Figure BDA0002280745150000141
将L-天冬氨酸(5.00g，37.6mmol)溶解于200mL无水甲苯，搅拌下加入对甲基苯磺酸(13.58g，78.9mmol)，升温至140℃，回流反应2h。冷却至室温，加入胆固醇(30.5g，78.9mmol)，升温至150℃，回流反应过夜。反应结束后，旋蒸除去甲苯，得到黄色油状物。溶解于300mL氯仿，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤(200mL×2)，饱和食盐水洗涤(200mL×1)，无水硫酸钠干燥，抽滤后浓缩得到淡黄色油状物，经柱层析纯化(石油醚︰乙酸乙酯＝8︰1)得到无色透明油状物15.03g，收率：46％。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ(ppm)5.38(d,2H,chol),4.13–4.09(m,1H,NH2CH),3.20(m,2H,chol),2.80(t,J＝7.6Hz,2H,CH2CO),2.29(d,4H,chol),2.04–0.85(m,76H,chol),0.68(s,6H,chol).
实施例8
制备Boc基团保护的赖氨酸天冬氨酸双胆固醇酯(OChol2-Asp-Lys(Boc)2)，化学结构式如下：
Figure BDA0002280745150000151
将Boc-Lys(Boc)-OH(597mg，1.725mmol)溶解于30mL氯仿并放置于0℃，搅拌下依次加入EDCI(529mg，2.759mmol)和HOBT(373mg，2.759mmol)。加料完毕后转移至室温搅拌3h，得反应液A；将OChol2-Asp(1.50g，1.725mmol)溶解于20mL氯仿，搅拌下加入三乙胺(721μL，5.174mmol)，室温搅拌1h，得反应液B。将反应液B缓慢滴入反应液A，室温搅拌过夜。反应结束后，用适量水洗涤两次，适量10％柠檬酸水溶液洗涤两次，适量饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，抽滤浓缩后得到粗产物黄色凝胶状固体，经柱层析纯化(石油醚︰乙酸乙酯＝5︰1)得到无色透明凝胶状固体882mg，收率：42.7％。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm)6.82(brs,1H,BocNH),5.38(d,2H,chol),5.16(brs,1H,BocNH),4.72(brs,1H,BocNHCH),4.13–4.07(m,1H,NHCH),3.22(m,2H,chol),3.11–3.06(brs,2H,NHCH2),2.85(t,J＝7.6Hz,2H,CH2CO),2.26(d,4H,chol),2.17–0.85(m,100H,chol,NHCH2CH2CH2CH2,C(CH3)3,NHCH2CH2,NHCH2CH2CH2),0.67(s,6H,chol).
实施例9
制备赖氨酸天冬氨酸双胆固醇酯(OChol2-Asp-Lys)，化学结构式如下：
Figure BDA0002280745150000152
将OChol2-Asp-Lys(Boc)2(882mg，0.598mmol)置于0℃，缓慢滴加氯化氢-1，4-二氧六环溶液(4.0M浓度)30ml。反应结束后，将反应液浓缩，得到黄色凝胶状固体607mg，收率：82.6％。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm)8.22(brs,2H,NH2),7.85(brs,2H,NH2),5.38(d,2H,chol),4.56–4.40(m,1H,NHCH),3.27–3.08(m,1H,NH2CH,2H,chol),2.66–2.42(brs,2H,NH2CH2),3.10–2.85(m,2H,CH2CO),2.26(d,4H,chol),2.17–0.85(m,82H,chol,NHCH2CH2CH2CH2,NHCH2CH2,NHCH2CH2CH2),0.67(s,6H,chol).
实施例10
制备甘氨酸油醇酯(OA-Gly)，化学结构式如下：
Figure BDA0002280745150000161
将L-甘氨酸(5.00g，66.6mmol)溶解于200mL无水甲苯，搅拌下加入对甲基苯磺酸(12.62g，73.3mmol)，升温至140℃，回流反应2h。冷却至室温，加入油醇(19.66g，73.3mmol)，升温至150℃，回流反应过夜。反应结束后，旋蒸除去甲苯，得到棕色油状物。溶解于300mL氯仿，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤(200mL×2)，饱和食盐水洗涤(200mL×1)，无水硫酸钠干燥，抽滤后浓缩得到棕色油状物，经柱层析纯化(石油醚︰乙酸乙酯＝8︰1)得到无色透明油状物8.78g，收率：41％。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ(ppm)5.38(m,2H,CH2CHCHCH2),4.18(m,2H,COOCH2),4.01(m,2H,NH2CH2),1.97(m,4H,CH2CHCHCH2),1.57(m,2H,COOCH2CH2),1.29(m,22H,CH2(oleyl)),0.86(t,3H,CH2CH3).
实施例11
制备Boc基团保护的赖氨酸甘氨酸油醇酯(OA-Gly-Lys(Boc)2)，化学结构式如下：
Figure BDA0002280745150000162
将Boc-Lys(Boc)-OH(2.086g，6.025mmol)溶解于30mL氯仿并放置于0℃，搅拌下依次加入EDCI(1.85g，9.640mmol)和HOBT(1.30g，9.640mmol)。加料完毕后转移至室温搅拌3h，得反应液A；将OA-Gly(1.96g，6.025mmol)溶解于20mL氯仿，搅拌下加入三乙胺(2.52mL，18.075mmol)，室温搅拌1h，得反应液B。将反应液B缓慢滴入反应液A，室温搅拌过夜。反应结束后，用适量水洗涤两次，适量10％柠檬酸水溶液洗涤两次，适量饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，抽滤浓缩后得到粗产物黄色油状物，经柱层析纯化(石油醚︰乙酸乙酯＝6︰1)得到无色透明油状物1.32g，收率：33.5％。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm)6.84(brs,1H,BocNH),5.35(m,2H,CH2CHCHCH2),5.17(brs,1H,BocNH),4.74(brs,1H,BocNHCH),4.12(m,2H,COOCH2),4.02(m,2H,NHCH2),3.09(brs,2H,NHCH2),1.95(m,4H,CH2CHCHCH2),1.63(m,2H,COOCH2CH2,2H,NHCH2CH2CH2CH2),1.43(m,18H,C(CH3)3,2H,NHCH2CH2),1.28(m,22H,CH2(oleyl),2H,NHCH2CH2CH2),0.86(t,3H,CH2CH3).
实施例12
制备赖氨酸甘氨酸油醇酯(OA-Gly-Lys)，化学结构式如下：
Figure BDA0002280745150000171
将OA-Gly-Lys(Boc)2(1.32g，2.020mmol)置于0℃，缓慢滴加氯化氢-1，4-二氧六环溶液(4.0M浓度)30ml。反应结束后，将反应液浓缩，得到黄色凝胶状固体726mg，收率：79.3％。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm)8.23(brs,2H,NH2),7.85(brs,2H,NH2),5.33(m,2H,CH2CHCHCH2),4.12(m,2H,COOCH2),4.02(m,2H,NHCH2),3.20(m,1H,NH2CH),2.56(brs,2H,NH2CH2),1.95(m,4H,CH2CHCHCH2),1.63(m,2H,COOCH2CH2,2H,NH2CH2CH2CH2CH2),1.30(m,22H,CH2(oleyl),2H,NH2CH2CH2CH2,2H,NH2CH2CH2),0.88(t,3H,CH2CH3).
实施例13
制备缬氨酸亚麻醇酯(ODA-Val)，化学结构式如下：
Figure BDA0002280745150000172
将L-缬氨酸(2.00g，17.072mmol)溶解于100mL无水甲苯，搅拌下加入对甲基苯磺酸(3.23g，18.779mmol)，升温至140℃，回流反应3h。冷却至室温，加入亚麻醇(5.0g，18.779mmol)，升温至150℃，回流反应过夜。反应结束后，旋蒸除去甲苯，得到棕色油状物。溶解于200mL氯仿，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤(150mL×2)，饱和食盐水洗涤(150mL×1)，无水硫酸钠干燥，抽滤后浓缩得到深棕色油状物，经柱层析纯化(石油醚︰乙酸乙酯＝8︰1)得到无色透明油状物2.87g，收率：46％。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ(ppm)5.36(m,4H,CH2CHCHCH2),4.06(m,2H,COOCH2),4.03(m,1H,NH2CH2),2.76(t,2H,CHCHCH2CHCH),2.39(m,1H,CH(CH3)2),2.03(m,4H,CH2CHCHCH2CHCHCH2),1.63(m,2H,COOCH2CH2),1.30(m,16H,CH2(linolylalcohol)),0.98(brs,6H,CH(CH3)2),0.89(t,3H,CH2CH3).
实施例14
制备Boc基团保护的赖氨酸缬氨酸亚麻醇酯(ODA-Val-Lys(Boc)2)，化学结构式如下：
Figure BDA0002280745150000181
将Boc-Lys(Boc)-OH(2.720g，7.856mmol)溶解于30mL氯仿并放置于0℃，搅拌下依次加入EDCI(2.410g，12.570mmol)和HOBT(1.699g，12.570mmol)。加料完毕后转移至室温搅拌3h，得反应液A；将ODA-Val(2.87g，7.856mmol)溶解于20mL氯仿，搅拌下加入三乙胺(3.285mL，23.568mmol)，室温搅拌1h，得反应液B。将反应液B缓慢滴入反应液A，室温搅拌过夜。反应结束后，用适量水洗涤两次，适量10％柠檬酸水溶液洗涤两次，适量饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，抽滤浓缩后得到粗产物黄色油状物，经柱层析纯化(石油醚︰乙酸乙酯＝6︰1)得到无色透明油状物1.673g，收率：30.7％。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm)6.88(brs,1H,BocNH),5.35(m,4H,CH2CHCHCH2),5.21(brs,1H,BocNH),4.74(brs,1H,BocNHCH),4.09(m,2H,COOCH2),4.02(m,1H,NHCH2),3.12(brs,2H,NHCH2),2.76(t,2H,CHCHCH2CHCH),2.38(m,1H,CH(CH3)2),2.03(m,4H,CH2CHCHCH2CHCHCH2),1.65(m,2H,COOCH2CH2,2H,NHCH2CH2CH2CH2),1.43(m,18H,C(CH3)3,2H,NHCH2CH2),1.30(m,16H,CH2(linolylalcohol),2H,NHCH2CH2CH2),0.96(brs,6H,CH(CH3)2),0.88(t,3H,CH2CH3).
实施例15
制备赖氨酸缬氨酸亚麻醇酯(ODA-Val-Lys)，化学结构式如下：
Figure BDA0002280745150000191
将ODA-Val-Lys(Boc)2(1.673g，2.412mmol)置于0℃，缓慢滴加氯化氢-1，4-二氧六环溶液(4.0M浓度)40ml。反应结束后，将反应液浓缩，得到黄色凝胶状固体905mg，收率：76.0％。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm)8.25(brs,2H,NH2),7.84(brs,2H,NH2),5.33(m,4H,CH2CHCHCH2),4.12(m,2H,COOCH2),4.03(m,1H,NHCH2),3.20(m,1H,NH2CH),2.56(brs,2H,NH2CH2),2.76(t,2H,CHCHCH2CHCH),2.39(m,1H,CH(CH3)2),2.05(m,4H,CH2CHCHCH2CHCHCH2),1.65(m,2H,COOCH2CH2,2H,NH2CH2CH2CH2CH2),1.30(m,16H,CH2(linolylalcohol),2H,NH2CH2CH2CH2,2H,NHCH2CH2),0.96(brs,6H,CH(CH3)2),0.89(t,3H,CH2CH3).
实施例16
制备丙氨酸胆固醇酯(OChol-Ala)，化学结构式如下：
Figure BDA0002280745150000192
将L-丙氨酸(4.00g，44.9mmol)溶解于200mL无水甲苯，搅拌下加入对甲基苯磺酸(8.50g，49.4mmol)，升温至140℃，回流反应2h。冷却至室温，加入胆固醇(19.10g，49.4mmol)，升温至150℃，回流反应过夜。反应结束后，旋蒸除去甲苯，得到黄色油状物。溶解于300mL氯仿，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤(200mL×2)，饱和食盐水洗涤(200mL×1)，无水硫酸钠干燥，抽滤后浓缩得到黄色油状物，经柱层析纯化(石油醚︰乙酸乙酯＝10︰1)得到无色透明油状物10.88g，收率：53％。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ(ppm)5.39(d,1H,chol),3.52(m,1H,CH3CH),3.20(m,1H,chol),2.29(d,2H,chol),2.00–0.83(m,41H,chol,CHCH3),0.67(s,3H,chol).
实施例17
制备Boc基团保护的赖氨酸丙氨酸胆固醇酯(OChol-Ala-Lys(Boc)2)，化学结构式如下：
Figure BDA0002280745150000201
将Boc-Lys(Boc)-OH(2.398g，6.926mmol)溶解于30mL氯仿并放置于0℃，搅拌下依次加入EDCI(1.931g，10.075mmol)和HOBT(1.361g，10.075mmol)。加料完毕后转移至室温搅拌3h，得反应液A；将OChol-Ala(2.88g，6.297mmol)溶解于20mL氯仿，搅拌下加入三乙胺(2.633mL，18.900mmol)，室温搅拌1h，得反应液B。将反应液B缓慢滴入反应液A，室温搅拌过夜。反应结束后，用适量水洗涤两次，适量10％柠檬酸水溶液洗涤两次，适量饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，抽滤浓缩后得到粗产物黄色凝胶状固体，经柱层析纯化(石油醚︰乙酸乙酯＝7︰1)得到无色透明凝胶状固体1.697g，收率：34.3％。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm)6.84(brs,1H,BocNH),5.39(d,1H,chol),5.17(brs,1H,BocNH),4.74(brs,1H,BocNHCH),4.12–4.05(m,1H,NHCH),3.52(m,1H,CH3CH),3.20(m,1H,chol),3.11–3.06(brs,2H,NHCH2),2.29(d,2H,chol),2.17–0.83(m,65H,chol,CHCH3,NHCH2CH2CH2CH2,C(CH3)3,NHCH2CH2,NHCH2CH2CH2),0.68(s,3H,chol).
实施例18
制备赖氨酸丙氨酸胆固醇酯(OChol-Ala-Lys)，化学结构式如下：
Figure BDA0002280745150000202
将OChol-Ala-Lys(Boc)2(1.697g，2.160mmol)置于0℃，缓慢滴加氯化氢-1，4-二氧六环溶液(4.0M浓度)40ml。反应结束后，将反应液浓缩，得到黄色凝胶状固体916mg，收率：72.4％。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm)8.25(brs,2H,NH2),7.82(brs,2H,NH2),5.39(d,1H,chol),4.50–4.42(m,1H,NHCH),3.52(m,1H,CH3CH),3.25–3.10(m,1H,chol,1H,NH2CH),2.69–2.55(brs,2H,NH2CH2),2.26(d,2H,chol),2.11–0.85(m,47H,chol,CHCH3,NHCH2CH2CH2CH2,NHCH2CH2,NHCH2CH2CH2),0.67(s,3H,chol).
实施例19
阳离子脂质体的制备与表征
采用过膜挤出法制备空白阳离子脂质体。按照1:2摩尔比称取适量胆固醇和实施例3、6、9、12、15、18中的阳离子脂质，溶于氯仿/甲醇混合溶剂(4:1，v/v)，减压蒸发成膜，真空干燥过夜除去残留的有机溶剂。室温下水化脂膜，将得到的脂质体混悬液，在37℃依次挤过0.8μm、0.45μm、0.2μm的碳酸脂膜各7次，得到空白脂质体溶液。其粒径和电位性质如表1所示。
表1阳离子空白脂质体的基本性质(n＝3)
Figure BDA0002280745150000211
上述实验数据表明，本发明制备的空白阳离子脂质体的粒径在50～200nm之间，符合基因载体的粒径要求；多分散系数(PDI)均小于0.3，表明通过薄膜挤出法制备的脂质体粒径均一；表面电位在0～+40mV之间，表明所制备的阳离子脂质体可以与负电性的核酸药物通过静电相互作用结合并有效压缩质粒。
实施例20
空白阳离子脂质体的透射电子显微镜(TEM)观察
将1mg/ml空白阳离子脂质体滴加到铜网上挥干，采用50％醋酸双氧铀溶液负染后，通过透射电子显微镜拍摄。其脂质体的形态如图1所示(标尺为50nm)。
上述实验表面，制备的空白阳离子脂质体呈现球形，并且其大小与粒径电位仪测定结果一致。
实施例21
质粒药物脂质体(阳离子脂质体/绿色荧光蛋白质粒)的制备与表征
按照不同的氮磷比(N/P＝1、2、3、5、7、9)将绿色荧光蛋白质粒(GFP-DNA)(如2μg)和上述空白阳离子脂质体溶液混合，用去离子水稀释至200μl，涡旋10s，并室温孵育30min，即得到阳离子脂质体/GFP-DNA二元复合物。通过琼脂糖凝胶电泳实验考察脂质体荷载GFP-DNA的能力，如图2所示。并考察二元复合物的粒径和电位，如图3所示。结果表明，所有阳离子脂质体均能在一定N/P条件下稳定荷载DNA，不发生泄漏，粒径在100-1000nm之间，电位在+5～+40mV之间，可进一步用于细胞实验。
实施例22
质粒药物脂质体(OA2-Glu-Lys/GFP-DNA)的透射电子显微镜(TEM)观察
按上述方法制备OA2-Glu-Lys/GFP-DNA(N/P＝3)，将该质粒药物脂质体滴加到铜网上挥干，并用50％醋酸双氧铀负染后，通过透射电子显微镜拍摄。其形态如图4所示(标尺为50nm)。上述实验结果表面，OA2-Glu-Lys/GFP-DNA(N/P＝3)仍呈现球形结构，并与粒径电位仪测定结果一致。其他质粒药物脂质体也具有类似的形貌。
实施例23
质粒药物脂质体的稳定性
按上述方法制备质粒药物脂质体，在不同培养介质中分别静置0、1、2、4、6、12、24h后，通过粒径仪测量其粒径变化(图5)。结果显示质粒药物脂质体在血清、RMI 1640培养基和生理盐水中孵育24h后粒径基本不变，表明该质粒药物脂质体具有良好的稳定性。
实施例24
质粒药物脂质体的核酸酶稳定性
按上述方法制备质粒药物脂质体(OA2-Glu-Lys/GFP-DNA(N/P＝3))，并将4μL DNA酶(DNaseⅠ，2.5U/μL)加入到质粒药物脂质体中，37℃孵育30分钟后，加入EDTA溶液终止酶解反应。随后加入十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液置换脂质体上的DNA，混合均匀后取20μL混合液进行琼脂糖凝胶电泳。同时以游离DNA按同样的操作作为对照(图6)。实验结果表明，裸露的DNA极易被核酸酶降解，而该阳离子脂质体可以保护DNA免受核酸酶降解。其他质粒药物脂质体也具有类似的保护DNA免受核酸酶降解的能力。
实施例25
HEK293细胞体外转染
按上述方法制备质粒药物脂质体。取对数生长期的HEK293细胞，调整细胞密度为4×105个/mL的细胞悬液，接种于24孔细胞板，每孔接种细胞悬液500μL，置于37℃，5％CO2恒温培养箱内继续培养24h至细胞密度达80％左右。弃去培养液，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤两次，各孔依次加入质粒药物脂质体(阳离子脂质体/绿色荧光蛋白质粒)，剂量为1.2μg/孔(n＝3)，继续培养6h。弃去上清，用PBS洗涤三次，加入500μl含10％胎牛血清的1640培养液，继续培养。72h后采用倒置荧光显微镜定性观察HEK293细胞中绿色荧光蛋白的表达情况(图7)(标尺为100μm)，同时采用流式细胞仪定量考察HEK293细胞中的绿色荧光强度(图8)。本实验以商业化转染试剂Lipofectamine 2000为阳性对照，评价本发明所提供的阳离子脂质体的绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况。
实验结果表明，与市售的脂质体Lipofectamine 2000相比，各种质粒药物脂质体转染的HEK293细胞表达更多的绿色荧光蛋白(GFP)，具有更高的转染效率。
实施例26
HepG2细胞体外转染
按上述方法制备质粒药物脂质体(OA2-Glu-Lys/GFP-DNA(N/P＝3)，ODA2-Glu-Lys/GFP-DNA(N/P＝3))。取对数生长期的HepG2细胞，调整细胞密度为4×105个/mL的细胞悬液，接种于24孔细胞板，每孔接种细胞悬液500μL，置于37℃，5％CO2恒温培养箱内继续培养24h至细胞密度达80％左右。弃去培养液，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤两次，各孔依次加入质粒药物脂质体(阳离子脂质体/绿色荧光蛋白质粒)，剂量为1.2μg/孔(n＝3)，继续培养6h。弃去上清，用PBS洗涤三次，加入500μl含10％胎牛血清的1640培养液，继续培养。72h后采用倒置荧光显微镜定性观察HepG2细胞中绿色荧光蛋白的表达情况(图9)(标尺为200μm)，并用流式细胞仪定量考察HepG2细胞中的绿色荧光强度(图10)。本实验以商业化转染试剂Lipofectamine 2000为阳性对照，评价本发明所提供的阳离子脂质体的绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况。
实验结果表明，与市售的脂质体Lipofectamine 2000相比，OA2-Glu-Lys脂质体和ODA2-Glu-Lys脂质体转染的HepG2细胞表达更多的绿色荧光蛋白(GFP)，具有更高的转染效率。
实施例27
小鼠原代肝实质细胞转染
按上述方法制备质粒药物脂质体(OA2-Glu-Lys/GFP-DNA(N/P＝3)，ODA2-Glu-Lys/GFP-DNA(N/P＝3))。提取小鼠肝实质细胞，以4×105个/mL的细胞悬液密度，接种于12孔细胞板，每孔接种细胞悬液1mL，置于37℃，5％CO2恒温培养箱内继续培养4h后进行换液，继续培养48h至细胞铺展。弃去培养液，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤两次，各孔依次加入质粒药物脂质体(阳离子脂质体/绿色荧光蛋白质粒)，剂量为1.2μg/孔(n＝3)，继续培养6h。弃去上清，用PBS洗涤三次，加入1mL含10％胎牛血清的MEM培养液，继续培养。48h后采用倒置荧光显微镜定性观察绿色荧光蛋白的表达情况(图11)，并用流式细胞仪定量考察肝实质细胞中的绿色荧光强度(图12)。本实验以商业化转染试剂Lipofectamine 2000为阳性对照，评价本发明所提供的阳离子脂质体的绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况。
实验结果显示，与市售的脂质体Lipofectamine 2000相比，OA2-Glu-Lys脂质体和ODA2-Glu-Lys脂质体对于原代细胞具有更高的转染能力。
实施例28
血清存在下的HepG2细胞转染
按上述方法制备质粒药物脂质体(OA2-Glu-Lys/GFP-DNA(N/P＝3))。取对数生长期的HepG2细胞，调整细胞密度为4×105个/mL的细胞悬液，接种于24孔细胞板，每孔接种细胞悬液500μL，置于37℃，5％CO2恒温培养箱内继续培养24h至细胞密度达80％左右。弃去培养液，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤两次，各孔依次加入质粒药物脂质体(阳离子脂质体/绿色荧光蛋白质粒)，剂量为1.2μg/孔(n＝3)，血清含量分别为0％、10％、20％、30％，继续培养6h。弃去上清，用PBS洗涤三次，加入500μl含10％胎牛血清的1640培养液，继续培养。72h后采用流式细胞仪定量考察HepG2细胞中的绿色荧光强度(图13)。本实验以商业化转染试剂Lipofectamine 2000为阳性对照，评价本发明所提供的阳离子脂质体的绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况。
实验结果显示，本发明的OA2-Glu-Lys阳离子脂质体在10％、20％、30％血清存在下的转染能力仍然与阳性对照Lipofectamine 2000相当，表明OA2-Glu-Lys阳离子脂质体体内应用也具有一定的可行性。
实施例29
空白阳离子脂质体的细胞安全性
取对数生长的HepG2细胞以3×104/孔的密度接种于96孔板中，置于含5％CO2的37℃恒温培养箱中培养24h至细胞密度达到80％左右。弃去培养基，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤两次，按上述方法制备的阳离子脂质体(OA2-Glu-Lys/GFP-DNA(N/P＝3))用转染专用的Opti-MEM培养基混合以4.1、8.2、12.3、16.4mg/ml的终浓度分别孵育细胞24h或48h。随后，每孔加入20μL的5mg/ml的MTT溶液37℃培养4h，弃去上清，加入200μl/孔的二甲基亚砜(DMSO)溶解紫色结晶，用酶标仪测定在波长570nm处的吸光值，重复测定三次。统计分析细胞存活率(n＝4)。本实验以商业化的转染试剂Lipofectamine 2000为阳性对照，评价本发明所提供的空白阳离子脂质体对HepG2细胞的毒性(图14)。(细胞存活率＝(制剂组细胞吸光值-空白板子的吸光值/空白组细胞吸光值-空白板子的吸光值)*100％)
实验结果显示，本发明的OA2-Glu-Lys阳离子脂质体在不同浓度下孵育HepG2细胞后存活率均大于80％，表明本发明的阳离子脂质体没有明显的细胞毒性，与市售的脂质体Lipofectamine 2000相比安全性更好。

Claims (14)

1.尾链不饱和阳离子脂质衍生物，其化学结构可由通式(I)或(II)表示：
Figure FDA0002280745140000011
其中，
n＝1或2；
R1＝含1～3个不饱和键的C15～23直链烃基，或
Figure FDA0002280745140000012
R2＝氢、取代或未取代的C1-4烷基，所述的取代基选自苯基、苄基、芳香杂环、羟基、酰基、硫醇基。
2.根据权利要求1所述的尾链不饱和阳离子脂质衍生物，其特征在于：
所述的R1选自
Figure FDA0002280745140000013
中的任意一种，或
Figure FDA0002280745140000014
R2选自
Figure FDA0002280745140000015
Figure FDA0002280745140000016
中的任意一种。
3.权利要求1或2中通式I所示阳离子脂质衍生物的合成方法，其合成路线如下：
Figure FDA0002280745140000021
4.权利要求1或2中通式II所示阳离子脂质衍生物的合成方法，其合成路线如下：
Figure FDA0002280745140000022
5.权利要求1或2所述的尾链不饱和阳离子脂质衍生物在制备阳离子脂质体中的应用。
6.权利要求1或2所述的尾链不饱和阳离子脂质衍生物在制备质粒药物脂质体中的应用。
7.一种空白阳离子脂质体，其特征在于含有权利要求1所述的不饱和阳离子脂质衍生物和常用脂质。
8.根据权利要求7所述的空白离子脂质体，其特征在于所述的空白阳离子脂质体具有20～300nm的平均粒径，+10～+50mV的表面电位。
9.根据权利要求7所述的空白离子脂质体，其特征在于所述的常用脂质选自二油酰基磷脂酰乙醇胺，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺，二硬脂酰基磷脂酰胆碱，1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂，二油酰基卵磷脂，二芥酰基卵磷脂，二棕榈酰基卵磷脂或胆固醇。
10.权利要求7～9中任一项所述的空白离子脂质体在制备DNA药物中的应用；优选在制备质粒药物脂质体中的应用。
11.一种质粒药物脂质体，其特征在于含有质粒DNA和权利要求7所述的的空白阳离子脂质体。
12.根据权利要求11所述的质粒药物脂质体，其特征在于所述的质粒药物脂质体具有50～600nm的平均粒径，0～+40mV的表面电位。
13.根据权利要求11所述的质粒药物脂质体，其特征在于所述的质粒为不同分子量和不同形状的DNA，分子量大小为1000-10000bp，包括线性DNA或环状DNA。
14.根据权利要求11所述的质粒药物脂质体，其特征在于质粒药物脂质体的阳离子脂质衍生物和DNA的氮磷比为1:1～20:1，优选2:1～10:1。
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