JP6997862B2 - 生分解性化合物、脂質粒子、脂質粒子を含む組成物、およびキット - Google Patents
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Description
Q-CHR2 (1)
(式中、
Qは、3級窒素を2つ以上含み、酸素を含まない含窒素脂肪族基であり、
Rは、それぞれ独立にC12~C24の脂肪族基であり、少なくとも一つのRは、その主鎖中または側鎖中に、-C(=O)-O-、-O-C(=O)-、-O-C(=O)-O-、-S-C(=O)-、-C(=O)-S-、-C(=O)-NH-、および-NH-C(=O)-からなる群から選択される連結基LRを含む)
で表されることを特徴とするものである。
本実施形態において、~を用いて数値範囲を示した場合、特に限定されない限り、これらは両方の端点を含み、単位は共通である。例えば、10~25モル%は、10モル%以上25モル%以下を意味する。
また、3級窒素とは、3つの炭素が結合している窒素を意味する。したがって、3級窒素は電子供与性を有する3級アミン構造を構成する。
実施形態による化合物は、リポソームを構成する脂質として適切な化合物である。そして、その疎水部に生分解性基を有しており、生分解性脂質化合物として機能するものである。そして、その頭部にはカチオン性基を含んでおらず、生体に適用した場合には細胞内でのタンパク質の結合が抑制され、毒性が低いという特徴を有している。また、リポソームがこの脂質化合物によって構成されると、リポソームの表面が非カチオン性となるため、細胞への障害性が低くなり、核酸等の活性剤の導入率が高くなる。
Q-CHR2 (1)
(式中、
Qは、3級窒素を2つ以上含み、酸素を含まない含窒素脂肪族基であり、
Rは、それぞれ独立にC12~C24の脂肪族基であり、少なくとも一つのRは、その主鎖中または側鎖中に、-C(=O)-O-、-O-C(=O)-、-O-C(=O)-O-、-S-C(=O)-、-C(=O)-S-、-C(=O)-NH-、および-NH-C(=O)-からなる群から選択される連結基LRを含む)
実施形態の効果を損なわない範囲で、非置換アミノや、4級アンモニウムなどを構成する窒素をさらに含んでいてもよいが、その3級窒素以外の窒素は含まないことが好ましい。また、頭部Qは酸素を含まない。従って、頭部Qには、オキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、アルコキシ、カルボキシラトなどの構造が含まれない。また、頭部Qはイオン性基を含むこともできるが、極性基を含まない中性基であることが好ましい。
RQ1 2N-(CRQ2 2)q1-NRQ1-(CRQ2 2)q2-* (1-Q)
(式中、
RQ1は、それぞれ独立に、アルキルであり、
RQ2は、それぞれ独立に、水素またはアルキルであり、
RQ1およびRQ2のうちのいずれか二つが結合して含窒素脂環を形成してもよく、q1は、1~4の数であり、
q2は、0~4の数であり、
*は、-CHR2への結合位置を表す)
ここで、アルキルはC1~C3アルキルであることが好ましい。
-LR1-C(=O)-O-LR2 (1-R)
(式中、
LR1はアルキレンであり、
LR2はアルケニルである)
-(CH2)r1- (1-R1)
-CH2-CH=CH-(CH2)r2-H (1-R2)(式中、
r1は、1~10の数であり、
r2は、1~10の数である)
実施形態に寄れば脂質粒子が提供される。この脂質粒子の代表例はリポソームであるが、それに限定されず、核酸等と複合したリポプレックスなども包含される。またリポソームは、一枚膜リポソーム、多重層膜リポソームのいずれであってもよい。
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、
1,2-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DSPE)、
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン(DPPC)、
1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン(POPC)、
1,2-ジ-O-オクタデシル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTMA)、1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウムプロパン(DODAP)、
1,2-ジミリストイル-3-ジメチルアンモニウムプロパン(14:0 DAP)、
1,2-ジパルミトイル-3-ジメチルアンモニウムプロパン(16:0 DAP)、
1,2-ジステアロイル-3-ジメチルアンモニウムプロパン(18:0 DAP)、
N-(4-カルボキシベンジル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(オレオイロキシ)プロパン(DOBAQ)、
1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTAP)、
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホクロリン(DOPC)、
1,2-ジリノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホクロリン(DLPC)、
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン(DOPS)、および
コレステロール
などを好ましいものとして挙げることができる。また、これらのうちDOPE、DOTAP、またはコレステロールがより好ましく、DOPEとコレステロールの組み合わせ、DOTAPとコレステロールの組み合わせ、DOPEとDOTAPとコレステロールの組み合わせが特に好ましい。これらは、リポソーム等の膜を形成する機能に加えて、膜の融合効果も発揮することができる。
その結果、脂質粒子の標的組織への送達を改善できる場合もある。
P-[X-W-Y-W’-Z]2 (2)
(式中、
Pは、1つ以上のエーテル結合を主鎖に含むアルキレンオキシであり、
Xは、それぞれ独立に、三級アミン構造を含む2価連結基であり、
Wは、それぞれ独立にC1~C6アルキレンであり、
Yは、それぞれ独立に、単結合、エーテル結合、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、カルバメート結合、および尿素結合からなる群から選ばれる2価連結基であり、
W’は、それぞれ独立に単結合またはC1~C6アルキレンであり、Zは、それぞれ独立に、脂溶性ビタミン残基、ステロール残基、またはC12~C22脂肪族炭化水素基である)
で表され、
構造中に、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、ジチオカルボン酸結合、アミド結合、カルバメート結合、カルボキシジオキシ結合、および尿素結合からなる群から選ばれる生分解性基を少なくとも一つ含む化合物をさらに含むことが好ましい。
Pが含む酸素の数は特に限定されないが、好ましくは1~2個の酸素を含む。また、Pが含む炭素の数も特に限定されないが、Pに含まれる炭化水素鎖は炭素数が1~3であることが好ましく、Pに含まれる炭素の総数が3~8個であることが好ましい。好ましいPとして、以下のものが挙げられる。
-(CH2)2-O-(CH2)2-
-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-
-(CH2)2-O-O-(CH2)2-
-(CH2)3-O-(CH2)2-O-(CH2)3-
-(CH2)2-O-CH2-O-(CH2)2-
このような構造を有することによって。立体構造の自由度が高くなる。この化合物をリポソームの構成に用いた場合、エーテル結合に含まれる酸素が、組み合わされる核酸等と水素結合を形成するため、核酸等の内包量が多くなる。
式(1)および(2)で表される脂質化合物を合計25~75モル%、
膜を形成する脂質を25~75モル%、
凝集を低減できる脂質を、1~10モル%
で配合されるのが一般的であり、好ましくは
式(1)および(2)で表される脂質化合物を合計30~60モル%、
膜を形成する脂質を30~65モル%、
凝集を低減できる脂質を、1~10モル%、例えば2.5モル%
である。ここで、式(1)の化合物と、膜を形成する脂質とのバランスが重要であり、一方だけが存在しても活性剤の導入率が十分高くならない。このため、式(1)または(2)の化合物と、膜を形成する脂質との配合比は、モル数基準で1:0.5~1:3であることが好ましく、1:0.75~1:2.1であることがより好ましい。
実施形態による脂質粒子は、従来知られている任意の方法で製造することができる。脂質粒子やリポソームを製造する方法としては、バンガム法、有機溶媒抽出法、界面活性剤除去法、凍結融解法などが知られており、それらを採用することもできる。また、例えば、式(1)で表される化合物、さらには膜を形成する脂質と、凝集を低減できる脂質とを、アルコールなどの有機溶媒に導入し、水性緩衝液を添加することで自然発生的に脂質粒子を形成させることもできる。この水性緩衝液に活性剤を組み合わせておくことで、脂質粒子に活性剤を導入することが可能である。
本実施形態による脂質粒子は、活性剤を細胞へ送達するために使用することができる。特に核酸等の活性剤の細胞への送達は、遺伝子工学、組み換えタンパク質の生産、及び遺伝子治療や細胞診断として知られている医療技術など、あらゆる分野で用いられる。一つの実施形態では、実施形態による脂質粒子と、担体とを含むことを特徴とする、活性剤を細胞へ送達するための組成物が提供される。他の実施形態では、活性剤を細胞へ送達するための、実施形態による脂質粒子が提供される。他の実施形態では、活性剤を細胞へ送達するための方法であって、該活性剤を含む実施形態による脂質粒子を細胞に接触させる(例えば、前記脂質粒子を被験体に投与する)ことを含む方法が提供される。他の実施形態では、活性剤を細胞へ送達するための、請求項9~22のいずれか1項に記載の脂質粒子の使用が提供される。一つの実施形態では、前記脂質粒子は、式(1)の化合物と式(2)の化合物の両方を含むものとされ、好ましくは、式(1)の化合物の含有量に対する式(2)の化合物の含有量のモル比は1未満とされる。一つの実施形態では、前記細胞は腫瘍細胞とされる。前記被験体は、好ましくはそのような処置を必要とする動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトとされる。これらの用途につき、以下に具体的に説明する。
本実施形態による脂質粒子は、組成物として用いることができる。例えば、本実施形態の脂質粒子と担体とを含む組成物が提供される。このような組成物は医薬用途にも適用できるものである。
該キットには、核酸導入の際に使用する試薬を組み合わせることができる。
実施形態による脂質粒子を医薬用途に用いた場合、組成物は、ヒトまたは動物の各種疾病の治療または診断に用いることができる。例えば、脂質粒子と組み合わせる活性剤として治療剤を適用することで治療剤を目的細胞に送達することで治療が可能となる。
前記した製造プロセスに従って、化合物(1-01)の合成を行った。具体的には、下記の通りの操作を行った。
アルゴン雰囲気下、500mLフラスコにマグネシウム(17.38g、714.96mol、4.4eq.)とジエチルエーテル(165mL)とヨウ素(7mg)を仕込んだ。9-ブロモノン-1-エン(100.00g、487.47mol、3eq.)を室温下で数滴滴下した後、還流させながら2 時間かけて滴下した。室温で一晩熟成させ、滴下漏斗にグリニャール試薬をジエチルエーテル(40mL)で洗い込みながら移した。ギ酸エチル(12.04g、162.49mol、1eq.)とジエチルエーテル(165mL)を仕込んだ1000mL4つ口フラスコに、0℃以下で1.5時間かけてグリニャール試薬を滴下した。
アルゴン雰囲気下で、1000mLフラスコに中間体(1-01-1)(41.1g、146.53mmol、1eq.)をジクロロメタン(330mL)に溶解させて投入し、トリエチルアミン(59.31g、586.12mmol、4eq.)、4-ジメチルアミノピリジン(1.79g、14.65mmol、0.1eq.)を加えた。-5℃でメタンスルホニルクロリド(33.57g、293.06mmol、2eq.)を滴下した。室温で1時間攪拌後、氷水(17.6mL)でクエンチした。続いて、1N塩酸(30mL)と水(300mL)、飽和食塩水(300mL)で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過濃縮して、橙色オイルとして中間体(1-01-2)を49.6g(収率94%)得た。
アルゴン雰囲気下で、1000mLフラスコにDMF(300mL)とシアン化ナトリウム(13.56g、276.65mmol、2eq.)を仕込んだ。DMF(200mL)に溶解した中間体(1-01-2)(49.6g、138.32mmol、1eq.)を添加し、55℃に加温して一晩反応させた。反応液を室温に戻して、水(500mL)で希釈し、酢酸エチル(800mL)で3回で抽出を繰り返した。抽出した有機層を水(500mL)、飽和食塩水(500mL)で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過濃縮して得た粗体(84.3g)をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル1012g 展開:ヘキサン→5%酢酸エチル/95%ヘキサン)で精製し薄黄色オイルとして中間耐3を28.1g(収率70%)を得た。
アルゴン雰囲気下、2000mLフラスコに中間体(1-01-3)(28.1g、97.06mmol、1eq.)とヘキサン(280mL)を仕込んだ。-70℃で1M水素化ジイソブチルアルミニウム(DIBAL-H)のn-ヘキサン溶液(194.13mL、194.13mmol、2eq.)を滴下し、室温下で30分攪拌させた。0℃に氷冷し、メタノール(14mL)でクエンチした。この反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液(1200mL)を加えて20分攪拌し、10%硫酸(450mL)を加えて分液した。続いてジエチルエーテル(500mL)で2回で抽出した。抽出した有機層を、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(500mL)、飽和食塩水(500mL)で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過濃縮して黄色オイルとして中間体(1-01-4)を25.3g(収率89%)を得た。
1000mLフラスコに中間体(1-01-4)(25.3g、86.5mmol、1eq.)とメタノール(253mL)を仕込んだ。0℃で水素化ホウ素ナトリウム(1.16g、30.27mmol、0.35eq.)を少しずつ加え、室温下で終夜攪拌した。反応液に酢酸(7mL)をpH4になるまで加えた。水(160mL)を加え、ジクロロメタン(400mL)で3回抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過濃縮して得た粗体(30.3g)をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル304g 展開:5%酢酸エチル/95%ヘキサン)で精製し薄黄色オイルとして中間体(1-01-5)を22.13g(収率87%)得た。
アルゴン雰囲気下、1000mLフラスコに中間体(1-01-5)(22.13g、75.14mmol、1eq.)をジクロロメタン(220mL)で溶かし、テトラブロモメタン(29.90g、90.17mmol、1.2eq.)を加えた。0℃でジクロロメタン(63mL)に溶かしたトリフェニルホスフィン(29.56g、112.71mmol、1.5eq.)を滴下した。室温下で1 時間攪拌後、反応液を濃縮して得た粗体(21.3g)をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル200g 展開:ヘキサン)で精製し無色透明オイルとして中間体(1-01-6)を14.5g(収率54%)を得た。
1000mLフラスコに6(5g、13.99mmol、1eq.)を入れ、クロロメタン(230mL)とアセトニトリル(230mL)に溶かし、塩化ルテニウム(III) (145mg、0.69mmol、Ru=40%)を添加した。10℃以下で水(115mL)に溶かした過ヨウ素酸ナトリウム(29.92g、139.89mmol、10eq.)を滴下し、室温下で終夜攪拌した。反応終了後、水(230mL)を加え、分液した。水層をジクロロメタン(100mL×2 回)で抽出して合わせた有機層に飽和食塩水(230mL)を加え、色が変わるまで3%硫化ナトリウムを滴下した。1M塩酸を酸性になるまで加え、分液した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過濃縮して得た粗体(14.7g)をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル300g 展開:クロロホルム→2% メタノール/98%クロロホルム)で精製し薄黄色オイルとして中間体(1-01-7)を2.73g(収率49%)を得た。
100mLフラスコに7(2.73g、6.94mmol、1eq.)をジクロロメタン(45mL)に溶かし、シス-2-ノネン-1-オル(2.41g、16.93mmol、2.44eq.)、4-ジメチルアミノピリジン(85mg、0.69mmol、0.1eq.)、N、N-ジイソプロピルエチルアミン(4.39g、34.01mmol、4.9eq.) を仕込んだ。その後、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチル-カルボジイミド塩酸塩(3.25g、16.93mmol、2.44eq.)を加え、室温下で終夜攪拌した。反応終了後、ジクロロメタン(45mL)で希釈し、水(45mL)、1M 塩酸(90mL)、重炭酸ナトリウム飽和水溶液(90mL)、飽和食塩水(90mL)で順次洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過濃縮して得た粗体(3.7g)をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル37g 展開:ヘキサン→5%酢酸エチル/95%ヘキサン)で精製し、中間体(1-01-8)を微黄色オイルとして1.62g(収率36%)得た。
50mL のオートクレーブに8 (1.62g、2.52mmol、1eq.)をTHF(30mL)で溶かし、N,N,N’トリメチルエチレンジアミン(5.16g、50.48mmol、20eq.)と炭酸カリウム(1.26g、9.09mmol、3.6eq.)を仕込んだ。55℃に加温して6日間反応させた。反応終了後、反応液を室温に戻して、ジクロロメタン(60mL)で希釈し、水(30mL)を加えて分液した。水層をジクロロメタン(20mL)で3回抽出して、合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過濃縮して得た粗体(2.3g)をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル25g 展開:クロロホルム→5%メタノール/95%クロロホルム)で精製し微黄色オイルとして、目的の化合物(1-01)1.21g(収率72%)を得た。
前記した製造プロセスに従って、化合物(2-01)の合成を行った。具体的には、下記の通りの操作を行った。
ベクターDNA溶液とDNA凝縮ペプチドを用いて、ベクターDNA-DNA凝縮ペプチドからなるコア複合体を調製した。ベクターDNAとして、サイトメガロウイルス初期プロモーター/エンハンサー、Nluc遺伝子、転写終結シグナルを組込んだプラスミドを使用した。DNA凝縮ペプチドとして、mHP-1(RQRQR-YY-RQRQR-GG-RRRRRR:配列番号1)とmHP-2(RRRRRR-YY-RQRQR-GG-RRRRRR:配列番号2)を1:3の割合で混合した混合物を使用した。
得られたリポソームについて、内包DNA量の測定を行った。測定は、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)でおこなった。0.1% Triton-X100(商品名)を含むTris-EDTA緩衝液95μLに、リポソーム溶液5.0μLを加えて穏やかに縣濁した。室温に30分間静置した後、溶液にTris-EDTA緩衝液で200倍希釈したPicoGreen溶液100μLを加えてよく混合した。室温に5分間静置した後、溶液の蛍光強度(励起波長:485nm、蛍光波長:530nm)をマイクロタイタープレートリーダー:Mithras LB-940(商品名、ベルトール社製)で測定した。
DNA濃度は、既知濃度のλDNAで作成した検量線を用いて定量した。得られた数値から、リポソーム内包DNA量を、溶液1mLあたりのDNA量(μg DNA/mL)として算出した。結果は表2に示した通りである。
リポソームの表面電荷(ゼータ電位)を、ゼータサイザー(ゼータサイザーナノZS(商品名)、Malvern Panalytical社製)で測定した。ゼータ電位測定用セル(DTS-1070(商品名)、Malvern Panalytical社製)にリポソーム溶液30μlを分注し、蒸留水870μlを加えて混合した後、セルをゼータサイザーにセットしてゼータ電位を測定した。得られた結果は表2に示すとおりであった。
リポソームによる細胞へのベクターDNAの導入は、ベクターDNA上のNluc遺伝子の発現により定量化した。NLuc遺伝子の発現は、その発光量をマイクロタイタープレートリーダー: infinite F200(製品名、Tecan社製)で測定することで評価した。細胞は、ヒトT細胞性白血病細胞株Jurkat、ヒト乳がん由来の細胞株MCF-7、ヒト肝臓がん由来の細胞株Huh-7(American Type Culture Collectionより購入)を使用した。96穴培養プレートに、1×106細胞/mLの細胞縣濁液を100μL播種した後、表1に示されるリポソーム溶液を1μL添加した。添加後、細胞を37℃、5%CO2雰囲気のインキュベータ内で48時間培養した後、NLucの酵素活性を測定した。NLucの酵素活性は、NanoGlo Luciferase Assay System(製品名、Promega社)を用いて、キット添付のマニュアルに従い、ルミノメーターで測定した。得られた結果は図1(Jurkat)、図2(MCF-7)、図3(Huh-7)に示すとおりであった。
前記した製造プロセスに従って、化合物(1-02)の合成を行った。具体的には、下記の通りの操作を行った。
アルゴン雰囲気下、500mLフラスコにマグネシウム(17.38g,714.96mmol,4.40eq.)とジエチルエーテル(165mL)とヨウ素(7mg)を仕込んだ。9-ブロモノン-1-エン(100.00g,487.47mol,3.00eq.)を室温下で数滴滴下した後、還流させながら2 時間かけて滴下した。室温で一晩熟成させ、滴下漏斗にグリニャール試薬をジエチルエーテル(40mL)で洗い込みながら移した。ギ酸エチル(12.04g,162.49mmol,1.00eq.)とジエチルエーテル(165mL)を仕込んだ1000mL4つ口フラスコに、0℃以下で1.5 時間かけてグリニャ-ル試薬を滴下した。1時間室温で反応させた後、アセトン(100mL)を加え、水(200mL)と10%硫酸(267mL)を順次添加して分液した。水層をジエチルエーテル(300mL)で抽出し、Na2SO4で有機層を乾燥した。濾過濃縮して得た粗体(72.1g)をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル721g,展開:ヘキサン→3%酢酸エチル/97%ヘキサン)で精製し、白色固体として中間体(1-02-1)を41.1g(収率98%)得た。
アルゴン雰囲気下で、1000mL フラスコに中間体(1-02-1)(41.1g,146.53mmol,1.00eq.)をジクロロメタン(330mL)で溶解させて投入し、トリチルアミン(59.31g,586.12mmol、4.00eq.)、4-ジメチルアミノピリジン(1.79g,14.65mmol,0.10eq.)を加えた。-5℃でメタンスルホニルクロリド(33.57g,293.06mmol,2.00eq.)を滴下した。室温で1時間攪拌後、氷水(17.6mL)でクエンチした。続いて、1N塩酸(30mL)と水(300mL)、飽和食塩水(300mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥した。濾過濃縮して、橙色オイルとして中間体(1-02-2)を49.6g(収率94%)得た。
アルゴン雰囲気下で、1000mL フラスコにDMF(300mL)とシアン化ナトリウム(13.56g,276.65mmol,2.00eq.)を仕込んだ。DMF(200mL)に溶解した中間体(1-02-2)49.6g,138.32mmol,1.00eq.)を添加し、55℃に加温して一晩反応させた。反応液を室温に戻して、水(500mL)で希釈し、酢酸エチル(800mL×3 回)で抽出した。抽出した有機層を水(500mL)、飽和食塩水(500mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥した。濾過濃縮して得た粗体(84.3g)をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル1012g、展開:ヘキサン→5%酢酸エチル/95%ヘキサン)で精製し薄黄色オイルとして中間体(1-02-3)を28.1g(収率70%)を得た。
アルゴン雰囲気下、2000mL フラスコに中間体(1-02-3)(28.1g,97.06mmol,1.00eq.)とヘキサン(280mL)を仕込んだ。-70℃で1M DIBAL-n-ヘキサン(194.13mL,194.13mmol,2.00eq.)を滴下し、室温下で30分攪拌させた。0℃に氷冷し、メタノール(14mL)でクエンチした。この反応液に飽和NH4Cl水溶液(1200mL)を加えて20 分攪拌し、10%H2SO4(450mL)を加えて分液した。続いてジエチルエーテル(500mL×2回)で抽出した。抽出した有機層を、飽和NaHCO3水溶液(500mL)、飽和食塩水(500mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥した。濾過濃縮して黄色オイルとして中間体(1-02-4)を25.3g(収率89%)を得た。
1000mLフラスコに中間体(1-02-4)(25.3g,86.5mmol,1.00eq.)と、メタノール(253mL)を仕込んだ。0℃で水素化ホウ素ナトリウム(1.16g,30.27mmol,0.35eq.)を少しずつ加え、室温下で終夜攪拌した。反応液に酢酸(7mL)をpH4になるまで加えた。水(160mL)を加え、ジクロロメタン(400mL×3回)で抽出し、有機層をNa2SO4で乾燥した。濾過濃縮して得た粗体(30.3g)をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル304g、展開:5%酢酸エチル/95%ヘキサン)で精製し薄黄色オイルとして中間体(1-02-5)を22.13g(収率87%)得た。
アルゴン雰囲気下、1000mL フラスコに中間体(1-02-5)(22.13g,75.14mmol,1.00eq.)をジクロロメタン(220mL)で溶かし、テトラブロモメタン(29.90g,90.17mmol,1.20eq.)を加えた。0℃でジクロロメタン(63mL)に溶かしたトリフェニルホスフィン(29.56g,112.71mmol,1.50eq.)を滴下した。室温下で1 時間攪拌後、反応液を濃縮して得た粗体(21.3g)をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル200g、展開:ヘキサン)で精製し無色透明オイルとして中間体(1-02-6)を14.5g(収率54%)を得た。
アルゴン雰囲気下で、200mL フラスコにエタノール (90mL)、20%エトキシナトリウム(溶媒:エタノール)(50.55g,148.57mmol,5.90eq.)を仕込み、65℃に加熱した。次いで、マロン酸ジエチル(24.20g, 151.09mmol,6.00eq.)、中間体(1-02-6)(9g,25.18mmol,1.00eq.)を加え、一晩加熱環流した。反応終了後、10℃以下で1N塩酸(90mL)を加え、クエンチした。反応液を酢酸エチル(200mL×3回)で抽出し、飽和NaHCO3水溶液(90mL)、飽和食塩水(90mL)で順次洗浄し、有機層をNa2SO4で乾燥した。濾過濃縮し、橙色オイルとして中間体(1-02-7)を7.31g(収率66%)を得た。
200mL フラスコに中間体(1-02-7)(7.31g,16.74mmol,1.00eq.)、ジメチルスルホキシド(70mL)、塩化ナトリウム(9.78g,167.40mmol)を仕込み、一晩加熱環流した。反応終了後、反応液を濃縮して得た粗体(21.3g)をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル200g 展開:ヘキサン→2%酢酸エチル/98%ヘキサン)で精製し中間体(1-02-8)を淡黄色オイルとして4.7g(収率51%)得た。
アルゴン雰囲気下、200mL4つ口フラスコにリチュムアルミニウムハイドライド (734mg,19.34mmol,1.5eq.)とTHF(40mL)を仕込んだ。0℃でTHF(40mL)に溶解させた中間体(1-02-8)(4.7g,34.54mmol,1.00eq.)を滴下し、室温で一晩反応させた。0℃に氷冷し、水(3.3mL)、15%水酸化ナトリウム(0.8mL)でクエンチした。この反応液に酢酸エチル(50mL)を加えてセライト濾過し、酢酸エチル(100mL)でセライトを洗浄した。濾液を濃縮して得た粗体(4.9g)をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル50g、展開:5%酢酸エチル95%ヘキサン)で精製し中間体(1-02-9)を無色オイルとして3.86g(収率93%)得た。
アルゴン雰囲気下で、100mL フラスコに中間体(1-02-9)(3.86g,11.97mmol,1.00eq.)をジクロロメタン(30mL)で溶解させて投入し、トリエチルアミン(4.84g,47.87mmol,4.00eq.)、4-ジメチルアミノピリジン(146mg,1.20mmol,0.10eq.)を加えた。-5℃でメタンスルホニルクロリド(2.74g,23.93mmol,2.00eq.)を滴下した。室温で1時間攪拌後、氷水(17.6mL)でクエンチした。続いて、1N塩酸(10mL)と水(30mL)、飽和食塩水(30mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥した。濾過濃縮して中間体(1-02-10)を褐色オイルとして、4.79g(収率99%)得た。
アルゴン雰囲気下で、100mLフラスコにDMF(28mL)とシアン化カリウム(1.17g,23.94mmol,2.00eq.)を仕込んだ。DMF(20mL)に溶解した中間体(1-02-10)(4.79g,11.97mmol,1.00eq.)を添加し、55℃に加温して一晩反応させた。反応液を室温に戻して、水(50mL)で希釈し、酢酸エチル(100mL×3回)で抽出した。抽出した有機層を水(50mL)、飽和食塩水(50mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥した。濾過濃縮して得た粗体(11.4g)をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル100g、展開:ヘキサン→5%酢酸エチル/95%ヘキサン)で精製し中間体(1-02-11)を無色オイルとして、3.6g(収率90%)得た。
アルゴン雰囲気下で、100mLフラスコに中間体(1-02-11)(3.6g, 10.86mmol,1.00eq.)とヘキサン(36mL)を仕込んだ。-70℃で1M DIBAL-n-ヘキサン(21.71mL,21.71mmol,2.00eq.) を滴下し、室温下で30 分攪拌させた。0℃に氷冷し、メタノール(1.6mL)でクエンチした。この反応液に飽和NH4Cl水溶液(150mL)を加え20分攪拌し、10% 硫酸(50mL)を加えて分液した。続いてジエチルエーテル(50mL×2回)で抽出した。抽出した有機層を飽和NaHCO3水(50mL)、飽和食塩水(50mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥した。濾過濃縮して中間体(1-02-12)を黄色オイルとして、3.2g(収率88%)得た。
100mL フラスコに中間体(1-02-12)(3.2g, 9.56mmol, 1.00eq.)とメタノール(32mL)を仕込んだ。0℃で水素化ホウ素ナトリウム(127mg, 3.35mmol,0.35eq.)を少しずつ加え、室温下で一晩攪拌した。反応液に酢酸(1mL)をpH4になるまで加えた。水(30mL)を加え、ジクロロメタン (30mL×3回)で抽出し、有機層をNa2SO4で乾燥した。濾過濃縮して得た粗体(3.17g)をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル32g、展開:5%酢酸エチル/95%ヘキサン)で精製し中間体(1-02-13)を淡黄色オイルとして、1.12g(収率35%)得た。
アルゴン雰囲気下で、30mL フラスコに中間体(1-02-13)(1g, 2.97mmol,1.00eq.)をジクロロメタン(10mL)で溶かし、テトラブロモメタン(1.18g,3.57mmol,1.20eq.)を加えた。0℃でジクロロメタン(5mL)に溶かしたトリフェニルホスフィン(1.17g,4.46mmol,1.50eq.)を滴下した。室温下で1時間攪拌後、反応液を濾過濃縮して得た粗体(7g)をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル70g、展開:ヘキサン)で精製し中間体(1-02-14)を無色透明オイルとして、1.12g(収率94%)得た。
200mLフラスコに中間体(1-02-14)(1.12g,2.80mmol,1.00eq.)を入れ、ジクロロメタン(51mL)とアセトニトリル(51mL)に溶かし、塩化ルテニウム(III)(29mg,0.14mmol,Ru=40%)を添加した。10℃以下で水(51mL)に溶かした過ヨウ素酸ナトリウム(5.99g,28.0mmol,10.00eq.)を滴下し、10℃以下で一晩攪拌した。反応終了後、水51mL)を加え、分液した。有機層に飽和食塩水(50mL)を加え、色が変わるまで3%Na2S水溶液を滴下した。1N塩酸を酸性になるまで加え、分液した。有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過濃縮して得た粗体(5.24g)をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル50g、展開:クロロホルム→5%メタノール/95%クロロホルム)で精製し中間体(1-02-15)を微黄色オイルとして、1.05g(収率86%)得た。
100mLフラスコに中間体(1-02-15)(1.00g,2.30mmol,1.00eq.)をジクロロメタン(30mL)に溶かし、シス-2-ノネン-1-オル(797mg,5.60mmol,2.44eq.)、4-ジメチルアミノピリジン(28mg,0.23mmol,0.10eq.)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(1.45g,11.25mmol,4.90eq.) を仕込んだ。その後、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチル-カルボジイミド塩酸塩(1.07g,5.603mmol, 2.44eq.) を加え、室温下で一晩攪拌した。反応終了後、ジクロロメタン(30mL)で希釈し、水(30mL)、1N塩酸(30mL)、飽和NaHCO3水(30mL)、飽和食塩水(30mL)で順次洗浄し、有機層をNa2SO4 で乾燥した。濾過濃縮して得た粗体(1.92g)をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル20g、展開:ヘキサン→2%酢酸エチル/98%ヘキサン)で精製し中間体(1-02-16)を微黄色オイルとして、77mg(収率5%)得た。
50mLのオートクレーブに中間体(1-02-16)(77mg,0.11mmol,1.00eq.)をTHF(3mL)で溶かし、1-メチルピペラジン(225mg,2.25mmol,20.00eq.)と炭酸カリウム(56mg,0.41mmol,3.6eq.)を仕込んだ。55℃に加温して6日間反応させた。反応終了後、反応液を室温に戻して、ジクロロメタン(6mL)で希釈し、水(5mL)を加えて分液した。水層をジクロロメタン(6mL×3回)で抽出して合わせた有機層をNa2SO4で乾燥した。濾過濃縮して得た粗体(108mg)をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル1g、展開:クロロホルム→10%メタノール/90%クロロホルム)で精製し、濃黄色オイルとして化合物(1-02)を54mg(収率68%)得た。
ベクターDNA溶液とDNA凝縮ペプチドを用いて、ベクターDNA-DNA凝縮ペプチドからなるコア複合体を調製した。ベクターDNAとして、サイトメガロウイルス初期プロモーター/エンハンサー、Nluc遺伝子、転写終結シグナルを組込んだプラスミドを使用した。DNA凝縮ペプチドとして、mHP-1(RQRQR-YY-RQRQR-GG-RRRRRR:配列番号1)とmHP-2(RRRRRR-YY-RQRQR-GG-RRRRRR:配列番号2)を4:1の割合で混合した混合物を使用した。
得られたリポソームについて、内包DNA量の測定を行った。測定は、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)でおこなった。0.1% Triton-X100(商品名)とヘパリンナトリウム塩(シグマアルドリッチジャパン合同会社)を含む Tris-EDTA緩衝液99.5μLに、リポソーム溶液0.5μLを加えて穏やかに縣濁した。室温に30分間静置した後、溶液にTris-EDTA緩衝液で200倍希釈したPicoGreen溶液100μLを加えてよく混合した。室温に5分間静置した後、溶液の蛍光強度(励起波長:485nm、蛍光波長:530nm)をマイクロタイタープレートリーダー:Mithras LB-940(商品名、ベルトール社製)で測定した。
式(1-02)の化合物を含むリポソームは、式(1-01)の化合物を含むリポソームと、同等の内包DNA量を示すことが明らかとなった。また、式(2-01)の化合物を組み合わせると、内包DNA量が多くなることも確認された。
リポソームの表面電荷(ゼータ電位)を、ゼータサイザー(ゼータサイザーナノZS(商品名)、Malvern Panalytical社製)で測定した。ゼータ電位測定用セル(DTS-1070(商品名)、Malvern Panalytical社製)にリポソーム溶液10μlを分注し、蒸留水890μlを加えて混合した後、セルをゼータサイザーにセットしてゼータ電位を測定した。得られた結果は表4に示すとおりであった。
膜を形成する脂質として、中性脂質であるDOPEを使用した場合(参照例2-2および実施例2-2)と、DOPEに対してカチオン性脂質であるDOTAPを使用した場合(参照例2-1および実施例2-1)とを比較すると、後者のほうがゼータ電位をよりプラス側にシフトさせることができることがわかった。
リポソームによる細胞へのベクターDNAの導入は、ベクターDNA上のNluc遺伝子の発現により定量化した。NLuc遺伝子の発現は、その発光量をマイクロタイタープレートリーダー:infinite F200(製品名、Tecan社製)で測定することで評価した。細胞は、ヒトT細胞性白血病細胞株Jurkat(American Type Culture Collectionより購入)、ヒト末梢血単核球細胞PBMC(ロンザジャパン株式会社より購入)を使用した。96穴培養プレートに、Jurkatは1×106細胞/mLの細胞縣濁液を100μL、PBMCは5×106細胞/mLの細胞縣濁液を100μL、播種した後、表1に示されるリポソーム溶液を、DNA量が0.8μg/ウェルになるように添加した。添加後、細胞を37℃、5%CO2雰囲気のインキュベータ内で48時間培養した後、NLucの酵素活性を測定した。NLucの酵素活性は、NanoGlo Luciferase Assay System(製品名、Promega社)を用いて、キット添付のマニュアルに従い、ルミノメーターで測定した。得られた結果は、図4(Jurkat)、図5(PBMC)に示すとおりであった。
式(1-02)の脂質化合物は、膜を形成する脂質化合物としてDOTAPを選択すると、Jurkat細胞において、式(1-01)よりも高いNluc遺伝子発現効率を示すことが確認できた。また、式(1-01)の脂質化合物は、膜を形成する脂質化合物として式(2-01)とDOPEを選択すると、PBMC細胞において、式(1-02)よりも高いNluc遺伝子発現効率を示すことが確認できた。
[RNA内包リポソームの調整]
メッセンジャーRNA(mRNA)は、レポーター遺伝子である緑色蛍光蛋白質GFPのmRNA(OZ Biosciences)を使用した。RNA内包リポソームは、GFP mRNA溶液を、表5に示された配合比の脂質溶液に加え、ピペッティングで縣濁した後、10mM HEPES(pH7.3)を静かに添加し、この溶液を遠心式限外ろ過で洗浄・濃縮して調整した。ここで、比較に用いる化合物として、式(R-01)で表される化合物を用いた。なお、比較例R-3は、比較例R-1と同処方による別調製物である。
リポソームに内包されたRNA量は、QuantiFluor RNA System キット(Promega)で測定した。測定は、キット添付のマニュアルに従った。RNA内包量の測定結果を表6に示した。表5の配合比の脂質溶液で調整したRNA内包リポソームにおいては、リポソームの内包RNA量に顕著な違いは見られなかった。
RNA内包リポソームの表面電荷(ゼータ電位)は、ゼータサイザー(ゼータサイザーナノZS、Malvern Panalytical社製)で測定した。リポソーム溶液をゼータ電位測定用セル(DTS-1070、Malvern Panalytical社製)に加えて、蒸留水で希釈・混合した後、セルをゼータサイザーの所定の位置にセットしてゼータ電位を測定した。表5で調整したRNA内包リポソームの内包RNA量と平均ゼータ電位は、表6に示すとおりであった。
リポソームによる細胞へのRNAの導入は、RNAがコードするGFP遺伝子の発現により定量化した。GFP遺伝子の発現は、その蛍光量をフローサイトメーター(FACSVerse, BD Biosciences社製)で測定することで評価した。細胞は、ヒトT細胞性白血病細胞株:Jurkat(American Type Culture Collectionより購入)を使用した。TexMACS培地(Gibco社製)で培養したJurkatを遠心で回収した後、0.65×107細胞となるように新鮮なTexMACSに縣濁した。48ウェル培養プレートに、1.0×106細胞/ウェルとなるように、細胞縣濁液とTexMACSを各150μLを加えた。その後、表5に記載したRNA内包リポソームで、GFP RNA量を0.5μg/ウェルとなるようにウェルに添加して、37℃、5%CO2雰囲気で培養した。ここで、比較に用いるRNA導入方法として、リポフェクタミン試薬(Lipofectamine 3000、Invitrogen社製)を用いたリポフェクションと、エレクトロポレーションとによるRNA導入方法をおこなった。リポフェクションによる導入は、試薬に添付されたマニュアルに従って行った。エレクトロポレーションによる導入は、Jurkatを遠心で回収し、OptiMEM(Gibco)を加えて洗浄後、再度遠心で細胞を回収した。回収した細胞をOptiMEMに1.0×107細胞/mLとなるように縣濁後、100μLの細胞縣濁液に0.5μgのGFP RNAを加えてキュベット電極に移し、エレクトロポレーションをおこなった。エレクトロポレーションは、CUY21 EDIT II(BEX)を使用し、以下の条件でおこなった。
Pp, 225V; Pp on, 2.5ms; Pp off, 50.0ms
<ドライビングパルス(Pd)条件>
Pd, 20V; Pd on, 50.0ms; Pd off, 50.0ms; 5サイクル; Capacitor、1416.3μF
実施例1-3、1-4および1-6に従って、NLucを発現するプラスミドを含むコア複合体内包リポソーム(実施例4-1、4-2および4-3)を作製した。該リポソームを構成する脂質溶液の組成と表面電荷の測定結果を、以下の表7に示す。
Claims (23)
- 下記式(1)
Q-CHR2 (1)
[式中、
Qは、下記式(1-Q):
RQ1 2N-(CRQ2 2)q1-NRQ1-(CRQ2 2)q2-* (1-Q)
(式中、
RQ1は、それぞれ独立に、アルキルであり、
RQ2は、それぞれ独立に、水素またはアルキルであり、RQ1およびRQ2のうちのいずれか二つが結合して含窒素脂環を形成してもよく、q1は、1~4の数であり、
q2は、0~4の数であり、
*は、-CHR2への結合位置を表す)
で表され、
Rは、それぞれ独立にC12~C24の脂肪族基であって、下記式(1-R):
-LR1-C(=O)-O-LR2 (1-R)
(式中、
LR1はアルキレンであり、
LR2はアルケニルである)
で表されるものである]
で表されることを特徴とする化合物。 - 前記LR1および前記LR2が、それぞれ下記式(1-R1)および(1-R2):
-(CH2)r1- (1-R1)
-CH2-CH=CH-(CH2)r2-H (1-R2)
(式中、
r1は、1~10の数であり、
r2は、1~10の数である)
で表される請求項1または2に記載の化合物。 - 前記r1が4~8の数である、請求項3に記載の化合物。
- 前記Rに含まれる、最も長い分子鎖が8原子以上である、請求項1~4のいずれか1項に記載の化合物。
- 請求項1~6のいずれか1項に記載された化合物を含む脂質粒子。
- 下記式(2):
P-[X-W-Y-W’-Z]2 (2)
(式中、
Pは、1つ以上のエーテル結合を主鎖に含むアルキレンオキシであり、
Xは、それぞれ独立に、三級アミン構造を含む2価連結基であり、
Wは、それぞれ独立にC1~C6アルキレンであり、
Yは、それぞれ独立に、単結合、エーテル結合、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、カルバメート結合、および尿素結合からなる群から選ばれる2価連結基であり、
W’は、それぞれ独立に単結合またはC1~C6アルキレンであり、Zは、それぞれ独立に、脂溶性ビタミン残基、ステロール残基、またはC12~C22脂肪族炭化水素基である)
で表され、
構造中に、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、ジチオカルボン酸結合、アミド結合、カルバメート結合、カルボキシジオキシ結合、および尿素結合からなる群から選ばれる生分解性基を少なくとも一つ含む化合物をさらに含む、請求項7に記載の脂質粒子。 - 前記Pが、3~8個の炭素および1~2個の酸素を含む、請求項8に記載の脂質粒子。
- 前記Xが、それぞれ独立に、メチルイミノ、1,2-ピロリジンジイル、および1,3-ピロリジンジイルからなる群から選ばれる、請求項8または9に記載の脂質粒子。
- 前記Zが、脂溶性ビタミン残基またはステロール残基である、請求項8~10のいずれか1項に記載の脂質粒子。
- 式(1)の化合物の含有量に対する式(2)の化合物の含有量のモル比が1未満である、請求項8~11に記載の脂質粒子。
- 膜を形成する脂質と、凝集を低減できる脂質とをさらに含む請求項7~12のいずれか1項に記載の脂質粒子。
- 前記の膜を形成する脂質が、
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、
1,2-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DSPE)、
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン(DPPC)、
1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン(POPC)、
1,2-ジ-O-オクタデシル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTMA)、1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウムプロパン(DODAP)、
1,2-ジミリストイル-3-ジメチルアンモニウムプロパン(14:0 DAP)、
1,2-ジパルミトイル-3-ジメチルアンモニウムプロパン(16:0 DAP)、
1,2-ジステアロイル-3-ジメチルアンモニウムプロパン(18:0 DAP)、
N-(4-カルボキシベンジル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(オレオイロキシ)プロパン(DOBAQ)、
1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTAP)、
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホクロリン(DOPC)、
1,2-ジリノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホクロリン(DLPC)、
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン(DOPS)、およびコレステロール、
からなる群から選択され、
前記凝集を低減できる脂質がポリエチレングリコール(PEG)修飾脂質である、請求項13に記載の脂質粒子。 - 活性剤をさらに含む、請求項7~14のいずれか1項に記載の脂質粒子。
- 前記活性剤が、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、siRNA、マイクロRNA、DNA、mRNA、アプタマー、およびリボザイムからなる群から選択された核酸である、請求項15に記載の脂質粒子。
- 前記活性剤が、少なくとも一種のDNAと、少なくとも一種のRNAとの組み合わせを含む、請求項15に記載の脂質粒子。
- 核酸と結合する化合物をさらに含む、請求項16または17に記載の脂質粒子。
- 前記核酸と結合する化合物が、塩基性タンパク質、または塩基性ペプチドである、請求項18に記載の脂質粒子。
- 前記核酸と結合する化合物が、プロタミンまたはヒストンである、請求項18または19に記載の脂質粒子。
- 細胞内での核酸の発現を調節する化合物をさらに含む、請求項18~20のいずれか1項に記載の脂質粒子。
- 活性剤を細胞へ送達するための、請求項7~21のいずれか1項に記載の脂質粒子。
- 前記細胞が腫瘍細胞である、請求項22に記載の脂質粒子。
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