KR101967411B1 - 활성제의 전달을 위한 생분해성 지질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 양이온성 지질의 지질 부분(예컨대, 소수성 사슬)의 중간 혹은 말단 부분에 위치된 하나 이상의 생분해성 기를 지니는 당해 양이온성 지질에 관한 것이다. 이들 양이온성 지질은 핵산 등과 같은 활성제를 전달하기 위하여 지질 입자 내로 편입될 수 있다. 본 발명은 또한 중성 지질, 응집을 저감시킬 수 있는 지질, 본 발명의 양이온성 지질, 및 임의선택적으로 스테롤을 포함하는 지질 입자에 관한 것이다. 상기 지질 입자는 핵산 등과 같은 치료제를 더 포함할 수 있다.

Description

활성제의 전달을 위한 생분해성 지질{BIODEGRADABLE LIPIDS FOR THE DELIVERY OF ACTIVE AGENTS}
우선권의 주장
본 출원은 미국 특허 출원 제61/351,146호(출원일: 2010년 6월 3일) 및 미국 특허 출원 제61/489,197호(출원일: 2011년 5월 23일)의 우선권을 주장하고, 이들 각각은 그들의 전문이 본 발명에 참조로서 편입된다.
기술분야
본 발명은 생분해성 지질, 그리고 핵산 등과 같은 활성제의 전달을 위한 그의 용도에 관한 것이다.
치료적 핵산에는, 예를 들어, 작은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 플라스미드, 면역 자극 핵산, 안티센스, 안타고미어(antagomir), 안티미어(antimir), 마이크로RNA 모방체, 수퍼미어(supermir), U1 어댑터(U1 adaptor) 및 압타머(aptamer)가 포함된다. 이들 핵산은 다양한 기전에 의해 작용한다. siRNA 또는 miRNA의 경우에, 이들 핵산은 RNA 간섭(RNAi)이라 불리는 과정을 통하여 특정 단백질의 세포내 수준을 하향-조절할 수 있다. 세포 세포질 내로 siRNA 또는 miRNA의 도입 이후에, 이들 이중-가닥 RNA 구조체는 RISC로 불리는 단백질에 결합할 수 있다. siRNA 또는 miRNA의 센스 가닥은 RISC 복합체로부터 이탈되고, 결합된 siRNA 또는 miRNA의 서열과 상보성 서열을 갖는 mRNA를 인식하고 여기에 결합할 수 있는 RISC 내에 주형(template)을 제공한다. RISC 복합체는, 상보성 mRNA에 결합하면, mRNA를 절단하고 절단된 가닥을 방출한다. RNAi는 단백질 합성을 인코딩하는 상응하는 mRNA의 특정 파괴를 표적화함으로써, 특정 단백질의 하향-조절(down-regulation)을 제공할 수 있다.
RNAi의 치료적 응용은 극히 넓은데, 그 이유는 siRNA와 miRNA 구조체가 표적 단백질에 지향되는 임의의 뉴클레오티드 서열로 합성될 수 있기 때문이다. 현재까지, siRNA 구조체는 시험관내와 생체내 모형 둘 모두에서 표적 단백질을 특이적으로 하향-조절하는 능력을 보였다. 이에 더하여, siRNA 구조체는 임상 연구에서 현재 평가되고 있다.
하지만, siRNA 또는 miRNA 구조체가 현재 직면하고 있는 2가지 문제점은, 첫째, 혈장 내에서 뉴클레아제 절단(nuclease digestion)에 대한 감수성, 그리고 둘째, 그들이 유리 siRNA 또는 miRNA로서 전신 투여될 때, RISC에 결합할 수 있는 세포내 구획에 대한 접근을 획득하는 한정된 능력이다. 이들 이중-가닥 구조체는 분자 내에 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 링커(linker), 예를 들면, 포스포티오에이트(phosphothioate) 기의 함입 혹은 편입(incorporation)에 의해 안정화될 수 있다. 그러나, 이들 화학적 변형은 뉴클레아제 절단으로부터 단지 한정된 보호만을 제공하고, 그리고 구조체의 활성을 감소시킬 수도 있다. siRNA 또는 miRNA의 세포내 전달은 담체 시스템, 예를 들면, 중합체, 양이온성 리포좀의 이용에 의해, 또는 구조체의 화학적 변형, 예를 들면, 콜레스테롤 분자의 공유 부착에 의해 조장될 수 있다. 하지만, siRNA와 miRNA 분자의 효능을 증가시키고 화학적 변형에 대한 요구를 감소시키거나 배제하기 위하여 향상된 전달 시스템이 요구된다.
안티센스 올리고뉴클레오티드 및 리보자임 역시 mRNA의 단백질로의 번역을 저해할 수 있다. 안티센스 구조체의 경우에, 이들 단일 가닥 데옥시핵산은 표적 단백질 mRNA의 서열과 상보성 서열을 갖고, 그리고 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 짝짓기(base pairing)에 의해 상기 mRNA에 결합할 수 있다. 이러한 결합은 표적 mRNA의 번역을 예방하고/하거나 mRNA 전사체의 RNase H 분해를 촉발시킨다. 결과적으로, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 작용(즉, 특정 질환-관련된 단백질의 하향-조절)의 특이성에 대한 엄청난 잠재력을 갖는다. 현재까지, 이들 화합물은 염증 질환, 암, 그리고 HIV의 모형을 비롯한 여러 시험관내와 생체내 모형에서 가능성을 보였다(문헌[Agrawal, Trends in Biotech. 14:376-387 (1996)]에서 검토되었다). 안티센스 역시 염색체 DNA와 특이적으로 혼성화됨으로써 세포 활성에 영향을 줄 수 있다. 여러 안티센스 약물의 진전된 인간 임상 평가가 현재 진행되고 있다. 이들 약물에 대한 표적에는 bcl2와 아포지단백(apolipoprotein) B 유전자 및 mRNA 산물이 포함된다.
면역-자극 핵산에는 데옥시리보핵산 및 리보핵산이 포함된다. 데옥시리보핵산의 경우에, 일정한 서열 또는 모티프가 포유동물에서 불량한 면역 자극을 유발하는 것으로 밝혀졌다. 이들 서열 또는 모티프에는 CpG 모티프, 피리미딘-풍부 서열 및 팰린드롬 서열이 포함된다. 데옥시리보핵산 내에서 CpG 모티프는 엔도솜 수용체, 톨-유사 수용체 9(TLR-9)에 의해 특이적으로 인식되고, 이는 이후, 선천성 및 후천성 면역 자극 경로 둘 모두를 유발하는 것으로 생각된다. 일정한 면역 자극 리보핵산 서열 역시 보고되었다. 이들 RNA 서열은 톨-유사 수용체 6 및 7(TLR-6 및 TLR-7)에 결합함으로써 면역 활성화를 유발하는 것으로 여겨진다. 이에 부가해서, 이중-가닥 RNA 역시 면역 자극성인 것으로 보고되고, 그리고 TLR-3에 결합에 의해 활성화되는 것으로 생각된다.
치료적 핵산의 이용에서 한 가지 널리 공지된 문제점은 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 연쇄의 안정성 및 뉴클레아제에 대한 이러한 링커의 감수성에 관한 것이다. 혈청 내에서 엑소뉴클레아제(exonuclease) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease)의 존재는 포스포다이에스터 링커(phosphodiester linker)를 보유하는 핵산의 급속한 절단을 유발하고, 따라서 치료적 핵산은 혈청의 존재에서 또는 세포 내에서 매우 짧은 반감기(half-life)를 가질 수 있다(Zelphati, O., et al., Antisense. Res. Dev. 3:323-338 (1993); 및 Thierry, A.R., et al., pp147-161 in Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA (Eds. Erickson, RP and Izant, JG; Raven Press, NY (1992)). 현재 개발 중에 있는 치료적 핵산은 이와 같은 공지된 문제점으로 인하여, 천연 핵산에서 관찰되는 기본적 포스포다이에스터 화학을 이용하지 않는다.
이러한 문제점은 혈청 또는 세포내 분해를 감소시키는 화학적 변형에 의해 부분적으로 극복되었다. 뉴클레오티드간 포스포디에스테르 가교(예컨대, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 또는 포스포라미데이트 연쇄를 이용)에서, 뉴클레오티드 염기(예컨대, 5-프로피닐-피리미딘)에서, 또는 당(예컨대, 2'-변형된 당)에서 변형이 시험되고 있다(Uhlmann E., et al. Antisense: Chemical Modifications. En사이클로pedia of Cancer, Vol. X., pp 64-81 Academic Press Inc. (1997)). 2'-5' 당 연쇄를 이용하여 안정성을 향상시키려는 다른 시도가 있었다 (예컨대, 미국 특허 제5,532,130호 참조). 다른 변화가 시도되었다. 하지만, 이들 해법 중에서 어느 것도 완전히 만족스러운 것으로 증명되지 않았고, 그리고 생체내 유리 치료적 핵산은 여전히 한정된 효능을 갖는다.
또한, siRNA와 miRNA와 관련하여 앞서 언급된 바와 같이, 세포 막을 횡단하는 치료적 핵산의 한정된 능력으로 인한 문제점(문헌[Vlassov, et al., Biochim. Biophys. Acta 1197:95-1082 (1994)] 참조), 그리고 전신 독성(systemic toxicity)과 연관된 문제점, 예를 들면, 보체-매개된 아나필락시스(complement-mediated anaphylaxis), 변경된 응고 성질, 그리고 혈구감소증 (cytopenia) (Galbraith, et al., Antisense Nucl. Acid Drug Des. 4:201-206 (1994))이 여전하다.
향상된 효능을 도모하기 위하여, 연구자들은 화학적으로 변형된 또는 변형되지 않은 치료적 핵산을 전달하는데 지질-기반 담체 시스템 역시 이용하였다. 문헌[Zelphati, O and Szoka, F.C., J. Contr. Rel. 41:99-119 (1996)]에서, 저자들은 음이온성(전통적인) 리포좀, pH 민감성 리포좀, 면역리포좀, 융합성(fusogenic) 리포좀, 그리고 양이온성 지질/안티센스 집합체의 이용에 대해 언급한다. 마찬가지로, siRNA는 양이온성 리포좀에 담겨 전신 투여되었고, 그리고 이들 핵산-지질 입자는 비-인간 영장류를 비롯한 포유동물에서 표적 단백질의 향상된 하향-조절을 제공하는 것으로 보고되었다(Zimmermann et al., Nature 441: 111-114 (2006)).
최근의 진전에도 불구하고, 일반적인 치료적 용도에 적합한 향상된 지질-치료적 핵산 조성물이 당해 분야에서 여전히 요구된다. 바람직하게는, 이들 조성물은 높은 효능을 갖는 핵산을 캡슐화(encapsulation)시키고, 높은 약물:지질 비율을 지니며, 캡슐화된 핵산을 혈청 내에서 분해와 제거로부터 보호하고, 전신 전달에 적합하며, 그리고 캡슐화된 핵산의 세포내 전달을 제공할 것이다. 이에 더하여, 이들 지질-핵산 입자는 충분히 내약성이고, 그리고 효과량의 핵산에서 환자 치료가 환자에 대한 현저한 독성 및/또는 위험과 연관되지 않도록 적절한 치료적 지수(therapeutic index)를 제공해야 한다. 본 발명에서는 이런 조성물, 이들 조성물을 제조하는 방법, 그리고 질환 치료의 목적을 비롯하여, 핵산을 세포내로 도입하기 위하여 이들 조성물을 이용하는 방법이 제공된다.
본 발명은 양이온성 지질의 지질 부분(예컨대, 소수성 사슬)의 중간 혹은 말단 부분에 위치된 하나 이상의 생분해성 기(biodegrable group)를 지니는 양이온성 지질에 관한 것이다. 이들 양이온성 지질은 핵산산(예컨대, siRNA) 등과 같은 활성제를 전달하기 위하여 지질 입자 내로 편입될 수 있다. 생분해성 기(들)의 양이온성 지질 내로의 편입은 표적 영역에 활성제의 전달을 수반하는 신체로부터 보다 빠른 대사 및 양이온성 지질의 제거를 유발한다. 그 결과, 이들 양이온성 지질은 생분해성 기가 없는 유사한 양이온성 지질보다 실질적으로 낮은 독성을 지닌다.
일 실시형태에 있어서, 양이온성 지질은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 염(예컨대, 그의 약제학적으로 허용가능한 염)이다:
[화학식 I]
Figure 112013000350703-pct00001
식 중,
R'는 존재하지 않거나, 수소 또는 알킬(예컨대, C1-C4 알킬)이고;
R1 및 R2에 대해서는,
(i) R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 임의선택적으로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬 혹은 복소환이고;
(ii) R1과 R2는, 이들이 부착되는 질소 원자와 함께, 임의선택적으로 치환된 복소환 고리를 형성하거나; 또는
(iii) R1과 R2 중 한쪽은 임의선택적으로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬 혹은 복소환이고, 다른 한쪽은 (a) 인접한 질소 원자 및 (b) 해당 질소 원자에 인접한 (R)a 기와 함께 4 내지 10원 복소환 고리 혹은 헤테로아릴(예컨대, 6-원 고리(member ring))을 형성하며;
각 경우의 R은 독립적으로 -(CR3R4)-이고;
각 경우의 R3 및 R4는, 독립적으로 H, OH, 알킬, 알콕시, -NH2, 알킬아미노 혹은 다이알킬아미노(하나의 바람직한 실시형태에 있어서, 각 경우의 R3 및 R4는 독립적으로 H 또는 C1-C4 알킬)이거나;
또는 R3과 R4는, 이들이 직접 부착되는 탄소 원자와 함께, 사이클로알킬기를 형성하되, 여기서 탄소 C*에 부착된 각 사슬 내의 3개 이하의 R기는 사이클로알킬(예컨대, 사이클로프로필)이고;
Q에 대한 파선(dashed line)은 존재하지 않거나 결합이며;
Q에 대한 파선이 존재하지 않을 경우, Q는 존재하지 않거나 또는 -O-, -NH-, -S-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R4)-, -N(R5)C(O)-, -S-S-, -OC(O)O-, -O-N=C(R5)-, -C(R5)=N-O-, -OC(O)N(R5)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -N(R5)C(O)O-, -C(O)S-, -C(S)O- 또는 -C(R5)=N-O-C(O)-이거나; 또는
Q에 대한 파선이 결합일 경우, (i) b는 0이고, (ii) Q와 이에 인접한 3차 탄소(C*)는 5 내지 10개의 고리 원자를 지니는 치환 혹은 비치환된 단환식 또는 이환식 복소환기를 형성하며(예컨대, 복소환기 내의 헤테로원자는 O 및 S로부터 선택되고, 바람직하게는 O임);
Q1 및 Q2는 각각 독립적으로 존재하지 않거나, 또는, -O-, -S-, -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -S-S-, -C(O)(NR5)-, -N(R5)C(O)-, -C(S)(NR5)-, -N(R5)C(O)-, -N(R5)C(O)N(R5)- 혹은 -OC(O)O-이고;
Q3 및 Q4는 각각 독립적으로 H, -(CR3R4)-, 아릴 혹은 콜레스테롤 부분이며;
각 경우의 A1, A2, A3 및 A4는 독립적으로 -(CR5R5-CR5=CR5)-이고;
각 경우의 R5는 독립적으로 H 또는 알킬이며;
M1 및 M2는 각각 독립적으로 생분해성 기(예컨대, -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -S-S-, -C(R5)=N-, -N=C(R5)-, -C(R5)=N-O-, -O-N=C(R5)-, -C(O)(NR5)-, -N(R5)C(O)-, -C(S)(NR5)-, -N(R5)C(O)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -OC(O)O-, -OSi(R5)2O-, -C(O)(CR3R4)C(O)O- 혹은 -OC(O)(CR3R4)C(O)-)이고;
Z는 존재하지 않거나 또는 알킬렌 혹은 -O-P(O)(OH)-O-이며;
Z에 대해 부착된 각 ------는 임의선택적 결합이므로, Z가 존재하지 않을 경우, Q3과 Q4는 함께 직접 공유결합적으로 결합되지 않고;
a는 1, 2, 3, 4, 5 혹은 6이며;
b는 0, 1, 2 혹은 3이고;
c, d, e, f, i, j, m, n, q 및 r은 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 혹은 10이며;
g 및 h는 각각 독립적으로 0, 1 혹은 2이고;
k 및 l은 각각 독립적으로 0 혹은 1이되, k 및 l 중 적어도 하나는 1이며;
o 및 p는 각각 독립적으로 0, 1 또는 2이고,
여기서,
(i) 상기 화합물은 이하의 부분을 포함하지 않으며:
Figure 112013000350703-pct00002
식 중, ----는 임의선택적 결합이고;
(ii) Q3 및 Q4는 각각 독립적으로 8개 이상의 원자(예컨대, 12 또는 14 혹은 그 이상의 원자)의 사슬에 의해 별표(*)로 표시된 3차 탄소원자로부터 분리된다.
일 실시형태에 있어서, (i) R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 임의선택적으로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬 혹은 복소환이거나; 또는 (ii) R1과 R2는, 이들이 부착되는 질소 원자와 함께, 임의선택적으로 치환된 복소환 고리를 형성한다.
화학식 I의 화합물의 바람직한 실시형태에 있어서,
(a) Q1이 생분해성 기(예컨대, -C(O)O-)이면, c는 적어도 4이고;
(b) Q2가 생분해성 기이면, d는 적어도 4이며;
(c) Q3 및 Q4는 각각 독립적으로 10개 이상의 원자(예컨대, 12 혹은 14 혹은 그 이상의 원자)의 사슬에 의해 별표(*)로 표시된 3차 탄소원자로부터 분리된다.
다른 바람직한 실시형태에 있어서, 화학식 I 내의 생분해성 기(예컨대, -C(O)O-)에 대한 탄소 원자 알파 혹은 베타는 1개 혹은 2개의 알킬기(예컨대, 1개의 C1-C4 알킬기, 예컨대, -CH3 치환체, 또는 2개의 C1-C4 알킬기, 예컨대, 2개의 -CH3 치환체)에 의해서 치환될 수 있거나, 또는 스피로환식 기(예컨대, C3-C5 사이클로알킬, 예컨대, C3 사이클로알킬)를 지닐 수 있다. 예를 들어, 생분해성 기에 대한 탄소 원자 알파 혹은 베타는 이하의 것들로부터 독립적으로 선택될 수 있다:
Figure 112013000350703-pct00003
(식 중, n은 4 내지 6이다).
일 실시형태에 있어서, M1 혹은 M2기 및 이웃하는 변수(들)는 이하의 군을 형성한다:
Figure 112013000350703-pct00004
(식 중, n은 4 내지 6이다).
또 다른 실시형태는 이하의 화학식 IA-1 또는 그의 염(예컨대, 그의 약제학적으로 허용가능한 염)의 양이온성 지질이다:
[화학식 IA-1]
Figure 112013000350703-pct00005
식 중,
R1, R2, R, a 및 b는 화학식 I에 대해서 정의된 바와 같고;
Q는 존재하지 않거나, 또는 -O-, -NH-, -S-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R4)-, -N(R5)C(O)-, -S-S-, -OC(O)O-, -O-N=C(R5)-, -C(R5)=N-O-, -OC(O)N(R5)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -N(R5)C(O)O-, -C(O)S-, -C(S)O- 또는 -C(R5)=N-O-C(O)-이며;
R'는 존재하지 않거나, 수소 또는 알킬(예컨대, C1-C4 알킬)이고;
각각의 R9 및 R10은 독립적으로 하나 이상의 생분해성 기를 지니는 C12-C24 알킬(예컨대, C12-C20 알킬), C12-C24 알케닐(예컨대, C12-C20 알케닐) 또는 C12-C24 알콕시(예컨대, C12-C20 알콕시)이며; 각 생분해성 기는 독립적으로 상기 C12-C24 알킬, 알케닐 혹은 알콕시기를 중단(interrupted)시키거나 C12-C24 알킬, 알케닐 혹은 알콕시기의 말단에 치환되고,
여기서,
(i) 상기 화합물은 이하의 부분을 포함하지 않으며:
Figure 112013000350703-pct00006
식 중, ----는 임의선택적 결합이고;
(ii) R9 및 R10의 말단은 8개 이상의 원자(예컨대, 12 또는 14 또는 그 이상의 원자)의 사슬에 의해 별표(*)로 표시된 3차 탄소원자로부터 분리된다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 양이온성 지질은 하기 화학식 IA-2의 화합물 또는 그의 염(예컨대, 그의 약제학적으로 허용가능한 염)이다:
[화학식 IA-2]
Figure 112013000350703-pct00007
식 중,
R'는 존재하지 않거나, 수소 또는 알킬(예컨대, C1-C4 알킬)이고;
R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 임의선택적으로 치환된 C1-C4 알킬, C2-C4 알케닐, C2-C4 알키닐, C3-C6 사이클로알킬, (C3-C6 사이클로알킬)C1-C4 알킬 또는 단환식 복소환이거나; 또는
R1과 R2는, 이들이 부착되는 질소 원자와 함께, 임의선택적으로 치환된 5- 또는 6-원 복소환 고리(예컨대, C5 혹은 C6 복소환 고리)를 형성하며;
각 경우의 R은 독립적으로 -(CR3R4)-이고;
각 경우의 R3 및 R4는 독립적으로 H, OH, 알킬, 알콕시, -NH2, 알킬아미노 혹은 다이알킬아미노(하나의 바람직한 실시형태에 있어서, 각 경우의 R3 및 R4는 독립적으로 H 또는 C1-C4 알킬임)이거나;
또는 R3과 R4는, 이들이 직접 부착되는 탄소 원자와 함께, C3-C6 사이클로알킬기를 형성하되, 여기서 탄소 C*에 부착된 각 사슬 내의 3개 이하의 R기는 사이클로알킬(예컨대, 사이클로프로필)이고;
Q에 대한 파선은 존재하지 않거나 결합이며;
Q에 대한 파선이 존재하지 않을 경우, Q는 존재하지 않거나, 또는 -O-, -NH-, -S-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R4)-, -N(R5)C(O)-, -S-S-, -OC(O)O-, -O-N=C(R5)-, -C(R5)=N-O-, -OC(O)N(R5)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -N(R5)C(O)O-, -C(O)S-, -C(S)O- 또는 -C(R5)=N-O-C(O)-이거나; 또는
Q에 대한 파선이 결합일 경우, b는 0이고, Q와 이에 인접한 3차 탄소(C*)는 5 내지 10개의 고리 원자를 지니는 치환 혹은 비치환된 단환식 또는 이환식 복소환기를 형성하며(예컨대, 복소환기 내의 헤테로원자는 O 및 S로부터 선택되고, 바람직하게는 O임);
Q3 및 Q4는 각각 독립적으로 H, -(CR3R4)-, 아릴 혹은 콜레스테롤 부분이고;
각 경우의 A1, A2, A3 및 A4는 독립적으로 -(CR5R5-CR5=CR5)-이고;
각 경우의 R5는 독립적으로 H 또는 알킬이며;
M1 및 M2는 각각 독립적으로 -C(O)-O-, -OC(O)-, -C(R5)=N-, -C(R5)=N-O-, -O-C(O)O-, -C(O)N(R5)-, -C(O)S-, -C(S)O-, -OSi(R5)2O-, -C(O)(CR3R4)C(O)O- 또는 -OC(O)(CR3R4)C(O)-이고;
Z는 존재하지 않거나 또는 알킬렌 혹은 -O-P(O)(OH)-O-이며;
Z에 대해 부착된 각 ------는 임의선택적 결합이므로, Z가 존재하지 않을 경우, Q3과 Q4는 함께 직접 공유결합적으로 결합되지 않고;
a는 1, 2, 3, 4, 5 혹은 6이며;
b는 0, 1, 2 혹은 3이고;
d, e, i, j, m, n, q 및 r은 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이고;
g 및 h는 각각 독립적으로 0, 1 혹은 2이고;
d + 3h의 합계는 적어도 4이고, e + 3g의 합계는 적어도 4이며;
k 및 l은 각각 독립적으로 0 혹은 1이되, 여기서 k 및 l 중 적어도 하나는 1이고;
o 및 p는 각각 독립적으로 0, 1 또는 2이며,
Q3 및 Q4는 각각 독립적으로 8개 이상의 원자(예컨대, 12 또는 14 혹은 그 이상의 원자)의 사슬에 의해 별표(*)로 표시된 3차 탄소원자로부터 분리된다.
일 실시형태에 있어서, 화학식 IA-2 중의 R'는 존재하지 않거나, 또는 수소이다. 일 실시형태에 있어서, 화학식 IA-2 중의 R'는 존재하지 않거나, 또는 알킬(예컨대, 메틸)이다.
일 실시형태에 있어서, 화학식 IA-2 중의 R1 및 R2는 각각 독립적으로 C1-C4 알킬(예컨대, 메틸 혹은 에틸)이다.
일 실시형태에 있어서, 화학식 IA-2 중의 각 경우의 R은 독립적으로 -CH2- 또는 -CH(CH3)-이다.
일 실시형태에 있어서, 화학식 IA-2 중의 Q3 및 Q4는 각각 독립적으로 H, 아릴 또는 콜레스테롤 부분이다.
일 실시형태에 있어서, 화학식 IA-2 중의 각 경우의 A1, A2, A3 및 A4는 독립적으로 -(CH2-CH=CH)-이다.
일 실시형태에 있어서, 화학식 IA-2 중의 M1 및 M2는 각각 -C(O)-O-이다.
화학식 (IA-2)의 화합물의 일 실시형태에 있어서, Z는 존재하지 않고, 각각 ------는 존재하지 않는다(즉, Q3 및 Q4는 함께 직접 공유결합적으로 결합되지 않는다).
일 실시형태에 있어서, 화학식 IA-2 중의 e+3g+i+m+3o+q의 합계는 약 8 내지 약 20이다. 다른 실시형태에 있어서, 화학식 IA-2 중의 e+3g+i+m+3o+q의 합계는 약 12 내지 약 20이다.
일 실시형태에 있어서, 화학식 IA-2 중의 d+3h+j+n+3p+r의 합계는 약 8 내지 약 20이다. 다른 실시형태에 있어서, 화학식 IA-2 중의 d+3h+j+n+3p+r의 합계는 약 12 내지 약 20이다.
다른 실시형태에 있어서, 양이온성 지질은 하기 화학식 IB의 화합물이다:
[화학식 IB]
Figure 112013000350703-pct00008
식 중,
R1, R2, R, a, b, M1 및 M2은 화학식 I에 대해서 정의된 바와 같고;
Q는 존재하지 않거나, 또는 -O-, -NH-, -S-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R4)-, -N(R5)C(O)-, -S-S-, -OC(O)O-, -O-N=C(R5)-, -C(R5)=N-O-, -OC(O)N(R5)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -N(R5)C(O)O-, -C(O)S-, -C(S)O- 또는 -C(R5)=N-O-C(O)-이며;
R'는 존재하지 않거나, 수소 또는 알킬(예컨대, C1-C4 알킬)이고;
각각의 R9 및 R10은 독립적으로 알킬렌 혹은 알케닐렌이며;
각각의 R11 및 R12는 독립적으로 COOR13에 의해 임의선택적으로 종결된, 알킬 혹은 알케닐이며, 여기서 각각의 R13은 독립적으로 알킬(예컨대, C1-C4 알킬, 예컨대, 메틸 혹은 에틸)이고;
R9, M1 및 R11은 함께 길이가 적어도 8개의 탄소 원자(예컨대, 12 혹은 14개의 탄소 원자 혹은 그 이상)이며;
R10, M2 및 R12는 함께 길이가 적어도 8개의 탄소 원자(예컨대, 12 혹은 14개의 탄소 원자 혹은 그 이상)이다.
화학식 IB의 화합물의 바람직한 실시형태에 있어서, R9 및 R10은 각각 독립적으로 C4-C12 알킬렌 또는 C4-C12 알케닐렌이고, M1 및 M2는 -C(O)O-이며, R11 및 R12는 C4-C12 알킬렌 또는 C4-C12 알케닐렌이다. 일 실시형태에 있어서, R9, M1 및 R11은 함께 길이가 12 내지 24개의 탄소 원자이다. 다른 실시형태에 있어서, R9, M1 및 R11은 함께 길이가 14 내지 18개의 탄소 원자이다. 일 실시형태에 있어서, R10, M2 및 R12는 함께 길이가 12 내지 24개의 탄소 원자이다. 다른 실시형태에 있어서, R10, M2 및 R12는 함께 길이가 14 내지 18개의 탄소 원자이다.
R'R1R2N-(R)a-Q-(R)b-기는, 이하의 표 1에 표시된 것 및 그들의 염을 포함하는, 본 명세서에 기재된 헤드기(head group) 중 어느 하나일 수 있다. 하나의 바람직한 실시형태에 있어서, R'R1R2N-(R)a-Q-(R)b-는 (CH3)2N-(CH2)3-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-NH-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-OC(O)-NH- 또는 (CH3)2N-(CH2)3-C(CH3)=N-O-이다.
또 다른 실시형태에 있어서, 양이온성 지질은 하기 화학식 IC의 화합물이다:
[화학식 IC]
Figure 112013000350703-pct00009
식 중,
R1, R2, R, a 및 b는 화학식 I에 대해서 정의된 바와 같고;
Q는 존재하지 않거나, 또는 -O-, -NH-, -S-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R4)-, -N(R5)C(O)-, -S-S-, -OC(O)O-, -O-N=C(R5)-, -C(R5)=N-O-, -OC(O)N(R5)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -N(R5)C(O)O-, -C(O)S-, -C(S)O- 또는 -C(R5)=N-O-C(O)-이며; R'는 존재하지 않거나, 수소 또는 알킬(예컨대, C1-C4 알킬)이고;
각각의 R9 및 R10은 독립적으로 생분해성 기, 예컨대, -COOR13을 지니는 그의 말단에 치환된 C12-C24 알킬 혹은 알케닐이며, 여기서 각각의 R13은 독립적으로 알킬(바람직하게는 C1-C4 알킬, 예컨대, 메틸 혹은 에틸)이다.
화학식 IC의 화합물의 바람직한 실시형태에 있어서, R9 및 R10은 각각 독립적으로 C14-C18 알킬렌 또는 C14-C18 알케닐렌이다. 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 생분해성 기는 -COOR13이며, 여기서 R13은 C1-C4 알킬(예컨대, 메틸 혹은 에틸)이다.
R'R1R2N-(R)a-Q-(R)b-기는, 이하의 표 1에 표시된 것들을 포함하는, 본 명세서에 기재된 헤드기 중 어느 하나일 수 있다. 하나의 바람직한 실시형태에 있어서, R'R1R2N-(R)a-Q-(R)b-는 (CH3)2N-(CH2)3-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-NH-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-OC(O)-NH- 또는 (CH3)2N-(CH2)3-C(CH3)=N-O-이다.
또 다른 실시형태는 하기 화학식 ID의 중간체 혹은 그의 염(예컨대, 그의 약제학적으로 허용가능한 염)이다:
[화학식 ID]
Figure 112013000350703-pct00010
식 중,
R'는 존재하지 않거나, 수소 또는 알킬(예컨대, C1-C4 알킬)이고;
R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 임의선택적으로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬 혹은 복소환이거나; 또는
R1과 R2는, 이들이 부착되는 질소 원자와 함께, 임의선택적으로 치환된 복소환 고리를 형성하며;
각 경우의 R은 독립적으로 -(CR3R4)-이고;
각 경우의 R3 및 R4는 독립적으로 H, OH, 알킬, 알콕시, -NH2, 알킬아미노 혹은 다이알킬아미노(하나의 바람직한 실시형태에 있어서, 각 경우의 R3 및 R4는 독립적으로 H 또는 알킬임)이거나;
또는 R3과 R4는, 이들이 직접 부착되는 탄소 원자와 함께, 사이클로알킬기를 형성하되, 탄소 C*에 부착된 각 사슬 내의 3개 이하의 R기는 사이클로알킬(예컨대, 사이클로프로필)이고;
Q에 대한 파선은 존재하지 않거나 결합이며;
Q에 대한 파선이 존재하지 않을 경우, Q는 존재하지 않거나, 또는 -O-, -NH-, -S-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R4)-, -N(R5)C(O)-, -S-S-, -OC(O)O-, -O-N=C(R5)-, -C(R5)=N-O-, -OC(O)N(R5)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -N(R5)C(O)O-, -C(O)S-, -C(S)O- 또는 -C(R5)=N-O-C(O)-이거나; 또는
Q에 대한 파선이 결합일 경우, b는 0이고, Q와 이에 인접한 3차 탄소(C*)는 5 내지 10개의 고리 원자를 지니는 치환 혹은 비치환된 단환식 또는 이환식 복소환기를 형성하며(예컨대, 복소환기 내의 헤테로원자는 O 및 S로부터 선택되고, 바람직하게는 O임);
Q1 및 Q2는 각각 독립적으로 존재하지 않거나, 또는, -O-, -S-, -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -S-S-, -C(O)(NR5)-, -N(R5)C(O)-, -C(S)(NR5)-, -N(R5)C(O)-, -N(R5)C(O)N(R5)- 혹은 -OC(O)O-이고;
Q3 및 Q4는 각각 독립적으로 H, -(CR3R4)-, 아릴, -OH 또는 콜레스테롤 부분이며;
각 경우의 A1, A2, A3 및 A4는 독립적으로 -(CR5R5-CR5=CR5)-이고;
각 경우의 R5는 독립적으로 H 또는 알킬이며;
M1 및 M2는 각각 독립적으로 생분해성 기(예컨대, -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -S-S-, -C(R5)=N-, -N=C(R5)-, -C(R5)=N-O-, -O-N=C(R5)-, -C(O)(NR5)-, -N(R5)C(O)-, -C(S)(NR5)-, -N(R5)C(O)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -OC(O)O-, -OSi(R5)2O-, -C(O)(CR3R4)C(O)O- 혹은 -OC(O)(CR3R4)C(O)-)이고;
Z는 존재하지 않거나 또는 알킬렌 혹은 -O-P(O)(OH)-O-이며;
Z에 대해 부착된 각 ------는 임의선택적 결합이므로, Z가 존재하지 않을 경우, Q3과 Q4는 함께 직접 공유결합적으로 결합되지 않고;
a는 1, 2, 3, 4, 5 혹은 6이며;
b는 0, 1, 2 혹은 3이고;
c, d, e, f, i, j, m, n, q 및 r은 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 혹은 10이며;
g 및 h는 각각 독립적으로 0, 1 혹은 2이고;
k 및 l은 각각 독립적으로 0 혹은 1이며;
o 및 p는 각각 독립적으로 0, 1 또는 2이고,
여기서,
(i) 상기 화합물은 이하의 부분을 포함하지 않으며:
Figure 112013000350703-pct00011
식 중, ----는 임의선택적 결합이고;
(ii) Q3 및 Q4는 각각 독립적으로 8개 이상의 원자(예컨대, 12 또는 14 혹은 그 이상의 원자)의 사슬에 의해 별표(*)로 표시된 3차 탄소원자로부터 분리된다.
또 추가의 실시형태에 있어서, 양이온성 지질은 화학식 IE의 화합물 혹은 그의 염(예컨대, 그의 약제학적으로 허용가능한 염)이다:
[화학식 IE]
Figure 112013000350703-pct00012
식 중,
R1은 화학식 -L1a-(CR1aR1b)α-[L1b-(CR1aR1b)β]γ-L1c-R1c를 지니는 C10 내지 C30이고, 여기서 L1a는 결합, -CR1aR1b-, -O-, -CO-, -NR1d-, -S- 또는 이들의 조합이며;
각각의 R1a 및 각각의 R1b는 독립적으로 H; 할로; 하이드록시; 사이아노; 할로, 하이드록시 혹은 알콕시에 의해 임의선택적으로 치환된 C1-C6 알킬; 할로, 하이드록시 혹은 알콕시에 의해 임의선택적으로 치환된 C3-C8 사이클로알킬; -OR1c; -NR1cR1d; 아릴; 헤테로아릴; 또는 헤테로사이클릴이고;
각각의 L1b는 독립적으로 결합, -(CR1aR1b)1-2-, -O-, -CO-, -NR1d-, -S-,
Figure 112013000350703-pct00013
,
Figure 112013000350703-pct00014
혹은 이들의 조합이거나; 또는 화학식
Figure 112013000350703-pct00015
을 지닐 수 있고, 여기서, j, k 및 l은 각각 독립적으로 0, 1, 2 혹은 3이되, 단, j, k 및 l의 합계는 적어도 1 내지 8 이하이며; R1f 및 R1g는 각각 독립적으로 R1b이거나, 또는 인접한 R1f와 R1g는 함께 임의선택적으로 결합이거나;
또는 화학식
Figure 112013000350703-pct00016
를 지닐 수 있으며, 여기서 j 및 k는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이되, 단 j 및 k의 합계는 적어도 1이고; R1f 및 R1g는 각각 독립적으로 R1b이거나 또는 인접한 R1f와 R1g는 함께 임의선택적으로 결합이거나;
또는 화학식:
Figure 112013000350703-pct00017
을 지닐 수 있고, 여기서 -Ar-은 0 내지 6개의 독립적인 R1a기에 의해 임의선택적으로 치환된 6 내지 14원의 아릴렌기이고;
화학식:
Figure 112013000350703-pct00018
을 지닐 수 있으며, 여기서 -Het-는 0 내지 6개의 독립적인 R1a기에 의해 임의선택적으로 치환된 3 내지 14원 헤테로사이클릴렌 혹은 헤테로아릴렌기이고;
L1c는 -(CR1aR1b)1-2-, -O-, -CO-, -NR1d-, -S-,
Figure 112013000350703-pct00019
혹은 이들의 조합이며;
R1c는 H; 할로; 하이드록시; 사이아노; 할로, 하이드록시, 알콕시 혹은 아릴에 의해 임의선택적으로 치환된 C1-C6 알킬; 할로, 하이드록시, 알콕시 혹은 아릴에 의해 임의선택적으로 치환된 C3-C8 사이클로알킬; 아릴; 헤테로아릴; 혹은 헤테로사이클릴이거나; 또는 R1c는 화학식:
Figure 112013000350703-pct00020
이고;
R1d는 H; 할로; 하이드록시; 사이아노; 할로, 하이드록시 혹은 알콕시에 의해 임의선택적으로 치환된 C1-C6 알킬; 할로, 하이드록시 혹은 알콕시에 의해 임의선택적으로 치환된 C3-C8 사이클로알킬; 아릴; 헤테로아릴; 혹은 헤테로사이클릴이며;
α는 0 내지 6(0과 6을 포함함)이고;
각각의 β는 독립적으로 0 내지 6(0과 6을 포함함)이며;
γ는 0 내지 6(0과 6을 포함함)이고;
R2는 화학식 -L2a-(CR2aR2b)δ[L2b-(CR2aR2b)ε]ζ-L2c-R2c를 지니는 C10 내지 C30기이고, 여기서 L2a는 결합, -CR2aR2b-, -O-, -CO-, -NR2d-, -S- 또는 이들의 조합이며;
각각의 R2a 및 각각의 R2b는 독립적으로 H; 할로; 하이드록시; 사이아노; 할로, 하이드록시 혹은 알콕시에 의해 임의선택적으로 치환된 C1-C6 알킬; 할로, 하이드록시 혹은 알콕시에 의해 임의선택적으로 치환된 C3-C8 사이클로알킬; -OR2c; -NR2cR2d; 아릴; 헤테로아릴; 혹은 헤테로사이클릴일 수 있고;
각각의 L2b는 독립적으로 can be 결합, -(CR2aR2b)1-2-, -O-, -CO-, -NR2d-, -S-,
Figure 112013000350703-pct00021
또는 이들의 조합일 수 있거나;
또는 화학식
Figure 112013000350703-pct00022
을 지닐 수 있고, 여기서 j, k 및 l은 각각 독립적으로 0, 1, 2 혹은 3이되, 단, j, k 및 l의 합계는 적어도 1 내지 8 이하이며; R2f 및 R2g는 각각 독립적으로 R2b이거나 또는 인접한 R2f와 R2g는 함께 임의선택적으로 결합이거나;
또는 화학식
Figure 112013000350703-pct00023
을 지닐 수 있고, 여기서 j 및 k는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이되, 단 j와 k의 합계는 적어도 1이며; R2f 및 R2g는 각각 독립적으로 R2b이거나, 또는 인접한 R2f와 R2g는 함께 임의선택적으로 결합이거나;
또는 화학식:
Figure 112013000350703-pct00024
을 지닐 수 있고, 여기서 -Ar-은 0 내지 6개의 독립적인 R2a기에 의해 임의선택적으로 치환된 6 내지 14원의 아릴렌기이거나;
또는 화학식:
Figure 112013000350703-pct00025
을 지닐 수 있고, 여기서 -Het-는 0 내지 6개의 독립적인 R2a기에 의해 임의선택적으로 치환된 3 내지 14원 헤테로사이클릴렌 혹은헤테로아릴렌기이며;
L2c는 -(CR2aR2b)1-2-, -O-, -CO-, -NR2d-, -S-,
Figure 112013000350703-pct00026
, 또는 이들의 조합이고;
R2c는 H; 할로; 하이드록시; 사이아노; 할로, 하이드록시, 알콕시 혹은 아릴에 의해 임의선택적으로 치환된 C1-C6 알킬; 할로, 하이드록시, 알콕시 혹은 아릴에 의해 임의선택적으로 치환된 C3-C8 사이클로알킬; 아릴; 헤테로아릴; 혹은 헤테로사이클릴이거나; 또는 R2c는 화학식:
Figure 112013000350703-pct00027
을 지니며;
R2d는 H; 할로; 하이드록시; 사이아노; 할로, 하이드록시 혹은 알콕시에 의해 임의선택적으로 치환된 C1-C6 알킬; 할로, 하이드록시 혹은 알콕시에 의해 임의선택적으로 치환된 C3-C8 사이클로알킬; 아릴; 헤테로아릴; 혹은 헤테로사이클릴이고;
δ는 0 내지 6(0과 6을 포함함)이며;
각각의 ε는 독립적으로 0 내지 6(0과 6을 포함함)이고;
ζ는 0 내지 6(0과 6을 포함함)이며;
L1은 C(Ra), -(CR5R6)xC(Ra)- 혹은 P(Q2)이고;
Ra는 H, 알킬, 알콕시, -OH, -N(Q)Q 혹은 -SQ이며;
L2는 -(CR5R6)x-, -C(O)-(CR5R6)x-, -(CR5R6)x-C(O)-, -(CR5R6)x-CR5=CR5-(CR5R6)y-, -C(O)-(CR5R6)x-CR5=CR5-(CR5R6)y-, -(CR5R6)x-CR5=CR5-(CR5R6)y-C(O)-, -O-, -S-, -N(Q)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)-, -N(Q)C(O)-, -C(O)N(Q)-, -N(Q)C(O)O-, -OC(O)N(Q)-, S(O), -N(Q)S(O)2N(Q)-, -S(O)2-, -N(Q)S(O)2-, -SS-, -O-N=, =N-O-, -C(O)-N(Q)-N=, -N(Q)-N=, -N(Q)-O-, -C(O)S-, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 사이클알킬렌 혹은 헤테로사이클릴렌이고;
각각의 x는 독립적으로 0 내지 6(0과 6을 포함함)일 수 있으며;
각각의 y는 독립적으로 0 내지 6(0과 6을 포함함)일 수 있고,
R3은 하기 화학식:
Figure 112013000350703-pct00028
,
Figure 112013000350703-pct00029
이며;
Y1은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬 혹은 알키닐이고, 여기서 Y1은 0 내지 6개의 독립적인 Rn에 의해 임의선택적으로 치환되며;
Y2는 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬 혹은 알키닐이고, 여기서 Y2는 0 내지 6개의 독립적인 Rn에 의해 임의선택적으로 치환되며;
Y3은 존재하지 않거나, 또는 존재한다면, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬 혹은 알키닐이되, 여기서 Y3은 0 내지 6개의 독립적인 Rn에 의해 임의선택적으로 치환되고;
Y4는 존재하지 않거나, 또는 존재한다면, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬 혹은 알키닐이되, 여기서 Y4는 0 내지 6개의 독립적인 Rn에 의해 임의선택적으로 치환되거나;
또는 Y1, Y2 및 Y3 중 임의의 2개는 이들이 부착되는 N 원자와 함께 0 내지 6개의 독립적인 Rn에 의해 임의선택적으로 치환된 3- 내지 8-원의 복소환을 형성하거나;
또는 Y1, Y2 및 Y3은 모두 이들이 부착되는 N 원자와 함께 0 내지 6개의 독립적인 Rn에 의해 임의선택적으로 치환된 이환식의 5- 내지 12-원의 복소환을 형성하고;
각각의 Rn은 독립적으로 H, 할로, 사이아노, 하이드록시, 아미노, 알킬, 알콕시, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 혹은 헤테로사이클릴일 수 있고;
L3은 결합, -N(Q)-, -O-, -S-, -(CR7R8)a-, -C(O)- 혹은 이들의 임의의 2개의 조합이며;
L4는 결합, -N(Q)-, -O-, -S-, -(CR7R8)a-, -C(O)- 혹은 이들의 임의의 2개의 조합이고;
L5는 결합, -N(Q)-, -O-, -S-, -(CR7R8)a-, -C(O)- 혹은 이들의 임의의 2개의 조합이며;
각 경우의 R7 및 R8은 독립적으로 H, 할로, 사이아노, 하이드록시, 아미노, 알킬, 알콕시, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 혹은 헤테로사이클릴이거나;
또는 인접한 탄소 원자 상의 2개의 R7기는 함께 합쳐져서 그들 각각의 탄소 원자 사이에 이중 결합을 형성할 수 있거나:
또는 인접한 탄소 원자 상의 2개의 R7기 및 상기와 동일한 인접한 탄소 원자 상의 2개의 R8기는 함께 합쳐져서 그들 각각의 탄소 원자 사이에 삼중 결합을 형성할 수 있거나:
또는 L3, L4 혹은 L5 중 어느 하나로부터의 R7 혹은 R8 치환체는 임의선택적으로 L3, L4 혹은 L5 중 어느 하나로부터의 R7 혹은 R8 치환체와 합쳐져서 3- 내지 8원 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 혹은 헤테로아릴기를 형성할 수 있거나;
또는 Y1, Y2 또는 Y3 중 어느 하나는 임의선택적으로 L3, L4 및 L5 중 어느 하나로부터의 R7 혹은 R8기 및 이들이 부착되는 원자들과 함께 3- 내지 8-원 헤테로사이클릴기를 형성하며;
각각의 a는 독립적으로 0, 1, 2 혹은 3일 수 있고;
각 경우의 R5 및 R6은 독립적으로 H, 할로, 사이아노, 하이드록시, 아미노, 알킬, 알콕시, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 혹은 헤테로사이클릴일 수 있으며;
각각의 Q는 독립적으로 H, 알킬, 아실, 사이클로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴 혹은 헤테로사이클릴이고;
각각의 Q2는 독립적으로 O, S, N(Q)Q, 알킬 혹은 알콕시이다.
몇몇 실시형태에 있어서, L1은 -C(R5R6)xC(Ra)-일 수 있거나; 또는 L1은 -CH2-C(Ra)-일 수 있다. L2는 -C(O)O-, -OC(O)-, -N(Q)C(O)-, -C(O)N(Q)-, -N(Q)C(O)O-, -OC(O)N(Q)-, -SS-, -O-N= 혹은 =N-O-일 수 있다. L2는 -C(O)O-, -OC(O)-, -SS- 또는 =N-O-일 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, -L1a-(CR1aR1b)α는 -(CH2)8-일 수 있다. -L2a-(CR2aR2b)δ는 -(CH2)8-일 수 있다. L1b-(CR1aR1b)β는 CH2CH2CH2, CH=CH-CH2 또는
Figure 112013000350703-pct00030
일 수 있고, β는 1, 2 혹은 3이다. L2b-(CR2aR2b)ε는 CH2CH2CH2, CH=CH-CH2 혹은
Figure 112013000350703-pct00031
일 수 있고, ε는 1, 2 혹은 3이다.
화학식 IE의 화합물의 일 실시형태에 있어서, 해당 화합물에 존재하는 적어도 하나의 L1a, L1b, L1c, L2a, L2b 혹은 L2c는 생분해성 기, 예컨대, 에스터 -C(O)O-, -OC(O)-, 다이설파이드(-S-S-), -C(R5)=N-, -O-C(O)O-, -C(O)N(R5), -N(R5)C(O)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(O)(CR1aR1b)C(O)O- 혹은 -OC(O)(CR1aR1b)C(O)-이다. 화학식 IE의 화합물의 다른 실시형태에 있어서, 해당 화합물에 존재하는 적어도 하나의 L1a, L1b 및 L1c는 생분해성 기이고, 해당 화합물에 존재하는 하나의 L2a, L2b 혹은 L2c는 생분해성 기(예컨대, 위에서 언급된 것들)이다. 화학식 IE의 화합물의 또 다른 실시형태에 있어서, R1 중의 α는 적어도 4이고, R2 중의 δ는 적어도 4이며, 해당 화합물에 존재하는 적어도 하나의 L1a, L1b 및 L1c는 생분해성 기이고 해당 화합물에 존재하는 하나의 L2a, L2b 혹은 L2c는 생분해성 기(예컨대, 위에서 언급된 것들)이다. 다른 실시형태에 있어서, R1 및/또는 R2 중의 탄소 사슬은 포화되어 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, R1 및/또는 R2 중의 탄소 사슬은 1개 혹은 2개의 이중 결합을 포함한다.
또 다른 실시형태에 있어서, 양이온성 지질은 이하의 화학식 II 내지 XXIII로부터 선택된 화합물 및 그의 염(예컨대, 그의 약제학적으로 허용가능한 염)이다:
Figure 112013000350703-pct00032
Figure 112013000350703-pct00033
Figure 112013000350703-pct00034
식 중,
m, n, o 및 p는 각각 독립적으로 1 내지 25이되, 단,
(i) 화학식 II, IV, VI 및 VII에서, m 및 p는 둘 모두 4 이상이고;
(ii) 화학식 VIII, X, XII, XIV, XVI, XVIII, XXI 및 XXIII에서, m은 4 이상이며;
(iii) 화학식 VIII, IX, XII 및 XIII에서, p는 8 이상(예컨대, 12 혹은 14 혹은 그 이상)이다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 이하를 지니는 양이온성 지질 혹은 그의 염에 관한 것이다:
(i) 중심 탄소 원자,
(ii) 상기 중심 원자에 직접 결합된 질소 함유 헤드기, 및
(iii) 상기 중심 탄소 원자에 직접 결합된 2개의 소수성 테일(hydrophobic tail)을 포함하되,
각 소수성 테일은 상기 중심 탄소 원자에 부착된 C8 이상의 지방족 기(바람직하게는 C14 혹은 그 이상의 지방족 기)를 포함하고, 상기 지방족 기(들) 중 한쪽 혹은 양쪽은 (a) 생분해성 기와 상기 중심 탄소 원자 사이에 적어도 4개의 탄소 원자의 사슬이 있도록 당해 생분해성 기에 의해 중단되거나, 또는 (b) 상기 소수성 테일의 말단부에 생분해성 기를 포함한다. 예를 들어, 생분해성 기는 -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -S-S-, -C(O)(NR5)-, -N(R5)C(O)-, -C(S)(NR5)-, -N(R5)C(O)-, -N(R5)C(O)N(R5)- 및 -C(O)O-로부터 선택된다.
또 다른 실시형태는 본 발명의 양이온성 지질을 포함하는 지질 입자이다. 일 실시형태에 있어서, 지질 입자는 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학식 II 내지 XXIII 중 어느 하나의 화합물을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 지질 입자는 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학식 I의 화합물을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 지질 입자는 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학식 IA-1, IA-2, IB, IC, ID 혹은 IE의 화합물을 포함한다.
바람직한 실시형태에 있어서, 지질 입자는 중성 지질, 응집을 저감시킬 수 있는 지질, 양이온성 지질, 및 임의선택적으로 스테롤(예컨대, 콜레스테롤)이다. 적절한 중성 지질로는 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 다이팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), POPC, DOPE 및 SM을 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 응집을 저감시킬 수 있는 적절한 지질로는, PEG 지질, 예컨대, PEG-DMA, PEG-DMG, 또는 이들의 조합을 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
지질 입자는 활성제(예컨대, 치료제)를 더 포함할 수 있다. 활성제는 플라스미드, 면역자극 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 마이크로RNA, 안타고미어, 압타머 혹은 리보자임 등과 같은 핵산일 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 지질 입자는 본 발명의 양이온성 지질, 중성 지질 및 스테롤을 포함한다. 지질 입자는 활성제, 예컨대, 핵산을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 본 발명의 지질 입자 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.
또 다른 실시형태는 대상체에서 핵산 분자를 전달하는 방법이며, 해당 방법은 핵산 분자 및 양이온성 지질(또는 그의 염)을 포함하는 지질 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 해당 양이온성 지질은
(i) 중심 탄소 원자,
(ii) 상기 중심 원자에 직접 결합된 질소 함유 헤드기, 및
(iii) 상기 중심 탄소 원자에 직접 결합된 2개의 소수성 테일을 포함하되,
각 소수성 테일은 상기 중심 탄소 원자에 부착된 C8 이상의 지방족 기(바람직하게는 C14 혹은 그 이상의 지방족 기)를 포함하고, 상기 지방족 기(들) 중 한쪽 혹은 양쪽은 (a) 생분해성 기와 상기 중심 탄소 원자 사이에 적어도 4개의 탄소 원자의 사슬이 있도록 당해 생분해성 기에 의해 중단되거나, 또는 (b) 상기 소수성 테일의 말단부에 생분해성 기를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 양이온성 지질은 소수성 테일의 절단이 생체내에서 일어난 후에 상기 핵산 분자의 전달 시까지 온전히 유지된다.
또 다른 양상은 본 발명의 지질 입자를 세포에 제공함으로써 세포 내 표적 유전자의 발현을 조절하는 방법이다. 활성제는 플라스미드, 면역자극 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 마이크로RNA, 안타고미어, 압타머 및 리보자임으로부터 선택된 핵산일 수 있다.
또 다른 양상은 본 발명의 약제학적 조성물을 대상체에게 제공함으로써 대상체 내 폴리펩타이드의 과발현(overexpression)을 특징으로 하는 질환 혹은 장애를 치료하는 방법이며, 여기서 활성제는 폴리펩타이드 또는 그의 보체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
또 다른 양상은 약제학적 조성물을 대상체에게 제공함으로써 대상체 내 폴리펩타이드의 소발현(underexpression)을 특징으로 하는 질환 혹은 장애를 치료하는 방법이며, 여기서 활성제는 상기 폴리펩타이드 또는 그의 기능성 변이체(functional variant) 혹은 단편을 인코딩하는 플라스미드이다.
또 다른 양상은 약제학적 조성물을 대상체에게 제공함으로써 대상체에서 면역 반응을 유도시키는 방법이며, 여기서 활성제는 면역자극 올리고뉴클레오타이드이다.
또 다른 양상은 전술한 조성물 혹은 지질 입자를 포함하는 치료제이며, 여기서, 상기 조성물 혹은 지질 입자는 핵산을 포함한다. 상기 제제는, 세포와 접촉될 경우, 세포에 핵산을 효율적으로 전달할 수 있다. 또 다른 양상은, 전술한 조성물 혹은 지질 입자를 얻거나 형성하고, 해당 조성물 혹은 지질 입자를 세포와 접촉시킴으로써, 세포의 내부에 핵산을 전달하는 방법이다.
기타 특성 및 양상은 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 특허청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1은, 실시예 14에 기재된 바와 같은 지질 입자 중의 양이온성 지질의 투여 후, 시간 경과에 따른 마우스의 간 내의 양이온성 지질(화합물 1 내지 3 및 기준 지질)의 농도의 그래프;
도 2는 실시예 14의 화합물 1 및 3에 대한 연관된 대사 경로를 도시한 도면;
도 3은, 실시예 14에 기재된 바와 같은 지질 입자 내의 양이온성 지질의 투여 후, 시간 경과에 다른 마우스의 비장 내의 양이온성 지질(화합물 1 내지 3 및 기준 지질)의 농도의 그래프;
도 4는, 실시예 14에 기재된 바와 같은 지질 입자 내의 양이온성 지질의 투여 후, 시간 경과에 다른 마우스의 혈장 내의 양이온성 지질(화합물 1 내지 3 및 기준 지질)의 농도의 그래프.
일 양상에 있어서, 본 발명은 중성 지질, 응집을 저감시킬 수 있는 지질, 양이온성 지질 및 임의선택적으로 스테롤을 포함하는 지질 입자에 관한 것이다. 소정의 실시형태에 있어서, 지질 입자는 활성제(예컨대, 치료제)를 더 포함한다. 이들 지질, 지질 입자, 및 이들을 포함하는 조성물, 그리고 치료제를 전달하고 유전자 및 단백질 발현을 조절하기 위한 그들의 용도의 각종 예시적인 실시형태는 이하에 더욱 상세히 기재된다.
양이온성 지질
일 실시형태에 있어서, 양이온성 지질은 화학식 I 내지 XXIII의 화합물이다. 다른 실시형태에 있어서, 양이온성 지질은 화학식 II 내지 XXIII 중 하나의 화합물이다. 일 실시형태에 있어서, 양이온성 지질은 화학식 I의 화합물이다. 다른 실시형태에 있어서, 양이온성 지질은 화학식 IA-1, IA-2, IB, IC 혹은 ID의 화합물이다. 이하의 개시는 화학식 I의 화합물의 각종 실시형태를 나타낸다.
일 실시형태에 있어서, M1 및 M2는 각각 독립적으로
-OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -S-S-, -C(R5)=N-, -N=C(R5)-, -C(R5)=N-O-, -O-N=C(R5)-, -C(O)(NR5)-, -N(R5)C(O)-, -C(S)(NR5)-, -N(R5)C(O)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -CC(O)O-, -OSi(R5)2O-, -C(O)(CR3R4)C(O)O- 또는 -OC(O)(CR3R4)C(O)-이다.
다른 실시형태에 있어서, M1 및 M2는 각각 독립적으로:
-OC(O)-, -C(O)-O-, -C(R5)=N-, -N=C(R5)-, -C(R5)=N-O-, -O-N=C(R5)-, -O-C(O)O-, -C(O)N(R5)-, -N(R5)C(O)-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(S)O-,-OC(S)-, -OSi(R5)2O-, -C(O)(CR3R4)C(O)O- 또는 -OC(O)(CR3R4)C(O)-이다.
또 다른 실시형태에 있어서, M1 및 M2는 각각 독립적으로:
-C(O)-O-, -OC(O)-, -C(R5)=N-, -C(R5)=N-O-, -O-C(O)O-, -C(O)N(R5)-, -C(O)S-, -C(S)O-, -OSi(R5)2O-, -C(O)(CR3R4)C(O)O- 또는 -OC(O)(CR3R4)C(O)-이다.
다른 실시형태에 있어서, M1 및 M2는 각각 -C(O)O-이다.
일 실시형태에 있어서, R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 임의선택적으로 치환된 알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬 혹은 복소환이다. 일 실시형태에 있어서, R1은 알킬이고, R2는 알킬, 사이클로알킬 혹은 사이클로알킬알킬이다. 일 실시형태에 있어서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 알킬(예컨대, C1-C4 알킬, 예컨대, 메틸, 에틸 혹은 아이소프로필)이다. 일 실시형태에 있어서, R1 및 R2는 둘 모두 메틸이다. 다른 실시형태에 있어서, R1과 R2는, 이들이 부착되는 질소 원자와 함께, 임의선택적으로 치환된 복소환 고리(예컨대, N-메틸피페라지닐)를 형성한다. 다른 실시형태에 있어서, R1과 R2 중 한쪽은
Figure 112013000350703-pct00035
이다(예컨대, R1은 2개의 상기 기 중 하나이고, R2는 수소이다).
일 실시형태에 있어서, R'는 수소 혹은 알킬이다. 다른 실시형태에 있어서, R'는 수소 혹은 메틸이다. 일 실시형태에 있어서, R'는 존재하지 않는다. 일 실시형태에 있어서, R'는 존재하지 않거나, 메틸이다.
R'가 존재하지 않는 화합물에 대해서, R'가 부착되는 질소 원자는 양전하를 지니고, 상기 화합물은 또한 음으로 하전된 대응 이온을 포함한다. 해당 상대이온은 임의의 음이온, 예컨대, 유기 혹은 무기 음이온일 수 있다. 음이온의 적절한 예로는, 토실레이트, 메탄설포네이트, 아세테이트, 시트레이트, 말로네이트, 타트레이트, 숙시네이트, 벤조에이트, 아스코베이트, α-케토글루타레이트, α-글라이세로포스페이트, 할라이드(예컨대, 염소), 설페이트, 나이트레이트, 바이카보네이트 및 카보네이트를 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 일 실시형태에 있어서, 상대이온은 할라이드(예컨대, Cl)이다.
일 실시형태에 있어서, 각 R은 독립적으로 -(CR3R4)-이고, 여기서 R3 및 R4는 각각 독립적으로 H 또는 알킬(예컨대, C1-C4 알킬)이다. 예를 들어, 일 실시형태에 있어서, 각 R은 독립적으로 -(CHR4)-이고, 여기서 각 R4는 독립적으로 H 또는 알킬(예컨대, C1-C4 알킬)이다. 다른 실시형태에 있어서, 각 R은 독립적으로 -CH2-, -C(CH3)2- 또는 -CH(iPr)-(여기서 iPr은 아이소프로필임)이다. 다른 실시형태에 있어서, 각각의 R은 -CH2-이다.
다른 실시형태에 있어서 R5는, 각 경우에, 수소 또는 메틸이다. 예를 들어, R5는, 각 경우에, 수소일 수 있다.
일 실시형태에 있어서, Q는 존재하지 않거나, 또는 -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R4)-, -N(R5)C(O)-, -S-S-, -OC(O)O-, -C(R5)=N-O-, -OC(O)N(R5)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -N(R5)C(O)O-, -C(O)S-, -C(S)O- 또는 -C(R5)=N-O-C(O)-이다. 일 실시형태에 있어서, Q는-C(O)O-이다.
일 실시형태에 있어서, Q1 및 Q2는 각각 독립적으로 존재하지 않거나 또는 -O-이다. 예를 들어, 일 실시형태에 있어서, Q1 및 Q2는 각각 존재하지 않는다. 다른 실시형태에 있어서, Q1 및 Q2는 각각 -O-이다.
일 실시형태에 있어서, Q에 대한 파선은 존재하지 않고, b는 0이고, R'R1R2N-(R)a-Q- 및 이에 인접하는 3차 탄소(C*)는 이하의 기를 형성한다:
Figure 112013000350703-pct00036
식 중, n은 1 내지 4(예컨대, n은 2)이다.
일 실시형태에 있어서, Q에 대한 파선은 존재하지 않고, b는 0이며, R'R1R2N-(R)a-Q- 및 이에 인접한 3차 탄소는 이하의 기를 형성한다:
Figure 112013000350703-pct00037
식 중, n은 1 내지 4(예컨대, n은 2)이고, R1, R2, R, a 및 b는 화학식 I에 대해서 정의된 바와 같다. 일 실시형태에 있어서, a는 3이다.
일 실시형태에 있어서, Q에 대한 파선은 존재하지 않고, b는 0이며, R'R1R2N-(R)a-Q- 및 이에 인접한 3차 탄소는 이하의 기를 형성한다:
Figure 112013000350703-pct00038
식 중, n은 1 내지 4(예컨대, n은 2)이고, R1, R2, R, a 및 b는 화학식 I에 대해서 정의된 바와 같다. 일 실시형태에 있어서, a는 0이다. 예를 들어, 상기 기는 이하의 것일 수 있다:
Figure 112013000350703-pct00039
.
일 실시형태에 있어서, b는 0이다. 다른 실시형태에 있어서, a는 2, 3 또는 4이고, b는 0이다. 예를 들어, 일 실시형태에 있어서, a는 3이고, b는 0이다. 다른 실시형태에 있어서, a는 3이고, b는 0이며, Q는 -C(O)O-이다.
일 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물은 이하의 서브화학식 IF이다:
[화학식 IF]
Figure 112013000350703-pct00040
식 중, R, R', R1, R2, A1, A2, A3, A4, Q1, Q2, Q3, Q4, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, n, o, p, q 및 r은 본 명세서에 개시된 실시형태들의 어느 하나에서 정의된 바와 같다.
화학식 IF의 화합물의 추가의 실시형태에 있어서, 이하의 (i) 내지 (xvii) 중 하나 이상이 적용된다:
(i) Q1 및 Q2는 존재하지 않음;
(ii) M1 및 M2는 양쪽 모두 -C(O)O-임;
(iii) g 및 h는 둘 모두 1임;
(iv) g 및 h는 둘 모두 0임;
(v) c 및 e는 전부 합해서 7임;
(vi) d 및 f는 전부 합해서 7임;
(vii) c, e 및 i는 전부 합해서 7임;
(viii) d, f 및 j는 전부 합해서 7임;
(ix) i 및 j는 각각 7임;
(x) k 및 l은 둘 모두 1임;
(xi) m 및 n은 둘 모두 0임;
(xii) m 및 q는 전부 합해서 1이거나 또는 m 및 q는 전부 합해서 2임;
(xiii) m 및 l은 전부 합해서 6임;
(xiv) r 및 n은 전부 합해서 6임;
(xv) p 및 o는 둘 모두 0임;
(xvi) n 및 r는 전부 합해서 2이거나 또는 n 및 r은 전부 합해서 1임; 및
(xvii) Q3은 H임.
소정의 실시형태에서, 양이온성 지질 내에 존재하는 생분해성 기는 에스터(예컨대, -C(O)O- 또는 -OC(O)-), 다이설파이드(-S-S-), 옥심(예컨대, -C(H)=N-O- 또는 O-N=C(H)-), -C(O)-O-, -OC(O)-, -C(R5)=N-, -N=C(R5)-, -C(R5)=N-O-, -O-N=C(R5)-, -O-C(O)O-, -C(O)N(R5), -N(R5)C(O)-, -C(S)(NR5)-, (NR5)C(S)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(S)O-,-OC(S)-, -OSi(R5)2O-, -C(O)(CR3R4)C(O)O- 혹은 -OC(O)(CR3R4)C(O)-로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 양이온성 지질의 소수성 테일들 중 한쪽 혹은 양쪽의 지방족 기는 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 포함한다.
본 발명의 양이온성 지질(화학식 I, IA-2, ID, IE 및 IF의 화합물을 포함함)에 대한 적절한 콜레스테롤 부분은 하기 화학식을 지닌다:
Figure 112013000350703-pct00041
.
추가의 실시형태는 헤드기, 하나 이상의 소수성 테일, 및 상기 헤드기와 하나 이상의 테일기 사이에 있는 링커를 구비한 양이온성 지질을 포함한다. 헤드기는 아민; 예를 들어 목적으로 하는 pKa를 지니는 아민을 포함할 수 있다. pKa는 지질의 구조, 특히 헤드기의 속성; 예컨대, 음이온성 작용기, 수소 결합 주개(donor) 작용기, 수소 결합 받개(acceptor)기, 소수성 기(예컨대, 지방족 기), 친수성 기(예컨대, 하이드록실 혹은 메톡시) 또는 아릴기 등과 같은 작용기의 존재 유무 및 위치에 의해 영향받을 수 있다. 헤드기 아민은 양이온성 아민; 1차, 2차 혹은 3차 아민일 수 있고; 헤드기는 아민기(모노아민), 2개의 아민기(다이아민), 3개의 아민기(트라이아민), 또는 올리고아민 혹은 폴리아민에서와 같은 보다 큰 수의 아민기를 포함할 수 있다. 헤드기는 아민보다 덜 강한 염기성인 작용기, 예를 들어, 이미다졸, 피리딘 혹은 구아니디늄기를 포함할 수 있다. 헤드기는 쯔비터이온성일 수 있다. 기타 헤드기도 또한 적합하다.
하나 이상의 소수성 테일은 2개의 소수성 사슬을 포함할 수 있으며, 이들 은 동일 혹은 상이할 수 있다. 테일들은 지방족일 수 있고, 예를 들어, 이들은 방향족 고리는 없지만 포화 혹은 불포화된, 탄소와 수소로 구성될 수 있다. 테일은 지방산 테일일 수 있다. 몇몇 이러한 기는 옥타닐, 노나닐, 데실, 라우릴, 미리스틸, 팔미틸, 스테아릴, α-리놀레일, 스테아리도닐, 리놀레일, γ-리놀레닐, 아라키도닐 및 올레일을 포함한다. 기타 소수성 테일도 또한 적합하다.
링커로는, 예를 들어, 글라이세라이드 링커, 비환식 글라이세라이드 유사체링커, 또는 환식 링커(스피로 링커, 이환식 링커 및 다환식 링커를 포함함)를 들 수 있다. 링커는 에터, 에스터, 포스페이트, 포스포네이트, 포스포로티오에이트, 설포네이트, 다이설파이드, 아세탈, 케탈, 이민, 하이드라존 혹은 옥심 등과 같은 작용기를 포함할 수 있다. 기타 링커 및 작용기도 또한 적합하다.
일 실시형태에 있어서, 양이온성 지질은 라세미 혼합물이다. 다른 실시형태에 있어서, 양이온성 지질은 하나의 부분입체이성질체 중에서 풍부하며, 예컨대, 양이온성 지질은 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 80% 혹은 적어도 70% 부분입체이성질체 과잉률을 지닌다. 또 다른 실시형태에 있어서, 양이온성 지질은 하나의 거울상이성질체 중에서 풍부하며, 예컨대, 지질은 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 80% 혹은 적어도 70% 거울상이성질체 과잉률을 지닌다. 또 다른 실시형태에 있어서, 양이온성 지질은 비대칭적으로(chirally) 순수하고, 예컨대, 단일의 광학적 이성질체이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 양이온성 지질은 하나의 광학 이성질체에 대해서 풍부하다.
이중 결합(예컨대, 탄소-탄소 이중 결합 혹은 탄소-질소 이중 결합)이 존재한다면, 해당 이중 결합에 대한 입체 형태에 있어서의 이성질성(즉, 시스/트랜스 혹은 E/Z 이성질성)이 있을 수 있다. 이중 결합의 입체 형태가 화학 구조에 예시된 경우, 대응하는 이성질체가 또한 존재하는 것이 이해된다. 존재하는 이성질체의 양은, 이성질체의 상대 안정성 및 이성질체들 간에 전환되는 데 요구되는 에너지에 따라서 다양할 수 있다. 따라서, 몇몇 이중 결합은, 실제 목적을 위하여, 단일 입체 형태만으로 존재하는 한편, 다른 것(예컨대, 상대 안정성이 유사하고 전환 에너지가 낮은 경우)은 입체 형태의 분리불가능한 평형 혼합물로서 존재할 수 있다.
몇몇 경우에, 이중 결합된 불포화 부분은 환식 불포화 부분으로 대체될 수 있다. 환식 불포화부분은 지환식 불포화부분, 예컨대, 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸 혹은 사이클로옥틸기일 수 있다. 몇몇 경우에, 환식 기는 다환식 기, 예컨대, 이환식 기 혹은 삼환식 기일 수 있다. 이환식 기는 가교되거나, 융합되거나 혹은 스피로 구조를 지닐 수 있다.
몇몇 경우에, 이중 결합 부분은 사이클로프로필 부분으로 대체될 수 있고, 예컨대,
Figure 112013000350703-pct00042
는
Figure 112013000350703-pct00043
로 대체될 수 있다. 예를 들어, 이하에 표시된 부분은 2개의 탄소-탄소 이중 결합을 지니며, 이들은 각각 독립적으로 환식 부분, 예컨대, 사이클로프로필 부분으로 대체될 수 있다. 이와 같이 해서,
Figure 112013000350703-pct00044
에 대한 치환체는
Figure 112013000350703-pct00045
를 포함할 수 있다.
추가의 예에 대해서,
Figure 112013000350703-pct00046
에 대한 치환체는
Figure 112013000350703-pct00047
를 포함한다.
추가의 예에 대해서,
Figure 112013000350703-pct00048
에 대한 치환체는
Figure 112013000350703-pct00049
를 포함한다.
추가의 예에 대해서,
Figure 112013000350703-pct00050
에 대한 치환체는
Figure 112013000350703-pct00051
를 포함한다.
양이온성 지질은 하나 이상의 생분해성 기를 포함한다. 생분해성 기(들)는 생물학적 환경에서, 예컨대, 유기체, 기관, 조직, 세포 혹은 세포기관 내에서 결합 파괴 반응을 받을 수 있는 하나 이상의 결합을 포함한다. 생분해성 결합을 포함하는 작용기는, 예를 들어, 에스터, 다이티올 및 옥심을 포함한다. 생분해성은 대상체에게 투여된 경우 신체로부터 화합물의 청소(clearance)에 영향을 미치는 인자일 수 있다. 생분해성은 세포기반 분석법에서 측정될 수 있고, 여기서, 양이온성 지질을 포함하는 제형은 세포에 노출되고, 샘플이 각종 시점에서 채취된다. 지질 분획은 세포로부터 추출되고 분리되어 LC-MS에 의해 분석된다. LC-MS 데이터로부터, (예컨대, t1/2 값으로서의) 생분해성 속도가 측정될 수 있다.
예를 들어, 화합물:
Figure 112013000350703-pct00052
은 각 지방족 사슬 내의 에스터 결합을 포함하며, 이는, 예를 들어, 생물학적 환경에서, 예컨대, 리파제 혹은 에스테라제에 노출될 경우 가수분해를 받을 수 있다. 물론 화합물의 구조는 해당 화합물이 생분해를 받게 되는 속도에 영향을 미친다. 이와 같이 해서,
Figure 112013000350703-pct00053
등과 같은 관련된 화합물은 상이한 생분해 속도를 발휘할 것으로 예상된다. 그 속도에 대한 보다 큰 작용은 가수분해 부위에서 화합물의 구조의 변화로부터 예상될 것이다. 가수분해 속도에 영향을 미칠 수 있고 따라서 생분해 속도와 대상체 신체로부터의 청소에 영향을 미치는 하나의 변형은 가수분해 반응의 이탈기가 2차 알코올보다 1차 알코올을 지니게 한다.
예를 들어, 이론에 얽매이길 원치 않지만, 위에 표시된 화합물 1 및 2는 도 2에 도시된 바와 같이 대사될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 실시형태들 중의 어느 하나의 양이온성 지질은 약 3시간 미만, 예컨대, 약 2.5시간 미만, 약 2시간 미만, 약 1.5시간 미만, 약 1시간 미만, 약 0.5시간 미만 혹은 약 0.25시간 미만의 생체내(예컨대, 간, 비장 혹은 혈장 내) 반감기(t1/2)를 지닌다.
다른 실시형태에 있어서, 생분해성 기 혹은 기들을 함유하는 본 명세서에 기재된 실시형태들 중의 어느 하나의 양이온성 지질은 상기 생분해성 기 혹은 기들이 없는 동일한 양이온성 지질에 대한 생체내 반감기보다 약 10% 미만(예컨대, 약 7.5% 미만, 약 5% 미만, 약 2.5% 미만)의 생체내(예컨대, 간, 비장 혹은 혈장 내) 반감기(t1/2)를 지닌다.
몇몇 양이온성 지질은 헤드기에 조합된 소수성 기로서 편리하게 표현될 수 있다. 예로서, 화합물:
Figure 112013000350703-pct00054
은 다음과 같은 헤드기와 소수성기의 조합인 것으로 여겨질 수 있다:
Figure 112013000350703-pct00055
.
이와 같이 해서, 몇몇 적절한 헤드기는 이하의 표 1에 표시된 것들을 포함한다:
Figure 112013000350703-pct00056
Figure 112013000350703-pct00057
Figure 112013000350703-pct00058
몇몇 적절한 소수성 테일기는 표 2에 도시된 것을 포함한다:
Figure 112013000350703-pct00059
Figure 112013000350703-pct00060
다른 양상에 있어서, 본 발명은 화학식 I 내지 XXIII 중 어느 하나의 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 적절한 예시적인 합성 방법은 이하의 반응식 A 내지 G에 예시되어 있다. 이하의 반응식들에 있어서의 변수는 상기 화학식 I 내지 XXIII 내의 동일 위치에 있는 변수들과 동일하다.
반응식 A
Figure 112013000350703-pct00061
반응식 A 중의 지질 사슬 길이 및 링커 길이는 변화될 수 있다. 또한, 질소 원자 상의 에스터 작용기 및 치환체 중의 R기는 유도체화될 수 있다.
반응식 B
Figure 112013000350703-pct00062
반응식 B에 표시된 바와 같이, 구리-매개 커플링은 말단 작용기 R을 지니는 다이엔 함유 지질 사슬을 제공하며, 상기 작용기는 다이엔 함유 지질 사슬을 생성하도록 환원될 수 있다. 링커 및 지질 사슬의 길이는 변화될 수 있고, 작용성 치환기(R, R1, R2)는 유도체화될 수 있다.
반응식 C
Figure 112013000350703-pct00063
식 중, Rx는 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴 또는 치환된 아릴이고, 헤드기는 표 1에 정의되어 있다.
반응식 C에 있어서의 헤드기는 본 명세서에 개시된 임의의 헤드기일 수 있다(예컨대, 표 1 참조).
반응식 D
Figure 112013000350703-pct00064
반응식 E
Figure 112013000350703-pct00065
반응식 F
Figure 112013000350703-pct00066
반응식 G
Figure 112013000350703-pct00067
본 발명의 양이온성 지질의 예는 이하의 표 3 내지 13에 표시된 것, 및 그의 염(그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함함)을 포함한다.
Figure 112013000350703-pct00068
Figure 112013000350703-pct00069
Figure 112013000350703-pct00070
Figure 112013000350703-pct00071
Figure 112013000350703-pct00072
Figure 112013000350703-pct00073
Figure 112013000350703-pct00074
Figure 112013000350703-pct00075
Figure 112013000350703-pct00076
Figure 112013000350703-pct00077
Figure 112013000350703-pct00078
Figure 112013000350703-pct00079
Figure 112013000350703-pct00080
Figure 112013000350703-pct00081
Figure 112013000350703-pct00082
Figure 112013000350703-pct00083
Figure 112013000350703-pct00084
Figure 112013000350703-pct00085
Figure 112013000350703-pct00086
Figure 112013000350703-pct00087
Figure 112013000350703-pct00088
Figure 112013000350703-pct00089
Figure 112013000350703-pct00090
Figure 112013000350703-pct00091
Figure 112013000350703-pct00092
Figure 112013000350703-pct00093
Figure 112013000350703-pct00094
Figure 112013000350703-pct00095
Figure 112013000350703-pct00096
Figure 112013000350703-pct00097
Figure 112013000350703-pct00098
Figure 112013000350703-pct00099
Figure 112013000350703-pct00100
Figure 112013000350703-pct00101
Figure 112013000350703-pct00102
Figure 112013000350703-pct00103
Figure 112013000350703-pct00104
Figure 112013000350703-pct00105
Figure 112013000350703-pct00106
Figure 112013000350703-pct00107
Figure 112013000350703-pct00108
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 양이온성 지질은 이하의 화합물 및 그의 염(그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함함)으로부터 선택된다:
Figure 112013000350703-pct00109
양이온성 지질은 알킬 치환체가 상이한 것(예를 들어, N-에틸-N-메틸아미노-, N-프로필-N-에틸아미노- 등)을 포함하는 또 다른 지방산 기 또는 다른 다이알킬아미노 기를 포함한다. R1 및 R2가 둘 다 장쇄 알킬, 알케닐, 알키닐, 또는 사이클로알킬알킬 기인 실시형태에 대해, 이들은 동일하거나 상이할 수 있다. 일반적으로, 여과멸균의 목적을 위하여 덜 포화된 아실 쇄를 가지는 지질(예를 들어, 양이온성 지질)은, 특히 복합체가 약 0.3 마이크론 미만의 크기일 때 더 용이한 크기로 된다. C10 내지 C20의 범위에 있는 탄소 쇄 길이를 갖는 불포화 지방산을 함유하는 양이온성 지질이 전형적이다. 아미노기(예를 들어, 양이온성 지질의 아미노기) 및 지방산 또는 양이온성 지질의 지방 알킬 부분을 분리하기 위하여 다른 스캐폴드가 또한 사용될 수 있다. 적합한 스캐폴드는 당업자에게 공지되어 있다.
특정 실시형태에서, 양이온성 지질은 적어도 하나의 양성자성 또는 탈양성자성 기를 가지며, 해당 지질은 생리적 pH(예를 들어, pH 7.4)에서 또는 그 미만에서 양으로 하전되고, 제2 pH에서, 바람직하게는 생리적 pH 초과에서 중성이다. 이러한 지질은 또한 양이온성 지질로 언급된다. 물론 pH의 작용으로서 양성자의 추가 또는 제거는 평형상태 과정이며, 하전되거나 중성인 지질에 대한 언급은 우세한 종의 특성에 관한 것이며, 모든 지질이 하전되거나 중성인 형태로 존재할 필요는 없다는 것이 이해될 것이다. 지질은 하나 이상의 양성자성 또는 탈양성자성 기를 가질 수 있으며, 또는 양쪽성 이온일 수 있다.
특정 실시형태에서, 양성자성 지질(즉, 양이온성 지질)은 약 4 내지 약 11의 범위 내에서 양성자성기의 pKa를 가진다. 전형적으로, 지질은 지질 입자 내에 포함될 때 약 4 내지 약 7, 예를 들어 약 5 내지 7, 예컨대 약 5.5 내지 6.8의 pKa를 가질 것이다. 이러한 지질은 더 낮은 pH 제형화 단계에서 양이온성인 반면, 입자는 pH 7.4 주변의 생리적 pH에서 크게(완전하지는 않지만) 중성화된 표면일 것이다. 약 4 내지 7의 범위에 있는 pKa의 이점 중 하나는 입자의 외표면과 결합된 적어도 일부의 핵산이 생리적 pH에서 그것의 정전기적 상호작용을 상실하며, 단순한 투석에 의해 제거되고; 따라서 클리어런스에 대한 입자의 민감성을 크게 감소시킨다는 것이다. 지질 입자 내 지질의 pKa 측정은, 예를 들어 전문이 참조로 포함되는 문헌[Cullis et al., (1986) Chem Phys Lipid 40, 127-144]에 기재된 방법을 사용하여 형광 프로브 2-(p-톨루이디노)-6-나프탈렌 설폰산(TNS)을 사용함으로써 수행될 수 있다.
특정 실시형태에서, 지질은 하전된 지질이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "하전된 지질"은 1 또는 2개의 지방 아실 또는 지방 알킬쇄 및 4가의 아미노 헤드 기를 가지는 지질을 포함하는 것을 의미한다. 4차의 아민은 영구적인 양전하를 운반한다. 헤드 기는 선택적으로 이온화가능한 기, 예컨대 생리적 pH에서 양성자화될 수 있는 1차, 2차 또는 3차 아민을 포함할 수 있다. 4차 아민의 존재는 4차 아민이 없는 구조적으로 유사한 화합물 내 기의 pKa에 비례하여 이온화가능한 기의 pKa를 변경할 수 있다(예를 들어, 4차 아민은 3차 아민으로 대체된다). 일부 실시형태에서, 하전된 지질은 "아미노 지질"로 언급된다. 예를 들어 전문이 참조로 포함된 2009년 12월 7일 출원된 미국 가특허출원 제61/267,419호를 참조한다.
상기에 구체적으로 기재된 것에 더하여 대략 생리적 pH에서 순 양전하를 운반하는 하나 이상의 추가적인 양이온성 지질은 또한 지질 입자 및 본 명세서에 기재된 조성물에 포함될 수 있다. 이러한 양이온성 지질은, 이에 제한되는 것은 아니지만, N,N-다이올레일-N,N-다이메틸암모늄 클로라이드("DODAC"); N-(2,3-다이올레일옥시)프로필-N,N-N-트라이에틸암모늄 클로라이드("DOTMA"); N,N-다이스테아릴-N,N-다이메틸암모늄 브로마이드("DDAB"); N-(2,3-다이올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드("DOTAP"); 1,2-다이올레일옥시-3-트라이메틸아미노프로판 클로라이드 염("DOTAP.Cl"); 3β-(N-(N',N'-다이메틸아미노에탄)-카바모일)콜레스테롤("DC-Chol"), N-(1-(2,3-다이올레일옥시)프로필)-N-2-(스퍼민카복사미도)에틸)-N,N-다이메틸암모늄 트라이플루오로아세테이트("DOSPA"), 다이옥타데실아미도글라이실 카복시스퍼민 ("DOGS"), 1,2-다이레오일-sn-3-포스포에탄올아민 ("DOPE"), 1,2-다이올레오일-3-다이메틸암모늄 프로판 ("DODAP"), N, N-다이메틸-2,3-다이올레일옥시)프로필아민 ("DODMA"), 및 N-(1,2-다이미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-다이메틸-N-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드("DMRIE")를 포함한다. 추가적으로, 양이온성 지질의 다수의 상업적 제제, 예를 들어 LIPOFECTIN(GIBCO/BRL로부터 입수가능한 DOTMA 및 DOPE를 포함), 및 LIPOFECTAMINW(GIBCO/BRL로부터 입수가능한 DOSPA 및 DOPE를 포함)가 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 양이온성 지질은 아미노 지질이다.
중성 지질
본 명세서에 기재되는 지질 입자 및 조성물은 또한 하나 이상의 중성 지질을 포함할 수 있다. 존재한다면, 중성 지질은 생리적 pH에서 비하전 또는 중성 양쪽성 이온 형태 중 하나로 존재하는 다수의 지질 종 중 어떤 것일 수 있다. 이러한 지질은, 예를 들어 다이아실포스파티딜콜린, 다이아실포스파티딜에탄올아민, 세라마이드, 스핑고마이엘린, 다이하이드로스핑고마이엘린, 세팔린, 및 세레브로사이드를 포함한다. 본 명세서에 기재된 입자에서 사용을 위한 중성 지질의 선택은 일반적으로, 예를 들어 리포좀 크기 및 혈류 내 리포좀의 안정성의 고려에 의해 선택된다. 바람직하게는, 중성 지질 성분은 2개의 아실 기(즉, 다이아실포스파티딜콜린 및 다이아실포스파티딜에탄올아민)을 가지는 지질이다. 다양한 쇄 길이 및 포화도의 여러가지 아실 쇄 기를 가지는 지질이 이용가능하며 또는 잘 공지된 기술에 의해 분리되거나 합성될 수 있다. 실시형태의 한 그룹에서, C10 내지 C20 범위에서 탄소 쇄 길이를 갖는 포화 지방산을 함유하는 지질이 바람직하다. 다른 실시형태 그룹에서, C10 내지 C20 범위에서 탄소 쇄 길이를 갖는 단일불포화 또는 이중불포화 지방산을 갖는 지질이 사용된다. 추가적으로, 포화 및 불포화 지방산쇄의 혼합물을 가지는 지질이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 사용된 중성 지질은 DOPE, DSPC, POPC, DPPC 또는 임의의 관련 포스파티딜콜린이다. 중성 지질은 세린 및 이노시톨과 같은 다른 헤드기를 가지는 스핑고마이엘린, 다이하이드로스핑고마이엘린, 또는 인지질로 구성될 수 있다.
응집을 감소시킬 수 있는 지질
본 명세서에 기재된 지질 입자 및 조성물은 또한 응집을 감소시킬 수 있는 하나 이상의 지질을 포함할 수 있다. 형성 동안 입자의 응집을 감소시키는 지질의 예는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)-변형 지질, 모노시알로강글리오사이드(monosialoganglioside) Gm1, 및 폴리아마이드 올리고머(polyamide oligomers, "PAO") 예컨대(전문이 참조로 포함되는 미국특허 제6,320,017호에 기재됨)를 포함한다. PEG, Gm1 또는 ATTA과 같이 형성 동안 응집을 방지하는 비하전, 친수성, 입체 장벽 모이어티 다른 화합물이 또한 지질에 결합될 수 있다. ATTA-지질은, 예를 들어 미국특허 제6,320,017호에 기재되며, PEG-지질 컨쥬게이트는, 예를 들어 미국특허 제5,820,873호, 제5,534,499호 및 제5,885,613호에 기재되며, 이들 각각은 전문이 참조로 포함된다. 전형적으로, 응집을 감소시키기 위해 선택되는 지질 성분의 농도는 약 1% 내지 15%(지질의 몰%로)이다.
지질 베시클의 표면에 PEG 부분을 고정하기 위한 다양한 "앵커링(anchoring)" 지질 부분을 가질 수 있는 PEG-변형 지질(또는 지질-폴리옥시에틸렌 컨쥬게이트)의 구체적 예는 PEG-변형 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티드산, PEG-세라마이드 컨쥬게이트(예를 들어, PEG-CerC14 또는 PEG-CerC20)(본 명세서에 참조로 포함되는 미국특허 제5,820,873호에 기재됨), PEG-변형 다이알킬아민 및 PEG-변형 1,2-다이아실옥시프로판-3-아민을 포함한다. PEG-변형 다이아실글라이세롤 및 다이알킬글라이세롤이 특히 선호된다.
PEG 또는 ATTA와 같은 입체적으로-큰 모이어티가 지질 앵커에 컨쥬게이트되는 실시형태에서, 지질 앵커의 선택은 컨쥬게이트가 지질 입자를 갖도록 하는 결합의 유형에 의존한다. 가능하다면 며칠만에 입자가 순환으로부터 클리어런스될 때까지 mPEG(mw2000)-다이아스테아로일포스파티딜에탄올아민(PEG-DSPE)은 리포좀과 결합한 채로 남는다는 것은 잘 공지되어 있다. PEG-CerC20과 같은 다른 컨쥬게이트는 유사한 체류용량(staying capacity)을 가진다. 그러나, PEG-CerC14는 일부 분석에서 60분 미만의 T1/2를 갖는 혈청에 노출시 제형을 벗어나서 용이하게 교환한다. 미국특허 제5,820,873호에서 설명되는 바와 같이, 적어도 3가지 특성: 아실 쇄의 길이, 아실 쇄의 포화도, 및 입체-장벽 헤드 기의 크기는 교환속도에 영향을 미친다. 이들 특징의 적합한 변형을 가지는 화합물이 유용할 수 있다. 일부 치료적 용도를 위해, PEG-변형 지질이 생체 내 핵산-지질 입자로부터 용이하게 손실되는 것이 바람직할 수 있으며, 따라서 PEG-변형 지질은 상대적으로 짧은 지질 앵커를 소유할 것이다. 다른 치료적 용도에서, 더 긴 혈장 순환을 나타내는 핵산-지질입자가 바람직할 수 있으며, 따라서 PEG-변형 지질은 상대적으로 더 긴 지질 앵커를 소유할 것이다.
응집 방지 화합물은 적절하게 작용하는 지질 컨쥬게이션을 필수적으로 필요로 하지 않는다는 것을 주의하여야 한다. 용액 내 유리 PEG 또는 유리 ATTA는 응집을 방지하기에 충분할 수 있다. 제형화 후 입자가 안정하다면, 피험체에 투여 전 PEG 또는 ATTA가 투석될 수 있다.
지질 입자
추가 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 양이온성 지질을 포함하는 지질 입자에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 지질 입자는 화학식 I 내지 XXIII 중 하나 이상의 화합물을 포함한다. 다른 실시형태에서, 지질 입자는 화학식 II 내지 XXIII 중 하나 이상의 화합물을 포함한다. 다른 실시형태에서, 지질 입자는 화학식 I의 하나 이상의 화합물을 포함한다. 다른 실시형태에서, 지질 입자는 화학식 IA-1, IA-2, IB, IC,ID 또는 IE의 화합물을 포함한다.
지질 입자는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 리포좀을 포함한다. 본 명에서에 사용되는 것과 같은 리포좀은 지질-함유 막이 수성인 내부를 둘러싸는 구조이다. 리포좀은 하나 이상의 지질막을 가질 수 있다. 리포좀은 유니라멜라로 언급되는 단일층, 또는 멀티라멜라로 언급되는 다중층일 수 있다. 핵산과 복합체를 형성할 때, 지질 입자는 또한 리포플렉스(lipoplex)일 수 있는데, 이는 DNA 층 사이에 샌드위치된 양이온성 지질 이중층을 구성한다.
지질 입자는 하나 이상의 추가적인 지질 및/또는 콜레스테롤과 같은 다른 성분을 추가로 포함할 수 있다. 다른 지질은 지질 산화를 방지하는 것 또는 리간드를 리포좀 표면에 부착시키는 것과 같은 다양한 목적을 위하여 리포좀 조성물에 포함될 수 있다. 임의의 다수의 지질은 양친매성, 중성, 양이온성, 및 음이온성 지질을 포함하는 리포좀 내에 존재할 수 있다. 이러한 지질은 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있다.
지질 입자 내에 존재할 수 있는 추가적인 성분은 폴리아마이드 올리고머(예를 들어, 전문이 참조로 포함되는 미국특허 제6,320,017호를 참조), 펩타이드, 단백질, 세정제, 지질-유도체, 예컨대 포스파티딜에탄올아민에 커플링된 PEG 및 세라마이드에 컨쥬게이트된 PEG(전문이 참조로 포함되는 미국특허 제5,885,613호를 참조)와 같은 이중층 안정화 성분을 포함한다.
한 실시형태에서, 지질 입자는 하나 이상의 제2 아미노 지질 또는 양이온성 지질, 중성 지질, 스테롤, 및 형성 동안 전하-유발 응집을 방지하는 입자의 입체적 안정화로부터 초래될 수 있는, 형성 동안 지질 입자의 응집을 감소시키기 위해 선택되는 지질을 포함한다.
지질 입자는 2가지 이상의 양이온성 지질을 포함할 수 있다. 지질은 상이한 유리한 특성에 기여하도록 선택될 수 있다. 예를 들어 아민 pKa, 화학적 안정성, 순환에서 반감기, 조직 내 반감기, 조직 내 순 축적, 또는 지질 입자에서 사용될 수 있는 독성과 같은 특성이 다른 양이온성 지질은 지질 입자에 사용될 수 있다. 특히 양이온성 지질은 혼합된-지질 입자의 특성이 개개 지질의 단일-지질 입자의 특성보다 더 바람직하도록 선택될 수 있다.
양이온성 지질의 순 조직 축적 및 장기간 독성(만약 있다면)은 주어진 제형 내에서 하나의 양이온성 지질을 선택하는 대신 양이온성 지질의 혼합물을 선택함으로써 바람직한 방법으로 조절될 수 있다. 이러한 혼합물은 또한 더 양호한 캡슐화 및/또는 약물의 방출을 제공할 수 있다. 양이온성 지질의 조합은 또한 제형 내 단일체(single entity)와 비교할 때 전신 안정성에 영향을 미칠 수 있다.
한 예에서, 일련의 구조적으로 유사한 화합물은, 예를 들어 범위를 확장하는다양한 pKa 값, 예를 들어 1 미만의 pKa 단위, 1 내지 2 pKa 단위, 또는 2 초과 범위의 pKa 단위를 가질 수 있다. 연속해서, 범위의 중간에 있는 pKa는 범위의 마지막에 대한 pKa 값을 가지는 화합물과 비교하여 유리한 특성의 향상(더 큰 유효성) 또는 불리한 특성의 감소(예를 들어, 감소된 독성)와 관련된다. 이러한 경우에, 범위의 정반대의 마지막에 대한 pKa 값을 가지는 2(또는 그 이상)의 상이한 화합물은 지질 입자 내에서 함께 사용하기 위해 선택될 수 있다. 이 방법에서, 지질 입자의 순 특성(예를 들어 국소 pH의 작용으로서 전하)은 범위 중간으로부터의 하나의 지질을 포함하는 입자의 순 특성과 더 가까울 수 있다. 구조적으로 유사하지 않은 양이온성 지질(예를 들어, 상기 언급한 일련의 구조적으로 유사한 화합물의 부분이 아님)은 혼합된-지질 입자에서 사용될 수 있다.
일부 경우에 2이상의 상이한 양이온성 지질은, 예를 들어 3 이상의 pKa 단위로 차이가 나는 크게 상이한 pKa 값을 가질 수 있다. 이 경우에, 혼합된 지질 입자의 순 거동은 중간 pKa를 가지는 단일-지질 입자의 순 거동을 필수적으로 모방하지 않을 것이다. 오히려, 순 거동은 상이한 pKa 값을 갖는 2개의 별개의 양성자성(또는 경우에 따라 탈양성자성) 부위를 가지는 입자의 순 거동일 수 있다. 단일 지질의 경우에, 실제로 양성자화되는 양성자성 부위의 분획은 pKa 미만으로부터 pKa 초과로 이동하는 pH로 급격히 변화한다(pH가 pKa 값과 동일할 때, 부위의 50%가 양성자화된다). 지질 입자 내에서 조합된 2 이상의 상이한 양이온성 지질이 크게 다른 pKa 값을 가질 때(예를 들어 3개 이상의 pKa 단위에 의해 다름), 지질 입자는 pH가 변함에 따라 비양성자화에서 양성자화로 더 점진적인 전이를 나타낼 수 있다.
다른 예에서, 다른 고려사항을 기반으로 2 이상의 지질이 선택될 수 있다. 예를 들어 하나의 지질 그 자체가 매우 효과적이지만 적당히 독성이라면, 이는 덜 효과적이지만 비독성인 지질과 조합될 수 있다. 일부 경우에, 조합이 단지 적당히 효과적이지만 단지 약간 덜 독성인 것으로 예측될 수 있는 경우 조차도, 조합은 매우 효과적으로 남을 수 있지만, 독성을 크게 감소시킬 수 있었다.
선택은 실험적으로 결정가능한 특징, 예를 들어 실험 결과로부터 수치적 값이 부여될 수 있는 특징의 측정 값에 의해 인도될 수 있다. 실험적으로 결정가능한 특징은 안전성의 측정, 효율의 측정, 사전결정된 생체분자와 상호작용의 측정, 또는 pKa를 포함할 수 있다.
안전성 측정은 생존률, LD50, 또는 조직 손상과 관련된 바이오마커(예컨대 혈청 바이오마커)의 수준(예를 들어, 간에 대해 간 효소; 근육에 대해 CPK; 신장에 대해 이온 균형)을 포함할 수 있다. 효능의 측정은 치료제가 효과를 생성하는지 여부; 특히 질병, 장애 또는 다른 임상적 상태를 치료하고, 방지하며, 호전시키거나 달리 개선시키는 것과 같은 원하는 효과를 생성하는지 여부 및/또는 그 정도를 표시하는 어떤 측정일 수 있다. 효능의 측정은 간접적 측정; 예를 들어 치료제가 세포 수준에서 특정 효과를 생성하도록 의도되는지 여부일 수 있으며, 세포 배양물 상에서 그 효과의 측정은 효능의 측정일 수 있다. 사전결정된 생체분자와 상호작용의 측정은 특정 단백질에 결합에 대한 Kd, 또는 세포막, 엔도솜 막, 핵막 등과 같은 세포 하부구조를 포함하는 다른 지질과 상호작용의 특징, 수준 또는 정도의 측정을 포함할 수 있다.
양이온성 지질은 작용 메커니즘, 예를 들어 어떤 상태 하에 있는지 여부, 지질이 사전결정된 생체분자와 상호작용하는 정도를 기준으로 선택될 수 있다. 예를 들어, 제1 양이온성 지질은 그것이 ApoE-의존적 메커니즘과 관련있기 때문에 부분적으로 선택될 수 있으며; 제2 양이온성 지질은 그것이 ApoE-의존적 메커니즘과 관련 있기 때문에 부분적으로 선택될 수 있다.
예를 들어, 지질 입자는 또한, 예를 들어 WO 2009/086558, 및 2008년 10월 9일 출원된 미국 가특허 출원 제61/104,219호(이들 각각은 그것의 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 양이온성 지질의 혼합물, 및 이것의 에스터 유사체를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 지질 입자는 지질의 혼합물, 예를 들어 2010년 1월 29일에 출원된 PCT/US10/22614에 기재된 지질 A 및 예를 들어 2009년 5월 5일 출원된 미국 가특허 출원 제61/175,770호에 기재된 화학식 V 또는 화학식 VI의 지질을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 세포 유형 또는 조직에 특이적인 표적화 모이어티를 사용하여 지질 입자를 표적화하는 것은 바람직하다. 다양한 표적화 모이어티, 예컨대 리간드, 세포 표면 수용체, 글라이코단백질, 비타민(예를 들어, 리보플라빈) 및 단일클론 항체를 사용하여 지질 입자를 표적화하는 것은 앞서 기재되었다(예를 들어, 미국특허 제4,957,773호 및 제4,603,044호를 참조하며, 이들 각각은 그것의 전문이 참조로 포함된다). 표적화 모이어티는 전체 단백질 또는 그것의 단편을 포함할 수 있다. 표적화 메커니즘은 일반적으로 표적 모이어티가 표적, 예를 들어 세포 표면 수용체와 상호작용할 수 있는 방식으로 표적화제가 지질 입자의 표면 상에 위치되는 것을 필요로 한다. 다양한 상이한 표적화제 및 방법이 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Sapra, P. and Allen, TM, Prog. Lipid Res. 42(5):439-62 (2003); 및 Abra, RM et al., J. Liposome Res. 12:1-3, (2002)]에 기재된 것을 포함하여 당업계에서 이용가능하다.
표적화를 위해 폴리 에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol, PEG) 쇄와 같은 친수성 폴리머 쇄의 표면 코팅에 의한 지질 입자, 즉, 리포좀의 사용이 제안되었다(Allen, et al., Biochimica et Biophysica Acta 1237: 99-108 (1995); DeFrees, et al., Journal of the American Chemistry Society 118: 6101-6104 (1996); Blume, et al., Biochimica et Biophysica Acta 1149: 180-184 (1993); Klibanov, et al., Journal of Liposome Research 2: 321-334 (1992); 미국특허 제5,013556호; Zalipsky, Bioconjugate Chemistry 4: 296-299 (1993); Zalipsky, FEBS Letters 353: 71-74 (1994); Zalipsky, in Stealth Liposomes Chapter 9(Lasic and Martin, Eds) CRC Press, Boca Raton Fl (1995)). 한 접근에서, 지질 입자를 표적화하기 위해 항체와 같은 리간드는 지질 입자를 형성하는 지질의 극성 헤드 기에 연결된다. 다른 접근에서, 표적화 리간드는 친수성 폴리머 코팅을 형성하는 PEG 쇄의 원위 말단에 부착된다(Klibanov, et al., Journal of Liposome Research 2: 321-334 (1992); Kirpotin et al., FEBS Letters 388: 115-118 (1996)).
표적화제를 커플링하기 위하여 표준 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 표적화제의 부착을 위해 활성화될 수 있는 포스파티딜에탄올아민, 또는 유도체화된 친유성 화합물, 예컨대 지질-유도체화된 블레오마이신이 사용될 수 있다. 항체-표적화된 리포좀은, 예를 들어 단백질 A를 포함하는 리포좀을 사용하여 구성될 수 있다(문헌[Renneisen, et al., J. Bio. Chem., 265:16337-16342 (1990) 및 Leonetti, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 87:2448-2451 (1990)]을 참조). 항체 컨쥬게이션의 다른 예는 미국특허 제6,027,726호에 개시되며, 이것의 교시는 본 명세서에 참조로 포함된다. 표적화 모이어티의 예는 또한 신생물 또는 종양 관련 항원을 포함하는 세포 성분에 특이적인 다른 단백질을 포함할 수 있다. 표적화 모이어티로서 사용되는 단백질은 공유 결합을 통해 리포좀에 부착될 수 있다(문헌[Heath, Covalent Attachment of Protein to Liposomes, 149 Methods in Enzymology 111-119(Academic Press, Inc. 1987)]을 포함한다). 다른 표적화 방법은 바이오틴-아비딘 시스템을 포함한다.
일부 실시형태에서, 해당 지질 입자는 양이온성 지질 및 융합-촉진 지질의 혼합물을 포함한다. 해당 지질 입자는 중성 지질, 스테롤, PEG-변형 지질, 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 해당 지질 입자는 양이온성 지질, 융합-촉진 지질(예를 들어, DPPC), 및 중성 지질을 포함할 수 있지만, 스테롤 또는 PEG-변형 지질을 포함하지 않는다. 해당 지질 입자는 양이온성 지질, 융합-촉진 지질, 및 중성 지질을 포함할 수 있지만, 스테롤 또는 PEG-변형 지질을 포함하지 않는다. 해당 지질 입자는 양이온성 지질, 융합-촉진 지질, 및 PEG-변형 지질을 포함할 수 있지만, 스테롤 또는 중성 지질을 포함하지 않는다. 해당 지질 입자는 양이온성 지질, 융합-촉진 지질, 스테롤, 및 중성 지질을 포함할 수 있지만, PEG-변형 지질을 포함하지 않는다. 해당 지질 입자는 양이온성 지질, 융합-촉진 지질, 스테롤, 및 PEG-변형 지질을 포함할 수 있지만, 중성 지질을 포함하지 않는다. 해당 지질 입자는 양이온성 지질, 융합-촉진 지질, 중성 지질, 및 PEG-변형 지질을 포함할 수 있지만, 스테롤을 포함하지 않는다. 해당 지질 입자는 양이온성 지질, 융합-촉진 지질, 스테롤, 중성 지질, 및 PEG-변형 지질을 포함할 수 있다.
하나의 예시적 실시형태에서, 해당 지질 입자는 양이온성 지질, 융합-촉진 지질, 중성 지질(양이온성 지질 이외), 스테롤 (예를 들어, 콜레스테롤) 및 PEG-변형 지질(예를 들어, PEG-DMG 또는 PEG-DMA)의 혼합물을 포함한다. 특정 실시형태에서, 해당 지질 혼합물은 양이온성 지질, 융합-촉진 지질, 중성 지질, 콜레스테롤, 및 PEG-변형 지질로 이루어지거나 이들로 본질적으로 이루어진다. 추가 바람직한 실시형태에서, 해당 지질 입자는 약 20-70% 양이온성 지질: 0.1-50% 융합 촉진 지질: 5-45% 중성 지질: 20-55% 콜레스테롤: 0.5-15% PEG-변형 지질의 몰 비로 상기 지질 혼합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 해당 융합-촉진 지질은 0.1-50%, 0.5-50%, 1-50%, 5%-45%, 10%-40%, 또는 15%-35%의 몰 비로 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 해당 융합-촉진 지질은 0.1-50%, 0.5-50%, 1-50%, 5%-45%, 10%-40%, 또는 15%-35%의 몰 비로 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 해당 융합-촉진 지질은 0.1-50%, 10-50%, 20-50%, 또는 30-50%의 몰 비로 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 융합-촉진 지질은 0.1-50%, 0.5-45%, 1-40%, 1%-35%, 1%-30%, 또는 1%-20%의 몰 비로 존재할 수 있다.
추가의 바람직한 실시형태에서, 해당 지질 입자는 약 20-70% 양이온성 지질: 0.1-50% 융합 촉진 지질: 5-45% 중성 지질: 20-55% 콜레스테롤: 0.5-15% PEG-변형 지질의 몰 비로 상기 지질 혼합물로 이루어지거나 이들로 본질적으로 이루어진다.
특정 실시형태에서, 양이온성 지질/DSPC/Chol/PEG-DMG 또는 PEG-DMA mol%에 대한 해당 몰 지질 비는 대략 40/10/40/10, 35/15/40/10 또는 52/13/30/5이며; 이 혼합물은 0.1-50%, 0.1-50%, 0.5-50%, 1-50%, 5%-45%, 10%-40%, 또는 15%-35%의 몰 비로 융합-촉진 지질과 추가로 조합되며; 다시 말해서, 지질/DSPC/Chol/PEG-DMG 또는 PEG-DMA의 40/10/40/10 혼합물이 50%의 몰 비로 융합-촉진 펩타이드와 조합될 때, 얻어진 지질 입자는 20/5/20/5/50의 (양이온성 지질/DSPC/Chol/PEG-DMG 또는 PEG-DMA/융합-촉진 펩타이드) 전체 몰 비를 가질 수 있다. 다른 그룹의 실시형태에서, 이들 조성물 내 해당 중성 지질, DSPC는 POPC, DPPC, DOPE 또는 SM으로 대체된다.
본 명세서에 기재된 지질 입자는 하나 이상의 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 따라서 활성제가 지질 입자와 관련되는 경우 지질 입자 및 활성제를 포함하는 조성물이 제공된다. 특정 실시형태에서, 해당 활성제는 치료제이다. 특정 실시형태에서, 활성제는 지질 입자의 수성 내부 내에서 캡슐화된다. 다른 실시형태에서, 활성제는 지질 입자의 하나 이상의 지질층 내에 존재한다. 다른 실시형태에서, 활성제는 지질 입자의 외부 또는 내부 지질 표면에 결합된다.
본 명세서에 사용되는 "완전히 캡슐화된"은 입자 내 핵산이 유리 핵산을 상당히 분해하는 혈청 또는 뉴클레아제 분석에 노출 후에 상당히 분해되지 않았다. 완전히 캡슐화된 시스템에서, 바람직하게는 보통 유리 핵산의 100%를 분해하는 처리에서 입자 핵산의 25% 미만이 분해되며, 더 바람직하게는 입자 핵산의 10% 미만 및 가장 바람직하게는 5% 미만이 분해된다. 대안적으로, 전체 캡슐화는 Oligreen(등록상표) 분석에 의해 결정될 수 있다. Oligreen(등록상표)은 용액 내 올리고뉴클레오타이드 및 단일-가닥 DNA를 정량화하기 위한 초민감 형광 핵산 균주이다(캘리포니아주 칼스베드에 소재한 Invitrogen Corporation으로부터 입수가능). 또한 완전 캡슐화는 해당 입자가 혈청 안정적이며, 즉 생체 내 투여 시 이것의 성분으로 빠르게 분해되지 않는다는 것을 시사한다.
한 실시형태에서, 지질 입자는 본 발명의 양이온성 지질, 중성 지질, 스테롤 및 PEG-변형 지질을 포함한다. 한 실시형태에서, 해당 지질 입자는 양이온성 지질의 몰 기준으로 약 25% 내지 약 75%, 예를 들어 몰 기준으로 약 35 내지 약 65%, 약 45 내지 약 65%, 약 60%, 약 57.5%, 약 57.1%, 약 50% 또는 약 40%를 포함한다. 한 실시형태에서, 해당 지질 입자는 중성 지질의 몰 기준으로 약 0% 내지 약 15%, 예를 들어 몰 기준으로 약 3 내지 약 12%, 약 5 내지 약 10%, 약 15%, 약 10%, 약 7.5%, 약 7.1% 또는 약 0%를 포함한다. 한 실시형태에서, 해당 중성 지질은 DPPC이다. 한 실시형태에서, 해당 중성 지질은 DSPC이다.
한 실시형태에서, 제형은 스테롤의 몰 기준으로 약 5% 내지 약 50%, 예를 들어 몰 기준으로 약 15 내지 약 45%, 약 20 내지 약 40%, 약 48%, 약 40%, 약 38.5%, 약 35%, 약 34.4%, 약 31.5% 또는 약 31%을 포함한다. 한 실시형태에서, 해당 스테롤은 콜레스테롤이다.
한 실시형태에서, 해당 지질 입자는 PEG-변형 지질의 몰 기준으로 약 0.1% 내지 약 20%, 예를 들어 몰 기준으로 약 0.5 내지 약 10%, 약 0.5 내지 약 5%, 약 10%, 약 5%, 약 3.5%, 약 1.5%, 약 0.5%, 또는 약 0.3%를 포함한다. 한 실시형태에서, PEG-변형 지질은 PEG- DMG이다. 한 실시형태에서, PEG-변형 지질은PEG-c-DMA이다. 한 실시형태에서, 지질 입자는 몰 기준으로 25-75%의 양이온성 지질, 0.5-15%의 중성 지질, 5-50%의 스테롤, 및 0.5- 20%의 PEG-변형 지질을 포함한다.
한 실시형태에서, 지질 입자는 몰 기준으로 35-65%의 양이온성 지질, 3-12%의 중성 지질, 15-45%의 스테롤, 및 0.5- 10%의 PEG-변형 지질을 포함한다. 한 실시형태에서, 해당 지질 입자는 몰 기준으로 45-65%의 양이온성 지질, 5-10%의 중성 지질, 25-40%의 스테롤, 및 0.5- 5%의 PEG-변형 지질을 포함한다. 한 실시형태에서, 해당 PEG 변형 지질은 2,000 Da의 평균 분자량의 PEG 분자를 포함한다. 한 실시형태에서, PEG 변형 지질은 PEG-다이스티릴 글라이세롤(PEG-DSG)이다.
한 실시형태에서, 상기 비율의 지질:siRNA 비는 적어도 약 0.5:1, 적어도 약 1:1, 적어도 약 2:1, 적어도 약 3:1, 적어도 약 4:1, 적어도 약 5:1, 적어도 약 6:1, 적어도 약 7:1, 적어도 약 11:1 또는 적어도 약 33:1이다. 한 실시형태에서, 상기 비율의 지질: siRNA의 비는 약 1:1 내지 약 35:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약 4:1 내지 약 15:1, 또는 약 5:1 내지 약 13:1이다. 한 실시형태에서, 지질:siRNA 비는 약 0.5:1 내지 약 12:1이다.
한 실시형태에서, 해당 지질 입자는 나노입자이다. 추가적인 실시형태에서, 해당 지질 입자는 약 50㎚ 내지 약 300㎚, 예컨대 약 50㎚ 내지 약 250㎚, 예를 들어 약 50㎚ 내지 약 200㎚의 평균 직경 크기를 가진다.
한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태의 양이온성 지질을 함유하는 지질 입자는 약 3시간 미만, 예컨대 약 2.5시간 미만, 약 2시간 미만, 약 1.5시간 미만, 약 1시간 미만, 약 0.5시간 미만 또는 약 0.25시간 미만의 생체 내 반감기(t1/2)(예를 들어, 간, 비장 또는 혈장 내)를 가진다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태의 양이온성 지질을 함유하는 지질 입자는 생분해성 기 또는 기들이 없이 동일한 양이온성 지질에 대해 그것의 약 10% 미만(예를 들어, 약 7.5% 미만, 약 5% 미만, 약 2.5% 미만)의 생체 내 반감기(t1/2)(예를 들어, 간, 비장 또는 혈장 내)를 가진다.
추가적인 성분
본 명세서에 기재된 지질 입자 및 조성물은 아폴리포단백질(apolipoprotein)을 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "아폴리포단백질" 또는 "리포단백질"은 당업자에게 공지된 아폴리포단백질 및 이것의 변이체 및 단편 및 이하에 기재되는 이것의 아폴리포단백질 작용제(agonist), 유사체 또는 단편을 지칭한다.
적합한 아폴리포단백질은, 이에 제한되는 것은 아니지만, ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoA-V 및 ApoE, 및 활성 다형체 형태, 아이소폼, 변이체 및 돌연변이체뿐만 아니라 이들의 단편 또는 절단된 형태를 포함한다. 특정 실시형태에서, 아폴리포단백질은 티올 함유 아폴리포단백질이다. "티올 함유 아폴리포단백질"은 적어도 하나의 시스테인 잔기를 함유하는 아폴리포단백질, 변이체, 단편 또는 아이소폼을 지칭한다. 가장 흔한 티올 함유 아폴리포단백질은 하나의 시스테인 잔기를 함유하는 ApoA-I Milano(ApoA-IM) 및 ApoA-I Paris(ApoA-IP)이다(Jia et al., 2002, Biochem. Biophys. Res. Comm. 297: 206-13; Bielicki and Oda, 2002, Biochemistry 41: 2089-96). ApoA-II, ApoE2 및 ApoE3은 또한 티올 함유 아폴리포단백질이다. 분리된 ApoE 및/또는 활성 단편 및 이들의 재조합적으로 생성된 형태를 포함하는 이들의 폴리펩타이드 유사체는 미국특허 제5,672,685호; 제5,525,472호; 제5,473,039호; 제5,182,364호; 제5,177,189호; 제5,168,045호; 제5,116,739호에 기재되어 있으며; 이것의 개시는 본 명세서에 참조로 포함된다. ApoE3은 문헌["Human E apoprotein heterogeneity: cysteine-arginine interchanges in the amino acid sequence of the apo-E isoforms," J. Biol. Chem. (1981) 256: 9077-9083]; 및 문헌[Rall, et al., "Structural basis for receptor binding heterogeneity of apolipoprotein E from type III hyperlipoproteinemic subjects," Proc. Nat. Acad. Sci. (1982) 79: 4696-4700]에 개시된다. 또한 GenBank 등록번호 K00396를 참조한다.
특정 실시형태에서, 아폴리포단백질은 그것의 성숙 형태로, 그것의 프레프로아폴리포단백질 형태로 또는 그것의 프로아폴리포단백질 형태로 있을 수 있다. 프로- 및 성숙 ApoA-I(Duverger et al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16(12):1424-29), ApoA-I MilanO(Klon et al., 2000, Biophys. J. 79:(3)1679-87; Franceschini et al., 1985, J. Biol. Chem. 260: 1632-35), ApoA-I Paris(Daum et al., 1999, J. Mol. Med. 77:614-22), ApoA-II (Shelness et al., 1985, J. Biol. Chem. 260(14):8637-46; Shelness et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(15):9929-35), ApoA-IV (Duverger et al., 1991, Euro. J. Biochem. 201(2):373-83), 및 ApoE (McLean et al., 1983, J. Biol. Chem. 258(14):8993-9000)의 호모- 및 헤테로다이머(실현가능한 경우)가 또한 이용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 아폴리포단백질은 해당 아폴리포단백질의 단편, 변이체 또는 아이소폼일 수 있다. 용어 "단편"은 본래의 아폴리포단백질보다 더 짧은 아미노산 서열을 가지는 임의의 아폴리포단백질을 말하는데, 이 단편은 지질 결합 특성을 포함하여 본래의 아폴리포단백질의 활성을 유지한다. "변이체"는 해당 아폴리포단백질의 아미노산 서열의 치환 또는 변경을 의미하는데, 치환 또는 변경, 예를 들어 아미노산 잔기의 첨가 및 결실은 지질 결합 특성을 포함하여 본래의 아폴리포단백질의 활성을 없애지 않는다. 따라서, 변이체는 하나 이상의 아미노산 잔기가 화학적으로 유사한 아미노산으로 보존적으로 치환된 본 명세서에 제공된 본래의 아폴리포단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 단백질 또는 펩타이드를 포함할 수 있다. 보존적 치환의 예는 적어도 하나의 소수성 잔기, 예컨대 아이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌이 다른 것으로 치환되는 것을 포함한다. 마찬가지로, 예를 들어 아르기닌과 리신, 글루타민과 아스파라긴, 및 글라이신과 세린 사이(미국특허 제6,004,925호, 제6,037,323호 및 제6,046,166호)와 같은 적어도 하나의 친수성 잔기의 치환은 보존적 치환이다. 용어 "아이소폼"은 동일하거나, 더 크거나 또는 부분적인 작용 및 유사하거나, 동일하거나 부분적인 서열을 가지는 단백질을 말하며, 보통 조직 특이적이며 동일한 유전자의 생성물일 수도 있고 아닐 수도 있다(문헌[Weisgraber 1990, J. Lipid Res. 31(8):1503-11; Hixson and Powers 1991, J. Lipid Res. 32(9):1529-35; Lackner et al., 1985, J. Biol. Chem. 260(2):703-6; Hoeg et al., 1986, J. Biol. Chem. 261(9):3911-4; Gordon et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(1):468-74; Powell et al., 1987, Cell 50(6):831-40; Aviram et al., 1998, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 18(10):1617-24; Aviram et al., 1998, J. Clin. Invest. 101(8):1581-90; Billecke et al., 2000, Drug Metab. Dispos. 28(11):1335-42; Draganov et al., 2000, J. Biol. Chem. 275(43):33435-42; Steinmetz and Utermann 1985, J. Biol. Chem. 260(4):2258-64; Widler et al., 1980, J. Biol. Chem. 255(21):10464-71; Dyer et al., 1995, J. Lipid Res. 36(1):80-8; Sacre et al., 2003, FEBS Lett. 540(1-3):181-7; Weers, et al., 2003, Biophys. Chem. 100(1-3):481-92; Gong et al., 2002, J. Biol. Chem. 277(33):29919-26; Ohta et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(23):14888-93] 및 미국특허 제6,372,886호를 참조).
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 지질 입자 및 조성물은 아폴리포단백질의 키메라 구조를 포함한다. 예를 들어 아폴리포단백질의 키메라 구조는 허혈 재관류 보호적 특성을 함유하는 아폴리포단백질 도메인과 관련된 고지질 결합 능력을 갖는 아폴리포단백질 도메인을 포함할 수 있다. 아폴리포단백질의 키메라 구조는 아폴리포단백질 내에서 별개의 영역을 포함하는 구조(즉, 상동성 구조)일 수 있고 또는 키메라 구조는 상이한 아폴리포단백질 사이의 별개의 영역을 포함하는 구조(즉, 이종성 구조)일 수 있다. 키메라 구조를 포함하는 조성물은 또한 아폴리포단백질 변이체인 절편 또는 특이적 특징(예를 들어, 지질 결합, 수용체 결합, 효소적, 효소 활성화, 항산화제 또는 환원-산화 특성)을 가지도록 설계된 또는 절편을 포함할 수 있다(문헌[Weisgraber 1990, J. Lipid Res. 31(8):1503-11; Hixson and Powers 1991, J. Lipid Res. 32(9):1529-35; Lackner et al., 1985, J. Biol. Chem. 260(2):703-6; Hoeg et al, 1986, J. Biol. Chem. 261(9):3911-4; Gordon et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(1):468-74; Powell et al., 1987, Cell 50(6):831-40; Aviram et al., 1998, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 18(10):1617-24; Aviram et al., 1998, J. Clin. Invest. 101(8):1581-90; Billecke et al., 2000, Drug Metab. Dispos. 28(11):1335-42; Draganov et al., 2000, J. Biol. Chem. 275(43):33435-42; Steinmetz and Utermann 1985, J. Biol. Chem. 260(4):2258-64; Widler et al., 1980, J. Biol. Chem. 255(21):10464-71; Dyer et al., 1995, J. Lipid Res. 36(1):80-8; Sorenson et al., 1999, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19(9):2214-25; Palgunachari 1996, Arterioscler. Throb. Vasc. Biol. 16(2):328-38: Thurberg et al., J. Biol. Chem. 271(11):6062-70; Dyer 1991, J. Biol. Chem. 266(23):150009-15; Hill 1998, J. Biol. Chem. 273(47):30979-84)]을 참조).
이용된 아폴리포단백질은 또한 재조합, 합성, 반합성 또는 정제된 아폴리포단백질을 포함한다. 아폴리포단백질 또는 이것의 동등물을 얻기 위한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 아폴리포단백질은, 예를 들어 밀도 구배 원심분리 또는 면역친화도 크로마토그래피에 의해 혈장 또는 본래의 생성물로부터 분리될 수 있고, 또는 합성으로, 반합성으로 또는 당업자에게 공지된 재조합 DNA 기법을 사용하여 분리될 수 있다(예를 들어, 문헌[Mulugeta et al., 1998, J. Chromatogr. 798(1-2): 83-90; Chung et al., 1980, J. Lipid Res. 21(3):284-91; Cheung et al., 1987, J. Lipid Res. 28(8):913-29; Persson, et al., 1998, J. Chromatogr. 711:97-109]; 미국특허 제5,059,528호, 제5,834,596호, 제5,876,968호 및 제5,721,114호; 및 국제특허출원 WO 86/04920 및 WO 87/02062를 참조).
아폴리포단백질은 ApoA-I, ApoA-I MilanO(ApoA-IM), ApoA-I Paris (ApoA-IP), ApoA-II, ApoA-IV, 및 ApoE의 활성을 모방하는 펩타이드 및 펩타이드 유사체와 같은 아폴리포단백질 작용제를 추가로 포함한다. 예를 들어, 해당 아폴리포단백질은 미국특허 제6,004,925호, 제6,037,323호, 제6,046,166호, 및 제5,840,688호에 기재된 어떤 것 일 수 있으며, 이것의 내용은 본 명세서에 그것의 전문이 참조로 포함된다.
아폴리포단백질 작용제 펩타이드 또는 펩타이드 유사체는, 예를 들어 미국특허 제6,004,925호, 제6,037,323호 및 제6,046,166호에 기재된 기술을 포함하여 당업계에 공지된 펩타이드에 대한 임의의 기법을 사용하여 합성되거나 제조될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드는 메리필드(Merrifield)(1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154)에 의해 처음으로 기재된 고체상 합성 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 다른 펩타이드 합성 기법은 문헌[Bodanszky et al., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2d Ed., (1976)] 및 당업자에게 용이하게 입수가능한 다른 참고문헌에서 발견할 수 있다. 폴리펩타이드 합성 기법의 요약은 문헌[Stuart and Young, Solid Phase Peptide. Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, Ill., (1984)]에서 발견할 수 있다. 펩타이드는 또한 문헌[The Protein, Vol. II, 3d Ed., Neurath et. al., Eds., p. 105-237, Academic Press, New York, N.Y. (1976)]에 기재된 것과 같은 용액법(solution method)으로 합성될 수 있다. 상이한 펩타이드 합성에서 사용을 위한 적합한 보호기는 상기 언급한 문헌에서뿐만 아니라 문헌[McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, N.Y. (1973)]에 기재된다. 펩타이드는 또한, 예를 들어 아폴리포단백질 A-I의 더 큰 부분으로부터 화학적 또는 효소적 절단에 의해 제조될 수 있다.
특정 실시형태에서, 해당 아폴리포단백질은 아폴리포단백질의 혼합물일 수 있다. 한 실시형태에서, 해당 아폴리포단백질은 상동성 혼합물, 즉 단일형의 아폴리포단백질일 수 있다. 다른 실시형태에서, 해당 아폴리포단백질은 아폴리포단백질의 이종성 혼합물, 즉, 2가지 이상의 상이한 아폴리포단백질의 혼합물일 수 있다. 아폴리포단백질의 이종성 혼합물의 실시형태는, 예를 들어 동물 공급원으로부터의 아폴리포단백질 및 반합성 공급원으로부터의 아폴리포단백질의 혼합물을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이종성 혼합물은, 예를 들어 ApoA-I와 ApoA-I Milano의 혼합물을 포함한다. 특정 실시형태에서, 이종성 혼합물은, 예를 들어 ApoA-I Milano와 ApoA-I Paris의 혼합물을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용을 위한 적합한 혼합물은 당업자에게 명백할 것이다.
아폴리포단백질이 천연 공급원으로부터 얻어진다면, 이는 식물 또는 동물 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 아폴리포단백질이 동물 공급원으로부터 얻어진다면, 아폴리포단백질은 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 특정 실시형태에서, 아폴리포단백질은 동물 공급원으로부터 얻을 수 있다. 특정 실시형태에서, 아폴리포단백질은 인간 공급원으로부터 얻을 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 아폴리포단백질은 해당 아폴리포단백질이 투여되는 개체와 동일한 종으로부터 유래된다.
본 명세서에 기재된 지질 입자 및 조성물은 지질 혼합물의 스테롤 성분을 추가로 함유할 수 있다. 존재한다면, 스테롤은 리포좀, 지질 베시클 또는 지질 입자 제조 분야에서 통상적으로 사용되는 임의의 스테롤일 수 있다. 한 실시형태에서, 스테롤은 콜레스테롤이다.
본 명세서에 기재된 지질 입자 및 조성물은 음이온성 지질을 추가로 포함할 수 있다. 지질 입자 내에서 사용에 적합한 음이온성 지질은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 포스파티딜글라이세롤, 카르디올리핀, 다이아실포스파티딜세린, 다이아실포스파티드산, N-도데카노일 포스파티딜에탄올로아민, N-숙시닐 포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴 포스파티딜에탄올아민, 리실포스파티딜글라이세롤, 및 중성 지질에 결합된 다른 음이온성 변형 기를 포함한다.
추가적인 실시형태에서, 양친매성 지질은 또한 본 명세서에 기재된 지질 입자 및 조성물에 포함된다. "양친매성 지질"은 임의의 적합한 물질을 지칭하되, 지질 물질의 소수성 부분은 소수성 층으로 향하는 반면, 친수성 부분은 수층으로 향한다. 이러한 화합물은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 인지질, 아미노지질, 및 스핑고지질을 포함한다. 대표적인 인지질은 스핑고마이엘린, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티드산, 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린, 라이베시클스파티딜콜린, 라이베시클스파티딜에탄올아민, 다이팔미토일포스파티딜콜린, 다이올레오일포스파티딜콜린, 다이스테아로일포스파티딜콜린, 또는다이리놀레오일포스파티딜콜린을 포함한다. 다른 인-결여 화합물, 예컨대 스핑고지질, 글라이코스핑고지질 패밀리, 다이아실글라이세롤, 및 β-아실옥시산이 또한 사용될 수 있다. 추가적으로, 이러한 양친매성 지질은 다른 지질, 예컨대 트라이글라이세라이드 및 스테롤과 용이하게 혼합될 수 있다.
또한 본 명세서에 기재된 지질 입자 및 조성물 내에 포함에 적합한 프로그램성 융합 지질 또는 융합-촉진 지질이 있다. 이러한 지질 입자는 세포막과 융합하는 경향이 거의 없으며 주어진 신호 사건이 생길 때까지 그것의 적재물을 전달한다. 이는 지질 입자를 유기체 또는 질병 부위 내로 주입 후 그것이 세포와 융합하기 전 더 균등하게 분포하도록 한다. 예를 들어 신호 사건은 pH의 변화, 온도, 이온 환경, 또는 시간일 수 있다. 융합 촉진-지질은, 예를 들어 상기 기재한 바와 같은 화학식 I의 화합물일 수 있다. 일부 경우에, 신호 사건은 예를 들어 세포 밖 환경과 세포 내 환경 간의, 또는 세포 내 환경과 엔도솜 환경 간의 pH 차이와 같은 pH의 변화일 수 있다.
시간이 신호 사건일 때, 융합 지연 또는 "클로킹(cloaking)" 성분, 예컨대 ATTA-지질 컨쥬게이트 또는 PEG-지질 컨쥬게이트는 시간에 따라 지질 입자 막 밖에서 단순히 교환될 수 있다. 지질 입자가 신체 내에서 적합하게 분포됨으로써, 융합이 용이하게 되도록 하는 충분한 클로킹제는 상실되었다. 다른 신호 사건과 함께, 염증 부위에서 증가된 온도와 같이 질병 부위 또는 표적 세포와 관련된 신호를 선택하는 것은 바람직할 수 있다.
활성(치료)제
본 명세서에 기재된 지질 입자 및 조성물은 하나 이상의 활성제(예를 들어 치료제)를 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 활성제는 세포, 조직, 기관 또는 피험체에서 원하는 효과를 발휘할 수 있는 임의의 분자 또는 화합물을 포함한다. 이러한 효과는 예를 들어 생물학적, 생리적 또는 미용적일 수 있다. 지질 입자 및 조성물은 임의의 다양한 활성제를 전달하기 위하여 사용될 수 있다. 활성제는 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드(예를 들어, 항체), 사이토카인, 성장 인자, 세포사멸(apoptotic) 인자, 분화-유발 인자, 세포 표면 수용체 및 그것의 리간드, 호르몬, 및 소분자일 수 있다. 적합한 치료제는 또한 항-염증 화합물, 항-우울제, 자극제, 진통제, 항생제, 산아제한 약품, 해열제, 혈관 확장제, 항-혈관형성제, 세포혈관제(cytovascular agent), 신호 전달 억제제, 심혈관 약물, 예를 들어 항-부정맥제, 혈관 수축제, 호르몬, 및 스테로이드를 포함한다. 본 발명의 지질 입자는 또한 앱타머(aptamer)를 전달할 수 있다.
특정 실시형태에서, 치료제는 또한 항종양 약물, 항암 약물, 종양 약물, 항신생물제 등으로 언급될 수 있는 종양 약물이다. 사용될 수 있는 종양 약물의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 아드리아미신, 알커란, 알로퓨리놀, 알트레타민, 아미포스틴, 아나스트로졸, 아라씨(araC), 삼산화비소, 아자타이오프린, 벡사로텐, 비아이씨엔유(biCNU), 블레오마이신, 정맥주사용 부설판, 경구용 부설판, 카펙시타빈(젤로다), 카보플라틴, 카무스틴, CCNU, 셀렉콕십, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 사이클로스포린 A, 사이타라빈, 사이토신, 아라비노사이드, 다우노루비신, 사이톡산, 다우노루비신, 덱사메타손, 덱스라족산, 도데탁셀, 독소루비신, 독소루비신, DTIC, 에피루비신, 에스트라무스틴, 에토포사이드 포스페이트, 에토포사이드 및 VP-16, 엑세메스탄, FK506, 플루다라빈, 플루오로우라실, 5-FU, 겜시타빈(겜자르), 겜투주맙-오조가미신, 고세렐린 아세테이트, 하이드레아, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이포스파마이드, 이마티닙 메실레이트, 인터페론, 이리노테칸(캄프토스타, CPT-111), 레트로졸, 류코보린, 류스타틴, 류프롤라이드, 레바미졸, 리트레티노인, 메가스트롤, 멜팔란, L-PAM, 메스나, 메토트렉세이트, 메톡살렌, 미트라마이신, 미토마이신, 미톡산트론, 질소 머스타드, 파클리탁셀, 파미드로네이트, 페가데마제, 펜토스타틴, 포피머 나트륨, 프레드니손, 리툭산, 스트렙토조신, STI-571, 타목시펜, 탁소테르, 테모졸라마이드, 테니포사이드, VM-26, 토포테칸(Hycamtin), 토레미펜, 트레티노인, ATRA, 발루비신, 벨반, 빈블라스틴, 빈크리스틴, VP16, 및 비노렐빈을 포함한다. 사용될 수 있는 종양 약물의 다른 예는 엘립티신 및 엘립티신 유사체 또는 유도체, 에포틸론, 세포내 키나제 억제제 및 캄토테신이다.
바람직한 실시형태에서, 활성제는 siRNA와 같은 핵산이다. 예를 들어, 활성제는, 이에 제한되는 것은 아니지만, RNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 안타고미르, DNA, 플라스미드, 리보솜 RNA(ribosomal RNA, rRNA), 마이크로 RNA(micro RNA, miRNA)(예를 들어 단일 가닥이며 길이가 17-25 뉴클레오타이드인 miRNA), 운반 RNA(transfer RNA, tRNA), 짧은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA), 소형 핵 RNA(small nuclear RNA, snRNA)을 포함하는 관심의 생성물로 암호화된 핵산, 항원, 이들의 단편, 단백질, 펩타이드, 백신 및 소분자 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 하나 이상의 바람직한 실시형태에서, 핵산은 올리고뉴클레오타이드(예를 들어 길이로 15-50 뉴클레오타이드(또는 길이로 15-30 또는 20-30 뉴클레오타이드))이다. siRNA는, 예를 들어 16-30 뉴클레오타이드 길이인 듀플렉스 영역을 가질 수 있다. 다른 실시형태에서, 핵산은 면역촉진 올리고뉴클레오타이드, 데코이 올리코뉴클레오타이드, 슈퍼미르(supermir), miRNA 모방체, 또는 miRNA 억제제이다. 슈퍼미르는 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA) 또는 둘 다 또는 이들의 변형물의 단일가닥, 이중가닥 또는 부분적으로 이중가닥인 올리고머 또는 폴리머를 말하는데, 이는 miRNA와 실질적으로 동일하고 그것의 표적에 대해 안티센스인 뉴클레오타이드 서열을 가진다. miRNA 모방체는 하나 이상의 miRNA의 유전자 침묵 능력을 모방하기 위하여 사용될 수 있는 분자의 부류를 나타낸다. 따라서, 용어 "마이크로RNA 모방체"는 RNAi 경로에 들어갈 수 있고 유전자 발현을 조절할 수 있는 합성의 비-암호화 RNA(즉, 내인성 miRNA의 공급원으로부터 정제에 의해 얻어지지 않는 miRNA)를 지칭한다.
지질-핵산 입자에 존재하는 핵산은 임의의 형태일 수 있다. 핵산은, 예를 들어 단일가닥 DNA 또는 RNA, 또는 이중가닥 DNA 또는 RNA, 또는 DNA-RNA 혼성체일 수 있다. 이중가닥 RNA의 비제한적 예는 siRNA를 포함한다. 단일-가닥 핵산은, 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 마이크로RNA, 및 트리플렉스-형성 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명의 지질 입자는 또한 하나 이상의 리간드와 컨쥬게이트된 핵산을 전달할 수 있다.
약제학적 조성물
지질 입자는 특히 치료제와 관련될 때, 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있는데, 예를 들어 투여 경로 및 표준 약제학적 실행에 따라서 선택된 약제학적으로 허용가능한 희석제, 부형제, 또는 담체, 예컨대 생리 식염수 또는 인산염 완충제를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, siRNA 분자 전달을 위한 조성물이 기재된다. 이들 조성물은 단백질 수준 및/또는 표적 단백질의 mRNA 수준을 하향 조절하는데 효과적이다. 이들 조성물의 활성은 양이온성 지질의 존재 및 제형 내 양이온성 지질의 몰 비에 의해 영향을 받을 수 있다.
특정 실시형태에서, 지질-핵산 입자를 포함하는 약제학적 조성물은 표적 기법에 따라서 제조되며, 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다. 일반적으로 식염수는 약제학적으로 허용가능한 담체로 사용될 것이다. 다른 적합한 담체는, 예를 들어 물, 완충수, 0.9% 식염수, 0.3% 글라이신 등을 포함하며, 향상된 안정성을 위한 글라이코단백질, 예컨대 알부민, 리포단백질, 글로불린 등을 포함한다. 식염수 또는 다른 염 함유 담체를 포함하는 조성물에서, 담체는 바람직하게는 지질 입자 형성 후 첨가된다. 따라서 지질-핵산 조성물이 형성된 후, 조성물은 식염수와 같은 약제학적으로 허용가능한 담체로 희석될 수 있다.
얻어진 약제학적 제제는 통상적인, 잘 공지된 멸균 기법에 의해 멸균될 수 있다. 그 다음에 수용액은 사용을 위해 포장되거나 무균상태 하에 여과되고 동결건조될 수 있으며, 동결건조된 제제는 투여 전 멸균 수용액과 합쳐진다. 조성물은 생리적 조건과 비슷해야할 필요가 있다면, 약제학적으로 허용가능한 보조 물질, 예컨대 pH 조절제 및 완충제, 등장성 조절제 등, 예를 들어 아세트산나트륨, 락트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 등을 함유할 수 있다. 추가적으로, 지질 현탁액은 저장 시 유리-라디칼 및 지질-과산화 손상에 대해 지질을 보호하는 지질-보호제를 포함할 수 있다. α-토코페롤과 같은 친유성 유리-라디칼 퀀처(quencher) 및 페리옥사민과 같은 수용성 철-특이적 킬레이터가 적합하다.
약제학적 제형 내 지질 입자 또는 지질-핵산 입자의 농도는 매우 다양할 수 있으며, 즉 약 0.01중량% 미만, 보통 또는 적어도 약 0.05중량% 내지 5중량%, 10중량% 내지 30중량% 만큼 많을 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식에 따라서 유체 용적, 점성도 등에 의해 주로 선택될 것이다. 예를 들어, 치료와 관련된 유체 부하를 낮추기 위하여 농도는 증가될 수 있다. 이는 아테롬성동맥경화증-관련 울혈심부전증 또는 중증의 고혈압을 가지는 환자에서 특히 바람직하다. 대안적으로, 자극 지질을 포함하는 복합체는 투여 부위에서 염증을 줄이기 위하여 저농도로 희석될 수 있다. 실시형태의 한 그룹에서, 핵산은 부착된 라벨을 가질 것이며, (상보적 핵산의 존재를 나타냄으로써)진단을 위하여 사용될 것이다. 이 예에서, 투여된 복합체의 양은 사용된 특정 라벨, 진단된 질병 상태 및 임상의의 판단에 의존할 것이지만, 일반적으로 체중의 킬로그램 당 약 0.01 내지 약 50㎎, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 5㎎/㎏체중일 것이다.
상기 주목한 바와 같이, 지질-치료제(예를 들어, 핵산) 입자는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)-변형 인지질, PEG-세라마이드, 또는 강글리오사이드 GM1-변형 지질 또는 응집을 방지하거나 제한하는데 효과적인 다른 지질을 포함할 수 있다. 이러한 성분의 첨가는 복합체 응집을 거의 방지하지 않는다. 오히려, 순환 반감기를 증가시키고 표적 조직에 지질-핵산 조성물의 전달을 증가시키는 수단을 제공할 수 있다.
지질-치료제 조성물은 또한 키트 형태로 제공될 수 있다. 키트는 전형적으로 다양한 키트의 구성요소를 보유하기 위하여 구획화되어 있는 용기를 포함할 것이다. 키트는 입자 또는 약제학적 조성물을 바람직하게는 탈수 형태 또는 농축 형태로, 그것의 재수화 또는 희석 및 투여를 위한 설명서와 함께 함유할 것이다. 특정 실시형태에서, 입자는 활성제를 포함하는 한편, 다른 실시형태에서 그것들은 그렇지 않다.
제조방법
양이온성 지질, 그것을 함유하는 지질 입자, 및 양이온성 지질 및/또는 지질 입자를 함유하는 약제학적 조성물은, 예를 들어 국제특허출원 WO 2010/054406, WO 2010/054401, WO 2010/054405, 및 WO 2010/054384, WO 2010/042877, WO 2010/129709, WO 2009/086558, 및 WO 2008/042973에 기재되며, 이들 각각은 그것의 전문이 참조로 포함된다.
지질 입자 및 지질 입자를 함유하는 약제학적 조성물의 제조방법은, 예를 들어 미국 공개 제2004/0142025호, 제2006/0051405호 및 제2007/0042031호에 기재되며, 이들 각각은 그것의 전문이 참조로 포함된다. 추가로, 치료제와 관련된 것, 예를 들어 핵산을 포함하는 지질 입자의 제조방법이 기재된다. 본 명세서에 기재된 방법에서, 지질의 혼합물은 핵산의 완충 수용액과 합쳐져서 지질 입자 내에서 캡슐화된 핵산을 함유하는 중간체 혼합물을 생성한다. 한 실시형태에서, 캡슐화된 핵산은 약 3wt% 내지 약 25wt%, 바람직하게는 5wt% 내지 15wt%의 핵산/지질 비로 존재한다. 중간체 혼합물은 선택적으로 지질-캡슐화된 핵산 입자를 얻기 위한 크기로 될 수 있되, 해당 지질 부분은 바람직하게는 30㎚ 내지 150㎚, 더 바람직하게는 약 40㎚ 내지 90㎚의 직경을 가지는 유니라멜라 베시클이다. 그 다음에 pH는 상승되어서 지질-핵산 입자 상에서 표면 전하의 적어도 일부를 중화하며, 따라서 적어도 부분적으로 표면-중화 지질-캡슐화된 핵산 조성물을 제공한다.
예를 들어, 한 실시형태에서, 유기 용액(예를 들어, 에탄올) 내 하나 이상의 지질(본 명세서에 기재된 임의의 실시형태의 양이온성 지질을 포함) 용액이 제조된다. 유사하게, 수성 완충된(예를 들어, 시트르산 완충제) 용액 내 하나 이상의 활성(치료)제(예를 들어 siRNA 분자 또는 2개의 siRNA 분자의 1:1 몰 혼합물) 용액이 제조된다. 두 용액이혼합되고 희석되어 siRNA 지질 입자의 콜로이드 현탁액을 형성한다. 한 실시형태에서, siRNA 지질 입자는 약 80 내지 90㎚의 평균 입자 크기를 가진다. 추가 실시형태에서, 분산물은 0.45/2 마이크론 필터를 통해 여과되고, 농축되며, 접선 유동 여과(tangential flow filtration)에 의해 투석여과된다. 추가 실시형태에서, 얻어진 생성물의 농축은 약 2㎎/㎖로 조절된다. 추가 실시형태에서, 생성물은 멸균여과되고, 무균 여과되며 포장된다. 상기 기재한 바와 같이, 몇몇의 이들 양이온성 지질은 아미노기의 pKa 미만의 pH에서 하전되며 pKa 초과의 pH에서 실질적으로 중성인 아미노 지질이다. 이들 양이온성 지질은 적정가능한 양이온성 지질로 칭해지며, 2-단계 과정을 사용하여 제형 중에 사용될 수 있다. 제1 단계에서, 지질 베시클이 핵산의 존재에서 적정가능한 양이온성 지질 및 다른 베시클 성분에 의해 더 낮은 pH에서 형성될 수 있다. 이런 방식으로, 베시클은 캡슐화되며, 핵산을 잡을 것이다. 제2 단계에서, 새로 형성된 베시클의 표면 전하는 존재하는 적정가능한 양이온성 지질의 pKa 초과 수준으로, 즉 생리적 pH 또는 초과로 배지의 pH를 증가시킴으로써 중화될 수 있다. 이 과정의 특히 유리한 양태는 임의의 표면 흡착 핵산의 수월한 제거와 중성 표면을 가지는 얻어진 핵산 전달 비히클 둘 다 포함한다. 중성 표면을 가지는 리포좀 또는 지질 입자는 순환으로부터의 빠른 클리어런스를 회피하고 양이온성 리포좀 제제와 관련된 특정 독성을 회피할 것이 기대된다. 핵산-지질 입자의 제형 내 이러한 적정가능한 양이온성 지질의 이런 사용에 대한 추가적인 상술은 본 명세서에 참조로 포함된 미국특허 제6,287,591호 및 미국특허 제6,858,225호에서 제공된다.
이런 방식으로 형성된 베시클은 고함량의 핵산을 가지는 균일한 베시클 크기의 제형을 제공한다. 추가적으로, 베시클은 약 30 내지 약 150㎚, 더 바람직하게는 약 30 내지 약 90㎚의 크기 범위를 가질 수 있다.
어떤 특정 이론에 구속하려는 의도 없이, 핵산 캡슐화의 매우 높은 효율은 낮은 pH에서 정전기적 상호작용의 결과인 것으로 믿어진다. 산성 pH(예를 들어 pH 4.0)에서, 베시클 표면은 하전되며, 정전기적 상호작용을 통해 핵산의 일부와 결합한다. 외부 산성 완충제가 더 많은 중성 완충제(예를 들어, pH 7.5)로 교환될 때, 해당 지질 입자 또는 리포좀의 표면은 중화되며, 임의의 외부 핵산이 제거되도록 한다. 제형화 과정에 대한 더 상세한 정보는 다양한 간행물에서 제공된다(예를 들어, 미국특허 제6,287,591호 및 미국특허 제6,858,225호).
상기를 고려하여, 지질/핵산 제형의 제조방법이 기재된다. 본 명세서에 기재되는 방법에서, 지질의 혼합물은 핵산의 완충 수용액과 합쳐져서 지질 입자 내에서 캡슐화된 핵산을 함유하는 중간체 혼합물을 생성하되, 예를 들어 캡슐화된 핵산은 약 10 wt% 내지 약 20 wt%의 핵산/지질 비로 존재한다. 중간체 혼합물은 선택적으로 지질-캡슐화된 핵산입자를 얻기 위한 크기로 될 수 있되, 해당 지질 부분은 바람직하게는 30 내지 150㎚, 더 바람직하게는 약 40 내지 90 ㎚의 직경을 가지는 유니라멜라 베시클이다. 그 다음에 pH는 상승되어 지질-핵산 입자 상에서 표면 전하의 적어도 일부를 중화하고, 따라서 적어도 부분적으로 표면-중화 지질-캡슐화 핵산 조성물을 제공한다.
특정 실시형태에서, 지질의 혼합물은 적어도 2가지 지질 성분: 지질이 pKa 미만의 pH에서 양이온성이며 pKa 초과의 pH에서 중성이 되도록 pKa를 가지는 지질 중에서 선택된 제1 지질 성분, 및 지질-핵산 입자 형태 동안 입자 응집을 방지하는 지질 중에서 선택된 제2 지질 성분을 포함한다. 특정 실시형태에서, 아미노 지질은 양이온성 지질이다.
핵산-지질 입자의 제조에서, 지질의 혼합물은 전형적으로 유기 용매 중의 지질 용액이다. 그 다음에 지질의 이런 혼합물은 건조되어 얇은 필름을 형성하거나 동결건조되어 분말을 형성한 후 수성 완충제에 의해 수화되어 리포좀을 형성할 수 있다. 대안적으로, 바람직한 방법에서, 지질 혼합물은 물 혼화성 알코올, 예컨대 에탄올 중에 용해될 수 있으며, 이 에탄올 용액은 자발적 리포좀 형성을 초래하는 수성 완충제에 첨가된다. 대부분의 실시형태에서, 알코올은 상업적으로 입수가능한 형태로 사용된다. 예를 들어, 에탄올은 무수 에탄올(100%)로서, 또는 95% 에탄올이며, 나머지는 물로서 사용될 수 있다. 이 방법은 미국특허 제5,976,567호에서 상세하기 기재된다.
하나의 예시적 실시형태에서, 지질의 혼합물은 알코올 용매 중의 양이온성 지질, 중성 지질(양이온성 지질 이외), 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤) 및 PEG-변형 지질(예를 들어, PEG-DMG 또는 PEG-DMA)의 혼합물이다. 바람직한 실시형태에서, 지질 혼합물은 본질적으로 알코올, 더 바람직하게는 에탄올 중의 양이온성 지질, 중성 지질, 콜레스테롤 및 PEG-변형 지질로 이루어진다. 추가적인 바람직한 실시형태에서, 제1 용액은 상기 지질 혼합물로 약 20-70% 양이온성 지질: 5-45% 중성 지질:20-55% 콜레스테롤:0.5-15% PEG-변형 지질의 몰 비로 이루어진다. 훨씬 더 바람직한 실시형태에서, 제1 용액은 본질적으로 표 1 내지 5에 기재된 지질, DSPC, Chol 및 PEG-DMG 또는 PEG-DMA에 기재된 지질로부터 선택된 양이온성 지질의 혼합물로 더 바람직하게는 약 20-60% 양이온성 지질: 5-25% DSPC:25-55% Chol:0.5-15% PEG-DMG 또는 PEG-DMA의 몰 비로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 몰 지질 비는 대략 40/10/40/10(mol% 양이온성 지질/DSPC/Chol/PEG-DMG 또는 PEG-DMA), 35/15/40/10(mol% 양이온성 지질/DSPC/Chol/PEG-DMG 또는 PEG-DMA) 또는 52/13/30/5(mol% 양이온성 지질/DSPC/Chol/PEG-DMG 또는 PEG-DMA)이다. 바람직한 실시형태의 다른 기에서, 이들 조성물 내 중성 지질은 POPC, DPPC, DOPE 또는 SM으로 대체된다.
지질 혼합물은 핵산을 함유할 수 있는 완충 수용액과 합쳐진다. 완충 수용액은 전형적으로 완충제가 지질 혼합물 내 양성자성 지질의 pKa 미만의 pH를 가지는 용액이다. 적합한 완충제의 예는 시트레이트, 포스페이트, 아세테이트 및 MES를 포함한다. 특히 바람직한 완충제는 시트레이트 완충제이다. 바람직한 완충제는 캡슐화되는 핵산의 화학에 따라서 1 내지 1000mM의 양이온의 범위에 있을 것이며, 완충제 농도의 최적화는 고부하 수준을 달성하기에 중요할 수 있다(예를 들어 전문이 각각 참조로 포함되는 미국특허 제6,287,591호 및 미국특허 제6,858,225호를 참조). 대안적으로, 클로라이드, 설페이트 등에 의해 pH 5-6으로 산성화된 순수(pure water)가 유용할 수 있다. 이 경우에, 입자가 투석되어 에탄올이 제거되고, pH가 증가되거나 식염수와 같은 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합될 때 입자 막을 가로지르는 삼투 퍼텐셜과 균형을 이루는 5% 글루코스, 또는 다른 비이온성 용질을 첨가하는 것이 적합할 수 있다. 완충제 내 핵산의 양은 다를 수 있지만, 전형적으로 약 0.01㎎/㎖ 내지 약 200㎎/㎖, 더 바람직하게는 약 0.5㎎/㎖ 내지 약 50㎎/㎖일 것이다.
지질과 치료적 핵산의 완충 수용액 혼합물은 합쳐져서 중간체 혼합물을 제공한다. 중간체 혼합물은 전형적으로 캡슐화된 핵산을 가지는 지질 입자의 혼합물이다. 추가적으로 중간체 혼합물은 또한 지질 입자 표면 상에서 음으로 하전된 핵산 및 양으로 하전된 지질(양성자성 제1 지질 성분을 구성하는 아미노 지질 또는 다른 지질은 지질 상의 양성자성 기의 pKa 미만의 pH를 가지는 완충제 중에서 양으로 하전됨)의 이온성 인력에 기인하여 지질 입자(리포좀 또는 지질 베시클)의 표면에 부착된 핵산의 일부를 함유할 수 있다. 바람직한 실시형태의 한 그룹에서, 지질의 혼합물은 지질의 알코올 용액이며, 각 용액의 용적은 조합 시 조절되며, 얻어진 알코올 함량은 약 20용적% 내지 약 45용적%이다. 혼합물의 조합 방법은 종종 생성된 제형의 규모에 의존하여 임의의 다양한 공정을 포함할 수 있다. 예를 들어, 전체 용적이 약 10-20㎖ 또는 그 기만일 때, 용액은 테스트 튜브 내에서 합쳐지고, 볼텍스 믹서를 사용하여 함께 교반될 수 있다. 대규모 공정은 적합한 생성 규모 유리제품 내에서 수행될 수 있다.
선택적으로, 지질 혼합물을 치료제(핵산)의 완충 수용액과 조합함으로써 생성된 지질-캡슐화된 치료제(예를 들어, 핵산) 복합체는 원하는 크기 범위 및 상대적으로 좁은 분포의 지질 입자 크기를 달성하기 위한 크기로 될 수 있다. 바람직하게는, 본 명세서에 제공된 조성물은 약 70㎚ 내지 약 200㎚, 더 바람직하게는 약 90 내지 약 130㎚의 평균 직경의 크기로 될 것이다. 리포좀을 원하는 크기로 사이징(sizing)하기 위하여 몇몇 기법이 이용가능하다. 한 사이징 방법은 본 명세서에 참조로 포함된 미국특허 제4,737,323호에서 기재된다. 욕(bath) 또는 프로브 초음파처리 중 하나에 의한 리포좀 현탁액의 초음파 처리는 소형 유니라멜라 베시클(small unilamellar vesicle, SUV)을 약 0.05 마이크론 미만의 크기로 점진적인 크기 감소를 만든다. 균질화는 거대 리포좀을 더 작은 것으로 단편화하기 위한 전단 에너지에 의존하는 다른 방법이다. 전형적인 균질화 방법에서, 멀티라멜라 베시클은 전형적으로 약 0.1 내지 0.5 마이크론의 선택된 리포좀 크기가 관찰될 때까지 표준 에멀젼 균질기를 통해 재순환된다. 두 방법 모두에서, 입자 크기 분포는 통상적인 레이저-빔 입자 크기 결정으로 모니터링될 수 있다. 본 명세서의 특정 방법에 대해, 균일한 베지클 크기를 얻기 위하여 압출이 사용된다. 소-기공 폴리카보네이트 막 또는 비대칭 세라믹막을 통한 리포좀 조성물의 압출은 상대적으로 잘 한정된 크기 분포를 초래한다. 전형적으로, 현탁액은 원하는 리포좀 복합체 크기 분포가 달성될 때까지 1회 이상 막을 통해 순환된다. 리포좀은 연속적으로 더 작은-기공 막을 통해 압출되어 리포좀 크기의 점진적 감소가 달성될 수 있다. 일부 예에서, 형성되는 지질-핵산 조성물은 어떤 사이징 없이 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 방법은 지질-핵산 조성물의 지질 부분 상에서 적어도 일부의 표면 전하를 중화하는 단계를 추가로 포함한다. 표면 전하를 적어도 부분적으로 중화함으로써, 비캡슐화된 핵산은 지질 입자 표면으로부터 유리되며, 통상적인 기법을 사용하여 조성물로부터 제거될 수 있다. 바람직하게는, 비캡슐화되고 표면 흡착된 핵산은 완충제 용액의 교환을 통해 얻어진 조성물로부터 제거된다. 예를 들어 시트레이트 완충제(pH 약 4.0, 조성물을 형성하기 위하여 사용함)을 HEPES-완충 식염수(HBS pH 약 7.5) 용액으로 대체하는 것은 리포좀 표면의 중화 및 표면으로부터의 핵산 방출을 초래한다. 그 다음에 방출된 핵산은 표준 방법을 사용하여 크로마토그래피를 통해 제거된 후, 사용한 지질의 pKa 초과의 pH를 갖는 완충제로 전환된다.
선택적으로 지질 베시클(즉, 지질 입자)은 수성 완충제 중에서 수화로 형성되며 핵산의 첨가 전 상기 기재한 어떤 방법을 사용하여 사이징될 수 있다. 상기 기재한 바와 같이, 수성 완충제는 아미노 지질의 pKa 미만의 pH를 가져야 한다. 핵산 용액은 그 다음에 이런 사이징되고, 사전형성된 베시클에 첨가될 수 있다. 헥산을 이러한 "사전-형성된" 베시클로 캡슐화하기 위하여 혼합물은 에탄올과 같은 알코올을 함유하여야 한다. 에탄올의 경우에, 약 20% (w/w) 내지 약 45% (w/w)의 농도로 존재하여야 한다. 추가로, 지질 베시클의 조성물 및 핵산의 특성에 의존하여 약 25℃ 내지 약 50℃의 온도로 수성 완충제-에탄올 혼합물 중에서 사전 형성된 베시클와 핵산의 혼합물을 가온하는 것이 필요할 수 있다. 지질 베시클 내 원하는 수준의 핵산을 달성하기 위한 캡슐화 공정의 최적화는 에탄올 농도 및 온도와 같은 변수의 조작을 필요로 한다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 핵산 캡슐화를 위한 적합한 조건의 예는 실시예에 제공한다. 일단 핵산이 사전형성된 베시클 내에서 캡슐화되면, 외부 pH는 증가되어 표면 전하를 적어도 부분적으로 중화할 수 있다. 그 다음에 비캡슐화되고 표면 흡착된 핵산은 상기 기재된 바와 같이 제거될 수 있다.
치료 방법
본 명세서에 기재된 지질 입자 및 조성물은 시험관 내 및 생체 내 둘 다에서 결합되거나 캡슐화된 치료제를 세포에 전달하는 것을 포함하는 다양한 목적을 위하여 사용될 수 있다. 따라서, 치료가 필요한 피험체에서 질병 또는 장애를 치료하는 방법은 피험체를 적합한 치료제와 결합된 지질과 접촉하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은, 지질 입자는 예를 들어 siRNA 분자 및 플라스미드를 포함하는 핵산의 전달에 특히 유용하다. 따라서, 지질 입자 및 조성물은 표적 유전자 발현을 감소시키는 핵산(예를 들어, siRNA) 또는 원하는 단백질의 발현을 증가시키기 위해 사용될 수 있는 핵산(예를 들어, 원하는 단백질을 암호화하는 플라스미드)과 결합된 지질 입자와 세포를 접촉시킴으로써 시험관 내 및 생체 내 둘 다에서 표적 유전자 및 단백질의 발현을 조절하는 것에 사용될 수 있다.
지질 입자는 시험관내 또는 생체내에서 세포에 치료제를 전달하기 위하여 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 치료제는 핵산-지질 입자를 사용하여 세포에 전달되는 핵산이다. 지질 입자 및 관련된 약제학적 조성물을 사용하는 다양한 방법의 하기 기재는 핵산-지질 입자에 관한 기재로 예시되지만, 이들 방법 및 조성물이 이러한 치료가 유리한 임의의 질병 또는 장애의 치료를 위한 임의의 치료제의 전달에 용이하게 적용된다는 것이 이해된다.
특정 실시형태에서, 핵산을 세포 내로 도입하는 방법이 기재된다. 세포 내로 도입을 위한 바람직한 핵산은 siRNA, 면역-자극 올리고뉴클레오타이드, 플라스미드, 안티센스 및 리보자임이다. 이 방법은 세포내 전달이 일어나기에 충분한 시간의 기간 동안 세포와 입자 또는 조성물을 접촉시킴으로써 수행될 수 있다.
조성물은 거의 모든 세포 유형에 흡착될 수 있다. 일단 흡착되면, 해당 핵산-지질 입자는 세포의 일부에 의해 흡수되거나, 세포막과 지질을 교환하거나, 또는 세포와 융합할 수 있다. 복합체의 핵산 부분의 전달 또는 포함은 이들 경로 중 어느 하나를 통해 일어날 수 있다. 제한하려는 의도는 아니지만, 그 다음에 입자를 엔도사이토시스에 의해 세포 내로 취하는 입자의 경우에 엔도솜 막과 상호작용하여, 가능하게는 비이중층의 형성에 의해 엔도솜 막의 탈안정화를 초래하며, 세포질 내로 캡슐화된 핵산의 도입을 초래하는 것으로 믿어진다. 유사하게 세포 혈장막과 입자의 직접적 융합의 경우에, 융합이 일어날 때, 리포좀 막은 세포막 내로 통합되며, 리포좀의 내용물은 세포내 유체와 합쳐진다. 세포와 지질-핵산 조성물 간의 접촉은, 시험관 내에서 수행될 때 생물학적으로 양립가능한 배지 내에서 일어날 것이다. 조성물 농도는 특정 용도에 의존하여 크게 다를 수 있지만, 일반적으로 약 1μ㏖ 내지 10m㏖이다. 특정 실시형태에서, 지질-핵산 조성물에 의한 세포의 처치는 약 1 내지 24 시간, 바람직하게는 약 2 내지 8시간의 기간 동안 생리적 온도(약 37℃)에서 일반적으로 수행될 것이다. 시험관 내 적용을 위하여, 핵산은 식물 유래이든 동물 유래이든, 척추동물이든 무척추동물이든, 임의의 조직 또는 유형을 가지든 그렇지 않든 배양물 내 임의의 세포에 전달될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 세포는 동물 세포, 더 바람직하게는 포유류 세포, 및 가장 바람직하게는 인간 세포일 것이다.
실시형태의 한 그룹에서, 지질-핵산 입자 현탁액은 약 103 내지 약 105 세포/㎖, 더 바람직하게는 약 2 X 104 세포/㎖의 세포 밀도를 가지는 60-80% 컨플루언트 플레이팅된 세포에 첨가된다. 세포에 첨가된 현탁액의 농도는 바람직하게는 약 0.01 내지 20 ㎍/㎖, 더 바람직하게는 약 1㎍/㎖이다.
다른 실시형태에서, 지질 입자는 세포 또는 세포주(예를 들어, 종양 세포주)에 핵산을 전달하기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 세포주의 비제한적 예는 하기를 포함한다: HELA(ATCC Cat N: CCL-2), KB(ATCC Cat N: CCL-17), HEP3B(ATCC Cat N: HB-8064), SKOV-3(ATCC Cat N: HTB-77), HCT-116(ATCC Cat N: CCL-247), HT-29(ATCC Cat N: HTB-38), PC-3(ATCC Cat N: CRL-1435), A549(ATCC Cat N: CCL-185), MDA-MB-231(ATCC Cat N: HTB-26).
전형적인 적용은 특정 세포 표적을 녹다운하거나 침묵시키도록 siRNA의 세포내 전달을 제공하는 잘 알려진 방법을 사용하는 것을 포함한다. 대안의 적용은 치료적으로 유용한 폴리펩타이드에 대해 암호화하는 DNA 또는 mRNA 서열의 전달을 포함한다. 이 방식에서, 치료는 결핍 또는 부재 유전자 생성물을 공급함으로써 유전적 질병에 대해 제공된다(즉, 뒤셴근이영양증에 대해 문헌[Kunkel, et al., Brit. Med. Bull. 45(3):630-643 (1989)]을 참조, 낭포성섬유증에 대해 문헌[Goodfellow, Nature 341:102-103 (1989)]을 참조). 조성물에 대한 다른 사용은 세포 내 안티센스 올리고 뉴클레오타이드의 도입을 포함한다(문헌[Bennett, et al., Mol. Pharm. 41:1023-1033 (1992)]을 참조).
대안으로, 조성물은 또한 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 생체 내에서 세포에 핵산을 전달하기 위하여 사용될 수 있다. DNA 또는 mRNA 서열의 전달에 대하여, 본 명세서에 참조로 포함된 문헌[Zhu, et al., Science 261:209-211 (1993)]은 DOTMA-DOPE 복합체를 사용하는 세포거대바이러스(cytomegalovirus, CMV)-클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(chloramphenicol acetyltransferase, CAT) 발현 플라스미드의 정맥내 전달을 기재한다. 본 명세서에 참조로 포함된 문헌[Hyde, et al., Nature 362:250-256 (1993)]은 리포좀을 사용하여 마우스의 기도 상피에 및 폐의 폐포에 낭포성 섬유증 막전위 전도 조절자(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR) 유전자의 전달하는 것을 기재한다. 본 명세서에 참조로 포함도는 문헌[Brigham, et al., Am. J. Med. Sci. 298:278-281 (1989)]은 세포내 효소를 암호화하는 기능성 원핵세포 유전자, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(chloramphenicol acetyltransferase, CAT)에 의한 마우스 폐의 생체 내 트랜스펙션을 기재한다. 따라서, 조성물은 감염성 질병의 치료에 사용될 수 있다.
생체 내 투여를 위하여, 약제학적 조성물은 바람직하게는 비경구로, 즉 관절내로, 정맥내로, 복강내로, 피하로, 또는 근육내로 투여된다. 특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 볼루스 주사에 의해 정맥내로 또는 복강내로 투여된다. 예를 들어, 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Stadler, et al.], 미국특허 제5,286,634를 참조한다. 세포내 핵산 전달은 또한 문헌[Straubringer, et al., Methods in Enzymology, Academic Press, New York. 101:512-527 (1983); Mannino, et al., Biotechniques 6:682-690 (1988); Nicolau, et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 6:239-271 (1989), 및 Behr, Acc. Chem. Res. 26:274-278 (1993)]에서 논의되었다. 지질-기반 치료제의 또 다른 투여방법은, 예를 들어 라만(Rahman) 등의 미국특허 제3,993,754호; 시어스(Sears)의 미국특허 제4,145,410호; 파파하드조포우로스(Papahadjopoulos) 등의 미국특허 제4,235,871호; 슈네이더(Schneider)의 미국특허 제4,224,179호; 렝크(Lenk) 등의 미국특허 제4,522,803호; 및 파운틴(Fountain) 등의 미국특허 제4,588,578호에 기재되어 있다.
다른 방법에서, 약제학적 제제는 조직에 제제의 직접 적용에 의해 표적 조직과 접촉될 수 있다. 적용은 국소의 "개방" 또는 "폐쇄" 방법으로 만들어질 수 있다. "국소"는 환경에 노출된 조직, 예컨대 피부, 인두, 외이도 등에 약제학적 제제의 직접적 적용을 의미한다. "개방"은 환자 피부를 절개하고 약제학적 제제가 적용되는 기저 조직을 직접 시각화하는 것을 포함하는 방법이다. 이는 일반적으로 수술적 방법, 예컨대 폐를 평가하기 위한 개흉, 복부 내장을 평가하기 위한 복부 개복술, 또는 표적 조직에 다른 직접적 수술에 의해 수행된다. "폐쇄" 방법은 내부 표적 조직이 직접적으로 시각화되지 않았지만 피부 내 작은 상처를 통해 도구를 삽입하는 것을 통해 평가되는 침습적 방법이다. 예를 들어, 제제는 니들 세척에 의해 복막에 투여될 수 있다. 마찬가지로, 약제학적 제제는 요추 천자 동안 인퓨전에 의해 수막 또는 척수에 투여된 다음 척추마취 또는 척수의 메트라자마이드 이미징을 위해 보통 실행되는 환자의 위치조정이 있을 수 있다. 대안적으로, 제제는 내시경 장치를 통해 투여될 수 있다.
지질-핵산 조성물은 또한 에어로졸 흡입으로 폐에(문헌[Brigham, et al., Am. J. Sci. 298(4):278-281 (1989)]을 참조) 또는 질병 부위에 직접 주사에 의해(Culver, Human Gene Therapy, MaryAnn Liebert, Inc., Publishers, New York. pp.70-71 (1994)) 투여될 수 있다.
지질-치료제 입자에 대한 투약량은 치료제 대 지질의 비 및 환자의 연령, 체중 및 상태를 기준으로 투여하는 담당의사의 의견에 의존할 것이다.
한 실시형태에서, 표적 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 발현 조절 방법이 기재된다. 본 방법은 일반적으로 표적 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 발현을 조절할 수 있는 핵산과 결합된 지질 입자와 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "조절하는"은 표적 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 발현을 변경시키는 것을 지칭한다. 상이한 실시형태에서, 조절은 증가시키는 것 또는 향상시키는 것을 의미할 수 있으며, 또는 줄이는 것 또는 감소시키는 것을 의미할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 발현 수준의 측정 방법은 공지되어 있으며 당업계에 이용가능하고, 예를 들어 역전사-중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR) 및 면역조직 화학 기법을 사용하는 방법을 포함할 것이다. 특정 실시형태에서, 표적 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 발현 수준은 적절한 대조군 값과 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 50% 초과로 증가되거나 감소된다.
예를 들어, 폴리펩타이드의 증가된 발현이 요망된다면, 헥산은 원하는 폴리펩타디으를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터일 수 있다. 다른 한편으로, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 감소된 발현이 요망된다면, 해당 핵산은 예를 들어 표적 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 특이적으로 혼성화함으로써, 표적 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 발현을 파괴하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 또는 마이크로RNA일 수 있다. 대안적으로, 해당 핵산은 이러한 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 또는 마이크로RNA를 발현하는 플라스미드일 수 있다.
특정 실시형태에서, 치료제는 siRNA, 마이크로RNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 및 siRNA, 마이크로RNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 발현할 수 있는 플라스미드로부터 선택되되, siRNA, 마이크로RNA, 또는 안티센스 RNA는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 이것의 보체를 포함하여, 폴리펩타이드의 발현은 감소된다.
다른 실시형태에서, 핵산은 폴리펩타이드 또는 이것의 기능성 변이체 또는 단편을 암호화하는 플리스미드여서, 폴리펩타이드 또는 이것의 기능성 변이체 또는 단편의 발현은 증가된다.
관련 실시형태에서, 피험체 내 폴리펩타이드의 과발현을 특징으로 하는 질병 또는 장애의 치료방법은 피험체에게 약제학적 조성물을 제공하는 단계를 포함하되, 해당 치료제는 siRNA, 마이크로RNA, 안티센스올리고뉴클레오타이드, 및 siRNA, 마이크로RNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 발현할 수 있는 플라스미드로부터 선택되고, 해당 siRNA, 마이크로RNA, 또는 안티센스 RNA는 폴리펩타이드 또는 이것의 보체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 표 1 내지 5에 기재된 지질, DSPC, Chol 및 PEG-DMG 또는 PEG-DMA에 기재된 지질로부터 선택된 양이온성 지질의 혼합물로, 예를 들어 약 20-60% 양이온성 지질: 5-25% DSPC:25-55% Chol:0.5-15% PEG-DMG 또는 PEG-DMA의 몰 비로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 해장 지질 입자는 치료적 핵산과 결합된다. 특정 실시형태에서, 지질 비는 대략 40/10/40/10(mol% 양이온성 지질/DSPC/Chol/PEG-DMG 또는 PEG-DMA), 35/15/40/10 (mol% 양이온성 지질/DSPC/Chol/PEG-DMG 또는 PEG-DMA) 또는 52/13/30/5 (mol% 양이온성 지질/DSPC/Chol/PEG-DMG 또는 PEG-DMA)이다. 실시형태의 다른 그룹에서, 이들 조성물 내 중성 지질은 POPC, DPPC, DOPE 또는 SM으로 대체된다.
다른 관련 실시형태에서, 피험체 내 폴리펩타이드의 발현 하에 특징지어지는 질병 또는 장애의 치료 방법은 약제학적 조성물을 피험체에게 제공하는 단계를 포함하되, 해당 치료제는 폴리펩타이드 또는 그것의 기능성 변이체 또는 단편을 암호화하는 플라스미드이다.
피험체 내 면역반응의 유발 방법은 약제학적 조성물을 피험체에게 제공하는 단계를 포함하되, 해당 치료제는 면역촉진 올리고뉴클레오타이드이다. 특정 실시형태에서, 면역 반응은 체액 또는 점막 면역 반응이다.
추가 실시형태에서, 약제학적 조성물은 백신 또는 항원과 조합하여 피험체에게 제공된다. 따라서, 백신은 면역촉진 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 또한 면역 반응이 요망되는 항원과 관련된 지질 입자를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 항원은 종양 항원이며 또는, 예를 들어 바이러스, 박테리아, 또는 기생충과 같은 감염성 작용물질과 관련된다.
다양한 종양 항원, 감염성 작용물질 항원, 및 다른 질병과 관련된 항원은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 이들의 예는 본 명세서에 인용된 참고문헌에 기재된다. 적합하 항원의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 폴리펩타이드 항원 및 DNA 항원을 포함한다. 항원의 구체적 예는 A형 간염, B형 간염, 천연두, 소아마비, 탄저병, 인플루엔자, 티푸스, 파상풍, 홍역, 로타바이러스, 디프테리아, 백일해, 결핵, 및 풍진 항원을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 항원은 B형 재조합 항원이다. 다른 양태에서, 항원은 A형 재조합 항원이다. 다른 양태에서, 항원은 종양 항원이다. 이러한 종양-관련 항원의 예는 MUC-1, EBV 항원 및 버킷 림프종과 관련된 항원이다. 추가 양태에서, 항원은 티로시나제-관련 단백질 종양 항원 재조합 항원이다. 당업자는 사용에 적합한 다른 항원을 알 것이다.
사용에 적합한 종양-관련 항원은 단일 종양 유형을 표시할 수 있고, 몇몇 유형의 종양 중에서 공유될 수 있으며, 및/또는 정상 세포와 비교하여 종양 세포에서 배타적으로 발현되거나 과발현될 수 있는 돌연변이와 비돌연변이 분자를 둘 다 포함한다. 단백질 및 글라이코단백질에 더하여, 탄수화물, 강글리오사이드, 글라이코지질 및 무친(mucin)의 종양-특이적 발현 패턴이 또한 기록되었다. 피험체 암 백신에서 사용을 위한 예시적인 종양-관련 항원은 암 유전자의 단백질 생성물, 종양 억제 유전자 및 종양 세포에 독특한 돌연변이 또는 재배열을 갖는 다른 유전자, 화된 배아 유전자 생성물, 종양 태아성 유전자, 조직-특이적(종양-특이적이지는 않음) 분화 항원, 성장 인자 수용체, 세포 표면 탄수화물 잔기, 외래 바이러스 단백질 및 다수의 다른 자가 단백질을 포함한다.
종양-관련 항원의 특정 실시형태는, 예를 들어 돌연변이된 항원, 예컨대 Ras p21 원발암유전자, 종양 억제 p53 및 BCR-abl 암유전자뿐만 아니라 CDK4, MUM1, 카파제 8, 및 베타 카테닌의 단백질 생성물; 갈렉틴 4, 갈렉틴 9, 탄산 무수화 효소, 알돌라제 A, PRAME, Her2/neu, ErbB-2 및 KSA, 종양태아성 항원, 예컨대 알파 페토단백질(알파 fetoproteinm AFP), 인간 융모성 생식선 자극호르몬(chorionic gonadotropin, hCG); 자가 항원, 예컨대 발암배아성 항원(carcinoembryonic antigen, CEA) 및 멜라닌세포 분화 항원, 예컨대 Mart 1/멜라닌 A, gp100, gp75, 티로시나제, TRP1 및 TRP2; 전립선 관련 항원, 예컨대 PSA, PAP, PSMA, PSM-P1 및d PSM-P2; 재활성화된 배아 유전자 생성물, 예컨대 MAGE 1, MAGE 3, MAGE 4, GAGE 1, GAGE 2, BAGE, RAGE, 및 다른 정소암 항원, 예컨대 NY-ESO1, SSX2 및 SCP1; 뮤신, 예컨대 Muc-1 및 Muc-2; 강글리오사이드, 예컨대 GM2, GD2 및 GD3, 중성 글라이코지질 및 글라이코단백질, 예컨대 루이스(y) 및 글로보-H; 및 글라이코단백질, 예컨대 Tn, 탐슨-프레이덴레히 항원(Thompson-Freidenreich antigen, TF) 및 sTn을 포함한다. 또한 전세포 및 종양 세포 용해물뿐만 아니라 이것의 면역원성 부분, 및 B 세포 림프종에 대한 사용을 위한 B 림프종의 단일클론 증식 상에서 발현된 면역글로불린 이디오형(idiotype)이 본 명세서의 종양-관련 항원으로 포함된다.
병원체는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 감염성 작용물질, 예를 들어 포유류, 및 더 구체적으로는 인간을 감염시키는 바이러스를 포함한다. 감염성 바이러스의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 레트로비리대(Retroviridae)(예를 들어, 인간 면역결핍 바이어스, 예컨대 HIV-1(또한 HTLV-III, LAV 또는 HTLV-III/LAV, 또는 HIV-III로 언급됨); 및 다른 분리물, 예컨대 HIV-LP; 피코르나비리대(Picornaviridae)(예를 들어, 소아마비 바이러스, A형 간염 바이러스; 장내 바이러스, 인간 콕삭키 바이러스, 리노바이러스, 에코바이러스; 칼시비리대(Calciviridae)(예를 들어 위장염을 야기하는 균주); 토가비리대(Togaviridae)(예를 들어, 뇌염 바이러스, 풍진 바이러스); 플라비리대(Flaviridae)(예를 들어, 뎅기열 바이러스, 뇌염 바이러스, 황열 바이러스); 코로노비리대(Coronoviridae)(예를 들어, 코로나바이러스); 랍도비리대(Rhabdoviradae)(예를 들어, 소포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스); 코로나비리대(예를 들어, 코로나바이러스); 랍도비리대(예를 들어, 소포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스); 필로비리대(Filoviridae)(예를 들어, 에볼라 바이러스); 파라믹소비리대(Paramyxoviridae)(예를 들어, 파라인플루엔자 바이러스, 볼거리 바이러스(Orthomyxoviridae)(예를 들어, 인플루엔자 바이러스); 분가 비리대(Bungaviridae)(예를 들어, 한탄 바이러스, 분가 바이러스, 플레보바이러스 및 나이로 바이러스); 아레나 비리대(Arena viridae)(출혈열 바이러스); 레오비리대(Reoviridae)(예를 들어, 레오바이러스, 오르비바이러스 및 로타바이러스); 비르나비리대(Birnaviridae); 헤파드나비리대(Hepadnaviridae)(B형 간염 바이러스); 파보비리대(Parvovirida)(파보바이러스); 파포바 비리대(Papovaviridae)(유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스); 아데노비리대(Adenoviridae)(대부분의 아데노바이러스); 헤르페스비리대(Herpesviridae) 단순 헤르페스 바이러스(단순 헤르페스 바이러스, HSV) 1 및 2, 바리셀라 조스터 바이러스, 세포거대바이러스(CMV), 헤르페스 바이러스; 폭스비리대(Poxviridae)(천연두 바이러스, 백시니아 바이러스, 수두 바이러스); 및 이리도비리대(Iridoviridae)(예를 들어, 아프리카 돼지 콜레라 바이러스); 및 미분류 바이러스(예를 들어, 해면상뇌증의 유병기생충, 델타 간염의 작용물질(B형 간염 바이러스의 결함있는 파생물이 되는 것으로 생각됨), 비A형 간염, 비B형 간염의 작용물질(부류 1 = 내부에 전염됨; 부류 2 = 비경구적으로 전염됨(즉, C형 간염); 노워크 및 관련 바이러스, 및 아스트로바이러스를 포함한다.
또한 그램 음성 및 그램 양성 박테리아는 척추동물 내에서 항원으로 작용한다. 이러한 그램 양성 박테리아는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 파스튜엘라(Pasteurella) 종, 스타필로콕시(Staphylococci) 종, 및 스트렙토코커스(Streptococcus) 종을 포함한다. 그램 음성 박테리아는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 에스캐리키아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 및 살모넬라(Salmonella) 종을 포함한다. 감염성 박테리아의 구체적 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 헬리코박터파일로리(Helicobacterpyloris) 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 레지오넬라 뉴모필리아(Legionella pneumophilia), 마이코박테리아(Mycobacteria) 종(예를 들어, 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis), 마이코박테리움 아비움(M. avium), 마이코박테리움 인트라셀룰라(M. intracellulare), 마이코박테리움 칸사이(M. kansaii), 마이코박테리움 고르도내(M. gordonae)), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 네이세리아 고노르호에(Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 스트렙토코커스 파이오제네스(A군 스트렙토코커스), 스트렙토코커스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae)(B군 스트렙토코커스), 스트렙토코커스(비리단스 군), 스트렙코코커스패칼리스(Streptococcusfaecalis), 스트렙코코커스 보비스(Streptococcus bovis), 스트렙토코커스(혐기성 종), 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 병원성 캄필로박터 종, 엔테로코커스(Enterococcus)종, 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus infuenzae), 바실러스 안트라시스(Bacillus antracis), 코리네박테리움 디프테리아(corynebacterium diphtheriae), 코리네박테리움(corynebacterium) 종, 에리시펠로트릭스 류시오파티애(Erysipelothrix rhusiopathiae), 클로스트리디움 페르프린저스(Clostridium perfringers), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes), 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 파스튜렐라 물토시다(Pasturella multocida), 박테로이데스(Bacteroides) 종, 푸로박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 스트렙토바실러스 모닐리포미스(Streptobacillus moniliformis), 트레포네마 팔리디움(Treponema pallidium), 트레포네마 페르테누에(Treponema pertenue), 렙토스피라(Leptospira), 리케챠(Rickettsia), 및 악티노마이세스 이스라엘리(Actinomyces israelli)를 포함한다.
병원체의 추가적인 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 포유류, 및 더 구체적으로는 인간을 감염시키는 감염성 진균을 포함한다. 감염성 진균의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans), 히스토플라스마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum), 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 블라스토마이세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 칸디다 알비칸스를 포함한다. 감염성 기생충의 예는 플라스모듐(Plasmodium), 예컨대 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 플라스모듐 말라리애(Plasmodium malariae), 플라스모듐 오발레(Plasmodium ovale), 및 플라스모듐 비박스(Plasmodium vivax)를 포함한다. 다른 감염성 유기체(즉, 원생생물)은 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii)를 포함한다.
한 실시형태에서, 제형은, 이에 제한되는 것은 아니지만, FVII, Eg5, PCSK9, TPX2, apoB, SAA, TTR, RSV, PDGF 베타 유전자, Erb-B 유전자, Src 유전자, CRK 유전자, GRB2 유전자, RAS 유전자, MEKK 유전자, JNK 유전자, RAF 유전자, Erk1/2 유전자, PCNA(p21) 유전자, MYB 유전자, JUN 유전자, FOS 유전자, BCL-2 유전자, Cyclin D 유전자, VEGF 유전자, EGFR 유전자, 사이클린 A 유전자, 사이클린 E 유전자, WNT-1 유전자, 베타-카테닌 유전자, c-MET 유전자, PKC 유전자, NFKB 유전자, STAT3 유전자, 수르비빈(survivin) 유전자, Her2/Neu 유전자, SORT1 유전자, XBP1 유전자, 토포아이소머라제 I 유전자, 토포아이소머라제 II 알파 유전자, p73 유전자, p21(WAF1/CIP1) 유전자, p27(KIP1) 유전자, PPM1D 유전자, RAS 유전자, 카베올린 I 유전자, MIB I 유전자, MTAI 유전자, M68 유전자, 종양 억제 유전자, p53 종양 억제 유전자, p53 패밀리 구성원 DN-p63, pRb 종양 억제 유전자, APC1 종양 억제 유전자, BRCA1 종양 억제 유전자, PTEN 종양 억제 유전자, mLL 융합 유전자, BCR/ABL 융합 유전자, TEL/AML1 융합 유전자, EWS/FLI1 융합 유전자, TLS/FUS1 융합 유전자, PAX3/FKHR 융합 유전자, AML1/ETO 융합 유전자, 알파 v-인테그린 유전자, Flt-1 수용체 유전자, 튜불린 유전자, 인간 파필로마 바이러스 유전자, 인간 파필로마 바이러스 복제에 필요한 유전자, 인간 면역결핍 바이러스 유전자, 인간 면역결핍 바이러스 복제에 필요한 유전자, A형 간염 바이러스 유전자, A형 간염 바이러스 복제에 필요한 유전자, B형 간염 바이러스 유전자, B형 간염 바이러스 복제에 필요한 유전자, C형 간염 바이러스 유전자 유전자, C형 간염 바이러스 유전자 복제에 필요한 유전자, D형 간염 바이러스 유전자, D형 간염 바이러스 복제에 필요한 유전자, E형 간염 바이러스 유전자, E형 간염 바이러스 복제에 필요한 유전자, F형 간염 바이러스 유전자, F형 간염 바이러스 복제에 필요한 유전자, G형 간염 바이러스 유전자, G형 간염 바이러스 복제에 필요한 유전자, H형 간염 바이러스 유전자, H형 간염 바이러스 복제에 필요한 유전자, 호흡기 세포 융합 바이러스 유전자, 호흡기 세포 융합 바이러스 복제에 필요한 유전자, 단순 헤르페스 바이러스 유전자, 단순 헤르페스 바이러스 복제에 필요한 유전자, 헤르페스 세포거대바이러스 유전자, 헤르페스 세포거대바이러스 복제에 필요한 유전자, 헤르페스 엡스타인 바르 바이러스 유전자, 헤르페스 엡스타인 바르 바이러스 복제에 필요한 유전자, 카포시 육종-관련 헤르페스 바이러스 유전자, 카포시 육종-관련 헤르페스 바이러스 복제에 필요한 유전자, JC 바이러스 유전자, JC 바이러스 복제에 필요한 인간 유전자, 믹소바이러스 유전자, 믹소바이러스 유전자 복제에 필요한 유전자, 리노바이러스 유전자, 리노바이러스 복제에 필요한 유전자, 코로나바이러스 유전자, 코로나바이러스 복제에 필요한 유전자, 웨스터 나일 바이러스 유전자, 웨스터 나일 바이러스 복제에 필요한 유전자, 세인트 루이스 뇌염 유전자, 세인트 루이스 뇌염 복제에 필요한 유전자, 진드기 매개 뇌염 바이러스 유전자, 진드기 매개 뇌염 바이러스 복제에 필요한 유전자, 머레이 밸리 뇌염 바이러스 유전자, 머리에 밸리 뇌염 바이러스 복제에 필요한 유전자, 뎅기열 바이러스 유전자, 뎅기열 바이러스 유전자 복제에 필요한 유전자, 시미안 바이러스 40 유전자, 시미안 바이러스 40 복제에 필요한 유전자, 인간 T 세포 림프친화 바이러스 유전자, 인간 T 세포 림프친화 바이러스 복제에 필요한 유전자, 몰로니-설치류 백혈병 바이러스 유전자, 몰로니-설치류 백혈병 바이러스 복제에 필요한 유전자, 뇌심근염 바이러스 유전자, 뇌심근염 바이러스 복제에 필요한 유전자, 홍역 바이러스 유전자, 홍역 바이러스 복제에 필요한 유전자, 베리셀라 조스터 바이러스 유전자, 베리셀라 조스터 바이러스 복제에 필요한 유전자, 아데노바이러스 유전자, 아데노바이러스 복제에 필요한 유전자, 황열 바이러스 유전자, 황열 바이러스 복제에 필요한 유전자, 소아마비 바이러스 유전자, 소아마비 바이러스 복제에 필요한 유전자, 폭스 바이러스 유전자, 폭스 바이러스 복제에 필요한 유전자, 플라스모디움 유전자, 플라스모디움 유전자 복제에 필요한 유전자, 마이코박테리움 울세란스 유전자, 마이코박테리움 울세란스 복제에 필요한 유전자, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 유전자, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 복제에 필요한 유전자, 마이코박테리움 레프래(Mycobacterium leprae) 유전자, 마이코박테리움 레프래 복제에 필요한 유전자, 스타필로코커스 아우레우스 유전자, 스타필로코커스 아우레우스 복제에 필요한 유전자, 스트렙토코커스 뉴모니애 유전자, 스트렙토코커스 뉴모니애 복제에 필요한 유전자, 스트렙토코커스 파이오겐스(Streptococcus pyogenes) 유전자, 스트렙토코커스 파이오겐스 복제에 필요한 유전자, 클라미디아 뉴모니애 유전자, 클라미디아 뉴모니애 복제에 필요한 유전자, 마이코플라즈마 뉴모니애 유전자, 마이코플라즈마 뉴모니애 복제에 필요한 유전자, 인테그린 유전자, 셀렉틴 유전자, 보체계 유전자, 케모카인 유전자, 케모카인 수용체 유전자, GCSF 유전자, Gro1 유전자, Gro2 유전자, Gro3 유전자, PF4 유전자, MIG 유전자, 프로-혈소판 염기성 단백질 유전자, MIP-1I 유전자, MIP-1J 유전자, RANTES 유전자, MCP-1 유전자, MCP-2 유전자, MCP-3 유전자, CMBKR1 유전자, CMBKR2 유전자, CMBKR3 유전자, CMBKR5v, AIF-1 유전자, I-309 유전자, 이온 채널의 성분에 대한 유전자, 신경전달물질 수용체에 대한 유전자, 신경전달물질 리간드에 대한 유전자, 아밀로이드-패밀리 유전자, 프레세닐린 유전자, HD 유전자, DRPLA 유전자, SCA1 유전자, SCA2 유전자, MJD1 유전자, CACNL1A4 유전자, SCA7 유전자, SCA8 유전자, LOH 세포 내에서 발견되는 대립유전자, 또는 다형체 유전자 중 하나의 대립유전자와 같은 표적을 침묵시키거나 조절하기 위하여 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 핵산 분자 및 양이온성 지질을 포함하는 핵산 지질 입자를 투여하는 단계를 포함하는 핵산 분자의 전달 방법에 관한 것이며, 해당 양이온성 지질은
(i) 중심 탄소 원자,
(ii) 중심 원자에 직접 결합된 헤드 기, 및
(iii) 중심 탄소 원자에 직접 결합된 2개의 소수성 꼬리를 가지되, 각각의 소수성 꼬리는 해당 중심 원자에 부착된 C14 또는 초과의 지방족 기를 포함하며, 지방족 기는 (a) 생분해성 기와 중심 탄소 원자 사이의 적어도 4개의 탄소 원자 쇄가 있는 생분해성 기에 의해 방해되고, 또는 (b) 소수성 꼬리의 말단 단부에서 생분해성 기를 포함하여 소수성 꼬리의 절단이 생체 내에서 발생한 후 핵산 분자의 전달까지 양이온성 지질이 무결함으로 유지된다.
정의
본 명세서에 사용되는 용어 "양이온성 지질"은 생리적 pH에서 양이온성 지질을 형성하도록 양성자화될 수 있는 1 또는 2개의 지방산 또는 지방 지방족 쇄 및 아미노 헤드 기(알킬아미노 또는 다이알킬아미노 기를 포함)를 가지는 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 "아미노 지질"로 언급된다.
복합체의 투여가 질병 또는 장애에 대한 효과적인 치료적 섭생인 피험체 또는 환자는 바람직하게는 인간이지만, 임상 시험 또는 스크리닝 또는 활성 실험에 대해서 실험 동물을 포함하는 임의의 동물일 수 있다. 따라서, 당업자에게 용이하게 인식될 수 있는 것과 같이, 본 발명의 방법, 화합물 및 조성물은 임의의 동물, 특히 포유류에 투여하기에 적합하며, 이에 제한되는 것은 아니지만, 인간, 가축, 예컨대 고양이 또는 개 피험체, 이에 제한되는 것은 아니지만, 소, 말, 염소, 양, 및 돼지 피험체, 야생 동물(야생형이든 동물원 정원이든)과 같은 농장 동물, 연구 동물, 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 염소, 양, 돼지, 개, 및 고양이, 조류, 예컨대 닭, 칠면조, 및 명금을, 즉 수의학적 용도를 위해 포함한다.
상기 화학식에 인용된 다수의 화학기는 특정 순서(예를 들어, -OC(O)-)로 기재된다. 달리 표시되지 않는다면 화학기는 제공되는 순서에서 화학식 내에 포함되는 것으로 의도된다. 예를 들어, 형태 -(R)i-(M1)k-(R)m-의 화학식은, 달리 특정되지 않는다면, M1은 -C(O)O-이며 k는 1이고 -(R)i-C(O)O-(R)m-을 지칭한다. 화학기가 특정 순서로 기재될 때, 달리 특정되지 않는다면 또한 역순이 또한 생각되는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 화학식 -(R)i-(M1)k-(R)m-에서, M1은 -(O)NH- (즉, -(R)i-C(O)-NH-(R)m-)로 정의되며, 달리 특정되지 않는다면, M1이 -NHC(O)-(즉, -(R)i-NHC(O)-(R)m-)인 경우의 화합물이 또한 생각된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "생분해성 기"는 생물학적 환경, 예를 들어 유기체, 기관, 조직, 세포 또는 세포소 기관 내에서 결합 파괴 반응을 겪을 수 있는 하나 이상의 결합을 포함하는 기를 지칭한다. 예를 들어, 생분해성 기는 포유류, 예컨대 인간에 의해(예를 들어, 가수분해로) 대사될 수 있다. 생분해성 결합을 함유하는 일부 기는, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만, 에스터, 다이티올 및 옥심을 포함한다. 생분해성 기의 비제한적 예는 -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -S-S-, -C(R5)=N-, -N=C(R5)-, -C(R5)=N-O-, -O-N=C(R5)-, -C(O)(NR5)-, -N(R5)C(O)-, -C(S)(NR5)-, -N(R5)C(O)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -OC(O)O-, -OSi(R5)2O-, -C(O)(CR3R4)C(O)O-, 또는 -OC(O)(CR3R4)C(O)-이다.
본 명세서에 사용되는 "지방족" 기는 탄소 원자가 쇄에 연결되며, 포화 또는 불포화인 비방향족 기이다.
용어 "알킬" 및 "알킬렌"은 직쇄 또는 분지쇄의 포화 탄화수소 모이어티를 지칭한다. 한 실시형태에서, 알킬기는 직쇄의 포화 탄화수소이다. 달리 특정되지 않는다면, "알킬" 또는 "알킬렌" 기는 1 내지 24개의 탄소 원자를 함유한다. 대표적인 포화 직쇄 알킬 기는 메틸, 에틸, n-프로필, n-뷰틸, n-펜틸, 및 n-헥실을 포함한다. 대표적인 포화 분지 알킬 기는 아이소프로필, sec-뷰틸, 아이소뷰틸, tert-뷰틸, 및 아이소펜틸을 포함한다.
용어 "알케닐"은 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 가지는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 모이어티를 지칭한다. 한 실시형태에서, 알케닐 기는 1, 2 또는 3개의 이중 결합을 함유하며, 다르게는 포화된다. 달리 특정되지 않는다면, "알케닐" 기는 2 내지 24개의 탄소 원자를 함유한다. 알케닐 기는 시스와 트랜스 이성질체를 둘 다 포함한다. 대표적인 직쇄 및 분지쇄 알케닐 기는 에틸렌일, 프로필렌일, 1-뷰텐일, 2-뷰텐일, 아이소뷰틸렌일, 1-펜텐일, 2-펜텐일, 3-메틸-1-뷰텐일, 2-메틸-2-뷰텐일, 및 2,3-다이메틸-2-뷰텐일을 포함한다.
용어 "알키닐"은 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 가지는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 모이어티를 지칭한다. 달리 특정되지 않는다면, "알키닐" 기는 2 내지 24개의 탄소 원자를 함유한다. 대표적인 직쇄 및 분지된 알키닐 기는 아세틸렌일, 프로핀일, 1-뷰틴일, 2-뷰틴일, 1-펜틴일, 2-펜틴일, 및 3-메틸-1-뷰틴일을 포함한다.
용어 "아실"은 수소, 알킬로 치환된 카보닐 기, 부분적으로 포화된 또는 완전히 포화된 사이클로알킬, 부분적으로 포화된 또는 완전히 포화된 헤테로사이클, 아릴, 또는 헤테로아릴을 지칭한다. 예를 들어, 아실 기는 (C1-C20)알카노일(예를 들어, 포밀, 아세틸, 프로피오닐, 뷰티릴, 발레릴, 카프로일, 및 t-뷰틸아세틸), (C3-C20)사이클로알킬카보닐(예를 들어, 사이클로프로필카보닐, 사이클로뷰틸카보닐, 사이클로펜틸카보닐, 및 사이클로헥실카보닐), 헤테로사이클릭 카보닐(예를 들어, 피롤리디닐카보닐, 피롤리드-2-온-5-카보닐, 피페리디닐카보닐, 피페라지닐카보닐, 및 테트라헤드로푸라닐카보닐), 아로일(예를 들어, 벤조일) 및 헤테로아로일(예를 들어, 티오페닐-2-카보닐, 티오페닐-3-카보닐, 푸라닐-2-카보닐, 푸라닐-3-카보닐, 1H-피로일-2-카보닐, 1H-피로일-3-카보닐, 및 벤조[b]티오페닐-2-카보닐)와 같은 기를 포함한다.
용어 "아릴"은 방향족 모노사이클릭, 바이사이클릭, 또는 트라이사이클릭 고리 시스템을 지칭한다. 달리 특정되지 않는다면, "아릴" 기는 6 내지 14개의 탄소 원자를 함유한다. 아릴 모이어티의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 페닐, 나프틸, 안트라세닐, 및 피레닐을 포함한다.
용어 "사이클로알킬" 및 "사이클로알킬렌"은 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 및 사이클로헥실과 같은 포화 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 탄화수소 모이어티를 지칭한다. 달리 특정되지 않는다면, "사이클로알킬" 및 "사이클로알킬렌"은 3 내지 10개의 탄소 원자를 함유한다.
용어 "사이클로알킬알킬"은 알킬 기에 결합된 사이클로알킬 기를 말하며, 알킬 기는 분자의 나머지에 결합된다.
용어 "헤테로사이클" (또는 "헤테로사이클릴")은 비-방향족의 5- 내지 8-원 모노사이클릭 또는 7 내지 12-원 바이사이클릭, 또는 11- 내지 14-원 트라이사이클릭 고리 시스템을 말하며, 이는 포화 또는 불포화이고, 모노사이클릭이라면 1 내지 3개의 헤테로원자, 바이사이클릭이라면 1-6개의 헤테로원자, 또는 트라이사이클릭이라면 1-9개의 헤테로원자를 함유하며, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택되되, 해당 질소 및 황 헤테로원자는 선택적으로 산화될 수 있고, 해당 질소 헤테로원자는 선택적으로 4차화될 수 있다. 예를 들어, 헤테로사이클은 사이클로알콕시 기일 수 있다. 헤테로사이클은 헤테로사이클 내 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자를 통해 분자의 나머지에 부착될 수 있다. 헤테로사이클은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 모폴리닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페리지닐, 하이단토이닐, 발레롤락타밀, 옥시라닐, 옥세타닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로피라닐, 옥시라닐, 옥세타닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로피리디닐, 테트라하이드로프리미디닐, 테트라하이드로티오페닐, 테트라하이드로티오피라닐, 테트라하이드로피리미디닐, 테트라하이드로티오페닐, 및 테트라하이드로티오피라닐을 포함한다.
용어 "헤테로아릴"은 모노사이클릭이라면 1 내지 3개의 헤테로원자, 바이사이클릭이라면 1 내지 6개의 헤테로원자, 또는 트라이사이클릭이라면 1 내지 9개의 헤테로원자를 가지는, 방향족 5-8원 모노사이클릭, 7-12원 바이사이클, 또는 11-14원 트라이사이클릭 고리 시스템이며, 해당 헤테로원자는 O, N, 또는 S(예를 들어, 각각 모노사이클릭, 바이사이클릭, 또는 트라이사이클릭이라면, 탄소 원자 및 N, O, 또는 S의 1-3개, 1-6개, 또는 1-9개 헤테로원자)로부터 선택된다. 본 명세서에 기재된 헤테로아릴 기는 또한 통상의 탄소-탄소 결합을 공유하는 융합된 고리를 함유할 수 있다.
달리 표시되지 않는다면 용어 "치환된"은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 할로, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤티로사이클릴, 티올, 알킬티오, 옥소, 티옥시, 아릴티오, 알킬티오알킬, 아릴티오알킬, 알킬설포닐, 알킬설포닐알킬, 아릴설포닐알킬, 알콕시, 아릴옥시, 아랄콕시, 아미노카보닐, 알킬아미노카보닐, 아릴아미노카보닐, 알콕시카보닐, 아릴옥시카보닐, 할로알킬, 아미노, 트라이플루오로메틸, 시아노, 나이트로, 알킬아미노, 아릴아미노, 알킬아미노알킬, 아릴아미노알킬, 아미노알킬아미노, 하이드록시, 알콕시알킬, 카복시알킬, 알콕시카보닐알킬, 아미노카보닐알킬, acyl, 아랄콕시카보닐, 카복실산, 설폰산, 설포닐, 포스폰산, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릭, 및 지방족 기를 포함하는 특정된 치환체의 라디칼로 주어진 구조 내 하나 이상의 수소 라디칼을 대체하는 것을 지칭한다. 치환체는 추가로 치환될 수 있다는 것이 이해된다. 예시적 치환체는 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 및 사이클릭 아미노 화합물을 포함한다.
용어 "할로겐" 또는 "할로"는 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 지칭한다.
용어 "알킬아민" 및 "다이알킬아민"은 각각 -NH(알킬) 및 -N(알킬)2 라디칼을 지칭한다.
용어 "알킬포스페이트"는 -O-P(Q')(Q")-O-R을 지칭하되, Q' 및 Q"는 각각 독립적으로 O, S, N(R)2, 선택적으로 치환된 알킬 또는 알콕시이며; R은 선택적으로 치환된 알킬, ω-아미노알킬 또는 ω-(치환된)아미노알킬이다.
용어 "알킬포스포로티오에이트"는 알킬포스페이트를 지칭하되, Q' 또는 Q" 중 적어도 하나는 S이다.
용오 "알킬포스포네이트"는 알킬포스페이트를 지칭하되, Q' 또는 Q" 중 적어도 하나는 알킬이다.
용어 "하이드록시알킬"은 -O-알킬 라디칼을 지칭한다.
용어 "알킬헤테로사이클"은 알킬을 지칭하되, 적어도 하나의 메틸렌은 헤테로사이클로 대체되었다.
용어 "ω-아미노알킬"은 -알킬-NH2 라디칼을 지칭한다. 용어 "ω-(치환된)아미노알킬"은 ω-아미노알킬을 지칭하되, N 상의 H 중 적어도 하나는 알킬로 대체되었다.
용어 "ω-포스포알킬"은 -알킬-O-P(Q')(Q")-O-R을 지칭하되, Q' 및 Q"는 각각 독립적으로 O 또는 S이며, R은 선택적으로 치환된 알킬이다.
용어 "ω-티오포스포알킬"은 ω-포스포알킬을 지칭하되, Q' 또는 Q" 중 적어도 하나는 S이다.
다음의 약어가 본 명세서에 사용된다:
DSPC: 다이스테아로일포스파티딜콜린; DPPC: 1,2-다이팔미토일-sn-글라이세로-3-포스포콜린; POPC: 1-팔미토일-2-올레오일-sn-포스파티딜콜린; DOPE: 1,2-다이올레일-sn-3-포스포에탄올아민; PEG-DMG는 일반적으로 1,2-다이미리스토일-sn-글라이세롤-메톡시 폴리에틸렌 글라이콜(예를 들어, PEG 2000)를 지칭함; TBDPSCl: tert-뷰틸클로로다이페닐실란; DMAP: 다이메틸아미노피리딘; NMO: N-메틸모폴린-N-옥사이드; LiHDMS: 리튬 비스(트라이메틸실릴)아마이드; HMPA: 헥사메틸포스포르아마이드; EDC: 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필) 카보다이이미드; DIPEA: 다이아이소프로필에틸아민; DCM: 다이클로로메탄; TEA: 트라이에틸아민; TBAF: 테트라뷰틸암모늄 플루오라이드.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 보호기의 사용을 필요로 한다. 보호기 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Protective Groups in Organic Synthesis, Green, T.W. et. al., Wiley-Interscience, New York City, 1999]을 참조). 간략하게, 보호기는 작용기의 원치않는 반응을 감소시키거나 제거하는 임의의 기이다. 보호기는 작용기에 첨가되어 특정 반응 동안 그것의 반응을 가리고, 그 다음에 제거되어 원래 작용기를 드러낸다. 일부 실시형태에서 "알코올 보호기"가 사용된다. "알코올 보호기"는 알코올 작용기의 원치않는 반응성을 줄이거나 제거하는 임의의 기이다. 보호기는 당업계에 잘 공지된 기법을 사용하여 첨가되고 제거될 수 있다.
화합물은 본 명세서에 기재된 기법 중 적어도 하나 또는 공지된 유기 합성 기법에 의해 제조될 수 있다.
실시예
실시예 1
Figure 112013000350703-pct00110
화합물 2:
CH2Cl2(80㎖) 중의 화합물 1(10.0g, 18.8m㏖, 국제특허공개 WO 2010/054406를 참조)의 용액에 트라이에틸아민(7.86㎖, 56.4m㏖), DMAP(459㎎, 3.76m㏖) 및 tert-뷰틸(클로로)다이페닐실란(9.62㎖, 37.6m㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 24시간 동안 교반하였다. 그 다음에 혼합물을 CH2Cl2 로 희석하였고, 수성 포화 NaHCO3 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하였고, 무수 Na2SO4에 거쳐서 건조시켰다. 여과 및 농축 후, 조질의 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥산 중의 0-5% EtOAc)로 정제하여 2(12.4g, 16.1m㏖, 86%, 헥산에 의한 Rf = 0.24)를 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.66-7.68 (m, 4 H), 7.33-7.42 (m, 6 H), 5.30-5.39 (m, 4 H), 3.67-3.72 (m, 1 H), 1.97-2.04 (m, 8 H), 1.07-1.42 (m, 52 H), 1.05 (s, 9 H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6 H).
화합물 3: tert-뷰탄올(100㎖), THF(30㎖) 및 H2O(10㎖) 중의 2(12.4g, 16.1m㏖)의 용액에, 4-메틸모폴린 N-옥사이드(4.15g, 35.4m㏖) 및 4산화오스뮴(41㎎, 0.161㎎)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 16시간 동안 교반한 다음, 중아황산을 첨가하여 퀀칭하였다. 증발로 용매를 제거한 후, 잔사를 Et2O(500㎖) 및 H2O(300㎖)로 추출하였다. 유기층을 분리하였고 무수 Na2SO4를 거쳐서 건조시켰다. 여과 및 농축 후, 조물질을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:EtOAc = 1:1, Rf = 0.49)로 정제하여 3(12.7g, 15.1m㏖, 94%)을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.66-7.68 (m, 4 H), 7.33-7.43 (m, 6 H), 3.67-3.73 (m, 1 H), 3.57-3.62 (m, 4 H), 1.82 (t, J = 5.0 Hz, 4 H), 1.10-1.51 (m, 60 H), 1.04 (s, 9 H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6 H).
화합물 4: 1,4-다이옥산(220㎖), CH2Cl2(70㎖), MeOH(55㎖), 및 H2O(55㎖) 중의 3(12.6g, 15.0m㏖)의 용액에 NaIO4(7.70g, 36.0m㏖)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 Et2O(500㎖) 및 H2O(300㎖)로 추출하였다. 유기층을 분리하였고 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 여과 및 농축 후, 조질의 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:EtOAc = 9:1, Rf = 0.30)로 정제하여 4(7.98g, 14.5m㏖, 97%)를 얻었다. C35H54NaO3Si (M+Na)+에 대한 분자량, 계산치 573.3740, 실측치 573.3.
화합물 7: THF (20㎖) 및 HMPA (4㎖) 중의 5(문헌[Tetrahedron, 63, 1140-1145, 2006]을 참조; 1.09g, 2.18m㏖)의 용액에, -20℃에서 LiHMDS(1M THF 용액, 4.36㎖, 4.36m㏖)를 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 20분 동안 동일 온도에서 교반한 다음, -78℃로 냉각시켰다. THF(4㎖) 중의 4(500㎎, 0.908m㏖)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 교반하였고, 실온으로 밤새 가온하였다. MS 분석은 2-산의 형성을 나타내었다(6; C53H85O5Si (M-H)- 계산치 829.6166, 실측치 829.5). 혼합물에, NaHCO3(1.10g, 13.1m㏖) 및 다이메틸 설페이트(1.24㎖, 13.1m㏖)를 첨가하였고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 포화 NH4Cl 수용액(50㎖)의 첨가에 의해 반응을 퀀칭한 다음, Et2O(2 x 100㎖)로 추출하였다. 유기층을 분리하였고 무수 Na2SO4에 거쳐서 건조시켰다. 여과 및 농축 후, 조질의 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:EtOAc = 9:1, Rf = 0.35)로 정제하여 7(270㎎, 0.314m㏖, 35%)을 얻었다. C55H90NaO5Si (M+Na)+에 대한 분자량, 계산치 881.6455, 실측치 881.6484.
화합물 8: THF(2.5㎖) 중의 7(265㎎, 0.308m㏖)의 용액에, n-TBAF(1M THF 용액, 0.555㎖, 0.555m㏖)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 45℃에서 14시간 동안 교반하였다. 농축 후, 혼합물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:EtOAc = 3:1, Rf = 0.52)에 의해 정제하여 8(155㎎, 0.250m㏖, 81%)을 얻었다. C39H72NaO5 (M+Na)+에 대한 분자량, 계산치 643.5277, 실측치 643.5273.
화합물 9: CH2Cl2 (5㎖) 중에서 화합물 8(150㎎, 0.242m㏖) 및 4-(다이메틸아미노)뷰티르산 하이드로클로라이드(49㎎, 0.290m㏖)의 용액에 다이아이소프로필에틸아민 (0.126㎖, 0.726m㏖), N-(3-다이메틸아미노프로필)-N'-에틸카보다이이미드 하이드로클로라이드(56㎎, 0.290m㏖) 및 DMAP(6㎎, 0.0484m㏖)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 14시간 동안 실온에서 교반하였다. 그 다음에 반응 혼합물을 CH2Cl2(100㎖)로 희석하였고, 포화 NaHCO3 aq.(50㎖)으로 세척하였다. 유기층을 MgSO4에 거쳐서 건조시키고, 여과하였으며 농축하였다. 조질의 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(CH2Cl2 중의 0-5% MeOH)로 정제하여 화합물 9(121㎎, 0.165m㏖, 68%, CH2Cl2 중의 5% MeOH로 전개한 Rf = 0.25)를 얻었다. C45H84NO6 (M+H)+ 에 대한 분자량, 계산치 734.6299, 실측치 734.5.
화합물 10: CH3CN 및 CHCl3 중에서 CH3Cl로 화합물 9의 처리로 화합물 10을 얻을 수 있다.
실시예 2
Figure 112013000350703-pct00111
화합물 12: THF(20㎖) 및 HMPA(4㎖) 중에서 11(문헌[J. Med. Chem., 38, 636-46, 1995]를 참조; 1.25g, 2.58m㏖)의 용액에, LiHMDS(1 M THF 용액, 2.58㎖, 2.58m㏖)를 -20℃에서 첨가하였다. 혼합물을 20분 동안 동일 온도에서 교반한 다음, -78℃로 냉각시켰다. THF(9㎖) 및 HMPA(0.9㎖) 중에서 4(500㎎, 0.908m㏖)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 교반하였고, 실온으로 밤새 가온하였다. H2O(40㎖)의 첨가로 반응을 퀀칭한 다음 Et2O(150㎖ x 3)로 추출하였다. 유기층을 분리하였고 무수 Na2SO4를 거쳐서 건조시켰다. 여과 및 농축 후, 조질의 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:EtOAc = 9:1, Rf = 0.35)로 정제하여 12(136㎎, 0.169m㏖, 19%)를 얻었다. C51H82NaO5Si (M+Na)+에 대한 분자량, 계산치 825.5829, 실측치 825.5.
5 대신 13을 사용하여, 화합물 7에 대해 기재한 것과 유사한 방법 다음에 화합물 12(135㎎, 0.168m㏖, 46%)를 얻었다.
화합물 15/화합물 16: THF (5㎖) 중의 12(800㎎, 0.996m㏖)의 용액에, n-TBAF(1M THF 용액, 5㎖, 5.00m㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 45℃에서 16시간 동안 교반하였다. 농축 후, 혼합물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 15(헥산:EtOAc = 3:1, Rf = 0.46, 372㎎, 0.659m㏖, 66%) 및 16 (CH2Cl2:MeOH = 95:5, Rf = 0.36, 135㎎, 0.251m㏖, 25%)을 얻었다. 15에 대한 분자량; C35H64NaO5 (M+Na)+ 계산치 587.4651, 실측치 587.4652. 16에 대한 분자량; C33H61O5 (M+H)+ 계산치 537.4519, 실측치 537.5.
화합물 17: CH2Cl2 (5㎖) 중에서 화합물 15(164㎎, 0.290m㏖) 및 4-(다이메틸아미노)뷰티르산 하이드로클로라이드(58㎎, 0.348m㏖)의 용액에 다이아이소프로필에틸아민(0.152㎖, 0.870m㏖), N-(3-다이메틸아미노프로필)-N'-에틸카보다이이미드 하이드로클로라이드(67㎎, 0.348m㏖) 및 DMAP(7㎎, 0.058m㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 14시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 CH2Cl2(100㎖)로 희석하였고, 포화 NaHCO3 aq.(50㎖)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4를 거쳐서 건조시키고, 여과하였으며 농축하였다. 조질의 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(CH2Cl2 중의 0-5% MeOH)로 정제하여 화합물 17(158㎎, 0.233m㏖, 80%, CH2Cl2 중의 5% MeOH로 전개한 Rf = 0.24)을 얻었다. C45H84NO6 (M+H)+에 대한 분자량, 계산치 734.6299, 실측치 734.5.
화합물 18: CH3CN 및 CHCl3 중의 CH3Cl에 의한 화합물 17의 처리로 화합물 18을 얻을 수 있다.
화합물 19: THF(2㎖) 및 MeOH(2㎖) 중에서 16(130㎎, 0.242m㏖)의 용액에, 트라이메틸실릴다이아조메탄(Et2O 중의 2M 용액, 0.158㎖, 0.315m㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 14시간 동안 교반하였다. 증발시킨 후, 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:EtOAc = 3:1, Rf = 0.50)로 정제하여 19(99㎎, 0.180m㏖, 74%)를 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.29-5.40 (m, 4 H), 4.12 (q, J = 7.1 Hz, 2 H), 3.66 (s, 3 H), 3.55-3.59 (m, 1 H), 2.30 (dd, J = 14.7, 7.2 Hz, 4 H), 1.98-2.07 (m, 8 H), 1.60-1.68 (m, 4 H), 1.23-1.43 (m, 37 H).
화합물 20: CH2Cl2(3㎖) 중에서 화합물 19(95㎎, 0.168m㏖) 및 4-(다이메틸아미노)뷰티르산 하이드로클로라이드(42㎎, 0.252m㏖)의 용액에 다이아이소프로필에틸아민(0.088㎖, 0.504m㏖), N-(3-다이메틸아미노프로필)-N'-에틸카보다이이미드 하이드로클로라이드(48㎎, 0.504m㏖) 및 DMAP(4㎎, 0.034m㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 14시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 CH2Cl2(100㎖)로 희석하였고 포화 NaHCO3 aq.(50㎖)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4를 거쳐서 건조시키고, 여과하였으며 농축하였다. 조질의 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(CH2Cl2 중의 0-5% MeOH)로 정제하여 화합물 20(103㎎, 0.155m㏖, 92%, CH2Cl2 중의 5% MeOH로 전개한 Rf = 0.19)을 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.29-5.40 (m, 4 H), 4.83-4.89 (m, 1 H), 4.12 (q, J = 7.1 Hz, 2 H), 3.67 (s, 3 H), 2.28-2.34 (m, 8 H), 2.23 (s, 6 H), 1.98-2.07 (m, 8 H), 1.76-1.83 (m, 2 H), 1.60-1.68 (m, 4 H), 1.23-1.51 (m, 35 H).
화합물 21: CH3CN 및 CHCl3 중에서 CH3Cl에 의한 화합물 20의 처리로 화합물 21을 얻을 수 있다.
실시예 3: 다이-알데하이드 중간체 4에 대한 대안의 합성
Figure 112013000350703-pct00112
1-브로모-9-데센을 사용하여 다이-알데하이드 4를 반응식 3에서 나타내는 바와 같이 합성할 수 있다. 헤드 기 27을 함유하는 다이-알데하이드는, 예를 들어 비티히 반응(Wittig reaction)을 사용하는 말단 에스터-치환 지질의 합성에 유용할 수 있다. 오존분해로 다이-알데하이드 4 및 27을 얻을 수 있다.
실시예 4: 화합물 8에 대한 대안의 합성
Figure 112013000350703-pct00113
화합물 8을 반응식 4에서 나타내는 바와 같이 합성할 수 있다.
화합물 29: 500㎖ 무수 DMF 중의 NaH(오일 중에서 60%, 82g, 1.7096㏖)의 교반 현탁액에, 1.5ℓ DMF 중의 화합물 28(250g, 1.7096㏖)의 용액을 0℃에서 적하 깔대기를 사용하여 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 교반한 다음, 벤질 브로마이드(208.86㎖, 1.7096㏖)를 질소 분위기 하에 서서히 첨가하였다. 반응물을 주위 온도로 가온하였고, 10시간 동안 교반하였다. 혼합물을 잘게 부순 얼음(~2㎏)으로 퀀칭하였고, 에틸 아세테이트(2 x 1ℓ)로 추출하였다. 유기층을 물(1ℓ)로 세척하여 원치않는 DMF를 제거하였고, Na2SO4를 거쳐서 건조시키고, 진공에서 증발건조시켰다. 조질의 화합물을 DCM 중의 0-5% MeOH로 용리하는 60-120 실리카겔 상에서 정제하여 화합물 29(220g, 54%)를 연한 황색 액체로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.33-7.24 (m, 5 H), 4.49 (s, 2 H), 3.63-3.60 (m, 2 H), 3.47-3.43 (m, 2 H), 1.63-1.51 (m, 4 H), 1.39-1.23 (m, 8 H).
화합물 30: 화합물 29(133g, 0.5635㏖)를 1.5의 DCM 중에서 용해하였고, CBr4(280.35g, 0.8456㏖)를 이 교반 용액에 첨가하였으며, 반응 혼합물을 비활성 분위기 하에 0℃로 냉각시켰다. 그 다음에 PPh3(251.03g, 0.9571㏖)를 20℃ 미만의 온도를 유지하면서 일부분 첨가하였다. 첨가의 완료 후, 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응의 완료 후, 반응 혼합물로부터 침전시킨 고체(PPh3O)를 여과에 의해 제거하였고, 여과액을 잘게 부순 얼음(~ 1.5㎏)으로 희석하였으며, DCM(3 x 750㎖)으로 추출하였다. 유기층을 분리하였고, 무수 Na2SO4로 건조시켰으며, 진공 하에 증류하였다. 얻어진 조질의 화합물을 용리 시스템으로서 헥산류 중의 0-5 % 에틸 아세테이트fmf 사용하여 60-120 메쉬 실리카겔 컬럼 상에서 크로마토그래피 하여 화합물 30(150g, 89%)을 연한 황색 액체로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.33-7.25 (m, 5 H), 4.49 (s, 2 H), 3.47-3.41 (m, 2 H), 3.41-3.37 (m, 2 H), 1.86-1.80 (m, 4 H), 1.62-1.56 (m, 2 H), 1.42-1.29 (m, 8 H).
화합물 31: 새로 활성화한 Mg 터닝(24.08g, 1.003㏖)에 200㎖ 무수 THF를 첨가한 후, 비활성 분위기 하에 혼합물에 약간의 요오드를 첨가하였다. 1ℓ의 건조 THF 중에서 화합물 30(150g, 0.5016㏖)의 용액을 서서히 첨가하였고, 발열 반응을 제어하였다. 그 다음에 반응을 1시간 동안 환류로 가열한 다음 실온으로 냉각시켰다. 그 다음에 메틸 포메이트(60.24g, 1.0033㏖)를 서서히 첨가하였고, 반응을 2시간 동안 지속하였다. 완료 후, 10% HCl 다음에, 물(1ℓ)을 서서히 첨가하여 반응을 퀀칭한 후, 에틸 아세테이트(3 x 1ℓ)로 추출하였다. 유기층을 5리터 비터로 취하였고, 500㎖의 메탄올로 희석하였으며 0℃로 냉각시켰다. 이 용액에, 과량의 NaBH4(~ 5eq)를 일부분 첨가하여 HCl의 첨가에 의해 절단되지 않는 포메이트 에스터의 가수분해를 보장하였다. 얻어진 용액을 1시간 동안 교반한 다음, 휘발물을 진공 하에 제거하였다. 물(1ℓ) 중에서 잔사를 취하였고 10% HCl 용액(pH 4)으로 산성화하였다. 그 다음에 생성물을 에틸 아세테이트(3 x 1ℓ)로 추출하였다. 그 다음에 유기층을 건조시키고, 회전 증발기 상에서 농축하여 원하는 화합물 31(57g, 24%)을 고체로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.35-7.32 (m, 8 H), 7.29-7.24 (m, 2 H), 4.49 (s, 4 H), 3.56 (m, 1 H), 3.46-3.43 (m, 4 H), 1.63-1.56 (m, 4 H), 1.44-1.34 (m, 28 H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ= 138.56, 128.21, 127.49, 127.34, 72.72, 71.76, 70.37, 37.37, 29.64, 29.56, 29.47, 29.33, 26.07, 25.54.
화합물 32: 화합물 31(56g, 0.1196㏖)을 700㎖ 건조 THF 중에 용해하였고, 0℃로 냉각시켰다. TBSCl(36.06g, 0.2396㏖)을 서서히 첨가한 다음, 비활성 분위기 하에 이미다졸(32.55g, 0.4786㏖)을 첨가하였다. 그 다음에 반응물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 완료 시, 반응물을 얼음(~1㎏)으로 퀀칭하였고, 에틸 아세테이트(3 x 500㎖)로 추출하였다. 유기층을 분리하였고, 포화 NaHCO3 용액으로 세척하여 산성 불순물을 제거하였으며, Na2SO4를 거쳐서 건조시키고, 감압 하에 증발시켜 조질의 화합물을 얻어서 실리카겔(60-120 메쉬)로 정제하였고, 0-10% 에틸 아세테이트 헥산으로 용리하여 (60g, 82%)의 화합물 32를 노르스름한 색의 오일로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.33-7.24 (m, 10 H), 4.49 (s, 4 H), 3.60-3.57 (m, 1 H), 3.46-3.43 (m, 4 H), 1.61-1.54 (m, 4 H), 1.41-1.26 (m, 28 H), 0.87 (s, 9 H), 0.02 (s, 6 H).
화합물 33: 화합물 32(60g, 0.1030㏖)를 500㎖ 에틸 아세테이트 중에 용해하였고, N2로 20분 동안 탈기하였다. 탄소(12 g) 상 (10 wt %) Pd을 첨가하였고, 반응물을 수소의 분위기 하에 18시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응물을 셀라이트 층을 통해 여과하였고, 에틸 아세테이트로 세척하였다. 여과액을 진공 하에 증발시켜 다음 합성 순서에서 사용하기에 충분히 순수한 화합물 33(19g, 46%)을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 3.64-3.58 (m, 5 H), 1.59 (br, 2 H), 1.57-1.51 (m, 4 H), 1.38-1.22 (m, 28 H), 0.87 (s, 9 H), 0.02 (s, 6 H).
화합물 34: 화합물 33(8.2g, 0.0199㏖)을 100㎖ 건조 DCM 중에서 용해하였고, 0℃로 냉각시켰다. TEA(22.14㎖, 0.1592㏖)를 비활성 분위기 하에 첨가하였다. 5분 동안 혼합물을 교반한 후, 메실 클로라이드(4.6㎖, 0.059㏖)를 적하하였고, 반응물을 추가 3시간 동안 교반하였다. 반응의 완료 후, 혼합물을 얼음(~200 g)으로 퀀칭하였고, DCM(3 x 75㎖)으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 증발시켜 조질의 화합물을 얻었으며, 이를 용리 시스템으로서 헥산 중의 0-30% 에틸 아세테이트를 사용하는 60-120 메쉬 실리카겔 컬럼 상에서 정제하여 화합물 34(8.2g, 73%)를 연한 황색 액체로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 4.22-4.19 (m, 4 H), 3.60-3.58 (m, 1 H), 2.99 (s, 6 H), 1.75-1.69 (m, 4 H), 1.38-1.28 (m, 28 H), 0.86 (s, 9 H), 0.02 (s, 6 H).
화합물 35: 400㎖ 건조 에터 중의 화합물 34(8.2g, 0.0146㏖) 용액에 질소 분위기 하에 0℃에서 MgBr2 .Et2O(22.74g, 0.08817㏖)를 일부분 첨가하였다. 첨가를 완료한 후, 반응 혼합물을 28시간 동안 환류로 가열하였다. 반응의 완료 후, 반응물에 형성된 무기 물질을 여과로 제거하였다. 여과액을 증발시키고, 얻어진 조질의 화합물을 용리 시스템으로서 헥산류 중의 0-3% 에틸 아세테이트를 사용하는 60-120 메쉬 실리카겔 컬럼 상에서 정제하여 화합물 35(6.6g, 85%)을 무색 액체로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 3.61-3.58 (m, 1 H), 3.41-3.37 (t, 4 H, J = 6.8 Hz), 1.87-1.80 (m, 4 H), 1.42-1.25 (m, 24 H), 0.87 (s, 9 H), 0.012 (s, 6 H).
화합물 36: 60㎖ 건조 THF 중의 에티닐 트라이메틸 실란(5.3㎖, 0.0378㏖) 용액을 -78℃로 냉각시켰고, 헥산 중의 1.4 M n-BuLi(23㎖, 0.03405㏖)를 비활성 분위기 하에 서서히 첨가하였다. 반응을 10분 동안 교반한 다음, HMPA(2.3g, 0.01324㏖)를 첨가하였고, 그 다음에 얻어진 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하였으며, -78℃로 냉각시켰다. 이것에 60㎖ 건조 THF 중의 화합물 35(5g, 0.0094㏖)의 용액을 서서히 첨가하였고, 첨가의 완료 후, 반응물을 실온으로 가온하였으며 18시간 동안 유지하였다. 반응 진행을 1H NMR로 모니터링하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 0℃로 냉각시켰고, 포화 NH4Cl 용액(50㎖) 다음에 물(200㎖)의 조심스러운 첨가로 퀀칭하였다. 수층을 헥산(3 x 250㎖)으로 추출하였다. 유기층을 건조시키고, 용매를 진공 하에 제거하여 화합물 36(5g, 94%)을 얻었고, 이것을 추가 정제 없이 사용하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 3.62-3.56 (m, 1 H), 2.21-2.17 (m, 4 H), 1.49-1.47 (m, 4 H), 1.37-1.26 (m, 24 H), 0.87 (s, 9 H), 0.13 (s, 18 H), 0.021 (s, 6 H).
화합물 37: 50㎖ 메탄올 중의 화합물 36(5g, 0.0088㏖)의 교반 용액에, K2CO3(6.1g, 0.044㏖)를 일부분 첨가하였고, 얻어진 혼합물을 18시간 동안 주위 온도에서 교반하였다. 그 다음에 휘발물을 회전 증발기 상에서 제거하였고, 조질의 혼합물을 100㎖ 물로 희석하였으며, 헥산(3 x 100㎖)으로 추출하였다. 유기층을 Na2SO4를 거쳐서 건조시키고 진공 하에 증발시켜 화합물 37(3.5g, 97%)을 얻었으며 이를 추가 정제 없이 사용하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 3.60-3.58 (m, 1 H), 2.19-2.14 (m, 4 H), 1.93-1.92 (m, 2 H), 1.54-1.49 (m, 4 H), 1.37-1.27 (m, 24 H), 0.87 (s, 9 H), 0.02 (s, 6 H).
화합물 39: 화합물 37(2.5g, 0.00598㏖)을 25㎖ 건조 THF 중에 용해하였고 -40℃로 냉각시켰다. n-BuLi(헥산 12.9㎖ 중의 1.4 M, 0.01794㏖)를 서서히 첨가한 다음, 10분 간격 후에, HMPA(25㎖)를 서서히 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 질소 분위기 하에 -40℃에서 30분 동안 유지하였다. 그 다음에 25㎖ 건조 THF 중의 화합물 38(3.5g, 1.01196㏖)의 용액을 적하하여 반응 혼합물을 냉각시켰다. 얻어진 혼합물을 2시간에 걸쳐 실온으로 가온한 다음, 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 그 다음에 혼합물을 포화 NH4Cl 용액(~50㎖)을 첨가함으로써 퀀칭하였고, 생성물을 에틸 아세테이트(3 x 50㎖)로 추출하였다. 용매를 회전 증발기 상에서 제거하였고, 얻어진 조질의 생성물을 용리 시스템으로서 다이클로로메탄 중의 0-3% 에틸 아세테이트를 사용하여 (100-200 메쉬) 실리카겔 컬럼에 의해 정제하여 황색 오일로서 화합물 39(0.9g, 18%)를 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 4.56-4.55 (m, 2 H), 3.87-3.83 (m, 2 H), 3.74-3.68 (m, 2 H), 3.59-3.57 (m, 1 H), 3.49-3.46 (m, 2 H), 3.39-3.33 (m, 2 H), 2.13-2.10 (m, 8 H), 1.87-1.75 (m, 2 H), 1.74-1.66 (m, 2 H), 1.57-1.42 (m, 20 H), 1.40-1.19 (m, 40 H), 0.87 (s, 9 H), 0.02 (s, 6 H).
화합물 40: 10㎖ 건조 에터 중의 화합물 39(504㎎, 0.598m㏖)의 용액에 MgBr2 .Et2O(926㎎, 3.59m㏖)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 14시간 동안 교반한 다음 포화 NaHCO3 수용액을 첨가하여 퀀칭하였다. 생성물을 CH2Cl2로 추출하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하였으며 농축하였다. 조질의 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 40(307㎎, 0.455m㏖, 76%, 헥산:EtOAc = 2:1으로 전개한 Rf = 0.36)을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.59-3.66 (m, 5 H), 2.14 (t, J = 6.6 Hz, 8 H), 1.21-1.59 (m, 52 H), 0.88 (s, 9 H), 0.03 (s, 6 H).
화합물 41: 무수 DMF(5㎖) 중의 40(180㎎, 0.267m㏖)의 교반 용액에 피리디늄 다이크로메이트(603㎎, 1.60m㏖)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 48시간 동안 교반하였다. 물(20㎖)로 희석한 후, 혼합물을 Et2O(3 x 40㎖)로 추출하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하였으며 농축하였다. 조질의 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 41(53㎎, 0.075m㏖, 28%, CH2Cl2:MeOH:AcOH = 95:4.5:0.5로 전개한 Rf = 0.25)를 얻었다. C43H77O5Si (M-H)-에 대한 분자량, 계산치 701.5540, 실측치 701.5. 이 화합물을 TEMPO 산화로 합성할 수 있다.
화합물 42: 화합물 19에 대해 기재한 유사한 방법으로 화합물 42(23 mg 0.032m㏖, 화합물 40으로부터 21%)를 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.67 (s, 6 H), 3.59-3.62 (m, 1 H), 2.30 (t, J = 7.5 Hz, 4 H), 2.13 (t, J = 6.8 Hz, 8 H), 1.27-1.64 (m, 48 H), 0.88 (s, 9 H), 0.03 (s, 6 H).
P-2 니켈 조건을 사용하는 환원으로 화합물 43을 제공하였고, TBAF에 의한 후속적인 탈양성자화로 화합물 8을 얻을 수 있다.
실시예 5: 화합물 8에 대한 대안의 합성
Figure 112013000350703-pct00114
화합물 8을 반응식 5에서 나타내는 바와 같이 합성할 수 있다. 브로마이드 51은 그것의 그리나드 시약(Grignard reagent)변환된 다음 에틸 포메이트와 결합되어 화합물 52를 얻을 수 있다. 후속의 산 처리, 산화, 및 환원으로 화합물 8을 제공할 수 있다.
실시예 6: 화합물 8에 대한 대안의 합성
Figure 112013000350703-pct00115
화합물 8을 반응식 6에서 나타내는 바와 같이 합성할 수 있다. 화합물 58, 60, 또는 62의 브로마이드 중 하나를 에틸 포메이트와 반응시켜 말단-기능화된 다이-올레핀 쇄를 만들어 낼 수 있다. 그 다음에 화합물 8을 표준 화학 반응을 사용하여 다이올레핀 쇄 화합물로부터 제조할 수 있다.
실시예 7
Figure 112013000350703-pct00116
8-벤질옥시-옥탄-1-올(2)의 합성:
500㎖ 무수 DMF 중의 NaH(오일 중에서 60%, 82g, 1.7096㏖)의 교반 현탁액에, 1.5ℓDMF 중의 화합물 1(250g, 1.7096㏖)의 용액을 0℃에서 적하 깔대기를 사용하여 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 교반한 다음, 벤질 브로마이드(208.86㎖, 1.7096㏖)를 질소 분위기 하에 서서히 첨가하였다. 그 다음에 반응물을 주위 온도로 가온하였고, 10분 동안 교반하였다. 반응의 완료 후, 혼합물을 잘게 부순 얼음(~2㎏)으로 퀀칭하였고, 에틸 아세테이트(2 x 1ℓ)로 추출하였다. 유기층을 물(1ℓ)로 세척하여 원치않는 DMF를 제거하였고, Na2SO4를 거쳐서 건조시켰으며 진공 하에서 증발건조시켰다. 조질의 화합물을 DCM 중의 0-5% MeOH로 용리하는 60-120 실리카겔 상에서 정제하여 화합물 2(220g, 54%)를 연한 황색 액체로 얻었다. H1 NMR (400MHz, CDCl3): δ = 7.33-7.24 (m, 5H), 4.49 (s, 2H), 3.63-3.60 (m, 2H), 3.47-3.43 (m, 2H), 1.63-1.51 (m, 4H), 1.39-1.23 (m, 8H).
(8-브로모-옥틸옥시메틸)-벤젠(3)의 합성: 화합물 2(133g, 0.5635㏖)를 1.5의 DCM 중에 용해하였고, CBr4(280.35g, 0.8456㏖)를 이 교반 용액에 첨가하였으며, 반응 혼합물을 비활성 분위기 하에 0℃로 냉각시켰다. 그 다음에 PPh3(251.03g, 0.9571㏖)를 20℃ 미만의 온도를 유지하면서 일부분 첨가하였고, 첨가를 완료한 후, 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응의 완료 후, 반응 혼합물로부터 침전시킨 고체(PPh3O)를 여과에 의해 분리하였고, 여과액을 잘게 부순 얼음(~ 1.5㎏)으로 희석하였으며, DCM(3 x 750㎖)으로 추출하였다. 유기층을 분리하였고, 무수 Na2SO4를 거쳐서 건조시켰으며, 진공 하에 증류하였다. 얻어진 조질의 화합물을 용리 시스템으로서 헥산류 중의 0-5 % 에틸 아세테이트를 사용하는 60-120 메쉬 실리카겔 컬럼 상에서 크로마토그래피하여, 화합물 3(150g, 89%)을 연한 황색 액체로 얻었다. 1H NMR (400MHz, CDCl3): δ= 7.33-7.25 (m, 5H), 4.49 (s, 2H), 3.47-3.41 (m, 2H), 3.41-3.37 (m, 2H), 1.86-1.80 (m, 4H), 1.62-1.56(m, 2H), 1.42-1.29 (m, 8H).
1,17-비스-벤질옥시-헵타데칸-9-올(4)의 합성:
새로 활성화한 Mg 터닝(24.08g, 1.003㏖)에 200㎖ 무수 THF를 첨가한 다음, 비활성 분위기 하에 혼합물 내로 약간의 요오드를 첨가하였다. 그리나드 형성의 개시 후, 발열 반응을 서서히 제어하면서 1ℓ의 건조 THF 중에서 화합물 3(150g, 0.5016㏖)의 용액을 첨가하였다. 첨가의 완료 후, 반응물을 1시간 동안 환류로 가열한 다음, 실온으로 냉각시켰다. 그 다음에 메틸 포메이트(60.24g, 1.0033mol)를 서서히 첨가하였고, 반응을 2시간 동안 지속하였다. 완료 후, 10% HCl 다음에 물(1ℓ)를 서서히 첨가하여 반응을 퀀칭하였고, 에틸 아세테이트(3 x 1ℓ)로 추출하였다. 유기층을 5리터 비터 내에 취하였으며, 500㎖의 메탄올로 희석하였고, 0℃로 냉각시켰다. 이 용액에 과량의 NaBH4(~ 5eq)를 일부분 첨가하여 HCl의 첨가로 절단되지 않는 포메이트 에스터의 가수분해를 보장하였다. 얻어진 용액을 1시간 동안 교반한 다음 휘발물을 진공 하에 제거하였다. 잔사를 물(1ℓ) 중에서 취하였고, 10% HCl 용액으로 산성화하였다(PH 4). 그 다음에 생성물을 에틸 아세테이트(3 x 1 ℓ)로 추출하였다. 후속하여 유기층을 건조시켰고, 회전 증발기 상에서 농축하여 화합물 4(57g, 24%)를 고체로 얻었다. 1H NMR (400MHz, CDCl3): δ= 7.35-7.32 (m, 8H), 7.29-7.24 (m, 2H), 4.49 (s, 4H), 3.56 (m, 1H), 3.46-3.43 (m, 4H), 1.63-1.56 (m, 4H), 1.44-1.34 (m, 28H). C13 NMR (100MHz, CDCl3): δ= 138.56, 128.21, 127.49, 127.34, 72.72, 71.76, 70.37, 37.37, 29.64, 29.56, 29.47, 29.33, 26.07, 25.54.
[9-벤질옥시-1-(8-벤질옥시-옥틸)-노닐옥시]- tert -뷰틸-다이메틸-실란(5)의 합성:
화합물 4(56g, 0.1196㏖)를 700㎖의 무수 THF 중에서 용해하였고, 0℃로 냉각시켰다. TBMS-Cl(36.06g, 0.2396㏖)을 서서히 첨가한 다음 이미다졸(32.55g, 0.4786㏖)을 비활성 분위기 하에 첨가하였다. 그 다음에 반응물을 실온에서 18시간 동안 교반한 후, 얼음(~1㎏)으로 퀀칭하였다. 생성물을 에틸 아세테이트(3 x 500㎖)로 추출하였다. 유기층을 분리하였고, 포화 NaHCO3 용액으로 세척하여 산성 불순물을 제거하였으며, Na2SO4를 거쳐서 건조시켰고, 감압하에 증발시켜 조질의 화합물을 얻었고, 이를 실리카겔(60-120 메쉬) 로 정제하였으며, 0-10% 에틸 아세테이트 헥산으로 용리하여 (60g, 82%)의 화합물 5를 노르스름한 색의 오일로 얻었다 as yellowish oil. H1 NMR (400MHz, CDCl3): δ = 7.33-7.24 (m, 10H), 4.49 (s, 4H), 3.60-3.57 (m, 1H), 3.46-3.43 (m, 4H), 1.61-1.54 (m, 4H), 1.41-1.26 (m, 28H), 0.87 (s, 9H), 0.02 (s, 6H)
9-( tert -뷰틸-다이메틸-실라닐옥시)-헵타데칸-1,17-다이올의 합성(6):
화합물 5(60g, 0.1030㏖)를 500㎖ 에틸 아세테이트 중에서 용해하였고, N2로 20분 동안 탈기하였다. (10 wt %) 탄소 상 Pd(12 g)을 첨가하였고, 반응물을 수소 분위기 하에 18시간 동안 교반하였다. 완료 후, 혼합물을 셀라이트 층을 통해 여과하였고, 에틸 아세테이트로 세척하였다. 여과액을 진공 하에 증발시켰다. 이렇게 얻은 화합물 6(19g, 46%)은 다음 반응을 수행하기에 충분히 순수하였다. 1H NMR (400MHz, CDCl3): δ = 3.64-3.58 (m, 5H), 1.59 (br, 2H), 1.57-1.51 (m, 4H), 1.38-1.22 (m, 28H), 0.87 (s, 9H), 0.02 (s, 6H).
9-( tert -뷰틸-다이메틸-실라닐옥시)-헵타데칸다이온산의 합성(7):
무수 DMF (40㎖) 중의 6(2g, 0.0049㏖)의 교반 용액에 피리디늄 다이크로메이트(2.7g, 0.0074㏖)를 0℃에서 비활성 분위기 하에 첨가하였다. 그 다음에 반응 혼합물을 10 내지 15분의 기간을 거쳐서 실온으로 가온시켰고, 24시간 동안 지속하였다. 후속하여, 반응물을 물(100㎖)로 희석하였다. 수층을 DCM(3 x 40㎖)을 사용하여 추출하였다. 유치층을 염수(1x25㎖)로 세척하였으며 진공 하에 농축하여 조질의 산을 얻었고, 이를 그 다음에 헥산류 시스템 중의 0-30% 에틸 아세테이트를 사용하여 (100-200 메쉬) 실리카겔 컬럼으로 정제하였다. 순수한 생성물(7)을 연한 황색 오일로 얻었다(0.7g, 33%).
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ = 3.61-3.56 (m, 1H), 2.35-2.32 (m, 4H), 1.64-1.59 (m, 4H), 1.40-1.19 (m, 24H), 0.86 (s, 9H), 0.017 (s, 6H); LC-MS [M+H] - 431.00; HPLC (ELSD) 순도-96.94%
다이((Z)-논-2-엔-1-일) 9-((tert-뷰틸다이메틸silyl)옥시)헵타데칸다이오에이트(8)의 합성
2산 7(0.42g, 0.97m㏖)을 20㎖의 다이클로로메탄 중에서 용해하였고, 그것에 시스-2-노넨-1-올(0.35g, 2.44m㏖)을 첨가한 후 휘니그 염기(0.68g, 4.9m㏖) 및 DMAP(12㎎)를 첨가하였다. 이 혼합물에 EDCI(0.47g, 2.44m㏖)를 첨가하였고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 그 다음에 반응 혼합물을 CH2Cl2(40㎖)로 희석하였고, 포화 NaHCO3(50㎖), 물(60㎖) 및 염수(60㎖)로 세척하였다. 합한 유기층을 무수 Na2SO4를 거쳐서 건조시켰고, 용매를 진공에서 제거하였다. 이렇게 얻은 조질의 생성물을 Combiflash Rf 정제 시스템(40 g 실리카겔, CH2Cl2 중의 0-10 % MeOH)으로 정제하여 무색의 오일로서 순수한 생성물 8(0.35g, 53%)을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ5.64 (dt, J = 10.9, 7.4 Hz, 2H), 5.58-5.43 (m, 2H), 4.61 (d, J = 6.8 Hz, 4H), 3.71-3.48 (m, 1H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.20-1.98 (m, 4H), 1.71-1.53 (m, 4H), 1.31 (ddd, J = 8.3, 7.0, 3.7 Hz, 34H), 1.07-0.68 (m, 14H), 0.02 (s, 5H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ178.18, 139.81, 127.78, 81.73, 81.42, 81.10, 76.72, 64.59, 41.52, 41.32, 38.76, 36.09, 34.10, 33.93, 33.80, 33.70, 33.59, 33.55, 33.26, 31.95, 30.34, 29.69, 29.58, 29.39, 27.01, 22.56, 18.48, 0.01.
다이((Z)-논-2-엔-1-일) 9-하이드록시헵타데칸다이오에이트(9)의 합성
실릴 보호된 다이에스터 8(0.3g, 0.44m㏖)을 THF (6㎖) 중의 TBAF의 1M 용액 중에서 용해하였고, 용액을 40℃에서 2일 동안 유지하였다. 반응 혼합물을 물(60㎖)로 희석하였고, 에터(2 x 50㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 농축하였고, 이렇게 얻은 조질의 생성물을 컬럼으로 정제하여 순수한 생성물을 분리하였다.(0.097g, 39%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ5.64 (dt, J = 10.9, 7.4 Hz, 2H), 5.52 (dt, J = 11.0, 6.8 Hz, 2H), 4.61 (d, J = 6.8 Hz, 4H), 3.57 (s, 1H), 2.30 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 2.09 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 1.75-1.53 (m, 4H), 1.53-1.06 (m, 36H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ173.98, 135.64, 123.57, 77.54, 77.22, 76.91, 72.14, 60.41, 37.69, 34.54, 31.89, 29.70, 29.60, 29.44, 29.29, 29.07, 27.76, 25.80, 25.15, 22.82, 14.29.
다이((Z)-논-2-엔-1-일) 9-((4-(다이메틸아미노)뷰타노일)옥시)헵타데칸다이오에이트의 합성
알코올 9(0.083g, 0.147m㏖)를 20㎖의 다이클로로메탄 중에서 용해하였고, 그것에 다이메틸아미노뷰티르산 하이드로클로라이드(0.030g, 0.176 m㏖)를 첨가한 후 휘니그 염기(0.045g, 0.44m㏖) 및 DMAP(2㎎)를 첨가하였다. 이 혼합물에 EDCI(0.034g, 0.176m㏖)를 첨가하였고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였으며, TLC(실리카겔, CH2Cl2 중의 10% MeOH)는 출발 알코올의 완전한 사라짐을 나타내었다. 반응 혼합물을 CH2Cl2(40㎖)로 희석하였으며, 포화 NaHCO3(50㎖), 물(60㎖) 및 염수(60㎖)로 세척하였다. 합한 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시켰고, 용매를 진공에서 제거하였다. 이렇게 얻은 조질의 생성물을 Combiflash Rf 정제 시스템(40 g silicagel, CH2Cl2 중의 0-10% MeOH)으로 정제하여 순수한 생성물을 무색의 오일로 분리하였다(0.062g, 62%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.74-5.58 (m, 2H), 5.51 (dtt, J = 9.7, 6.8, 1.3 Hz, 2H), 4.95-4.75 (m, 1H), 4.61 (d, J = 6.8 Hz, 4H), 2.35-2.24 (m, 8H), 2.22 (d, J = 7.9 Hz, 6H), 2.09 (q, J = 6.9 Hz, 4H), 1.83-1.72 (m, 2H), 1.60 (dd, J = 14.4, 7.2 Hz, 4H), 1.49 (d, J = 5.7 Hz, 4H), 1.41-1.13 (m, 30H), 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 6H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 173.72, 173.36, 135.40, 123.35, 74.12, 60.18, 58.95, 45.46, 34.30, 34.11, 32.45, 31.67, 29.38, 29.35, 29.17, 29.07, 28.84, 27.53, 25.28, 24.93, 23.16, 22.59, 14.06. C41H75NO6 (MH+)에 대한 MW 계산치: 678.04, 실측치: 678.5.
실시예 8
다음의 더 짧은 경로를 본 발명의 화합물 1의 합성을 위하여 사용할 수 있다. 상업적 9-브로모논-1-엔 10을 마그네슘으로 처리하여 에틸포메이트와 반응하는 대응하는 그리나드 시약을 형성하여, 브로모뷰티릴 클로라이드로 처리 시 대응하는 부가물 11을 얻어서, 브로모에스터 12를 제공한다. RuO4로 처리 시 브로모에스터 12는 2산 13을 제공하였다. 다이메틸아민으로 처리 시 브로모2산 13은 아미노 2산 14를 제공하였다. 알코올 15와 커플링 시 아미노2산 14는 양호한 수율로 생성물을 제공하였다.
Figure 112013000350703-pct00117
노나데카-1,18-다이엔-10-올의 합성(11)
화염 건조시킨 500㎖ RB 플라스크에, 새로 활성화한 Mg 터닝(9 g)을 첨가하였고, 플라스크는 자기 교반 바, 첨가 깔대기 및 환류 콘덴서를 구비하였다. 이 셋업을 탈기시켰고, 아르곤으로 플러싱하며 100㎖의 무수 에터를 시린지를 통해 플라스크에 첨가하였다. 브로마이드 3(51.3g, 250m㏖)을 무수 에터(100㎖) 중에서 용해시켰고, 첨가 깔대기에 첨가하였다. 약 5㎖의 이런 에터 용액을 Mg 터닝에 첨가한 한편, 격렬하게 교반하였다. 발열 반응을 주의하였고(그리나드 시약 형성을 확인/가속화함, 5㎎의 요오드를 첨가하였고, 그리나드 시약의 형성을 확인하면서 즉시 탈색을 관찰함), 에터를 환류시키기 시작하였다. 브로마이드 용액의 나머지를 적하하는 한편, 물 중에서 플라스크를 냉각시킴으로써 부드러운 환류 하에 반응을 유지하였다. 첨가의 완료 후, 반응 혼합물을 35℃에서 1시간 동안 유지한 다음 빙욕에서 냉각시켰다. 에틸 포메이트(9g, 121m㏖)를 무수 에터(100㎖) 중에서 용해하였고, 첨가 깔대기로 옮기고, 교반하면서 반응 혼합물에 적하하였다. 발열 반응을 관찰하였고, 반응 혼합물을 환류를 시작하였다. 반응의 개시 후, 포메이트의 가벼운 용액의 나머지를 증기로서 빠르게 첨가하였으며, 반응 혼합물을 1시간 동안 주위 온도에서 추가 기간 동안 교반하였다. 10㎖의 아세톤을 적하한 후 얼음물(60㎖)을 첨가하여 반응을 퀀칭하였다. 용액이 균질하게 되고 층이 분리될 때까지 반응 혼합물을 수성 H2SO4(10 용적%, 300㎖)로 처리하였다. 수층을 에터(2x200㎖)로 추출하였다. 합한 에터층을 건조시키고(Na2SO4) 농축하여 조질의 생성물을 얻었고 컬럼(실리카겔, 헥산류 중의 0-10% 에터) 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물 분획을 증발시켜 순수한 생성물 11을 백색 고체로 제공하였다(30.6g, 90%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.26 (s, 1H), 5.81 (ddt, J = 16.9, 10.2, 6.7 Hz, 8H), 5.04-4.88 (m, 16H), 3.57 (dd, J = 7.6, 3.3 Hz, 4H), 2.04 (q, J = 6.9 Hz, 16H), 1.59 (s, 1H), 1.45 (d, J = 7.5 Hz, 8H), 1.43-1.12 (m, 94H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 2H). 13C NMR (101 MHz, cdcl3) δ 139.40, 114.33, 77.54, 77.22, 76.90, 72.21, 37.70, 34.00, 29.86, 29.67, 29.29, 29.12, 25.85.
노나데카-1,18-다이엔-10-일 4-브로모뷰타노에이트(12)의 합성
무수 DCM(300㎖) 중의 알코올 11(5.6g, 20㏖)의 용액에 브로모뷰트릴 클로라이드(20m㏖)를 0℃에서 비활성 분위기 하에 서서히, 주의깊게 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하였고, 20시간 동안 교반하였으며, TLC로 모니터링하였다 (실리카겔, 헥산류 중의 10% 에틸 아세테이트). 반응의 완료 시, 혼합물을 물(400㎖)로 희석하였고, 유기층을 분리하였다. 그 다음에 유기층을 NaHCO3의 포화 용액(1 x 400㎖)으로 세척한 다음 염수(1 x 100㎖)로 세척하였고, 진공 하에 농축하였다. 후속하여 조질의 생성물을 실리카겔(100-200 메쉬) 컬럼으로 정제하였고, 헥산 용액 중의 2-3% 에틸 아세테이트로 용리하여 6 g(90%)의 원하는 생성물 12를 무색 액체로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.80 (ddt, J = 16.9, 10.2, 6.7 Hz, 2H), 5.05-4.81 (m, 5H), 3.46 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.48 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.17 (p, J = 6.8 Hz, 2H), 2.11-1.93 (m, 4H), 1.65-1.44 (m, 4H), 1.43-1.17 (m, 19H). 13C NMR (101 MHz, cdcl3) δ172.51, 139.37, 114.35, 77.54, 77.23, 76.91, 74.86, 34.31, 33.99, 33.01, 32.96, 29.65, 29.56, 29.24, 29.09, 28.11, 25.52.
9-((4-브로모뷰타노일)옥시)헵타데칸다이온산(13)의 합성
다이클로로메탄 (300㎖) 및 아세토나이트릴(300㎖) 중의 브로모에스터 12(12.1g, 28.2m㏖) 용액에, RuCl3(1.16g, 5 mol%)를 첨가하였고, 혼합물을 10℃로 냉각시켰으며, 물(400㎖) 중에서 메타과요오드산 나트륨(60 g)을 적하하였다. 이것을 10℃에서 20시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 희석하였고, 물을 분리하였으며, 유기층에 포화 염수 용액을 교반하면서 첨가한 후, 3% 황화나트륨 용액을 탈색 동안(어두운 녹색에서 연한 황색으로) 적하하였다. 층을 분리하였고, 유기층을 황산 나트륨에 거쳐서 건조시켰으며 감압하에 증발시켜 순수한 생성물을 얻었다. C20H35BrO7에 대한 계산치 MW 467.39; 실측치 465.4 (M-2H).
9-((4-(다이메틸아미노)뷰타노일)옥시)헵타데칸다이온산(14)의 합성
브로모산 13(2m㏖)을 THF (20㎖) 중에서 다이메틸아민의 2M 용액에 용해하였고, 그것에 1g의 무수 K2CO3를 첨가하였으며, 혼합물을 압력 보틀 내 50℃에서 밤새 가열하였다. TLC는 반응의 완료를 나타내었다. 반응 혼합물을 아세트산으로 산성화하였고, 물(100㎖)로 희석하였으며, 다이클로로메탄(2 x 60㎖)으로 추출하였다. 합한 유기층을 농축 건조시키고, 다음 반응에서 사용하였다. C23H43NO6 에 대한 MW 계산치 429.59; 실측치 430.6 (MH)+.
다이((Z)-논-2-엔-1-일) 9-((4-(다이메틸아미노)뷰타노일)옥시)헵타데칸다이오에이트의 합성
2산 14를 8의 합성에 대해 기재한 것과 같이 대응하는 다이에스터로 전환하고, 분석 및 분광 데이터는 생성물과 일치하였다.
실시예 9
다른 접근에서, 본 발명의 화합물 1의 합성을 위하여 다음의 합성 접근을 사용하였다.
Figure 112013000350703-pct00118
실시예 10: 양이온성 지질 유래 리포좀을 사용하는 FVII 생체내 평가
C57BL/6 마우스(메사추세츠주에 소재한 Charles River Labs)는 0.01㎖/g의 용적으로 꼬리 정맥 주사를 통해 원하는 제형 내에서 식염수 또는 siRNA를 받았다. 투여 후 다양한 시점에, 동물은 아이소플루오란 흡입으로 마취하였고, 안구후면(retro orbital) 출혈에 의해 혈액을 혈청 분리기 튜브 내에 수하였다. 인자 VII 단백질의 혈청 수준을 색원체 분석을 사용하여 제조업자 프로토콜에 따라서 샘플 내에서 결정하였다(오하이오주에 소재한 DiaPharma Group의 Coaset Factor VII, 또는 오하이오주에 소재한 Aniara Corporation의 Biophen FVII). 식염수 처리 동물로부터 수집한 혈청을 사용하여 표준 곡선을 만들었다. 간 mRNA 수준이 평가되는 실험에서, 투여 후 다양한 시점에 동물을 희생시키고, 간을 채취하였으며, 액체 질소 중에서 순간 냉동시켰다. 냉동시킨 간 조직을 분말로 분쇄하였다. 조직 용해물을 제조하였고, 인자 VII 및 apoB의 간 mRNA 수준을 분기형 DNA 분석(캘리포니아주에 소재한 Panomics의 QuantiGene Assay)을 사용하여 결정하였다.
실시예 11: 생체 내 설치류 인자 VII 침묵 모델을 사용하여 다양한 양이온성 지질을 함유하는 지질 입자 제형의 효능 결정
응고 캐스케이드 내 우세한 단백질인 인자 VII(FVII)를 간(간세포)에서 합성하였고, 혈장 내로 분비하였다. 혈장 내 FVII 수준을 단순, 플레이트-기반 비색 분석으로 결정할 수 있다. 이와 같은, FVII는 간세포-유래 단백질의 siRNA-매개 하향조절의 결정뿐만 아니라 혈장 농도의 모니터링 및 핵산 지질 입자 및 siRNA, 예컨대 표 19에 나타낸 siRNA의 조직 분포를 모니터링하는 편리한 모델을 나타낸다.
듀플렉스 서열 5'-3' 서열번호 표적
AD-1661
 GGAfUfCAfUfCfUfCAAGfUfCfUfUAfCdTsdT FVII
GfUAAGAfCfUfUGAGAfUGAfUfCfCdTsdT
소문자는 2'OMe 변형이며, Nf는 2'F 변형 뉴클레오염기이고, dT는 데옥시티미딘이며, s는 포스포티오에이트이다.
본 명세서에 기재된 양이온성 지질은, 전문이 참조로 포함되는 국제특허공개 WO 2010/088537에 기재되는 바와 같이, 인라인(in-line) 믹싱 방법을 사용하여 AD-1661듀플렉스를 함유하는 리포좀을 제형화하는데 사용된다. 지질 입자는 다음의 몰 비를 사용하여 제형화된다: 50% 양이온성 지질 / 10% 다이스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC) / 38.5% 콜레스테롤/ 1.5% PEG-DMG(2000의 평균 PEG 분자량을 갖는 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글라이콜)-2,3-다이미리스토일글라이세롤).
C57BL/6 마우스(메사추세츠주에 소재한 Charles River Labs)는 꼬리 정맥 주사를 통해 식염수 또는 제형화된 siRNA 중 하나를 받았다. 투여 후 다양한 시점에, 혈청 샘플을 안구후면 출혈에 의해 수집하였다. 인자 VII 단백질의 혈청 수준을 색원체 분석을 사용하는 샘플 내에서 결정하였다(오하이오주에 소재한 Aniara Corporation의 Biophen FVII). 인자 VII의 간 mRNA 수준을 결정하기 위하여, 동물을 희생시켰고, 간을 채휘하였으며, 액체 질소 중에서 순간 냉동시켰다. 조직 용해물을 냉동 조직으로부터 제조하였으며, 인자 VII의 간 mRNA 수준을 분기형 DNA 분석(캘리포니아주에 소재한 Panomics의 QuantiGene Assay)을 사용하여 결정하였다.
C57BL/6 마우스에 정맥내(볼루스) 주사 48시간 후에 FVII 활성을 FVII siRNA-처리 동물에서 평가하였다. FVII을 혈청 또는 조질 내 단백질 수준을 결정하기 위하여 상업적으로 입수가능한 키트를 사용하여 마이크로플레이트 규모에서 제조업자의 설명서에 따라서 결정하였다. 미처리 대조군 마우스에 대해 FVII 감소를 결정하였고, 결과는 잔여 FVII%로 표현하였다. 2용량 수준(0.05 및 0.005㎎/㎏ FVII siRNA)을 각각의 신규 리포좀 조성물의 스크린 내에서 사용한다.
실시예 12: 사전형성 베시클을 사용하는 siRNA 제형
양이온성 지질 함유 입자를 사전형성 베시클 방법을 사용하여 만든다. 양이온성 지질, DSPC, 콜레스테롤 및 PEG-지질을 각각 40/10/40/10의 몰 비에서 에탄올 중에 용해한다. 지질 혼합물을 각각 30%(vol/vol) 및 6.1㎎/㎖의 최종 에탄올 및 지질 농도로 수성 완충제(50 mM 시트레이트, pH 4)에 혼합하면서 첨가하였고, 실온에서 2분 동안 평형상태로 만든 후 압출하였다. 수화된 지질을 Lipex Extruder(캐나다 브리티쉬 컬럼비아주 밴쿠버에 소재한 Northern Lipid)를 22에서 사용하여 Nicomp 분석으로 결정하여 70-90㎚의 베시클 직경이 얻어질 때까지 2개의 적층된 80㎚ 기공-크기 필터(Nuclepore)를 통해 압출한다. 이것은 일반적으로 1 내지 3회 통과를 필요로 한다. 소형 베시클을 형성하지 않는 일부 양이온성 지질 혼합물에 대해, DSPC 헤드 기 상의 포스페이트 기를 양성자화하기 위해 더 낮은 pH 완충제(50mM 시트레이트, pH 3)로 지질 혼합물을 수화시키는 것은 안정한 70-90㎚ 베시클을 형성하게 한다.
FVII siRNA(50mM 시트레이트 내 가용화됨, 30% 에탄올을 함유하는 pH 4 수용액)를 ~5㎖/분의 속도에서 혼합하면서, 35로 사전 평형상태로 된 베시클에 첨가한다. 0.06(wt/wt)의 최종 표적 siRNA/지질 비가 달성된 후, 35℃에서 혼합물을 추가 30분 동안 인큐베이션하여 베시클이 재수화되고 FVII siRNA가 캡슐화되도록 한다. 그 다음에 에탄올을 제거하였고, 투석 또는 접선 유동 여과 중 하나에 의해 외부 완충제를 PBS(155mM NaCl, 3mM Na2HPO4, 1mM KH2PO4, pH 7.5)로 대신한다. 크기배제 스핀 컬럼 또는 이온 교환 스핀 컬럼을 사용하여 비캡슐화 siRNA의 제거 후 최종 캡슐화된 siRNA-대-지질 비를 결정하였다.
실시예 13: 지질 제형 효능의 생체 내 결정
시험 제형을 처음에 처리군 당 3마리의 마우스로 0.1, 0.3, 1.0 및 5.0㎎/㎖에서 암컷 15-25g의 7-9주령인 암컷 C57Bl/6 마우스에서 그것의 FVII 녹다운을 평가하였다. 모든 연구는 포스페이트-완충 식염수(phosphate-buffered saline, PBS, 대조군) 또는 기준 제형 중 하나를 받은 동물을 포함한다. 조제물을 시험 바로 전 PBS 중에서 적절한 농도로 희석한다. 마우스를 칭량하고, 적절한 용량 용적을 계산한다(10㎕/g 체중).　시험 및 기준 조제물뿐만 아니라 PBS(대조군 동물에 대해)를 옆구리 꼬리 정맥을 통해 정맥 내로 투여한다. 동물을 24시간 후에 케타민/자일라진의 복강 내 주사로 마취시키고, 500-700㎕의 혈액을 심장천자에 의해 혈청 분리기 튜브(BD Microtainer) 내로 수집한다. 혈액을 2,000 x g에서 10분 동안 15℃에서 원심분리하고 혈청을 수집하며 분석까지 -70℃에서 저장한다. 혈청 샘플을 37℃에서 30분 동안 해동시키고, PBS 중에서 희석하며, 96-웰 분석 플레이트 내로 부분표본화한다. 제조업자의 설명서에 따라서 색원체 분석(Biophen FVII 키트, Hyphen BioMed)을 사용하여 인자 VII 수준을 평가하고, 405㎚ 파장 필터를 구비한 마이크로플레이트 판독기 내에서 흡광도를 측정한다. 혈장 FVII 수준을 정량화하고대조군 동물로부터 혈청의 풀링한 샘플로부터 만든 표준 곡선을 사용하여 ED50(대조군 동물과 비교하여 혈장 FVII 수준의 50% 감소를 초래하는 용량)을 계산하였다. 높은 수준의 FVII 녹다운을 나타내는 관심의 제형(ED50 << 0.1 ㎎/㎏)을 저용량 범위에서 독립적 연구로 재시험하여 효능을 확인하고 ED50 수준을 확립한다.
실시예 14: 마우스에서 지질 프로파일 및 조질 클리어런스의 결정을 위한 연구
본 발명에 따르는 양이온성 지질에 대해 마우스에서 지질 프로파일 및 조직 클리어런스를 결정하기 위한 연구를 수행하였다.
수컷 마우스(C57BL, 20-30g)를 4개의 그룹으로 분리하였고, 이하의 표 20에 나타내는 바와 같이 (정맥 내로) 본 발명의 화합물 1, 2 또는 3, 또는 기준 지질을 투여하였다.
그룹 지질 지질 용량
(㎎/㎏)		 지질 농도
(㎎/㎖)		 수컷 마우스의 수
I 기준 지질 0.3 0.03 12
II 화합물 1 0.3 0.03 12
III 화합물 2 0.3 0.03 12
IV 화합물 3 0.3 0.03 12
Figure 112013000350703-pct00119
마우스를 절식시키지 않았다. 혈액, 간 및 비장 샘플을 용량투여 후 0.17, 8, 24, 72, 168, 336 및 672 시간에 수집하였다(그룹당 시점마다 2개의 샘플).
도 1은 각 그룹 I 내지 IV의 마우스에 대해 시간에 따른 간 지질 농도를 나타낸다. 간 약동학 데이터를 이하의 표 21에 제시한다.
지질 Cmax (ng/㎖) AUC
(h.ng/㎖)		 MRT0-t (시간)
기준 지질 22,400 6,954,787 221
화합물 1 1,136 4,594 NC
화합물 2 118 436 NC
화합물 3 208 NC NC
MRT는 평균 체류 시간을 나타낸다. NC는 계산불가능함을 나타낸다.
화합물 1 및 3에 대해 예측된 대사 경로를 도 2에 나타낸다. 이들 대사물질의 농도는 간에서 측정하였다. 결과를 이하의 표 22에 나타낸다. 24시간 후 모든 측정은(투여 후 72, 168, 336, 및 672시간에 취한 것을 포함) 정량 수준 미만(below the level of quantification, BLQ)이었다.
시간(시간) 화합물 1 화합물 2 화합물 3
1-산 2-산 1-산 2-산 1-산 2-산
0.17 126.00 125.50 10.62 14.75 20.15 23.95
8 1.25 1.31 0.40 0.56 BLQ BLQ
24 BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ
도 3은 각 그룹 I 내지 IV에서 마우스에 대해 시간에 따른 비장 지질 농도를 나타낸다. 비장 약동학 데이터는 이하의 표 23에 제시한다.
지질 Cmax
(ng/㎖)		 AUC
(h.ng/㎖)		 MRT0-t
(시간)
기준 지질 9,152 3,426,038 229.7
화합물 1 7,460 41,967 2.8
화합물 2 13,640 238,044 11.1
화합물 3 4368 18,686 0.7
비장 내 화합물 1 내지 3의 대사물질 농도를 측정하였고, 결과를 이하의 표 24에 나타낸다.
시간(시간) 화합물 1 화합물 2 화합물 3
1-산 2-산 1-산 2-산 1-산 2-산
0.17 208.1 37.5 624.8 95.1 1591.5 687.3
8 36.2 BLQ 792.0 127.2 182.6 121.9
24 BLQ BLQ 62.1 BLQ BLQ 샘플없음
72 BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ 99.7
168 BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ 33.6
336 BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ 52.0
672 BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ
도 4는 각 그룹 I 내지 IV에서 마우스에 대해 시간에 따른 혈장 지질 농도를 나타낸다. 혈장 약동학 데이터는 이하의 표 25에서 제시한다.
지질 Cmax
(ng/㎖)		 AUC
(h.ng/㎖)		 MRT0-t
(시간)
기준 지질 2,110 63,775 201
화합물 1 38,750 155,012 0.0006
화합물 2 28,800 115,612 0.0285
화합물 3 30,600 122,412 0.0008
혈장 내 화합물 1 내지 3의 대사물질 농도를 측정하였고, 결과를 이하의 표 26에 나타낸다. 24시간 후 모든 측정(투여 후 72, 168, 336, 및 672시간에 취한 것을 포함)은 정량 수준 미만(BLQ)이었다.
시간(시간) 화합물 1 화합물 2 화합물 3
1-산 2-산 1-산 2-산 1-산 2-산
0.17 181.43 1186.40 1355.56 605.56 1037.63 871.64
8 BLQ BLQ 2.66 3.53 BLQ 21.18
24 BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ 2.45
도 1, 3 및 4 및 표 22, 24 및 26에서 나타내는 바와 같이, 본 발명의 화합물 1, 2 및 3은 기준 지질과 비교할 때 극적으로 개선된 조직 클리어런스 및 활성을 나타낸다.
이들 및 다른 변화는 상기 상세한 설명에 비추어 실시형태로 만들어질 수 있다. 일반적으로 다음의 특허청구범위에서, 사용된 용어는 본 명세서에 개시된 특허청구범위 내지 구체적 실시형태 및 특허청구범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되지만, 이러한 특허청구범위가 자격을 부여하는 동등물의 완전한 범주와 함께 모든 가능한 실시형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 특허청구범위는 본 명세서로 제한되지 않는다.

Claims (55)

  1. 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 염:
    [화학식 I]
    Figure 112018090295659-pct00120

    식 중,
    R'는 존재하지 않거나, 수소 또는 알킬이고;
    R1 및 R2에 대해서는,
    (i) R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬 혹은 복소환이거나;
    (ii) R1과 R2는, 이들이 부착되는 질소 원자와 함께, 복소환 고리를 형성하거나; 또는
    (iii) R1과 R2 중 한쪽은 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬 혹은 복소환이고, 다른 한쪽은 (a) 인접한 질소 원자 및 (b) 해당 질소 원자에 인접한 (R)a 기와 함께 4 내지 10원 복소환 고리 혹은 헤테로아릴을 형성하며;
    각 경우의 R은 독립적으로 -(CR3R4)-이고;
    각 경우의 R3 및 R4는 독립적으로 H, OH, 알킬, 알콕시, -NH2, 알킬아미노 혹은 다이알킬아미노이거나;
    또는 R3과 R4는, 이들이 직접 부착되는 탄소 원자와 함께, 사이클로알킬기를 형성하되, 탄소 C*에 부착된 각 사슬 내의 3개 이하의 R기는 사이클로알킬이고;
    Q는 -C(O)O- 또는 -OC(O)-이고;
    Q1 및 Q2는 각각 독립적으로 존재하지 않거나, -C(O)O- 또는 -OC(O)-이고;
    Q3 및 Q4는 각각 독립적으로 H, -(CR3R4)- 혹은 아릴이며,
    각 경우의 A1, A2, A3 및 A4는 독립적으로 -(CR5R5-CR5=CR5)-이고;
    각 경우의 R5는 독립적으로 H 또는 알킬이며;
    M1 및 M2는 각각 독립적으로 -C(O)O- 또는 -OC(O)-이고;
    Z는 존재하지 않거나 또는 알킬렌 혹은 -O-P(O)(OH)-O-이며;
    Z에 대해 부착된 각 ------는 임의선택적 결합이므로, Z가 존재하지 않을 경우, Q3과 Q4는 함께 직접 공유결합적으로 결합되지 않고;
    a는 1, 2, 3, 4, 5 혹은 6이며;
    b는 0, 1, 2 혹은 3이고;
    c, d, e, f, i, j, m, n, q 및 r은 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 혹은 10이며; Q1이 존재할 경우, c는 4, 5, 6, 7, 8, 9 혹은 10이며; Q2가 존재할 경우, d는 4, 5, 6, 7, 8, 9 혹은 10이며;
    g 및 h는 각각 독립적으로 0, 1 혹은 2이고;
    k 및 l은 각각 독립적으로 0 혹은 1이되, k 및 l 중 적어도 하나는 1이며;
    o 및 p는 각각 독립적으로 0, 1 또는 2이고,
    식 중,
    (i) 상기 화합물은 이하의 부분을 함유하지 않으며:
    Figure 112018090295659-pct00121

    식 중 ----는 임의선택적 결합이고;
    (ii) Q3 및 Q4는 각각 독립적으로 10개 이상의 원자의 사슬에 의해 별표(*)로 표시된 3차 탄소원자로부터 분리된다.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, M1 및 M2는 각각 -C(O)O-인 것인 화합물.
  5. 제1항에 있어서, R1 및 R2는 각각 알킬인 것인 화합물.
  6. 제5항에 있어서, R1 및 R2는 각각 메틸인 것인 화합물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 각 경우의 R은 독립적으로 -CH2-, -C(CH3)2- 또는 -CH(iPr)-인 것인 화합물.
  10. 제1항에 있어서, Q1 및 Q2는 각각 독립적으로 존재하지 않는 것인 화합물.
  11. 제1항에 있어서, a는 2, 3 또는 4이고, b는 0인 것인 화합물.
  12. 삭제
  13. 제1항에 있어서, 이하의 (i) 내지 (xvii) 중 하나 이상이 적용되는 것인 화합물:
    (i) Q1 및 Q2 존재하지 않음;
    (ii) M1 및 M2는 둘 모두 -C(O)O-임;
    (iii) g 및 h는 둘 모두 1임;
    (iv) g 및 h는 둘 모두 0임;
    (v) c 및 e는 전부 합해서 7임;
    (vi) d 및 f는 전부 합해서 7임;
    (vii) c, e 및 i는 전부 합해서 7임;
    (viii) d, f 및 j는 전부 합해서 7임;
    (ix) i 및 j는 각각 7임;
    (x) k 및 l은 둘 모두 1임;
    (xi) m 및 n은 둘 모두 0임;
    (xii) m 및 q는 전부 합해서 1이거나 또는 m 및 q는 전부 합해서 2임;
    (xiii) m 및 l은 전부 합해서 6임;
    (xiv) r 및 n은 전부 합해서 6임;
    (xv) p 및 o는 둘 모두 0임;
    (xvi) n 및 r는 전부 합해서 2이거나 또는 n 및 r은 전부 합해서 1임; 및
    (xvii) Q3은 H임.
  14. 제1항에 있어서, 이하로부터 선택되는 화합물 또는 그의 염:
    Figure 112013000350703-pct00122
    .
  15. 하기 화학식 IA-1의 화합물 또는 그의 염:
    [화학식 IA-1]
    Figure 112018090295659-pct00123

    식 중,
    R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬 혹은 복소환이거나; 또는
    R1과 R2는, 이들이 부착되는 질소 원자와 함께, 복소환 고리를 형성하며;
    각 경우의 R은 독립적으로 -(CR3R4)-이고;
    각 경우의 R3 및 R4는 독립적으로 H, OH, 알킬, 알콕시, -NH2, 알킬아미노 혹은 다이알킬아미노이고;
    Q는 -C(O)O- 또는 -OC(O)-이고;
    a는 2, 3, 혹은 4이며;
    b는 0이고;
    R'는 존재하지 않거나, 수소 또는 알킬이며;
    각각의 R9 및 R10은 독립적으로 -C(O)O- 혹은 -OC(O)-를 지니는 C12-C24 알킬, C12-C24 알케닐 또는 C12-C24 알콕시이고; 상기 -C(O)O- 혹은 -OC(O)-는 독립적으로 상기 C12-C24 알킬, 알케닐 혹은 알콕시기를 중단(interrupted)시키거나 혹은 C12-C24 알킬, 알케닐 또는 알콕시기의 말단에 치환되며;
    (i) 상기 화합물은 이하의 부분을 포함하지 않고:
    Figure 112018090295659-pct00124

    식 중, ----는 임의선택적 결합이고;
    (ii) R9 및 R10의 말단은 10개 이상의 원자의 사슬에 의해 별표(*)로 표시된 3차 탄소원자로부터 분리된다.
  16. 제15항에 있어서, R'R1R2N-(R)a-Q-(R)b-기는 (CH3)2N-(CH2)3-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-NH-C(O)O-, 또는 (CH3)2N-(CH2)2-OC(O)-NH-인 것인 화합물.
  17. 하기 화학식 IA-2의 화합물 또는 그의 염:
    [화학식 IA-2]
    Figure 112018090295659-pct00137

    식 중,
    R'는 존재하지 않거나, 수소 또는 알킬이고;
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 C1-C4 알킬, C2-C4 알케닐, C2-C4 알키닐, C3-C6 사이클로알킬, (C3-C6 사이클로알킬)C1-C4 알킬 또는 단환식 복소환이거나; 또는
    R1과 R2는, 이들이 부착되는 질소 원자와 함께, 5- 혹은 6-원 복소환 고리를 형성하며;
    각 경우의 R은 독립적으로 -(CR3R4)-이고;
    각 경우의 R3 및 R4는 독립적으로 H, OH, 알킬, 알콕시, -NH2, 알킬아미노 혹은 다이알킬아미노이거나;
    또는 R3과 R4는, 이들이 직접 부착되는 탄소 원자와 함께, C3-C6 사이클로알킬기를 형성하되, 탄소 C*에 부착된 각 사슬 내의 3개 이하의 R기는 사이클로알킬이며;
    Q는 -C(O)O- 또는 -OC(O)-이고;
    Q3 및 Q4는 각각 독립적으로 H, -(CR3R4)-, 혹은 아릴이며;
    각 경우의 A1, A2, A3 및 A4는 독립적으로 -(CR5R5-CR5=CR5)-이고;
    각 경우의 R5는 독립적으로 H 또는 알킬이며;
    M1 및 M2는 각각 독립적으로 -C(O)O- 혹은 -OC(O)-이고;
    Z는 존재하지 않거나 또는 알킬렌 혹은 -O-P(O)(OH)-O-이며;
    Z에 대해 부착된 각 ------는 임의선택적 결합이므로, Z가 존재하지 않을 경우, Q3과 Q4는 함께 직접 공유결합적으로 결합되지 않고;
    a는 1, 2, 3, 4, 5 혹은 6이며;
    b는 0, 1, 2 혹은 3이고;
    c, d, e, i, j, m, n, q 및 r은 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이고;
    g 및 h는 각각 독립적으로 0, 1 혹은 2이고;
    d + 3h의 합계는 적어도 4이고, e + 3g의 합계는 적어도 4이며;
    k 및 l은 각각 독립적으로 0 혹은 1이되, k 및 l 중 적어도 하나는 1이고;
    o 및 p는 각각 독립적으로 0, 1 또는 2이며,
    Q3 및 Q4는 각각 독립적으로 10개 이상의 원자의 사슬에 의해 별표(*)로 표시된 3차 탄소원자로부터 분리된다.
  18. 제17항에 있어서, R'는 존재하지 않거나 또는 알킬인 것인 화합물.
  19. 제17항에 있어서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 C1-C4 알킬인 것인 화합물.
  20. 제17항에 있어서, 각 경우의 R은 독립적으로 -CH2- 또는 -CH(CH3)-인 것인 화합물.
  21. 제17항에 있어서, Q3 및 Q4는 각각 독립적으로 H 또는 아릴인 것인 화합물.
  22. 제17항에 있어서, M1 및 M2는 각각 -C(O)-O-인 것인 화합물.
  23. 제17항에 있어서, e+3g+i+m+3o+q의 합계는 8 내지 20인 것인 화합물.
  24. 제17항에 있어서, d+3h+j+n+3p+r의 합계는 8 내지 20인 것인 화합물.
  25. 하기 화학식 IB의 화합물:
    [화학식 IB]
    Figure 112018090295659-pct00126

    식 중,
    R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬 혹은 복소환이거나; 또는
    R1과 R2는, 이들이 부착되는 질소 원자와 함께, 복소환 고리를 형성하고;
    각 경우의 R은 독립적으로 -(CR3R4)-이며;
    각 경우의 R3 및 R4는 독립적으로 H, OH, 알킬, 알콕시, -NH2, 알킬아미노 혹은 다이알킬아미노이거나;
    Q는 -C(O)O- 또는 -OC(O)-이고;
    a는 1, 2, 3, 4, 5 혹은 6이고;
    b는 0, 1, 2 혹은 3이며;
    R'는 존재하지 않거나, 수소 또는 알킬이고;
    M1 및 M2는 각각 독립적으로 -C(O)O- 또는 -OC(O)-이고;
    각각의 R9 및 R10은 독립적으로 알킬렌 혹은 알케닐렌이며;
    각각의 R11 및 R12는, 독립적으로, 임의선택적으로 COOR13에 의해 종결되는, 알킬 또는 알케닐이고, 각 R13은 독립적으로 알킬이며;
    단,
    R9, M1 및 R11은 함께 길이가 적어도 8개의 탄소 원자이고;
    R10, M2, 및 R12는 함께 길이가 적어도 8개의 탄소 원자이다.
  26. 제25항에 있어서, R9 및 R10은 각각 독립적으로 C4-C12 알킬렌 또는 C4-C12 알케닐렌이고, M1 및 M2는 -C(O)O-이며, R11 및 R12는 C4-C12 알킬렌 또는 C4-C12 알케닐렌인 것인 화합물.
  27. 제25항에 있어서, R9, M1 및 R11은 함께 길이가 12 내지 24개의 탄소 원자인 것인 화합물.
  28. 제25항에 있어서, R10, M2 및 R12는 함께 길이가 12 내지 24개의 탄소 원자인 것인 화합물.
  29. 제25항에 있어서, R'R1R2N-(R)a-Q-(R)b-기는 (CH3)2N-(CH2)3-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-NH-C(O)O-, 또는 (CH3)2N-(CH2)2-OC(O)-NH-인 것인 화합물.
  30. 하기 화학식 IC의 화합물:
    [화학식 IC]
    Figure 112018090295659-pct00127

    식 중,
    R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬 혹은 복소환이거나; 또는
    R1과 R2는, 이들이 부착되는 질소 원자와 함께, 복소환 고리를 형성하고;
    각 경우의 R은 독립적으로 -(CR3R4)-이고;
    각 경우의 R3 및 R4는 독립적으로 H, OH, 알킬, 알콕시, -NH2, 알킬아미노 혹은 다이알킬아미노이고;
    Q는 -C(O)O- 또는 -OC(O)-이고;
    a는 1, 2, 3, 4, 5 혹은 6이고;
    b는 0, 1, 2 혹은 3이며;
    R'는 존재하지 않거나, 수소 또는 알킬이고;
    각각의 R9 및 R10은 독립적으로, 그 말단이 -COOR13 (각 R13은 독립적으로 알킬)로 치환된 C12-C24 알킬 혹은 알케닐인 것인 화합물.
  31. 삭제
  32. 제30항에 있어서, 상기 R'R1R2N-(R)a-Q-(R)b-기는 (CH3)2N-(CH2)3-C(O)O-, (CH3)2N-(CH2)2-NH-C(O)O-, 또는 (CH3)2N-(CH2)2-OC(O)-NH-인 것인 화합물.
  33. 하기 화학식 ID의 화합물 또는 그의 염:
    [화학식 ID]
    Figure 112018090295659-pct00128

    식 중,
    R'는 존재하지 않거나, 수소 또는 알킬이고;
    R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬 혹은 복소환이거나; 또는
    R1과 R2는, 이들이 부착되는 질소 원자와 함께, 복소환 고리를 형성하며;
    각 경우의 R은 독립적으로 -(CR3R4)-이고;
    각 경우의 R3 및 R4는 독립적으로 H, OH, 알킬, 알콕시, -NH2, 알킬아미노 혹은 다이알킬아미노이거나;
    또는 R3과 R4는, 이들이 직접 부착되는 탄소 원자와 함께, 사이클로알킬기를 형성하되, 탄소 C*에 부착된 각 사슬 내의 3개 이하의 R기는 사이클로알킬이고;
    Q는 -C(O)O- 또는 -OC(O)-이고;
    Q1 및 Q2는 각각 독립적으로 존재하지 않거나, -C(O)O- 또는 -OC(O)-이고;
    Q3 및 Q4는 각각 독립적으로 H, -(CR3R4)-, 아릴 혹은 -OH이며;
    각 경우의 A1, A2, A3 및 A4는 독립적으로 -(CR5R5-CR5=CR5)-이고;
    각 경우의 R5는 독립적으로 H 또는 알킬이며;
    M1 및 M2는 각각 독립적으로 -C(O)O- 또는 -OC(O)-이고;
    Z는 존재하지 않거나 또는 알킬렌 혹은 -O-P(O)(OH)-O-이며;
    Z에 대해 부착된 각 ------는 임의선택적 결합이므로, Z가 존재하지 않을 경우, Q3과 Q4는 함께 직접 공유결합적으로 결합되지 않고;
    a는 1, 2, 3, 4, 5 혹은 6이며;
    b는 0, 1, 2 혹은 3이고;
    c, d, e, f, i, j, m, n, q 및 r은 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 혹은 10이며; Q1이 존재할 경우, c는 4, 5, 6, 7, 8, 9 혹은 10이며; Q2가 존재할 경우, d는 4, 5, 6, 7, 8, 9 혹은 10이며;
    g 및 h는 각각 독립적으로 0, 1 혹은 2이고;
    k 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이며; k 및 l 중 적어도 하나는 1이며;
    o 및 p는 각각 독립적으로 0, 1 또는 2이고,
    (j) 상기 화합물은 이하의 부분을 포함하지 않으며:
    Figure 112018090295659-pct00129

    식 중, ----는 임의선택적 결합이고;
    Q3 및 Q4는 각각 독립적으로 10개 이상의 원자의 사슬에 의해 별표(*)로 표시된 3차 탄소원자로부터 분리된다.
  34. 하기 화학식 II 내지 XXIII로부터 선택된 화합물 및 그의 염:
    Figure 112013000350703-pct00130

    Figure 112013000350703-pct00131

    Figure 112013000350703-pct00132

    식 중,
    m, n, o 및 p는 각각 독립적으로 1 내지 25이되, 단,
    (i) 화학식 II, IV, VI 및 VII에서, m 및 p는 둘 모두 4 이상이고;
    (ii) 화학식 VIII, X, XII, XIV, XVI, XVIII, XXI 및 XXIII에서, m은 4 이상이며;
    (iii) 화학식 VIII, IX, XII 및 XIII에서, p는 8 이상이다.
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 제1항, 제4항 내지 제6항, 제9항 내지 제11항, 제13항 내지 제30항, 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 약제학적으로 허용가능한 염의 형태인 것인 화합물.
  39. 제1항, 제4항 내지 제6항, 제9항 내지 제11항, 제13항 내지 제30항, 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 양이온성 지질인 것인 화합물.
  40. 중성 지질, 응집을 저감시킬 수 있는 지질 및 제39항의 양이온성 지질을 포함하는 지질 입자로서,
    상기 중성 지질은 DSPC, DPPC, POPC, DOPE 또는 SM으로부터 선택되고;
    응집을 저감시킬 수 있는 상기 지질은 PEG 지질인 것인 지질 입자.
  41. 제40항에 있어서, 상기 지질 입자는 스테롤을 더 포함하는 것인 지질 입자.
  42. 제40항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 20% 내지 60%의 몰 백분률로 존재하고; 상기 중성 지질은 5% 내지 25%의 몰 백분률로 존재하며; 상기 스테롤은 25% 내지 55%의 몰 백분률로 존재하고; 상기 PEG 지질은 PEG-DMA, PEG-DMG 또는 이들의 조합이며, 0.5% 내지 15%의 몰 백분률로 존재하는 것인 지질 입자.
  43. 제40항에 있어서, 핵산을 더 포함하는 지질 입자.
  44. 제43항에 있어서, 상기 핵산은 플라스미드, 면역자극 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 마이크로RNA, 안타고미어, 압타머 및 리보자임으로부터 선택된 것인 지질 입자.
  45. 제40항에 있어서, 상기 지질 입자는 3시간 미만의 생체내 반감기(t1/2)를 지니는 것인 지질 입자.
  46. 제40항에 있어서, 상기 지질 입자는 -C(O)O- 또는 -OC(O)- 기 없이 동일한 양이온성 지질을 함유하는 지질 입자에 대한 생체내 반감기의 10% 미만의 생체내 반감기(t1/2)를 지니는 것인 지질 입자.
  47. 제43항에 기재된 지질 입자 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 제형(formulation).
  48. 제43항에 있어서, 세포 내 표적 유전자의 발현을 조절하기 위한 지질 입자.
  49. 삭제
  50. 제47항에 있어서, 핵산은 siRNA, 마이크로RNA, 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 siRNA, 마이크로RNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 폴리펩타이드 또는 그의 보체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 폴리펩타이드의 과발현(overexpression)을 특징으로 하는 질환 혹은 장애를 치료하기 위한 약제학적 제형.
  51. 제47항에 있어서, 핵산은 상기 폴리펩타이드 또는 그의 기능성 변이체기능성 변이체(functional variant) 혹은 단편을 인코딩하는 플라스미드인 것인, 폴리펩타이드의 소발현(underexpression)을 특징으로 하는 질환 혹은 장애를 치료하기 위한 약제학적 제형.
  52. 제47항에 있어서, 핵산은 면역자극 올리고뉴클레오타이드인 것인, 면역 반응을 유도시키기 위한 약제학적 제형.
  53. 제52항에 있어서, 표적 유전자는 인자 VII, Eg5, PCSK9, TPX2, apoB, SAA, TTR, RSV, PDGF 베타 유전자, Erb-B 유전자, Src 유전자, CRK 유전자, GRB2 유전자, RAS 유전자, MEKK 유전자, JNK 유전자, RAF 유전자, Erk1/2 유전자, PCNA(p21) 유전자, MYB 유전자, JUN 유전자, FOS 유전자, BCL-2 유전자, 사이클린 D 유전자, VEGF 유전자, EGFR 유전자, 사이클린 A 유전자, 사이클린 E 유전자, WNT-1 유전자, 베타-카테닌 유전자, c-MET 유전자, PKC 유전자, NFKB 유전자, STAT3 유전자, 서바이빈 유전자(survivin gene), Her2/Neu 유전자, SORT1 유전자, XBP1 유전자, 국소이성화효소 I 유전자, 국소이성화효소 II 알파 유전자, p73 유전자, p21(WAF1/CIP1) 유전자, p27(KIP1) 유전자, PPM1D 유전자, RAS 유전자, 카베올린(caveolin) I 유전자, MIB I 유전자, MTAI 유전자, M68 유전자, 종양 억제 유전자 및 p53 종양 억제 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 약제학적 제형.
  54. 제53항에 있어서, 상기 표적 유전자는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인, 약제학적 제형.
  55. 제43항에 있어서, 핵산 분자를 전달하기 위한 지질 입자.
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