TW202039534A - KRAS變體mRNA分子 - Google Patents

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卡加 菲德勒
沃特 烏爾麗克 哥納德
芮吉納 海登里希
米希里 科內魯
桂格葛瑞 Ｄ 帕洛曼
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美商美國禮來大藥廠
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Abstract

本發明提供一種編碼至少一種KRAS變體肽之mRNA分子。另外，本發明提供一種包含該mRNA分子之醫藥組合物及套組。該mRNA分子、該醫藥組合物及該套組適用於治療癌症。

Description

KRAS變體mRNA分子
本發明係關於編碼KRAS變體肽之mRNA分子。
RAS基因(因其在形成大鼠肉瘤中之作用而命名)為人類癌細胞中鑑別之第一致癌基因。三種RAS基因編碼共有82%-90%胺基酸序列一致性且共有幾乎相同之結構及生物化學特性之188至189個胺基酸蛋白質。RAS (大鼠肉瘤)蛋白家族成員為在調節細胞分化、增殖及存活率中起作用之低分子量GTP結合蛋白。存在RAS家族之三個主要成員：HRAS、NRAS及KRAS，其包含人類癌症中突變最頻繁之致癌基因家族，其中在大致25-30%之人類癌症中發現RAS之突變(E Santos,Genes Cancer 2011 ; 2: 344-358)。
RAS突變頻率在美國之癌症死亡之三個主要原因(肺癌、結腸直腸癌及胰臟癌)中為最高的，從而引起密集工作以研發抗RAS療法(Wang等人,J. Med. Chem. 2013; 56: 5219-5230；Waters及Der,Cold Spring Harb Perspect Med. 2018 ; 8: a031435；及Stephen等人,Cancer Cell. 2014 ; 25:272-81, doi: 10.1016/j.ccr.2014.02.017)。
KRAS為突變最頻繁之RAS同功異構物，且經展示以在至多90%之胰臟腺癌、45%之結腸直腸癌及25-35%之肺腺癌中突變(Zeitouni D等人,Cancers (Basel) 2016 ; 8:45；Tan C及X Du,World J. Gastroent. 2012 ; 18: 5175-5189；及Kempf E等人,Eur. Resp. Rev. 2016 ; 25: 71-76)。已在胰臟、結腸、小腸、膽及肺癌腫瘤中觀測到KRAS突變，且已在造血及皮膚癌中觀測到NRAS突變(Hunter JD等人,Mol. Cancer Research 13 : 1325 (2015))。在腎上腺腫瘤、膽道腫瘤、骨腫瘤、乳腫瘤、子宮頸腫瘤、子宮內膜腫瘤、淋巴瘤、腎臟腫瘤、大腸腫瘤、肝臟腫瘤、肺腫瘤、食道腫瘤、卵巢腫瘤、胰臟腫瘤、前列腺腫瘤、唾液腺腫瘤、皮膚腫瘤、小腸腫瘤、胃腫瘤及睪丸腫瘤中觀測到RAS突變，且KRAS為突變最頻繁之RAS同功異構物，存在於COSMIC資料集中所分析之22%之腫瘤中(Prior IA等人,Cancer Research 71 : 2457 (2012))。
然而，儘管經過三十多年的努力工作，但癌症患者尚未得到有效KRAS抑制劑，且KRAS驅動之癌症為最難以治療的且有時難以治療。Ras蛋白質主要基於不能鑑別有效化學抑制劑而稱為「不可成藥」。
因此，仍然需要滿足用於患有帶KRAS突變之腫瘤之患者之有效抗癌療法之醫學需求。
本發明提供一種包含mRNA序列的mRNA分子，其編碼包含CTLA4信號肽之胺基酸序列、KRAS變體肽、PADRE衍生之T輔助抗原決定基序列及CTLA4跨膜域或其部分。在一較佳實施例中，KRAS變體肽包含KRAS變體肽序列之29個鄰近胺基酸殘基。
在一個較佳實施例中，本發明之mRNA分子經調配為脂質奈米粒子，例如在醫藥組合物中。在另一實施例中，脂質奈米粒子(例如在醫藥組合物中)包含調配為脂質奈米粒子之1、2、3、4或5種mRNA分子，其中各個別mRNA分子編碼不同KRAS變體肽。在另一較佳實施例中，脂質奈米粒子(例如在醫藥組合物中)包含5種mRNA分子，其中各個別mRNA分子編碼不同KRAS變體肽。在另一較佳實施例中，脂質奈米粒子(例如在醫藥組合物中)包含4種mRNA分子，其中各個別mRNA分子編碼不同KRAS變體肽。在另一較佳實施例中，脂質奈米粒子(例如在醫藥組合物中)包含3種mRNA分子，其中各個別mRNA分子編碼不同KRAS變體肽。在另一較佳實施例中，脂質奈米粒子(例如在醫藥組合物中)包含2種mRNA分子，其中各個別mRNA分子編碼不同KRAS變體肽。在另一實施例中，脂質奈米粒子(例如在醫藥組合物中)包含1種mRNA分子。
在另一較佳實施例中，一或多種個別mRNA分子(各自編碼不同KRAS變體肽)在調配為脂質奈米粒子之前經混合。在另一較佳實施例中，1、2、3、4或5種個別mRNA分子(各自編碼特定KRAS變體肽)在調配為脂質奈米粒子之前經混合。在另一較佳實施例中，5種個別mRNA分子(各自編碼不同KRAS變體肽)在調配為脂質奈米粒子之前經混合在一起。
在一個較佳實施例中，脂質奈米粒子調配物包含：本發明之一或多種mRNA分子、磷酸膽鹼(例如，二硬脂醯基磷酸膽鹼(DSPC)或1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)、聚乙二醇化脂質(例如，2-mPEG2000-正,正二(十四烷基)乙醯胺)、固醇(例如，膽固醇)及衍生自本文中之式(LNP-III)的陽離子脂質(例如，本文表4中之LNP III-3之脂質)。在另一實施例中，脂質奈米粒子包含本發明之一或多種mRNA分子、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、2-mPEG2000-正,正二(十四烷基)乙醯胺、膽固醇及本文表4中之LNP III-3之脂質。
在另一較佳實施例中，KRAS變體肽包含KRAS G12C變體胺基酸殘基、KRAS G12D變體胺基酸殘基、KRAS G12V變體胺基酸殘基、KRAS G12R變體胺基酸殘基或KRAS G13D變體胺基酸殘基。
在另一較佳實施例中，mRNA分子進一步包含3'-UTR序列。在另一實施例中，mRNA分子進一步包含5'-UTR序列及3'-UTR序列。
在另一較佳實施例中，mRNA不含有編碼任何其他功能元件之序列。在另一較佳實施例中，mRNA並不編碼干擾素基因刺激因子(stimulator of interferon genes；STING)之肽或多肽。
在另一較佳實施例中，KRAS變體肽包含SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12 (表1)之胺基酸序列，其胺基酸序列可較佳地分別由表1之第三行及第四行中所闡述之核酸編碼。
表1
KRAS變體(新抗原決定基) SEQ ID NO: (胺基酸) SEQ ID NO: (野生型核酸) SEQ ID NO: (最佳化核酸)
G12C 8 13 18或23或28
G12D 9 14 19或24或29
G12R 10 15 20或25或30
G12V 11 16 21或26或31
G13D 12 17 22或27或32
在另一較佳實施例中，mRNA分子為表2中之序列識別符中所闡述之mRNA分子。
表2
KRAS變體(新抗原決定基)    KRAS肽 胺基酸 SEQ ID NO: 全編碼胺基酸 SEQ ID NO:    mRNA編碼序列 SEQ ID NO: mRNA構築體之一個較佳實施例 SEQ ID NO:
G12C    8 48 58、63、68、73、78、83、88、93、98、103或108 63、58或68
G12D    9 49 59、64、69、74、79、84、89、94、99、104或109 64、59或69
G12R    10 50 60、65、70、75、80、85、90、95、100、105或110 65、60或70
G12V    11 51 61、66、71、76、81、86、91、96、101、106或111 66、61或71
G13D    12 52 62、67、72、77、82、87、92、97、102、107或112 67、62或72
在另一較佳實施例中，mRNA分子為SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66或SEQ ID NO: 67 (表2)中所闡述之mRNA分子。
在另一較佳實施例中，mRNA分子為SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61或SEQ ID NO: 62 (表2)中所闡述之mRNA分子。
在另一較佳實施例中，mRNA分子編碼SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51或SEQ ID NO: 52 (表3)中所闡述之KRAS變體肽或多肽。在另一較佳實施例中，分子闡述於SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56或SEQ ID NO: 57中。
表3
KRAS新抗原決定基之識別符(aa位置) 信號肽(aa位置) SEQ ID NO: 胺基酸 SEQ ID NO: 最佳化核酸
G12C (1-29) CTLA4 (1-35) 48 53
G12D (1-29) CTLA4 (1-35) 49 54
G12R (1-29) CTLA4 (1-35) 50 55
G12V (1-29) CTLA4 (1-35) 51 56
G13D (1-29) CTLA4 (1-35) 52 57
在另一較佳實施例中，mRNA分子編碼包含KRAS G12C變體肽之胺基酸序列。在另一較佳實施例中，KRAS G12C變體肽為SEQ ID NO: 8。在另一較佳實施例中，mRNA分子編碼包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列。在另一較佳實施例中，mRNA分子編碼包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列。在另一較佳實施例中，mRNA分子包含SEQ ID NO: 58。在另一較佳實施例中，mRNA分子包含SEQ ID NO: 63。
在另一較佳實施例中，mRNA分子編碼包含KRAS G12D變體肽之胺基酸序列。在另一較佳實施例中，KRAS G12D變體肽為SEQ ID NO: 9。在另一較佳實施例中，mRNA分子編碼包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列。在另一較佳實施例中，mRNA分子編碼包含SEQ ID NO: 54之胺基酸序列。在另一較佳實施例中，mRNA分子包含SEQ ID NO: 59。在另一較佳實施例中，mRNA分子包含SEQ ID NO: 64。
在另一較佳實施例中，mRNA分子編碼包含KRAS G12R變體肽之胺基酸序列。在另一較佳實施例中，KRAS G12R變體肽為SEQ ID NO: 10。在另一較佳實施例中，mRNA分子編碼包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列。在另一較佳實施例中，mRNA分子編碼包含SEQ ID NO: 55之胺基酸序列。在另一較佳實施例中，mRNA分子包含SEQ ID NO: 60。在另一較佳實施例中，mRNA分子包含SEQ ID NO: 65。
在另一較佳實施例中，mRNA分子編碼包含KRAS G12V變體肽之胺基酸序列。在另一較佳實施例中，KRAS G12V變體肽為SEQ ID NO: 11。在另一較佳實施例中，mRNA分子編碼包含SEQ ID NO: 51之胺基酸序列。在另一較佳實施例中，mRNA分子編碼包含SEQ ID NO: 56之胺基酸序列。在另一較佳實施例中，mRNA分子包含SEQ ID NO: 61。在另一較佳實施例中，mRNA分子包含SEQ ID NO: 66。
在另一較佳實施例中，mRNA分子編碼包含KRAS G13D變體肽之胺基酸序列。在另一較佳實施例中，KRAS G13D變體肽為SEQ ID NO: 12。在另一較佳實施例中，mRNA分子編碼包含SEQ ID NO: 52之胺基酸序列。在另一較佳實施例中，mRNA分子編碼包含SEQ ID NO: 57之胺基酸序列。在另一較佳實施例中，mRNA分子包含SEQ ID NO: 62。在另一較佳實施例中，mRNA分子包含SEQ ID NO: 67。
根據一尤佳實施例，mRNA分子進一步包含至少一個5'-序列及/或3'-UTR序列。
本發明亦提供一種醫藥組合物，其包含本文中之本發明之mRNA分子及一或多種醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
在一較佳實施例中，醫藥組合物包含1、2、3、4或5個不同mRNA分子，各mRNA分子編碼不同KRAS變體肽。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼單一KRAS變體肽之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含2個不同mRNA分子，各mRNA分子編碼不同KRAS變體肽。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含3種mRNA分子，各mRNA分子編碼不同KRAS變體肽。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含4種mRNA分子，各mRNA分子編碼不同KRAS變體肽。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含5種mRNA分子，各mRNA分子編碼不同KRAS變體肽。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼包含KRAS G12C變體肽之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G12C變體肽為SEQ ID NO: 8。在另一較佳實施例中，mRNA分子編碼包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列。在另一較佳實施例中，mRNA分子編碼包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼包含KRAS G12D變體肽之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G12D變體肽為SEQ ID NO: 9。在另一較佳實施例中，mRNA分子編碼包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列。在另一較佳實施例中，mRNA分子編碼包含SEQ ID NO: 54之胺基酸序列。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼包含KRAS G12R變體肽之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G12R變體肽為SEQ ID NO: 10。在另一較佳實施例中，mRNA分子編碼包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列。在另一較佳實施例中，mRNA分子編碼包含SEQ ID NO: 55之胺基酸序列。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼包含KRAS G12V變體肽之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G12V變體肽為SEQ ID NO: 11。在另一較佳實施例中，mRNA分子編碼包含SEQ ID NO: 51之胺基酸序列。在另一較佳實施例中，mRNA分子編碼包含SEQ ID NO: 56之胺基酸序列。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼包含KRAS G13D變體肽之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G13D變體肽為SEQ ID NO: 12。在另一較佳實施例中，mRNA分子編碼包含SEQ ID NO: 52之胺基酸序列。在另一較佳實施例中，mRNA分子編碼包含SEQ ID NO: 57之胺基酸序列。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼包含KRAS G12C變體肽之胺基酸序列之mRNA分子及編碼包含KRAS G12D變體肽之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G12C變體肽為SEQ ID NO: 8，且KRAS G12D變體肽為SEQ ID NO: 9。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 49之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 54之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 58之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 59之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 63之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 64之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼包含KRAS G12D變體肽之胺基酸序列之mRNA分子及編碼包含KRAS G12V變體肽之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G12D變體肽為SEQ ID NO: 9，且KRAS G12V變體肽為SEQ ID NO: 11。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼SEQ ID NO: 49之胺基酸序列之mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 51之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼SEQ ID NO: 54之胺基酸序列之mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 56之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 59之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 61之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 64之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 66之mRNA分子。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼包含KRAS G12D變體肽之胺基酸序列之mRNA分子及編碼包含KRAS G12R變體肽之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G12D變體肽為SEQ ID NO: 9，且KRAS G12R變體肽為SEQ ID NO: 10。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼SEQ ID NO: 49之胺基酸序列之mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 50之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼SEQ ID NO: 54之胺基酸序列之mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 55之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 59之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 60之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 64之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 65之mRNA分子。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼包含KRAS G12D變體肽之胺基酸序列之mRNA分子及編碼包含KRAS G13D變體肽之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G12D變體肽為SEQ ID NO: 9，且KRAS G13D變體肽為SEQ ID NO: 12。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼SEQ ID NO: 49之胺基酸序列之mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 52之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼SEQ ID NO: 54之胺基酸序列之mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 57之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 59之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 62之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 64之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 67之mRNA分子。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼包含KRAS G12C變體肽之胺基酸序列之mRNA分子及編碼包含KRAS G12V變體肽之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G12C變體肽為SEQ ID NO: 8，且KRAS G12V變體肽為SEQ ID NO: 11。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 51之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 56之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 58之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 61之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 63之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 66之mRNA分子。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼包含KRAS G12C變體肽之胺基酸序列之mRNA分子及編碼包含KRAS G12R變體肽之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G12C變體肽為SEQ ID NO: 8，且KRAS G12R變體肽為SEQ ID NO: 10。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 50之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 55之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 58之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 60之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 63之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 65之mRNA分子。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼包含KRAS G12C變體肽之胺基酸序列之mRNA分子及編碼包含KRAS G13D變體肽之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G12C變體肽為SEQ ID NO: 8，且KRAS G13D變體肽為SEQ ID NO: 12。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 52之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 57之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 58之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 62之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 63之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 67之mRNA分子。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼包含KRAS G12R變體肽之胺基酸序列之mRNA分子及編碼包含KRAS G12V變體肽之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G12R變體肽為SEQ ID NO: 10，且KRAS G12V變體肽為SEQ ID NO: 11。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼SEQ ID NO: 50之胺基酸序列之mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 51之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼SEQ ID NO: 55之胺基酸序列之mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 56之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 60之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 61之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 65之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 66之mRNA分子。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼包含KRAS G12V變體肽之胺基酸序列之mRNA分子及編碼包含KRAS G13D變體肽之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G12V變體肽為SEQ ID NO: 11，且KRAS G13D變體肽為SEQ ID NO: 12。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼SEQ ID NO: 51之胺基酸序列之mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 52之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼SEQ ID NO: 56之胺基酸序列之mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 57之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 61之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 62之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 66之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 67之mRNA分子。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼包含KRAS G12R變體肽之胺基酸序列之mRNA分子及編碼包含KRAS G13D變體肽之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G12R變體肽為SEQ ID NO: 10，且KRAS G13D變體肽為SEQ ID NO: 12。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼SEQ ID NO: 50之胺基酸序列之mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 52之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含編碼SEQ ID NO: 55之胺基酸序列之mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 57之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 60之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 62之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 65之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 67之mRNA分子。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼包含KRAS G12D變體肽之胺基酸序列之mRNA分子、編碼包含KRAS G12C變體肽之胺基酸序列的mRNA分子及編碼包含KRAS G12V變體肽之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G12C變體肽為SEQ ID NO: 8，KRAS G12D變體肽為SEQ ID NO: 9，且KRAS G12V變體肽為SEQ ID NO: 11。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 49之胺基酸序列的mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 51之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 54之胺基酸序列的mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 56之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 58之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 59之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 61之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 63之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 64之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 66之mRNA分子。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼包含KRAS G12D變體肽之胺基酸序列之mRNA分子、編碼包含KRAS G12C變體肽之胺基酸序列的mRNA分子及編碼包含KRAS G12R變體肽之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G12C變體肽為SEQ ID NO: 8，KRAS G12D變體肽為SEQ ID NO: 9，且KRAS G12R變體肽為SEQ ID NO: 10。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 49之胺基酸序列的mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 50之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 54之胺基酸序列的mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 55之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 58之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 59之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 60之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 63之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 64之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 65之mRNA分子。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼包含KRAS G12D變體肽之胺基酸序列之mRNA分子、編碼包含KRAS G12C變體肽之胺基酸序列的mRNA分子及編碼包含KRAS G13D變體肽之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G12C變體肽為SEQ ID NO: 8，KRAS G12D變體肽為SEQ ID NO: 9，且KRAS G13D變體肽為SEQ ID NO: 12。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 49之胺基酸序列的mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 52之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 54之胺基酸序列的mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 57之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 58之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 59之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 62之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 63之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 64之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 67之mRNA分子。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼包含KRAS G12D變體肽之胺基酸序列之mRNA分子、編碼包含KRAS G12R變體肽之胺基酸序列的mRNA分子及編碼包含KRAS G12V變體肽之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G12D變體肽為SEQ ID NO: 9，KRAS G12R變體肽為SEQ ID NO: 10，且KRAS G12V變體肽為SEQ ID NO: 11。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 49之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 50之胺基酸序列的mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 51之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 54之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 55之胺基酸序列的mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 56之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 59之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 60之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 61之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 64之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 65之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 66之mRNA分子。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼包含KRAS G12D變體肽之胺基酸序列之mRNA分子、編碼包含KRAS G12V變體肽之胺基酸序列的mRNA分子及編碼包含KRAS G13D變體肽之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G12D變體肽為SEQ ID NO: 9，KRAS G12V變體肽為SEQ ID NO: 11，且KRAS G13D變體肽為SEQ ID NO: 12。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 49之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 51之胺基酸序列的mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 52之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 54之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 56之胺基酸序列的mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 57之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 59之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 61之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 62之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 64之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 66之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 67之mRNA分子。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼包含KRAS G12D變體肽之胺基酸序列之mRNA分子、編碼包含KRAS G12R變體肽之胺基酸序列的mRNA分子及編碼包含KRAS G13D變體肽之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G12D變體肽為SEQ ID NO: 9，KRAS G12R變體肽為SEQ ID NO: 10，且KRAS G13D變體肽為SEQ ID NO: 12。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 49之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 50之胺基酸序列的mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 52之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 54之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 55之胺基酸序列的mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 57之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 59之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 60之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 62之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 64之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 65之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 67之mRNA分子。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼包含KRAS G12C變體肽之胺基酸序列之mRNA分子、編碼包含KRAS G12R變體肽之胺基酸序列的mRNA分子及編碼包含KRAS G12V變體肽之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G12C變體肽為SEQ ID NO: 8，KRAS G12R變體肽為SEQ ID NO: 10，且KRAS G12V變體肽為SEQ ID NO: 11。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 50之胺基酸序列的mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 51之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 55之胺基酸序列的mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 56之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 58之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 60之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 61之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 63之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 65之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 66之mRNA分子。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼包含KRAS G12C變體肽之胺基酸序列之mRNA分子、編碼包含KRAS G12V變體肽之胺基酸序列的mRNA分子及編碼包含KRAS G13D變體肽之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G12C變體肽為SEQ ID NO: 8，且KRAS G12V變體肽為SEQ ID NO: 11，且KRAS G13D變體肽為SEQ ID NO: 12。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 51之胺基酸序列的mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 52之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 56之胺基酸序列的mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 57之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 58之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 61之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 62之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 63之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 66之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 67之mRNA分子。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼包含KRAS G12C變體肽之胺基酸序列之mRNA分子、編碼包含KRAS G12R變體肽之胺基酸序列的mRNA分子及編碼包含KRAS G13D變體肽之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G12C變體肽為SEQ ID NO: 8，KRAS G12R變體肽為SEQ ID NO: 10，且KRAS G13D變體肽為SEQ ID NO: 12。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 50之胺基酸序列的mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 52之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 55之胺基酸序列的mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 57之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 58之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 60之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 62之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 63之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 65之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 67之mRNA分子。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼包含KRAS G12R變體肽之胺基酸序列之mRNA分子、編碼包含KRAS G12V變體肽之胺基酸序列的mRNA分子及編碼包含KRAS G13D變體肽之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G12R變體肽為SEQ ID NO: 10，KRAS G12V變體肽為SEQ ID NO: 11，且KRAS G13D變體肽為SEQ ID NO: 12。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 50之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 51之胺基酸序列的mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 52之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 55之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 56之胺基酸序列的mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 57之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 60之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 61之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 62之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 65之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 66之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 67之mRNA分子。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼包含KRAS G12C變體肽之胺基酸序列之mRNA分子、編碼包含KRAS G12D變體肽之胺基酸序列的mRNA分子、編碼包含KRAS G12R變體肽之胺基酸序列之mRNA分子及編碼包含KRAS G12V變體肽之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G12C變體肽為SEQ ID NO: 8，KRAS G12D變體肽為SEQ ID NO: 9，KRAS G12R變體肽為SEQ ID NO: 10，且KRAS G12V變體肽為SEQ ID NO: 11。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 49之胺基酸序列的mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 50之胺基酸序列之mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 51之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 54之胺基酸序列的mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 55之胺基酸序列之mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 56之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 58之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 59之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 60之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 61之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 63之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 64之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 65之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 66之mRNA分子。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼包含KRAS G12C變體肽之胺基酸序列之mRNA分子、編碼包含KRAS G12D變體肽之胺基酸序列的mRNA分子、編碼包含KRAS G12V變體肽之胺基酸序列之mRNA分子及編碼包含KRAS G13D變體肽之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G12C變體肽為SEQ ID NO: 8，KRAS G12D變體肽為SEQ ID NO: 9，KRAS G12V變體肽為SEQ ID NO: 11，且KRAS G13D變體肽為SEQ ID NO: 12。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 49之胺基酸序列的mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 51之胺基酸序列之mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 52之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 54之胺基酸序列的mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 56之胺基酸序列之mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 57之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 58之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 59之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 61之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 62之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 63之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 64之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 66之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 67之mRNA分子。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼包含KRAS G12C變體肽之胺基酸序列之mRNA分子、編碼包含KRAS G12D變體肽之胺基酸序列的mRNA分子、編碼包含KRAS G12R變體肽之胺基酸序列之mRNA分子及編碼包含KRAS G13D變體肽之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G12C變體肽為SEQ ID NO: 8，KRAS G12D變體肽為SEQ ID NO: 9，KRAS G12R變體肽為SEQ ID NO: 10，且KRAS G13D變體肽為SEQ ID NO: 12。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 49之胺基酸序列的mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 50之胺基酸序列之mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 52之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 54之胺基酸序列的mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 55之胺基酸序列之mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 57之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 58之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 59之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 60之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 62之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 63之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 64之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 65之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 67之mRNA分子。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼包含KRAS G12D變體肽之胺基酸序列之mRNA分子、編碼包含KRAS G12V變體肽之胺基酸序列的mRNA分子、編碼包含KRAS G12R變體肽之胺基酸序列之mRNA分子及編碼包含KRAS G13D變體肽之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G12D變體肽為SEQ ID NO: 9，KRAS G12R變體肽為SEQ ID NO: 10，KRAS G12V變體肽為SEQ ID NO: 11，且KRAS G13D變體肽為SEQ ID NO: 12。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 49之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 50之胺基酸序列的mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 51之胺基酸序列之mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 52之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 54之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 55之胺基酸序列的mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 56之胺基酸序列之mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 57之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 59之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 60之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 61之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 62之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 64之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 65之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 66之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 67之mRNA分子。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼包含KRAS G12C變體肽之胺基酸序列之mRNA分子、編碼包含KRAS G12V變體肽之胺基酸序列的mRNA分子、編碼包含KRAS G12R變體肽之胺基酸序列之mRNA分子及編碼包含KRAS G13D變體肽之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G12C變體肽為SEQ ID NO: 8，KRAS G12R變體肽為SEQ ID NO: 10，KRAS G12V變體肽為SEQ ID NO: 11，且KRAS G13D變體肽為SEQ ID NO: 12。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 50之胺基酸序列的mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 51之胺基酸序列之mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 52之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 55之胺基酸序列的mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 56之胺基酸序列之mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 57之胺基酸序列的mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 58之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 60之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 61之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 62之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 63之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 65之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 66之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 67之mRNA分子。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼包含KRAS G12C變體肽之胺基酸序列之mRNA分子、編碼包含KRAS G12D變體肽之胺基酸序列的mRNA分子、編碼包含KRAS G12R變體肽之胺基酸序列之mRNA分子、編碼包含KRAS G12V變體肽之胺基酸序列的mRNA分子及編碼包含KRAS G13D變體肽之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，KRAS G12C變體肽為SEQ ID NO: 8，KRAS G12D變體肽為SEQ ID NO: 9，KRAS G12R變體肽為SEQ ID NO: 10，KRAS G12V變體肽為SEQ ID NO: 11，且KRAS G13D變體肽為SEQ ID NO: 12。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 49之胺基酸序列的mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 50之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 51之胺基酸序列的mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 52之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：編碼SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 54之胺基酸序列的mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 55之胺基酸序列之mRNA分子、編碼SEQ ID NO: 56之胺基酸序列的mRNA分子及編碼SEQ ID NO: 57之胺基酸序列之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 58之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 59之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 60的mRNA分子、包含SEQ ID NO: 61之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 62之mRNA分子。在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：包含SEQ ID NO: 63之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 64之mRNA分子、包含SEQ ID NO: 65的mRNA分子、包含SEQ ID NO: 66之mRNA分子及包含SEQ ID NO: 67之mRNA分子。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物進一步包含陽離子脂質、固醇、中性脂質及PEG脂質。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：闡述於SEQ ID NO: 63-67中之mRNA分子中之一或多者；膽固醇；2-mPEG2000-正,正二(十四烷基)乙醯胺；1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)；及陽離子脂質
Figure 02_image001
。
在另一較佳實施例中，陽離子脂質:DSPC:膽固醇:PEG脂質之莫耳比為大致50:10:38.5:1.5、47.5:10:40.8:1.7或47.4:10:40.9:1.7 mol%。
在另一較佳實施例中，醫藥組合物包含：闡述於SEQ ID NO: 58-62中之mRNA分子中之一或多者；膽固醇；2-mPEG2000-正,正二(十四烷基)乙醯胺；1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)；及陽離子脂質
Figure 02_image003
。
在另一較佳實施例中，陽離子脂質:DSPC:膽固醇:PEG脂質之莫耳比為大致50:10:38.5:1.5、47.5:10:40.8:1.7或較佳地47.4:10:40.9:1.7 mol%。
本發明亦提供一種套組，其包含技術方案1至16中任一項之mRNA分子及視情況選用之具有關於mRNA分子之投與及劑量之資訊的說明書。
在一個較佳實施例中，本發明提供本發明之mRNA分子或本發明之醫藥組合物以用於人類投與。
根據另一態樣，本發明係關於用於治療癌症之本發明之mRNA分子或醫藥組合物。因此，本發明提供一種治療癌症之方法，其包含向有需要之個體投與有效量的本發明之一或多種mRNA分子。在一個實施例中，癌症為實體腫瘤癌，即膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、頭頸癌、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、胃癌(stomach/gastric cancer)、睾丸癌、甲狀腺癌或子宮癌。
在一尤佳實施例中，癌症為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer；NSCLC)、結腸直腸癌(colorectal cancer；CRC)或胰臟癌。
在另一較佳實施例中，肺癌為非小細胞肺癌。在另一較佳實施例中，非小細胞肺癌為鱗狀細胞癌、大細胞癌或腺癌。在另一較佳實施例中，非小細胞肺癌為晚期及/或轉移性非小細胞肺癌，甚至更佳地為不可切除性及/或晚期非小細胞肺癌。在另一較佳實施例中，非小細胞肺癌為難以用標準護理治療之晚期及/或轉移性非小細胞肺癌。在另一較佳實施例中，非小細胞肺癌為非轉移性可切除非小細胞肺癌或手術切除之後而無殘留疾病跡象的非小細胞肺癌或可經受化學輻射療法或化學輻射療法之後無殘留疾病跡象之非小細胞肺癌。
在另一較佳實施例中，結腸直腸癌為結腸癌或直腸癌。在另一較佳實施例中，結腸直腸癌為晚期及/或轉移性結腸直腸癌，甚至更佳地為具有微衛星不穩定性(microsatellite instability；MSI)或非超突變微衛星穩定性(microsatellite stability；MSS)之晚期及/或轉移性超突變癌症。在另一較佳實施例中，結腸直腸癌為可切除結腸直腸癌、可經受化學輻射療法或在化學輻射療法之後之直腸癌或手術切除之後無殘留疾病跡象以及微衛星不穩定性(MSI)或非超突變微衛星穩定性(MSS)之結腸直腸癌。
在另一較佳實施例中，結腸直腸癌為可切除結腸直腸癌、可經受化學輻射療法或在化學輻射療法之後之直腸癌或手術切除之後無殘留疾病跡象以及微衛星不穩定性(MSI)或非超突變微衛星穩定性(MSS)之結腸直腸癌。
在另一較佳實施例中，胰臟癌為胰臟癌。在另一較佳實施例中，胰臟癌為晚期及/或轉移性胰臟癌。在另一較佳實施例中，胰臟癌為經受化學輻射或在化學輻射之後之可切除胰臟癌或在手術切除之後無殘留疾病跡象的胰臟癌。
在另一較佳實施例中，經投與mRNA分子之個體經腫瘤分型。在一個實施例中，個體已經腫瘤分型為KRAS G12D、G12C、G12R、G12V或G13D突變中之一或多者。在另一較佳實施例中，經投與mRNA之個體經HLA分型。在另一較佳實施例中，經投與mRNA之個體已經腫瘤分型及HLA分型兩者。
在另一較佳實施例中，經投與mRNA分子之個體尚未經腫瘤分型。在一個實施例中，個體經腫瘤分型為KRAS G12D、G12C、G12R、G12V或G13D突變中之一或多者。在另一較佳實施例中，經投與mRNA之個體尚未經HLA分型。在另一較佳實施例中，經投與mRNA之個體尚未經腫瘤分型或HLA分型。
本發明之mRNA分子或醫藥組合物可經非經腸，例如皮下、靜脈內、肌肉內、皮內、結節內或腹膜內投與。在另一實施例中，mRNA分子經肌肉內投與。
根據另一態樣，因此本發明係關於用作藥物，特定言之治療癌症之本發明之mRNA分子或醫藥組合物。在一個較佳實施例中，mRNA分子經肌肉內投與。在另一較佳實施例中，mRNA分子經皮下投與。
本發明進一步係關於一種本發明之mRNA分子或醫藥組合物在製造用於治療癌症之藥物中之用途。
在另一較佳實施例中，本發明提供一種治療癌症之方法，其包含以與一或多種抗腫瘤劑同時、單獨或依序組合方式投與有效量的本發明之mRNA分子。抗腫瘤劑之非限制性實例包括雷莫蘆單抗(ramucirumab)、萊西單抗(necitumumab)、奧拉單抗(olaratumab)、高倫替布(galunisertib)、阿貝西尼(abemaciclib)、瑞格非尼(regorafenib)、埃羅替尼(erlotinib)、克唑替尼(crizotinib)、順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、達卡巴嗪(dacarbazine)、脂質體小紅莓(liposomal doxorubicin)、多西他賽(docetaxel)、環磷醯胺(cyclophosphamide)及小紅莓、溫諾平(navelbine)、艾瑞布林(eribulin)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、白蛋白結合型太平洋紫杉醇(nab-paclitaxel)、可注射懸浮液之太平洋紫杉醇蛋白結合粒子、伊沙匹隆(ixabepilone)、卡培他濱(capecitabine)、FOLFOX (甲醯四氫葉酸、氟尿嘧啶(fluorouracil)及奧沙利鉑(oxaliplatin))、FOLFIRI (甲醯四氫葉酸、氟尿嘧啶及伊立替康(irinotecan))、FOLFIRINOX (甲醯四氫葉酸、氟尿嘧啶、奧沙利鉑及伊立替康)、培美曲塞(pemetrexed)、吉西他濱(gemcitabine)、西妥昔單抗(cetuximab)、EGFR抑制劑、Raf抑制劑、B-Raf抑制劑、CDK4/6抑制劑、吲哚胺2,3-雙加氧酶抑制劑、TGFβ抑制劑及TGFβ受體抑制劑。
在另一較佳實施例中，本發明提供一種治療癌症之方法，其包含以與一或多種免疫腫瘤學藥劑同時、單獨或依序組合方式投與有效量的本發明之mRNA分子。免疫腫瘤學藥劑之非限制性實例包括：納武單抗(nivolumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、皮立珠單抗(pidilizumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、曲美單抗(tremelimumab)、烏瑞魯單抗(urelumab)、利瑞路單抗(lirilumab)、阿特珠單抗(atezolizumab)、德瓦魯單抗(durvalumab)、阿維魯單抗(avelumab)及抗PD-L1抗體LY3300054 (其重鏈及輕鏈序列分別在WO 2017/034916及US 2017/0058033中闡述為SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 11)。
在另一較佳實施例中，本發明提供一種治療癌症之方法，其包含投與有效量的本發明之mRNA分子而無需與一或多種免疫腫瘤學藥劑同時、單獨或依序組合。
在另一較佳實施例中，本發明提供一種治療癌症之方法，其包含以與放射療法同時、單獨或依序組合方式投與有效量的本發明之mRNA分子。
在另一較佳實施例中，本發明提供一種治療癌症之方法，其包含以與手術同時、單獨或依序組合方式投與有效量的本發明之mRNA分子。
本發明亦提供一種用於療法之本發明之mRNA分子。
本發明亦提供一種用於治療癌症之本發明之mRNA分子。在一個較佳實施例中，癌症為實體腫瘤癌，即膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、頭頸癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌、子宮癌或尿道上皮癌。在另一實施例中，肺癌為非小細胞肺癌。
本發明亦提供一種用於製造用於治療癌症之藥物的本發明之mRNA分子。在一個較佳實施例中，癌症為實體腫瘤癌，即膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、頭頸癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌、子宮癌或尿道上皮癌。在另一實施例中，肺癌為非小細胞肺癌。
在一個實施例中，經投與根據本發明之mRNA分子或醫藥組合物的個體可為患有選自以下之腫瘤或癌症疾病之個體： -  非小細胞肺癌(NSCLC)，較佳地晚期及/或轉移性NSCLC，甚至更佳地不可切除性及/或晚期NSCLC； -  結腸直腸癌(CRC)，較佳地晚期及/或轉移性CRC，甚至更佳地具有微衛星不穩定性(MSI)或非超突變微衛星穩定性(MSS)之晚期及/或轉移性超突變癌症；或 -  胰臟癌，較佳地晚期及/或轉移性胰臟癌，甚至更佳地不可切除性及/或晚期胰臟癌。
在一個實施例中，經投與根據本發明之mRNA分子或醫藥組合物的個體可為患有較佳地如本文中所定義之腫瘤或癌症疾病，更佳地選自由以下組成之群中之疾病之個體：非小細胞肺癌(NSCLC)、較佳地晚期及/或轉移性NSCLC、甚至更佳地不可切除性及/或晚期NSCLC；結腸直腸癌(CRC)、較佳地結腸癌及直腸癌、甚至更佳地具有微衛星不穩定性(MSI)或非超突變微衛星穩定性(MSS)之晚期及/或轉移性超突變癌症；或胰臟癌、較佳地胰臟腺癌，該個體接受(received/receives)化學療法(例如第一線或第二線化學療法)、放射療法、化學輻射(化學療法及放射療法之組合)、激酶抑制劑、抗體療法及/或檢查點調節劑(例如CTLA4抑制劑、PD-1路徑抑制劑)；或在接受上文所指定之治療中之一或多者之後已達成完全反應、部分反應、穩定疾病的個體。
在一些實施例中，經投與根據本發明之mRNA分子或醫藥組合物的個體可為患有較佳地如本文中所定義之腫瘤或癌症疾病，更佳地選自由以下組成之群的疾病之個體：非小細胞肺癌(NSCLC)、較佳地晚期及/或轉移性NSCLC、甚至更佳地不可切除性及/或晚期NSCLC；結腸直腸癌(CRC)、較佳地結腸癌及直腸癌；或胰臟癌、較佳地胰臟腺癌，該個體接受習知地用於如本文中所描述之此等疾病中之任一者中的化合物。
在一些實施例中，經投與根據本發明之mRNA分子或醫藥組合物的個體可為患有腫瘤或癌症疾病、較佳地NSCLC、更佳地晚期及/或轉移性NSCLC之個體，該個體正接受或已接受以下治療中之至少一者： -  術前(新輔助化學療法)及/或術後(輔助)化學療法； -  針對原發性腫瘤之手術或較佳地初次手術； -  放射療法； -  檢查點調節劑單一療法，較佳地靶向CTLA4、PD1 (諸如派姆單抗)或PD-L1 (諸如LY3300054)； -  利用介白素之組合療法，諸如IL-10或聚乙二醇化IL-10； -  較佳地靶向CTLA4、PD1 (諸如派姆單抗)或PD-L1 (諸如LY3300054)之檢查點調節劑及化學療法之組合療法； -  基於鉑之化學療法，使用化合物(諸如順鉑或卡鉑)，較佳地與培美曲塞或吉西他濱組合； -  靶向EGFR信號傳導路徑之化合物，諸如抗體西妥昔單抗或酪胺酸激酶抑制劑，諸如埃羅替尼、吉非替尼(gefitinib)、阿法替尼(afatinib)或奧希替尼(osimertinib)； -  充當間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase；ALK)及c-ros致癌基因1 (ROS1)抑制劑之化合物，使用諸如克唑替尼之化合物；或 -  靶向血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor；VEGF)之化合物，諸如抗體貝伐珠單抗(bevacizumab)。
在一些實施例中，經投與根據本發明之mRNA分子或醫藥組合物的個體可為患有腫瘤或癌症疾病、較佳地結腸直腸癌(CRC)、更佳地具有微衛星不穩定性(MSI)或非超突變微衛星穩定(MSS)之晚期及/或轉移性超突變癌症的個體，該個體正接受或已接受以下治療中之至少一者： -  針對原發性腫瘤之手術或較佳地初次手術； -  化學療法； -  放射療法； -  靶向療法； -  免疫療法； -  手術、放射療法、化學療法、靶向療法及免疫療法中之兩者或更多者之組合； -  術前(新輔助化學療法)及/或術後(輔助)化學療法； -  使用化合物，諸如氟尿嘧啶(5-FU，阿德希爾(Adrucil))、卡培他濱(希羅達(Xeloda)、伊立替康(開普拓(Camptosar))、奧沙利鉑(艾洛汀(Eloxatin))、曲氟尿苷(Trifluridine)/替吡嘧啶(tipiracil) (TAS-102，洛斯氟(Lonsurf))之化學療法； -  停止或減少血管生成之化合物，諸如貝伐珠單抗(安維汀(Avastin))； -  抑制表皮成長因子受體(epidermal growth factor receptor；EGFR)之化合物，諸如西妥昔單抗(愛必妥(Erbitux))或帕尼單抗(panitumumab) (維克替比(Vectibix))；或 -  靶向免疫檢查點，較佳地CTLA4、PD1或PD-L1之化合物，諸如靶向PD-1受體之派姆單抗(克珠達(Keytruda))、納武單抗(歐狄沃(Opdivo))或抗PD-L1抗體LY3300054； -  納武單抗及伊匹單抗(易沃伊(Yervoy))之組合。
在一些實施例中，經投與根據本發明之mRNA分子或醫藥組合物的個體可為患有腫瘤或癌症疾病、較佳地胰臟癌、更佳地晚期及/或轉移性胰臟癌、更佳地胰臟腺癌之個體，該個體正接受或已接受以下治療中之至少一者： -  針對原發性腫瘤之手術或較佳地初次手術； -  放射療法； -  化學療法； -  手術、放射療法及化學療法之組合； -  利用介白素之組合療法，諸如IL-10或聚乙二醇化IL-10； -  術前(新輔助)及/或術後(輔助)化學療法； -  化學療法，使用諸如吉西他濱或氟尿嘧啶(5-FU)、伊立替康、奧沙利鉑或白蛋白結合型太平洋紫杉醇之化合物； -  靶向EGFR信號傳導路徑之化合物，使用諸如埃羅替尼之化合物； -  吉西他濱與埃羅替尼之組合； -  支援消化系統之化合物，使用諸如質子泵抑制劑、H2拮抗劑或甲氧氯普胺(metoclopramide)之化合物；或 -  靶向免疫檢查點之化合物，諸如派姆單抗、納武單抗、伊匹單抗或LY3300054。
可藉由一般熟習此項技術者將判定為臨床上適當之療程向有需要之個體投與本發明之mRNA分子或醫藥組合物或套組。
在一個實施例中，以約1、5、10、20、30、40、100、300或1000 μg之劑量向個體投與本發明之一或多種mRNA分子。在另一實施例中，以約1 μg之劑量向個體投與本發明之一或多種mRNA分子。在另一實施例中，以約5 μg之劑量向個體投與本發明之一或多種mRNA分子。在另一實施例中，以約10 μg之劑量向個體投與本發明之一或多種mRNA分子。在另一實施例中，以約20 μg之劑量向個體投與本發明之一或多種mRNA分子。在另一實施例中，以約40 μg之劑量向個體投與本發明之一或多種mRNA分子。在另一實施例中，以約100 μg之劑量向個體投與本發明之一或多種mRNA分子。在另一實施例中，以約300 μg之劑量向個體投與本發明之一或多種mRNA分子。在另一實施例中，以約1000 μg之劑量向個體投與本發明之一或多種mRNA分子。在另一實施例中，本發明之一或多種mRNA分子與免疫腫瘤學藥劑(諸如抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體(諸如LY3300054))或聚乙二醇化IL-10分子組合投與。
在一個實施例中，向個體投與本發明之一或多種mRNA分子持續3、4、5、6、12、18或24個月。在另一實施例中，向個體投與本發明之一或多種mRNA分子持續3個月。在另一實施例中，向個體投與本發明之一或多種mRNA分子持續4個月。在另一實施例中，向個體投與本發明之一或多種mRNA分子持續5個月。在另一實施例中，向個體投與本發明之一或多種mRNA分子持續至多6個月。在另一實施例中，本發明之一或多種mRNA分子與免疫腫瘤學藥劑(諸如抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體(LY3300054))或聚乙二醇化IL-10分子組合投與。
在另一實施例中，以約1、5、10、20、30、40、100、300或1000 μg之劑量向個體投與本發明之一或多種mRNA分子且持續3、4、5或6個月。
本發明亦提供一種尤佳地用作藥物之mRNA分子，其編碼包含CTLA4信號肽之胺基酸序列、KRAS變體肽、PADRE衍生之T輔助抗原決定基序列及CTLA4免疫反應激活信號轉導蛋白序列尤佳。在一較佳實施例中，KRAS變體肽包含KRAS變體肽序列之29個鄰近胺基酸殘基。
本發明亦提供一種用於治療癌症之包含mRNA序列的mRNA分子，其編碼包含CTLA4信號肽之胺基酸序列、KRAS變體肽、PADRE衍生之T輔助抗原決定基序列及CTLA4免疫反應激活信號轉導蛋白序列，其中該癌症較佳地為實體腫瘤癌，該實體腫瘤癌尤佳地選自以下：膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、頭頸癌、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌或子宮癌。在一較佳實施例中，KRAS變體肽包含KRAS變體肽序列之29個鄰近胺基酸殘基。
在另一較佳態樣，本發明提供一種套組，其包含本發明之mRNA分子或醫藥組合物及視情況選用之液體媒劑及/或視情況選用之具有關於mRNA分子或組合物之適當投與及劑量之資訊的技術說明書。
本申請案根據35 U.S.C.§119(e)主張2018年12月14日申請之美國臨時申請案系列第62/779,858號及2019年1月4日申請之美國臨時申請案系列第62/788,285號的權益；該等申請案中之揭示內容以引用之方式併入本文中。
雖然下文詳細描述本發明，但應理解本發明不限於本文中所描述之特定方法、方案及試劑，因為此等可能變化。亦應理解，本文中所使用之術語並不意欲限制本發明之範疇。除非本文中另外定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語均具有與一般熟習此項技術者通常所理解相同的含義。
在整個本說明書及隨附申請專利範圍中，除非上下文另外規定，否則術語「包含(comprise)」及變化形式(諸如「包含(comprises/comprising)」)應理解為暗示包括所陳述成員、整體或步驟但不排除任何其他未陳述之成員、整體或步驟。術語「由...組成」為術語「包含」之特定實施例，其中排除任何其他未陳述之成員、整體或步驟。在本發明之上下文中，術語「包含」涵蓋術語「由…組成」。因此，術語「包含」涵蓋「包括」以及「由...組成」，例如「包含」X之組合物可獨佔地由X組成或可包括其他某物。
除非本文中另外指示或與上下文明顯矛盾，否則在描述本發明之上下文中(尤其在申請專利範圍之上下文中)所使用的術語「一(a/an)」及「該」以及類似參考應解釋為覆蓋單數及複數二者。本文中之值的範圍敍述僅意欲充當個別地提及屬於該範圍內之各單獨值的簡寫方法。除非本文中另外指示，否則將各個別值併入至本說明書中，如同其在本文中個別地敍述一般。本說明書中之任何語言不應解釋為指示實踐本發明所必需之任何未主張要素。
關於數值x之術語「約」意謂x±10%。
在本發明中，在不另外指示之情況下，替代方案及實施例之不同特徵可彼此組合。
術語「HLA」係指人類白血球抗原，其為將變體肽呈現至T細胞受體之細胞表面分子。術語「經HLA分型之個體」係指彼個體體內之人類白血球抗原概況已經判定的個體。用於判定HLA型之方法為一般熟習此項技術者所熟知，如展示於例如Rajalingam R等人,Molecular Diagnostics, Techniques and Applications for the Clinical Laboratory 2010 , 第367-379頁, Academic Press；及Choo SY,Yonsei Medical Journal 48 : 11 (2007)中。用於判定HLA型之非限制性方法包括細胞分型、基因測序、表型及單體分型。術語「經HLA分型之個體」及「經人類白血球抗原分型之個體」為同義的。
肽或多肽典型為由肽鍵連接之胺基酸單體之聚合物。其典型地含有小於50個單體單元。然而，術語肽不為針對具有多於50個單體單元之分子之免責聲明。長肽亦稱為多肽，典型地具有50與600之間的單體單元。
如本文中所使用，RNA意謂核糖核酸，且mRNA意謂信使RNA。本發明之mRNA可使用此項技術中已知之任何方法製備，包括化學合成，諸如固相RNA合成；以及活體外方法，諸如RNA活體外轉錄反應。在一較佳實施例中，人工RNA，較佳地mRNA係藉由RNA活體外轉錄來獲得。因此，在一個實施例中，本發明之RNA為活體外轉錄之RNA，較佳地活體外轉錄之mRNA。
術語「經腫瘤分型之個體」係指其中由個體之腫瘤展現之KRAS突變類型已經判定之個體。在一個實施例中，個體已經腫瘤分型為KRAS G12D、G12C、G12R、G12V或G13D突變中之一或多者。KRAS腫瘤分型之方法為一般熟習此項技術者所已知，例如參見Hunter JD等人,Mol.Cancer Research 13 : 1325 (2015)；Prior IA等人,Cancer Research 71 : 2457 (2012)；Tan C及D Xiang,World J. Gastroenterol. 18 : 5171 (2012)。
術語「治療(treatment/treating)」疾病包括預防或避免疾病(即，使得不罹患臨床症狀)；抑制疾病(亦即，遏制或抑制臨床症狀之發展)；及/或緩解疾病(亦即，使得臨床症狀之消退)。
在一較佳實施例中，術語「個體」係指人類。
本發明係部分基於以下發現：編碼KRAS突變型肽之mRNA可經吸收，且經編碼肽經處理並且藉由抗原呈現細胞(antigen presenting cell；APC)以足以藉由預先存在T細胞識別之水準呈現，此可區分突變型及野生型RAS序列。T細胞相互作用導致突變型RAS特異性T細胞群體之擴增，從而隨後可尋找且殺死RAS突變型腫瘤細胞。本發明使用來自「靶向」蛋白質(諸如細胞毒性T淋巴球蛋白4 (CTLA4)之信號序列，該靶向蛋白質已知為容易且週期地內化以進入核內體路徑的「快速再循環」蛋白質，該等核內體路徑相交於MHC I類且特定言之亦相交於MHC II類路徑。藉由將KRAS衍生之抗原稠合至「靶向」序列，抗原可經導引至MHC I類及MHC II類處理區室-獨立於標靶細胞類型-且影響其對MHC I且特定言之MHC II之表現及呈現。
為此，將編碼KRAS衍生之抗原/抗原決定基的mRNA分子稠合至編碼適合「靶向」序列之核酸序列。「靶向」序列典型地包含以下或由以下組成：蛋白質之全長胺基酸序列或較佳地其跨膜(及視情況細胞質)域，較佳地連同適合信號肽。藉由將編碼KRAS衍生之抗原之核酸序列稠合至此類「靶向」序列，KRAS衍生之抗原/抗原決定基較佳地定位於質膜，且經再循環至進行MHC I類及II類處理及載入之細胞區室，如內質網、核內體或溶酶體。本文中呈現之靶向策略利用胺基酸序列(尤其是跨膜域)賦予之快速再循環特徵，該等胺基酸序列衍生自衍生自駐存於免疫細胞之質膜中之免疫反應激活信號轉導(immune-response activating signal transduction；IRSTepm )蛋白的群。藉由將變體肽或蛋白質有效地導引至質膜且影響其在其中之錨定，且隨後經由所稠合之IRSTepm 衍生蛋白域再循環至與MHC處理及載入路徑相交的細胞區室，利用MHC I類及MHC II類在受體細胞中呈現經編碼之抗原/抗原決定基，且因此較佳地增大藉由基於核酸之疫苗誘導針對免疫原性抗原決定基或全部抗原之抗原特異性免疫反應。因此，本文中呈現之靶向方法利用快速再循環膜結合IRSTepm 蛋白之之共同路徑代替使用經由稠合不同運輸序列將經轉譯之變體蛋白質或肽直接地引導至核內體/溶酶體區室之當前最新技術方法。
術語「免疫反應激活信號轉導」係指級聯過程，利用該等級聯過程信號與受體相互作用，從而引起第二信使或其他下游目標之水準或活性之變化，且最終引起免疫反應之激活或延續。
如本文中所使用，術語「(蛋白質/胺基酸序列)變體」一般係指「序列變體」，亦即包含至少一個胺基酸殘基不同於參考(或「親本」)蛋白質或(多)肽之參考(或「親本」)胺基酸序列的胺基酸序列之蛋白質或(多)肽。「變體」蛋白質/(肽)肽(在其胺基酸序列中)包含與其各別參考序列相比的至少一個胺基酸突變、取代、插入或缺失。
術語「KRAS衍生之變體肽或蛋白質」係指包含能夠提供至少一種(官能性)KRAS抗原決定基或新抗原決定基之(多)肽。與野生型KRAS肽或蛋白質序列相比，KRAS變體肽或蛋白質為展現至少一個胺基酸殘基突變之一者。KRAS G12C、G12D、G12V、G12R及G13D變體為可發現於KRAS變體肽中之KRAS變體之實例。
將KRAS衍生之變體肽接合至衍生自衍生自快速再循環之免疫反應激活信號轉導蛋白CTLA4之選定域或全長蛋白質。可包括信號肽及跨膜域以最佳化轉運至質膜之外部位點並錨定於其上。另外，可包括適合之連接子以促進藉由MHC I類及II類分子呈現免疫原性肽。可包括T輔助細胞抗原決定基以增大誘導對於經編碼KRAS衍生之抗原決定基的抗原特異性免疫反應。
術語「抗原決定基」、「新抗原決定基」係指由免疫系統識別之變體肽或蛋白質(抗原)之部分或片段。新抗原決定基可用作疾病特異性標靶，病變組織無法自其中輕易地逃脫免疫監視且在癌症之情況下其將產生增強腫瘤控制。抗原決定基可包含約5至約20或甚至更多個胺基酸。抗原決定基可為「構形的」(或「不連續的」)，亦即由衍生其之變體肽或蛋白質之胺基酸之不連續序列組成，但以例如MHC複合物之三維結構形式結合在一起；或「直鏈的」，亦即由其衍生自之變體肽或蛋白質之連續胺基酸序列組成。
根據本發明之一較佳實施例，KRas衍生之變體肽或蛋白質包含突變型KRAS變體或由突變型KRAS變體組成，包含衍生自突變型KRas之新抗原決定基。尤佳的為衍生自突變型KRas變體G12C、G12D、G12V、G12R及G13D中之一或多者之新抗原決定基。
根據本發明之一尤佳實施例，mRNA分子進一步編碼至少一個信號肽 (尤佳地來自CTLA4)，且特定言之CTLA4 (NM_005214.4)胺基酸殘基1-35 (SEQ ID NO: 3)，其可由SEQ ID NO: 4、5、6或7之核酸序列中之任一者編碼。
因此，本發明之mRNA分子較佳地編碼至少一個信號肽，較佳地包含或由以下組成：如藉由SEQ ID NO: 3所定義之胺基酸序列或其片段、衍生物或變體。較佳地，編碼CTLA4衍生之信號肽的mRNA序列包含以下或由以下組成：如SEQ ID NO: 4、5、6或7中之任一者中所闡述之核酸序列，其中SEQ ID NO: 5為尤佳的。
根據本發明之一尤佳實施例，mRNA分子進一步編碼至少一個跨膜域或其部分(尤佳地來自CTLA4)，且特定言之CTLA4胺基酸殘基162-223 (SEQ ID NO: 42)，其可由SEQ ID NO: 43、44、45、46或47之核酸序列中之任一者編碼。根據較佳實施例，根據本發明之mRNA分子的至少一個編碼區進一步編碼至少一個連接子。
術語「連接子」係指肽連接子，亦即連接(connecting/linking)兩個多肽序列之典型地較短(亦即，包含1至150個胺基酸、較佳地1至50個胺基酸、更佳地1至20個胺基酸且甚至更佳地15個胺基酸)直鏈胺基酸序列。較佳地，連接子為非免疫原性的，亦即並不觸發免疫反應。連接子可經採用以連接(connect/link)由本發明之mRNA分子編碼的變體稠合蛋白質之至少兩種組分。根據本發明之mRNA分子之編碼區可編碼至少一個連接子或複數個至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個相同或不同的連接子，如本文中所描述。在複數個連接子由mRNA分子編碼之情況下，尤佳的為連接子不同之處在於編碼各別連接子之其胺基酸序列及/或核酸序列。
連接子之非限制性實例揭示於WO 2002/014478、WO 2001/008636、WO 2013/171505、WO 2008/017517及WO 1997/047648中。
根據較佳實施例，本發明之mRNA分子在其至少一個編碼區中編碼至少一個連接子，該連接子較佳為非免疫原性連接子，較佳地包含根據SEQ ID NO: 35之胺基酸序列或由其組成。
因此，本發明之mRNA分子較佳地包含(在其至少一個編碼區中)至少一個核酸序列，該至少一個核酸序列包含以下或由以下組成：根據SEQ ID NO: 36、37、38、39、40或41中之任一者且較佳地SEQ ID NO:37、38或39中之任一者的核酸序列。
在本發明之一較佳實施例中，mRNA分子進一步編碼至少一種T輔助抗原決定基。術語「T輔助抗原決定基」係指能夠結合至MHC分子(較佳地MHC II類分子)，藉此由CD4+ T輔助(T helper；Th)細胞識別之變體決定子。因此，T輔助抗原決定基可有利地用於誘導或增強CD4+ Th細胞反應、CTL反應(較佳地包括增大的細胞介導之免疫及增強的(例如)抗腫瘤免疫反應)。
在存在或不存在C末端及N末端中攜帶D-胺基酸之情況下，如WO 95/07707及Alexander J等人, 1994, Immunity 1: 751-761中所描述的「泛DR抗原決定基肽(pan DR epitope peptide；PADRE)」較佳為本發明之上下文中之T輔助抗原決定基。
根據較佳實施例，本發明之mRNA分子(在其至少一個編碼區中)編碼至少一個T輔助抗原決定基(較佳地SEQ ID NO: 33)，且較佳地由SEQ ID NO: 34之RNA編碼。
根據本發明之mRNA分子可為單順反子、雙順反子或多順反子。「雙順反子或多順反子」RNA典型地包含兩個(雙順反子)或更多個(多順反子)開放閱讀框架(open reading frame；ORF)。
根據較佳實施例，本發明之mRNA分子可為「經序列修飾」，亦即可包含如下文所描述之至少一種序列修飾。
根據較佳實施例，本發明之mRNA分子可藉由修飾其鳥苷/胞嘧啶(G/C)含量，較佳地藉由修飾至少一個編碼序列之G/C含量來修飾，且因此穩定。
在一個較佳實施例中，本發明之mRNA分子之核糖體結合位點的環境中之A/U含量與其各別野生型mRNA之核糖體結合位點的環境中之A/U含量相比增加。此修飾(圍繞核糖體結合位點增加之A/U含量)可增大核糖體結合至mRNA分子之效率。核糖體與核糖體結合位點之有效結合(Kozak序列)繼而具有有效轉譯本發明之mRNA分子之效果。
在一個較佳實施例中，本發明之mRNA分子可相對於潛在地不穩定序列元件進行修飾。特定言之，mRNA分子之編碼序列及/或5'及/或3'非轉譯區與各別野生型mRNA (或其他野生型核酸)相比可經修飾，使得其不含不穩定序列元件，經修飾之mRNA分子的經編碼胺基酸序列與其各別野生型mRNA相比較佳地不經修飾。
在一個較佳實施例中，如本文中所定義之mRNA分子可藉由添加所謂「5'端帽(5' cap)」結構修飾，其較佳地活體內穩定mRNA分子，如本文中所描述。另外，包含帽結構之mRNA表徵為增大的活體內轉譯效率及減小的先天性免疫刺激。「5'端帽」為實體、典型地經修飾之核苷酸實體，其通常將成熟mRNA之5'端「封端」。5'端帽可典型地由經修飾核苷酸，特定言之鳥嘌呤核苷酸之衍生物形成。較佳地，經由5'-5'-三磷酸酯鍵將5'端帽連接至5'末端。5'端帽可經甲基化，例如m7GpppN，其中N為攜帶5'端帽之核酸之末端5'核苷酸，典型為mRNA之5'端。5'端帽結構(例如m7GpppN)為天然存在於由聚合酶II轉錄之mRNA中之5'端帽結構，且因此較佳地不被視為此上下文中「經修飾」mRNA中所包含之修飾。因此，術語「經修飾」mRNA分子可包含m7GpppN、ARCA Cap、Cap1作為5'端帽結構及額外地如本文中所定義之至少另一種修飾。
可使用5'-5'-三磷酸酯鍵(例如加底線之三磷酸酯鍵：m7GpppN )添加5'端帽。5'端帽結構之其他實例包括：甘油基、倒置去氧無鹼基殘基(部分)、4',5'亞甲基核苷酸、1-(β-D-赤呋喃醣基)核苷酸、4'-硫基核苷酸、碳環核苷酸、1,5-無水己糖醇核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、經修飾之鹼基核苷酸、蘇-呋喃戊醣基核苷酸、非環3',4'-斷核苷酸、非環3,4-二羥基丁基核苷酸、非環3,5二羥基戊基核苷酸、3'-3'-倒置核苷酸部分、3'-3'-倒置無鹼基部分、3'-2'-倒置核苷酸部分、3'-2'-倒置無鹼基部分、1,4-丁二醇磷酸酯、3'-胺基磷酸酯、己基磷酸酯、磷酸胺基己酯、3'-磷酸酯、3'硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或橋接或非橋接甲基膦酸酯部分、cap1 (m7G之相鄰核苷酸之核糖的甲基化)、cap2 (m7G之第2核苷酸下游之核糖的額外甲基化)、cap3 (m7G之第3核苷酸下游之核糖的額外甲基化)、cap4 (m7G之第4核苷酸下游之核糖的甲基化)、抗反向端帽類似物(anti-reverse cap analogue；ARCA)、經修飾之ARCA (例如經硫代磷酸酯修飾之ARCA)、肌核苷、N1-甲基-鳥苷、2'-氟-鳥苷、7-脫氮-鳥苷、8-側氧基-鳥苷、2-胺基-鳥苷、LNA-鳥苷及2-疊氮基-鳥苷。此等經修飾之5'端帽結構可在本發明之上下文中視為至少一種「修飾」。
因此，在一較佳實施例中，本發明之mRNA可包含5'端帽結構或經修飾之5'端帽結構。較佳地，mRNA分子可包含選自m7GpppN、ARCA Cap或Cap1之5'端帽結構。
在一較佳實施例中，可適當地使用如本文中所定義之端帽類似物(cap-analogue)將5'端帽結構適當地共轉錄地添加於如本文中所定義之RNA活體外轉錄反應中。本發明之上下文中之較佳的端帽類似物為m7G(5')ppp(5')G(m7G)或3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G。本發明之上下文中之其他較佳地端帽類似物為m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG或m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG以共轉錄地產生cap1結構(例如CleanCap®)。
在一個較佳實施例中，mRNA分子包含cap1結構，其中cap1結構可藉由共轉錄封端獲得。包含mRNA之cap1結構在本發明之上下文中具有若干種有利特徵，包括增大的轉譯效率及減小的先天性免疫系統刺激。
根據另一較佳實施例，本發明之mRNA分子可含有poly(A)序列。「poly(A)序列」(亦稱為「poly(A)尾」或「3'-poly(A)尾」)典型經理解為腺苷核苷酸之序列，例如至多約400個腺苷核苷酸，例如約20至約400、較佳地約50至約400、更佳地約50至約300、甚至更佳地約50至約250、最佳地約60至約250個腺苷核苷酸之序列。如本文中所使用，poly(A)序列亦可包含約10至200個腺苷核苷酸，較佳地約10至100個腺苷核苷酸，更佳地約40至80個腺苷核苷酸或甚至更佳地約50至70個腺苷核苷酸。poly(A)序列典型位於RNA，特定言之mRNA之3'端處。
在一個較佳實施例中，本發明之mRNA分子可在其3'末端處含有典型約10至200個腺苷核苷酸、較佳地約10至100個腺苷核苷酸、更佳地約40至80個腺苷核苷酸或甚至更佳地約50至70個腺苷核苷酸之poly(A)尾。
在一較佳實施例中，適當位於3'末端處(例如如本文中所定義之3' UTR之下游)的poly(A)序列包含10至500個腺苷核苷酸、10至200個腺苷核苷酸、40至200個腺苷核苷酸、40至150個腺苷核苷酸或30至150個腺苷核苷酸。在一尤佳實施例中，poly(A)序列包含約64個腺苷核苷酸。在其他尤佳實施例中，poly(A)序列包含約75個腺苷核苷酸。在另一較佳實施例中，poly(A)序列包含約100個腺苷核苷酸。
根據一較佳實施例，本發明之mRNA分子可在3'末端上含有典型約10至200個胞嘧啶核苷酸、較佳地約10至100個胞嘧啶核苷酸、更佳地約20至70個胞嘧啶核苷酸或甚至更佳地約20至60個或甚至10至40個胞嘧啶核苷酸之poly(C)尾。在一尤佳實施例中，poly(C)序列包含約30個胞嘧啶核苷酸。
如本文中所使用之術語「poly(C)序列」將由一般熟習此項技術者所識別及理解，且例如意欲為典型位於RNA之3'端處之胞嘧啶核苷酸的序列，至多約200個胞嘧啶核苷酸之序列。在本發明之上下文中，poly(C)序列可位於mRNA或任何其他核酸分子內，諸如在例如藉由轉錄DNA模板(例如，質體DNA或PCR產物)充當用於產生RNA，較佳地mRNA之模板的DNA中。
在尤佳實施例中，本發明之編碼RNA的確包含如本文中所定義之poly(A)序列(較佳地為(精確)位於3'末端處之100個腺苷核苷酸)，且不包含poly(C)序列。
根據一較佳實施例，本發明之mRNA分子可包含至少一個5'-UTR元件及/或3'-UTR元件。「UTR元件」包含核酸序列或由其組成，該核酸序列衍生自任何天然存在之基因的5'-UTR或3'-UTR或衍生自基因之5'-UTR或3'-UTR之片段、同系物或變體。
在一個較佳實施例中，根據本發明之mRNA分子的編碼區可位於如本文中所定義之5' UTR元件之下游及/或如本文中所定義之3' UTR元件之上游。較佳地，若根據本發明之mRNA分子包含至少一個3' UTR元件及至少一個5' UTR元件，則編碼區可位於至少一個5' UTR元件與至少一個3' UTR元件之間。
較佳地，本發明之mRNA分子可包含衍生自基因，較佳地α-血球蛋白基因之3' UTR元件。尤佳的為SEQ ID NO: 1之3' UTR元件。
在一較佳實施例中，本發明之第一態樣之mRNA分子包含至少一個組蛋白莖環。
如本文中所使用之術語「組蛋白莖環」將由一般熟習此項技術者所識別及理解，且例如意欲係指主要發現於組蛋白mRNA中之核酸序列。尤佳之組蛋白莖環序列由SEQ ID NO: 2編碼。在一較佳實施例中，本發明之mRNA分子包含闡述於SEQ ID NO: 58-72中之任一者中的RNA序列或由其組成。在一尤佳實施例中，本發明之mRNA分子包含闡述於SEQ ID NO: 63、64、65、66或67中之任一者中的RNA序列或由其組成。在實施例中，本發明之編碼RNA包含3'末端序列元件。該3'末端序列元件包含poly(A)序列及組蛋白-莖環序列，其中該序列元件位於本發明之RNA之3'末端處(精確地位於3'末端處)。在一尤佳實施例中，本發明之mRNA分子包含闡述於SEQ ID NO: 73-112中之任一者中的RNA序列或由其組成。
根據一較佳實施例，本發明之mRNA分子可以「裸」形式提供，亦即不與用於增加mRNA分子或任何其他核酸之轉染效率及/或免疫刺激特性的任何其他媒劑、轉染劑或複合劑締合。
在一個較佳實施例中，本發明之mRNA分子可經提供於組合物中。在其他態樣中，因此本發明提供一種組合物，其包含本發明之至少一種mRNA分子及視情況選用之載劑。其中，至少一種mRNA分子可能與用於增加mRNA分子之轉染效率及/或免疫刺激特性之適合之媒劑、轉染劑或複合劑締合。視情況，組合物可為醫藥組合物，如下文更詳細地描述。
本發明之mRNA分子可與一或多種(聚)陽離子化合物，較佳地與(聚)陽離子聚合物、(聚)陽離子肽或蛋白質(例如魚精蛋白(protamine))、(聚)陽離子多醣及/或[(聚)陽離子]脂質複合或締合。如本文中所描述之其他核酸亦可與脂質複合，藉此形成脂複合體、脂質體或較佳地脂質奈米粒子(lipid nanoparticle；LNP)。
根據一較佳實施例，醫藥組合物之mRNA分子可與一或多種脂質複合，藉此形成脂複合體、脂質體或較佳地脂質奈米粒子(LNP)。
因此，醫藥組合物之mRNA分子可以基於脂質之調配物形式提供。術語「脂質奈米粒子」(亦稱為「LNP」)不受限於任何特定形態，且包括在例如在水性環境中及/或在RNA存在之情況下將陽離子脂質及視情況選用之一或多種其他脂質組合時產生之任何形態。較佳地，術語脂質奈米粒子(LNP)理解為包含術語「脂質體」、「脂質複合物」及「脂複合體」。
亦設想在本發明之上下文中如本文中所描述之任何其他核酸(例如免疫刺激核酸或其類似者)可與一或多種脂質複合，藉此形成如本發明之上下文中所描述的脂複合體、脂質體或較佳地脂質奈米粒子(LNP)。此外，脂複合體、脂質體或較佳地脂質奈米粒子(LNP)可包含本發明之mRNA分子及如本文中所描述之另一任何其他核酸。
醫藥組合物之mRNA分子可與脂質(尤其是陽離子及/或中性脂質)複合或締合以形成一或多種脂質奈米粒子。較佳地，脂質奈米粒子(LNP)包含：(a)本發明之至少一種mRNA分子、(b)陽離子脂質、(c)聚集降低劑(諸如聚乙二醇(polyethylene glycol；PEG)脂質或經PEG修飾之脂質)、(d)視情況選用之非陽離子脂質(諸如中性脂質)及(e)視情況選用之固醇。特定言之，除本發明之至少一種mRNA分子以外，LNP可包含：(i)至少一種陽離子脂質；(ii)中性脂質；(iii)固醇，例如膽固醇；及(iv)經PEG修飾之脂質，較佳地呈約20-60%陽離子脂質:5-25%中性脂質:25-55%固醇:0.5-15% PEG脂質之莫耳比。
LNP典型包含陽離子脂質及選自以下之一或多種賦形劑：中性脂質、帶電脂質、類固醇及聚合物結合脂質(例如聚乙二醇化脂質)。本發明之mRNA分子可經包封於LNP之脂質部分中或由LNP之一些或整個脂質部分包裹之水性空間中。本發明之mRNA分子亦可與LNP締合及複合。LNP可包含能夠形成粒子以附接核酸或將一或多種核酸包封於其中之任何脂質。較佳地，LNP包含一或多種陽離子型脂質及一或多種穩定脂質。穩定脂質包括中性脂質及聚乙二醇化脂質。
LNP之陽離子脂質可為可陽離子化的(cationisable)，亦即其隨著pH下降低於脂質之可電離基團之pK時而變為質子化，但在較高pH值下逐漸地為更中性的。在低於pK之pH值下，脂質隨後能夠與帶負電核酸締合。在某些實施例中，陽離子脂質包含在pH降低時呈現正電荷之兩性離子脂質。
(i)  陽離子脂質
LNP可包括適用於形成脂質奈米粒子之任何陽離子脂質。較佳地，陽離子脂質在約生理pH下攜帶淨正電荷。
陽離子脂質可為胺基脂質。如本文中所使用，術語「胺基脂質」意謂包括具有一個或兩個脂肪酸或脂肪烷基鏈及可經質子化以在生理pH下形成陽離子脂質之胺基頭基(包括烷胺基或二烷胺基)的彼等脂質。
陽離子脂質可為例如氯化N,N-二油基-N,N-二甲基銨(DODAC)、溴化N,N-二硬脂基-N,N-二甲基銨(DDAB)、氯化1,2-二油醯基三甲基丙烷銨 (DOTAP) (亦已知為氯化N-(2,3-二油醯氧基)丙基)-N,N,N-三甲基銨及1,2-二油烯基氧基-3-三甲胺基丙烷氯化鹽)、氯化N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基銨(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油烯基氧基)丙胺(DODMA)、1,2-二亞油氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亞麻氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLenDMA)、1,2-二-基亞麻氧基-N,N-二甲胺基丙烷(γ-DLenDMA)、1,2-二亞油基胺甲醯基氧基-3-二甲胺基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亞油基氧基-3-(二甲胺基)乙醯氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亞油基氧基-3-(N-嗎啉基)丙烷(DLin-MA)、1,2-二亞油醯基-3-二甲胺基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亞油基硫基-3-二甲胺基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亞油醯基-2-亞油氧基-3-二甲胺基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亞油氧基-3-三甲胺基丙烷氯化鹽(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亞油醯基-3-三甲基-胺基丙烷氯化鹽(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亞油氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)或3-(N,N-二亞油基胺基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油烯基胺基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亞油基側氧基-3-(2-N,N-二甲胺基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、2,2-二亞油基-4-二甲胺基甲基-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-DMA)或其類似物、(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)四氫-3aH-環戊并-[d][1,3]間二氧雜環戊烯-5-胺、4-(二甲胺基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基酯(MC3)、1,1'-(2-(4-(2-((2-(雙(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)哌嗪-1-基)乙基氮烷二基)-二十二烷-2-醇(C12-200)、2,2-二亞油基-4-(2-二甲胺基乙基)-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-C2-DMA)、2,2-二亞油基-4-二甲胺基甲基-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-DMA)、4-(二-甲胺基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基酯(DLin-M-C3-DMA)、3-((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-N,N-二甲基丙-1-胺(MC3 Ether)、4-((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-N,N-二甲基-丁-1-胺(MC4 Ether)或前述任一者中之任何組合。
其他陽離子脂質包括(但不限於)溴化N,N-二硬脂基-N,N-二甲基銨(DDAB)、3P-(N-(N',N'-二甲胺基乙烷)-胺甲醯基)膽固醇(DC-Chol)、三氟乙酸N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N-2-(精胺-甲醯胺基)乙基)-N,N-二甲基銨(DOSPA)、二(十八烷基)醯胺基甘胺醯基羧基精胺(DOGS)、1,2-二油醯基-sn-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二油醯基-3-二甲基銨丙烷(DODAP)、溴化N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基銨(DMRIE)及2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧雜環戊烷(XTC)。另外，可使用市售之陽離子脂質製劑，諸如LIPOFECTIN (包括DOTMA及DOPE，可自GIBCO/BRL獲得)及LIPOFECTAMINE (包含DOSPA及DOPE，可自GIBCO/BRL獲得)。
其他適合之的陽離子脂質揭示於國際公開案第WO 09/086558號、第WO 09/127060號、第WO 10/048536號、第WO 10/054406號、第WO 10/088537號、第WO 10/129709號及第WO 2011/153493號；美國專利公開案第2011/0256175號、第2012/0128760號及第2012/0027803號；美國專利第8,158,601號；以及Love等人, PNAS, 107(5), 1864-69, 2010中。
在一些實施例中，脂質選自由以下組成之群：98N12-5、C12-200及ckk-E12。
在一個實施例中，另一陽離子脂質為胺基脂質。代表性胺基脂質包括(但不限於) 1,2-二亞油基氧基-3-(二甲胺基)乙醯氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亞油基氧基-3(N-嗎啉基)丙烷(DLin-MA)、1,2-二亞油醯基-3-二甲胺基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亞油基硫基-3-二甲胺基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亞油醯基-2-亞油氧基-3二甲胺基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亞油氧基-3-三甲胺基丙烷氯化鹽(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亞油醯基-3-三甲胺基丙烷氯化鹽(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亞油氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N二亞油基胺基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油烯基胺基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亞油基側氧基-3-(2-N,N-二甲胺基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)及2,2-二亞油基-4-二甲胺基甲基-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-DMA)、2,2-二亞油基-4-(2-二甲胺基乙基)-[l,3]-二氧雜環戊烷(DLin-KC2-DMA)；二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)；MC3(US20100324120)。
在一個實施例中，至少一種mRNA分子可經調配胺基醇脂質載體(lipidoid)中。可用於本發明中之胺基醇脂質載體可由美國專利第8,450,298號中所描述之方法製備。適合之(可電離)脂質亦可為如表1、2及3所揭示以及如WO2017/075531A1之技術方案1至24中所定義之化合物。
在另一實施例中，可電離脂質亦可為如WO2015/074085A1、美國申請案第61/905,724號及第15/614,499號或美國專利第9,593,077號及第9,567,296號中所揭示之化合物(亦即，ATX-001至ATX-032或如技術方案1至26中所指定之化合物)。
在彼背景中，可適當地使用衍生自通式(LNP-I)之任何脂質
Figure 02_image005
其中，R1 及R2 相同或不同，各自為由1至9個碳組成之直鏈或分支鏈烷基、由2至11個碳組成之烯基或炔基，L1 及L2 相同或不同，各自為由5至18個碳組成或與N形成雜環的直鏈伸烷基或伸烯基，X1 為鍵或為-CO-O-，藉以形成-L2 -CO-O-R2 ，X2 為S或O，L3 為鍵或由1至6個碳組成或與N形成雜環之直鏈或分支鏈伸烷基，R3 為由1至6個碳組成之直鏈或分支鏈伸烷基，且R4 及R5 相同或不同，各自為氫或由1至6個碳組成之直鏈或分支鏈烷基；或其醫藥學上可接受之鹽。
在其他實施例中，適合之的陽離子脂質亦可為如WO2017/117530A1 (亦即，脂質13、14、15、16、17、18、19、20或如申請專利範圍中所指定之化合物)中所揭示之化合物。
在彼上下文中，可適當地使用衍生自通式(LNP-II)之任何脂質
Figure 02_image007
其中 X為直鏈或分支鏈伸烷基或伸烯基、單環、雙環或三環芳烴或雜芳烴； Y為鍵、乙烯或未經取代或經取代之芳族或雜芳環；Z為S或0； L為1至6個碳之直鏈或分支鏈伸烷基； R3 及R4 獨立地為1至6個碳之直鏈或分支鏈烷基； R1 及R2 獨立地為1至20個碳之直鏈或分支鏈烷基或烯基；r為0至6；且 m、n、p及q獨立地為1至18； 其中當n=q，m=p，且R1 =R2 時，則X與Y不同； 其中當X=Y，n=q，m=p時，則R1 與R2 不同； 其中當X=Y，n=q，且R1 =R2 時，則m與p不同；且 其中當X=Y，m=p，且R1 =R2 時，則n及q不同； 或其醫藥學上可接受之鹽。
在較佳實施例中，可適當地使用衍生自式(LNP-II)之脂質，其中，X為鍵、直鏈或分支鏈伸烷基、伸烯基或單環、雙環或三環芳烴或雜芳烴；Y為單環、雙環或三環芳烴或雜芳烴；Z為S或O；L為1至6個碳之直鏈或分支鏈伸烷基；R3 及R4 獨立地為1至6個碳之直鏈或分支鏈烷基；R1 及R2 獨立地為1至20個碳之直鏈或分支鏈烷基或烯基；r為0至6；且m、n、p及q獨立地為1至18；或其醫藥學上可接受之鹽。
在較佳實施例中，可電離脂質亦可選自PCT申請案PCT/EP2017/077517(亦即，衍生自PCT/EP2017/077517之式I、II及III的脂質化合物或如PCT/EP2017/077517之技術方案1至12中所指定之脂質化合物)、PCT/EP2017/077517之揭示內容中所揭示之脂質化合物。在彼上下文中，揭示於PCT/EP2017/077517之表7中之脂質化合物(例如衍生自式I-1至I-41之脂質化合物)及揭示於PCT/EP2017/077517之表8中的脂質化合物(例如衍生自式II-1至II-36之脂質化合物)可適當地用於本發明之上下文中。因此，PCT/EP2017/077517之式I-1至式I-41及式II-1至式II-36及與其有關之特定揭示內容可適當地用於本發明之上下文中。
在尤佳實施例中，適合之的脂質可為根據式(LNP-III)之陽離子脂質
Figure 02_image009
或其醫藥學上可接受之鹽、互變異構體、前藥或立體異構體，其中R1 、R2 、R3 、L1 、L2 、G1 、G2 及G3 如下。
式(LNP-III)進一步定義為： L1 或L2 中之一者為-O(C=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)-、-O-、-S(O)x -、-S-S-、-C(=O)S-、SC(=O)-、-NRa C(=O)-、-C(=O)NRa -、-NRa C(=O)NRa -、-OC(=O)NRa -或-NRa C(=O)O-，且L1 或L2 中之另一者為-O(C=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)-、-O-、-S(O)x -、-S-S-、-C(=O)S-、SC(=O)-、-NRa C(=O)-、-C(=O)NRa -、-NRa C(=O)NRa -、-OC(=O)NRa -或-NRa C(=O)O-或直接鍵； G1 及G2 各自獨立地為未經取代之C1 -C12 伸烷基或C1 -C12 伸烯基； G3 為C1 -C24 伸烷基、C1 -C24 伸烯基、C3 -C8 伸環烷基、C3 -C8 伸環烯基； Ra 為H或C1 -C12 烷基； R1 及R2 各自獨立地為C6 -C24 烷基或C6 -C24 烯基； R3 為H、OR5 、CN、-C(=O)OR4 、-OC(=O)R4 或-NR5 C(=O)R4 ； R4 為C1 -C12 烷基； R5 為H或C1 -C6 烷基；且 x為0、1或2。
在式(LNP-III)之前述實施例中之一些中，脂質具有以下結構(LNP-IIIA)或(LNP-IIIB)中之一者：
Figure 02_image011
其中： A為3至8員環烷基或伸環烷基環；R6 在每次出現時獨立地為H、OH或C1 -C24 烷基；n為介於1至15之範圍內的整數。
在式(LNP-III)之前述實施例中之一些中，脂質具有結構(LNP-IIIA)，且在其他實施例中，脂質具有結構(LNP-IIIB)。
在式(LNP-III)之其他實施例中，脂質具有以下結構(LNP-IIIC)或(LNP-IIID)中之一者：
Figure 02_image013
其中y及z各自獨立地為介於1至12之範圍內的整數。
在式(LNP-III)之前述實施例中之任一者中，L1 或L2 中之一者為-O(C=O)-。舉例而言，在一些實施例中，L1 及L2 中之每一者為-O(C=O)-。在前述任一者之一些不同實施例中，L1 及L2 各自獨立地為-(C=O)O-或-O(C=O)-。舉例而言，在一些實施例中，L1 及L2 中之每一者為-(C=O)O-。
在較佳實施例中，LNP之陽離子脂質為式(LNP-III)之化合物，其中： L1 及L2 各自獨立地為-O(C=O)-或(C=O)-O-； G3 為C1 -C24 伸烷基或C1 -C24 伸烯基；且 R3 為H或OR5 。
在式(LNP-III)之一些不同實施例中，脂質具有以下結構(LNP-IIIE)或(LNP-IIIF)中之一者：
Figure 02_image015
。
在式(LNP-III)之前述實施例中之一些中，脂質具有以下結構(LNP-IIIG)、(LNP-IIIH)、(LNP-IIII)或(LNP-IIIJ)中之一者：
Figure 02_image017
；
Figure 02_image019
。
在式(LNP-III)之前述實施例中之一些中，n為介於2至12，例如2至8或2至4之範圍內整數。在一些實施例中，n為3、4、5或6。在一些實施例中，n為3。在一些實施例中，n為4。在一些實施例中，n為5。在一些實施例中，n為6。在式(LNP-III)之前述實施例中之一些其他者中，y及z各自獨立地為介於2至10之範圍內的整數。舉例而言，在一些實施例中，y及z各自獨立地為介於4至9或4至6之範圍內的整數。在式(LNP-III)之前述實施例中之一些中，R6 為H。在前述實施例中之其他者中，R6 為C1 -C24 烷基。在其他實施例中，R6 為OH。在式(LNP-III)之一些實施例中，G3 未經取代。在其他實施例中，G3 經取代。在各個不同實施例中，G3 為直鏈C1 -C24 伸烷基或直鏈C1 -C24 伸烯基。在式(LNP-III)之一些其他前述實施例中，R1 或R2 或兩者為C6 -C24 烯基。舉例而言，在一些實施例中，R1 及R2 各自獨立地具有以下結構：
Figure 02_image021
， 其中： R7a 及R7b 在每次出現時獨立地為H或C1 -C12 烷基；且a為2至12之整數，其中R7a 、R7b 及a各自經選擇以使得R1 及R2 各自獨立地包含6至20個碳原子。舉例而言，在一些實施例中，a為介於5至9或8至12之範圍內整數。在式(LNP-III)之前述實施例中之一些中，R7a 之至少一次出現為H。舉例而言，在一些實施例中，R7a 在每次出現時為H。在前述之其他不同實施例中，R7b 之至少一次出現為C1 -C8 烷基。舉例而言，在一些實施例中，C1 -C8 烷基為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、正己基或正辛基。
在式(LNP-III)之不同實施例中，R1 或R2 或兩者具有以下結構中之一者：
Figure 02_image023
Figure 02_image025
。
在較佳實施例中，LNP之陽離子脂質為式(LNP-III)之化合物，其中： L1 及L2 各自獨立地為-O(C=O)-或(C=O)-O-；且 R1 及R2 各自獨立地具有以下結構中之一者：
Figure 02_image027
Figure 02_image029
。
在式(LNP-III)之前述實施例中之一些中，R3 為OH、CN、-C(=O)OR4 、-OC(=O)R4 或-NHC(=O)R4 。在一些實施例中，R4 為甲基或乙基。
在較佳實施例中，LNP之陽離子脂質為式(LNP-III)之化合物，其中R3 為OH。
在尤佳實施例中，本發明之mRNA與一或多種脂質複合，藉此形成脂質奈米粒子(LNP)，其中LNP選自結構(LNP-III-1)至(LNP-III-36) (本文中之表4)。
表4 衍生自式(LNP-III)之代表性脂質化合物
編號 結構
LNP-III-1
Figure 02_image031
LNP-III-2
Figure 02_image033
LNP-III-3
Figure 02_image035
LNP-III-4
Figure 02_image037
LNP-III-5
Figure 02_image039
LNP-III-6
Figure 02_image041
LNP-III-7
Figure 02_image043
LNP-III-8
Figure 02_image045
LNP-III-9
Figure 02_image047
LNP-III-10
Figure 02_image049
LNP-III-11
Figure 02_image051
LNP-III-12
Figure 02_image053
LNP-III-13
Figure 02_image055
LNP-III-14
Figure 02_image057
LNP-III-15
Figure 02_image059
LNP-III-16
Figure 02_image061
LNP-III-17
Figure 02_image063
LNP-III-18
Figure 02_image065
LNP-III-19
Figure 02_image067
LNP-III-20
Figure 02_image069
LNP-III-21
Figure 02_image071
LNP-III-22
Figure 02_image073
LNP-III-23
Figure 02_image075
LNP-III-24
Figure 02_image077
LNP-III-25
Figure 02_image079
LNP-III-26
Figure 02_image081
LNP-III-27
Figure 02_image083
LNP-III-28
Figure 02_image085
LNP-III-29
Figure 02_image087
LNP-III-30
Figure 02_image089
LNP-III-31
Figure 02_image091
LNP-III-32
Figure 02_image093
LNP-III-33
Figure 02_image095
LNP-III-34
Figure 02_image097
LNP-III-35
Figure 02_image099
LNP-III-36
Figure 02_image101
在一較佳實施例中，LNP包含式(LNP-III)之脂質、本發明之至少一種mRNA分子及較佳地選自中性脂質、類固醇及聚乙二醇化脂質的一或多種賦形劑。在尤佳實施例中，式(LNP-III)之脂質為化合物(LNP-III-3)。在一些實施例中，式(LNP-III)之脂質為化合物(LNP-III-7)。
在另一較佳實施例中，LNP包含選自以下之陽離子脂質：
Figure 02_image103
。
在一尤佳實施例中，本發明之mRNA與一或多種脂質複合，藉此形成脂質奈米粒子(LNP)，其中LNP包含以下陽離子脂質(根據表4之式LNP-III-3之脂質)：
Figure 02_image105
。
在一個較佳實施例中，如本文中所定義，較佳地如表4中所揭示，更佳地為陽離子脂質化合物LNP-III-3之陽離子脂質以相對於LNP之總脂質含量之約30至約95莫耳%的量存在於LNP中。若將多於一種陽離子脂質併入於LNP內，則此類百分比應用於經合併之陽離子脂質。
在另一較佳實施例中，陽離子脂質以約30至約70莫耳%之量存在於LNP中。在一個實施例中，陽離子脂質以約40至約60莫耳%，諸如分別約40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60莫耳%之量存在於LNP中。在實施例中，陽離子脂質以約47至約48莫耳%，諸如分別以約47.0、47.1、47.2、47.3、47.4、47.5、47.6、47.7、47.8、47.9、50.0莫耳%之量存在於LNP中，其中47.7莫耳%為尤佳的。
陽離子脂質可以存在於LNP中之總脂質的約20 mol%至約70或75 mol%或約45至約65 mol%或約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或約70 mol%之比率存在。在其他實施例中，LNP包含按莫耳計約25%至約75%之陽離子脂質，例如按莫耳計(按脂質奈米粒子中之脂質之100%總莫耳計)約20至約70%、約35至約65%、約45至約65%、約60%、約57.5%、約57.1%、約50%或約40%。在一些實施例中，陽離子脂質與核酸，較佳地與本發明之mRNA之比為約3至約15，諸如約5至約13或約7至約11。在一個較佳實施例中，陽離子脂質與核酸，較佳地與本發明之mRNA之比為約6。
在一個較佳實施例中，LNP包含上文所描述之任何脂質之組合或混合。
在一個較佳實施例中，如本文中所定義之胺基或陽離子脂質具有至少一個可質子化(protonatable)或可去質子化基團，使得脂質在處於或低於生理pH之pH (例如pH 7.4)下為帶正電的，且在較佳地處於或高於生理pH之第二pH下為中性的。當然，應理解隨pH變化來添加或移除質子為均衡過程，且參考帶電或中性脂質係指主導性物種之性質並且不需要所有脂質必須以帶電或中性形式存在。具有多於一個可質子化或可去質子化基團或為兩性離子之脂質不經排除且可同樣地適用於本發明之上下文中。
在一個較佳實施例中，可質子化脂質具有在約4至約11之範圍內的可質子化基團之pKa，例如約5至約7之pKa。
LNP可包含兩種或多於兩種(不同)陽離子脂質。陽離子脂質可經選擇以有助於不同有利特性。舉例而言，關於諸如胺pKa、化學穩定性、循環之半衰期、組織之半衰期、組織之淨積累或毒性方面之特性不同之陽離子脂質可用於LNP中。特定而言，陽離子脂質可經選擇以使得混合LNP之特性比個別脂質之單一LNP之特性更合乎需要。
可考慮核酸負荷(cargo)之量來選擇持久性陽離子脂質或脂質載體之量。在一個實施例中，此等量經選擇以便產生在約0.1至約20之範圍內的奈米粒子或組合物之N/P比。在此上下文中，N/P比經定義為脂質或脂質載體之含有鹼性氮之基團之氮原子(「N」)與用作負荷之RNA之磷酸酯基團(「P」)的莫耳比。N/P比可基於例如1 μg RNA通常含有約3 nmol磷酸殘基來計算，其限制條件為RNA展現鹼基之統計分佈。脂質或脂質載體之「N」值可基於其分子量以及持久性陽離子及(若存在)可陽離子化基團之相對含量來計算。
LNP活體內特徵及行為可藉由將親水性聚合物塗層(例如聚乙二醇(PEG))添加至LNP表面以賦予立體穩定化來修飾。此外，LNP可藉由將配體(例如抗體、肽及碳水化合物)附接至其表面或經附接PEG鏈之末端(例如經由聚乙二醇化脂質或聚乙二醇化膽固醇)而用於特異性靶向。
在一較佳實施例中，LNP包含聚合物結合脂質。術語「聚合物結合脂質」係指包含脂質部分及聚合物部分兩者之分子。聚合物結合脂質之實例為聚乙二醇化脂質或經PEG修飾之脂質。術語「聚乙二醇化脂質或經PEG修飾之脂質」係指包含脂質部分及聚乙二醇部分兩者之分子。聚乙二醇化脂質為此項技術中已知的且包括1-(單甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻醯甘油(PEG-s-DMG)及其類似者。在此上下文中，2-mPEG2000-正,正二(十四烷基)乙醯胺尤佳用作聚乙二醇化脂質。
其他適合之的胺基脂質包括具有替代性脂肪酸基團及其他二烷胺基之彼等脂質，包括其中烷基取代基不同(例如，N-乙基-N-甲胺基-及N-丙基-N-乙胺基-)之彼等脂質。大體而言，具有較少飽和醯基鏈之胺基脂質更易於設定尺寸，特定言之在複合物必須設定尺寸小於約0.3微米時，以出於過濾滅菌之目的。可使用含有碳鏈長度在C14 至C22 之範圍內的不飽和脂肪酸之胺基脂質。其他骨架亦可用於將胺基脂質之胺基及脂肪酸或脂肪烷基部分分離。
胺基或陽離子脂質可具有至少一個可質子化或可去質子化基團，使得脂質在處於或低於生理pH之pH (例如pH 7.4)下為帶正電的，且在較佳地處於或高於生理pH之第二pH下為中性的。當然，應理解隨pH變化來添加或移除質子為均衡過程，且參考帶電或中性脂質係指主導性物種之性質並且不需要所有脂質以帶電或中性形式存在。本發明不排除使用具有多於一個可質子化或可去質子化基團或為兩性離子之脂質。
可質子化脂質可具有在約4至約11之範圍內內可質子化基團之pKa，例如約5至約7之pKa。在一個較佳實施例中，可質子化脂質可具有約6.09之可質子化基團之pKa。
LNP可包括兩種或多於兩種陽離子脂質。陽離子脂質可經選擇以有助於不同有利特性。舉例而言，關於諸如胺pKa、化學穩定性、循環之半衰期、組織之半衰期、組織之淨積累或毒性之特性不同之陽離子脂質可能用於LNP中。特定言之，陽離子脂質可經選擇以使得混合LNP之特性比個別脂質之單一LNP之特性更合乎需要。
陽離子脂質可以存在於LNP中之總脂質之約20 mol%至約70或75 mol%或約45至約65 mol%或約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或約70 mol%的比率存在。LNP可包含按莫耳計約25%至約75%之陽離子脂質，例如按莫耳計(按脂質奈米粒子中之脂質之100%總莫耳計)約20至約70%、約35至約65%、約45至約65%、約60%、約50%或約40%。陽離子脂質與核酸之比率可為約3至約15，諸如約5至約13或約7至約11。特定言之，脂質體可具有在1:1與20:1之間的陽離子脂質之氮原子與RNA之磷酸的莫耳比(N:P比)，如國際公開案第WO 2013/006825 A1號中所描述。可替代地，脂質體可具有大於20:1或小於1:1之N:P比。
(ii) 中性及非陽離子脂質
非陽離子脂質可為中性脂質、陰離子脂質或兩性脂質。中性脂質(若存在)可選自在生理pH下以不帶電或中性兩性離子形式存在之多種脂質物種中之任一者。此類脂質包括例如二醯基磷脂醯膽鹼、二醯基磷脂醯乙醇胺、腦醯胺、鞘磷脂、二氫鞘磷脂、腦磷脂及腦苷脂。用於本文中所描述之粒子中的中性脂質之選擇通常藉由考慮例如LNP尺寸及LNP在血流中之穩定性來引導。較佳地，中性脂質為具有兩個醯基之脂質(例如，二醯基磷脂醯膽鹼及二醯基磷脂醯乙醇胺)。
中性脂質可含有碳鏈長度在C10 至C20 之範圍內的飽和脂肪酸。在其他實施例中，使用具有碳鏈長度在C10 至C20 之範圍內的單或二不飽和脂肪酸之中性脂質，其中。另外或可替代地，可使用具有飽和及不飽和脂肪酸鏈之混合物之中性脂質。
適合之的中性脂質包括(但不限於)二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二油醯基磷脂醯甘油(DOPG)、二棕櫚醯基磷脂醯甘油(DPPG)、二油醯基-磷脂醯乙醇胺(DOPE)、棕櫚醯油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、棕櫚醯油醯基-磷脂醯乙醇胺(POPE)、二油醯基-磷脂醯乙醇胺4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)-環己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻醯基磷酸乙醇胺(DMPE)、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、二硬脂醯基-磷脂醯基-乙醇胺(DSPE)、SM、16-0-單甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂醯基-2-油醯基-磷脂醯乙醇胺(SOPE)、膽固醇或其混合物。適用於LNP之陰離子脂質包括(但不限於)磷脂醯甘油、心磷脂、二醯基-磷脂醯絲胺酸、二醯基磷脂酸、N-十二醯基磷脂醯乙醇胺(N-dodecanoyl phosphatidylethanoloamine)、N-丁二醯基磷脂醯基-乙醇胺、N-戊二醯基磷脂醯乙醇胺、離胺醯基磷脂醯甘油(lysylphosphatidylglycerol)及接合至中性脂質之其他陰離子修飾基團。在此上下文中，將二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)用作中性脂質為尤佳的。
兩性脂質係指任何適合材料，其中脂質材料之疏水性部分定向於疏水相中，而親水性部分朝向水相定向。此等化合物包括(但不限於)磷脂、胺基脂質及鞘脂。代表性磷脂包括鞘磷脂、磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯肌醇、磷脂酸、棕櫚醯基-油醯基磷脂醯膽鹼、溶血磷脂醯膽鹼、溶血磷脂醯乙醇胺、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼、二油醯基磷脂醯膽鹼、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼或二亞油醯基磷脂醯膽鹼。亦可使用其他不含磷化合物，諸如鞘脂、鞘醣脂家族、二醯化甘油及β-醯基含氧酸(acyloxyacid)。
在一些實施例中，LNP包含選自以下之中性脂質：DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE及SM。在多個實施例中，陽離子脂質與中性脂質之莫耳比介於約2:1至約8:1之範圍。在一個較佳實施例中，陽離子脂質與中性脂質之莫耳比介於約4:1約至5:1之範圍。
在較佳實施例中，中性脂質為1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)。陽離子脂質與DSPC之莫耳比可在約2:1至8:1之範圍內。在一個較佳實施例中，陽離子脂質與中性脂質之莫耳比介於約4:1至約5:1之範圍。
非陽離子脂質可以存在於LNP中之總脂質的約5 mol%至約90 mol%、約5 mol%至約10 mol%、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或約90 mol%之比率存在。
LNP可包含按莫耳計約0%至約15或45%之中性脂質，例如約3至約12%或約5至約10%。舉例而言，LNP可包括按莫耳計(按LNP中之脂質之100%總莫耳計)約15%、約10%、約7.5%或約7.1%之中性脂質。尤佳10 mol%之DSPC作為中性脂質為尤佳的。
(iii)     固醇
固醇可較佳地為膽固醇。
固醇可以LNP之約10 mol%至約60 mol%或約25 mol%至約40 mol%之比率存在。固醇可以存在於LNP中之總脂質的約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或約60 mol%之比率存在。 LNP可包含按莫耳計之約5%至約50%之固醇，例如按莫耳計(按LNP中之脂質之100%總莫耳計)約15%至約45%、約20%至約40%、約48%、約40%、約38.5%、約35%、約34.4%、約31.5%或約31%。在此上下文中，40.9 mol%之膽固醇為尤佳的。
(iv)     聚集降低劑
聚集降低劑可為能夠降低聚集之脂質。
此類脂質之實例包括(但不限於)經聚乙二醇(PEG)修飾之脂質、單唾液酸神經節苷脂(monosialoganglioside) Gml及聚醯胺寡聚物(polyamide oligomer；PAO)，諸如美國專利第6,320,017號中所描述之彼等脂質。具有在調配期間防止聚集之不帶電、親水性、立體阻擋部分之其他化合物(如PEG、Gml或ATTA)亦可經偶合至脂質。ATTA脂質描述於例如美國專利第6,320,017號中，且PEG-脂質結合物描述於例如美國專利第5,820,873號、第5,534,499號及第5,885,613號中。
聚集降低劑可例如選自聚乙二醇(PEG)-脂質，包括(但不限於) PEG-二醯化甘油(DAG)、PEG-二烷基甘油、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-腦醯胺(Cer)或其混合物(諸如PEG-Cer14 或PEG-Cer20 )。PEG-DAA結合物可為例如PEG-二月桂基氧基丙基(C12 )、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(C14 )、PEG-二棕櫚基氧基丙基(C16 )或PEG-二硬脂基氧基丙基(C18 )。其他聚乙二醇化脂質包括(但不限於)：聚乙二醇-二肉豆蔻醯基甘油(C14 -PEG或PEG-C14 ，其中PEG具有2000 Da之平均分子量) (PEG-DMG)；(R)-2,3-雙(十八烷基氧基)丙基-1-(甲氧基聚(乙二醇)2000)丙基胺基甲酸酯) (PEG-DSG)；PEG-胺甲醯基-1,2-二(十四烷基)氧基丙基胺(dimyristyloxypropylamine)，其中PEG具有2000 Da之平均分子量(PEG-cDMA)；N-乙醯基半乳糖胺-((R)-2,3-雙(十八烷基氧基)丙基-1-(甲氧基聚(乙二醇)2000)丙基胺基甲酸酯)) (GalNAc-PEG-DSG)；mPEG (mw2000)-二硬脂醯基磷脂醯基-乙醇胺(PEG-DSPE)；及聚乙二醇-二棕櫚醯甘油(PEG-DPG)。
較佳地，聚集降低劑可選自PEG-DMG或PEG-c-DMA。
在較佳實施例中，本發明之mRNA與一或多種脂質複合，藉此形成脂質奈米粒子(LNP)，其中LNP額外包含具有以下之聚乙二醇化脂質 式(LNP-IV)：
Figure 02_image107
或其醫藥學上可接受之鹽、互變異構體或立體異構體，其中R8 及R9 各自獨立地為含有10至30個碳原子之直鏈或分支鏈、飽和或不飽和烷基鏈，其中烷基鏈視情況間雜有一或多個酯鍵；且w具有介於30至60之範圍內的平均值。
在根據式(LNP-IV)之聚乙二醇化脂質的前述實施例中之一些中，在w為42時，R8 及R9 並不都為正十八烷基。在一些其他實施例中，R8 及R9 各自獨立地為含有10至18個碳原子之直鏈或分支鏈、飽和或不飽和烷基鏈。在一些實施例中，R8 及R9 各自獨立地為含有12至16個碳原子之直鏈或分支鏈、飽和或不飽和烷基鏈。在一些實施例中，R8 及R9 各自獨立地為含有12個碳原子之直鏈或分支鏈、飽和或不飽和烷基鏈。在一些實施例中，R8 及R9 各自獨立地為含有14個碳原子之直鏈或分支鏈、飽和或不飽和烷基鏈。在其他實施例中，R8 及R9 各自獨立地為含有16個碳原子之直鏈或分支鏈、飽和或不飽和烷基鏈。在另外更多實施例中，R8 及R9 各自獨立地為含有18個碳原子之直鏈或分支鏈、飽和或不飽和烷基鏈。在其他實施例中，R8 為含有12個碳原子之直鏈或分支鏈、飽和或不飽和烷基鏈，且R9 為含有14個碳原子之直鏈或分支鏈、飽和或不飽和烷基鏈。
在多個實施例中，w跨越所選之範圍以使得根據式(LNP-IV)之聚乙二醇化脂質的PEG部分具有約400至約6000 g/mol之平均分子量。在一些實施例中，平均w為約50。
在較佳實施例中，根據式(LNP-IV)之聚乙二醇化脂質之R8 及R9 為飽和烷基鏈。
在一尤佳實施例中，本發明之mRNA分子與一或多種脂質複合，藉此形成脂質奈米粒子(LNP)，其中LNP額外包含聚乙二醇化脂質，其中PEG脂質具有式(LNP-IVa)
Figure 02_image109
， 其中n具有介於30至60，諸如約28至約32、約30至約34、32至約36、約34至約38、36至約40、約38至約42、40至約44、約42至約46、44至約48、約46至約50、48至約52、約50至約54、52至約56、約54至約58、56至約60、約58至約62之範圍內的平均值。在較佳實施例中，n為約45、46、47、48、49、50、51、52、53、54。在一最佳實施例中，n具有平均值49。在此上下文中，2-mPEG2000-正,正二(十四烷基)乙醯胺尤佳。在此上下文中，2-mPEG2000-正,正二(十四烷基)乙醯胺尤佳。
在其他實施例中，聚乙二醇化脂質具有以下結構中之一者：
Figure 02_image111
其中n為所選之整數以使得聚乙二醇化脂質之平均分子量為約2500 g/mol，最佳地n為約49。
適用於彼上下文中之PEG-脂質之其他實例提供於US20150376115A1及WO201519995中。
在一些實施例中，按LNP中之脂質之總莫耳計，LNP包括小於約3、2或1莫耳%的PEG或經PEG修飾之脂質。在其他實施例中，LNP包含按莫耳計約0.1%至約20%之經PEG修飾之脂質，例如按莫耳計(按LNP中之脂質之100%總莫耳計)約0.5至約10%、約0.5至約5%、約10%、約5%、約3.5%、約3%、約2.5%、約2%、約1.5%、約1%、約0.5%或約0.3%。在較佳實施例中，LNP包含按莫耳計約1.0%至約2.0%之經PEG修飾之脂質，例如約1.2至約1.9%、約1.2至約1.8%、約1.3至約1.8%、約1.4至約1.8%、約1.5至約1.8%、約1.6至約1.8%，特定言之約1.4%、約1.5%、約1.6%、約1.7%、約1.8%、約1.9%，最佳1.7% (按LNP中之脂質之100%總莫耳計)。在此上下文中，1.7 mol%之2-mPEG2000-正,正二(十四烷基)乙醯胺作為經PEG修飾之脂質為尤佳的。
在多個實施例中，陽離子脂質與聚乙二醇化脂質之莫耳比介於約100:1至約25:1之範圍內。
LNP組合物可能尤其受以下影響：陽離子脂質組分之選擇、陽離子脂質飽和程度、聚乙二醇化之性質、所有組分之比率及生物物理學參數(諸如其尺寸)。在根據Semple等人(Semple等人 Nature Biotech. 2010 28: 172-176)之一個實例中，LNP組合物由57.1%陽離子脂質、7.1%二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼、34.3%膽固醇及1.4% PEG-c-DMA組成(Basha等人 Mol Ther. 2011 19:2186-2200)。
LNP可包含約35%至約45%陽離子脂質、約40%至約50%陽離子脂質、約50%至約60%陽離子脂質及/或約55%至約65%陽離子脂質。脂質與核酸之比率可介於約5:1至約20:1、約10:1至約25:1、約15:1至約30:1及/或至少30:1之範圍內。
經PEG修飾之脂質中之PEG部分的平均分子量可介於約500至約8,000道爾頓(例如，約1,000至約4,000道爾頓)之範圍內。在一個較佳實施例中，PEG部分之平均分子量為約2,000道爾頓。
按LNP中之脂質之100%總莫耳計，聚集降低劑的濃度可介於約0.1至約15 mol%之範圍內。在一些實施例中，按LNP中之脂質之總莫耳計，LNP包括小於約3、2或1莫耳%的PEG或經PEG修飾之脂質。在其他實施例中，LNP包含按莫耳計約0.1%至約20%之經PEG修飾之脂質，例如按莫耳計(按LNP中之脂質之100%總莫耳計)約0.5至約10%、約0.5至約5%、約10%、約5%、約3.5%、約1.5%、約0.5%或約0.3%。
具有按莫耳計(按脂質奈米粒子中之脂質之總莫耳計)，具有不同莫耳比的陽離子脂質、非陽離子(或中性)脂質、固醇(例如，膽固醇)及聚集降低劑(諸如經PEG修飾之脂質)之不同LNP，如下表5中所描繪。在較佳實施例中，本發明之脂質奈米粒子調配物基本上由呈約20-70%陽離子脂質:5-45%中性脂質:20-55%膽固醇:0.5-15%經PEG修飾之脂質的莫耳比，更佳地呈約20-60%陽離子脂質:5-25%中性脂質:25-55%膽固醇:0.5-15%經PEG修飾之脂質的莫耳比之脂質混合物組成。表 5 ：基於脂質之調配物
脂質之莫耳比 (按脂質奈米粒子中之脂質之100%總莫耳計)
陽離子脂質 非陽離子 (或中性)脂質 固醇 聚集降低劑 (例如，PEG脂質)
約35%至約65% 約3%至約12%或15% 約15%至約45% 約0.1%至約10% (較佳地約0.5%至約2%或3%)
約20%至約70% 約5%至約45% 約20%至約55% 約0.1%至約10% (較佳地約0.5%至約2%或3%)
約45%至約65% 約5%至約10% 約5%至約45% 約0.1%至約3%
約20%至約60% 約5%至約25% 約25%至約40% 約0.1%至約5% (較佳地約0.1%至約3%)
約40% 約10% 約25%至約55% 約10%
約35% 約15%    約10%
約52% 約13%    約5%
約50% 約10%    約1.5%
LNP可作為脂質體或脂複合體出現，如下文更詳細地描述。
較佳地，脂質奈米粒子(LNP)包含：(a)至少一種mRNA、(b)陽離子脂質、(c)聚集降低劑(諸如聚乙二醇(PEG)脂質或經PEG修飾之脂質)、(d)視情況選用之非陽離子脂質(諸如中性脂質)及(e)視情況選用之固醇。
在一些實施例中，LNP包含式(LNP-III)之脂質、如上文所定義之mRNA、中性脂質、類固醇及聚乙二醇化脂質。在較佳實施例中，式(LNP-III)之脂質為脂質化合物(LNP-III-3)，中性脂質為DSPC，類固醇為膽固醇，且聚乙二醇化脂質為式(LNP-Iva，諸如2-mPEG2000-正,正二(十四烷基)乙醯胺)之化合物。
在一較佳實施例中，LNP基本上由以下組成：(i)至少一種陽離子脂質；(ii)中性脂質；(iii)固醇，例如膽固醇；及(iv)PEG脂質，例如PEG-DMG或PEG-cDMA，呈約20-60%陽離子脂質:5-25%中性脂質:25-55%固醇:0.5-15% PEG脂質之莫耳比。
在尤佳實施例中，本發明之mRNA與一或多種脂質複合，藉此形成脂質奈米粒子(LNP)，其中LNP基本上由以下組成： (i)       如本文中所定義之至少一種陽離子脂質，較佳地為式(LNP-III)之脂質，更佳地為脂質(LNP-III-3)； (ii)      如本文中所定義之中性脂質，較佳地為1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)； (iii)    如本文中所定義之類固醇或類固醇類似物，較佳地為膽固醇；及 (iv)     如本文中所定義之PEG脂質(例如PEG-DMG或PEG-cDMA)，較佳地為式(LNP-Iva，諸如2-mPEG2000-正,正二(十四烷基)乙醯胺)之聚乙二醇化脂質， 其中(i)至(iv)呈約20-60%陽離子脂質:5-25%中性脂質:25-55%固醇:0.5-15% PEG脂質之莫耳比，最佳地呈47.7%陽離子脂質:10%中性脂質:40.9%固醇:1.7% PEG脂質之莫耳比。
在一個較佳實施例中，脂質奈米粒子包含：具有式(LNP-III)之陽離子脂質及/或具有式(LNP-IV)之PEG脂質；視情況選用之中性脂質，較佳地為1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)；及視情況選用之類固醇，較佳地為膽固醇，其中陽離子脂質與DSPC之莫耳比視情況在約2:1至8:1之範圍內，其中陽離子脂質與膽固醇之莫耳比視情況在約2:1至1:1之範圍內。
在一尤佳實施例中，脂質奈米粒子(LNP)具有大致50:10:38.5:1.5、較佳地47.5:10:40.8:1.7或更佳地47.4:10:40.9:1.7之莫耳比(亦即，陽離子脂質(較佳地脂質LNP-III-3)、DSPC、膽固醇及PEG脂質(較佳地為式(LNP-IVa)之PEG脂質，其中n=49)的比例(mol%)；溶解於乙醇中)。
脂質奈米粒子中之mRNA之總量可變化且視例如RNA與總脂質w/w比而定義。在本發明之一個實施例中，mRNA與總脂質之比小於0.06 w/w，較佳地在0.03 w/w與0.04 w/w之間。
LNP尺寸
根據一些實施例，LNP具有約50 nm至約300 nm，諸如約50 nm至約250 nm，例如約50 nm至約200 nm之中值直徑尺寸。
根據一些實施例，可使用較小LNP。此類粒子可包含(但不限於)小於0.1 μm，至多1000 μm之直徑，諸如小於0.1 μm、小於1.0 μm、小於5 μm、小於10 μm、小於15 μm、小於20 μm、小於25 μm、小於30 μm、小於35 μm、小於40 μm、小於50 μm、小於55 μm、小於60 μm、小於65 μm、小於70 μm、小於75 μm、小於80 μm、小於85 μm、小於90 μm、小於95 μm、小於100 μm、小於125 μm、小於150 μm、小於175 μm、小於200 μm、小於225 μm、小於250 μm、小於275 μm、小於300 μm、小於325 μm、小於350 μm、小於375 μm、小於400 μm、小於425 μm、小於450 μm、小於475 μm、小於500 μm、小於525 μm、小於550 μm、小於575 μm、小於600 μm、小於625 μm、小於650 μm、小於675 μm、小於700 μm、小於725 μm、小於750 μm、小於775 μm、小於800 μm、小於825 μm、小於850 μm、小於875 μm、小於900 μm、小於925 μm、小於950 μm、小於975 μm。在另一實施例中，可使用較小LNP遞送核酸，該等LNP可包含以下直徑：約1 nm至約100 nm、約1 nm至約10 nm、約1 nm至約20 nm、約1 nm至約30 nm、約1 nm至約40 nm、約1 nm至約50 nm、約1 nm至約60 nm、約1 nm至約70 nm、約1 nm至約80 nm、約1 nm至約90 nm、約5 nm至約100 nm、約5 nm至約10 nm、約5 nm至約20 nm、約5 nm至約30 nm、約5 nm至約40 nm、約5 nm至約50 nm、約5 nm至約60 nm、約5 nm至約70 nm、約5 nm至約80 nm、約5 nm至約90 nm、約10至約50 nm、約20至約50 nm、約30至約50 nm、約40至約50 nm、約20至約60 nm、約30至約60 nm、約40至約60 nm、約20至約70 nm、約30至約70 nm、約40至約70 nm、約50至約70 nm、約60至約70 nm、約20至約80 nm、約30至約80 nm、約40至約80 nm、約50至約80 nm、約60至約80 nm、約20至約90 nm、約30至約90 nm、約40至約90 nm、約50至約90 nm、約60至約90 nm及/或約70至約90 nm。
如本文中所使用，平均直徑可由如藉由作為此項技術中通常已知之動態光散射所測定之z平均值表示。
根據一些實施例，LNP可具有大於100 nm、大於150 nm、大於200 nm、大於250 nm、大於300 nm、大於350 nm、大於400 nm、大於450 nm、大於500 nm、大於550 nm、大於600 nm、大於650 nm、大於700 nm、大於750 nm、大於800 nm、大於850 nm、大於900 nm、大於950 nm或大於1000 nm之直徑。
在本發明之另一較佳實施例中，脂質奈米粒子分別具有在約50 nm至約300 nm或約60 nm至約250 nm、約60 nm至約150 nm或約60 nm至約120 nm之範圍內的流體動力學直徑。
根據其他實施例，LNP具有單模粒徑分佈(亦即，其不為雙模態或多模態)。
除上文所提及之彼等以外，LNP可進一步包含一或多種脂質及/或其他組分。其他脂質可出於多個目的而包括於脂質體組合物中，諸如防止脂質氧化或將配體附接至脂質體表面上。數目個脂質中之任一者可存在於LNP中，包括兩性、中性、陽離子及陰離子脂質。此類脂質可單獨或以組合形式使用。
可存在於LNP中之額外組分包括雙層穩定組分，諸如聚醯胺寡聚物(參見例如美國專利第6,320,017號)、肽、蛋白質及清潔劑。
在一個實施例中，本發明之mRNA分子經調配為脂質奈米粒子。
在另一實施例中，編碼不同突變型KRAS變體肽之各個別mRNA分子經單獨地調配於脂質奈米粒子中。在另一實施例中，各自編碼不同突變型KRAS變體肽之一或多種個別mRNA分子經單獨地調配為脂質奈米粒子。在另一實施例中，各自編碼不同KRAS變體肽之1、2、3、4或5種個別mRNA分子經單獨地調配為脂質奈米粒子。在另一實施例中，經各自編碼不同KRAS變體肽之5種個別mRNA分子單獨地調配為脂質奈米粒子。
在另一實施例中，各自編碼不同KRAS變體肽之一或多種種個別mRNA分子在調配為脂質奈米粒子之前經混合。在另一實施例中，各自編碼特定KRAS變體肽之1、2、3、4或5種個別mRNA分子在調配為脂質奈米粒子之前經混合。在另一實施例中，將各自編碼不同KRAS變體肽之5種個別mRNA分子在調配為脂質奈米粒子之前經混合。
在一個實施例中，脂質奈米粒子調配物包含：本發明之一或多種人工核酸分子、陽離子脂質、磷酸膽鹼(例如，二硬脂醯基磷脂醯膽鹼)、聚乙二醇化脂質(例如，2-mPEG2000-正,正二(十四烷基)乙醯胺)、固醇(例如，膽固醇)及衍生自本文中之式(LNP-III)的脂質(例如，本文表4中之LNP III-3之脂質)。在另一實施例中，脂質奈米粒子調配物包含本發明之一或多種人工核酸分子、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼、2-mPEG2000-正,正二(十四烷基)乙醯胺、膽固醇及本文表4中之LNP III-3之脂質。
在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含根據本發明之mRNA分子及/或組合物，以及至少一種醫藥學上可接受之載劑、賦形劑、佐劑或其他組分。
根據本發明之醫藥組合物包含「安全且治療有效量」的本發明之至少一種mRNA分子及/或組合物。
「治療有效量」將另外結合待治療之特定病狀且亦結合待治療之患者的年齡、身體條件、體重、性別及飲食、病狀之嚴重程度、治療持續時間、隨附療法之性質、所使用之特定醫藥學上可接受之載劑及/或賦形劑的性質、治療方案及類似因素而變化。其可進一步視所採用mRNA分子是否為單順反子雙順反子或甚至多順反子而變化。
本發明之醫藥組合物可進一步包含至少一種醫藥學上可接受之賦形劑、載劑、佐劑或其他組分(例如額外活性劑及其類似者)，如本文中所描述。
較佳地，根據本發明之醫藥組合物包含至少一種醫藥學上可接受之載劑及/或賦形劑。術語「醫藥學上可接受」係指與一或多種活性劑(此處：mRNA分子及/或組合物)相容且不干擾及/或實質上降低其醫藥活性之化合物或藥劑。醫藥學上可接受之載劑及/或賦形劑較佳地具有足夠高之純度及足夠低之毒性以使其適用於投與至待治療之個體。適合之的醫藥賦形劑及載劑為一般熟習此項技術者所已知，且非限制性實例可見於Remington: The Science and Practice of Pharmacy , 第22版 (2012), A. Loyd等人，Pharmaceutical Press中。
根據其他實施例，本發明之醫藥組合物可進一步包含至少一種佐劑。適合之的佐劑為一般熟習此項技術者所已知，且非限制性實例可見於Remington: The Science and Practice of Pharmacy , 第22版 (2012), A. Loyd等人，Pharmaceutical Press中。
最廣義而言，「佐劑」或「佐劑組分」典型為可修飾(例如增強)其他活性劑之效果之藥理學及/或免疫藥劑，例如治療劑或疫苗。在此上下文中，「佐劑」可理解為任何化合物，其適合於支持投與及遞送根據本發明之組合物。具體而言，佐劑可較佳地增強添加其之醫藥組合物之免疫刺激特性。此外，此類佐劑可在不受其約束之情況下起始或增大先天性免疫系統之免疫反應，亦即非特異性免疫反應。
「佐劑」通常不引發適應性免疫反應。到目前為止，「佐劑」並不適合當作抗原。換言之，當投與時，醫藥組合物典型因由醫藥組合物中所含有之mRNA分子之至少一個編碼序列編碼的變體肽或蛋白質而起始適應性免疫反應。另外，存在於醫藥組合物中之佐劑可產生(支援性)先天性免疫反應。
在一較佳實施例中，本發明之醫藥組合物不含有佐劑。
生物序列1至67 SEQ ID NO: 1 (muag 3'-UTR)
Figure 02_image113
SEQ ID NO: 2 (組蛋白莖環)
Figure 02_image115
SEQ ID NO: 3 (CTLA4 1-35)
Figure 02_image117
SEQ ID NO: 4 (CTLA4 1-35)
Figure 02_image119
SEQ ID NO: 5 (CTLA4 1-35)
Figure 02_image121
SEQ ID NO: 6 (CTLA4 1-35)
Figure 02_image123
EQ ID NO: 7 (CTLA4 1-35)
Figure 02_image125
SEQ ID NO: 8 (Kras G12C)
Figure 02_image127
SEQ ID NO: 9 (Kras G12D)
Figure 02_image129
SEQ ID NO: 10 (Kras G12R)
Figure 02_image131
SEQ ID NO: 11 (Kras G12V)
Figure 02_image133
SEQ ID NO: 12 (Kras G13D)
Figure 02_image135
SEQ ID NO: 13 (Kras G12C)
Figure 02_image137
SEQ ID NO: 14 (Kras G12D)
Figure 02_image139
SEQ ID NO: 15 (Kras G12R)
Figure 02_image141
SEQ ID NO: 16 (Kras G12V)
Figure 02_image143
SEQ ID NO: 17 (Kras G13D)
Figure 02_image145
SEQ ID NO: 18 (Kras G12C)
Figure 02_image147
SEQ ID NO: 19 (Kras G12D)
Figure 02_image149
SEQ ID NO: 20 (Kras G12R)
Figure 02_image151
SEQ ID NO: 21 (Kras G12V)
Figure 02_image153
SEQ ID NO: 22 (Kras G13D)
Figure 02_image155
SEQ ID NO: 23 (Kras G12C)
Figure 02_image157
SEQ ID NO: 24 (Kras G12D)
Figure 02_image159
SEQ ID NO: 25 (Kras G12R)
Figure 02_image161
SEQ ID NO: 26 (Kras G12V)
Figure 02_image163
SEQ ID NO: 27 (Kras G13D)
Figure 02_image165
SEQ ID NO: 28 (Kras G12C)
Figure 02_image167
SEQ ID NO: 29 (Kras G12D)
Figure 02_image169
SEQ ID NO: 30 (Kras G12R)
Figure 02_image171
SEQ ID NO: 31 (Kras G12V)
Figure 02_image173
SEQ ID NO: 32 (Kras G13D)
Figure 02_image175
SEQ ID NO: 33 (T輔助抗原決定基1)
Figure 02_image177
SEQ ID NO: 34 (T輔助抗原決定基1)
Figure 02_image179
SEQ ID NO: 35 (連接子)
Figure 02_image181
SEQ ID NO: 36 (連接子)
Figure 02_image183
SEQ ID NO: 37 (連接子)
Figure 02_image185
SEQ ID NO: 38 (連接子)
Figure 02_image187
SEQ ID NO: 39 (連接子)
Figure 02_image189
SEQ ID NO: 40 (連接子)
Figure 02_image191
SEQ ID NO: 41 (連接子)
Figure 02_image193
SEQ ID NO: 42 (CTLA4 162-223)
Figure 02_image195
SEQ ID NO: 43 (CTLA4 162-223)
Figure 02_image197
SEQ ID NO: 44 (CTLA4 162-223)
Figure 02_image199
SEQ ID NO: 45 (CTLA4 162-223)
Figure 02_image201
SEQ ID NO: 46 (CTLA4162-223)
Figure 02_image203
SEQ ID NO: 47 (CTLA4 162-223)
Figure 02_image205
SEQ ID NO: 48 (Kras G12C構築體)
Figure 02_image207
SEQ ID NO: 49 (Kras G12D構築體)
Figure 02_image209
Figure 02_image211
SEQ ID NO: 50 (Kras G12R構築體)
Figure 02_image213
SEQ ID NO: 51 (Kras G12V構築體)
Figure 02_image215
SEQ ID NO: 52 (Kras G13D構築體)
Figure 02_image217
SEQ ID NO: 53 (Kras G12C構築體)
Figure 02_image219
SEQ ID NO: 54 (Kras G12D構築體)
Figure 02_image221
SEQ ID NO: 55 (Kras G12R構築體)
Figure 02_image223
SEQ ID NO: 56 (Kras G12V構築體)
Figure 02_image225
SEQ ID NO: 57 (Kras G13D構築體)
Figure 02_image227
SEQ ID NO: 58 (Kras G12C mRNA構築體)
Figure 02_image229
SEQ ID NO: 59 (Kras G12D mRNA構築體)
Figure 02_image231
SEQ ID NO: 60 (Kras G12R mRNA構築體)
Figure 02_image233
SEQ ID NO: 61 (Kras G12V mRNA構築體)
Figure 02_image235
SEQ ID NO: 62 (Kras G13D mRNA構築體)
Figure 02_image237
SEQ ID NO: 63 (Kras G12C mRNA構築體)
Figure 02_image239
SEQ ID NO: 64 (Kras G12D mRNA構築體)
Figure 02_image241
SEQ ID NO: 65 (Kras G12R mRNA構築體)
Figure 02_image243
SEQ ID NO: 66 (Kras G12V mRNA構築體)
Figure 02_image245
SEQ ID NO: 67 (Kras G13D mRNA構築體)
Figure 02_image247
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036
Figure 12_A0101_SEQ_0037
Figure 12_A0101_SEQ_0038
Figure 12_A0101_SEQ_0039
Figure 12_A0101_SEQ_0040
Figure 12_A0101_SEQ_0041
Figure 12_A0101_SEQ_0042
Figure 12_A0101_SEQ_0043
Figure 12_A0101_SEQ_0044
Figure 12_A0101_SEQ_0045
Figure 12_A0101_SEQ_0046
Figure 12_A0101_SEQ_0047
Figure 12_A0101_SEQ_0048
Figure 12_A0101_SEQ_0049
Figure 12_A0101_SEQ_0050
Figure 12_A0101_SEQ_0051
Figure 12_A0101_SEQ_0052
Figure 12_A0101_SEQ_0053
Figure 12_A0101_SEQ_0054
Figure 12_A0101_SEQ_0055
Figure 12_A0101_SEQ_0056
Figure 12_A0101_SEQ_0057
Figure 12_A0101_SEQ_0058
Figure 12_A0101_SEQ_0059
Figure 12_A0101_SEQ_0060
Figure 12_A0101_SEQ_0061
Figure 12_A0101_SEQ_0062
Figure 12_A0101_SEQ_0063

Claims (47)

  1. 一種包含mRNA序列之mRNA分子，其編碼包含CTLA4信號肽之胺基酸序列、KRAS變體肽、PADRE衍生之T輔助抗原決定基序列及CTLA4跨膜域或其部分。
  2. 如請求項1之mRNA分子，其中該KRAS變體肽包含KRAS G12C變體胺基酸殘基、KRAS G12D變體胺基酸殘基、KRAS G12V變體胺基酸殘基、KRAS G12R變體胺基酸殘基或KRAS G13D變體胺基酸殘基。
  3. 如請求項1或請求項2之mRNA分子，其中該mRNA分子並不編碼干擾素基因刺激因子之肽或多肽。
  4. 如請求項1至3中任一項之mRNA分子，其進一步包含α-血球蛋白3' UTR元件。
  5. 如請求項4之mRNA分子，其中編碼KRAS變體肽之該mRNA位於該α-血球蛋白3' UTR元件之5'處。
  6. 如請求項1至5中任一項之mRNA分子，其中該KRAS變體肽包含SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之序列。
  7. 如請求項1至5中任一項之mRNA分子，其中該分子包含SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56或SEQ ID NO: 57。
  8. 如請求項1至5中任一項之mRNA分子，其中該mRNA闡述於SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66或SEQ ID NO: 67。
  9. 如請求項1至5中任一項之mRNA分子，其中該mRNA分子闡述於SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61或SEQ ID NO: 62。
  10. 如請求項1至5中任一項之mRNA分子，其中該mRNA分子編碼闡述於SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51或SEQ ID NO: 52之KRAS變體肽。
  11. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至10中任一項之mRNA分子及一或多種醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
  12. 如請求項11之醫藥組合物，其中該組合物包含1、2、3、4或5種不同mRNA分子，其中各mRNA分子編碼不同KRAS變體肽。
  13. 如請求項11之醫藥組合物，其中該組合物包含編碼單一KRAS變體肽之mRNA分子。
  14. 如請求項11之醫藥組合物，其中該組合物包含2種不同mRNA分子，其中各mRNA分子編碼不同KRAS變體肽。
  15. 如請求項11之醫藥組合物，其中該組合物包含3種mRNA分子，其中各mRNA分子編碼不同KRAS變體肽。
  16. 如請求項11之醫藥組合物，其中該組合物包含4種mRNA分子，其中各mRNA分子編碼不同KRAS變體肽。
  17. 如請求項11之醫藥組合物，其中該組合物包含5種mRNA分子，其中各mRNA分子編碼不同KRAS變體肽。
  18. 如請求項13至17中任一項之醫藥組合物，其進一步包含陽離子脂質、固醇、中性脂質及PEG脂質。
  19. 如請求項18之醫藥組合物，其中該陽離子脂質具有下式：
    Figure 03_image249
    或醫藥學上可接受之鹽，其中： L1 或L2 各自獨立地為-O(C=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)-、-O-、-S(O)x -、-S-S-、-C(=O)S-、-SC(=O)-、 -NRa C(=O)-、-C(=O)NRa -、-NRa C(=O)NRa -、-OC(=O)NRa -或-NRa C(=O)O-，較佳地L1 或L2 為-O(C=O)-或 -(C=O)O-； G1 及G2 各自獨立地為未經取代之C1 -C12 伸烷基或C1 -C12 伸烯基； G3 為C1 -C24 伸烷基、C1 -C24 伸烯基、C3 -C8 伸環烷基或C3 -C8 伸環烯基； Ra 為H或C1 -C12 烷基； R1 及R2 各自獨立地為C6 -C24 烷基或C6 -C24 烯基； R3 為H、OR5 、CN、-C(=O)OR4 、-OC(=O)R4 或-NR5 C(=O)R4 ； R4 為C1 -C12 烷基； R5 為H或C1 -C6 烷基；且 x為0、1或2。
  20. 如請求項19之醫藥組合物，其中：L1 及L2 各自獨立地為-O(C=O)-或(C=O)-O-；G3 為C1 -C24 伸烷基或C1 -C24 伸烯基；且R3 為H或OR5 。
  21. 如請求項19或請求項20之醫藥組合物，其中：L1 及L2 各自獨立地為-O(C=O)-或(C=O)-O-；且R1 及R2 各自獨立地具有以下結構中之一者：
    Figure 03_image251
    Figure 03_image253
    。
  22. 如請求項18至20中任一項之醫藥組合物，其中R3 為OH。
  23. 如請求項19至22中任一項之醫藥組合物，其中該陽離子脂質為
    Figure 03_image255
    。
  24. 如請求項18之醫藥組合物，其中該PEG脂質具有下式：
    Figure 03_image257
    ， 其中R8 及R9 各自獨立地為含有10至30個碳原子之直鏈或分支鏈、飽和或不飽和烷基鏈，其中該烷基鏈視情況間雜有一或多個酯鍵；且w具有介於30至60之範圍內的平均值。
  25. 如請求項24之醫藥組合物，其中在該PEG脂質中R8 及R9 為飽和烷基鏈。
  26. 如請求項18、24或25之醫藥組合物，其中該PEG脂質為
    Figure 03_image259
    ， 其中n具有介於30至60之範圍內的平均值；較佳地，其中n具有約45、46、47、48、49、50、51、52、53、54之平均值；最佳地，其中n具有平均值49。
  27. 如請求項18或24至26中任一項之醫藥組合物，其中該PEG脂質為2-mPEG2000-正,正二(十四烷基)乙醯胺。
  28. 如請求項18之醫藥組合物，其中該中性脂質為二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二油醯基磷脂醯甘油(DOPG)、二棕櫚醯基磷脂醯甘油(DPPG)、二油醯基-磷脂醯乙醇胺(DOPE)、棕櫚醯油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、棕櫚醯油醯基-磷脂醯乙醇胺(POPE)及二油醯基-磷脂醯乙醇胺4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)-環己烷-1甲酸脂(DOPE-mal)、二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻醯基-磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂醯基-磷脂醯乙醇胺(DSPE)、16-O-單甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂醯基-2-油醯基磷脂醯乙醇胺(SOPE)或1,2-二反油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)。
  29. 如請求項18或請求項28之醫藥組合物，其中該中性脂質為二硬脂醯基磷脂醯膽鹼。
  30. 如請求項29之醫藥組合物，其中該二硬脂醯基磷脂醯膽鹼為1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼。
  31. 如請求項18之醫藥組合物，其中該固醇為膽固醇。
  32. 如請求項18之醫藥組合物，其中該PEG脂質為2-mPEG2000-正,正二(十四烷基)乙醯胺，該中性脂質為1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼，該固醇為膽固醇，且該陽離子脂質為
    Figure 03_image261
    。
  33. 如請求項18至32中任一項之醫藥組合物，其包含莫耳比約20至60%陽離子脂質、5至25%中性脂質、25至55%固醇及0.5至15% PEG脂質。
  34. 如請求項33之醫藥組合物，其包含莫耳比mol%大致50:10:38.5:1.5、47.5:10:40.8:1.7或47.4:10:40.9:1.7之陽離子脂質:中性脂質:膽固醇:PEG脂質。
  35. 如請求項18之醫藥組合物，其包含： 闡述於SEQ ID NO: 63至67中之該等mRNA分子中之一或多者； 膽固醇； 2-mPEG2000-正,正二(十四烷基)乙醯胺； 1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼；及 陽離子脂質
    Figure 03_image263
    。
  36. 如請求項35之醫藥組合物，其中陽離子脂質:1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼:膽固醇:2-mPEG2000-正,正二(十四烷基)乙醯胺之莫耳比mol%為大致50:10:38.5:1.5、47.5:10:40.8:1.7或47.4:10:40.9:1.7。
  37. 如請求項18之醫藥組合物，其包含： 闡述於SEQ ID NO: 58-62中之該等mRNA分子中之一或多者； 膽固醇； 2-mPEG2000-正,正二(十四烷基)乙醯胺； 1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼；及 該陽離子脂質
    Figure 03_image265
    。
  38. 如請求項37之醫藥組合物，其中陽離子脂質:1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼:膽固醇:2-mPEG2000-正,正二(十四烷基)乙醯胺之莫耳比mol%為大致50:10:38.5:1.5、47.5:10:40.8:1.7或47.4:10:40.9:1.7。
  39. 一種套組，其包含如請求項1至17中任一項之mRNA及視情況選用之說明書，該說明書載明關於該mRNA分子之投與及劑量之資訊。
  40. 一種如請求項1至17中任一項之mRNA分子或如請求項18至38中任一項之醫藥組合物之用途，其係供製造用於治療對其有需要之個體中癌症之藥物，其中該癌症為實體腫瘤癌，即膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、頭頸癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌、子宮癌或尿道上皮癌。
  41. 如請求項40之用途，其中該癌症為結腸直腸癌、胰臟癌或肺癌。
  42. 如請求項41之用途，其中該肺癌為非小細胞肺癌。
  43. 如請求項40至42中任一項之用途，其中該個體係經腫瘤分型。
  44. 如請求項43之用途，其中該個體經腫瘤分型為KRAS G12D、G12C、G12R、G12V或G13D突變中之一或多者。
  45. 如請求項40至42中任一項之用途，其中該個體係經HLA分型。
  46. 如請求項40至42中任一項之用途，其中該個體係經腫瘤分型及HLA分型。
  47. 如請求項40至46中任一項之用途，其中該藥物係用於肌肉內投與。
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