KR20230124927A - 핵산 전달을 위한 지질 나노입자, 및 관련 사용 방법 - Google Patents

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대릴 씨. 드럼먼드
드미트리 비. 커포틴
마크 이. 헤이에스
알렉산더 코쉬카르예프
로스 비. 풀톤
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아카제라 메디신즈, 인크.
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Abstract

본 발명은 치료 핵산을 세포로 전달하기 위한, 이온화 가능한 지질 나노입자의 개선된 조성물을 제공한다. 이온화 가능한 양이온성 지질은 세포에서 높은 형질감염 활성 또는 효능을 유지하면서도 보관 중에 산화적 분해에 대한 안정성이 개선되도록 설계되었다. 이들 지질은 생분해성으로 설계되므로, 생체 내에서 이와 함께 형성된 나노입자의 내약성을 개선한다. 또한, 이들 나노입자를 수지상 세포에 대해 매우 특이적인 방식으로 표적화하는 것은 세포 표면 수용체에 대해 지시되는 항체 접합체들을 포함시킴에 의해 제공된다.

Description

핵산 전달을 위한 지질 나노입자, 및 관련 사용 방법
관련 출원
이 특허 출원은 2020년 11월 25일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/118,534의 이익 및 우선권을 주장하며, 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다.
서열 목록의 참조
본 명세서는 2021년 11월 24일에 생성된 7,061바이트 크기의 191016-010403_ST25.txt 파일을 포함하는 함께 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 내용은 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 양이온성 이온화 가능한 지질 및 지질 나노입자(LNP)에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 양이온성 이온화가능 지질(들)을 포함하는 LNP는 핵산 화합물의 전달, 수지상 세포 표적화 또는 이러한 LNP 조성물을 백신으로서 사용하는 방법에 유용하다. 일부 실시형태에서, LNP는 생체환원성 이온화 가능한 양이온성 지질 또는 비접합 폴리올레핀계 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함할 수 있다.
배경
지질 나노입자(LNP)는 치료용 핵산을 세포에 전달하는 데 사용된다. 예를 들어, LNP 약학 조성물은 mRNA 치료제를 전달하기 위해 백신에 사용된다. LNP 제형은 전형적으로 이온화 가능한 양이온성 지질(ICL)을 포함한다. 그러나, 특정 ICL 화합물은 저장하는 동안 산화에 민감하여 바람직하지 않다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 핵산과 같은 치료제와 함께 LNP에 포함될 때 세포에서 원하는 형질감염 활성 또는 효능을 제공하면서 저장 중에 산화적 분해에 대해 개선된 안정성을 갖는 개선된 ICL 화합물이 필요하다.
SNALP 조성물은 다양한 감염성 질병에 대한 핵산 요법의 전달에 유용하다. 결핵, HIV/AIDS, 말라리아 및 COVID-19와 같은 전염병은 인간 건강에 중대한 문제를 제기한다. 예를 들어, 마이코박테리아는 결핵(TB)을 일으키는 박테리아의 속이다. 세계 보건 기구(WHO)에 따르면 전 세계적으로 TB는 상위 10대 사망 원인 중 하나이며 단일 감염원으로 인한 주요 사망 원인이다. 현재 최선의 노력에도 불구하고 많은 전염병을 예방하는데 효과적인 백신 개발에 상당한 어려움이 있었다. 개개의 항원 펩티드 또는 이들의 조합을 식별하기 위한 새로운 노력은 백신의 효율성을 개선하는 데 도움이 되었다. 그럼에도 불구하고 이러한 항원 서열을 수지상 세포와 같은 전문 항원 제시 세포에 효율적으로 전달하여 제시하는 데 도움이 되는 보조제의 조작에 중요한 기회가 남아 있다. 이온화 가능한 양이온성 지질 나노입자와 조합된 항원 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 mRNA가 백신 개발에서 특히 유망한 전략을 나타낸다. 백신 조성물을 포함하여 다양한 질병을 치료 및 예방하기 위한, mRNA 전달용 SNALP 약학 조성물을 포함하는 안전하고 효과적인 치료법이 필요하다.
요약
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온성 지질(ICL)이 제공된다. 양이온성 지질은 세포에서 높은 형질감염 활성 또는 효능을 유지하면서도 보관 중에 산화적 분해에 대한 안정성이 개선되도록 설계되었다. 본 발명의 양상들은 폴리엔 사슬들을 갖는 이온화 가능한 지질의 바람직하지 않은 산화 및/또는 분해가 한 쌍의 알키닐 이중 결합 사이에 2개 이상의 메틸렌기를 포함시킴으로써 개선될 수 있다는 발견에 부분적으로 기초한다. 본원에 개시된 지질은 적어도 2개의 메틸렌 또는 치환된 메틸렌 기로 이격된 적어도 2개의 탄소-탄소 이중 결합(올레핀)을 포함하며, 여기서 치환된 메틸렌은 -C(R1)(R2)-이고, 여기서 R1 및 R2는 독립적으로 H, 알킬, 또는 할로겐이다. 본원에 개시된 지질은 각각이 2개, 3개 또는 4개의 메틸렌 기의 어느 한 쪽에 2개의 탄소-탄소 이중 결합(올레핀)을 갖는 2개의 대칭 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함한다. 적어도 2개의 메틸렌기에 의해 분리된 지질 테일의 올레핀은 본원에 기술된 화합물이 하나의 메틸렌기에 의해 분리된 화합물, 예를 들어, 이온화 가능한 양이온성 지질 설계에서 황금 표준으로 간주되며 안정성 문제가 있는 것으로 보고된 바 있는 DLin-MC3-DMA에 비해 산화에 상당히 덜 민감해지게 만든다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 화합물은 대조군 LNP와 비교할 때 산화 부산물의 감소가 30% 초과, 50% 초과, 75% 초과, 90% 초과 및 95% 초과이다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 화합물은 DLin-KC2-DMA 지질을 함유하는 대조군 LNP와 비교할 때 산화 부산물의 감소가 30% 초과, 50% 초과, 75% 초과, 90% 초과 및 95% 초과이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온성 지질 조성물이 제공된다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 양이온성 지질은 각각 1개 또는 2개의 알케닐 이중 결합 모이어티를 포함하는 2개의 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 양이온성 지질은 각각 2개의 알케닐 이중 결합 모이어티 사이에 2개 이상의 메틸렌기를 포함하는 2개의 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 양이온성 지질은 2개의 C16 또는 C18 폴리엔 탄화수소 사슬을 함유할 수 있다.
일부 실시형태에서, 각각의 폴리엔 탄화수소 사슬에서 2개의 인접한 불포화 알키닐 이중 결합 사이에 불포화 선형 에틸렌, n-프로필렌 또는 n-부틸렌을 각각 포함하는, 한 쌍의 선형 폴리엔 C16 또는 C18 탄화수소 사슬을 갖는 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함하는 리포좀 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 리포좀 조성물은 6 내지 7의 pKa를 갖는 디알킬 아미노기를 포함하는 헤드 기에 공유 결합된 16개 또는 18개의 탄소 선형 다중불포화 지질 꼬리의 쌍으로 이루어진 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 지질을 포함할 수 있고; 여기서 헤드 기는 디알킬 아미노기에 공유 결합되고 선택적으로 포스페이트기를 추가로 포함하는 헤테로사이클릴 또는 알킬 부분을 포함하고; 각각의 다중불포화 지질 테일은 지질 테일의 길이를 따라 적어도 2개의 메틸렌 기에 의해 분리된 적어도 2개의 올레핀을 제외하고는 불포화되고, 각각의 지질 테일은 선택적으로 헤드 기에 공유 결합된 말단에 단일 아실 기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 각각의 지질 테일은 동일하고, 각각의 지질 테일은 비치환된 에틸렌, n-프로필 또는 n-부틸에 의해서만 분리된 총 2개의 올레핀을 갖는다. 일부 실시형태에서, 각각의 지질 테일은 헤드 기의 산소에 결합되어 에스테르를 형성하는 아실기를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온성 지질의 헤드 기의 디알킬 아미노 부분은 화학식 (IV-A)의 디알킬 아미노 화학 구조를 갖는다.
화학식 IV-A,
여기서. 화학식 (IV-A)에서 n은 2, 3 또는 4이고; 화학식 (IV-A)에서 R10 및 R12는 각각 독립적으로 메틸, 에틸 및 n-프로필로 이루어진 군으로부터 선택된 알킬기로부터 선택되며, 여기서 R10 및 R12의 알킬은 하나 이상의 하이드록실로 선택적으로 치환된다. 일부 실시형태들에서, 화학식 (IV-A)에서 R10 및 R12는 각각 독립적으로 메틸, 에틸, - (CH2)(CH2)OH, 또는 -(CH2)2(CH2)OH이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온성 지질은 , , , , 및 로 이루어진 군으로부터 선택된 화학 구조를 포함하고; 여기서 R22는 지질 테일의 제1 말단이고 는 헤드 기의 디알킬 아미노 화학 구조에 대한 헤드 기의 부착을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 화학식 (IV-A)의 화학적 하위 구조를 포함하는 이온화 가능한 양이온성 지질은 , , , , 및 로 이루어진 군으로부터 선택되는 추가의 화학 구조를 추가로 포함하고; 여기서 R22는 지질 테일의 제1 말단이고 는 헤드 기의 디알킬 아미노 화학 구조에 대한 헤드 기의 부착을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온성 지질은 헤드 기에 부착된 한 쌍의 지질 테일을 추가로 포함하며, 여기서 각각의 지질 테일은 화학식 A 또는 화학식 B의 화학 구조를 갖는 탄화수소 사슬을 포함한다:
화학식 A
여기서 화학식 A에서 a는 1, 2, 3 또는 4이고; b는 2, 3 또는 4이고; 화학식 A에서 c는 3, 4, 5, 6 또는 7이고; 또는
화학식 B
여기서 화학식 B에서 a는 5, 6 또는 7이고; 화학식 B에서 c는 3, 4 또는 5이다. 일부 실시형태에서, b는 4이고 화학식 A에서 a, b 및 c의 합은 10, 11, 12 또는 13이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온성 지질은 상기 나타낸 화학 구조에서 R22에 화학식 A 또는 화학식 B의 지질 테일을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온성 지질은 화학식 A의 지질 테일을 포함하고, 여기서 화학식 A에서 는 상기 나타낸 화학 구조에서 R22에서의 부착 위치를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온성 지질은 화학식 B의 지질 테일을 포함하고, 여기서 화학식 B에서 는 상기 나타낸 화학 구조에서 R22에서의 부착 위치를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온성 지질은 다음 화학식(I-A)의 화학 구조를 가지며
화학식 I-A
여기서
a는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고; b는 2, 3 또는 4이고; c는 3, 4, 5, 6 또는 7이고; a, b 및 c의 합은 10 또는 12이고; q는 1, 2, 3 또는 4이고; R10 및 R12는 각각 독립적으로 하나 이상의 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이고; 그리고
L은 이고, 여기서 v는 0 또는 1이고; q는 1, 2 또는 3이고 q2는 1 또는 2이다. 일부 실시형태에서, 화학식 I-A에서 v가 0일 때 q는 1, 2 또는 3이고, v가 1일 때 q는 1, 2, 3 또는 4이다.
일부 실시형태에서, 화학식 I-A에서 v는 0이다. 일부 실시형태에서, 화학식 I-A에서 v는 0이고 q는 1, 2 또는 3이다. 일부 실시형태에서, 화학식 I-A에서 v는 0이고 q는 1 또는 2이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화합물 17-19, 및 23-25로 이루어진 군으로부터 선택된 양이온성 지질이다:
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 양이온성 지질이다: AKG-UO-1, AKG-UO-2, AKG-UO-4, 및 AKG-UO-5. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 AKG-UO-1이다:
. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 AKG-UO-1A이다:
. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 AKG-UO-1B이다:
. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 AKG-UO-2이다:
. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 AKG-UO-4이다:
. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 AKG-UO-4A이다:
. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 AKG-UO-5이다:
.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 AKG-UO-6, AKG-UO-7, AKG-UO-7, AKG-UO-8, AKG-UO-9, 또는 AKG-UO-10이다:
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 메틸화된 포스페이트 모이어티를 포함하는 헤드 기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 v가 1인 화학식 I-A의 화학 구조를 가진다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 v가 1이고 q가 3 또는 4인 화학식 I-A의 화학 구조를 가진다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 AKG-UO-3이다:
.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 다음 화학식 II-A의 화학 구조를 가지며
화학식(II-A)
여기서 a는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고; b는 2, 3 또는 4이고; c는 4, 5, 6, 7 또는 8이고;
R2는 이고;
q는 1 또는 2이고; 그리고
R10및 R12 각각은 독립적으로 하나 이상의 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화합물 1-3 및 화합물 5-8로 이루어진 군으로부터 선택된다:
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화합물 1-8로 이루어진 군으로부터 선택된다:
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 다음 화학식 II-A의 화학 구조를 가지며:
화학식(II-A)
여기서 a는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고; b는 2, 3 또는 4이고; c는 4, 5, 6, 7 또는 8이고;
R2는 이고;
q'은 1 또는 2이고; 그리고
R10및 R12 각각은 독립적으로 하나 이상의 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화합물 9-19로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물이다:
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 다음 화학식 II-A의 화학 구조를 가지며:
화학식(II-A)
여기서 a는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고; b는 2, 3 또는 4이고; c는 4, 5, 6, 7 또는 8이고;
R2는 이고;
L은 이고, 여기서 v는 0 또는 1이고; q는 1, 2, 3 또는 4이고; q2는 1 또는 2이고; R10 및 R12는 각각 독립적으로 하나 이상의 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (II-A)에서 v가 0일 때 q는 1, 2 또는 3이거나, v가 1일 때 q가 3 또는 4이다.
일부 실시형태에서, 지질은 생분해성으로 설계되므로, 생체 내에서 이와 함께 형성된 나노입자의 내약성을 개선한다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (II-B)의 화학 구조를 가지며:
화학식 (II-B)
여기서 a는 5, 6 또는 7이고; c는 3, 4 또는 5이고;
R2는 또는 이고;
q 및 q'은 각각 독립적으로 1 또는 2이고; 그리고
R10 및 R12는 각각 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온성 지질은 화합물 29-34로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물이다:
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 생체환원성 양이온성 지질이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 스테롤 화학 구조를 포함하는 생체환원성 양이온성 지질이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (VI-A)의 화학 구조:
(VI-A)
또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 q는 3 또는 4이고 R3은 또는 이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온성 지질은 화합물 35-38로 이루어진 군으로부터 선택된다:
일부 실시형태에서, 지질 나노입자 조성물은 지질 및 핵산을 포함하고, 지질 나노입자는 화학식 I, II, III, IV 또는 이의 조합 또는 약학적으로 허용되는 이의 염의 이온화 가능한 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자 조성물은 지질 및 핵산을 포함하고, 지질 나노입자는 화학식 (I-A), (II-A), (II-B), (IV-A), 또는 (VI-A) 또는 이의 조합 또는 약학적으로 허용되는 이의 염의 이온화 가능한 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자 조성물은 지질 및 핵산을 포함하고, 지질 나노입자는 화학식 A, 화학식 A', 화학식 A'' 또는 화학식 B* 또는 이의 조합 또는 약학적으로 허용되는 이의 염의 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함하는 이온화 가능한 지질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 또한 치료 핵산을 세포로 전달하기 위한 지질 나노입자(LNP)의 조성물을 제공한다. 본 발명의 양상는 LNP 조성물이 다양한 이온화 양이온성 지질을 조성물 내 총 지질의 20mol% 미만의 특정 소량의 포스파티딜-L-세린(예를 들어, 조성물 내 총 지질의 2.5 내지 10mol%)은 놀랍게도 캡슐화된 핵산의 상당히 향상된 표적화를 입증했다.
일부 실시형태에서, LNP 조성물은: (a) 핵산, (b) 이온화 가능한 양이온성 지질, (c) 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체, 또는 베타-시토스테롤과 같은 피토스테롤), (d) 포스파티딜세린을 포함하는 인지질(예를 들어, 포스파티딜세린과 DSPC의 혼합물), 및 (e) 접합된 지질(예를 들어, PEG-DMG)을 포함한다. 한 양상에서, LNP 조성물은: (a) 핵산, (b) 이온화 가능한 양이온성 지질, (c) 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체, 또는 베타-시토스테롤과 같은 피토스테롤); (d) 조성물 내 총 지질의 1-10 mol%(예를 들어, 2.5-10 mol%, 3-9 mol%, 5.0-7.5 mol%)의 총량의 포스파티딜세린 지질을 포함하는 인지질, 및 추가적인 인지질 (예를 들어, DSPC), 및 (e) 접합된 지질(예를 들어, PEG-DMG)을 포함한다. 한 양상에서, LNP 조성물은: (a) 핵산, (b) 이온화 가능한 양이온성 지질, (c) 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체, 또는 베타-시토스테롤과 같은 피토스테롤); (d) 조성물 내 총 지질의 1-10 mol%(예를 들어, 2.5-10 mol%, 3-9 mol%, 5.0-7.5 mol%)의 총량의 포스파티딜세린 지질을 포함하는 인지질, 및 추가적인 인지질(예를 들어, DSPC), 및 (e) 조성물 내 총 지질의 0.5-4.5 mol%(예를 들어, 0.5-2.5 mol%, 1.5 mol%)의 총량의 접합된 지질(예를 들어, PEG-DMG)을 포함한다. 한 양상에서, LNP 조성물은: (a) 핵산, (b) 조성물 내 총 지질의 40-65 mol%(예를 들어, 50 mol%) 총량의 이온화 가능한 양이온성 지질, (c) 조성물 내 총 지질의 25-40 mol%(예를 들어, 38.5 mol%)의 총량의 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체, 또는 베타-시토스테롤과 같은 피토스테롤); (d) 조성물 내 총 지질의 1-10 mol%(예를 들어, 2.5-10 mol%, 3-9 mol%, 5.0-7.5 mol%) 총량의 포스파티딜세린 지질을 포함하는 인지질, 및 추가적인 인지질 (예를 들어, DSPC), 및 (e) 조성물 내 총 지질의 0.5-4.5 mol%(예를 들어, 0.5-2.5 mol%, 1.5 mol%) 총량의 접합된 지질(예를 들어, PEG-DMG)을 포함한다. 한 양상에서, LNP 조성물은: (a) 핵산, (b) 조성물 내 총 지질의 40-65 mol%(예를 들어, 50 mol%) 총량의 이온화 가능한 양이온성 지질, (c) 조성물 내 총 지질의 25-40 mol%(예를 들어, 38.5 mol%) 총량의 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체, 또는 베타-시토스테롤과 같은 피토스테롤); (d) 조성물 내 총 지질의 5-25 mol% 총량의 인지질(여기서 인지질은 조성물 내 총 지질의 1-10 mol%(예를 들어, 2.5-10 mol%, 3- 9 mol%, 5.0-7.5 mol%) 총량의 포스파티딜세린 지질, 및 추가적인 인지질(예: DSPC)(예: 조성물 내 총 지질의 10 mol%)을 포함함), 및 (e) 조성물 내 총 지질의 0.5-4.5 mol%(예를 들어, 0.5-2.5 mol%, 1.5 mol%) 총량의 접합된 지질(예: PEG-DMG)을 포함한다.
한 양상에서, LNP 조성물은: (a) 핵산, (b) 각각의 폴리엔 탄화수소 사슬 내 2개의 인접한 불포화 알키닐 이중 결합 사이에 불포화 선형 에틸렌, n-프로필렌 또는 n-부틸렌을 각각 포함하는 한 쌍의 선형 폴리엔 C16 또는 C18 탄화수소 사슬을 갖는 이온화 가능한 양이온성 지질(여기서 이온화 가능한 양이온성 지질은 조성물 내 총 지질의 40-65mol%의 총량으로 조성물에 존재함), (c) 조성물 내 총 지질의 25-40mol% 총량의 총 스테롤(예: 콜레스테롤); (d) 조성물 내 총 지질의 5-25 mol% 총량의 인지질(여기서 인지질은 조성물 내 총 지질의 1-10 mol% 총량의 포스파티딜세린 지질(예: 포스파티딜-L-세린 지질)을 포함함), 및 추가적인 인지질(예를 들어, 조성물 내 총 지질의 10mol% 총량의 DSPC), 및 (e) 조성물 내 총 지질의 0.5-2.5mol% 총량의 접합된 지질(예: PEG-DMG)을 포함한다. 한 양상에서, LNP 조성물은: (a) mRNA 핵산, (b) 조성물 내 총 지질의 40-65 mol% 총량의 화학식 (I-A), 화학식 (II-A) 또는 화학식 (II-B)의 이온화 가능한 양이온(여기서 v는 0), (c) 조성물 내 총 지질의 25-40mol% 총량의 콜레스테롤; (d) 조성물 내 총 지질의 1-10 mol%(예를 들어, 2.5-10 mol%, 3-9 mol%, 5.0-7.5 mol%) 총량의 L-세린 포스파티딜세린 지질(예를 들어, DPPS 또는 DSPS), 및 조성물 내 총 지질의 5-25 mol% 총량의 DSPC, 및 (e) 조성물 내 총 지질의 0.5-2.5 mol% 총량의 접합된 지질(예를 들어, PEG-DMG)을 포함한다. 한 양상에서, LNP 조성물은: (a) mRNA 핵산, (b) 조성물 내 총 지질의 40-65 mol% 총량의 화학식 (I-A)의 이온화 가능한 양이온(여기서 v는 0), (c) 조성물 내 총 지질의 25-40mol% 총량의 콜레스테롤; (d) 조성물 내 총 지질의 3-9 mol% 총량의 L-세린 포스파티딜세린 지질(예를 들어, DPPS 또는 DSPS), 및 조성물 내 총 지질의 5-25 mol% 총량의 DSPC, 및 (e) 조성물 내 총 지질의 0.5-2.5 mol% 총량의 접합된 지질(예를 들어, PEG-DMG)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은: (a) 다중불포화 이온화 가능한 양이온성 지질; 및 (b) 하전된 인지질 포스파티딜세린 지질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은: (a) 화학식 (IV-A)의 이온화 가능한 양이온성 지질; 및 (b) DSPS (L-이성질체), DPPS (L-이성질체), DMPS (L-이성질체), DOPS (L-이성질체), DSPS (D-이성질체), DSPG, DPPG, N-Glu-DSPE, 및 N-Suc-DSPE로 이루어진 군으로부터 선택된 음이온성 인지질 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은: (a) 화학식 (IV-A)의 이온화 가능한 양이온성 지질; 및 (b) 화학식 (V-A)의 음이온성 인지질 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은: (a) 화학식 (IV-A)의 이온화 가능한 양이온성 지질; 및 (b) DSPS(L-이성질체) 및 DPPS(L-이성질체)로 이루어진 군으로부터 선택되는 음이온성 인지질 표적화 모이어티를 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은: (a) 화학식 (IV)의 이온화 가능한 양이온성 지질; 및 (b) 화학식 (V-A)의 음이온성 인지질 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은: (a) 화학식 (IV)의 이온화 가능한 양이온성 지질; 및 (b) DSPS (L-이성질체), DPPS (L-이성질체), DMPS (L-이성질체), DOPS (L-이성질체), DSPS (D-이성질체), DSPG, DPPG, N-Glu-DSPE, 및 N-Suc-DSPE로 이루어진 군으로부터 선택되는 음이온성 인지질 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은: (a) 화학식 (IV)의 이온화 가능한 양이온성 지질; 및 (b) 화학식 (V-A)의 음이온성 인지질 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은: (a) 화학식 (IV-A)의 이온화 가능한 양이온성 지질; 및 (b) DSPS(L-이성질체) 및 DPPS(L-이성질체)로 이루어진 군으로부터 선택되는 음이온성 인지질 표적화 모이어티를 포함한다.
한 양상에서, LNP 조성물은: (a) mRNA 핵산, (b) AKG-KC2-OA, AKG-KC3-OA, Dlin-KC2-DMA 및 Dlin-KC3-DMA로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물 내 총 지질의 40-65mol% 총량의 이온화 가능한 양이온성 지질, (c) 조성물 내 총 지질의 25-40mol% 총량의 콜레스테롤(또는 이의 유도체); (d) 조성물 내 총 지질의 5-25 mol% 총량의 2개 이상의 인지질의 혼합물(여기서 인지질은 조성물 내 총 지질의 3-9 mol%(예를 들어, 5.0-7.5 mol%) 총량의 L-세린 포스파티딜세린 지질(예: DPPS 또는 DSPS)을 포함함), 및 (e) 조성물 내 총 지질의 0.5-2.5 mol% 총량의 접합된 지질(예를 들어, PEG-DMG)을 포함한다.
한 양상에서, 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물은 핵산, 이온화 가능한 양이온성 지질 AKG-UO-1, 및 LNP 조성물의 총 지질 함량 중 2.5-10 mol% 총량의 (L-세린) PS 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 mRNA이고, PS 지질은 (L-세린)DPS, (L-세린)DPPS, 또는 이들의 혼합물이고, LNP 조성물은 콜레스테롤 및 DSPC, DPPC 및 DOPC로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 인지질을 추가로 포함한다. LNP 조성물은 LNP 조성물 내 총 지질 함량을 기준으로 0.5-1.5mol% PEG-DMG 또는 PEG-DSG를 추가로 포함한다.
한 양상에서, 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물은 핵산, KC2OA, KC2, KC2-01, ALC-0315 및 SM102로부터 선택되는 이온화 가능한 양이온성 지질; 및 LNP 조성물의 총 지질 함량 중 2.5-10 mol% 총량의 (L-세린)PS 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 N/P 비율이 3 내지 8(예를 들어, 5-7 또는 5의 비율)이다.
한 양상에서, 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물은 핵산, AKG-UO-6 및 AKG-UO-7로부터 선택되는 이온화 가능한 양이온성 지질; 및 LNP 조성물의 총 지질 함량 중 2.5-10 mol% 총량의 (L-세린)PS 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, N/P 비율은 3 내지 8(예를 들어, 5-7 또는 5 또는 7의 비율)이다.
한 양상에서, 핵산 지질 나노입자(LNP) 백신 조성물은 N/P 비율이 3 내지 8인 mRNA 핵산; LNP 조성물 내 총 지질 함량의 40-65mol% 총량의 ALC-0315 이온화 가능한 양이온성 지질; LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-40 mol% 총량의 콜레스테롤; LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 (L-세린)PS 지질; LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 DSPC 인지질; 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 0-2.5mol% 총량의 PEG-DMG를 포함한다.
한 양상에서, 핵산 지질 나노입자(LNP) 백신 조성물은 N/P 비율이 3 내지 8인 mRNA 핵산; LNP 조성물 내 총 지질 함량의 40-65mol% 총량의 Dlin-KC2-DMA 이온화 가능한 양이온성 지질; LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-40 mol% 총량의 콜레스테롤; LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 (L-세린)PS 지질; LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 DSPC 인지질; 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 0-2.5mol% 총량의 PEG-DMG를 포함한다.
한 양상에서, 지질 나노입자(LNP) 백신 조성물은 N/P 비율이 3 내지 8인 mRNA 핵산; LNP 조성물 내 총 지질 함량의 40-65mol% 총량의 KC3-OA 이온화 가능한 양이온성 지질; LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-40 mol% 총량의 콜레스테롤; LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 (L-세린)PS 지질; LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 DSPC 인지질; 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 0-2.5mol% 총량의 PEG-DMG를 포함한다.
한 양상에서, 핵산 지질 나노입자(LNP) 백신 조성물은 N/P 비율이 3 내지 8인 mRNA 핵산; LNP 조성물 내 총 지질 함량의 40-65mol% 총량의 이온화 가능한 양이온성 지질; LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-40 mol% 총량의 콜레스테롤; LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 (L-세린)PS 지질; 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 DSPC 인지질; 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 0-2.5mol% 총량의 PEG-DMG를 포함한다.
본 발명의 한 양상은 LNP를 수지상 세포에 대해 표적화하기 위한 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 LNP 내 (L-세린)PS 지질의 용도에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, LNP는 mRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 콜레스테롤을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 ICL을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 DSPC를 포함하는 하나 이상의 추가 인지질을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 접합된 지질을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 N/P 비율이 3 내지 8인 mRNA 핵산; LNP 조성물 내 총 지질 함량의 40-65mol% 총량의 이온화 가능한 양이온성 지질(ICL); LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-40 mol% 총량의 콜레스테롤; LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 (L-세린)PS 지질; LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 DSPC 인지질; 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 0-2.5mol% 총량의 접합된 지질을 포함한다.
도 1은 특히 산화에 민감한 접합된 다중 불포화를 함유하는 리놀레산의 지질 에스테르의 산화적 분해 메커니즘의 묘사이다.
도 2는 Fab' 항체 단편의 환원된 c-말단 시스테인과 말레이미드 말단-폴리(에틸렌 글리콜) 2000 유도체화 디스테아로일포스파티딜에탄올아민의 반응을 나타낸다. R1과 R2는 스테아르산이다. 최종 항체 지질중합체 접합체는 지질 나노입자의 외부 지질층에 후속적으로 삽입되어 능동적으로 표적화되는 중간체이다.
도 3A. 이온화 가능한 양이온성 지질로서 DLin-KC2-DMA를 사용하여 제형화된 mCherry mRNA LNP를 사용한 수지상 세포(MutuDC1940)의 형질감염 효율에 대한 0-2.5mol%의 DSPS 포함의 영향. ICL은 50mol%, 콜레스테롤은 38.5mol%, PEG-DMG는 1.5mol%로 유지되었고 DSPS 함량은 다양했다. DSPS의 포함은 추가된 DSPS의 동일한 mol%만큼 DSPC 함량을 줄임으로써 이루어졌다. 세포를 24시간 동안 1ug mRNA/mL의 농도에서 각 제형과 함께 인큐베이션하였다. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다. Lipofect는 리포펙타민 처리 샘플을 지칭한다.
도 3B. 이온화 가능한 양이온성 지질로서 DLin-KC2-DMA를 사용하여 제형화된 mCherry mRNA LNP를 사용한 수지상 세포(MutuDC1940)의 형질감염 효율에 대한 0-7.5mol%의 DSPS 포함의 영향. ICL은 50mol%, 콜레스테롤은 38.5mol%, PEG-DMG는 1.5mol%로 유지되었고 DSPS 함량은 다양했다. DSPS의 포함은 추가된 DSPS의 동일한 mol%만큼 DSPC 함량을 줄임으로써 이루어졌다. 세포를 24시간 동안 1ug mRNA/mL의 농도에서 각 제형과 함께 인큐베이션하였다. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다. Lipofect는 리포펙타민 처리 샘플을 지칭한다.
도 3C. 이온화 가능한 양이온성 지질로서 DLin-KC2-DMA를 사용하여 제형화된 mCherry mRNA LNP를 사용한 수지상 세포(MutuDC1940)의 형질감염 효율에 대한 0-7.5mol%의 DSPS 포함의 영향. ICL은 50mol%, 콜레스테롤은 38.5mol%, PEG-DMG는 1.5mol%로 유지되었고 DSPS 함량은 다양했다. DSPS의 포함은 추가된 DSPS의 동일한 mol%만큼 DSPC 함량을 줄임으로써 이루어졌다. 세포를 24시간 동안 0.3ug mRNA/mL의 농도에서 각 제형과 함께 인큐베이션하였다. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다.
도 3D. 이온화 가능한 양이온성 지질로서 DLin-KC2-DMA를 사용하여 제형화된 mCherry mRNA LNP를 사용한 수지상 세포(MutuDC1940)의 형질감염 효율에 대한 0-7.5mol%의 DSPS 포함의 영향. ICL은 50mol%, 콜레스테롤은 38.5mol%, PEG-DMG는 1.5mol%로 유지되었고 DSPS 함량은 다양했다. DSPS는 추가된 동일한 DSPS mol%만큼 DSPC 함량을 감소시킴으로써 포함되었다. 세포는 0.1ug mRNA/mL의 농도에서 24시간 동안 각 제형과 함께 인큐베이션되었다. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다.
도 4. 다양한 ICL(KC2, KC2-OA, KC3-OA 및 SM-102) 및 5 mol% DSPS를 포함하는 LNP를 사용한 뮤린 수지상 세포(MutuDC1940)의 형질감염 및 DSPS 대신 Glu-DSPE 또는 Suc-DSPE를 사용한 LNP와의 비교. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다.
도 5. DSPS 또는 DPPS는 ICL을 포함하는 KC2, KC2-01, KC2-PA, KC3-01 및 KC3-OA의 mCherry LNP 형질감염을 증가시킨다. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다.
도 6A. 뮤린 수지상 세포 형질감염에서 LNP를 함유하는 AKG-UO-1과 다양한 화학적 형태의 포스파티딜세린의 비교. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다. Lipo는 제조업체의 지침에 따라 LNP와 동일한 용량 수준으로 사용되는 리포펙타민 메신저맥스(Lipofectamine MessengerMax, ThermoFisher)를 지칭한다.
도 6B. LNP를 포함하는 AKG-UO1을 사용하여 뮤린 수지상 세포를 형질감염시키는 데 있어 DSPS와 다른 음전하를 띤 인지질과의 비교. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다. Lipo는 제조업체의 지침에 따라 LNP와 동일한 용량 수준으로 사용되는 리포펙타민 메신저맥스(Lipofectamine MessengerMax, ThermoFisher)를 지칭한다.
도 7. LNP를 포함하는 AUG-UO-1에서 DSPS 농도가 수지상 세포의 형질감염에 미치는 영향. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다.
도 8. 5 mol% DSPS가 있거나 없는 LNP를 함유하는 AUG-UO-1에서 PEG-DMG 농도의 수지상 세포의 형질감염에 대한 영향. Y축은 조성물에 사용된 % PEG를 세포에 첨가된 mRNA의 농도(0.11, 0.33 또는 1μg/mL)에 따라 나타낸다. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다.
도 9A. 2개의 올레핀(KC2, KC3 및 O-11769) 사이에 단일 메틸렌이 있는 ICL과 2개의 올레핀(KC2-01, KC3-01 및 UO-1) 사이에 4개의 메틸렌이 있는 ICL의 지질 현탁액의 산화적 분해.
도 9B. UO-1을 포함하는 2개의 올레핀 사이에 단일 메틸렌이 있는 ICL인 O-11769를 포함하는 리포좀 및, 2개의 올레핀 사이에 4개의 메틸렌이 있는 ICL인 UO-1을 포함하는 리포좀의 산화적 분해.
도 10A. 뮤린 수지상 세포에서 1 μg/ml의 LNP를 포함하는 KC2-01의 mCherry 발현에 대한 N/P의 효과. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다.
도 10B. 뮤린 수지상 세포에서 0.33 μg/ml의 LNP를 포함하는 KC2-01의 mCherry 발현에 대한 N/P의 효과. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다.
도 11. DSPS(7.5 mol%)를 포함하거나 포함하지 않고 다양한 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함하는 LNP의 형질감염 효율. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다.
도 12. 마우스 수지상 세포에서 다양한 농도의 DOPS(총 지질의 %로서 0, 10 및 25mol%) 및 mCherry mRNA를 포함하는 LNP 제형의 형질감염 효율.
도 13A. SARS-COV2 스파이크 단백질 생성 서열인 VRN-029의 mRNA 서열.
도 13B. LNP 백신 면역원성에 대한 PEG-DMG(C14) 농도(mol%)의 효과. PEG-DMG의 mol%를 증가시키면서 7.5% DSPS 및 이온화 가능한 지질 UO1을 사용한 mRNA-LNP로 면역화된 마우스로부터의 총 항-스파이크 항체 역가 및 CD4 반응. 중간 그래프는 34일차 종점 항체 역가를 보여준다. 오른쪽 그래프는 해당 CD4 T 세포 반응을 보여준다.
도 13C. LNP 백신 면역원성에 대한 PEG-DPPE(C16) 농도(mol%)의 효과. PEG-DPPE의 mol%를 증가시키면서 7.5% DSPS 및 이온화 가능한 지질 UO1을 사용한 mRNA-LNP로 면역화된 마우스로부터의 총 항-스파이크 항체 역가. 중간 그래프는 34일차 종점 항체 역가를 보여준다. PEG-DPPE의 mol%는 항체 수준에 역으로 영향을 미쳤다. 오른쪽 그래프는 해당 CD4 T 세포 반응을 보여준다.
도 13D. 1.5 mol% PEG-DMG(14C) 또는 PEG-DSG(18C)와 함께 7.5% DSPS 및 이온화 가능한 지질 KC2OA를 사용한 mRNA-LNP로 면역화된 마우스로부터의 총 항-스파이크 항체 역가 및 CD4 반응. 왼쪽 그래프는 34일차 종점 항체 역가를 보여준다. 오른쪽 그래프는 해당 CD4 T 세포 반응을 보여준다.
도 13E. 1.5 mol% PEG-DMG(14C) 또는 PEG-DSG(18C)와 함께 7.5% DSPS 및 이온화 가능한 지질 UO1을 사용한 mRNA-LNP로 면역화된 마우스로부터의 총 항-스파이크 항체 역가 및 CD4 반응. 왼쪽 그래프는 34일차 종점 항체 역가를 보여준다. 오른쪽 그래프는 해당 CD4 T 세포 반응을 보여준다.
도 13F. mRNA-LNP 면역원성에서 포스파티딜세린 포함의 효과. 다양한 이온화 가능한 지질 및 PEG-지질 +/- 7.5 mol% DSPS 항체 데이터를 사용하여 mRNA-LNP로 면역화된 마우스로부터 총 항-스파이크 항체 역가(A) 및 스파이크 특이적 CD4 T 세포 반응을 로그 변환하고 Sidak의 다중 비교 검정과 함께 이원 ANOVA를 사용하여 분석하였다. CD4 T 세포 데이터는 Sidak의 다중 비교 검정과 함께 REML 혼합 효과 모델을 사용하여 분석되었다.
도 13G. B(패널 A) 및 T 세포(패널 B) 반응의 mRNA-LNP 프라이밍에 대한 포스파티딜세린 지질 테일(DPPS 대 DSPS) 조성의 효과. 항체 데이터는 분석 전에 로그 변환되었다. Tukey의 다중 비교 검정과 함께 일원 ANOVA를 사용하여 데이터를 분석했다.
도 14A. 24시간 동안 1 μg/mL mRNA에서 KC2-01 LNP, 7.5 mol% DSPS(D 이성질체) 및 DSPS(L 이성질체)의 mCherry 발현 비교.
도 14B. 24시간 동안 0.33 μg/mL mRNA에서 KC2-01 LNP, 7.5 mol% DSPS(D 이성질체) 및 DSPS(L 이성질체)의 mCherry 발현 비교.
도 15. 24시간 동안 1 μg/mL mRNA에서 SM-102 또는 ALC-0315와 함께 제조된 LNP에 대한, 5 및 7.5 mol% DSPS(L-이성질체) 포함 KC2 LNP의 mCherry 발현 비교. Y축은 평균 형광 강도(MFI)이다. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다.
도 16. 24시간 동안 1μg/mL mRNA에서 UO1, UO6 및 UO7 제형 단독 또는 7.5mol% D-이성질체 DSPS를 첨가한 이들 제형의 mCherry 발현 비교. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다.
도 17. 24시간 동안 1μg/mL mRNA에서 UO1, SM102, ALC-0315 제형 단독 또는 DSPS를 첨가한 이들 제형의 mCherry 발현 비교. Lipo는 제조업체의 지침에 따라 LNP와 동일한 용량 수준으로 사용되는 리포펙타민 메신저맥스(Lipofectamine MessengerMax, ThermoFisher)를 지칭한다. UT 샘플은 LNP가 추가되지 않은 세포들에 해당한다.
상세한 설명
전술한 일반적인 설명 및 하기 상세한 설명 모두는 단지 청구범위의 예시 및 설명을 위한 것이며 본 발명의 조성물 및 방법을 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
안정화된 핵산 지질 입자(SNALP)는 mRNA 또는 기타 핵산 치료제의 전신 전달을 위한 비히클로 사용된다. SNALP 조성물은 단일 메틸렌 기(예: 리놀레산)에 의해 분리된 한 쌍의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 한 쌍의 선형 18 탄소 지방족 사슬에 결합된 양성자화 가능한 3차 아민 헤드 기를 포함하는, MC3 또는 KC2와 같은 양이온성 지질을 포함한다. 그러나, 각각 단일 메틸렌 기에 의해 분리된 한 쌍의 이중 결합을 포함하는 이들 탄화수소 사슬의 구조가 SNALP 조성물에 바람직한 생물학적 특성을 부여하는 반면, 이러한 화학적 하위 구조는 또한 산화적 분해에 대한 화합물의 민감도 증가라는 바람직하지 않은 문제를 가져온다. 에를 들어, 도 1은 특히 산화에 민감한, 접합된 다중 불포화를 함유하는 리놀레산의 지질 에스테르의 산화적 분해 메커니즘을 도시한다. 필요한 것은 SNALP 조성물에 사용하기에 적합하지만 산화적 분해에 대한 향상된 내성을 갖는 신규한 양이온성 지질이다.
박테리아 감염의 치료와 관련된 화합물, 조성물 및 방법이 본원에 개시된다. 본원에서 사용되는 용어 “화합물”, “약물” 및 “활성제”는 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 일부 양상은 신규한 이온화 가능한 지질 또는 생체환원성 이온화 가능한 지질에 관한 것이다. 이들 지질은 세포에 의한 세포내이입 또는 식균작용 후에 세포내에서 발생하는 것과 같이 산성 pH에서 양이온성이다(즉, 양전하를 띤다). 동일한 지질 및 이를 함유하는 조성물은 pH 7.4에서 존재할 때 거의 중성에 가깝다. 이들 지질은 또한 이들의 알킬 또는 아실 기에 존재하는 적어도 2개의 메틸렌 기에 의해 분리된 다중 올레핀을 가질 수 있다.
본 발명의 일부 양상은 신규한 이온화 가능한 지질의 합성 방법에 관한 것이다.
다른 양상은 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함하는 지질 나노입자를 포함하는 조성물에 관한 것이며, 지질 나노입자는 핵산을 함유한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 지질 나노입자 내부에 캡슐화된다.
본 발명의 다른 양상은 감염성 질환 또는 암의 예방을 위한 백신에서 이러한 이온화 가능한 지질 또는 이온화가능 지질을 포함하는 지질 나노입자 조성물의 용도에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 감염성 질환은 박테리아 또는 바이러스 감염일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물은 결핵, HIV/AIDS, 말라리아, 또는 COVID-19와 같은 코로나바이러스 관련 감염과 관련된 감염을 예방하기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 감염은 인플루엔자, B형 간염, C형 간염, 뎅기열, 인유두종바이러스(HPV), 노로바이러스, 볼거리, 홍역, 수막구균성 질환, 폐렴구균성 질환, 소아마비, 로토바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 풍진, 대상포진/대상 포진 바이러스, 파상풍 또는 백일해이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 화합물 및 조성물은 조직 대식세포 및 수지상 세포를 포함하는 표적 세포의 효율적인 흡수 및 형질감염을 촉진할 수 있다. 감염성 바이러스 또는 박테리아에 특이적인 항원을 코딩하는 효율적인 전달 핵산 및 후속하여 해당 항원을 제시하여 원하는 면역 반응을 유도하고 해당 감염으로부터 보호하는 것이 그 결과이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 SARS-CoV, MERS-CoV 또는 SARS-CoV-2와 같은 코로나바이러스의 에피토프를 인코딩하는 합성 핵산(예를 들어, 조작된 코돈 최적화 mRNA)일 수 있다. 일부 실시형태에서 핵산은 S-단백질(스파이크 단백질) 또는 SARS-CoV, MERS-CoV 또는 SARS-CoV-2와 같은 코로나바이러스의 단편을 인코딩하는 합성 핵산(예: 조작된 코돈 최적화 mRNA)일 수 있다.
정의
편의상, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 특정 용어들을 여기에 모아 설명한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 해당 분야의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 가진다.
본원에서 사용된 다음 용어 및 어구들은 다음과 같은 의미를 갖는다.
관사 “a” 및 “an”은 본원에서 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 둘 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하는 데 사용된다. 예로서, “요소”는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 “포함하는” 또는 “포함하다”는 주어진 실시형태에 제공되는 조성물, 방법 및 이들의 각각의 구성요소(들)와 관련하여 사용되지만 불특정 요소를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 “~으로 본질적으로 구성되는”은 주어진 실시형태에 필요한 요소들을 지칭한다. 이 용어는 본 발명의 실시형태들의 기본적이고 신규한 또는 기능적 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가 요소의 존재를 허용한다.
“~으로 구성된”이라는 용어는 본원에 기재된 조성물, 방법 및 이들의 각각의 구성요소를 지칭하며, 실시형태의 설명에서 인용되지 않은 임의의 요소를 제외시킨다.
본원에서 사용되는 “포함하는”이라는 용어는 “구성되는” 및 “본질적으로 구성되는”을 포함한다.
상세한 설명에서 “위에서 언급한 바와 같이” 또는 “위에서 언급한”, “상기”로 언급되는 경우, 이는 이전 페이지의 명세서에 개시된 임의의 내용을 지칭한다.
상세한 설명에서 “본원에 언급된”, “본원에 설명된”, “본원에 제공된” 또는 “본 문단에서 언급된” 또는 “본원에 설명된”으로 언급되는 경우, 이전 또는 이후 페이지의 명세서에 개시된 임의의 내용을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 “약”은 명시된 값의 20% 이내, 10% 이내 및 5% 이내의 허용 가능한 변화를 의미한다. 특정 실시형태에서, “약”은 +/- 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10% 또는 20%의 변화를 의미할 수 있다.
화합물 또는 조성물과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 “유효량”은 살균 또는 정균 효과를 유발하기에 충분한 활성 화합물(또한 본원에서 활성제 또는 약물로 지칭됨)의 양을 의미한다. 한 실시형태에서, 유효량은 치료되는 세균 감염의 증상을 완화하기에 충분한 활성 화합물의 양을 의미하는 “치료적 유효량”이다.
본원에서 사용되는 용어 “대상체”(또는 대안적으로 “환자”)는 예방적 또는 치료적 치료를 받는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 “투여” 또는 “투여하는 것”은 경구, 정맥내, 근육내, 복강내, 피하, 경피, 흡입, 협측, 안구, 설하, 질, 직장 등을 비롯하여, 치료를 필요로 하는 대상체에 화합물 또는 약학 조성물을 투여하는 모든 수단을 포함한다. 화합물 또는 조성물의 투여는 적합하게는 비경구이다. 예를 들어, 화합물 또는 조성물은 바람직하게는 정맥내 투여될 수 있지만, 마이코박테리움 아비움(mycobacterium avium)의 치료에서 리포솜 아미카신에 대해 임상에서 현재 사용되는 것과 같이 복강내 또는 흡입을 통해 투여될 수도 있다(Shirley 외, Amikacin Liposome Inhalation Suspension: A Review in Mycobacterium avium Complex Lung Disease. Drugs. 2019 Apr; 79(5):555-562 참조)
본원에서 사용되는 용어 “치료하다”, “치료하는 것” 및 “치료”는 본원에 기재된 것과 같은 치료적 또는 예방적 조치를 지칭한다.
용어 “약학적으로 허용되는 염”은 그 염이 원하는 약리 활성을 갖는 상대적으로 무독성인 본 발명의 화합물의 무기 또는 유기 산 부가염을 지칭한다.
용어 “알킬”은 탄소 사슬이 달리 정의되지 않는 한, 선형 또는 분지형 또는 이들의 조합일 수 있는 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 포화된 탄소 사슬을 의미한다. 알킬 기의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, sec- 및 tert-부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸 등을 포함한다.명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 알킬 기는 선택적으로 치환된다.
임의의 아실 사슬 조성을 갖는 “포스파티딜세린”이라는 용어는 특정 실시예에서 명시되지 않는 한 헤드 기에서 세린의 L-이성질체를 지칭한다.
용어 “지질 접합체”는 지질 입자의 응집을 억제하는 접합된 지질을 지칭한다. 이러한 지질 접합체는 폴리사르코신(예를 들어 WO2021191265A1 참조, 이는 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참고로 포함됨), 폴리아미드 올리고머(예를 들어, ATTA-지질 접합체), PEG-지질 접합체, 예컨대, 디알킬옥시프로필에 커플링된 PEG, 디아실글리세롤에 커플링된 PEG, 콜레스테롤에 커플링된 PEG, 포스파티딜에탄올아민에 커플링된 PEG, 세라마이드에 커플링된 PEG(예를 들어, 미국 특허 제 5,885,613 참조, 이의 개시 내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨), 양이온성 PEG 지질 및 이들의 혼합물을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. PEG는 지질에 직접 접합되거나 링커 모이어티를 통해 지질에 연결될 수 있다. 예를 들어, 비-에스테르 함유 링커 모이어티 및 에스테르-함유 링커 모이어티를 비롯하여 PEG를 지질에 커플링시키기에 적합한 임의의 링커 모이어티가 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 비-에스테르 함유 링커 모이어티가 사용된다.
이온화 가능한 양이온성 지질에 대한 약어는 표에 사용된 것으로부터 실시예에서 생략될 수 있는데, 예를 들어, AKG-UO-1 또는 AKG-KC2-01은 UO1 또는 KC2-01로 지칭될 수 있다.
다양한 연구에서 사용되는 약어 UT는 처리되지 않은 샘플을 지칭한다.
“지질 나노입자” 또는 “LNP”라는 용어는 직경이 약 5 내지 500nm인 입자를 의미한다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 하나 이상의 활성제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 나노입자의 내부에서 양이온성 지질, 중합체 또는 다가 소분자 및 생물학적 환경과 상호작용하는 외부 지질 코트와 함께 응축된다. 인산기 사이의 반발력으로 인해 핵산은 본질적으로 딱딱한 중합체이며 길쭉한 구조를 선호한다. 세포에서, 부피 제약에 대처하기 위해 DNA는 이온 및 기타 분자의 도움을 받아 적절한 용액 조건에서 스스로를 패킹할 수 있다. 일반적으로 DNA 응축은 확장된 DNA 사슬이 하나 또는 몇 개의 분자만 포함하는 치밀하고 규칙적인 입자로 붕괴되는 것으로 정의된다. 인산염 기에 결합함으로써 양이온성 지질은 인산염 전하를 중화하여 DNA를 응축시키고 밀집 패킹을 허용한다.
일부 실시형태에서, 활성제는 LNP로 캡슐화된다. 일부 실시형태에서, 활성제는 음이온성 화합물, 예를 들어, DNA, RNA, 천연 및 합성 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드, 간섭 RNA 및 짧은 간섭 RNA 포함), 핵단백질, 펩티드, 핵산, 리보자임, DNA 함유 핵단백질, 예를 들어, 온전하거나 부분적으로 단백질이 제거된 바이러스 입자(비리온), DNA 이외의 올리고머 및 중합체 음이온 화합물(예: 산성 다당류 및 당단백질)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 활성제는 보조제와 혼합될 수 있다.
LNP 백신 제품에서, 활성제는 일반적으로 LNP 내부에 포함된다. 일부 실시형태에서, 활성제는 핵산을 포함한다. 전형적으로, 수용성 핵산은 입자의 내부에서 양이온성 지질 또는 다가양이온성 중합체와 함께 축합되고 입자의 표면은 중성 지질 또는 PEG-지질 유도체가 풍부하다. 추가적인 이온화 가능한 양이온성 지질 또한 표면에 있을 수 있으며 양전하를 띠고 엔도좀 탈출을 촉진함으로써 환경의 산성화에 반응할 수 있다.
이온화 가능한 지질은 LNP와 관련하여 상이한 특성 또는 기능을 가질 수 있다. 아미노 기의 pKa로 인해, 지질 분자는 산성 조건에서 양전하를 띨 수 있다. 이러한 조건 하에서, 지질 분자는 LNP의 형성 및 핵산의 포획을 허용하는 핵산의 인산염 기에 정전기적으로 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, pKa는 생리학적 pH 값인 혈액과 같은 생물학적 유체에서 LNP의 표면 전하가 실질적으로 중성이 되도록 충분히 낮을 수 있다. 높은 LNP 표면 전하는 독성, 순환계로부터 고정 및 자유 대식세포에 의한 빠른 제거, 면역 활성화를 포함한 용혈성 독성과 관련이 있다(Filion et al Biochim Biophys Acta. 1997 Oct 23;1329(2):345-56).
일부 실시형태에서, pKa는 이온화 가능한 양이온성 지질이 산성 엔도솜 pH 값에서 양전하 형태를 채택할 수 있을 정도로 충분히 높을 수 있다. 이러한 방식으로 양이온성 지질은 내인성 엔도좀 음이온성 지질과 결합하여 육각형 HII 상과 같은 막 용해성 비이중층 구조를 촉진시켜 보다 효율적인 세포내 전달을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, pKa는 6.2-6.5 범위이다. 예를 들어, pKa는 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5일 수 있다. 불포화 테일은 또한 비이중층 구조를 채택하는 지질의 능력에 기여한다. (Jayaraman 외, Angew Chem Int Ed Engl. 2012 Aug 20;51(34):8529-33).
리포좀 제거 및 순환 반감기와 같은 기타 특성들 중에서 LNP 제형으로부터 핵산의 방출은 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤) 또는 LNP의 다른 잠재적 첨가제의 존재 및 상기 제형의 일부로서 포함된 이온화 가능한 양이온성 지질의 pKa를 포함한 전체 화학 구조에 의해 변경될 수 있다.
용어 “생체환원성”은 환원성 환경에서 다이설파이드 결합의 절단으로 인해 가속화된 분해를 거치는 화합물을 지칭한다. siRNA와 같은 다른 핵산 치료제와 달리, mRNA 기반 치료법의 성공은 mRNA를 캡슐화하는 안전하고 효율적인 전달 비히클의 이용가능성에 달려 있다. mRNA는 깨지기 쉽고 표적 부위에 도달할 때까지 활성 상태를 유지하려면 보호 코팅이 필요하다. LNP를 함유하는 mRNA는 Covd-19 면역을 위한 유망한 백신 옵션이다(Jackson 외, Preliminary Report. N Engl J Med. 2020 Nov 12;383(20):1920-1931). LNP의 효율성 및 내약성은 아미노 지질에 기인하며 몇 주 또는 몇 개월의 필요한 서비스 수명을 가질 수 있는 많은 생체 재료 응용 분야와 달리 mRNA의 기능적 LNP 매개 전달은 몇 시간 내에 발생하여 지속적인 지질의 필요성을 제거한다. 실제로 만성 투여가 필요한 응용 분야에서는 이것이 특히 중요할 것이다. LNP는 엔도사이토시스를 통해 세포에 들어가 엔도리소좀 구획에 축적된다는 것이 입증되었다. 이온화 가능한 양이온성 지질(ICL)은 리파아제에 의한 후기 엔도좀/리소좀의 효소적 가수분해 또는 완전한 생분해를 가능하게 하는 리소좀의 환원 환경에 의해 촉발된 가수분해에 민감하면서 엔도사이토시스 후 세포질에 mRNA를 효과적으로 전달할 수 있다. 세포외 공간은 상대적으로 산화 환경인 반면, 세포내 공간은 환원성 환경으로, 다이설파이드 연결된 분자로 하여금 세포외 공간에서는 온전하게 남아있지만 일단 내재화되면 급속히 감소되게 한다(Huang 외, Mol Ther. 2005 Mar;11(3):409-17, 2005). 일부 실시형태는 LNP 제형에서 안정하고 순환계에 있지만 리소좀의 환원성 환경에서 절단되는 생체환원성 다이설파이드 연결된 ICL 분자(화합물 29-36, 표 2 참조)를 제공한다. 이러한 화합물 및 조성물은 지질의 신속한 생물학적 파괴를 촉진할 수 있고 ICL 지질의 잠재적 독성 축적을 방지할 수 있다(DLin-MC3-DMA를 보유한 래트에서 관찰됨(Sabins 외, Mol Ther. 2018 Jun 6;26(6): 1509-1519).
본원에서 사용되는 용어 “캡슐화” 및 “포획된”은 지질 나노입자 내부에 또는 이를 이용한 mRNA, DNA, siRNA 또는 다른 핵산 약제의 포함 또는 회합을 지칭한다. 본원에서 사용되는 “캡슐화된”이라는 용어는 완전한 캡슐화 또는 부분적인 캡슐화를 의미한다. siRNA는 관심 유전자의 발현을 선택적으로 녹다운 또는 하향조절할 수 있다. 예를 들어, siRNA는 siRNA를 포함하는 나노입자 조성물을 필요로 하는 대상체에게 투여시 특정 질환, 장애 또는 병태와 관련된 유전자를 침묵시키기 위해 선택될 수 있다. siRNA는 관심 유전자 또는 단백질을 인코딩하는 mRNA 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
콜레스테롤에 관한 용어 “mol%”는 콜레스테롤 및 비페길화된 인지질의 몰량의 합에 대한 콜레스테롤의 몰량을 백분율 포인트로 표현한 것을 의미한다. 예를 들어, 콜레스테롤 및 HSPC를 함유하는 리포좀에서 “55mol% 콜레스테롤”은 45몰 부의 HSPC 당 55몰 부의 콜레스테롤의 조성을 의미한다.
PEG-지질과 관련하여 용어 “mol%”는 PEG-지질 및 비페길화 인지질의 몰량의 비율을 백분율 포인트로 표현한 것을 의미한다. 예를 들어, HSPC 및 PEG-DSPE를 함유하는 LNP에서 “5 mol% PEG-DSPE”는 100몰 부의 HSPC 당 5 몰 부의 PEG-DSPE를 갖는 조성을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 “약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제”에는, 제한 없이, 인간 또는 가축에서의 사용에 대하여 허용되는 것으로 미국 식품의약국이 승인한, 임의의 보강제, 담체, 부형제, 유동화제, 감미제, 희석제, 보존제, 염료/착색제, 향 증진제, 계면활성제, 습윤화제, 분산제, 현탁화제, 안정화제, 등장화제, 용매, 또는 유화제가 포함된다.
다양한 양상 및 실시예는 다음 하위 섹션에서 더 자세히 설명된다.
화합물
결핵을 포함하는 감염성 질병의 치료 또는 예방을 위한 화합물, 조성물 및 방법이 본원에서 제공된다. 본 발명의 양상에 따르면, 양이온성 지질은 화학식 I, II, III 또는 IV를 갖는 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함한다. 본 발명의 양상에 따르면, 이온화 가능한 양이온성 지질은 화학식 IV, 화학식 IV-A, 화학식 A, 화학식 A', 화학식 A'', 화학식 A''', 및/또는 화학식 B로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화학적 하위 구조를 갖는 화합물을 포함한다. 본 발명의 일부 양상에서, 이온화 가능한 양이온성 지질은 화학식 I, 화학식 I-A', 화학식 I-A'', 화학식 II, 화학식 II-A, 화학식 II-A', 화학식 II-B, 화학식 II-B', 화학식 III 또는 화학식 III-A 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 갖는 화합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 양상에서, LNP는 화학식 V 또는 화학식 V-A를 갖는 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 양상에서, LNP는 화학식 VI 또는 화학식 VI-A를 갖는 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 양상에서, LNP는 화학식 VII을 갖는 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 양상에서, LNP는 화학식 VIII을 갖는 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함할 수 있다. 본 발명의 양상에 따르면, 양이온성 지질은 (a) 화학식 I, 화학식 IA, 화학식 I-A', 화학식 I-A'', 화학식 II, 화학식 II-A, 화학식 II-A', 화학식 II-B, 화학식 II-B', 화학식 III 또는 화학식 III-A의 화합물로부터 선택되는 이온화 가능한 양이온성 지질, 또는 화학식 VI-A의 스테롤 지질, 또는 화학식 VIII의 분지형 지질, 및 (b) 화학식 VI의 스테롤을 갖는 화합물, 및 선택적으로 (c) 화학식 VII의 알킬렌 글리콜 지질을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 화학식 V 또는 화학식 V-A의 인지질을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 표 3의 음이온성 인지질 표적화 모이어티를 추가로 포함한다.
또한 결핵을 포함하는 감염성 질병의 치료 또는 예방을 위한 화합물, 조성물 및 방법이 본원에서 제공된다. 본 발명의 양상에 따르면, 양이온성 지질은 화학식 A를 갖는 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함한다. 일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 화학식 II, II, III 또는 IV에서와 같은 2개의 지방 아실기를 갖는다.
백신 제조에 유용한 화학식 I, 화학식 II, 화학식 III, 화학식 IV의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염이 본원에 개시된다. 또한 화학식 I, 화학식 II, 화학식 III, 화학식 IV의 양이온성 지질 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 조성물이 본원에 개시된다. 일부 실시형태에서, 백신은 마이코박테리움 감염을 예방하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 백신은 결핵, 비결핵성 마이코박테리아(NTM), 비결핵성 폐 질환, 나병, 마이코박테리움 아비움-인트라셀룰라레, 마이코박테리움 칸사시, 마이코박테리움 마리넘, 마이코박테리움 울세란스, 마이코박테리움 첼로나에, 마이코박테리움 포르투이툼, 마이코박테리움 압세수스 및 기타의 감염성 질환, 예를 들어, 코로나바이러스(COVID-19, SARS CoV2, SARS-CoV, MERS-CoV), 디프테리아, 에볼라, 독감(인플루엔자), 간염, Hib 질병, HIV/AIDS, HPV(인유두종바이러스), 말라리아, 홍역, 수막구균성 질병, 유행성이하선염, 노로바이러스, 흑사병, 폐렴구균성 질병, 소아마비, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 로타바이러스, 풍진(독일 홍역), 슁글스(대상포진), 파상풍(Lockjaw), 백일해(퍼투시스) 및 지카의 예방을 위해 사용될 수 있다.
결핵을 포함하는 감염성 질병의 치료 또는 예방을 위한 화합물, 조성물 및 방법이 본원에서 제공된다. 본 발명의 양상에 따르면, 양이온성 지질은 화학식 I, II, III 또는 IV를 갖는 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함한다. 일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 화학식 II, II, III 또는 IV에서와 같은 2개의 지방 아실기를 갖는다.
본 발명의 한 양상은 화학식 A의 하나 이상의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함하는 지질을 제공하고:
화학식 A.
여기서 a는 1, 2, 3 또는 4이고; b는 2, 3 또는 4이고; c는 3, 4, 5, 6 또는 7이다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 지질은 b가 4인 2개의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 지질은 a, b 및 c의 합이 10, 11, 12 또는 13인, 화학식 A의 2개의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 지질은 a가 4이고; b는 4이고; c는 4 또는 5인 화학식 A의 2개의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 지질은 a가 1, 2 또는 3이고; b가 4이고; c가 3, 4, 5, 6 또는 7인 화학식 A의 2개의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 지질은 a가 5 또는 6이고; b가 2, 3, 또는 4이고; c가 6, 4, 5, 6 또는 7인 화학식 A의 2개의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 지질은 a, b 및 c의 합이 10, 11, 12 또는 13인, 화학식 A의 2개의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 지질은 a, b 및 c의 합이 12인, 화학식 A의 2개의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 지질은 b가 2이고 a, b 및 c의 합이 12인, 화학식 A의 2개의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 지질은 b가 3이고 a, b 및 c의 합이 12인, 화학식 A의 2개의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 지질은 b가 4이고 a, b 및 c의 합이 12인, 화학식 A의 2개의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 A의 2개의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 양상은 화학식 A의 하나 이상의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함하는 지질을 제공하고:
화학식 A'.
여기서 a는 1, 2, 또는 3이고; b는 2, 3 또는 4이고; c는 3, 4, 5, 6 또는 7이다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 지질은 b가 4인 2개의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 지질은 a, b 및 c의 합이 10, 11, 12 또는 13인, 화학식 A'의 2개의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 양상은 화학식 A'':
화학식 A**
의 하나 이상의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함하는 지질을 제공하고:
여기서 a는 4이고; b는 4이고; c는 4 또는 5이다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 지질은 a, b 및 c의 합이 12인, 화학식 A**의 2개의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 양상은 화학식 A''':
화학식 A'''
의 하나 이상의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함하는 지질을 제공하고:
여기서 a는 5 또는 6이고; b는 2, 3 또는 4이고; c는 3, 4, 5, 6 또는 7이다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 지질은 a, b 및 c의 합이 10, 11, 12 또는 13인, 화학식 A'''의 2개의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 지질은 a, b 및 c의 합이 12인, 화학식 A'''의 2개의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 지질은 b가 2이고 a, b 및 c의 합이 12인, 화학식 A'''의 2개의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 지질은 b가 3이고 a, b 및 c의 합이 12인, 화학식 A'''의 2개의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 지질은 b가 4이고 a, b 및 c의 합이 12인, 화학식 A'''의 2개의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 A'''의 2개의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 양상은 화학식 B의 하나 이상의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함하는 지질을 제공하고:
화학식 B
여기서 a는 5, 6 또는 7이고; c는 3, 4 또는 5이다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 지질은 b가 4인 2개의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 지질은 a와 c의 합이 9, 10 또는 11인 화학식 B의 2개의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식(IV-A)의 화학 구조를 포함한다:
(IV-A),
또는 약학적으로 허용되는 이의 염일 수 있으며, 여기서
Y는 , , , , 또는 이고;
n은 정수 2, 3 또는 4이고;
R22는 화학식 A, 화학식 A', 화학식 A'', 또는 화학식 A''' 또는 화학식 B의 폴리엔 탄화수소 사슬이고; 그리고
R10및 R12 각각은 독립적으로 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이다.
일부 양상에서, 화학식 (IV-A)의 R22는 화학식 A의 폴리엔 탄화수소 사슬이다. 일부 양상에서, 화학식 (IV-A)의 R22는 화학식 A'의 폴리엔 탄화수소 사슬이다. 일부 양상에서, 화학식 (IV-A)의 R22는 화학식 A''의 폴리엔 탄화수소 사슬이다. 일부 양상에서, 화학식 (IV-A)의 R22는 화학식 A'''의 폴리엔 탄화수소 사슬이다. 일부 양상에서, 화학식 (IV-A)의 R22는 화학식 B의 폴리엔 탄화수소 사슬이다.
일부 양상에서, 화학식 (IV-A)에서 R10 및 R12는 각각 독립적으로 메틸, 에틸, 프로필, -(CH2)(CH2)OH, 및 -(CH2)2(CH2)OH로부터 선택된다. 일부 양상에서, 화학식 (IV-A)에서 R10 및 R12는 각각 독립적으로 메틸이다. 일부 양상에서, 화학식 (IV-A)에서 R10 및 R12는 각각 독립적으로 에틸이다. 일부 양상에서, 화학식 (IV-A)에서 R10 및 R12 중 적어도 하나는 하이드록실로 선택적으로 치환된 n-프로필이다. 일부 양상에서, 화학식 (IV-A)에서 R10은 메틸이고 R12는 메틸, 에틸, -(CH2)(CH2)OH, 및 -(CH2)2(CH2)OH로부터 선택된다. 일부 양상에서, 화학식 (IV-A)에서 R10은 메틸이고 R12는 -(CH2)(CH2)OH, 및 -(CH2)2(CH2)OH로부터 선택된다. 일부 양상에서, 화학식(IV-A)의 화학 구조를 포함하는 화합물에서 R10은 메틸이고 R12는 -(CH2)(CH2)OH, 및 -(CH2)2(CH2)OH로부터 선택된다. 일부 양상에서, 화학식 (IV-A)에서 R10 및 R12는 하나 이상의 하이드록실로 선택적으로 치환 메틸 또는 에틸로부터 독립적으로 선택된다. 일부 양상에서, 화학식 (IV-A)에서 R10 및 R12 중 하나 또는 둘 모두는 화학식 (IV-A)에서 -(CH2)(CH2)OH, 또는 -(CH2)2(CH2)OH이다. 일부 양상에서, 화학식 (IV-A)에서 R10은 메틸이고 R12는 하이드록실로 치환된 메틸 또는 에틸이다. 일부 양상에서, 화학식 (IV-A)에서 R10 중 하나 또는 둘 모두는 메틸이고 화학식 (IV-A)에서 R12는 -(CH2)(CH2)OH이다. 일부 양상에서, 화학식 (IV-A)에서 R10 중 하나 또는 둘 모두는 메틸이고 화학식 (IV-A)에서 R12는 -(CH2)2(CH2)OH이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (IV-A)의 Y 부분에 공유 결합된 하나 이상의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함하며, 여기서 Y는 이고; n은 정수 2, 3 또는 4이고; R22는 화학식 A, 화학식 A', 화학식 A'', 화학식 A''' 또는 화학식 B의 폴리엔 탄화수소 사슬이고; R10 및 R12는 각각 독립적으로 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (IV-A)의 Y 부분에 공유 결합된 하나 이상의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함하며, 여기서 Y는 이고; n은 정수 2, 3 또는 4이고; R22는 화학식 A, 화학식 A', 화학식 A'', 화학식 A'''의 폴리엔 탄화수소 사슬이고; R10 및 R12는 각각 독립적으로 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (IV-A)의 Y 부분에 공유 결합된 하나 이상의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함하며, 여기서 Y는 이고; n은 정수 2, 3 또는 4이고; R22는 화학식 B의 폴리엔 탄화수소 사슬이고; R10 및 R12는 각각 독립적으로 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (IV-A)의 Y 부분에 공유 결합된 하나 이상의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함하며, 여기서 Y는 이고; n은 정수 2, 3 또는 4이고; R22는 화학식 A, 화학식 A', 화학식 A'', 화학식 A''' 또는 화학식 B의 폴리엔 탄화수소 사슬이고; R10 및 R12는 각각 독립적으로 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (IV-A)의 Y 부분에 공유 결합된 하나 이상의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함하며, 여기서 Y는 이고; n은 정수 2, 3 또는 4이고; R22는 화학식 A, 화학식 A', 화학식 A'', 또는 화학식 A'''의 폴리엔 탄화수소 사슬이고; R10 및 R12는 각각 독립적으로 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (IV-A)의 Y 부분에 공유 결합된 하나 이상의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함하며, 여기서 Y는 이고; n은 정수 2, 3 또는 4이고; R22는 화학식 B의 폴리엔 탄화수소 사슬이고; R10 및 R12는 각각 독립적으로 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (IV-A)의 Y 부분에 공유 결합된 하나 이상의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함하며, 여기서 Y는 이고; n은 정수 2, 3 또는 4이고; R22는 화학식 A, 화학식 A', 화학식 A'', 화학식 A''' 또는 화학식 B의 폴리엔 탄화수소 사슬이고; R10 및 R12는 각각 독립적으로 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (IV-A)의 하나 이상의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬:
또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하고, 여기서 Y는 이고; n은 정수 2, 3 또는 4이고; R22는 화학식 A, 화학식 A', 화학식 A'', 또는 화학식 A'''의 폴리엔 탄화수소 사슬이고; R10 및 R12는 각각 독립적으로 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (IV-A)의 Y 부분에 공유 결합된 하나 이상의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함하며, 여기서 Y는 이고; n은 정수 2, 3 또는 4이고; R22는 화학식 A, 화학식 A', 화학식 A'', 화학식 A''' 또는 화학식 B의 폴리엔 탄화수소 사슬이고; R10 및 R12는 각각 독립적으로 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (IV-A)의 Y 부분에 공유 결합된 하나 이상의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함하며, 여기서 Y는 이고; n은 정수 2, 3 또는 4이고; R22는 화학식 A, 화학식 A', 화학식 A'', 화학식 A''' 또는 화학식 B의 폴리엔 탄화수소 사슬이고; R10 및 R12는 각각 독립적으로 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (IV) 또는 약학적으로 허용되는 이의 염의 Y 부분에 공유 결합된 하나 이상의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함하고:
(IV), 여기서 Y는 , , , , 또는 이고; n은 정수 2, 3 또는 4이고; 그리고 R22는 화학식 A, 화학식 A', 화학식 A'', 화학식 A''' 또는 화학식 B의 폴리엔 탄화수소 사슬이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (IV) 또는 약학적으로 허용되는 이의 염의 Y 부분에 공유 결합된 하나 이상의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함하고:
(IV), 여기서 Y는 이고; n은 정수 2, 3 또는 4이고; 그리고 R22는 화학식 A의 폴리엔 탄화수소 사슬이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (IV) 또는 약학적으로 허용되는 이의 염의 Y 부분에 공유 결합된 하나 이상의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함하고:
(IV), 여기서 Y는 이고; n은 정수 2이고; 그리고 R22는 화학식 A'의 폴리엔 탄화수소 사슬이다.
본 발명의 한 양상은 화학식 I의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 제공하고:
화학식 I
여기서 Y는 독립적으로 메틸 또는 에틸 기이고,
여기서 2개의 지방 아실 기는 16-18개의 탄소를 가지며 2개의 비접합 올레핀을 함유한다.
본 발명의 또 다른 양상은 이온화 가능한 지질을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 지질 나노입자는 화학식 I의 이온화 가능한 지질 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하고,
화학식 I
여기서 Y는 독립적으로 메틸 또는 에틸 기이고,
여기서 2개의 지방 아실 기는 총 16-18개의 탄소를 가지며 2개 내지 4개의 메틸렌 기에 의해 분리된 2개의 올레핀을 함유한다.
일부 실시형태에서, 2개의 지방 아실 기는 16개의 탄소를 갖는다. 일부 실시형태에서, 2개의 지방 아실 기는 17개의 탄소를 갖는다. 일부 실시형태에서, 2개의 지방 아실 기는 18개의 탄소를 갖는다.
일부 실시형태에서, 화학식 I-A의 이온화 가능한 지질 또는 약학적으로 허용되는 이의 염이 제공되고:
화학식 I-A
여기서 a는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고; b는 2, 3 또는 4이고; c는 3, 4, 5, 6 또는 7이고; a, b 및 c의 합은 10 또는 12이고; L은 이고; R10 및 R12는 각각 독립적으로 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이고; v는 0 또는 1이고; q는 1, 2, 3 또는 4이고; q2는 1 또는 2이다. 일부 양상에서, 화학식 I-A의 이온화 가능한 지질에서 v는 0이고, q는 1, 2 또는 3이고, a, b 및 c의 합은 12이다. 일부 양상에서, 화학식 I-A의 이온화 가능한 지질에서 v는 1이고, q는 3 또는 4이고, a, b 및 c의 합은 12이다. 일부 양상에서, 화학식 I-A의 이온화 가능한 지질에서 R10 및 R12는 각각 화학식 I-A'의 이온화 가능한 지질에서 단일 하이드록실로 선택적으로 치환된 메틸, 에틸 및 프로필로부터 독립적으로 선택된다. 일부 양상에서, a, b 및 c의 합은 12이고, R10 및 R12는 독립적으로 메틸, 에틸, -(CH2)(CH2)OH, 및 -(CH2)2(CH2)OH로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 화학식 I-A'의 이온화 가능한 지질 또는 약학적으로 허용되는 이의 염이 제공되고:
화학식 I-A'
여기서 a는 1, 2 또는 3이고; c는 3, 4, 5, 6 또는 7이고; L은 이고; Y*는 메틸 또는 에틸이고; v는 0 또는 1이고; q는 2, 3 또는 4이고; q2는 1 또는 2이다. 일부 양상에서, 화학식 I-A'의 이온화 가능한 지질에서 v는 0이고, q는 1, 2 또는 3이고; a와 c의 합은 6 또는 8이다. 일부 양상에서, 화학식 I-A'의 이온화 가능한 지질에서 v는 1이고, q는 3 또는 4이고; a와 c의 합은 6 또는 8이다.
일부 실시형태에서, 화학식 I-A''의 이온화 가능한 지질 또는 약학적으로 허용되는 이의 염이 제공되고:
화학식 I-A''
여기서 a는 4, 5 또는 6이고; b는 2, 3 또는 4이고; c는 3, 4, 5, 6 또는 7이고;
L은 이고; R10 및 R12는 각각 독립적으로 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이고; v는 0 또는 1이고; q는 1, 2, 3 또는 4이고; q2는 1 또는 2이다. 일부 양상에서, 화학식 I-A''의 이온화 가능한 지질에서 v는 0이고, q는 1, 2 또는 3이고, a, b 및 c의 합은 12이다. 일부 양상에서, 화학식 I-A''의 이온화 가능한 지질에서 v는 1이고, q는 3 또는 4이고, a, b 및 c의 합은 12이다. 일부 양상에서, 화학식 I-A의 이온화 가능한 지질에서 R10 및 R12는 각각 화학식 I-A''의 이온화 가능한 지질에서 단일 하이드록실로 선택적으로 치환된 메틸, 에틸 및 프로필로부터 독립적으로 선택된다. 일부 양상에서, a, b 및 c의 합은 12이고, R10 및 R12는 독립적으로 메틸, 에틸, -(CH2)(CH2)OH, 및 -(CH2)2(CH2)OH로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 양상은 화학식 II의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 제공하고:
화학식 II
여기서 R은 상기 나타낸 구조들 중 하나의 디알킬아미노기를 포함하는 치환기이고,
여기서 2개의 지방 아실 기는 16-18개의 탄소이고 적어도 2개의 메틸렌 기에 의해 분리된 2개의 올레핀을 함유한다.
일부 실시형태에서, 2개의 지방 아실 기는 16개의 탄소를 갖는다. 일부 실시형태에서, 2개의 지방 아실 기는 17개의 탄소를 갖는다. 일부 실시형태에서, 2개의 지방 아실 기는 18개의 탄소를 갖는다.
본 발명의 또 다른 양상은 화학식 II-A의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 제공하고:
화학식(II-A)
여기서 a는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고; b는 2, 3 또는 4이고; c는 4, 5, 6, 7 또는 8이고; R2는 또는 이고; q 및 q'는 각각 독립적으로 1 또는 2이고; R10 및 R12는 각각 메틸 또는 에틸이다. 일부 양상에서, 화학식 I-A의 이온화 가능한 지질에서 a, b 및 c의 합은 11 또는 13이다. 일부 양상에서, 화학식 I-A의 이온화 가능한 지질은 다음 중 하나 이상을 특징으로 한다: a는 1, 2 또는 3이고; q는 2이고; q'는 1이고; R10 또는 R12 중 적어도 하나는 에틸이다. 일부 양상에서, 화학식 II-A의 이온화 가능한 지질에서 b는 4이다. 일부 양상에서, 화학식 II-A의 이온화 가능한 지질에서 a는 4이고, b는 4이고 c는 4이다. 일부 양상에서, 화학식 II-A의 이온화 가능한 지질에서 a는 1이고, b는 4이고 및 c는 8이다. 일부 양상에서, 화학식 II-A의 이온화 가능한 지질에서 a는 2이고, b는 4이고 c는 5이다.
본 발명의 또 다른 양상은 화학식 II-A'의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 제공하고:
화학식(II-A')
여기서 a는 1, 2, 또는 3이고; b는 2, 3 또는 4이고; c는 4, 5, 6, 7 또는 8이고; R2는 또는 이고; q 및 q'는 각각 독립적으로 1 또는 2이고; R10 및 R12는 각각 메틸 또는 에틸이다. 일부 양상에서, 화학식 I-A'의 이온화 가능한 지질에서 a, b 및 c의 합은 11 또는 13이다. 일부 양상에서, 화학식 I-A의 이온화 가능한 지질은 다음 중 하나 이상을 특징으로 한다: q는 2이고; q'는 1이고; R10 또는 R12 중 적어도 하나는 에틸이다. 일부 양상에서, 화학식 II-A'의 이온화 가능한 지질에서 b는 4이다. 일부 양상에서, 화학식 II-A'의 이온화 가능한 지질에서 a는 4이고, b는 4이고 c는 4이다. 일부 양상에서, 화학식 II-A'의 이온화 가능한 지질에서 a는 1이고, b는 4이고 및 c는 8이다. 일부 양상에서, 화학식 II-A'의 이온화 가능한 지질에서 a는 2이고, b는 4이고 c는 5이다.
본 발명의 또 다른 양상은 화학식 II-B의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 제공하고:
화학식 (II-B)
여기서 a는 5, 6 또는 7이고; c는 3, 4 또는 5이고; R2는 또는 이고; q 및 q'는 각각 독립적으로 1 또는 2이고; R10 및 R12는 각각 메틸 또는 에틸이다. 일부 양상에서, 화학식 I-B의 이온화 가능한 지질에서 a, 및 c의 합은 9 또는 11이다. 일부 양상에서, 화학식 I-B의 이온화 가능한 지질은 다음 중 하나 이상을 특징으로 한다: q는 2이고; q'는 1이고; R10 또는 R12 중 적어도 하나는 에틸이다. 일부 양상에서, 화학식 I-B의 이온화 가능한 지질은 다음 중 하나 이상을 특징으로 한다: q는 1이고; q'는 2이고; R10 및 R12는 각각 메틸이다. 일부 양상에서, 화학식 II-B의 이온화 가능한 지질에서 c는 4이다. 일부 양상에서, 화학식 II-B의 이온화 가능한 지질에서 a는 5 또는 7이고 c는 4이다. 일부 양상에서, 화학식 II-B의 이온화 가능한 지질에서 a는 5이고 c는 4이다. 일부 양상에서, 화학식 II-B의 이온화 가능한 지질에서 a는 7이고 c는 4이다.
본 발명의 또 다른 양상은 화학식 II-B의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 제공하고:
화학식(II-B*)
여기서 a는 5 또는 7이고; c는 3 또는 4이고; R2는 또는 이고; q 및 q'은 각각 독립적으로 1 또는 2이고; R10 및 R12는 각각 메틸이다. 일부 양상에서, 화학식 I-B의 이온화 가능한 지질에서 a 및 c의 합은 9 또는 11이다. 일부 양상에서, 화학식 II-B의 이온화 가능한 지질에서 c는 4이다. 일부 양상에서, 화학식 II-B의 이온화 가능한 지질에서 a는 5 또는 7이고 c는 4이다. 일부 양상에서, 화학식 II-B의 이온화 가능한 지질에서 a는 5이고 c는 4이다. 일부 양상에서, 화학식 II-B의 이온화 가능한 지질에서 a는 7이고 c는 4이다. 일부 양상에서, 화학식 II-B의 이온화 가능한 지질에서 a는 5이고 c는 3이다. 일부 양상에서, 화학식 II-B의 이온화 가능한 지질에서 a는 7이고 c는 3이다.
본 발명의 또 다른 양상은 화학식 III의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 제공하고:
화학식 III
여기서 Y는 메틸 또는 에틸 기이고,
여기서 2개의 지방 아실기는 16-18개의 탄소를 갖고 단일 올레핀을 함유하는 다이설파이드 지방 아실 기이다.
일부 실시형태에서, 2개의 지방 아실 기는 16개의 탄소를 갖는다. 일부 실시형태에서, 2개의 지방 아실 기는 17개의 탄소를 갖는다. 일부 실시형태에서, 2개의 지방 아실 기는 18개의 탄소를 갖는다.
본 발명의 또 다른 양상은 화학식 III-A의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 제공하고:
화학식 III-A
여기서 a는 5, 6 또는 7이고; c는 3, 4 또는 5이고; q는 2 또는 3이고 R10 및 R12는 메틸 또는 에틸이다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 지질은 a가 5 또는 7인 화학식 III-A의 화합물을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 지질은 a와 c의 합이 8, 9 또는 10인 화학식 A의 2개의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 화학식 III-A'의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 제공하고:
화학식 III-A'
여기서 a는 5 또는 7이고; c는 3, 4 또는 5이고; q는 2 또는 3이고 R10 및 R12는 메틸 또는 에틸이다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 지질은 c가 3인 2개의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 지질은 a와 c의 합이 8 또는 10인 화학식 III-A'의 2개의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 지질은 q가 2이고 a와 c의 합이 8 또는 10인 화학식 III-A'의 2개의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 III-A'의 2개의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함할 수 있으며, 여기서 q는 2이고, R10 및 R12는 각각 메틸이고, a 및 c의 합은 8 또는 10이다. 일부 양상에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 III-A'의 2개의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬을 포함할 수 있으며, 여기서 q는 2이고, R10 및 R12는 각각 메틸이고, c는 3이다.
일부 실시형태에서, 화학식 I-III의 화합물은 6 내지 7의 pKa를 갖는다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자 조성물은 지질 및 핵산을 포함하고, 지질 나노입자는 화학식 I, II, III의 화합물, 또는 이의 조합 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함한다.
일부 실시형태에서, LNP는 화학식 (IV)의 구조를 갖는 이온화 가능한 지질:
(IV), 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하고,
여기서 Y는 , , , , 또는 이고; 각각의 R22는 독립적으로 알킬, 알케닐, 알키닐 또는 헤테로알킬이고, 이들 각각은 RB로 선택적으로 치환되고; 각각의 RB는 독립적으로 알킬, 할로, 하이드록시, 아미노, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클릴이고; n은 1에서 10(포함) 사이의 정수이고; 은 부착 지점을 나타낸다.
일부 실시형태에서, Y는 이다.
일부 실시형태에서, 화학식 IV의 화합물은 6 내지 7의 pKa를 갖는다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (IV-A)의 하나 이상의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬:
(IV-A), 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하고, 여기서 Y는 이고; n은 정수 2, 3 또는 4이고; R22는 화학식 A, 화학식 A', 화학식 A'', 또는 화학식 A'''의 폴리엔 탄화수소 사슬이고; R10 및 R12는 각각 독립적으로 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이다. 일부 양상에서, 화학식 (IV-A)에서 R10 및 R12는 독립적으로 메틸, 에틸, -(CH2)(CH2)OH, 및 -(CH2)2(CH2)OH로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (IV-A)의 하나 이상의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬:
(IV-A), 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하고, 여기서 Y는 이고; n은 정수 2, 3 또는 4이고; R22는 화학식 A, 화학식 A', 화학식 A'', 또는 화학식 A''', 또는 화학식 B의 폴리엔 탄화수소 사슬이고; R10 및 R12는 각각 독립적으로 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이다. 일부 양상에서, 화학식 (IV-A)에서 R10 및 R12는 독립적으로 메틸, 에틸, -(CH2)(CH2)OH, 및 -(CH2)2(CH2)OH로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (IV-A)의 하나 이상의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬:
(IV-A), 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하고, 여기서 Y는 이고; n은 정수 2, 3 또는 4이고; R22는 화학식 A, 화학식 A', 화학식 A'', 또는 화학식 A''', 또는 화학식 B의 폴리엔 탄화수소 사슬이고; R10 및 R12는 각각 독립적으로 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이다. 일부 양상에서, 화학식 (IV-A)에서 R10 및 R12는 독립적으로 메틸, 에틸, -(CH2)(CH2)OH, 및 -(CH2)2(CH2)OH로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (IV-A)의 하나 이상의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬:
(IV-A), 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하고, 여기서 Y는 이고; n은 정수 2, 3 또는 4이고; R22는 화학식 A, 화학식 A', 화학식 A'', 또는 화학식 A''', 또는 화학식 B의 폴리엔 탄화수소 사슬이고; R10 및 R12는 각각 독립적으로 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이다. 일부 양상에서, 화학식 (IV-A)에서 R10 및 R12는 독립적으로 메틸, 에틸, -(CH2)(CH2)OH, 및 -(CH2)2(CH2)OH로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (IV-A)의 하나 이상의 다중불포화 폴리엔 탄화수소 사슬:
(IV-A), 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하고, 여기서 Y는 이고; n은 정수 2, 3 또는 4이고; R22는 화학식 A, 화학식 A', 화학식 A'', 또는 화학식 A''', 또는 화학식 B의 폴리엔 탄화수소 사슬이고; R10 및 R12는 각각 독립적으로 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이다. 일부 양상에서, 화학식 (IV-A)에서 R10 및 R12는 독립적으로 메틸, 에틸, -(CH2)(CH2)OH, 및 -(CH2)2(CH2)OH로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 화합물은 표 1 또는 표 2에 열거된 화합물의 구조를 갖는다.
표 1A는 양이온성 지질의 예를 보여준다. 표 2는 생체환원성 양이온성 지질의 예를 보여준다.
표 1A. 양이온성 지질의 예시
표 1A. 양이온성 지질의 예시(계속)
표 1A. 양이온성 지질의 예시(계속)
표 1A. 양이온성 지질의 예시(계속)
표 1B 추가적인 양이온성 지질의 예시
표 2. 생체환원성 양이온성 지질의 예시
표 2. 생체환원성 양이온성 지질의 예시(계속)
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 핵산을 캡슐화한다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 LNP 제형에서 핵산을 캡슐화한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 siRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 mRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 DNA 분자이다.
일부 실시형태에서, 세포 표면 수용체에 대해 지시된 항체 접합체와 같은 리간드를 추가로 포함하는 조성물은 수지상 세포에 매우 특이적인 방식으로 지질 나노입자를 표적화하도록 제공된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 표적 리간드를 추가로 포함하며, 여기서 표적 리간드는 나노입자의 외부로 배향된다. 일부 실시형태에서, 표적화 리간드는 항체이다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 수성 매질에 존재한다.
일부 실시형태에서, 핵산은 화학식 I, II, III, IV의 화합물 또는 이의 조합을 포함하는 본원에 개시된 화합물과 함께 지질 나노입자에 포획되며, 여기서 핵산은 RNA 또는 DNA이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 화학식 I, I-A, II, II-A, II-B, III, III-A, IV, IV-A, IV-B, V, V-A, VI-A, VII, VIII의 화합물을 비롯한 본원에 개시된 화합물과 함께 지질 나노입자에 포획되고, 여기서 핵산은 RNA 또는 DNA이다. 일부 실시형태들에서, 핵산은 mRNA이다. 일부 실시형태들에서, 핵산은 siRNA이다. 일부 실시형태들에서, 핵산은 DNA이다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 포스파티딜콜린 및 스테롤을 포함하는 막을 포함한다. 일부 실시형태에서, 스테롤은 콜레스테롤이다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 포스파티딜콜린, 이온화 가능한 양이온성 지질(ICL)을 포함하는 막을 포함한다. 일부 실시형태에서, ICL은 화학식 I, II, III 또는 IV의 구조 및 콜레스테롤을 가지며, 여기서 막은 지질 나노입자의 내부를 수성 매질로부터 분리한다. 일부 실시형태에서, ICL은 표 1A 및 표 2에 나타낸 구조를 갖는다. 일부 실시예에서, ICL은 표 1B에 나타낸 구조를 갖는다. 일부 실시형태에서, 포스파티딜콜린은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 또는 수첨 대두 포스파티딜콜린(HSPC)이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온성 지질 대 콜레스테롤 몰비는 약 65:35 내지 40:60이다. 일부 실시형태에서, ICL 대 콜레스테롤 몰비는 약 60:40 내지 약 45:55이다.
일부 실시형태에서, 포스파티딜콜린 대 콜레스테롤 몰비는 약 1:5 내지 약 1:2이다.
일부 실시형태에서, 막은 중합체-접합 지질을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 ICL, DSPC, 콜레스테롤 및 중합체-접합 지질을 약 49.5:10.3:39.6:2.5 몰비로 포함한다.
일부 실시형태에서, 중합체-접합 지질은 PEG(2000)-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG) 또는 PEG(분자량 2,000)-디미리스토일포스파티딜에탄올아민(PEG-DMPE)이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질에 대한 산화적 분해 생성물의 백분율은 DLin-KC2-DMA 또는 DLin-MC3-DMA 대조군 제형에 대한 것의 50% 미만이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 비경구 투여를 위한 액체 약학적 제형이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 피하, 근육내 또는 피내 투여를 위한 액체 약학적 제형이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 동결건조된 분말의 형태이며, 이는 후속적으로 투여 전에 수성 매질과 함께 재구성된다.
본 발명의 다른 양상은 박테리아 또는 바이러스 감염을 예방하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 면역 반응을 유도하기 위해 본원에 제공된 유효량의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태는 필요로 하는 대상체를 백신접종하는 방법을 제공하며, 이 방법은 항원성 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 피하, 근육내 또는 피내로 투여된다.
일부 실시형태에서, 박테리아 감염은 마이코박테리움 투베르쿨로시스 감염이다. 일부 실시형태에서, 박테리아 감염은 비결핵 마이코박테리움의 한 형태이다.
일부 실시형태에서, 바이러스 감염은 코로나바이러스이다. 일부 실시형태에서, 코로나바이러스는 SARS-CoV, MERS-CoV 또는 SARS-CoV-2이다.
일부 실시형태에서, 바이러스 감염은 HIV/AID이다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 비경구적으로 투여된다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자 조성물은 단일 주사의 일부로서 투여된다.
본 발명은 핵산, 예를 들어, DNA, mRNA, siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, CRISPR 성분, 예를 들어, 가이드 RNA(gRNA 또는 sgRNA) 및 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제(Cas 단백질) 및 지질을 포함하는 지질 나노입자를 특징으로 한다. 예시적인 지질은 이온화 가능한 양이온성 지질(ICL), 인지질, 스테롤 지질, 알킬렌 글리콜 지질(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 지질), 스핑고지질, 글리세로지질, 글리세로인지질, 프레놀 지질, 사카로지질, 지방산 및 폴리케타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 단일 유형의 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 다수(예를 들어 2개 이상)의 지질을 포함한다. LNP는 이온화 가능한 양이온성 지질, 인지질, 스테롤 또는 알킬렌 글리콜 지질(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 지질) 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
한 실시형태에서, LNP는 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함한다. 본원에서 사용되는 “이온화 가능한 양이온성 지질”, “이온화 가능한 지질” 및 “ICL”은 상호교환적으로 사용된다. ICL은 특정 조건 하에서(예를 들어, 특정 pH 범위에서, 예를 들어, 생리학적 조건 하에서) 전하(예를 들어, 양전하, 예를 들어, 양이온성 지질)를 보유할 수 있는 이온화 가능한 모이어티를 포함하는 지질이다. 이온화 가능한 부분은 아민, 바람직하게는 치환된 아민을 포함할 수 있다. 이온화 가능한 지질은 양이온성 지질 또는 음이온성 지질일 수 있다. 이온화 가능한 모이어티에 더하여, 이온화 가능한 지질은, 예를 들어, 6개 초과 탄소 원자 길이(예를 들어, 약 8개 탄소, 10개 탄소, 12개 탄소, 14개 탄소, 16개 탄소, 18개 탄소, 20개 탄소 또는 그 이상의 길이)의 알킬 또는 알케닐 기를 함유할 수 있다. 본원에 기술된 LNP에 포함될 수 있는 추가적인 이온화 가능한 지질은 Jayaraman 외, (Angew. Chem. Int. Ed. 51:8529-8533 (2012)), Semple 외, Nature Biotechnol. 28:172-176 (2010)), 및 미국 특허 제 8,710,200 및 8,754,062에 개시된 것들이며, 이들 문헌 각각은 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, LNP는 화학식 (IV)의 구조를 갖는 이온화 가능한 지질:
(IV), 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하고,
여기서 Y는 , , , , 또는 이고; 각각의 R22는 독립적으로 알킬, 알케닐, 알키닐 또는 헤테로알킬이고, 이들 각각은 RB로 선택적으로 치환되고; 각각의 RB는 독립적으로 알킬, 할로, 하이드록시, 아미노, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클릴이고; n은 1에서 10(포함) 사이의 정수이고; 은 부착 지점을 나타낸다.
일부 실시형태에서, Y는 이다.
일부 실시형태에서, LNP는 화학식 (IV-A)의 구조를 갖는 이온화 가능한 지질 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함한다.
(IV-B)
여기서 R10 및 R12 각각은 독립적으로 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이고; v는 0 또는 1이고; q1은 1 또는 2이고; Y는 , , , , 또는 이고; R22는 이고; a는 1, 2, 3, 4 또는 5이고; c는 4, 5, 6, 7 또는 8이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 v는 0이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 v는 1이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (IV-A)의 화합물의 경우 v는 1이고 q1은 1이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 v는 1이고 q1은 2이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 R22에서 a와 c의 합은 6, 7, 8 또는 9이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 R22에서 a와 c의 합은 6이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 R22에서 a와 c의 합은 7이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 R22에서 a와 c의 합은 9이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 v는 0이고 R22에서 a와 c의 합은 6, 7, 8 또는 9이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 v는 0이고 R22에서 a와 c의 합은 6이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 v는 0이고 R22에서 a와 c의 합은 7이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 v는 0이고 R22에서 a와 c의 합은 9이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 R10 및 R12는 각각 독립적으로 메틸, 에틸, -(CH2)(CH2)OH, 및 -(CH2)2(CH2)OH로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 R10 및 R12는 각각 메틸이고 R22에서 a와 c의 합은 6, 7, 8 또는 9이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 R10 및 R12는 각각 메틸이고, v는 0이고, R22에서 a와 c의 합은 6, 7, 8 또는 9이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 v는 0이고 R22는 이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 v는 0이고 R22는 이고 a와 c의 합은 8이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 v는 0이고 R22는 이고 a는 1이고 c는 7이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 v는 0이고 R22는 이고 a는 2이고 c는 4이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 v는 1이고 R22는 이다. 일부 실시형태에서, v는 1이고 R22는 이고 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 a와 c의 합은 8이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 v는 1이고 R22는 이고, a는 1이고 c는 7이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 v는 0이고 R22는 이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 v는 0이고 R22는 이고 a와 c의 합은 7 또는 9이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 v는 0이고 R22는 이고 a는 4이고 c는 5이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 v는 0이고 R22는 이고 a는 1이고 c는 8이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 v는 0이고 R22는 이고 a는 2이고 c는 5이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 v는 0이고 R22는 이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 v는 0이고 R22는 이고 a와 c의 합은 7 또는 9이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 v는 0이고 R22는 이고 a는 4이고 c는 5이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 v는 0이고 R22는 이고 a는 1이고 c는 8이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (IV-B)의 화합물의 경우 v는 0이고 R22는 이고 a는 2이고 c는 5이다.
LNP는, 예를 들어, LNP의 총 지질 함량의 약 0.1mol% 초과 농도의 이온화 가능한 지질을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, LNP는, 예를 들어, LNP의 총 지질 함량의 약 1mol%, 약 2mol%, 약 4mol%, 약 8mol%, 약 20mol%, 약 40mol%, 약 50mol%, 약 60mol%, 약 80mol% 초과 농도의 이온화 가능한 지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 20mol%, 약 40mol%, 또는 약 50mol% 초과 농도의 이온화 가능한 지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는, 예를 들어, LNP의 총 지질 함량의 약 1mol% 내지 약 95mol% 농도의 이온화 가능한 지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는, 예를 들어, LNP의 총 지질 함량의 약 2mol% 내지 약 90mol%, 약 4mol% 내지 약 80mol%, 약 10mol% 내지 약 70mol%, 약 20mol% 내지 약 60mol%, 약 40mol% 내지 약 55mol% 농도의 이온화 가능한 지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 20mol% 내지 약 60mol% 농도의 이온화 가능한 지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 40mol% 내지 약 55mol% 농도의 이온화 가능한 지질을 포함한다.
한 실시형태에서, LNP는 인지질을 포함한다. 인지질은 인산염 기와 적어도 하나의 알킬, 알케닐 또는 헤테로알킬 사슬을 포함하는 지질이다. 인지질은 천연 발생 또는 비천연 발생(예: 합성 인지질)일 수 있다. 인지질은 아민, 아미드, 에스테르, 카르복실, 콜린, 하이드록실, 아세탈, 에테르, 탄수화물, 스테롤 또는 글리세롤을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 인지질은 포스포콜린, 포스포스핑고지질, 또는 플라스마로겐을 포함할 수 있다. 예시적인 인지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 수소화 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE), 1-미리스토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(MOPC), 1, 2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DAPC), 1-팔미토일-2-리놀레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(PLPC), 1-팔미토일-2-올레오일-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1-스테아로일-2-미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(SMPC), 1-팔미토일-2-미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(PMPC), 비스(모노아실글리세롤)포스페이트(BMP), L-α-포스파티딜콜린, 1,2-디헵타데카노일-sn-글리세로-3-포스포릴콜린(DHDPC) 및 1-스테아로일-2-아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(SAPC)을 포함한다. 본원에 기술된 LNP에 포함될 수 있는 추가적인 인지질은 Li, J. 외, (Asian J. Pharm. Sci. 10:81-98 (2015))에 개시된 것들이며, 이 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, LNP는 하기 화학식 (V)의 구조를 갖는 인지질:
(V), 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하고, 각각의 R23은 독립적으로 알킬, 알케닐 또는 헤테로알킬이고; 여기서 각각의 알킬, 알케닐 또는 헤테로알킬은 RC로 선택적으로 치환되고; 각각의 R25는 독립적으로 수소 또는 알킬이고; R24는 존재하지 않거나, 수소 또는 알킬이고; 각각의 RC는 독립적으로 알킬, 할로, 하이드록시, 아미노, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클릴이고; m은 1과 4 사이(1과 4 포함)의 정수이고; u는 2 또는 3이다.
일부 실시형태에서, 각각의 R23은 독립적으로 알킬(예를 들어, C2-C32알킬, C4-C28 알킬, C8-C24 알킬, C12-C22 알킬, 또는 C16-C20 알킬)이다. 일부 실시형태에서, 각각의 R23은 독립적으로 알케닐(예를 들어, C2-C32 알킬, C4-C28 알케닐, C8-C24 알케닐, C12-C22 알케닐, 또는 C16-C20 알케닐)이다. 일부 실시형태에서, 각각의 R23은 독립적으로 헤테로알킬 (예를 들어, C4-C28헤테로알킬, C8-C24헤테로알킬, C12-C22헤테로알킬, C16-C20헤테로알킬)이다. 일부 실시형태에서, 각각의 R23은 독립적으로 C16-C20 알킬이다. 일부 실시형태에서, 각각의 R23은 독립적으로 C17 알킬이다. 일부 실시형태에서, 각각의 R23은 독립적으로 헵타데실이다. 일부 실시형태에서, 각각의 R23은 동일하다. 일부 실시형태에서, 각각의 R23은 상이하다. 일부 실시형태에서, 각각의 R23은 RC로 선택적으로 치환된다. 일부 실시형태에서, RC는 독립적으로 알킬, 할로, 하이드록시, 아미노, 사이클로알킬, 또는 헤테로사이클릴이다.
일부 실시형태에서, R25 중 하나는 수소이다. 일부 실시형태에서, R25 중 하나는 알킬이다. 일부 실시형태에서, R25 중 하나는 메틸이다. 일부 실시형태에서, 각각의 R25는 독립적으로 알킬이다. 일부 실시형태에서, 각각의 R25는 독립적으로 메틸이다. 일부 실시형태에서, 각각의 R25는 독립적으로 메틸이고 u는 2이다. 일부 실시형태에서, 각각의 R25는 독립적으로 메틸이고 u는 3이다.
일부 실시형태에서, R24는 존재하지 않으며, 이것이 부착된 산소는 음전하를 띤다. 일부 실시형태에서, R24는 수소이다.
일부 실시형태에서, m은 1과 10, 1과 8, 1과 6, 1과 4 사이의 정수이다. 일부 실시형태에서, m은 1, 2, 3, 또는 4이다. 일부 실시형태에서, m은 1이다. 일부 실시형태에서, m은 2이다. 일부 실시형태에서, m은 3이다.
일부 실시형태에서, 양이온성 이온화 가능한 지질 및 음이온성 인지질 표적 모이어티를 모두 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 음이온성 인지질은 하기 화학식 (V-A)의 조성물이고:
화학식(V-A)
여기서 a는 14 또는 16이고, z는 아미드, 글리콜 또는 아미딜-알킬-카르복실산 모이어티이다. 일부 실시형태에서, Z는 , 또는 이고, 여기서 m은 2 또는 3이다. 일부 실시형태에서, 음이온성 인지질 표적화 모이어티는 DSPS (L-이성질체), DPPS (L-이성질체), DMPS (L-이성질체), DOPS (L-이성질체), DSPS (D-이성질체), DSPG, DPPG, N-Glu-DSPE, 및 N-Suc-DSPE로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 인지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)이다. 일부 실시형태에서, 인지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC)이다. 일부 실시형태에서, 인지질은 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC)이다. 일부 실시형태에서, 인지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)이다.
포스파티딜세린의 포함
(예를 들어, 본 명세서에 기재된) LNP는 다음 성분 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (i) 약 1mol% 내지 약 95mol% 사이(또는 그 사이의 임의의 값, 예를 들어 약 20mol% 내지 약 80mol%) 농도의 C16 알킬 또는 C16 알케닐 기 또는 C18 알킬 또는 C18 알케닐 기를 함유하는 이온화 가능한 양이온성 지질(ICL); (ii) 0.1mol% 내지 약 20mol%(또는 그 사이의 임의의 값, 예를 들어, 약 2.5mol% 내지 약 10mol%) 농도의 인지질(여기서 인지질은 또한 C16 또는 C18 알킬 또는 알케닐 기를 함유함); (iii) 약 1mol% 내지 약 95mol%(또는 그 사이의 임의의 값, 예를 들어 약 20mol% 내지 약 80mol%) 농도의 콜레스테롤; (iv) LNP의 총 지질 함량의 약 0.5 mol% 내지 약 20 mol%, 약 2.5 mol% 내지 약 10 mol%, 약 4 mol% 내지 약 8 mol%, 또는 이들 사이의 임의의 값의 농도의, LNP 지질 제제에 첨가된 포스파티딜세린(PS) 또는 포스파티딜글리세롤(PG), 및 (v) 약 0.1mol% 내지 약 5mol%(또는 그 사이의 임의의 값, 예를 들어 약 1mol% 내지 약 2.5mol%)의 농도의 폴리에틸렌글리콜(PEG)-2000-함유 지질(예: DPG-PEG2000, DPPE-PEG2000, DMPE-PEG2000, DMG-PEG2000). 한 실시형태에서, LNP는 (i)-(v) 중 2개를 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 (i)-(v) 중 3개를 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 (i)-(v) 중 4개를 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 각각의 (i)-(v)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i) 및 (ii)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i) 및 (iii)을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i) 및 (v)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (ii) 및 (iii)을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (ii) 및 (v)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (iii) 및 (iv)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (iii) 및 (v)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i), (ii) 및 (iii)을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i), (ii) 및 (v)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (ii), (iii) 및 (v)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (ii), (iii), (iv) 및 (v)를 포함한다. 실시예에서, LNP는 (i)-(v) 중 4개로 구성되거나 이들로 본질적으로 구성된다. 실시예에서, LNP는 각각의 (i)-(v)로 구성되거나 이들로 필수적으로 구성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i) 및 (ii)로 구성되거나 이들로 본질적으로 구성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i) 및 (iii)으로 구성되거나 이들로 본질적으로 구성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i) 및 (v)로 구성되거나 이들로 본질적으로 구성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 (ii) 및 (iii)으로 구성되거나 이들로 본질적으로 구성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 (ii) 및 (v)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (iii) 및 (iv)로 구성되거나 이들로 본질적으로 구성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 (iii) 및 (v)로 구성되거나 이들로 본질적으로 구성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i), (ii) 및 (iii)으로 구성되거나 이들로 본질적으로 구성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i), (ii) 및 (v)로 구성되거나 이들로 본질적으로 구성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 (ii), (iii) 및 (v)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (ii), (iii), (iv) 및 (v)로 구성되거나 이들로 본질적으로 구성된다.
LNP는, 예를 들어, LNP의 총 지질 함량의 약 0.1mol% 보다 큰 농도의 인지질을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, LNP는 LNP의 총 지질 함량의 약 0.5mol%, 약 1mol%, 약 1.5mol%, 약 2mol%, 약 3mol%, 약 4mol%, 약 5mol%, 약 6mol%, 약 8mol%, 약 10mol%, 약 12mol%, 약 15mol%, 약 20mol%, 약 50mol% 보다 큰 농도의 인지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 1mol%, 약 5mol%, 또는 약 10mol% 보다 큰 농도의 인지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는, 예를 들어, LNP의 총 지질 함량의 약 0.1mol% 내지 약 50mol% 농도의 인지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는, 예를 들어, LNP의 총 지질 함량의 약 0.5mol% 내지 약 40mol%, 약 1mol% 내지 약 30mol%, 약 5mol% 내지 약 25mol%, 약 10mol% 내지 약 20mol%, 약 10mol% 내지 약 15mol%, 또는 약 15mol% 내지 약 20mol% 농도의 인지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 5mol% 내지 약 25mol% 농도의 인지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 10mol% 내지 20mol% 농도의 인지질을 포함한다.
한 실시형태에서, LNP는 스테롤 또는 이온화 가능한 스테롤 분자를 포함한다. 스테롤은 다환식 구조 및 선택적으로 하이드록실 또는 에테르 치환기를 포함하는 지질이며, 천연 발생 또는 비천연 발생(예를 들어, 합성 스테롤)일 수 있다. 스테롤은 이중 결합을 포함하지 않거나 단일 이중 결합 또는 다중 이중 결합을 포함할 수 있다. 스테롤은 추가로 알킬, 알케닐, 할로, 에스테르, 케톤, 하이드록실, 아민, 폴리에테르, 탄수화물 또는 사이클릭 모이어티를 포함할 수 있다. 스테롤은 디알킬아미노 기와 해당 분자의 다환 부분 사이에 생체환원성 다이설파이드 링키지를 추가로 함유할 수 있다(표 2, 화합물 35-38 참조). 스테롤의 예시적인 목록은 콜레스테롤, 디하이드로에르고스테롤, 에르고스테롤, 캄페스테롤, β시토스테롤, 스티그마스테롤, 라노스테롤, 디하이드로라노스테롤, 데스모스테롤, 브라시카스테롤, 라토스테롤, 자이모스테롤, 7-디하이드로데스모스테롤, 아베나스테롤, 캄페스타놀, 루페올 및 사이클로아르테놀을 포함한다. 일부 실시형태에서, 스테롤은 콜레스테롤, 디하이드로에르고스테롤, 에르고스테롤, 캄페스테롤, β시토스테롤 또는 스티그마스테롤을 포함한다. 본원에 기술된 LNP에 포함될 수 있는 추가적인 스테롤은 Fahy, E. 외, (J. Lipid. Res. 46:839-862 (2005)에 개시된 것들이다.
이온화 가능한 스테롤
일부 실시형태에서, LNP는 화학식 (VI)의 구조를 갖는 스테롤:
(VI) 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하고, 여기서 R26은 수소, 알킬, 헤테로알킬, 또는 -C(O)RD이고, R27은 수소, 알킬, 또는 -ORE이고; 각각의 RD 및 RE는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이고, 여기서 각각의 알킬, 알케닐, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴은 알킬, 할로, 또는 카르보닐로 선택적으로 치환되고; 그리고 각각의 ““는 단일 또는 이중 결합이고, 여기서 단일 또는 이중 결합에 참여하는 각각의 탄소 원자는 원자가가 허용하는 한 0, 1 또는 2개의 수소에 결합된다.
일부 실시형태에서, ““ 중 1개는 단일 결합이다. 일부 실시형태에서, ““ 중 1개는 이중 결합이다.
일부 실시형태에서, ““ 중 2개는 단일 결합이다. 일부 실시형태에서, ““ 중 2개는 이중 결합이다. 일부 실시형태에서, 각각의 ““는 단일 결합이다. 일부 실시형태에서, 각각의 ““는 이중 결합이다.
일부 실시형태에서, 스테롤은 콜레스테롤이다. 일부 실시형태에서, 스테롤은 디하이드로에르고스테롤이다. 일부 실시형태에서, 스테롤은 에르고스테롤이다. 일부 실시형태에서, 스테롤은 캄페스테롤이다. 일부 실시형태에서, 스테롤은 β시토스테롤이다. 일부 실시형태에서, 스테롤은 스티그마스테롤이다. 일부 실시형태에서, 스테롤은 코르티코스테로이드(예: 코르티코스테론, 하이드로코르티손, 코르티손 또는 알도스테론)이다.
일부 실시형태에서, LNP는 화학식 (VI-A)의 구조를 갖는 스테롤:
(VI-A) 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하고, 여기서 q는 3 또는 4이고 R3은 또는 이다.
본 발명의 또 다른 양상은 화학식 (V-A)의 음이온성 인지질 및 화학식 (VIII)의 분지형 이온화 가능한 지질을 포함하는 조성물을 제공하며:
화학식 VIII
여기서 d는 2, 3 또는 4이고; e 및 f는 각각 독립적으로 5, 6 또는 7이고; 그리고 Z1 및 Z2는 각각 독립적으로 -O-C(O)- 또는 -C(O)-O-이고; 그리고 R14 및 R15는 각각 독립적으로 l선형 또는 분지형 (C10-C20)알킬이다. 일부 양상에서, 화학식 VII의 R14 및 R15는 각각 C14 또는 C16 분지형 알킬이다. 일부 양상에서, R14는 C11 선형 알킬이고 R15는 C14 또는 C16 분지형 알킬이다. 일부 양상에서, 화학식 VII의 R14는 C11 선형 알킬이고 R15는 C14 또는 C16 선형 알킬이다. 일부 양상에서, 화학식 VII의 R14 및/또는 R15는 각각 독립적으로 이고, 여기서 g 및 h는 각각 독립적으로 5, 6, 또는 7이다. 일부 양상에서, 화학식 VII의 R14 및 R15는 각각 독립적으로 이고, 여기서 g 및 h는 둘 다 동일하고 5, 6, 또는 7이다. 일부 양상에서, 화학식 VII의 R14는 선형 C11 알킬이고 화학식 VII의 R15는 이고, 여기서 g 및 h는 둘 다 동일하고 5, 6, 또는 7이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 ALC-0315 및 SM-102로부터 선택되는 분지형의 이온화 가능한 지질일 수 있다:
.
LNP는, 예를 들어, LNP의 총 지질 함량의 약 0.1mol% 보다 큰 농도의 스테롤을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, LNP는 예를 들어, LNP의 총 지질 함량의 약 0.5mol%, 약 1mol%, 약 5mol%, 약 10mol%, 약 15mol%, 약 20mol%, 약 25mol%, 약 35mol%, 약 40mol%, 약 45mol%, 약 50mol%, 약 55mol%, 약 60mol%, 약 65mol%, 또는 약 70mol% 보다 큰 농도의 스테롤을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 10mol%, 약 15mol%, 약 20mol%, 또는 약 25mol%보다 큰 농도의 스테롤을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는, 예를 들어, LNP의 총 지질 함량의 약 1mol% 내지 약 95mol% 농도의 스테롤을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 LNP의 총 지질 함량의 약 5mol% 내지 약 90mol%, 약 10mol% 내지 약 85mol%, 약 20mol% 내지 약 80mol%, 약 20mol% 내지 약 60mol%, 약 20mol% 내지 약 50mol%, 또는 약 20mol% 내지 40mol% 농도의 스테롤을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 20mol% 내지 약 50mol% 농도의 스테롤을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 30mol% 내지 약 60mol% 농도의 스테롤을 포함한다.
일부 실시형태에서, LNP는 알킬렌 글리콜 함유 지질을 포함한다. 알킬렌 글리콜 함유 지질은 적어도 하나의 알킬렌 글리콜 모이어티, 예를 들어, 메틸렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜 모이어티를 포함하는 지질이다. 일부 실시형태에서, 알킬렌 글리콜 함유 지질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 알킬렌 글리콜 함유 지질은 PEG 함유 지질일 수 있다. 중합체-접합 지질은 폴리(에틸렌 글리콜)-접합 (페길화)인지질 (PEG-지질), 예를 들어, PEG(분자량 2,000) 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-1,2-디스테아로일-sn-글리세롤(PEG-DSG), PEG(분자량 2,000) 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-1,2-팔미토일-sn-글리세롤(PEG-DPG), PEG(분자량 2,000) 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (PEG-DSPE) 또는 N-팔미토일-스핑고신-1-{숙시닐[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)2000]} (PEG-세라마이드)를 포함할 수 있다. PEG-지질 성분에서 PEG 부분의 분자량은 또한 500-10,000g/mol, 1,500-6000g/mol로 다양할 수 있지만, 바람직하게는 약 2,000MW이다. 지질 앵커에 대한 접합에 사용되는 다른 중합체는 폴리(2-메틸-2-옥사졸린)(PMOZ), 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)(PEOZ), 폴리-N-비닐피롤리돈(PVP), 폴리글리세롤, 폴리(하이드록시에틸 L-아스파라긴)(PHEA), 및 폴리(하이드록시에틸 L-글루타민)(PHEG)을 포함할 수 있다.
PEG 함유 지질은 아민, 아미드, 에스테르, 카르복실, 포스페이트, 콜린, 하이드록실, 아세탈, 에테르, 헤테로사이클 또는 탄수화물을 추가로 포함할 수 있다. PEG-함유 지질은, 예를 들어, PEG 모이어티에 더하여, 예를 들어, 6개 초과 탄소 원자 길이(예를 들어, 약 8개 초과, 10개 초과, 12개 초과, 14개 초과, 16개 초과, 18개 초과, 20개 초과 또는 그 이상의 길이)의 적어도 하나의 알킬 또는 알케닐기를 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, PEG 함유 지질은 적어도 20개의 PEG 단량체, 예를 들어, 적어도 30개의 PEG 단량체, 40개의 PEG 단량체, 45개의 PEG 단량체, 50개의 PEG 단량체, 100개의 PEG 단량체, 200개의 PEG 단량체, 300개의 PEG 단량체, 500개의 PEG 단량체, 1000개의 PEG 단량체, 또는 2000개의 PEG 단량체를 포함하는 PEG 모이어티를 포함한다. 예시적인 PEG-함유 지질은 PEG-DMG(예를 들어, DMG-PEG2k), PEG-c-DMG, PEG-DSG, PEG-DPG, PEG-DSPE, PEG-DMPE, PEG-DPPE, PEG-DOPE 및 PEG-DLPE를 포함한다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 PEG-DMG(예를 들어, DMG-PEG2k), PEG-c-DMG, PEG-DSG 및 PEG-DPG를 포함한다. 본원에 기술된 LNP에 포함될 수 있는 추가적인 PEG-지질은 Fahy, E. 외, (J. Lipid. Res. 46:839-862 (2005))에 개시된 것들이며, 이 문헌은 본원에 전문이 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, LNP는 다음 화학식 (VII)의 구조를 갖는 알킬렌 글리콜 함유 지질:
(VII) 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하고, 여기서 각각의 R28은 독립적으로 알킬, 알케닐, 또는 헤테로알킬이고, 이들 각각은 RF로 선택적으로 치환되고; A는 존재하지 않거나, O, CH2, C(O), 또는 NH이고; E는 존재하지 않거나, 알킬, 또는 헤테로알킬이고, 여기서 알킬 또는 헤테로알킬은 카르보닐로 선택적으로 치환되고; 각각의 RF는 독립적으로 알킬, 할로, 하이드록시, 아미노, 사이클로알킬, 또는 헤테로사이클릴이고; 그리고 z는 10과 200 사이(이들 포함)의 정수이다.
일부 실시형태에서, 각각의 R28은 독립적으로 알킬이다. 일부 실시형태에서, 각각의 R28은 독립적으로 헤테로알킬이다. 일부 실시형태에서, 각각의 R28은 독립적으로 알케닐이다.
일부 실시형태에서, A는 O 또는 NH이다. 일부 실시형태에서, A는 CH2이다. 일부 실시형태에서, A는 카르보닐이다. 일부 실시형태에서, A는 존재하지 않는다.
일부 실시형태에서, E는 알킬이다. 일부 실시형태에서, E는 헤테로알킬이다. 일부 실시형태에서, A 및 E 모두가 존재하지 않는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, A는 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, E는 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, A 또는 E 중 하나는 존재하지 않는다. 일부 실시예에서, A 및 E는 둘 다 독립적으로 존재하지 않는다.
일부 실시형태에서, z는 10과 200 사이(예를 들어, 20과 180 사이, 20과 160 사이, 20과 120 사이, 20과 100 사이, 40과 80 사이, 40과 60 사이, 40과 50 사이)의 정수이다. 일부 실시형태에서, z는 45이다.
일부 실시형태에서, PEG-지질은 PEG-DMG(예를 들어, DMG-PEG2k)이다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 α-(3'-{[1,2-디(미리스틸옥시)프로판옥시] 카르보닐아미노}프로필)-ω-메톡시, 폴리옥시에틸렌(PEG-c-DMG)이다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 PEG-DSG이다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 PEG-DPG이다.
LNP는, 예를 들어, LNP의 총 지질 함량의 약 0.1mol% 보다 큰 농도의 알킬렌 글리콜 함유 지질을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, LNP는 LNP의 총 지질 함량의 약 0.5mol%, 약 1mol%, 약 1.5mol%, 약 2mol%, 약 3mol%, 약 4mol%, 약 5mol%, 약 6mol%, 약 8mol%, 약 10mol%, 약 12mol%, 약 15mol%, 약 20mol%, 약 50mol% 보다 큰 농도의 알킬렌 글리콜 함유 지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 1mol%, 약 4mol%, 또는 약 6mol% 보다 큰 농도의 알킬렌 글리콜 함유 지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는, 예를 들어, LNP의 총 지질 함량의 약 0.1mol% 내지 약 50mol% 농도의 알킬렌 글리콜 함유 지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는, 예를 들어, LNP의 총 지질 함량의 약 0.5mol% 내지 약 40mol%, 약 1mol% 내지 약 35mol%, 약 1.5mol% 내지 약 30mol%, 약 2mol% 내지 약 25mol%, 약 2.5mol% 내지 약 20%, 약 3mol% 내지 약 15mol%, 약 3.5mol% 내지 약 10mol%, 또는 약 4mol% 내지 9mol% 농도의 알킬렌 글리콜 함유 지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 3.5mol% 내지 약 10mol% 농도의 알킬렌 글리콜 함유 지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 4mol% 내지 약 9mol% 농도의 알킬렌 글리콜 함유 지질을 포함한다.
일부 실시형태에서, LNP는 적어도 2가지 유형의 지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 이온화 가능한 지질, 인지질, 스테롤 및 알킬렌 글리콜 함유 지질 중 2개를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 적어도 3가지 유형의 지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 이온화 가능한 지질, 인지질, 스테롤 및 알킬렌 글리콜 함유 지질 중 3개를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 적어도 4가지 유형의 지질을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 이온화 가능한 지질, 인지질, 스테롤 및 알킬렌 글리콜 함유 지질 각각을 포함한다.
(예를 들어, 본원에 기재된) LNP는 다음 성분들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (i) 약 1mol% 내지 약 95mol%(예를 들어, 약 20mol% 내지 약 80mol%) 농도의 이온화 가능한 양이온성 지질; (ii) 0.1mol% 내지 약 50mol%(예를 들어, 약 2.5mol% 내지 약 20mol%) 농도의 인지질; (iii) 약 1mol% 내지 약 95mol%(예를 들어, 약 20mol% 내지 약 80mol%) 농도의 스테롤; 및 (iv) 약 0.1mol% 내지 약 50mol%(예를 들어, 약 2.5mol% 내지 약 20mol%) 농도의 PEG 함유 지질. 한 실시형태에서, LNP는 (i)-(iv) 중 1개를 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 (i)-(iv) 중 2개를 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 (i)-(v) 중 3개를 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 각각의 (i)-(v)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i) 및 (ii)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i) 및 (iii)을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i) 및 (iv)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (ii) 및 (iii)을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (ii) 및 (iv)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (iii) 및 (iv)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i), (ii) 및 (iii)을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i), (ii) 및 (iv)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (ii), (iii) 및 (iv)를 포함한다.
(예를 들어, 본원에 기재된) LNP는 다음 성분들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (i) 약 1mol% 내지 약 95mol%(예를 들어, 약 20mol% 내지 약 80mol%) 농도의 이온화 가능한 양이온성 지질(ICL); (ii) 0.1mol% 내지 약 50mol%(예를 들어, 약 2.5mol% 내지 약 20mol%) 농도의 DSPC; (iii) 약 1mol% 내지 약 95mol%(예를 들어, 약 20mol% 내지 약 80mol%) 농도의 콜레스테롤; 및 (iv) 약 0.1mol% 내지 약 50mol%(예를 들어, 약 2.5mol% 내지 약 20mol%) 농도의 DMG-PEG2k. 한 실시형태에서, LNP는 (i)-(iv) 중 2개를 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 (i)-(v) 중 3개를 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 각각의 (i)-(v)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i) 및 (ii)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i) 및 (iii)을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i) 및 (iv)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (ii) 및 (iii)을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (ii) 및 (iv)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (iii) 및 (iv)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (iii) 및 (iv)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i), (ii) 및 (iii)을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (i), (ii) 및 (iv)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 (ii), (iii) 및 (iv)를 포함한다.
일부 실시형태에서, LNP는 약 50:1 내지 약 1:1(예를 들어, 40:1, 32:3, 6:1, 7:1, 5:1, 24:5, 26:5, 10:3, 15:2, 16:7, 18:1, 3:1, 3:2 또는 1:1)의 이온화 가능한 지질 대 인지질의 비율을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 15:2의 이온화 가능한 지질 대 인지질의 비율을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 5:1의 이온화 가능한 지질 대 인지질의 비율을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 10:1 내지 약 1:10(예를 들어, 9:1, 8:1, 8:7, 7:1, 7:5, 7:3, 6:1, 6:5, 5:1, 5:3, 4:1, 4:3, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 3:4, 1:4, 3:5, 1:5, 4:5, 1:6, 5:6, 7:6, 7:8 또는 8:9)의 이온화 가능한 지질 대 스테롤의 비율을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 1:10 내지 약 10:1(예를 들어, 1:9, 1:8, 7:8, 7:1, 7:5, 7:3, 6:1, 6:5, 5:1, 5:3, 4:1, 4:3, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 3:4, 1:4, 3:5, 1:5, 4:5, 1:6, 5:6, 7:6, 7:8, 또는 8:9)의 이온화 가능한 지질 대 알킬렌 함유 지질의 비율을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 10:1 내지 약 1:10(예를 들어, 9:1, 8:1, 8:7, 7:1, 7:5, 7:3, 6:1, 6:5, 5:1, 5:3, 4:1, 4:3, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 3:4, 1:4, 3:5, 1:5, 4:5, 1:6, 5:6, 7:6, 7:8 또는 8:9)의 인지질 대 알킬렌 함유 지질의 비율을 포함한다. 한 실시형태에서, LNP는 약 50:1 내지 약 1:1(예를 들어, 40:1, 32:3, 6:1, 7:1, 5:1, 24:1, 22:1, 20:1, 22:5, 24:5, 26:5, 10:3, 15:2, 16:7, 18:1, 3:1, 3:2 또는 1:1)의 스테롤 대 알킬렌 함유 지질의 비율을 포함한다.
한 실시형태에서, (예를 들어, 본원에 기재된) LNP는 이온화 가능한 지질, 인지질, 스테롤 및 알킬렌 글리콜 함유 지질(예를 들어, PEG-함유 지질) 중 2개를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, (예를 들어, 본원에 기재된) LNP는 이온화 가능한 지질, 인지질, 스테롤 및 알킬렌 글리콜 함유 지질(예를 들어, PEG-함유 지질) 중 3개를 포함한다. 한 실시형태에서, (예를 들어, 본원에 기재된) LNP는 이온화 가능한 지질, 인지질, 스테롤 및 알킬렌 글리콜 함유 지질(예를 들어, PEG-함유 지질) 각각을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 LNP는 5 내지 500 nm, 예를 들어 10 내지 400 nm, 20 내지 350 nm, 25 내지 325 nm, 30 내지 300 nm, 50 내지 250 nm, 60 내지 200 nm, 75 내지 190nm, 80 내지 180nm, 100 내지 200nm, 200 내지 300nm, 150 내지 250nm의 직경을 갖는다. LNP의 직경은 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 동적 광 산란, 투과 전자 현미경(TEM) 또는 주사 전자 현미경(SEM)에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP는 50 내지 100nm, 70 내지 100nm, 및 80 내지 100nm의 직경을 갖는다. 한 실시형태에서, LNP는 약 90nm의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 LNP는 약 30nm 보다 큰 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 35nm, 약 40nm, 약 45nm, 약 50nm, 약 60nm, 약 70nm, 약 80nm, 약 90nm, 약 100nm, 약 120nm, 약 140 nm, 약 160 nm, 약 180 nm, 약 200 nm, 약 225 nm, 약 250 nm, 약 275 nm 또는 약 300 nm 보다 큰 직경을 갖는다. 한 실시형태에서, LNP는 약 70nm 보다 큰 직경을 갖는다. 한 실시형태에서, LNP는 약 90nm 보다 큰 직경을 갖는다. 한 실시형태에서, LNP는 약 180nm 보다 큰 직경을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 복수의 LNP는 약 40 nm 내지 약 180 nm 범위의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 복수의 LNP는 약 50 nm 내지 약 150 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 복수의 LNP는 약 50 nm 내지 약 120 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 복수의 LNP는 약 60 nm 내지 약 120 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 복수의 LNP는 약 40 nm, 약 45 nm, 약 50 nm, 약 60 nm, 약 70 nm, 약 80 nm, 약 90 nm, 약 100 nm, 약 120 nm, 약 140nm, 약 160nm, 약 180nm의 평균 직경을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 나노입자 또는 복수의 나노입자는 -100 mv 미만, 예를 들어, -90 mv, -80 mv, -70 mv, -60 mv, -50 mv, -40mv, -30mv 및 -20mv 미만의 평균 중성 내지 음의 표면 전하를 갖는다. 일부 실시형태에서, 나노입자 또는 복수의 나노입자는 -100 mv 내지 100 mv, -75 mv 내지 0, 또는 -50 mv 내지 -10 mv의 중성 내지 음의 표면 전하를 갖는다.
일부 실시예에서, 다수의 나노입자 중 적어도 5%(예를 들어, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%)의 나노입자는 -100mv 미만의 평균 중성 내지 음의 표면 전하를 갖는다. 일부 실시형태에서, 나노입자 또는 복수의 나노입자는 pH 7.4에서 -20 mv 내지 +20, -10 mv 내지 +10 mv, 또는 -5 mv 내지 +5 mv의 평균 표면 전하를 갖는다. 전하가 중성인 LNP는 양이온성 LNP에 비해 약동학 및 생물학적 성능이 개선되었다.
지질 나노입자(LNP) 제조
LNP의 제조 방법은 제1 용액을 제2 용액과 혼합하는 단계를 포함할 수 있다. 혼합 단계는 표준 액체 혼합 기술, 예를 들어, 프로펠러 혼합, 소용돌이 용액을 사용하여, 또는 바람직하게는 미세유체 혼합 또는 고효율 T-혼합을 통해 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 용액은 지질 또는 복수의 지질 및 핵산을 포함하며, 여기서 모든 성분은 물/용매 시스템에서 용해된다. 용매는 임의의 수혼화성 용매(예를 들어, 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 디메틸설폭사이드, 디옥산 또는 테트라하이드로푸란)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 용액은 적은 백분율의 물 또는 pH 완충수를 포함한다. 제1 용액은 부피로 최대 적어도 60%, 예를 들어, 부피로 최대 적어도 약 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% 또는 60%의 물을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, 제1 용액은 부피로 약 0.05% 내지 60%의 물, 예를 들어, 약 0.05% 내지 50%, 약 0.05% 내지 40%, 또는 약 5% 내지 20%의 물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 용액은 단일 유형의 지질, 예를 들어, 이온화 가능한 지질, 인지질, 스테롤 또는 PEG-함유 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 용액은 복수의 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 지질은 이온화 가능한 지질, 인지질, 스테롤 또는 PEG-함유 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 지질은 콜레스테롤, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC),1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌2000(DMG-PEG2k) 또는 α-(3'-{[1,2-디(미리스틸옥시)프로판옥시] 카르보닐아미노}프로필)-ω-메톡시, 폴리옥시에틸렌 (PEG2000-C-DMG), 및 이온화 가능한 지질을 포함한다. 복수의 지질은 임의의 비율로 존재할 수 있다. 한 실시형태에서, 복수의 지질은 이온화 가능한 지질 또는 스테롤, 인지질, 스테롤, 상기 지질의 PEG-함유 지질 또는 이들의 조합을 특정 비율(예를 들어, 본 명세서에 기재된 비율)로 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 용액은 물이다. 일부 실시형태에서, 제2 용액은 pH 3-6(예를 들어, 약 3, 약 4, 약 5, 또는 약 6의 pH)을 갖는 수성 완충액이다. 제2 용액은 로딩 성분, 예를 들어, 핵산(예를 들어, mRNA)을 포함할 수 있다. 제2 용액은 작은 백분율의 수혼화성 유기 용매를 포함할 수 있다. 제1 용액은 부피로 최대 적어도 60%의 적어도 하나의 수혼화성 유기 용매, 예를 들어, 부피로 최대 적어도 약 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%,10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트의 적어도 하나의 유기 용매(예를 들어, 수혼화성 유기 용매)를 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, 제2 용액은 부피로 약 0.05% 내지 60%의 유기 용매, 예를 들어, 부피로 약 0.05% 내지 50%, 약 0.05% 내지 40%, 또는 약 5% 내지 20%의 유기 용매(예를 들어, 수혼화성 유기 용매)를 포함한다. 완충 수용액은 시트레이트 완충 수용액일 수 있다. 일부 실시형태에서, 수성 완충액은 pH 4-6(예를 들어, 약 4, 약 5, 또는 약 6의 pH)을 갖는 시트레이트 완충액이다. 한 실시형태에서, 수성 완충 용액은 pH가 약 6인 시트레이트 완충 용액이다.
일부 실시형태에서, LNP 현탁액을 포함하는 제1 용액과 제2 용액의 혼합물을 포함하는 용액은 희석될 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP 현탁액을 포함하는 제1 용액과 제2 용액의 혼합물을 포함하는 용액은 희석될 수 있다. 물, 산, 염기 또는 수성 완충액을 첨가하여 LNP 현탁액의 pH를 희석 또는 조정할 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP 현탁액의 pH의 희석 또는 조정은 수행되지 않는다. 일부 실시형태에서, LNP 현탁액의 pH의 희석 및 조정 모두가 수행된다.
일부 실시형태에서, 과량의 시약, 용매, 캡슐화되지 않은 핵산은 접선 유동 여과(TFF)(예를 들어, 정용여과)에 의해 LNP 현탁액으로부터 제거될 수 있다. 유기 용매(예를 들어, 에탄올) 및 완충액은 또한 TFF를 사용하여 LNP 현탁액으로부터 제거될 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP 현탁액은 TFF가 아니라 투석을 거친다. 일부 실시형태에서, LNP 현탁액은 투석이 아니라 TFF를 거친다. 일부 실시형태에서, LNP 현탁액은 투석 및 TFF 모두를 거친다.
한 양상에서, 본 발명은 지질층을 분해하여 캡슐화 및/또는 포획된 핵산(들)을 방출하기에 적합한 기간 동안 핵산을 포함하는 LNP의 샘플을 세제(예를 들어, Triton X-100, 또는 음이온성 세제(예를 들어, 소듐 도데실 설페이트(SDS)(그러나 이에 제한되는 것은 아님), 또는 비이온성 세제, 예를 들어, β옥틸글루코사이드, 또는 쯔비터젠트(쯔비터젠트) 3-14(그러나 이에 제한되는 것은 아님))를 포함하는 유체로 처리하는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 한다. 한 실시형태에서, 상기 방법은 방출된 핵산(들)의 존재, 부재 및/또는 양에 대해 샘플을 분석하는 단계를 추가로 포함한다.
리간드를 포함하는 LNP
본 발명의 일부 양상은 세포 표면 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 리간드(또한 본원에서 표적화 리간드로 지칭됨)를 포함하는 LNP에 관한 것이며, 여기서 항원에 대한 리간드의 결합은 리간드의 내재화를 유도한다. 일부 실시형태는 본원에 기술된 리간드를 포함하는 LNP를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 표적화 리간드는 지질 접합체에 결합된다. 예를 들어, 지질 접합체는 친수성 중합체-지질 접합체, 예를 들어, PEG(2000)-DSPE 또는 PEG(2000)-DSG(그러나 이에 제한되지 않음)일 수 있다. 커플링은 당업계에 공지된 다양한 화학에 의해 달성될 수 있다(예를 들어, Bioconjugates Techniques (Greg T. Hermanson), 3rd Edition, 2013, Elsevier 참조). 일부 실시형태에서, 표적화 리간드는 링커를 통해 지질 접합체에 커플링된다. 링커 분자는 일반적으로 친수성 중합체 사슬, 예를 들어, 지질 도메인(인지질 또는 스테롤)에 PEG-말단 연결된 사슬을 포함하고 말단에 말레이미드와 같은 티올 반응성 작용기를 포함한다. PEG 크기 스페이서, 다양한 탄화수소 사슬 길이의 포스파티딜에탄올아민(PE) 지질 앵커, 및 말단 말레이미드 또는 요오도아세테이트 기를 포함하는 링커는 현재 Avanti Polar Lipids사(미국 앨라배마) 및 NOF Corporation사(일본)에서 상업적으로 수득가능하다. 일반적으로 사용되는 전략 중 하나는 티올 반응성 지질중합체 링커, 예를 들어, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[말레이미드(폴리에틸렌 글리콜)-2000(Mal-PEG-DSPE)에 단백질을 커플링시키는 것이다. 바람직하게는, 관심 단백질은 단일 지점 접합을 보장하기 위해 C-말단에 하나의 시스테인을 함유하도록 조작된다. 대안적으로, F(ab)2 또는 Fab'는 IgG로부터 효소적으로 생성될 수 있고 디티오트레이톨(DTT), 머캅토에틸아민, (트리스(2-카르복시에틸)포스핀) TCEP-HCL과 같은 환원제를 사용한 다이설파이드 결합의 환원에 의해 Mal-PEG-DSPE에 커플링하는 반응성 시스테인 티올 기를 생성한다. 환원된 시스테인과 Mal-PEG-DSPE의 반응은 pH 5.5-7.5, 예를 들어, pH 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 그리고 바람직하게는 pH 6.0의 수성 완충액에서 일어난다. 반응은 일반적으로 4시간 이내에 완료된다. 소량의 시스테인 또는 머캅토에탄올을 첨가하여 미반응 말레이미드기와 반응시켜 커플링 반응을 퀀칭한다. 후속 막 삽입 단계 이전에 접합되지 않은 단백질을 제거할 필요는 없지만 저장 목적으로 접합체를 정제하고 보다 정확한 특성화를 가능하게 하는 것이 유용하다. 지질중합체 미셀의 크기가 크기 때문에(당량 분자량 850kDa; Nellis 외, 2005a), 크기 배제 크로마토그래피(SEC)가 이를 수행하는 편리한 방법이다. 이러한 단백질-접합체는 다양한 기술에 의해 특성화된다. 예를 들어, 순도는 SEC로 결정하고, 분자량은 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)로 정량하고, 단백질 융점은 시차 주사 열량계(DSC)로, 등전점 결정은 모세관 전기영동으로, 표적 결합 친화도는 표면 플라즈몬 공명(BIAcore) 및 생물층 간섭계(ForteBio)로 정량화된다.
표적화 리간드의 예는 Her2 수용체, 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 수용체, 에프린 A2 수용체, CLEC9A 수용체, DEC205 수용체, CLEC4A 수용체, XCR1 수용체, CD141 수용체, HLA-DR 수용체, 트랜스페린 수용체 1형, 트랜스페린 수용체 2형, VEGF 수용체, PDGF 수용체, 인테그린, NGF 수용체, CD19, CD20, CD22, CD33, CD43, CD38, CD56, CD69, 전립선 특이적 막 항원(PSMA) 또는 다양한 다른 세포 표면 수용체, 또는 당접합체, 프로테오글리칸, 당단백질 및 당지질, 예를 들어, 아시알로당단백질 수용체(ASGPR)에 결합하는 당접합체 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 리간드, 또는 엽산 수용체를 표적하는 엽산-PEG-DSPE와 같은 소분자 접합체를 비롯하여, 세포 표면 수용체에 대한 항체 또는 항체 단편일 수 있다.
한 실시형태에서, 표적화 리간드는 항-DEC205 항체이다. DEC-205(CD205)는 주로 수지상 세포(DC)에 의해 발현되는 유형 I 세포 표면 단백질이다. 이는 림프 조직, 골수 유래 DC, 랑게르한스 세포의 T 세포 영역에서 서로 맞물리는 DC에서 발견되며 대식세포 및 T 세포에서 낮은 수준으로 발견되며 DC의 성숙 동안 상당히 상향 조절된다. DEC-205의 발현은 CD8a의 발현과 양의 상관관계가 있으며, 이들 모두 림프구 DC에서 높은 수준으로 골수성 DC에서 낮은 수준으로 발견된다. DEC-205는 또한 B 세포에 의해 적당한 수준으로 발현되며 pre-B 세포에서 B 세포로의 전이 동안 상향 조절된다. 재조합 항인간 DEC205 항체는 Creative Biolabs사에서 상업적으로 수득할 수 있다.
한 실시형태에서, LNP에 대한 항원 특이적 표적화는 LNP를 표적화 리간드-지질 접합체와 공동-인큐베이션함으로써 리간드-표적화된 LNP를 제조함으로써 이루어진다. 표적화 리간드-지질 접합체는 LNP 제조 전에 제조될 수 있다(Nellis 외, Biotechnol Prog. 2005 Jan-Feb;21(1):205-20 참조).
한 실시형태에서, LNP는 항체 또는 단편-PEG-인지질 미셀 또는 다른 리간드-접합체와 공동 인큐베이션되고 밤새 37℃에서 가열되어 LNP 외막 내부로의 항체 접합체 삽입을 촉진한다(Nellis 외, Biotechnol Prog. 2005 Jan-Feb 21(1):221-32). 또 다른 양상에서, 삽입은 더 짧은 시간 동안, 예를 들어, 37℃에서 0.5-8시간, 또는 바람직하게는 37℃에서 0.5-2시간 동안 승온에서 가열함으로써 달성될 수 있다. 미셀 삽입은 얼음에 LNP를 넣어 온도를 신속히 내림으로써 퀀칭될 수 있으며, 그 후 LNP를 4℃에서 냉장고에 보관가능하다. 첨가된 지질 접합체의 총량은 총 지질의 0.02%-2%, 또는 바람직하게는 총 지질의 0.1%-1%, 또는 바람직하게는 0.1%-0.5% 일 수 있다. 항체-지질 접합체의 포함 효율은 SDS 또는 기타 세제에 의한 LNP 해리 후 동일한 단백질의 표준 곡선과 비교하여 SDS-PAGE에 의해 측정될 수 있다(Nellis 외, Biotechnol Prog. 2005 Jan-Feb;21(1):205-20). 다른 표적 리간드들의 삽입 효율은 증발 광산란 검출기(UPLC-ELSD)가 장착된 초고성능 액체 크로마토그래피로 측정할 수 있다(Gauthier 외, J Mol Sci. 2019 Nov 12;20(22):5669).
도 2는 Fab' 항체 단편의 환원된 c-말단 시스테인과 말레이미드 말단-폴리(에틸렌 글리콜) 2000 유도체화 디스테아로일포스파티딜에탄올아민의 반응을 나타낸다. R1과 R2는 스테아르산이다. 최종 항체 지질중합체 접합체는 지질 나노입자의 외부 지질층에 후속적으로 삽입되어 능동적으로 표적화되는 중간체이다.
LNP 표적화는 제형에 지질을 첨가함으로써 달성될 수도 있다. 예를 들어, 포스파티딜세린은 아폽토시스 동안 원형질막의 외부 표면에 재분포되는 것으로 알려져 있으며 이는 식세포 유인을 위한 분자 자극이다(Fadok 외, Curr Biol. 2003 Aug 19;13(16):R655-7). 포스파티딜세린(PS) 및 포스파티딜글리세롤(PG)은 수지상 세포에 의해 인식되며 수지상 세포의 흡수 및 활성화를 유도할 수 있다. LNP 표적화는 특정 음이온성 인지질을 상기 제형에 첨가함으로써 달성될 수도 있다(표 3). 예를 들어, 포스파티딜세린은 아폽토시스 동안 원형질막의 외부 표면에 재분포되는 것으로 알려져 있으며 이는 식세포 유인을 위한 분자 자극이다(Fadok 외, Curr Biol. 2003 Aug 19;13(16):R655-7). 포스파티딜세린(PS) 및 포스파티딜글리세롤(PG)은 수지상 세포에 의해 인식되며 수지상 세포의 흡수 및 활성화를 유도할 수 있다(Caronni 외, Nat Comm. 2021 April 14; 12: 2237-2253; Ischihashi 외, PLOS One 2013). 음이온성 인지질이 이전에 리포솜과 관련하여 사용되었지만, 이온화 가능한 양이온성 지질의 결합 부위에 대해 음이온성 헤드 기가 mRNA의 인산염 백본과 경쟁할 수 있기 때문에, 또는 표면 전하를 변경함으로써 세포내 탈출을 억제할 수 있기 때문에, 또는 형성 또는 저장 중에 LNP를 응집시킬 수 있기 때문에, 응축된 핵산을 포함하는 지질 나노입자에 이들을 포함시키는 것은 예상할 수 없는 것이다.
표 3. 음이온성 인지질 표적화 모이어티
한 실시형태에서, 음이온성 표적화 리간드는 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜글리세롤(PG), N-글루타릴-포스파티딜에탄올아민(N-glu-PE) 또는 N-숙시닐-포스파티딜에탄올아민(N-Suc-PE) 기로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 사용되는 음이온성 인지질은 포스파티딜세린이다. 또 다른 실시형태에서, 포스파티딜세린은 세린의 L-이성질체를 함유한다. 또 다른 실시형태에서, 디미리스토일포스파티딜-L-세린(DMPS), 디팔미토일포스파티딜-L-세린(DPPS) 또는 디스테아로일포스파티딜-L-세린(DSPS)의 경우와 같이 포스파티딜세린에 대해 아실 사슬은 완전히 포화된다. 바람직한 실시형태에서, 사용되는 PS는 DPPS 또는 DSPS의 L-이성질체이다. 포스파티딜세린은 또한, 예를 들어, 하나의 아실 사슬이 스테아르산이고 또 다른 하나가 팔미트산인 비대칭 아실 사슬 조성물을 함유할 수 있다.
한 실시형태에서, PS 또는 PG는 LNP의 총 지질 함량의 약 0.1 mol% 내지 약 20 mol%, 약 0.1 mol% 내지 약 10 mol%, 약 0.1 mol% 내지 약 5 mol%, 약 0.5 mol% 내지 약 20 mol%, 약 0.5 mol% 내지 약 10 mol%, 약 0.5 mol% 내지 약 5 mol%, 약 1 mol% 내지 약 20 mol%, 약 1 mol% 내지 약 10 mol%, 또는 약 1 mol% 내지 약 5 mol%의 농도로 LNP 지질 제형에 첨가된다. 한 실시형태에서, PS는 LNP의 총 지질 함량의 약 1 mol% 내지 약 20 mol%, 약 2.5 mol% 내지 약 10 mol%, 약 3 mol% 내지 약 9 mol%, 또는 약 4 mol% 내지 약 8 mol%.의 농도로 LNP 지질 제형에 첨가된다.
한 실시형태에서 PS 지질은 DODAP, AKG-OA-DM2, O-11769, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA, DLin-KC3-DMA, ALC-0315, 및 SM-102를 비롯하여, 해당 분야에 공지된 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함하는 LNP 조성물에 포함된다.
또 다른 실시형태에서 PS 지질은 화학식 I, II, III의 ICL, 이의 조합 또는 이의 약학적 염을 포함하는 LNP 조성물에 포함된다. 다른 실시형태에서, PS 지질은 3 내지 8, 4 내지 7, 또는 5 내지 6의 N/P 비율을 사용하여 LNP 조성물에 포함된다.
일부 양상에서, 핵산을 세포로 전달하는 방법이 제공되며, 이 방법은 세포 표면 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 리간드(또한 본원에서 표적화 리간드로 지칭됨)를 포함하는 LNP를 포함하는 조성물과 세포를 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 항원에 대한 리간드의 결합은 리간드의 내재화를 유도한다. 일부 실시형태에서, 표적화 리간드는 내재화 항체, 또는 이의 단편, 소분자 접합체 또는 당접합체일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 특정 세포 표면 항원에 대한 표적화 리간드의 결합은, 내재화 조건하에서 세포와 접촉하여 인큐베이션될 때 적어도 100,000개 또는 적어도 1,000,000개의 항원 분자를 발현하는 세포에 의해 부착된 표적화 리간드로 LNP의 내재화를 유도한다.
표 4. 디알킬 및 분지형 이온화 가능한 양이온성 지질의 예시
표 4. 디알킬 및 분지형 이온화 가능한 양이온성 지질의 예시(계속)
조성물
일부 실시형태에서, 지질 나노입자 조성물은 지질 및 핵산을 포함하고, 지질 나노입자는 화학식 I, II, III의 화합물, 또는 이의 조합 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함한다.
일부 실시형태에서, LNP는 화학식 (IV)의 구조를 갖는 이온화 가능한 지질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 약학적 부형제를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 수성 매질에 존재한다.
일부 실시형태에서, 핵산은 화학식 I, II, III, IV의 화합물 또는 이의 조합의 화합물과 함께 지질 나노입자에 포획되며, 여기서 핵산은 RNA 또는 DNA이다. 일부 실시형태들에서, 핵산은 mRNA이다. 일부 실시형태들에서, 핵산은 siRNA이다. 일부 실시형태들에서, 핵산은 DNA이다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 포스파티딜콜린 및 스테롤을 포함하는 막을 포함한다. 일부 실시형태에서, 스테롤은 콜레스테롤이다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 포스파티딜콜린, 이온화 가능한 양이온성 지질(ICL)을 포함하는 막을 포함한다. 일부 실시형태에서, ICL은 화학식 I, II, III 또는 IV의 구조 및 콜레스테롤을 가지며, 여기서 막은 지질 나노입자의 내부를 수성 매질로부터 분리한다. 일부 실시형태에서, ICL은 표 1A 및 표 2에 나타낸 구조를 갖는다. 일부 실시예에서, ICL은 표 1B에 나타낸 구조를 갖는다. 일부 실시형태에서, 포스파티딜콜린은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 또는 수첨 대두 포스파티딜콜린(HSPC)이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 양이온성 지질 대 콜레스테롤 몰비는 약 65:35 내지 40:60이다. 일부 실시형태에서, ICL 대 콜레스테롤 몰비는 약 60:40 내지 약 45:55이다.
일부 실시형태에서, 포스파티딜콜린 대 콜레스테롤 몰비는 약 1:5 내지 약 1:2이다.
일부 실시형태에서, 막은 중합체-접합 지질을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 ICL, DSPC, 콜레스테롤 및 중합체-접합 지질을 약 49.5:10.3:39.6:2.5 몰비로 포함한다.
일부 실시형태에서, 중합체-접합 지질은 PEG(2000)-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG) 또는 PEG(분자량 2,000)-디미리스토일포스파티딜에탄올아민(PEG-DMPE)이다.
본 발명의 조성물은, 예를 들어, 정맥내, 비경구, 복강내 또는 국소 경로를 통해 전신 전달을 수행하기 위한 다양한 경로로 투여될 수 있다. 조성물은 대상체에게 정맥내, 피하 또는 복강내로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 대상체에게 핵산을 생체내 전달하기 위한 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 비경구 투여를 위한 액체 약학적 제형이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 피하, 근육내 또는 피내 투여를 위한 액체 약학적 제형이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 동결건조된 분말의 형태이며, 이는 후속적으로 투여 전에 수성 매질과 함께 재구성된다.
사용 방법.
수지상 세포의 표적화
수지상 세포(DC)는 적응 면역을 개시하고 조절하는 데 중심적인 역할을 하는 특수화된 항원 제시 세포이다. 강력한 항원(Ag) 제시 능력과 뚜렷한 T 세포 반응을 생성하는 능력으로 인해, DC에 Ag를 효율적이고 특이적으로 전달하는 것은 종양이나 병원체에 대한 Ag 특이적 이펙터 및 기억 세포를 생성하기 위한 초석이다.
수지상 세포는 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), IL-4 및 IFN-감마를 추가하여 시험관 내에서 단핵구 유래 DC를 분화시킴으로써 인간 혈액 단핵구로부터 생성될 수 있다. 배양 세포는 수지상 및 가려진 형태를 모두 나타내며, 전자는 부착형이고 후자는 현탁형이다. 표현형으로는, 이들은 CD1a-/dim, CD11a+, CD11b++, CD11c+, CD14dim/-, CD16a-/dim, CD18+, CD32dim/-, CD33+, CD40+, CD45R0+, CD50+, CD54+, CD64-/dim, CD68+, CD71+, CD80dim, CD86+/++, MHC 클래스 I++/, HLA-DR++/ , HLA-DP+ 및 HLA-DQ이다(Geiseler 외, Dev Immunol. 1998;6(1-2):25-39).
대안적으로, 인간 1차 혈액 수지상 세포주가 개발되었으며 Creative Biolabs사로부터 상업적으로 수득가능하다.
CD8+ T 세포는 IL2, IFN-γ 및 TNF를 생산할 수 있는데, 이들은 마이코박테리움 투베르쿨로시스 감염 동안 중요한 기능을 하는 것으로 알려진 사이토카인이다. 중요하게는, CD8+ T 세포는 과립-매개 기능(퍼포린, 그랜자임 및 그래뉼리신을 통해) 또는 아폽토시스를 유도하는 Fas-Fas 리간드 상호작용을 통해 마이코박테리움 투베르쿨로시스에 감염된 세포를 사멸시키는 세포용해 기능을 가지고 있다. 인간에서 CD8+ T 세포는 마이코박테리움 투베르쿨로시스를 직접 사멸시킬 수 있는 그래뉼리신을 생산할 수 있다. 따라서 DC에 전달된 항원 생성 mRNA LNP는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 감염에 맞서 싸우기 위해 CD8+ T 세포 반응을 자극할 것으로 예상된다.
CD8+ T 세포는 고전적 및 비고전적 MHC 분자에 의해 제시된 M. 투베르쿨로시스 특이적 항원(펩티드)을 인식할 수 있다. 고전적으로 제한된 CD8+ T 세포는 고전적인 MHC Ia(HLA-A, -B, -C) 분자와 관련하여 항원 제시 세포에 의해 제시된 항원을 인식하는 것으로 확인되었다. 비고전적으로 제한되는 CD8+ T 세포에는 HLA-E 분자(비-MHC 1a), 그룹 1 CD1 분자와 관련된 당지질 및 MHC I 관련 분자(MR1)의 맥락에서 Mg 항원을 인식할 수 있는 CD8+ T 세포, 예를 들어, 점막 관련 불변 T 세포(MAIT)가 포함된다. 마지막으로, γδ T 세포는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 감염에 대한 반응으로 선천 기능과 적응 기능을 모두 가진 CD8(및 CD4) T 세포의 별도 집단을 나타낸다. CD8+ T 세포는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 감염에 반응하여 직접적인 기능을 수행하는 것으로 나타났지만 전체 숙주 면역 반응(예를 들어, 최적의 CD4 T 세포 기능을 제공하기 위한 상호 작용)에서 많은 상이한 기능들을 조율하는 데 중요한 역할을 한다.
한 실시형태에서, LNP는 배양된 인간 수지상 세포에 적절한 농도(예: 1-5μg/mL mRNA)로 첨가될 수 있다. 세포를 흡수시키고 항원을 발현시킬 수 있게 하는 일정 시간 후, 인간 T 세포(HemaCare)를 첨가할 수 있고 세포 배양 배지를 INF-γ에 대해 다양한 시간에 Elisa(R&D Systems, DIF50C)로 샘플링한다. 대안적으로, 세포는 CD8+ 마커 또는 세포내 INFγ생성(PE 항-인간 IFN-γ 항체, Biolegend)에 대해 유동 세포측정법에 의해 분석될 수 있다.
한 실시형태에서, LNP는 상기 약술된 임의의 투여 경로에 의해 0.01-5 mg/kg mRNA의 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, LNP의 일부는 DC 세포에 흡수되는 반면, 대부분은 간 및 비장에 축적될 것이다. DC 세포는 항원성 펩티드를 발현할 수 있고, MHC I 제시를 위해 그것을 처리하고 나이브 T 세포에 제시하기 위해 림프절로 이동하여 항원에 대한 기억 T 세포의 교육을 유도할 수 있다.
한 실시형태에서, 항-DEC205-PEG-DSPE와 같은 표적화 리간드로 변형된 LNP는 0.01-5 mg/kg mRNA의 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 더 높은 비율의 LNP가 DC 세포로 흡수될 수 있어, 비표적화 LNP에 비해 항원성 펩티드의 생산을 증가시키고 병원체에 대한 백신접종을 보다 효율적이게 할 수 있다. 수지상 세포에 대한 추가적인 표적 리간드는 CLEC9A, CLEC4A, XCR1, CD141 및 HLD-DR을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, R&D Systems의 종 특이적 IFN-감마 Quantikine ELISA 키트로 INFγ혈장 수준을 측정하여 생체 내 생산된 항원에 대한 CD8+ 반응성을 평가할 수 있다.
일부 실시형태에서, LNP 조성물은 연장된 혈장 반감기 및 mRNA의 안정한 캡슐화와 같은 바람직한 약동학적 특성을 제공한다. 혈장 반감기는 면역적격 마우스에 정맥 주사한 후 6시간 또는 24시간 후에 혈액에 남아 있는 주사된 용량(ID)의 백분율로 측정될 수 있다. 혈장에서 24시간에 걸친 mRNA 캡슐화의 안정성은 마우스에서 iv 투여 후 mRNA-대-지질 비율(mRNA/L 비율)의 변화에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 혈액에 남아있는 캡슐화된 mRNA의 백분율은 6시간에 주입된 용량의 20% 초과, 바람직하게는 30% 초과, 가장 바람직하게는 40% 초과이다. 24시간 후 혈액에 남아 있는 퍼센트는 바람직하게는 주입된 용량의 10% 초과, 더 바람직하게는 20% 초과이다.
본 명세서에서는 마이코박테리움 투베르쿨로시스와 같은 마이코박테리아 감염, 또는 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스(MRSA)와 같은 그람 양성 박테리아를 예방하는 방법을 개시한다. 추가적인 마이코박테리아 및 그람 양성 박테리아에는 마이코박테리움 아비움 콤플렉스, 마이코박테리움 레프라에, 마이코박테리움 고르도나에, 마이코박테리움 앱세서스, 마이코박테리움 앱세서스, 마이코박테리움 뮤코제니쿰, 스트렙토코키, 반코마이신 내성 엔테로코키(VRE), 스타필로코쿠스 뉴모니아에, 엔테로코쿠스 패시움, 스트렙토코쿠스 아갈락티아에, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 스트렙토코쿠스 피오게네스, 비리단스 그룹 스트렙토코키, 리스테리아 모노사이토게네스, 노카르디아, 및 코리네박테리움이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
제2 면역 반응을 유도하기 위한 백신의 투여는 MHC 클래스 II 제시된 에피토프를 제공할 수 있는데, 이는 MHC 제시된 에피토프들을 유도한 항원을 발현하는 세포에 대해 CD4 + 헬퍼 T 세포 반응을 유도할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제2 면역 반응을 유도하기 위한 백신의 투여는 MHC 클래스 I 제시된 에피토프를 제공할 수 있는데, 이는 MHC 제시된 에피토프들을 유도한 항원을 발현하는 세포에 대해 CD8 + T 세포 반응을 유도할 수 있다. 또한, 제2 면역 반응을 유도하기 위한 백신의 투여는 하나 이상의 네오-에피토프(알려진 네오 에피토프 포함) 뿐만 아니라 암 특이적 체세포 돌연변이를 함유하지 않지만 암세포에 의해 발현되고 바람직하게는 암 세포에 대한 면역 반응, 바람직하게는 암 특이적 면역 반응을 유도하는 하나 이상의 에피토프를 제공할 수 있다.　한 실시형태에서, 제2 면역 반응을 유도하기 위한 백신의 투여는 신생 에피토프를 제공하는데, 이는 MHC 클래스 II-제시된 에피토프인 및/또는 MHC 제시된 에피토프가 유래된 항원을 발현하는 세포에 대해 CD4 + 헬퍼 T 세포 반응을 유도할 수 있으며, 뿐만 아니라, 상기 투여는 암-특이적 체세포 돌연변이를 함유하지 않는 에피토프를 제공하는데, 이는 MHC 클래스 I-제시된 에피토프인 및/또는 MHC 제시된 에피토프가 유래된 항원을 발현하는 세포에 대해 CD8 + T 세포 반응을 유도할 수 있다. 한 실시형태에서, 에피토프는 암 특이적 체세포 돌연변이를 함유하지 않는다.　
“세포 면역 반응”, “세포 반응”, “항원에 대한 세포 반응” 또는 유사한 용어는 항원을 클래스 I 또는 클래스 II MHC로 제시하는 것을 특징으로 하는 세포에 대한 세포 반응을 포함하고자 한다. 세포 반응은 “헬퍼 세포” 또는 “살해 세포”로 작용하는 T 세포 또는 T 림프구라고 하는 세포와 관련이 있다. 헬퍼 T 세포(CD4+T 세포라고도 함)는 면역 반응을 조절하고 살해 세포(세포독성 T 세포, 세포용해 T 세포, CD8+T 세포 또는 CTLS라고도 함)는 암 세포와 같은 질병 세포를 사멸시켜, 더 많은 질병 세포의 생성을 방지하는 중심적인 역할을 한다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 발현된 항원을 발현하고 바람직하게는 이러한 발현된 항원을 클래스 I MHC로 제시하는 마이코박테리움에 대한 항-마이코박테리움 투베르쿨로시스 CTL 반응의 자극을 포함한다.
본 발명에 따른 “항원”은 면역 반응을 유도할 임의의 물질을 포함한다. 특히, “항원”은 항체 또는 T-림프구(T 세포)와 특이적으로 반응하는 임의의 물질, 바람직하게는 펩티드 또는 단백질에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 용어 “항원”은 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 임의의 분자를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 맥락에서 항원은 선택적으로 가공 후, 바람직하게는 항원(항원을 발현하는 세포 포함)에 특이적인 면역 반응을 유도하는 분자이다. 본 발명에 따르면, 면역 반응의 후보인 임의의 적합한 항원이 사용될 수 있으며, 여기서 면역 반응은 바람직하게는 세포 면역 반응이다. 본 발명의 실시형태의 맥락에서, 항원은 바람직하게는 세포, 바람직하게는 MHC 분자의 맥락에서 질병 세포, 특히 암 세포를 포함하는 항원 제시 세포에 의해 제시되며, 이는 항원에 대한 면역 반응을 초래한다. 항원은 바람직하게는 자연 발생 항원에 해당하거나 이로부터 유래된 생성물이다. 이러한 자연 발생 항원은 종양 항원을 포함할 수 있다.　
본원에 사용된 “항원 펩티드”는 면역 반응, 바람직하게는 항원의 발현 및 바람직하게는 이러한 항원의 제시를 특징으로 하는 항원 또는 세포들, 예를 들어, 질병 세포, 특히 암 세포에 대한 세포 반응을 자극할 수 있는 항원의 일부 또는 단편에 관한 것이다. 바람직하게는, 항원 펩티드는 클래스 I MHC를 갖는 항원의 제시를 특징으로 하는 세포에 대한 세포 반응을 자극할 수 있고 바람직하게는 항원 반응성 세포독성 T-림프구(CTL)를 자극할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항원 펩티드는 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 제시된 펩티드이거나 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 제시된 펩티드를 생성하도록 가공될 수 있다. 바람직하게는, 항원 펩티드는 항원 단편의 아미노산 서열에 실질적으로 상응하는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 항원의 상기 단편은 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 제시된 펩티드이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항원 펩티드는 이러한 단편의 아미노산 서열에 실질적으로 상응하는 아미노산 서열을 포함하고 이러한 단편, 즉 항원으로부터 유도된 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 제시 펩티드를 생성하도록 가공된다. 펩티드가 곧바로, 즉, 가공 없이, 특히, 절단 없이 제시되어야 한다면, MHC 분자, 특히, 클래스 I MHC 분자에 결합하기에 적합한 길이, 바람직하게는 7-20개 길이, 더 바람직하게는 7-12개 아미노산 길이, 더 바람직하게는 8-11개 아미노산 길이, 특히, 9 또는 10개 아미노산 길이를 가진다.　
전문 항원 제시 세포의 주요 유형은 가장 넓은 범위의 항원을 제시하는 수지상 세포이며 그리고 아마도 가장 중요한 항원 제시 세포인, 대식세포, B 세포 및 특정 활성화된 상피 세포일 것이다. 수지상 세포(DC)는 말초 조직에서 포획된 항원을 MHC 클래스 II 및 I 항원 제시 경로 모두를 통해 T 세포에 제시하는 백혈구 집단이다.　수지상 세포가 면역 반응의 강력한 유도인자이며 이 세포의 활성화가 항종양 면역 유도를 위한 중요한 단계라는 것은 잘 알려져 있다. 수지상 세포는 “미성숙” 및 “성숙” 세포로 편리하게 분류되며, 이는 2개의 잘 특성화된 표현형을 구별하는 간단한 방법으로 사용될 수 있다.
그러나 이 명명법은 분화의 모든 가능한 중간 단계를 배제하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 미성숙 수지상 세포는 항원 흡수 및 처리 능력이 높은 항원 제시 세포로서 특징되며, Fcg 수용체 및 만노스 수용체의 높은 발현과 상관관계가 있다. 성숙 표현형은 전형적으로 이들 마커의 낮은 발현, 그러나 T 세포 활성화를 담당하는 세포 표면 분자, 예를 들어, 클래스 I 및 클래스 II MHC, 접착 분자(예를 들어, CD54 및 CD11) 및 공동자극 분자(예를 들어, CD40, CD80, CD86 및 4-1BB)의 높은 발현을 특징으로 한다. 수지상 세포 성숙은 수지상 세포 활성화 상태로 지칭되는데, 이 상태에서 이러한 항원 제시 수지상 세포는 T 세포 프라이밍을 유도하지만, 미성숙 수지상 세포에 의한 제시는 내성을 초래한다. 수지상 세포 성숙은 주로 선천적 수용체에 의해 검출되는 미생물 특성(박테리아 DNA, 바이러스 RNA, 내독소 등)을 가지는 생물분자, 전염증성 사이토카인(TNF, IL-1, IFNs), CD4OL에 의한 수지상 세포 표면의 CD40의 결찰 및 스트레스가 많은 세포 사멸을 거치는 세포에서 방출되는 물질에 의해 유발된다. 수지상 세포는 골수 세포를 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM CSF) 및 종양 괴사 인자 알파와 같은 사이토카인과 함께 시험관 내에서 배양함으로써 유도될 수 있다. 비-전문 항원 제시 세포는 나이브 T 세포와의 상호작용에 필요한 MHC 클래스 II 단백질을 항시적으로 발현하지 않으며; 이들은 IFNg과 같은 특정 사이토카인에 의한 비-전문 항원 제시 세포의 자극 시에만 발현된다. “항원 제시 세포”에는 펩티드 또는 제시될 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 바람직하게는 mRNA, 예를 들어, 항원을 인코딩하는 핵산을 세포에 형질도입함으로써 MHC 클래스 I 제시된 펩티드가 로딩될 수 있다.　
일부 실시형태에서, 수지상 세포 또는 다른 항원 제시 세포를 표적으로 하는 유전자 전달 비히클을 포함하는 약학 조성물은 환자에게 투여되어 생체내에서 일어나는 형질감염을 야기할 수 있다. 본원에서 사용되는 “핵산”은 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA), 더욱 바람직하게는 RNA, 가장 바람직하게는 시험관내 전사 RNA(IVT RNA) 또는 합성 RNA이다. 핵산은 본 발명에 따라 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 재조합 생산 및 화학적 합성 분자를 포함한다. 본 발명에 따르면, 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥 및 선형 또는 공유적으로 원형으로 폐쇄된 분자로 존재할 수 있다. 핵산은 본 발명에 따라 단리될 수 있다. 용어 “단리된 핵산”은 본 발명에 따라, 핵산이 (i) 예를 들어, 중합 효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 시험관 내에서 증폭되었고, (ii) 클로닝에 의해 재조합적으로 생성되었으며, (iii) 예를 들어, 겔 전기영동에 의한 절단 및 분리에 의해 정제되었고, 또는 (iv) 예를 들어, 화학적 합성에 의해 합성되었음을 의미한다.　핵산은 특히 DNA 템플릿으로부터 시험관내 전사에 의해 제조될 수 있는 RNA의 형태로, 세포 내부에 도입, 즉, 세포를 형질감염시키기 위해 사용될 수 있다.　또한 RNA는 사용 전 서열 안정화, 캡핑 및 폴리아데닐화에 의해 변형될 수 있다.　
본원에서 사용되는 용어 “RNA”는 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하고 바람직하게는 전체적으로 또는 실질적으로 리보뉴클레오티드 잔기로 구성된 분자에 관한 것이다. “리보뉴클레오티드”는 B-D-리보푸라노실기의 2'-위치에 하이드록실기를 갖는 뉴클레오티드에 관한 것이다. 용어 “RNA”는 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 부분적으로 또는 완전히 정제된 RNA와 같은 단리된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 및 재조합적으로 생성된 RNA, 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 천연 발생 RNA와 상이한 변형된 RNA를 포함한다. 이러한 변경은, 예를 들어, RNA의 말단(들)에 또는 내부적으로, 예를 들어, RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에 비-뉴클레오티드 물질을 추가하는 것을 포함할 수 있다. RNA 분자의 뉴클레오티드는 또한 비-자연 발생 뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드와 같은 비-표준 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 변경된 RNA는 유사체 또는 자연 발생 RNA의 유사체라고 지칭할 수 있다.　
　 본원에서 사용되는 용어 “RNA”는 “mRNA”를 포함하고 바람직하게는 이와 관련이 있다. “mRNA”라는 용어는 “메신저-RNA”를 의미하며, DNA 템플릿을 사용하여 생성되고 펩티드 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 “전사체”에 관한 것이다. 전형적으로, mRNA는 5'-UTR, 단백질 코딩 영역 및 3'-UTR을 포함한다. mRNA는 세포에서 그리고 시험관 내에서 제한된 반감기를 가지고 있다.　본 발명의 내용에서, mRNA는 DNA 템플릿으로부터 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있다. 본 발명에서 사용된 RNA와 관련하여 용어 “변형”은 상기 RNA에 자연적으로 존재하지 않는 RNA의 임의의 변형을 포함한다. 본 발명의 한 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용되는 RNA는 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트를 갖지 않는다. 이러한 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트는 RNA를 포스파타제로 처리함으로써 제거될 수 있다. 본 발명에 따른 RNA는 안정성을 증가시키고/시키거나 세포독성을 감소시키기 위해 변형된 리보뉴클레오티드를 가질 수 있다. 예를 들어, 한 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용되는 RNA에서 5-메틸시티딘은 시티딘을 부분적으로 또는 완전히, 바람직하게는 완전히 치환한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 한 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용되는 RNA에서 수도우리딘은 우리딘을 부분적으로 또는 완전히, 바람직하게는 완전히 치환한다.　
한 실시형태에서, 용어 “변형”은 RNA에 5-캡 또는 5'-캡 유사체를 제공하는 것과 관련된다. 용어 “5-캡”은 mRNA 분자의 5'-말단에서 발견되는 캡 구조를 말하며 일반적으로 특이한 5'-5 트리포르페이트 링키지를 통해 mRNA에 연결된 구아노신 뉴클레오티드로 구성된다. 한 실시형태에서, 이러한 구아노신은 7-위치에서 메틸화된다. 용어 “통상적인 5'-캡”은 천연 발생 RNA 5'-캡, 바람직하게는 7-메틸구아노신 캡(m'G)을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 “5'-캡”은 RNA 캡 구조와 유사하고 바람직하게는 생체내에서 및/또는 세포에서 RNA에 부착시 RNA를 안정화하고/하거나 RNA의 번역을 향상시키는 능력을 갖도록 변형된 5'-캡 유사체를 포함한다.　
　본 발명에 따르면, RNA의 안정성 및 번역 효율은 필요에 따라 변형될 수 있다. 예를 들어, RNA는 안정화될 수 있고 안정화 효과를 갖는 하나 이상의 변형 및/또는 RNA의 번역 효율 증가에 의해 이의 번역이 증가될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함된 PCT/EP2006/009448에 설명되어 있다. 본 발명에 따라 사용되는 RNA의 발현을 증가시키기 위해, 코딩 영역, 즉, 발현된 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 서열 내부에서, RNA는 바람직하게는 발현된 펩티드 또는 단백질의 서열을 변경시키지 않고, GC 함량을 증가시켜 mRNA 안정성을 증가시키고 코돈 최적화를 수행하여 세포에서 번역을 향상시키도록 변형될 수 있다.
본 발명의 양상은 박테리아 또는 바이러스 감염을 예방하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 면역 반응을 유도하기 위해 본원에 제공된 유효량의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 양상은 대상체를 백신접종하는 방법을 제공하며 이 방법은 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산(예를 들어, mRNA)을 포함하는 본원에 기술된 조성물의 단일 용량을 대상체를 백신접종하기 위한 유효량으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 양이온성 지질 나노입자 내에 제형화된다. 일부 실시형태에서,지질 나노입자 조성물은 단일 주사로 투여된다.
일부 실시형태에서, 박테리아 감염은 마이코박테리움 투베르쿨로시스 감염이다.
일부 실시형태에서, 바이러스 감염은 코로나바이러스이다. 일부 실시형태에서, 코로나바이러스는 SARS-CoV, MERS-CoV 또는 SARS-CoV-2이다.
일부 실시형태에서, 바이러스 감염은 HIV/AIDS이다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 비경구적으로 투여된다.
　일반적으로 환자에게 피내주사 투여가 가능하다. 그러나 주사는 림프절 내부에 림프절 내 투여될 수도 있다(Maloy 외, (2001), Proc Natl Acad Sci USA 98:3299-3033).　생성된 세포는 관심 복합체를 제시하고 자가 세포독성 T 림프구에 의해 인식된 다음 증식한다.　
일부 실시형태에서, 조성물은 흡입에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 비강 스프레이 및/또는 에어로졸로 제형화된다.
본원에 개시된 약학 조성물에서 활성제의 실제 투여량 수준은 환자에 대한 독성 없이 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성제의 양을 얻기 위해 다양할 수 있다.
투여에 관한 내용에서 본원에서 사용되는 “비경구”는 장관 및 국소 투여 이외의 투여 방식들, 통상적으로, 주사를 의미하며, 제한 없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 피막내, 안와내, 심장내, 진피내, 복강내, 경결막, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척추내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입이 포함된다.
본원에서 사용되는 문구 “비경구 투여” 및 “비경구적으로 투여되는”은 장관 (즉, 소화관을 통한) 및 국소 투여 이외의 투여 방식들, 통상적으로, 주사 또는 주입을 지칭하며, 제한 없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 피막내, 안와내, 심장내, 진피내, 복강내, 경결막, 피하, 표피하, 관절내, 흡입, 피막하, 지주막하, 호흡기 점막, 척추내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입이 포함된다. 정맥 주사 및 주입은 리포솜 약물 투여에 종종(배타적이지는 않지만) 사용된다.
최적의 원하는 반응 (예: 치료 반응)을 제공하기 위해 용량 요법이 조정될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 용량이 시간에 따라 투여될 수 있거나 이러한 용량은 치료 상황의 긴급성이 나타나는 바에 따라 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다.
일부 실시형태에서, 용량은 0.01 내지 5mg/kg의 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용량은 0.01 내지 5mg/kg의 mRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 용량은 0.01 내지 3mg/kg의 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용량은 0.01 내지 3mg/kg의 mRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 용량은 0.01 내지 1mg/kg의 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용량은 0.01 내지 1mg/kg의 mRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 용량은 0.01 내지 0.5mg/kg의 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용량은 0.01 내지 0.5mg/kg의 mRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 용량은 0.01 내지 1mg/kg의 mRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 용량은 0.01 내지 0.1mg/kg의 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용량은 0.01 내지 0.05mg/kg의 mRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 용량은 0.01 내지 0.1mg/kg의 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용량은 0.01 내지 0.05mg/kg의 mRNA를 포함한다.
화합물 및/또는 약학적으로 허용되는 이의 염 또는 화합물 및/또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 LNP의 용량은 넓은 범위 내에서 달라질 수 있으며, 각 특정 사례에서 개별 조건 및 통제되는 병원체에 대해 자연적으로 조정될 것이다.
추가 실시형태
1. 화학식 I의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염.
2. 화학식 II의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염.
3. 화학식 III의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염.
4. 화학식 IV의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염.
5. 표 1A의 구조를 갖는 화합물.
6. 표 2의 구조를 갖는 화합물로서, 생체환원성인 화합물.
7. 상기 실시형태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, pKa가 6 내지 7인 화합물.
8. 화학식 I의 이온화 가능한 지질 또는 약학적으로 허용되는 이의 염, 및 핵산을 포함하는 지질 나노입자 조성물.
9. 화학식 II의 이온화 가능한 지질 또는 약학적으로 허용되는 이의 염, 및 핵산을 포함하는 지질 나노입자 조성물.
10. 화학식 III의 이온화 가능한 지질 또는 약학적으로 허용되는 이의 염, 및 핵산을 포함하는 지질 나노입자 조성물.
11. 화학식 IV의 이온화 가능한 지질 또는 약학적으로 허용되는 이의 염, 및 핵산을 포함하는 지질 나노입자 조성물.
12. 상기 실시형태 8-11 중 어느 하나에 있어서, 이온화 가능한 지질은 핵산을 캡슐화하는, 조성물.
13. 실시형태 8-11 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 siRNA인, 조성물.
14. 실시형태 8-11 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 DNA인, 조성물.
15. 실시형태 8-11 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 mRNA인, 조성물.
16. 실시형태 8-11 중 어느 하나에 있어서, 스테롤, 포스파티딜콜린, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는, 조성물.
17. 실시형태 16에 있어서, 스테롤은 콜레스테롤인, 조성물.
18. 실시형태 17에 있어서, 이온화 가능한 지질 대 콜레스테롤 몰비는 약 65:35 내지 약 40:60인, 조성물.
19. 실시형태 17에 있어서, 이온화 가능한 지질 대 콜레스테롤 몰비는 약 60:40 내지 약 45:55인, 조성물.
20. 실시형태 17에 있어서, 포스파티딜콜린 대 콜레스테롤 몰비는 약 1:5 내지 약 1:2인, 조성물.
21. 실시형태 17에 있어서, 중합체-접합 지질을 추가로 포함하는, 조성물.
22. 실시형태 21에 있어서, 중합체-접합 지질은 PEG(2000)-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG) 또는 PEG(분자량 2,000)-디미리스토일포스파티딜에탄올아민(PEG-DMPE)을 포함하는, 조성물.
23. 실시형태 8-11 중 어느 하나에 있어서, 표적화 리간드를 추가로 포함하며, 여기서 표적화 리간드는 나노입자의 외부로 배향되는, 조성물.
24. 실시형태 23에 있어서, 표적화 리간드는 항체인, 조성물.
25. 실시형태 8-11 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 액체 약학 제형인, 조성물.
26. 실시형태 8-11 중 어느 하나에 있어서, 이온화 가능한 지질에 대한 산화적 분해 생성물의 백분율은 DLin-KC2-DMA 또는 DLin-MC3-DMA 대조군 제형에 대한 것의 50% 미만이다.
27. 박테리아 또는 바이러스 감염을 예방하는 방법으로서, 이 방법은 실시형태 9-26 중 어느 하나의 유효량의 조성물 및 약학적 부형제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 투여는 면역 반응을 유도하는 방법.
28. 실시형태 27에 있어서, 조성물은 피하, 근육내 또는 피내로 투여되는, 방법.
29. 실시형태 27에 있어서, 박테리아 감염은 마이코박테리움 투베르쿨로시스 감염인, 방법.
30. 실시형태 27에 있어서, 바이러스 감염은 SARS-CoV, MERS-CoV 또는 SARS-CoV-2 감염인, 방법.
31. 실시형태 27에 있어서, 바이러스 감염은 HIV 감염인, 방법.
32. 실시형태 27에 있어서, 감염은 비투베르비결핵 마이코박테리움의 형태인, 방법.
33. pKa가 6 내지 7인 디알킬 아미노기를 포함하는 헤드 기에 공유 결합된 한 쌍의 16개 또는 18개의 탄소 선형 다중불포화 지질 테일들로 이루어진 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질 나노입자(LNP) 조성물로서;
상기 헤드 기는 디알킬 아미노기에 공유 결합된 헤테로사이클릴 또는 알킬 부분을 포함하고 선택적으로 포스페이트 기를 추가로 포함하고;
각각의 다중불포화 지질 테일은 지질 테일의 길이를 따라 적어도 2개의 메틸렌 기에 의해 분리된 적어도 2개의 올레핀을 제외하고는 불포화되고, 선택적으로 헤드 기에 공유 결합된 말단에 단일 아실 기를 포함하는, 조성물.
34. 실시형태 33에 있어서, 각각의 지질 테일은 동일하고, 각각의 지질 테일은 비치환된 에틸렌, n-프로필 또는 n-부틸에 의해서만 분리된 총 2개의 올레핀을 갖는, 조성물.
35. 실시형태 34에 있어서, 각각의 지질 테일은 헤드 기의 산소에 결합되어 에스테르를 형성하는 아실기를 추가로 포함하는, 조성물.
36. 실시형태 34에 있어서, 각각의 지질 테일은 화학식 A 또는 화학식 B의 화학 구조를 갖는, 조성물:
화학식 A
식 A에서 a는 1, 2, 3 또는 4이고; b는 2, 3 또는 4이고; 화학식 A에서 c는 3, 4, 5, 6, 7이고; 또는
화학식 B.
여기서 화학식 B에서 a는 5, 6 또는 7이고; 화학식 B에서 c는 3, 4 또는 5임.
37. 실시형태 36에 있어서, b는 4인, 조성물.
38. 실시형태 36에 있어서, 이온화 가능한 양이온성 지질은 , , , , 및 로 이루어진 군으로부터 선택된 화학 구조를 포함하고; 여기서 R22는 지질 테일의 제1 말단이고 는 헤드 기의 디알킬 아미노 부분에 대한 헤드 기의 부착을 나타내는, 조성물.
39. 실시형태 38에 있어서, 헤드 기의 디알킬 아미노 부분은 화학식 (IV-A)의 화학 구조를 가지며:
화학식 IV-A,
여기서 화학식 (IV-A)에서 n은 2, 3 또는 4이고; 화학식 (IV-A)에서 R10 및 R12는 메틸, 에틸 및 프로필로 이루어진 군으로부터 선택된 알킬 기으로부터 각각 독립적으로 선택되며, 여기서 R10 및 R12의 알킬은 하나 이상의 하이드록실로 선택적으로 치환되는, 조성물.
40. 실시형태 39에 있어서, 화학식(IV-A)에서 R10 및 R12는 각각 독립적으로 메틸, 에틸, -(CH2)(CH2)OH, 또는 -(CH2)2(CH2)OH인, 조성물.
41. 실시형태 33에 있어서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (I-A)의 화학 구조를 가지며.
화학식 I-A
여기서
a는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고; b는 2, 3 또는 4이고; c는 3, 4, 5, 6 또는 7이고; a, b 및 c의 합은 10 또는 12이고;
R10및 R12 각각은 독립적으로 하나 이상의 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이고; 그리고
L은 이고, 여기서 v는 0 또는 1이고; q2는 1 또는 2인, 조성물.
42. 제41항에 있어서, v가 0인, 조성물.
43. 제41항에 있어서, v가 1인, 조성물.
44. 실시형태 33에 있어서, 이온화 가능한 지질은 화학식 II-A의 화학 구조를 가지며.
화학식(II-A)
여기서 a는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고; b는 2, 3 또는 4이고; c는 4, 5, 6, 7 또는 8이고;
R2는는 또는 이고;
q 및 q'은 각각 독립적으로 1 또는 2이고; 그리고
R10 및 R12는 각각 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬인, 조성물.
45. 실시형태 33에 있어서, 이온화 가능한 지질은 화학식 II-A의 화학 구조를 가지며.
화학식 (II-B)
여기서 a는 5, 6 또는 7이고; c는 3, 4 또는 5이고;
R2는 또는 이고;
q 및 q'은 각각 독립적으로 1 또는 2이고; 그리고
R10 및 R12는 각각 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬인, 조성물.
실시예
본 발명을 특정 실시예와 관련하여 설명하였고 많은 세부사항이 설명을 위해 제시되었지만, 본 명세서는 추가적인 실시예를 포함하고 본 명세서에 기술된 세부사항 중 일부는 본 발명의 범위에서 벗어나지 않고 상당히 달라질 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명는 이러한 추가적인 실시예, 변형 및 균등물을 포함한다. 특히, 본 발명은 다양한 예시적 구성요소 및 실시예의 특징, 용어 또는 요소들의 임의의 조합을 포함한다.
달리 명시적으로 나타내지 않는 한, 실시예에 사용된 포스파티딜세린 지질의 이성질체 형태는 포스파티딜-L-세린이다.
본 명세서에 개시된 실시형태들의 다양한 실시형태들을 설명하기 위해 특정한 실시예들이 아래에 제공된다. 당업자는 본 명세서에 개시된 다양한 실시예가 이들 특정한 예시적인 예에 제한되지 않는다는 것을 알고 있을 것이다.
실시예 1A: 이온화 가능한 지질의 합성
반응식 1 AKG-UO-1 내지 AKG-UO-3을 위한 산 중간체의 합성
중간체 (6Z,12Z)-6,12-옥타데카디엔산 및 (6Z,12Z)-6,12-헥사데카디엔산은 다음에 도시된 바와 같은 일반 합성에 의해 제조되었다:
(S)-4-(디메틸아미노)부탄-1,2-디일 (6Z,6'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-6,12-디에노에이트) (AKG-UO-1, O-11956)
(S)-4-(디에틸아미노)부탄-1,2-디일 (6Z,6'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-6,12-디에노에이트) (AKG-UO-1A, O-11955)
(S)-4-(디메틸아미노)부탄-1,2-디일 (6Z,6'Z,12Z,12'Z)-비스(헥사데카-6,12-디에노에이트, AKG-UO-4, O-12401)
(S)-4-(디에틸아미노)부탄-1,2-디일 (6Z,6'Z,12Z,12'Z)-비스(헥사데카-6,12-디에노에이트, AKG-UO-4A, O-12402)
(S)-4-(디메틸아미노)부탄-1,2-디일 (6Z,6'Z,11Z,11'Z)-비스(옥타데카-6,11-디에노에이트)(AKG-UO-1a)
실험 절차
2-((5-브로모펜틸)옥시)테트라하이드로-2H-피란 2의 합성
0℃에서 디클로로메탄(100mL) 및 피리디늄 p-톨루엔 설포네이트(40mg, 0.16mmol) 중 5-브로모-1-펜탄올 1(3.6 g, 21.6mmol)의 용액에 3,4-디하이드로-2H-피란(6.54mL, 71.8mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음 물로 퀀칭하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트(2X100mL)로 추출하였다. 조합한 유기물을 염수로 세척한 후 황산 마그네슘 상에서 건조시키고 여과하고 여과액을 진공하에 농축시켜 미정제 오일을 수득하였다. 미정제 오일을 n-헥산 중 5-10% 에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 2-((5-브로모펜틸)옥시)테트라하이드로-2H-피란, 2(4.5g, 83%)를 투명한 오일로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.55-4.54 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 3.92-3.72 (m, 2H), 3.42-3.38 (m, 3H), 1.88-1.55 (m, 3H), 1.52-1.50 (m, 10H).
2-(트리데카-6,12-디인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란 4의 합성
-78℃에서 테트라하이드로푸란(100 mL) 중 헥사메틸포스포르아미드(16 mL, 90.8 mmol) 및 1,7-옥타디인 3 (6 mL, 45.4 mmol)의 용액에 [n-헥산 중 2.5 M n-부틸리튬](18mL, 45.4mmol) 적가하였다. 첨가 완료 시, 용액을 -78℃에서 1시간 동안 교반한 다음 한 시간 더 -20℃로 가온하였다. 생성된 용액을 다시 한번 -78℃로 냉각시키고, 여기에 테트라하이드로푸란(10mL) 중 2-((5-브로모펜틸)옥시)테트라하이드로-2H-피란, 2(5.67g, 22.7mmol)의 용액을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온으로 가온하고 12시간 동안 교반하였다. 12시간 후, 반응물을 0℃로 냉각시키고 물(100mL)로 퀀칭하였다. 이어서 반응 혼합물을 진공 하에 농축하여 테트라하이드로푸란을 제거한 다음 n-헥산으로 희석하였다. 유기물을 물 및 염수(2X100mL)로 세척하였다. 유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 진공하에 농축시켜 9g 중량의 미정제 오일을 수득하였다. 미정제 오일을 n-헥산 중 5-10% 에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 2-(트리데카-6,12-디인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란, 4(4.5g, 72%)를 투명한 오일로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, d6.DMSO): δ ppm 4.544.53 (m, 1H), 3.72-3.61 (m, 1H), 3.60-3.58 (m, 1H), 3.43-3.33 (m, 1H), 3.32-3.29 (m, 1H), 2.77-2.75 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 2.16-2.13 (m, 6H), 1.55-1.41 (m, 16H).
알킨의 알킬화를 위한 대표적인 절차
2-(헥사데카-6,12-디인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란 7의 합성
-78℃에서 테트라하이드로푸란(100 mL) 중 2-(트리데카-6,12-디인-1-일옥시) 테트라하이드로-2H-피란, 4(7.14 g, 25.86 mmol) 및 헥사메틸포스포르아미드(18 mL, 103.4 mmol)의 용액에 [n-헥산 중 2.5M n-부틸리튬](41.3mL, 103.4mmol)을 적가했다. 첨가 완료 시, 용액을 -78℃에서 1시간 동안 교반한 다음 한 시간 더 -20℃로 가온하였다. 생성된 용액을 -78℃로 다시 한 번 냉각시키고, 여기에 테트라하이드로푸란(20mL) 중 1-요오도프로판 5(9.9mL, 103.4mmol)의 용액을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온으로 가온하고 12시간 동안 교반하였다. 12시간 후, 반응물을 0℃로 냉각시키고 물(100mL)로 퀀칭하였다. 이어서 반응 혼합물을 진공 하에 농축하여 테트라하이드로푸란을 제거한 다음 n-헥산으로 희석하였다. 유기물을 물 및 염수(2X100mL)로 세척하였다. 유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 진공하에 농축시켜 9g 중량의 미정제 오일을 수득하였다. 미정제 오일을 n-헥산 중 5% 에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 2-(헥사데카-6,12-디인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란, 7(5.9g, 72%)을 투명한 오일로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 4.57-4.55 (m, 1H), 3.86-3.74 (m, 1H), 3.73-3.71 (m, 1H), 3.50-3.39 (m, 1H), 3.37-3.36 (m, 1H), 2.16-2.11 (m, 8H), 1.59-1.56 (m, 2H), 1.55-1.47 (m, 16H), 0.98-0.93 (t, J = 1.6 Hz, 3H).
2-(옥타데카-6,12-디인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란 8
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 4.57-4.55 (m, 1H), 3.85-3.74 (m, 1H), 3.73-3.70 (m, 1H), 3.50-3.38 (m, 1H), 3.36-3.35 (m, 1H), 2.23-2.12 (m, 8H), 1.61-1.54 (m, 2H), 1.53-1.48 (m, 16H), 1.47-1.46 (m, 4H), 0.90-0.85 (t, J = 1.6 Hz, 3H).
“P-2 Ni”를 사용하여 알킨을 알켄으로 환원시키는 대표적인 절차
2-(((6Z,12Z)-헥사데카-6,12-디엔-1-일)옥시)테트라하이드로-2H-피란 9의 합성
0℃에서 수소 블랭킷 하에 에탄올(80mL) 중의 소듐 보로하이드라이드(0.56g, 14.8mmol) 용액에 니켈(II) 아세테이트 테트라하이드레이트(3.22g, 12.98mmol)를 첨가하였다. 첨가 완료 시, 반응물을 진공 하에 배기시키고 수소로 플러싱하였다. 10분 동안 교반한 후, 에탄올(10mL) 중 에틸렌디아민(3.7mL, 65.6mmol) 및 2-(헥사데카-6,12-디인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란, 7(5.9g, 18.55mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응물을 수소 벌룬 하에 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 4시간 후, 반응 혼합물에서 수소를 제거한 다음 질소로 플러싱하였다. 미정제 혼합물을 셀라이트 상에서 여과하고 여과액을 진공 하에 농축하여 4g 중량의 미정제 오일을 수득하였다. 미정제 오일을 n-헥산 중 5-10% 디에틸 에테르를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 2-(((6Z,12Z)-헥사데카-6,12-디엔-1-일)옥시)테트라하이드로-2H-피란, 9(4.67g, 78% 수율)를 투명한 오일로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.35-5.34 (m, 4H), 4.58-4.55 (m, 1H), 3.86-3.74 (m, 1H), 3.73-3.71 (m, 1H), 3.51-3.39 (m, 1H), 3.36-3.35 (m, 1H), 2.03-1.98 (m, 8H), 1.57-1.39 (m, 2H), 1.38-1.36 (m, 6H), 1.35-1.32 (m, 10H), 0.91-0.86 (t, J = 1.6 Hz, 3H).
13C NMR (300 MHz, CDCl3): 129.98, 129.85, 98.93, 77.53, 77.10, 76.68, 67.72, 62.43, 30.86, 29.71, 29.70, 29.45, 29.46, 29.44, 27.20, 27.19, 26.01, 25.59, 22.98, 19.78, 13.91.
2-(((6Z,12Z)-옥타데카-6,12-디엔-1-일)옥시)테트라하이드로-2H-피란 10
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.39-5.29 (m, 4H), 4.58-4.55 (m, 1H), 3.86-3.76 (m, 1H), 3.74-3.68 (m, 1H), 3.51-3.41 (m, 1H), 3.39-3.36 (m, 1H), 2.14-1.97 (m, 8H), 1.56-1.38 (m, 2H), 1.37-1.35 (m, 6H), 1.34-1.28 (m, 14H), 0.93-0.85 (t, J = 1.6 Hz, 3H).
13C NMR (300 MHz, CDCl3 ): 130.13, 129.97, 129.84, 129.71, 98.93, 77.53, 77.10, 76.68, 67.71, 62.42, 31.62, 30.86, 29.72, 29.71, 29.47, 29.46, 27.27, 27.18, 26.01, 25.59, 22.67, 19.78, 14.18.
테트라하이드로피라닐 에테르(THP)의 탈보호를 위한 대표적인 절차
(6Z,12Z)-헥사데카-6,12-디엔-1-올 11의 합성
메탄올(20 mL) 중 2-(((6Z,12Z)-헥사데카-6,12-디엔-1-일)옥시)테트라하이드로-2H-피란 9 (4.67 g, 14.5 mmol)의 용액에 p-톨루엔설폰산 일수화물(300mg, 1.58mmol)을 실온에서 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 3시간 동안 교반한 다음 물로 퀀칭하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트(2X50mL)로 추출하였다. 조합한 유기물을 물로 세척한 다음 황산마그네슘 상에서 건조시키고 여과하고 여과액을 진공하에 농축시켜 4g 중량의 미정제 오일을 수득하였다. 미정제 오일을 n-헥산 중 5-10% 디에틸 에테르를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 (6Z,12Z)-헥사데카-6,12-디엔-1-올, 11(2.5g, 72%)을 투명한 오일로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz , CDCl3): 5.34-5.33 (m, 4H), 3.65-3.61 (m, 2H), 2.02-2.00 (m, 8H), 1.36-1.34 (m, 2H), 1.34-1.25 (m, 10H), 0.89-0.86 (t, J = 0.82 Hz, 3H).
(6 Z ,12 Z )-옥타데카-6,12-디엔-1-올 12
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.33 (m, 4H), 3.65-3.61 (m, 2H), 2.02-2.01 (m, 8H), 1.36-1.35 (m, 2H), 1.34-1.25 (m, 14H), 0.88-0.85 (t, J = 0.76 Hz, 3H).
Jones 시약을 사용하여 알코올을 카르복시산으로 산화시키는 대표적인 절차
(6Z,12Z)-헥사데카-6,12-디엔산 13의 합성
0 ℃에서 아세톤(20 mL) 중 (6Z,12Z)-헥사데카-6,12-디엔-1-올, 11 (2.5 g, 10.5 mmol) 및 Jones 시약 [황산 중 2M]의 혼합물(10.5 mL, 21 mmol)을 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물로 퀀칭하고 에틸 아세테이트(2X100mL)로 추출하였다. 조합한 유기물을 황산 마그네슘 상에서 건조시키고 여과하고 여과액을 진공하에 농축시켜 미정제 오일을 수득하였다. 미정제 오일을 n-헥산 중 20% 에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 (6Z,12Z)-헥사데카-6,12-디에노산, 13(1.7g, 68%)을 투명한 오일로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.35-5.33 (m, 4H), 2.37-2.32 (t, 2H), 2.06-1.98 (m, 8H), 1.64-1.39 (m, 2H), 1.37-1.32 (m, 8H), 0.91-0.87 (t, J = 0.91 Hz, 3H).
(6 Z ,12 Z )-옥타데카-6,12-디엔산 14
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.32 (m, 4H), 2.35-2.33 (t, 2H), 2.06-2.01 (m, 8H), 1.64-1.42 (m, 2H), 1.34-1.28 (m, 12H), 0.90-0.85 (t, 3H).
( S )-2-(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)에틸 4-메틸벤젠설포네이트 16 의 합성
0 °C에서 피리딘(30 mL) 중 (S)-2-(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)에탄-1-올 15(25 g, 171.1 mmol)의 혼합물에 p-톨루엔설포닐클로라이드(35.8g, 188.2mmol) 및 DMAP(140mg, 1.14 mmol)를 첨가하고 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 CH2Cl2(500mL)로 희석하고, 포화 NH4Cl, 물 및 염수로 희석하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 용매를 증발시키고, 미정제 잔류물을 정제 없이 다음 단계에 사용하였다(43.8g, 85%).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 7.77 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 4.15-4.01 (m, 3H), 3.65-3.47 (m, 2H), 2.43 (s, 3H), 1.82-1.62 (m, 2H), 1.32 (s, 3H), 1.27 (s, 3H).
디-알킬아민 치환을 위한 대표적인 절차
(S)-2-(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸에탄-1-아민 19 의 합성
(S)-2-(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)에틸 4-메틸벤젠설포네이트 16(10g, 33.3mmol)과 디메틸아민 용액 17(166mL, 333.3mmol)(THF 중 2M)의 혼합물를 실온에서 2일 동안 교반하였다. 혼합물을 농축하고, 미정제 잔류물을 CH2Cl2(500mL)로 희석하고, 포화 NaHCO3, 물 및 염수로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 용매를 증발시키고, 미정제 잔류물을 고속 크로마토그래피(SiO2: CH2Cl2 = 1% NH4OH를 포함하는 CH2Cl2 중의 100% 내지 10% MeOH)로 정제하여 무색 오일 생성물 19를 수득하였다(2.1 g, 37%).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.15-4.01 (m, 2H), 3.52 (dd, J = 7.4, 7.4 Hz, 1H), 2.41-2.23 (m, 2H), 2.21 (s, 6H), 1.82-1.62 (m, 2H), 1.39 (s, 3H), 1.33 (s, 3H).
MS (APCI+): 174.1 (M+1)
(S)-2-(2,2-디에틸-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸에탄-1-아민 20
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.15-4.01 (m, 2H), 3.48 (dd, J = 7.4, 7.4 Hz, 1H), 2.48-2.43 (m, 6H), 1.82-1.62 (m, 2H), 1.36 (s, 3H), 1.27 (s, 3H), 0.97 (t, J = 7.2 Hz, 6H).
MS (APCI+): 202.2 (M+1)
케탈 가수분해의 대표적인 절차
(S)-4-(디메틸아미노)부탄-1,2-디올 염산염 21의 합성
MeOH(10 mL) 중 (S)-2-(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸에탄-1-아민 19(2 g, 11.54 mmol)의 혼합물에 1N HCl 수용액(17mL, 17.3mmol)을 첨가하고 반응물을 80℃에서 45분 동안 가열하였다. TLC(Rf = 0.1, 1% NH4OH를 포함하는 CH2Cl2 중 10% MeOH)는 반응의 완료를 보여주었다. 반응 혼합물을 농축한 후, 미정제 잔류물을 물(5mL)에 용해시키고 밤새 동결건조시켰다. 점착성 시럽 생성물 21을 HCl 염으로서 수득하였다(2.1g, 정량적).
1H NMR (300 MHz, D2O): δ ppm 3.77-3.72 (m, 1H), 3.54-3.46 (m, 2H), 3.29-3.22 (m, 2H), 2.85 (s, 6H), 1.92-1.79 (m, 2H).
MS (APCI+): 134.1 (M+1)
( S )-4-(디에틸아미노)부탄-1,2-디올 하이드로클로라이드 염 22
1H NMR (300 MHz, D2O): δ ppm 3.77-3.72 (m, 1H), 3.54-3.46 (m, 2H), 3.22-3.15 (m, 6H), 1.92-1.74 (m, 2H), 1.24 (t, J = 7.4 Hz, 6H).
MS (APCI+): 162.1 (M+1)
대표적인 디에스테르화 절차
( S )-4-(디메틸아미노)부탄-1,2-디일 (6 Z ,6' Z ,12 Z ,12' Z )-비스(옥타데카-6,12-디에노에이트) AKG-UO-1 (O-11956)의 합성
0 ℃에서 옥살릴 클로라이드(0.33mL, 3.9mmol)를 디클로로메탄/DMF(15mLs, 25mL) 중 (6Z,12Z)-옥타데카-6,12-디엔산, 14(0.36g, 1.3mmol)의 용액에 적가하고 반응을 실온으로 가온하고 1시간 동안 교반하였다. 1시간 후, 반응물을 진공 하에 농축 건조시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(10mL)에 재용해시키고 N,N-디이소프로필에틸아민(2.3mL, 10mmol), 4-디메틸아미노피리딘(317mg, 2.6mmol) 및 (S)-4-(디메틸아미노)부탄-1,2-디올 하이드로클로라이드, 21(101mg, 0.6mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 생성된 용액을 24시간 동안 교반하였다.
24시간 후, 반응물을 0℃로 냉각시키고 물(10mL)로 퀀칭시켰다. 반응 혼합물을 디클로로메탄(2X100mL)으로 추출하고 유기물을 물 및 염수(2X100mL)로 세척하였다. 유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 진공하에 농축시켜 미정제 오일을 수득하였다. 미정제 오일을 디클로로메탄 중 2% 메탄올을 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 (S)-4-(디메틸아미노)부탄-1,2-디일 (6Z,6'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-6,12-디에노에이트), AKG-UO-1, (0.12 g, 30%)을 황색 오일로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.40-5.29 (m, 8H), 5.14-5.12 (m, 1H), 4.25 (dd, J = 11.8, 3.3 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 12.1, 6.3 Hz, 1H), 2.32-2.26 (m, 6H), 2.20 (s, 6H), 2.06-1.99 (m, 16H), 1.78-1.70 (m, 2H), 1.65-1.58 (m, 4H), 1.42-1.25 (m, 24H), 0.90-0.85 (m, 6H).
MS (APCI+): 658.5 (M+1)
(S)-4-(디에틸아미노)부탄-1,2-디일 (6Z,6'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-6,12-디에노에이트) AKG-UO-1A (O-11955)
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.37-5.29 (m, 8H), 5.12-5.10 (m, 1H), 4.25 (dd, J = 12.1, 3.6 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 11.8, 6.3 Hz, 1H), 2.52-2.42 (m, 6H), 2.29 (t, J = 7.4 Hz, 4H)), 2.06-1.99 (m, 16H), 1.78-1.70 (m, 2H), 1.64-1.59 (m, 4H), 1.41-1.19 (m, 24H), 0.99 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.96-0.87 (m, 6H).
MS (APCI+): 686.6 (M+1)
(S)-4-(디메틸아미노)부탄-1,2-디일 (6Z,6'Z,12Z,12'Z)-비스(헥사데카-6,12-디에노에이트) AKG-UO-4 (O-12401)
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.39-5.29 (m, 8H), 5.13-5.12 (m, 1H), 4.24 (dd, J = 11.8, 3.3 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 11.8, 6.3 Hz, 1H), 2.32-2.27 (m, 6H), 2.19 (s, 6H), 2.01-1.99 (m, 16H), 1.75-1.72 (m, 2H), 1.65-1.58 (m, 4H), 1.36-1.31 (m, 16H), 0.91-0.86 (m, 6H).
MS (APCI+): 602.5 (M+1)
(S)-4-(디에틸아미노)부탄-1,2-디일 (6 Z ,6' Z ,12 Z ,12' Z )-비스(헥사데카-6,12-디에노에이트) AKG-UO-4A (O-12402) 의 합성
1H NMR (300 MHz, CDCl3 ) : 5.40-5.29 (m, 8H), 5.12-5.11 (m, 1H), 4.25 (dd, J = 11.8, 3.3 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 11.8, 6.3 Hz, 1H), 2.54-2.43 (m, 6H), 2.29 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 2.11-1.96 (m, 16H), 1.74-1.65 (m, 2H), 1.65-1.59 (m, 4H), 1.39-1.31 (m, 16H), 0.99 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.91-0.89 (m, 6H).
MS (APCI+): 630.5 (M+1), i) 5-브로모 펜탄올로부터 제조된 트리페닐 포스포늄 일라이드 및 상응하는 알데히드의 초기 Witting 반응, ii) 메실화 및 치환에 의한 말단 알코올의 브롬화물로의 전환, iii) 일라이드 합성 및 Witting 반응의 순서 반복, 그리고 마지막으로 iv) 말단 알코올의 과요오드 산 산화를 수반. 생성된 산 중간체를 AKG-UO-1에서 AKG-UO-4로의 합성에 사용하였다(아래 참조).
반응식 2 AKG-UO-5를 위한 산 중간체의 합성
AKG-UO-5의 합성에 사용되는 산 중간체 (9Z,15Z)-9,15-옥타데카디엔산은 i) (5Z)-1-브로모-5-옥텐을 이용한 실릴 보호된 10-하이드록시-1-데신의 알킬화, ii) 알킨의 시스-알켄으로의 촉매적 수소화, iii) 알코올 상의 실릴 보호 제거, 및 마지막으로 iv) 말단 알코올의 원하는 산으로의 산화를 포함하는, 반응식 2에 도시된 일반 합성에 의해 제조되었다.
반응식 3 AKG-BDG-01 및 AKG-BDG-02를 위한 산 중간체의 합성
AKG-BDG-1 및 AKG-BDG-2의 합성에 사용되는 2개의 다이설파이드산 중간체의 합성을 에 도시한다.
( S )-4-(디메틸아미노)부탄-1,2-디일 (6Z,6'Z,11Z,11'Z)-비스(옥타데카-6,11-디에노에이트)(AKG-UO-1a)의 합성
실험 절차
2-((5-브로모펜틸)옥시)테트라하이드로-2H-피란 2의 합성
0℃에서 디클로로메탄(100mL) 및 피리디늄 p-톨루엔 설포네이트(40mg, 0.16mmol) 중 5-브로모-1-펜탄올 1(3.6 g, 21.6mmol)의 용액에 3,4-디하이드로-2H-피란(6.54mL, 71.8mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음 물로 퀀칭하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트(2X100mL)로 추출하였다. 조합한 유기물을 염수로 세척한 후 황산 마그네슘 상에서 건조시키고 여과하고 여과액을 진공하에 농축시켜 미정제 오일을 수득하였다. 미정제 오일을 n-헥산 중 5-10% 에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 2-((5-브로모펜틸)옥시)테트라하이드로-2H-피란, 2(4.5g, 83%)를 투명한 오일로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.55-4.54 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 3.92-3.72 (m, 2H), 3.42-3.38 (m, 3H), 1.88-1.55 (m, 3H), 1.52-1.50 (m, 10H).
2-(도데카-6,11-디인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란 4a의 합성
-78 °C에서 테트라하이드로푸란(100 mL) 중 1,6-헵타디인 3a(5 g, 54.3 mmol) 및 헥사메틸포스포르아미드(19 mL, 108 mmol)의 용액에 [n-헥산 중 2.5 M n-부틸리튬](21.7 mL, 54.3 mmol)을 적가하였다. 첨가 완료 시, 용액을 -78℃에서 1시간 동안 교반한 다음 한 시간 더 -20℃로 가온하였다. 생성된 용액을 다시 한번 -78℃로 냉각시키고, 여기에 테트라하이드로푸란(10mL) 중 2-((5-브로모펜틸)옥시)테트라하이드로-2H-피란, 2(6.8 g, 27.1 mmol)의 용액을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온으로 가온하고 12시간 동안 교반하였다. 12시간 후, 반응물을 0℃로 냉각시키고 물(100mL)로 퀀칭하였다. 이어서 반응 혼합물을 진공 하에 농축하여 테트라하이드로푸란을 제거한 다음 n-헥산으로 희석하였다. 유기물을 물 및 염수(2X100mL)로 세척하였다. 유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 진공하에 농축시켜 미정제 오일을 수득하였다. 미정제 오일을 n-헥산 중 5-10% 에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 2-(도데카-6,11-디인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란, 4a(4.1 g, 58%)를 투명한 오일로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.57-4.56 (m, 1H), 3.96-3.82 (m, 1H), 3.77-3.69 (m, 1H), 3.50-3.41 (m, 1H), 3.39-3.34 (m, 1H), 2.29-2.25 (m, 4H), 2.15-2.12 (m, 2H), 1.95-1.94 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 1.73-1.43 (m, 14H).
2-(옥타데카-6,11-디인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란 6a 의 합성
-78℃에서 테트라하이드로푸란(100 mL) 중 2-(도데카-6,11-디인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란, 4a(4.1 g, 15.64 mmol) 및 헥사메틸포스포르아미드(11 mL, 62.6 mmol)의 용액에 [n-헥산 중 2.5M n-부틸리튬](12.5 mL, 31.3 mmol)을 적가했다. 첨가 완료 시, 용액을 -78℃에서 1시간 동안 교반한 다음 한 시간 더 -20℃로 가온하였다. 생성된 용액을 -78℃로 다시 한 번 냉각시키고, 여기에 테트라하이드로푸란(20mL) 중 1-요오도헥산 5a(9.5 mL, 62.6mmol)의 용액을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온으로 가온하고 12시간 동안 교반하였다. 12시간 후, 반응물을 0℃로 냉각시키고 물(100mL)로 퀀칭하였다. 이어서 반응 혼합물을 진공 하에 농축하여 테트라하이드로푸란을 제거한 다음 n-헥산으로 희석하였다. 유기물을 물 및 염수(2X100mL)로 세척하였다. 유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 진공하에 농축시켜 미정제 오일을 수득하였다. 미정제 오일을 n-헥산 중 5% 에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 2-(옥타데카-6,11-디인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란, 6a(3.1 g, 57%)를 투명한 오일로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 4.58-4.55 (m, 1H), 3.86-3.82 (m, 1H), 3.77-3.69 (m, 1H), 3.51-3.47 (m, 1H), 3.41-3.34 (m, 1H), 2.26-2.21 (m, 6H), 2.14-2.12 (m, 6H), 1.66-1.26 (m, 18H), 0.93-0.85 (t, J = 6.5 Hz, 3H).
2-(((6Z,11Z)-옥타데카-6,11-디엔-1-일)옥시)테트라하이드로-2H-피란 7a 의 합성
0℃에서 수소 블랭킷 하에 에탄올(50mL) 중의 소듐 보로하이드라이드(0.27g, 14.8mmol) 용액에 니켈(II) 아세테이트 테트라하이드레이트(1.55 g, 6.25mmol)를 첨가하였다. 첨가 완료 시, 반응물을 진공 하에 배기시키고 수소로 플러싱하였다. 10분 동안 교반한 후, 에탄올(10mL) 중 에틸렌디아민(1.8 mL, 26.8 mmol) 및 2-(옥타데카-6,11-디인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란, 6a(3.1 g, 8.93mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응물을 수소 벌룬 하에 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 4시간 후, 반응 혼합물에서 수소를 제거한 다음 질소로 플러싱하였다. 미정제 혼합물을 셀라이트 상에서 여과하고 여과액을 진공 하에 농축하여 4g 중량의 미정제 오일을 수득하였다. 미정제 오일을 n-헥산 중 5-10% 디에틸 에테르를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 2-(((6Z,11Z)-옥타데카-6,11-디엔-1-일)옥시)테트라하이드로-2H-피란, 7a(2.86 g, 92% 수율)를 투명한 오일로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.4-5.34 (m, 4H), 4.58-4.55 (m, 1H), 3.86-3.82 (m, 1H), 3.74-3.68 (m, 1H), 3.51-3.49 (m, 1H), 3.41-3.36 (m, 1H), 2.06-1.99 (m, 6H), 1.83-1.67 (m, 2H), 1.59-1.51 (m, 6H),1.48-1.32 (m, 16H), 0.92-0.85 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
(6Z,11Z)-옥타데카-6,11-디엔-1-올 8a 의 합성
절차는 앞에서 설명하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.37-5.33 (m, 4H), 3.65-3.61 (m, 1H), 2.06-1.99 (m, 6H), 1.56-1.41 (m, 4H), 1.38-1.27 (m, 14H), 0.88-0.85 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
(6Z,11Z)-옥타데카-6,11-디엔산 9a 의 합성
절차는 앞에서 설명하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.38-5.33 (m, 4H), 2.37-2.33 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.06-1.99 (m, 6H), 1.67-1.59 (m, 2H), 1.41-1.25 (m, 14H), 0.89-0.85 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
( S )-4-(디메틸아미노)부탄-1,2-디일 (6Z,6'Z,11Z,11'Z)-비스(옥타데카-6,11-디에노에이트)( AKG-UO-1a )의 합성
절차는 앞에서 설명하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.39-5.29 (m, 8H), 5.14-5.12 (m, 1H), 4.25 (dd, J = 11.8, 3.3 Hz, 1H), 4.06 (dd, J = 11.8, 6.3 Hz, 1H), 2.32-2.28 (m, 6H), 2.20 (s, 6H), 2.03-2.01 (m, 16H), 1.74-1.64 (m, 2H), 1.62-1.60 (m, 6H), 1.38-1.27 (m, 22H), 0.89-0.85 (m, 6H).
MS (APCI+): 658.5 (M+1)
AKG-BDG-1에 대한 산 중간체의 일반적인 합성은 i) 4-브로모 부티르산으로부터 4-머캅토 부티르산의 합성, ii) DPS와 4-머캅토 부티르산의 반응으로 4-(2-피리디닐디설파닐)부탄산을 생성, iii) 3-데신-1-올의 시스-알켄으로의 촉매적 수소화, iv) 1차 알코올의 토실화, v) 티오우레아를 사용한 토실 기 치환으로 말단 티올 생성, 및 마지막으로 vi) 말단 티올과 상기 단계 ii에서 제조된 4-(2-피리디닐디설파닐)부탄산을 커플링하여 다이설파이드 함유 산 중간체 생성을 포함한다. 3-도데신-1-올에서 시작하는 유사한 합성 순서에 따라 AKG-BDG-2의 합성에 사용되는 제2의 산 중간체가 생성되었다.
반응식 4 AKG-UO-1, AKG-UO-4, AKG-UO-5, AKG-BDG-1 및 AKG-BDG-2의 합성
반응식 4에 나타낸 지질 AKG-UO-1, AKG-UO-4, AKG-UO-5, AKG-BDG-1 및 AKG-BDG-2의 일반적인 합성은 다음 단계를 포함한다: i) 시판되는 키랄 디옥솔란의 1차 알코올의 토실화, ii) 디메틸아민을 사용한 토실 기 치환으로 3차 아민을 생성, iii) 디올의 산 촉매 탈보호, 및 마지막으로 iv) 반응식 1-3에 따라 합성된 상응하는 산 중간체를 사용한 디올의 에스테르화. AKG-UO-2는 하기 반응식 5에 나타낸 바와 같이 상이한 디옥솔란 및 상응하는 산 중간체로부터 출발하여 유사한 합성 순서에 따라 제조된다.
반응식 5 AKG-UO-2의 합성
반응식 6에 나타낸 트리알킬 포스페이트 함유 지질 AKG-UO-3의 일반적인 합성은 하기 단계를 포함한다: i) 시판 키랄 디옥솔란의 1차 알코올과 메틸 디클로로포스파이트의 반응으로 상응하는 디알킬 클로로포스파이트 생성, ii) 디알킬 클로로포스파이트의 클로라이드를 3-브로모 프로판올로 처리하여 이의 염화물을 치환, iii) 디올의 산 촉매화된 탈보호, iv) 반응식 1에 따라 합성된 상응하는 산 중간체를 이용한 디올의 에스테르화, 및 마지막으로 v) 디메틸아민을 사용한 브로마이드 기의 치환으로 3차 아민을 생성.
반응식 6 AKG-UO-3의 합성
대안적으로, 탄화수소 사슬의 이중 결합 위치 사이에 2개의 메틸렌 기를 갖는 산 중간체가 Caballeira 외, Chem. Phys. Lipids, vol. 100, p. 33-40, 1999에 기재된 바와 같이, 또는 D'yakonov 외, (D'yakonov 외, Med. Chem. Res., 2016, vol. 25, p. 30-39; D'yakonov 외, Chem. Commun. 2013, vol. 49, p 8401-8403; D'yakonov 외, 2020, Phytochem. Rev.)에 기재된 바와 같이 합성된다.
(S)-4-(디메틸아미노)부탄-1,2-디일 (6Z,6'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-6,12-디에노에이트) (AKG-UO-1, O-11956)
(S)-4-(디에틸아미노)부탄-1,2-디일 (6Z,6'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-6,12-디에노에이트) (AKG-UO-1A, O-11955)
(S)-4-(디메틸아미노)부탄-1,2-디일 (6Z,6'Z,12Z,12'Z)-비스(헥사데카-6,12-디에노에이트, AKG-UO-4, O-12401)
(S)-4-(디에틸아미노)부탄-1,2-디일 (6Z,6'Z,12Z,12'Z)-비스(헥사데카-6,12-디에노에이트, AKG-UO-4A, O-12402)
(S)-4-(디메틸아미노)부탄-1,2-디일 (6Z,6'Z,11Z,11'Z)-비스(옥타데카-6,11-디에노에이트)(AKG-UO-1a)
실험 절차
2-((5-브로모펜틸)옥시)테트라하이드로-2H-피란 2의 합성
0℃에서 디클로로메탄(100mL) 및 피리디늄 p-톨루엔 설포네이트(40mg, 0.16mmol) 중 5-브로모-1-펜탄올 1(3.6 g, 21.6mmol)의 용액에 3,4-디하이드로-2H-피란(6.54mL, 71.8mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음 물로 퀀칭하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트(2X100mL)로 추출하였다. 조합한 유기물을 염수로 세척한 후 황산 마그네슘 상에서 건조시키고 여과하고 여과액을 진공하에 농축시켜 미정제 오일을 수득하였다. 미정제 오일을 n-헥산 중 5-10% 에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 2-((5-브로모펜틸)옥시)테트라하이드로-2H-피란, 2(4.5g, 83%)를 투명한 오일로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.55-4.54 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 3.92-3.72 (m, 2H), 3.42-3.38 (m, 3H), 1.88-1.55 (m, 3H), 1.52-1.50 (m, 10H).
2-(트리데카-6,12-디인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란 4의 합성
-78℃에서 테트라하이드로푸란(100 mL) 중 헥사메틸포스포르아미드(16 mL, 90.8 mmol) 및 1,7-옥타디인 3(6 mL, 45.4 mmol)의 용액에 [n-헥산 중 2.5 M n-부틸리튬](18mL, 45.4mmol)을 적가하였다. 첨가 완료 시, 용액을 -78℃에서 1시간 동안 교반한 다음 한 시간 더 -20℃로 가온하였다. 생성된 용액을 다시 한번 -78℃로 냉각시키고, 여기에 테트라하이드로푸란(10mL) 중 2-((5-브로모펜틸)옥시)테트라하이드로-2H-피란, 2(5.67g, 22.7mmol)의 용액을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온으로 가온하고 12시간 동안 교반하였다. 12시간 후, 반응물을 0℃로 냉각시키고 물(100mL)로 퀀칭하였다. 이어서 반응 혼합물을 진공 하에 농축하여 테트라하이드로푸란을 제거한 다음 n-헥산으로 희석하였다. 유기물을 물 및 염수(2X100mL)로 세척하였다. 유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 진공하에 농축시켜 9g 중량의 미정제 오일을 수득하였다. 미정제 오일을 n-헥산 중 5-10% 에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 2-(트리데카-6,12-디인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란, 4(4.5g, 72%)를 투명한 오일로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, d6.DMSO): δ ppm 4.544.53 (m, 1H), 3.72-3.61 (m, 1H), 3.60-3.58 (m, 1H), 3.43-3.33 (m, 1H), 3.32-3.29 (m, 1H), 2.77-2.75 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 2.16-2.13 (m, 6H), 1.55-1.41 (m, 16H).
알킨을 알킬화하는 대표적인 절차
2-(헥사데카-6,12-디인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란 7의 합성
-78℃에서 테트라하이드로푸란(100 mL) 중 2-(트리데카-6,12-디인-1-일옥시) 테트라하이드로-2H-피란, 4(7.14 g, 25.86 mmol) 및 헥사메틸포스포르아미드(18 mL, 103.4 mmol)의 용액에 [n-헥산 중 2.5M n-부틸리튬](41.3mL, 103.4mmol)을 적가했다. 첨가 완료 시, 용액을 -78℃에서 1시간 동안 교반한 다음 한 시간 더 -20℃로 가온하였다. 생성된 용액을 -78℃로 다시 한 번 냉각시키고, 여기에 테트라하이드로푸란(20mL) 중 1-요오도프로판 5(9.9mL, 103.4mmol)의 용액을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온으로 가온하고 12시간 동안 교반하였다. 12시간 후, 반응물을 0℃로 냉각시키고 물(100mL)로 퀀칭하였다. 이어서 반응 혼합물을 진공 하에 농축하여 테트라하이드로푸란을 제거한 다음 n-헥산으로 희석하였다. 유기물을 물 및 염수(2X100mL)로 세척하였다. 유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 진공하에 농축시켜 9g 중량의 미정제 오일을 수득하였다. 미정제 오일을 n-헥산 중 5% 에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 2-(헥사데카-6,12-디인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란, 7(5.9g, 72%)을 투명한 오일로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 4.57-4.55 (m, 1H), 3.86-3.74 (m, 1H), 3.73-3.71 (m, 1H), 3.50-3.39 (m, 1H), 3.37-3.36 (m, 1H), 2.16-2.11 (m, 8H), 1.59-1.56 (m, 2H), 1.55-1.47 (m, 16H), 0.98-0.93 (t, J = 1.6 Hz, 3H).
2-(옥타데카-6,12-디인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란 8
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 4.57-4.55 (m, 1H), 3.85-3.74 (m, 1H), 3.73-3.70 (m, 1H), 3.50-3.38 (m, 1H), 3.36-3.35 (m, 1H), 2.23-2.12 (m, 8H), 1.61-1.54 (m, 2H), 1.53-1.48 (m, 16H), 1.47-1.46 (m, 4H), 0.90-0.85 (t, J = 1.6 Hz, 3H).
“P-2 Ni”를 사용하여 알킨을 알켄으로 환원시키는 대표적인 절차
2-(((6Z,12Z)-헥사데카-6,12-디엔-1-일)옥시)테트라하이드로-2H-피란 9의 합성
0℃에서 수소 블랭킷 하에 에탄올(80mL) 중의 소듐 보로하이드라이드(0.56g, 14.8mmol) 용액에 니켈(II) 아세테이트 테트라하이드레이트(3.22g, 12.98mmol)를 첨가하였다. 첨가 완료 시, 반응물을 진공 하에 배기시키고 수소로 플러싱하였다. 10분 동안 교반한 후, 에탄올(10mL) 중 에틸렌디아민(3.7mL, 65.6mmol) 및 2-(헥사데카-6,12-디인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란, 7(5.9g, 18.55mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응물을 수소 벌룬 하에 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 4시간 후, 반응 혼합물에서 수소를 제거한 다음 질소로 플러싱하였다. 미정제 혼합물을 셀라이트 상에서 여과하고 여과액을 진공 하에 농축하여 4g 중량의 미정제 오일을 수득하였다. 미정제 오일을 n-헥산 중 5-10% 디에틸 에테르를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 2-(((6Z,12Z)-헥사데카-6,12-디엔-1-일)옥시)테트라하이드로-2H-피란, 9(4.67g, 78% 수율)를 투명한 오일로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.35-5.34 (m, 4H), 4.58-4.55 (m, 1H), 3.86-3.74 (m, 1H), 3.73-3.71 (m, 1H), 3.51-3.39 (m, 1H), 3.36-3.35 (m, 1H), 2.03-1.98 (m, 8H), 1.57-1.39 (m, 2H), 1.38-1.36 (m, 6H), 1.35-1.32 (m, 10H), 0.91-0.86 (t, J = 1.6 Hz, 3H).
13C NMR (300 MHz, CDCl3): 129.98, 129.85, 98.93, 77.53, 77.10, 76.68, 67.72, 62.43, 30.86, 29.71, 29.70, 29.45, 29.46, 29.44, 27.20, 27.19, 26.01, 25.59, 22.98, 19.78, 13.91.
2-(((6Z,12Z)-옥타데카-6,12-디엔-1-일)옥시)테트라하이드로-2H-피란 10
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.39-5.29 (m, 4H), 4.58-4.55 (m, 1H), 3.86-3.76 (m, 1H), 3.74-3.68 (m, 1H), 3.51-3.41 (m, 1H), 3.39-3.36 (m, 1H), 2.14-1.97 (m, 8H), 1.56-1.38 (m, 2H), 1.37-1.35 (m, 6H), 1.34-1.28 (m, 14H), 0.93-0.85 (t, J = 1.6 Hz, 3H).
13C NMR (300 MHz, CDCl3): 130.13, 129.97, 129.84, 129.71, 98.93, 77.53, 77.10, 76.68, 67.71, 62.42, 31.62, 30.86, 29.72, 29.71, 29.47, 29.46, 27.27, 27.18, 26.01, 25.59, 22.67, 19.78, 14.18.
테트라하이드로피라닐 에테르(THP)의 탈보호를 위한 대표적인 절차
(6Z,12Z)-헥사데카-6,12-디엔-1-올 11 의 합성
메탄올(20 mL) 중 2-(((6Z,12Z)-헥사데카-6,12-디엔-1-일)옥시)테트라하이드로-2H-피란, 9(4.67 g, 14.5 mmol)의 용액에 p-톨루엔설폰산 일수화물(300mg, 1.58mmol)을 실온에서 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 3시간 동안 교반한 다음 물로 퀀칭하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트(2X50mL)로 추출하였다. 조합한 유기물을 물로 세척한 다음 황산마그네슘 상에서 건조시키고 여과하고 여과액을 진공하에 농축시켜 4g 중량의 미정제 오일을 수득하였다. 미정제 오일을 n-헥산 중 5-10% 디에틸 에테르를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 (6Z,12Z)-헥사데카-6,12-디엔-1-올, 11(2.5g, 72%)을 투명한 오일로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.34-5.33 (m, 4H), 3.65-3.61 (m, 2H), 2.02-2.00 (m, 8H), 1.36-1.34 (m, 2H), 1.34-1.25 (m, 10H), 0.89-0.86 (t, J = 0.82 Hz, 3H).
(6 Z ,12 Z )-옥타데카-6,12-디엔-1-올 12
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.33 (m, 4H), 3.65-3.61 (m, 2H), 2.02-2.01 (m, 8H), 1.36-1.35 (m, 2H), 1.34-1.25 (m, 14H), 0.88-0.85 (t, J = 0.76 Hz, 3H).
Jones 시약을 사용하여 알코올을 카르복시산으로 산화시키는 대표적인 절차
(6Z,12Z)-헥사데카-6,12-디엔산 13의 합성
0 ℃에서 아세톤(20 mL) 중 (6Z,12Z)-헥사데카-6,12-디엔-1-올, 11 (2.5 g, 10.5 mmol) 및 Jones 시약 [황산 중 2M]의 혼합물(10.5 mL, 21 mmol)을 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물로 퀀칭하고 에틸 아세테이트(2X100mL)로 추출하였다. 조합한 유기물을 황산 마그네슘 상에서 건조시키고 여과하고 여과액을 진공하에 농축시켜 미정제 오일을 수득하였다. 미정제 오일을 n-헥산 중 20% 에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 (6Z,12Z)-헥사데카-6,12-디에노산, 13(1.7g, 68%)을 투명한 오일로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.35-5.33 (m, 4H), 2.37-2.32 (t, 2H), 2.06-1.98 (m, 8H), 1.64-1.39 (m, 2H), 1.37-1.32 (m, 8H), 0.91-0.87 (t, J = 0.91 Hz, 3H).
(6 Z ,12 Z )-옥타데카-6,12-디엔산 14
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.32 (m, 4H), 2.35-2.33 (t, 2H), 2.06-2.01 (m, 8H), 1.64-1.42 (m, 2H), 1.34-1.28 (m, 12H), 0.90-0.85 (t, 3H).
( S )-2-(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)에틸 4-메틸벤젠설포네이트 16 의 합성
0 °C에서 피리딘(30 mL) 중 (S)-2-(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)에탄-1-올 15(25 g, 171.1 mmol)의 혼합물에 p-톨루엔설포닐클로라이드(35.8g, 188.2mmol) 및 DMAP(140mg, 1.14mmol)를 첨가하고 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 CH2Cl2(500mL)로 희석하고, 포화 NH4Cl, 물 및 염수로 희석하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 용매를 증발시키고, 미정제 잔류물을 정제 없이 다음 단계에 사용하였다(43.8g, 85%).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 7.77 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 4.15-4.01 (m, 3H), 3.65-3.47 (m, 2H), 2.43 (s, 3H), 1.82-1.62 (m, 2H), 1.32 (s, 3H), 1.27 (s, 3H).
디-알킬아민 치환을 위한 대표적인 절차
(S)-2-(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸에탄-1-아민 19 의 합성
(S)-2-(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)에틸 4-메틸벤젠설포네이트 16(10g, 33.3mmol)과 디메틸아민 용액 17(166mL, 333.3mmol)(THF 중 2M)의 혼합물를 실온에서 2일 동안 교반하였다. 혼합물을 농축하고, 미정제 잔류물을 CH2Cl2(500mL)로 희석하고, 포화 NaHCO3, 물 및 염수로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 용매를 증발시키고, 미정제 잔류물을 고속 크로마토그래피(SiO2: CH2Cl2 = 1% NH4OH를 포함하는 CH2Cl2 중의 100% 내지 10% MeOH)로 정제하여 무색 오일 생성물 19를 수득하였다(2.1 g, 37%).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.15-4.01 (m, 2H), 3.52 (dd, J = 7.4, 7.4 Hz, 1H), 2.41-2.23 (m, 2H), 2.21 (s, 6H), 1.82-1.62 (m, 2H), 1.39 (s, 3H), 1.33 (s, 3H).
MS (APCI+): 174.1 (M+1)
(S)-2-(2,2-디에틸-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸에탄-1-아민 20
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.15-4.01 (m, 2H), 3.48 (dd, J = 7.4, 7.4 Hz, 1H), 2.48-2.43 (m, 6H), 1.82-1.62 (m, 2H), 1.36 (s, 3H), 1.27 (s, 3H), 0.97 (t, J = 7.2 Hz, 6H).
MS (APCI+): 202.2 (M+1)
케탈 가수분해의 대표적인 절차
(S)-4-(디메틸아미노)부탄-1,2-디올 염산염 21의 합성
MeOH(10 mL) 중 (S)-2-(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸에탄-1-아민 19(2 g, 11.54 mmol)의 혼합물에 1N HCl 수용액(17mL, 17.3mmol)을 첨가하고 반응물을 80℃에서 45분 동안 가열하였다. TLC(Rf = 0.1, 1% NH4OH를 포함하는 CH2Cl2 중 10% MeOH)는 반응의 완료를 보여주었다. 반응 혼합물을 농축한 후, 미정제 잔류물을 물(5mL)에 용해시키고 밤새 동결건조시켰다. 점착성 시럽 생성물 21을 HCl 염으로서 수득하였다(2.1g, 정량적).
1H NMR (300 MHz, D2O): δ ppm 3.77-3.72 (m, 1H), 3.54-3.46 (m, 2H), 3.29-3.22 (m, 2H), 2.85 (s, 6H), 1.92-1.79 (m, 2H).
MS (APCI+): 134.1 (M+1)
( S )-4-(디에틸아미노)부탄-1,2-디올 하이드로클로라이드 염 22
1H NMR (300 MHz, D2O): δ ppm 3.77-3.72 (m, 1H), 3.54-3.46 (m, 2H), 3.22-3.15 (m, 6H), 1.92-1.74 (m, 2H), 1.24 (t, J = 7.4 Hz, 6H).
MS (APCI+): 162.1 (M+1)
대표적인 디에스테르화 절차
( S )-4-(디메틸아미노)부탄-1,2-디일 (6 Z ,6' Z ,12 Z ,12' Z )-비스(옥타데카-6,12-디에노에이트) AKG-UO-1 (O-11956) 의 합성
0 ℃에서 옥살릴 클로라이드(0.33mL, 3.9mmol)를 디클로로메탄/DMF(15mLs, 25mL) 중 (6Z,12Z)-옥타데카-6,12-디엔산, 14(0.36g, 1.3mmol)의 용액에 적가하고 반응을 실온으로 가온하고 1시간 동안 교반하였다. 1시간 후, 반응물을 진공 하에 농축 건조시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(10mL)에 재용해시키고 N,N-디이소프로필에틸아민(2.3mL, 10mmol), 4-디메틸아미노피리딘(317mg, 2.6mmol) 및 (S)-4-(디메틸아미노)부탄-1,2-디올 하이드로클로라이드, 21(101mg, 0.6mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 생성된 용액을 24시간 동안 교반하였다.
24시간 후, 반응물을 0℃로 냉각시키고 물(10mL)로 퀀칭시켰다. 반응 혼합물을 디클로로메탄(2X100mL)으로 추출하고 유기물을 물 및 염수(2X100mL)로 세척하였다. 유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 진공하에 농축시켜 미정제 오일을 수득하였다. 미정제 오일을 디클로로메탄 중 2% 메탄올을 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 (S)-4-(디메틸아미노)부탄-1,2-디일 (6Z,6'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-6,12-디에노에이트), AKG-UO-1, (0.12 g, 30%)을 황색 오일로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.40-5.29 (m, 8H), 5.14-5.12 (m, 1H), 4.25 (dd, J = 11.8, 3.3 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 12.1, 6.3 Hz, 1H), 2.32-2.26 (m, 6H), 2.20 (s, 6H), 2.06-1.99 (m, 16H), 1.78-1.70 (m, 2H), 1.65-1.58 (m, 4H), 1.42-1.25 (m, 24H), 0.90-0.85 (m, 6H).
MS (APCI+): 658.5 (M+1)
(S)-4-(디에틸아미노)부탄-1,2-디일 (6Z,6'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-6,12-디에노에이트) AKG-UO-1A (O-11955)
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.37-5.29 (m, 8H), 5.12-5.10 (m, 1H), 4.25 (dd, J = 12.1, 3.6 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 11.8, 6.3 Hz, 1H), 2.52-2.42 (m, 6H), 2.29 (t, J = 7.4 Hz, 4H)), 2.06-1.99 (m, 16H), 1.78-1.70 (m, 2H), 1.64-1.59 (m, 4H), 1.41-1.19 (m, 24H), 0.99 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.96-0.87 (m, 6H).
MS (APCI+): 686.6 (M+1)
(S)-4-(디메틸아미노)부탄-1,2-디일 (6Z,6'Z,12Z,12'Z)-비스(헥사데카-6,12-디에노에이트) AKG-UO-4 (O-12401)
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.39-5.29 (m, 8H), 5.13-5.12 (m, 1H), 4.24 (dd, J = 11.8, 3.3 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 11.8, 6.3 Hz, 1H), 2.32-2.27 (m, 6H), 2.19 (s, 6H), 2.01-1.99 (m, 16H), 1.75-1.72 (m, 2H), 1.65-1.58 (m, 4H), 1.36-1.31 (m, 16H), 0.91-0.86 (m, 6H).
MS (APCI+): 602.5 (M+1)
(S)-4-(디에틸아미노)부탄-1,2-디일 (6 Z ,6' Z ,12 Z ,12' Z )-비스(헥사데카-6,12-디에노에이트) AKG-UO-4A (O-12402) 의 합성
1H NMR (300 MHz, CDCl3 ): 5.40-5.29 (m, 8H), 5.12-5.11 (m, 1H), 4.25 (dd, J = 11.8, 3.3 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 11.8, 6.3 Hz, 1H), 2.54-2.43 (m, 6H), 2.29 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 2.11-1.96 (m, 16H), 1.74-1.65 (m, 2H), 1.65-1.59 (m, 4H), 1.39-1.31 (m, 16H), 0.99 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.91-0.89 (m, 6H).
MS (APCI+): 630.5 (M+1), 및 마지막으로 v) 디메틸아민을 사용한 브로마이드 기의 치환으로 3차 아민이 생성된다.
반응식 7 AKG-UO-3의 합성
대안적으로, 탄화수소 사슬의 이중 결합 위치 사이에 2개의 메틸렌 기를 갖는 산 중간체가 Caballeira 외, Chem. Phys. Lipids, vol. 100, p. 33-40, 1999에 기재된 바와 같이, 또는 D'yakonov 외, (D'yakonov 외, Med. Chem. Res., 2016, vol. 25, p. 30-39; D'yakonov 외, Chem. Commun. 2013, vol. 49, p 8401-8403; D'yakonov 외, 2020, Phytochem. Rev.)에 기재된 바와 같이 합성된다.
실시예 1B: 이온화 가능한 지질의 합성
(S)-4-(디메틸아미노)부탄-1,2-디일 (6Z,6'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-6,12-디에노에이트) (AKG-UO-1, O-11956)
(S)-4-(디에틸아미노)부탄-1,2-디일 (6Z,6'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-6,12-디에노에이트) (AKG-UO-1A, O-11955)
(S)-4-(디메틸아미노)부탄-1,2-디일 (6Z,6'Z,12Z,12'Z)-비스(헥사데카-6,12-디에노에이트, AKG-UO-4, O-12401)
(S)-4-(디에틸아미노)부탄-1,2-디일 (6Z,6'Z,12Z,12'Z)-비스(헥사데카-6,12-디에노에이트, AKG-UO-4A, O-12402)
(S)-4-(디메틸아미노)부탄-1,2-디일 (6Z,6'Z,11Z,11'Z)-비스(옥타데카-6,11-디에노에이트)(AKG-UO-1a)
실험 절차
2-((5-브로모펜틸)옥시)테트라하이드로-2 H -피란 2 의 합성
0℃에서 디클로로메탄(100mL) 및 피리디늄 p-톨루엔 설포네이트(40mg, 0.16mmol) 중 5-브로모-1-펜탄올 1(3.6 g, 21.6mmol)의 용액에 3,4-디하이드로-2H-피란(6.54mL, 71.8mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음 물로 퀀칭하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트(2X100mL)로 추출하였다. 조합한 유기물을 염수로 세척한 후 황산 마그네슘 상에서 건조시키고 여과하고 여과액을 진공하에 농축시켜 미정제 오일을 수득하였다. 미정제 오일을 n-헥산 중 5-10% 에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 2-((5-브로모펜틸)옥시)테트라하이드로-2H-피란, 2(4.5g, 83%)를 투명한 오일로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.55-4.54 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 3.92-3.72 (m, 2H), 3.42-3.38 (m, 3H), 1.88-1.55 (m, 3H), 1.52-1.50 (m, 10H).
2-(트리데카-6,12-디인-1-일옥시)테트라하이드로-2 H -피란 4 의 합성
-78℃에서 테트라하이드로푸란(100 mL) 중 헥사메틸포스포르아미드(16 mL, 90.8 mmol) 및 1,7-옥타디인 3(6 mL, 45.4 mmol)의 용액에 [n-헥산 중 2.5 M n-부틸리튬](18mL, 45.4mmol)을 적가하였다. 첨가 완료 시, 용액을 -78℃에서 1시간 동안 교반한 다음 한 시간 더 -20℃로 가온하였다. 생성된 용액을 다시 한번 -78℃로 냉각시키고, 여기에 테트라하이드로푸란(10mL) 중 2-((5-브로모펜틸)옥시)테트라하이드로-2H-피란, 2(5.67g, 22.7mmol)의 용액을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온으로 가온하고 12시간 동안 교반하였다. 12시간 후, 반응물을 0℃로 냉각시키고 물(100mL)로 퀀칭하였다. 이어서 반응 혼합물을 진공 하에 농축하여 테트라하이드로푸란을 제거한 다음 n-헥산으로 희석하였다. 유기물을 물 및 염수(2X100mL)로 세척하였다. 유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 진공하에 농축시켜 9g 중량의 미정제 오일을 수득하였다. 미정제 오일을 n-헥산 중 5-10% 에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 2-(트리데카-6,12-디인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란, 4(4.5g, 72%)를 투명한 오일로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, d6.DMSO): δ ppm 4.544.53 (m, 1H), 3.72-3.61 (m, 1H), 3.60-3.58 (m, 1H), 3.43-3.33 (m, 1H), 3.32-3.29 (m, 1H), 2.77-2.75 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 2.16-2.13 (m, 6H), 1.55-1.41 (m, 16H).
알킨을 알킬화하는 대표적인 절차
2-(헥사데카-6,12-디인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란 7 의 합성
-78℃에서 테트라하이드로푸란(100 mL) 중 2-(트리데카-6,12-디인-1-일옥시) 테트라하이드로-2H-피란, 4(7.14 g, 25.86 mmol) 및 헥사메틸포스포르아미드(18 mL, 103.4 mmol)의 용액에 [n-헥산 중 2.5M n-부틸리튬](41.3mL, 103.4mmol)을 적가했다. 첨가 완료 시, 용액을 -78℃에서 1시간 동안 교반한 다음 한 시간 더 -20℃로 가온하였다. 생성된 용액을 -78℃로 다시 한 번 냉각시키고, 여기에 테트라하이드로푸란(20mL) 중 1-요오도프로판 5(9.9mL, 103.4mmol)의 용액을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온으로 가온하고 12시간 동안 교반하였다. 12시간 후, 반응물을 0℃로 냉각시키고 물(100mL)로 퀀칭하였다. 이어서 반응 혼합물을 진공 하에 농축하여 테트라하이드로푸란을 제거한 다음 n-헥산으로 희석하였다. 유기물을 물 및 염수(2X100mL)로 세척하였다. 유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 진공하에 농축시켜 9g 중량의 미정제 오일을 수득하였다. 미정제 오일을 n-헥산 중 5% 에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 2-(헥사데카-6,12-디인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란, 7(5.9g, 72%)을 투명한 오일로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 4.57-4.55 (m, 1H), 3.86-3.74 (m, 1H), 3.73-3.71 (m, 1H), 3.50-3.39 (m, 1H), 3.37-3.36 (m, 1H), 2.16-2.11 (m, 8H), 1.59-1.56 (m, 2H), 1.55-1.47 (m, 16H), 0.98-0.93 (t, J = 1.6 Hz, 3H).
2-(옥타데카-6,12-디인-1-일옥시)테트라하이드로-2 H -피란 8
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 4.57-4.55 (m, 1H), 3.85-3.74 (m, 1H), 3.73-3.70 (m, 1H), 3.50-3.38 (m, 1H), 3.36-3.35 (m, 1H), 2.23-2.12 (m, 8H), 1.61-1.54 (m, 2H), 1.53-1.48 (m, 16H), 1.47-1.46 (m, 4H), 0.90-0.85 (t, J = 1.6 Hz, 3H).
“P-2 Ni”를 사용하여 알킨을 알켄으로 환원시키는 대표적인 절차
2-(((6Z,12Z)-헥사데카-6,12-디엔-1-일)옥시)테트라하이드로-2H-피란 9 의 합성
0℃에서 수소 블랭킷 하에 에탄올(80mL) 중의 소듐 보로하이드라이드(0.56g, 14.8mmol) 용액에 니켈(II) 아세테이트 테트라하이드레이트(3.22g, 12.98mmol)를 첨가하였다. 첨가 완료 시, 반응물을 진공 하에 배기시키고 수소로 플러싱하였다. 10분 동안 교반한 후, 에탄올(10mL) 중 에틸렌디아민(3.7mL, 65.6mmol) 및 2-(헥사데카-6,12-디인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란, 7(5.9g, 18.55mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응물을 수소 벌룬 하에 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 4시간 후, 반응 혼합물에서 수소를 제거한 다음 질소로 플러싱하였다. 미정제 혼합물을 셀라이트 상에서 여과하고 여과액을 진공 하에 농축하여 4g 중량의 미정제 오일을 수득하였다. 미정제 오일을 n-헥산 중 5-10% 디에틸 에테르를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 2-(((6Z,12Z)-헥사데카-6,12-디엔-1-일)옥시)테트라하이드로-2H-피란, 9(4.67g, 78% 수율)를 투명한 오일로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.35-5.34 (m, 4H), 4.58-4.55 (m, 1H), 3.86-3.74 (m, 1H), 3.73-3.71 (m, 1H), 3.51-3.39 (m, 1H), 3.36-3.35 (m, 1H), 2.03-1.98 (m, 8H), 1.57-1.39 (m, 2H), 1.38-1.36 (m, 6H), 1.35-1.32 (m, 10H), 0.91-0.86 (t, J = 1.6 Hz, 3H).
13C NMR (300 MHz, CDCl3): 129.98, 129.85, 98.93, 77.53, 77.10, 76.68, 67.72, 62.43, 30.86, 29.71, 29.70, 29.45, 29.46, 29.44, 27.20, 27.19, 26.01, 25.59, 22.98, 19.78, 13.91.
2-(((6 Z ,12 Z )-옥타데카-6,12-디엔-1-일)옥시)테트라하이드로-2 H -피란 10
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.39-5.29 (m, 4H), 4.58-4.55 (m, 1H), 3.86-3.76 (m, 1H), 3.74-3.68 (m, 1H), 3.51-3.41 (m, 1H), 3.39-3.36 (m, 1H), 2.14-1.97 (m, 8H), 1.56-1.38 (m, 2H), 1.37-1.35 (m, 6H), 1.34-1.28 (m, 14H), 0.93-0.85 (t, J = 1.6 Hz, 3H).
13C NMR (300 MHz, CDCl3): 130.13, 129.97, 129.84, 129.71, 98.93, 77.53, 77.10, 76.68, 67.71, 62.42, 31.62, 30.86, 29.72, 29.71, 29.47, 29.46, 27.27, 27.18, 26.01, 25.59, 22.67, 19.78, 14.18.
테트라하이드로피라닐 에테르(THP)를 탈보호하는 대표적인 절차
(6Z,12Z)-헥사데카-6,12-디엔-1-올 11 의 합성
메탄올(20 mL) 중 2-(((6Z,12Z)-헥사데카-6,12-디엔-1-일)옥시)테트라하이드로-2H-피란 9 (4.67 g, 14.5 mmol)의 용액에 p-톨루엔설폰산 일수화물(300mg, 1.58mmol)을 실온에서 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 3시간 동안 교반한 다음 물로 퀀칭하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트(2X50mL)로 추출하였다. 조합한 유기물을 물로 세척한 다음 황산마그네슘 상에서 건조시키고 여과하고 여과액을 진공하에 농축시켜 4g 중량의 미정제 오일을 수득하였다. 미정제 오일을 n-헥산 중 5-10% 디에틸 에테르를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 (6Z,12Z)-헥사데카-6,12-디엔-1-올, 11(2.5g, 72%)을 투명한 오일로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.34-5.33 (m, 4H), 3.65-3.61 (m, 2H), 2.02-2.00 (m, 8H), 1.36-1.34 (m, 2H), 1.34-1.25 (m, 10H), 0.89-0.86 (t, J = 0.82 Hz, 3H).
(6 Z ,12 Z )-옥타데카-6,12-디엔-1-올 12
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.33 (m, 4H), 3.65-3.61 (m, 2H), 2.02-2.01 (m, 8H), 1.36-1.35 (m, 2H), 1.34-1.25 (m, 14H), 0.88-0.85 (t, J = 0.76 Hz, 3H).
Jones 시약을 사용하여 알코올을 카르복시산으로 산화시키는 대표적인 절차
(6Z,12Z)-헥사데카-6,12-디엔산 13 의 합성
0 ℃에서 아세톤(20 mL) 중 (6Z,12Z)-헥사데카-6,12-디엔-1-올, 11 (2.5 g, 10.5 mmol) 및 Jones 시약 [황산 중 2M]의 혼합물(10.5 mL, 21 mmol)을 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물로 퀀칭하고 에틸 아세테이트(2X100mL)로 추출하였다. 조합한 유기물을 황산 마그네슘 상에서 건조시키고 여과하고 여과액을 진공하에 농축시켜 미정제 오일을 수득하였다. 미정제 오일을 n-헥산 중 20% 에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 (6Z,12Z)-헥사데카-6,12-디에노산, 13(1.7g, 68%)을 투명한 오일로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.35-5.33 (m, 4H), 2.37-2.32 (t, 2H), 2.06-1.98 (m, 8H), 1.64-1.39 (m, 2H), 1.37-1.32 (m, 8H), 0.91-0.87 (t, J = 0.91 Hz, 3H).
(6 Z ,12 Z )-옥타데카-6,12-디엔산 14
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.32 (m, 4H), 2.35-2.33 (t, 2H), 2.06-2.01 (m, 8H), 1.64-1.42 (m, 2H), 1.34-1.28 (m, 12H), 0.90-0.85 (t, 3H).
( S )-2-(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)에틸 4-메틸벤젠설포네이트 16 의 합성
0 °C에서 피리딘(30 mL) 중 (S)-2-(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)에탄-1-올 15(25 g, 171.1 mmol)의 혼합물에 p-톨루엔설포닐클로라이드(35.8g, 188.2mmol) 및 DMAP(140mg, 1.14 mmol)를 첨가하고 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 CH2Cl2(500mL)로 희석하고, 포화 NH4Cl, 물 및 염수로 희석하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 용매를 증발시키고, 미정제 잔류물을 정제 없이 다음 단계에 사용하였다(43.8g, 85%).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 7.77 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 4.15-4.01 (m, 3H), 3.65-3.47 (m, 2H), 2.43 (s, 3H), 1.82-1.62 (m, 2H), 1.32 (s, 3H), 1.27 (s, 3H).
디-알킬아민 치환을 위한 대표적인 절차
( S )-2-(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)- N , N -디메틸에탄-1-아민 19 의 합성
(S)-2-(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)에틸 4-메틸벤젠설포네이트 16(10 g, 33.3 mmol)과 디메틸아민 용액 17(166mL, 333.3mmol)(THF 중 2M)의 혼합물를 실온에서 2일 동안 교반하였다. 혼합물을 농축하고, 미정제 잔류물을 CH2Cl2(500mL)로 희석하고, 포화 NaHCO3, 물 및 염수로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 용매를 증발시키고, 미정제 잔류물을 고속 크로마토그래피(SiO2: CH2Cl2 = 1% NH4OH를 포함하는 CH2Cl2 중의 100% 내지 10% MeOH)로 정제하여 무색 오일 생성물 19를 수득하였다(2.1 g, 37%).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.15-4.01 (m, 2H), 3.52 (dd, J = 7.4, 7.4 Hz, 1H), 2.41-2.23 (m, 2H), 2.21 (s, 6H), 1.82-1.62 (m, 2H), 1.39 (s, 3H), 1.33 (s, 3H).
MS (APCI+): 174.1 (M+1)
( S )-2-(2,2-디에틸-1,3-디옥솔란-4-일)- N , N -디메틸에탄-1-아민 20
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.15-4.01 (m, 2H), 3.48 (dd, J = 7.4, 7.4 Hz, 1H), 2.48-2.43 (m, 6H), 1.82-1.62 (m, 2H), 1.36 (s, 3H), 1.27 (s, 3H), 0.97 (t, J = 7.2 Hz, 6H).
MS (APCI+): 202.2 (M+1)
대표적인 케탈 가수분해 절차
( S )-4-(디메틸아미노)부탄-1,2-디올 하이드로클로라이드 염 21 의 합성
MeOH(10 mL) 중 (S)-2-(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸에탄-1-아민 19(2 g, 11.54 mmol)의 혼합물에 1N HCl 수용액(17mL, 17.3mmol)을 첨가하고 반응물을 80℃에서 45분 동안 가열하였다. TLC(Rf = 0.1, 1% NH4OH를 포함하는 CH2Cl2 중 10% MeOH)는 반응의 완료를 보여주었다. 반응 혼합물을 농축한 후, 미정제 잔류물을 물(5mL)에 용해시키고 밤새 동결건조시켰다. 점착성 시럽 생성물 21을 HCl 염으로서 수득하였다(2.1g, 정량적).
1H NMR (300 MHz, D2O): δ ppm 3.77-3.72 (m, 1H), 3.54-3.46 (m, 2H), 3.29-3.22 (m, 2H), 2.85 (s, 6H), 1.92-1.79 (m, 2H).
MS (APCI+): 134.1 (M+1)
( S )-4-(디에틸아미노)부탄-1,2-디올 하이드로클로라이드 염 22
1H NMR (300 MHz, D2O): δ ppm 3.77-3.72 (m, 1H), 3.54-3.46 (m, 2H), 3.22-3.15 (m, 6H), 1.92-1.74 (m, 2H), 1.24 (t, J = 7.4 Hz, 6H).
MS (APCI+): 162.1 (M+1)
대표적인 디에스테르화 절차
( S )-4-(디메틸아미노)부탄-1,2-디일 (6 Z ,6' Z ,12 Z ,12' Z )-비스(옥타데카-6,12-디에노에이트) AKG-UO-1 (O-11956) 의 합성
0 ℃에서 옥살릴 클로라이드(0.33mL, 3.9mmol)를 디클로로메탄/DMF(15mLs, 25mL) 중 (6Z,12Z)-옥타데카-6,12-디엔산, 14(0.36g, 1.3mmol)의 용액에 적가하고 반응을 실온으로 가온하고 1시간 동안 교반하였다. 1시간 후, 반응물을 진공 하에 농축 건조시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(10mL)에 재용해시키고 N,N-디이소프로필에틸아민(2.3mL, 10mmol), 4-디메틸아미노피리딘(317mg, 2.6mmol) 및 (S)-4-(디메틸아미노)부탄-1,2-디올 하이드로클로라이드, 21(101mg, 0.6mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 생성된 용액을 24시간 동안 교반하였다.
24시간 후, 반응물을 0℃로 냉각시키고 물(10mL)로 퀀칭시켰다. 반응 혼합물을 디클로로메탄(2X100mL)으로 추출하고 유기물을 물 및 염수(2X100mL)로 세척하였다. 유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 진공하에 농축시켜 미정제 오일을 수득하였다. 미정제 오일을 디클로로메탄 중 2% 메탄올을 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 (S)-4-(디메틸아미노)부탄-1,2-디일 (6Z,6'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-6,12-디에노에이트), AKG-UO-1, (0.12 g, 30%)을 황색 오일로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.40-5.29 (m, 8H), 5.14-5.12 (m, 1H), 4.25 (dd, J = 11.8, 3.3 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 12.1, 6.3 Hz, 1H), 2.32-2.26 (m, 6H), 2.20 (s, 6H), 2.06-1.99 (m, 16H), 1.78-1.70 (m, 2H), 1.65-1.58 (m, 4H), 1.42-1.25 (m, 24H), 0.90-0.85 (m, 6H).
MS (APCI+): 658.5 (M+1)
( S )-4-(디에틸아미노)부탄-1,2-디일 (6 Z ,6' Z ,12 Z ,12' Z )-비스(옥타데카-6,12-디에노에이트) AKG-UO-1A (O-11955)
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.37-5.29 (m, 8H), 5.12-5.10 (m, 1H), 4.25 (dd, J = 12.1, 3.6 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 11.8, 6.3 Hz, 1H), 2.52-2.42 (m, 6H), 2.29 (t, J = 7.4 Hz, 4H)), 2.06-1.99 (m, 16H), 1.78-1.70 (m, 2H), 1.64-1.59 (m, 4H), 1.41-1.19 (m, 24H), 0.99 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.96-0.87 (m, 6H).
MS (APCI+): 686.6 (M+1)
( S )-4-(디메틸아미노)부탄-1,2-디일 (6 Z ,6' Z ,12 Z ,12' Z )-비스(헥사데카-6,12-디에노에이트) AKG-UO-4 (O-12401)
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.39-5.29 (m, 8H), 5.13-5.12 (m, 1H), 4.24 (dd, J = 11.8, 3.3 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 11.8, 6.3 Hz, 1H), 2.32-2.27 (m, 6H), 2.19 (s, 6H), 2.01-1.99 (m, 16H), 1.75-1.72 (m, 2H), 1.65-1.58 (m, 4H), 1.36-1.31 (m, 16H), 0.91-0.86 (m, 6H).
MS (APCI+): 602.5 (M+1)
( S )-4-(디에틸아미노)부탄-1,2-디일 (6 Z ,6' Z ,12 Z ,12' Z )-비스(헥사데카-6,12-디에노에이트) AKG-UO-4A (O-12402) 의 합성
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.40-5.29 (m, 8H), 5.12-5.11 (m, 1H), 4.25 (dd, J = 11.8, 3.3 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 11.8, 6.3 Hz, 1H), 2.54-2.43 (m, 6H), 2.29 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 2.11-1.96 (m, 16H), 1.74-1.65 (m, 2H), 1.65-1.59 (m, 4H), 1.39-1.31 (m, 16H), 0.99 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.91-0.89 (m, 6H).
MS (APCI+): 630.5 (M+1)
( S )-4-(디메틸아미노)부탄-1,2-디일 (6Z,6'Z,11Z,11'Z)-비스(옥타데카-6,11-디에노에이트)(AKG-UO-1a)의 합성
실험 절차
2-((5-브로모펜틸)옥시)테트라하이드로-2 H -피란 2 의 합성
0℃에서 디클로로메탄(100mL) 및 피리디늄 p-톨루엔 설포네이트(40mg, 0.16mmol) 중 5-브로모-1-펜탄올 1(3.6 g, 21.6mmol)의 용액에 3,4-디하이드로-2H-피란(6.54mL, 71.8mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음 물로 퀀칭하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트(2X100mL)로 추출하였다. 조합한 유기물을 염수로 세척한 후 황산 마그네슘 상에서 건조시키고 여과하고 여과액을 진공하에 농축시켜 미정제 오일을 수득하였다. 미정제 오일을 n-헥산 중 5-10% 에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 2-((5-브로모펜틸)옥시)테트라하이드로-2H-피란, 2(4.5g, 83%)를 투명한 오일로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.55-4.54 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 3.92-3.72 (m, 2H), 3.42-3.38 (m, 3H), 1.88-1.55 (m, 3H), 1.52-1.50 (m, 10H).
2-(도데카-6,11-디인-1-일옥시)테트라하이드로-2 H -피란 4a 의 합성
-78 °C에서 테트라하이드로푸란(100 mL) 중 1,6-헵타디인 3a(5 g, 54.3 mmol) 및 헥사메틸포스포르아미드(19 mL, 108 mmol)의 용액에 [n-헥산 중 2.5 M n-부틸리튬](21.7 mL, 54.3 mmol)을 적가하였다. 첨가 완료 시, 용액을 -78℃에서 1시간 동안 교반한 다음 한 시간 더 -20℃로 가온하였다. 생성된 용액을 다시 한번 -78℃로 냉각시키고, 여기에 테트라하이드로푸란(10mL) 중 2-((5-브로모펜틸)옥시)테트라하이드로-2H-피란, 2(6.8 g, 27.1 mmol)의 용액을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온으로 가온하고 12시간 동안 교반하였다. 12시간 후, 반응물을 0℃로 냉각시키고 물(100mL)로 퀀칭하였다. 이어서 반응 혼합물을 진공 하에 농축하여 테트라하이드로푸란을 제거한 다음 n-헥산으로 희석하였다. 유기물을 물 및 염수(2X100mL)로 세척하였다. 유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 진공하에 농축시켜 미정제 오일을 수득하였다. 미정제 오일을 n-헥산 중 5-10% 에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 2-(도데카-6,11-디인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란, 4a(4.1 g, 58%)를 투명한 오일로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 4.57-4.56 (m, 1H), 3.96-3.82 (m, 1H), 3.77-3.69 (m, 1H), 3.50-3.41 (m, 1H), 3.39-3.34 (m, 1H), 2.29-2.25 (m, 4H), 2.15-2.12 (m, 2H), 1.95-1.94 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 1.73-1.43 (m, 14H).
2-(옥타데카-6,11-디인-1-일옥시)테트라하이드로-2 H -피란 6a 의 합성
- 78℃에서 테트라하이드로푸란(100 mL) 중 2-(도데카-6,11-디인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란, 4a(4.1 g, 15.64 mmol) 및 헥사메틸포스포르아미드(11 mL, 62.6 mmol)의 용액에 [n-헥산 중 2.5M n-부틸리튬](12.5 mL, 31.3 mmol)을 적가했다. 첨가 완료 시, 용액을 -78℃에서 1시간 동안 교반한 다음 한 시간 더 -20℃로 가온하였다. 생성된 용액을 -78℃로 다시 한 번 냉각시키고, 여기에 테트라하이드로푸란(20mL) 중 1-요오도헥산 5a(9.5 mL, 62.6mmol)의 용액을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온으로 가온하고 12시간 동안 교반하였다. 12시간 후, 반응물을 0℃로 냉각시키고 물(100mL)로 퀀칭하였다. 이어서 반응 혼합물을 진공 하에 농축하여 테트라하이드로푸란을 제거한 다음 n-헥산으로 희석하였다. 유기물을 물 및 염수(2X100mL)로 세척하였다. 유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 진공하에 농축시켜 미정제 오일을 수득하였다. 미정제 오일을 n-헥산 중 5% 에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 2-(옥타데카-6,11-디인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란, 6a(3.1 g, 57%)를 투명한 오일로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 4.58-4.55 (m, 1H), 3.86-3.82 (m, 1H), 3.77-3.69 (m, 1H), 3.51-3.47 (m, 1H), 3.41-3.34 (m, 1H), 2.26-2.21 (m, 6H), 2.14-2.12 (m, 6H), 1.66-1.26 (m, 18H), 0.93-0.85 (t, J = 6.5 Hz, 3H).
2-(((6 Z ,11 Z )-옥타데카-6,11-디엔-1-일)옥시)테트라하이드로-2 H -피란 7a 의 합성
0℃에서 수소 블랭킷 하에 에탄올(50mL) 중의 소듐 보로하이드라이드(0.27g, 14.8mmol) 용액에 니켈(II) 아세테이트 테트라하이드레이트(1.55 g, 6.25mmol)를 첨가하였다. 첨가 완료 시, 반응물을 진공 하에 배기시키고 수소로 플러싱하였다. 10분 동안 교반한 후, 에탄올(10mL) 중 에틸렌디아민(1.8 mL, 26.8 mmol) 및 2-(옥타데카-6,11-디인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란, 6a(3.1 g, 8.93mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응물을 수소 벌룬 하에 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 4시간 후, 반응 혼합물에서 수소를 제거한 다음 질소로 플러싱하였다. 미정제 혼합물을 셀라이트 상에서 여과하고 여과액을 진공 하에 농축하여 4g 중량의 미정제 오일을 수득하였다. 미정제 오일을 n-헥산 중 5-10% 디에틸 에테르를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 2-(((6Z,11Z)-옥타데카-6,11-디엔-1-일)옥시)테트라하이드로-2H-피란, 7a(2.86 g, 92% 수율)를 투명한 오일로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.4-5.34 (m, 4H), 4.58-4.55 (m, 1H), 3.86-3.82 (m, 1H), 3.74-3.68 (m, 1H), 3.51-3.49 (m, 1H), 3.41-3.36 (m, 1H), 2.06-1.99 (m, 6H), 1.83-1.67 (m, 2H), 1.59-1.51 (m, 6H),1.48-1.32 (m, 16H), 0.92-0.85 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
(6Z,11Z)-옥타데카-6,11-디엔-1-올 8a 의 합성
절차는 앞에서 설명하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.37-5.33 (m, 4H), 3.65-3.61 (m, 1H), 2.06-1.99 (m, 6H), 1.56-1.41 (m, 4H), 1.38-1.27 (m, 14H), 0.88-0.85 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
(6Z,11Z)-옥타데카-6,11-디엔산 9a 의 합성
절차는 앞에서 설명하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.38-5.33 (m, 4H), 2.37-2.33 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.06-1.99 (m, 6H), 1.67-1.59 (m, 2H), 1.41-1.25 (m, 14H), 0.89-0.85 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
( S )-4-(디메틸아미노)부탄-1,2-디일 (6Z,6'Z,11Z,11'Z)-비스(옥타데카-6,11-디에노에이트)(AKG-UO-1a)의 합성
절차는 앞에서 설명하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.39-5.29 (m, 8H), 5.14-5.12 (m, 1H), 4.25 (dd, J = 11.8, 3.3 Hz, 1H), 4.06 (dd, J = 11.8, 6.3 Hz, 1H), 2.32-2.28 (m, 6H), 2.20 (s, 6H), 2.03-2.01 (m, 16H), 1.74-1.64 (m, 2H), 1.62-1.60 (m, 6H), 1.38-1.27 (m, 22H), 0.89-0.85 (m, 6H).
MS (APCI+): 658.5 (M+1)
실시예 1C. KC-01 시리즈 이온화 가능한 지질의 합성
2-(( S )-2,2-디((6 Z ,12 Z )-옥타데카-6,12-디엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)- N , N -디메틸에탄-1-아민 (AKG-KC2-01, O-12095)의 합성
3-(( S )-2,2-디((6 Z ,12 Z )-옥타데카-6,12-디엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)- N , N -디메틸프로판-1-아민 (AKG-KC3-01, O-12096)
(6Z,12Z)-1-브로모옥타데카-6,12-디엔, 2의 합성
0 ℃에서 디클로로메탄(50 mL) 중 (6Z,12Z)-옥타데카-6,12-디엔-1-올, 1(3.6 g, 13.7mmol)의 용액에 메탄 설포닐 클로라이드(1.26 mL, 16.4mmol) 및 트리에틸아민(3.6mL, 20.5mmol)를 첨가했다. 생성된 용액을 실온으로 가온하고 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물로 퀀칭하고 디클로로메탄(2X100mL)으로 추출하였다. 조합한 유기물을 염수로 세척한 다음 마그네슘 설페이트로 건조시킨 후 여과하였다. 여과액을 진공 하에서 농축하여 미정제 오일을 얻었다. 생성된 오일을 디에틸 에테르(50mL)에 용해시키고, 0℃에서 디에틸 에테르(50mL) 중 마그네슘 브로마이드 에틸 에테레이트(7g, 27.4mmol)의 교반 슬러리에 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온하고 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 퀀칭하고 에틸 아세테이트(2X100 mL)로 추출하였다. 조합한 유기물을 염수로 세척한 다음 마그네슘 설페이트로 건조시킨 후 여과하였다. 여과액을 진공 하에서 농축하여 미정제 오일을 얻었다.미정제 오일을 n-헥산 중 5-10% 에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 (6Z,12Z)-1-브로모옥타데카-6,12-디엔, 3(2.9 g, 8.89 mmol, 65%)을 황색 오일로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.33 (m, 4H), 3.42-3.37 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.04-1.97 (m, 8H), 1.83-1.83 (m, 2H), 1.37-1.28 (m, 14H), 0.90-0.86 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
(6 Z ,12 Z ,25 Z ,31 Z )-헵타트리아콘타-6,12,25,31-테트라엔-19-올, 3 의 합성
에테르(10mL) 중 (6Z,12Z,)-1-브로모옥타데카-6,12-디엔, 2(2g, 6.08mmol)의 용액을 실온에서 아르곤하에 에테르(2mL) 중 요오드 및 마그네슘 조각(162mg, 6.69mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 90분 동안 교반하고(마그네슘 조각 소모됨) 여기에 에틸 포르메이트(0.24mL, 3.04mmol)를 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 반응물을 1N HCl 용액으로 퀀칭하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트(2X100mL)로 추출하고 조합한 유기물을 물에 이어 염수로 세척하였다. 유기물을 마그네슘 설페이트 하에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 진공 하에 농축시켜 미정제 오일을 수득하였다. 생성된 오일을 에탄올(10mL)에 용해시키고 물(3mL) 중의 포타슘 하이드록사이드(260mg) 용액에 첨가하였다. 12시간 동안 교반한 후, 혼합물의 pH를 2N HCl로 4로 조정하였다. 수용액을 디클로로메탄(2X)으로 추출하고 합하였다. 유기물을 염수로 세척한 후 마그네슘 설페이트 하에서 건조시키고 여과하였다. 여과액을 진공 하에서 농축하여 미정제 오일을 얻었다. 미정제 오일을 n-헥산 중 10-30% 에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 정제하여 (6Z,12Z,25Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,12,25,31-테트라엔-19-올, 3(0.29g, 0.55mmol, 18%)을 투명한 오일로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.32 (m, 8H), 3.57 (bs, 1H), 3.33-3.32, (m, 2H), 2.13-1.97 (m, 16H), 1.36-1.29 (m, 34H), 0.90-0.86 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
(6 Z ,12 Z ,25 Z ,31 Z )-헵타트리아콘타-6,12,25,31-테트라엔-19-온, 4 의 합성
0℃에서 디클로로메탄 중 (6Z,12Z,25Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,12,25,31-테트라엔-19-올, 3(0.29g, 0.55mmol) 및 소듐 카보네이트(3mg, 0.03mmol)의 혼합물에 피리디늄 클로로크로메이트(236mg, 1.1mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온하고 1시간 동안 교반하였다. 1시간 후, 실리카겔(1g)을 반응물에 첨가하고 혼합물을 여과하였다. 여과액을 농축시키고 생성된 오일을 n-헥산 중 10-20% 에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 정제하여 (6Z,12Z,25Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,12,25,31-테트라엔-19-온, 4(0.12g, 0.23mmol, 42%)를 투명한 오일로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.32 (m, 8H), 3.36-3.32, (m, 1H), 2.40-2.35 (t, J = 6.6 Hz, 3H), 2.14-2.00 (m, 16H), 1.58-1.54 (m, 4H), 1.34-1.29 (m, 28H), 0.90-0.86 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
2-(( S )-2,2-디((9 Z ,12 Z )-옥타데카-9,12-디엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일) 에탄-1-올, 7 의 합성
톨루엔(10mL) 중 (6Z,12Z,25Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,12,25,31-테트라엔-19-온, 4(0.12g, 0.23mmol), (4S)-(+)-4-(2-하이드록시에틸)-2,2-디메틸-1,3-디옥솔란 5(0.20g, 1.38mmol), 및 피리디늄 p-톨루엔 설포네이트(9mg))의 혼합물 질소 양압 하에 환류 가열하였다. 12시간 후, 혼합물을 진공 하에서 농축하여 미정제 오일을 얻었다. 생성된 미정제 오일을 n-헥산 중 20-40% 에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 2-((S)-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일) 에탄-1-올, 7 (0.11 g, 0.17 mmol, 77%)을 투명한 오일로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.32 (m, 8H), 4.25-4.20 (m, 1H), 4.10-4.06 (m, 1H), 3.82-3.77 (m, 1H), 3.54-3.49 (m, 1H), 2.23-2.19 (t, J = 6.6 Hz, 3H), 2.14-2.00 (m, 16H), 1.84-1.78 (m, 2H), 1.62-1.51 (m, 6H), 1.34-1.29 (m, 28H), 0.90-0.86 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
3-(( S )-2,2-디((9 Z ,12 Z )-옥타데카-9,12-디엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)프로판-1-올 , 8 의 합성
톨루엔(10mL) 중 (6Z,12Z,25Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,12,25,31-테트라엔-19-온, 4(0.50 g, 0.95 mmol), (S)-(3)-(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)프로판올 6 (0.76 g, 4.75 mmol), 및 피리디늄 p-톨루엔 설포네이트(36mg))의 혼합물 질소 양압 하에 환류 가열하였다. 12시간 후, 혼합물을 진공 하에서 농축하여 미정제 오일을 얻었다. 생성된 미정제 오일을 n-헥산 중 20-40% 에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 3-((S)-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)프로판-1-올, 8 (0.48 g, 0.76 mmol, 80%)을 투명한 오일로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.34-5.29 (m, 8H), 4.06-4.02 (m, 2H), 3.67-3.47 (m, 2H), 3.45-3.43 (m, 1H), 2.12-2.01 (m, 16H), 1.65-1.62 (m, 8H), 1.34-1.29 (m, 32H), 0.89-0.85 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
2-(( S )-2,2-디((9 Z ,12 Z )-옥타데카-9,12-디엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)- N , N -디메틸에탄-1-아민, (AKG-KC2-01, O-12095)의 합성
0 ℃에서 디클로로메탄(10 mL) 중 2-((S)-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일) 에탄-1-올, 7(0.49 g, 0.79 mmol)의 용액에 메탄설포닐 클로라이드(73 L, 0.95 mmol) 및 트리에틸아민(0.26 mL, 1.2 mmol)을 첨가하였다. 용액을 실온으로 가온하고 한 시간 더 교반하였다. 반응을 물로 퀀칭하고 디클로로메탄(2X100mL)으로 추출하였다. 유기물을 염수로 세척한 후 마그네슘 설페이트에서 건조시키고 여과하였다. 여과액을 진공 하에서 농축하여 미정제 오일을 얻었다. 2M 디메틸아민 용액(10mL)을 생성된 미정제 오일에 첨가하고 24시간 동안 교반하였다. 이후 혼합물을 물로 퀀칭하고 디클로로메탄(2X100mL)으로 추출하였다. 조합한 유기물을 염수로 세척한 다음 마그네슘 설페이트로 건조시킨 후 여과하였다. 여과액을 진공 하에서 농축하여 미정제 오일을 얻었다.미정제 오일을 n-헥산 중 5-100% 에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하여 2-((S)-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸에탄-1-아민, (AKG-KC2-01, O-12095), (206 mg, 0.32 mmol, 41%)을 투명한 오일로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.35-5.32 (m, 8H), 4.08-4.03 (m, 2H), 3.47 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 2.36-2.27 (m, 2H), 2.21 (s, 6H), 2.01-1.99 (m, 16H), 1.88-1.77 (m, 2H), 1.68-1.53 (m, 6H), 1.42-1.19 (m, 34H), 0.96-0.86 (t, J = 3.7 Hz, 6H).
C43H79NO2에 대한 MS(APCI): 642.6.
3-((S)-2,2-디((6Z, 12Z)-옥타데카-6-12-디엔-4-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸프로판-1-아민, AKG-KC3-01, O-12096)의 합성
절차는 앞에서 설명하였다.
투명한 오일의 3-((S)-2,2-디((6Z, 12Z)-옥타데카-6-12-디엔-4-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸프로판-1-아민, (AKG-KC3-01, O-12096), (255 mg, 0.39 mmol, 51%).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.39-5.32 (m, 8H), 4.06-4.02 (m, 2H), 3.48-3.44 (m, 1H), 2.35-2.30 (m, 2H), 2.25 (s, 6H), 2.01-1.98 (m, 16H), 1.70-1.51 (m, 12H), 1.35-1.25 (m, 32H), 0.90-0.85 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
C44H81NO2에 대한 MS(APCI): 656.6
2-(( S )-2,2-디(( Z )-옥타덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)- N , N -디메틸에탄-1-아민 (AKG-KC2-OA, O-11880)의 합성
2-(( S )-2,2-디(( Z )-헥사덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)- N , N -디메틸에탄-1-아민 (AKG-KC2-PA, O-11879)의 합성
3-(( S )-2,2-디(( Z )-옥타덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)- N , N -디메틸프로판-1-아민 (AKG-KC3-OA, O-11957)
실험 절차(앞서 설명한 AKG-KC2-01의 합성 참조)
(Z)-1-브로모옥타덱-9-엔 3 의 합성
절차는 앞에서 설명하였다.
투명한 오일로서 (Z)-1-브로모옥타덱-9-엔(6.4g, 19.33mmol).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.32 (m, 2H), 3.41 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.01-1.99 (m, 4H), 1.87-1.82 (m, 2H), 1.44-1.26 (m, 22H), 0.87 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
( Z )-16-브로모헥사덱-7-엔 4
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.32 (m, 2H), 3.42 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.01-1.99 (m, 4H), 1.87-1.82 (m, 2H), 1.44-1.26 (m, 18H), 0.89 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
(9 Z ,28 Z )-헵타트리아콘타-9,28-디엔-19-올 5 의 합성
절차는 앞에서 설명하였다.
고체로서 (9Z,28Z)-헵타트리아콘타-9,28-디엔-19-올 (1.2 g, 2.25 mmol, 47%).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.29 (m, 4H), 3.57 (bs, 1H), 2.01-1.97 (m, 8H), 1.42-1.26 (m, 53H), 0.89 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
(7 Z ,26 Z )-트리트리아콘타-7,26-디엔-17-올 6
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.29 (m, 4H), 3.57 (bs, 1H), 2.01-1.97 (m, 8H), 1.42-1.26 (m, 45H), 0.89 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
(9 Z ,28 Z )-헵타트리아콘타-9,28-디엔-19-온 7 의 합성
절차는 앞에서 설명하였다.
투명한 오일로서 (9Z,28Z)-헵타트리아콘타-9,28-디엔-19-온 (0.89 g, 1.67 mmol, 74%).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.29 (m, 4H), 2.03-1.98 (m, 8H), 1.42-1.26 (m, 52H), 0.90-0.89 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
(7Z,26Z)-트리트리아콘타-7,26-디엔-17-온 8
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.29 (m, 4H), 2.03-1.98 (m, 8H), 1.42-1.26 (m, 44H), 0.90-0.89 (t, J = 6.6 Hz, 6H).
2-(( S )-2,2-디(( Z )-옥타덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일) 에탄-1-올 9 의 합성
절차는 앞에서 설명하였다.
투명한 오일로서 2-((S)-2,2-디((Z)-옥타덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일) 에탄-1-올 (0.39 g, 0.63 mmol, 74%).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.28 (m, 4H), 4.22-4.10 (m, 1H), 4.08-4.05 (m, 1H), 3.82-3.79 (m, 2H), 3.48 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 2.24-2.21 (m, 1H), 2.01-1.99 (m, 8H), 1.81-1.80 (m, 2H), 1.59-1.54 (m, 6H), 1.34-1.26 (m, 45H), 0.87 (t, J = 6.3 Hz, 6H).
2-(( S )-2,2-디(( Z )-헥사덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)에탄-1-올, 10 의 합성
절차는 앞에서 설명하였다.
투명한 오일로서 2-((S)-2,2-디((Z)-헥사덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)에탄-1-올 (1.02 g, 1.65 mmol, 51%).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.36-5.29 (m, 4H), 4.23-4.10 (m, 1H), 4.07-4.05 (m, 1H), 3.82-3.79 (m, 2H), 3.48 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 2.24-2.12 (m, 1H), 2.01-1.97 (m, 8H), 1.84-1.78 (m, 2H), 1.57-1.55 (m, 8H), 1.34-1.29 (m, 35H), 0.87 (t, J = 6.3 Hz, 6H).
3-(( S )-2,2-디(( Z )-옥타덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)프로판-1-올, 11 의 합성
절차는 앞에서 설명하였다.
투명한 오일로서 3-((S)-2,2-디((Z)-옥타덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일) 프로판-1-올 (0.41 g, 0.65 mmol, 76%)
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.39-5.32 (m, 4H), 4.06-4.03 (m, 2H), 3.71-3.67 (m, 2H), 3.47-3.46 (m, 1H), 2.01-1.99 (m, 10H), 1.66-1.59 (m, 4H), 1.56-1.54 (m, 6H), 1.34-1.26 (m, 44H), 0.87 (t, J = 6.3 Hz, 6H).
2-(( S )-2,2-디(( Z )-옥타덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)- N , N -디메틸에탄-1-아민, (AKG-KC2-OA, O-11880) 의 합성
절차는 앞에서 설명하였다.
투명한 오일로서 2-((S)-2,2-디((Z)-헥사덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸에탄-1-아민, (AKG-KC2-OA, O-11880), (200 mg, 0.31 mmol, 49%).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.38-5.28 (m, 4H), 4.08-4.01 (m, 2H), 3.48 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 2.39-2.24 (m, 2H), 2.21 (s, 6H), 2.01-1.97 (m, 8H), 1.82-1.77 (m, 2H), 1.68-1.52 (m, 6H), 1.34-1.26 (m, 46H), 0.87 (t, J = 6.3 Hz, 6H).
C43H83NO2에 대한 MS(APCI): 646.7
2-(( S )-2,2-디(( Z )-헥사덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)- N , N -디메틸에탄-1-아민, (AKG-KC2-PA, O-11879) 의 합성
절차는 앞에서 설명하였다.
투명한 오일로서 2-((S)-2,2-디((Z)-헥사덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸에탄-1-아민, (AKG-KC2-PA, O-11879), (195 mg, 0.33 mmol, 18%).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.35-5.28 (m, 4H), 4.08-4.02 (m, 2H), 3.48 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 2.38-2.27 (m, 2H), 2.20 (s, 6H), 2.01-1.99 (m, 8H), 1.97-1.80 (m, 2H), 1.77-1.52 (m, 6H), 1.34-1.29 (m, 38H), 0.87 (t, J = 6.3 Hz, 6H).
C39H75NO2에 대한 MS(APCI): 590.6
3-(( S )-2,2-디(( Z )-옥타덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)- N , N -디메틸프로판-1-아민, (AKG-KC3-OA, O-11957) 의 합성
절차는 앞에서 설명하였다.
투명한 오일로서 3-((S)-2,2-디((Z)-옥타덱-9-엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸프로판-1-아민, (AKG-KC3-OA, O-11957), (160 mg, 0.24 mmol, 37%).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5.39-5.28 (m, 4H), 4.06-4.01 (m, 2H), 3.44 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 2.26 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.20 (s, 6H), 2.01-1.97 (m, 8H), 1.82-1.77 (m, 2H), 1.60-1.43 (m, 8H), 1.34-1.26 (m, 46H), 0.87 (t, J = 6.3 Hz, 6H).
C44H85NO2:에 대한 MS(APCI): 660.6
실시예 2. 인간 간세포 또는 암세포의 체외 세포독성 분석
LNP는 인간 간세포/간(HepG2; ATCC #HB8065) 세포에서 IC50을 결정하기 위해 일련의 10회 희석에 걸쳐 시험관 내에서 테스트될 수 있다. 이러한 제형은 일반적으로 무독성인 것으로 예상되므로, 모든 연구에 Lipofectamine™ 3000(ThermoFisher #L3000015)-복합체 mRNA(2μl 시약/1μg mRNA)의 양성 대조군이 포함된다. 사용된 mRNA는 CleanCap FLuc, EGFP 또는 MCherry 리포터 유전자 mRNA(5moU; Trilink #L-7202, #L-7201 또는 #L-7203)이다. 데이터는 전체 세포 생존율 곡선과 각 화합물에 대한 실제 IC50 값의 계산으로 보고된다.
부착 세포는 ~80% 컨플루언시까지 성장된다. 0.25% 트립신-EDTA(Gibco # 25200-072)를 첨가하여 세포를 트립신 처리한 다음, 세포를 스핀다운하고, 5ml의 성장 배지(MEM 배지; Corning # 10010 CM)를 첨가하여 세포를 분산시켰다. 세포 밀도는 혈구계산기를 사용하여 결정된다. 성장 배지(10% FBS를 포함하는 MEM 배지; Corning # 35015 CV)를 세포에 첨가하여 적절한 세포 농도로 조정한다. 그런 다음, 200 μl의 세포(5,000개 세포/웰)를 96-웰 투명 편평 바닥 플레이트(Costar #9804)에 첨가하고 37°C의 플레이트에서 5% CO2가 있는 가습 인큐베이터에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
성장 배지를 용매로 사용하는 LNP 제형의 연속 희석물을 제조한다. 이들 화합물은 1 mg/ml mRNA 농도의 무균 수용액으로 제공된다. 희석을 위해, 각 LNP 스톡을 실온으로 가온시켰다. 이들은 250ug/ml의 최고 테스트 mRNA 농도로 성장 배지에서 4x로 추가로 희석되었다.
LNP는 각 LNP에 대한 초기 250 μg/ml 농도로부터, 기존 배지를 흡인하고 이를 LNP 함유 배지 200 μl로 대체함으로써 연속 1:3 희석하여 웰에 추가된다. 플레이트를 72시간 동안 5% CO2가 있는 가습 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션했다. LNP 인큐베이션 기간이 끝나면 각 웰의 배지를 1X PrestoBlue 세포 생존도 시약(ThermoFisher 카탈로그 # A13261) 100μl로 교체한다. 플레이트를 37℃에서 5% CO2가 있는 가습 인큐베이터에서 30분 내지 2시간 동안 인큐베이션한다. 30분, 60분, 120분에 판독값을 기록한다. SpectraMax M5 플레이트 판독기(Molecular Devices)를 사용하여 560nm 여기 및 590nm 방출로 형광을 판독한다. 모든 샘플 판독값에서 배양 배지(배경 대조 웰)만 포함하는 대조군의 RFU를 빼서 배경을 수정한다. 아래 식을 사용하여 세포 독성 백분율을 계산하라:
세포독성 % = [(RFU.배지 - RFU 처리)/ RFU.배지] x 100%
IC50은 다음 식을 사용하여 GraphPad Prism을 사용하여 결정되었다:
Y=100/(1+10^((LogIC50-X)*힐슬로프)))
Lipofectamine™ 3000(ThermoFisher #L3000015)-복합체 mRNA(2μl 시약/1μg mRNA) 양성 대조군의 세포독성은 일부 실시예에서 본원에 개시된 화합물보다 5-100배 더 독성일 수 있다. 이는 개시된 화합물이 시험관내 간세포독성 검정에서 시판되는 형질감염 시약보다 독성이 적다는 것을 보여준다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 화합물은 시판되는 형질감염 시약보다 생체내 독성이 더 적은 LNP를 형성한다.
실시예 3. 이온화 가능한 지질의 pKa 결정
이온화 가능한 양이온성 지질의 pKa는 여러 가지 방법으로 계산할 수 있다. 지질의 경우 막 구조 그리고 막의 인접한 지질이 아미노 기의 해리 특성에 영향을 주어 잠재적으로 부정확한 값을 제공할 수 있기 때문에 계산여기서때로 어렵다. 이온화 가능한 지질의 겉보기 pKa가 지질이 의도한 환경 내에 있는 동안(이 경우 LNP의 일부로서) 측정되는 현장 측정이 이상적이다(Jayaraman 2012, Sabins 2018).
각각의 LNP 제형에 대해, 아미노 지질 pKa 값은 pH 3 내지 12로 적정하는 동안 2-(p-톨루이디노)-6-나프탈렌 설폰산(TNS)의 형광을 측정하여 결정된다. TNS는 용액에서 형광을 발하지 않지만 양성 지질 막과 결합할 때 형광을 증가시키는 음이온 분자이며, 이 특성은 과거에 막 표면 전하를 조사하는 데 사용되어 왔다. 겉보기 pKa를 결정하기 위해 다양한 pH 값에서 완충액을 준비하는 데 사용되는 마스터 완충액 스톡(10mM 수산화칼륨, 10mM 붕산나트륨, 10mM 구연산나트륨, 150mM 염화나트륨)을 준비한다. 1M 수산화나트륨과 1M 염산을 사용하여 마스터 완충액 스톡에서 약 20개의 고유 완충액을 약 3~12 사이의 다양한 pH 값에서 준비한다. 300mM 6-(p-톨루이디노)-2-나프탈렌설폰산 나트륨 염(TNS) DMSO(디메틸 술폭사이드)에 용해된 시약)을 스톡으로 사용한다. LNP는 최종 mRNA 농도가 0.04 mg/mL인 원하는 pH 완충액으로 준비 및 정제된다. 원하는 완충액이 사전 부하된 96-웰 플레이트를 사용하여, mRNA의 최종 농도가 0.7μg/mL이 되도록 LNP를 포함하는 mRNA를 추가한다. 각각의 웰에, DMSO 농도가 1%(v/v)가 되도록 TNS를 첨가한다. 혼합 후, 각 웰에서 TNS의 형광을 측정하고(Ex/Em 331nm/445nm) S자형 최적 적합 분석을 형광 데이터에 적용한다. pKa는 절반 최대 형광 강도를 발생시키는 pH로 결정된다. 화합물 1-36에 대해 측정된 겉보기 pKa는 pH 범위 6.0-7.0에 속한다.
실시예 4. LNP의 세포 흡수 측정.
LNP 세포 흡수는 형광 이미징 및/또는 형광 정량화에 의해 측정된다. 이용가능한 많은 적합한 형광 추적자들, 예를 들어, 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카르보시아닌 퍼클로레이트(DiI), 3,3'-디리놀레일옥사카르보시아닌 퍼클로레이트(DiO), 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도디카르보시아닌 퍼클로레이트(DiD) 및 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도트리카르보시아닌 요오다이드(DiR)(Thermo)가 존재한다. 이러한 지질은 물에서 약하게 형광을 나타내지만 LNP에 존재하는 지질들과 같이 지질막에 통합될 때 높은 형광을 나타낸다. 선택된 지질은 광안정성이며 높은 흡광 계수를 갖는 것이 중요하다.
이러한 유형의 지질을 포함하는 LNP는 형광 현미경으로 시각화된다. 한 방법에서, LNP 지질 제형은 0.1-0.5mol% 총 지질의 형광 지질 추적자, 예를 들어, 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도디카르보시아닌-5,5'-디설폰산 (DiI5-DS)을 함유한다. 관심 있는 세포들을 24-웰 플레이트(Corning사)와 같은 적합한 세포 배양 접시에서 성장시킨다. 세포들을 섭취 연구 전날 50% 컨플루언시로 시딩하고 적절한 조건, 예를 들어, 37℃, 5% CO2, 90-100% 습도에서 밤새 성장시킨다. LNP는 세포 배양 배지에 0.1-100 ug/mL mRNA로 첨가되고 일정 시간(4-24시간) 동안 세포와 상호작용시킨 다음, 세포는 배지로 세 번 세척하여 내재화되지 않은 LNP를 관찰하기 전에 제거한다. 형광 검출 기능이 있는 현미경으로 세포를 관찰한다. LNP 세포 흡수의 상대적 정도는 비처리 세포를 배경 대조군으로 사용하여 세포로부터의 형광 강도 신호로부터 결정된다. 대안적으로, 세포 형광 지질은 세포를 펠릿화하고 트리톤-X100과 같은 세제로 세포를 용해시키고 분광형광계로 형광을 정량화하거나 HPLC로 형광 지질 추적자를 정량화함으로써 정량적으로 측정될 수 있다.
유사한 방식으로, 형광 표지된 mRNA가 정량된다. 예를 들어, 1:3 비율의 시아닌 5-UTP:5-메톡시-UTP로 전사된 염료 표지 강화 녹색 형광 단백질(EGFP) 및 반딧불이 루시페라제(FLuc) mRNA는 현재 Trilink Biotechnologies사에서 수득가능하다. 시아닌 5는 여기 최대값이 650nm이고 방출 최대값이 670nm이다. 이 비율로 대체하면 쉽게 시각화되고 세포 배양물에서도 여전히 번역될 수 있는 mRNA가 생성된다. 형광 표지된 mRNA를 포획함으로써 위에서 설명한 방법으로 mRNA의 세포내 전달을 시각화할 수 있다.
세포에서 LNP 섭취는 ApoE 매개와 같은 내인성 방법 또는 활성 표적화와 같은 외인성 방법을 통해 달성될 수 있다. 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함하는 LNP 시스템은 혈액에서 아포지단백 E(ApoE)를 흡착한 다음(Cullis et al 2017) ApoE 결합 리간드를 포함하는 여러 수용체에 의해 간세포에서 활발하게 흡수되는 “천연” 표적화 과정을 활용한다는 것이 밝혀졌다(Williams 외, 2010). 중복되지 않는 형광단을 사용하여 mRNA 및 LNP 세포내 분포 및 세포소기관 축적 동역학을 독립적으로 추적할 수 있다.
mRNA 세포 발현 수준은 Trilink Biotechnologies에서 수득할 수 있는 EGFP, FLuc 또는 mCherry와 같은 리포터 시스템을 사용하여 정량화될 수 있다. 한 실시형태에서, EGFP mRNA는 LNP에 캡슐화되고 관심 세포에 0.1-100ug/mL mRNA로 첨가된다. 세포는 4-24시간 후에 배지를 교체하여 내재화되지 않은 LNP가 없도록 세척될 수 있다. 24시간에, GFP 신호는 형광 현미경 또는 유세포 분석으로 정량화된다. 이러한 방식으로 리포터 단백질 발현 수준에 따라 LNP 제형의 패널을 구별할 수 있다.
실시예 5. 형질감염 선택성 지수
형질감염 선택성 지수(Transfection Selectivity Index, TSI)는 포유동물 세포의 상대적인 형질감염 효율을 동일한 세포에서의 상대적인 독성과 비교하여 결정하기 위해 계산된다. 선택성 지수는 아래 식을 사용하여 계산되었다:
TSI = EF포유동물/ IC50,포유동물
여기서 EF포유동물은 백만개 세포 당 단백질의 ng으로 표현되는 형질감염 효율이고 IC50,포유동물은 절반 최대 억제 농도로서 동일한 제제의 세포 생존율과 관련된다.
본원에 기술된 화합물을 사용하는 LNP(1-36)는 ICL로서 대조군 분자 DLin-MC3-DMA로 만든 동일한 LNP를 사용하여 만든 LNP보다 TSI가 50% 더 높다.
실시예 6. 지질 과산화에 대한 분석.
산화 정도는 LNP 샘플을 25℃에서 3% H2O2로 처리하고 지질 산화 생성물에 대해 0일, 1일, 3일 및 5일차에 샘플링하는 강제 분해 분석을 사용하여 결정될 수 있다(Blessy 외, (2014) Journal of Pharmaceutical Analysis 4, 159-165). 산화 반응은 에탄올에 0.1M 부틸화 하이드록시톨루렌(BHT)을 첨가하여 퀀칭되고 측정할 때까지 -80°C에서 냉동 보관될 수 있다. 지질 산화 생성물은 지질 과산화의 최종 생성물인 말론디알데히드(MDA)를 검출하기 위한 2-티오바르비투르산(TBA) 반응성 분석(Gutteridge (1982) FEBS Letters 150, 454-458)을 사용하거나 증발 광 산란 검출(ELSD) 또는 하전 에어로졸 검출(CAD)을 이용한 HPLC 분석을 사용하여 검출하여 측정할 수 있다. 지질 산화 및 이성질체화 불순물 구조는 알려진 문헌 예시들에 기초하여 지정될 수 있으며 이성질체의 혼합물일 것으로 예상된다.
일반적으로, 아실 사슬에 다중 불포화를 갖는 지질이 산화에 더 민감하다는 것이 당업계에 공지되어 있다(Reis and Spickett (2012) Biochim Biophys Acta 1818, 2374-2387 참조).
본원에 기재된 화합물 1-36은 DLin-KC2-DMA 지질을 함유하는 대조군 LNP와 비교할 때 또는 DLin-MC3-DMA를 함유하는 대조군 LNP와 비교할 때 산화적 손상 또는 분해에 덜 민감할 것으로 예상된다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 화합물은 대조군 LNP와 비교할 때 산화 부산물의 감소가 30% 초과, 50% 초과, 75% 초과, 90% 초과 및 95% 초과이다.
실시예 7. 리간드-표적화 LNP 준비
항체 Fab' 단편 또는 단일 사슬 Fv 단편 형태의 관심 세포, 예를 들어, 면역 세포 내부로 LNP의 특이적 흡수를 제공하는 항체 리간드는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조되며(예를 들어, Drummond 외, 미국 특허 출원 20180271998; Zhou 외, 미국 특허 10,406,225; Marks 외, 미국 특허 8,974,792에 설명된 바와 같음), 이의 전문은 본 명세서에 참조로 포함된다). LNP에 대한 리간드의 접합을 제공하기 위해, 리간드는 CAA 또는 GGSGGC와 같은 시스테인 잔기를 갖는 C-말단 서열로 작제된다. 리간드는 박테리아 또는 진핵 세포에서 발현되며 단백질 친화성 크로마토그래피 또는 금속 킬레이트 크로마토그래피와 같은 표준 방법을 사용하여 세포 덩어리 또는 성장 배지에서 단리된다. 말단 시스테인 잔기의 티올 기를 활성화시키기 위해, 리간드는 140mm NaCl을 함유하는 pH 6.0-6.2의 10mM 시트레이트 완충액 중 15mM 시스테인의 존재하에서 1시간 동안 인큐베이션되고, 140mm NaCl을 함유하는 pH 6.0-6.2의 10mM 시트레이트 완충액인 용리액으로 SEPHADEX G-25 또는 유사한 컬럼 상에서 겔 크로마토그래피로 정제된다. 정제된 시스테인 활성화 리간드 용액의 단백질 농도는 280nm에서 UV 분광광도법을 사용하여 결정된다. 상기 명명된 완충액 중 1 내지 10 mg/ml의 항체 리간드를 말레이미드-종결 PEG-DSPE 유도체(mal-PEG(2000)-DSPE, 카탈로그 번호 880126, Avanti Polar Lipids, AL, USA, 또는 Sunbright ® DSPE-020MA, NOF corporation, 일본) 수용액과 4:1의 단백질/지질 몰비로 혼합한다. 분자량이 3,400 (Sunbright ® DSPE-034MA) 또는 5,000(NOF Corporation사로부터 수득가능(Sunbright ® DSPE-050MA))인 PEG 스페이서를 갖는 Mal-PEG-지질은 LNP 표면과 리간드 모이어티 사이의 거리가 더 먼 것이 바람직한 경우에 사용될 수 있다. 용액을 주위 온도에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 미반응 말레이미드 기를 차단하기 위해 0.5mM 시스테인으로 조정하고, 미셀 리간드-PEG-DSPE 접합체를 용리액 - pH 7.0-7.4의 10mM HEPES로 완충된 144mM NaCl으로 Ultrogel AcA 34(리간드가 Fab인 경우) 또는 Ultrogel AcA 44(리간드가 scFv인 경우)에서 겔 크로마토그래피에 의해 정제한다. 접합된 단백질은 UV 분광광도법으로 정량하고 SDS 겔 전기영동으로 순도를 확인한다.
리간드는 다음 방법 중 하나를 사용하여 LNP의 표면에 추가된다.
방법 1. 예비형성된 LNP(본원에 그 전문이 참조로 포함된 Hope 외, US 10,653,780에 기재된 바와 같이 수득됨)는 LNP 입자 당 5-100(전형적으로 15 -30)개 리간드 범위의 필요한 리간드/지질 비율에 도달하도록 HEPES-완충 식염수(10mM HEPES, 140mM NaCl, pH 7.0-7.2)에서 리간드-PEG-DSPE 접합체의 미셀 용액과 혼합된다. 혼합물을 37-40℃에서 2시간 동안 또는 2-8℃에서 밤새도록 천천히 교반하면서 인큐베이션하고, 이 시간 동안 접합체는 LNP의 외부 지질층에 포함된다. 리간드-접합된 LNP는 포함되지 않은 리간드-PEG-DSPE로부터 세파로스 CL-2B 또는 CL-4B(동일한 분자량 컷오프를 갖는 친수성 크기 배제 매질도 사용될 수 있음) 상의 겔 크로마토그래피에 의해 정제되며; 공극 부피 근방에서 보이는 LNP 부분들을 수집한다. 입자에 접합된 리간드의 양은 쿠마씨 블루 또는 형광 염색을 사용한 SDS 겔 전기영동 및 동시에 실행되는 리간드 표준에 의해 결정된다.
방법 2. LNP의 핵산 성분 또한 함유하는 pH 4.0의 10mM Na-시트레이트 완충액 중의 리간드-PEG-DSPE 접합체 용액을 Semple 외, 미국 특허 8,021,686(그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 LNP 지질의 에탄올 용액과 40 부피%의 최종 에탄올 농도까지 혼합하였다. 대안적으로, Hope 등의 미국 특허 10,653,780(그 전문이 본원에 참조로 포함됨)의 LNP 준비 프로토콜이 사용된다. 리간드-PEG-DSPE의 양은 지질의 0.1-1 mol%이다. 혼합물을 HEPES-완충 식염수(10mM HEPES, 140mM NaCl, pH 7.0)에 대해 투석하여 에탄올을 제거한다. 리간드-PEG-DSPE는 생성된 LNP에 통합된다. 잔여 리간드-PEG-DSPE는, 용리액 HEPES-완충 식염수, 세파로즈 CL-4B 또는 CL-2B를 사용하는 겔 크로마토그래피에 의해, 또는 500 KD 분자량 컷오프를 갖는 폴리설폰 막(평면 또는 중공 섬유 카트리지) 상에서 접선 유동 여과에 의한 HEPES-완충 식염수로의 완충액 교환에 의해 제거된다.
방법 3. Mal-PEG-DSPE는 방법 1의 리간드-PEG-DSPE와 동일한 방식으로 시트레이트 완충 식염수(10mM Na-시트레이트 완충액 pH 6.0-6.2, 140mM NaCl)에서 미리 형성된 LNP와 LNP 지질에 대해 0.1-1 mol%의 양으로 조합된다. mal-PE-DSPE가 포함된 LNP는 포함되지 않은 mal-PEG-DSPE로부터 동일한 완충액의 세파로즈 CL-4B 상의 겔 크로마토그래피에 의해 정제되고 티올-활성화 항체 리간드(LNP 입자 당 5-100개 리간드)와 함께 2-24시간 동안 인큐베이션된다. 이렇게 얻어진 리간드-접합된 LNP는 HEPES-완충 식염수 pH 7.0을 용리액으로 사용하는 세파로즈 CL-4B 겔 크로마토그래피에 의해 접합되지 않은 리간드로부터 정제된다.
방법 4. Mal-PEG-DSPE는 방법 2에 따라 리간드-PEG-DSPE와 동일한 방식으로 LNP 지질의 0.1-1 mol%로 LNP에 포함된다. 생성된 Mal-PEG-접합된 LNP는 티올-활성화된 리간드와 함께 인큐베이션되고 방법 3에 기재된 바와 같이 정제된다.
방법 5. 방법 4의 프로토콜이 수행되는데, 다른 점은 mal-PEG-DSPE 대신에 PEG 스페이서가 없는 말레이미드-접합 지질(mal-DSPE, Coatsome® FE-808MA3, NOF Corporation, 일본)을 지질 용액에 첨가하는 것이다. 생성된 말레이미드-LNP는 방법 3에 따라 티올 활성화 리간드에 접합된다.
방법 6. 저분자량 리간드(예를 들어, 만노스)는 방법 1 또는 2에 의해 LNP에 접합되는데, 여기서 만노스-PEG-DSPE(Biochempeg Scientific, MA, USA, 카탈로그 번호 12169)가 항체 리간드-PEG-DSPE를 치환한다.
실시예 8. 리간드 표적 LNP의 최적 리간드 밀도 결정
실시예 7의 방법들 중 하나를 사용하여 주어진 범위(LNP 입자당 2-200개 리간드, 또는 LNP 입자당 5-100개 리간드)에서 리간드 밀도를 증가시키면서 LNP 패널을 제조한다. LNP는 실시예 4에 기재된 바와 같이 형광 표지된 지질 또는 형광 표지된 핵산을 포함시켜 형광 표지된다. 표지된 리간드-접합된 LNP를 실시예 4에 따라 세포 흡수에 대해 테스트하고, LNP의 리간드-특이적 세포 흡수의 최대치에 상응하는 리간드 함량을 결정한다. 핵산 세포내 기능(예를 들어, mRNA 발현)이 분석 결과로 사용될 수 있으며(실시예 4), 이 경우 지질 또는 검출 가능한 핵산 표지가 필요하지 않다.
실시예 9. 지질 나노입자(LNP)의 준비.
5-메톡시우리딘(5moU)으로 변형되고 mCherry(카탈로그#L-7203)를 코딩하는 mRNA를 Trilink Biotechnologies(San Diego, CA)로부터 입수하였다. 모든 우리딘 뉴클레오시드는 N1-메틸-슈도우리딘으로 치환되었다. mRNA를 제조하기 위해, mRNA 서열을 인코딩하는 합성 유전자를 DNA 플라스미드에 클로닝했다. 합성 유전자는 RNA 프로모터, 5' 비번역 영역, mCherry 단백질 코딩 서열, 3' 비번역 영역 및 약 120A의 폴리(A) 테일 영역으로 구성되었다. TriLink(카탈로그#L-7203)의 mCherry mRNA에 대한 오픈 리딩 프레임 서열은 서열번호: 1에 해당한다.
AUGGUGAGCAAGGGCGAGGAGGACAACAUGGCCAUCAUCAAGGAGUUCAUGCGGUUCAAGGUGCACAUGGAGGGCAGCGUGAACGGCCACGAGUUCGAGAUCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGGCCCUACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCUGAAGGUGACCAAGGGCGGCCCCCUGCCCUUCGCCUGGGACAUCCUGAGCCCCCAGUUCAUGUACGGCAGCAAGGCCUACGUGAAGCACCCCGCCGACAUCCCCGACUACCUGAAGCUGAGCUUCCCCGAGGGCUUCAAGUGGGAGCGGGUGAUGAACUUCGAGGACGGCGGCGUGGUGACCGUGACCCAGGACAGCAGCCUGCAGGACGGCGAGUUCAUCUACAAGGUGAAGCUGCGGGGCACCAACUUCCCCAGCGACGGCCCCGUGAUGCAGAAGAAGACCAUGGGCUGGGAGGCCAGCAGCGAGCGGAUGUACCCCGAGGACGGCGCCCUGAAGGGCGAGAUCAAGCAGCGGCUGAAGCUGAAGGACGGCGGCCACUACGACGCCGAGGUGAAGACCACCUACAAGGCCAAGAAGCCCGUGCAGCUGCCCGGCGCCUACAACGUGAACAUCAAGCUGGACAUCACCAGCCACAACGAGGACUACACCAUCGUGGAGCAGUACGAGCGGGCCGAGGGCCGGCACAGCACCGGCGGCAUGGACGAGCUGUACAAGAGCGGCAACUGA
각각의 지질의 스톡 용액을 준비했다. 이온화 가능한 지질을 4mL 유리 바이알(Thermo B7999-2)에서 계량하고 최종 농도 10mM이 되도록 에탄올(Sigma-Aldrich 200 proof, RNase 없음)에 용해시켰다. DSPC, 콜레스테롤 및 PEG-DMG와 같은 다른 지질을 계량하고 에탄올에 1mM의 농도로 용해시켰다. DSPS는 1mM의 농도로 메탄올(Sulpelco, Omnisolve)에 용해되었고 잠시 70°C로 가열하여 용해를 완료하였다.
각각의 개별 LNP에 대한 지질 혼합물은 원하는 부피의 각 지질 스톡 용액을 새로운 바이알에 첨가하고, 필요에 따라 1.2mL의 최종 부피를 달성하도록 에탄올을 첨가하여 준비되었다. 예를 들어, N/P가 5인 AKG-UO-1/DSPC/DSPS/Chol/PEG-DMG(50/2.5/7.5/38.5/1.5 mol%)의 LNP 제형은 사용된 mRNA 100 μg당 1500 nmol AKG-UO-1, 75 nmol DSPC, 225 nmol DSPS, 1155 nmol Chol 및 45 nmol PEG-DMG를 함유했다.
동결된 mRNA(mCherry mRNA, Trilink) 바이알을 해동시키고 mRNA를 6.25mM 아세트산나트륨(pH 5.0)에서 최종 농도 0.033mg/mL로 희석하여 mRNA 용액을 준비했다.
LNP를 준비하기 위해, NanoAssemblr Benchtop 미세유체 장치(Precision Nanosystems)를 사용했다. LNP에 DSPS가 포함된 경우, 70°C로 설정된 가열 블록 액세서리를 사용하고 그렇지 않은 경우 LNP를 실온에서 혼합했다. mRNA 용액 3mL를 3mL 일회용 주사기(BD 309656)에 넣고 지질 혼합물 1ml를 1ml 주사기(BD309659)에 넣고 혼합하기 전에 4분 동안 NanoAssemblr 가열 블록에 두었다. LNP는 6 mL/분의 혼합 속도에서 3:1 수성:알코올 부피 비율로 액체 스트림을 일회용 마이크로유체 카세트를 통해 펌핑하여 형성되었다. 혼합 후, 3.6mL의 LNP 혼합물을 수집하고 초기 혼합 부피 0.35mL와 마지막 0.05mL의 혼합물을 버렸다. 에탄올은 PBS(Cytivia, SH30256.01)에서 SpectraPor 투석 튜브(12-14k MWCO)를 사용하여 완충액 교환에 의해 또는 Amicon Ultra-4 원심 농축기(10k MWCO, 500g)를 사용하여 순차적인 농축 및 희석에 의해 제거되었다.
LNP는 일반적으로 pH 7.4의 PBS로 교환된 다음 15mM Tris, pH 7.4, 20% 수크로스로 교환되고, 20-50ug/mL mRNA로 농축되고, 멸균 여과(Thermo Nalgene 0.2um #720-1320)한 후 액체 질소에 5분 동안 담가 동결시키고 -20°C에서 장기간 보관했다.
실시예 10. LNP 특성화
A. 형광 결합 염료에 의한 mRNA 농도 및 상대적 캡슐화 효율 결정
재료: Ribogreen 시약(Thermo #11491), 뚜껑이 있는 3 x 96웰 플레이트, PBS, 해리 완충액(10% DMSO 및 1%(wt/wt) 쯔비터젠트 3-14(Sigma-Aldrich #693017)가 포함된 PBS, mRNA, 일반 피펫 팁 및 반복 피펫 팁.
1. 5mL의 2μg/mL mRNA 스톡을 DPBS 또는 PBS에서 준비했다.
2. 희석된 표준은 96-웰 플레이트(플레이트 A)의 하나의 웰에서 다음과 같이 준비되었다.
3. 플레이트 A의 다른 웰을 사용하여 샘플을 표준 곡선 내부에 존재하도록 희석했으며, 샘플 당 하나의 웰이 필요할 것이다. 예를 들어, 대략적인 mRNA 농도가 샘플에서 ~ 30ug/mL이어야 하는 경우, 20X 희석을 수행했다(희석 계수). (웰의 380 μL PBS에 20 uL 샘플 추가). 플레이트 A에는 뚜껑을 사용하지 않았다. 샘플을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 샘플을 혼합했다.
플레이트 A의 실시예
4. 2개의 추가 플레이트인, 플레이트 B 및 C를 사용하였다. 다중 채널 피펫터를 사용하여, 60μL의 각 표준을 2번 각 웰에 피펫팅하고(중복) 샘플들을 각각 3개 웰에 피펫팅하였다(삼중)
플레이트 B 및 C의 예
5. 각 플레이트에 사용된 웰의 수를 세고 이 수에 4를 더했다. 플레이트 B의 경우, Ribogreen을 1:100으로 희석시켜 PBS를 준비했다. 예를 들어, 40웰의 경우 44를 상기 수치로 사용했다. 44 X 60 μL = 2.64 mL Ribogreen 용액이 필요하므로, 26.4 μL Ribogreen을 사용하여 PBS는 2.61 mL가 된다.
6. 플레이트 C의 경우, 2.61mL 해리 완충액 및 26.4uL Ribogreen을 피펫팅했다.
7. 60μL로 설정된 리피터 피펫(repeater pipette)을 사용하여 PBS+RiboGreen을 플레이트 B의 각 웰에 추가하고 60μL 해리 완충액+Ribogreen을 플레이트 C에 추가했다. 두 플레이트 B와 C를 오비탈 믹서(120rpm)에서 1분 동안 혼합했다. 플레이트 B를 15분 동안 암실에 두었다. 플레이트 C를 37°C의 암실에서 10분 동안 인큐베이션한 후 RT에서 5분 동안 인큐베이션했다.
8. 여기 465, 방출 530nm을 사용하여 두 플레이트를 차례로 판독하였다.
9. 표준 곡선을 사용하여, 기울기와 절편을 계산하고 외삽을 통해 플레이트 B 및 C 샘플들의 mRNA 농도를 계산했다(평균 및 표준 편차).
10. [mRNA] 플레이트 B/ [mRNA] 플레이트 CX 100에 의한 캡슐화 효율 퍼센트(% EE)를 계산했다.
11. [mRNA] 플레이트 C X 희석배수를 취하여 총 [mRNA]를 계산하였다.
B. LNP 입자 크기
1. LNP 30μL를 폴리스티렌 큐벳(Sarstedt, #67.754)에서 1.5mL PBS와 혼합하고 ZS Xplorer 소프트웨어(버전 번호 1.4.0.105)를 사용하는 ZetaSizer Pro(Malvern)를 사용하여 크기를 분석했다. Z-평균 크기 및 다분산 지수 값을 기록했다. 전형적으로, LNP의 크기를 LNP 혼합 후, 완충액 교환 후 그리고 멸균 여과 후 측정하였다.
C. LNP 제타 전위
1. 30μL의 LNP를 1.5mL PBS와 혼합하고 일회용의 폴딩된 모세관 셀(Malvern Nanoseries DTS1070)에 주입하고 ZetaSizer Pro에서 25°C에서 제타 전위를 측정했다.
실시예 11. mCherry mRNA를 사용하여 LNP의 뮤린 수지상 세포에서 형질감염 효율의 측정.
A. 세포 증식, 형질감염, 수확 및 염색 프로토콜
1. MutuDC1940 세포(ABM)를 공급업체의 지시에 따라 T75 플라스크에서 성장시켰다. 필요한 경우, 이 세포들을 형질감염 하루 전에 24-웰 플레이트에 180,000개의 세포/웰로 플레이팅하였다.
2. LNP를 1 mL 배지에 1 μg/mL로 각 웰에 3회 반복 첨가하고 24시간 후 세포를 DPBS(VWR 02-0119-1000)로 1회 세척했다.
3. 분리를 용이하게 하기 위해 0.2 mL의 DPBS(+ 5 mM EDTA, pH 7.4)를 첨가하였다.
4. 세포들을 분리될 때까지 3분 동안 37℃에 두었다.
5. 0.5ml DPBS를 각 웰에 첨가하고 액체를 유동 세포 측정 튜브(Falcon 5mL #352054)로 옮겼다.
6. 튜브를 1100rpm에서 3-5분 동안 원심분리하고 액체를 따라 냈다.
7. Zombie Violet 100μL(Biolegend)(PBS에 1:500으로 희석)를 각 튜브에 첨가했다.
8. 튜브를 부드럽게 두드려 세포를 재현탁시키고 RT에서 15분 동안 암실에 두었다.
9. 세포에 0.5 mL(PBS:DPBS 1:1중 파라포름알데히드 4%)를 첨가하고 세포를 부드럽게 흔들어 재현탁시키고 얼음에 30분 동안 두었다. 또 다른 2ml PBS가 추가되었다.
10. 세포들을 상기와 같이 펠릿화하고 5% BSA를 함유하는 0.5 mL DPBS에 재현탁시키고 필요할 때까지 냉장고에 두었다.
B. 세포 분석
1. 세포 현탁액은 생존/사멸 신호 및 mCherry 형광 신호에 대해 각각 VL1 및 YL2를 사용하는 Attune NxT 유동 세포 분석기로 분석했다. 게이팅 분석은 FloJo 소프트웨어에서 수행되었다.
실시예 12. 이온화 가능한 양이온성 지질로서 KC2를 갖는 LNP를 사용하는 수지상 세포의 형질감염 효율에 대한 DSPS의 영향.
이 연구의 목적은 뮤린 수지상 세포에서 형질감염 효율에 대한 DSPS를 사용한 포스파티딜세린 표적화의 효과를 탐구하는 것이었다. 실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하고, 실시예 10에 기재된 바와 같이 입자 크기 및 제타 전위를 특성화하고, 실시예 11에 기재된 바와 같이 뮤린 수지상 세포에서의 형질감염 효율에 대해 평가하였다. LNP는 모두 총 지질의 5 및 50mol%의 N/P 비율의 DLin-KC2-DMA 상수를 갖고, PS 지질은 초기에 0 - 2.5mol%로 다양하고 DSPC 인지질은 0 - 7.5mol%로 다양하며(DSPC 및 DSPS의 총 mol%는 10mol%로 일정함), 콜레스테롤 상수는 38.5mol%(총 지질의 모든 mol%)이다. 모든 제형에 대한 입자 크기, 다분산도 지수(PDI) 및 포획 효율은 아래 표 5 및 6에 제시되어 있다.
표 5. 실시예 12에서 사용된 KC2-함유 LNP의 물리화학적 특성은 실시예 12 및 도 3A에서 사용된 0-2.5 mol%로 다양하다.
표 6. 실시예 12 및 도 3B, 도 3C, 및 도 3D에서 사용된 0-7.5mol%로 변화하는 KC2-함유 LNP의 물리화학적 특성.
DLin-KC2-DMA 및 0-2.5mol% DSPS 형태의 다양한 포스파티딜세린을 함유하는 LNP의 초기 세트는 0 또는 0.5mol% DSPS에서 거의 형질감염을 나타내지 않았지만, DSPS는 2.5mol%로 포함되었을 때 18배 증가하였다(도 3A). 0-7.5mol%의 DSPS로 제조된 LNP의 두 번째 시리즈는 0.1, 0.3 및 1μg/mL mRNA 농도에서 평가되었다(도 3B, 도 3C 및 도 3D). 형질감염 효율은 DSPS의 mol%가 2.5mol% 이상 증가함에 따라 증가했으며, 최대값은 1μg/mL mRNA에서 7.5mol%, 0.1 및 0.3μg/mL mRNA 모두에서 5mol%였다. 이들 데이터는 포스파티딜-L-세린의 포함이 mRNA-함유 LNP의 형질감염 효율을 극적으로 증가시킬 수 있고, 최대 흡수가 DSPS의 5-7.5mol%(총 지질의 %로서)에서 발생한다는 것을 입증한다.
실시예 13. 수지상 세포의 mRNA 형질감염에 대한 ICL 및 음이온성 인지질 표적화 리간드의 영향.
이 연구의 목적은 다른 음이온성 인지질이 LNP의 형질감염 효율을 향상시킬 수 있는지, 다양한 ICL 및 PS 표적화로 준비된 LNP가 수지상 세포를 형질감염시키는 방법을 확인하는 것이었다. 실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하고, 실시예 10에 기재된 바와 같이 입자 크기 및 제타 전위를 특성화하고, 실시예 11에 기재된 바와 같이 뮤린 수지상 세포에서의 형질감염 효율에 대해 평가하였다. LNP는 다양한 ICL(DLin-KC2-DMA, KC2-OA, KC3-OA 또는 SM-102)이 N/P 비율이 총 지질의 5 및 50mol%로 일정하고, PS 지질은 5mol%로, DSPC는 5mol%로 일정하게 유지되고, 콜레스테롤은 38.5mol%(총 지질의 모든 mol%)로 일정하게 유지되었다. 모든 제형에 대한 입자 크기, PDI 및 포획 효율은 아래 표 7에 제시되어 있다.
표 7. 사용되는 ICL를 변화시키면서 그리고 5 mol%에서 음이온성 인지질을 갖는 LNP의 물리화학적 특성.
형질감염 결과는 도 4에 도시되어 있으며, 도 4는 3개의 상이한 KC-시리즈 ICL(KC2, KC2-OA 및 KC3-OA) 그리고 또한 분지형 ICL인, SM-102와 함께 제조된 LNP에서 높은 형질감염률을 보여준다. 다른 음이온성 인지질(Suc-DSPE 또는 Glu-DSPE)과 함께 제조된 제형들을 비롯하여, 모든 제형에 대해 캡슐화 효율이 높았고 입자 크기가 100nm 미만이었다. 데이터는 DSPS(L-세린)는 N-글루타릴-디스테아로일포스파티딜에탄올아민(Glu-DSPE) 또는 N-숙시닐-디스테아로일포스파티딜에탄올아민(Suc-DSPE)으로 치환될 수 없고 그리고 두 가지 인지질 모두 또한 2개의 음전하를 함유하고 두 가지 모두 동일한 디스테아로일(C18:0) 완전 포화 아실 사슬을 함유함에도 불구하고 동일한 높은 수준의 mRNA 형질감염을 제공함을 입증한다. 이러한 연구는 또한 DSPS의 추가가, 단일 불포화 아실 증가(KC2-OA 또는 KC3-OA)을 포함하는 것들 그리고 SM-102와 같은 분지형 ICL을 포함하는 것들을 비롯하여, 다른 이온화 가능한 양이온성 지질에 대해 높은 형질감염 효율을 유발할 수 있음을 분명히 보여준다. 예를 들어, SM-102 함유 LNP에 DSPS를 추가하면 mCherry 발현이 22배 증가한다.
실시예 14. ICL 및 PS 구조에 대한 PS 표적화의 의존성.
이 연구의 목적은 다양한 아실 사슬 조성의 KC2 및 KC3 시리즈 이온화 가능한 양이온성 지질과 PS-표적화된 LNP를 비교하는 것이었다. 디메틸아미노에틸 헤드 기 구조의 구조를 갖는 KC2 시리즈 지질을 디메틸아미노프로필-유도체화된 헤드 기를 포함하는 KC3 시리즈와 비교하였다. LNP는 ICL로서 다양한 ICL(KC2, KC2-01, KC2-OA, KC2-PA, KC3-OA 및 KC3-01)을 5 및 50mol% ICL의 N/P 비율 및 일정한 1.5mol% PEG-DMG로 함유하였다. 콜레스테롤 함량은 38.5mol%로 일정하게 유지되었고 DSPC 함량은 0 또는 5mol%의 DSPS의 mol%에 따라 역으로 변화하였다(모든 지질 농도는 총 지질의 mol%로 사용되었다). 실시예 11에 기술된 바와 같이 뮤린 수지상 세포에서 형질감염 효율을 평가하였다.
표 8. 다양한 ICL을 사용하고 5 mol%의 음이온성 인지질을 보유한 LNP의 물리화학적 특성.
형질감염 결과를 도 5에 나타내며 도 5는 여러 KC 시리즈의 ICL에 대한 PS 표적화의 긍정적인 영향을 명확하게 보여준다. 여기서 우리는 불포화 C16 및 C18 ICL을 모두 포함하는 ICL이 포스파티딜-L-세린으로 표적화될 수 있고 수지상 세포에 대한 높은 형질감염률을 생성할 수 있음을 보여준다. PS와 PC가 미스매치된 아실 사슬 조성을 포함하고 5 mol% DPPC 및 5 mol% DSPS를 가지며 C16 ICL(KC2-PA)과 조합될 때 가장 높은 형질감염률이 나타났다.
실시예 15. LNP의 형질감염 효율에 대한 포스파티딜세린 구조의 영향
이 연구의 목적은 수지상 세포에서 형질감염 효율에 대한 다양한 음이온성 인지질 구조의 효과를 탐구하는 것이었다. 실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하고, 실시예 10에 기재된 바와 같이 입자 크기 및 제타 전위를 특성화하고, 실시예 11에 기재된 바와 같이 뮤린 수지상 세포에서의 형질감염 효율에 대해 평가하였다. LNP는 모두 총 지질의 5 및 50mol%의 N/P 비율에서 일정한 AKG-UO-1을 가졌으며, 음이온성 지질은 제형에 따라 DSPC 인지질과 역으로 변화하엿으며, 20mol% DSPS LNP를 제외하고는 38.5mol%로 일정한 콜레스테롤을 갖는다(모두 총 지질 중의 mol%). 최대 10%의 포스파티딜세린 성분을 함유하는 샘플의 경우, 포스파티딜콜린 조성은 그에 따라 10mol%로부터 감소했다. 예를 들어, 5mol% DSPS를 포함하는 LNP는 5mol% DSPS 및 5mol% DSPC를 포함하고 10mol% DSPS를 포함하는 LNP에는 DSPC가 없었다. 그러나, 20mol% DSPS를 함유한 샘플의 경우, 제형에 DSPC가 없었고 mol% 콜레스테롤은 28.5mol%로 10mol% 만큼 감소하였다.
모든 제형에서 포획 효율은 84 내지 90%였으며, 이는 LNP에서 높은 효율의 mRNA 포획을 나타낸다.
표 9. AKG-UO-1을 ICL로 사용하고 다양한 음이온성 인지질로 제조한 LNP의 물리화학적 특성 및 캡슐화.
상이한 포스파티딜세린 화학적 형태의 효과를 도 6A에서 평가하였으며, 이는 뮤린 수지상 세포에서 LNP 형질감염 활성에 대한 포화, 아실 사슬 길이 및 세린 입체화학의 중요성을 보여준다. 올레산 아실 사슬을 갖는 또는 입체화학이 L-세린이 아닌 (D-세린)과 같은 PS 유사체(DOPS)는 어떠한 포스파티딜세린도 없이 제조된 LNP와 유사한 형질감염 활성을 갖는 LNP를 발생시킨다. 그러나 세린의 L-이성질체와 포화 아실 사슬을 포함하는 PS로 제조된 LNP는 PS가 없는 LNP에 비해 수지상 세포를 형질감염시킴에 있어 훨씬 더 우수하다. 포화 시리즈 중에서 C16(DPPS) 또는 C18(DSPS)을 가진 세포는 가장 높은 활성을 보인 반면, C14(DMPS)를 가진 세포는, PS가 없는 LNP로 처리된 수지상 세포에 비해 활성이 여전히 개선되었지만 낮았다. 도 6B에서 다른 음이온성 인지질의 영향은 배경과 유사한 활성을 보여주는 DSPG-함유 제형들(5 또는 7.5mol%) 및 N-글루타릴- 또는 N-숙시닐-디스테아로일포스파티딜에탄올아민(Glu-DSPE 또는 Suc-DSPE)으로 평가되었으며, 이러한 AKG-UO1 함유 LNP들에 포함될 때 활성은 보다 온건하게 3-5배 향상되었다. 이 실시예는 포화 포스파티딜-L-세린과 함께 LNP가 불포화 디올레오일포스파티딜-L-세린(DOPS) 또는 DSPS의 D-이성질체를 함유하는 것보다 훨씬 더 우수하게 수지상 세포를 형질감염시킨다는 것을 보여준다. DSPS 및 DPPS의 L-이성질체를 포함하는 LNP는 5 또는 7.5mol%의, 다른 형태의 PS, 음이온성 N-글루타릴 또는 N-숙시닐 DSPE 유사체 또는 디스테아로일포스파티디글리세롤(DSPG)에 비해 가장 높은 수준의 형질감염을 나타냈다.
실시예 16. LNP를 함유하는 AKG-UO-1에서 DSPS 밀도 최적화
이 연구의 목적은 DSPS 밀도가 LNP의 형질감염 효율에 미치는 영향을 조사하는 것이었다. 실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하였다. LNP는 0 내지 20mol% DSPS 및 일정한 1.5mol% PEG-DMG와 함께 ICL로서 5의 N/P 비율의 AKG-UO-1을 함유하였다. 콜레스테롤 함량은 38.5mol%로 일정하게 유지되었고 DSPC 함량은 0-10 mol% 사이의 DSPS의 mol%에 따라 역으로 변화하였다(모든 지질 농도는 총 지질의 mol%로 사용되었다). 20 mol% DSPS 제형에서는 DSPC가 없었고 콜레스테롤 함량은 (38.5로부터 28.5 mol%로) 총 10 mol% 감소하였다. 실시예 11에 기술된 바와 같이 뮤린 수지상 세포에서 형질감염 효율을 평가하였다.
표 10. AKG-UO-1을 ICL로 사용하고 다양한 음이온성 인지질로 제조한 LNP의 물리화학적 특성 및 캡슐화.
AKG-UO1 함유 LNP에 있어 DSPS 농도에 대한 LNP 조성의 의존성을 도 7에 나타낸다. 이 연구는 AKG-UO-1 함유 LNP에서 제형 내 DSPS의 존재가 2.5 내지 10mol% DSPS의 높은 수준의 수지상 세포 형질감염 및 약 5-7.5mol% DSPS의 겉보기 피크를 가능하게 함을 시사한다.
실시예 17. AKG-UO-1 함유 LNP의 형질감염 효율에 대한 PEG의 영향.
이 연구의 목적은 비표적화된 그리고 포스파티딜-L-세린 표적화된 LNP의 형질감염 효율에 대한 PEG-지질 밀도의 영향을 조사하는 것이었다. 실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하였다. LNP는 0 또는 5mol% DSPS 및 0.5-4.5 mol% PEG-DMG와 함께 ICL로서 5의 N/P 비율의 AKG-UO-1을 함유하였다. 콜레스테롤 함량은 38.5mol%로 일정하게 유지되었고 DSPC 함량은 DSPS가 없는 제형의 경우 10mol%, 5mol% DSPS가 있는 제형의 경우 5mol%였다. 1.5 mol% 이상의 PEG-DMG 함량에서, 총 콜레스테롤 함량을 추가된 PEG-DMG의 양만큼 감소시켰는데, 예를 들면, PEG-DMG 함량이 3.5 mol%인 경우, 콜레스테롤 함량을 38.5 mol%에서 36.5 mol%로 감소시켰다. 0.5% PEG-DMG를 포함하는 입자는 pH 7.4에서 음의 제타 전위를, 그리고 pH 5에서 양의 제타 전위로 상당한 이동을 나타냈다. 1.5-3.5mol% PEG-DMG를 포함하는 LNP는 pH 7에서 본질적으로 중성이었다.
표 11. 실시예 17에서 사용되고 AKG-UO-1, 0 또는 5mol%의 DSPS를 함유하는 LNP의 물리화학적 특성
AKG-UO-1 ICL을 포함하는 DSPS-표적화된 LNP에 의한 수지상 세포의 형질감염에 대한 PEG-DMG의 영향을 도 8에 나타낸다. 0.5% PEG-DMG를 포함하는 제형은 5% DSPS의 존재시 1.5-2.5% PEG-DMG에서 관찰된 것보다 6-7배 더 높은 형질감염 효율을 나타냈다. 1.5 및 2.5% PEG-DMG에서의 형질감염은 유사했지만, 3.5 및 4.5mol% PEG-DMG에서는 두드러지게 감소하였다. 각각의 PEG 밀도에서 표적화 대 비표적화 형질감염의 비율은 다양했고, 0.5% PEG에서 12배, 1.5% PEG에서 7배, 2.5% PEG에서 37배, 3.5 및 4.5% PEG에서 5배 미만이었는데, 이는 아마도 PS 표적화 모이어티의 높은 PEG-차폐 때문일 것이다. 이러한 데이터의 조합은 PEG-밀도의 최적 범위가 0.5-2.5% PEG-DMG이며 전체 형질감염 효율에 있어서 해당 범위의 하한이 최적인 반면, 표적 특이성에 있어서는 2.5%가 최적임을 보여준다.
실시예 18. ICL의 산화 안정성
이 연구의 목적은 접합된 올레핀이 있는 양이온성 지질(예: KC2, KC3 및 O-11769)과 가속화된 산화하에 있는 접합된 올레핀이 있는 양이온성 지질(예: KC2-01, KC3-01 및 UO-1)의 안정성을 비교하는 것이다.
개별 지질 스톡(10mM)을 에탄올에서 준비하고 -20oC에서 보관했다. 실험에 앞서, 에탄올(Sigma-Aldrich, 카탈로그# 459836)에 45μl의 10mM 지질 스톡을 초순수(Rx Biosciences, 카탈로그# P01-UPW02-1000) 45μl와 혼합하여 5mM 현탁액(KC2, KC2-01, KC3, KC3-01, O-11769 및 UO-1)을 준비했다. AKG-UO-1 및 O-11769 이온화 가능한 양이온성 지질에 기초한 리포좀 제형(표 12)은 NanoAssemblr(Precision Nanosystems) 상에서 6 mL/분으로 1mL 에탄올 중 원하는 조성의 지질 혼합물을 pH 5.0의 3mL 6.25mM 아세트산나트륨과 조합함으로써 제조되었다. 3.6mL의 혼합물을 유지하고 초기 0.35mL 및 최종 0.05mL의 혼합물을 버렸다. 에탄올은 4℃에서 10분 동안 500g에서 Aminon-Ultra 4 원심 농축기를 사용하여 각각의 리포솜 제제들을 농축하고 PBS로 원래 부피로 다시 희석함으로써 pH 7.4의 PBS로 완충액 교환하여 제거되었다. 에탄올 농도가 1% 미만이 될 때까지 이 주기를 여러 번 반복했다. 마지막으로, 리포솜을 0.2μm PES(Nalgene) 주사기 필터를 통해 멸균 여과하고 ZetaSizer(Malvern)로 크기를 측정했다. AKG-UO-1 함유 제형(Lot#102021-6)은 평균 크기가 81.8 nm이고 PDI가 0.09인 반면, O-11769 함유 제형은 평균 크기가 86.6 nm이고 PDI가 0.10이었다.
표 12. 가속화 산화 연구에 사용된 LNP 제형.
리포좀 제형의 분취물들을 -80oC 에서 보관하고 실험 전에 해동시켰다. 물에서 조합된, 10% H202(Sigma-Aldrich, cat# H1009) 및 1mM Fe(III)Cl(Sigma-Aldrich, cat# 372870)의 스톡을 처리 전에 새로 준비했다. H202 및 100μM Fe(III)Cl의 1% 최종 농도를 만들기 위해, 10% H202/1mM Fe(III)Cl 스톡 10μl를 90μl의 리포좀 제형 및 개별 지질에 첨가했다. 리포좀과 개별 지질들을 37oC에서 H202/Fe(III)Cl과 함께 인큐베이션한 다음 각 샘플 5μl를 상이한 시점들(0, 3, 24, 48 및 72시간)에서 취하고 HPLC 분석을 위해 90μl의 MeOH에 용해시켰다. 주요 지질 피크의 분해는 하전 에어로졸 검출기(Charged Aerosol Detector, CAD) 및 Thermo Scientific Accucore™ C18+ UHPLC 컬럼(L= 50mm, D= 2.1mm, 입자 크기 = 1.5μm)이 장착된 Thermo Scientific Vanquish Flex UHPLC 을 사용하여 분석했다. UHPLC 가동 조건은 표 13에 나열되어 있다.
표 13. 크로마토그래피 조건
데이터는 시간 0에서 측정된 지질 피크에 대한, 서로 다른 시점에서 측정된 주요 지질 피크의 백분율로 표시된다.
표 14. 하나(KC2, KC3 또는 O-11769) 또는 그 이상(KC2-01, KC3-01, UO-1, UO-6 및 UO-7)의 메틸렌에 의해 분리된 두 개의 올레핀이 있는 ICL의 분해.
도 9A 및 도 9B에서 보는 바와 같이, 2개의 올레핀 사이에 4개의 메틸렌을 갖는 올레핀(KC2-01, KC3-01 및 UO-1)을 갖는 모든 ICL은 2개의 올레핀을 분리하는 단일 메틸렌을 갖는 대응물(각각 KC2, KC3 및 O-11769)과 비교하여 과산화수소를 사용한 가속화된 산화 하에서 극적으로 우수한 안정성을 나타낸다. 과산화수소로 72시간 처리한 후에도 KC2-01, KC3-01 및 UO-1의 주요 피크는 처리 시작시에 비해 70% 이상 유지되는 반면, KC2, KC3 및 O-11769는 과산화수소로 48시간 인큐베이션 후 완전히 분해된다. 2개의 다른 다중불포화 ICL(UO-6 및 UO-7)은 유사하게 산화에 대해 양호한 안정성을 나타내었지만, 헤드 기에 하이드록시에틸 치환기를 갖는 UO-7은 디메틸아미노 ICL보다 더 빠르게 분해되었다(표 14).
하나 이상의 메틸렌에 의해 분리된 올레핀이 있는 ICL의 안정성을, 구조적으로 관련된 UO-1 및 O-11769 ICL을 사용하여 mRNA가 없는 리포솜 제형의 일부로서 연구하였다. 다른 이온화 가능한 양이온성 지질(KC2, KC2-01, KC3 및 KC3-01)은 크로마토그래피 피크가 DSPC 피크와 겹치고 이는 데이터 해석을 손상시키기 때문에 이 연구에서 제외되었다. UO-1 및 O-11769 기반 리포좀 제형의 안정성 데이터는 도 9A에 도시되어 있다. 리포좀에 제형화된 UO-1은 1% 과산화수소 존재 하에 72시간 인큐베이션 후 주요 UO-1 피크의 73 ± 0.05%를 가진다. 대조적으로, O-11769 기반 리포좀은 처리 72시간 후 O-11769 피크의 3.9 ± 0.06%만을 나타낸다.
이 데이터 전체는 실시예 14 및 20 또는 그 올레핀들 사이에 1개 초과의 메틸렌이 있는 ICL에서 입증된 개선된 형질감염 효율 이외에도, 이들 지질이 산화 분해에 대해 상당히 개선된 안정성을 나타낸다는 것을 시사한다.
실시예 19. mCherry mRNA 함유 LNP의 형질감염 효율에 대한 N/P 비율의 영향.
이 연구의 목적은 수지상 세포에서 형질감염 효율에 대한 다양한 N/P 비율의 효과를 탐구하는 것이었다. 실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하고, 실시예 10에 기재된 바와 같이 입자 크기 및 제타 전위를 특성화하고, 실시예 11에 기재된 바와 같이 뮤린 수지상 세포에서의 형질감염 효율에 대해 평가하였다. LNP는 모두 ICL로 KC2-01을 사용했지만 양이온성 지질-대-mRNA 인산염(N/P) 비율을 4-7로 변화시켰고 PS 지질은 5mol%로 일정했고 DSPC 인지질은 5mol%로 일정했으며 콜레스테롤은 38.5mol%로 일정했다. 모든 제형에서 포획 효율은 84 내지 90%였으며, 이는 LNP에서 높은 효율의 mRNA 포획을 나타낸다. 실시예 11에 기술된 바와 같이 뮤린 수지상 세포에서 형질감염 효율을 평가하였다.
표 15. 실시예 19에서 사용된 LNP의 물리화학적 특성
DSPS-표적화된 및 비표적화된 KC-01 LNP 제형 모두에 대한 형질감염 활성을 1 ug/ml(도 10A) 및 0.33 ug/ml(도 10B) 모두에서 평가하였다. 이 데이터는 광범위한 N/P 비율에 걸쳐 LNP를 함유하는 KC2-01에 대한 높은 DSPS-매개 형질감염 효율을 나타내며, 최대 형질감염 효율은 N/P 7에서 관찰되었다.
실시예 20. 이온화 가능한 지질 구조가 LNP를 포함하는 형질감염 효율에 미치는 영향.
이 연구의 목적은 수지상 세포에서 형질감염 효율에 대한 다양한 ICL의 효과를 탐구하는 것이었다. 실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하고, 실시예 10에 기재된 바와 같이 입자 크기 및 제타 전위를 특성화하고, 실시예 11에 기재된 바와 같이 뮤린 수지상 세포에서의 형질감염 효율에 대해 평가하였다. LNP는, N/P 비율이 5로 일정하고 PS 지질이 0 또는 7.5 mol%이고 DSPC 인지질 이 10 또는 2.5 mol%로 일정하고(DSPC 및 DSPC의 총합이 10 mol%임), 콜레스테롤이 38.5 mol%로 일정한 ICL에서 표 16의 이온화 가능한 지질을 사용했다.
표 16. 실시예 20에서 사용된 LNP의 물리화학적 특성.
형질감염 활성에 대한 표적화 및 ICL 선택의 효과는 비표적화된 그리고 7.5mol% DSPS-표적화된 LNP 모두를 사용하여 평가하였다(도 11). 이 연구에 사용된 모든 ICL은 아실 사슬의 불포화 정도와 위치 또는 사용된 특정 이온화 가능한 아민이 변화하는 관련 디아실 구조를 가지고 있었으므로 겉보기 pKa이다. 이 데이터는 2개의 올레핀이 4개의 메틸렌(C18 총 길이)에 의해 분리되어 있는 AKG-UO1 지질이 LNP에 통합되었을 때 가장 높은 활성을 나타냄을 보여준다. O-11769 지질(디리놀레산)은 LNP를 함유하는 AKG-UO-1의 대략 절반인 활성을 나타냈고, 후자는 C16 아실 사슬을 갖는 AKG-UO4 지질 및 동일한 헤드 기를 갖지만 두 아실 사슬 모두에서 올레산(단일 올레핀)을 갖는 ICL(AKG-OA-DM2)과 유사한 활성을 갖는다. 그러나 활성의 가장 큰 감소는 AKG-UO-1의 디메틸 아민 치환기를 UO-1A의 디에틸아미노로 변경하거나 두 에스테르와 디메틸아미노 그룹(DODAP) 사이의 메틸렌 수를 줄이는 데서 발생했다. 이 두 가지 변화는 형질감염 활성을 크게 감소시켰고, 후자는 DSPS 표적화가 있는 경우에도 마찬가지였다.
이 시리즈 중에서, 7.5 mol% DSPS를 포함하는 LNP는 DSPS를 포함하지 않았던 LNP보다 동결-해동 과정을 거친 후 입자 크기의 불리한 변화에 덜 민감하다는 점도 주목할 가치가 있다. 평균적으로 DSPS를 포함하지 않았던 LNP는 직경이 28.4nm로 변경된 반면 DSPS를 포함하는 LNP는 3.9nm로 변경되었다. 저장 안정성은 mRNA 백신의 주요 관심사이기 때문에 DSPS의 추가는 이러한 LNP에 중요한 안정화 효과를 제공한다.
실시예 21. MutuDC1940 수지상 세포주에서 LNP 입자 형성 및 활성에 대한 10 및 25mol% DOPS 첨가 효과 측정.
이 연구의 목적은 mRNA LNP 제형에 DOPS를 이전에 문헌(Gaitonde 외, (2011) Clin Immunol 138, 135-145; Rodriquez-Fernandez (2018) Front Immunol 9, 253)에 나타난 mol% 이하의 조성으로 포함시켜 리포좀의 수지상 세포로의 흡수를 향상시키는 영향을 조사하는 것이었다. 25°C에서 실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하고 실시예 10에서와 같이 분석하였다. LNP는 0, 10 및 25mol% DOPS 및 일정한 1.5mol% PEG-DMG와 함께 ICL로서 5의 N/P 비율의 KC2를 함유하였다. 콜레스테롤 함량은 0% 및 10% DOPS 제형에서 38.5 mol%로 일정하게 유지되었고 DSPC 함량은 0-10 mol% 사이에서 DOPS의 mol%에 따라 역으로 변화하였다(모든 지질 농도는 총 지질의 mol%로서 사용됨). 25 mol% DOPS 제형에서는 DSPC가 없었고 콜레스테롤 함량은 총 15 mol% 감소하였다(38.5로부터 23.5 mol%로). 실시예 11에 기술된 바와 같이 뮤린 수지상 세포에서 형질감염 효율을 평가하였다.
표 17. DOPS 함유 LNP 제형의 물리화학적 특성
수지상 세포에 대한 LNP의 표적화에 대한 10-25 mol% DOPS의 영향을 도 12에서 평가하였다. 이 연구는 KC2 기반 LNP 제형에 10 mol% DOPS를 포함시키는 것이 MutuDC1940 세포의 mCherry 발현 수준에 긍정적인 영향을 줌과 동시에 입자 크기 또는 mRNA의 캡슐화에 부정적인 영향을 미치지 않음을 보여준다. 그러나, DOPS 함량이 25mol%로 증가했을 때 mCherry의 발현은 DOPS가 없는 제형보다 낮았고 PDI의 증가에 의해 입증된 바와 같이 크기 분포는 넓어졌으며 > 400nm의 입자를 포함하는 분포를 유발하였다. 종합하면, 25mol%는 문헌에서 수지상 세포로의 리포좀 흡수를 향상시키는 것으로 나타났을 수 있으나, mRNA를 갖는 LNP 제형에서는 입자 크기 및 형질감염 활성 모두에 해로운 영향을 미쳤다. 중요한 것은 본원과 문헌에 사용된 DOPS에 불포화 아실 사슬(이 경우에는 올레산)이 포함되어 있다는 것이다. 이것은 포스파티딜세린 아실 사슬이 종종 sn-2 위치에서 그리고 많은 경우에 다중 올레핀(2-4)으로 불포화되는 많은 세포에서 전형적인 것과 유사하다. 낮은 농도의 DOPS에서 약간 향상되지만, 이 향상은 실시예 15에서 PS가 포화 아실 사슬, 가장 바람직하게는 디팔미토일(C16) 또는 디스테아로일(C18)로 구성될 때 상당히 더 높은 것으로 나타났다.
실시예 22. SARS-CoV-2 스파이크 단백질 mRNA 백신 구조체들의 면역원성에 대한 페길화 및 포스파티딜세린 표적화의 영향.
마우스 및 연구 설계. 생체 내 연구가 수행되었다. 암컷 BALB/c 마우스를 Jackson Labs에서 구입하여 적어도 7일 동안 동식물 사육장에서 적응시켰으며 연구 시작 시 6-8주차였다. 연구 0일차에 50L 부피의 백신 후보(양은 mRNA를 지칭함) 1ug을 마우스 오른쪽 사두근에 근육 주사하였다. 연구 그룹은 5마리의 마우스로 구성되었고 비히클 대조군, 대조 백신 및 실험 백신 후보를 포함하였다. 21일 후에 마우스에 동일한 백신 후보를 두 번째 주사했다. 연구 시작 시 무작위로 선택된 5마리의 대조군 마우스와 연구 21일 및 34일차에 모든 마우스로부터 혈액을 수집하고 혈청을 단리했다. 항체 역가를 분석할 때까지 혈청을 -80°C에 보관했다. 연구 34일차에 마우스를 안락사시키고 비장을 적출하였다.
mRNA의 설계 및 준비. SARS-CoV-2 전장 스파이크 단백질을 인코딩하고 BNT162b2(Comirnaty) 백신에 사용된 것과 동일한 UTR이 측접한 mRNA를 Vernal Biosciences에서 구입했다. 모든 우리딘 뉴클레오시드는 N1-메틸-슈도우리딘으로 치환되었다. mRNA를 생성하기 위해, mRNA 서열(VRN029; 서열번호 2, 도 13A)을 인코딩하는 합성 유전자를 DNA 플라스미드에 클로닝하였다. 합성 유전자는 RNA 프로모터, 5' 비번역 영역, SARS-COV2 스파이크 단백질 수용체 결합 도메인, 3' 비번역 영역 및 약 120A의 폴리(A) 테일 영역으로 구성되었다.　플라스미드는 대장균의 배양물에서 증식 및 확장된 다음 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 정화된 대장균 용해물로부터 단리되었다. 정제된 플라스미드는 폴리(A) 테일 인코딩 영역의 말단의 부위에서 절단하는 유형 IIs 제한 효소를 사용하여 선형화되었다.　그런 다음 그 플라스미드를 뉴클레오티드 트리포스페이트, RNA 중합효소 및 RNase 억제제가 있는 완충액에서 인큐베이션했다.　반응을 중단시키기 위해, 선형 플라스미드 템플릿을 절단하는 DNase I을 첨가했다.　이어서 캡핑되지 않은 RNA를 크로마토그래피를 사용하여 정제한 다음 GTP, S-아데노실메티오닌, 구아날릴트랜스퍼라제, 2'-O-메틸트랜스퍼라제 및 RNase 억제제와 함께 또 다른 완충액에서 인큐베이션하였다.　이어서, 캡핑된 mRNA를 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 완충액을 물로 교환하고, 바이알에 채웠다.
mRNA를 포함하는 지질 나노입자(LNP)의 생성. 각각의 지질의 스톡 용액을 준비했다. 이온화 가능한 지질을 4mL 유리 바이알(Thermo B7999-2)에서 계량하고 최종 농도 10mM이 되도록 에탄올(Sigma-Aldrich 200 proof, RNase 없음)에 용해시켰다. DSPC(Avanti Polar Lipids), 콜레스테롤(Dishman) 및 PEG-DMG(NOF)와 같은 다른 지질을 계량하고 에탄올에 1mM의 농도로 용해시켰다. DSPS-Na (NOF)는 1mM의 농도로 메탄올(Sulpelco, Omnisolve)에 용해되었고 잠시 70°C로 가열하여 용해를 완료하였다.
각각의 개별 LNP에 대한 지질 혼합물은 원하는 부피의 각 지질 스톡 용액을 새로운 바이알에 첨가하고, 필요에 따라 1.2mL의 최종 부피를 달성하도록 에탄올을 첨가하여 준비되었다. 예를 들어, N/P가 5인 AKG-UO-1/DSPC/DSPS/Chol/PEG-DMG(50/2.5/7.5/38.5/1.5 mol%)의 LNP 제형은 사용된 mRNA 100 μg당 1500 nmol AKG-UO-1, 75 nmol DSPC, 225 nmol DSPS, 1155 nmol Chol 및 45 nmol PEG-DMG를 함유했다. 동결된 mRNA(SARS-CoV-2 스파이크 mRNA, Vernal) 바이알을 해동시키고 mRNA를 6.25mM 아세트산나트륨(pH 5.0)에서 최종 농도 0.033mg/mL로 희석하여 mRNA 용액을 준비했으며, 여기서 농도는 Nanodrop에서 흡광도로 확인된다.
LNP를 준비하기 위해, NanoAssemblr Benchtop 미세유체 장치(Precision Nanosystems)를 사용했다. LNP에 DSPS가 포함된 경우, 70°C로 설정된 가열 블록 액세서리를 사용하고 그렇지 않은 경우 LNP를 실온에서 혼합했다. mRNA 용액 3mL를 3mL 일회용 주사기(BD 309656)에 넣고 지질 혼합물 1ml를 1ml 주사기(BD309659)에 넣고 혼합하기 전에 4분 동안 NanoAssemblr 가열 블록에 두었다. LNP는 6 mL/분의 혼합 속도에서 3:1 수성:알코올 부피 비율로 액체 스트림을 일회용 마이크로유체 카세트를 통해 펌핑하여 형성되었다. 혼합 후, 3.6mL의 LNP 혼합물을 수집하고 초기 혼합 부피 0.35mL와 마지막 0.05mL의 혼합물을 버렸다. 에탄올은 PBS(Cytivia, SH30256.01)에서 SpectraPor 투석 튜브(12-14k MWCO)를 사용하여 완충액 교환에 의해 제거되었다. LNP는 일반적으로 pH 7.4의 PBS로 교환된 다음 15mM Tris, pH 7.4, 20% 수크로스로 교환되고, 20-50ug/mL mRNA로 농축되고, 멸균 여과(Thermo Nalgene 0.2um #720-1320)한 후 액체 질소에 5분 동안 담가 동결시키고 -20°C에서 장기간 보관했다. 이 연구를 위해 샘플을 >40 μg/mL mRNA로 농축하고 다양한 부피의 15 mM Tris, 20% Sucrose, pH 7.4로 희석하여 목표 농도 40 μg mRNA로 만든 다음 LN2에서 동결시켰다. LNP의 분취물을 해동시키고 pH 7.4의 15mM Tris로 1:1(부피:부피)로 희석하여 최종 농도가 15mM 트리스, 10% 수크로스, pH 7.4 중에서 20μg/mL mRNA가 되도록 한 후에, LNP의 특성화에 착수했다. 이는 뒷다리에 IM 주입을 통해 50 μL 부피의 1 μg mRNA를 동물에게 투여하기 전에 수행되었던 샘플 준비 조건들을 시뮬레이션한 것이다.
LNP 특성화. LNP 내 mRNA 캡슐화 및 mRNA 농도는 Ribogreen 분석을 사용하여 측정되었다. 나노 입자 크기와 제타 전위는 제타사이저(Malvern)로 측정했다.
SARS-CoV-2 항스파이크 항체 역가. SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 총 IgG 결합 항체에 대한 혈청 샘플을 분석하기 위해 표준 간접 ELISA를 수행했다. 이 분석을 위해 Nunc MaxiSorp 96-웰 플레이트를 1x PBS, pH 7.4에서 2μg/mL로 희석된 100μL의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(Sino Biological, 카탈로그 번호 40589-V08B1)로 코팅하였다. 플레이트를 37oC에서 12시간 동안 정적으로 인큐베이션했다. 100 μL PBS + 0.05% Tween-20으로 플레이트를 3회 세척하여 결합되지 않은 코팅 항원을 제거했다. 그런 다음 플레이트를 37oC에서 1시간 동안 PBS + 5% 탈지유에서 블로킹하였다. 테스트 및 양성 대조군 샘플을 분석 희석액(PBS, Tween-20, 1% 탈지유)에서 시작점 희석 1:20으로 희석한 다음 U-바닥 희석 플레이트를 사용하여 4배 연속 희석했다. 블로킹이 완료되면 뒤집어 블로킹 완충액을 제거하고 각 샘플을 이중으로 플레이팅했다. 플레이트를 37oC에서 2시간 동안 정적으로 인큐베이션한 다음 100 μL의 PBS + 0.05% Tween-20으로 3회 세척하여 결합되지 않은 혈청을 제거했다. 100L의 2차 검출 항체(염소 항-마우스-HRP IgG, Abcam)를 1:10,000의 희석으로 각 웰에 첨가했다. 플레이트를 실온에서 30분 동안 정적으로 인큐베이션하고, 이어서 결합되지 않은 항체를 제거하고 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 세척하였다. 현상을 위해 100μL의 1단계 Ultra TMB 기질을 각 웰에 추가하고 50μL의 TMB 정지 용액(SeraCare, 카탈로그 번호 5150-0019)으로 약 10분 후에 반응을 정지시켰다. Thermo LabSystems Multiskan 분광광도계를 사용하여 450nm에서 30분 이내에 플레이트를 판독했다. 역가는 적정 곡선의 선형 부분에서 OD 450에 대한 특정 컷오프 값을 생성하는 희석의 역수로 정의되었다.
생체외 T 세포 반응. 연구 34일차에, 비장을 단일 세포 현탁액에 기계적으로 분리시켰다. 세포를 세포 자극 배지(L-글루타민 및 HEPES 완충액을 함유한 RPMI, 열-불활성화 소 태아 혈청 및 Pen/Strep)에 재현탁시키고 2x106개 세포를 100 L 부피로 96-웰 플레이트에 분취하였다. 각 마우스의 비장 세포는 PMA 및 이오노마이신 또는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(JPT, 카탈로그 # PM-WCPV-S-2)을 포함하는 1g/mL의 펩티드 풀을 포함하는 양성 대조군 세포 자극 칵테일(ThermoFisher, 카탈로그 # 00-4970-93)로 처리된 100L 배지만으로 37℃에서 약 18시간 동안 자극되었다. 자극 1시간 후, Golgi Stop(BD Biosciences, 카탈로그 # 554724)을 각 웰에 첨가하였다.
유동 세포 측정. 자극 후, 세포를 PBS로 세척하고 96-웰 딥웰 플레이트로 옮겼다. 세포를 4℃에서 20분 동안 PBS에 희석된 LIVE/DEAD 근적외선 생존도 염료(ThermoFisher, 카탈로그 # L10119)로 염색했다. 세포를 FBS 염색 완충액(BD Biosciences, 카탈로그 # 554656)으로 세척하고 Fc Block(BD Biosciences, cat. 553142)과 함께 4℃에서 10분 동안 인큐베이션했다. 그런 다음 세포를 CD3 BV605(BD, 카탈로그 번호 564009), CD4 BV421(BD, 카탈로그 번호 562891) 및 CD8 APC(BD, 카탈로그 번호 553035)로 구성된 세포 표면 항체 칵테일로 4℃에서 40분 동안 염색했다. BD Brilliant 염색 완충액(카탈로그 번호 563794)이 염색 완충액에 포함되었다. 세포를 FBS 염색 완충액으로 세척한 후 Fix/Perm 완충액(ThermoFisher, 카탈로그 # 00-5523-00)으로 실온에서 20분 동안 고정시켰다. 세포를 1x Perm 완충액으로 세척하고, Fc Block과 함께 인큐베이션한 다음, IFN-g PE/Cy7(BD, 카탈로그 # 557649), IL-2 PE(BioLegend, 카탈로그 # 503808) 및 TNF-a FITC(BD, 카탈로그 # 554418)로 구성된 세포내 사이토카인 항체 칵테일로 4℃에서 40분 동안 염색했다. 그런 다음 세포를 세척하고 FBS 염색 완충액에 재현탁하고 MACSQuant 16 유동 세포 측정기(Miltenyi Biotec)에서 수집했다. 유동 데이터는 FlowJo v10.8.1(BD Biosciences)을 사용하여 분석했다.
표 18. SARS-CoV-2 스파이크 단백질 mRNA 백신 구조체의 면역원성을 평가하는 데 사용되는 LNP의 물리화학적 특성
백신 면역원성에 대한 PEG-지질 농도의 영향을 평가하기 위해, BALB/c 마우스를 증가하는 양의 PEG-지질(PEG-DMG 또는 PEG-DPPE)을 함유하는 mRNA-LNP로 면역화하였다. 항체 분석을 위해 프라임 후 21일차 및 부스트 후 13일차(연구 34일차)에 혈청을 수집하였다. 비장 세포를 스파이크 펩티드 풀로 자극하고 IL-2를 생산하는 CD4 T 세포의 백분율을 유동 세포측정법을 사용하여 정량화했다(도 13B 및 도 13C). 두 가지 형태의 PEG, PEG-DMG (도 13B) 또는 PEG-DPPE (도 13C) 모두 mRNA-LNPA 백신 면역원성에 역으로 영향을 주었고, 더 낮은 농도의 PEG-지질은 더 높은 수준의 B-세포 및 T-세포 반응 모두를 나타냈다.
mRNA-LNP 면역원성에 대한 PEG-지질 아실 사슬 조성의 영향을 평가하기 위해, BALB/c 마우스를 상이한 PEG 형식(PEG-DMG 또는 PEG-DSG)을 포함하는 mRNA-LNP로 면역화하였다. 프라임 후 21일차 및 부스트 후 13일차(연구 34일차)에 혈청을 수집하였다. 비장 세포를 스파이크 펩티드 풀로 자극하고 IL-2를 생산하는 CD4 T 세포의 백분율을 유동 세포측정법을 사용하여 정량화했다. 항체 역가 데이터는 통계 분석 전에 로그 변환되었다. 독립표본 t 검정을 사용하여 그룹들을 비교했다. 이온화 가능한 지질 KC2OA로 제조된 LNP의 경우, 어느 PEG 형식도 유사하게 거동하였다(도 13D). 대조적으로, 이온화 가능한 지질 UO1 및 PEG-DMG를 사용하는 LNP는 PEG-DSG를 함유하는 LNP보다 우수한 항체 반응을 유도하였다(도 13E).
포스파티딜세린의 포함이 mRNA-LNP 면역원성에 어떻게 영향을 미치는지 평가하기 위해, BALB/c 마우스를 DSPS가 있거나 없는 다양한 이온화 가능한 지질을 함유하는 mRNA-LNP로 면역화했다. 34일(부스팅 후 13일)차에, ELISA로 총 IgG 항-스파이크 항체를 정량화하기 위해 혈청을 수집하였다. 비장 세포를 펩티드로 자극하고 IL-2를 생산하는 CD4 T 세포의 퍼센트를 유동 세포측정법을 사용하여 정량화했다.
비교 이온화 가능한 지질 ALC-0315를 갖는 DSPS의 포함은 전체 IgG 항-스파이크 항체 수준에 부정적인 영향을 미쳤다(도 13F). DSPS는 이온화 가능한 지질 UO1 및 KC2OA를 포함하는 LNP에 대해 반대의 효과를 보였고 기하 평균 항체 수준을 각각 36배 및 46배 크게 증가시켰다. DSPS는 또한 CD4 T 세포 반응에 영향을 미쳤는데, 반응은 UO1 및 KC2OA를 포함하는 LNP에서 더 높은 경향이 있었고 SM-102에서 상당히 더 높았다. 종합하면, 지질 나노입자에 DSPS를 포함시키는 것은 mRNA 백신의 면역원성에 실질적으로 영향을 미칠 수 있으며, DSPS의 영향은 이온화 가능한 양이온성 지질의 유형에 의해 영향을 받는다.
상이한 포스파티딜세린 아실 사슬 조성의 혈청 항체 역가에 대한 효과(도 13G, 패널 A) 및 비장에서 스파이크 특이적 CD4 T 세포 반응의 크기(도 13G, 패널 B)를 평가하였다. 생쥐는 이온화 가능한 지질 UO1과 DSPS 또는 DPPS 형태의 포스파티딜 세린을 사용한 LNP로 면역화되었다. 34일(부스팅 후 13일)차에, ELISA로 총 IgG 항-스파이크 항체를 정량화하기 위해 혈청을 수집하였다. 비장 세포를 펩티드로 자극하고 IL-2를 생산하는 CD4 T 세포의 퍼센트를 유동 세포측정법을 사용하여 정량화했다.
PS 아실 사슬 조성의 영향과 관련하여, 두 형태의 PS 모두 PS가 결여된 기본 제형에 비해 항체 수준을 비교적 증가시켰다(도 13G, 패널 A). DPPS를 포함하는 제형만이 PS가 없는 기본 제형보다 상당히 더 높았지만, 두 형태의 PS 모두 CD4 T 세포 반응에 긍정적인 영향을 미쳤다(도 13G, 패널 B). 종합하면, 우리의 LNP, DPPS 또는 DSPS에 포함된 두 형태의 PS 모두는 mRNA-LNP 백신의 면역원성을 증가시키는 데 유사한 긍정적 효과를 나타냈다.
실시예 23. KC2-01 기반 LNP에서 DSPS D-이성질체 또는 L-이성질체를 7.5mol%로 추가하는 것의 효과를 MutuDC1940 수지상 세포주에서 입자 특성 및 활성으로 측정.
본 연구의 목적은 DSPS의 D 및 L-이성질체를 7.5mol%로 mRNA LNP 제형에 포함시키는 것의 영향을 비교하는 것이었다. 25°C에서 실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하고 실시예 10에서와 같이 분석하였다. LNP는 2.5mol% DSPC, 7.5mol% DSPS(D 또는 L) 및 일정한 1.5mol% PEG-DMG와 함께 ICL로서 KC2-01을 5의 N/P 비율로 함유하였다. 실시예 11에 기술된 바와 같이 뮤린 수지상 세포에서 형질감염 효율을 평가하였다.
표 19. mCherry mRNA 및 디스테아로일포스파티딜-L-세린 또는 디스테아로일포스파티딜-D-세린이 있는 KC2-01 LNP의 물리화학적 특성.
이 연구는 KC2-01 기반 LNP 제형에 7.5 mol% DSPS(둘 중 하나의 이성질체)를 포함시키는 것이 입자 크기 또는 mRNA 캡슐화에 영향을 미치지 않음을 보여준다. 제타 전위 값은 pH 5에서 유사하지만, DSPS 함유 제형은 비-DSPS 함유 제형보다 pH 7에서 더 많은 음의 값을 가지는데, 이는 아마도 DSPS에 의해 추가된 추가 음전하로 인한 결과일 것이다. 형질감염에 대한 입체화학의 영향을 도 14A 및 도 14B에서 평가하였다. DSPS의 D-이성질체가 사용되었을 때 1μg/mL mRNA(0.33μg/mL mRNA에서 4.7배)에서 L 이성질체와 비교하여 mCherry 발현의 8배 증가가 관찰되었으며, 이는 DSPS 함유 LNP의 흡수 또는 발현 메커니즘(들)이 입체특이적일 가능성이 있음을 나타낸다.
실시예 24. MutuDC1940 수지상 세포주에서 25°C 및 65°C에서 KC2 기반 LNP에 DSPS를 포함시키는 것의 입자 특성 및 활성에 대한 효과를 측정.
이 연구의 목적은 두 가지 다른 온도에서 생산된 KC2 기반 LNP에서 DSPS의 D-이성질체를 포함시키는 것의 영향을 비교하는 것이었다. 실시예 9에 기술된 바와 같이(여기서 DSPS를 포함하는 것들은 65℃에서 제조되었고 DSPS를 포함하지 않는 것들은 25℃에서 제조되었음) LNP를 제조하고 모든 LNP를 실시예 10에서와 같이 분석하였다.
모든 LNP는 일정한 1.5mol% PEG-DMG와 함께 ICL을 N/P 비율 5로 포함하였다. 콜레스테롤 함량은 38.5mol%로 일정하게 유지되었고 DSPC 함량은 5 및 7.5 mol%의 DSPS mol%에 따라 역으로 변화하였다(모든 지질 농도는 총 지질의 mol%로 사용되었다).　이들 mRNA LNP는 모두 mCherry mRNA를 함유하였으며 mRNA-1273에서 사용된 것과 동일한 지질 조성의 SM-102 기반 지질 제제 및 BNT162b2에서 사용된 것과 유사한 ALC-0315를 사용한 지질 제제를 사용한 비교 제형들의 조성은 각각의 처방 정보로부터 취하여졌다. ALC-0315를 사용하는 BNT162b2 비교제형은 본 연구의 다른 제형에 따라 5.0의 N/P로 만들어졌는데, 이는 승인된 Covid 백신 Comirnaty와 상이하다.
표 20. SM102 또는 ALC-0315 이온화 가능한 양이온성 지질로 제조된 유사한 LNP에 대해 5 또는 7.5% DSPS를 갖는 KC2 함유 LNP의 물리화학적 특성.
이 연구는 65°C로 설정된 가열 블록에서 지질 용액 및 mRNA 용액을 가열하는 것이 5 또는 7.5mol% DSPS 함량에서 입자 직경 또는 제타 전위 또는 mRNA 캡슐화 판독값에 유해한 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다. DSPS-표적화 KC2 LNP의 형질감염에 대한 온도의 영향, 및 SM102 및 ALC-0315 함유 LNP와의 비교가 도 15에 도시되어 있다. 5 mol% DSPS 제형은 25°C에서 만든 완전히 동일한 제형보다 mCherry 발현이 2배 더 높았다(p < 0.05, T-검정). 두 온도에서 제조된 7.5 mol% DSPS를 사용한 제형의 비교는 유의한 차이를 나타내지 않았다. 65°C에서 만들어진 5mol% DSPS 함유 LNP는 SM102 제형에 비해 mCherry 발현을 6.5배 증가시켰다. 더 높은 온도는 알코올에서 DSPS의 용해도를 증가시키고 입자에 지질을 더 잘 포함시킬 수 있게 하여, 본 시험관내 연구에서 향상된 흡수를 허용하는 동시에, 크기, 캡슐화 또는 mRNA 발현과 같은 많은 중요한 LNP 입자 특성에 악영향을 미치지 않는다.
실시예 25. DSPS 유무에 따른 LNP에서 UO1, UO6 & 7 비교
이 연구의 목적은 7.5mol% DSPS가 있는 그리고 없는 LNP에서 AKG-UO-6(“UO-6”) 및 AKG-UO-7(“UO-7”)을 평가하는 것이었다. 이전에는 7.5 mol% DSPS가 UO-1 시리즈에서 가장 최적의 LNP를 생성하는 것으로 나타났다. 본 실시예에서 7.5 mol% DSPS는 구조적으로 유사한 UO-6을 비교하기 위해 포함시킬 초기 DSPS의 양으로 선택되었고 7개의 LNP를 실시예 9에 기술된 바와 같이 제조하였고 실시예 10에서와 같이 분석하였다.
LNP는 ICL로서 UO-1, UO-6 또는 UO-7을 50mol% 함유하였다. 이들 제형은 또한 38.5mol% 콜레스테롤 및 1.5mol% PEG-DMG를 함유하였다. 비 DSPS 함유 샘플은 10mol% DSPC를 갖고, 7.5mol% DSPS 함유 LNP에 DSPS를 7.5mol%로 첨가하였고 DSPC는 2.5mol%로 포함시켰다. 모든 제형의 N/P는 5였다. 실시예 11에 기술된 바와 같이 뮤린 수지상 세포에서 형질감염 효율을 평가하였다.
표 21. DSPS-표적화 유무에 따른 UO-1, UO-6 및 UO-7 LNP의 물리화학적 특성 및 캡슐화 효율.
이 연구는 UO1, UO6 및 UO7을 기반으로 하는 LNP에 DSPS를 포함시키면 입자 크기 또는 mRNA 포획의 불리한 변화 없이 mCherry의 발현을 증가시킨다는 것을 보여준다. 3가지 상이한 ICL(UO-1, UO-6 및 UO-7)로 제조된 제형에 있어서, LNP에 7.5% DSPS를 포함시킨 것의 수지상 세포 형질감염 활성에 대한 영향이 나타났다(도 16). 7.5mol% DSPS를 포함하는 UO-1의 경우, mCherry 발현은 7.5mol% DSPS를 포함하는 UO6보다 11배, 7.5mol% DSPS를 포함하는 UO7보다 7배 더 높았다. DSPS가 있는 UO-7은 DSPS가 있는 UO6보다 mCherry 표현이 1.5배 더 많았다. DSPS를 함유하지 않은 제형들 중에서 UO7은 UO1보다 2.2배 더 활성이었고 UO6보다 1.9배 더 활성이었다. 그러나 3가지 ICL 모두로 제조된 LNP는 우수한 캡슐화 효율, 입자 크기 및 제타 전위를 유지하면서도 해당 제형에 DSPS를 포함시켜 표적화하는 이점을 얻었다.
실시예 26. UO1, SM102 및 ALC-0315 기반 LNP에 DSPS를 첨가한 효과를 MutuDC1940 수지상 세포주에서 입자 특성 및 활성을 비교하여 평가.
본 연구의 목적은 DSPC의 L-이성질체를 0, 5% 및 7.5mol%로 mRNA LNP 제형에 포함시킨 효과를 평가하는 것이었다. 25°C에서 실시예 9에 기재된 바와 같이 LNP를 제조하고 실시예 10에서와 같이 분석하였다.
LNP는 ICL로서 AKG-UO-1(“UO-1”) 또는 SM102를 50mol%로 포함하였다. UO1 및 SM102의 경우 제형들은 38.5mol% 콜레스테롤 및 1.5mol% PEG-DMG를 함유했다. 비 DSPS 함유 샘플들은 10 mol% DSPC를 가지며, DSPS 함유 LNP에, DSPS가 5 또는 7.5 mol%로 첨가되었고 동시에 DSPC는 이와 동일한 mol%만큼 감소되었다. ALC-0315 제형의 경우, ICL은 46.3mol%, DSPC 9.4mol%, 콜레스테롤 42.7mol% 및 PEG-DMG 1.5mol%이었다. DSPS는 상기와 같이 DSPC mol%를 동시에 감소시키면서 첨가되었다. 모든 제형의 N/P는 5였다. 실시예 11에 기술된 바와 같이 뮤린 수지상 세포에서 형질감염 효율을 평가하였다.
표 22. UO1, SM102 및 ALC-0315 함유 LNP의 PS-표적화 제형들의 물리화학적 특성 및 캡슐화 효율
이 연구는 UO1, SM102 및 ALC-0315을 기반으로 하는 LNP에 DSPS를 포함시키면 입자 크기 또는 mRNA 포획의 불리한 변화 없이 mCherry의 발현을 증가시킨다는 것을 보여준다(도 17). UO-1 및 SM102의 경우 5mol% DSPS가 최대인 반면 ALC-0315 제형의 경우 7.5mol% DSPS가 최대였다. UO-1 및 SM102의 경우, 5mol% DSPS 샘플에서 발현 증가는 각각 18.1배 및 58.7배였다. 이러한 증가는 7.5 mol% DSPS에 대한 ALC-0315 기반 샘플의 경우 80.9배였다.
실시예 27. 추가적인 예시적 포스파티딜-L-세린 표적화 LNP 제형.
하기 제시된 추가 제형들 또한 상기 실시예에 기술된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 모든 지질 농도는 LNP에서 총 지질의 백분율로서 mol%로 표시된다. 하기 조성물은 접합된 지질 함량이 0.5 내지 2.5mol%, 스테롤 함량이 25 내지 45mol%, ICL 함량이 40 내지 65mol%, 포화 포스파티딜-L-세린 함량이 2 내지 10mol%, 그리고 총 비양이온성 인지질 함량이 5 내지 20mol%로 다양하다. 대부분의 조성물은 2개의 인지질, 전형적으로 포스파티딜-L-세린(DSPS 또는 DPPS가 바람직함) 및 포스파티딜콜린을 함유할 것이지만, 일부 예시적인 제형은 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)과 같은 포스파티딜에탄올아민을 비롯한 2개 이상의 인지질을 함유할 수 있다.
표 23. 예시적인 포스파티딜-L-세린 함유 LNP 제형
표 23. 예시적인 포스파티딜-L-세린 함유 LNP 제형(계속)
본 발명의 다양한 양상들은 단독으로, 조합되어, 또는 전술한 실시예에서 구체적으로 논의되지 않은 다양한 배열로 사용될 수 있으며, 따라서 그 적용이 전술한 설명에서 설명되거나 도면에 예시된 구성 요소들의 세부 사항 및 배열에 제한되지 않는다. 예를 들어, 한 실시형태에서 설명된 양상들은 다른 실시형태에서 설명된 양상들과 임의의 방식으로 조합될 수 있다.
본 발명의 특정한 실시형태들이 논의되었지만, 상기 설명은 예시적인 것이며 제한적이지 않다. 본 발명의 많은 변형은 본 명세서를 읽으면 당업자에게 명백해질 것이다. 본 발명의 전체 범위는 균등물의 전체 범위와 함께 청구항을 참조하고, 그러한 변형과 함께 명세서를 참조하여 결정되어야 한다.
본 명세서에 참조된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함된다고 구체적으로 명시된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Akagera, Inc. <120> LIPID NANOPARTICLES FOR DELIVERY OF NUCLEIC ACIDS AND METHODS OF USE THEREOF <130> 191016-010403/PCT <150> 63/118,534 <151> 2020-11-25 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 720 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 1 auggugagca agggcgagga ggacaacaug gccaucauca aggaguucau gcgguucaag 60 gugcacaugg agggcagcgu gaacggccac gaguucgaga ucgagggcga gggcgagggc 120 cggcccuacg agggcaccca gaccgccaag cugaagguga ccaagggcgg cccccugccc 180 uucgccuggg acauccugag cccccaguuc auguacggca gcaaggccua cgugaagcac 240 cccgccgaca uccccgacua ccugaagcug agcuuccccg agggcuucaa gugggagcgg 300 gugaugaacu ucgaggacgg cggcguggug accgugaccc aggacagcag ccugcaggac 360 ggcgaguuca ucuacaaggu gaagcugcgg ggcaccaacu uccccagcga cggccccgug 420 augcagaaga agaccauggg cugggaggcc agcagcgagc ggauguaccc cgaggacggc 480 gcccugaagg gcgagaucaa gcagcggcug aagcugaagg acggcggcca cuacgacgcc 540 gaggugaaga ccaccuacaa ggccaagaag cccgugcagc ugcccggcgc cuacaacgug 600 aacaucaagc uggacaucac cagccacaac gaggacuaca ccaucgugga gcaguacgag 660 cgggccgagg gccggcacag caccggcggc auggacgagc uguacaagag cggcaacuga 720 <210> 2 <211> 4319 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 2 gggaataaac tagtattctt ctggtcccca cagactcaga gagaacccgc caccatgttc 60 gtgttcctgg tgctgctgcc tctggtgtcc agccagtgtg tgaacctgac caccagaaca 120 cagctgcctc cagcctacac caacagcttt accagaggcg tgtactaccc cgacaaggtg 180 ttcagatcca gcgtgctgca ctctacccag gacctgttcc tgcctttctt cagcaacgtg 240 acctggttcc acgccatcca cgtgtccggc accaatggca ccaagagatt cgacaacccc 300 gtgctgccct tcaacgacgg ggtgtacttt gccagcaccg agaagtccaa catcatcaga 360 ggctggatct tcggcaccac actggacagc aagacccaga gcctgctgat cgtgaacaac 420 gccaccaacg tggtcatcaa agtgtgcgag ttccagttct gcaacgaccc cttcctgggc 480 gtctactacc acaagaacaa caagagctgg atggaaagcg agttccgggt gtacagcagc 540 gccaacaact gcaccttcga gtacgtgtcc cagcctttcc tgatggacct ggaaggcaag 600 cagggcaact tcaagaacct gcgcgagttc gtgtttaaga acatcgacgg ctacttcaag 660 atctacagca agcacacccc tatcaacctc gtgcgggatc tgcctcaggg cttctctgct 720 ctggaacccc tggtggatct gcccatcggc atcaacatca cccggtttca gacactgctg 780 gccctgcaca gaagctacct gacacctggc gatagcagca gcggatggac agctggtgcc 840 gccgcttact atgtgggcta cctgcagcct agaaccttcc tgctgaagta caacgagaac 900 ggcaccatca ccgacgccgt ggattgtgct ctggatcctc tgagcgagac aaagtgcacc 960 ctgaagtcct tcaccgtgga aaagggcatc taccagacca gcaacttccg ggtgcagccc 1020 accgaatcca tcgtgcggtt ccccaatatc accaatctgt gccccttcgg cgaggtgttc 1080 aatgccacca gattcgcctc tgtgtacgcc tggaaccgga agcggatcag caattgcgtg 1140 gccgactact ccgtgctgta caactccgcc agcttcagca ccttcaagtg ctacggcgtg 1200 tcccctacca agctgaacga cctgtgcttc acaaacgtgt acgccgacag cttcgtgatc 1260 cggggagatg aagtgcggca gattgcccct ggacagacag gcaagatcgc cgactacaac 1320 tacaagctgc ccgacgactt caccggctgt gtgattgcct ggaacagcaa caacctggac 1380 tccaaagtcg gcggcaacta caattacctg taccggctgt tccggaagtc caatctgaag 1440 cccttcgagc gggacatctc caccgagatc tatcaggccg gcagcacccc ttgtaacggc 1500 gtggaaggct tcaactgcta cttcccactg cagtcctacg gctttcagcc cacaaatggc 1560 gtgggctatc agccctacag agtggtggtg ctgagcttcg aactgctgca tgcccctgcc 1620 acagtgtgcg gccctaagaa aagcaccaat ctcgtgaaga acaaatgcgt gaacttcaac 1680 ttcaacggcc tgaccggcac cggcgtgctg acagagagca acaagaagtt cctgccattc 1740 cagcagtttg gccgggatat cgccgatacc acagacgccg ttagagatcc ccagacactg 1800 gaaatcctgg acatcacccc ttgcagcttc ggcggagtgt ctgtgatcac ccctggcacc 1860 aacaccagca atcaggtggc agtgctgtac caggacgtga actgtaccga agtgcccgtg 1920 gccattcacg ccgatcagct gacacctaca tggcgggtgt actccaccgg cagcaatgtg 1980 tttcagacca gagccggctg tctgatcgga gccgagcacg tgaacaatag ctacgagtgc 2040 gacatcccca tcggcgctgg aatctgcgcc agctaccaga cacagacaaa cagccctcgg 2100 agagccagaa gcgtggccag ccagagcatc attgcctaca caatgtctct gggcgccgag 2160 aacagcgtgg cctactccaa caactctatc gctatcccca ccaacttcac catcagcgtg 2220 accacagaga tcctgcctgt gtccatgacc aagaccagcg tggactgcac catgtacatc 2280 tgcggcgatt ccaccgagtg ctccaacctg ctgctgcagt acggcagctt ctgcacccag 2340 ctgaatagag ccctgacagg gatcgccgtg gaacaggaca agaacaccca agaggtgttc 2400 gcccaagtga agcagatcta caagacccct cctatcaagg acttcggcgg cttcaatttc 2460 agccagattc tgcccgatcc tagcaagccc agcaagcgga gcttcatcga ggacctgctg 2520 ttcaacaaag tgacactggc cgacgccggc ttcatcaagc agtatggcga ttgtctgggc 2580 gacattgccg ccagggatct gatttgcgcc cagaagttta acggactgac agtgctgcct 2640 cctctgctga ccgatgagat gatcgcccag tacacatctg ccctgctggc cggcacaatc 2700 acaagcggct ggacatttgg agcaggcgcc gctctgcaga tcccctttgc tatgcagatg 2760 gcctaccggt tcaacggcat cggagtgacc cagaatgtgc tgtacgagaa ccagaagctg 2820 atcgccaacc agttcaacag cgccatcggc aagatccagg acagcctgag cagcacagca 2880 agcgccctgg gaaagctgca ggacgtggtc aaccagaatg cccaggcact gaacaccctg 2940 gtcaagcagc tgtcctccaa cttcggcgcc atcagctctg tgctgaacga tatcctgagc 3000 agactggacc ctcctgaggc cgaggtgcag atcgacagac tgatcacagg cagactgcag 3060 agcctccaga catacgtgac ccagcagctg atcagagccg ccgagattag agcctctgcc 3120 aatctggccg ccaccaagat gtctgagtgt gtgctgggcc agagcaagag agtggacttt 3180 tgcggcaagg gctaccacct gatgagcttc cctcagtctg cccctcacgg cgtggtgttt 3240 ctgcacgtga catatgtgcc cgctcaagag aagaatttca ccaccgctcc agccatctgc 3300 cacgacggca aagcccactt tcctagagaa ggcgtgttcg tgtccaacgg cacccattgg 3360 ttcgtgacac agcggaactt ctacgagccc cagatcatca ccaccgacaa caccttcgtg 3420 tctggcaact gcgacgtcgt gatcggcatt gtgaacaata ccgtgtacga ccctctgcag 3480 cccgagctgg acagcttcaa agaggaactg gacaagtact ttaagaacca cacaagcccc 3540 gacgtggacc tgggcgatat cagcggaatc aatgccagcg tcgtgaacat ccagaaagag 3600 atcgaccggc tgaacgaggt ggccaagaat ctgaacgaga gcctgatcga cctgcaagaa 3660 ctggggaagt acgagcagta catcaagtgg ccctggtaca tctggctggg ctttatcgcc 3720 ggactgattg ccatcgtgat ggtcacaatc atgctgtgtt gcatgaccag ctgctgtagc 3780 tgcctgaagg gctgttgtag ctgtggcagc tgctgcaagt tcgacgagga cgattctgag 3840 cccgtgctga agggcgtgaa actgcactac acatgatgac tcgagctggt actgcatgca 3900 cgcaatgcta gctgcccctt tcccgtcctg ggtaccccga gtctcccccg acctcgggtc 3960 ccaggtatgc tcccacctcc acctgcccca ctcaccacct ctgctagttc cagacacctc 4020 ccaagcacgc agcaatgcag ctcaaaacgc ttagcctagc cacaccccca cgggaaacag 4080 cagtgattaa cctttagcaa taaacgaaag tttaactaag ctatactaac cccagggttg 4140 gtcaatttcg tgccagccac accctggagc tagcagcggc cgcggccgca aaaaaaaaaa 4200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 4319

Claims (24)

  1. 지질 나노입자(LNP) 조성물로서, 헤드 기에 공유 결합된 한 쌍의 선형 다중불포화 지질 테일들로 이루어진 화학 구조를 갖는 이온화 가능한 지질을 포함하고, 상기 헤드 기는 선택적으로 pKa가 6 내지 7인 디알킬 아미노기를 포함하고;
    상기 헤드 기는 디알킬 아미노기에 공유 결합된 헤테로사이클릴 또는 알킬 부분을 포함하고 선택적으로 포스페이트 기를 추가로 포함하고;
    각각의 다중불포화 지질 테일은 지질 테일의 길이를 따라 적어도 2개의 메틸렌 기에 의해 분리된 적어도 2개의 올레핀을 제외하고는 불포화되고, 선택적으로 헤드 기에 공유 결합된 지질 테일의 말단에 단일 아실 기를 포함하는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 각각의 지질 테일은 동일하고, 각각의 지질 테일은 비치환된 에틸렌, n-프로필 또는 n-부틸에 의해서만 분리된 총 2개의 올레핀을 가지며,
    선택적으로 각각의 지질 테일은 헤드 기의 산소에 결합된 아실 기를 추가로 포함하여 에스테르를 형성하고, 아실 기를 포함하여 총 16개 또는 18개의 탄소 원자를 가지는, 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    a. 헤드 기의 디알킬 아미노 부분은 화학식 (IV-A)의 화학 구조를 가지며:

    화학식 IV-A,
    여기서
    화학식(IV-A)에서 n은 1, 2, 3, 또는 4이고; 그리고
    화학식 (IV-A)에서 R10 및 R12는 메틸, 에틸 및 프로필로 이루어진 군으로부터 선택된 알킬 기으로부터 각각 독립적으로 선택되며, 여기서 R10 및 R12의 알킬은 하나 이상의 하이드록실로 선택적으로 치환되고; 그리고
    b. 이온화 가능한 지질은 화학식 (IV-A)의 디알킬 아미노 부분에 대해 원위에 헤드 기의 일부에 공유 결합된 각각의 지질 테일의 아실기를 포함하는 화학 구조 를 추가로 포함하고, 여기서 는 헤드 기 내부에서 화학식 IV-A에 대한 부착을 나타내고, R22는 상기 아실기에 공유 결합되고 화학식 A의 화학 구조를 가지는 각각의 지질 테일의 일부분을 나타내고:

    화학식 A
    여기서 화학식 A에서 는 각각의 지질 테일 내부에서 R22에 대한 화학식 A의 부착을 나타내고; 그리고
    a는 4, 1, 2, 또는 3이고;
    b는 4, 2, 또는 3이고; 그리고
    c는 4, 3, 5, 6, 또는 7이고,
    단, a, b 및 c의 합은 화학식 A에서 12, 10, 11 또는 13이고,
    선택적으로 화학식(IV-A)에서 R10 및 R12는 각각 독립적으로 메틸, 에틸, -(CH2)(CH2)OH, 또는 -(CH2)2(CH2)OH이고, 그리고
    선택적으로 여기서 b는 4이고 화학식 (IV-A)에서 R10 및 R12는 각각 메틸인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (I-A)의 화학 구조를 가지며,


    화학식 I-A
    여기서
    a는 4, 1, 2, 3, 5 또는 6이고;
    b는 4, 3 또는 2이고;
    c는 4, 3, 5, 6 또는 7이고; 그리고
    a, b 및 c의 합은 12 또는 10이고;
    q는 1, 2, 3 또는 4이고; 그리고
    R10및 R12 각각은 독립적으로 하나 이상의 하이드록실로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이고; 그리고
    L은 이고,
    여기서 v는 0 또는 1이고; q2는 2 또는 1이고,
    선택적으로 여기서 v는 0이고 q는 1, 2 또는 3인, 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 이온화 가능한 지질은 AKG-UO-1, AKG-UO-1A, AKG-UO-1B, AKG-UO-2, AKG-UO-4, AKG-UO-4A, AKG-UO-5, AKG-UO-6, AKG-UO-7, AKG-UO-8, AKG-UO-9 및 AKG-UO-10:



    로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  6. 다음을 포함하는 조성물:
    a. 핵산, 선택적으로 mRNA인 핵산;
    b. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 이온화 가능한 지질;
    c. 스테롤, 선택적으로 콜레스테롤인 스테롤;
    d. 포스파티딜세린(PS) 지질을 포함하는 하나 이상의 인지질, 선택적으로 하나 이상의 인지질은 (i) DSPC, DPPC 및 DOPC로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인지질, 및 (ii) DPPS, DSPS 및 DOPS로 이루어진 군으로부터 선택되는 PS 지질로 이루어지고; 및
    e. 선택적으로 접합된 지질을 추가로 포함함.
  7. 제6항에 있어서, 하나 이상의 인지질은 다음으로 이루어지고:
    a. DSPS; 및
    b. (L-세린)DPPS 및 (L-세린)DPS로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 PS 지질,
    여기서 선택적으로 조성물은 PS 지질을 조성물 내 총 지질의 2.5-10 mol%의 총량으로 포함하고,
    선택적으로 접합된 지질은 PEG를 포함하는, 조성물.
  8. 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물로서:
    a. 핵산;
    b. LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65mol% 총량의 이온화 가능한 양이온성 지질;
    c. LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-45mol% 총량의 스테롤;
    d. LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol%의 인지질 총량이고 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10mol% 총량의 포스파티딜세린(PS)을 포함하는 하나 이상의 인지질을 포함하고; 및
    e. 선택적으로 LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5 - 2.5 mol% 총량의 접합된 지질을 추가로 포함하는 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 핵산은 mRNA이고,
    선택적으로 스테롤은 콜레스테롤이고,
    선택적으로 여기서 하나 이상의 인지질은 DSPC 및 L-세린 PS로 구성되는, 조성물.
  10. 제9항에 있어서, LNP 조성물은 PS를 조성물 내 총 지질의 5.0-7.5 mol%의 총량으로 포함하고,
    선택적으로 접합된 지질은 PEG를 포함하고,
    선택적으로 접합된 지질은 PEG-DMG이고,
    선택적으로 LNP 조성물은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5 내지 1.5mol%의 총량으로 접합된 지질을 포함하거나 LNP 조성물은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 1mol% 미만의 총량으로 접합된 지질을 포함하는, 조성물.
  11. 제8항에 있어서,
    a. 핵산은 mRNA이고,
    b. 이온화 가능한 양이온성 지질은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 45-55mol% 총량이고;
    c. 스테롤은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 35-45mol% 총량의 콜레스테롤이고;
    d. 인지질 총량은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 7-15mol%이고;
    e. 하나 이상의 인지질은 DSPC로 구성되고 PS 지질은 DPPS 및 DSPS의 L-세린 구조로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 지질이고; 및
    f. PS 지질의 총량은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 3-9mol%인, 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 조성물은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 1.25 mol%, 2.5 mol%, 5 mol%, 7.5 mol% 및 10 mol%로부터 선택된 총량의 PS 지질을 포함하는, 조성물.
  13. 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물로서:
    a. 핵산, 여기서 핵산은 mRNA이고;
    b. LNP 조성물의 총 지질 함량의 45-55 mol% 총량의 이온화 가능한 양이온성 지질;
    c. 스테롤, 여기서 스테롤은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 35-45mol% 총량의 콜레스테롤이고;
    d. 하나 이상의 인지질, 여기서 하나 이상의 인지질은 LNP 조성물의 총 지질 함량의 10 mol%의 인지질 총량이고, LNP 조성물의 총 지질 함량의 3-9 mol% 총량의 포스파티딜세린(PS)을 포함하고; 및
    e. LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5 - 1.5 mol% 총량의 접합된 지질을 포함하고,
    선택적으로 (i) PS 지질은 DSPS (L-이성질체), DPPS (L-이성질체), DMPS (L-이성질체), DOPS (L-이성질체), DSPS (D-이성질체), DSPG, DPPG, N-Glu-DSPE, 및 N-Suc-DSPE로 이루어진 군으로부터 선택되고, 선택적으로 접합된 지질은 PEG-DMG이고; 그리고 PS 지질은 DSPS(L-이성질체) 및 DPPS로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
    (ii) 이온화 가능한 양이온성 지질은 화합물 1-28 (표 1), 화합물 29-38 (표 2), AKG-UO-1, AKG-UO-1A, AKG-UO-1B, AKG-UO-1B, AKG-UO-2, AKG-UO-3, AKG-UO-4, AKG-UO-4A, AKG-UO-5, AKG-BDG-01, AKG-BDG-02, AKG-UO-6, AKG-UO-7, AKG-UO-8, AKG-UO-9, 및 AKG-UO-10으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물이거나,
    (iii) 이온화 가능한 양이온성 지질은 화합물 1-3, 5-8, 9-12, 14-28로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물이거나, 또는
    (iv) 이온화 가능한 양이온성 지질은 화합물 29-38로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물인, 조성물.
  14. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 이온화 가능한 양이온성 지질은 KC2-OA, KC3-OA, Dlin-KC2-DMA, DlinKC3-DMA, KC2-PA, DODAP, AKG-OA-DM2, AKG-OA-DM3, O-11769, Dlin-MC3-DMA, ALC-0315 및 SM-102로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물인, 조성물.
  15. 제8항에 있어서, LNP 조성물은:
    a. 핵산;
    b. LNP 조성물의 총 지질 함량의 50mol% 총량의 이온화 가능한 양이온성 지질;
    c. LNP 조성물의 총 지질 함량의 38.5mol% 총량의 콜레스테롤;
    d. LNP 조성물의 총 지질 함량의 7-15 mol%의 총량으로 존재하고 LNP 조성물의 총 지질 함량의 3-9 mol%의 총량의 포스파티딜세린(PS) 지질을 포함하는 하나 이상의 인지질, 선택적으로 여기서 인지질은 DSPC, DPPC 및 DOPC로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인지질로 이루어지며, 선택적으로 PS 지질은 DPPS 및 DSPS로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 L-세린 지질이고; 및
    e. LNP 조성물의 총 지질 함량의 0.5-1.5mol% 총량의 PEG 함유 지질을 포함하고; 또는
    여기서 LNP 조성물은 아실 사슬 길이가 일치하지 않는 적어도 2개의 (L-세린) PS 지질을 포함하는 하나 이상의 인지질을 포함하고, 선택적으로 PS 지질은 DPPC 및 DSPS이고, 선택적으로 DPPC 및 DSPS는 각각 LNP 조성물의 총 지질 함량을 기준으로 5 mol%의 총량으로 각각 LNP에 존재하는, 조성물.
  16. 다음을 포함하는 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물:
    a. 핵산, 이온화 가능한 양이온성 지질 AKG-UO-1, 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 (L-세린) PS 지질, 선택적으로 핵산은 mRNA이고, PS 지질은 (L-세린) DSPS, (L-세린) DPPS, 또는 이들의 혼합물이고, LNP 조성물은 콜레스테롤 및 DSPC, DPPC 및 DOPC로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 인지질을 추가로 포함하고, 그리고 선택적으로 LNP 조성물은 LNP 조성물 내 총 지질 함량을 기준으로 0.5-1.5 mol%의 PEG-DMG 또는 PEG-DSG를 추가로 포함하거나; 또는
    b. 핵산, KC2OA, KC2, KC2-01, ALC0315 및 SM102로부터 선택되는 이온화 가능한 양이온성 지질; 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 (L-세린) PS 지질, 선택적으로 LNP 조성물은 N/P 비율이 3 내지 8이고, 선택적으로 LNP 조성물은 N/P 비율이 5 내지 7이며, 선택적으로 LNP 조성물은 N/P 비율이 6이고, 선택적으로 이온화 가능한 양이온성 지질은 KC2OA, KC2, KC2-01, ALC0315, 또는 SM102임.
  17. 핵산 지질 나노입자(LNP) 조성물로서, 핵산, AKG-UO-6 및 AKG-UO-7에서 선택된 이온화 가능한 양이온성 지질; 및 LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5 내지 10 mol% 총량의 (L-세린) PS 지질을 포함하고, 선택적으로 LNP 조성물은 N/P 비율이 3 내지 8이고, 선택적으로 LNP 조성물은 N/P 비율이 5 내지 7이고, 선택적으로 LNP 조성물은 N/P 비율이 5이며, 선택적으로 LNP 조성물은 N/P 비율이 7인, 조성물.
  18. 제8항 내지 제13항 및 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 인코딩하는 mRNA인, 조성물.
  19. 핵산 지질 나노입자(LNP) 백신 조성물로서, 여기서 LNP 백신 조성물은:
    a. N/P 비율이 3 내지 8인 mRNA 핵산;
    b. LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65mol% 총량의 이온화 가능한 양이온성 지질 ALC-0315;
    c. LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-40mol% 총량의 콜레스테롤;
    d. LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10mol% 총량의 (L-세린) PS 지질;
    e. LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 DSPC 인지질; 및
    f. LNP 조성물의 총 지질 함량의 0-2.5mol% 총량의 PEG-DMG를 포함하거나; 또는
    LNP 백신 조성물은:
    a. N/P 비율이 3 내지 8인 mRNA 핵산;
    b. LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65mol% 총량의 이온화 가능한 양이온성 지질 Dlin-KC2-DMA;
    c. LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-40mol% 총량의 콜레스테롤;
    d. LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10mol% 총량의 (L-세린) PS 지질;
    e. LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 DSPC 인지질; 및
    f. LNP 조성물의 총 지질 함량의 0-2.5mol% 총량의 PEG-DMG을 포함하는, 조성물.
  20. 핵산 지질 나노입자(LNP) 백신 조성물로서:
    a. N/P 비율이 3 내지 8인 mRNA 핵산;
    b. LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65 mol% 총량의 이온화 가능한 양이온성 지질 KC3-OA;
    c. LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-40mol% 총량의 콜레스테롤;
    d. LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10mol% 총량의 (L-세린) PS 지질;
    e. LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 DSPC 인지질; 및
    f. LNP 조성물의 총 지질 함량의 0-2.5mol% 총량의 PEG-DMG을 포함하는, 조성물.
  21. 핵산 지질 나노입자(LNP) 백신 조성물로서:
    a. N/P 비율이 3 내지 8인 mRNA 핵산;
    b. LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65mol% 총량의 이온화 가능한 양이온성 지질;
    c. LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-40mol% 총량의 콜레스테롤;
    d. LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10mol% 총량의 (L-세린) PS 지질;
    e. LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 DSPC 인지질; 및
    f. LNP 조성물의 총 지질 함량의 0-2.5mol% 총량의 PEG-DMG을 포함하고,
    선택적으로 핵산은 서열번호 2의 mRNA인, 조성물.
  22. LNP를 수지상 세포에 대해 표적화하기 위한 LNP 조성물 내 총 지질 함량의 2.5-10 mol% 총량의 LNP 내 (L-세린) PS 지질의 용도.
  23. 제22항에 있어서, LNP는 mRNA를 포함하고, 선택적으로 LNP는 콜레스테롤을 추가로 포함하고, 선택적으로 LNP는 이온화 가능한 양이온성 지질(ICL)을 추가로 포함하고, 선택적으로 LNP는 DSPC를 포함하는 하나 이상의 추가 인지질을 추가로 포함하고, 선택적으로 LNP는 접합된 지질을 추가로 포함하는, 용도.
  24. 제23항에 있어서, LNP는:
    a. N/P 비율이 3 내지 8인 mRNA 핵산;
    b. LNP 조성물의 총 지질 함량의 40-65mol% 총량의 이온화 가능한 양이온성 지질(ICL);
    c. LNP 조성물의 총 지질 함량의 25-40mol% 총량의 콜레스테롤;
    d. LNP 조성물의 총 지질 함량의 2.5-10mol% 총량의 (L-세린) PS 지질;
    e. LNP 조성물의 총 지질 함량의 5-25mol% 총량의 DSPC 인지질; 및
    f. LNP 조성물의 총 지질 함량의 0-2.5mol% 총량의 접합된 지질을 포함하고,
    선택적으로 ICL은 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 화합물로부터 선택되는, 용도.
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