JP2023502576A - イオン化可能な脂質およびそれらのナノ粒子組成物 - Google Patents

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Abstract

本明細書で提供されるのは、式（Ｉ）によって表されるイオン化可能な脂質、またはその薬学的に許容される塩であり、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、ｍ、およびｎは、本明細書で定義されている通りである。また本明細書で提供されるのは、本発明のイオン化可能な脂質およびカプシド不含非ウイルスベクター（例えば、ｃｅＤＮＡ）を含む、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物である。これらのＬＮＰは、カプシド不含非ウイルスＤＮＡベクターを目的の標的部位（例えば、細胞、組織、器官など）に送達するように使用され得る。JPEG2023502576000060.jpg3653

Description

関連出願
この出願は、２０１９年１１月２２日に出願された米国仮出願第６２／９３９，３２６号および２０２０年５月１８日に出願された米国仮出願第６３／０２６，４９３号の優先権の利益を主張し、それぞれの内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
遺伝子療法は、異常な遺伝子発現プロファイルによって引き起こされる遺伝性障害または後天性疾患のいずれかに罹患している患者についての臨床成績を向上することを目的とする。疾患を治療するための薬剤として治療用核酸を患者の細胞に送達する様々な種類の遺伝子療法がこれまでに開発されてきた。
患者の標的細胞への修復遺伝子の導入および発現は、操作されたウイルス遺伝子送達ベクター、および潜在的にプラスミド、ミニ遺伝子、オリゴヌクレオチド、ミニサークル、または様々な閉端ＤＮＡの使用を含む、多くの方法を介して実行され得る。利用可能な多くのウイルス由来ベクター（例えば、組換えレトロウイルス、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルスなど）の中で、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、遺伝子療法において汎用的、かつ比較的安全なベクターとして受け入れられている。しかしながら、アデノ随伴ベクターなどのウイルスベクターは、免疫原性が高く、特に再投与に関して有効性を損なう可能性のある体液性免疫および細胞性免疫を誘発し得る。
非ウイルス遺伝子送達は、ウイルス形質導入に関連する特定の不利な点、特にベクター粒子を形成するウイルス構造タンパク質に対する体液性および細胞性免疫応答、ならびに任意の新規ウイルス遺伝子発現に起因する不利な点を回避する。非ウイルス遺伝子送達技術の中には、担体としてのカチオン性脂質の使用がある。
イオン化可能な脂質は、大まかにアミン部分と脂質部分とで構成され、カチオン性アミン部分とポリアニオン核酸とが静電的に相互作用して、正に帯電したリポソームまたは脂質膜構造を形成する。したがって、細胞への取り込みが促進され、核酸が細胞に送達される。
広く使用されているイオン化可能な脂質には、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ（ＤＯＤＡＰとも呼ばれる）、およびＤＯＴＡＰなどのカチオン性脂質がある。注目すべきことに、これらの脂質は肝臓へのｓｉＲＮＡ送達に使用されてきたが、高用量での肝臓毒性とともに、最適でない送達効率に悩まされている。現在のカチオン性脂質の欠点を考慮して、毒性の低減とともに効力の増強を示すだけでなく、薬物動態ならびに細胞取り込みおよび脂質担体からの核酸放出などの細胞内動態を改善する脂質足場を提供する必要がある。
本明細書で提供されるのは、式（Ｉ）：
Figure 2023502576000002
 で表されるイオン化可能な脂質、またはその薬学的に許容される塩であり、式中、
Ｒ１およびＲ１’は、それぞれ独立して、任意に置換された直鎖または分枝鎖Ｃ１～３アルキレンであり、
Ｒ２およびＲ２’は、それぞれ独立して、任意に置換された直鎖または分枝鎖Ｃ１～６アルキレンであり、
Ｒ３およびＲ３’は、それぞれ独立して、任意に置換された直鎖または分枝鎖Ｃ１～６アルキルであるか、
あるいは、Ｒ２が任意に置換された分枝鎖Ｃ１～６アルキレンである場合、Ｒ２およびＲ３は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成するか、
あるいは、Ｒ２’が任意に置換された分枝鎖Ｃ１～６アルキレンである場合、Ｒ２’およびＲ３’は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成し、
Ｒ４およびＲ４’は、それぞれ独立して、－ＣＲａ、－Ｃ（Ｒａ）２ＣＲａ、または－［Ｃ（Ｒａ）２］２ＣＲａであり、
Ｒａは、各出現に対して、独立してＨまたはＣ１～３アルキルであるか、
あるいは、Ｒ４が－Ｃ（Ｒａ）２ＣＲａ、または－［Ｃ（Ｒａ）２］２ＣＲａである場合、かつＲａがＣ１～３アルキルである場合、Ｒ３およびＲ４は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成するか、
あるいは、Ｒ４’が－Ｃ（Ｒａ）２ＣＲａ、または－［Ｃ（Ｒａ）２］２ＣＲａである場合、かつＲａがＣ１～３アルキルである場合、Ｒ３’およびＲ４’は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成し、
Ｒ５およびＲ５’は、それぞれ独立して、Ｃ１～２０アルキレンまたはＣ２～２０アルケニレンであり、
Ｒ６およびＲ６’は、各出現に対して、独立してＣ１～２０アルキレン、Ｃ３～２０シクロアルキレン、またはＣ２～２０アルケニレンであり、
ｍおよびｎは、それぞれ独立して、１、２、３、４、および５から選択される整数である。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ２およびＲ２’は、それぞれ独立してＣ１～３アルキレンである。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ１またはＲ１’によって表される直鎖または分枝鎖Ｃ１～３アルキレン、Ｒ２またはＲ２’によって表される直鎖または分枝鎖Ｃ１～６アルキレン、および任意に置換された直鎖または分枝鎖Ｃ１～６アルキルは、それぞれ任意に、１つ以上のハロおよびシアノ基で置換されている。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、一緒になったＲ１およびＲ２は、Ｃ１～３アルキレンであり、一緒になったＲ１’およびＲ２’は、Ｃ１～３アルキレン、例えば、エチレンである。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ３およびＲ３’は、それぞれ独立して、任意に置換されたＣ１～３アルキル、例えば、メチルである。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ４およびＲ４’はそれぞれ－ＣＨである。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ２は、任意に置換された分枝鎖Ｃ１～６アルキレンであり、Ｒ２およびＲ３は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、５員または６員のヘテロシクリルを形成する。本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ２’は、任意に置換された分枝鎖Ｃ１～６アルキレンである。Ｒ２’およびＲ３’は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、ピロリジニルまたはピペリジニルなどの５員または６員のヘテロシクリルを形成する。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ４は、－Ｃ（Ｒａ）２ＣＲａ、または－［Ｃ（Ｒａ）２］２ＣＲａであり、Ｒａは、Ｃ１～３アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、５員または６員のヘテロシクリルを形成する。本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ４’は、－Ｃ（Ｒａ）２ＣＲａ、または－［Ｃ（Ｒａ）２］２ＣＲａであり、Ｒａは、Ｃ１～３アルキルであり、Ｒ３’およびＲ４’は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、ピロリジニルまたはピペリジニルなどの５員または６員のヘテロシクリルを形成する。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ５およびＲ５’は、それぞれ独立して、Ｃ１～１０アルキレンまたはＣ２～１０アルケニレンである。一実施形態では、Ｒ５およびＲ５’は、それぞれ独立して、Ｃ１～８アルキレンまたはＣ１～６アルキレンである。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ６およびＲ６’は、各出現に対して、独立して、Ｃ１～１０アルキレン、Ｃ３～１０シクロアルキレン、またはＣ２～１０アルケニレンである。一実施形態では、Ｃ１～６アルキレン、Ｃ３～６シクロアルキレン、またはＣ２～６アルケニレンである。一実施形態では、Ｃ３～１０シクロアルキレンまたはＣ３～６シクロアルキレンは、シクロプロピレンである。本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ｍおよびｎは、それぞれ３である。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、イオン化可能な脂質は、表１の脂質のうちのいずれか１つまたはその薬学的に許容される塩から選択される。
本開示の別の態様は、本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかを含む式（Ｉ）のイオン化可能な脂質と、核酸と、を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に関する。一実施形態では、核酸はイオン化可能な脂質に封入されている。特定の実施形態では、核酸は、閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）である。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、ステロールをさらに含む。いくつかの実施形態によれば、ステロールはコレステロールまたはベータシトステロールであり得る。
いくつかの実施形態によれば、コレステロールは、約２０％～約４０％、例えば約２０％～約３５％、約２０％～約３０％、約２０％～約２５％、約２５％～約３５％、約２５％～約３０％または約３０％～約３５％のモルパーセンテージで存在し、イオン化可能な脂質は、約８０％～約６０％、例えば約８０％～約６５％、約８０％～約７０％、約８０％～約７５％、約７５％～約６０％、約７５％～約６５％、約７５％～約７０％、約７０％～約６０％または約７０％～約６０％のモルパーセンテージで存在する。いくつかの実施形態によれば、コレステロールは、約２０％～約４０％、例えば約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％または約４０％のモルパーセンテージで存在し、イオン化可能な脂質は、約８０％～約６０％、例えば約８０％、約７９％、約７８％、約７７％、約７６％、約７５％、約７４％、約７３％、約７２％、約７１％、約７０％、約６９％、約６８％、約６７％、約６６％、約６５％、約６４％＜約６３％、約６２％、約６１％または約６０％のモルパーセンテージで存在する。いくつかの実施形態によれば、コレステロールは、約４０％のモルパーセンテージで存在し、イオン化可能な脂質は、約５０％のモルパーセンテージで存在する。本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、組成物は、コレステロール、ＰＥＧまたはＰＥＧ－脂質コンジュゲート、および非カチオン性脂質をさらに含む。いくつかの実施形態によれば、ＰＥＧまたはＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、約１．５％～約３％、例えば約１．５％～約２．７５％、約１．５％～約２．５％、約１．５％～約２．２５％、約１．５％～約２％、約２％～約３％、約２％～約２．７５％、約２％～約２．５％、約２％～約２．２５％、約２．２５％～約３％、約２．２５％～約２．７５％または約２．２５％～約２．５％で存在する。いくつかの実施形態によれば、ＰＥＧまたはＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、約２％、約２．１％、約２．２％、約２．３％、約２．４％、約２．５％、約２．６％、約２．７％、約２．８％、約２．９％または約３％で存在する。いくつかの実施形態によれば、コレステロールは、約３０％～約５０％、例えば約３０％～約４５％、約３０％～約４０％、約３０％～約３５％、約３５％～約５０％、約３５％～約４５％、約３５％～約４０％、約２０％～約４０％、約４０％～約５０％、または約４５％～約５０％のモルパーセンテージで存在する。いくつかの実施形態によれば、コレステロールは、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％または約５０％のモルパーセンテージで存在する。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をさらに含む。いくつかの実施形態によれば、ＰＥＧは、１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧまたはＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）である。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、非カチオン性脂質をさらに含む。いくつかの実施形態によれば、非カチオン性脂質は、ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－モノメチルＰＥなど）、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－ジメチルＰＥなど）、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２－ジフィタノイル（ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌ）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＨｙＰＥ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リソレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジカシド、セレブロシド、ジセチルホスフェート、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、またはそれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、非カチオン性脂質は、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、およびジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態によれば、ＰＥＧまたはＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、約１．５％～約４％、例えば約１．５％～約３％、約２％～約３％、約２．５％～約３％、約１．５％～約２．７５％、約１．５％～約２．５％、約１．５％～約２．２５％、約１．５％～約２％、約１．５％～約１．７５％、約２％～約３％、約２％～約２．７５％、約２％～約２．５％、約２％～約２．２５％で存在する。いくつかの実施形態によれば、ＰＥＧまたはＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、約２％、約２．１％、約２．２％、約２．３％、約２．４％、約２．５％、約２．６％、約２．７％、約２．８％、約２．９％または約３％で存在する。いくつかの実施形態によれば、イオン化可能な脂質は、約４２．５％～約６２．５％のモルパーセンテージで存在する。いくつかの実施形態によれば、イオン化可能な脂質は、約４２．５％、約４３％、約４３．５％、約４４％、約４４．５％、約４５％、約４５．５％、約４６％、約４６．５％、４７．５％、約４８％、約４８．５％、約４９％、約４９．５％、約５０％、約５０．５％、約５１％、約５１．５％、約４７％約５２％、約５２．５％、約５３％、約５３．５％、約５４％、約５４．５％、約５５％、約５５．５％、約５６％、約５６．５％、約５７％、５７．５％、約５８％、約５８．５％、約５９％、約５９．５％、約６０％、約６０．５％、約６１％、約６１．５％、約６２％または約６２．５％のモルパーセンテージで存在する。本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、非カチオン性脂質は、約２．５％～約１２．５％のモルパーセンテージで存在する。本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、コレステロールは、約４０％のモルパーセンテージで存在し、イオン化可能な脂質は、約５２．５％のモルパーセンテージで存在し、非カチオン性脂質は、約７．５％のモルパーセンテージで存在し、ＰＥＧは、約３％で存在する。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰ組成物は、パルミチン酸デキサメタゾンをさらに含む。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、直径が約５０ｎｍ～約１１０ｎｍ、例えば約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０ｎｍ～約９５ｎｍ、約５０ｎｍ～約９０ｎｍ、約５０ｎｍ～約８５ｎｍ、約５０ｎｍ～約８０ｎｍ、約５０ｎｍ～約７５ｎｍ、約５０ｎｍ～約７０ｎｍ、約５０ｎｍ～約６５ｎｍ、約５０ｎｍ～約６０ｎｍ、約５０ｎｍ～約５５ｎｍ、約６０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１００ｎｍ、約６０ｎｍ～約９５ｎｍ、約６０ｎｍ～約９０ｎｍ、約６０ｎｍ～約８５ｎｍ、約６０ｎｍ～約８０ｎｍ、約６０ｎｍ～約７５ｎｍ、約６０ｎｍ～約７０ｎｍ、約６０ｎｍ～約６５ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０ｎｍ～約９５ｎｍ、約７０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８５ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、約７０ｎｍ～約７５ｎｍ、約８０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約９５ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約８５ｎｍ、約９０ｎｍ～約１１０ｎｍ、または約９０ｎｍ～約１００ｎｍの範囲のサイズにある。本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、サイズが約１００ｎｍ未満、例えばサイズが約１０５ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約９５ｎｍ未満、約９０ｎｍ未満、約８５ｎｍ未満、約８０ｎｍ未満、約７５ｎｍ未満、約７０ｎｍ未満、約６５ｎｍ未満、約６０ｎｍ未満、約５５ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、約４５ｎｍ未満、約４０ｎｍ未満、約３５ｎｍ未満、約３０ｎｍ未満、約２５ｎｍ未満、約２０ｎｍ未満、約１５ｎｍ未満または約１０ｎｍ未満である。いくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、サイズが約７０ｎｍ未満、例えばサイズが約６５ｎｍ未満、約６０ｎｍ未満、約５５ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、約４５ｎｍ未満、約４０ｎｍ未満、約３５ｎｍ未満、約３０ｎｍ未満、約２５ｎｍ未満、約２０ｎｍ未満、約１５ｎｍ未満または約１０ｎｍ未満である。いくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、サイズが約６０ｎｍ未満、例えばサイズが約５５ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、約４５ｎｍ未満、約４０ｎｍ未満、約３５ｎｍ未満、約３０ｎｍ未満、約２５ｎｍ未満、約２０ｎｍ未満、約１５ｎｍ未満または約１０ｎｍ未満である。本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰ組成物は、約１０：１の全脂質対核酸比を有する。本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰ組成物は、約２０：１の全脂質対核酸比を有する。本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、組成物は、約３０：１の全脂質対核酸比を有する。本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、組成物は、約４０：１の全脂質対核酸比を有する。本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、組成物は、約５０：１の全脂質対核酸比を有する。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、組織標的化部分をさらに含む。組織標的化部分は、がん、肝臓、ＣＮＳ、または筋肉などの１つ以上の特定の組織へのＬＮＰの送達に使用できるペプチド、オリゴ糖などであることができる。いくつかの実施形態によれば、組織標的化部分は、肝臓特異的受容体のリガンドである。一実施形態によれば、肝臓標的化に使用される肝臓特異的受容体のリガンドは、ＬＮＰの成分、例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートなどに共有結合しているＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）などのオリゴ糖である。いくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃは、例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートに共有結合している。いくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃは、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００にコンジュゲートしている。いくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、全脂質の１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１．０％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、または０．１％のモルパーセンテージで脂質ナノ粒子中に存在する。いくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、全脂質の０．２％のモルパーセンテージでＬＮＰ中に存在する。いくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、全脂質の０．３％のモルパーセンテージでＬＮＰ中に存在する。いくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、全脂質の０．４％のモルパーセンテージでＬＮＰ中に存在する。いくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、全脂質の０．５％のモルパーセンテージでＬＮＰ中に存在する。いくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、全脂質の０．６％のモルパーセンテージでＬＮＰ中に存在する。いくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、全脂質の０．７％のモルパーセンテージでＬＮＰ中に存在する。いくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、全脂質の０．８％のモルパーセンテージでＬＮＰ中に存在する。いくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、全脂質の０．９％のモルパーセンテージでＬＮＰ中に存在する。いくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、全脂質の１．０％のモルパーセンテージでＬＮＰ中に存在する。いくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、全脂質の約１．５％のモルパーセンテージでＬＮＰ中に存在する。いくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、全脂質の２．０％のモルパーセンテージでＬＮＰ中に存在する。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰ組成物は、リンゴ酸などの緩衝液中で調製される。いくつかの実施形態では、組成物は、約１０ｍＭ～約３０ｍＭのリンゴ酸、例えば、約１０ｍＭ～約２５ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５ｍＭ、約１５ｍＭ～約２５ｍＭ、約１５ｍＭ～約２０ｍＭ、約２０ｍＭ～約２５ｍＭで調製される。本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、組成物は、約１０ｍＭのリンゴ酸、約１１ｍＭのリンゴ酸、約１２ｍＭのリンゴ酸、約１３ｍＭのリンゴ酸、約１４ｍＭのリンゴ酸、約１５ｍＭのリンゴ酸、約１６ｍＭのリンゴ酸、約１７ｍＭのリンゴ酸、約１８ｍＭのリンゴ酸、約１９ｍＭのリンゴ酸、約２０ｍＭのリンゴ酸、２１ｍＭのリンゴ酸、約２２ｍＭのリンゴ酸、約２３ｍＭのリンゴ酸、約２４ｍＭのリンゴ酸、約２５ｍＭのリンゴ酸、約２６ｍＭのリンゴ酸、約２７ｍＭのリンゴ酸、約２８ｍＭのリンゴ酸、約２９ｍＭのリンゴ酸、または約３０ｍＭのリンゴ酸で調製される。いくつかの実施形態によれば、組成物は、約２０ｍＭのリンゴ酸を含む。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰ組成物は、約３０ｍＭ～約５０ｍＭのＮａＣｌ、例えば約３０ｍＭ～約４５ｍＭのＮａＣｌ、約３０ｍＭ～約４０ｍＭのＮａＣｌ、約３０ｍＭ～約３５ｍＭのＮａＣｌ、約３５ｍＭ～約４５ｍＭのＮａＣｌ、約３５ｍＭ～約４０ｍＭのＮａＣｌまたは約４０ｍＭ～約４５ｍＭのＮａＣｌを有する溶液で調製される。本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰ組成物は、約３０ｍＭのＮａＣｌ、約３５ｍＭのＮａＣｌ、約４０ｍＭのＮａＣｌまたは約４５ｍＭのＮａＣｌを有する溶液で調製される。いくつかの実施形態によれば、ＬＮＰ組成物は、約４０ｍＭのＮａＣｌを有する溶液で調製される。
いくつかの実施形態によれば、ＬＮＰ組成物は、約２０ｍＭ～約１００ｍＭのＭｇＣｌ２、例えば約２０ｍＭ～約９０ｍＭのＭｇＣｌ２、約２０ｍＭ～約８０ｍＭのＭｇＣｌ２、約２０ｍＭ～約７０ｍＭのＭｇＣｌ２、約２０ｍＭ～約６０ｍＭのＭｇＣｌ２、約２０ｍＭ～約５０ｍＭのＭｇＣｌ２、約２０ｍＭ～約４０ｍＭのＭｇＣｌ２、約２０ｍＭ～約３０ｍＭのＭｇＣｌ２、約３２０ｍＭ～約９０ｍＭのＭｇＣｌ２、約３０ｍＭ～約８０ｍＭのＭｇＣｌ２、約３０ｍＭ～約７０ｍＭのＭｇＣｌ２、約３０ｍＭ～約６０ｍＭのＭｇＣｌ２、約３０ｍＭ～約５０ｍＭのＭｇＣｌ２、約３０ｍＭ～約４０ｍＭのＭｇＣｌ２、約４０ｍＭ～約９０ｍＭのＭｇＣｌ２、約４０ｍＭ～約８０ｍＭのＭｇＣｌ２、約４０ｍＭ～約７０ｍＭのＭｇＣｌ２、約４０ｍＭ～約６０ｍＭのＭｇＣｌ２、約４０ｍＭ～約５０ｍＭのＭｇＣｌ２、約５０ｍＭ～約９０ｍＭのＭｇＣｌ２、約５０ｍＭ～約８０ｍＭのＭｇＣｌ２、約５０ｍＭ～約７０ｍＭのＭｇＣｌ２、約５０ｍＭ～約６０ｍＭのＭｇＣｌ２、約６０ｍＭ～約９０ｍＭのＭｇＣｌ２、約６０ｍＭ～約８０ｍＭのＭｇＣｌ２、約６０ｍＭ～約７０ｍＭのＭｇＣｌ２、約７０ｍＭ～約９０ｍＭのＭｇＣｌ２、約７０ｍＭ～約８０ｍＭのＭｇＣｌ２、または約８０ｍＭ～約９０ｍＭのＭｇＣｌ２を有する溶液中で調製される。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡである。本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、プロモーター配列および導入遺伝子を含む発現カセットを含む。
いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ポリアデニル化配列を含む発現カセットを含む。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、当該発現カセットの５’または３’末端のいずれかに隣接する少なくとも１つの逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む。いくつかの実施形態によれば、発現カセットは、２つのＩＴＲに隣接し、２つのＩＴＲは、１つの５’ＩＴＲおよび１つの３’ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態によれば、発現カセットは、３’末端でＩＴＲ（３’ＩＴＲ）に連結される。いくつかの実施形態によれば、発現カセットは、５’末端でＩＴＲ（５’ＩＴＲ）に連結される。いくつかの実施形態によれば、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、野生型ＡＡＶ ＩＴＲである。いくつかの実施形態によれば、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、修飾型ＩＴＲである。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、５’ＩＴＲと発現カセットとの間にスペーサー配列をさらに含む。
いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、３’ＩＴＲと発現カセットとの間にスペーサー配列をさらに含む。いくつかの実施形態によれば、スペーサー配列は、長さが少なくとも５塩基対の長さである。いくつかの実施形態によれば、スペーサー配列は、長さが少なくとも５～１００塩基対の長さである。いくつかの実施形態によれば、スペーサー配列は、長さが５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００塩基対の長さである。いくつかの実施形態によれば、スペーサー配列は、長さが少なくとも５～５００塩基対の長さである。いくつかの実施形態によれば、スペーサー配列は、長さが５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０または４９５塩基対の長さである。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ニックまたはギャップを有する。
いくつかの実施形態によれば、ＩＴＲは、ＡＡＶ血清型に由来するＩＴＲであり、ガチョウウイルスのＩＴＲに由来し、Ｂ１９ウイルスＩＴＲに由来し、パルボウイルスからの野生型ＩＴＲである。いくつかの実施形態によれば、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１およびＡＡＶ１２を含む群から選択される。
いくつかの実施形態によれば、ＩＴＲは、変異体ＩＴＲであり、ｃｅＤＮＡは、第１のＩＴＲとは異なる追加のＩＴＲを任意に含む。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、発現カセットの５’および３’末端の両方に２つの変異体ＩＴＲを含み、任意に、２つの変異体ＩＴＲは、対称変異体である。本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ＣＥＬｉＤ、ＤＮＡベースのミニサークル、ＭＩＤＧＥ、ミニスタリング（ｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）ＤＮＡ、発現カセットの５’および３’末端にＩＴＲの２つのヘアピン構造を含むダンベル型の直鎖状二重鎖閉端ＤＮＡ、またはｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡである。本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
いくつかの態様によれば、本開示は、対象における遺伝性障害を治療する方法を提供し、この方法は、本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかによる有効量の薬学的組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態によれば、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、鎌状赤血球貧血症、メラノーマ、血友病Ａ（凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）欠損症）および血友病Ｂ（凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）欠損症）、嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ）、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬ受容体欠損症）、肝芽細胞腫、ウィルソン病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、先天性肝性ポルフィリン症、遺伝性肝代謝障害、レッシュナイハン症候群、鎌状赤血球貧血症、サラセミア、色素性乾皮症、ファンコニ貧血、網膜色素変性症、毛細血管拡張性運動失調症、ブルーム症候群、網膜芽細胞腫、ムコ多糖蓄積症（例えば、ハーラー症候群（ＭＰＳ Ｉ型）、シャイエ症候群（ＭＰＳ Ｉ Ｓ型）、ハーラー・シャイエ症候群（ＭＰＳ Ｉ Ｈ－Ｓ型）、ハンター症候群（ＭＰＳ ＩＩ型）、サンフィリッポＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤ型（ＭＰＳ ＩＩＩ Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ型）、モルキオＡおよびＢ型（ＭＰＳ ＩＶＡおよびＭＰＳ ＩＶＢ）、マロトーラミー症候群（ＭＰＳ ＶＩ型）、スライ症候群（ＭＰＳ ＶＩＩ型）、ヒアルロニダーゼ欠損症（ＭＰＳ ＩＸ型））、ニーマンピック病Ａ／Ｂ、Ｃ１およびＣ２型、ファブリー病、シンドラー病、ＧＭ２－ガングリオシドーシスＩＩ型（サンドホフ病）、テイ・サックス病、異染性白質ジストロフィー、クラッベ病、ムコリピドーシスＩ、ＩＩ／ＩＩＩおよびＩＶ型、シアリドーシスＩおよびＩＩ型、グリコーゲン蓄積症ＩおよびＩＩ型（ポンペ病）、ゴーシェ病Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型、ファブリー病、シスチン症、バッテン病、アスパルチルグルコサミン尿症、サラ病、ダノン病（ＬＡＭＰ－２欠損症）、リソソーム酸性リパーゼ（ＬＡＬ）欠損症、神経セロイドリポフスチン症（ＣＬＮ１－８、ＩＮＣＬ、およびＬＩＮＣＬ）、スフィンゴリピドーシス、ガラクトシアリドーシス、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症、フリードライヒ運動失調症、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、ジストロフィー表皮水疱症（ＤＥＢ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ１欠損症、乳児期の全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）、レーバー先天性黒内障、シュタルガルト黄斑ジストロフィー（ＡＢＣＡ４）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、アッシャー症候群、アルファ－１アンチトリプシン欠損症、進行性家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣ）Ｉ型（ＡＴＰ８Ｂ１欠損症）、ＩＩ型（ＡＢＣＢ１１）、ＩＩＩ型（ＡＢＣＢ４）、またはＩＶ型（ＴＪＰ２）、ならびにカテプシンＡ欠損症からなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）である。いくつかの実施形態によれば、ＬＣＡは、ＬＣＡ１０である。いくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、ニーマンピック病である。いくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、シュタルガルト黄斑ジストロフィーである。いくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）欠損症（グリコーゲン蓄積症Ｉ型）またはポンペ病（グリコーゲン蓄積症ＩＩ型）である。いくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、血友病Ａ（因子ＶＩＩＩ欠損症）である。いくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、血友病Ｂ（因子ＩＸ欠損症）である。いくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、ハンター症候群（ムコ多糖症ＩＩ型）である。いくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、嚢胞性線維症である。いくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、ジストロフィー表皮水疱症（ＤＥＢ）である。いくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）である。いくつかの実施形態によれば、遺伝的障害は、進行性家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣ）である。いくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、ウィルソン病である。いくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、ゴーシェ病Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ型である。
上記に簡単に要約され、以下により詳細に論じられる本開示の実施形態は、添付の図面に描かれた本開示の例示的な実施形態を参照することによって理解することができる。しかしながら、添付の図面は、本開示の典型的な実施形態のみを示し、したがって、本開示は他の等しく有効な実施形態を認めることができるため、範囲を限定するものとみなされるべきではない。
非対称ＩＴＲを含む、本明細書に開示される導入遺伝子の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。この実施形態では、例示的なｃｅＤＮＡベクターは、ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、およびＢＧＨｐＡを含有する発現カセットを含む。導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位（Ｒ３／Ｒ４）に挿入され得る。発現カセットは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）－発現カセットの上流（５’端）の野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲおよび下流（３’端）の修飾型ＩＴＲに隣接しており、したがって、発現カセットに隣接する２つのＩＴＲは、互いに対して非対称である。 ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、およびＢＧＨｐＡを含有する発現カセットを有する非対称ＩＴＲを含む、本明細書に開示される導入遺伝子の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位に挿入され得る。発現カセットは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）－発現カセットの上流（５’端）の修飾型ＩＴＲおよび下流（３’端）の野生型ＩＴＲに隣接している。 エンハンサー／プロモーター、導入遺伝子、転写後エレメント（ＷＰＲＥ）、およびポリＡシグナルを含有する発現カセットを有する非対称ＩＴＲを含む、本明細書に開示される導入遺伝子の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位への目的のタンパク質をコードする導入遺伝子、または治療用核酸の挿入を可能にする。発現カセットは、互いに対して非対称である２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）、発現カセットの上流（５’端）の修飾型ＩＴＲおよび下流（３’端）の修飾型ＩＴＲに隣接しており、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの両方は、修飾型ＩＴＲであるが、異なる修飾を有する（すなわち、同じ修飾を有しない）。 ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、およびＢＧＨｐＡを含有する発現カセットを有する、本明細書で定義される対称な修飾型ＩＴＲまたは実質的に対称な修飾型ＩＴＲを含む、本明細書に開示される導入遺伝子の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位に挿入される。発現カセットは、５’修飾型ＩＴＲおよび３’修飾型ＩＴＲが対称または実質的に対称である、２つの修飾型逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接している。 エンハンサー／プロモーター、導入遺伝子、転写後エレメント（ＷＰＲＥ）、およびポリＡシグナルを含有する発現カセットを有する、本明細書で定義される対称な修飾型ＩＴＲまたは実質的に対称の修飾型ＩＴＲを含む、本明細書に開示される導入遺伝子の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位への導入遺伝子の挿入を可能にする。発現カセットは、５’修飾型ＩＴＲおよび３’修飾型ＩＴＲが対称または実質的に対称である、２つの修飾型逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接している。 ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、およびＢＧＨｐＡを含有する発現カセットを有する、本明細書で定義される対称なＷＴ－ＩＴＲまたは実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲを含む、本明細書に開示される導入遺伝子の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位に挿入される。発現カセットは、５’ＷＴ－ＩＴＲおよび３’ＷＴ ＩＴＲが対称または実質的に対称である、２つの野生型逆位末端反復（ＷＴ－ＩＴＲ）に隣接している。 エンハンサー／プロモーター、導入遺伝子、転写後エレメント（ＷＰＲＥ）、およびポリＡシグナルを含有する発現カセットを有する、本明細書で定義される対称な修飾型ＩＴＲまたは実質的に対称な修飾型ＩＴＲを含む、本明細書に開示される導入遺伝子の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位への導入遺伝子の挿入を可能にする。発現カセットは、５’ＷＴ－ＩＴＲおよび３’ＷＴ ＩＴＲが対称または実質的に対称である、２つの野生型逆位末端反復（ＷＴ－ＩＴＲ）に隣接している。 Ａ－Ａ’アーム、Ｂ－Ｂ’アーム、Ｃ－Ｃ’アーム、２つのＲｅｐ結合部位（ＲＢＥおよびＲＢＥ’）の同定とともに野生型左ＩＴＲのＴ形ステムループ構造を提供し、末端分解部位（ｔｒｓ）も示す。ＲＢＥは、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８のいずれかと相互作用すると考えられる一連の４つの二重四量体を含有する。加えて、ＲＢＥ’はまた、構築物中の野生型ＩＴＲまたは変異型ＩＴＲ上で組み立てられたＲｅｐ複合体と相互作用すると考えられる。ＤおよびＤ’領域は、転写因子結合部位および他の保存構造を含有する。 Ａ－Ａ’アーム、Ｂ－Ｂ’アーム、Ｃ－Ｃ’アーム、２つのＲｅｐ結合部位（ＲＢＥおよびＲＢＥ’）の同定とともにＡＡＶ２の野生型左ＩＴＲのＴ形ステムループ構造を含む、野生型左ＩＴＲ中の提案されたＲｅｐ触媒ニッキングおよびライゲーション活性を示し、また末端分解部位（ｔｒｓ）、ならびにいくつかの転写因子結合部位を含むＤおよびＤ’領域ならびに他の保存構造も示す。 野生型左ＡＡＶ２ ＩＴＲのＡ－Ａ’アーム、ならびにＣ－Ｃ’およびＢ－Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の一次構造（ポリヌクレオチド配列）（左）ならびに二次構造（右）を提供する。 左ＩＴＲについての例示的な変異型ＩＴＲ（修飾型ＩＴＲとも称される）配列を示す。例示的な変異型左ＩＴＲ（ＩＴＲ－１、左）のＡ－Ａ’アーム、Ｃアーム、およびＢ－Ｂ’アームのＲＢＥ部分の一次構造（左）および予測された二次構造（右）が示される。 野生型右ＡＡＶ２ ＩＴＲのＡ－Ａ’ループ、ならびにＢ－Ｂ’およびＣ－Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の一次構造（左）ならびに二次構造（右）を示す。 例示的な右修飾型ＩＴＲを示す。例示的な変異体右ＩＴＲ（ＩＴＲ－１、右）のＡ－Ａ’アーム、ならびにＢ－Ｂ’およびＣアームのＲＢＥ含有部分の一次構造（左）および予測された二次構造（右）が示される。左および右のＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲまたは他のウイルス血清型または合成ＩＴＲ）の任意の組み合わせを、本明細書で教示されるように使用することができる。図３Ａ～３Ｄポリヌクレオチド配列の各々は、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡを産生するために使用されるプラスミドまたはバクミド／バキュロウイルスゲノム中で使用される配列を指す。プラスミドまたはバクミド／バキュロウイルスゲノム中のｃｅＤＮＡベクター構成および予測されたＧｉｂｂｓ自由エネルギー値から推定される対応するｃｅＤＮＡ二次構造もまた、図３Ａ～３Ｄの各々に含まれる。 図４Ｂの概略図に記載されるプロセスにおける、本明細書に開示される導入遺伝子の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの産生に有用である、バキュロウイルス感染した昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を作製するための上流プロセスを示す概略図である。 ｃｅＤＮＡの産生の例示的な方法の概略図である。 ｃｅＤＮＡベクターの産生を確認するための生化学的方法およびプロセスを示す。 図４ＢのｃｅＤＮＡ産生プロセス中に取得された細胞ペレットから採取されたＤＮＡ中のｃｅＤＮＡの存在を同定するためのプロセスを説明する概略図である。図４Ｄは、左が未切断であるか、または制限エンドヌクレアーゼで消化された後、未変性ゲルまたは変性ゲルのいずれかで電気泳動に供される例示的なｃｅＤＮＡの概略的予想バンドを示す。左端の概略図は、未変性ゲルであり、その二重鎖および未切断形態で、ｃｅＤＮＡが少なくとも単量体および二量体状態で存在し、より速く移動する小さい単量体および単量体のサイズの２倍である、より遅く移動する二量体として見えることを示唆する、多重バンドを示す。左から２番目の概略図は、ｃｅＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼで切断された場合、元のバンドが消え、切断後に残存する予想断片サイズに対応する、より速く移動する（例えば、より小さな）バンドが出現することを示す。変性条件下、元の二重鎖ＤＮＡは一本鎖であり、相補鎖が共有結合されるため、未変性ゲル上で観察されるものより２倍大きい種として移動する。したがって、右から２番目の概略図において、消化されたｃｅＤＮＡは、未変性ゲル上で観察されるものと同様のバンディング分布を示すが、バンドは、未変性ゲル対応物のサイズの２倍の断片として移動する。右端の概略図は、変性条件下の未切断のｃｅＤＮＡが、一本鎖開環として移動し、したがって観察されたバンドは、環が開いていない未変性条件下で観察されるもののサイズの２倍であることを示す。この図において、「ｋｂ」を使用して、文脈に応じて、ヌクレオチド鎖の長さ（例えば、変性状態で観察される単鎖分子の場合）または塩基対の数（例えば、未変性状態で観察される二本鎖分子の場合）に基づくヌクレオチド分子の相対サイズを示す。図４Ｅは、非連続的な構造を有するＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡは、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、中性条件および変性条件の両方において、異なるサイズ（１ｋｂおよび２ｋｂ）を有する２つのＤＮＡ断片を生成することができる。図４Ｅはまた、直鎖状かつ連続的な構造を有するｃｅＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡベクターは、制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、中性条件において１ｋｂおよび２ｋｂとして移動する２つのＤＮＡ断片を生成することができるが、変性条件では、鎖は、接続されたままであり、２ｋｂおよび４ｋｂとして移動する一本鎖を産生する。 図４ＢのｃｅＤＮＡ産生プロセス中に取得された細胞ペレットから採取されたＤＮＡ中のｃｅＤＮＡの存在を同定するためのプロセスを説明する概略図である。図４Ｄは、左が未切断であるか、または制限エンドヌクレアーゼで消化された後、未変性ゲルまたは変性ゲルのいずれかで電気泳動に供される例示的なｃｅＤＮＡの概略的予想バンドを示す。左端の概略図は、未変性ゲルであり、その二重鎖および未切断形態で、ｃｅＤＮＡが少なくとも単量体および二量体状態で存在し、より速く移動する小さい単量体および単量体のサイズの２倍である、より遅く移動する二量体として見えることを示唆する、多重バンドを示す。左から２番目の概略図は、ｃｅＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼで切断された場合、元のバンドが消え、切断後に残存する予想断片サイズに対応する、より速く移動する（例えば、より小さな）バンドが出現することを示す。変性条件下、元の二重鎖ＤＮＡは一本鎖であり、相補鎖が共有結合されるため、未変性ゲル上で観察されるものより２倍大きい種として移動する。したがって、右から２番目の概略図において、消化されたｃｅＤＮＡは、未変性ゲル上で観察されるものと同様のバンディング分布を示すが、バンドは、未変性ゲル対応物のサイズの２倍の断片として移動する。右端の概略図は、変性条件下の未切断のｃｅＤＮＡが、一本鎖開環として移動し、したがって観察されたバンドは、環が開いていない未変性条件下で観察されるもののサイズの２倍であることを示す。この図において、「ｋｂ」を使用して、文脈に応じて、ヌクレオチド鎖の長さ（例えば、変性状態で観察される単鎖分子の場合）または塩基対の数（例えば、未変性状態で観察される二本鎖分子の場合）に基づくヌクレオチド分子の相対サイズを示す。図４Ｅは、非連続的な構造を有するＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡは、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、中性条件および変性条件の両方において、異なるサイズ（１ｋｂおよび２ｋｂ）を有する２つのＤＮＡ断片を生成することができる。図４Ｅはまた、直鎖状かつ連続的な構造を有するｃｅＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡベクターは、制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、中性条件において１ｋｂおよび２ｋｂとして移動する２つのＤＮＡ断片を生成することができるが、変性条件では、鎖は、接続されたままであり、２ｋｂおよび４ｋｂとして移動する一本鎖を産生する。 ＬＮＰ３９（脂質３９：ＤＯＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ―ＰＥＧ２０００：ＤＳＰＥ―ＰＥＧ２０００のモルパーセンテージ比、５０．８：７．２：３８．６：２．９：０．４８）を網膜下注射（０．０４μｇ／μＬのＬＮＰ－ｃｅＤＮＡ製剤の２．５μＬ）した野生型Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（雄）の眼におけるインビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）の全光束（光子／秒）で測定されたルシフェラーゼ遺伝子を含有するｃｅＤＮＡ（すなわち、ｃｅＤＮＡ：Ｌｕｃに作動可能に連結されたＣＡＧプロモーター）の発現を示す。
本開示は、ウイルスまたは非ウイルスベクター（例えば、閉端ＤＮＡ）などの治療用核酸（ＴＮＡ）を送達するための脂質ベースのプラットフォームを提供し、これは、細胞の細胞質から核に移動して、高レベルの発現を維持することができる。例えば、ウイルスベクターベースの遺伝子療法に関連する免疫原性は、既存のバックグラウンド免疫のために治療できる患者の数を制限し、かつ各患者の有効レベルまで滴定するための、または長期にわたって効果を維持するため患者の再投与を妨げてきた。さらに、他の核酸モダリティは、免疫応答のカスケードを誘発する生来のＤＮＡまたはＲＮＡセンシングメカニズムのために免疫原性に大きく悩まされている。既存の免疫が欠如しているため、本明細書に記載するＴＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、必要に応じて、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｃｅＤＮＡなどのＴＮＡの追加用量を可能にし、組織成長に応じて後続の投与を必要とし得る小児集団を含める患者アクセスをさらに拡大させる。さらに、特に、１つ以上の三級アミノ基を含む脂質組成物、およびジスルフィド結合を含むＴＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、ＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）のより効率的な送達、より良好な忍容性および改善された安全性プロファイルを提供することが本開示の発見である。本明細書中に記載するＴＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、ウイルスカプシド内の空間によって課されるパッケージングの制約がないため、理論的には、ＴＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の唯一のサイズ制限は、宿主細胞の発現（例えば、ＤＮＡ複製、またはＲＮＡ翻訳）効率に存在する。
特に希少疾患における療法の開発における最大のハードルの１つは、多数の個々の病態である。地球上で約３億５０００万人が希少障害を抱えて生活しており、国立衛生研究所は、希少障害を、診断された人が２０万人未満の障害または病態と定義している。これらの希少障害の約８０％は遺伝的起源であり、それらの約９５％はＦＤＡによって承認された治療（ｒａｒｅｄｉｓｅａｓｅｓ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｉｓｅａｓｅｓ／ｐａｇｅｓ／３１／ｆａｑｓ－ａｂｏｕｔ－ｒａｒｅ－ｄｉｓｅａｓｅｓ）を有しない。本明細書に記載されるＴＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の利点の中には、ＴＮＡの特定のモダリティで治療することができる複数の疾患、特に多くの遺伝性障害または疾患の治療の現在の状態を有意義に変更することができる希少な単一遺伝子疾患に迅速に適応することができるアプローチを提供することにある。
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、１～２０個の炭素原子の飽和一価炭化水素ラジカル（すなわち、Ｃ１～２０アルキル）を指す。「一価」とは、アルキルが分子の残りの部分に１つの結合点を有していることを意味する。一実施形態では、アルキルは、１～１２個の炭素原子（すなわち、Ｃ１～１２アルキル）、または１～１０個の炭素原子（すなわち、Ｃ１～１０アルキル）を有する。一実施形態では、アルキルは、１～８個の炭素原子（すなわち、Ｃ１～８アルキル）、１～７個の炭素原子（すなわち、Ｃ１～７アルキル）、１～６個の炭素原子（すなわち、Ｃ１～６アルキル）、１～４個の炭素原子（すなわち、Ｃ１～４アルキル）、または１～３個の炭素原子（すなわち、Ｃ１～３アルキル）を有する。例としては、メチル、エチル、１－プロピル、２－プロピル、１－ブチル、２－メチル－１－プロピル、２－ブチル、２－メチル－２－プロピル、１－ペンチル、２－ペンチル、３－ペンチル、２－メチル－２－ブチル、３－メチル－２－ブチル、３－メチル－１－ブチル、２－メチル－１－ブチル、１－ヘキシル、２－ヘキシル、３－ヘキシル、２－メチル－２－ペンチル、３－メチル－２－ペンチル、４－メチル－２－ペンチル、３－メチル－３－ペンチル、２－メチル－３－ペンチル、２，３－ジメチル－２－ブチル、３，３－ジメチル－２－ブチル、１－ヘプチル、１－オクチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。「直鎖または分枝鎖Ｃ１～６アルキル」、「直鎖または分枝鎖Ｃ１～４アルキル」、もしくは「直鎖または分枝鎖Ｃ１～３アルキル」などの直鎖または分枝鎖アルキルは、飽和一価炭化水素ラジカルが直鎖または分枝鎖であることを意味する。
本明細書で使用される「アルキレン」という用語は、１～２０個の炭素原子の飽和二価炭化水素ラジカル（すなわち、Ｃ１～２０アルキレン）を指し、その例には、上に例示したようなアルキル基の同じコア構造を有するものが挙げられるが、それらに限定されない。「二価」とは、アルキレンが分子の残りの部分に２つの結合点を有していることを意味する。一実施形態では、アルキレンは、１～１２個の炭素原子（すなわち、Ｃ１～１２アルキレン）、または１～１０個の炭素原子（すなわち、Ｃ１～１０アルキレン）を有する。一実施形態では、アルキレンは、１～８個の炭素原子（すなわち、Ｃ１～８アルキレン）、１～７個の炭素原子（すなわち、Ｃ１～７アルキレン）、１～６個の炭素原子（すなわち、Ｃ１～６アルキレン）、１～４個の炭素原子（すなわち、Ｃ１～４アルキレン）、または１～３個の炭素原子（すなわち、Ｃ１～３アルキレン）を有し、エチレン、またはメチレンである。「直鎖または分枝鎖Ｃ１～６アルキレン」、「直鎖または分枝鎖Ｃ１～４アルキレン」、もしくは「直鎖または分枝鎖Ｃ１～３アルキレン」などの直鎖または分枝鎖アルキレンは、飽和二価炭化水素ラジカルが直鎖または分枝鎖であることを意味する。
本明細書で使用される「アルケニレン」は、１つまたは２つの炭素－炭素二重結合を有する１～２０個の炭素原子の脂肪族二価炭化水素ラジカル（すなわち、Ｃ２～２０アルケニレン）を指し、ここで、アルケニレンラジカルは、「シス」および「トランス」配向または別の命名法による、「Ｅ」および「Ｚ］配向を有するラジカルを含む。「二価」とは、アルキレンが分子の残りの部分に２つの結合点を有していることを意味する。一実施形態では、アルケニレンは、２～１２個の炭素原子（すなわち、Ｃ２～１６アルケニレン）、または２～１０個の炭素原子（すなわち、Ｃ２～１０アルケニレン）を有する。一実施形態では、アルケニレンは２～４個の炭素原子（Ｃ２～４）を有する。例としては、エチレニレンまたはビニレン（－ＣＨ＝ＣＨ－）、アリル（－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ－）などが挙げられるが、これらに限定されない。「直鎖または分枝鎖Ｃ２～６アルケニレン」、「直鎖または分枝鎖Ｃ２～４アルケニレン」、もしくは「直鎖または分枝鎖Ｃ２～３アルケニレン」などの直鎖または分枝鎖アルケニレンは、不飽和二価炭化水素ラジカルが直鎖または分枝鎖であることを意味する。
本明細書で使用される「シクロアルキレン」は、単環式環として３～１２個の炭素原子、または二環式環として７～１２個の炭素原子を有する二価飽和炭素環式環ラジカルを指す。「二価」は、シクロアルキレンが分子の残りの部分に２つの結合点を有していることを意味する。一実施形態では、シクロアルキレンは、３員～７員の単環式または３員～６員の単環式である。単環式シクロアルキル基の例としては、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロヘキシレン、シクロヘプチレン、シクロオクチレン、シクロノニレン、シクロデシレン、シクロウンデシレン、シクロドデシレンなどが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、シクロアルキレンはシクロプロピレンである。
「複素環」、「ヘテロシクリル」、複素環式および「複素環式環」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、少なくとも１個のＮ原子を含有し、ヘテロ原子、ならびに任意にＮおよびＳから選択される１～３個の追加のヘテロ原子を有し、非芳香族である（すなわち、部分的または完全に飽和している）環状基を指す。単環式または二環式（架橋もしくは融合）にすることができる。複素環式環の例としては、アジリジニル、ジアジリジニル、チアジリジニル、アゼチジニル、ジアゼチジニル、トリアゼチジニル、チアジアゼチジニル、チアゼチジニル、ピロリジニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イソチアゾリジニル、チアゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ヘキサヒドロピリミジニル、アゼパニル、アゾカニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。複素環は、１～４個のヘテロ原子を含み、これは、ＮおよびＳから選択され、同じであっても異なっていてもよい。一実施形態では、複素環は、１～３個のＮ原子を含有する。別の実施形態では、複素環は、１個または２個のＮ原子を含有する。別の実施形態では、複素環は、１個のＮ原子を含有する。「４員～８員のヘテロシクリル」とは、単環式環に配置された４～８個の原子（ＮおよびＳから選択される１～４個のヘテロ原子、または１～３個のＮ原子、または１個もしくは２個のＮ原子、または１個のＮ原子を含む）を有するラジカルを意味する。「５員または６員のヘテロシクリル」とは、単環式環に配置された５または６個の原子（ＮおよびＳから選択される１～４個のヘテロ原子、または１～３個のＮ原子、または１個もしくは２個のＮ原子、または１個のＮ原子を含む）を有するラジカルを意味する。「複素環」という用語は、考えられるすべての異性体形態を含むことを意図している。複素環は、Ｌｅｏ Ａ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６８）、特に第１、３、４、６、７、および９章、Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ａ Ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９５０から現在まで）、特に第１３巻、１４巻、１６巻、１９巻、および２８巻、ならびにＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９６０）８２：５５６６に記載されている。ヘテロシクリル基は、可能であれば、分子の残りの部分に結合した炭素（炭素結合）または窒素（窒素結合）であり得る。
基が「任意に置換されている」と記載されている場合、その基は（１）置換されていないか、または（２）置換されている場合がある。基の炭素が置換基のリストのうちの１つ以上で任意に置換されていると記載されている場合、炭素上水素原子のうちの１つ以上（存在する範囲で）を、独立して選択された任意の置換基で別々におよび／または一緒に置き換えることができる。
アルキル、アルキレン、アルケニレン、シクロアルキレン、およびヘテロシクリルに好適な置換基は、二官能性化合物の生物学的活性に著しく悪影響を及ぼさないものである。特に明記しない限り、これらの基について例示的な置換基としては、１～１０個の炭素原子を有する直鎖、分枝鎖もしくは環状アルキル、アルケニルまたはアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ハロゲン、グアニジニウム［－ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ２］、－ＯＲ１００、ＮＲ１０１Ｒ１０２、－ＮＯ２、－ＮＲ１０１ＣＯＲ１０２、－ＳＲ１００、－ＳＯＲ１０１で表されるスルホキシド、－ＳＯ２Ｒ１０１で表されるスルホン、スルホネート－ＳＯ３Ｍ、サルフェート－ＯＳＯ３Ｍ、－ＳＯ２ＮＲ１０１Ｒ１０２で表されるスルホンアミド、シアノ、アジド、－ＣＯＲ１０１、－ＯＣＯＲ１０１、－ＯＣＯＮＲ１０１Ｒ１０２およびポリエチレングリコール単位（－ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＲ１０１が挙げられ、式中、Ｍは、Ｈまたはカチオン（Ｎａ＋またはＫ＋など）であり、Ｒ１０１、Ｒ１０２およびＲ１０３はそれぞれ、Ｈ、１～１０個の炭素原子を有する直鎖、分枝鎖もしくは環状アルキル、アルケニルまたはアルキニル、ポリエチレングリコール単位（－ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－Ｒ１０４（ｎは、１～２４の整数であり）、６～１０個の炭素原子を有するアリール、３～１０個の炭素原子を有する複素環式環、および５～１０個の炭素原子を有するヘテロアリールから独立して選択され、Ｒ１０４は、Ｈまたは１～４個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ１００、Ｒ１０１、Ｒ１０２、Ｒ１０３およびＲ１０４によって表される基中のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルは、ハロゲン、－ＯＨ、－ＣＮ、－ＮＯ２、および１～４個の炭素原子を有する非置換の直鎖または分枝鎖アルキルから独立して選択される１つ以上（例えば、２、３、４、５、６またはそれ以上）の置換基で任意に置換される。好ましくは、上記の任意に置換されたアルキル、アルキレン、アルケニレン、シクロアルキレン、およびヘテロシクリルについての置換基は、ハロゲン、－ＣＮ、－ＮＲ１０１Ｒ１０２、－ＣＦ３、－ＯＲ１００、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、－ＳＲ１０１、－ＳＯＲ１０１、－ＳＯ２Ｒ１０１、および－ＳＯ３Ｍからなる群から選択される。あるいは、適切な置換基は、ハロゲン、－ＯＨ、－ＮＯ２、－ＣＮ、Ｃ１～４アルキル、－ＯＲ１００、ＮＲ１０１Ｒ１０２、－ＮＲ１０１ＣＯＲ１０２、－ＳＲ１００、－ＳＯ２Ｒ１０１、－ＳＯ２ＮＲ１０１Ｒ１０２、－ＣＯＲ１０１、－ＯＣＯＲ１０１、および－ＯＣＯＮＲ１０１Ｒ１０２からなる群から選択され、式中、Ｒ１００、Ｒ１０１、およびＲ１０２は、それぞれ独立して、－ＨまたはＣ１～４アルキルである。
本明細書で使用される「ハロゲン」は、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを指す。「シアノ」は、－ＣＮである。
本明細書で交換可能に使用される「アミン」または「アミノ」は、孤立電子対を有する塩基性窒素原子を含有する官能基を指す。
本明細書で使用される「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明のイオン化可能な脂質の薬学的に許容される有機または無機の塩を指す。例示的な塩としては、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酸性酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩「メシレート」、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、パモエート（すなわち、１，１’－メチレン－ビス－（２－ヒドロキシ－３－ナフトエート））塩、アルカリ金属（例えば、ナトリウムおよびカリウム）塩、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）塩、およびアンモニウム塩が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩は、酢酸イオン、コハク酸イオンまたは他の対イオンなどの別の分子の包含を含み得る。対イオンは、親化合物の電荷を安定化させる任意の有機または無機部分であり得る。さらに、薬学的に許容される塩は、その構造中に２つ以上の荷電原子を有し得る。複数の荷電原子が薬学的に許容される塩の一部である場合、複数の対イオンを有することができる。したがって、薬学的に許容される塩は、１つ以上の荷電原子および／または１つ以上の対イオンを有することができる。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、「約」という用語は、量、時間的持続時間などの測定可能な値を指す場合、開示された方法を実施するのに適切であるように指定の値から±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％、またさらにより好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味する。
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」という用語と同義であることを意味し、例えば、成分に続くものの存在を指定する包括的または自由形式の用語であり、当該技術分野において既知であるか、またはそこに開示されている、追加の、引用されていない成分、特徴、エレメント、メンバー、ステップの存在を除外または排除しない。
「からなる」という用語は、実施形態の説明において列挙されてないいずれのエレメントも除いた、本明細書に記載される組成物、方法、プロセス、およびそれらのそれぞれの構成成分を指す。
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要なエレメントを指す。この用語は、本発明の実施形態の基本的かつ新規または機能的な特徴に物質的に影響を及ぼさない追加のエレメントの存在を許容する。
本明細書で使用される場合、「投与」、「投与する」という用語およびその変形は、組成物または薬剤（例えば、核酸、特にｃｅＤＮＡ）を対象に導入することを指し、１つ以上の組成物または薬剤の同時で連続的な導入を含む。「投与」は、例えば、治療、薬物動態、診断、研究、プラセボ、および実験方法を指し得る。「投与」は、インビトロおよびエクスビボ治療も包含する。組成物または薬剤の対象への導入は、経口、肺、鼻腔内、非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下）、直腸、リンパ管内、腫瘍内、または局所を含む任意の好適な経路による。投与には、自己管理および他者による投与が含まれる。投与は、任意の好適な経路によって実行され得る。好適な投与経路は、組成物または薬剤がその意図された機能を遂行することを可能にする。例えば、好適な経路が静脈内である場合、組成物は、組成物または薬剤を対象の静脈に導入することによって投与される。
本明細書で使用される場合、「抗治療用核酸免疫応答」、「抗転移ベクター免疫応答」、「治療用核酸に対する免疫応答」、「転移ベクターに対する免疫応答」などの句は、その起源がウイルス性または非ウイルス性の治療用核酸に対する任意の望ましくない免疫応答を指すことを意味する。いくつかの実施形態では、望ましくない免疫応答は、ウイルス転移ベクター自体に対する抗原特異的免疫応答である。いくつかの実施形態では、免疫応答は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、または二本鎖ＲＮＡであり得る転移ベクターに特異的である。他の実施形態では、免疫応答は、転移ベクターの配列に特異的である。他の実施形態では、免疫応答は、転移ベクターのＣｐＧ含有量に特異的である。
本明細書で使用される場合、「担体」とおよび「賦形剤」という用語は、任意かつすべての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含むことを意味する。医薬活性物質に対するそのような媒質および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補充的活性成分を組成物に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与された場合に、毒性反応、アレルギー性反応、または同様の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ」という用語は、合成またはその他の非ウイルス遺伝子導入のためのカプシド不含閉端直鎖状二本鎖（ｄｓ）二重鎖ＤＮＡを指すことを意味する。ｃｅＤＮＡの詳細な説明は、２０１７年３月３日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２０８２８の国際出願に記載されており、その全容は参照により本明細書に明示的に組み込まれる。細胞ベースの方法を使用して様々な逆位末端反復（ＩＴＲ）配列および構成を含むｃｅＤＮＡの産生のためのある特定の方法は、２０１８年９月７日に出願された国際出願第１８／４９９９６号および２０１８年１２月６日に出願された同第２０１８／０６４２４２号の実施例１に記載されており、その各々は、その全体の参照により本明細書に組み込まれる。様々なＩＴＲ配列および構成を含む合成ｃｅＤＮＡベクターの産生のためのある特定の方法は、例えば、２０１９年１月１８日に出願された国際出願第２０１９／１４１２２号に記載されており、その全容は参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡベクター」および「ｃｅＤＮＡ」という用語は交換可能に使用される。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、閉端直鎖状二重鎖（ＣＥＬｉＤ）ＣＥＬｉＤ ＤＮＡである。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ＤＮＡベースのミニサークルである。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクターである。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ミニスタリングＤＮＡである。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、発現カセットの５’および３’末端にＩＴＲの２つのヘアピン構造を含むダンベル型の直鎖状二重鎖閉端ＤＮＡである。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡである。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バクミド」という用語は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてプラスミドとして伝播することができる分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含み、それによりバキュロウイルスのシャトルベクターとして作動し得る、感染性バキュロウイルスゲノムを指すことを意味する。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス」という用語は、バキュロウイルスゲノム内の分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含むバキュロウイルスを指すことを意味する。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス感染昆虫細胞」および「ｃｅＤＮＡ－ＢＩＩＣ」という用語は、交換可能に使用され、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスに感染した無脊椎動物宿主細胞（限定されないが、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）を含む）を指すことを意味する。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡゲノム」という用語は、少なくとも１つの逆位末端反復領域をさらに組み込む発現カセットを指すことを意味する。ｃｅＤＮＡゲノムは、１つ以上のスペーサー領域をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡゲノムは、ＤＮＡの分子間二重鎖ポリヌクレオチドとして、プラスミドまたはウイルスゲノムに組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ調節配列」、「制御エレメント」、および「調節エレメント」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナルなどの転写および翻訳制御配列を指すことを意味し、これらは非コード配列（例えば、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ）またはコード配列（例えば、部位特異的修飾ポリペプチドもしくはＣａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチド）の転写を提供および／もしくは調節し、かつ／またはコードされたポリペプチドの翻訳を調節する。
本明細書で使用される場合、活性剤または治療用核酸などの治療剤の「有効量」または「治療有効量」という語句は、治療用核酸の不在下で検出された発現レベルと比較して、所望の効果、例えば、標的配列の発現の阻害をもたらすのに十分な量である。標的遺伝子または標的配列の発現を測定するための好適なアッセイは、例えば、ドットブロット、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、酵素機能、同様に当業者に既知の表現型アッセイなどの、当業者に既知の技法を使用するタンパク質またはＲＮＡレベルの検査を含む。
本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、その天然源以外の細胞中に存在する物質を指すことを意味する。本明細書で使用される「外因性」という用語は、通常見られず、核酸またはポリペプチドをそのような細胞または生物に導入することが望まれる、人の手が関与するプロセスによって細胞または生物などの生物系に導入された核酸（例えば、ポリペプチドをコードする核酸）またはポリペプチドを指し得る。代替的に、「外因性」とは、それが比較的少量で見られ、細胞または生物における核酸またはポリペプチドの量を増加させること、例えば、異所性発現またはレベルをもたらすことが望まれる、人の手が関与するプロセスによって細胞または生物などの生物系に導入された核酸またはポリペプチドを指し得る。これとは対照的に、本明細書で使用される場合、「内因性」という用語は、生物系または細胞に対して天然である物質を指す。
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、ＲＮＡおよびタンパク質、また必要に応じて、例えば、転写、転写処理、翻訳およびタンパク質の折りたたみ、修飾および処理を含むがこれらに限定されない分泌タンパク質の産生に関与する細胞プロセスを指すことを意味する。本明細書で使用される場合、「発現産物」という語句は、遺伝子（例えば、導入遺伝子）から転写されたＲＮＡ、および遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳によって得られたポリペプチドを含む。
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、ベクター上の転写調節配列に連結された配列からのＲＮＡまたはポリペプチドの発現を指示するベクターを指すことを意味する。発現される配列は、多くの場合、宿主細胞に対して異種であるが、必ずしもそうではない。発現ベクターは、追加のエレメントを含むことができ、例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有することができるため、それを２つの生物、例えば発現の場合はヒト細胞、ならびにクローニングおよび増幅の場合は原核生物宿主で維持することができる。発現ベクターは、組換えベクターであり得る。
本明細書で使用される場合、「発現カセット」および「発現ユニット」という用語は、交換可能に使用され、ＤＮＡベクター、例えば、合成ＡＡＶベクターの導入遺伝子の転写を指示するのに十分なプロモーターまたは他のＤＮＡ調節配列に操作可能に連結される異種ＤＮＡ配列を指すことを意味する。好適なプロモーターには、例えば、組織特異的プロモーターが含まれる。プロモーターは、ＡＡＶ起源でもあり得る。
本明細書で使用される場合、「隣接する」という用語は、別の核酸配列に対するある核酸配列の相対位置を指すことを意味する。一般に、配列ＡＢＣでは、Ｂの両側にＡおよびＣが隣接している。配置ＡｘＢｘＣについても同様である。したがって、隣接する配列は、隣接される配列の前または後に続くが、隣接される配列と連続している、またはすぐ隣である必要はない。一実施形態では、隣接するという用語は、直鎖状一本鎖合成ＡＡＶベクターの各末端における末端反復を指す。
本明細書で使用される場合、「ギャップ」および「ニック」という用語は交換可能に使用され、本発明の合成ＤＮＡベクターの中断された部分を指すことを意味し、その他の二本鎖ｃｅＤＮＡには一本鎖ＤＮＡ部分のストレッチが作成される。ギャップは、二重鎖ＤＮＡの一本鎖の長さが１塩基対～１００塩基対の長さであり得る。本明細書に記載される方法によって設計および作成された典型的なギャップ、および当該方法によって生成された合成ベクターは、長さが、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０ｂｐの長さであり得る。本開示における例示的なギャップは、長さが１ｂｐ～１０ｂｐの長さ、１～２０ｂｐの長さ、１～３０ｂｐの長さであり得る。
本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、インビトロまたはインビボでの所与のＲＮＡまたはタンパク質の発現に関連する核酸の任意のセグメントを指すために広く使用される。したがって、遺伝子には、発現されたＲＮＡ（通常はポリペプチドコード配列を含む）をコードする領域、および、多くの場合、それらの発現に必要な調節配列が含まれる。遺伝子は、目的の供給源からのクローニングまたは既知のもしくは予測された配列情報からの合成を含む、様々な供給源から得ることができ、特に所望のパラメータを有するように設計された配列を含んでもよい。
本明細書で使用される場合、「遺伝性疾患」または「遺伝性障害」という語句は、ゲノム中の１つ以上の異常、特に出生時から存在する状態によって部分的または完全に、直接的または間接的に引き起こされる疾患を指すことを意味する。異常は、遺伝子における変異、挿入、または欠失であり得る。異常は、遺伝子のコード配列またはその調節配列に影響を与える可能性がある。
本明細書で使用される場合、「異種」という用語は、それぞれ天然の核酸またはタンパク質には見られないヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指すことを意味する。異種核酸配列は、天然に存在する核酸配列（またはそのバリアント）に（例えば、遺伝子操作によって）連結されて、キメラポリペプチドをコードするキメラヌクレオチド配列を生成し得る。異種核酸配列は、バリアントポリペプチドに（例えば、遺伝子操作によって）連結されて、融合バリアントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を生成し得る。
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本開示の核酸治療薬による形質転換、トランスフェクション、形質導入などを受けやすい任意の細胞型を指す。非限定的な例として、宿主細胞は、単離された初代細胞、多能性幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、人工多能性幹細胞、またはいくつかの不死化細胞株（例えば、ＨｅｐＧ２細胞）のいずれかであり得る。あるいは、宿主細胞は、組織、器官、または生物におけるインサイチュまたはインビボの細胞であり得る。さらに、宿主細胞は、例えば、哺乳動物対象（例えば、遺伝子療法を必要とするヒト患者）の標的細胞であり得る。
本明細書に記載される場合、「誘導性プロモーター」は、誘導因子もしくは誘導剤の存在下、それによって影響される場合、またはそれによって接触される場合に、転写活性を開始または強化することによって特徴付けられるものを指すことを意味する。本明細書で使用される場合、「誘導因子」または「誘導剤」は、内因性であり得るか、または誘導性プロモーターからの転写活性を誘導することにおいて活性であるような方式で投与される、通常は外因性の化合物またはタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、誘導因子または誘導剤、すなわち、化学物質、化合物、またはタンパク質は、それ自体が核酸配列の転写または発現の結果であり得（すなわち、誘導因子は、別の構成成分またはモジュールによって発現される誘導因子タンパク質であり得る）、それ自体が誘導性プロモーターの制御下であり得る。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、リプレッサーなどのある特定の薬剤の不在下で誘導される。誘導性プロモーターの例としては、テトラサイクリン、メタロチオニン、エクジソン、哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、およびマウス乳腺腫瘍ウイルスの長い末端反復（ＭＭＴＶ－ＬＴＲ））、ならびに他のステロイド応答性プロモーター、ラパマイシン応答性プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、細胞抽出物などの無傷膜を有する細胞の存在を必要としないアッセイおよび方法を指すことを意味し、非細胞系、例えば細胞抽出物などの細胞または細胞系を含まない媒質にプログラム可能な合成生物的回路を導入することを指し得る。
本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、多細胞動物などの生物中または生物内で起こるアッセイまたはプロセスを指すことを意味する。本明細書に記載される態様のうちのいくつかでは、方法または使用は、細菌などの単細胞生物が使用されるときに「インビボで」起こると言われ得る。「エクスビボ」という用語は、多細胞動物または植物、例えば、とりわけ外植片、培養細胞（一次細胞および細胞株を含む）、形質転換細胞株、および抽出組織または細胞（血液細胞を含む）の体外に無傷膜を有する生細胞を使用して実施される方法および使用を指す。
本明細書で使用される場合、「脂質」という用語は、脂肪酸のエステルを含むがこれらに限定されない有機化合物群を指すことを意味し、水に不溶であるが、多くの有機溶媒に可溶であることを特徴とする。脂質は通常、少なくとも３つのクラスに分類される。（１）脂肪および油ならびにワックスを含む「単純脂質」、（２）リン脂質および糖脂質を含む「複合脂質」、（３）ステロイドなどの「誘導脂質」。
リン脂質の代表的な例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、およびジリノレオイルホスファチジルコリンが含まれるが、これらに限定されない。スフィンゴ脂質、スフィンゴ糖脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、およびβ－アシルオキシ酸など、リンを欠く他の化合物も両親媒性脂質と呼ばれる群に含まれる。さらに、上記の両親媒性脂質は、トリグリセリドおよびステロールを含む他の脂質と混合することができる。
一実施形態では、脂質組成物は、１つ以上の三級アミノ基、１つ以上のフェニルエステル結合、およびジスルフィド結合を含む。
本明細書で使用される場合、「脂質コンジュゲート」という用語は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を指すことを意味する。そのような脂質コンジュゲートには、例えば、ジアルキルオキシプロピルと共役したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲート）、ジアシルグリセロールと共役したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＧコンジュゲート）、コレステロールと共役したＰＥＧ、ホスファチジルエタノールアミンと共役したＰＥＧ、およびセラミドと共役したＰＥＧ（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号を参照されたい）などのＰＥＧ－脂質コンジュゲート、イオン化ＰＥＧ脂質、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート（例えば、ＰＯＺ－ＤＡＡコンジュゲート、例えば、２０１０年１月１３日に出願された米国仮出願第６１／２９４，８２８号、および２０１０年１月１４日に出願された米国仮出願第６１／２９５，１４０号を参照されたい）、ポリアミドオリゴマー（例えば、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート）ならびにそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。ＰＯＺ－脂質コンジュゲートの追加例は、ＰＣＴ公開第２０１０／００６２８２号に記載されている。ＰＥＧまたはＰＯＺは、脂質に直接結合するか、またはリンカー部分を介して脂質に結合することができる。例えば、非エステル含有リンカー部分およびエステル含有リンカー部分を含む、ＰＥＧまたはＰＯＺを脂質に結合するのに好適な任意のリンカー部分を使用することができる。ある特定の好ましい実施形態では、アミドまたはカルバメートなどの非エステル含有リンカー部分が使用される。上記の各特許文書の開示内容は、あらゆる目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「脂質で封入する」という用語は、核酸（例えば、ＡＳＯ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｃｅＤＮＡ、ウイルスベクター）などの活性剤または治療剤を、完全封入、部分封入、またはその両方で提供する脂質粒子を指すことを意味する。好ましい実施形態では、核酸は脂質粒子内に完全に封入される（例えば、核酸を含有する脂質粒子を形成するため）。
本明細書で使用される場合、「脂質粒子」または「脂質ナノ粒子」という用語は、核酸治療薬（ＴＮＡ）などの治療剤を目的の標的部位（例えば、細胞、組織、器官など）に送達するために使用され得る脂質製剤を指すことを意味する（「ＴＮＡ脂質粒子」、「ＴＮＡ脂質ナノ粒子」または「ＴＮＡ ＬＮＰ」と称される）。一実施形態では、本発明の脂質粒子は治療用核酸含有脂質粒子であり、これは典型的にはイオン化可能な脂質、非カチオン性脂質、および任意に粒子の凝集を防止するコンジュゲートされた脂質から形成される。他の好ましい実施形態では、治療用核酸などの治療剤を粒子の脂質部分に封入し、それにより酵素分解から保護することができる。一実施形態では、脂質粒子は、核酸（例えば、ｃｅＤＮＡ）と、１つ以上の三級アミノ基、１つ以上のフェニルエステル結合およびジスルフィド結合を含む脂質とを含む。
本発明の脂質粒子は、典型的には、約２０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約９０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、または約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、約５０ｎｍ、約５５ｎｍ、約６０ｎｍ、約６５ｎｍ、約７０ｎｍ、約７５ｎｍ、約８０ｎｍ、約８５ｎｍ、約９０ｎｍ、約９５ｎｍ、約１００ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１４５ｎｍまたは約１５０ｎｍの平均直径を有する。
本明細書で使用される場合、「疎水性脂質」という用語は、長鎖飽和および不飽和脂肪族炭化水素基、ならびに１つ以上の芳香族、脂環式、または複素環式基で任意に置換された基を含むがこれらに限定されない無極性基を有する化合物を指す。好適な例には、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、Ｎ－Ｎ－ジアルキルアミノ、１，２－ジアシルオキシ－３－アミノプロパン、および１，２－ジアルキル－３－アミノプロパンが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「イオン化可能な脂質」という用語は、脂質が生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）以下で正に帯電し、第２のｐＨ、好ましくは生理学的ｐＨ以上で中性であるように、少なくとも１つのプロトン化可能または脱プロトン化可能基を有する脂質、例えばカチオン性脂質を指すことを意味する。ｐＨの関数としてのプロトンの付加または除去は平衡プロセスであり、荷電または中性脂質への言及は優勢種の性質を指し、すべての脂質が荷電または中性の形態で存在する必要はないことは、当業者によって理解されるであろう。一般に、イオン化可能な脂質は、約４～約７の範囲のプロトン化可能な基のｐＫａを有する。いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、「切断可能脂質」または「ＳＳ切断可能脂質」を含み得る。
本明細書で使用される場合、「中性脂質」という用語は、選択されたｐＨで非荷電または中性の双性イオン形態のいずれかで存在する多くの脂質種のいずれかを指すことを意味する。生理学的ｐＨでは、そのような脂質には、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド、およびジアシルグリセロールが含まれる。
本明細書で使用される場合、「アニオン性脂質」という用語は、生理学的ｐＨで負に荷電するあらゆる脂質を指す。これらの脂質には、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ－ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リジルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、および中性脂質と結合した他のアニオン性修飾基が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「非カチオン性脂質」という用語は、任意の両親媒性脂質、および任意の他の中性脂質またはアニオン性脂質を指すことを意味する。
本明細書で使用される場合、「切断可能脂質」または「ＳＳ切断可能脂質」という用語は、ジスルフィド結合の切断可能な単位を含む脂質を指す。一実施形態では、切断可能脂質は、酸性区画、例えば、膜不安定化のためのエンドソームまたはリソソーム、および細胞質などの還元環境で切断され得るジスルフィド結合に応答する三級アミンを含む。一実施形態では、切断可能脂質は、イオン化可能な脂質である。一実施形態では、切断可能脂質は、カチオン性脂質である。一実施形態では、切断可能脂質は、イオン化可能なカチオン性脂質である。切断可能脂質は、本明細書でより詳細に記載されている。
本明細書で使用される場合、「有機脂質溶液」という用語は、全体または一部に脂質を有する有機溶媒を含む組成物を指すことを意味する。
本明細書で使用される場合、「リポソーム」という用語は、水性外部から分離された内部水性体積を封入する球形構成で組み立てられた脂質分子を指すことを意味する。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療薬送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再位置付けすることによって作用して、薬物または活性製剤成分を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、典型的には、リン脂質、特にホスファチジルコリン基を有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。
本明細書で使用される場合、「局所送達」という用語は、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）などの活性剤の、生物内の標的部位への直接の送達を指すことを意味する。例えば、薬剤は、腫瘍などの疾患部位、または炎症部位などの他の標的部位、または肝臓、心臓、膵臓、腎臓などの標的器官への直接注射によって局所的に送達することができる。
本明細書で使用される場合、「ｎｅＤＮＡ」または「ニックの入ったｃｅＤＮＡ」という用語は、オープンリーディングフレーム（例えば、発現されるプロモーターおよび導入遺伝子）の５’上流のステム領域またはスペーサー領域に１～１００塩基対のニックまたはギャップを有する閉端ＤＮＡを指すことを意味する。
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態で少なくとも２つのヌクレオチド（すなわち、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド）を含むポリマーを指すことを意味し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらのハイブリッドを含む。ＤＮＡは、例えば、アンチセンス分子、プラスミドＤＮＡ、ＤＮＡ－ＤＮＡ二重鎖、事前に凝縮されたＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ベクター（Ｐ１、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、染色体ＤＮＡ、またはこれらのグループの誘導体および組み合わせの形態であり得る。ＤＮＡは、ミニサークル、プラスミド、バクミド、ミニ遺伝子、ミニストリングＤＮＡ（直鎖状の共有結合的に閉じたＤＮＡベクター）、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ＣＥＬｉＤまたはｃｅＤＮＡ）、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡ、ダンベル型ＤＮＡ、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）－ベクター、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターの形態であり得る。ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、およびそれらの組み合わせの形態であり得る。核酸としては、既知のヌクレオチド類似体または修飾型骨格残基もしくは連結を含有する核酸が挙げられ、これらは、合成、天然に存在する、および天然に存在しないものであり、参照核酸と同様の結合特性を有する。そのような類似体および／または修飾残基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（モルホリノ）、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ（商標））、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。別途限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有する天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。別途明記しない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的修飾型バリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、および相補的配列、同様に、明示的に示された配列を暗黙的に包含する。
本明細書で使用される場合、「核酸治療薬」、「治療用核酸」および「ＴＮＡ」という語句は、交換可能に使用され、疾患または障害を治療するための治療剤の活性成分として核酸を使用する治療の任意のモダリティを指す。本明細書で使用される場合、これらの語句は、ＲＮＡベースの治療薬およびＤＮＡベースの治療薬を指す。ＲＮＡベースの治療薬の非限定的な例としては、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。ＤＮＡベースの治療薬の非限定的な例としては、ミニサークルＤＮＡ、ミニ遺伝子、ウイルスＤＮＡ（例えば、レンチウイルスまたはＡＡＶゲノム）または非ウイルスＤＮＡベクター、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ／ＣＥＬｉＤ）、プラスミド、バクミド、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡベクター、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）－ベクター、非ウイルスミニストリングＤＮＡベクター（直鎖状の共有結合的に閉じたＤＮＡベクター）、およびダンベル型ＤＮＡ最小ベクター（「ダンベルＤＮＡ」）が挙げられる。本明細書で使用される場合、「ＴＮＡ ＬＮＰ」という用語は、上記のように、ＴＮＡの少なくとも１つを含有する脂質粒子を指す。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」は、糖デオキシリボース（ＤＮＡ）またはリボース（ＲＮＡ）、塩基、およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは、リン酸基を介してともに連結している。
「操作可能に連結された」とは、そのように記載された構成成分が、それらが意図された様式で機能することを許可する関係にある並列を指すことを意味する。例えば、プロモーターがその転写または発現に影響を与える場合、プロモーターは、コード配列に操作可能に連結されている。プロモーターは、それが調節する核酸配列の発現を駆動する、または転写を駆動すると言うことができる。「操作可能に連結された」、「作動可能に位置付けられた」、「作動可能に連結された」、「制御下」、および「転写制御下」という語句は、プロモーターが、核酸配列に関して正しい機能的位置および／または配向にあり、その配列の転写開始および／または発現を制御するように調節することを示す。本明細書で使用される場合、「逆位プロモーター」は、核酸配列が逆配向にあるプロモーターを指し、それによりコード鎖であったものは、今は非コード鎖であり、逆も同様である。逆位プロモーター配列を様々な実施形態で使用して、スイッチの状態を調節することができる。加えて、様々な実施形態では、プロモーターをエンハンサーと併せて使用することができる。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、タンパク質またはＲＮＡをコードする異種標的遺伝子であり得る、核酸配列の転写を駆動することによって、別の核酸配列の発現を調節する任意の核酸配列を指すことを意味する。プロモーターは、構成的、誘導性、抑制性、組織特異性、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。プロモーターは、核酸配列の残りの転写の開始および速度が制御される、核酸配列の制御領域である。プロモーターはまた、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節タンパク質および分子が結合し得る、遺伝子エレメントを含有し得る。プロモーター配列内では、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインが見出されるであろう。真核生物プロモーターは、必ずしもそうではないが、多くの場合、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有する。誘導性プロモーターを含む様々なプロモーターを使用して、本明細書に開示される合成ＡＡＶベクター中の導入遺伝子の発現を駆動することができる。プロモーター配列は、その３’末端で転写開始部位によって結合され、バックグラウンドより上で検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含むように上流（５’配向）に伸びる。
プロモーターは、所与の遺伝子または配列のコードセグメントおよび／またはエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって取得され得る、遺伝子または配列と天然に関連するものであり得る。そのようなプロモーターは、「内因性」と呼ばれ得る。同様に、いくつかの実施形態では、エンハンサーは、その配列の下流または上流のいずれかに位置する、核酸配列と天然に関連するものであり得る。いくつかの実施形態では、コード核酸セグメントは、「組換えプロモーター」または「異種プロモーター」の制御下で位置付けられ、これらの両方は、その自然環境において操作可能に連結されたコードされた核酸配列と通常は関連しないプロモーターを指す。同様に、「組換えまたは異種エンハンサー」は、その自然環境において所与の核酸配列と通常は関連しないエンハンサーを指す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、任意の他の原核、ウイルス性、または真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、および「天然に存在」しない合成プロモーターまたはエンハンサーを含み得、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメント、および／または当該技術分野において既知である遺伝子操作の方法を通じて発現を変更する変異を含み得る。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に産生することに加えて、プロモーター配列は、本明細書に開示される合成生物的回路およびモジュールに関して、ＰＣＲを含む組換えクローニングおよび／または核酸増幅技術を使用して産生され得る（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第５，９２８，９０６号を参照されたく、各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。さらに、ミトコンドリア、クロロプラストなどの非核性細胞小器官内の配列の転写および／または発現を配向する制御配列が同様に用いられ得ることが企図される。
本明細書で使用される場合、「Ｒｅｐ結合部位」（「ＲＢＳ」）および「Ｒｅｐ結合エレメント」（「ＲＢＥ」）は、交換可能に使用され、Ｒｅｐタンパク質（例えば、ＡＡＶ Ｒｅｐ７８またはＡＡＶ Ｒｅｐ６８）の結合部位を指すことを意味し、Ｒｅｐタンパク質による結合時に、Ｒｅｐタンパク質が、ＲＢＳを組み込む配列上でその部位特異的エンドヌクレアーゼ活性を実施することを可能にする。ＲＢＳ配列およびその逆相補体は、一緒に単一ＲＢＳを形成する。ＲＢＳ配列は、当該技術分野において周知であり、例えば、ＡＡＶ２において同定されたＲＢＳ配列である５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’を含む。
本明細書で使用される場合、「組換えベクター」という語句は、異種核酸配列を含むベクター、またはインビボで発現することができる「導入遺伝子」を指すことを意味する。本明細書に記載されるベクターは、いくつかの実施形態では、他の好適な組成物および療法と組み合わせることができることを理解されたい。いくつかの実施形態では、ベクターは、エピソームである。好適なエピソームベクターの使用は、対象における目的のヌクレオチドを高コピー数の染色体外ＤＮＡに維持し、それによって染色体組み込みの潜在的な影響を排除する手段を提供する。
本明細書で使用される場合、「レポーター」という用語は、検出可能な読み出しを提供するために使用可能なタンパク質を指すことを意味する。レポーターは、一般に、蛍光、色、または発光などの測定可能なシグナルを産生する。レポータータンパク質コード配列は、細胞または生物中の存在が容易に観察されるタンパク質をコードする。
本明細書で使用される場合、「センス」および「アンチセンス」という用語は、ポリヌクレオチド上の構造エレメントの配向を指すことを意味する。エレメントのセンスバージョンおよびアンチセンスバージョンは、互いの逆相補体である。
本明細書で使用される場合、「配列同一性」という用語は、２つのヌクレオチド配列間の関連性を指すことを意味する。本開示の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，上記）、好ましくはバージョン３．０．０以降において実装されるように、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，上記）を使用して決定される。使用される任意のパラメータは、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ拡張ペナルティ０．５、およびＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」とラベル付けされたＮｅｅｄｌｅの出力（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して取得される）は、同一性パーセントとして使用され、次のように計算される、（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／アラインメントの長さ－アラインメントにおけるギャップの総数）。アラインメントの長さは、好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも１００ヌクレオチドである。
本明細書で使用される場合、「スペーサー領域」という用語は、ベクターまたはゲノム内の機能的エレメントを分離する介在配列を指すことを意味する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶスペーサー領域は、最適機能性のための所望の処理で２つの機能的エレメントを保持する。いくつかの実施形態では、スペーサー領域は、ベクターまたはゲノムの遺伝的安定性を提供するか、または増大させる。いくつかの実施形態では、スペーサー領域は、クローニング部位および塩基対の設計番号のギャップに便利な位置を提供することによって、ゲノムの容易な遺伝子操作を促進する。例えば、ある特定の態様では、いくつかの制限エンドヌクレアーゼ部位を含むオリゴヌクレオチド「ポリリンカー」もしくは「ポリクローニング部位」、または既知のタンパク質（例えば、転写因子）結合部位を有しないように設計された非オープンリーディングフレーム配列をベクターまたはゲノム中に位置付けて、シス作用性因子を分離することができ、例えば、６ｍｅｒ、１２ｍｅｒ、１８ｍｅｒ、２４ｍｅｒ、４８ｍｅｒ、８６ｍｅｒ、１７６ｍｅｒなどを挿入する。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、本発明による治療用核酸での予防的治療を含む治療が提供される、ヒトまたは動物を指すことを意味する。通常、動物は、限定されないが、霊長類、齧歯類、飼育動物、または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えば、アカゲザルが挙げられるが、これらに限定されない。齧歯類としては、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、およびハムスターが挙げられる。飼育動物および狩猟動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、例えば、飼いネコ、イヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、トリ種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、ならびに魚、例えば、トラウト、ナマズ、およびサケが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される態様のある特定の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、霊長類またはヒトである。対象は、男性または女性であり得る。追加的に、対象は、幼児または子供であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、新生児または胎児対象であり得、例えば、対象は、子宮内に存在する。好ましくは、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、疾患および障害の動物モデルを代表する対象として有利に使用され得る。加えて、本明細書に記載される方法および組成物は、飼育動物および／またはペットに使用され得る。ヒト対象は、任意の年齢、性別、人種、または民族グループ、例えば、コーカサス人（白人）、アジア人、アフリカ人、黒人、アフリカ系アメリカ人、アフリカ系ヨーロッパ人、ラテンアメリカ系、中東系などであり得る。いくつかの実施形態では、対象は、臨床設定において患者または他の対象であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、既に治療を受けている。いくつかの実施形態では、対象は、胚、胎児、新生児、幼児、子供、青年、または成人である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト胎児、ヒト新生児、ヒト幼児、ヒト子供、ヒト青年、またはヒト成人である。いくつかの実施形態では、対象は、動物胚、または非ヒト胚もしくは非ヒト霊長類胚である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト胚である。
本明細書で使用される場合、「必要とする対象」という語句は、語句の文脈および使用法が別段の指示をしない限り、（ｉ）記載された発明に従ってＴＮＡ脂質粒子（またはＴＮＡ脂質粒子を含む薬学的組成物）を投与される予定であり、（ｉｉ）記載された本発明に従ってＴＮＡ脂質粒子（またはＴＮＡ脂質粒子を含む薬学的組成物）を受けているか、または（ｉｉｉ）記載された発明に従ってＴＮＡ脂質粒子（またはＴＮＡ脂質粒子を含む薬学的組成物）を受けた、対象を指す。
本明細書で使用される場合、「抑制する」、「減少する」、「妨害する」、「阻害する」および／または「低減する」という用語（ならびに同様の用語）は、一般に、天然、予想もしくは平均に対して、または対照条件に対して、直接的または間接的に、濃度、レベル、機能、活性、または挙動を低減する行為を指す。
本明細書で使用される場合、「合成ＡＡＶベクター」および「ＡＡＶベクターの合成産生」という用語は、完全に無細胞環境でのＡＡＶベクターおよびその合成産生方法を指すことを意味する。
本明細書で使用される場合、「全身送達」という用語は、生物内での干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）などの活性剤の広範な生体内分布をもたらす脂質粒子の送達を指すことを意味する。投与技術によっては、特定の薬剤の全身送達にいたることもあれば、そうでないものもある。全身送達とは、有用な量、好ましくは治療量の薬剤が身体のほとんどの部分にさらされることを意味する。広範な生体内分布を得るには、一般に、薬剤が、投与部位より遠位の疾患部位に到達する前に（初回通過器官（肝臓、肺など）によって、または急速な非特異的細胞結合によって）急速に分解または排出されないような血液寿命が必要である。脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の全身送達は、例えば静脈内、皮下、および腹腔内を含む、当技術分野で既知の任意の手段によることができる。好ましい実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の全身送達は、静脈内送達による。
本明細書で使用される場合、「末端分解部位」および「ＴＲＳ」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、Ｒｅｐが、細胞ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮＡ ｐｏｌデルタまたはＤＮＡ ｐｏｌイプシロンを介してＤＮＡ伸長の基質として役立つ３’－ＯＨを生成する５’チミジンとのチロシン－ホスホジエステル結合を形成する領域を指すことを意味される。代替的に、Ｒｅｐ－チミジン複合体は、配位ライゲーション反応に関与し得る。
本明細書で使用される場合、活性剤（例えば、本明細書に記載されるＴＮＡ脂質粒子）の「治療量」、「治療有効量」、「有効量」、または「薬学的有効量」という用語は交換可能に使用され、治療の意図された利益を提供するのに十分な量を指す。しかしながら、投与量レベルは、傷害の種類、年齢、体重、性別、患者の病状、病状の重症度、投与経路、および用いられる特定の活性剤を含む、多様な因子に基づく。したがって、投与計画は、大きく異なる可能性があるが、標準的な方法を使用して医師によって常套的に決定され得る。追加的に、「治療量」、「治療有効量」および「薬学的有効量」という用語は、記載された本発明の組成物の予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）量を含む。記載された発明の予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）用途において、薬学的組成物または薬剤は、疾患、障害または状態の生化学的、組織学的および／または行動症状、その合併症、ならびに疾患、障害または状態の発症中に現れる中間の病理学的表現型を含む、疾患、障害または状態に罹患しやすい患者、またはそうでなければそのリスクがある患者に、リスクを排除もしくは低減するか、重症度を減少させるか、または疾患、障害もしくは状態の発症を遅らせるのに十分な量で投与される。いくつかの医学的判断によれば、最大用量、すなわち最高の安全用量を使用することが一般に好ましい。「用量」および「投与量」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。
本明細書で使用される場合、「治療効果」という用語は、治療の結果を指し、その結果は、望ましくかつ有益であると判断される。治療効果としては、直接的または間接的に、疾患症状の阻止、低減、または排除を挙げることができる。治療効果としてはまた、直接的または間接的に、疾患症状の進行の阻止、低減、または排除を挙げることができる。
本明細書に記載される任意の治療剤について、治療有効量は、予備的なインビトロ研究および／または動物モデルから最初に決定することができる。治療有効用量はまた、ヒトのデータから決定することができる。適用される用量は、投与される化合物の相対的な生物学的利用能および効力に基づいて調整することができる。上記の方法および他の周知の方法に基づいて最大の効力を達成するように用量を調整することは、当業者の能力の範囲内である。参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（２００１）の第１章に見いだされ得る治療有効性を決定するための一般原則を以下に要約する。
薬物動態学的原理は、許容できない副作用を最小限に抑えながら、望ましい程度の治療効果を得るために投与計画を変更するための基礎を提供する。薬物の血漿濃度を測定でき、治療濃度域に関連している状況では、投与量の変更に関する追加のガイダンスを入手することができる。
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、および／または「治療」という用語は、状態の進行を抑制する、実質的に阻害する、遅らせる、もしくは逆転させる、状態の臨床症状を実質的に改善する、または状態の臨床症状の出現を実質的に防ぐ、有益なもしくは望ましい臨床結果を得ることを含む。治療することは、（ａ）障害の重症度を低減すること、（ｂ）治療されている障害に特徴的な症状の発症を限定すること、（ｃ）治療されている障害に特徴的な症状の悪化を限定すること、（ｄ）以前に障害を有していた患者における障害の再発を限定すること、および（ｅ）以前は障害に関して無症候性であった患者の症状の再発を限定することのうちの１つ以上を達成することをさらに指す。
薬理学的および／または生理学的効果などの有益なまたは所望の臨床結果は、疾患、障害または状態の素因を有する可能性があるが、疾患の症状をまだ経験していないか、もしくは呈していない対象において疾患、障害または状態が発生するのを防ぐこと（予防的治療）、疾患、障害または状態の症状の緩和、疾患、障害または状態の程度の減少、疾患、障害または状態の安定化（すなわち、悪化させない）、疾患、障害または状態の蔓延を防ぐこと、疾患、障害または状態の進行を遅らせるまたは遅くすること、疾患、障害または状態の改善または軽減、およびそれらの組み合わせ、同様に治療を受けていない場合に予想される生存と比較して生存を延長することを含むが、これらに限定されない。
「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、別のＤＮＡセグメント、すなわち「インサート」「導入遺伝子」または「発現カセット」が、細胞において結合されたセグメント（「発現カセット」）の発現または複製をもたらすために、結合され得るプラスミド、バクミド、ファージ、ウイルス、ビリオン、またはコスミドなどのレプリコンを指すことを意味する。ベクターは、宿主細胞への送達のために、または異なる宿主細胞間の移動のために設計された核酸構築物であり得る。本明細書で使用される場合、ベクターは、最終的な形態でウイルス起源、または非ウイルス起源であり得る。しかしながら、本開示の目的のために、「ベクター」は、一般に、合成ＡＡＶベクターまたはニックの入ったｃｅＤＮＡベクターを指す。したがって、「ベクター」という用語は、適切な制御エレメントと関連する場合に複製することができ、遺伝子配列を細胞に移すことができる任意の遺伝的エレメントを包含する。いくつかの実施形態では、ベクターは、組換えベクターまたは発現ベクターであり得る。
本明細書に開示される本発明の代替エレメントまたは実施形態のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各郡のメンバーは、個別に、または群の他のメンバーまたは本明細書で見られる他のエレメントとの任意の組み合わせで参照および主張することができる。群の１つ以上のメンバーは、利便性および／または特許性の理由から、群に含める、または群から削除することができる。そのような任意の包含または削除が発生した場合、本明細書では、明細書が修正されたグループを含むとみなされ、したがって添付の特許請求の範囲で使用されているすべてのマーカッシュグループの記述を満たす。
態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載される開示は、人間のクローン化プロセス、人間の生殖細胞系列の遺伝的同一性を修正するプロセス、産業もしくは商業目的でのヒト胚の使用、または人もしくは動物にいかなる実質的な医学的利益ももたらすことなく苦しみを引き起こす可能性が高い動物、およびそのようなプロセスから生じる動物の遺伝的同一性を修正するためのプロセスに関係しない。
本明細書では、本発明の様々な態様の説明内で他の用語が定義されている。
文献参照、発行済み特許、公開済みの特許出願、および係属中の特許出願を含む、本出願を通して引用されるすべての特許および他の出版物は、例えば、本明細書に記載される技術に関連して使用され得るそのような刊行物に記載される方法論を説明および開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの出版物は、本出願の出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供されている。この点に関するいかなるものも、発明者が先行発明のおかげで、またはいかなる他の理由のためにもそのような開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。日付に関するすべての記述またはこれらの文書の内容に関する表現は、出願人が入手できる情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関するいかなる承認も構成するものではない。
本開示の実施形態の説明は、網羅的であること、または本開示を開示された正確な形態に限定することを意図したものではない。本開示の特定の実施形態および実施例が、例示の目的で本明細書で説明されているが、当業者が認識するように、本開示の範囲内で様々な同等の修正が可能である。例えば、方法のステップまたは機能は、所与の順序で提示されるが、代替的な実施形態は、異なる順序で機能を実施してもよく、または機能は実質的に同時に実施されてもよい。本明細書で提供される開示の教示は、必要に応じて他の手順または方法に適用することができる。本明細書に記載される様々な実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わせることができる。本開示の態様は、必要に応じて、上記の参照文献および出願の組成物、機能、および概念を用いて本開示のさらなる実施形態を提供するように修正することができる。さらに、生物学的機能の同等性の考慮により、種類または量の生物学的または化学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造にいくつかの変更を加えることができる。詳細な説明に照らして、これらの変更および他の変更を本開示に加えることができる。そのような修正はすべて、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
前述の実施形態のいずれかの特定のエレメントは、他の実施形態の要素と組み合わせるか、または置き換えることができる。さらに、本開示のある特定の実施形態に関連する利点が、これらの実施形態の文脈で説明されたが、他の実施形態もそのような利点を示し得、すべての実施形態が本開示の範囲内にあるために必ずしもそのような利点を示す必要はない。
本明細書に記載される技術は、以下の実施例によってさらに説明されており、決してこれらをさらに限定するものと解釈されるべきではない。本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬などにいかなる様式でも限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定することを意図されない。
ＩＩ．イオン化可能な脂質
本明細書で提供されるのは、式（Ｉ）：
Figure 2023502576000003
 で表されるイオン化可能な脂質、またはその薬学的に許容される塩であり、式中、
Ｒ１およびＲ１’は、それぞれ独立して、Ｃ１～３アルキレンであり、
Ｒ２およびＲ２’は、それぞれ独立して、直鎖または分枝鎖Ｃ１～６アルキレン、またはＣ３～６シクロアルキレンであり、
Ｒ３およびＲ３’は、それぞれ独立して、任意に置換されたＣ１～６アルキル、または任意に置換されたＣ３～６シクロアルキルであるか、
あるいは、Ｒ２が分枝鎖Ｃ１～６アルキレンである場合、かつＲ３がＣ１～６アルキルである場合、Ｒ２およびＲ３は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成するか、
あるいは、Ｒ２’が分枝鎖Ｃ１～６アルキレンである場合、かつＲ３’がＣ１～６アルキルである場合、Ｒ２’およびＲ３’は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成し、
Ｒ４およびＲ４’は、それぞれ独立して、－ＣＨ、－ＣＨ２ＣＨ、または－（ＣＨ２）２ＣＨであり、
Ｒ５およびＲ５’は、それぞれ独立して、Ｃ１～２０アルキレンまたはＣ２～２０アルケニレンであり、
Ｒ６およびＲ６’は、各出現に対して、独立してＣ１～２０アルキレン、Ｃ３～２０シクロアルキレン、またはＣ２～２０アルケニレンであり、
ｍおよびｎは、それぞれ独立して、１、２、３、４、および５から選択される整数である。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ２およびＲ２’は、それぞれ独立してＣ１～３アルキレンである。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ１またはＲ１’によって表される直鎖または分枝鎖Ｃ１～３アルキレン、Ｒ２またはＲ２’によって表される直鎖または分枝鎖Ｃ１～６アルキレン、および任意に置換された直鎖または分枝鎖Ｃ１～６アルキルは、それぞれ任意に、１つ以上のハロおよびシアノ基で置換されている。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、一緒になったＲ１およびＲ２は、Ｃ１～３アルキレンであり、一緒になったＲ１’およびＲ２’は、Ｃ１～３アルキレン、例えば、エチレンである。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ３およびＲ３’は、それぞれ独立して、任意に置換されたＣ１～３アルキル、例えば、メチルである。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ４およびＲ４’はそれぞれ－ＣＨである。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ２は、任意に置換された分枝鎖Ｃ１～６アルキレンであり、Ｒ２およびＲ３は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、５員または６員のヘテロシクリルを形成する。本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ２’は、任意に置換された分枝鎖Ｃ１～６アルキレンである。Ｒ２’およびＲ３’は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、ピロリジニルまたはピペリジニルなどの５員または６員のヘテロシクリルを形成する。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ４は、－Ｃ（Ｒａ）２ＣＲａ、または－［Ｃ（Ｒａ）２］２ＣＲａであり、Ｒａは、Ｃ１～３アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、５員または６員のヘテロシクリルを形成する。本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ４’は、－Ｃ（Ｒａ）２ＣＲａ、または－［Ｃ（Ｒａ）２］２ＣＲａであり、Ｒａは、Ｃ１～３アルキルであり、Ｒ３’およびＲ４’は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、ピロリジニルまたはピペリジニルなどの５員または６員のヘテロシクリルを形成する。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ５およびＲ５’は、それぞれ独立して、Ｃ１～１０アルキレンまたはＣ２～１０アルケニレンである。一実施形態では、Ｒ５およびＲ５’は、それぞれ独立して、Ｃ１～８アルキレンまたはＣ１～６アルキレンである。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ６およびＲ６’は、各出現に対して、独立して、Ｃ１～１０アルキレン、Ｃ３～１０シクロアルキレン、またはＣ２～１０アルケニレンである。一実施形態では、Ｃ１～６アルキレン、Ｃ３～６シクロアルキレン、またはＣ２～６アルケニレンである。一実施形態では、Ｃ３～１０シクロアルキレンまたはＣ３～６シクロアルキレンは、シクロプロピレンである。本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ｍおよびｎは、それぞれ３である。
本明細書の態様または実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、イオン化可能な脂質は、表１の脂質のうちのいずれか１つまたはその薬学的に許容される塩から選択される。
Figure 2023502576000004
Figure 2023502576000005
Figure 2023502576000006
Figure 2023502576000007
Figure 2023502576000008
Figure 2023502576000009
Figure 2023502576000010
Figure 2023502576000011
Figure 2023502576000012
Figure 2023502576000013
式（Ｉ）のイオン化可能な脂質と、カプシド不含非ウイルスベクター（例えば、ｃｅＤＮＡ）とを含む脂質－核酸粒子（ＬＮＰ）、またはその薬学的組成物は、目的の標的部位（例えば、細胞、組織、器官など）にカプシド不含非ウイルスＤＮＡベクターを送達するために使用され得る。式（Ｉ）のイオン化可能な脂質は、酸性区画、膜不安定化のための（例えば、エンドソームまたはリソソーム）、および還元環境（例えば、細胞質）で切断され得るジスルフィド結合に応答する三級アミンを含む。
しかしながら、国際特許出願公開第２０１９／１８８８６７号に記載されているＳＳ切断可能脂質とは異なり、式（Ｉ）のイオン化可能な脂質は、エステル結合、およびアミド結合、カルバメート結合、エーテル結合、または尿素結合を含まないか、または実質的に含まない。特に、前述の公開された特許出願に記載されているＳＳ切断可能脂質中のフェニルエステルは、脂質の構造の分解性（自己分解性）を高める。一般に、本発明のイオン化可能な脂質は、本明細書に記載の式（Ｉ）で証明されるように、酸素原子を含まないか、または実質的に含まない。
さらに、本発明のイオン化可能な脂質は、本明細書に記載の式（Ｉ）で証明されるように、本明細書で定義される芳香族またはヘテロ芳香族基もしくは部分を含まないか、または実質的に含まない。
一実施形態では、脂質粒子（脂質ナノ粒子）製剤は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、２０１８年９月７日に出願された国際出願第２０１８／０５００４２号に開示されるプロセスにより得られたＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）で作製およびロードされる。これは、脂質をプロトン化し、粒子のｃｅＤＮＡ／脂質会合および核形成に好ましいエネルギー論を提供する、低ｐＨでのエタノール脂質とｃｅＤＮＡなどの水性ＴＮＡとの高エネルギー混合によって達成され得る。粒子は、水性希釈および有機溶媒の除去によってさらに安定化され得る。粒子は、所望のレベルに濃縮され得る。
一般に、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、約１０：１～６０：１の全脂質対核酸（質量または重量）比で調製される。いくつかの実施形態では、脂質対核酸比（質量／質量比、ｗ／ｗ比）は、約１：１～約６０：１、約１：１～約５５：１、約１：１～約５０：１、約１：１～約４５：１、約１：１～約４０：１、約１：１～約３５：１、約１：１～約３０：１、約１：１～約２５：１、約１０：１～約１４：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１、約６：１～約９：１、約３０：１～約６０：１の範囲内であり得る。いくつかの実施形態によれば、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、約６０：１の全脂質比に対する核酸（質量または重量）で調製される。いくつかの実施形態によれば、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、約３０：１の全脂質比に対する核酸（質量または重量）で調製される。脂質および核酸の量を調整して、所望のＮ／Ｐ比、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のＮ／Ｐ比を提供し得る。一般に、脂質粒子製剤の全体脂質含有量は、約５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、ｃｅＤＮＡなどの核酸カーゴを凝縮および／または封入するための薬剤を含む。このような薬剤は、本明細書では、凝縮剤または封入剤とも称される。制限なしに、核酸を凝縮および／または封入するための当該技術分野で既知の任意の化合物は、それが非融合性である限り使用することができる。言い換えれば、薬剤は、ｃｅＤＮＡなどの核酸カーゴを凝縮および／または封入することができるが、融合活性をほとんどまたはまったく有しない。理論に拘束されることを望まないが、凝縮剤は、ｃｅＤＮＡなどの核酸を凝縮／封入しない場合、いくらかの融合活性を有する可能性があるが、当該凝縮剤で形成された脂質ナノ粒子を封入する核酸は、非融合性であり得る。
一般に、イオン化可能な脂質は、核酸カーゴ、例えばｃｅＤＮＡを低ｐＨで凝縮させるため、および膜会合および膜融合性を駆動するために用いられる。一般に、カチオン性脂質は、正に帯電した、または例えばｐＨ６．５以下の酸性条件下でプロトン化される少なくとも１つのアミノ基を含む脂質である。カチオン性脂質はまた、イオン化可能な脂質、例えば、イオン化可能なカチオン性脂質であり得る。「非融合性イオン化可能な脂質」とは、ｃｅＤＮＡなどの核酸カーゴを凝縮および／または封入することができるが、融合性活性を有しないか、またはほとんど有しないイオン化可能な脂質を意味する。
一実施形態では、イオン化可能な脂質は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の２０～９０％（ｍｏｌ）を含み得る。例えば、イオン化可能な脂質モル含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の２０～７０％（ｍｏｌ）、３０～６０％（ｍｏｌ）、４０～６０％（ｍｏｌ）、４０～５５％（ｍｏｌ）または４５～５５％（ｍｏｌ）であり得る。いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約５０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％を含む。
一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、非カチオン性脂質をさらに含むことができる。非カチオン性脂質は、融合性を高め、形成中のＬＮＰの安定性を高めるのに役立つことができる。非イオン性脂質としては、両親媒性脂質、中性脂質、およびアニオン性脂質が挙げられる。したがって、非カチオン性脂質は、中性の非電荷、双性イオン性、またはアニオン性脂質であり得る。非カチオン性脂質は、典型的に、膜融合性を増強するために用いられる。
例示的な非カチオン性脂質としては、ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－モノメチルＰＥなど）、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－ジメチルＰＥなど）、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＨｙＰＥ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リソレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジカシド、セレブロシド、ジセチルホスフェート、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。他のジアシルホスファチジルコリンおよびジアシルホスファチジルエタノールアミンリン脂質もまた使用され得ることを理解されたい。これらの脂質中のアシル基は、好ましくは、Ｃ１０～Ｃ２４炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基、例えば、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、またはオレオイルである。
脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中での使用に好適な非カチオン性脂質の他の例としては、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、パルミチン酸アセチル、リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリル系ポリマー、トリエタノールアミン－硫酸ラウリル、アルキル－アリールサルフェートポリエチルオキシル化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチル臭化アンモニウム、セラミド、スフィンゴミエリンなどの非亜リン脂質が挙げられる。
一実施形態では、非カチオン性脂質は、リン脂質である。一実施形態では、非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、およびＳＭからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣである。他の実施形態では、非カチオン性脂質は、ＤＯＰＣである。他の実施形態では、非カチオン性脂質は、ＤＯＰＥである。
いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の０～２０％（ｍｏｌ）を含み得る。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の０．５～１５％（ｍｏｌ）である。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の５～１２％（ｍｏｌ）である。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の５～１０％（ｍｏｌ）である。一実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約６％（ｍｏｌ）である。一実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約７．０％（ｍｏｌ）である。一実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約７．５％（ｍｏｌ）である。一実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約８．０％（ｍｏｌ）である。一実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約９．０％（ｍｏｌ）である。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約１０％（ｍｏｌ）である。一実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約１１％（ｍｏｌ）である。
例示的な非カチオン性脂質は、ＰＣＴ公開第２０１７／０９９８２３号および米国特許公開第２０１８／００２８６６４号に記載されており、これらの両方の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、脂質粒子の膜の統合性および安定性を提供するために、ステロールなどの成分をさらに含むことができる。一実施形態では、脂質粒子に使用することができる例示的なステロールは、コレステロールまたはその誘導体である。コレステロール誘導体の非限定例としては、５α－コレスタノール、５β－コプロスタノール、コレステリル－（２’－ヒドロキシ）－エチルエーテル、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテルおよび６－ケトコレスタノールなどの極性類似体、５α－コレスタン、コレステノン、５α－コレスタノン、５β－コレスタノンおよびデカン酸コレステリルなどの非極性類似体、ならびにそれらの混合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、コレステロール誘導体は、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテルなどの極性類似体である。いくつかの実施形態では、コレステロール誘導体は、ヘミコハク酸コレストリル（ＣＨＥＭＳ）である。
例示的なコレステロール誘導体は、ＰＣＴ公開第２００９／１２７０６０号および米国特許公開第２０１０／０１３０５８８に記載されており、これらの両方の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、ステロールなどの膜統合性を提供する成分は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の０～５０％（ｍｏｌ）を含み得る。いくつかの実施形態では、そのような成分は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の全脂質含有量の２０～５０％（ｍｏｌ）である。いくつかの実施形態では、そのような成分は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の全脂質含有量の３０～４０％（ｍｏｌ）である。いくつかの実施形態では、そのような成分は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の全脂質含有量の３５～４５％（ｍｏｌ）である。いくつかの実施形態では、そのような成分は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の全脂質含有量の３８～４２％（ｍｏｌ）である。
一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはコンジュゲートされた脂質分子をさらに含み得る。一般に、これらを使用して、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の凝集を阻害し、かつ／または立体安定化を提供する。例示的なコンジュゲートされた脂質としては、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートなど）、カチオン性－ポリマー脂質（ＣＰＬ）コンジュゲート、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、コンジュゲートされた脂質分子は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、例えば、（メトキシポリエチレングリコール）－コンジュゲートされた脂質である。いくつかの実施形態では、コンジュゲートされた脂質分子は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、例えば、ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ（ジミリストイルグリセロール）である。
例示的なＰＥＧ－脂質コンジュゲートとしては、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ））、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、ＰＥＧ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ－ＤＡＧ）（４－Ｏ－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－Ｏ－（ｗ－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ））、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩、またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。追加の例示的なＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、例えば、ＵＳ５，８８５，６１３、ＵＳ６，２８７，５９１、ＵＳ２００３／００７７８２９、ＵＳ２００３／００７７８２９、ＵＳ２００５／０１７５６８２、ＵＳ２００８／００２００５８、ＵＳ２０１１／０１１７１２５、ＵＳ２０１０／０１３０５８８、ＵＳ２０１６／０３７６２２４、およびＵＳ２０１７／０１１９９０４に記載されており、それらすべての内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル、またはＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピルであり得る。ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ジラウリルグリセロール、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、ＰＥＧ－ジステリルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール（１－［８’－（コレスタ－５－エン－３［ベータ］－オキシ）カルボキシアミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、および１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］のうちの１つ以上であり得る。一実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］からなる群から選択することができる。
一実施形態では、ＰＥＧ以外の分子とコンジュゲートされた脂質は、ＰＥＧ－脂質の代わりに使用することもできる。例えば、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートなど）、およびカチオン性－ポリマー脂質（ＣＰＬ）コンジュゲートを、ＰＥＧ－脂質の代わりに、またはそれに加えて使用することができる。例示的なコンジュゲートされた脂質、すなわち、ＰＥＧ－脂質、（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート、およびカチオン性ポリマー－脂質は、ＰＣＴ特許出願公開第１９９６／０１０３９２号、同第１９９８／０５１２７８号、同第２００２／０８７５４１号、同第２００５／０２６３７２号、同第２００８／１４７４３８号、同第２００９／０８６５５８号、同第２０１２／０００１０４号、同第２０１７／１１７５２８号、同第２０１７／０９９８２３号、同第２０１５／１９９９５２号、同第２０１７／００４１４３号、同第２０１５／０９５３４６号、同第２０１２／０００１０４号、同第２０１２／０００１０４号、および同第２０１０／００６２８２号、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号、同第２００５／０１７５６８２号、同第２００８／００２００５８号、同第２０１１／０１１７１２５号、同第２０１３／０３０３５８７号、同第２０１８／００２８６６４号、同第２０１５／０３７６１１５号、同第２０１６／０３７６２２４号、同第２０１６／０３１７４５８号、同第２０１３／０３０３５８７号、同第２０１３／０３０３５８７号、および同第２０１１／０１２３４５３号、ならびに米国特許第５，８８５，６１３号、同第６，２８７，５９１号、同第６，３２０，０１７号、および同第６，５８６，５５９号に記載されており、これらの内容はすべて、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧまたはコンジュゲートされた脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の０～２０％（ｍｏｌ）を含み得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧまたはコンジュゲートされた脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の０．５～１０％（ｍｏｌ）である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧまたはコンジュゲートされた脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の１～５％（ｍｏｌ）である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧまたはコンジュゲートされた脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の１～３％（ｍｏｌ）である。一実施形態では、ＰＥＧまたはコンジュゲートされた脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約１．５％（ｍｏｌ）である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧまたはコンジュゲートされた脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約３％（ｍｏｌ）である。
式（Ｉ）のイオン化可能な脂質と、非カチオン性脂質、ステロール、およびＰＥＧ／コンジュゲートされた脂質とのモル比は、必要に応じて変えることができることが理解される。例えば、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、組成物のモルまたは全重量で３０～７０％のイオン化可能な脂質、組成物のモルまたは全重量で０～６０％のコレステロール、組成物のモルまたは全重量で０～３０％の非カチオン性脂質、および組成物のモルまたは全重量で１～１０％のＰＥＧまたはコンジュゲートされた脂質を含み得る。一実施形態では、組成物は、組成物のモルまたは全重量で４０～６０％のイオン化可能な脂質、組成物のモルまたは全重量で３０～５０％のコレステロール、組成物のモルまたは全重量で５～１５％の非カチオン性脂質、および組成物のモルまたは全重量で１～５％のＰＥＧまたはコンジュゲートされた脂質を含む。一実施形態では、組成物は、組成物のモルまたは全重量で４０～６０％のイオン化可能な脂質、組成物のモルまたは全重量で３０～４０％のコレステロール、および組成物のモルまたは全重量で５～１０％の非カチオン性脂質、および組成物のモルまたは全重量で１～５％のＰＥＧまたはコンジュゲートされた脂質である。組成物は、組成物のモルまたは全重量で６０～７０％のイオン化可能な脂質、組成物のモルまたは全重量で２５～３５％のコレステロール、組成物のモルまたは全重量で５～１０％の非カチオン性脂質、および組成物のモルまたは全重量で０～５％のＰＥＧまたはコンジュゲートされた脂質を含有し得る。組成物はまた、組成物のモルまたは全重量で最大４５～５５％のイオン化可能な脂質、組成物のモルまたは全重量で３５～４５％のコレステロール、および組成物のモルまたは全重量で２～１５％の非カチオン性脂質、および組成物のモルまたは全重量で１～５％のＰＥＧまたはコンジュゲートされた脂質を含有し得る。製剤はまた、例えば、組成物のモルもしくは全重量で８～３０％のイオン化可能な脂質、組成物のモルもしくは全重量で５～１５％の非カチオン性脂質、および組成物のモルもしくは全重量で０～４０％のコレステロール；組成物のモルもしくは全重量で４～２５％のイオン化可能な脂質、組成物のモルもしくは全重量で４～２５％の非カチオン性脂質、組成物のモルもしくは全重量で２～２５％のコレステロール、組成物のモルもしくは全重量で１０～３５％のコンジュゲート脂質、および組成物のモルもしくは全重量で５％のコレステロール；または組成物のモルもしくは全重量で２～３０％のイオン化可能な脂質、組成物のモルもしくは全重量で２～３０％の非カチオン性脂質、組成物のモルもしくは全重量で１～１５％のコレステロール、組成物のモルもしくは全重量で２～３５％のＰＥＧもしくはコンジュゲート脂質、および組成物のモルもしくは全重量で１～２０％のコレステロール；またはさらには組成物のモルもしくは全重量で最大９０％のイオン化可能な脂質、および組成物のモルもしくは全重量で２～１０％の非カチオン性脂質；またはさらには組成物のモルもしくは全重量で１００％のイオン化可能な脂質を含む、脂質ナノ粒子製剤であってもよい。いくつかの実施形態では、脂質粒子製剤は、イオン化可能な脂質、非カチオン性リン脂質、コレステロール、およびＰＥＧ化脂質（コンジュゲートされた脂質）を５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。
一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）製剤は、イオン化可能な脂質、非カチオン性リン脂質、コレステロール、およびＰＥＧ化脂質（コンジュゲートされた脂質）を約５０：７：４０：３のモル比で含む。
一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、イオン化可能な脂質、非カチオン性脂質（例えば、リン脂質）、ステロール（例えば、コレステロール）、およびＰＥＧ化脂質（コンジュゲートされた脂質）を含み、脂質のモル比は、イオン化可能な脂質の場合、２０～７０モルパーセントの範囲であり（目標３０～６０）、非カチオン性脂質のモルパーセントは、０～３０の範囲であり（目標０～１５）、ステロールのモルパーセントは、２０～７０の範囲であり（目標３０～５０）、ＰＥＧ化脂質（コンジュゲートされた脂質）のモルパーセントは、１～６の範囲である（目標２～５）。
ｃｅＤＮＡを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、２０１８年９月７日に提出された国際出願第２０１８／０５００４２号に開示されており、これはその全体が本明細書に組み込まれ、本明細書に開示される方法および組成物における使用が想定される。
脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の粒径は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を使用する準弾性光散乱によって決定され得、およそ５０～１５０ｎｍの直系、およそ５５～９５ｎｍの直径、またはおよそ７０～９０ｎｍの直径である。
製剤化されたイオン化可能な脂質のｐＫａは、核酸の送達のためのＬＮＰの有効性と相関し得る（Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２），５１（３４），８５２９－８５３３、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８，１７２－１７６（２０１０）を参照されたく、それらの両方は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。一実施形態では、各イオン化可能な脂質のｐＫａは、２－（ｐ－トルイジノ）－６－ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）の蛍光に基づくアッセイを使用して、脂質ナノ粒子中で決定される。０．４ｍＭ全脂質の濃度でのＰＢＳ中のイオン化可能な脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－脂質（５０／１０／３８．５／１．５ｍｏｌ％）からなる脂質ナノ粒子は、本明細書および他に記載されるインラインプロセスを使用して調製され得る。ＴＮＳは、蒸留水中の１００ｍＭストック溶液として調製され得る。小胞は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＭＥＳ、１０ｍＭの酢酸アンモニウム、１３０ｍＭのＮａＣｌを含有する２ｍＬの緩衝溶液中の２４ｍＭ脂質に希釈され得、ｐＨは、２．５～１１の範囲である。ＴＮＳ溶液のアリコートを添加して、１ｍＭの最終濃度にすることができ、続いて渦流混合発光強度を、３２１ｎｍの励起波長および４４５ｎｍの発振波長を使用し、ＳＬＭ Ａｍｉｎｃｏ Ｓｅｒｉｅｓ ２発光分光光度計において室温で測定する。Ｓ字状最良適合分析は、蛍光データに適用することができ、ｐＫａは、半最適蛍光強度を生じるｐＨとして測定される。
一実施形態では、相対活性は、尾静脈注射を介した投与の４時間後に肝臓内のルシフェラーゼ発現を測定することによって決定され得る。０．３および１．０ｍｇ ｃｅＤＮＡ／ｋｇの用量で活性を比較し、投与の４時間後に測定された肝臓１ｇあたりのルシフェラーゼｎｇとして表される。
無制限に、本開示の脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、カプシド不含非ウイルスＤＮＡベクターを目的の標的部位（例えば、細胞、組織、器官など）に送達するように使用され得る脂質製剤を含む。一般に、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、カプシド不含非ウイルスＤＮＡベクターおよびイオン化可能な脂質またはその塩を含む。
一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、イオン化可能な脂質／非カチオン性脂質／ステロール／コンジュゲートされた脂質を５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、イオン化可能な脂質／非カチオン性脂質／ステロール／コンジュゲートされた脂質を５１：７：３８．５：３．５のモル比で含む。一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、イオン化可能な脂質／非カチオン性脂質／ステロール／コンジュゲートされた脂質を５１：７：３９：３のモル比で含む。一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、イオン化可能な脂質／非カチオン性脂質／ステロール／コンジュゲートされた脂質を５１．５：７：３９：２．５のモル比で含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲートされた脂質は、ＰＥＧ－脂質、例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧおよび／またはＰＥＧ－ＤＳＰＥである。
一実施形態では、本開示は、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含む脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）製剤を提供する。
ＩＩＩ．治療用核酸（ＴＮＡ）
本開示は、治療用核酸（ＴＮＡ）を送達するための脂質ベースのプラットフォームを提供する。本明細書で使用される場合、「核酸治療」、「治療用核酸」および「ＴＮＡ」という語句は、交換可能に使用され、疾患または障害を治療するための治療剤の活性成分として核酸を使用する治療の任意のモダリティを指す。ＴＮＡは、ＲＮＡベースの治療薬およびＤＮＡベースの治療薬を指す。ＲＮＡベースの治療薬の非限定的な例は、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む。ＤＮＡベースの治療薬の非限定的な例としては、ミニサークルＤＮＡ、ミニ遺伝子、ウイルスＤＮＡ（例えば、レンチウイルスまたはＡＡＶゲノム）または非ウイルスＤＮＡベクター、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ／ＣＥＬｉＤ）、プラスミド、バクミド、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡベクター、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）－ベクター、非ウイルスミニストリングＤＮＡベクター（直鎖状の共有結合的に閉じたＤＮＡベクター）、またはダンベル型ＤＮＡ最小ベクター（「ダンベルＤＮＡ」）が挙げられる。したがって、本開示の態様は、一般に、ＴＮＡを含むイオン化可能な脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）を提供する。
治療用核酸
本開示の例示的な治療用核酸としては、ミニ遺伝子、プラスミド、ミニサークル、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、リボザイム、閉端二本鎖ＤＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ、ＣＥＬｉＤ、直鎖状の共有結合的に閉じたＤＮＡ（「ミニストリング」）、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）、プロテロメア閉端ＤＮＡ、またはダンベル直鎖状ＤＮＡ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、およびＤＮＡウイルスベクター、ウイルスＲＮＡベクター、ならびにそれらの任意の組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されない。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれるプロセスを通じて特定のタンパク質の細胞内レベルを下方調節することができるｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡもまた、本発明によって核酸治療薬であると企図される。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡが宿主細胞の細胞質に導入された後、これらの二本鎖ＲＮＡ構築物はＲＩＳＣと呼ばれるタンパク質に結合することができる。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのセンス鎖はＲＩＳＣ複合体によって除去される。ＲＩＳＣ複合体は、相補的ｍＲＮＡと結合すると、ｍＲＮＡを切断し、切断された鎖を放出する。ＲＮＡｉは、対応するタンパク質の下方調節をもたらすｍＲＮＡの特異的破壊を誘導することによるものである。
タンパク質へのｍＲＮＡ翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）およびリボザイムは、核酸治療薬となり得る。アンチセンス構築物の場合、これらの一本鎖デオキシ核酸は、標的タンパク質ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を有し、ワトソン－クリック塩基対合によってｍＲＮＡに結合することができる。この結合は、標的ｍＲＮＡの翻訳を防ぎ、かつ／またはｍＲＮＡ転写産物のＲＮａｓｅＨ分解を誘起する。その結果、アンチセンスオリゴヌクレオチドは作用の特異性（すなわち、特定の疾患関連タンパク質の下方調節）を高めた。
本明細書で提供される方法および組成物のいずれにおいても、治療用核酸（ＴＮＡ）は治療用ＲＮＡであり得る。当該治療用ＲＮＡは、ｍＲＮＡ翻訳の阻害剤、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の薬剤、触媒的に活性なＲＮＡ分子（リボザイム）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、またはｍＲＮＡ転写物（ＡＳＯ）、タンパク質もしくは他の分子リガンドに結合するＲＮＡ（アプタマー）であり得る。本明細書で提供される方法のいずれにおいても、ＲＮＡｉの薬剤は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ、または三重らせん形成オリゴヌクレオチドであり得る。
本明細書で提供される方法組成物のいずれにおいても、治療用核酸（ＴＮＡ）は、閉端二本鎖ＤＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ、ＣＥＬｉＤ、直鎖状の共有結合的に閉じたＤＮＡ（「ミニストリング」）、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）、プロテロメア閉端ＤＮＡ、ダンベル直鎖状ＤＮＡ、プラスミド、ミニサークルなど）などの治療用ＤＮＡであり得る。本開示のいくつかの実施形態は、導入遺伝子（例えば、治療用核酸）を発現することができる閉端直鎖状二重鎖（ｃｅＤＮＡ）を含む方法および組成物に基づく。本明細書に記載されるようなｃｅＤＮＡベクターは、ウイルスカプシド内の限定空間によって課されるパッケージング制約を有しない。ｃｅＤＮＡベクターは、原核細胞的に産生されたプラスミドＤＮＡベクターに対する可変の真核細胞的に産生された代替物を表す。
ｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、非連続的な構造ではなく直鎖状で連続的な構造を有する。直鎖状で連続的な構造は、細胞エンドヌクレアーゼによる攻撃に対してより安定であると同時に、組換えられて変異誘発を引き起こす可能性が低いと考えられる。したがって、直鎖状で連続的な構造のｃｅＤＮＡベクターは、好ましい実施形態である。連続的な直鎖状の一本鎖分子内二重鎖ｃｅＤＮＡベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列なしに、終端に共有結合している可能性がある。これらのｃｅＤＮＡベクターは、細菌起源の環状二重鎖核酸分子であるプラスミド（本明細書に記載されるｃｅＤＮＡプラスミドを含む）とは構造的に異なる。プラスミドの相補鎖は、変性に続いて分離されて２つの核酸分子を産生することができるが、反対に、ｃｅＤＮＡベクターは、相補鎖を有するが、単一ＤＮＡ分子であり、したがって変性された場合でも単一分子のままである。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、プラスミドとは異なり、原核細胞タイプのＤＮＡ塩基メチル化なしに産生され得る。したがって、ｃｅＤＮＡベクターおよびｃｅＤＮＡ－プラスミドは、構造（特に、直鎖状対環状）ならびにこれらの異なる対象物を産生および精製するために使用される方法の両方に関して、またｃｅＤＮＡ－プラスミドの場合は原核細胞タイプおよびｃｅＤＮＡベクターの場合は真核細胞タイプのものである、それらのＤＮＡメチル化に関して異なる。
本明細書で提供されるのは、共有結合性閉端を有する非ウイルスカプシド不含ｃｅＤＮＡ分子（ｃｅＤＮＡ）である。これらの非ウイルスカプシド不含ｃｅＤＮＡ分子は、２つの異なる逆位末端反復（ＩＴＲ）配列の間に位置付けられた異種遺伝子（例えば、導入遺伝子、特に治療用導入遺伝子）を含有する発現構築物（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスまたは統合型細胞株）からの許容宿主細胞中で産生され得、ＩＴＲは、互いに関して異なる。いくつかの実施形態では、ＩＴＲのうちの１つは、野生型ＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ）と比較した欠失、挿入、および／または置換によって修飾され、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、機能性末端分解部位（ｔｒｓ）およびＲｅｐ結合部位を含む。ｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、発現カセットなどの分子の少なくとも一部分にわたって二重鎖、例えば、自己相補的である（例えば、ｃｅＤＮＡは、二本鎖環状分子ではない）。ｃｅＤＮＡベクターは、共有結合性閉端を有し、したがって、例えば、１時間以上３７℃でエキソヌクレアーゼ消化（例えば、エキソヌクレアーゼＩまたはエキソヌクレアーゼＩＩＩ）に対して耐性である。
一態様では、ｃｅＤＮＡベクターは、５’から３’方向に、第１のアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、目的のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット）、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、第１のＩＴＲ（５’ＩＴＲ）および第２のＩＴＲ（３’ＩＴＲ）は、互いに対して非対称である。すなわち、それらは、互いに異なる三次元空間構成を有する。例示的な実施形態として、第１のＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり得、第２のＩＴＲは、変異型または修飾型ＩＴＲであり得るか、またはその逆であり、第１のＩＴＲは、変異型または修飾型ＩＴＲであり得、第２のＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり得る。一実施形態では、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲは、両方とも修飾されているが、異なる配列であるか、または異なる修飾を有するか、または同一の修飾型ＩＴＲではなく、異なる３次元空間構成を有する。言い換えると、非対称ＩＴＲを用いるｃｅＤＮＡベクターは、ＷＴ－ＩＴＲに対する１つのＩＴＲのいかなる変更も他のＩＴＲに反映されないＩＴＲを有するか、あるいは非対称ＩＴＲが修飾された非対称ＩＴＲ対を有する場合は、互いに対して異なる配列および異なる三次元形状を有し得る。
一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、５’から３’方向に、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、目的のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット）、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含み、第１のＩＴＲ（５’ＩＴＲ）および第２のＩＴＲ（３’ＩＴＲ）は、互いに対して対称または実質的に対称であり、すなわち、ｃｅＤＮＡベクターは、対称の三次元空間構成を有するＩＴＲ配列を含み得、それによりそれらの構造は、幾何学的空間で同じ形状であるか、または三次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’、Ｂ－Ｂ’ループを有する。そのような実施形態では、対称のＩＴＲ対、または実質的に対称のＩＴＲ対は、野生型ＩＴＲではない修飾型ＩＴＲ（例えば、ｍｏｄ－ＩＴＲ）であり得る。ｍｏｄ－ＩＴＲ対は、野生型ＩＴＲからの１つ以上の修飾を有し、互いに逆相補（逆位）である同じ配列を有し得る。一実施形態では、修飾型ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、修飾型ＩＴＲ対は、異なる配列を有し得るが、対応するまたは同じ対称な３次元形状を有し得る。いくつかの実施形態では、対称のＩＴＲ、または実質的に対称のＩＴＲは、本明細書に記載されるように野生型（ＷＴ－ＩＴＲ）であり得る。すなわち、両方のＩＴＲが野生型配列を有するが、必ずしも同じＡＡＶ血清型のＷＴ－ＩＴＲである必要はない。一実施形態では、一方のＷＴ－ＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他方のＷＴ－ＩＴＲは、異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。そのような実施形態では、ＷＴ－ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、それらは、対称的な三次元空間構成を維持しながら、１つ以上の保存的ヌクレオチド修飾を有することができる。
本明細書に提供される野生型または変異型または他の方法で修飾されたＩＴＲ配列は、ｃｅＤＮＡベクターの産生のために発現構築物（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス）に含まれるＤＮＡ配列を表す。したがって、ｃｅＤＮＡ－プラスミドまたは他の発現構築物から産生されたｃｅＤＮＡベクター中に実際に含有されるＩＴＲ配列は、産生プロセス中に起こる天然に存在する変化（例えば、複製エラー）の結果として、本明細書に提供されるＩＴＲ配列に対して同一であっても同一でなくてもよい。
一実施形態では、治療用核酸配列である導入遺伝子を有する発現カセットを含む本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を可能にするかまたは制御する１つ以上の調節配列に作動可能に連結され得る。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、第１のＩＴＲ配列および第２のＩＴＲ配列を含み、目的のヌクレオチド配列は、第１および第２のＩＴＲ配列によって隣接され、第１および第２のＩＴＲ配列は、互いに対して非対称であるか、または互いに対して対称である。
一実施形態では、発現カセットは、２つのＩＴＲ間に位置し、導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーター、転写後調節エレメント、ならびにポリアデニル化および終結シグナルのうちの１つ以上をこの順に含む。一実施形態では、プロモーターは、調節可能－誘導可能または抑制可能である。プロモーターは、導入遺伝子の転写を促進する任意の配列であり得る。一実施形態では、プロモーターは、ＣＡＧプロモーターまたはその変形である。転写後調節エレメントは、導入遺伝子の発現を調整する配列であり、非限定的な例として、治療用核酸配列である導入遺伝子の発現を強化する三次構造を作成する任意の配列である。
一実施形態では、転写後調節エレメントは、ＷＰＲＥを含む。一実施形態では、ポリアデニル化および終結シグナルは、ＢＧＨポリＡを含む。当該技術分野において既知の任意のシス調節エレメント、またはその組み合わせ、例えば、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサー配列（ＵＳＥ）または他の転写後処理エレメント（限定されないが、単純ヘルペスウイルスまたはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のチミジンキナーゼ遺伝子を含む）が追加として使用され得る。一実施形態では、５’～３’方向の発現カセット長は、ＡＡＶビリオン中でカプシド化されることが知られている最大長を超える。一実施形態では、長さは、４．６ｋｂ超、または５ｋｂ超、または６ｋｂ超、または７ｋｂ超である。様々な発現カセットが、本明細書に例示される。
一実施形態では発現カセットは、４０００ヌクレオチド超、５０００ヌクレオチド、１０，０００ヌクレオチド、もしくは２０，０００ヌクレオチド、もしくは３０，０００ヌクレオチド、もしくは４０，０００ヌクレオチド、または５０，０００ヌクレオチド、または約４０００～１０，０００ヌクレオチド、もしくは１０，０００～５０，０００ヌクレオチドの任意の範囲、または５０，０００ヌクレオチド超を含み得る。
一実施形態では、発現カセットはまた、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）および／または２Ａエレメントを含み得る。シス調節エレメントとしては、プロモーター、リボスイッチ、インスレーター、ｍｉｒ調節エレメント、転写後調節エレメント、組織および細胞型特異的プロモーター、ならびにエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、導入遺伝子のプロモーターとして作用し得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の構成成分、例えば、導入遺伝子の発現を制御および調節するための調節スイッチを含み、所望であれば、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の制御された細胞死を可能にするキルスイッチである調節スイッチを含み得る。
一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、カプシド不含であり、第１のＩＴＲ、発現可能な導入遺伝子カセットおよび第２のＩＴＲをこの順にコードするプラスミドから取得され得、第１および／または第２のＩＴＲ配列のうちの少なくとも１つは、対応する野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列に関して変異する。
一実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、治療目的（例えば、医療、診断、もしくは獣医学的使用）または免疫原性ポリペプチドに使用される。
発現カセットは、治療用核酸配列である任意の導入遺伝子を含むことができる。ある特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、１つ以上のポリペプチド、ペプチド、リボザイム、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉｓ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、抗体、抗原結合断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む、対象における任意の目的の遺伝子を含む。
一実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターの発現カセット、発現構築物、またはドナー配列で提供される配列は、宿主細胞についてコドン最適化することができる。本明細書で使用される場合、「最適化されたコドン」または「コドン最適化」という用語は、目的の脊椎動物、例えばマウスまたはヒトの細胞中の発現強化のために、少なくとも１つ、２つ以上、または相当数の未変性配列（例えば、原核細胞配列）のコドンを、その脊椎動物の遺伝子中でより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンと置き換えることによって、核酸配列を修飾するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンに対して特定の偏向を呈する。
典型的に、コドン最適化は、元の翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列を変更しない。最適化されたコドンは、例えば、ＡｐｔａｇｅｎのＧｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（登録商標）コドン最適化およびカスタム遺伝子合成プラットフォーム（Ａｐｔａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，２１９０ Ｆｏｘ Ｍｉｌｌ Ｒｄ．Ｓｕｉｔｅ ３００，Ｈｅｒｎｄｏｎ，Ｖａ．２０１７１）または別の公開データベースを使用して決定することができる。
多くの生物は、特定のコドンを使用して、成長するペプチド鎖における特定のアミノ酸の挿入をコードする偏向を示す。生物間のコドン使用頻度の違いであるコドン優先またはコドン偏向は、遺伝暗号の縮退によってもたらされ、多くの生物の間で十分に文書化されている。コドン偏向は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関関係があることが多く、特に翻訳されるコドンの特性および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の可用性に依存すると考えられている。細胞内の選択されたｔＲＮＡの優勢は、一般にペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために遺伝子を調整することができる。
多種多様な動物、植物、および微生物種で利用可能な多数の遺伝子配列を考えると、コドン使用頻度の相対頻度を計算することが可能である（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．″Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００″Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００））。
逆位末端反復（ＩＴＲ）
本明細書に記載されるように、ｃｅＤＮＡベクターは、共有結合性末端（直鎖状で連続的な非カプシド構造）を有する相補的ＤＮＡの連続鎖から形成されたカプシド不含直鎖状二重鎖ＤＮＡ分子であり、異なるか、または互いに対して非対称である５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列および３’ＩＴＲ配列を含む。ＩＴＲのうち少なくとも１つは、機能的末端分解部位および複製タンパク質結合部位（ＲＰＳ）（複製タンパク質結合部位と呼ばれることもある）、例えば、Ｒｅｐ結合部位を含む。一般に、ｃｅＤＮＡベクターは、少なくとも１つの修飾型ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）、すなわち、他のＩＴＲに対する欠失、挿入、および／または置換、ならびに発現可能な導入遺伝子を含有する。
一実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、ＡＡＶ ＩＴＲ、例えば、野生型ＡＡＶ ＩＴＲである。一実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、他のＩＴＲに対する修飾型ＩＴＲであり、すなわち、ｃｅＤＮＡは、互いに対して非対称であるＩＴＲを含む。一実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、非機能的ＩＴＲである。
一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、（１）シス調節エレメント、プロモーター、および少なくとも１つの導入遺伝子を含む発現カセット；（２）少なくとも１つの導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーター；ならびに（３）当該発現カセットに隣接する２つの自己相補的配列、例えば、ＩＴＲを含み、ｃｅＤＮＡベクターは、カプシドタンパク質と関連していない。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＡＡＶゲノム中で見出される２つの自己相補的配列を含み、少なくとも１つは、操作的Ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）およびＡＡＶの末端分解部位（ｔｒｓ）またはＲＢＥの機能的バリアント、および導入遺伝子に作動可能に連結された１つ以上のシス調節エレメントを含む。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の構成成分、例えば、導入遺伝子の発現を制御および調節するための調節スイッチを含み、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の制御された細胞死を可能にするキルスイッチである調節スイッチを含み得る。
一実施形態では、２つの自己相補的配列は、任意の既知のパルボウイルス、例えばＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１～ＡＡＶ１２）などのディペンドウイルスからのＩＴＲ配列であり得る。ヘアピン二次構造形成を可能にする可変パリンドローム配列に加えて、５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’などのＲｅｐ結合部位（ＲＢＳ）および末端分解部位（ｔｒｓ）を保持する修飾型ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を含むが、これらに限定されない任意のＡＡＶ血清型を使用することができる。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、合成であり得る。一実施形態では、合成ＩＴＲは、２つ以上のＡＡＶ血清型からのＩＴＲ配列に基づいている。別の実施形態では、合成ＩＴＲは、ＡＡＶベース配列を含まない。さらに別の実施形態では、合成ＩＴＲは、上記のＩＴＲ構造を保存するが、わずかなＡＡＶ源配列を有するか、または全く有しない。いくつかの態様において、合成ＩＴＲは、野生型Ｒｅｐまたは特定の血清型のＲｅｐと優先的に相互作用し得るか、または場合によっては、野生型Ｒｅｐによって認識されず、変異Ｒｅｐによってのみ認識される。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、ヘアピン二次構造形成を可能にする可変パリンドローム配列に加えて、５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’などの機能性Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ）および末端分解部位（ＴＲＳ）を保持する合成ＩＴＲ配列である。いくつかの例では、修飾型ＩＴＲ配列は、ＲＢＳ、ｔｒｓの配列、ならびに野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲの対応する配列からの１つのＩＴＲヘアピン二次構造の末端ループ部分を形成するＲｅｐ結合エレメントの構造および位置を保持する。ｃｅＤＮＡベクターで使用するための例示的なＩＴＲ配列は、表２～９、１０Ａおよび１０Ｂ、配列番号２、５２、１０１～４４９および５４５～５４７に開示され、２０１８年９月７日に出願されたＰＣＴ出願第１８／４９９９６号の図２６Ａ～２６Ｂに示される部分的なＩＴＲ配列。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、表２、３、４、５、６、７、８、９、１０Ａおよび１０Ｂ ２０１８年９月７日に出願されたＰＣＴ出願第１８／４９９９６号のいずれか１つ以上に示されるＩＴＲ配列またはＩＴＲ部分配列における修飾のうちのいずれかに対応するＩＴＲにおける修飾を伴うＩＴＲを含み得る。
一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、シス調節エレメントの特定の組み合わせをさらに含む発現構築物から産生され得る。シス調節エレメントとしては、プロモーター、リボスイッチ、インスレーター、ｍｉｒ調節エレメント、転写後調節エレメント、組織および細胞型特異的プロモーター、ならびにエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、導入遺伝子のプロモーターとして作用し得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加成分、例えば、２０１８年９月７日に出願されたＰＣＴ出願第１８／４９９９６号に記載される調節スイッチを含み、導入遺伝子、またはｃｅＤＮＡベクターを含む細胞を殺傷し得るキルスイッチの発現を調節する。
一実施形態では、発現カセットはまた、導入遺伝子の発現を増加させるために、転写後エレメントを含み得る。一実施形態では、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を使用して、導入遺伝子の発現を増加させる。他の転写後処理エレメント、例えば、単純ヘルペスウイルスまたはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のチミジンキナーゼ遺伝子からの転写後エレメントを使用することができる。分泌配列は、導入遺伝子、例えば、ＶＨ－０２およびＶＫ－Ａ２６配列に連結され得る。発現カセットは、例えば、ウシＢＧＨｐＡもしくはウイルスＳＶ４０ｐＡから単離された天然配列、または合成配列などの、当該技術分野において既知のポリアデニル化配列またはその変形を含み得る。いくつかの発現カセットはまた、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサー（ＵＳＥ）配列を含み得る。ＵＳＥは、ＳＶ４０ｐＡまたは異種ポリＡシグナルと組み合わせて使用され得る。
２０１８年９月７日に出願され、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際出願第２０１８／０５００４２号の図１Ａ～１Ｃは、非限定の例示的なｃｅＤＮＡベクター、またはｃｅＤＮＡプラスミドの対応する配列の概略図を示す。ｃｅＤＮＡベクターは、カプシド不含であり、第１のＩＴＲ、発現可能な導入遺伝子カセットおよび第２のＩＴＲをこの順にコードするプラスミドから取得され得、第１および／または第２のＩＴＲ配列のうちの少なくとも１つは、対応する野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列に関して変異する。発現可能な導入遺伝子カセットは、好ましくは、エンハンサー／プロモーター、ＯＲＦレポーター（導入遺伝子）、転写後調節エレメント（例えば、ＷＰＲＥ）、ならびにポリアデニル化および終結シグナル（例えば、ＢＧＨポリＡ）のうちの１つ以上をこの順序で含む。
プロモーター
上記のものを含む好適なプロモーターは、ウイルスに由来し得るため、ウイルスプロモーターと称され得るか、またはそれらは、原核生物または真核生物を含む任意の生物に由来し得る。好適なプロモーターを使用して、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ ＩＩＩ）によって発現を駆動することができる。例示的なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＴＥ）などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６小核プロモーター（Ｕ６、例えば、（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｌ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０，４９７－５００（２００２））、強化Ｕ６プロモーター（例えば、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ｓｅｐ．１；３１（１７））、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）、ＣＡＧプロモーター、ヒトα１－抗トリプシン（ＨＡＡＴ）プロモーター（例えば、など）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、これらのプロモーターは、それらの下流イントロン含有端で変更されて、１つ以上のヌクレアーゼ切断部位を含む。一実施形態では、ヌクレアーゼ切断部位を含有するＤＮＡは、プロモーターＤＮＡに対して外来である。
一実施形態では、プロモーターは、１つ以上の特定の転写調節配列を含むことにより、発現をさらに増強する、ならびに／またはその空間的発現および／もしくは時間的発現を変更することができる。プロモーターはまた、転写の開始部位から数千塩基対も離れて位置し得る遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含み得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む供給源に由来し得る。プロモーターは、発現が起こる細胞、組織もしくは器官に関して、または発現が起こる発達段階に関して、または生理学的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤などの外部刺激に応答して、構成的または示差的に遺伝子成分の発現を調節し得る。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーターおよびＣＭＶ ＩＥプロモーター、ならびに以下に列挙されるプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターおよび／またはエンハンサーは、目的の任意の遺伝子、例えば、治療用タンパク質）の発現に使用できる。例えば、ベクターは、治療用タンパク質をコードする核酸配列に操作可能に連結されるプロモーターを含み得る。一実施形態では、治療用タンパク質コード配列に操作可能に連結されたプロモーターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えば、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）の長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ最初期プロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。一実施形態では、プロモーターはまた、ヒトユビキチンＣ（ｈＵｂＣ）、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子からのプロモーターであってもよい。プロモーターはまた、天然または合成の、組織特異的プロモーター、例えば、肝臓特異的プロモーター、例えば、ヒトα１－抗トリプシン（ＨＡＡＴ）であり得る。一実施形態では、肝臓への送達は、肝細胞の表面上に存在する低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体を介して、肝細胞へのｃｅＤＮＡベクターを含む組成物の内因性ＡｐｏＥ特異的標的を使用して達成され得る。
一実施形態では、使用されるプロモーターは、治療タンパク質をコードする遺伝子の未変性プロモーターである。治療用タンパク質をコードするそれぞれの遺伝子のプロモーターおよび他の調節配列は既知であり、特徴付けられている。使用されるプロモーター領域は、１つ以上の追加の調節配列（例えば、未変性）、例えば、エンハンサーをさらに含み得る。
本発明に従って使用するための好適なプロモーターの非限定例としては、例えば、ＣＡＧプロモーター、ＨＡＡＴプロモーター、ヒトＥＦ１－αプロモーター、またはＥＦ１－αプロモーターおよびラットＥＦ１－αプロモーターの断片が挙げられる。
ポリアデニル化配列
ポリアデニル化配列をコードする配列は、ｃｅＤＮＡベクターから発現されたｍＲＮＡを安定化するため、および核輸送および翻訳を助けるために、ｃｅＤＮＡベクター中に含まれ得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ポリアデニル化配列を含まない。他の実施形態では、ベクターは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０以上のアデニンジヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化配列は、約４３ヌクレオチド、約４０～５０ヌクレオチド、約４０～５５ヌクレオチド、約４５～５０ヌクレオチド、約３５～５０ヌクレオチド、またはその間の任意の範囲を含む。
一実施形態では、ｃｅＤＮＡは、２つの異なる逆位末端反復配列（ＩＴＲ）（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ）の間に作動可能に位置付けられた異種核酸をコードするベクターポリヌクレオチドから取得可能であり、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、末端分解部位および複製タンパク質結合部位（ＲＰＳ）、例えば、Ｒｅｐ結合部位（例えば、ｗｔ ＡＡＶ ＩＴＲ）を含み、ＩＴＲのうちの１つは、他のＩＴＲ、例えば機能的ＩＴＲに関する欠失、挿入、および／または置換を含む。
一実施形態では、宿主細胞はウイルスカプシドタンパク質を発現せず、ポリヌクレオチドベクターテンプレートは任意のウイルスカプシドコード配列を欠いている。一実施形態では、ポリヌクレオチドベクターテンプレートは、ＡＡＶカプシド遺伝子を欠いているが、他のウイルスのカプシド遺伝子も欠いている）。一実施形態では、核酸分子はまた、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コード配列を欠いている。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は、機能的なＡＡＶキャップおよびＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の両方を欠いている。
一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、修飾型ＩＴＲを有しない。
一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示される（または、２０１８年９月７日に出願されたＰＣＴ出願第１８／４９９９６号において）調節スイッチを含む。
ＩＶ．ｃｅＤＮＡベクターの産生
本明細書で定義される非対称ＩＴＲ対または対称ＩＴＲ対を含む本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクターの産生のための方法は、２０１８年９月７日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６のセクションＩＶに記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるように、ｃｅＤＮＡベクターは、例えば、ａ）ポリヌクレオチド発現構築物テンプレート（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、および／またはｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス）を内包する宿主細胞（例えば、昆虫細胞）の集団をインキュベートするステップであって、Ｒｅｐタンパク質の存在下では、宿主細胞内のｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたってウイルスカプシドコード配列を欠いており、宿主細胞が、ウイルスカプシドコード配列を含まない、インキュベートするステップと、ｂ）ｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞から採取し、単離するステップと、を含むプロセスによって取得され得る。Ｒｅｐタンパク質の存在は、修飾型ＩＴＲを有するベクターポリヌクレオチドの複製を誘導して、宿主細胞中でｃｅＤＮＡベクターを産生する。
しかしながら、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶビリオン）は発現されない。したがって、ＡＡＶまたは他のウイルスベースベクターにおいて天然に課されるものなどのサイズ制限はない。
宿主細胞から単離されたｃｅＤＮＡベクターの存在は、宿主細胞から単離されたＤＮＡをｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、ならびに消化されたＤＮＡ材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状かつ非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状かつ連続的なＤＮＡのバンドの存在を確認することによって確認され得る。
一実施形態では、本発明は、例えば、Ｌｅｅ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ ８（８）：ｅ６９８７９に記載されるように、非ウイルスＤＮＡベクターの産生において、ＤＮＡベクターポリヌクレオチド発現テンプレート（ｃｅＤＮＡテンプレート）をそれら自体のゲノムに安定して組み込んでいる宿主細胞株の使用を提供する。好ましくは、Ｒｅｐは、約３のＭＯＩで宿主細胞に付加される。宿主細胞株が哺乳動物細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３細胞である場合、細胞株は、安定して組み込まれたポリヌクレオチドベクターテンプレートを有し得、ヘルペスウイルスなどの第２のベクターを使用して、Ｒｅｐタンパク質を細胞に導入することができ、Ｒｅｐおよびヘルパーウイルスの存在下でのｃｅＤＮＡの切除および増幅を可能にする。
一実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを作製するために使用される宿主細胞は、昆虫細胞であり、バキュロウイルスは、Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ｃｅＤＮＡの非ウイルスＤＮＡベクターポリヌクレオチド発現構築物テンプレートとを両方送達するために使用される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｒｅｐタンパク質を発現するために操作される。
次いで、ｃｅＤＮＡベクターは、宿主細胞から採取され、単離される。本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを細胞から採取および収集するための時間は、ｃｅＤＮＡベクターの高収率産生を達成するために選択され、最適化され得る。例えば、採取時間は、細胞生存率、細胞形態論、細胞増殖などを考慮して選択され得る。一実施形態では、細胞は、十分な条件下で増殖し、ｃｅＤＮＡベクターを産生するためのバキュロウイルス感染から十分な時間が経過した後、但し細胞の大部分がバキュロウイルスの毒性のために死滅し始める前に採取される。ＤＮＡ－ベクターは、Ｑｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏ－Ｆｒｅｅプラスミドキットなどのプラスミド精製キットを使用して単離され得る。プラスミド単離のために開発された他の方法もまた、ＤＮＡ－ベクターに対して適合され得る。一般に、任意の核酸精製方法が採用され得る。
ＤＮＡベクターは、ＤＮＡの精製のための当業者に既知の任意の手段によって精製され得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＤＮＡ分子として精製される。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、エキソソームまたは微粒子として精製される。ｃｅＤＮＡベクターの存在は、細胞から単離されたベクターＤＮＡをＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、ならびにゲル電気泳動を使用し、消化されたＤＮＡ材料および未消化のＤＮＡ材料の両方を分析して、直鎖状かつ非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状かつ連続的なＤＮＡのバンドの存在を確認することによって確認され得る。
Ｖ．脂質粒子の調製
脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、ＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）および脂質の混合時に自発的に形成することができる。所望の粒子サイズ分布に応じて、得られたナノ粒子混合物は、例えば、Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）などのサーモバレル押出機を使用して、膜（例えば、１００ｎｍカットオフ）を通して押し出すことができる。場合によっては、押し出しステップは省略することができる。エタノール除去および同時緩衝液交換は、例えば、透析またはタンジェンシャル・フロー・フィルトレーションによって達成され得る。
一般に、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、当該技術分野において既知の任意の方法によって形成することができる。例えば、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、例えば、ＵＳ２０１３／００３７９７７、ＵＳ２０１０／００１５２１８、ＵＳ２０１３／０１５６８４５、ＵＳ２０１３／０１６４４００、ＵＳ２０１２／０２２５１２９およびＵＳ２０１０／０１３０５８８に記載されている方法によって調製することができ、これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、連続混合法、直接希釈プロセス、またはインライン希釈プロセスを使用して調製することができる。直接希釈およびインライン希釈プロセスを使用して脂質ナノ粒子を調製するための装置のプロセスおよび装置は、ＵＳ２００７／００４２０３１に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。段階希釈プロセスを使用して脂質ナノ粒子を調製するためのプロセスおよび装置は、ＵＳ２００４／０１４２０２５に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、衝突ジェットプロセスによって調製することができる。一般に、粒子は、アルコール（例えば、エタノール）に溶解した脂質を、緩衝液、例えば、クエン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウムおよび塩化マグネシウム緩衝液、リンゴ酸緩衝液、リンゴ酸および塩化ナトリウム緩衝液、またはクエン酸ナトリウムおよび塩化ナトリウム緩衝液、に溶解したｃｅＤＮＡと混合することによって形成される。ｃｅＤＮＡに対する脂質の混合比は、約４５～５５％の脂質および約６５～４５％のｃｅＤＮＡであり得る。
脂質溶液は、アルコール、例えばエタノール中に、５～３０ｍｇ／ｍＬ、よりおそらく５～１５ｍｇ／ｍＬ、最もおそらく９～１２ｍｇ／ｍＬの全脂質濃度で、式（Ｉ）のイオン化可能な脂質、非カチオン性脂質（例えば、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＥ、およびＤＯＰＣなどのリン脂質）、ＰＥＧまたはＰＥＧコンジュゲートされた分子（例えば、ＰＥＧ－脂質）、およびステロール（例えば、コレステロール）を含有することができる。脂質溶液において、脂質のモル比は、カチオン性脂質の場合、約２５～９８％、好ましくは約３５～６５％、非イオン性脂質の場合、約０～１５％、好ましくは約０～１２％、ＰＥＧまたはＰＥＧコンジュゲートされた脂質分子の場合、約０～１５％、好ましくは約１～６％、ステロールの場合、約０～７５％、好ましくは約３０～５０％の範囲であり得る。
ｃｅＤＮＡ溶液は、３．５～５の範囲のｐＨを有する、緩衝溶液中に０．３～１．０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、０．３～０．９ｍｇ／ｍＬの濃度範囲でｃｅＤＮＡを含むことができる。
ＬＮＰを形成するために、１つの例示的であるが非限定的な実施形態では、２つの液体は、約１５～４０℃、好ましくは約３０～４０℃の範囲の温度に加熱され、次いで、例えば、衝突ジェットミキサーにおいて混合され、即座にＬＮＰを形成する。混合流量は、１０～６００ｍＬ／分の範囲であり得る。チューブＩＤは、０．２５～１．０ｍｍの範囲を有し、１０～６００ｍＬ／分の総流量であり得る。流量とチューブＩＤとの組み合わせは、ＬＮＰの粒子サイズを３０～２００ｎｍに制御する効果を有し得る。次いで、溶液を、より高いｐＨで、１：１～１：３のｖｏｌ：ｖｏｌ、好ましくは約１：２のｖｏｌ：ｖｏｌの範囲の混合比で緩衝溶液と混合することができる。必要に応じて、この緩衝溶液は、１５～４０℃または３０～４０℃の範囲の温度になり得る。次いで、混合されたＬＮＰは、アニオン交換濾過ステップを受けることができる。アニオン交換の前に、混合されたＬＮＰを一定期間、例えば３０分～２時間インキュベートすることができる。インキュベーション中の温度は、１５～４０℃または３０～４０℃の範囲の温度になり得る。インキュベーション後、アニオン交換分離ステップを含む０．８μｍフィルターなどのフィルターで溶液を濾過する。このプロセスでは、１ｍｍのＩＤ～５ｍｍのＩＤの範囲のチューブＩＤおよび１０～２０００ｍＬ／分の流量を使用できる。
形成後、ＬＮＰを濃縮し、限外濾過プロセスを介して限界濾過することができ、このプロセスでは、アルコールが除去され、緩衝液が最終的な緩衝溶液、例えば、約ｐＨ７、例えば約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、または約ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と交換される。
限外濾過プロセスでは、膜の公称分子量カットオフ範囲が３０～５００ｋＤのタンジェンシャル・フロー・フィルトレーションフォーマット（ＴＦＦ）を使用できる。膜フォーマットは中空糸またはフラットシートカセットである。適切な分子量カットオフのＴＦＦプロセスでは、保持液にＬＮＰを保持することができ、濾液または透過液はアルコール、クエン酸緩衝液および最終緩衝液の廃棄物を含有する。ＴＦＦプロセスは、初期濃度が１～３ｍｇ／ｍＬのｃｅＤＮＡ濃度になる複数ステップのプロセスである。濃縮後、ＬＮＰ溶液を最終緩衝液に対して１０～２０容量で限界濾過し、アルコールを除去して緩衝液交換を実施する。次いで、材料をさらに１～３倍に濃縮することができる。濃縮されたＬＮＰ溶液は滅菌濾過できる。
ＶＩ．薬学的組成物および製剤
本明細書では、ＴＮＡ脂質粒子および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む薬学的組成物もまた提供される。
一実施形態では、ＴＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、治療用核酸の完全な封入、部分的な封入とともに提供される。一実施形態では、核酸治療薬は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に完全に封入されて、脂質粒子を含有する核酸を形成する。一実施形態では、核酸は、粒子の脂質部分内に封入され得、それによって、それを酵素分解から保護し得る。
一実施形態では、脂質粒子は、効果的な送達を保証するため、約２０ｎｍ～約１００ｎｍ、３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約９０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、または約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、もしくは１５０ｎｍの平均直径を有する。核酸含有脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）およびそれらの調製方法は、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１８／５００４２、米国特許公開第２００４／０１４２０２５号および同第２００７／００４２０３１号に開示されており、これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）サイズは、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）システムを使用して準弾性光散乱によって決定することができる。
一般に、本発明の脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、意図した治療効果を提供するように選択された平均直径を有する。
脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の意図した使用に応じて、構成成分の割合は変化し得、特定の製剤の送達効率は、例えば、エンドソーム放出パラメータ（ＥＲＰ）アッセイを使用して測定され得る。
一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、凝集を防止するために他の部分とコンジュゲートされ得る。そのような脂質コンジュゲートには、例えば、ジアルキルオキシプロピルと共役したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲート）、ジアシルグリセロールと共役したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＧコンジュゲート）、コレステロールと共役したＰＥＧ、ホスファチジルエタノールアミンと共役したＰＥＧ、およびセラミドと共役したＰＥＧ（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号を参照されたい）などのＰＥＧ－脂質コンジュゲート、カチオン性ＰＥＧ脂質、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート（例えば、ＰＯＺ－ＤＡＡコンジュゲート、例えば、２０１０年１月１３日に出願された米国仮出願第６１／２９４，８２８号、および２０１０年１月１４日に出願された米国仮出願第６１／２９５，１４０号を参照されたい）、ポリアミドオリゴマー（例えば、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート）ならびにそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。ＰＯＺ－脂質コンジュゲートの追加例は、ＰＣＴ公開第２０１０／００６２８２号に記載されている。ＰＥＧまたはＰＯＺは、脂質に直接コンジュゲートするか、リンカー部分を介して脂質に結合することができる。例えば、非エステル含有リンカー部分およびエステル含有リンカー部分を含む、ＰＥＧまたはＰＯＺを脂質に結合するのに好適な任意のリンカー部分を使用することができる。ある特定の好ましい実施形態では、アミドまたはカルバメートなどの非エステル含有リンカー部分が使用される。上記の各特許文書の開示内容は、あらゆる目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、ｃｅＤＮＡは、粒子の脂質部分と複合され得るか、または脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の脂質位置に封入され得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡは、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の脂質位置に完全に封入され得、それによって例えば水溶液中のヌクレアーゼによる分解からそれを保護する。一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中のｃｅＤＮＡは、３７℃で少なくとも約２０、３０、４５、または６０分間のヌクレアーゼへの脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の曝露後に実質的に分解されない。いくつかの実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中のｃｅＤＮＡは、３７℃で少なくとも約３０、４５、もしくは６０分、または少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、もしくは３６時間の血清中の粒子のインキュベーション後に実質的に分解されない。
一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、対象、例えばヒトなどの哺乳動物に対して実質的に非毒性である。
一実施形態では、本開示の治療用核酸を含む薬学的組成物は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に製剤化され得る。いくつかの実施形態では、治療用核酸を含む脂質粒子は、式（Ｉ）のイオン化可能な脂質から形成することができる。いくつかの他の実施形態では、治療用核酸を含む脂質粒子は、非カチオン性脂質から形成され得る。好ましい実施形態では、本発明の脂質粒子は、核酸を含有する脂質粒子であり、これは、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ミニサークルＤＮＡ、ミニ遺伝子、ウイルスＤＮＡ（例えば、レンチウイルスまたはＡＡＶゲノム）または非ウイルス合成ＤＮＡベクター、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ／ＣＥＬｉＤ）、プラスミド、バクミド、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡベクター、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクター、非ウイルスミニストリングＤＮＡベクター（直鎖状の共有結合的に閉じたＤＮＡベクター）、またはダンベル型ＤＮＡ最小ベクター（「ダンベルＤＮＡ」）からなる群から選択される治療用核酸を含む式（Ｉ）のイオン化可能な脂質から形成される。
別の好ましい実施形態では、本発明の脂質粒子は核酸含有脂質粒子であり、これは非カチオン性脂質、および任意に粒子の凝集を防止するコンジュゲートされた脂質から形成される。
一実施形態では、脂質粒子製剤は、水溶液である。一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）製剤は、凍結乾燥粉末である。
いくつかの態様によれば、本開示は、１つ以上の薬学的賦形剤をさらに含む脂質粒子製剤を提供する。一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）製剤は、スクロース、トリス、トレハロース、および／またはグリシンをさらに含む。
一実施形態では、本明細書に開示される脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、対象の細胞、組織、または器官へのインビボ送達のために対象に投与するのに好適な薬学的組成物に組み込まれ得る。典型的に、薬学的組成物は、本明細書に開示されるＴＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）および薬学的に許容される担体を含む。一実施形態では、本開示のＴＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、治療的投与（例えば、非経口投与）の所望の経路に適した薬学的組成物に組み込むことができる。高圧静脈内または動脈内注入を介した受動組織形質導入、同様に、核内微量注射もしくは細胞質内注射などの細胞内注射もまた、企図される。治療目的のための薬学的組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高ｃｅＤＮＡベクター濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注射可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量のｃｅＤＮＡベクター化合物を、必要に応じて、上記で列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせと組み込み、濾過滅菌によって調製され得る。
本明細書に開示される脂質粒子は、局所、全身、羊膜内、くも膜下腔内、頭蓋内、動脈内、静脈内、リンパ内、腹腔内、皮下、気管、組織内（例えば、筋肉内、心臓内、肝内、腎臓内、脳内）、くも膜下腔内、膀胱内、結膜（例えば、眼窩外、眼窩内、眼窩後、網膜内、網膜下、脈絡膜、脈絡膜下、間質内、房内、および硝子体内）、蝸牛内、ならびに粘膜（例えば、経口、直腸、経鼻）投与に好適な薬学的組成物に組み込むことができる。高圧静脈内または動脈内注入を介した受動組織形質導入、同様に、核内微量注射もしくは細胞質内注射などの細胞内注射もまた、企図される。
ＴＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）を含む薬学的に活性な組成物は、核酸中の導入遺伝子をレシピエントの細胞に送達するように製剤化され得、その中の導入遺伝子の治療的発現をもたらす。この組成物はまた、薬学的に許容される担体を含み得る。
治療目的のための薬学的組成物は、典型的に、無菌であり、製造および貯蔵の条件下で安定していなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高ｃｅＤＮＡベクター濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注射可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量のｃｅＤＮＡベクター化合物を、必要に応じて、上記で列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせと組み込み、濾過滅菌によって調製され得る。
一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、少なくとも１つの脂質二層を有する固体コア粒子である。一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、非二層構造、すなわち非ラメラ（すなわち、非二層）形態を有する。無制限に、非二層形態としては、例えば、三次元チューブ、棒、立方対称性などを挙げることができる。脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の非ラメラ形態（すなわち、非二層構造）は、当業者に既知であり、当業者によって使用される分析技法を使用して決定され得る。そのような技法としては、低温透過型電子顕微鏡（「Ｃｒｙｏ－ＴＥＭ」）、示差走査熱量計（「ＤＳＣ」）、Ｘ線回折などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、脂質粒子の形態（ラメラ対非ラメラ）は、容易に評価され、例えば、ＵＳ２０１０／０１３０５８８（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるＣｒｙｏ－ＴＥＭ分析を使用して容易に評価され、特性化され得る。
一実施形態では、非ラメラ形態を有する脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、高電子密度である。
一実施形態では、本開示は、単一ラメラ構造または多ラメラ構造のいずれかである脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）を提供する。いくつかの態様では、本開示は、多胞体粒子および／または発泡ベース粒子を含む脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）製剤を提供する。脂質構成成分の組成物および濃度を制御することによって、脂質コンジュゲートが脂質粒子（脂質ナノ粒子）外で交換する速度、順に脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を制御することができる。加えて、例えば、ｐＨ、温度、またはイオン強度を含む他の変数を使用して、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）が膜融合性になる速度を変化および／または制御することができる。脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）が膜融合性になる速度を制御するために使用され得る他の方法は、本開示に基づいて当業者に明らかとなるであろう。脂質コンジュゲートの組成物および濃度を制御することによって、脂質粒径を制御することができることも明らかとなるであろう。
一実施形態では、製剤化されたイオン化可能な脂質のｐＫａは、核酸の送達のためのＬＮＰの有効性と相関し得る（Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２），５１（３４），８５２９－８５３３、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８，１７２－１７６（２０１０）を参照。それらの両方は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。一実施形態では、ｐＫａの好ましい範囲は、約５～約８である。一実施形態では、ｐＫａの好ましい範囲は、約６～約７である。一実施形態では、好ましいｐＫａは、約６．５である。一実施形態では、イオン化可能な脂質のｐＫａは、２－（ｐ－トルイジノ）－６－ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）の蛍光に基づくアッセイを使用し、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中で決定され得る。
一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中のｃｅＤＮＡの封入は、核酸と会合したときに蛍光を強化した色素を使用する、膜不透過性蛍光色素排除アッセイ、例えばＯｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイまたはＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）アッセイを実施することによって決定され得る。一般に、封入は、脂質粒子製剤に色素を添加し、得られた蛍光を測定し、それを少量の非イオン性界面活性剤の添加時に観察される蛍光と比較することによって決定される。脂質二層の界面活性剤媒介性崩壊は、封入されたｃｅＤＮＡを放出し、それが膜不透過性色素と相互作用することを可能にする。ｃｅＤＮＡの封入は、Ｅ＝（Ｉｏ－Ｉ）／Ｉｏとして計算することができ、ＩおよびＩｏは、界面活性剤の添加前および添加後の蛍光強度を指す。
単位投与量
一実施形態では、薬学的組成物は、単位剤形で提示され得る。単位剤形は、典型的に、薬学的組成物の１つ以上の投与経路に適合されるであろう。いくつかの実施形態では、単位剤形は、吸入による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、吸入器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、噴霧器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、エアロゾル化器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、経口投与のため、頬側投与のため、または舌下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、静脈内、筋肉内、または皮下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、髄腔内または脳室内投与のために適合される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、局所投与のために製剤化される。単一剤形を産生するために担体材料と組み合わされ得る活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす化合物の量となるであろう。
ＶＩＩ．治療の方法
本明細書に記載されるイオン化可能な脂質組成物および方法（例えば、本明細書に記載のＴＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用して、宿主細胞に核酸配列（例えば、治療用核酸配列）を導入することができる。一実施形態では、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用する宿主細胞への核酸配列の導入を、治療された患者からの適切なバイオマーカーでモニタリングして、遺伝子発現を評価することができる。
本明細書に提供されるＬＮＰ組成物を使用して、様々な目的のために導入遺伝子（核酸配列）を送達することができる。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、例えば、エクスサイチュ、インビトロおよびインビボの適用、方法論、診断手順、および／または遺伝子療法計画を含む、様々な方法で使用することができる。
本明細書で提供されるのは、治療有効量のＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を、任意に薬学的に許容される担体とともに、治療を必要とする対象の標的細胞（例えば、肝細胞、筋細胞、腎細胞、神経細胞、または他の罹患した細胞型）に導入することを含む、対象における疾患または障害を治療する方法である。実装されるＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、疾患を治療するために有用な目的のヌクレオチド配列を含む。特に、ＴＮＡは、対象に導入されたときに、外因性ＤＮＡ配列によってコードされる所望のポリペプチド、タンパク質、またはオリゴヌクレオチドの転写を指示することができる制御エレメントに操作可能に連結された所望の外因性ＤＮＡ配列を含み得る。ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、本明細書に記載され、当該技術分野において既知の任意の好適な経路を介して投与することができる。一実施形態では、標的細胞は、ヒト対象にある。
本明細書で提供されるのは、診断的または治療的有効量のＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を、それを必要とする対象に提供するための方法であり、この方法は、ある量のＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を、それを必要とする対象の細胞、組織、または器官に、ＴＮＡ ＬＮＰからの導入遺伝子の発現を可能にするのに有効な時間にわたって提供し、それによって診断的または治療的有効量のＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））によって発現されるタンパク質、ペプチド、核酸を、対象に提供することを含む。一実施形態では、対象は、ヒトである。
本明細書で提供されるのは、対象における疾患、障害、機能不全、傷害、異常状態、または外傷のうちの少なくとも１つ以上の症状を診断、予防、治療、または改善するための方法である。一般に、この方法は、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を、それを必要とする対象に、対象の疾患、障害、機能不全、傷害、異常状態、または外傷の１つ以上の症状を診断、予防、治療、または改善するのに十分な量および時間にわたって投与するステップを少なくとも含む。一実施形態では、対象は、ヒトである。
本明細書で提供されるのは、疾患または疾患状態の１つ以上の症状を治療または低減するためのツールとしての、ＴＮＡ ＬＮＰを使用することを含む方法である。欠陥遺伝子が知られているいくつかの遺伝性疾患が存在し、典型的に、通常は一般に劣性的に遺伝される酵素の欠乏状態と、調節または構造タンパク質に関与し得るが、典型的に常に優性的に遺伝されるとは限らない不均衡状態との２つのクラスに分類される。欠乏状態の疾患の場合、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用し、導入遺伝子を送達して、置換療法のために正常な遺伝子を罹患した組織に運び入れるとともに、いくつかの実施形態では、アンチセンス変異を使用して、疾患の動物モデルを創り出すことができる。不均衡疾患状態の場合、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用して、モデルシステムにおいて疾患状態を創り出すことができ、次いでこれを使用して、その疾患状態に反作用するように試みることができる。したがって、本明細書に開示されるＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））および方法は、遺伝子疾患の治療を可能にする。本明細書で使用される場合、疾患状態は、疾患を引き起こす、またはそれをより重篤にする欠乏または不均衡を部分的または全体的に修繕することによって治療される。
一般に、上記の説明に従ってＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用して任意の導入遺伝子を送達して、遺伝子発現に関する任意の障害に関連する症状を治療、予防、または改善することができる。例示的な疾患状態としては、嚢胞性線維症（および他の肺の疾患）、血友病Ａ、血友病Ｂ、サラセミア、貧血症および他の血液障害、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、癲癇および他の神経障害、がん、糖尿病、筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ型、ベッカー型）、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、代謝障害、網膜変性疾患（および他の眼の疾患）、ミトコンドリオパチー（例えば、レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、リー症候群、および亜急性硬化性脳炎）、ミオパチー（例えば、顔面肩甲上腕型ミオパチー（ＦＳＨＤ）および心筋症）、固形臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓、心臓）の疾患等が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるようなｃｅＤＮＡベクターは、代謝障害（例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症）を有する個人の治療において有利に使用され得る。
一実施形態では、本明細書に記載されるＴＮＡ ＬＮＰを使用して、遺伝子または遺伝子産物中の変異によって引き起こされる疾患または障害を治療、改善、および／または予防することができる。ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））で治療され得る例示的な疾患または障害としては、代謝疾患または障害（例えば、ファブリー病、ゴーシェ病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、グリコーゲン蓄積症）；尿素サイクル疾患または障害（例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症）；リソソーム蓄積疾患または障害（例えば、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ、ハンター症候群））；肝疾患または障害（例えば、進行性家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣ）；血液疾患または障害（例えば、血友病（ＡおよびＢ）、サラセミア、および貧血症）；がんおよび腫瘍、ならびに遺伝子疾患または障害（例えば、嚢胞性線維症）が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を用いて、導入遺伝子（例えば、本明細書に記載される、ホルモンまたは増殖因子をコードする導入遺伝子）の発現レベルを調節することが望ましい状況において、異種ヌクレオチド配列を送達することができる。
一実施形態では、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用して、疾患または障害をもたらす遺伝子産物の異常なレベルおよび／または機能（例えば、タンパク質中の不在または欠損）を訂正することができる。ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、機能的タンパク質を産生し、かつ／またはタンパク質のレベルを修復して、タンパク質中の不在もしくは欠損によって引き起こされる特定の疾患もしくは障害から生じる症状を緩和もしくは低減するか、または利益を付与することができる。例えば、ＯＴＣ欠損症の治療は、機能的ＯＴＣ酵素を産生することによって達成され得る。血友病ＡおよびＢの治療は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、および第Ｘ因子のレベルを修正することによって達成され得る。ＰＫＵの治療は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素のレベルを修正することによって達成され得る。ファブリー病またはゴーシェ病の治療は、それぞれ機能的αガラクトシダーゼまたはβグルコセレブロシダーゼを産生することによって達成され得る。ＭＦＤまたはＭＰＳＩＩの治療は、それぞれ機能的アリールスルファターゼＡまたはイズロネート－２－スルファターゼを産生することによって達成され得る。嚢胞性線維症の治療は、機能的嚢胞性線維症の膜貫通コンダクタンス調節因子を産生することによって達成され得る。グリコーゲン蓄積症の治療は、機能的Ｇ６Ｐａｓｅ酵素機能を回復することによって達成され得る。ＰＦＩＣの治療は、機能的ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４、またはＴＪＰ２遺伝子を産生することによって達成され得る。
一実施形態では、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用して、インビトロまたはインビボで細胞にＲＮＡベースの治療薬を提供することができる。ＲＮＡベースの治療薬の例としては、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用して、インビトロまたはインビボで細胞にアンチセンス核酸を提供することができる。例えば、導入遺伝子が、ＲＮＡｉ分子である場合、標的細胞中のアンチセンス核酸またはＲＮＡｉの発現は、細胞による特定のタンパク質の発現を減少させる。したがって、ＲＮＡｉ分子またはアンチセンス核酸である導入遺伝子を投与して、それを必要とする対象における特定のタンパク質の発現を減少させることができる。アンチセンス核酸をインビトロで細胞に投与して、細胞生理学を調節する、例えば、細胞または組織培養系を最適化することもできる。
一実施形態では、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用して、インビトロまたはインビボで細胞にＤＮＡベースの治療薬を提供することができる。ＤＮＡベースの治療薬の例としては、ミニサークルＤＮＡ、ミニ遺伝子、ウイルスＤＮＡ（例えば、レンチウイルスまたはＡＡＶゲノム）または非ウイルス合成ＤＮＡベクター、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ／ＣＥＬｉＤ）、プラスミド、バクミド、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡベクター、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）－ベクター、非ウイルスミニストリングＤＮＡベクター（直鎖状の共有結合的に閉じたＤＮＡベクター）、またはダンベル型ＤＮＡ最小ベクター（「ダンベルＤＮＡ」）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用して、インビトロまたはインビボで細胞にミニサークルを提供することができる。例えば、導入遺伝子が、ミニサークルＤＮＡである場合、標的細胞中のミニサークルＤＮＡの発現は、細胞による特定のタンパク質の発現を減少させる。したがって、ミニサークルＤＮＡである導入遺伝子を投与して、それを必要とする対象における特定のタンパク質の発現を減少させることができる。ミニサークルＤＮＡをインビトロで細胞に投与して、細胞生理学を調節する、例えば、細胞または組織培養系を最適化することもできる。
一実施形態では、発現カセットを含むＴＮＡベクターによってコードされる例示的な導入遺伝子としては、Ｘ、リソソーム酵素（例えば、テイ・サックス病に関連するヘキソサミニダーゼＡ、またはハンター症候群／ＭＰＳ ＩＩに関連するイズロネートスルファターゼ）、エリスロポエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、スーパーオキシドジスムターゼ、グロビン、レプチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、ならびにサイトカイン（例えば、インターフェロン、β－インターフェロン、インターフェロン－γ、インターロイキン－２、インターロイキン－４、インターロイキン１２、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン等）、ペプチド増殖因子およびホルモン（例えば、ソマトトロピン、インスリン、インスリン様増殖因子１および２、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、神経栄養因子－３および４、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来増殖因子（ＧＤＮＦ）、形質転換増殖因子－ａおよび－ｂなど）、受容体（例えば、腫瘍壊死因子受容体）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例示的な実施形態では、導入遺伝子は、１つ以上の所望の標的に特異的なモノクローナル抗体をコードする。いくつかの例示的な実施形態では、２つ以上の導入遺伝子が、ｃｅＤＮＡベクターによってコードされる。いくつかの例示的な実施形態では、導入遺伝子は、目的の２つの異なるポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、本明細書で定義されるように、全長抗体または抗体断片を含む、抗体をコードする。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に定義されるように、抗原結合ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列である。他の例示的な導入遺伝子配列は、自殺遺伝子産物（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、チトクロームＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、および腫瘍壊死因子）、がん療法において使用される薬物に対する耐性を付与するタンパク質、および腫瘍抑制因子遺伝子産物をコードする。
投与
一実施形態では、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクター脂質粒子）は、インビボでの細胞の形質導入のために生物に投与することができる。一実施形態では、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、エクスビボでの細胞の形質導入のために生物に投与することができる。
一般に、投与は、分子を血液または組織細胞と最終的に接触させるために通常使用される経路のうちのいずれかによるものである。そのような核酸を投与する好適な方法は、当業者によって利用可能かつ周知であり、特定の組成物を投与するために２つ以上の経路が使用され得るが、特定の経路は、多くの場合、別の経路よりも即時であり、効果的な反応を提供し得る。ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））の例示的な投与形態としては、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介した）、頬側（例えば、舌下）、膣、髄腔内、眼内、経皮、内皮内、子宮内（または卵内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、筋肉内（骨格、横隔膜、および／または心筋への投与を含む）、胸膜内、脳内、および動脈内）、局所（例えば、気道表面を含む皮膚および粘膜表面への、ならびに経皮投与）、リンパ内など、ならびに直接組織または器官注射（例えば、肝臓、眼、骨格筋、心筋、横隔膜、筋肉、もしくは脳への）が挙げられる。
ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子）の投与は、脳、骨格筋、平滑筋、心臓、横隔膜、気道上皮、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、皮膚、および眼からなる群から選択される部位を含むが、これらに限定されない、対象の任意の部位に対して行われ得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））の投与はまた、腫瘍（例えば、腫瘍またはリンパ節内またはその付近）に対するものであり得る。任意の所与の症例における最も好適な経路は、治療、改善、および／または予防される病態の性質および重症度、ならびに使用されている特定のｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））の性質に依存するであろう。追加として、ｃｅＤＮＡは、単一のベクターまたは複数のｃｅＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡカクテル）中に２つ以上の導入遺伝子を投与することを可能にする。
一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））の骨格筋への投与としては、肢（例えば、上腕、下腕、上肢、および／または下肢）、腰、首、頭（例えば、舌）、咽頭、腹部、骨盤／会陰、および／または指の骨格筋への投与が挙げられるが、これらに限定されない。ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、四肢灌流（任意に、脚および／もしくは腕の単離された四肢灌流、例えば、Ａｒｒｕｄａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｂｌｏｏｄ １０５：３４５８－３４６４を参照されたい）ならびに／または直接筋肉内注射によって骨格筋に送達され得る。特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子）は、対象（例えば、ＤＭＤなどの筋ジストロフィーを有する対象）の肢（腕および／または脚）に、四肢灌流、任意に単離された四肢灌流（例えば、静脈内または動脈内投与による）によって投与される。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクター脂質粒子）は、「流体力学的」技法を使用せずに投与することができる。
ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））の心筋への投与としては、左心房、右心房、左心室、右心室、および／または中隔への投与が挙げられる。ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、静脈内投与、大動脈内投与などの動脈内投与、直接心臓注射（例えば、左心房、右心房、左心室、右心室への）、および／または冠動脈灌流によって心筋に送達され得る。横隔膜筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹腔内投与を含む任意の好適な方法によって行われ得る。平滑筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹腔内投与を含む任意の好適な方法によって行われ得る。一実施形態では、投与は、平滑筋内、その付近、および／またはその上に存在する内皮細胞に対して行われ得る。
一実施形態では、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、骨格筋、横隔膜筋および／または心筋に投与される（例えば、筋ジストロフィーまたは心臓病（例えば、ＰＡＤまたはうっ血性心不全）を治療、改善、および／または予防するために。
ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、ＣＮＳ（例えば、脳または眼）に投与することができる。ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、脊髄、脳幹（延髄、脳橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、脳下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体、後頭葉、側頭葉、頭頂葉、および前頭葉、皮質、基底核、海馬、および偏桃体（ｐｏｒｔａａｍｙｇｄａｌａ）を含む大脳）、辺縁系、新皮質、線条体、大脳、ならびに下丘中に導入されてもよい。ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））はまた、網膜、角膜、および／または視神経などの眼の異なる領域に投与され得る。ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、（例えば、腰椎穿刺によって）脳脊髄液に送達され得る。ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、さらに、血液脳関門が撹乱された状況（例えば、脳腫瘍または脳梗塞）において、ＣＮＳに血管内投与され得る。
一実施形態では、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、当該技術分野において既知の任意の経路によってＣＮＳの所望の領域に投与され得、髄腔内、眼内、脳内、脳室内、静脈内（例えば、マンニトールなどの糖の存在下）、鼻腔内、耳内、眼内（例えば、硝子体内、網膜下、前房）、および眼周囲（例えば、テノン下領域）送達、ならびに運動ニューロンへの逆行性送達を伴う筋肉内送達を含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態によれば、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、ＣＮＳ中の所望の領域または区画への直接注射（例えば、定位的注入）によって、液体製剤中で投与される。他の実施形態によれば、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、所望の領域への局所適用によって、またはエアロゾル製剤の鼻腔内投与によって提供され得る。眼への投与は、液滴の局所適用によって行われてもよい。さらなる代替例として、ｃｅＤＮＡベクターは、固体の徐放性製剤として投与され得る（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，２０１，８９８号を参照されたい）。一実施形態では、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を、逆行性輸送に使用して、運動ニューロンが関与する疾患および障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）など）を治療、改善、および／または予防することができる。例えば、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、筋組織に送達され、そこからニューロン中に移動し得る。
一実施形態では、適切なレベルの発現が達成されるまで、治療用製品の反復投与を行うことができる。したがって、一実施形態では、治療用核酸を複数回投与および再投与することができる。例えば、治療用核酸は、０日目に投与することができる。０日目の初回治療に続いて、治療用核酸を用いた初回治療の約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、または約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、または約１年、約２年、約３年、約４年、約５年、約６年、約７年、約８年、約９年、約１０年、約１１年、約１２年、約１３年、約１４年、約１５年、約１６年、約１７年、約１８年、約１９年、約２０年、約２１年、約２２年、約２３年、約２４年、約２５年、約２６年、約２７年、約２８年、約２９年、約３０年、約３１年、約３２年、約３３年、約３４年、約３５年、約３６年、約３７年、約３８年、約３９年、約４０年、約４１年、約４２年、約４３年、約４４年、約４５年、約４６年、約４７年、約４８年、約４９年または約５０年後に、２回目の投薬（再投与）を実施することができる。
一実施形態では、１つ以上の追加の化合物もまた含まれ得る。それらの化合物は、別々に投与され得るか、または追加の化合物は、本発明の脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中に含まれ得る。言い換えれば、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、ＴＮＡに加えて他の化合物、または少なくとも第１のものとは異なる第２のＴＮＡを含有し得る。無制限に、他の追加の化合物は、小さいまたは大きい有機または無機分子、単糖類、二糖類、三糖類、オリゴ糖類、多糖類、ペプチド、タンパク質、ペプチド類似体およびそれらの誘導体、ペプチド模倣体、核酸、核酸類似体および誘導体、生体物質から作製される抽出物、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。
一実施形態では、１つ以上の追加の化合物は、治療剤であり得る。治療剤は、治療目的に好適な任意のクラスから選択され得る。したがって、治療剤は、治療目的に好適な任意のクラスから選択され得る。治療剤は、所望の治療目的および生物作用に従って選択され得る。例えば、一実施形態では、ＬＮＰ内のＴＮＡが、がんを治療するために有用である場合、追加の化合物は、抗がん剤（例えば、化学療法剤、標的がん療法（小分子、抗体、または抗体－薬物コンジュゲートを含むが、これらに限定されない）であり得る。一実施形態では、ＴＮＡを含有するＬＮＰが、感染症を治療するために有用である場合、追加の化合物は、抗微生物剤（例えば、抗生物質または抗ウイルス化合物）であり得る。一実施形態では、ＴＮＡを含有するＬＮＰが、免疫疾患または障害を治療するために有用である場合、追加の化合物は、免疫応答を調節する化合物（例えば、免疫抑制剤、免疫刺激性化合物、または１つ以上の特定の免疫経路を調節する化合物）であり得る。一実施形態では、異なるタンパク質または異なる化合物（治療薬など）をコードするＴＮＡなどの、異なる化合物を含有する異なる脂質粒子の異なるカクテルを、本発明の組成物および方法で使用することができる。一実施形態では、追加の化合物は、免疫調節剤である。例えば、追加の化合物は、免疫抑制剤である。いくつかの実施形態では、追加の化合物は、免疫刺激性である。
以下の実施例は、限定ではない例証によって提供される。イオン化可能な脂質は、以下に記載される一般的な合成方法を使用して設計および合成することができることが当業者によって理解されるであろう。この方法はイオン化可能な脂質で例示されているが、それらは式（Ｉ）の下で企図される切断可能脂質の合成に適用可能である。
実施例１
一般的な合成（例えば、Ｒ４＝－Ｃ）
本明細書に記載のイオン化可能な脂質の合成は、脂質酸（ａ）から開始することができる。Ｎ，Ｏ－ジメチルヒドロキシルアミンにカップリングすると、ワインレブアミド（ｂ）が得られる。グリニャール付加によりケトン（ｃ）が生成される。チタンを介した還元的アミノ化により、タイプ（ｄ）の生成物が得られ、これは、一般構造（ｅ）のジスルフィドと反応し、両方の末端アルコールが脱離基、すなわちメタンスルホニル基を有し、一般構造（ｆ）の最終生成物を生成する。
Figure 2023502576000014
脂質１についての合成（スキーム）
Figure 2023502576000015
短い手順での個々の合成ステップ
Figure 2023502576000016
 ０℃に冷却したジクロロメタン（ＤＣＭ）中のオレイン酸（Ｉ）の溶液に、ＣＤＩを添加した。反応物を周囲温度に３０分間温めた後、０℃に冷却し、最初にトリエチルアミンで、次いでジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩で処理した。１時間後、反応物を水とヘプタンとの間で分配した。有機物を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空で蒸発させて、粗ワインレブアミド（ＩＩ）を得て、これを直接次の反応に運んだ。
Figure 2023502576000017
ジクロロメタン中のジエチル亜鉛の１Ｍ溶液を－１℃に冷却し、ＴＦＡで滴下処理した。３０分後、ジヨードメタンを添加し、これを氷浴中で３０分間エージングさせた。この溶液に、ワインレブアミド（ＩＩ）を添加した。反応物を周囲温度に温め、１時間撹拌した。反応物を塩化アンモニウム溶液でクエンチし、有機層を分配し、１０％チオ硫酸ナトリウムで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空中で蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィーにより精製を行い、（ＩＩＩ）を得た。
Figure 2023502576000018
化合物（ＩＩＩ）を乾燥ＴＨＦ中に溶解し、次いで１Ｍの臭化ノニルマグネシウムを窒素下、周囲温度で添加した。１０分後、反応を過剰の飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液でゆっくりとクエンチした。反応物をヘキサンおよび水で分液漏斗中で洗浄し、振とうし、下層の水層を廃棄し、上層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させて、粗ケトンを得た。上記の粗ケトン（ＩＶ）にジメチルアミン（ＴＨＦ中２Ｍ）、続いてＴｉ（Ｏ－ｉ－Ｐｒ）４を添加し、一晩撹拌した。翌日、エタノール、続いてＮａＢＨ４を添加した。５分間撹拌した後、反応物全体を直接シリカカラムに注入して精製し、化合物（ＩＶ）を得た。
Figure 2023502576000019
ジスルフィド（ｅ）および４モル当量のアミン（Ｖ）を、アセトニトリルに溶解し、Ｃｓ２ＣＯ３の存在下で約４８時間加熱した。粗反応混合物をフラッシュクロマトグラフィー用のシリカに充填して、最終的な標的化合物（１）を得た。
脂質３の合成
Figure 2023502576000020
実験的：
Figure 2023502576000021
 Ｎ－メトキシ－Ｎ－メチルオレアミド（２）の合成。ジクロロメタン５００ｍｌ中のオレイン酸（１ｇ、３．５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＣＤＩ（０．６３ｇ、３．９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１０分間撹拌した後、トリエチルアミン（０．３９ｇ、３．９ｍｍｏｌ）および１ａ（０．３８ｇ、３．９ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１時間撹拌した後、反応混合物を水とヘキサンとに分配した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させた。粗生成物をさらに精製することなく、次のステップで直接使用した。
Figure 2023502576000022
Ｎ－メトキシ－Ｎ－メチル－８－（２－オクチルシクロプロピル）オクタンアミド（３）の合成。ジエチル亜鉛の溶液（７．０３ｍｌの１Ｍ溶液、７．０３ｍｍｏｌ）を０℃に冷却し、ＴＦＡ（０．８ｇ、７．０３ｍｍｏｌ）で処理した。３０分後、ジヨードメタン（１．８８ｇ、７．０３ｍｍｏｌ）を添加し、これを氷浴中で３０分間エージングさせた。この溶液に、２（０．７６ｇ、２．３４ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を周囲温度に温め、１時間撹拌した。反応物を塩化アンモニウム溶液（１０ｍｌ）でクエンチし、有機層を分別し、１０％チオ硫酸ナトリウムで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させた。粗生成物を、溶離液としてヘキサン中の０～２０％酢酸エチルを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、３（０．７ｇ、８８％）を白色固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ ３．６７（ｓ、３Ｈ）、３．１７（ｓ、３Ｈ）、２．４０（ｔ、２Ｈ）、１．５７（ｍ、３Ｈ）、１．３２－１．３５（ｍ、２２Ｈ）、１．２６（ｍ、２Ｈ）、０．８９（ｍ、３Ｈ）、０．５０－０．７０（ｍ、３Ｈ）、－０．３５（ｍ、１Ｈ）。
Figure 2023502576000023
１－（２－オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン－８－オン（４）の合成。２５ｍｌの無水エーテルに、３（２．０３ｇ、５．８ｍｍｏｌ）を溶解した。この溶液に、１Ｍの臭化ノニルマグネシウム溶液（１２ｍｌ、１２ｍｍｏｌ）を０℃で滴加した。得られた混合物を室温で２時間撹拌し、飽和塩化アンモニウム溶液中でクエンチし、ヘキサンで抽出した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させた後、溶離液としてヘキサン中の０～２０％酢酸エチルを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、４（２．１ｇ、８７％）を白色固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ ２．３５－２．４０（ｔ、４Ｈ）、１．５５（ｓ、６Ｈ）、１．２６－１．３６（ｍ、３２Ｈ）、１．００－１．２０（ｍ、２Ｈ）、０．８９（ｍ、６Ｈ）、０．５０－０．７０（ｍ、３Ｈ）、－０．３５（ｍ、１Ｈ）。
Figure 2023502576000024
１－（２－オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン－８－アミン（５）の合成。エタノール（３ｍｌ）中の３３％メチルアミンの溶液に、５ｍｌのエタノール中の４（８００ｍｇ、２ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。得られた混合物を、室温で８時間撹拌した。上記の溶液に、ＮａＢＨ４（２００ｍｇ、５ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。得られた混合物を、室温で一晩撹拌した後、水でクエンチした。反応溶媒を蒸発させ、残留物を、溶離液として酢酸エチル中のメチルアミンを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、５（５６０ｍｇ、６８％）を淡黄色油状物として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ ２．３７（ｓ、３Ｈ）、１．１０－１．４０（ｍ、４４Ｈ）、１．００－１．２０（ｍ、２Ｈ）、０．８９（ｍ、６Ｈ）、０．５０－０．７０（ｍ、３Ｈ）、－０．３５（ｍ、１Ｈ）。
Figure 2023502576000025
Ｎ，Ｎ’－（ジスルファンジイルビス（エタン－２，１－ジイル））ビス（１－（２－オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン－８－アミン）（脂質３）の合成。５ｍｌのＡＣＮに、５（１１０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、６（２０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）およびＣｓ２ＣＯ３（１２４ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を、密封チューブ内で１５０℃で１２時間撹拌した。粗反応混合物を室温に冷却し、濾過して固体を除去し、溶離液としてジクロロメタン中の３～５％メタノールを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、脂質３（３０ｍｇ、４８％）を淡黄色油状物として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ ２．６－２．９（ｍ、８Ｈ）、２．３－２．４（ｍ、２Ｈ）、２．２０（ｓ、６Ｈ）、１．１０－１．５０（ｍ、８８Ｈ）、０．８５－０．８９（ｔ、１２Ｈ）、０．６５（ｍ、４Ｈ）、０．５－０．６（ｍ、２Ｈ）、－０．３５（ｑ、２Ｈ）。
脂質３０の合成
Figure 2023502576000026
実験的：
Figure 2023502576000027
 エチル（Ｅ）－３－（７－（２－オクチルシクロプロピル）ヘプチル）ドデカ－２－エノエート（９）の合成。６０ｍｌの無水ＴＨＦ中のＮａＨ（１．６ｇ、４０．３ｍｍｏｌ）の懸濁液に、８（９．２ｍｌ、４６ｍｍｏｌ）を０℃で滴加した。得られた混合物を０℃で３０分間撹拌して、透明な溶液を得た。この溶液に４（２．２５ｇ、５．７５ｍｍｏｌ）を添加し、次いで２日間還流下で撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、水でクエンチし、エーテルで抽出した。合わせた有機層を、ヘキサン中の１％酢酸エチルを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、９（２．３ｇ、８８％）を無色油状物として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ ５．６（ｓ、１Ｈ）、４．１５（ｑ、２Ｈ）、２．５８（ｔ、３Ｈ）、２．１２（ｍ、３Ｈ）、１．２６－１．５０（ｍ、４０Ｈ）、０．８９（ｍ、６Ｈ）、０．５０－０．７０（ｍ、３Ｈ）、－０．３５（ｍ、１Ｈ）。
Figure 2023502576000028
エチル３－（７－（２－オクチルシクロプロピル）ヘプチル）ドデカンノエート（１０）の合成。ＴＨＦ中の９（２．０ｇ、４ｍｍｏｌ）の溶液に、ラネー－Ｎｉ（２．０ｇ）を添加した。得られた混合物を、大気圧で一晩水素化した。触媒を濾過により除去し、濾液を蒸発させて、１０（２．１ｇ、１００％）を無色油状物として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ ４．１３（ｑ、２Ｈ）、２．２０（ｍ、３Ｈ）、１．２６－１．５０（ｍ、４４Ｈ）、０．８９（ｍ、６Ｈ）、０．５０－０．７０（ｍ、３Ｈ）、－０．３５（ｍ、１Ｈ）。
Figure 2023502576000029
３－（７－（２－オクチルシクロプロピル）ヘプチル）ドデカン酸（１１）の合成。２０ｍｌのＴＨＦ中の１０（１．９ｇ、４ｍｍｏｌ）の溶液に、１ＮのＮａＯＨ ２０ｍｌを添加した。得られた混合物を還流下で３日間撹拌した後、室温に冷却し、１ＮのＨＣｌで中和した。反応混合物を、ジクロロメタンで抽出した。合わせた有機層を蒸発させ、溶離液としてヘキサン中の０～２０％酢酸エチルを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、１１（１．０ｇ、８３％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ ２．２８（ｍ、３Ｈ）、１．２６－１．５０（ｍ、４４Ｈ）、０．８９（ｍ、６Ｈ）、０．５０－０．７０（ｍ、３Ｈ）、－０．３５（ｍ、１Ｈ）。
Figure 2023502576000030
Ｎ－メチル－３－（７－（２－オクチルシクロプロピル）ヘプチル）ドデカンアミド（１２）の合成。３０ｍｌのジクロロメタンの溶液に、１１（１．５ｇ、３．３ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ中の２Ｍメチルアミン（３．５ｍｌ、７ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．３３ｇ、３．４ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．８５ｇ、６．６ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、１ＮのＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３および水で洗浄した。有機層を、溶離液としてヘキサン中の５～２５％酢酸エチルを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、１２（１．４５ｇ、９４％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ ５．２（ｂｒ、１Ｈ）、２．８０（ｓ、３Ｈ）、２．２８（ｍ、３Ｈ）、１．２６－１．５０（ｍ、４４Ｈ）、０．８９（ｍ、６Ｈ）、０．５０－０．７０（ｍ、３Ｈ）、－０．３５（ｍ、１Ｈ）。
Figure 2023502576000031
Ｎ－メチル－３－（７－（２－オクチルシクロプロピル）ヘプチル）ドデカン－１－アミン（１３）の合成。１５ｍｌの無水ＴＨＦ中の１２（７５０ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）の溶液に、２ＭのＬｉＡｌＨ４（１．５ｍｌ、３ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を還流下で２時間撹拌し、Ｎａ２ＳＯ４・１０Ｈ２Ｏでクエンチし、濾過した。濾液を蒸発させて、１３（５７７ｍｇ、７０％）を無色油状物として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ ２．５４（ｍ、３Ｈ）、１．０－１．６（ｍ、４４Ｈ）、０．８７（ｍ、６Ｈ）、０．５０－０．７０（ｍ、３Ｈ）、－０．３５（ｍ、１Ｈ）。
Figure 2023502576000032
Ｎ，Ｎ’－（ジスルファンジイルビス（エタン－２，１－ジイル））ビス（Ｎ－メチル－３－（７－（２－オクチルシクロプロピル）ヘプチル）ドデカン－１－アミン）（脂質３０）の合成。３ｍｌのベンゼン中の１３（３００ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）および６（８０ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）の混合物を、マイクロ波中で１１０℃で８時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、空気下で一晩撹拌した後、蒸発乾固させた。残留物を、溶離液としてジクロロメタン中の５％メタノールを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、脂質３０（１１０ｍｇ、３２％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ ２．８０－２．９０（ｍ、４Ｈ）、２．６－２．７（ｍ、４Ｈ）、２．３－２．４（ｍ、４Ｈ）、２．２６（ｓ、６Ｈ）、１．０－１．５（ｍ、９６Ｈ）、０．８６－０．９０（ｍ、１２Ｈ）、０．５０－０．７０（ｍ、６Ｈ）、－０．３５（ｍ、２Ｈ）。
脂質３１の合成
Figure 2023502576000033
Ｎ－メチルオレアミド（１）
ＣＨ２Ｃｌ２（１５０ｍｌ）中のオレイン酸（５．０ｇ、１７．７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（２．１６ｇ、１７．７ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（４．７５ｇ、２４．７ｍｍｏｌ）を添加した。次に、メチルアミン（１３．２８ｍＬ、２６．５ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を室温で一晩撹拌した。続いて、反応混合物を３００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、有機層を水およびブラインで洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発乾固させ、溶離液としてヘキサン中の５～５０％ＥｔＯＡｃを使用するＩＳＣＯクロマトグラフィーによって精製した。所望の化合物を含む画分をプールし、蒸発させて、１（４．２ｇ、８０．３％）を得た。
（Ｚ）－Ｎ－メチルオクタデカ－９－エン－１－アミン（２）
化合物１（４．２ｇ、１４．２１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。次いで、ＬｉＡｌＨ４（１．６２ｇ、４２．６４ｍｍｏｌ）を数回に分けて添加した。添加後、反応混合物を室温に到達させ、５０℃で一晩加熱した。続いて、反応物を０℃に冷却し、ＬｉＡｌＨ４がクエンチされるまで水を滴加した。次に、反応混合物をセライトで濾過し、蒸発させて、所望の生成物２（３．９２ｇ、９８％）を得た。
ジスルファンジイルビス（エタン－２，１－ジイル）ジメタンスルホネート（２’）。
市販の２，２’－ジスルファンジイルビス（エタン－１－オール）１’（１５ｇ、９７．２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１４３ｍｌ）に溶解し、続いてＮＥｔ３（３３．３ｇ、３２８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物にＭｓＣｌ（３４．５ｇ、３００ｍｍｏｌ）を０℃で滴加した。得られた反応混合物を、室温で３時間撹拌した。反応混合物にＥｔＯＨ（３９ｍｌ）を添加して反応をクエンチし、不溶性物質を濾過により除去した。濾液をジクロロメタン（１５０ｍｌ）と１０％重炭酸ナトリウム水（１５０ｍｌ）との間で分配した。有機層を１００ｍｌの水で４回洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて、２’を褐色油状物として得（２５ｇ、８１％）、これは静置すると固化した。
（９Ｚ，９’Ｚ）－Ｎ，Ｎ’－（ジスルファンジイルビス（エタン－２，１－ジイル））ビス（Ｎ－メチルオクタデカ－９－エン－１－アミン）（脂質３１）
化合物２（０．２ｇ、０．６４ｍｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮ（３ｍＬ）に溶解し、Ｃｓ２ＣＯ３（０．３２ｇ、１．２８ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、ＣＨ３ＣＮ中の化合物２’（０．７２５ｇ、２．５６ｍｍｏｌ）の溶液を反応混合物に滴加し、室温で一晩撹拌した。続いて、溶媒を蒸発させ、化合物をＩＳＣＯクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中の０～１０％ＭｅＯＨ（３％ＮＨ））によって精製して、生成物脂質３１（０．１３ｇ、３１％）を回収した。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム） δ ５．３４（ｔ、Ｊ＝４．８Ｈｚ、４Ｈ）、２．８０（ｄｄ、Ｊ＝９．０、５．４Ｈｚ、４Ｈ）、２．６７（ｄｄ、Ｊ＝９．１、５．５Ｈｚ、４Ｈ）、２．４４－２．３０（ｍ、４Ｈ）、２．２４（ｓ、４Ｈ）、２．０６－１．９３（ｍ、８Ｈ）、１．４４（ｄ、Ｊ＝６．１Ｈｚ、４Ｈ）、１．２７（ｄ、Ｊ＝４．９Ｈｚ、４６Ｈ）、０．８７（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、６Ｈ）。［Ｃ４２Ｈ８４Ｎ２Ｓ２］についてのＭＳ実測値６８１．６［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値６８０．６１。
脂質３５についての合成スキーム
Figure 2023502576000034
（Ｚ）－Ｎ－メチルノナデカ－１０－エン－１－アミン（２ａ－１）
オレイルメタンスルホネート（５．０ｇ、１４．４ｍｍｏｌ）を密閉チューブに量り取り、５０ｍＬのメチルアミン（ＴＨＦ中２Ｍ）を添加した。反応混合物を、室温で１６時間撹拌した。次いで、溶媒を蒸発させ、次のステップで直接使用した。
（Ｚ）－２－（メチル（ノナデカ－１０－エン－１－イル）アミノ）エタン－１－チオール（２ａ－２）
化合物２ａ－２を密閉チューブ内でトルエンに溶解し、Ｎ２で５分間パージした。次いで、硫化エチレン（１．２８ｍＬ、２１．６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を５０℃で２４時間加熱した。次いで、反応混合物を真空中で濃縮し、直ちに次のステップで使用した。
（Ｚ）－Ｎ－メチル－Ｎ－（２－（フェニルジスルファネイル）エチル）ノナデカ－１０－エン－１－アミン（２ａ－３）
化合物２ａ－２を５０ｍＬのＣＨＣｌ３に溶解し、２，２’－ジピリジルジスルフィド（４．０ｇ、１８．２ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１６時間撹拌した。次いで、反応混合物を真空中で濃縮し、ＩＳＣＯクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ ０～１５％）によって精製した。
Ｎ－メトキシ－Ｎ－メチルオレアミド（１ａ－１）
ジクロロメタン（５０ｍＬ）中のオレイン酸（５．０ｇ、１７．７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（９．２ｍＬ、５３．１ｍｍｏｌ）、およびＨＡＴＵ（１０．１ｇ、２６．５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１５分間撹拌した。次いで、Ｎ，Ｏ－ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（４．８９ｇ、５３．１ｍｍｏｌ）を添加し、室温で一晩撹拌した。続いて、反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、水、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させ、残留物をＩＳＣＯクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ ０～３０％）によって精製した。所望の化合物を含有する画分を蒸発させて、１ａ－１（４．２ｇ、７３％）を得た。
Ｎ－メトキシ－Ｎ－メチル－８－（２－オクチルシクロプロピル）オクタンアミド（１ａ－２）
ジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解したジエチル亜鉛の溶液（５４ｍｍｏｌ、１Ｍ溶液５４ｍＬ）を０℃に冷却した。次いで、溶液をＴＦＡ（４．１２ｍＬ、５４ｍｍｏｌ）を滴加して処理した。３０分後、ジヨードメタン（４．３４ｍＬ、５４．ｍｍｏｌ）を添加し、これを氷浴中で３０分間エージングさせた。この溶液にワインレブアミド（１ａ－１）（５．８ｇ、１７．８ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を周囲温度に温め、１時間撹拌した。反応物を塩化アンモニウム溶液でクエンチし、有機層を分別し、１０％チオ硫酸ナトリウムで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。次いで、溶媒を真空下で蒸発させ、残渣をＩＳＣＯクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ ０～２０％）によって精製した。所望の化合物を含有する画分を蒸発させて、１ａ－２（５．８ｇ、７８％）を得た。
１－（２－オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン－８－オン（１ａ－３）
化合物１ａ－２（１．０ｇ、２．９５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（６ｍＬ）に溶解し、次いで臭化ノニルマグネシウム（５．９ｍＬ、５．９ｍｍｏｌ、Ｅｔ２Ｏ中１Ｍ）を窒素雰囲気下、室温で滴加した。１時間撹拌した後、ＮＨ４Ｃｌ溶液を添加することにより反応物をクエンチした。生成物をヘキサンで抽出し、有機層を水で洗浄し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。次いで、溶媒を真空下で蒸発させ、残渣をＩＳＣＯクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ ０～５％）によって精製した。所望の化合物を含有する画分を蒸発させて、１ａ－３（０．８５ｇ、７２％）を得た。
Ｎ－メチル－１－（２－オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン－８－アミン（１ａ－４）
化合物１ａ－３（０．８５ｇ、２．１ｍｍｏｌ）を密閉チューブ内で１０ｍＬのＴＨＦに溶解し、０℃に冷却し、メチルアミン（２．６ｍＬ、５．２２ｍｍｏｌ）を添加した。密閉した反応混合物を、室温で１６時間撹拌した。次いで、反応混合物を０℃に冷却し、ＮａＢＨ４（０．２１４ｇ、５．６７ｍｍｏｌ）を添加し、一晩撹拌した。続いて、反応物を水でクエンチし、生成物をＥｔＯＡｃで抽出し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。次いで、溶媒を真空下で蒸発させ、残渣をＩＳＣＯクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ ０～１０％）によって精製した。
２－（メチル（１－（２－オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン－８－イル）アミノ）エタン－１－チオール（１ａ－５）
化合物１ａ－４（０．４ｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を密閉チューブ内のトルエン（５ｍＬ）に溶解し、Ｎ２で５分間パージした。次いで、硫化エチレン（０．０９ｍＬ、１．４１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を５０℃で２４時間加熱した。次いで、反応混合物を真空中で濃縮し、精製することなく次のステップで使用した。
（Ｚ）－Ｎ－メチル－Ｎ－（２－（（２－（メチル（１－（２－オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン－８－イル）アミノ）エチル）ジスルファネイル）エチル）オクタデカ－９－エン－１－アミン（脂質３５）
化合物１ａ－５および２ａ－４を１０ｍＬのＣＨＣｌ３に溶解し、室温で撹拌した。完了後、溶媒を真空で蒸発させ、ＩＳＣＯクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：１０％ＭｅＯＨ ０～５０％）によって精製した。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム） δ ５．３５（ｔ、Ｊ＝４．９Ｈｚ、２Ｈ）、２．８５－２．７５（ｍ、４Ｈ）、２．７４－２．５９（ｍ、４Ｈ）、２．４１－２．２９（ｍ、４Ｈ）、２．２３（ｄ、Ｊ＝１３．３Ｈｚ、６Ｈ）、２．０１（ｄ、Ｊ＝５．５Ｈｚ、４Ｈ）、１．３１（ｄ、Ｊ＝２５．３Ｈｚ、６９Ｈ）、０．９７－０．８１（ｍ、９Ｈ）、０．６４（ｓ、２Ｈ）、０．５７（ｄｄ、Ｊ＝７．１、３．９Ｈｚ、１Ｈ）、－０．２８－－０．４２（ｍ、１Ｈ）。［Ｃ５２Ｈ１０４Ｎ２Ｓ２］についてのＭＳ実測値８２１．７［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値８２０．７６。
脂質３６についての合成スキーム
Figure 2023502576000035
Figure 2023502576000036
エチル（２Ｅ，１１Ｚ）－３－ノニルイコサ－２，１１－ジエノエート（１ｂ－１）の合成
６０ｍｌの無水ＴＨＦ中のＮａＨ（１．６ｇ、４０．３ｍｍｏｌ）の懸濁液に、エチル２－（ジエトキシホスホリル）アセテート（９．２ｍｌ、４６ｍｍｏｌ）を０℃で滴加した。得られた混合物を０℃で３０分間撹拌して、透明な溶液を得た。この溶液に１ａ－３（２．２５ｇ、５．７５ｍｍｏｌ）を添加した後、還流下で２日間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、水でクエンチし、エーテルで抽出した。合わせた有機層を、ヘキサン中の１％酢酸エチルを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、１ｂ－１（２．４ｇ、９１％）を無色油状物として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ ５．６（ｓ、１Ｈ）、５．３０－５．４０（ｍ、２Ｈ）、４．１５（ｑ、２Ｈ）、２．５８（ｔ、３Ｈ）、２．１２（ｍ、３Ｈ）、１．２６－１．５０（ｍ、４０Ｈ）、０．８９（ｍ、６Ｈ）。
エチル３－（７－（２－オクチルシクロプロピル）ヘプチル）ドデカノエート（１ｂ－２）
ＴＨＦ中の１ｂ－１（２．０ｇ、４ｍｍｏｌ）の溶液に、ラネー－Ｎｉ（２．０ｇ）を添加した。得られた混合物を、大気圧で一晩水素化した。触媒を濾過により除去し、濾液を蒸発させて、１ｂ－２（２．１ｇ、１００％）を無色油状物として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ ４．１３（ｑ、２Ｈ）、２．２０（ｍ、３Ｈ）、１．２６－１．５０（ｍ、４４Ｈ）、０．８９（ｍ、６Ｈ）、０．５０－０．７０（ｍ、３Ｈ）、－０．３５（ｍ、１Ｈ）。
３－（７－（２－オクチルシクロプロピル）ヘプチル）ドデカン酸（１ｂ－３）
２０ｍｌのＴＨＦ中の１ｂ－２（１．９ｇ、４ｍｍｏｌ）の溶液に、１ＮのＮａＯＨ ２０ｍｌを添加した。得られた混合物を還流下で３日間撹拌した後、室温に冷却し、１ＮのＨＣｌで中和した。反応混合物を、ジクロロメタンで抽出した。合わせた有機層を蒸発させ、溶離液としてヘキサン中の０～２０％酢酸エチルを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、１ｂ－３（１．０ｇ、８３％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ ２．２８（ｍ、３Ｈ）、１．２６－１．５０（ｍ、４４Ｈ）、０．８９（ｍ、６Ｈ）、０．５０－０．７０（ｍ、３Ｈ）、－０．３５（ｍ、１Ｈ）。
Ｎ－メチル－３－（７－（２－オクチルシクロプロピル）ヘプチル）ドデカンアミド（１ｂ－４）。
３０ｍｌのジクロロメタンの溶液に、１ｂ－３（１．５ｇ、３．３ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ中の２Ｍメチルアミン（３．５ｍｌ、７ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．３３ｇ、３．４ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．８５ｇ、６．６ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、１ＮのＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３および水で洗浄した。有機層を、溶離液としてヘキサン中の５～２５％酢酸エチルを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、１ｂ－４（１．４５ｇ、９４％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ ５．２（ｂｒ、１Ｈ）、２．８０（ｓ、３Ｈ）、２．２８（ｍ、３Ｈ）、１．２６－１．５０（ｍ、４４Ｈ）、０．８９（ｍ、６Ｈ）、０．５０－０．７０（ｍ、３Ｈ）、－０．３５（ｍ、１Ｈ）。
Ｎ－メチル－３－（７－（２－オクチルシクロプロピル）ヘプチル）ドデカン－１－アミン（１ｂ－５）
１５ｍｌの無水ＴＨＦ中の１ｂ－４（７５０ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）の溶液に、２ＭのＬｉＡｌＨ４（１．５ｍｌ、３ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を還流下で２時間撹拌し、Ｎａ２ＳＯ４．１０Ｈ２Ｏでクエンチし、濾過した。濾液を蒸発させて、１ｂ－５（５７７ｍｇ、７０％）を無色油状物として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ ２．５４（ｍ、３Ｈ）、１．０－１．６（ｍ、４４Ｈ）、０．８７（ｍ、６Ｈ）、０．５０－０．７０（ｍ、３Ｈ）、－０．３５（ｍ、１Ｈ）。
２－（メチル（３－（７－（２－オクチルシクロプロピル）ヘプチル）ドデシル）アミノ）エタン－１－チオール（１ａ－６）
化合物１ａ－５（０．５ｇ、１．１４ｍｍｏｌ）を密閉チューブ内のトルエン（５ｍＬ）に溶解し、Ｎ２で５分間パージした。次いで、硫化エチレン（０．０８ｍＬ、１．２６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を５０℃で２４時間加熱した。次いで、反応混合物を真空中で濃縮し、精製することなく次のステップで使用した。
（Ｚ）－Ｎ－メチル－Ｎ－（２－（（２－（メチル（３－（７－（２－オクチルシクロプロピル）ヘプチル）ドデシル）アミノ）エチル）ジスルファネイル）エチル）オクタデカ－９－エン－１－アミン（脂質３６）
化合物１ｂ－６（０．３ｇ、０．３９ｍｍｏｌ）および２ａ－４（０．２ｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのＣＨＣｌ３に溶解し、室温で撹拌した。完了後、溶媒を真空で蒸発させ、ＩＳＣＯクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：１０％ＭｅＯＨ ０～５０％）によって精製した。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム） δ ５．３４（ｔ、Ｊ＝４．９Ｈｚ、２Ｈ）、２．８１（ｔ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、４Ｈ）、２．６７（ｄｄ、Ｊ＝９．０、５．５Ｈｚ、４Ｈ）、２．４１－２．３１（ｍ、４Ｈ）、２．２４（ｓ、６Ｈ）、２．０６－１．９４（ｍ、４Ｈ）、１．２５（ｓ、７１Ｈ）、０．８７（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、９Ｈ）、０．６４（ｄ、Ｊ＝５．２Ｈｚ、２Ｈ）、０．５９－０．５０（ｍ、１Ｈ）、－０．３４（ｑ、Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）。）。［Ｃ５４Ｈ１０８Ｎ２Ｓ２］についてのＭＳ実測値８４９．７［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値８４８．８０。
脂質３７についての合成スキーム
Figure 2023502576000037
（Ｚ）－ヘプタコサ－１８－エン－１０－オン（１ｃ－１）
１５ｍｌの無水エーテルに、１ａ－１（１．５３ｇ、４．７ｍｍｏｌ）を溶解した。この溶液に、１Ｍの臭化ノニルマグネシウム溶液（９．４ｍｌ、１２ｍｍｏｌ）を０℃で滴加した。得られた混合物を室温で２時間撹拌し、飽和塩化アンモニウム溶液中でクエンチし、ヘキサンで抽出した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させた後、溶離液としてヘキサン中の０～２０％酢酸エチルを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、１ｃ－１（１．１４ｇ、６２％）を白色固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ ５．３２－５．３６（ｍ、２Ｈ）、２．３５－２．４０（ｔ、４Ｈ）、１．９９－２．１２（ｍ、４Ｈ）、１．５３－１．５４（ｍ、４Ｈ）、１．１０－１．４０（ｍ、３２Ｈ）、０．８３－０．８９（ｔ、６Ｈ）。
（Ｚ）－Ｎ－メチルヘプタコサ－１８－エン－１０－アミン（１ｃ－２）
化合物１ｃ－１（２．５ｇ、６．４ｍｍｏｌ）を密閉チューブ内の１０ｍＬのＥｔＯＨに溶解し、１０ｍＬのＥｔＯＨ中の３０％メチルアミン（２．６ｍＬ、５．２２ｍｍｏｌ）を室温で添加した。密閉した反応混合物を、室温で６時間撹拌した。次いで、反応混合物を０℃に冷却し、ＮａＢＨ４（０．７３ｇ、１９．２ｍｍｏｌ）を添加し、一晩撹拌した。続いて、反応物を水でクエンチし、生成物をＥｔＯＡｃで抽出し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。次いで、溶媒を真空下で蒸発させ、残渣をＩＳＣＯクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ ０～１０％）によって精製した。
（Ｚ）－２－（ヘプタコサ－１８－エン－１０－イル（メチル）アミノ）エタン－１－チオール（１ｃ－３）
化合物１ｃ－２（０．５ｇ、１．２２ｍｍｏｌ）を密閉チューブ内のトルエン（５ｍＬ）に溶解し、Ｎ２で５分間パージした。次いで、硫化エチレン（０．１１ｍＬ、１．８３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を５０℃で２４時間加熱した。次いで、反応混合物を真空中で濃縮し、精製することなく次のステップで使用した。
（Ｚ）－Ｎ－メチル－Ｎ－（２－（（２－（メチル（（Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イル）アミノ）エチル）ジスルファネイル）エチル）ヘプタコサ－１８－エン－１０－アミン（脂質３７）
化合物１ｂ－４（０．４ｇ、０．８５ｍｍｏｌ）および２ａ－４（０．４３ｇ、０．９３ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのＣＨＣｌ３に溶解し、室温で撹拌した。完了後、溶媒を真空で蒸発させ、ＩＳＣＯクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：１０％ＭｅＯＨ ０～５０％）によって精製した。１Ｈ ＮＭＲ（３０１ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム） δ ５．３４（ｔ、Ｊ＝４．９Ｈｚ、４Ｈ）、２．８４－２．７４（ｍ、４Ｈ）、２．７４－２．５９（ｍ、４Ｈ）、２．４３－２．３１（ｍ、３Ｈ）、２．２３（ｄ、Ｊ＝１３．７Ｈｚ、６Ｈ）、２．０９－１．９１（ｍ、８Ｈ）、１．２６（ｓ、６４Ｈ）、０．８８（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、９Ｈ）。［Ｃ５１Ｈ１０２Ｎ２Ｓ２］についてのＭＳ実測値８０７．７［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値８０６．７５。
脂質３８についての合成スキーム
Figure 2023502576000038
エチル（Ｅ）－３－（７－（２－オクチルシクロプロピル）ヘプチル）ドデカ－２－エノエート（１ｄ－１）
６０ｍｌの無水ＴＨＦ中のＮａＨ（１．６ｇ、４０．３ｍｍｏｌ）の懸濁液に、８（９．２ｍｌ、４６ｍｍｏｌ）を０℃で滴加した。得られた混合物を０℃で３０分間撹拌して、透明な溶液を得た。この溶液に４（２．２５ｇ、５．７５ｍｍｏｌ）を添加した後、還流下で２日間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、水でクエンチし、エーテルで抽出した。合わせた有機層を、ヘキサン中の１％酢酸エチルを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、１ｄ－１（２．３ｇ、８８％）を無色油状物として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ ５．６（ｓ、１Ｈ）、４．１５（ｑ、２Ｈ）、２．５８（ｔ、３Ｈ）、２．１２（ｍ、３Ｈ）、１．２６－１．５０（ｍ、４０Ｈ）、０．８９（ｍ、６Ｈ）、０．５０－０．７０（ｍ、３Ｈ）、－０．３５（ｍ、１Ｈ）。
エチル３－（７－（２－オクチルシクロプロピル）ヘプチル）ドデカノエート（１ｄ－２）
ＴＨＦ中の１ｄ－１（２．０ｇ、４ｍｍｏｌ）の溶液に、ラネー－Ｎｉ（２．０ｇ）を添加した。得られた混合物を、大気圧で一晩水素化した。触媒を濾過により除去し、濾液を蒸発させて、１ｄ－２（２．１ｇ、１００％）を無色油状物として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ ４．１３（ｑ、２Ｈ）、２．２０（ｍ、３Ｈ）、１．２６－１．５０（ｍ、４４Ｈ）、０．８９（ｍ、６Ｈ）、０．５０－０．７０（ｍ、３Ｈ）、－０．３５（ｍ、１Ｈ）。
（Ｚ）－３－ノニルイコサ－１１－エン酸（１ｄ－３）
水（１００ｍＬ）およびＴＨＦ（３０ｍｌ）中の１ｄ－２（３．０ｇ、６．４５ｍｍｏｌ）の溶液に、１０当量のＮａＯＨ溶液を添加し、７２時間還流した。次いで、反応混合物を１ＮのＨＣｌ溶液を添加することにより中和した。生成物をＥｔＯＡｃで２回抽出し、ブラインで洗浄し、無水Ｎｓ２ＳＯ４で乾燥させた。合わせた有機層をＩＳＣＯクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ ４０～１００％）によって精製して、２．１ｇの１ｄ－３（７５％）を得た。
（Ｚ）－Ｎ－メチル－３－ノニルイコサ－１１－エンアミド（１ｄ－４）
ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍｌ）中の１ｄ－３（２．１ｇ、４．８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（０．５８ｇ、４．８ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（１．２９ｇ、６．７２ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、メチルアミン（３．７ｍＬ、７．２ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を室温で一晩撹拌した。続いて、反応混合物を３００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、有機層を水およびブラインで洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発乾固させ、溶離液としてヘキサン中の５～５０％ＥｔＯＡｃを使用するＩＳＣＯクロマトグラフィーによって精製した。所望の化合物を含有する画分をプールし、蒸発させて、１ｄ－４（１．５ｇ、８０．３％）を得た。
（Ｚ）－Ｎ－メチル－３－ノニルイコサ－１１－エン－１－アミン（１ｄ－５）
化合物１ｄ－４（１．５ｇ、３．４４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。次いで、ＬｉＡｌＨ４（０．４ｇ、１０．３２ｍｍｏｌ）を数回に分けて添加した。添加後、反応混合物を室温に到達させ、５０℃で一晩加熱した。続いて、反応物を０℃に冷却し、ＬｉＡｌＨ４がクエンチされるまで水を滴加した。次いで、反応混合物をセライトで濾過し、溶媒を蒸発乾固させ、ＩＳＣＯクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ（２％ＮＨ３）０～１００％）によって精製して、所望の生成物１ｄ－５（０．９３ｇ、６２％）を得た。
（Ｚ）－２－（メチル（３－ノニルイコサ－１１－エン－１－イル）アミノ）エタン－１－チオール（１ｄ－６）
化合物１ｄ－６（０．５ｇ、１．１４ｍｍｏｌ）を密閉チューブ内のトルエン（５ｍＬ）に溶解し、Ｎ２で５分間パージした。次いで、硫化エチレン（０．１１ｍＬ、１．２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を５０℃で２４時間加熱した。次いで、反応混合物を真空中で濃縮し、精製することなく次のステップで使用した。
（Ｚ）－Ｎ－メチル－Ｎ－（２－（（２－（メチル（（Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イル）アミノ）エチル）ジスルファネイル）エチル）－３－ノニルイコサ－１１－エン－１－アミン（脂質３８）
化合物１ｄ－６（０．２ｇ、０．４０ｍｍｏｌ）および２ａ－４（０．２８ｇ、０．６ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのＣＨＣｌ３に溶解し、室温で撹拌した。完了後、溶媒を真空で蒸発させ、ＩＳＣＯクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：１０％ＭｅＯＨ ０～５０％）によって精製した。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム） δ ５．３４（ｔ、Ｊ＝４．８Ｈｚ、４Ｈ）、２．８４－２．７２（ｍ、４Ｈ）、２．７２－２．５９（ｍ、４Ｈ）、２．４０－２．２９（ｍ、４Ｈ）、２．２３（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、６Ｈ）、２．０４－１．９１（ｍ、８Ｈ）、１．２６（ｓ、６９Ｈ）、０．８７（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、９Ｈ）。［Ｃ５３Ｈ１０６Ｎ２Ｓ２］についてのＭＳ実測値８３５．８［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値８３４．７８。
脂質３９についての合成スキーム
Figure 2023502576000039
（Ｚ）－ペンタコサ－１６－エン－８－オン（１ｅ－１）の合成
６０ｍｌの無水エーテルに、１ａ－１（５ｇ、１４．７ｍｍｏｌ）を溶解した。この溶液に、１Ｍの臭化ヘプチルマグネシウム溶液（３０ｍｌ、３０ｍｍｏｌ）を０℃で滴加した。得られた混合物を室温で２時間撹拌し、飽和塩化アンモニウム溶液中でクエンチし、ヘキサンで抽出した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させた後、溶離液としてヘキサン中の０～２０％酢酸エチルを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、１ｅ－１（４ｇ、７５％）を白色固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ ５．３２－５．３６（ｍ、２Ｈ）、２．４０（ｔ、４Ｈ）、１．９９－２．０２（ｍ、４Ｈ）、１．５３－１．５８（ｍ、４Ｈ）、１．１０－１．４０（ｍ、２８Ｈ）、０．８３－０．８９（ｔ、６Ｈ）。
（Ｚ）－ペンタコサ－１６－エン－８－アミン（１ｅ－２）の合成
エタノール（４．５ｍｌ）中の３３％メチルアミンの溶液に、５ｍｌエタノール中の１ｅ－１（１ｇ、２．７ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。得られた混合物を、室温で８時間撹拌した。上記の溶液に、ＮａＢＨ４（３００ｍｇ、７．５ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。得られた混合物を、室温で一晩撹拌した後、水でクエンチした。反応溶媒を蒸発させ、残渣を、溶離液として酢酸エチル中のメチルアミンを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、１ｅ－２（５１０ｍｇ、４９％）を淡黄色油状物として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ ５．３３－５．３４（ｍ、２Ｈ）、２．３９（ｍ、４Ｈ）、１．９７－２．０１（ｍ、４Ｈ）、１．１０－１．５０（ｍ、４２Ｈ）、０．８５－０．８７（ｔ、６Ｈ）。
（Ｚ）－２－（メチル（ペンタコサ－１６－エン－８－イル）アミノ）エタン－１－チオール（１ｅ－３）
化合物１ｅ－２（０．５ｇ、１．３０ｍｍｏｌ）を密閉チューブ内のトルエン（５ｍＬ）に溶解し、Ｎ２で５分間パージした。次いで、硫化エチレン（０．０８ｍＬ、１．３６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を５０℃で２４時間加熱した。次いで、反応混合物を真空中で濃縮し、精製することなく次のステップで使用した。
（Ｚ）－Ｎ－メチル－Ｎ－（２－（（２－（メチル（（Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イル）アミノ）エチル）ジスルファネイル）エチル）ペンタコサ－１６－エン－８－アミン（脂質３９）
化合物１ｅ－３（０．２７ｇ、０．６１ｍｍｏｌ）および２ａ－４（０．３０ｇ、０．６４ｍｍｏｌ）を５ｍＬのＣＨＣｌ３に溶解し、室温で撹拌した。完了後、溶媒を真空で蒸発させ、ＩＳＣＯクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：１０％ＭｅＯＨ ０～５０％）によって精製した。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム） δ ５．３５（ｔ、Ｊ＝４．８Ｈｚ、４Ｈ）、２．７８（ｄｄ、Ｊ＝７．９、４．０Ｈｚ、４Ｈ）、２．７５－２．６２（ｍ、４Ｈ）、２．４２－２．３１（ｍ、３Ｈ）、２．２３（ｄ、Ｊ＝１３．６Ｈｚ、６Ｈ）、２．０７－１．９４（ｍ、８Ｈ）、１．２７（ｄ、Ｊ＝４．１Ｈｚ、６１Ｈ）、０．８８（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、９Ｈ）。［Ｃ４９Ｈ９８Ｎ２Ｓ２］についてのＭＳ実測値７７９．７［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値７７８．７２。
脂質４０についての合成スキーム
Figure 2023502576000040
２－（メチル（オクタデシル）アミノ）エタン－１－チオール（２ｂ－１）
Ｎ－メチルオクタデシルアミン（１．５ｇ、５．３０ｍｍｏｌ）を密閉チューブ内のトルエン（１０ｍＬ）に溶解し、Ｎ２で５分間パージした。次いで、硫化エチレン（０．３２ｍＬ、５．８３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を５０℃で２４時間加熱した。次いで、反応混合物を真空中で濃縮し、精製することなく次のステップで使用した。
Ｎ－メチル－Ｎ－（２－（ピリジン－２－イルジスルファネイル）エチル）オクタデカン－１－アミン（２ｂ－２）
化合物２ｂ－１を５０ｍＬのＣＨＣｌ３に溶解し、２，２’－ジピリジルジスルフィド（１．４ｇ、６．３６ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１６時間撹拌した。次いで、反応混合物を真空中で濃縮し、ＩＳＣＯクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ ０～１５％）によって精製した。
Ｎ－メチル－Ｎ－（２－（（２－（メチル（３－（７－（２－オクチルシクロプロピル）ヘプチル）ドデシル）アミノ）エチル）ジスルファネイル）エチル）オクタデカン－１－アミン（脂質４０）
化合物１ａ－５および２ｂ－２を、５ｍＬのＣＨＣｌ３に溶解し、室温で撹拌した。完了後、溶媒を真空で蒸発させ、ＩＳＣＯクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：１０％ＭｅＯＨ ０～５０％）によって精製した。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム） δ ２．９３－２．７５（ｍ、４Ｈ）、２．６８（ｄｄ、Ｊ＝９．１、５．９Ｈｚ、４Ｈ）、２．４２－２．３１（ｍ、４Ｈ）、２．２５（ｄ、Ｊ＝２．２Ｈｚ、６Ｈ）、１．２６（ｓ、８０Ｈ）、０．８８（ｄｄ、Ｊ＝６．７、４．７Ｈｚ、９Ｈ）、０．６５（ｓ、２Ｈ）、０．５８（ｄｄ、Ｊ＝７．０、４．３Ｈｚ、１Ｈ）、－０．３２（ｔ、Ｊ＝４．４Ｈｚ、１Ｈ）。［Ｃ５４Ｈ１１０Ｎ２Ｓ２］についてのＭＳ実測値８５１．８［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値８５０．８１。
脂質４１についての合成スキーム
Figure 2023502576000041
（９Ｚ，１２Ｚ）－Ｎ－メチルオクタデカ－９，１２－ジエン－１－アミン（２ｃ－１）
リノレイルメタンスルホネート（５．０ｇ、１４．５ｍｍｏｌ）を密閉チューブに量り取り、５８ｍＬのメチルアミン（ＴＨＦ中２Ｍ）を添加した。反応混合物を、室温で１６時間撹拌した。次に、反応混合物を真空中で濃縮し、ＩＳＣＯクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ ０～１０％）によって精製した。所望の化合物を含有する画分を蒸発させて、２ｃ－１（２．５ｇ、６２％）を得た。
２－（メチル（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）アミノ）エタン－１－チオール（２ｃ－２）
化合物２ｃ－１（２．５ｇ、８．９０ｍｍｏｌ）を密閉チューブ内のトルエン（１０ｍＬ）に溶解し、Ｎ２で５分間パージした。次いで、硫化エチレン（０．５４ｍＬ、９ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を５０℃で２４時間加熱した。次いで、反応混合物を真空中で濃縮し、精製することなく次のステップで使用した。
（９Ｚ，１２Ｚ）－Ｎ－メチル－Ｎ－（２－（ピリジン－２－イルジスルファネイル）エチル）オクタデカ－９，１２－ジエン－１－アミン（２ｃ－３）
化合物２ｃ－２を５０ｍＬのＣＨＣｌ３に溶解し、２，２’－ジピリジルジスルフィド（５．５ｇ、２５ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１６時間撹拌した。次いで、反応混合物を真空中で濃縮し、ＩＳＣＯクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ ０～３０％）によって精製して、生成物２ｃ－３（２．３ｇ、５８％）を回収した。
（９Ｚ，１２Ｚ）－Ｎ－メチル－Ｎ－（２－（（２－（メチル（３－（７－（２－オクチルシクロプロピル）ヘプチル）ドデシル）アミノ）エチル）ジスルファネイル）エチル）オクタデカ－９，１２－ジエン－１－アミン（脂質４１）
化合物１ａ－５および２ｃ－２を、５ｍＬのＣＨＣｌ３に溶解し、室温で撹拌した。完了後、溶媒を真空で蒸発させ、ＩＳＣＯクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：１０％ＭｅＯＨ ０～５０％）によって精製した。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム） δ ５．４２－５．２６（ｍ、４Ｈ）、２．７９（ｄｔ、Ｊ＝１０．４、５．８Ｈｚ、４Ｈ）、２．６７（ｄｄ、Ｊ＝８．９、５．４Ｈｚ、４Ｈ）、２．４０－２．３１（ｍ、４Ｈ）、２．２５（ｄ、Ｊ＝３．７Ｈｚ、６Ｈ）、２．０４（ｑ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、４Ｈ）、１．３５－１．１８（ｍ、６５Ｈ）、０．８８（ｔｄ、Ｊ＝６．７、２．６Ｈｚ、９Ｈ）、０．６９－０．６１（ｍ、２Ｈ）、０．５６（ｄｄ、Ｊ＝７．２、３．９Ｈｚ、１Ｈ）、－０．３３（ｔ、Ｊ＝４．４Ｈｚ、１Ｈ）。［Ｃ５４Ｈ１１０Ｎ２Ｓ２］についてのＭＳ実測値８４７．８［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値８４６．７８。
脂質４６、４７、および４９～５１の合成
一般的なスキーム：
Figure 2023502576000042
化合物２、１２の合成
Figure 2023502576000043
 炭素鎖のメシレート（Ｒ１／Ｒ３／Ｒ５）を密閉チューブに量り取り、メチルアミン（ＴＨＦ中２Ｍ）を添加した。次いで、混合物を室温で１６時間撹拌した。続いて、反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、有機層を２ＮのＮａＯＨ溶液およびブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過した。濾液を、真空中で濃縮した。生成物をさらに精製することなく次のステップで使用した。
化合物９の合成
Figure 2023502576000044
 ブロモノナン（Ｒ４）を密閉チューブに量り取り、メチルアミン（ＴＨＦ中２Ｍ）（２０当量）を添加した。次いで、混合物を室温で１６時間撹拌した。続いて、ＴＨＦを真空で除去し、反応混合物をＣＨＣｌ３で希釈し、有機層を水およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過した。濾液を、真空中で濃縮した。生成物をさらに精製することなく次のステップで使用した。
化合物３、６、１０および１３の合成
Figure 2023502576000045
 前のステップの中間体（２、１２、および９）を密閉チューブ内でトルエンに溶解し、Ｎ２で５分間パージした。次いで、硫化エチレン（１．５当量）を添加し、混合物を５０℃で２４時間加熱した。次いで、反応混合物を真空中で濃縮し、直ちに次のステップで使用した。
化合物４および７の合成
Figure 2023502576000046
 前のステップ（３／６）からのチオールをＣＨＣｌ３に溶解し、２，２’－ジピリジルジスルフィド（１．５当量）を添加し、室温で１６時間撹拌した。次に、反応混合物を真空中で濃縮し、ＩＳＣＯクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ ０～１０％）によって精製した。
化合物１６の合成
Figure 2023502576000047
 化合物１４（ｓｗＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム） δ ５．３４（ｔ、Ｊ＝４．９Ｈｚ、２Ｈ）、２．８１（ｄｄ、Ｊ＝９．４、５．６Ｈｚ、４Ｈ）、２．６７（ｄｄ、Ｊ＝８．９、５．３ Ｈｚ、４Ｈ）、２．４１－２．３０（ｍ、４Ｈ）、２．２５（ｓ、６Ｈ）、２．０１（ｄ、Ｊ＝５．６ Ｈｚ、４Ｈ）、１．４５（ｓ、４Ｈ）、１．２６（ｓ、３８Ｈ）、０．８７（ｔ、Ｊ＝６．７ Ｈｚ、６Ｈ）。［Ｃ３５Ｈ７２Ｎ２Ｓ２］についてのＭＳ実測値５８５．４［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値５８４．５１。
Ｎ－メチル－Ｎ－（２－（（２－（メチル（ウンデシル）アミノ）エチル）ジスルファネイル）エチル）オクタデカン－１－アミン（脂質４７）収量：０．０８２ｇ（３０％）。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム） δ ２．８０（ｄｄ、Ｊ＝９．２、５．６Ｈｚ、４Ｈ）、２．６７（ｄｄ、Ｊ＝９．０、５．３Ｈｚ、４Ｈ）、２．４２－２．２９（ｍ、４Ｈ）、２．２４（ｓ、６Ｈ）、１．５２－１．３８（ｍ、６Ｈ）、１．２４（ｓ、４６Ｈ）、０．８７（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、６Ｈ）。［Ｃ３５Ｈ７４Ｎ２Ｓ２］についてのＭＳ実測値５８７．７［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値５８６．５３。
（Ｚ）－Ｎ－メチル－Ｎ－（２－（（２（メチル（ノニル）アミノ）エチル）ジスルファネイル）エチル）オクタデカ－９－エン－１－アミン（脂質４９）収量：０．２５２ｇ（４２％）。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム） δ ５．３４（ｔ、Ｊ＝４．９Ｈｚ、２Ｈ）、２．８１（ｄｄ、Ｊ＝９．３、５．６Ｈｚ、４Ｈ）、２．６７（ｄｄ、Ｊ＝８．５、５．８Ｈｚ、４Ｈ）、２．４２－２．３０（ｍ、４Ｈ）、２．２４（ｓ、６Ｈ）、２．０８－１．９４（ｍ、６Ｈ）、１．６８（ｄ、Ｊ＝４．４Ｈｚ、２Ｈ）、１．４５（ｓ、４Ｈ）、１．２６（ｓ、３２Ｈ）、０．８７（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、６Ｈ）。［Ｃ３３Ｈ６８Ｎ２Ｓ２］についてのＭＳ実測値５５７．４［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値５５６．４８。
Ｎ－メチル－Ｎ－（２－（（２－（メチル（ノニル）アミノ）エチル）ジスルファネイル）エチル）オクタデカン－１－アミン（脂質５０）収量：０．１１４ｇ（２１％）。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム） δ ２．８８－２．７６（ｍ、４Ｈ）、２．７２－２．５９（ｍ、４Ｈ）、２．３５（ｄｄ、Ｊ＝９．８、５．３Ｈｚ、４Ｈ）、２．２４（ｓ、６Ｈ）、１．５１－１．３７（ｍ、４Ｈ）、１．２５（ｄ、Ｊ＝４．０Ｈｚ、４２Ｈ）、０．８７（ｔ、Ｊ＝６．７Ｈｚ、６Ｈ）。［Ｃ３３Ｈ６８Ｎ２Ｓ２］についてのＭＳ実測値５５９．４［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値５５８．５０。
（９Ｚ，１２Ｚ）－Ｎ－メチル－Ｎ－（２－（（２（メチル（ノニル）アミノ）エチル）ジスルファネイル）エチル）オクタデカ－９，１２－ジエン－１－アミン（脂質５１）収量：０．０７４ｇ（２６％）。１Ｈ ＮＭＲ（３０１ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム） δ ５．４２－５．２８（ｍ、４Ｈ）、２．８７－２．８０（ｍ、４Ｈ）、２．７７－２．７２（ｍ、４Ｈ）、２．５０－２．３８（ｍ、４Ｈ）、２．３０（ｓ、６Ｈ）、２．０４（ｑ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、４Ｈ）、１．５４－１．４２（ｍ、４Ｈ）、１．２８（ｓ、Ｊ＝５．６Ｈｚ、３０Ｈ）、０．９３－０．８１（ｍ、６Ｈ）。［Ｃ３３Ｈ６６Ｎ２Ｓ２］についてのＭＳ実測値５５５．４［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値５５４．４７。
実施例２
ラットへの網膜下注射後の脂質３９を含むＬＮＰで製剤化した治療用核酸の安全性および導入遺伝子発現の評価
イオン化可能な脂質として脂質３９（「ＬＮＰ３９」）を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に製剤化された治療用核酸（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）の導入遺伝子発現を評価するために、ルシフェラーゼ遺伝子に操作可能に連結されたＣＡＧプロモーターを含むｃｅＤＮＡ（「ＣＡＧ－Ｌｕｃ ｃｅＤＮＡ」）をＬＮＰ中に封入し（脂質３９：ＤＯＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００、５０．８：７．２：３８．６：２．９：０．４８のモル比）、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（雄）に注射した。ＬＮＰの平均直径は７２．４ｎｍで、封入効率はおよそ４０％であった。上記のように、すべての試験品は、ＬＮＰ製剤化ｃｅＤＮＡ：イオン化可能な脂質として脂質３９を含有する「ＣＡＧ－ルシフェラーゼｃｅＤＮＡ」であった。上述したように、脂質３９は、（Ｚ）－Ｎ－メチル－Ｎ－（２－（（２－（メチル（（Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イル）アミノ）エチル）ジスルファネイル）エチル）ペンタコサ－１６－エン－８－アミンという名称のイオン化可能な脂質である。
以下に詳細に説明するように、試験品を動物に網膜下（ＳＲ）に投与した。すべての動物は、－１日目から開始し、１４日目まで終了する、０．５ｍｇ／ｋｇのメチルプレドニゾロン（皮下、ＳＣ）の毎日の処置で処置された。
動物の健康および順応：
動物は、麻酔前に最低３日間、試験環境に順応させた。順応期間の終了時に、各動物を身体検査して、試験参加への適合性を決定した。検査には、皮膚ならびに外耳、目、腹部、神経学的、行動、および全身の状態が含まれていた。健康であると決定された動物は、試験用に解放された。
検査：死亡率および罹患率の検査は、毎日行った。
外科的処置：
外科的処置の日に、ラットにブプレノルフィン０．０１～０．０５ｍｇ／ｋｇをＳＱ投与した。動物はまた、トロピカミド（１．０％）およびフェニレフリン（２．５％）のカクテルを局所的に与えられ、眼を拡張して眼球突出させた。次いで、ケタミン／キシラジンカクテルを用いて外科的処置のために動物を静置し、０．５％プロパラカインＨＣＬを１滴両眼に適用した。無菌外科的処置のために眼を調製した。あるいは、ラットを吸入イソフルランで鎮静化した。角膜は局所洗眼器を使用して湿らせたままにし、体温は必要に応じてホットパッドを使用して維持した。
網膜下注射：強膜を露出させるために、結膜およびテノン嚢を通る長さ２ｍｍの切開を行った。後強膜には、３３ゲージの針およびハミルトンシリンジを使用して網膜下注射用に３０ゲージの針の先端を使用した小さな下穴を開けた。いずれかの注射処置に続いて、オフロキサシン点眼液１滴、続いて眼の潤滑剤を眼の表面に局所的に適用し、動物を手術から回復させた。キシラジン効果を逆転させるためにラットにアチパメゾールを投与した（０．１～１．０ｍｇ／ｋｇ）。
眼の検査：
細隙灯生体顕微鏡を使用して眼の検査を行い、上記表に示す時点で眼の表面形態を評価した。以下のスコア表は、前眼部の炎症を評価するために使用した。
ＩＶＩＳイメージング：
１４日目に、すべての動物は、ルシフェラーゼ発現を定量化および決定するために、眼のＩＶＩＳイメージング処置を受けた。基質ルシフェリンを腹腔内注射し（０．１５ｍｇ／ｇ）、注射後およそ５～１０分でラットの画像を撮影した。各眼の周りの楕円体ＲＯＩから、全光束（光子／秒）、および平均放射輝度（光子／秒／ｃｍ／ｓｒ）の測定値が取得された。
光干渉断層撮影（ＯＣＴ）
すべての動物は、網膜下注射の成功および経時変化を決定するために、眼の後部のＯＣＴイメージング処置を受けた。検査の１５分前にＯＣＴのために、トロピカミドＨＣＬ１％および塩酸フェニレフリン２．５％のカクテルを使用して眼を拡張した。外顆粒層（ＯＮＬ）の厚さは、２回のＯＣＴスキャンから３つの位置（左、右、および中央）で測定された。
結果
図５に示されるように、脂質３９：ＤＯＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００：ＤＳＰＥ―ＰＥＧ２０００、５０．８：７．２：３８．６：２．９：０．４８のモルパーセンテージ比を有し、「ＣＡＧ－Ｌｕｃ ｃｅＤＮＡ」を封入するＬＮＰを含有する２．５μＬのＬＮＰ製剤（０．０４μｇ／μＬ）（「ＬＮＰ３９」）を網膜下（ＳＲ）注射されたＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットは、１４日目にルシフェラーゼの顕著な発現を示した。ビヒクルで処置された動物および処置されなかった動物は、バックグラウンドレベルのみを示した。ＬＮＰ３９で処置されたすべての動物は、顕著な体重減少なしに用量に良好な耐容性を示した。
参考文献
特許および特許出願を含むがこれらに限定されない、本明細書および本明細書の実施例で引用されるすべての刊行物および参考文献は、あたかも個々の刊行物または参考文献が、完全に記載されるように参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示されるかのように、それらの全体が参照により組み込まれる。この出願が優先権を主張する任意の特許出願もまた、刊行物および参考文献について上述した方法で、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (101)

  1. 式（Ｉ）：
    Figure 2023502576000048
     で表されるイオン化可能な脂質、またはその薬学的に許容される塩であって、式中、
    Ｒ１およびＲ１’が、それぞれ独立して、任意に置換された直鎖または分枝鎖Ｃ１～３アルキレンであり、
    Ｒ２およびＲ２’が、それぞれ独立して、任意に置換された直鎖または分枝鎖Ｃ１～６アルキレンであり、
    Ｒ３およびＲ３’が、それぞれ独立して、任意に置換された直鎖または分枝鎖Ｃ１～６アルキルであるか、
    あるいは、Ｒ２が任意に置換された分枝鎖Ｃ１～６アルキレンである場合、Ｒ２およびＲ３が、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成するか、
    あるいは、Ｒ２’が任意に置換された分枝鎖Ｃ１～６アルキレンである場合、Ｒ２’およびＲ３’が、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成し、
    Ｒ４およびＲ４’が、それぞれ独立して、－ＣＲａ、－Ｃ（Ｒａ）２ＣＲａ、または－［Ｃ（Ｒａ）２］２ＣＲａであり、
    Ｒａが、各出現に対して、独立してＨまたはＣ１～３アルキルであるか、
    あるいは、Ｒ４が－Ｃ（Ｒａ）２ＣＲａ、または－［Ｃ（Ｒａ）２］２ＣＲａである場合、かつＲａがＣ１～３アルキルである場合、Ｒ３およびＲ４が、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成するか、
    あるいは、Ｒ４’が－Ｃ（Ｒａ）２ＣＲａ、または－［Ｃ（Ｒａ）２］２ＣＲａである場合、かつＲａがＣ１～３アルキルである場合、Ｒ３’およびＲ４’が、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成し、
    Ｒ５およびＲ５’が、それぞれ独立して、Ｃ１～２０アルキレンまたはＣ２～２０アルケニレンであり、
    Ｒ６およびＲ６’が、各出現に対して、独立してＣ１～２０アルキレン、Ｃ３～２０シクロアルキレン、またはＣ２～２０アルケニレンであり、
    ｍおよびｎが、それぞれ独立して、１、２、３、４、および５から選択される整数である、イオン化可能な脂質、またはその薬学的に許容される塩。
  2. Ｒ１またはＲ１’によって表される前記直鎖または分枝鎖Ｃ１～３アルキレン、Ｒ２またはＲ２’によって表される前記直鎖または分枝鎖Ｃ１～６アルキレン、および前記任意に置換された直鎖または分枝鎖Ｃ１～６アルキルが、それぞれ任意に、１つ以上のハロおよびシアノ基で置換されている、請求項１に記載のイオン化可能な脂質。
  3. Ｒ２およびＲ２’が、それぞれ独立して、Ｃ１～３アルキレンである、請求項１に記載のイオン化可能な脂質。
  4. 一緒になったＲ１およびＲ２が、Ｃ１～３アルキレンであり、一緒になったＲ１’およびＲ２’が、Ｃ１～３アルキレンである、請求項３に記載のイオン化可能な脂質。
  5. 一緒になったＲ１およびＲ２が、エチレンであり、一緒になったＲ１’およびＲ２’が、エチレンである、請求項４に記載のイオン化可能な脂質。
  6. Ｒ３およびＲ３’が、それぞれ独立して、任意に置換されたＣ１～３アルキルである、請求項１に記載のイオン化可能な脂質。
  7. Ｒ３およびＲ３’が、それぞれメチルである、請求項６に記載のイオン化可能な脂質。
  8. Ｒ４およびＲ４’が、それぞれ－ＣＨである、請求項１に記載のイオン化可能な脂質。
  9. Ｒ２が、任意に置換された分枝鎖Ｃ１～６アルキレンであり、Ｒ２およびＲ３が、それらの介在するＮ原子と一緒になって、５員または６員のヘテロシクリルを形成する、請求項１に記載のイオン化可能な脂質。
  10. Ｒ２’が、任意に置換された分枝鎖Ｃ１～６アルキレンであり、Ｒ２’およびＲ３’が、それらの介在するＮ原子と一緒になって、５員または６員のヘテロシクリルを形成する、請求項１に記載のイオン化可能な脂質。
  11. Ｒ４が、－Ｃ（Ｒａ）２ＣＲａ、または－［Ｃ（Ｒａ）２］２ＣＲａであり、ＲａがＣ１～３アルキルであり、Ｒ３およびＲ４が、それらの介在するＮ原子と一緒になって、５員または６員のヘテロシクリルを形成する、請求項１に記載のイオン化可能な脂質。
  12. Ｒ４’が、－Ｃ（Ｒａ）２ＣＲａ、または－［Ｃ（Ｒａ）２］２ＣＲａであり、ＲａがＣ１～３アルキルであり、Ｒ３’およびＲ４’が、それらの介在するＮ原子と一緒になって、５員または６員のヘテロシクリルを形成する、請求項１に記載のイオン化可能な脂質。
  13. 前記５員または６員のヘテロシクリルが、ピロリジニルまたはピペリジニルである、請求項９～１２のいずれか一項に記載のイオン化可能な脂質。
  14. Ｒ５およびＲ５’が、それぞれ独立して、Ｃ１～１０アルキレンまたはＣ２～１０アルケニレンである、請求項１～１３のいずれか一項に記載のイオン化可能な脂質。
  15. Ｒ６およびＲ６’が、各出現に対して、独立して、Ｃ１～１０アルキレン、Ｃ３～１０シクロアルキレン、またはＣ２～１０アルケニレンである、請求項１～１４のいずれか一項に記載のイオン化可能な脂質。
  16. 前記Ｃ３～１０シクロアルキレンが、シクロプロピレンである、請求項１５に記載のイオン化可能な脂質。
  17. ｍおよびｎが、それぞれ３である、請求項１５または１６に記載のイオン化可能な脂質。
  18. 前記イオン化可能な脂質が、
    Figure 2023502576000049
    Figure 2023502576000050
    Figure 2023502576000051
    Figure 2023502576000052
    Figure 2023502576000053
    Figure 2023502576000054
     または前述のうちのいずれかの薬学的に許容される塩から選択される、請求項１に記載のイオン化可能な脂質。
  19. 前記イオン化可能な脂質が、
    Figure 2023502576000055
    Figure 2023502576000056
    Figure 2023502576000057
    Figure 2023502576000058
     から選択される、請求項１に記載のイオン化可能な脂質。
  20. 請求項１～１９および１０１のいずれか一項に記載のイオン化可能な脂質と、核酸と、を含む、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）。
  21. 前記核酸が、前記イオン化可能な脂質内に封入されている、請求項２０に記載の脂質ナノ粒子。
  22. 前記核酸が、ミニ遺伝子、プラスミド、ミニサークル、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、リボザイム、ｃｅＤＮＡ、ミニストリング、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）、プロテロメア閉端ＤＮＡ、またはダンベル直鎖状ＤＮＡ、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＤＮＡウイルスベクター、ウイルスＲＮＡベクター、非ウイルスベクター、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項２０または２１に記載の脂質ナノ粒子。
  23. 前記核酸が、閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）である、請求項２２に記載の脂質ナノ粒子。
  24. ステロールをさらに含む、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  25. 前記ステロールが、コレステロールである、請求項２４に記載の脂質ナノ粒子。
  26. ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＰＥＧ－脂質コンジュゲートをさらに含む、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  27. 前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）である、請求項２６に記載の脂質ナノ粒子。
  28. 非カチオン性脂質をさらに含む、請求項２０～２７のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  29. 前記非カチオン性脂質が、ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－モノメチルＰＥなど）、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－ジメチルＰＥなど）、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２－ジフィタノイル（ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌ）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＨｙＰＥ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リソレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジカシド、セレブロシド、ジセチルホスフェート、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、またはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２８に記載の脂質ナノ粒子。
  30. 前記非カチオン性脂質が、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、およびジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる群から選択される、請求項２９に記載の脂質ナノ粒子。
  31. 前記ＰＥＧまたはＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、約２％～約４％で存在する、請求項３０に記載の脂質ナノ粒子。
  32. 前記ＰＥＧまたはＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、約２％～約３．５％で存在する、請求項３１に記載の脂質ナノ粒子。
  33. 前記ＰＥＧまたはＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、約２．５％～約３％で存在する、請求項３２に記載の脂質ナノ粒子。
  34. 前記ＰＥＧまたはＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、約３％で存在する、請求項３３に記載の脂質ナノ粒子。
  35. 前記コレステロールが、約２０％～約４０％のモルパーセンテージで存在し、前記イオン化可能な脂質が、約８０％～約６０％のモルパーセンテージで存在する、請求項２９～３４のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  36. 前記コレステロールが、約４０％のモルパーセンテージで存在し、前記イオン化可能な脂質が、約５０％のモルパーセンテージで存在する、請求項３５に記載の脂質ナノ粒子。
  37. コレステロール、ＰＥＧまたはＰＥＧ－脂質コンジュゲート、および非カチオン性脂質をさらに含む、請求項１９～２３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  38. 前記ＰＥＧまたはＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、約２％～約４％で存在する、請求項３７に記載の脂質ナノ粒子。
  39. 前記ＰＥＧまたはＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、約２％～約３．５％で存在する、請求項３８に記載の脂質ナノ粒子。
  40. 前記ＰＥＧまたはＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、約２．５％～約３％で存在する、請求項３９に記載の脂質ナノ粒子。
  41. 前記ＰＥＧまたはＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、約３％で存在する、請求項４０に記載の脂質ナノ粒子。
  42. 前記コレステロールが、約３０％～約５０％のモルパーセンテージで存在する、請求項３６～４１のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  43. 前記イオン化可能な脂質が、約４２．５％～約６２．５％のモルパーセンテージで存在する、請求項３６～４１のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  44. 前記非カチオン性脂質が、約２．５％～約１２．５％のモルパーセンテージで存在する、請求項３６～４１のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  45. 前記コレステロールが、約４０％のモルパーセンテージで存在し、前記イオン化可能な脂質が、約５２．５％のモルパーセンテージで存在し、前記非カチオン性脂質が、約７．５％のモルパーセンテージで存在し、前記ＰＥＧまたはＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、約３％で存在する、請求項３６～４１のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  46. パルミチン酸デキサメタゾンをさらに含む、請求項２０～４５のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  47. 前記ナノ粒子が、約５０ｎｍ～約１１０ｎｍの範囲の直径を有する、請求項２０～４６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  48. 前記ナノ粒子が、サイズが約１００ｎｍ未満である、請求項２０～４６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  49. 前記粒子が、サイズが約７０ｎｍ未満である、請求項４８に記載の脂質ナノ粒子。
  50. 前記粒子が、サイズが約６０ｎｍ未満である、請求項４９に記載の脂質ナノ粒子。
  51. 前記粒子が、約１０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ比を有する、請求項２３に記載の脂質ナノ粒子。
  52. 前記粒子が、約２０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ比を有する、請求項２３に記載の脂質ナノ粒子。
  53. 前記粒子が、約３０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ比を有する、請求項２３に記載の脂質ナノ粒子。
  54. 前記粒子が、約４０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ比を有する、請求項２３に記載の脂質ナノ粒子。
  55. 組織特異的標的化部分をさらに含む、請求項２０～５４のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  56. 前記組織特異的標的化部分が、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）含有部分（例えば、ＧａｌＮＡＣ－ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）であり、前記全脂質の約１．５％、約１．４％、約１．３％、約１．２％、約１．１％、約１．０％、約０．９％、約０．８％、約０．７％、約０．６％、約０．５％、約０．４％、約０．３％、約０．２％、または約０．１％のモルパーセンテージで前記粒子中に存在する、請求項５５に記載の脂質ナノ粒子。
  57. 前記ＧａｌＮＡｃ含有部分が、前記全脂質の約０．５％のモルパーセンテージで前記粒子中に存在する、請求項５６に記載の脂質ナノ粒子。
  58. 約１０ｍＭ～約３０ｍＭのリンゴ酸をさらに含む、請求項２０～５７のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  59. 約２０ｍＭのリンゴ酸を含む、請求項５８に記載の脂質ナノ粒子。
  60. 約３０ｍＭ～約５０ｍＭのＮａＣｌをさらに含む、請求項２０～５９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  61. 約４０ｍＭのＮａＣｌをさらに含む、請求項６０に記載の脂質ナノ粒子。
  62. 約２０ｍＭ～約１００ｍＭのＭｇＣｌ２をさらに含む、請求項２０～６１のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  63. 前記ｃｅＤＮＡが、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡである、請求項２３に記載の脂質ナノ粒子。
  64. 前記ｃｅＤＮＡが、発現カセットを含み、前記発現カセットが、プロモーター配列および導入遺伝子を含む、請求項２３に記載の脂質ナノ粒子。
  65. 前記発現カセットが、ポリアデニル化配列を含む、請求項６４に記載の脂質ナノ粒子。
  66. 前記ｃｅＤＮＡが、前記発現カセットの５’または３’末端のいずれかに隣接する少なくとも１つの逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む、請求項６３～６５のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  67. 前記発現カセットが、２つのＩＴＲに隣接し、前記２つのＩＴＲが、１つの５’ＩＴＲおよび１つの３’ＩＴＲを含む、請求項６６に記載の脂質ナノ粒子。
  68. 前記発現カセットが、３’末端でＩＴＲ（３’ＩＴＲ）に連結される、請求項６６に記載の脂質ナノ粒子。
  69. 前記発現カセットが、５’末端でＩＴＲ（５’ＩＴＲ）に連結される、請求項６６に記載の脂質ナノ粒子。
  70. ５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＡＡＶ ＩＴＲである、請求項６６に記載の脂質ナノ粒子。
  71. ５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、修飾型ＩＴＲである、請求項６６に記載の脂質ナノ粒子。
  72. 前記ｃｅＤＮＡが、５’ＩＴＲと前記発現カセットとの間にスペーサー配列をさらに含む、請求項６６に記載の脂質ナノ粒子。
  73. 前記ｃｅＤＮＡが、３’ＩＴＲと前記発現カセットとの間にスペーサー配列をさらに含む、請求項６６に記載の脂質ナノ粒子。
  74. 前記スペーサー配列が、長さが少なくとも５塩基対の長さである、請求項７２または７３に記載の脂質ナノ粒子。
  75. 前記スペーサー配列が、長さが５～１００塩基対の長さである、請求項７４に記載の脂質ナノ粒子。
  76. 前記スペーサー配列が、長さが５～５００塩基対の長さである、請求項７４に記載の脂質ナノ粒子。
  77. 前記ｃｅＤＮＡが、ニックまたはギャップを有する、請求項２０～７６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  78. 前記ＩＴＲが、ＡＡＶ血清型に由来するＩＴＲであり、ガチョウウイルスのＩＴＲに由来し、Ｂ１９ウイルスＩＴＲに由来し、パルボウイルスからの野生型ＩＴＲである、請求項６６に記載の脂質ナノ粒子。
  79. 前記ＡＡＶ血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１およびＡＡＶ１２を含む群から選択される、請求項７８に記載の脂質ナノ粒子。
  80. 前記ＩＴＲが、変異体ＩＴＲであり、前記ｃｅＤＮＡが、第１のＩＴＲとは異なる追加のＩＴＲを任意に含む、請求項６６に記載の脂質ナノ粒子。
  81. 前記ｃｅＤＮＡが、前記発現カセットの５’および３’末端の両方に２つの変異体ＩＴＲを含み、任意に、前記２つの変異体ＩＴＲが、対称変異体である、請求項６６に記載の脂質ナノ粒子。
  82. 前記ｃｅＤＮＡが、ＣＥＬｉＤ、ＤＮＡベースのミニサークル、ＭＩＤＧＥ、ミニスタリング（ｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）ＤＮＡ、発現カセットの５’および３’末端にＩＴＲの２つのヘアピン構造を含むダンベル型の直鎖状二重鎖閉端ＤＮＡ、またはｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡである、請求項２３に記載の脂質ナノ粒子。
  83. 請求項２０～８２のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、薬学的組成物。
  84. 対象における遺伝性障害を治療する方法であって、前記方法が、有効量の請求項２０～８０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子、または有効量の請求項８３に記載の薬学的組成物を、前記対象に投与することを含む、方法。
  85. 前記対象が、ヒトである、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記遺伝性障害が、鎌状赤血球貧血症、メラノーマ、血友病Ａ（凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）欠損症）および血友病Ｂ（凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）欠損症）、嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ）、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬ受容体欠損症）、肝芽細胞腫、ウィルソン病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、先天性肝性ポルフィリン症、遺伝性肝代謝障害、レッシュナイハン症候群、鎌状赤血球貧血症、サラセミア、色素性乾皮症、ファンコニ貧血、網膜色素変性症、毛細血管拡張性運動失調症、ブルーム症候群、網膜芽細胞腫、ムコ多糖蓄積症（例えば、ハーラー症候群（ＭＰＳ Ｉ型）、シャイエ症候群（ＭＰＳ Ｉ Ｓ型）、ハーラー・シャイエ症候群（ＭＰＳ Ｉ Ｈ－Ｓ型）、ハンター症候群（ＭＰＳ ＩＩ型）、サンフィリッポＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤ型（ＭＰＳ ＩＩＩ Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ型）、モルキオＡおよびＢ型（ＭＰＳ ＩＶＡおよびＭＰＳ ＩＶＢ）、マロトーラミー症候群（ＭＰＳ ＶＩ型）、スライ症候群（ＭＰＳ ＶＩＩ型）、ヒアルロニダーゼ欠損症（ＭＰＳ ＩＸ型））、ニーマンピック病Ａ／Ｂ、Ｃ１およびＣ２型、ファブリー病、シンドラー病、ＧＭ２－ガングリオシドーシスＩＩ型（サンドホフ病）、テイ・サックス病、異染性白質ジストロフィー、クラッベ病、ムコリピドーシスＩ、ＩＩ／ＩＩＩおよびＩＶ型、シアリドーシスＩおよびＩＩ型、グリコーゲン蓄積症ＩおよびＩＩ型（ポンペ病）、ゴーシェ病Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型、ファブリー病、シスチン症、バッテン病、アスパルチルグルコサミン尿症、サラ病、ダノン病（ＬＡＭＰ－２欠損症）、リソソーム酸性リパーゼ（ＬＡＬ）欠損症、神経セロイドリポフスチン症（ＣＬＮ１－８、ＩＮＣＬ、およびＬＩＮＣＬ）、スフィンゴリピドーシス、ガラクトシアリドーシス、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症、フリードライヒ運動失調症、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、ジストロフィー表皮水疱症（ＤＥＢ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ１欠損症、乳児期の全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）、レーバー先天性黒内障、シュタルガルト黄斑ジストロフィー（ＡＢＣＡ４）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、アッシャー症候群、アルファ－１アンチトリプシン欠損症、進行性家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣ）Ｉ型（ＡＴＰ８Ｂ１欠損症）、ＩＩ型（ＡＢＣＢ１１）、ＩＩＩ型（ＡＢＣＢ４）、またはＩＶ型（ＴＪＰ２）、ならびにカテプシンＡ欠損症からなる群から選択される、請求項８４または８５に記載の方法。
  87. 前記遺伝性障害が、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）である、請求項８６に記載の方法。
  88. 前記ＬＣＡが、ＬＣＡ１０である、請求項８７に記載の方法。
  89. 前記遺伝性障害が、ニーマンピック病である、請求項８６に記載の方法。
  90. 前記遺伝性障害が、シュタルガルト黄斑ジストロフィーである、請求項８６に記載の方法。
  91. 前記遺伝性障害が、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）欠損症（グリコーゲン蓄積症Ｉ型）またはポンペ病（グリコーゲン蓄積症ＩＩ型）である、請求項８６に記載の方法。
  92. 前記遺伝性障害が、血友病Ａ（因子ＶＩＩＩ欠損症）である、請求項８６に記載の方法。
  93. 前記遺伝性障害が、血友病Ｂ（因子ＩＸ欠損症）である、請求項８６に記載の方法。
  94. 前記遺伝性障害が、ハンター症候群（ムコ多糖症ＩＩ型）である、請求項８６に記載の方法。
  95. 前記遺伝性障害が、嚢胞性線維症である、請求項８６に記載の方法。
  96. 前記遺伝性障害が、ジストロフィー表皮水疱症（ＤＥＢ）である、請求項８６に記載の方法。
  97. 前記遺伝性障害が、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）である、請求項８６に記載の方法。
  98. 前記遺伝性障害が、進行性家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣ）である、請求項８６に記載の方法。
  99. 前記遺伝性障害が、ウィルソン病である、請求項８６に記載の方法。
  100. 前記遺伝性障害が、ゴーシェ病Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ型である、請求項８６に記載の方法。
  101. 前記イオン化可能な脂質が、（Ｚ）－Ｎ－メチル－Ｎ－（２－（（２－（メチル（（Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イル）アミノ）エチル）ジスルファネイル）エチル）ペンタコサ－１６－エン－８－アミンであり、その式が、以下に記載されている、請求項１に記載のイオン化可能な脂質。
    Figure 2023502576000059
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