ES2908827T3 - Lípidos y composiciones lipídicas para el suministro de agentes activos - Google Patents

Lípidos y composiciones lipídicas para el suministro de agentes activos Download PDF

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Delai Chen
Gabriel Grant Gamber
Andrew Geall
Kevin Love
Thomas Zabawa
Frederic Zecri
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Abstract

Un compuesto, o sal del mismo, de fórmula (II): **(Ver fórmula)** n es 0, 1, 2, 3 o 4; R1 es **(Ver fórmula)** v es 3 o 4; cada uno de R y R' es, independientemente, alquilo C1-8; y R2 se selecciona entre alquilo C6-20 y alquenilo C15-19; R3 se selecciona entre: alquilo C4-22, alquenilo C12-22, **(Ver fórmula)**

Description

DESCRIPCIÓN
Lípidos y composiciones lipídicas para el suministro de agentes activos
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención se refiere a compuestos lipídicos catiónicos y a composiciones que comprenden dichos compuestos. Esta invención también se refiere a composiciones para usar en la inducción de una respuesta inmunitaria.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El suministro de agentes biológicamente activos (incluyendo compuestos terapéuticamente relevantes) a sujetos a menudo se ve obstaculizado por dificultades para que los compuestos alcance la célula o el tejido diana. En particular, el tráfico de muchos agentes biológicamente activos en células vivas está muy restringido por los sistemas complejos de membrana de las células. Estas restricciones pueden dar lugar a la necesidad de usar concentraciones mucho mayores de agentes biológicamente activos de lo que es deseable para lograr un resultado, lo que aumenta el riesgo de efectos tóxicos y efectos secundarios. Una solución a este problema es utilizar moléculas transportadoras específicas y composiciones transportadoras a las que se permita la entrada selectiva en la célula. Se pueden usar vehículos lipídicos, polímeros biodegradables y diversos sistemas conjugados para mejorar el suministro de agentes biológicamente activos a las células.
Una clase de agentes biológicamente activos que es particularmente difícil de suministrar a las células es un agente bioterapéutico (incluyendo nucleósidos, nucleótidos, polinucleótidos, ácidos nucleicos y derivados, tales como agentes de ARNm, iARN y ARN autorreplicante). En general, los ácidos nucleicos son estables solo durante un tiempo limitado en células o plasma. El desarrollo de interferencia de ARN, terapia de iARN, terapia de ARNm, fármacos de ARN, terapia antisentido, terapia génica y vacunas de ácido nucleico (p. ej., vacunas de ARN), entre otros, ha aumentado la necesidad de un medio eficaz para introducir agentes de ácido nucleico activos en las células. Por estos motivos, las composiciones que pueden estabilizar y suministrar agentes a base de ácido nucleico en células son de interés particular.
Los enfoques mejor estudiados para mejorar el transporte de ácidos nucleicos extraños a células implican el uso de vectores víricos o formulaciones con lípidos catiónicos. Pueden usarse vectores víricos para transferir genes eficientemente a algunos tipos celulares, pero en general no pueden usarse para introducir moléculas sintetizadas químicamente en células.
Un enfoque alternativo es usar composiciones de suministro que incorporan lípidos catiónicos que, por una parte, interactúan con un agente biológicamente activo, y por otra parte, interactúan con un sistema de membrana. Se ha informado de que tales composiciones proporcionan liposomas, micelas, lipoplexos o nanopartículas lipídicas, dependiendo de la composición y el método de preparación (para revisiones, véase Feigner, 1990, Advanced Drug Delivery Reviews, 5, 162-187; Feigner, 1993, J. Liposome Res., 3, 3-16; Gallas, 2013, Chem. Soc. Rev., 42, 7983-7997; Falsini, 2013, J. Med. Chem. dx.doi.org/10.1021/jm400791q; y sus referencias).
Desde la primera descripción de liposomas en 1965 de Bangham (J. Mol. Biol. 13, 238-252), ha habido un interés continuado e intentos de desarrollar sistemas de transportadores a base de lípidos para el suministro de agentes biológicamente activos (Allen, 2013, Advanced Drug Delivery Reviews, 65, 36-48). El proceso de introducir ácidos nucleicos funcionales en células cultivadas usando liposomas con carga positiva se describió por primera vez en Philip Felgner et al. Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 84, 7413-7417 (1987). El proceso se demostró posteriormente in vivo por K. L. Brigham et al., Am. J. Med. Sci., 298, 278-281 (1989). Más recientemente, se han desarrollado formulaciones de nanopartículas lipídicas con eficacia demostrada in vitro e in vivo. (Falsini, 2013, J. Med. Chem. dx.doi.org/10.1021/jm400791q; Morrissey, 2005, Nat. Biotech., 23, 1002-1007; Zimmerman, 2006, Nature, 441, 111-114.; Jayaraman, 2012, Angew. Chem. Int. Ed., 51, 8529-8533).
El documento WO2013086354A1 se refiere a un lípido catiónico que tiene uno o más grupos biodegradables localizados en un resto lipídico del lípido catiónico que puede incorporarse en una partícula lipídica para suministrar un agente activo.
Obika et al., Bioorg. Med. Chem. (2001) 9:245-254 se refiere a triglicéridos catiónicos simétricos, a su síntesis y a su aplicación a la transferencia de genes.
El documento US6020317A se refiere a un dispositivo lipídico funcionalmente equivalente a un liposoma catiónico, que comprende un lípido y un fosfolípido.
El documento WO2015095351A1 se refiere a una formulación que comprende un ARN mensajero sintético modificado que codifica una proteína leptina, y a un agente de suministro.
Las formulaciones lipídicas son vehículos atractivos ya que pueden proteger a las moléculas biológicas de la degradación mejorando al mismo tiempo su captación celular. De las diversas clases de formulaciones lipídicas, se usan habitualmente formulaciones que contienen lípidos catiónicos para suministrar polianiones (p. ej., ácidos nucleicos). Dichas formulaciones pueden formarse usando lípidos catiónicos solo y que incluyen opcionalmente otros lípidos y anfífilos tales como fosfatidiletanolamina. Se conoce bien en la técnica que tanto la composición de la formulación lipídica así como su método de preparación afectan a la estructura y el tamaño del agregado resultante (Leung, 2012, J. Phys Chem. C, 116, 18440-18450).
La encapsulación de compuestos aniónicos usando lípidos catiónicos es esencialmente cuantitativa debido a la interacción electrostática. Además, se cree que los lípidos catiónicos interactúan con las membranas celulares con carga negativa que inician el transporte a través de la membrana celular (Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio., 2, 139; Xu et al., 1996, Biochemistry 35, 5616). Además, se cree que la forma molecular, la conformación y las propiedades de los lípidos catiónicos proporcionan una eficacia de suministro potenciada de los compartimentos endosómicos al citosol (Semple, 2010, Nat. Biotech, 28, 172-176; Zhang, 2011, 27, 9473-9483)
Aunque se ha demostrado que el uso de lípidos catiónicos para el suministro celular de agentes biológicamente activos tiene varias ventajas, todavía se necesitan más lípidos catiónicos que faciliten el suministro sistémico y local de agentes biológicamente activos tales como los agentes ARNm e iARN a las células. También existe la necesidad de lípidos catiónicos que, en relación con los lípidos catiónicos conocidos en la técnica, mejoren el suministro sistémico y local de agentes biológicamente activos a las células. Existe una necesidad adicional de formulaciones lipídicas que tienen características físicas optimizadas para mejora del suministro sistémico y local de agentes biológicamente activos a órganos específicos y a tumores, especialmente tumores fuera del hígado.
Además, se necesitan más lípidos catiónicos que proporcionen una menor toxicidad (o un mejor índice terapéutico), en relación con los lípidos catiónicos conocidos en la técnica. Los lípidos catiónicos tradicionales se han empleado para el suministro de ARN y ADN en el hígado o en los tumores, pero adolecen de una eficacia de suministro que no es óptima, así como de toxicidad tisular y orgánica a dosis elevadas. Un método para reducir la exposición y aumentar la biocompatibilidad de los lípidos catiónicos es incorporar funcionalidades química o bioquímicamente degradables, (tales como ésteres, amidas, acetales, iminas, etc.), que pueden dar lugar a una eliminación in vivo potenciada (Maier, 2013, 21, 1570-1578).
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se describe en las reivindicaciones adjuntas. La presente invención proporciona un armazón lipídico catiónico que demuestra una eficacia mejorada junto con una menor toxicidad (índice terapéutico mejorado) como resultado de niveles lipídicos sostenidos más bajos en los tejidos relevantes y para aplicaciones de suministro local (ojo, oído, piel, pulmón); suministro al músculo (i.m.), grasa o células subcutáneas (dosificación s.c.).
En un primer aspecto, esta invención proporciona un compuesto, o sal del mismo, de fórmula (II):
Figure imgf000003_0001
v es 3 o 4;
cada uno de R y R' es, independientemente, alquilo C1-8; y
R2 se selecciona entre alquilo C6-20 y alquenilo C15-19;
R3 se selecciona entre: alquilo C4-22, alquenilo C12-22,
Figure imgf000004_0001
Los compuestos de fórmula (II) y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos son lípidos catiónicos útiles en el suministro de agentes biológicamente activos a las células y tejidos.
En un segundo aspecto, esta invención proporciona una composición lipídica que comprende un compuesto de acuerdo con la fórmula (II) (es decir, una composición lipídica de la invención), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En una realización, la composición lipídica comprende además al menos otro componente lipídico. En otra realización, la composición lipídica comprende además un agente biológicamente activo, opcionalmente junto con uno o más de otros componentes lipídicos. En otra realización, la composición lipídica está en forma de un liposoma. En otra realización, la composición lipídica está en forma de una nanopartícula lipídica (LNP). En otra realización, la composición lipídica es adecuada para el suministro al hígado. En otra realización, la composición lipídica es adecuada para el suministro a un tumor. En otra realización, la composición lipídica es adecuada para fines de inmunización. En otra realización, la composición lipídica es adecuada para aplicaciones de suministro local (ojo, oído, piel, pulmón); suministro al músculo (i.m.), grasa o células subcutáneas (dosificación s.c.).
En un tercer aspecto, esta invención proporciona una composición farmacéutica (es decir, formulación) que comprende una composición lipídica de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización, la composición farmacéutica comprende al menos otro componente lipídico en la composición lipídica. En otra realización, la composición lipídica está en forma de un liposoma. En otra realización, la composición lipídica está en forma de una nanopartícula lipídica. En otra realización, la composición lipídica es adecuada para el suministro al hígado. En otra realización, la composición lipídica es adecuada para el suministro a un tumor. En otra realización, la composición lipídica es adecuada para aplicaciones de suministro local (ojo, oído, piel, pulmón); suministro al músculo (i.m.), grasa o células subcutáneas (dosificación s.c.). En otra realización, el agente biológicamente activo es un ARN o ADN. En otra realización, la composición lipídica es adecuada para fines de inmunización y el agente biológicamente activo es un ARN o ADN que codifica un inmunógeno.
En un cuarto aspecto, esta invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria en un sujeto frente a un inmunógeno de interés en un vertebrado, que comprende administrar una cantidad inmunológicamente eficaz de la composición farmacéutica del tercer aspecto, en donde la composición comprende una molécula de ARN que codifica el inmunógeno.
En un quinto aspecto, esta invención proporciona un compuesto:
Figure imgf000005_0001
dioctanoato de 2-(10-dodecil-3-etil-8,14-dioxo-7,9,13-trioxa-3-azaoctadecan-18-il)propano-1,3-diílo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En un sexto aspecto, esta invención proporciona un compuesto:
Figure imgf000005_0002
succinato de (13Z,16Z)-4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)docosa-13, 16-dien-1-il heptadecan-9-ilo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En un séptimo aspecto, esta invención proporciona un compuesto:
Figure imgf000005_0003
decanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-5-octiltridecilo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En un octavo aspecto, esta invención proporciona un compuesto:
Figure imgf000005_0004
bis(octadeca-9,12-dienoato) de (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En un noveno aspecto, esta invención proporciona un compuesto:
Figure imgf000006_0001
bis(octadeca-9,12-dienoato) de (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((2-(((3-(dimetNamino)propoxi)carbonil)oxi)tetradecanoN)oxi)propano-1,3-diílo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En el presente documento se divulga un compuesto, o sal del mismo, de fórmula (I):
Figure imgf000006_0003
v es 0, 1, 2, 3 o 4; w es 0, 1, 2 o 3; Cyl es heterociclo de 5-7 miembros que contiene nitrógeno opcionalmente sustituido con uno o dos grupos alquilo; Ar es un grupo arilo, opcionalmente sustituido con un grupo alquilamino C1-8; cada uno de R y R' es, independientemente, hidrógeno o alquilo C1-8; y R2 se selecciona entre alquilo C6-20 opcionalmente sustituido con un hidroxilo, alquenilo C15-19, alquil C1-12-OC(O)-alquilo C5-20, alquil C1-12-C(O)O-alquilo C5-20 y
Figure imgf000006_0002
R3 se selecciona entre: alquilo C4-22, alquenilo C12-22,
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000008_0001
En el presente documento se divulga un compuesto, o sal del mismo, en donde el compuesto es de fórmula (I):
Figure imgf000008_0002
n es 0, 1, 2, 3 o 4; p es 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8; Li es -O- o un enlace; L2 es -OC(O)- o -C(O)O-; R1 se selecciona entre:
Figure imgf000009_0001
v es 0, 1, 2, 3 o 4; w es 0, 1, 2 o 3; Cyl es heterociclo de 5-7 miembros que contiene nitrógeno opcionalmente sustituido con uno o dos grupos alquilo; cada uno de R y R' es, independientemente, hidrógeno o alquilo C1-8; y R2 se selecciona entre alquilo C6-20 opcionalmente sustituido con un hidroxilo, alquenilo C15-19, alquil C1-12-OC(O)-alquilo C5-20, alquil C1-12-C(O)O-alquilo C5-20 y
Figure imgf000009_0002
R3 se selecciona entre: alquilo C4-22, alquenilo C12-22,
Figure imgf000010_0001
El primer aspecto de la invención es el compuesto, o sal del mismo, en donde el compuesto es de fórmula (II):
Figure imgf000011_0001
En una realización, el compuesto es de fórmula (III):
Figure imgf000011_0002
En el presente documento se divulga el compuesto, o sal del mismo, en donde R2 se selecciona entre:
Figure imgf000012_0001
En el presente documento se divulga el compuesto, o sal del mismo, en donde R2 se selecciona entre:
Figure imgf000013_0001
En otra realización, el compuesto es de fórmula (IV):
Figure imgf000013_0002
En el presente documento se divulga el compuesto, o sal del mismo, en donde R3 se selecciona entre:
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000017_0001
En el presente documento se divulga el compuesto, o sal del mismo, en donde R3 se selecciona entre:
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000021_0001
En otra realización, el compuesto es de fórmula (V):
Figure imgf000021_0002
En otra realización, el compuesto es de fórmula (VI):
Figure imgf000021_0003
En otra realización, el compuesto es de fórmula (VII):
Figure imgf000021_0004
En el presente documento se divulga el compuesto, o sal del mismo, en donde R1 se selecciona entre:
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000023_0001
En el presente documento se divulga el compuesto, o sal del mismo, en donde R1 se selecciona entre:
Figure imgf000023_0002
En otra realización, R1 es
Figure imgf000024_0001
En otra realización, la invención es el compuesto, o sal del mismo, en donde el compuesto, se selecciona entre (los compuestos señalados con * están fuera del alcance de la invención):
dioctanoato de 2-(10-dodecil-3-etil-8,14-dioxo-7,9,13-trioxa-3-azaoctadecan-18-il)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-(9-dodecil-2-metil-7,13-dioxo-6,8,12-trioxa-2-azaheptadecan-17-il)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-(9-dodecil-2-metil-7,13-dioxo-6,8,12-trioxa-2-azapentadecan-15-il)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-(10-dodecil-3-etil-8,14-dioxo-7,9,13-trioxa-3-azahexadecan-16-il)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-(8-dodecil-2-metil-6,12-dioxo-5,7,11-trioxa-2-azaheptadecan-17-il)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-(10-dodecil-3-etil-8,14-dioxo-7,9,13-trioxa-3-azanonadecan-19-il)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-(9-dodecil-2-metil-7,13-dioxo-6,8,12-trioxa-2-azaoctadecan-18-il)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-(8-dodecil-2-metil-6,12-dioxo-5,7,11-trioxa-2-azaoctadecan-18-il)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-(10-dodecil-3-etil-8,14-dioxo-7,9,13-trioxa-3-azaicosan-20-il)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-(9-dodecil-2-metil-7,13-dioxo-6,8,12-trioxa-2-azanonadecan-19-il)propano-1,3-diílo;
4.4- bis(octiloxi)butanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
4.4- bis((2-etilhexil)oxi)butanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
4.4- bis((2-propilpentil)oxi)butanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
4.4- bis((2-propilpentil)oxi)butanoato de 3-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
4.4- bis((2-propilpentil)oxi)butanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
6.6- bis(octiloxi)hexanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
6.6- bis(hexiloxi)hexanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
6.6- bis((2-etilhexil)oxi)hexanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
8.8- bis(hexiloxi)octanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
8.8- dibutoxioctanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
8.8- bis((2-propilpentil)oxi)octanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
8.8- bis((2-propilpentil)oxi)octanoato de 3-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
8.8- bis((2-propilpentil)oxi)octanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
3-octilundecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
3-octilundec-2-enoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
7-hexiltridec-6-enoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
9-pentiltetradecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
9-pentiltetradec-8-enoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
5-heptildodecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
5-heptildodecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)tridecilo;
5-heptildodecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)undecilo;
* (3-(((2-(dimetilamino)etoxi)carbonil)oxi)pentadecil)succinato de 1,3-bis(octanoiloxi)propan-2-ilo;
* (3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecil)succinato de 1,3-bis(octanoiloxi)propan-2-ilo;
10-octil decanodioato de 1-(3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo);
10-octil decanodioato de 1-(3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo);
10-octil decanodioato de 1-(3-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo);
10-(2-etilhexil) decanodioato de 1-(3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo);
10-(2-etilhexil) decanodioato de 1-(3-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo);
10-(octanoiloxi)decanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
decanoato de 8-dodecil-2-metil-6,12-dioxo-5,7,11-trioxa-2-azanonadecan-19-ilo;
10-(octanoiloxi)decanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
10-(octanoiloxi)decanoato de 3-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-3-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-3-(((2-(dimetilamino)etoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
* 1,4-dimetilpiperidin-4-carboxilato de 1-((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoiloxi)pentadecan-3-ilo;
4,4-bis((2-etilhexil)oxi)butanoato de 2-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)tetradecilo;
* octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-(12Z,15Z)-3-((3-(dimetilamino)propanoil)oxi)henicosa-12,15-dien-1-ilo; * 3-octilundecanoato de (12Z,15Z)-3-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)henicosa-12,15-dien-1-ilo;
* 5-heptildodecanoato de (12Z,15Z)-3-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)henicosa-12,15-dien-1-ilo;
* 7-hexiltridecanoato de (12Z,15Z)-3-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)henicosa-12,15-dien-1-ilo;
* 9-pentiltetradecanoato de (12Z,15Z)-3-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)henicosa-12,15-dien-1-ilo;
* 3-(dimetilamino)propanoato de (12Z,15Z)-1-((((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)carbonil)oxi)henicosa-12,15-dien-3-ilo;
* 2,2-bis(heptiloxi)acetato de (13Z,16Z)-4-(((2-(dimetilamino)etoxi)carbonil)oxi)docosa-13,16-dien-1-ilo;
* 2,2-bis(heptiloxi)acetato de (13Z,16Z)-4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)docosa-13,16-dien-1-ilo;
* 3-((3-etiM0-((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)-8,15-dioxo-7,9,14-trioxa-3-azaheptadecan-17-il)disulfanil)propanoato de 2,2-bis(heptiloxi)etilo;
heptadecan-9-il succinato de (13Z,16Z)-4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)docosa-13,16-dien-1-ilo; * octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-2-(((11Z,14Z)-2-((3-(dimetilamino)propanoil)oxi)icosa-11,14-dien-1-il)oxi)etilo; *
* octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-(octanoiloxi)tridecilo; * 3-octilundecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-(octanoiloxi)tridecilo;
* 5-heptildodecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-hidroxitridecilo;
* 5-heptildodecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-(octanoiloxi)tridecilo;
* 7-hexiltridecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-(octanoiloxi)tridecilo;
* 9-pentiltetradecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-hidroxitridecilo;
* 9-pentiltetradecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-(octanoiloxi)tridecilo;
* 10-octil decanodioato de 1-(3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-(octanoiloxi)tridecilo);
* 10-(octanoiloxi)decanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-(octanoiloxi)tridecilo; octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-5-octiltridecilo;
decanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-5-octiltridecilo;
octanoato de 5-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-7-octilpentadecilo;
octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-5-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-7-octilpentadecilo;
* octanoato de 9-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-11-octilnonadecilo;
* decanoato de 9-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-11-octilnonadecilo;
* octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-9-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)nonadecilo;
* hexanoato de 9-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)nonadecilo;
* 3-octilundecanoato de 9-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)nonadecilo;
* hexanoato de 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)nonadecilo;
* 3-octilundecanoato de 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)nonadecilo;
bis(octadeca-9,12-dienoato) de (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* bis(octadeca-9,12-dienoato) de (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo; *
* bis(octadeca-9,12,15-trienoato) de (9Z,9'Z,12Z,12'Z,15Z,15'Z)-2-((4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* dioleato de (Z)-2-((4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* ditetradecanoato de 2-((4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* ditetradecanoato de 2-((4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* ditetradecanoato de 2-((4-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo; * didodecanoato de 2-((4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* didodecanoato de 2-((4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* didodecanoato de 2-((4-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* bis(decanoato) de 2-((4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* bis(decanoato) de 2-((4-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* dioctanoato de 2-((4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* dioctanoato de 2-((4-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* dioctanoato de 2-(((13Z,16Z)-4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)docosa-13,16-dienoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* dioctanoato de 2-(((13Z,16Z)-4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)docosa-13,16-dienoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* bis(octadeca-9,12-dienoato) de (9Z,9'Z, 12Z, 12'Z)-2-((2-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)tetradecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* bis(octadeca-9,12-dienoato) de (9Z,9'Z, 12Z, 12'Z)-2-((2-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)dodecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
bis(octadeca-9,12-dienoato) de (9Z,9'Z, 12Z, 12'Z)-2-((2-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)tetradecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* bis(octadeca-9,12-dienoato) de (9Z,9'Z, 12Z, 12'Z)-2-((2-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)dodecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* dioctanoato de 2-((2-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)tetradecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* 4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoato de 4,4-bis(octiloxi)butilo;
* 2-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)dodecanoato de 4,4-bis(octiloxi)butilo;
* octadeca-9,12-dienoato de (9Z, 12Z)-10-dodecil-3-etil-14-(2-((9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dienoiloxi)etil)-8,13-dioxo-7,9-dioxa-3,14-diazahexadecan-16-ilo;
* dioctanoato de 2-((4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)-11-(octanoiloxi)undecanoil)oxi)propano-1,3-diílo; * bis(octadeca-9,12-dienoato) de (9Z,9'Z, 12Z,12'Z)-2-(9-dodecil-2-metil-7,12-dioxo-6,8,13-trioxa-2-azatetradecan-14-il)propano-1,3-diílo;
4,4-bis(octiloxi)butanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
* 6,6-bis(octiloxi)hexanoato de 3-(((3-(piperidin-1-il)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
* 6,6-bis(octiloxi)hexanoato de 3-(((3-(piperazin-1-il)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
6.6- bis(octiloxi)hexanoato de 3-(((4-(dietilamino)butoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
* 6,6-bis(octiloxi)hexanoato de 3-(((3-(4-metilpiperazin-1-il)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
* 6,6-bis(octiloxi)hexanoato de 3-((((1-metilpiperidin-4-il)metoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
* 6,6-bis(octiloxi)hexanoato de 3-(((3-morfolinopropoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
6.6- bis(octiloxi)hexanoato de 3-(((2-(dietilamino)etoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
6.6- bis(octiloxi)hexanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
6.6- bis((2-propilpentil)oxi)hexanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
6.6- bis((2-propilpentil)oxi)hexanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo LXR420: 6,6-bis((3-etilpentil)oxi)hexanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
* 1-metilpirrolidin-2-carboxilato de (2R)-1-((6,6-bis(octiloxi)hexanoil)oxi)pentadecan-3-ilo;
* 1-metilpirrolidin-2-carboxilato de (2S)-1-((6,6-bis(octiloxi)hexanoil)oxi)pentadecan-3-ilo;
* pirrolidin-2-carboxilato de (2R)-1-((6,6-bis(octiloxi)hexanoil)oxi)pentadecan-3-ilo;
* 1,3-dimetilpirrolidin-3-carboxilato de 1-((6,6-bis(octiloxi)hexanoil)oxi)pentadecan-3-ilo;
* 6,6-bis(octiloxi)hexanoato de 3-((3-(1-metilpiperidin-4-il)propanoil)oxi)pentadecilo;
* 1,4-dimetilpiperidin-4-carboxilato de 1-((6,6-bis(octiloxi)hexanoil)oxi)pentadecan-3-ilo;
* 6,6-bis(octiloxi)hexanoato de 3-((5-(dietilamino)pentanoil)oxi)pentadecilo;
* 5-(4,6-diheptil-1,3-dioxan-2-il)pentanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
6.6- bis(octiloxi)hexanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)undecilo;
6.6- bis(octiloxi)hexanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)tridecilo;
6.6- bis(octiloxi)hexanoato de (12Z,15Z)-3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)henicosa-12,15-dien-1-ilo; * octanoato de 6-((6,6-bis(octiloxi)hexanoil)oxi)-4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexilo;
* 5-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)heptadecanoato de 4,4-bis(octiloxi)butilo;
dicarbonato de 4,4-bis(octiloxi)butil(3-(dietilamino)propil)pentadecano-1,3-diílo;
* dioctanoato de 2-(5-((4-((1,4-dimetilpiperidin-4-carbonil)oxi)hexadecil)oxi)-5-oxopentil)propano-1,3-diílo; * dioctanoato de 2-(5-((4-((1,3-dimetilpirrolidin-3-carbonil)oxi)hexadecil)oxi)-5-oxopentil)propano-1,3-diílo; * dioctanoato de 2-(5-oxo-5-((4-(((S)-pirrolidin-2-carbonil)oxi)hexadecil)oxi)pentil)propano-1,3-diílo;
* dioctanoato de 2-(5-((4-(((((S)-1-metilpirrolidin-3-il)oxi)carbonil)oxi)hexadecil)oxi)-5-oxopentil)propano-1,3-diílo; * dioctanoato de 2-(5-((4-(((((R)-1-metilpirrolidin-3-il)oxi)carbonil)oxi)hexadecil)oxi)-5-oxopentil)propano-1,3-diílo; * dioctanoato de 2-(5-((4-((((1-etilpiperidin-3-il)metoxi)carbonil)oxi)hexadecil)oxi)-5-oxopentil)propano-1,3-diílo; * dioctanoato de 2-(5-((4-((((1-metilpiperidin-4-il)oxi)carbonil)oxi)hexadecil)oxi)-5-oxopentil)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-(10-dodecil-3-etil-8,15-dioxo-7,9,14-trioxa-3-azanonadecan-19-il)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-(11-dodecil-3-etil-9,15-dioxo-8,10,14-trioxa-3-azanonadecan-19-il)propano-1,3-diílo;
* dioctanoato de 2-(5-((3-(((3-(1H-imidazol-1-il)propoxi)carbonil)oxi)pentadecil)oxi)-5-oxopentil)propano-1,3-diílo; * dioctanoato de 2-(5-oxo-5-((3-(((3-(piperidin-1-il)propoxi)carbonil)oxi)pentadecil)oxi)pentil)propano-1,3-diílo; y dioctanoato de 2-(12-dodecil-3-etil-8,14-dioxo-7,9,13-trioxa-3-azaoctadecan-18-il)propano-1,3-diílo.
En otra realización, la invención es el compuesto, o sal del mismo, en donde el compuesto, se selecciona entre (los compuestos señalados con * están fuera del alcance de la invención):
dioctanoato de 2-(10-dodecil-3-etil-8,14-dioxo-7,9,13-trioxa-3-azaoctadecan-18-il)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-(9-dodecil-2-metil-7,13-dioxo-6,8,12-trioxa-2-azaheptadecan-17-il)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-(9-dodecil-2-metil-7,13-dioxo-6,8,12-trioxa-2-azapentadecan-15-il)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-(10-dodecil-3-etil-8,14-dioxo-7,9,13-trioxa-3-azahexadecan-16-il)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-(8-dodecil-2-metil-6,12-dioxo-5,7,11-trioxa-2-azaheptadecan-17-il)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-(10-dodecil-3-etil-8,14-dioxo-7,9,13-trioxa-3-azanonadecan-19-il)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-(9-dodecil-2-metil-7,13-dioxo-6,8,12-trioxa-2-azaoctadecan-18-il)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-(8-dodecil-2-metil-6,12-dioxo-5,7,11-trioxa-2-azaoctadecan-18-il)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-(10-dodecil-3-etil-8,14-dioxo-7,9,13-trioxa-3-azaicosan-20-il)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-(9-dodecil-2-metil-7,13-dioxo-6,8,12-trioxa-2-azanonadecan-19-il)propano-1,3-diílo; 4.4- bis(octiloxi)butanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
4.4- bis((2-etilhexil)oxi)butanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
4.4- bis((2-propilpentil)oxi)butanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo; 4.4- bis((2-propilpentil)oxi)butanoato de 3-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo; 4.4- bis((2-propilpentil)oxi)butanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo; 6.6- bis(octiloxi)hexanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
6.6- bis(hexiloxi)hexanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
6.6- bis((2-etilhexil)oxi)hexanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
8.8- bis(hexiloxi)octanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
8.8- dibutoxioctanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
8.8- bis((2-propilpentil)oxi)octanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo; 8.8- bis((2-propilpentil)oxi)octanoato de 3-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo; 8.8- bis((2-propilpentil)oxi)octanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo; 3-octilundecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
3-octilundec-2-enoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
7-hexiltridec-6-enoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
9-pentiltetradecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
9- pentiltetradec-8-enoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
5-heptildodecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
5-heptildodecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)tridecilo;
5-heptildodecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)undecilo;
* (3-(((2-(dimetilamino)etoxi)carbonil)oxi)pentadecil)succinato de 1,3-bis(octanoiloxi)propan-2-ilo; * (3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecil)succinato de 1,3-bis(octanoiloxi)propan-2-ilo; 10- octil decanodioato de 1-(3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo);
10-octil decanodioato de 1-(3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo);
10-octil decanodioato de 1-(3-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo);
10-(2-etilhexil) decanodioato de 1-(3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo);
10-(2-etilhexil) decanodioato de 1-(3-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo);
10-(octanoiloxi)decanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo; decanoato de 8-dodecil-2-metil-6,12-dioxo-5,7,11-trioxa-2-azanonadecan-19-ilo;
10-(octanoiloxi)decanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
10-(octanoiloxi)decanoato de 3-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo; octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo; octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-3-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-3-(((2-(dimetilamino)etoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;
* 1,4-dimetilpiperidin-4-carboxilato de 1-((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoiloxi)pentadecan-3-ilo;
4,4-bis((2-etilhexil)oxi)butanoato de 2-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)tetradecilo;
* octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-(12Z,15Z)-3-((3-(dimetilamino)propanoil)oxi)henicosa-12,15-dien-1-ilo; * 3-octilundecanoato de (12Z,15Z)-3-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)henicosa-12,15-dien-1-ilo;
* 5-heptildodecanoato de (12Z,15Z)-3-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)henicosa-12,15-dien-1-ilo;
* 7-hexiltridecanoato de (12Z,15Z)-3-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)henicosa-12,15-dien-1-ilo;
* 9-pentiltetradecanoato de (12Z,15Z)-3-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)henicosa-12,15-dien-1-ilo;
* 3-(dimetilamino)propanoato de (12Z,15Z)-1-((((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)carbonil)oxi)henicosa-12,15-dien-3-ilo;
* 2,2-bis(heptiloxi)acetato de (13Z,16Z)-4-(((2-(dimetilamino)etoxi)carbonil)oxi)docosa-13,16-dien-1-ilo;
* 2,2-bis(heptiloxi)acetato de (13Z,16Z)-4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)docosa-13,16-dien-1-ilo;
* 3-((3-etiM0-((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)-8,15-dioxo-7,9,14-trioxa-3-azaheptadecan-17-il)disulfanil)propanoato de 2,2-bis(heptiloxi)etilo;
heptadecan-9-il succinato de (13Z,16Z)-4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)docosa-13,16-dien-1-ilo; * octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-2-(((11Z,14Z)-2-((3-(dimetilamino)propanoil)oxi)icosa-11,14-dien-1-il)oxi)etilo;
* octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-(octanoiloxi)tridecilo;
* 3-octilundecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-(octanoiloxi)tridecilo;
* 5-heptildodecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-hidroxitridecilo;
* 5-heptildodecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-(octanoiloxi)tridecilo;
* 7-hexiltridecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-(octanoiloxi)tridecilo;
* 9-pentiltetradecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-hidroxitridecilo;
* 9-pentiltetradecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-(octanoiloxi)tridecilo;
* 10-octil decanodioato de 1-(3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-(octanoiloxi)tridecilo);
* 10-(octanoiloxi)decanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-(octanoiloxi)tridecilo; octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-5-octiltridecilo;
decanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-5-octiltridecilo;
octanoato de 5-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-7-octilpentadecilo;
octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-5-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-7-octilpentadecilo;
* octanoato de 9-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-11-octilnonadecilo;
* decanoato de 9-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-11-octilnonadecilo;
* octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-9-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)nonadecilo;
* hexanoato de 9-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)nonadecilo;
* 3-octilundecanoato de 9-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)nonadecilo;
* hexanoato de 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)nonadecilo;
* 3-octilundecanoato de 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)nonadecilo;
bis(octadeca-9,12-dienoato) de (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* bis(octadeca-9,12-dienoato) de (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* bis(octadeca-9,12,15-trienoato) de (9Z,9'Z,12Z,12'Z,15Z,15'Z)-2-((4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* dioleato de (Z)-2-((4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* ditetradecanoato de 2-((4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* ditetradecanoato de 2-((4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* ditetradecanoato de 2-((4-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* didodecanoato de 2-((4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* didodecanoato de 2-((4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* didodecanoato de 2-((4-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* bis(decanoato) de 2-((4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* bis(decanoato) de 2-((4-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* dioctanoato de 2-((4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* dioctanoato de 2-((4-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* dioctanoato de 2-(((13Z,16Z)-4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)docosa-13,16-dienoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* dioctanoato de 2-(((13Z,16Z)-4-(((3-(dietNamino)propoxi)carbonN)oxi)docosa-13,16-dienoN)oxi)propano-1,3-diílo;
* bis(octadeca-9,12-dienoato) de (9Z,9'Z, 12Z, 12'Z)-2-((2-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)tetradecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* bis(octadeca-9,12-dienoato) de (9Z,9'Z, 12Z, 12'Z)-2-((2-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)dodecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
bis(octadeca-9,12-dienoato) de (9Z,9'Z, 12Z, 12'Z)-2-((2-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)tetradecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
bis(octadeca-9,12-dienoato) de * (9Z,9'Z, 12Z, 12'Z)-2-((2-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)dodecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* dioctanoato de 2-((2-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)tetradecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
* 4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoato de 4,4-bis(octiloxi)butilo;
* 2-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)dodecanoato de 4,4-bis(octiloxi)butilo;
* octadeca-9,12-dienoato de (9Z, 12Z)-10-dodecil-3-etil-14-(2-((9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dienoiloxi)etil)-8,13-dioxo-7,9-dioxa-3,14-diazahexadecan-16-ilo;
* dioctanoato de 2-((4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)-11-(octanoiloxi)undecanoil)oxi)propano-1,3-diílo; y * bis(octadeca-9,12-dienoato) de (9Z,9'Z, 12Z,12'Z)-2-(9-dodecil-2-metil-7,12-dioxo-6,8,13-trioxa-2-azatetradecan-14-il)propano-1,3-diílo.
El segundo aspecto de la invención es una composición lipídica que comprende un compuesto de acuerdo con el primer aspecto de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En una realización, la composición lipídica comprende además un agente biológicamente activo.
En otra realización, el agente biológicamente activo es un ácido nucleico.
En otra realización, el agente biológicamente activo es un ADN, ARNip o ARNm.
En otra realización, el agente biológicamente activo es un ARNm.
En otra realización, el agente biológicamente activo es un ARNip.
En otra realización, la composición lipídica comprende además un lípido auxiliar.
En otra realización, la composición lipídica comprende además un lípido neutro.
En otra realización, la composición lipídica comprende además un lípido de circulación prolongada.
En otra realización, el lípido auxiliar es colesterol, el lípido natural es DSPC y el lípido de circulación prolongada es PEG-DMG, S010, S011 o S024.
En otra realización, la composición lipídica está en forma de una nanopartícula lipídica.
Como se divulga en el presente documento, la composición lipídica puede tener un 30-60 % de un compuesto de fórmula (I), un 5-10 % de colesterol/30-60 % de DSPC y un 1-5 % de PEG-DMG, S010, S011 o S024
En otra realización, el pH de dicha composición lipídica es 4-6 en el momento de encapsulación y/o formulación.
En otra realización, el pH de dicha composición lipídica es 5-6 en el momento de encapsulación y/o formulación.
En otra realización, el pH de dicha composición lipídica es 5,6-6,0 en el momento de encapsulación y/o formulación. El tercer aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende una composición lipídica de acuerdo con el segundo aspecto de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En el presente documento se divulga un método para el tratamiento de una enfermedad o afección que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición lipídica de acuerdo con el segundo o tercer aspecto de la invención a un paciente que necesita tratamiento de la misma.
En el presente documento se divulga un método para el tratamiento de una enfermedad o afección que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de acuerdo con el segundo o tercer aspecto de la invención.
En otra realización, la composición comprende una molécula de ARN que codifica un inmunógeno.
En otra realización, el lípido está en forma de una nanopartícula lipídica (LNP) y el ARN está asociado con la LNP. En otra realización, la LNP es un liposoma.
En otra realización, el liposoma tiene un diámetro en el intervalo de aproximadamente: 60-180 nm, p. ej., aproximadamente: 80-160 nm.
En otra realización, el liposoma es de aproximadamente: 80-160 nm y en donde al menos la mitad del porcentaje molar de las moléculas de ARN está encapsulado en los liposomas.
En otra realización, dicho liposoma comprende además un lípido que comprende un grupo de cabeza zwiteriónico.
En otra realización, dicho liposoma comprende además DlinDMA (1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano), DSPC (1,2-Diastearoil-sn-glicero-3-fosfocolina), un colesterol, un lípido PEGilado o una combinación de los mismos.
En otra realización, la composición farmacéutica comprende la composición del tercer aspecto de la invención y un excipiente farmacéutico.
En otra realización, la composición farmacéutica comprende liposomas y moléculas de ARN que codifican inmunógenos, en donde los liposomas comprenden el compuesto del primer aspecto de la invención, y en donde al menos la mitad del porcentaje molar de las moléculas de ARN está encapsulado en los liposomas.
En otra realización, (i) al menos el 80 % en número de los liposomas tienen diámetros en el intervalo de aproximadamente: 60-180 nm, (ii) el diámetro medio de los liposomas está en el intervalo de aproximadamente: 60-180 nm, o (iii) los diámetros de los liposomas tienen un índice de polidispersidad <0,2.
En otra realización, el ARN es un ARN autorreplicante.
En otra realización, el ARN autorreplicante codifica una polimerasa de ARN dependiente de ARN.
En otra realización, el ARN autorreplicante comprende un primer marco de lectura abierto que codifica una replicasa de alfavirus y un segundo marco de lectura abierto que codifica el inmunógeno.
En otra realización, el ARN autorreplicante es mayor de aproximadamente 2000 nucleótidos, tal como mayor de aproximadamente: 9000, 12000, 15000, 18000, 21000, 24000 o más nucleótidos de longitud.
En otra realización, el inmunógeno puede suscitar una respuesta inmunitaria in vivo contra una bacteria, un virus, un hongo o un parásito.
El cuarto aspecto de la invención es una composición farmacéutica para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria en un vertebrado, que comprende administrar una cantidad eficaz de la composición del tercer aspecto de la invención al vertebrado, en donde la composición comprende una molécula de ARN que codifica el inmunógeno.
Como se usa en el presente documento, el término "alquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo ramificada o no ramificada, completamente saturada, que tiene el número especificado de átomos de carbono. Por ejemplo, alquilo C1-8 se refiere a un grupo alquilo que tiene de 1 a 8 átomos de carbono. Por ejemplo, alquilo C4-22 se refiere a un grupo alquilo que tiene de 4 a 22 átomos de carbono. Por ejemplo, alquilo C6-10 se refiere a un grupo alquilo que tiene de 6 a 10 átomos de carbono. Por ejemplo, alquilo C12-22 se refiere a un grupo alquilo que tiene de 12 a 22 átomos de carbono. Los ejemplos representativos de alquilo incluyen, pero sin limitación, metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo, ferc-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, n-hexilo, 3-metilhexilo, 2,2-dimetilpentilo, 2,3-dimetilpentilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo, n-decilo, n-undecanilo, n-dodecanilo, n-tridecanilo, 9-metilheptadecanilo, 1 -heptildecilo, 2-octildecilo, 6-hexildodecilo, 4-heptilundecilo y similares.
Como se usa en el presente documento, el término "alquileno" se refiere a un grupo alquilo divalente como se ha definido anteriormente en el presente documento. Los ejemplos representativos de alquileno incluyen, pero sin limitación, metileno, etileno, n-propileno, iso-propileno, n-butileno, sec-butileno, iso-butileno, ferc-butileno, n-pentileno, isopentileno, neopentileno, n-hexileno, 3-metilhexileno, 2,2-dimetilpentileno, 2,3-dimetilpentileno, n-heptileno, n-octileno, n-nonileno, ndecileno y similares.
Como se usa en el presente documento, el término "alquenilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo ramificada o no ramificada, saturada, que tiene el número especificado de átomos de carbono y uno o más dobles enlaces carbonocarbono dentro de la cadena. Por ejemplo, alquenilo C12-22 se refiere a un grupo alquenilo que tiene de 12 a 22 átomos de carbono con uno o más dobles enlaces carbono-carbono dentro de la cadena. En determinadas realizaciones, los grupos alquenilo tienen un doble enlace carbono-carbono dentro de la cadena. En otras realizaciones, los grupos alquenilo tienen más de un doble enlace carbono-carbono dentro de la cadena. Los grupos alquenilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes como se define en la fórmula (I). Los ejemplos representativos de alquenilo incluyen, pero sin limitación, etilenilo, propenilo, butenilo, pentenilo, hexenilo y similares. Otros ejemplos de alquenilo incluyen, pero sin limitación: Z-octadec-9-enilo, Z-undec-7-enilo, Z-heptadeca-8-enilo, (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienilo, (8Z,11Z)-heptadeca-8,11-dienilo, (8Z,11Z,14Z)-heptadeca-8,11,14-trienilo, linolenilo, 2-octildeca-1-enilo, linoleílo y olelilo.
Como se usa en el presente documento, el término "alquenileno" se refiere a un grupo alquenilo divalente como se ha definido anteriormente en el presente documento. Los ejemplos representativos de alquenileno incluyen, pero sin limitación, etenileno, propenileno, butenileno, pentenileno, hexenileno y similares.
Como se usa en el presente documento, el término "alcoxi" se refiere a se refiere a cualquier resto alquilo unido a través de un puente oxígeno (es decir, un grupo -O-alquilo C1-3 en el que el alquilo C1-3 es como se define en el presente documento). Los ejemplos de tales grupos incluyen, pero sin limitación, metoxi, etoxi y propoxi.
Como se usa en el presente documento, el término "cidoalquilo" se refiere a un anillo de hidrocarburo monocíclico, bicíclico o tricíclico, saturado, que tiene el número especificado de átomos de carbono. Por ejemplo, cicloalquilo C3-7 se refiere a un anillo cicloalquilo que tiene de 3 a 7 átomos de carbono. Los grupos cicloalquilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes como se define en la fórmula (I). Los ejemplos representativos de cicloalquilo incluyen, pero sin limitación, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, biciclo[2.1.1]hexilo, biciclo[2.2.1]heptilo, adamantilo y similares.
Como se usa en el presente documento, el término "halo" se refiere a flúor, cloro, bromo y yodo.
Como se usa en el presente documento, el término "heterocíclico" se refiere a un anillo monocíclico o bicíclico, saturado o insaturado, de 4 a 12 miembros, que contiene de 1 a 4 heteroátomos. Los sistemas de anillos heterocíclicos no son aromáticos. Los grupos heterocíclicos que contienen más de un heteroátomo pueden contener heteroátomos diferentes. Son grupos heterocíclicos sistemas de anillos monocíclicos, espiro, condensados o puenteados. Los ejemplos de grupos heterocíclicos monocíclicos incluyen tetrahidrofuranoílo, dihidrofuranilo, 1,4-dioxanilo, morfolinilo, 1,4-ditianilo, azetidinilo, piperazinilo, piperidinilo, 1,3-dioxolanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirrolinilo, pirrolidinilo, tetrahidropi ranilo, dihidropiranilo, 1,2,3,6-tetrahidropiridinilo, oxatiolanilo, ditiolanilo, 1,3-dioxanilo, 1,3-ditianilo, oxatianilo, tiomorfolinilo, 1,4,7-trioxa-10-azaciclododecanilo, azapanilo y similares. Los ejemplos de anillos heterocíclicos espiro incluyen, pero sin limitación, 1,5-dioxa-9-azaespiro[5.5]undecanilo, 1,4-dioxa-8-azaespiro[4.5]decanilo, 2-oxa-7-azaespiro[3.5]nonanilo y similares. Los sistemas de anillos heterocíclicos condensados tienen de 8 a 11 átomos en el anillo e incluyen grupos en donde un anillo heterocíclico está condensado con un anillo de fenilo. Los ejemplos de anillos heterocíclicos condensados incluyen, pero sin limitación, decahidroqunilinilo, (4aS,8aR)-decahidroisoquinolinilo, (4aS,8aS)-decahidroisoquinolinilo, octahidrociclopenta[c]pirrolilo, isoinolinilo, (3aR,7aS)-hexahidro-[1,3]dioxolo[4.5-c]piridinilo, octahidro-1 H-pirrolo[3,4-b]piridinilo, tetrahidroisoquinolinilo y similares.
Como se usa en el presente documento, la expresión "heterociclilalquilo C1-8" se refiere a un anillo heterocíclico como se ha definido anteriormente que está unido al resto de la molécula mediante un enlace sencillo o mediante un radical alquilo C1-8 como se ha definido anteriormente.
Como se usa en el presente documento, el término "heteroarilo" se refiere a un radical de anillo monocíclico, aromático, de 5 o 6 miembros, que comprende 1, 2, 3 o 4 heteroátomos seleccionados individualmente entre nitrógeno, oxígeno y azufre. El radical heteroarilo puede estar unido mediante un átomo de carbono o un heteroátomo. Los ejemplos de heteroarilo incluyen, pero sin limitación, furilo, pirrolilo, tienilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, triazolilo, tetrazolilo, pirazinilo, piridazinilo, pirimidilo o piridilo.
Como se usa en el presente documento, la expresión "heteroarilalquilo C W se refiere a un anillo heteroarilo como se ha definido anteriormente que está unido al resto de la molécula mediante un enlace sencillo o mediante un radical alquilo C1-8 como se ha definido anteriormente. Como se usa en el presente documento, la expresión "un isómero óptico" o "un estereoisómero" se refiere a cualquiera de las diversas configuraciones que pueden existir para un compuesto dado de la presente invención e incluye isómeros geométricos. Se entiende que un sustituyente puede estar unido a un centro quiral de un átomo de carbono. El término "quiral" se refiere a moléculas que tienen la propiedad de no superponerse con su imagen especular, mientras que el término "aquiral" se refiere a moléculas que se pueden superponer con su imagen especular. Por lo tanto, la invención incluye enantiómeros, diastereómeros o racematos del compuesto. Los "enantiómeros" son un par de estereoisómeros que son imágenes especulares no superponibles entre sí. Una mezcla 1: 1 de un par de enantiómeros es una mezcla "racémica". El término se usa para designar una mezcla racémica cuando sea apropiado. Los "diastereoisómeros" son estereoisómeros que tienen al menos dos átomos asimétricos, pero que no son imágenes especulares entre sí. La estereoquímica absoluta se especifica de acuerdo con el sistema R-S de Cahn-Ingold-Prelog. Cuando un compuesto es un enantiómero puro, la estereoquímica en cada uno de los carbonos quirales se puede especificar ya sea como R o S. Los compuestos resueltos, cuya configuración absoluta es desconocida, se pueden designar (+) o (-) dependiendo de la dirección (dextrógira o levógira) en la que desvían el plano de luz polarizada a la longitud de onda de la línea D del sodio. Determinados compuestos descritos en el presente documento contienen uno o más centros o ejes asimétricos y, por tanto, pueden dar lugar a enantiómeros, diastereómeros y otras formas estereoisoméricas que pueden definirse, en términos de su estereoquímica absoluta, como (R) o (S).
Dependiendo de la elección de los materiales de partida y los procedimientos, los compuestos se pueden encontrar presentes en forma de uno de los posibles isómeros o como mezclas de estos, por ejemplo, como isómeros ópticos puros, o como mezclas de isómeros tales como racematos y mezclas de diastereómeros, dependiendo del número de átomos de carbono asimétricos. La presente invención pretende incluir todos estos posibles isómeros, incluidas mezclas racémicas, mezclas diastereoisoméricas y formas ópticamente puras. Se pueden preparar isómeros (R) y (S) ópticamente activos utilizando sintones quirales o reactivos quirales, o se pueden resolver utilizando técnicas convencionales. Si el compuesto contiene un doble enlace, el sustituyente puede tener la configuración E o Z. Si el compuesto contiene un cicloalquilo disustituido, el sustituyente cicloalquilo puede tener una configuración cis o trans. También se pretende incluir todas las formas tautoméricas.
Cualquier átomo asimétrico (p. ej., carbono o similar) del compuesto o compuestos de la presente invención puede estar presente en forma racémica o enantioméricamente enriquecida, por ejemplo la configuración (R), (S) o (R,S). En ciertas realizaciones, cada átomo asimétrico tiene al menos un 50 % de exceso enantiomérico, al menos un 60 % de exceso enantiomérico, al menos un 70 % de exceso enantiomérico, al menos un 80 % de exceso enantiomérico, al menos un 90 % de exceso enantiomérico, al menos un 95 % de exceso enantiomérico o al menos un 99 % de exceso enantiomérico en la configuración (R) o (S). Los sustituyentes en átomos con dobles enlaces insaturados pueden estar presentes, si es posible, en forma cis (Z) o trans (E).
Por consiguiente, como se usa en el presente documento, un compuesto de la presente invención puede estar en forma de uno de los posibles isómeros, rotámeros, atropisómeros, tautómeros o mezclas de los mismos, por ejemplo, como racematos, isómeros ópticos (enantiómeros), diastereómeros, isómeros geométricos (cis o trans) sustancialmente puros o mezclas de los mismos.
Cualquier mezcla resultante de isómeros puede separarse basándose en las diferencias fisicoquímicas de los constituyentes, en isómeros geométricos u ópticos, diastereómeros o racematos puros o sustancialmente puros, por ejemplo, mediante cromatografía y/o cristalización fraccionada.
Cualquier racemato resultante de productos finales o intermedios se pueden resolver en los enantiómeros ópticos mediante métodos conocidos, p. ej., mediante la separación de las sales diastereoméricas de los mismos, obtenidas con una base o ácido ópticamente activo, y la liberación del compuesto ácido o básico ópticamente activo. En particular, de esta manera puede emplearse un resto básico para resolver los compuestos de la presente invención en sus antípodas ópticas, p. ej., por cristalización fraccionada de una sal formada con un ácido ópticamente activo, p. ej., ácido tartárico, ácido dibenzoil tartárico, ácido diacetil tartárico, ácido di-0,0-p-toluoil tartárico, ácido mandélico, ácido málico o ácido canfor-10-sulfónico. Los productos racémicos también se pueden resolver mediante cromatografía quiral, p. ej., cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) utilizando un adsorbente quiral.
Como se usan en el presente documento, los términos "sal" o "sales" se refieren a una sal de adición de ácidos de un compuesto de la invención. Las "sales" incluyen, en particular, "sales farmacéuticamente aceptables". La expresión "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales que conservan la eficacia biológica y las propiedades de los compuestos de la presente invención y que normalmente no son biológicamente o de otra manera indeseables. En muchos casos, los compuestos de la presente invención son capaces de formar sales de ácidos y/o bases en virtud de la presencia de grupos amino y/o carboxilo o grupos similares a los mismos.
Se pueden formar sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables con ácidos inorgánicos y ácidos orgánicos, p. ej., sales acetato, aspartato, benzoato, besilato, bromuro/bromhidrato, bicarbonato/carbonato, bisulfato/sulfato, canforsulfonato, cloruro/clorhidrato, cloroteofilonato, citrato, etandisulfonato, fumarato, gluceptato, gluconato, glucuronato, hipurato, yodhidrato/yoduro, isetionato, lactato, lactobionato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, mandelato, mesilato, metilsulfato, naftoato, napsilato, nicotinato, nitrato, octadecanoato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, fosfato/hidrogenofosfato/dihidrogenofosfato, poligalacturonato, propionato, estearato, succinato, sulfosalicilato, tartrato, tosilato y trifluoroacetato.
Los ácidos inorgánicos de los que se pueden obtener sales incluyen, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares.
Los ácidos orgánicos de los que se pueden obtener sales incluyen, por ejemplo, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido toluensulfónico, ácido sulfosalicílico y similares. Se pueden formar sales de adición de bases farmacéuticamente aceptables con bases orgánicas e inorgánicas.
Las bases inorgánicas de las que se pueden obtener sales incluyen, por ejemplo, sales de amonio y metales de las columnas I a XII de la tabla periódica. En algunas realizaciones, las sales se obtienen de sodio, potasio, amonio, calcio, magnesio, hierro, plata, zinc y cobre; Las sales particularmente adecuadas incluyen sales de amonio, potasio, sodio, calcio y magnesio.
Las bases orgánicas a partir de las cuales pueden obtenerse sales incluyen, por ejemplo, aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas que incluyen aminas sustituidas de origen natural, aminas cíclicas, resinas de intercambio iónico básicas y similares. Algunas aminas orgánicas incluyen isopropilamina, benzatina, colinato, dietanolamina, dietilamina, lisina, meglumina, piperazina y trometamina.
Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente invención se pueden sintetizar a partir de un resto básico o ácido, mediante métodos químicos convencionales. Generalmente, tales sales se pueden preparar haciendo reaccionar formas de ácido libre de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base apropiada (como hidróxido, carbonato, bicarbonato de Na, Ca, Mg o K, o similares), o haciendo reaccionar formas de base libre de estos compuestos con una cantidad estequiométrica del ácido apropiado. Las reacciones de este tipo normalmente se llevan a cabo en agua o en un disolvente orgánico, o en una mezcla de los dos. Por lo general, siempre que sea posible, es deseable el uso de medios no acuosos tales como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Se pueden encontrar listas de sales adecuadas adicionales, p. ej., en "Remington's Pharmaceutical Sciences", 20a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985); y en "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use" por Stahl y Wermuth (Wiley-VCH, Weinheim, Alemania, 2002).
Métodos generales para sintetizar lípidos catiónicos
En el presente documento se divulgan procesos para la preparación de compuestos de fórmula (I). En las reacciones descritas, podría ser necesario proteger grupos funcionales reactivos, por ejemplo, grupos hidroxilo, amino, imino, tio o carboxi, en los sitios en los que se desee en el producto final, para evitar su participación no deseada en las reacciones. Los compuestos de la invención o divulgación y los procesos de la divulgación se entenderán mejor en relación con los siguientes esquemas sintéticos, que solo pretenden ser métodos ilustrativos mediante los que pueden prepararse generalmente los compuestos y no pretenden limitar el alcance de la invención que se define en las reivindicaciones. Los compuestos finales de fórmula (I) pueden prepararse como se describe en el Esquema I.
ESQUEMA 1
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ei rr r inve rso
a) Adición de Grignard a aldehido. b) Formación de p-nitro fenilcarbonato. c) Formación de carbonato con el amino alcohol apropiado. d) Desprotección de éter de sililo. e) EDC, o acoplamiento por esterificación comparable. f) Hidrólisis del éster.
Composiciones lipídicas
La presente invención proporciona una composición lipídica que comprende al menos un compuesto de fórmula (II), es decir, una composición lipídica de la invención. En una realización, está presente al menos otro componente lipídico. Dichas composiciones también pueden contener un agente biológicamente activo, opcionalmente junto con uno o más de otros componentes lipídicos.
Una realización de la presente invención proporciona una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (II) y otro componente lipídico. Dichos otros componentes lipídicos incluyen, pero limitación, lípidos catiónicos, lípidos neutros, lípidos aniónicos, lípidos auxiliares y lípidos de circulación prolongada.
Los lípidos catiónicos adecuados para su uso en una composición lipídica de la invención incluyen, pero sin limitación, cloruro de N,N-dioleil-N,N-dimetilamonio (DODAC), bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio (DDAB), cloruro de N-(1-(2,3-dioleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP), 1,2-dioleoil-3-dimetilamonio-propano (DODAP), cloruro de N-(1-(2,3-dioleiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (d Ot MA), 1,2-dioleoilcarbamil-3-dimetilamonio-propano (DOCDAP), 1,2-dilineoil-3-dimetilamonio-propano (DLINDAP), dilauril(C12:0) trimetil amonio propano (DLTAP), dioctadecilamidoglicil espermina (DOGS), DC-Col, trifluoroacetato de dioleoiloxi-N-[2-esperminacarboxamido)etil}-N,N-dimetil-1-propanaminio (DOSPA), bromuro de 1,2-dimiristiloxipropil-3-dimetil-hidroxietil amonio (DMRIE), 3-dimetilamino-2-(colest-5-en-3-betaoxibutan-4-oxi)-1-(cis,cis-9,12-octadecadienoxi)propano (CLinDMA), N,N-dimetil-2,3-dioleiloxi)propilamina (DODMA), 2-[5'-(colest-5-en-3[beta]-oxi)-3'-oxapentoxi)-3-dimetil-1-(cis,cis-9',12'-octadecadienoxi)propano (CpLinDMA) y N,N-dimetil-3,4-dioleiloxibencilamina (DMOBA) y 1,2-N,N'-dioleilcarbamil-3-dimetilaminopropano (DOcarbDAP). En una realización, el lípido catiónico es DOTAP o DlTAp .
Los "lípidos neutros" adecuados para su uso en una composición lipídica de la invención incluyen, por ejemplo, una diversidad de lípidos neutros, no cargados o zwiteriónicos. Los ejemplos de fosfolípidos neutros adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero sin limitación: 5-heptadecilbenceno-1,3-diol (resorcinol), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), fosfocolina (DOPC), dimiristoi lfosfatidil col i n a (DMp C), fosfatidilcolina (PLPC), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DAPC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilcolina de huevo (EPC), dilauriloilfosfatidilcolina (DLPC), dimiristoi lfosfatidil coli n a (DMPC), 1 -miristoil-2-palmitoil fosfatidilcolina (MPPC), 1-palmitoil-2-miristoil fosfatidilcolina (PMPC), 1 -palmitoil-2-estearoil fosfatidilcolina (PSPC), 1,2-diaraquidoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DBPC), 1 -estearoil-2-palmitoil fosfatidilcolina (SPPC), 1,2-dieicosenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DEPC), palmitoiloleoil fosfatidilcolina (POPC), lisofosfatidil colina, dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE), dilinoleoilfosfatidilcolina diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), dimiristoil fosfatidiletanolamina (DMPE), dipalmitoil fosfatidiletanolamina (DPPE), palmitoiloleoil fosfatidiletanolamina (POPE), lisofosfatidiletanolamina y combinaciones de los mismos. En una realización, el fosfolípido neutro se selecciona entre el grupo que consiste en diestearoilfosfatidilcolina (DSPC) y dimiristoil fosfatidil etanolamina (DMPE).
Los lípidos aniónicos adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero sin limitación, fosfatidilglicerol, cardiolipina, diacilfosfatidilserina, ácido diacilfosfatídico, N-dodecanoil fosfatidil etanoloamina, N-succinil fosfatidiletanolamina, hemisuccinato de N-glutaril fosfatidiletanolamina y colesterol (CHEMS) y lisilfosfatidilglicerol.
Los lípidos neutros y aniónicos adecuados también incluyen los que se describen en el documento US 2009/0048197.
Los "lípidos auxiliares" son lípidos que mejoran en cierta medida la transfección (p. ej., la transfección de la nanopartícula que incluye el agente biológicamente activo). El mecanismo por el que el lípido auxiliar mejora la transfección puede incluir, p. ej., mejorar la estabilidad de las partículas y/o mejorar la fusiogenicidad de la membrana. Los lípidos auxiliares incluyen esteroides y alquil resorcinoles. Los lípidos auxiliares adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero sin limitación, colesterol, 5-heptadecilresorcinol y hemisuccinato de colesterol.
Los lípidos de circulación prolongada son lípidos que aumentan el tiempo durante el cual las nanopartículas pueden existir in vivo (p. ej., en la sangre). Los lípidos de circulación prolongada adecuados para su uso en una composición lipídica de la invención incluyen, pero sin limitación, lípidos de circulación prolongada que tienen un grupo de cabeza hidrófilo unido a un resto lipídico. Los ejemplos de dichos lípidos de circulación prolongada incluyen compuestos de fórmula (XI), como se describe en el documento WO2011/076807,
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o una sal o derivado farmacéuticamente aceptable de los mismos, en donde:
Zn es un resto de polímero hidrófilo seleccionado entre PEG poli(óxido de etileno) o polímeros basados en poli(oxazolina), poli(alcohol vinílico), poli(glicerol), poli(N-vinilpirrolidona), poli[N-(2-hidroxipropil)metacrilamida], polisacáridos y poli(aminoácidos) o una combinación de los anteriores, en donde el polímero puede ser lineal o ramificado, y en donde cada Z puede estar opcional e independientemente opcionalmente sustituido;
en donde Z se polimeriza con n subunidades;
n es un grado de polimerización promediado entre 10 y 200 unidades de Z, en donde n está optimizado para diferentes tipos de polímeros;
Li es un enlazador alquileno C1-10 o heteroalquileno C1-10 opcionalmente sustituido que incluye cero, uno, dos o más de un éter (p. ej., -O-), éster (p. ej., -C(O)O-), succinato (p. ej., -O(O)C-CH2-CH2-C(O)O-)), carbamato (p. ej., -OC(O)-NR'-), carbonato (p. ej., -OC(O)O-), cetona (p. ej., -C-C(O)-C-), carbonilo (p. ej., -C(O)-), urea (p. ej., -NRC(O)NR'-), amina (p. ej., -NR'-), amida (p. ej., -C(O)NR'-), imina (p. ej., -C(NR')-), tioéter (p. ej., -S-), xantato (p. ej., -OC(S)S-) y fosfodiéster (p. ej., -OP(O)2O-); pudiendo estar cualquiera de ellos sustituido con cero, uno o más grupos Z;
en donde R' se selecciona independientemente entre -H, -NH-, -NH2 , -O-, -S-, un fosfato o un alquileno C1-10 opcionalmente sustituido;
X1 y X2 se seleccionan independientemente entre un carbono o un heteroátomo seleccionado entre -NH-, -O-, -S- o un fosfato;
A1 y A2 se seleccionan independientemente entre un alquilo C6-30, alquenilo C6-30 y alquinilo C6-30, en donde A1 y A2 pueden ser iguales o diferentes,
o en donde A1 y A2 , junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un esteroide opcionalmente sustituido.
Los lípidos de circulación prolongada específicos incluyen, pero sin limitación, los listados en la Tabla 1.
Tabla 1. Lí i ir l i n r l n
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Pueden encontrarse otros lípidos de circulación prolongada adecuados para su uso en una composición lipídica de la presente invención así como información sobre la bioquímica de dichos lípidos en Romberg et al., Pharmaceutical Research, Vol. 25, N.° 1, 2008, págs. 55-71 y Hoekstra et al., Biochimica et Biophysica Acta 1660 (2004) 41-52.
En una realización, el lípido de circulación prolongada adecuado comprende un grupo seleccionado entre PEG (en algunas ocasiones denominado poli(óxido de etileno) y polímeros basados en poli(oxazolina), poli(alcohol vinílico), poli(glicerol), poli(N-vinilpirrolidona), poliaminoácidos y poli[N-(2-hidroxipropil)metacrilamida]. Se divulgan lípidos de PEG adecuados adicionales, p. ej., en el documento WO 2006/007712.
Los lípidos de circulación prolongada adecuados específicos incluyen conjugados de polietilenglicol-diacilglicerol o polietilenglicol-diacilglicamida (PEG-DAG) que incluyen los que comprenden un grupo dialquilglicerol o dialquilglicamida que tiene una longitud de cadena de alquilo que comprende independientemente de aproximadamente C4 a aproximadamente C40 átomos de carbono saturados o insaturados. El grupo dialquilglicerol o dialquilglicamida puede comprender adicionalmente uno o más grupos alquilo sustituido. En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, el conjugado de PEG puede seleccionarse entre PEG-dilaurilglicerol, PEG-dimiristilglicerol (PEG-DMG) (n.° de catálogo GM-020 de n Of , Tokio, Japón), PEG-dipalmitoilglicerol, PEG-diesterilglicerol, PEG-dilaurilglicamida, PEG-dimiristilglicamida, PEG-dipalmitoilglicamida y PEG-diesterilglicamida, PEG-colesterol (1-[8'-(Colest-5-en-3[beta]-oxi)carboxamido-3',6'-dioxaoctanil]carbamoil-[omega]-metil-poli(etilenglicol), PEG-DMB (3,4-Ditetradecoxilbencil-[omega]-metil-poli(etilenglicol)éter), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (n.° de catálogo 880150P de Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, EE.UU.).
En una realización, el lípido de circulación prolongada es S010, S024, S027, S031 o S033.
En otra realización, el lípido de circulación prolongada es S024.
A menos que se indique otra cosa, el término "PEG", como se usa en el presente documento, significa cualquier polímero de polietilenglicol u otro polialquileno. En una realización, PEG es un polímero de etilenglicol u óxido de etileno lineal o ramificado, opcionalmente sustituido. En una realización, PEG está sin sustituir. En una realización, el PEG está sustituido, p. ej., con uno o más grupos alquilo, alcoxi, acilo, hidroxi o arilo. En una realización, el término incluye copolímeros PEG tales como PEG-poliuretano o PEG-polipropileno (véase, p. ej., J. Milton Harris, Poly(ethylene glycol) chemistry: biotechnical and biomedical applications (1992)); en otra realización, el término no incluye copolímeros de PEG. En una realización, el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 130 a aproximadamente 50,000, en una subrealización de aproximadamente 150 a aproximadamente 30,000, en una subrealización de aproximadamente 150 a aproximadamente 20,000, en una subrealización de aproximadamente 150 a aproximadamente 15,000, en una subrealización de aproximadamente 150 a aproximadamente 10,000, en una subrealización de aproximadamente 150 a aproximadamente 6,000, en una subrealización de aproximadamente 150 a aproximadamente 5,000, en una subrealización de aproximadamente 150 a aproximadamente 4,000, en una subrealización de aproximadamente 150 a aproximadamente 3,000, en una subrealización de aproximadamente 300 a aproximadamente 3,000, en una subrealización de aproximadamente 1,000 a aproximadamente 3,000 y en una subrealización de aproximadamente 1,500 a aproximadamente 2,500.
En ciertas realizaciones, el PEG (p. ej., conjugado con un lípido, tal como un lípido de circulación prolongada) es un "PEG-2K", también denominado "PEG 2000", que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 2000 daltons. PEG-2K se representa en el presente documento por la siguiente fórmula (XIIa), en donde n es 45, lo que significa que el grado de polimerización promediado comprende aproximadamente 45 subunidades. Sin embargo, pueden usarse otras realizaciones de PEG conocidas en la técnica, incluyendo, p. ej., aquellas en las que el grado de polimerización promediado comprende aproximadamente 23 subunidades (n = 23) y/o 68 subunidades (n = 68).
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Las composiciones lipídicas de la invención también pueden incluir uno o más agentes biológicamente activos incluyendo, pero sin limitación, anticuerpos (p. ej., monoclonales, quiméricos, humanizados, nanocuerpos y fragmentos de los mismos, etc.), colesterol, hormonas, péptidos, proteínas, productos quimioterapéuticos y otros tipos de agentes antineoplásicos, fármacos de bajo peso molecular, vitaminas, cofactores, nucleósidos, nucleótidos, oligonucleótidos, ácidos nucleicos enzimáticos, ácidos nucleicos antisentido, oligonucleótidos formadores de triples cadenas, composiciones de ADN o ARN antisentido, composiciones quiméricas de ADN:ARN, alozimas, aptámeros, ribozima, señuelos y análogos de los mismos, plásmidos y otros tipos de vectores de expresión, y moléculas pequeñas de ácido nucleico, agentes de iARN, "ácido ribonucleico mensajero" (ARN mensajero, ARNm), ácido nucleico interferente pequeño (ANip), ARN interferente pequeño (ARNip), ARN bicatenario (ARNbc), micro-ARN (miARN) y moléculas ARN en horquilla corta (ARNhc), ácido nucleico peptídico (ANP), un ribonucleótido de ácido nucleico bloqueado (LNA), nucleótido morfolino, ácido nucleico treósico (TNA), ácido nucleico glicólico (GNA), ARNipsi (ARN interferente pequeño segmentado internamente), ARNia (ARN interferente asimétrico) y ARNip con 1, 2 o más emparejamientos incorrectos entre la cadena con sentido y antisentido para células y/o tejidos relevantes, tal como en un cultivo celular, sujeto u organismo. Dichos compuestos pueden estar purificados o parcialmente purificados, pueden aparecer de forma natural o sintética y pueden estar químicamente modificados. En una realización, el agente biológicamente activo es un agente de iARN, ácido nucleico interferente pequeño (ANip), ARN interferente pequeño (ARNip), ARN bicatenario (ARNbc), micro-ARN (miARN) o una molécula ARN en horquilla corta (ARNhc). En una realización, el agente biológicamente activo es un agente de iARN útil para mediar la interferencia de ARN (iARN). En otra realización el agente biológicamente activo es un ARNm.
En la técnica están disponibles diversos métodos para cargar agentes biológicamente activos en composiciones lipídicas, tales como liposomas y nanopartículas lipídicas, incluyendo métodos de carga pasivos y activos. El método exacto empleado puede elegirse basándose en múltiples factores que incluyen, pero sin limitación, p. ej., el agente biológicamente activo a cargar, el método de almacenamiento a usar una vez cargado, el tamaño de la partícula resultante y la posología contemplada. Los métodos incluyen, p. ej., la mezcla mecánica del fármaco y los lípidos en el momento en que se forman o reconstituyen los liposomas, disolver todos los componentes en un disolvente orgánico y concentrarlos en una película seca, formar un pH o gradiente iónico para atraer el agente activo hacia el interior del liposoma, crear un potencial transmembrana y carga mediada por ionóforos. Véase, p. ej., la publicación PCT N.° WO 95/08986, la Pat. de EE.UU. N.° 5,837,282, la Pat. de EE.UU. N.° 5,837,282 y la Pat. de EE.UU. N.° 7,811,602.
Por "nanopartícula lipídica" se entiende una partícula que comprende una pluralidad de (es decir, más de una) moléculas lipídicas asociadas físicamente entre sí por fuerzas intermoleculares. Las nanopartículas lipídicas pueden ser, p. ej., microesferas (incluyendo vesículas unilamelares y multilamelares, p. ej. "liposomas"-bicapas lipídicas de fase lamelar que, en algunas realizaciones, son básicamente esféricas y, en más realizaciones particulares, pueden comprender un núcleo acuoso, p. ej., que comprende una parte sustancial de moléculas de ARN), una fase dispersada en una emulsión, micelas o una fase interna en una suspensión.
Las nanopartículas lipídicas tienen un tamaño de aproximadamente 1 a aproximadamente 2,500 nm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 1,500 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 1,000 nm, en una subrealización de aproximadamente 50 a aproximadamente 600 nm, en una subrealización de aproximadamente 50 a aproximadamente 400 nm, en una subrealización de aproximadamente 50 a aproximadamente 250 nm y en una subrealización de aproximadamente 50 a aproximadamente 150 nm. A menos que se indique lo contrario, todos los tamaños a los que se hace referencia en el presente documento son tamaños promedio (diámetros) de la nanopartícula completamente formada, medidos por dispersión dinámica de luz en un Malvern Zetasizer. La muestra de nanopartículas se diluye en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para que el índice de recuento sea de aproximadamente 200 - 400 kcts. Los datos se presentan como un promedio ponderado de la medición de intensidad.
Una realización de la presente invención proporciona una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (II) y otro componente lipídico. En el presente documento se divulga una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I) and y un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol. En el presente documento se divulga una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I), un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, y un lípido neutro, por ejemplo DSPC. En el presente documento se divulga una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I), un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, un lípido neutro, por ejemplo DSPc , y un lípido de circulación prolongada, por ejemplo S010, S024, S027, S031 o S033. En el presente documento se divulga una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I), un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, un lípido neutro, por ejemplo DSPC, un lípido de circulación prolongada, por ejemplo S010, S024, S027, S031 o S033, y un agente biológicamente activo, por ejemplo un ARN o ADN. En el presente documento se divulga una nanopartícula lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I) un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, un lípido neutro, por ejemplo DSPC, y un lípido de circulación prolongada, por ejemplo S010, S024, S027, S031, o S033, y un agente biológicamente activo, por ejemplo un ARNm, ARNip o ADN.
Las realizaciones de la presente invención también proporcionan composiciones lipídicas descritas según las respectivas relaciones molares de los lípidos componentes en la formulación, en donde una barra ("/") indica los respectivos componentes, como se proporciona en el presente documento.
En el presente documento se divulga una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I) y un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, en una proporción molar de lípido de 55-40 de compuesto de fórmula (I)/55-40 de lípido auxiliar. En el presente documento se divulga una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I), un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, y un lípido neutro, por ejemplo DPSC, en una proporción molar de lípido de 55-40 de compuesto de fórmula (I)/55-40 de lípido auxiliar/15-5 de lípido neutro. En el presente documento se divulga una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I), un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, un lípido neutro, por ejemplo DSPC, y un lípido de circulación prolongada, por ejemplo S010, S024, S027, S031 o S033, en una proporción molar de lípido de 55-40 de compuesto de fórmula (I)/55-40 de lípido auxiliar/15-5 de lípido neutro/10-1 de lípido de circulación prolongada.
En el presente documento se divulga una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I) y un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, en una proporción molar de lípido de 50-40 de compuesto de fórmula (I)/50-40 de lípido auxiliar. En el presente documento se divulga una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I), un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, y un lípido neutro, por ejemplo DPSC, en una proporción molar de lípido de 50-40 de compuesto de fórmula (I)/50-40 de lípido auxiliar/15-5 de lípido neutro. En el presente documento se divulga una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I), un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, un lípido neutro, por ejemplo DSPC, un lípido de circulación prolongada, por ejemplo S010, S024, S027, S031 o S033, en una proporción molar de lípido de 50-40 de compuesto de fórmula (I)/50-40 de lípido auxiliar/15-5 de lípido neutro/5-1 de lípido de circulación prolongada.
En el presente documento se divulga una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I) y un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, en una proporción molar de lípido de 47-43 de compuesto de fórmula (I)/47-43 de lípido auxiliar. En el presente documento se divulga una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I), un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, y un lípido neutro, por ejemplo DPSC, en una proporción molar de lípido de 47-43 de compuesto de fórmula (I)/47-43 de lípido auxiliar/12-7 de lípido neutro. En el presente documento se divulga una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I), un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, un lípido neutro, por ejemplo DSPC, un lípido de circulación prolongada, por ejemplo S010, S024, S027, S031 o S033, en una proporción molar de lípido de 47-43 de compuesto de fórmula (I)/47-43 de lípido auxiliar/12-7 de lípido neutro/4-1 de lípido de circulación prolongada.
En el presente documento se divulga una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I) y un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, en una proporción molar de lípido de aproximadamente 45 de compuesto de fórmula (I)/aproximadamente 44 de lípido auxiliar. En el presente documento se divulga una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I), un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, y un lípido neutro, por ejemplo DPSC, en una proporción molar de lípido de aproximadamente 45 de compuesto de fórmula (I)/aproximadamente 44 de lípido auxiliar/aproximadamente 9 de lípido neutro. En el presente documento se divulga una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I), un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, un lípido neutro, por ejemplo DSPC, un lípido de circulación prolongada, por ejemplo S010, S024, S027, S031 o S033, en una proporción molar de lípido de aproximadamente 45 de compuesto de fórmula (I)/aproximadamente de 44 de lípido auxiliar/aproximadamente 9 de lípido neutro/aproximadamente 2 de lípido de circulación prolongada, por ejemplo S010, S024, S027, S031 o S033.
Se dan compuestos preferidos de fórmula (II) para su uso en las composiciones lipídicas anteriores en los Ejemplos 1-31 y 34-36. Se dan compuestos particularmente preferidos en los Ejemplos 1 y 80. Son agentes biológicamente activos preferidos ARN y ADN.
Las composiciones lipídicas de la presente invención pueden optimizarse adicionalmente por un experto en la materia combinando lípidos catiónicos con el intervalo de pKa deseado, lípidos de circulación prolongada, lípidos auxiliares y lípidos neutros en formulaciones, incluyendo, p. ej., formulaciones de liposomas, formulaciones de nanopartículas lipídicas (LNP) y similares, para administrar a células y tejidos específicos in vivo. En una realización, la optimización adicional se obtiene ajustando la proporción molar de lípido entre los diversos tipos de lípidos. En una realización, la optimización adicional se obtiene ajustando uno o más de: el tamaño de partículas deseado, la proporción N/P, los métodos de formulación y/o la posología (p. ej., número de dosis administradas a lo largo del tiempo, dosis real en mg/kg, tiempo de las dosis, combinaciones con otros agentes terapéuticos, etc.). Las diversas técnicas de optimización conocidas por los expertos en la materia que pertenecen a las realizaciones enumeradas anteriormente se consideran parte de esta invención.
Métodos generales para preparar nanopartículas lipídicas
Pueden emplearse los siguientes métodos para preparar nanopartículas lipídicas de la invención. Para lograr una reducción del tamaño y/o un aumento de la homogeneidad del tamaño en las partículas, el experto en la materia puede emplear las etapas del método que se detallan a continuación, experimentando con diferentes combinaciones. Además, el experto en la materia podría emplear sonicación, filtración u otras técnicas de dimensionamiento que se usan en formulaciones liposomales.
El proceso para preparar una composición de la invención normalmente comprende proporcionar una solución acuosa, tal como tampón citrato, que comprende un agente biológicamente activo en un primer reservorio, proporcionar un segundo reservorio que comprende una solución orgánica, tal como un alcohol orgánico, por ejemplo, etanol, del lípido o lípidos, y después mezclar la solución acuosa con la solución lipídica orgánica. El primer reservorio está opcionalmente en comunicación fluida con el segundo reservorio. La etapa de mezclado se sigue opcionalmente de una etapa de incubación, una etapa de filtración o diálisis y una etapa de dilución y/o concentración. La etapa de incubación comprende dejar reposar la solución de la etapa de mezclado en un recipiente durante aproximadamente 0 a aproximadamente 100 horas (preferentemente de aproximadamente 0 a aproximadamente 24 horas) aproximadamente a la temperatura ambiente y opcionalmente protegida de la luz. La temperatura puede ser de aproximadamente 4 °C durante la incubación. La etapa de incubación puede estar seguida de una etapa de dilución. La etapa de dilución puede implicar la dilución con tampón acuoso (p. ej., tampón citrato o agua pura), p. ej., usando un aparato de bombeo (p. ej., una bomba peristáltica). La etapa de filtración es ultrafiltración o diálisis. La ultrafiltración comprende la concentración de la solución diluida seguida de diafiltración, p. ej., usando un sistema de bombeo adecuado (p. ej., un aparato de bombeo tal como una bomba peristáltica o equivalente) junto con una membrana de ultrafiltración adecuada (p. ej., cartuchos de fibra hueca GE o equivalente). La diálisis comprende el intercambio del disolvente (tampón) a través de una membrana adecuada (p. ej., membrana de piel de serpiente de 10,000). Como alternativa, la diálisis puede realizarse usando columnas de intercambio de tampón (p. ej., columnas PD-10 de GE healthcare).
La etapa de mezclado puede proporcionar una sola fase transparente.
Después de la etapa de mezclado, el disolvente orgánico puede eliminarse para proporcionar una suspensión de partículas, en donde el agente biológicamente activo está encapsulado por el lípido o lípidos.
La selección de un disolvente orgánico implicará normalmente la consideración de la polaridad del disolvente y la facilidad con la que el disolvente pueda eliminarse en las últimas etapas de la formación de partículas. El disolvente orgánico, que también se emplea como agente solubilizante, está preferentemente en una cantidad suficiente para proporcionar una mezcla transparente de una sola fase de agentes biológicamente activos y lípidos. El disolvente orgánico puede seleccionarse entre uno o más (p. ej., dos) de cloroformo, diclorometano, éter dietílico, ciclohexano, ciclopentano, benceno, tolueno, metanol y otros alcoholes alifáticos (p. ej., de C1 a C8) tales como etanol, propanol, isopropanol, butanol, tercbutanol, iso-butanol, pentanol y hexanol.
La etapa de mezclado puede realizarse por cualquiera de diversos métodos, por ejemplo, por medios mecánicos tales como un mezclador de vórtice.
Los métodos empleados para eliminar el disolvente orgánico implicarán normalmente diafiltración, diálisis o evaporación a presiones reducidas o el soplado de una corriente de gas inerte (p. ej., nitrógeno o argón) a través de la mezcla.
El método puede comprender adicionalmente añadir policationes no lipídicos que son útiles para efectuar la transformación de células usando las presentes composiciones. Los ejemplos de policationes no lipídicos adecuados incluyen, pero sin limitación, bromuro de hexadimetrina (comercializado bajo el nombre comercial POLYBRENE(R), de Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wis., EE.UU.) u otras sales de hexadimetrina. Otros policationes adecuados incluyen, por ejemplo, sales de poli-L-ornitina, poli-L-arginina, poli-L-lisina, poli-D-lisina, polialilamina y polietilenimina.
La formación de las nanopartículas lipídicas puede realizarse en un sistema monofase (p. ej., una monofase de Bligh y Dyer o una mezcla similar de disolventes acuosos y orgánicos) o en un sistema de dos fases con un mezclado adecuado.
La nanopartícula lipídica puede formarse en un sistema monofase o bifase. En un sistema monofase, cada uno del lípido o lípidos catiónicos y el agente biológicamente activo se disuelven en un volumen de la mezcla monofase. La combinación de las dos soluciones proporciona una mezcla individual en la que se forman los complejos. En un sistema bifase, los lípidos catiónicos se unen al agente biológicamente activo (que está presente en la fase acuosa) y lo "arrastran" hacia la fase orgánica. Las nanopartículas lipídicas pueden prepararse por un método que comprende: (a) poner en contacto el agente biológicamente activo con una solución que comprende lípidos no catiónicos y un detergente para formar una mezcla compuesto-lípido; (b) poner en contacto los lípidos catiónicos con la mezcla compuesto-lípido para neutralizar una parte de la carga negativa del agente biológicamente activo y formar una mezcla de carga neutralizada de agente biológicamente activo y lípidos; y (c) eliminar el detergente de la mezcla de carga neutralizada.
La solución de lípidos neutros y detergente puede ser una solución acuosa. La puesta en contacto del agente biológicamente activo con la solución de lípidos neutros y detergente se realiza normalmente mezclando juntos una primera solución del agente biológicamente activo y una segunda solución de los lípidos y detergente. Preferentemente, la solución de agente biológicamente activo también es una solución detergente. La cantidad de lípido neutro que se usa en el presente método se determina normalmente basándose en la cantidad de lípido catiónico usada, y normalmente es de aproximadamente 0,2 a 5 veces la cantidad de lípido catiónico, preferentemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2 veces la cantidad de lípido catiónico usada.
La mezcla de agente biológicamente activo-lípido formada de esta manera se pone en contacto con lípidos catiónicos para neutralizar una parte de la carga negativa que está asociada con la molécula de interés (u otros materiales polianiónicos) presente. La cantidad de lípidos catiónicos usada es normalmente 3-8 veces más que la proporción molar calculada de carga negativa (fosfatos).
Los métodos empleados para eliminar el detergente normalmente implican diálisis. Cuando están presentes disolventes orgánicos, la eliminación se realiza normalmente por diafiltración o evaporación a presiones reducidas o soplando una corriente de gas inerte (p. ej., nitrógeno o argón) a través de la mezcla.
En el presente documento se divulga un aparato para preparar una composición de la presente invención. El aparato incluye normalmente un primer reservorio para contener una solución acuosa que comprende un agente biológicamente activo y un segundo reservorio para contener una solución lipídica orgánica. El aparato también incluye normalmente un mecanismo de bombeo configurado para bombear las soluciones acuosa y lipídica orgánica a una región de mezclado o cámara de mezclado a caudales sustancialmente iguales. La región de mezclado o cámara de mezclado puede comprender un acoplamiento en T o equivalente, que permite que las corrientes de fluido acuoso y orgánico se combinen al entrar en el conector en T y las soluciones acuosa y orgánica combinadas resultantes salgan del conector en T hacia un reservorio de recogida o equivalente. Se puede usar un dispositivo microfluídico, tal como un NANOASSEMBLR TM, para preparar una composición proporcionada por la invención.
Métodos para suministrar agentes biológicamente activos y el tratamiento de la enfermedad
El cuarto aspecto de la invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria en un sujeto frente a un inmunógeno de interés en un vertebrado, que comprende administrar una cantidad inmunológicamente eficaz de la composición farmacéutica del tercer aspecto, en donde la composición comprende una molécula de ARN que codifica el inmunógeno.
Los lípidos catiónicos de fórmula (I) y composiciones lipídicas de los mismos son útiles en composiciones farmacéuticas o formulaciones usadas para el suministro de agentes biológicamente activos. Las formulaciones que contienen lípidos catiónicos de fórmula (I) o composiciones lipídicas de los mismos puede estar en diversas formas, incluyendo, pero sin limitación, agentes de suministro de formación de partículas incluyendo micropartículas, nanopartículas y agentes de transfección que son útiles para suministrar diversas moléculas a células. Las formulaciones específicas son eficaces en la transfección o el suministro de agentes biológicamente activos, tales como anticuerpos (p. ej., monoclonales, quiméricos, humanizados, nanocuerpos y fragmentos de los mismos, etc.), colesterol, hormonas, péptidos, proteínas, productos quimioterapéuticos y otros tipos de agentes antineoplásicos, fármacos de bajo peso molecular, vitaminas, cofactores, nucleósidos, nucleótidos, oligonucleótidos, ácidos nucleicos enzimáticos, ácidos nucleicos antisentido, oligonucleótidos formadores de triples cadenas, composiciones de ADN o ARN antisentido, composiciones quiméricas de ADN:ARN, alozimas, aptámeros, ribozimas, señuelos y análogos de los mismos, plásmidos y otros tipos de vectores de expresión, y moléculas pequeñas de ácido nucleico, ARNm, agentes de iARN, ácido nucleico interferente pequeño (ANip), a Rn interferente pequeño (ARNip), ARN bicatenario (ARNbc), micro-ARN (miARN), moléculas ARN en horquilla corta (ARNhc) y moléculas de "ARN autorreplicante" (que codifica una actividad de enzima replicasa y que puede dirigir su propia replicación o amplificación in vivo), ácido nucleico peptídico (ANP), un ribonucleótido de ácido nucleico bloqueado (LNA), nucleótido morfolino, ácido nucleico treósico (TNA), ácido nucleico glicólico (GNA), ARNipsi (ARN interferente pequeño segmentado internamente), ARNia (ARN interferente asimétrico) y ARNip con 1, 2 o más emparejamientos incorrectos entre la cadena con sentido y antisentido para células y/o tejidos relevantes, tal como en un cultivo celular, sujeto u organismo. La lista anterior de agentes biológicamente activos es solo ilustrativa y no se pretende que sea limitante. Dichos compuestos pueden estar purificados o parcialmente purificados, pueden aparecer de forma natural o sintética y pueden estar químicamente modificados.
Dichas formulaciones que contienen agentes biológicamente activos son útiles, p. ej., para proporcionar composiciones para prevenir, inhibir o tratar enfermedades, afecciones o rasgos en una célula, sujeto u organismo. Las enfermedades, afecciones o rasgos incluyen, pero sin limitación, enfermedades proliferativas, incluyendo cáncer, enfermedad inflamatoria, rechazo de trasplante y/o tejido, enfermedades o afecciones autoinmunitarias, enfermedad relacionada con la edad, enfermedad neurológica o neurodegenerativa, enfermedad respiratoria, enfermedad cardiovascular, enfermedad ocular, enfermedad metabólica, enfermedad dermatológica, enfermedad auditiva, una enfermedad hepática, una enfermedad de riñón o renal, etc.
La cantidad de agente activo administrada por dosis es una cantidad por encima de la dosis terapéutica mínima pero por debajo de una dosis tóxica. La cantidad real por dosis puede ser determinada por un médico dependiendo de varios factores, tales como el historial médico del paciente, el uso de otras terapias, el agente biológicamente activo que se va a proporcionar y la naturaleza de la enfermedad. La cantidad de agente biológicamente activo administrada puede ajustarse a lo largo del tratamiento, dependiendo de la respuesta del paciente al tratamiento y la presencia o gravedad de cualquier efecto secundario asociado con el tratamiento. Se conocen las dosis y el tratamiento ilustrativos para compuestos que han sido aprobados por una agencia reguladora y están disponibles para los expertos en la materia. Véase, p. ej., Physician's Desk Reference, 64a ed., Physician's Desk Reference Inc. (2010), Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Filadelfia, Pa. (1985), y Remington The Science and Practice of Pharmacy, 21a ed., Lippincott Williams & Williams Publishers (2005).
En una realización, se administra una sola dosis de un agente biológicamente activo a un paciente que lo necesita. En una realización, se administran múltiples dosis, en donde las múltiples dosis pueden administrarse simultáneamente, secuencialmente o de forma alternante. En una realización, la misma formulación se administra en múltiples dosis. En una realización, las formulaciones difieren en múltiples dosis. En diversas realizaciones, las dosis pueden administrarse una vez al día o durante uno, dos, tres, cuatro o más días consecutivos. En una realización, las dosis se administran una vez a la semana. En una realización, las dosis se administran una vez cada dos semanas. En una realización, los pacientes reciben al menos dos ciclos de una pauta de tratamiento, y potencialmente más, dependiendo de la respuesta del paciente al tratamiento. En pautas de agentes individuales, los ciclos totales de tratamiento se determinan por el paciente y el médico en función de las respuestas y la toxicidad observadas. Las pautas posológicas anteriores deben considerarse ejemplos no limitantes. Se contemplan otras pautas posológicas como dentro del alcance de la invención, y dependen del efecto terapéutico deseado.
En el presente documento se divulga un método para el tratamiento de una enfermedad o afección que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición lipídica de la invención a un paciente que necesita tratamiento de la misma. La enfermedad o afección puede ser tratable mediante la administración de un agente de ARN.
En el presente documento se divulga el uso de una composición lipídica de la invención en el tratamiento de una enfermedad o afección en un paciente. La enfermedad o afección puede ser tratable mediante la administración de un agente de ARNip o ARNm.
La cantidad total de lípido proporcionada por la invención en la composición que se administra es, en una realización, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 mg de lípido por mg de agente biológicamente activo (p. ej., ARN), en otra realización, de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 mg de lípido por mg de agente biológicamente activo (p. ej., ARN), en otra realización, de aproximadamente 7 a aproximadamente 25 mg de lípido por mg de agente biológicamente activo (p. ej., ARN), y en una realización, de aproximadamente 7 a aproximadamente 15 mg de lípido por mg de agente biológicamente activo (p. ej., ARN).
Como se usa en el presente documento, el "tratamiento" incluye tratamiento de mejora, curativo y profiláctico. Como se usa en el presente documento, un "paciente" significa un animal, preferentemente un mamífero, preferentemente un ser humano, que necesite tratamiento.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad del compuesto de la invención y el agente biológicamente activo (p. ej., el compuesto terapéutico) necesaria para tratar o aliviar una enfermedad o afección diana.
La expresión "cantidad inmunológicamente eficaz" se refiere a la cantidad del compuesto de la invención y de ARN que codifica un inmunógeno necesario para inducir una respuesta inmunitaria que reconozca el inmunógeno (p. ej., en el contexto de un patógeno). El término "inmunógeno" se refiere a cualquier sustancia u organismo que provoque una respuesta inmunitaria cuando se introduzca en el cuerpo. La expresión "ARN que codifica un inmunógeno" se refiere a un polinucleótido, tal como un ARN mensajero o un replicón (p. ej., ARN autorreplicante) que, cuando se administra a una célula u organismo, es capaz de traducirse a un polipéptido según la secuencia codónica de dicho ARN.
Por "enfermedad proliferativa", como se usa en el presente documento, se entiende cualquier enfermedad, afección, rasgo, genotipo o fenotipo caracterizado por un crecimiento o replicación celular desregulado como se conoce en la técnica. En una realización, la enfermedad proliferativa es cáncer. En una realización, la enfermedad proliferativa es un tumor. En una realización, la enfermedad proliferativa incluye, pero sin limitación, p. ej., tumores líquidos tales como, por ejemplo, leucemias, por ejemplo, leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia linfocítica aguda (LLA), mieloma múltiple y leucemia linfocítica crónica; y tumores sólidos, por ejemplo, cánceres relacionados con el SIDA tales como sarcoma de Kaposi; cánceres de mama; cánceres de hueso; cánceres de cerebro; cánceres de la cabeza y el cuello, linfoma no hodgkiniano, adenoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma laríngeo, cánceres de la vesícula biliar y los conductos biliares, cánceres de la retina, cánceres del esófago, cánceres gastrointestinales, cáncer ovárico, cáncer uterino, cáncer de tiroides, cáncer testicular, cáncer endometrial, melanoma, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de pulmón (incluyendo carcinoma de pulmón no microcítico), cáncer pancreático, sarcomas, tumor de Wilms, cáncer del cuello uterino, cáncer de cabeza y cuello, cánceres de piel, carcinoma nasofaríngeo, liposarcoma, carcinoma epitelial, carcinoma de células renales, adenocarcinoma de la vesícula biliar, sarcoma endometrial, cánceres multirresistentes. En una realización, enfermedad proliferativa incluye neovascularización asociada con la angiogénesis tumoral, degeneración macular (p. ej., degeneración macular senil húmeda/seca), neovascularización corneal, retinopatía diabética, glaucoma neovascular, degeneración miópica. En una realización, la enfermedad proliferativa incluye reestenosis y enfermedad de riñón poliquístico.
Por "enfermedad autoinmunitaria", como se usa en el presente documento, se entiende cualquier enfermedad, afección, rasgo, genotipo o fenotipo caracterizado por autoinmunidad como se conoce en la técnica. Las enfermedades autoinmunitarias incluyen, pero sin limitación, p. ej., esclerosis múltiple, diabetes mellitus, lupus, esclerodermia, fibromialgia, rechazo de trasplantes (p. ej., prevención del rechazo de aloinjertos), anemia perniciosa, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, dermatomiositis, miastenia grave, lupus eritematoso, esclerosis múltiple y enfermedad de Graves.
Por "enfermedad infecciosa" se entiende cualquier enfermedad, trastorno o afección asociado con un agente infeccioso, tal como un virus, bacteria, hongo, prion o parásito. La invención se puede usar para inmunizar contra patógenos que provocan enfermedad infecciosa. Se proporcionan ejemplos de dichos patógenos a continuación.
Por "enfermedad neurológica" se entiende cualquier enfermedad, trastorno o afección que afecte al sistema nervioso central o periférico. Las enfermedades neurológicas incluyen, pero sin limitación, enfermedades o trastornos del sistema nervioso central o periférico incluyendo, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, aneurisma, lesión cerebral, síndrome del túnel carpiano, aneurisma cerebral, dolor crónico, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, epilepsia, enfermedad de Huntington, meningitis, trastornos de convulsiones y otras enfermedades, trastornos y síndromes neurológicos.
Por "enfermedad respiratoria" se entiende cualquier enfermedad o afección que afecte a las vías respiratorias. Las enfermedades respiratorias incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), rinitis alérgica, sinusitis, alergias, respiración dificultosa, síndrome de dificultad respiratoria, fibrosis quística, hipertensión pulmonar o vasoconstricción y enfisema.
Por "enfermedad cardiovascular" se entiende cualquier enfermedad o afección que afecte al corazón y a la vasculatura. Las enfermedades cardiovasculares incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, cardiopatía coronaria (CHD), enfermedad cerebrovascular (CVD), estenosis aórtica, enfermedad vascular periférica, infarto de miocardio (ataque al corazón), arritmia, isquemia e insuficiencia cardíaca congestiva.
Por "enfermedad ocular", como se usa en el presente documento, se entiende cualquier enfermedad, afección, rasgo, genotipo o fenotipo del ojo y las estructuras relacionadas. Las enfermedades oculares incluyen, pero sin limitación, p. ej., edema macular quistoide, retinopatía diabética, degeneración reticular, oclusión de las venas retinianas, oclusión de las arterias retinianas, degeneración macular (p. ej., degeneración macular senil, tal como DMS húmeda o DMS seca), toxoplasmosis, retinitis pigmentosa, laceración de la conjuntiva, laceración corneal, glaucoma y similares.
Por "enfermedad metabólica" se entiende cualquier enfermedad o afección que afecte a las vías metabólicas. La enfermedad metabólica puede dar lugar a un proceso metabólico anómalo, ya sea congénito debido a anomalía enzimática heredada (metabolopatías innatas) o adquirido debido a una enfermedad de un órgano endocrino o insuficiencia de un órgano metabólicamente importante tal como el hígado. En una realización, la enfermedad metabólica incluye obesidad, resistencia a la insulina y diabetes (p. ej., diabetes de tipo I y/o tipo II).
Por "enfermedad dermatológica" de entiende cualquier enfermedad o afección de la piel, dermis o cualquier subestructura en las mismas, tal como un pelo, un folículo, etc. Las enfermedades, trastornos, afecciones y rasgos dermatológicos pueden incluir psoriasis, dermatitis ectópica, cánceres cutáneos tales como melanoma y carcinoma de células basales, alopecia, eliminación del pelo y alteraciones de la pigmentación.
Por "enfermedad auditiva" se entiende cualquier enfermedad o afección del sistema auditivo, incluyendo el oído, tal como el oído interno, oído medio, oído externo, nervio auditivo y cualquier subestructura en los mismos. Las enfermedades, trastornos, afecciones y rasgos auditivos pueden incluir pérdida de audición, sordera, acúfenos, vértigo, equilibrio y trastornos del movimiento.
Por "enfermedad regenerativa" se entiende cualquier enfermedad o afección en la que una generación o regeneración in vivo o in vitro insuficiente de células o tejidos impide el establecimiento o la restauración de la función adecuada de los órganos antes o después de una lesión, impide o retarda la cicatrización de heridas o la resolución de lesiones ulcerativas, acelera el envejecimiento o previene una terapia basada en células eficaz. La expresión "ácido ribonucleico mensajero" (ARN mensajero, ARNm) se refiere a una molécula de ácido ribonucleico (a Rn ) que media en la transferencia de información genética a ribosomas en el citoplasma, donde actúa como un molde para la síntesis de proteínas. Se sintetiza a partir de un molde de ADN durante el proceso de transcripción. Véase The American Heritage® Dictionary of the English Language, cuarta edición (actualizado en 2009). Houghton Mifflin Company.
En eucariotas, el ARNm se transcribe in vivo en los cromosomas mediante la enzima celular ARN polimerasa. Durante o después de la transcripción in vivo, se añade una caperuza 5' (también denominada caperuza de ARN, caperuza de 7-metilguanosina de ARN o caperuza de m7G de ARN) in vivo al extremo 5' del ARNm. La caperuza 5' es el resto de 7-metilguanosina terminal que está ligado a través de un enlace 5'-5'-trifosfato al primer nucleótido transcrito. Además, la mayoría de moléculas de ARNm eucariotas tienen un resto de poliadenililo ("cola de poli(A)") en el extremo 3' de la molécula de ARNm. In vivo, la célula eucariota añade la cola de poli(A) después de la transcripción, con frecuencia a una longitud de aproximadamente 250 restos de adenosina. Por tanto, un ARNm eucariota maduro habitual tiene una estructura que comienza en el extremo 5' con un nucleótido de caperuza de ARNm seguido de una región 5' no traducida (5'UTR) de nucleótidos, después una fase abierta de lectura que comienza con un codón de inicio que es un triplete AUG de bases nucleotídicas, que es la secuencia codificante de una proteína, y que termina con un codón de parada que puede ser un triplete UAA, UAG o UGA de bases nucleotídicas, después una región 3' no traducida (3'UTR) de nucleótidos y que termina con una cola de poliadenosina. Aunque los elementos del ARNm eucariota maduro habitual se producen de forma natural en una célula eucariota in vivo, los mismos elementos o elementos estructural y funcionalmente equivalentes pueden producirse in vitro usando los métodos de biología molecular. Por consiguiente, cualquier ARN que tenga la estructura similar a un ARNm eucariota maduro habitual puede actuar como ARNm y está dentro del alcance de la expresión "ácido ribonucleico mensajero".
La molécula de ARNm tiene en general un tamaño que puede encapsularse en una nanopartícula lipídica de la invención. Aunque el tamaño de una molécula de ARNm varía en la naturaleza dependiendo de la identidad de la especie de ARNm que codifica una proteína en particular, un tamaño promedio para una molécula de ARNm es el tamaño promedio del ARNm de 500-10.000 bases.
El ADN puede existir en al menos dos formas, que tienen diferentes tamaños. La primera forma de ADN es un polímero de gran tamaño llamado cromosoma. Un cromosoma contiene la información genética de muchas o la mayoría de las proteínas de una célula y también contiene información por la que la célula puede controlar la replicación de la molécula de ADN. Una célula bacteriana puede contener uno o más cromosomas. Una célula eucariota suele contener más de un cromosoma celular, ambos cromosomas
La segunda forma de ADN es de menor tamaño. Muchas moléculas de ADN de la segunda forma tienen un tamaño tal que pueden encapsularse en una nanopartícula lipídica de la invención. Algunas de estas formas más cortas de ADN pueden tener un tamaño que permita codificar útilmente las proteínas. Algunos ejemplos de estas segundas formas de ADN, más cortas y útiles, incluyen plásmidos y otros vectores. Para una descripción más completa, véase, Alberts B et al. (2007) Molecular Biology of the Cell, quinta edición, Garly Science.
Un plásmido es una pequeña molécula de ADN que está físicamente separada del ADN cromosómico y puede replicarse independientemente del ADN cromosómico dentro de una célula. Los plásmidos comúnmente existen in vivo como moléculas de ADN bicatenarias circulares pequeñas. En la naturaleza, los plásmidos portan genes que pueden transcribirse y traducirse en proteínas que pueden beneficiar la supervivencia de un organismo (p. ej., resistencia a antibióticos). En la naturaleza, los plásmidos pueden transmitirse con frecuencia de un organismo a otro por transferencia horizontal de genes. Los plásmidos artificiales o recombinantes se utilizan ampliamente en biología molecular, ya que sirven para permitir la replicación de secuencias de ADN recombinantes y la expresión de proteínas útiles dentro de los organismos hospedadores. El tamaño de los plásmidos puede variar de aproximadamente 1 a más de 25 pares de kilobases. Un plásmido recombinante puede hacerse de manera recombinante para que tenga un tamaño tal que pueda encapsularse en una nanopartícula lipídica de la invención.
En biología molecular, un vector es una molécula de ADN utilizada como vehículo para portar de manera artificial material genético de una célula o de una reacción bioquímica in vitro a otra célula, donde el ADN puede replicarse y/o expresarse. Un vector que contiene ADN extraño se denomina recombinante. Entre los tipos de vectores útiles están los plásmidos y los vectores víricos. La inserción de un vector en la célula diana suele denominarse transformación en el caso de las células bacterianas, transfección en el caso de las células eucariotas, aunque la inserción de un vector vírico suele denominarse transducción.
Los vectores víricos son generalmente virus recombinantes que portan ADN o ARN vírico modificado que se ha convertido en no infeccioso, pero que todavía contiene promotores víricos y también el transgén, permitiendo así la traducción del transgén a través de un promotor vírico. Los vectores víricos, en algunas realizaciones, están diseñados para la incorporación permanente del inserto en el genoma del hospedador (integrar), y por lo tanto dejan marcadores genéticos distintos en el genoma del hospedador después de incorporar el transgén. Un vector vírico puede recombinarse para que tenga un tamaño tal que pueda encapsularse en una nanopartícula lipídica de la invención.
La expresión "ácido nucleico interferente pequeño" (ANip), como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico capaz de inhibir o regular negativamente la expresión génica o replicación vírica mediando en la interferencia de ARN (ía Rn ) o el silenciamiento génico de una manera específica de secuencia. Incluye ARN interferente pequeño (ARNip), microARN (miARN), oligonucleótidos interferentes pequeños y moléculas de ácido nucleico interferente pequeño modificadas químicamente. Los ARNip son responsables de la interferencia de ARN, el proceso de silenciamiento génico postranscripcional específico de secuencia en animales y plantas. Se generan ARNip mediante escisión por ribonucleasa III de a Rn bicatenario (ARNbc) más largo que son homólogos de, o específicos para, la diana génica silenciada.
La expresión "interferencia de ARN" (iARN) es una técnica de silenciamiento génico dirigida, postranscripcional, que usa un agente de iARN para degradar el ARN mensajero (ARNm) que contiene una secuencia que es igual o muy similar al agente de iARN. Véase: Zamore y Haley, 2005, Science, 309, 1519-1524; Zamore et al., 2000, Cell, 101,25-33; Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494-498; y Kreutzer et al., publicación PCT WO 00/44895; Fire, publicación PCT WO 99/32619; Mello y Fire, publicación PCT WO 01/29058; y similares.
Como se usa en el presente documento, iARN es equivalente a otros términos usados para describir la interferencia de ARN específica de secuencia, tal como el silenciamiento génico postranscripción, la inhibición de la traducción, la inhibición de la transcripción o la epigenética. Por ejemplo, las formulaciones que contienen lípidos de la invención pueden usarse junto con moléculas de ANip para silenciar epigenéticamente genes en el nivel postranscripcional y/o en el nivel pretranscripcional. En un ejemplo no limitante, la modulación de la expresión génica por moléculas de ANip puede resultar de la escisión mediada por ANip (ya sea ARN codificante o no codificante) mediante RISC o, como alternativa, inhibición de la traducción como se conoce en la técnica. En otra realización, la modulación de la expresión génica por ANip puede resultar de la inhibición de la transcripción tal como se indica, por ejemplo, en Janowski et al., 2005, Nature Chemical Biology, 1, 216-222.
La expresión "inhibidor de iARN" es cualquier molécula que puede modular negativamente (p. ej., reducir o inhibir) la función o actividad de interferencia de ARN en una célula o paciente. Un inhibidor de iARN puede regular negativamente, reducir o inhibir iARN (p. ej., escisión mediada por iARN de un polinucleótido diana, inhibición de la traducción o silenciamiento de la transcripción) mediante interacción con o interferencia con la función de cualquier componente de la vía de iARN, incluyendo componentes proteicos tales como RISC o componentes de ácido nucleico tales como miARN o ARNip. Un inhibidor de iARN puede ser una molécula de ANip, una molécula antisentido, un aptámero o una molécula pequeña que interactúa con o interfiere con la función de RISC, un miARN o un ARNip o cualquier otro componente de la vía de iARN en una célula o paciente. Al inhibir la iARN (p. ej., escisión mediada por iARN de un polinucleótido diana, inhibición de la traducción o silenciamiento de la transcripción), se puede usar un inhibidor de iARN para modular (p. ej., regular positivamente o regular negativamente) la expresión de un gen diana. En una realización, se usa un inhibidor de ARN para regular positivamente la expresión génica al interferir con (p. ej., reducir o prevenir) la regulación negativa endógena o la inhibición de la expresión génica a través de inhibición de la traducción, silenciamiento de la transcripción o escisión mediada por RISC de un polinucleótido (p. ej., ARNm). Al interferir con mecanismos de represión, silenciamiento o inhibición endógenos de la expresión génica, los inhibidores de iARN de la invención pueden usarse, por lo tanto, para regular positivamente la expresión génica para el tratamiento de enfermedades o afecciones resultantes de una pérdida de función. La expresión "inhibidor de iARN" se usa indistintamente con el término "ANip" en diversas realizaciones del presente documento.
La expresión "ácido nucleico enzimático", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene complementariedad en una región de unión a sustrato para una diana génica específica y también tiene una actividad enzimática que actúa para escindir de forma específica un ARN diana, inactivando de este modo la molécula de ARN diana. Las regiones complementarias permiten suficiente hibridación de la molécula de ácido nucleico enzimático con el ARN diana y, de este modo, permiten la escisión. Se prefiere una complementariedad del 100 %, pero también puede ser útil una complementariedad tan baja como del 50-75 % en la presente invención (véase, por ejemplo, Werner y Uhlenbeck, 1995, Nucleic Acids Research, 23, 2092-2096; Hammann et al., 1999, Antisense and Nucleic Acid Drug Dev., 9, 25-31). Los ácidos nucleicos pueden modificarse en la base, el azúcar y/o los grupos fosfato. La expresión ácido nucleico enzimático se usa indistintamente con expresiones tales como ribozimas, ARN catalítico, ARN enzimático, ADN catalítico, aptazima o ribozima de unión a aptámero, ribozima regulable, oligonucleótidos catalíticos, nucleozima, ADNzima, enzima de ARN, endorribonucleasa, endonucleasa, minizima, enzima de plomo, oligozima o enzima de ADN. Toda esta terminología describe moléculas de ácido nucleico con actividad enzimática. Las características clave de una molécula de ácido nucleico enzimático son que tiene un sitio de unión a sustrato específico que es complementario de una o más de las regiones de ácido nucleico diana y que tiene secuencias de nucleótidos en o en torno al sitio de unión a sustrato que transmite una actividad de escisión y/o ligamiento de ácido nucleico a la molécula (véase, p. ej., Cech et al., patente de EE.UU. 4,987,071; Cech et al., 1988, 260 JAMA 3030). Las ribozimas y moléculas de ácido nucleico enzimático de la invención se pueden modificar químicamente, por ejemplo, como se describe en la técnica y en otra parte del presente documento.
La expresión "ácido nucleico antisentido", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico no enzimático que se une a ARN diana por medio de interacciones ARN-ARN o ARN-ADN o ARN-APN (ácido nucleico proteico; Egholm et al., 1993 Nature 365, 566) y altera la actividad del ARN diana (para una revisión, véase Stein y Cheng, 1993 Science 261, 1004 y Woolf et al., patente de EE.UU. 5,849,902). El ADN antisentido puede sintetizarse químicamente o expresarse mediante el uso de un vector de expresión de ADN monocatenario o equivalente del mismo. Las moléculas antisentido de la invención pueden modificarse químicamente, por ejemplo, como se describe en la técnica.
La expresión "región activadora de RNasa H", como se usa en el presente documento, se refiere a una región (generalmente mayor o igual a 4-25 nucleótidos de longitud, preferentemente de 5-11 nucleótidos de longitud) de una molécula de ácido nucleico capaz de unirse a un ARN diana para formar un complejo no covalente que es reconocido por la enzima RNasa H celular (véase, por ejemplo, Arrow et al., patente de los Estados Unidos 5.849.902; Arrow et al., patente de los Estados Unidos 5.989.912). La enzima RNasa H se une al complejo de molécula de ácido nucleico-ARN diana y escinde la secuencia de ARN diana.
La expresión "quimera antisentido 2-5A", como se usa en el presente documento, se refiere a un oligonucleótido antisentido que contiene un resto de adenilato ligado en 2'-5' fosforilado en 5'. Estas quimeras se unen a ARN diana de una manera específica de secuencia y activan una ribonucleasa dependiente de 2-5A que, a su vez, escinde el ARN diana (Torrence et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1300; Silverman et al., 2000, Methods Enzymol., 313, 522-533; Player y Torrence, 1998, Pharmacol. Ther., 78, 55-113). Las moléculas quiméricas antisentido 2-5A pueden modificarse químicamente, por ejemplo, como se describe en la técnica.
La expresión "oligonucleótidos formadores de triples cadenas", como se usa en el presente documento, se refiere a un oligonucleótido que puede unirse a un ADN bicatenario de una manera específica de secuencia para formar una hélice tricatenaria. Se ha mostrado que la formación de dicha estructura de hélice triple inhibe la transcripción del gen diana (Duval-Valentin et al., 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 504; Fox, 2000, Curr. Med. Chem., 7, 17-37; Praseuth et. al., 2000, Biochim. Biophys. Acta, 1489, 181-206). Las moléculas oligonucleotídicas formadoras de triples cadenas de la invención pueden modificarse químicamente, por ejemplo, como se describe en la técnica.
La expresión "ARN señuelo", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ARN o aptámero que está diseñado para unirse preferentemente a un ligando predeterminado. Dicha unión puede dar lugar a la inhibición o activación de una molécula diana. El ARN señuelo o aptámero puede competir con una diana de unión de origen natural para la unión de un ligando específico. De forma análoga, a ARN señuelo puede estar diseñado para unirse a un receptor y bloquear la unión de una molécula efectora, o puede estar diseñado para unirse a un receptor de interés y evitar la interacción con el receptor. Las moléculas señuelo de la invención pueden modificarse químicamente, por ejemplo, como se describe en la técnica.
La expresión "ADN monocatenario" (ADNmc), como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido desoxirribonucleico de origen natural o sintético que comprende una única cadena lineal, por ejemplo, un ADNmc puede ser una secuencia génica con sentido o antisentido o EST (marcador de secuencia expresado).
El término "alozima", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico enzimático alostérica, incluyendo, por ejemplo, patentes de EE.UU. N.° 5,834,186; 5,741,679; 5,589,332; 5,871,914; y publicaciones PCT N.° WO 00/24931, WO 00/26226, WO 98/27104 y WO 99/29842.
El término "aptámero", como se usa en el presente documento, se entiende como una composición polinucleotídica que se une específicamente a una molécula diana, en donde el polinucleótido tiene una secuencia que difiere de una secuencia normalmente reconocida por la molécula diana en una célula. Como alternativa, un aptámero puede ser una molécula de ácido nucleico que se une a una molécula diana donde la molécula diana no se une de forma natural a un ácido nucleico. La molécula diana puede ser cualquier molécula de interés. Las moléculas de aptámeros de la invención pueden modificarse químicamente, por ejemplo, como se describe en la técnica.
Formulaciones de composiciones lipídicas
Para uso farmacéutico, las composiciones lipídicas de la invención pueden ser administradas por vías entéricas o parenterales, incluyendo administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica, de las vías respiratorias (aerosol), oral, intranasal, rectal, vaginal, bucal, nasofaríngea, gastrointestinal o sublingual. La administración puede ser sistémica (p. ej., IV) o local (p. ej. IM, SC, TD, intranasal, o tópica). La administración tópica puede implicar, por ejemplo, cateterización, implantación, bombeo osmótico, inyección directa, aplicación dérmica/transdérmica, endoprótesis vascular, gotas para los oídos/ojos o administración en la vena porta. Los compuestos de fórmula (I) deben evaluarse para determinar sus propiedades biofarmacéuticas, tales como solubilidad y estabilidad en solución (a través del pH), permeabilidad, etc., para seleccionar la forma de dosificación y vía de administración más apropiadas para el tratamiento de la indicación propuesta.
Las composiciones de la invención se administrarán en general, pero no necesariamente, como una formulación en asociación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. El término "excipiente" incluye cualquier ingrediente distinto del compuesto o los compuestos de la invención, el otro componente o componentes lipídicos y el agente biológicamente activo. Un excipiente puede transmitir una característica funcional (p. ej., control de la velocidad de liberación del fármaco) y/o no funcional (p. ej., ayuda de procesamiento o diluyente) a las formulaciones. La elección de excipiente dependerá en gran medida de factores tales como el modo particular de administración, el efecto del excipiente en la solubilidad y estabilidad, y la naturaleza de la forma de dosificación.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables habituales incluyen:
□ diluyentes, p. ej., lactosa, dextrosa, sacarosa, manitol, sorbitol, celulosa y/o glicina;
□ lubricantes, p. ej., sílice, talco, ácido esteárico, su sal de magnesio o calcio y/o polietilenglicol;
□ aglutinantes, p. ej., silicato de magnesio y aluminio, pasta de almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio y/o polivinilpirrolidona;
□ disgregantes, p. ej., almidones, goma de agar, ácido algínico o su sal de sodio, o mezclas efervescentes; y/o
□ absorbentes, colorantes, aromatizantes y/o edulcorantes.
El excipiente puede ser un vehículo de solución acuosa que puede contener opcionalmente un tampón (p. ej., un tampón de PBS) y/o un azúcar.
Se dispone de un análisis profundo de excipientes farmacéuticamente aceptables en Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy 2000, 20.a edición (ISBN: 0683306472).
Las composiciones de la invención se pueden administrar por vía oral. La administración oral puede implicar la deglución, de modo que el compuesto entre en el tracto gastrointestinal, y/o la administración bucal, lingual o sublingual mediante la cual el compuesto entra en el torrente sanguíneo directamente desde la boca.
Las composiciones de la invención se pueden administrar por vía parenteral. Los compuestos y composiciones de la invención se pueden administrar directamente en el torrente sanguíneo, en tejido subcutáneo, en el músculo o en un órgano interno. Los medios adecuados para administración incluyen intravenoso, intraarterial, intratecal, intraventricular, intrauretral, intraesternal, intracraneal, intramuscular, intrasinovial y subcutáneo. Los dispositivos adecuados para administración incluyen inyectores de aguja (incluyendo microaguja), inyectores sin aguja y técnicas de infusión.
Las formulaciones parenterales son normalmente soluciones acuosas u oleosas. Cuando la solución es acuosa, excipientes tales como azúcares (incluyendo, pero sin limitación, glucosa, manitol, sorbitol, etc.), sales, carbohidratos y agentes tamponantes (preferentemente a un pH de 3 a 9), pero, para algunas aplicaciones, pueden formularse más adecuadamente como una solución no acuosa estéril o como una forma seca para usar junto con un vehículo adecuado tal como agua estéril, sin pirógenos (WFI).
Las formulaciones parenterales pueden incluir implantes derivados de polímeros degradables tales como poliésteres (es decir, ácido poliláctico, polilactida, polilactida-co-glicólido, policaprolactona, polihidroxibutirato), poliortoésteres y polianhídridos. Estas formulaciones pueden administrarse mediante incisión quirúrgica en el tejido subcutáneo, tejido muscular o directamente en órganos específicos.
La preparación de formulaciones parenterales en condiciones estériles, por ejemplo, por liofilización, puede lograrse fácilmente usando técnicas farmacéuticas convencionales bien conocidas por el experto en la materia.
La solubilidad de los compuestos y las composiciones en la preparación de soluciones parenterales puede aumentarse mediante el uso de técnicas de formulación adecuadas, tales como la incorporación de codisolventes y/o agentes de mejora de la solubilidad tales como tensioactivos, estructuras de micelos y ciclodextrinas.
Las composiciones de la invención se pueden administrar por vía intranasal o por inhalación, normalmente en forma de un polvo seco (ya sea solo, como una mezcla, por ejemplo, en una mezcla seca con lactosa, o como una partícula de componentes mixtos, por ejemplo, mezclada con fosfolípidos, tales como fosfatidilcolina) a partir de un inhalador de polvo seco, como un pulverizador de aerosol de un recipiente presurizado, bomba, pulverizador, atomizador (preferentemente un atomizador que usa electrohidrodinámica para producir una bruma fina) o nebulizador, con o sin el uso de un propulsor adecuado, tal como 1,1,1,2-tetrafluoroetano o 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano, o como gotas nasales. Para uso intranasal, el polvo puede comprender un agente bioadhesivo, por ejemplo, quitosano o ciclodextrina.
El recipiente presurizado, bomba, pulverizador, atomizador o nebulizador contiene una solución o suspensión del compuesto o los compuestos de la invención que comprenden, por ejemplo, etanol, etanol acuoso o un agente alternativo adecuado para dispersar, solubilizar o extender la liberación de las composiciones de la invención, un propulsor o propulsores como disolvente y un tensioactivo opcional, tal como trioleato de sorbitano, ácido oleico o un ácido oligoláctico.
Antes de su uso en un polvo seco o formulación de suspensión, la composición se microniza a un tamaño adecuado para suministro por inhalación (normalmente menos de 5 micrómetros). Esto se puede lograr mediante cualquier método de trituración adecuado, tal como molienda a chorro en espiral, molienda a chorro de lecho fluido, procesamiento de líquido supercrítico para formar nanopartículas, homogeneización a alta presión o secado por pulverización.
Pueden formularse cápsulas (hechas, por ejemplo, de gelatina o hidroxipropilmetilcelulosa), blísteres y cartuchos para su uso en un inhalador o insuflador para contener una mezcla de polvo del compuesto o composición de la invención, una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón y un modificador del rendimiento tal como /-leucina, manitol o estearato de magnesio. La lactosa puede ser anhidra o en forma de monohidrato, preferentemente este último. Otros excipientes adecuados incluyen dextrano, glucosa, maltosa, sorbitol, xilitol, fructosa, sacarosa y trehalosa.
Las formulaciones para administración inhalada/intranasal pueden formularse para ser de liberación inmediata y/o modificada usando, por ejemplo, PGLA. Las formulaciones de liberación modificada incluyen liberación retardada, sostenida, por pulsos, controlada, dirigida y programada.
Formulaciones adecuadas para la aplicación transdérmica incluyen una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o composición de la invención con un vehículo. Los vehículos ventajosos incluyen disolventes absorbibles farmacológicamente aceptables para ayudar al paso a través de la piel del huésped. De manera característica, los dispositivos transdérmicos tienen la forma de un vendaje que comprende un miembro de respaldo, un depósito que contiene el compuesto opcionalmente con vehículos, opcionalmente una barrera de control de la velocidad para suministrar el compuesto a la piel del huésped a una velocidad controlada y predeterminada durante un período prolongado de tiempo y medios para fijar el dispositivo a la piel.
Las composiciones lipídicas de la invención se administran en cualquiera de varias maneras, incluyendo parenteral, intravenosa, sistémica, local, oral, intratumoral, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, por inhalación o cualquier método similar de suministro. En una realización, las composiciones se administran por vía parenteral, es decir, por vía intraarticular, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. En una realización específica, las composiciones de liposomas se administran por infusión intravenosa o por vía intraperitoneal mediante una inyección en embolada. Las composiciones lipídicas de la invención se pueden formular como composiciones farmacéuticas adecuadas para el suministro a un sujeto. Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenderán con frecuencia además uno o más tampones (p. ej., solución salina tamponada neutra o solución salina tamponada con fosfato), carbohidratos (p. ej., glucosa, manosa, sacarosa, dextrosa o dextranos), manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina, antioxidantes, bacteriostáticos, agentes quelantes tales como EDTA o glutatión, adyuvantes (p. ej., hidróxido de aluminio), solutos que hacen a la formulación isotónica, hipotónica o débilmente hipertónica con la sangre de un receptor, agentes de suspensión, agentes espesantes y/o conservantes. Como alternativa, las composiciones de la presente invención pueden formularse como un liofilizado.
Pueden encontrarse formulaciones adecuadas para su uso en la presente invención, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Filadelfia, Pa., 17a ed. (1985). Con frecuencia, las composiciones comprenderán una solución de las nanopartículas lipídicas suspendidas en un vehículo aceptable, tal como un vehículo acuoso.
En una realización, esta invención proporciona una composición farmacéutica (es decir, formulación) que comprende una composición lipídica de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. En otra realización, está presente al menos otro componente lipídico en la composición lipídica. En otra realización, la composición lipídica está en forma de un liposoma. En otra realización, la composición lipídica está en forma de una nanopartícula lipídica. En otra realización, la composición lipídica es adecuada para el suministro al hígado. En otra realización, la composición lipídica es adecuada para el suministro a un tumor. En otra realización, la composición lipídica es adecuada para aplicaciones de suministro local (ojo, oído, piel, pulmón); suministro al músculo (i.m.), grasa o células subcutáneas (dosificación s.c.). En otra realización, el agente biológicamente activo es un ARN o ADN.
Para fines de inmunización, una composición se preparará, en general, como un inyectable y se administrará mediante inyección (p. ej., mediante inyección intramuscular).
En el presente documento se divulga un dispositivo de suministro (p. ej., jeringa, nebulizador, pulverizador, inhalador, parche dérmico, etc.) que contiene una composición de la invención. Este dispositivo se puede usar para administrar una composición farmacéutica a un sujeto, por ejemplo, a un ser humano para inmunización.
Células y órganos a los que se dirige la invención
Los compuestos, composiciones y composiciones para uso de la invención o divulgación, y los métodos y usos de la divulgación, pueden usarse para suministrar un agente biológicamente activo a uno o más de los siguientes en un paciente:
el hígado o células hepáticas (p. ej., hepatocitos);
un riñón o células renales;
un tumor o células tumorales;
el SNC o células del SNC (sistema nervioso central, por ejemplo, cerebro y/o médula espinal);
el SNP o células del SNP (sistema nervioso periférico);
un pulmón o células pulmonares;
la vasculatura o células vasculares;
la piel o células cutáneas (p. ej., células de la dermis y/o células foliculares);
un ojo o células oculares (p. ej., mácula, fóvea, córnea, retina) y
un oído o células del oído (p. ej., células del oído interno, oído medio y/u oído externo).
Los compuestos, composiciones y composiciones para uso de la invención o la divulgación, y los métodos y usos de la divulgación, también pueden usarse para suministrar un agente biológicamente activo (p. ej., ARN que codifica un inmunógeno) a células del sistema inmunitario.
Los compuestos, composiciones, métodos y usos pueden ser para administrar un agente biológicamente activo a células hepáticas (p. ej., hepatocitos). Los compuestos, composiciones, métodos y usos pueden ser para suministrar un agente biológicamente activo a un tumor o células tumorales (p. ej., un tumor primario o células de cáncer metastásico). Los compuestos, composiciones, métodos y usos pueden ser para suministrar un agente biológicamente activo a la piel, tejido adiposo, músculo y ganglios linfáticos (es decir, dosificación sc).
Para el suministro de un agente biológicamente activo al hígado o a células hepáticas, una composición de la invención puede ponerse en contacto con el hígado o las células hepáticas del paciente como se conoce en general en la técnica, tal como mediante administración parenteral (p. ej., administración intravenosa, intramuscular, subcutánea) o administración local (p. ej., inyección directa, cateterización, endoprótesis), para facilitar el suministro.
Para el suministro de un agente biológicamente activo al riñón o a células renales, una composición de la invención puede ponerse en contacto con el riñón o las células renales del paciente como se conoce en general en la técnica, tal como mediante administración parenteral (p. ej., administración intravenosa, intramuscular, subcutánea) o administración local (p. ej., inyección directa, cateterización, endoprótesis), para facilitar el suministro.
Para el suministro de un agente biológicamente activo a un tumor o a células tumorales, una composición de la invención puede ponerse en contacto con el tumor o las células tumorales del paciente como se conoce en general en la técnica, tal como mediante administración parenteral (p. ej., administración intravenosa, intramuscular, subcutánea) o administración local (p. ej., inyección directa, cateterización, endoprótesis), para facilitar el suministro.
Para el suministro de un agente biológicamente activo al SNC o a células del SNC (p. ej., células del cerebro y/o células de la médula espinal), una composición de la invención puede ponerse en contacto con el SNC o las células del SNC (p. ej., células del cerebro y/o células de la médula espinal) del paciente como se conoce en general en la técnica, tal como mediante administración parenteral (p. ej., administración intravenosa, intramuscular, subcutánea) o administración local (p. ej., inyección directa, cateterización, endoprótesis, administración por bombeo osmótico (p. ej., intratecal o ventricular)), para facilitar el suministro.
Para el suministro de un agente biológicamente activo al SNP o a células del SNP, una composición de la invención puede ponerse en contacto con el SNP o las células del SNP del paciente como se conoce en general en la técnica, tal como mediante administración parenteral (p. ej., administración intravenosa, intramuscular, subcutánea) o administración local (p. ej., inyección directa), para facilitar el suministro.
Para el suministro de un agente biológicamente activo a un pulmón o a células pulmonares, una composición de la invención puede ponerse en contacto con el pulmón o las células pulmonares del paciente como se conoce en general en la técnica, tal como mediante administración parenteral (p. ej., administración intravenosa, intramuscular, subcutánea) o administración local (p. ej., administración por vía pulmonar directa a tejidos y células pulmonares), para facilitar el suministro.
Para el suministro de un agente biológicamente activo a la vasculatura o a células vasculares, una composición de la invención puede ponerse en contacto con la vasculatura o células vasculares del paciente como se conoce en general en la técnica, tal como mediante administración parenteral (p. ej., administración intravenosa, intramuscular, subcutánea) o administración local (p. ej., pinzamiento, cateterización, endoprótesis), para facilitar el suministro.
Para el suministro de un agente biológicamente activo a la piel o a células cutáneas (p. ej., células de la dermis y/o células foliculares), una composición de la invención puede ponerse en contacto con la piel o las células cutáneas (p. ej., células de la dermis y/o células foliculares) del paciente como se conoce en general en la técnica, tal como mediante administración parenteral (p. ej., administración intravenosa, intramuscular, subcutánea) o administración local (p. ej., aplicación dérmica directa, iontoforesis), para facilitar el suministro.
Para el suministro de un agente biológicamente activo a un ojo o a células oculares (p. ej., mácula, fóvea, córnea, retina),una composición de la invención puede ponerse en contacto con el ojo o las células oculares (p. ej., mácula, fóvea, córnea, retina) del paciente como se conoce en general en la técnica, tal como mediante administración parenteral (p. ej., administración intravenosa, intramuscular, subcutánea) o administración local (p. ej., inyección directa, inyección intraocular, inyección periocular, subretiniana, iontoforesis, uso de colirio, implantes), para facilitar el suministro.
Para el suministro de un agente biológicamente activo a un oído o células del oído (p. ej., células del oído interno, oído medio y/u oído externo), la composición de la invención puede ponerse en contacto con el oído o células del oído (p. ej., células del oído interno, oído medio y/u oído externo) del paciente como se conoce en general en la técnica, tal como mediante administración parenteral (p. ej., administración intravenosa, intramuscular, subcutánea) o administración local (p. ej., inyección directa), para facilitar el suministro.
Para el suministro de un agente biológicamente activo (p. ej., ARN que codifica un inmunógeno) a células del sistema inmunitario (p. ej., células presentadoras de antígenos, incluyendo células presentadoras de antígenos profesionales), una composición de la invención puede suministrarse por vía intramuscular, después de lo cual las células inmunitarias pueden infiltrarse en el sitio de suministro y procesar el ARN suministrado. Dichas células inmunitarias pueden incluir macrófagos (p. ej., macrófagos derivados de médula ósea), células dendríticas (p. ej., células dendríticas plasmacitoides derivadas de médula ósea y/o células dendríticas mieloides derivadas de médula ósea), monocitos (p. ej., monocitos de sangre periférica humana), etc. (p. ej., véase el documento WO2012/006372).
Inmunización de acuerdo con la invención
A efectos de inmunización, los compuestos, composiciones y composiciones para su uso de la invención o divulgación, y los métodos y usos de la divulgación, también pueden usarse para suministrar un ARN que codifica un inmunógeno. El inmunógeno induce una respuesta inmunitaria que reconoce el inmunógeno y, por tanto, puede usarse para proporcionar inmunidad contra un patógeno, o contra un alérgeno o contra un antígeno tumoral. Se prefiere la inmunización contra enfermedad y/o infección provocada por un patógeno.
El ARN puede suministrarse con una composición lipídica de la invención (p. ej., formulada como un liposoma o LNP). En algunas realizaciones, la invención utiliza liposomas dentro de los cuales se encapsula el ARN que codifica el inmunógeno. La encapsulación dentro de los liposomas puede proteger ARN de la digestión por RNasas. La eficacia de la encapsulación no tiene por qué ser del 100 %. Se acepta la presencia de moléculas de ARN externas (p. ej., en la superficie exterior del liposoma) o de moléculas de ARN "desnudas" (moléculas de ARN no asociadas a un liposoma). Preferentemente, para una composición que comprende liposomas y moléculas de ARN, al menos la mitad de las moléculas de ARN (p. ej., al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 % o al menos el 95 % de las moléculas de ARN) están encapsuladas en liposomas.
Las moléculas de ARN también pueden formar complejos con las LNP. Por ejemplo, no es necesario que el lípido forme solamente liposomas (con núcleo acuoso). Algunas nanopartículas lipídicas pueden comprender un núcleo lipídico (p. ej., la composición puede comprender una mezcla de liposomas y nanopartículas con un núcleo lipídico). En estos casos, las moléculas de ARN pueden encapsularse mediante las LNP que tienen un núcleo acuoso, y formar complejos con las LNP que tienen un núcleo lipídico mediante interacciones no covalentes (p. ej., interacciones iónicas entre el ARN cargado negativamente y el lípido catiónico). La encapsulación y la formación de complejos con las LNP (ya sea con un núcleo lipídico o acuoso) pueden proteger el ARN de la digestión por RNasas. La eficacia de la encapsulación/formación de complejos no tiene por qué ser del 100 %. Se acepta la presencia de moléculas de ARN "desnudas" (moléculas de ARN no asociadas a un liposoma). Preferentemente, para una composición que comprende una población de LNP y una población de moléculas de ARN, al menos la mitad de la población de moléculas de ARN (p. ej., al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, o al menos el 95 % de las moléculas de ARN) están bien encapsuladas en LNP o en forma de complejos con LNP.
Liposomas y LNP
Los liposomas suelen dividirse en tres grupos: vesículas multilamelares (MLV, por sus siglas en inglés), vesículas unilamelares pequeñas (SUV, por sus siglas en inglés) y vesículas unilamelares grandes (LUV, por sus siglas en inglés). Las MLV tienen múltiples bicapas en cada vesícula, formando varios compartimentos acuosos separados. Las SUV y las LUV tienen una única bicapa que encapsula un núcleo acuoso; las SUV suelen tener un diámetro <50 nm y las LUV tienen un diámetro > 50 nm. Para el suministro de ARN codificante de inmunógenos, el intervalo preferido de diámetros está en el intervalo de 60-180 nm, y más preferentemente en el intervalo de 80-160 nm.
La composición lipídica también puede ser LNP. La composición puede comprender una mezcla de nanopartículas que tienen un núcleo acuoso y nanopartículas que tienen un núcleo lipídico. Para el suministro de ARN codificante de inmunógenos, el intervalo preferido de diámetros está en el intervalo de 60-180 nm, y en realizaciones más particulares, en el intervalo de 80-160 nm.
Un liposoma o LNP puede formar parte de una composición que comprende una población de liposomas o LNP, y los liposomas o LNP dentro de la población pueden tener un intervalo de diámetros. Para una composición que comprende una población de liposomas o LNP con diferentes diámetros, se prefiere que (i) al menos el 80 % en número de los liposomas o LNP tengan diámetros en el intervalo de 60-180 nm, por ejemplo, en el intervalo de 80-160 nm, (ii) el diámetro medio (por intensidad, por ejemplo, promedio Z) de la población está idealmente en el intervalo de 60-180 nm, por ejemplo, en el intervalo de 80-160 nm; y/o (iii) los diámetros dentro de la pluralidad tienen un índice de polidispersidad < 0,2.
Para obtener liposomas o LNP con el uno o más diámetros deseados, la mezcla puede realizarse mediante un proceso en el que se combinan dos corrientes de alimentación de solución acuosa de ARN en una única zona de mezclado con una corriente de una solución etanólica de lípidos, todo ello al mismo caudal, por ejemplo, en un canal microfluídico.
Las mezclas útiles de lípidos, para formar composiciones lipídicas (p. ej., liposomas o LNP) para usos de inmunización, comprenden: un lípido de fórmula (I); colesterol; y un lípido PEGilado, tal como PEG-DMG, es decir, 1,2-dimiristoil-snglicero-3-fosfotanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)] conjugado con PEG). Esta mezcla también puede incluir un lípido zwitteriónico neutro, tal como DSPC (1,2-diastearoil-sn-glicero-3-fosfocolina) o DPyPE. Estas (y otras) mezclas se utilizan en los ejemplos.
En ciertas realizaciones, las composiciones lipídicas proporcionadas por la invención (tal como liposomas o LNP) tienen actividad adyuvante, es decir, en ausencia de un inmunógeno, tal como un antígeno proteico o un ácido nucleico (ADN o ARN), tal como un ácido nucleico que codifica dicho antígeno. Por lo tanto, los lípidos y la composición lipídica proporcionados por la invención pueden formularse con cualquier tipo de antígeno, por ejemplo, polipéptido, ácido nucleico, molécula pequeña, etc. Por tanto, en algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas por la invención pueden utilizarse en métodos para generar una respuesta inmunitaria a un inmunógeno, por ejemplo, administrando una composición que comprende un lípido o una composición lipídica proporcionados por la invención junto con un inmunógeno.
Moléculas de ARN
Después de la administración in vivo de una composición de inmunización, el ARN suministrado se libera y se traduce dentro de una célula para proporcionar el inmunógeno in situ. En ciertas realizaciones, el ARN es de cadena positiva ("+"), de modo que puede traducirse por células sin necesitar etapas de replicación intermedias tales como transcripción inversa. También se puede unir a receptores TLR7 expresados por células inmunitarias, iniciando de este modo un efecto adyuvante. Adicionalmente o como alternativa, el ARN puede unirse a otros receptores tales como RIG I, MDA5, o RIG I y MDA5.
En ciertas realizaciones, el ARN es un ARN autorreplicante. Una molécula de ARN autorreplicante (replicón) puede, cuando se suministra a una célula de vertebrado incluso sin ninguna proteína, da lugar a la producción de múltiples ARN descendientes mediante transcripción de sí misma (a través de una copia antisentido que genera a partir de sí misma). Una molécula de ARN autorreplicante es por tanto, en determinadas realizaciones, una molécula de cadena (+) que puede traducirse directamente después de su suministro a una célula, y esta traducción proporciona una ARN polimerasa dependiente de ARN que después produces transcritos tanto antisentido como con sentido a partir del ARN suministrado. Por tanto, el ARN suministrado da lugar a la producción de múltiples ARN descendientes. Estos ARN descendientes, así como transcritos subgenómicos colineales, pueden en sí traducirse para proporcionar expresión in situ de un inmunógeno codificado o pueden transcribirse para proporcionar transcritos adicionales con el mismo sentido que el ARN suministrado que se traducen para proporcionar expresión in situ del inmunógeno. El resultado general de esta secuencia de transcripciones es una amplificación enorme del número de los ARN de replicones introducidos y, por tanto, el inmunógeno codificado se convierte en un producto polipeptídico importante de las células hospedadoras.
Un sistema adecuado para lograr la autorreplicación es usar un replicón de ARN basado en alfavirus. Estos replicones de cadena (+) se traducen después del suministro a una célula para proporcionar una replicasa (o replicasa-transcriptasa). La replicasa se traduce como una poliproteína que se autoescinde para proporcionar un complejo de replicación que crea copias de cadenas (-) genómicas del ARN suministrado de cadena (+). Estos transcritos de cadena (-) pueden en sí transcribirse para proporcionar copias adicionales del ARN precursor de cadena y también para proporcionar un transcrito subgenómico que codifica el inmunógeno. La traducción del transcrito subgenómico da lugar de este modo a la expresión in situ del inmunógeno por la célula infectada. Los replicones de alfavirus adecuados pueden usar una replicasa de un virus sindbis, un virus del bosque de semliki, un virus de la encefalitis equina oriental, un virus de la encefalitis equina venezolana, etc. Secuencias de virus mutantes o de tipo silvestre, por ejemplo, el mutante TC83 atenuado de VEEV se ha usado en replicones.
Una molécula preferida de ARN autorreplicante codifica por tanto (i) una ARN polimerasa dependiente de ARN que puede transcribir ARN de molécula de ARN autorreplicante y (ii) un inmunógeno. La polimerasa puede ser una replicasa de alfavirus, por ejemplo, que comprende uno o más de las proteínas de alfavirus nsP1, nsP2, nsP3 y nsP4.
Mientras que los genomas naturales de alfavirus codifican proteínas estructurales de viriones además de la poliproteína replicasa no estructural, en determinadas realizaciones, una molécula de ARN autorreplicante de la invención no codifica proteínas estructurales de alfavirus. Por tanto, un ARN autorreplicante particular puede dar lugar a la producción de copias genómicas de ARN de sí mismo en una célula, pero no a la producción de viriones que contengan ARN. La incapacidad para producir estos viriones significa que, a diferencia de un alfavirus de tipo silvestre, la molécula de ARN autorreplicante no puede perpetuarse en sí misma en forma infecciosa. Las proteínas estructurales de alfavirus que son necesarias para perpetuación en virus de tipo silvestre están ausentes de ARN autorreplicantes de la invención y su lugar es tomado por uno o más genes que codifican el inmunógeno de interés, de modo que el transcrito subgenómico codifique el inmunógeno en lugar de las proteínas de viriones de alfavirus estructurales.
Por tanto, una molécula de ARN autorreplicante útil con la invención puede tener dos marcos de lectura abiertos. Un marco de lectura abierto codifica una replicasa, por ejemplo, el primer marco de lectura abierto (5'); el otro marco de lectura abierto codifica un inmunógeno, por ejemplo, el segundo marco de lectura abierto (3'). En algunas realizaciones, el ARN puede tener marcos de lectura abiertos (p. ej., cadena abajo) adicionales, p. ej., para codificar inmunógenos adicionales (véase a continuación) o para codificar polipéptidos accesorios.
Una molécula de ARN autorreplicante puede tener una secuencia 5' que es compatible con la replicasa codificada.
Las moléculas de ARN autorreplicantes pueden tener diversas longitudes, pero normalmente son de 5000-25000 nucleótidos de longitud, por ejemplo, 8000-15000 nucleótidos o 9000-12000 nucleótidos. Por tanto, el ARN es más largo que el observado en el suministro de ARNip o ARNm convencional. En algunas realizaciones, el ARN autorreplicante es mayor de aproximadamente 2000 nucleótidos, tal como mayor de aproximadamente: 9000,12000, 15000, 18000, 21000, 24000, o más nucleótidos de longitud
Una molécula de ARN puede tener una caperuza 5' (p. ej., una 7-metilguanosina). Esta caperuza puede mejorar la traducción in vivo del ARN.
El nucleótido 5' de una molécula de ARN útil con la invención puede tener un grupo 5' trifosfato. En un ARN protegido terminalmente con caperuza esto puede unirse con una 7-metilguanosina a través de un enlace de 5' a 5'. Un 5' trifosfato puede mejorar la unión de RIG-I y, por tanto, promover efectos adyuvantes.
Una molécula de ARN puede tener una cola de poli A 3'. También puede incluir una secuencia de reconocimiento de poli A polimerasa (p. ej., AAUAAA) cerca de su extremo 3'.
Una molécula de ARN útil con la invención para fines de inmunización normalmente será monocatenaria. Los ARN monocatenarios pueden iniciar en general un efecto adyuvante al unirse a TLR7, TLR8, ARN helicasas y/o PKR. El ARN suministrado en forma bicatenaria (ARNbc) puede unirse a TLR3 y este receptor también puede desencadenarse mediante ARNbc que se forma durante la replicación de un ARN monocatenario o dentro de la estructura secundaria de un ARN monocatenario.
Las moléculas de ARN para fines de inmunización pueden prepararse convenientemente mediante transcripción in vitro (IVT, por sus siglas en inglés). La IVT puede usar un molde (Ad Nc) creado y propagado en forma de plásmido en bacterias o creado de forma sintética (p. ej., mediante métodos de ingeniería de síntesis génica y/o reacción en cadena de la polimerasa (PCR)). Por ejemplo, una ARN polimerasa dependiente de ADN (tal como las ARN polimerasas de bacteriófagos T7, T3 o SP6) puede usarse para transcribir el ARN de un molde de ADN. Se pueden usar reacciones adecuadas de protección terminal con caperuza y adición de poli A según sea necesario (aunque el poli-A del replicón está habitualmente codificado dentro del molde de ADN). Estas ARN polimerasas pueden tener requisitos rigurosos para el uno o más nucleótidos 5' y, en algunas realizaciones, estos requisitos deben coincidir con los requisitos de la replicasa codificada, para garantizar que el ARN transcrito por IVT pueda actuar eficazmente como un sustrato para su replicasa autocodificada.
Como se analiza en el documento WO2011/005799, el ARN autorreplicante puede incluir (además de cualquier estructura de caperuza 5') uno o más nucleótidos que tienen una nucleobase modificada. Por ejemplo, un ARN autorreplicante puede incluir una o más nucleobases de pirimidina modificadas, tales como restos de pseudouridina y/o 5-metilcitosina. En algunas realizaciones, sin embargo, el ARN no incluye nucleobases modificadas y puede no incluir nucleótidos modificados, es decir, todos los nucleótidos en el ARN son ribonucleótidos A, C, G y U convencionales (excepto para cualquier estructura de caperuza 5', que puede incluir una metilguanosina 7'). En otras realizaciones, el ARN puede incluir una caperuza 5' que comprende una metilguanosina 7', y los primeros 1, 2 o 3 ribonucleótidos 5' pueden estar metilados en la posición 2' de la ribosa.
Un ARN usado con la invención para fines de inmunización incluye idealmente solo enlaces fosfodiéster entre nucleósidos, pero en algunas realizaciones puede contener enlaces de fosforamidato, fosforotioato y/o metilfosfonato.
La invención incluye realizaciones en las que se formulan múltiples especies de ARN con una composición lipídica proporcionada por la invención, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más especies de ARN, incluyendo diferentes clases de ARN (tal como ARNm, ARNip, ARN autorreplicantes y combinaciones de los mismos).
Inmunógenos
Las moléculas de ARN utilizadas con la invención para fines de inmunización, en algunas realizaciones, codifican un inmunógeno polipeptídico. En estas realizaciones, después de la administración, el ARN se traduce in vivo y el inmunógeno puede inducir una respuesta inmunitaria en el receptor. El inmunógeno puede inducir una respuesta inmunitaria contra un patógeno (p. ej., una bacteria, un virus, un hongo o un parásito) pero, en algunas realizaciones, puede inducir una respuesta inmunitaria contra un alérgeno o un antígeno tumoral. La respuesta inmunitaria puede comprender una respuesta de anticuerpo (que incluye habitualmente IgG) y/o una respuesta inmunitaria mediada por células. El inmunógeno polipeptídico inducirá normalmente una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido patógeno (o alérgeno o tumoral) correspondiente, pero en algunas realizaciones el polipéptido puede actuar como un mimótopo para inducir una respuesta inmunitaria que reconoce un sacárido. El inmunógeno será normalmente un polipéptido de superficie, por ejemplo, una adhesina, una hemaglutinina, una glucoproteína de envoltura, una glucoproteína espicular, etc.
La molécula de ARN puede codificar un único inmunógeno polipeptídico o múltiples polipéptidos. Múltiples inmunógenos pueden presentarse como un único inmunógeno polipeptídico (polipéptido de fusión) o como polipéptidos separados. Si los inmunógenos se expresan como polipéptidos separados de un replicón, entonces uno o más de estos puede estar provisto de un IRES cadena arriba o un elemento promotor vírico adicional. Como alternativa, múltiples inmunógenos pueden expresarse a partir de una poliproteína que codifica inmunógenos individuales fusionados con una proteasa autocatalítica corta (p. ej., proteína 2A del virus de la glosopeda) o como inteínas.
En ciertas realizaciones, se pueden utilizar inmunógenos polipeptídicos (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más inmunógenos), ya sea solos o junto con una molécula de ARN, tal como un ARN autorreplicante, que codifica uno o más inmunógenos (iguales o diferentes a los inmunógenos polipeptídicos).
En algunas realizaciones, el inmunógeno induce una respuesta inmunitaria contra una de estas bacterias:
Neisseria meningitidis: los inmunógenos útiles incluyen, pero sin limitación, proteínas de membrana tales como adhesinas, autotransportadores, toxinas, proteínas de adquisición de hierro y proteína de unión al factor H. Se desvela una combinación de tres polipéptidos útiles en Giuliani et al. (2006) Proc Natl Acad Sci U S A 103 (29): 10834-9.
Streptococcus pneumoniae: se desvelan inmunógenos polipeptídicos útiles en el documento WO2009/016515. Estos incluyen, pero sin limitación, la subunidad pilosa RrgB, el precursor de beta-N-acetil-hexosaminidasa (spr0057), spr0096, proteína de tensión general GSP-781 (spr2021, SP2216), serina/treonina cinasa StkP (SP1732) y adhesina de superficie neumocócica PsaA.
Streptococcus pyogenes: los inmunógenos útiles incluyen, pero sin limitación, los polipéptidos desvelados en los documentos WO02/34771 y WO2005/032582.
Moraxella catarrhalis.
Bordetellapertussis: Los inmunógenos tosferínicos útiles incluyen, pero sin limitación, toxina o toxoide tosferínico (PT), hemaglutinina filamentosa (FHA), pertactina y aglutinógenos 2 y 3.
Staphylococcus aureus: Los inmunógenos útiles incluyen, pero sin limitación, los polipéptidos desvelados en el documento WO2010/119343, tales como una hemolisina, esxA, esxB, proteína de unión a ferricromo (sta006) y/o la lipoproteína sta011.
Clostridium tetani: el inmunógeno habitual es el toxoide tetánico.
Cornynebacterium diphtheriae: el inmunógeno habitual es el toxoide diftérico.
Haemophilus influenzae: Los inmunógenos útiles incluyen, pero sin limitación, los polipéptidos desvelados en los documentos WO2006/110413 y WO2005/111066.
Pseudomonas aeruginosa
Streptococcus agalactiae: los inmunógenos útiles incluyen, pero sin limitación, los polipéptidos desvelados en el documento WO02/34771.
Chlamydia trachomatis: Los inmunógenos útiles incluyen, pero sin limitación, PepA, LcrE, ArtJ, DnaK, CT398, OmpH-like, L7/L12, OmcA, AtoS, CT547, Eno, HtrA y MurG (p. ej., como se desvela en el documento WO2005/002619). LcrE (documento WO2006/138004) y HtrA (documento WO2009/109860) son dos inmunógenos preferidos.
Chlamydia pneumoniae: Los inmunógenos útiles incluyen, pero sin limitación, los polipéptidos desvelados en el documento WO02/02606.
Helicobacter pylori: Los inmunógenos útiles incluyen, pero sin limitación, CagA, VacA, NAP y/o ureasa (documento WO03/018054).
Escherichia coli: Los inmunógenos útiles incluyen, pero sin limitación, inmunógenos procedentes de E. coli enterotoxígena (ETEC), E. Coli enteroagregante (EAggEC), E. coli de adherencia difusa (DAEC), E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli patógena extraintestinal (ExPEC) y/o E. coli enterohemorrágica (EHEC). Las cepas de ExPEC incluyen E.coli uropatógena (UPEC) y E.coli asociada a meningitis/septicemia (MNEC). Se desvelan inmunógenos UPEC en los documentos WO2006/091517 y WO2008/020330. Se desvelan inmunógenos MNEC útiles en el documento WO2006/089264. Un inmunógeno útil para varios tipos de E.coli es AcfD (documento WO2009/104092).
Bacillus anthracis
Yersinia pestis: Los inmunógenos útiles incluyen, pero sin limitación, los desvelados en los documentos WO2007/049155 y WO2009/031043.
Staphylococcus epidermis
Clostridium perfringens o Clostridium botulinums
Legionella pneumophila
Coxiella burnetii
Brucella, tal como B. abortus, B. canis, B. melitensis, B. neotomae, B. ovis, B. suis, B. pinnipediae.
Francisella, tal como F. novicida, F. philomiragia, F. tularensis.
Neisseria gonorrhoeae
Treponema pallidum
Haemophilus ducreyi
Enterococcus faecalis o Enterococcus faecium
Staphylococcus saprophyticus
Yersinia enterocolitica
Mycobacterium tuberculosis
Rickettsia
Listeria monocytogenes
Vibrio cholerae
Salmonella typhi
Borrelia burgdorferi
Porphyromonas gingivalis
Klebsiella
En algunas realizaciones, el inmunógeno induce una respuesta inmunitaria contra uno de estos virus:
Orthomyxovirus: Los inmunógenos útiles pueden ser de un virus de la gripe A, B o C, tal como las proteínas hemaglutinina, neuraminidasa o M2 de la matriz. Cuando el inmunógeno es una hemaglutinina del virus de la gripe A puede ser de cualquier subtipo, por ejemplo, H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 o H16.
Virus Paramyxoviridae: los inmunógenos incluyen, pero sin limitación, los obtenidos a partir de Pneumovirus (p. ej., virus respiratorio sincitial, RSV), Rubulavirus (p. ej., virus de las paperas), Paramyxovirus (p. ej., virus paragripal), Metapneumovirus y Morbillivirus (p. ej., virus del sarampión).
Poxviridae: los inmunógenos incluyen, pero sin limitación, los obtenidos a partir de Orthopoxvirus tales como viruela, incluyendo, pero sin limitación, viruela mayor y viruela menor.
Picornavirus: los inmunógenos incluyen, pero sin limitación, los obtenidos a partir de Picornavirus, tales como Enterovirus, Rhinovirus, Heparnavirus, Cardiovirus y Aphthovirus. En una realización, el enterovirus es un poliovirus, por ejemplo, un poliovirus de tipo 1, tipo 2 y/o tipo 3. En otra realización, el enterovirus es un enterovirus EV71. En otra realización, el enterovirus es un virus coxsackie A o B.
Bunyavirus: los inmunógenos incluyen, pero sin limitación, los obtenidos a partir de un Orthobunyavirus, tal como el virus de la encefalitis de California, un Phlebovirus, tal como el virus de la fiebre del valle del Rift o un Nairovirus, tal como el virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo.
Heparnavirus: los inmunógenos incluyen, pero sin limitación, los obtenidos a partir de un Heparnavirus, tal como el virus de la hepatitis A (VHA).
Filovirus: los inmunógenos incluyen, pero sin limitación, los obtenidos a partir de un filovirus, tal como un virus del Ébola (incluyendo un ebolavirus de Zaire, Costa de Marfil, Reston o Sudán) o un virus de Marburgo.
Togavirus: los inmunógenos incluyen, pero sin limitación, los obtenidos a partir de un Togavirus, tal como un Rubivirus, un Alphavirus o un Arterivirus. Esto incluye el virus de la rubéola.
Flavivirus: los inmunógenos incluyen, pero sin limitación, los obtenidos a partir de un Flavivirus, tal como el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBE), virus del Dengue (tipos 1,2, 3 o 4), virus de la fiebre amarilla, virus de la encefalitis japonesa, virus del bosque de Kyasanur, virus de la encefalitis del Nilo occidental, virus de la encefalitis de San Luis, virus de la encefalitis de primavera-verano rusa, virus de la encefalitis de Powassan. Pestivirus: los inmunógenos incluyen, pero sin limitación, los obtenidos a partir de un Pestivirus, tales como diarrea vírica bovina (BVDV), fiebre porcina clásica (CSFV) o enfermedad de la frontera (BDV).
Hepadnavirus: los inmunógenos incluyen, pero sin limitación, los obtenidos a partir de un Hepadnavirus, tal como el virus de la hepatitis B. Una composición puede incluir el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg).
Otros virus de hepatitis: Una composición puede incluir un inmunógeno de un virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis delta, virus de la hepatitis E o virus de la hepatitis G.
Rhabdovirus: los inmunógenos incluyen, pero sin limitación, los obtenidos a partir de un Rhabdovirus, tal como un Lyssavirus (p. ej., un virus de la rabia) y Vesiculovirus (VSV).
Caliciviridae: los inmunógenos incluyen, pero sin limitación, los obtenidos a partir de Calciviridae, tal como virus de Norwalk (Norovirus) y virus de tipo Norwalk, tales como virus de Hawaii y virus de Snow Mountain.
Coronavirus: los inmunógenos incluyen, pero sin limitación, los obtenidos a partir de un coronavirus de SARS, bronquitis infecciosa aviar (IBV), virus de la hepatitis de ratón (MHV) y virus de la gastroenteritis transmisible porcina (TGEV). El inmunógeno de coronavirus puede ser un polipéptido espicular.
Retrovirus: los inmunógenos incluyen, pero sin limitación, los obtenidos a partir de un Oncovirus, un Lentivirus (p. ej., HIV-1 o HIV-2) o un Spumavirus.
Reovirus: los inmunógenos incluyen, pero sin limitación, los obtenidos a partir de un Orthoreovirus, un Rotavirus, un Orbivirus o un Coltivirus.
Parvovirus: los inmunógenos incluyen, pero sin limitación, los obtenidos a partir de Parvovirus B19.
Herpesvirus: los inmunógenos incluyen, pero sin limitación, los obtenidos a partir de un herpesvirus humano, tales como, solo a modo de ejemplo, virus del Herpes simple (HSV) (p. ej., HSV de tipos 1 y 2), virus de varicela zóster (VZV), virus de Epstein-Barr virus (EBV), citomegalovirus (CMV), herpesvirus humano 6 (HHV6), herpesvirus humano 7 (HHV7) y herpesvirus humano 8 (HHV8).
Papovavirus: los inmunógenos incluyen, pero sin limitación, los obtenidos a partir de Papilomavirus y Poliomavirus. El papilomavirus (humano) puede ser del serotipo 1,2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 o 65, por ejemplo, de uno o más de los serotipos 6, 11, 16 y/o 18.
Adenovirus: los inmunógenos incluyen los obtenidos a partir del serotipo 36 (Ad-36).
En algunas realizaciones, el inmunógeno induce una respuesta inmunitaria contra un virus que infecta a peces, tal como: virus de la anemia infecciosa del salmón (ISAV), virus de la enfermedad pancreática del salmón (SPDV), virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV), virus del siluro del canal (CCV), virus de la enfermedad linfoquística de los peces (FLDV), virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV), herpesvirus de la carpa koi, virus de tipo picorna del salmón (también conocido como virus de tipo picorna del salmón atlántico), virus del salmón de interior (LSV), rotavirus del salmón atlántico (ASR), virus de las manchas de fresa de la trucha (TSD), virus tumoral del salmón plateado (CSTV) o virus de la septicemia hemorrágica vírica (VHSV).
Pueden obtenerse inmunógenos fúngicos de dermatófitos, incluyendo: Epidermophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporum distortum, Microsporum equinum, Microsporum gypsum, Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton megnini, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleini, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum var. album, var. discoides, var. ochraceum, Trichophyton violaceum y/o Trichophyton faviforme; o de Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus, Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guilliermondi, Cladosporium carrionii, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Microsporidia, Encephalitozoon spp., Septata intestinalis y Enterocytozoon bieneusi; los menos habituales son Brachiola spp, Microsporidium spp., Nosema spp., Pleistophora spp., Trachipleistophora spp., Vittaforma spp., Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Pythiumn insidiosum, Pityrosporum ovale, Sacharomyces cerevisae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces pombe, Scedosporium apiosperum, Sporothrix schenckii, Trichosporon beigelii, Toxoplasma gondii, Penicillium marneffei, Malassezia spp., Fonsecaea spp., Wangiella spp., Sporothrix spp., Basidiobolus spp., Conidiobolus spp., Rhizopus spp, Mucor spp, Absidia spp, Mortierella spp, Cunninghamella spp, Saksenaea spp., Alternaria spp, Curvularia spp, Helminthosporium spp, Fusarium spp, Aspergillus spp, Penicillium spp, Monolinia spp, Rhizoctonia spp, Paecilomyces spp, Pithomyces spp y Cladosporium spp.
En algunas realizaciones, el inmunógeno induce una respuesta inmunitaria contra un parásito del género Plasmodium, tal como P. falciparum, P. vivax, P. malariae o P. ovale. Por tanto, la invención se puede usar para inmunizar contra el paludismo. En algunas realizaciones, el inmunógeno induce una respuesta inmunitaria contra un parásito de la familia Caligidae, en particular los de los géneros Lepeophtheirus y Caligus, por ejemplo, piojos de mar tales como Lepeophtheirus salmonis o Caligus rogercresseyi.
En algunas realizaciones, el inmunógeno induce una respuesta inmunitaria contra: alérgenos de polen (alérgenos de polen de árboles, herbáceas, hierbas y céspedes); alérgenos de insectos o arácnidos (alérgenos inhalantes, de saliva y de veneno, p. ej., alérgenos de ácaros, cucarachas y mosquitos, alérgenos de veneno de himenópteros); alérgenos de pelo y caspa de animales (de, p. ej., perro, gato, caballo, rata, ratón, etc.); y alérgenos de alimentos (p. ej., una gliadina). Los alérgenos de polen importantes de árboles, hierbas y herbáceas son los que se originan de los órdenes taxonómicos de Fagales, Oleales, Pinales y platanáceas incluyendo, pero sin limitación, abedul (Betula), aliso (Alnus), avellano (Corylus), carpe (Carpinus) y olivo (Olea), cedro (Cryptomeria y Juniperus), plátano (Platanus), el orden de Poales incluyendo hierbas de los géneros Lolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis, Holcus, Phalaris, Secale y Sorghum, los órdenes de Asterales y Urticales incluyendo hierbas de los géneros Ambrosia, Artemisia y Parietaria. Otros alérgenos de inhalación importantes son los de ácaros del polvo domésticos del género Dermatophagoides y Euroglyphus, ácaros de los silos por ejemplo, Lepidoglyphys, Glycyphagus y Tyrophagus, los de cucarachas, mosquitos y pulgas, por ejemplo, Blatella, Periplaneta, Chironomus y Ctenocepphalides, y los de mamíferos tales como gato, perro y caballo, alérgenos de veneno incluyendo los que se originan de insectos picadores o mordedores tales como los del orden taxonómico de Hymenoptera incluyendo abejas (Apidae), avispas (Vespidea) y hormigas (Formicoidae).
En algunas realizaciones el inmunógeno es un antígeno tumoral seleccionado entre: (a) antígenos de cáncer de testículo tales como NY-ESO-1, SSX2, SCP1 así como polipéptidos de las familias RAGE, Ba Ge , GAGE y MAGE, por ejemplo, GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6 y MAGE-12 (que pueden usarse, por ejemplo, para abordar el melanoma, tumores de pulmón, cabeza y cuello, NSCLC, de mama, gastrointestinal y de vejiga; (b) antígenos mutados, por ejemplo, p53 (asociado con diversos tumores sólidos, por ejemplo, cáncer colorrectal, de pulmón, cabeza y cuello), p21/Ras (asociado con, por ejemplo, melanoma, cáncer pancreático y colorrectal), CDK4 (asociado con, por ejemplo, melanoma), MUM1 (asociado con, por ejemplo, melanoma), caspasa-8 (asociado con, por ejemplo, cáncer de cabeza y cuello), CIA 0205 (asociado con, por ejemplo, cáncer de vejiga), HLA-A2-R1701, beta catenina (asociado con, por ejemplo, melanoma), TCR (asociado con, por ejemplo, linfoma no hodgkiniano de linfocitos T), BCR-abl (asociado con, por ejemplo, leucemia mielógena crónica), triosafosfato isomerasa, KIA 0205, CDC-27 y LDLR-FUT; (c) antígenos sobreexpresados, por ejemplo, Galectina 4 (asociado con, por ejemplo, cáncer colorrectal), Galectina 9 (asociado con, por ejemplo, enfermedad de Hodgkin), proteinasa 3 (asociado con, por ejemplo, leucemia mielógena crónica), WT 1 (asociado con, por ejemplo, diversas leucemias), anhidrasa carbónica (asociado con, por ejemplo, cáncer renal), aldolasa A (asociado con, por ejemplo, cáncer de pulmón), PRAME (asociado con, por ejemplo, melanoma), HER-2/neu (asociado con, por ejemplo, cáncer de mama, colon, pulmón y ovario), mamaglobina, alfafetoproteína (asociado con, por ejemplo, hepatoma), KSA (asociado con, por ejemplo, cáncer colorrectal), gastrina (asociado con, por ejemplo, cáncer pancreático y gástrico), proteína catalítica de la telomerasa, MUC-1 (asociado con, por ejemplo, cáncer de mama y ovario), G-250 (asociado con, por ejemplo, carcinoma de células renales), p53 (asociado con, por ejemplo, cáncer de mama, colon) y antígeno carcinoembrionario (asociado con, por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de pulmón y cánceres del tracto gastrointestinal tales como cáncer colorrectal); (d) antígenos compartidos, por ejemplo, antígenos de diferenciación de melanoma-melanocitos tales como MART-1/Melan A, gp100, MC1R, receptor hormonal estimulante de melanocitos, tirosinasa, proteína 1 relacionada con la tirosinasa/TRP1 y proteína 2 relacionada con la tirosinasa/TRP2 (asociado con, por ejemplo, melanoma); (e) antígenos asociados a próstata tales como PAP, PSA, PSMA, PSH-P1, PSM-P1, PSM-P2, asociados con por ejemplo, cáncer de próstata; (f) idiotipos de inmunoglobulina (asociados con mieloma y linfomas de linfocitos B, por ejemplo). En determinadas realizaciones, los inmunógenos tumorales incluyen, pero sin limitación, p15, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antígenos del virus de Epstein Barr, EBNA, antígenos del papilomavirus humano (HPV), incluyendo E6 y E7, antígenos de virus de la hepatitis B y C, antígenos de virus linfotrópicos humanos de linfocitos T, TSP-180, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, mn-23H1, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17,1, NuMa, K-ras, p16, TAGE, PSCA, CT7, 43-9F, 5T4, 791 Tgp72, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27,29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (proteína de unión a Mac-2/proteína asociada a ciclofilina C), TAAL6, TAG72, TLP, TPS y similares.
Composiciones farmacéuticas
Una composición farmacéutica de la invención, particularmente una útil para inmunización, puede incluir uno o más inmunopotenciadores de moléculas pequeñas. Por ejemplo, la composición puede incluir un agonista de TLR2 (p. ej., Pam3CSK4), un agonista de TLR4 (p. ej., un glucosaminida fosfato de aminoalquilo, tal como E6020), un agonista de TLR7 (p. ej., imiquimod), un agonista de TLR8 (p. ej., resiquimod) y/o un agonista de TLR9 (p. ej., IC31). Cualquiera de dichos agonistas tiene idealmente un peso molecular de < 2000 Da. Dicho uno o más agonistas pueden estar encapsulados con el ARN dentro de liposomas, o encapsulados o en forma de complejos con LNP, pero en otras realizaciones están sin encapsular o sin formar complejos.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden tener una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, por ejemplo entre 240-360 mOsm/kg, o entre 290-310 mOsm/kg.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir uno o más conservantes, tal como tiomersal o el 2 fenoxietanol. Se pueden preparar composiciones sin mercurio y preparar vacunas sin conservantes.
Las composiciones comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de las composiciones lipídicas descritas en el presente documento (p. ej., liposomas y LNP), así como cualquier otro componente, según sea necesario. La cantidad inmunológicamente eficaz se refiere a la cantidad administrada a un individuo, ya sea en una dosis única o como parte de una serie, que es eficaz para el tratamiento (p. ej., la respuesta inmunitaria profiláctica contra un patógeno). Esta cantidad varía dependiendo del estado físico y de salud del individuo que se va a tratar, edad, el grupo taxonómico del individuo que se va a tratar (p. ej., primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo de sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación del médico a cargo del tratamiento de la situación médica y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad esté dentro de un intervalo relativamente amplio que se puede determinar a través de ensayos habituales. Las composiciones de la invención se expresarán generalmente en términos de cantidad de ARN por dosis. Una dosis preferida tiene <100 |jg de ARN (p. ej., 10-100 jg , tal como aproximadamente 10 jg , 25 jg , 50 jg , 75 jg o 100 jg), pero la expresión puede observarse a niveles mucho más bajos, p. ej., < 1 jg/dosis, < 100 ng/dosis, <10 ng/dosis, <1 ng/dosis, etc.
En el presente documento se divulga un dispositivo de suministro (p. ej., jeringa, nebulizador, pulverizador, inhalador, parche dérmico, etc.) que contiene una composición farmacéutica de la invención. Este dispositivo puede utilizarse para administrar la composición a un sujeto vertebrado.
Los liposomas o LNP de la invención no comprenden ribosomas.
Métodos de tratamiento y usos médicos
El cuarto aspecto de la invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria en un sujeto frente a un inmunógeno de interés en un vertebrado, que comprende administrar una cantidad inmunológicamente eficaz de la composición farmacéutica del tercer aspecto, en donde la composición comprende una molécula de ARN que codifica el inmunógeno.
Las composiciones farmacéuticas y de ARN formuladas en liposomas o LNP descritas en el presente documento son adecuadas para su uso in vivo para inducir una respuesta inmunitaria contra un inmunógeno de interés.
En el presente documento se describe un método para inducir una respuesta inmunitaria en un vertebrado que comprende la administración de una cantidad eficaz del ARN formulado en liposomas o LNP, o de la composición farmacéutica, como se describe en el presente documento. La respuesta inmunitaria es preferentemente protectora y preferentemente implica anticuerpos y/o inmunidad mediada por células. Las composiciones pueden utilizarse tanto para fines de cebado como de refuerzo. Como alternativa, un programa de inmunización de cebado y refuerzo puede ser una mezcla de ARN y el antígeno polipeptídico correspondiente (p. ej., cebado de ARN, refuerzo con proteínas).
En el presente documento se divulga un liposoma LNP, o composición farmacéutica para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria en un vertebrado.
En el presente documento se divulga el uso de un liposoma LNP, o composición farmacéutica en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmunitaria en un vertebrado.
Al inducir una respuesta inmunitaria en el vertebrado mediante estos usos y métodos, el vertebrado puede estar protegido contra diversas enfermedades y/o infecciones, por ejemplo, contra enfermedades bacterianas y/o víricas, como se ha analizado anteriormente. Los liposomas, las LNP y las composiciones son inmunogénicas, y son más preferentemente composiciones de vacuna. Las vacunas según la invención pueden ser profilácticas (es decir, para prevenir la infección) o terapéuticas (es decir, para tratar la infección), pero normalmente serán profilácticas.
El vertebrado es preferentemente un mamífero, tal como un ser humano o un gran mamífero veterinario (p. ej., caballos, vacas, ciervos, cabras, cerdos). Como se usa en el presente documento, "mamífero grande" se refiere a los mamíferos que tienen un peso típico o medio de adulto de al menos 5 kg, preferentemente de al menos 7 kg. Dichos mamíferos grandes pueden incluir, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, perros, cerdos, vacas, ciervos cabras, y se pretende excluir a los mamíferos pequeños, tal como los ratones, las ratas, las cobayas y otros roedores.
Cuando la vacuna es para uso profiláctico, el ser humano es preferentemente un niño (p. ej., un niño pequeño o un bebé) o un adolescente; cuando la vacuna es para uso terapéutico, el ser humano es preferentemente un adolescente o un adulto. Una vacuna destinada a los niños también puede administrarse a los adultos, por ejemplo, para evaluar la seguridad, dosis, inmunogenicidad, etc.
Las vacunas preparadas según la invención pueden utilizarse para tratar tanto a niños como a adultos. Por tanto, un paciente humano puede tener menos de 1 año, menos de 5 años, 1-5 años, 5-15 años, 15-55 años o al menos 55 años. Los pacientes preferidos para recibir las vacunas son los ancianos (p. ej., > 50 años, > 60 años y, preferentemente, > 65 años), los jóvenes (p. ej., < 5 años), los pacientes hospitalizados, los trabajadores sanitarios, el personal de las fuerzas armadas y militares, las mujeres embarazadas, los enfermos crónicos o los pacientes inmunodeficientes. Sin embargo, las vacunas no son adecuadas únicamente para estos grupos y pueden utilizarse de forma más general en una población. Las composiciones de la invención generalmente se administrarán directamente a un paciente. La administración directa puede llevarse a cabo mediante inyección parenteral (p. ej., subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, intradérmica o en el espacio intersticial de un tejido; la inyección intraglosal no suele utilizarse con fines de inmunización. Las vías de administración alternativas incluyen rectal, oral (p. ej., comprimidos, aerosoles), bucal, sublingual, vaginal, tópica, transdérmica o transcutánea, intranasal, ocular, aural, pulmonar u otra administración en las mucosas. La administración intradérmica e intramuscular son dos vías preferidas. La inyección puede realizarse mediante una aguja (p. ej., una aguja hipodérmica), pero también se puede utilizar la inyección sin aguja. Una dosis intramuscular típica es de 0.5 ml.
La invención puede utilizarse para inducir la inmunidad sistémica y/o de las mucosas, preferentemente para provocar una inmunidad sistémica y/o de las mucosas potenciada.
La dosificación puede ser mediante un esquema de dosis única o un esquema de dosis múltiple. Se pueden utilizar múltiples dosis en un esquema de inmunización primaria y/o en un esquema de inmunización de refuerzo.
En un esquema de dosis múltiples, las distintas dosis pueden administrarse por la misma vía o por vías diferentes, p. ej., un cebado parenteral y un refuerzo de la mucosa, un cebado de la mucosa y un refuerzo parenteral, etc. Las dosis múltiples se administrarán normalmente con un intervalo de al menos 1 semana (p. ej., aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.). En una realización, las dosis múltiples pueden administrarse aproximadamente 6 semanas, 10 semanas y 14 semanas después del nacimiento, por ejemplo, a una edad de 6 semanas, 10 semanas y 14 semanas, como se suele utilizar en el Programa Ampliado de Inmunización ("EPI, por sus siglas en inglés) de la Organización Mundial de la Salud. En una realización alternativa, se administran dos dosis primarias con un intervalo de dos meses, por ejemplo, con un intervalo de 7, 8 o 9 semanas, seguidas de una o más dosis de refuerzo entre 6 meses y 1 año después de la segunda dosis primaria, por ejemplo, 6, 8, 10 o 12 meses después de la segunda dosis primaria. En una realización adicional, se administran dos dosis primarias con un intervalo de dos meses, por ejemplo, con un intervalo de 7, 8 o 9 semanas, seguidas de una o más dosis de refuerzo entre 6 meses y 1 año después de la segunda dosis primaria, por ejemplo, 6, 8, 10 o 12 meses después de la segunda dosis primaria.
EJEMPLOS - Los ejemplos señalados con * quedan fuera del alcance de la invención
Lípidos catiónicos de Fórmula (I)
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar la invención y no deben interpretarse como limitaciones de la misma. Las temperaturas se indican en grados centígrados. Si no se menciona lo contrario, todas las concentraciones evaporativas se realizan a presión reducida, preferentemente entre aproximadamente 15 mm de Hg y 100 mm de Hg (= 20-133 mbar). La estructura de los productos finales, compuestos intermedios y materiales de partida se confirma mediante métodos analíticos convencionales, por ejemplo, microanálisis y características espectroscópicas, por ejemplo, MS, IR o RMN. Las abreviaturas utilizadas son las convencionales en la técnica, algunas de las cuales se definen a continuación.
La purificación en columna ultrarrápida se realiza preferentemente sobre gel de sílice usando un eluyente apropiado de composición isocrática o en gradiente.
El análisis por HPLC se realiza sobre una columna Waters Atlantis dC18 (4.6 x 150 mm, 3 mm), con elución en gradiente (acetonitrilo del 0 % al 95 % en agua modificado con ácido trifluoroacético al 0.1 % v/v durante 20 min y un caudal de 1.4 ml/min), a menos que se describa de otro modo.
Los espectros de 1H RMN se registraron en un espectrómetro Bruker Avance II 400 MHz. Todos los desplazamientos químicos se indican en partes por millón (5) con respecto a tetrametilsilano. Se utilizan las siguientes abreviaturas para indicar los patrones de señal: s = singlete, d = doblete, t = triplete, c = cuadruplete, m = multiplete, a = ancho. Los datos de ES-MS se registraron usando un espectrómetro de masas Waters LTC Premier con una fuente de ionización por electronebulización dual en un cromatógrafo de líquidos Agilent 1100. Se utilizó sulfadimetoxina [Sigma, m/z = 311.0814 (M 1)] como referencia adquirida a través del canal LockSpray™ cada tres barridos. Se ha comprobado que la precisión de masa del sistema es de < 5 ppm.
Abreviaturas:
AcOH
ácido acético
Ac.
acuoso
Ar
arilo
Atm
atmósfera
BOC
Carbonato de ferc-butilo
s.a., sa
singlete ancho
°C
Centígrados
CD2Cl2
diclorometano deuterado
CDCla
cloroformo deuterado
CH2Cl2, DCM
diclorometano
CHaCN, MeCN
acetonitrilo
d
doblete
dd
doblete de dobletes
ddd
doblete de dobletes de dobletes
DIPEA
N-etildiisopropilamina
DME
1,4-dimetoxietano
DMF
N,N-dimetilformamida
DMAP
dimetil aminopiridina
DMSO
dimetilsulfóxido
dt
doblete de tripletes
EDC
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
EtOAc
acetato de etilo
EtOH
etanol
FCC
cromatografía en columna ultrarrápida
G
calibre
h
hora
HBTU
hexafluorofosfato de (2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio HCl
ácido clorhídrico
HMPA
hexametilfosforamida
HPLC
cromatografía líquida de alta resolución
HT
de gran capacidad
IBX
Ácido 2-yodoxibenzoico /-PrOH
Alcohol isopropílico
H2O
agua
K
kelvin
KOH
hidróxido de potasio
LC
cromatografía líquida
M
molar
m
multiplete, masa
MeOH
metanol
MgSO4
sulfato de magnesio
MHz
megahercios
ml
Mililitros
mm
milímetro
mmol
milimol
min.
minuto
ARNm
ácido ribonucleico mensajero MS
espectroscopia de masas mo
microondas
NaH
hidruro de sodio
NaHMDS
hexametildisilazano de sodio NaOEt
etóxido de sodio
NaOH
hidróxido de sodio
Na2SO4
sulfato de sodio
NEta
trietilamina
ng
nanogramos
NH3
amoniaco
RMN
resonancia magnética nuclear quint.
quintuplete
Pd/C
paladio sobre carbono
ppt
precipitado
mfr
matraz de fondo redondo Fr
Factor de retraso
ta
temperatura ambiente
Tr
Tiempo de retención
s
singlete
sat.
saturado
ARNip
ácido ribonucleico interferente pequeño MP
material de partida
t
triplete
TFA
ácido trifluoroacético
THF
tetrahidrofurano
TLC
cromatografía de capa fina
UPLC
cromatografía líquida de ultra rendimiento p
peso
Hg
microgramos
Hl
microlitros
IBX
ácido 2-yodobenzoico
PMA
ácido fosfomolíbdico
PPTS
p-toluenosulfonato de piridinio TBDPS
ferc-butil difenil sililo
TBDPSCI
cloruro de ferc-butil difenil sililo
TBS
ferc-butil sililo
Todos los compuestos se nombran usando AutoNom.
Especificidad de LC:
Método de LC 1: Los tiempos de retención (Tr) se obtuvieron en un sistema Waters Acquity SDS con una columna Acquity BEH 1.7 |jm 2.1 x 50 mm. Se aplicó un gradiente de H2O (+ácido fórmico al 0.1 %)/CH3Cn (+ácido fórmico al 0.1 %) de 60/40 a 0.1/99.9 durante 1.4 min, después se mantuvo durante 0.6 min (1.0 ml/min como flujo de disolvente) con una temperatura del horno de 50 °C.
Método de LC 2: Los tiempos de retención (Tr) se obtuvieron en un sistema Waters Acquity SDS con una columna Acquity BEH 1.7 jm 2.1 x 50 mm. Se aplicó un gradiente de H2O (+ácido fórmico al 0.1 %)/CHsCn (+ácido fórmico al 0.1 %) de 60/40 a 0.1/99.9 durante 3.4 min, después se mantuvo durante 1.6 min (1.0 ml/min como flujo de disolvente) con una temperatura del horno de 50 °C.
Método de LC 3: Los tiempos de retención (Tr) se obtuvieron en un sistema Agilent 1100 con una columna Inertsil C8, 3.0 jm , 3.0 x 30 mm. Se aplicó un gradiente de H2O (+ácido fórmico al 0.1 %)/CH3CN (+ácido fórmico al 0.1 %) de 60/40 a 5/95 durante 1.0 min, después se mantuvo durante 1.0 min (2.0 ml/min como flujo de disolvente) con una temperatura del horno de 50 °C.
Método de LC 4: Los tiempos de retención (Tr) se obtuvieron en un sistema Waters Acquity SDS con una columna Acquity BEH 1.7 jm 2.1 x 50 mm. Se aplicó un gradiente de H2O (+ácido fórmico al 0.1 %)/CHsCn (+ácido fórmico al 0.1 %) de 45/55 a 0/100 durante 2.0 min, después se mantuvo durante 3.0 min (1.0 ml/min como flujo de disolvente) con una temperatura del horno de 50 °C.
Método de LC 5: Los tiempos de retención (Tr) se obtuvieron en un sistema Waters Acquity SDS con una columna Acquity BEH 1.7 jm 2.1 x 50 mm. Se aplicó un gradiente de H2O (+ácido fórmico al 0.1 %)/CHsCn (+ácido fórmico al 0.1 %) de 45/55 a 0/100 durante 1.0 min, después se mantuvo durante 1.0 min (1.0 ml/min como flujo de disolvente) con una temperatura del horno de 50 °C.
Método de LC 6: Los tiempos de retención (Tr) se obtuvieron en un sistema Agilent 1100 en una columna Inertsil C8, 3.0 jm , 3.0 x 30 mm. Se aplicó un gradiente de H2O (+ácido fórmico al 0.1 %)/CH3CN (+ácido fórmico al 0.1 %) de 60/40 a 5/95 durante 1.0 min, después se mantuvo durante 1.0 min (2.0 ml/min como flujo de disolvente) con una temperatura del horno de 50 °C.
Método de LC 7: Los tiempos de retención (Tr) se obtuvieron en un sistema Agilent 1100 con una columna XBridge C8, 3.0 jm , 3.0 x 30 mm. Se aplicó un gradiente de H2O (+ácido fórmico al 0.1 %)/CH3CN (+ácido fórmico al 0.1 %) de 60/40 a 5/95 durante 1.0 min, después se mantuvo durante 1.0 min (2.0 ml/min como flujo de disolvente) con una temperatura del horno de 50 °C.
Método de LC 8: Los tiempos de retención (Tr) se obtuvieron en un sistema Agilent 1100 con una columna XBridge C8, 3.0 jm , 3.0 x 30 mm. Se aplicó un gradiente de H2O (+ formiato de amonio 5 mM, ACN al 2 %)/CH3CN de 60/40 a 5/95 durante 1.0 min, después se mantuvo durante 1.0 min (2.0 ml/min como flujo de disolvente) con una temperatura del horno de 50 °C.
Método de LC 9: Los tiempos de retención (Tr) se obtuvieron en un sistema Agilent 1100 con una columna Atlantis C18, 3.5 jm , 3.0 x 30 mm. Se aplicó un gradiente de H2O (+ácido trifluoroacético al 0.05 %)/CH3CN de 60/40 a 2/98 durante 1.7 min, después se mantuvo durante 0.3 min (2.0 ml/min como flujo de disolvente) y después se cambió a 60/40 durante 0.1 min con una temperatura del horno de 40 °C.
Método de LC 10: Los tiempos de retención (Tr) se obtuvieron en un sistema Agilent 1100 con una columna XBridge C18, 3.5 jm , 2.1 x 50 mm. Se aplicó un gradiente de H2O (+ácido fórmico al 0.1 %)/CH3CN de 95/5 a 5/95 durante 1.7 min, después se mantuvo durante 0.2 min (2.0 ml/min como flujo de disolvente) y después se cambió a 95/5 durante 0.1 min con una temperatura del horno de 40 °C.
Método de LC 11: Los tiempos de retención (Tr) se obtuvieron en un sistema Agilent 1100 con una columna XBridge C18, 3.5 |jm, 2.1 x 50 mm. Se aplicó un gradiente de H2O (+ácido fórmico al 0.1 %)/CH3CN de 95/5 a 5/95 durante 1.7 min, después se mantuvo durante 0.2 min (2.0 ml/min como flujo de disolvente) y después se cambió a 95/5 durante 0.1 min con una temperatura del horno de 40 °C.
Método 12 de LC: Los tiempos de retención (Tr) se obtuvieron en un sistema Waters Acquity SDS con una columna Acquity BEH C18 1,7 jm 2,1 x 50 mm. Se aplicó un gradiente de H2O (+ácido fórmico al 0.1 %)/CH3CN (+ácido fórmico al 0.1 %) de 45/55 a 1/99 durante 1.4 min, después se aplicó un gradiente de 1/99 a 0/100 durante 3.7 min (1.0 ml/min como flujo de disolvente) con una temperatura del horno de 50 °C.
Método 13 de LC: Los tiempos de retención (Tr) se obtuvieron en un sistema Waters Acquity SDS con una columna Acquity BEH 1,7 jm 2,1 x 50 mm. Se aplicó un gradiente de H2O (+ácido fórmico al 0,1 %)/CH3CN (+ácido fórmico al 0,1 %) de 60/40 a 2/98 durante 3,4 min, después se mantuvo durante 1,7 min (1,0 ml/min. como flujo de disolvente) con una temperatura del horno de 50 °C.
Método 14 de LC: Los tiempos de retención (Tr) se obtuvieron en un sistema Waters Acquity SDS con una columna Acquity BEH 1,7 jm 2,1 x 50 mm. Se aplicó un gradiente de H2O (+ácido fórmico al 0.1 %)/CH3CN (+ácido fórmico al 0.1 %) de 45/55 a 1/99 durante 0.7 min, después se mantuvo durante 1.3 min (1.0 ml/min como flujo de disolvente) con una temperatura del horno de 50 °C.
Síntesis del Ejemplo 1: dioctanoato de 2-(10-dodecil-3-etil-8,14-dioxo-7,9,13-trioxa-3-azaoctadecan-18-il)propano-1,3-diílo
Intermedio 1a: metanosulfonato de 5-(benciloxi)pentilo
Figure imgf000071_0001
Se añadió Et3N (10.79 ml, 78 mmol) en una porción mediante una jeringa a una solución de 5-Benciloxi-1-pentanol (10.08 g, 51.9 mmol) en DCM (75 ml) en un matraz de fondo redondo cargado con una barra de agitación magnética a 0 °C en atmósfera de N2. Después, se añadió MsCI (4.85 ml, 62.3 mmol) gota a gota mediante una jeringa en 4 porciones separadas a una velocidad tal que la temperatura interna no superara los 15 °C. Se dejó que la reacción continuara en agitación durante 1 hora, después de lo cual se diluyó con H2O (200 ml) y DCM (150 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se lavó con d Cm (225 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (200 ml), se secaron con Na2SO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida para proporcionar el compuesto del título en forma de un aceite en bruto de color naranja (14.46 g, 99 %). MS (M 1) = 272.9, Tr = 1.33 min (método 10 de LC).
Intermedio 1b: 2-(5-(benciloxi)pentil)malonato de dietilo
Figure imgf000071_0002
A una solución enfriada a 0 °C de malonato de dietilo (7.5 g, 46.8 mmol) en DMF seca (100 ml) en atmósfera de N2 se le añadió NaH al 60 % (2.23 g, 56.2 mmol) en porciones durante 10 min. Se observó el desprendimiento de gas. La mezcla se agitó a 0 °C durante 30 min y después se añadió el Intermedio 1a (14.46 g, 51.5 mmol) en DMF seca (41 ml) gota a gota durante 10 min seguido de yoduro de tetrabutilamonio (1.73 g, 4.68 mmol). Después, la mezcla se calentó a 100 °C durante 1.5 h. La mezcla se enfrió a ta y se dejó durante una noche. Después, la mezcla se inactivó con NH4Cl sat. (50 ml) y se diluyó con H2O (100 ml). La mezcla se extrajo con EtOAc (2 x 200 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con H2O (100 ml) y salmuera (100 ml), se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron al vacío. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con EtOAc al 0-30 %/heptano para proporcionar el compuesto del título en forma de un aceite (11.7 g, 74 %). MS (M 1) = 336.6, Tr = 1.64 min (método 10 de Lc ).
Intermedio 1c: 2-(5-(benciloxi)pentil)propano-1,3-diol
Figure imgf000071_0003
A una solución enfriada a 0 °C del Intermedio 1b (5.5 g, 16.35 mmol) en THF seco (20 ml) en atmósfera de N2 se le añadió LiAlH42.0 M en THF (24.52 ml, 49.0 mmol) gota a gota durante 15 min. La mezcla se dejó calentar a ta y se agitó durante una noche. La mezcla se enfrió a 0 °C, se trató de nuevo con LiAl H42.0 M en THF (16.35 ml, 32.7 mmol), se dejó calentar a ta y se agitó durante el fin de semana. La reacción se enfrió a 0 °C y se interrumpió con EtOAc (9.30 ml) gota a gota durante 10 min. Después, la mezcla se trató con H2O (3.10 ml) gota a gota, con una solución de NaOH al 15 % (3.10 ml) gota a gota y después con más cantidad de H2O (9.30) gota a gota. La mezcla se agitó durante 30 min a ta. La mezcla se filtró a través de una capa de Celite. El Celite se lavó con EtOAc. El filtrado se concentró a presión reducida para proporcionar el compuesto del título en forma de un sólido semiceroso (1.52 g, 37 %). MS (M 1) = 253.0, Tr = 1.37 min (método 10 de LC).
Intermedio 1d: dioctanoato de 2-(5-(benciloxi)pentil)propano-1,3-diílo
Figure imgf000072_0001
Se añadió piridina (1.21 ml, 14.96 mmol) gota a gota mediante una jeringa durante -30 segundos a una solución del Intermedio 1c (1.51 g, 5.98 mmol) en DCM (20 ml) en un matraz de fondo redondo cargado con una barra de agitación magnética a 0 °C en atmósfera de N2. Después, se añadió gota a gota cloruro de octanoílo (2.145 ml, 12.57 mmol) mediante una jeringa durante varios minutos y la reacción se dejó calentar a ta y se agitó durante una noche. La mezcla se diluyó con NH4Cl sat. (100 ml) y CH2O 2 (100 ml). La capa orgánica se separó. La capa acuosa se extrajo con CH2O 2 (100 ml). Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El material en bruto se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con EtOAc al 0-10 %/heptano para proporcionar el compuesto del título en forma de un aceite incoloro (2.88 g, 95 %). MS (M 1) = 505.6, Tr = 1.77 min (método 1 de LC).
Intermedio 1e: dioctanoato de 2-(5-hidroxipentil)propano-1,3-diílo
Figure imgf000072_0002
A una solución del Intermedio 1d (2.5 g, 4.95 mmol) en MeOH (25 ml) a ta se le añadió Pd al 10 %/C, tipo degussa húmedo (264 mg). La mezcla se agitó en un globo de H2 durante una noche. La mezcla de reacción en bruto se filtró a través de una capa de celite y el filtrado se concentró a presión reducida para proporcionar el compuesto del título en forma de un aceite incoloro (2.0 g, 97 %). 1H RMN (400 MHz, CD2O 2) 84,11 - 3,96 (m, 4H), 3,59 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 2,28 (t, J = 7,5 Hz, 4H), 2,04 - 1,91 (m, 1H), 1,66 - 1,48 (m, 7H), 1,41 - 1,34 (m, 6H), 1,34 - 1,20 (m, 16H), 0,88 (t, J = 6,8 Hz, 6H).
Intermedio 1f: ácido 7-(octanoiloxi)-6-((octanoiloxi)metil)heptanoico
Figure imgf000072_0003
Se añadió TEMPO (0.151 g, 0.965 mmol) en una porción al Intermedio 1e (2.0 g, 4.82 mmol) en MeCN:H2O (46.84 ml, proporción 1:1) en un vial cargado con una barra de agitación magnética a ta. Después, se añadió diacetato de yodobenceno (3.42 g, 10.61 mmol) en una porción y se dejó que la reacción continuara en agitación a ta durante una noche, después de lo cual la reacción se interrumpió con tiosulfato sódico acuoso al 15 % (50 ml). La reacción se diluyó con H2O y se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron con Na2SO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida para proporcionar un aceite de color amarillo pálido. El aceite se disolvió en tolueno (15 ml) y se concentró a presión reducida (x 6) para proporcionar un aceite de color amarillo pálido, que se disolvió en DCM y se concentró a presión reducida (x 3) para proporcionar el compuesto del título (más impurezas aromáticas menores que podrían corresponder al tolueno o al yodobenceno residuales) en forma de un aceite de color amarillo pálido (2.0 g, 97 %). MS (M-1) = 427.2, Tr = 1.73 min (método 9 de LC).
Intermedio 1g: 3-((terc-butildimetilsilil)oxi)propanal
En un matraz de fondo redondo de 1 l con una barra de agitación, se disolvió terc-butildimetilsililoxipropanol (20 g, 105 mmol) en DCM (500 ml). Se añadió Et3N (43.9 ml, 315 mmol). En un segundo matraz de 500 ml equipado con una barra de agitación, se disolvió SO3-Py (25.08 g, 158 mmol) en DMSO (100 ml, 1409 mmol). La solución resultante se añadió gota a gota a la solución de alcohol a 0 °C (en un baño de hielo-agua). La reacción se agitó mientras se calentaba a ta durante el fin de semana. A la mezcla se le añadieron agua y DCM en un embudo de decantación. Después, los extractos orgánicos se lavaron con agua, se extrajeron en DCM, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron (frío) a presión reducida para dar la mezcla del producto en bruto. La purificación por cromatografía en columna sobre gel de sílice (columna de 330 g, DCM al 100 %) proporcionó el compuesto del título (17.7 g, 89 %). 1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 9,81 (t, J = 2,1 Hz, 1H), 3,99 (t, J = 6,0 Hz, 2H), 2,61 (td, J = 6,0, 2,3 Hz, 2H), 0,88 (s, 9H), 0,07 (s, 6H).
Intermedio 1h: 1-((terc-butMdimetMsiNl)oxi)pentadecan-3-ol
Figure imgf000073_0001
En un matraz de fondo redondo de 500 ml, el Intermedio 1g (17.7 g, 94 mmol) se disolvió en THF (100 ml) y se enfrió a 0 °C en un baño de hielo-agua. Después, se añadió bromuro de dodecilmagnesio, 1 M en éter dietílico (132 ml, 132 mmol) al aldehído gota a gota durante 10 min mediante una pipeta, el baño de hielo se retiró y la reacción se agitó a ta durante 30 min. El matraz de reacción se enfrió de nuevo a 0 °C en un baño de hielo. Se añadió lentamente una sol. sat. de NH4Cl para ajustar a pH ~7 (600 ml) y la mezcla se vertió en un embudo de decantación de 1 l. Después, los extractos orgánicos se lavaron con una solución sat. de cloruro de amonio, se extrajeron en EtOAc, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida para dar la mezcla del producto en bruto. La purificación por cromatografía en columna sobre gel de sílice (columna de 330 g, Heptanos al 100 % para 2 volúmenes de columna, EtOAc del 0 % al 2 %/Heptano para 1 volumen de columna, EtOAc al 2 %/Heptano para 3 volúmenes de columna, EtOAc del 2 % al 5 %/Heptano para 1 volumen de columna, y después EtOAc al 5 %/Heptano para 10 volúmenes de columna) proporcionó el compuesto del título (24.9 g, 74 %). 1H RMN (400 MHz, CDCla) 53,97 - 3,87 (m, 1H), 3,87-3,77 (m, 2H), 1,69- 1,60 (m, 2H), 1,57- 1,36 (m, 3H), 1,36 - 1,19 (a, 19H), 0,93 - 0,84 (m, 12H), 0,09 (s, 6H).
Intermedio 1i: (4-nitrofenil)carbonato de 1-((terc-butildimetilsilil)oxi)pentadecan-3-ilo
Figure imgf000073_0002
Se añadió carbonocloridato de 4-nitrofenilo (2.084 g, 9.92 mmol) en una porción a una solución del Intermedio 1h (2.9660 g, 8.27 mmol) en DCM (28 ml) en un matraz de fondo redondo cargado con una barra de agitación magnética a ta. La reacción se ajustó con un tapón y se puso en atmósfera de N2 , después de lo cual se añadió piridina (1.003 ml, 12.40 mmol) gota a gota mediante una jeringa durante varios minutos. La reacción se dejó en agitación a ta durante una noche. Después de un tiempo de reacción de 24 horas, la reacción se diluyó con H2O (100 ml) y DCM (125 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se lavó con DCM (125 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron con Na2SO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida para proporcionar un residuo de color blanquecino. El residuo en bruto se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (columna de 80 g, carga líquida, EtOAc al 0-2.5 %:heptano) para proporcionar 3.144 g (73 %) del compuesto del título (más picos de impurezas minoritarias no identificadas) en forma de un aceite incoloro. 1H RMN (400 MHz, CD2O 2) 58,29 - 8,24 (m, 2H), 7,41 - 7,35 (m, 2H), 5,03 - 4,95 (m, 1H), 3,73 (dd, J = 6,6, 5,7 Hz, 2H), 1,95- 1,80 (m, 2H), 1,80 - 1,63 (m, 2H), 1,45 - 1,19 (m, 20H), 0,92 - 0,83 (m, 12H), 0,06 (s, 6H).
Intermedio 1j: (3-(dietilamino)propil)carbonato de 1-((terc-butildimetilsilil)oxi)pentadecan-3-ilo
Figure imgf000074_0001
Se añadió 3-(dietilamino)propan-1-ol (3.48 ml, 22.26 mmol) gota a gota mediante una jeringa durante unos minutos al Intermedio 1i (2.9153 g, 5.57 mmol) en DCM (40 ml) en un matraz de fondo redondo cargado con una barra de agitación magnética en atmósfera de N2. Después, se añadió piridina (2.251 ml, 27.8 mmol) gota a gota mediante una jeringa durante ~30 segundos, seguido de la adición de DMAP (0.136 g, 1.113 mmol) en una porción. Se dejó que la reacción continuara en agitación a ta durante una noche. Después de un tiempo de reacción de 22 horas, la reacción se diluyó con H2O (200 ml) y DCM (200 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se lavó con DCM (200 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron con Na2SO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida para proporcionar un aceite de color amarillo-naranja en bruto, que se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (columna de 120 g, carga líquida (en DCM), MeOH al 0-8 %:DCM) para proporcionar un aceite de color amarillo. El aceite de color amarillo se pasó a través de una columna bond elut NH2 (10 g), eluyendo con DCM. El filtrado se concentró a presión reducida para proporcionar un aceite de color amarillo pálido. El procedimiento bond elut se repitió de nuevo para proporcionar el compuesto del título en forma de un aceite incoloro (2.0887 g, 73 %). MS (M 1) = 516.4, Tr = 1.42 min (método 9 de LC).
Intermedio 1k: (1-hidroxipentadecan-3-il)carbonato de 3-(dietilamino)propilo
Figure imgf000074_0002
A una solución del Intermedio 1j (2.2 g, 4.26 mmol) en MeOH (50 ml) a ta se le añadió CAN (5.14 g, 9.38 mmol) en una porción. La mezcla se agitó a ta and seguido de TLC (EtOAc al 70 %/heptano, tinción con KMNO4). Después de que se observara que el material de partida se había consumido, la mezcla se diluyó con CH2Cl2 (100 ml) y se lavó con NaHCO3 sat. (2 x 100 ml). La capa acuosa se extrajo con CH2O 2 (100 ml). Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida para proporcionar el compuesto del título (junto con algunas impurezas minoritarias) en forma de un aceite. MS (M 1) = 402.2, Tr = 0.76 min (Método 9 de LC).
Preparación de compuestos finales
Figure imgf000075_0001
a) Tratamiento con malonato de dietilo y NaH. b) Reducción de LAH. c) Esterificación con cloruro de octanoílo, piridina. d) Hidrogenación sobre Pd/C. e) Oxidación con TEMPO, BAIB. f) Tratamiento con bromuro de dodecilmagnesio. g) Formación de carbonato con cloroformiato de 4-nitrofenilo. h) Desplazamiento con los alcoholes apropiados. i) Acoplamiento de EDC.
Ejemplo 1: Síntesis de dioctanoato de 2-(10-dodecM-3-etM-8,14-dioxo-7,9,13-trioxa-3-azaoctadecan-18-M)propano-1,3-diílo
Figure imgf000075_0002
En un matraz de fondo redondo, el Intermedio 1f(1.99 g, 4.66 mmol), DMAP (0.207 g, 1.693 mmol), DIPEA (1.48 ml, 8.47 mmol) y el Intermedio 1k (1.7 g, 13.07 mmol) se recogieron en diclorometano (20 ml). Se añadió EDCHCl (1.62 g, 8.47 mmol) en una porción y la reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 24 h, la reacción se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (MeOH del 0 % al 5 % en CH2O 2). Las fracciones se recogieron y los disolventes se eliminaron a presión reducida para proporcionar un aceite de color amarillo (3.8 g). El aceite se purificó de nuevo por cromatografía en columna sobre gel de sílice (EtOAc al 0-75 %/heptano) para proporcionar el compuesto del título en forma de un aceite de color blanquecino (2.6 g, 71.8 %). 1H RMN (400MHz, CDCb) 5 = 4,80 (t, J=6,1 Hz, 1H), 4,25-3,96 (m, 8H), 2,62 (s a., 4H), 2,30 (t, J=7,5 Hz, 6H), 2,05 - 1,85 (m, 5H), 1,71 - 1,53 (m, 8H), 1,43 - 1,21 (m, 42H), 1,21 - 0,98 (m, 6H), 0,96 - 0,79 (m, 9H). 13C RMN (101MHz, CDCb) 5 = 174,15 (s, 2C), 173,71, 155,20, 75,90, 66,41, 64,14 (s, 2C), 60,85, 49,32, 47,10 (s, 2C), 37,46, 34,56 (s, 3C), 34,52, 34,29, 33,28, 32,22, 31,97 (s, 2C), 29,95 (s, 2C), 29,88, 29,80, 29,76, 29,66, 29,41 (s, 2C), 29,23 (s, 2C), 28,20, 26,64, 25,36, 25,25 (s, 4C), 23,00, 22,90 (s, 2C), 14,44, 14,38 (s, 2C), 11,37 (s, 2C).
Los siguientes ejemplos pueden prepararse usando métodos de acoplamiento similares a los empleados para la síntesis del Ejemplo 1.
Ejemplo 2: dioctanoato de 2-(9-dodecil-2-metil-7,13-dioxo-6,8,12-trioxa-2-azaheptadecan-17-il)propano-1,3-diílo
Figure imgf000076_0001
1H RMN (400MHz, CDCb) 5= 4,88-4,71 (m, 1H), 4,28-3,98 (m, 8H), 2,54 (s a., 2H), 2,48-2,35 (m, 6H), 2,31 (t, J=7,7 Hz, 6H), 2,13 - 1,98 (m, 2H), 1,98 - 1,85 (m, 3H), 1,71 (c, J=7,5 Hz, 2H), 1,65 - 1,49 (m, 6H), 1,40 - 1,16 (m, 36H), 0,97 - 0,80 (m, 9H). 13C RMN (101MHz, CDCb) 5 = 173,69 (2C), 172,89, 154,84, 75,60, 63,55 (3C), 60,72, 55,77, 45,05 - 44,29 (2C), 36,80, 34,24, 34,20 (2C), 33,00, 31,90, 31,64 (2C), 31,42, 29,65, 29,63 (2C), 29,56, 29,49, 29,44, 29,33, 29,09 (2C), 28,90 (2C), 25,06, 24,91 (3C), 23,44, 22,66, 22,58 (2C), 14,10, 14,04 (2C).
Ejemplo 4: dioctanoato de 2-(10-dodecil-3-etil-8,14-dioxo-7,9,13-trioxa-3-azahexadecan-16-il)propano-1,3-diílo
Figure imgf000077_0001
1H RMN (400MHz, CDCb) 5 = 4,80 (t, J=6,0 Hz, 1H), 4,28 - 3,98 (m, 8 H), 2,63 (s a., 6 H), 2,40 (t, J=7,7 Hz, 2H), 2,31 (t, J=7,5 Hz, 4H), 2,11 - 2,00 (m, 1H), 2,00- 1,84 (m, 4H), 1,71 (c, J=7,5 Hz, 2H), 1,66- 1,49 (m, 6 H), 1,40 - 1,21 (m, 36H), 1,09 (s a., 6 H), 0,88 (t, J=6 , 8 Hz, 9H). 13C RMN (101MHz, CDCb) 5 = 173,73 (2C), 172,89, 154,92, 75,44, 66,31 (2C), 63,50 (2C), 60,79, 48,99, 46,82 (2C), 36,71, 34,22, 34,18 (2C), 32,95, 31,89, 31,63 (2C), 31,37, 29,62 (3C), 29,55, 29,48, 29,45, 29,34, 29,08 (2C), 28,90 (2C), 25,04, 24,89 (2C), 23,37, 22,67, 22,58 (2C), 14,11, 14,05 (2C), 11,33 (2C).
Ejemplo 5: dioctanoato de 2-(8-dodecil-2-metil-6,12-dioxo-5,7,11-trioxa-2-azaheptadecan-17-il)propano-1,3-diílo
Figure imgf000077_0002
1H RMN (400MHz, CDCI3) 5 = 4,89 - 4,72 (m, 1H), 4,26 - 3,96 (m, 8 H), 2,62 - 2,40 (m, 6 H), 2,40-2,21 (m, 6 H), 2,04- 1,87 (m, 3H), 1,87- 1,74 (m, 2H), 1,74- 1,52 (m, 8 H), 1,41 - 1,17 (m, 42H), 1,01 (t, J=7,2 Hz, 6 H), 0,96-0,80 (m, 9H). 13C RMN (101MHz, CDCI3) 5 = 173,86 (2C), 173,54, 154,99, 75,49, 66,57, 63,92 (2C), 60,61, 49,03, 46,89 (2C), 37,22, 34,26 (2C), 34,20, 34,08, 32,98, 31,91,31,66 (2C), 29,65, 29,63 (2C), 29,56, 29,49, 29,45, 29,35, 29,25, 29,10 (2C), 28,92 (2C), 28,02, 26,49, 26,47, 25,04, 24,94 (2C), 24,70, 22,68, 22,59 (2C), 14,13, 14,07 (2C), 11,78 (2C).
Ejemplo 7: dioctanoato de 2-(9-dodecil-2-metil-7,13-dioxo-6,8,12-trioxa-2-azaoctadecan-18-il)propano-1,3-diílo
Figure imgf000078_0001
1H RMN (400MHz, CDCb) 5 = 4,92 - 4,73 (m, 1H), 4,26 - 3,97 (m, 8H), 2,52 (d, J=6,6 Hz, 6H), 2,38 - 2,23 (m, 6H), 2,02 -1,88 (m, 3H), 1,88- 1,74 (m, 2H), 1,69- 1,53 (m, 8H), 1,41 - 1,19 (m, 44H), 1,02 (t, J=7,1 Hz, 6H), 0,94-0,80 (m, 9H). 13C RMN (101MHz, CDCI3) 5 = 173,81 (2C), 173,59, 155,01,75,55, 66,55, 63,99 (2C), 60,59, 49,10, 46,94 (2C), 37,31, 34,29 (2C), 34,22, 34,16, 33,03, 31,91, 31,66 (2C), 29,65, 29,63 (2C), 29,56, 29,49, 29,44 (2C), 29,34, 29,11 (2C), 29,03, 28,91 (2C), 28,19, 26,64, 26,53, 25,04, 24,97 (2C), 24,83, 22,68, 22,58 (2C), 14,10, 14,05 (2C), 11,80 (2C).
Ejemplo 10: dioctanoato de 2-(9-dodecil-2-metil-7,13-dioxo-6,8,12-trioxa-2-azanonadecan-19-il)propano-1,3-diílo
Figure imgf000079_0001
1H RMN (400MHz, CDCb) 5 = 4,95 - 4,72 (m, 1H), 4,28 - 3,98 (m, 8 H), 2,48 - 2,26 (m, 8 H), 2,23 (s, 6 H), 2,02 - 1,89 (m, 3H), 1,89- 1,78 (m, 2H), 1,69- 1,58 (m, 8 H), 1,41 - 1,19 (m, 44H), 0,96 - 0,79 (m, 9H). 13C RMN (101MHz, CDCI3) 5 = 173,82 (2C), 173,60, 154,97, 75,60, 66,34, 63,99 (2C), 60,59, 56,00, 45,46 (2C), 37,31, 34,29 (2C), 34,21, 34,16, 33,02, 31,91, 31,66 (2C), 29,65, 29,63 (2C), 29,55, 29,49, 29,44 (2C), 29,34, 29,11 (2C), 29,03, 28,91 (2C), 28,19, 26,99, 26,64, 25,05, 24,97 (2C), 24,83, 22,68, 22,58 (2C), 14,10, 14,05 (2C).
Síntesis del Ejemplo 11:
Intermedio 11a: 4,4-bis(octiloxi)butanonitrilo
Figure imgf000079_0002
A una mezcla de 4,4-dietoxibutanonitrilo (15 g, 95 mmol) y octanol (37.3 g, 286 mmol) se le añadió p-toluenosulfonato de piridinio (1.2 g, 4.77 mmol) y la mezcla se calentó en un baño a 105 °C. Después de 72 h, la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se purificó sobre gel de sílice usando acetato de etilo/heptano como eluyente para proporcionar 9.34 g del producto esperado. 1H RMN (400 MHz, CDCb): 5 = 4,56 (t, J = 5,40 Hz, 1H), 3,61 (dt, J = 9,16, 6,59 Hz, 2H), 3,44 (dt, J = 9,22, 6 , 6 8 Hz, 2H), 2,43 (t, J = 7,28 Hz, 2H), 1,95 (td, J = 7,34, 5,40 Hz, 2H), 1,50-1,66 (m, 4H), 1,17-1,44 (m, 20H), 0,80-0,95 (m, 6 H).
Intermedio 11b: ácido 4,4-bis(octiloxi)butanoico
Figure imgf000079_0003
En un vial de reacción a alta presión, el Intermedio 11a (9.34 g, 28.7 mmol) se disolvió en 30 ml de EtOH. Se disolvió KOH (4.83 g) en 30 ml de agua y la solución de KOH se añadió a la solución de EtOH. El tubo se cerró herméticamente y se calentó en un baño a 110 °C durante una noche. La mezcla se enfrió y se diluyó con EtOAc. Se añadió HCl 1 N para ajustar el pH a 5 y la fase acuosa se extrajo con EtOAc dos veces. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre MgSO4 , se filtraron y se concentraron a presión reducida para proporcionar 10.9 g del producto esperado. 1H RMN (400 MHz, CDCb): 5 = 4,46 (t, J = 5,52 Hz, 1H), 3,46-3,59 (m, 2H), 3,08-3,46 (m, 3H), 2,18 (t, J = 7,28 Hz, 2H), 1,72-1,89 (m, 2H), 1,46-1,63 (m, 4H), 1,28 (d, J = 3,76 Hz, 20H), 0,79-0,96 (m, 6 H).
Preparación de compuestos finales
Figure imgf000080_0001
Los siguientes ejemplos (Ejemplos 11-15) pueden prepararse usando métodos similares a los empleados para la síntesis del Ejemplo 1.
Ejemplo 11: 4,4-bis(octiloxi)butanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo
Figure imgf000080_0002
1H RMN (400MHz, CDCb) 5 = 4,89 - 4,72 (m, 1H), 4,50 (t, J=5,6 Hz, 1H), 4,28 - 4,09 (m, 4H), 3,68 - 3,48 (m, 2H), 3,41 (td, J=6,8, 9,2 Hz, 2H), 2,61 - 2,45 (m, 6H), 2,39 (t, J=7,5 Hz, 2H), 1,99 - 1,88 (m, 4H), 1,81 (quin, J=7,0 Hz, 2H), 1,72 -1,47 (m, 8H), 1,42 - 1,20 (m, 38H), 1,02 (t, J=7,2 Hz, 6H), 0,94 - 0,82 (m, 9H). 13C RMN (101MHz, CDCla) 5 = 173,27, 154,98, 102,03, 75,50, 66,57, 66,07 (2C), 60,73, 49,03, 46,89 (2C), 34,21, 32,96, 31,91, 31,83 (2C), 29,84 (2C), 29,64 (3C), 29,56, 29,50, 29,44 (2C), 29,36 (3C), 29,28 (2C), 28,67, 26,45, 26,22 (2C), 25,05, 22,66 (3C), 14,11 (3C), 11,78 (2C).
Ejemplo 12: 4,4-bis((2-etilhexil)oxi)butanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo
Figure imgf000080_0003
1H RMN (400MHz, CDCla) 5 = 4,80 (t, J=6,3 Hz, 1H), 4,46 (t, J=5,5 Hz, 1H), 4,27-3,99 (m, 4H), 3,55 - 3,41 (m, 2H), 3,28 (dt, J=5,8, 8,9 Hz, 2H), 2,56 (s a., 4H), 2,39 (t, J=7,5 Hz, 2H), 2,00 - 1,77 (m, 6H), 1,75 - 1,53 (m, 4H), 1,53 - 1,44 (m, 2H), 1,44 - 1,23 (m, 36H), 1,05 (d, J=6,8 Hz, 6H), 0,98 - 0,76 (m, 15H). MS (M 1) = 728,3, Rt = 2,09 min (LC Método 4).
Ejemplo 13: 4,4-bis((2-propilpentil)oxi)butanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo
Figure imgf000081_0001
1H RMN (400MHz, CDCb) 5 = 4,80 (t, J=6,1 Hz, 1H), 4,45 (t, J=5,6 Hz, 1H), 4,25 - 4,06 (m, 4H), 3,47 (dd, J=5,8, 9,0 Hz, 2H), 3,27 (dd, J=5,8, 9,3 Hz, 2H), 2,75 - 2,45 (m, 6 H), 2,38 (t, J=7,7 Hz, 2H), 2,01 - 1,80 (m, 6 H), 1,72- 1,47 (m, 4H), 1,43­ 1,18 (m, 36H), 1,18 - 0,98 (m, 6 H), 0,97 - 0,81 (m, 15H). 13C RMN (101MHz, CDCI3) 5 = 173,34, 154,89, 102,40, 75,58, 69,00 (2C), 66,25, 60,63, 49,02, 46,81 (2C), 37,91 (2C), 34,19, 33,66 (4C), 32,95, 31,90, 29,63 (3C), 29,55, 29,49, 29,44, 29,38, 29,34, 28,63, 26,07, 25,04, 22,68, 19,96 (2C), 19,92 (2C), 14,47 (4C), 14,12, 11,39 (2C).
Ejemplo 14: 4,4-bis((2-propilpentil)oxi)butanoato de 3-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo
Figure imgf000081_0002
1H RMN (400MHz, CDCI3) 5 = 4,80 (t, J=6,1 Hz, 1H), 4,45 (t, J=5,5 Hz, 1H), 4,27 - 4,06 (m, 4H), 3,47 (dd, J=5,8, 9,0 Hz, 2H), 3,27 (dd, J=5,8, 9,0 Hz, 2H), 2,38 (t, J=7,5 Hz, 9H), 2,03 - 1,84 (m, 6 H), 1,73 - 1,47 (m, 4H), 1,38 - 1,09 (m, 39H), 0,96-0,78 (m, 15H). 13C RMN (101MHz, CDCI3) 5 = 173,37, 154,82, 102,39, 75,65, 69,01 (2C), 65,87 (a), 60,57, 53,27, 51,30, 40,69 (a), 37,90 (2C), 34,19 (2C), 33,66 (4C), 32,94, 31,90, 29,63 (2C), 29,55, 29,49, 29,44, 29,38, 29,34, 28,63, 25,87 (a), 25,05, 22,68, 19,96 (2C), 19,92 (2C), 14,47 (4C), 14,12, 11,02.
Ejemplo 15: 4,4-bis((2-propilpentil)oxi)butanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo 1
Figure imgf000081_0003
1H RMN (400MHz, CDCI3) 5 = 4,91 -4,69 (m, 1H), 4,45 (t, J=5,5 Hz, 1H), 4,28-4,03 (m, 4H), 3,47 (dd, J=5,8, 9,0 Hz, 2H), 3,27 (dd, J=5,8, 9,3 Hz, 2H), 2,52 (s a., 2H), 2,44 - 2,26 (m, 8 H), 2,02 - 1,85 (m, 6 H), 1,72 - 1,48 (m, 4H), 1,40 - 1,16 (m, 36H), 0,99-0,83 (m, 15H). 13C RMN (101MHz, CDCI3) 5= 173,36, 154,83, 102,39, 75,64, 69,03, 69,00, 65,90, 60,60, 55,84, 44,90 (2C), 37,90 (2C), 34,19, 33,66 (4C), 32,94, 31,90, 29,65 (2C), 29,62, 29,55, 29,49, 29,43, 29,38, 29,34, 28,63, 26,34, 25,04, 22,68, 19,96 (2C), 19,92 (2C), 14,47 (4C), 14,12.
Síntesis del Ejemplo 16
Intermedio 16a: 6,6-dimetoxihexanoato de metilo
Figure imgf000082_0001
Se recogió 6-oxohexanoato de metilo (11 g, 76 mmol) en metanol (60 ml) y se añadió ácido sulfúrico conc. (244 ul, 4.58 mmol). La reacción se calentó a reflujo durante una noche. La reacción se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con agua. La mezcla se extrajo con acetato de etilo. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El concentrado se purificó sobre gel de sílice con acetato de etilo/heptano como eluyente para proporcionar 12.1 g del compuesto deseado. 1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 4,37 (t, J = 5,77 Hz, 1H), 3,68 (s, 3H), 3,33 (s, 6H), 2,34 (t, J = 7,53 Hz, 2H), 1,57-1,73 (m, 4H), 1,34 - 1,46 (m, 2H) ppm.
Intermedio 16b: 6,6-bis(octiloxi)hexanoato de octilo
Figure imgf000082_0002
El Intermedio 16a (3.06 g, 16.09 mmol) se disolvió en 1-octanol (10.17 ml, 64.3 mmol) y se añadió bisulfato de potasio (0.110 g, 0.804 mmol). La mezcla se calentó a 70 °C y se agitó durante 4 h. La mezcla se diluyó con 40 ml de agua y se extrajo con EtOAc (2 x 50 ml). Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron sobre sulfato sódico y después se concentraron al vacío. La mezcla en bruto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (gradiente de EtOAc al 0-10 %/heptano) para proporcionar 5.07 g del compuesto del título (rendimiento del 65 %). 1H RMN (400 MHz, CDCb) 5= 4,46 (t, J=5,69 Hz, 1 H), 4,02 - 4,12 (m, 2 H), 3,56 (dt, J=9,29, 6,66 Hz, 2 H), 3,40 (dt, J=9,32, 6,71 Hz, 2 H), 2,31 (t, J=7,58 Hz, 2 H), 1,51 - 1,72 (m, 12 H), 1,20 - 1,45 (m, 30 H), 0,81 - 0,97 (m, 9 H).
Intermedio 16c: ácido 6,6-bis(octiloxi)hexanoico
Figure imgf000082_0003
Al intermedio 16b (5.07 g, 10.46 mmol) se le añadieron agua (34.9 ml), MeOH (34.9 ml) y NaOH (2.091 g, 52.3 mmol). La mezcla se calentó a reflujo y se agitó durante 2 h. La mezcla se neutralizó con HCl 1 N y después se extrajo con EtOAc (2 x 50 ml). Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con salmuera (100 ml), después se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se concentraron. El material en bruto se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. 1H RMN (400 MHz, DMSO-cfe) 5 = 4,38 (t, J=5,62 Hz, 1 H), 3,42 - 3,51 (m, 2 H), 3,28 - 3,38 (m, 2 H), 1,96 (t, J=7,34 Hz, 2 H), 1,39 - 1,55 (m, 8 H), 1,19 (m., 23 H), 0,80 - 0,93 (m, 6 H).
Preparación de compuestos finales
Scheme X
Figure imgf000082_0004
Los siguientes ejemplos (Ejemplos 16-23) pueden prepararse usando métodos similares a los empleados para la síntesis del Ejemplo 1.
Ejemplo 16: 6,6-bis(octiloxi)hexanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo
Figure imgf000083_0001
1H RMN (400MHz, CDCI3) 5 = 4,89 - 4,71 (m, 1H), 4,42 (t, J=5,6 Hz, 1H), 4,28-4,06 (m, 4H), 3,46 (dt, J=6,0, 8,3 Hz, 2H), 3,37 - 3,17 (m, 2H), 2,55 (s a., 4H), 2,31 (t, J=7,5 Hz, 2H), 2,01 - 1,76 (m, 4H), 1,73 - 1,54 (m, 6H), 1,54 - 1,43 (m, 2H), 1,43 - 1,23 (m, 40H), 1,04 (t, J=6,7 Hz, 6H), 0,97 - 0,77 (m, 15H). MS (M 1) = 756,5, Rt = 2,23 min (LC Método 4). Ejemplo 19: 8,8-bis(octiloxi)octanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo
Figure imgf000084_0001
1H RMN (400MHz, CDCI3) 5 = 4,81 (t, J=6,3 Hz, 1H), 4,40 (t, J=5,6 Hz, 1H), 4,26 - 4,06 (m, 4H), 3,45 (dd, J=5,6, 9,2 Hz, 2H), 3,26 (dd, J=5,9, 9,2 Hz, 2H), 2,59 (s a., 6H), 2,29 (t, J=7,5 Hz, 2H), 1,92 (c, J=6,3 Hz, 4H), 1,72 - 1,49 (m, 10H), 1,38 - 1,16 (m, 40H), 1,07 (s a., 6H), 0,98 - 0,80 (m, 15H). 13C RMN (101MHz, CDCI3 ) 5 = 173,39, 154,59, 103,14, 75,28, 68,10 (2C), 65,92, 60,16, 48,70, 46,50 (2C), 37,62 (2C), 33,87 (2C), 33,42 (2C), 33,37 (2C), 32,99, 32,64, 31,58, 29,31 (3C), 29,24, 29,16, 29,11, 29,03, 28,83, 28,81,25,68, 24,72, 24,51,24,38, 22,36, 19,63 (4C), 14,16 (4C), 13,81, 11,01 (2C).
Ejemplo 22: 8,8-bis((2-propilpentil)oxi)octanoato de 3-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo
Figure imgf000085_0001
1H RMN (400MHz, CDCb) 5 = 4,80 (t, J=6,1 Hz, 1H), 4,40 (t, J=5,8 Hz, 1H), 4,26 - 4,04 (m, 4H), 3,45 (dd, J=5,8, 9,3 Hz, 2H), 3,32 - 3,17 (m, 2H), 2,51 (s a., 4H), 2,36 - 2,20 (m, 5H), 1,92 (c, J=6,3 Hz, 4H), 1,73 - 1,46 (m, 10H), 1,46 - 1,17 (m, 40H), 1,17 - 1,01 (m, 3H), 0,98 - 0,78 (m, 15H). 13C RMN (101MHz, CDCb) 5 = 173,70, 154,90, 103,45 (2C), 75,61, 68,41 (2C), 66,22, 60,47, 53,37, 51,37, 41,23, 37,94 (2C), 34,19 (2C), 33,73 (2C), 33,69 (2C), 33,31, 32,95, 31,90, 29,62 (2C), 29,55, 29,48, 29,43, 29,34, 29,15, 29,12, 26,25, 25,03, 24,83, 24,69, 22,68, 19,95 (4C), 14,48 (4C), 14,12, 11,86.
Ejemplo 23: 8,8-bis((2-propilpentil)oxi)octanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo
Figure imgf000085_0002
1H RMN (400MHz, CDCI3) 5= 4,80 (t, J=6,1 Hz, 1H), 4,40 (t, J=5,8 Hz, 1H), 4,26 - 4,04 (m, 4H), 3,45 (dd, J=5,8, 9,3 Hz, 2H), 3,26 (dd, J=5,9, 9,2 Hz, 2H), 2,53 - 2,36 (m, 2H), 2,36 - 2,20 (m, 8 H), 1,91 (td, J=6,2, 12,2 Hz, 4H), 1,71 - 1,48 (m, 10H), 1,44 - 1,16 (m, 40H), 0,98 - 0,79 (m, 15H). 13C RMN (101MHz, CDCb) 5 = 173,71, 154,89, 103,45, 75,63, 68,41 (2C), 66,08, 60,47, 55,90, 45,15 (2C), 37,94 (2C), 34,19 (2C), 33,73 (2C), 33,69 (2C), 33,31, 32,94, 31,90, 29,62 (2C), 29,54 (2C), 29,48, 29,42, 29,34, 29,14, 29,12, 26,61, 25,03, 24,83, 24,69, 22,68, 19,95 (4C), 14,48 (4C), 14,12.
Síntesis del Ejemplo 24:
Intermedio 24a: 3-octilundec-2-enoato de etilo
Figure imgf000085_0003
Una solución de 9-heptadecanona (15 g, 59 mmol) y fosfonoacetato de trietilo (13,2 g, 59 mmol) se agitó en THF (100 ml). A esta mezcla se le añadió NaOEt (26.4 ml, 21 % en EtOH, 70.7 mmol) y la solución resultante se calentó a reflujo durante 48 h. La reacción se acidificó con HCl 1 M y después se diluyó con EtOAc. La capa orgánica se recogió y se lavó con bicarbonato sódico acuoso saturado. El material orgánico resultante se secó sobre sulfato sódico y los volátiles se eliminaron a presión reducida para producir un material en bruto que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice usando heptanos/EtOAc como eluyente, proporcionando 11.7 g del producto deseado. 1H RMN (400 MHz, CDCb): 5 = 5,62 (s, 1H), 4,01-4,26 (m, 2H), 2,49-2,68 (m, 2H), 2,13 (m, 2H), 1,44 (dd, J = 7,33, 4,80 Hz, 4H), 1,17-1,35 (m, 23H), 0,83-0,98 (m, 6 H).
Intermedio 24b: 3-octilundecanoato de etilo
El Intermedio 24a (11.75 g, 36.2 mmol) se agitó en DCM (16.5 ml) y MeOH (165 ml). Se añadió Pd al 10 %/C (3.85 g,) y el matraz de reacción se equipó con un globo relleno con hidrógeno. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 h. La reacción se desgasificó con nitrógeno y se filtró a través de celite con un lavado de DCM y MeOH. El filtrado se recogió y los volátiles se eliminaron a presión reducida para proporcionar 10.6 g del producto deseado, que se utilizó sin purificación adicional. 1H RMN (400 MHz, CDCls) 5 = (c, J = 7,16 Hz, 2H), 2,39 (t, J = 7,45 Hz, 2H), 2,22 (d, J = 6,82 Hz, 2H), 1,84 (s a., 1H), 1,56 (t, J = 7,20 Hz, 2H), 1,19-1,36 (m, 27H), 0,81-0,95 (m, 6H).
Intermedio 24c: ácido 3-octilundecanoico
Figure imgf000086_0001
El Intermedio 24b (10.6 g, 32.5 mmol) se agitó con NaOH (9.74 ml, 10 M, 97.4 mmol) en MeOH (100 ml) y DCM (10 ml). La reacción se calentó a reflujo durante una noche. Se añadió HCI acuoso para neutralizar la solución, los volátiles se eliminaron a presión reducida y el material resultante se recogió de nuevo en DCM. Los extractos orgánicos se lavaron con bicarbonato sódico acuoso saturado y la capa acuosa resultante se extrajo de nuevo con DCM. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El material en bruto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice usando heptanos/EtOAc como eluyente. El material resultante se recogió en DCM y se cargó sobre una columna funcionalizada con NH2. La columna se lavó con DCM y después con DCM/MeOH. El producto se eluyó con metanol ácido y el eluyente se concentró a presión reducida. El residuo se recogió en DCM y se lavó con bicarbonato sódico acuoso saturado, se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró a presión reducida para proporcionar 6.5 g del producto deseado. 1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 2,28 (d, J=7,07 Hz, 2 H) 1,86 (s a., 1 H) 1,15 - 1,44 (m, 28 H) 0,82 - 0,97 (m, 6 H).
Ejemplo 24: 3-octilundecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo
Figure imgf000086_0002
El Ejemplo 24 puede prepararse usando métodos similares a los empleados para la síntesis del Ejemplo 1
1H RMN (400 MHz, CDCla) 5= 4,71 - 4,88 (m, 1 H) 4,01 - 4,31 (m, 4 H) 2,71 (s a., 2 H) 2,50 (s a., 6 H) 2,17 - 2,28 (m, 2 H) 2,06 (s a., 2 H) 1,88 - 1,99 (m, 2 H) 1,83 (s a., 1 H) 1,50 - 1,75 (m, 2 H) 1,17 - 1,40 (m, 48 H) 0,80 - 0,96 (m, 9 H). 13C RMN (101MHz, CDCl3) 5 = 173,27, 154,46, 75,52, 65,14, 59,94, 55,37, 43,93 (2C), 38,90, 34,71,33,89, 33,53 (2C), 32,72, 31,58 (3C), 29,60, 29,34 (2C), 29,31 (2C), 29,28 (2C), 29,18, 29,14, 29,02 (2C), 29,00 (2C), 26,21 (3C), 24,75, 22,35 (3C), 13,78 (3C).
Síntesis del Ejemplo 25:
Intermedio 25a: ácido 3-octilundec-2-enoico
Figure imgf000086_0003
El Intermedio 25a puede sintetizarse a partir del Intermedio 24a utilizando métodos similares a los descritos para la síntesis del Intermedio 24c.
TLC (gel de sílice, acetato de etilo al 10 % en hexanos): Fr = 0,18
Ejemplo 25: 3-octilundec-2-enoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo
Figure imgf000087_0001
El Ejemplo 25 puede prepararse usando métodos similares a los empleados para la síntesis del Ejemplo 1
1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 5,20 - 5,41 (m, 1 H) 4,81 (dt, J=13,45, 6,54 Hz, 1 H) 4,04 - 4,27 (m, 4 H) 2,58 (m, 2 H) 2,30 - 2,48 (m, 2 H) 2,24 (s, 6 H) 1,99 - 2,16 (m, 4 H) 1,82 - 1,98 (m, 4 H) 1,50 - 1,74 (m, 2 H) 1,43 (dd, J=14,15, 6,57 Hz, 2 H) 1,17 - 1,40 (m, 40 H) 0,80 - 1,00 (m, 9 H). MS (M 1) = 652,5, Rt = 1,44 min (LC Método 4).
Síntesis del Ejemplo 26:
Intermedio 26a: 3-hexilnon-2-enoato de metilo
Figure imgf000087_0002
A una suspensión de hidruro sódico (al 60 % en aceite de parafina, 14.16 g, 335 mmol) en THF (500 ml), enfriada en un baño de hielo-agua, se le añadió lentamente fosfonoacetato de trimetilo (50.74 g, 278.8 mmol) para controlar el desprendimiento de gas. Después de que terminara la adición, la reacción se agitó durante 2 h, después se añadió lentamente tridecan-7-ona (6.5 g, 32.8 mmol) y la reacción se calentó a temperatura ambiente. Después de 1 h más, la reacción se calentó a reflujo. Después de 4 d, la reacción se enfrió y se añadió HCl 1 N (ac.) para interrumpir la reacción. La reacción se extrajo con acetato de etilo (3 x 200 ml). Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El concentrado se purificó sobre gel de sílice, usando acetato de etilo/hexanos como eluyente para proporcionar 8,0 g del producto deseado. TLC (gel de sílice, acetato de etilo al 10 % en hexanos): Fr = 0,72.
Intermedio 26b: 3-hexilnon-2-en-1-ol
Figure imgf000087_0003
A una solución del Intermedio 26a (8.1 g, 31.9 mmol) en THF (100 ml), enfriada en un baño de hielo-agua, se le añadió hidruro de diisobutilaluminio (al 25 % en tolueno, 54.4 ml, 95.6 mmol). Después de 30 minutos, la reacción se llevó a temperatura ambiente. Después de 6 h más, la reacción se enfrió en un baño de hielo-agua y se interrumpió con agua enfriada con hielo (50 ml) y HCl 1 N (ac., 15 ml). La reacción se extrajo con acetato de etilo (2 x 50 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua (2 x 60 ml) y salmuera (60 ml). El extracto orgánico se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró a presión reducida. El concentrado se purificó sobre gel de sílice, usando acetato de etilo/hexanos como eluyente para proporcionar 6,8 g del producto deseado. TLC (gel de sílice, acetato de etilo al 20 % en hexanos): Fr = 0,29.
Intermedio 26c: 3-hexilnon-2-enal
Figure imgf000087_0004
A una suspensión agitada de IBX (21.0 g, 75.12 mmol) en DMSO (30 ml), calentada a 30 °C, se le añadió el Intermedio 26b en THF (100 ml). La reacción se mantuvo a 25-30 °C durante 2 h. La reacción se diluyó con éter dietílico y se filtró a través de celite con lavados de éter dietílico. El filtrado se lavó con agua (2 x 200 ml) y salmuera (200 ml). El extracto orgánico se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró a presión reducida para proporcionar 6,0 g del producto deseado, que se usó sin purificación adicional. TLC (gel de sílice, acetato de etilo al 10 % en hexanos): Fr = 0,50.
Intermedio 26d: ácido 7-hexiltrideca-4,6-dienoico
Figure imgf000087_0005
A una suspensión de bromuro de (3-carboxipropil)trifenilfosfonio (19,09 g, 44,6 mmol) en THF (80 ml) y HMPA (5 ml), enfriada en un baño de hielo-agua, se le añadió NaHMDS (1,0 M en THF, 111 ml, 111 mmol). Se añadió lentamente el Intermedio 26c (5.0 g, 22.3 mmol) en THF (20 ml) y la reacción se calentó a 30 °C. Después de 16 h, la reacción se diluyó con 200 ml de agua y se acidificó con HCl 2 N (ac.). La reacción se extrajo con acetato de etilo (3 x 100 ml). Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El concentrado se purificó sobre gel de sílice con acetato de etilo/hexanos como eluyente para proporcionar 4.0 g del producto deseado. TLC (gel de sílice, acetato de etilo al 30 % en n-hexano): Fr = 0,21.
Intermedio 26e: ácido 7-hexiltridec-6-enoico
Figure imgf000088_0001
A una solución del Intermedio 26d (1.0 g) en metanol (60 ml) se le añadió Pd al 10 %/C (300 mg). La reacción se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera de gas hidrógeno durante 14 h. La mezcla de reacción se filtró sobre celite y el residuo se aclaró con metanol. El filtrado se concentró a presión reducida. El concentrado se purificó sobre gel de sílice con acetato de etilo/hexanos como eluyente para proporcionar el producto deseado. TLC (gel de sílice, acetato de etilo al 10 % en n-hexano): Fr = 0,16
Ejemplo 26: 7-hexiltridec-6-enoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo
Figure imgf000088_0002
El Ejemplo 26 puede prepararse usando métodos similares a los empleados para la síntesis del Ejemplo 1
1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 = 5,02 - 5,20 (m, 1 H) 4,80 (t, J=5,18 Hz, 1 H) 4,00 - 4,30 (m, 4 H) 2,74 (s a., 2 H) 2,53 (s a., 6 H) 2,30 (t, J=7,58 Hz, 2 H) 1,84 - 2,14 (m, 8 H) 1,50 - 1,78 (m, 4 H) 1,21 - 1,42 (m, 40 H) 0,80 - 0,98 (m, 9 H). 13C RMN (101MHz, CDCla) 5 = 173,41, 154,46, 139,95, 123,49, 75,49, 65,05, 59,99, 55,37, 43,86 (2C), 36,62, 35,12, 33,90, 32,70, 31,59 (2C), 31,50, 29,76, 29,33 (2C), 29,31 (3C), 29,24, 29,17, 29,12, 29,02, 28,83, 28,15, 27,93, 26,99, 26,91, 24,74, 24,33, 22,36 (3C), 13,78 (3C).
Síntesis del Ejemplo 27:
Intermedio 27a: ácido (E)-9-pentiltetradeca-6,8-dienoico
Figure imgf000088_0003
El Intermedio 27a puede sintetizarse utilizando métodos similares a los usados para producir el Intermedio 26d.
TLC (gel de sílice, acetato de etilo al 10 % en n-hexano): Fr = 0,31
Intermedio 27b: ácido 9-pentiltetradecanoico
Figure imgf000088_0004
A una solución del Intermedio 27a (2.0 g, 6.80 mmol) en metanol (70 ml) se le añadió Pd al 10 %/C (300 mg). La reacción se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera de gas hidrógeno durante 4 h. La mezcla de reacción se filtró sobre celite y el residuo se lavó con metanol. El filtrado se concentró a presión reducida. El concentrado se purificó sobre gel de sílice con acetato de etilo/n-hexano como eluyente para proporcionar el producto deseado. TLC (gel de sílice, acetato de etilo al 10 % en n-hexano): Fr = 0,26
Ejemplo 27: 9-pentiltetradecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo
Figure imgf000089_0001
A una suspensión de hidruro sódico (al 55 % en aceite de parafina, 3.5 g, 74.3 mmol) en THF (70 ml), enfriada en un baño de hielo-agua, se le añadió lentamente fosfonoacetato de trimetilo (9.6 ml, 59.5 mmol). Después de 10 min, se añadió el Intermedio 29a (7.5 g, 29.7 mmol) en THF (10 ml) y la reacción se dejó calentar a temperatura ambiente. Después de 2 h más, la reacción se interrumpió mediante la adición lenta de agua enfriada con hielo (20 ml). La reacción se extrajo con acetato de etilo (2 x 100 ml). Los extractos orgánicos se lavaron con agua y salmuera. Los extractos orgánicos se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se concentraron a presión reducida para proporcionar 8 . 0 g del producto deseado, que se usó sin purificación adicional. TLC (gel de sílice, acetato de etilo al 10 % en hexanos): Fr = 0,75.
Intermedio 29c: 5-heptildodecanoato de metilo
Figure imgf000090_0001
A una solución del Intermedio 29b (8.0 g, 25.95 mmol) en metanol (350 ml) se le añadió Pd al 10 %/C (1.0 g). La reacción se realizó en una atmósfera de hidrógeno suministrada por un globo. Después de 14 h, la reacción se filtró a través de celite con lavados de metanol. El filtrado se concentró a presión reducida para proporcionar 7.7 g del producto deseado, que se usó sin purificación adicional. TLC (gel de sílice, metanol al 5 % en diclorometano): Fr = 0,63.
Intermedio 29d: ácido 5-heptildodecanoico
Figure imgf000090_0002
A una mezcla de hidróxido sódico ac. 5 N (125 ml) y metanol (350 ml) se le añadió el Intermedio 29c (7.7 g, 24.7 mmol) y la reacción se calentó a reflujo. Después de 16 h, la reacción se enfrió en un baño de hielo-agua y se interrumpió mediante la adición de HCI acuoso concentrado hasta que se hizo ácida. La mezcla se extrajo con acetato de etilo (2 x 250 ml). Los extractos orgánicos se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El concentrado se purificó sobre gel de sílice con acetato de etilo/hexanos como eluyente para proporcionar 7,0 g del producto deseado. Fr = 0.82, EtOAc al 50 %/heptano
Los siguientes ejemplos (Ejemplos 29-31) pueden prepararse usando métodos similares a los empleados para la síntesis del Ejemplo 1.
Ejemplo 29: 5-heptildodecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo
Figure imgf000090_0003
1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 0,89 (t, J=6,65 Hz, 9 H) 1,15 - 1,42 (m, 42 H) 1,49 - 1,77 (m, 5 H) 1,77 - 1,99 (m, 4 H) 2,18 - 2,37 (m, 8 H) 2,43 (s a., 2 H) 4,02 - 4,29 (m, 4 H) 4,81 (t, J=6,27 Hz, 1 H). 13C RMN (101MHz, CDCb) 5 = 173,81, 154,90, 75,66, 66,14, 60,51,55,93, 45,23 (2C), 37,19, 34,65, 34,19, 33,44 (2C), 33,14, 32,96, 31,93 (2C), 31,89, 30,07 (2C), 29,58, 29,56, 29,49, 29,44, 29,38 (2C), 29,32, 26,70, 26,63 (2C), 25,04, 22,69 (3C), 22,13, 14,13 (3C).
Ejemplo 31: 5-heptildodecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)undecilo
Figure imgf000091_0001
1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 0,76 - 0,97 (m, 9 H) 1,16 - 1,46 (m, 40 H) 1,46 - 1,75 (m, 5 H) 1,92 (dt, J=12,61, 6,37 Hz, 4 H) 2,17 - 2,39 (m, 6 H) 2,39 - 2,56 (m, 2 H) 4,03 - 4,33 (m, 4 H) 4,81 (t, J=6,15 Hz, 1 H). 13C RMN (101MHz, CDCI3) 5 = 173,82, 154,88, 75,67, 66,07, 60,49, 55,82, 45,02 (2C), 37,19, 34,64, 34,17, 33,43 (2C), 33,14, 32,95, 31,92 (2C), 31,82, 30,07 (2C), 29,42 (2C), 29,38 (2C), 29,21, 26,62 (2C), 26,50, 25,03, 22,68 (2C), 22,64, 22,12, 14,13 (2C), 14,10.
* Síntesis del Ejemplo 32:
Intermedio 32a: ácido 4-((1,3-bis(octanoiloxi)propan-2-il)oxi)-4-oxobutanoico
Figure imgf000091_0002
En un vial para microondas de 30 ml equipado con una barra de agitación, 1,3-dicaprilina (2 g, 5.81 mmol) y anhídrido succínico (0.581 g, 5.81 mmol) se disolvieron en tolueno (Volumen: 10 ml). Se añadió DMAP (0.284 g, 2.322 mmol) y la mezcla se calentó con microondas a 140 °C durante 40 min. La mezcla en bruto se evaporó a presión reducida para obtener un aceite en bruto. La purificación por cromatografía en columna sobre gel de sílice (columna de 80 g, EtoAc al 0-10 %/Heptano) proporcionó el compuesto del título en forma de un aceite incoloro (0.900 g, 70 %). 1H RMN (400MHz, CDCb) 5 = 5,35 - 5,22 (m, 1H), 4,39 - 4,25 (m, 2H), 4,24 - 4,09 (m, 2H), 2,76 - 2,60 (m, 4H), 2,39 - 2,26 (m, 4H), 1,70 -1,53 (m, 4H), 1,39 - 1,19 (m, 16H), 0,97 - 0,82 (m, 6 H). 13C RMN (101MHz, CDCb) 5 = 177,01, 173,38 (s, 2C), 171,22, 69,57, 61,12 (s, 2C), 33,97 (s, 2C), 31,63 (s, 2C), 29,02 (s, 2C), 28,89 (s, 2C), 28,74, 28,60, 24,80 (s, 2C), 22,58 (s, 2C), 14,29 (s, 2C).
Los siguientes ejemplos (Ejemplos 32 y 33) pueden prepararse usando métodos similares a los empleados para la síntesis del Ejemplo 1.
* Ejemplo 32: (3-(((2-(dimetilamino)etoxi)carbonil)oxi)pentadecil)succinato de 1,3-bis(octanoiloxi)propan-2-ilo 1
Figure imgf000091_0003
1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 5,31 - 5,22 (m, 1H), 4,81 (s, 1H), 4,41 - 4,23 (m, 4H), 4,23 - 4,09 (m, 4H), 2,79 - 2,58 (m, 6 H), 2,46 - 2,25 (m, 10H), 2,01 - 1,86 (m, 2H), 1,74 - 1,51 (m, 7H), 1,42 - 1,18 (m, 35H), 0,97 - 0,82 (m, 9H). MS (M 1) = 787,0, Rt = 1,60 min (LC Método 5).
* Ejemplo 33: (3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecil)succinato de 1,3-bis(octanoiloxi)propan-2-ilo
Figure imgf000092_0001
1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 = 5,33 - 5,22 (m, 1H), 4,80 (s a., 1H), 4,36 - 4,25 (m, 2H), 4,24-4,08 (m, 6H), 2,70 - 2,51 (m, 6H), 2,45 - 2,27 (m, 10H), 2,01 (s, 2H), 2,00 - 1,86 (m, 4H), 1,70 - 1,51 (m, 6H), 1,39 - 1,18 (m, 34H), 0,95 - 0,82 (m, 9H). MS (M 1) = 801,7, Rt = 1,27 min (LC Método 4).
Síntesis del Ejemplo 34:
Intermedio 34a: ácido 10-(octiloxi)-10-oxodecanoico
Figure imgf000092_0002
A una solución de ácido sebácico (5.0 g, 24.7 mmol) en diclorometano (40 ml) se le añadieron EDCHCI (7.2 g, 37.1 mmol) y DMAP (3.0 g, 24.7 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h y después se añadió 1-octanol (2.9 g, 22.2 mmol). La reacción se agitó durante 72 h más. La reacción se diluyó con agua y la capa acuosa se extrajo con diclorometano (2 x 30 ml). Los extractos de diclorometano combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato sódico y se filtraron. El filtrado se concentró a presión reducida y el material en bruto resultante se purificó sobre gel de sílice con acetato de etilo y hexano como eluyente para proporcionar el producto deseado. TLC (gel de sílice, acetato de etilo al 40 % en hexanos): Fr = 0,42
Los siguientes ejemplos (Ejemplos 34-38) pueden prepararse usando métodos similares a los empleados para la síntesis del Ejemplo 1.
Ejemplo 34: 10-octil decanodioato de 1-(3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo)
Figure imgf000092_0003
1H RMN (400MHz, CDCb) 5 = 4,81 (s, 1H), 4,24 - 4,09 (m, 4H), 4,06 (t, J=6,8 Hz, 2H), 2,56 (s a., 6H), 2,29 (t, J=7,5 Hz, 4H), 1,99 - 1,78 (m, 4H), 1,61 (d, J=6,3 Hz, 8H), 1,41 - 1,18 (m, 38H), 1,05 (t, J=6,8 Hz, 6H), 0,88 (t, J=6,8 Hz, 6H). 13C RMN (101 MHz, CDCl3) 5 174,0, 173,7, 154,9, 75,6, 66,4, 64,4, 60,5, 49,0, 46,8 (2C), 34,3, 34,2 (2C), 33,0, 31,9, 31,8, 29,7, 29,6 (2C), 29,5, 29,4, 29,3, 29,2 (3C), 29,1 (4C), 28,6, 26,1, 25,9, 25,0 (2C), 24,8, 22,7, 22,6, 14,1 (2C), 11,4 (2C).
Ejemplo 36: 10-octil decanodioato de 1-(3-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo)
Figure imgf000093_0001
1H RMN (400 MHz, CDCI3) 5= 4,81 (s, 1H), 4,10-4,25 (m, 4H), 4,06 (t, J=6,78 Hz, 2H), 2,50 (s a., 4H), 2,19-2,38 (m, 7H), 1,83-1,99 (m, 4H), 1,61 (d, J=6,27 Hz, 8H), 1,18-1,42 (m, 38H), 1,09 (t, J=7,03 Hz, 3H), 0,89 (t, J=6,78 Hz, 6H). 13C RMN (101 MHz, CDCI3) 5 = 174,0, 173,7, 154,9, 75,6, 66,3, 64,4, 60,5, 53,3, 51,3, 41,2, 34,3, 34,2 (2C), 32,9, 31,9, 31,8, 29,7 (3C), 29,6, 29,5, 29,4, 29,3, 29,2 (2C), 29,1 (4C), 28,6, 26,3, 25,9, 25,1, 25,0, 24,8, 22,7, 22,6, 14,1 (2C), 11,9.
Ejemplo 37: 10-(2-etilhexil) decanodioato de 1-(3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo)
Figure imgf000093_0002
1H RMN (400MHz, CDCI3) 5 = 4,90 - 4,68 (m, 1H), 4,28 - 4,08 (m, 4H), 3,98 (dd, J=1,9, 5,9 Hz, 2H), 2,53 (d, J=6,5 Hz, 6H), 2,29 (dt, J=3,5, 7,5 Hz, 4H), 1,92 (c, J=6,5 Hz, 2H), 1,83 (td, J=6,5, 13,6 Hz, 2H), 1,74 - 1,48 (m, 7H), 1,43 - 1,17 (m, 36H), 1,03 (t, J=7,0 Hz, 6H), 0,96 - 0,82 (m, 9H). 13C RMN (101 MHz, CDCI3) 5 = 174,08, 173,73, 154,97, 75,55, 66,61, 66,49, 60,54, 49,03, 46,87 (2C), 38,68, 34,39, 34,20 (2C), 32,96, 31,90, 30,37, 29,65, 29,62 (2C), 29,55, 29,48, 29,43, 29,34, 29,10 (3C), 28,89, 26,35 (2C), 25,04, 24,99, 24,85, 23,74, 22,96, 22,68, 14,12, 14,05, 11,66 (2C), 10,98.
Ejemplo 38: 10-(2-etilhexil) decanodioato de 1-(3-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo) 1
Figure imgf000093_0003
1H RMN (400MHz, CDCI3) 5 = 4,81 (t, J=6,1 Hz, 1H), 4,26 - 4,08 (m, 4H), 3,98 (dd, J=1,9, 5,9 Hz, 2H), 2,45 (d, J=6,8 Hz, 4H), 2,30 (dt, J=3,4, 7,5 Hz, 4H), 2,24 (s, 3H), 1,97 - 1,81 (m, 4H), 1,72 - 1,50 (m, 7H), 1,43 - 1,20 (m, 36H), 1,07 (t, J=7,2 Hz, 3H), 0,96 - 0,82 (m, 9H). 13C RMN (101 MHz, CDCI3) 5 = 174,08, 173,73, 154,97, 75,55, 66,61, 66,49, 60,54, 49,0, 46,87 (2C), 38,68, 34,39, 34,20 (2C), 32,96, 31,90, 30,37, 29,65, 29,62 (2C), 29,55, 29,48, 29,43, 29,34, 29,10 (3C), 28,89, 26,35 (2C), 25,04, 24,99, 24,85, 23,74, 22,96, 22,68, 14,12, 14,05, 11,66 (2C), 10,98.
Síntesis del Ejemplo 39:
Intermedio 39a: ácido 10-(octanoiloxi)decanoico
Figure imgf000094_0001
A una solución de ácido octanoico (766 mg, 5.32 mmol) en diclorometano (25 ml) se le añadieron EDCHCI (1.02 g, 5.32 mmol) y DIPEA (0.95 ml, 5.32 mmol). La reacción se agitó durante 1 h a temperatura ambiente y después se añadieron ácido 10-hidroxidecanoico (500 mg, 2.66 mmol) y DMAP (162 mg, 1.33 mmol). La reacción se agitó durante 24 h más. La reacción se diluyó con agua y la capa acuosa se extrajo con diclorometano (2 x 30 ml). Los extractos de diclorometano combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato sódico y se filtraron. El filtrado se concentró a presión reducida y el material en bruto se purificó sobre gel de sílice con metanol/diclorometano como eluyente para proporcionar el producto deseado. TLC (gel de sílice, metanol al 10 % en diclorometano): Fr = 0,69
Los siguientes ejemplos (Ejemplos 39-42) pueden prepararse usando métodos similares a los empleados para la síntesis del Ejemplo 1.
Ejemplo 39: 10-(octanoiloxi)decanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo
Figure imgf000094_0002
1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 4,72 - 4,91 (m, 1 H) 4,13 - 4,35 (m, 4 H) 3,97 - 4,13 (m, 4 H) 2,85 (s a., 2 H) 2,62 (s a., 6 H) 2,30 (t, J=7,45 Hz, 4 H) 2,14 (s a., 2 H) 1,81 - 2,04 (m, 2 H) 1,50 - 1,73 (m, 8 H) 1,15- 1,42 (m, 36 H) 0,79 - 0,98 (m, 6H). MS (M 1) = 670,8, Rt = 1,19 min (LC Método 4).
Ejemplo 40: decanoato de 8-dodecil-2-metil-6,12-dioxo-5,7,11-trioxa-2-azanonadecan-19-ilo
Figure imgf000094_0003
1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 = 4,88 - 4,74 (m, 1H), 4,25 (t, J=5,4 Hz, 2H), 4,21 - 4,09 (m, 2H), 4,05 (t, J=6,7 Hz, 2H), 2,66 (s a., 2H), 2,41 - 2,24 (m, 9H), 1,92 (c, J=6,4 Hz, 2H), 1,73 - 1,51 (m, 9H), 1,48 - 1,18 (m, 38H), 0,96 - 0,81 (m, 6H). MS (M 1) = 657,9, Rt = 1,76 min (LC Método 4).
Ejemplo 41: 10-(octanoiloxi)decanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo 1
Figure imgf000094_0004
1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 0,80 - 0,94 (m, 6 H) 1,03 (t, J=6,53 Hz, 6 H) 1,18 - 1,41 (m, 38 H) 1,52 - 1,72 (m, 8 H) 1,84 (s a., 2 H) 1,92 (c, J=6,36 Hz, 2 H) 2,29 (t, J=7,53 Hz, 4 H) 2,54 (s a., 6 H) 4,05 (t, J=6,78 Hz, 2 H) 4,10 - 4,28 (m, 4 H) 4,81 (t, J=6,27 Hz, 1 H). 13C RMN (101MHz, CDCb) = 174,04, 173,75, 154,96, 75,56, 66,46, 64,35, 60,53, 49,03, 46,86 (2C), 34,38, 34,22, 34,19, 32,96, 31,90, 31,65, 29,65, 29,63 (2C), 29,56, 29,48, 29,43, 29,34, 29,33, 29,19 (2C), 29,11, 29,10, 28,92, 28,62, 26,51 - 26,06 (m, 1C), 25,90, 25,04, 25,00, 24,86, 22,68, 22,59, 14,12, 14,07, 11,59 (2C).
Ejemplo 42: 10-(octanoiloxi)decanoato de 3-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo
Figure imgf000095_0001
1H RMN (400MHz, CDCb) 5 = 4,93 - 4,67 (m, 1H), 4,25 - 4,09 (m, 4H), 4,05 (t, J=6,7 Hz, 2H), 2,42 (c, J=7,4 Hz, 4H), 2,29 (t, J=7,5 Hz, 4H), 2,21 (s, 3H), 2,00 - 1,79 (m, 4H), 1,67 - 1,50 (m, 8H), 1,41 - 1,15 (m, 38H), 1,05 (t, J=7,2 Hz, 3H), 0,88 (t, J=6,7 Hz, 6H). 13C RMN (101MHz, CDCb) 5 = 174,03, 173,74, 154,96, 75,57, 66,47, 64,35, 60,54, 53,46, 51,42, 41,56, 34,38, 34,21,34,18, 32,95, 31,90, 31,65, 29,62 (3C), 29,55, 29,48, 29,43, 29,33 (2C), 29,19 (2C), 29,10 (2C), 28,92, 28,61, 26,63, 25,90, 25,03, 25,00, 24,86, 22,68, 22,59, 14,12, 14,07, 12,28.
Los siguientes ejemplos (Ejemplos 43-46) pueden prepararse usando métodos similares a los empleados para la síntesis del Ejemplo 1.
Ejemplo 43: octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo
Figure imgf000095_0002
1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 5,23 - 5,48 (m, 4 H) 4,81 (t, J=5,31 Hz, 1 H) 4,01 - 4,29 (m, 4 H) 2,71 - 2,85 (m, 2 H) 2,63 (s a., 2 H) 2,44 (s a., 6 H) 2,30 (t, J=7,58 Hz, 2 H) 2,06 (c, J=7,07 Hz, 6 H) 1,84 - 1,97 (m, 2 H) 1,49 - 1,71 (m, 4 H) 1,34 -1,42 (m, 4 H) 1,18 - 1,34 (m, 30 H) 0,79 - 0,98 (m, 6 H). MS (M 1) = 636,5, Rt = 1,12 min (LC Método 6).
Ejemplo 44: octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo
Figure imgf000095_0003
1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 0,79 - 0,98 (m, 6 H) 1,04 (t, J=7,15 Hz, 6 H) 1,16 - 1,45 (m, 34 H) 1,51 - 1,72 (m, 5 H) 1,76 - 1,99 (m, 5 H) 2,05 (c, J=6,78 Hz, 4 H) 2,30 (t, J=7,65 Hz, 2 H) 2,47 - 2,64 (m, 4 H) 2,78 (t, J=6,53 Hz, 2 H) 4,05 - 4,28 (m, 4 H) 4,81 (t, J=6,15 Hz, 1 H) 5,24 - 5,53 (m, 4 H). MS (M 1) = 665,6, Rt = 1,40 min (LC Método 7).
Ejemplo 45: octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-3-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo
Figure imgf000095_0004
1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 5,29 - 5,46 (m, 4 H), 4,83 (quin, J=6,20 Hz, 1 H), 4,20 (t, J=6,53 Hz, 2 H), 4,15 (t, J=6,50 Hz, 2 H), 2,79 (t, J=6,53 Hz, 2 H), 2,52 (s a., 4 H), 2,23 - 2,37 (m, 5 H), 2,07 (c, J=6,78 Hz, 4 H), 1,94 (c, J=6,50 Hz, 4 H), 1,53 - 1,78 (m, 4 H), 1,23 - 1,43 (m, 34 H), 1,06 - 1,18 (m, 3 H), 0,86 - 0,96 (m, 6 H). MS (M 1) = 650,6, Rt = 1,92 min (LC Método 7).
Ejemplo 46: octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-3-(((2-(dimetilamino)etoxi)carbonil)oxi)pentadecilo
Figure imgf000096_0001
1H RMN (400MHz, CDCb) 5 = 5,45 - 5,28 (m, 4H), 4,81 (t, J=6,1 Hz, 1H), 4,24 (t, J=5,6 Hz, 2H), 4,19 - 4,07 (m, 2H), 2,78 (t, J=6,7 Hz, 2H), 2,64 (s a., 2H), 2,38 - 2,25 (m, 8H), 2,05 (c, J=6,9 Hz, 4H), 1,92 (c, J=6,4 Hz, 2H), 1,73 - 1,51 (m, 5H), 1,43 - 1,20 (m, 33H), 0,89 (dt, J=4,0, 6,8 Hz, 6H). MS (M 1) = 623,3, Rt = 1,70 min (LC Método 7).
* Síntesis del Ejemplo 47: 1,4-dimetilpiperidin-4-carboxilato de 1-((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoiloxi)pentadecan-3-ilo
Intermedio 47a: 1,4-dimetilpiperidin-4-carboxilato de 1-((terc-butildimetilsilil)oxi)pentadecan-3-ilo
Figure imgf000096_0002
En un matraz de fondo redondo equipado con una barra de agitación, se disolvió clorhidrato del ácido 1,4-dimetilpiperidin-4-carboxílico (0.612 g, 3.07 mmol) en DCM (Volumen: 20 ml). Se añadió DIPEA (1.461 ml, 8.36 mmol), seguido de DMAP (0.136 g, 1.115 mmol), el Intermedio 1g (1 g, 2.79 mmol) y, finalmente, EDCHCI (0.695 g, 3.62 mmol). La mezcla se agitó a ta durante una noche. Los volátiles se evaporaron a presión reducida. La mezcla en bruto se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (columna de 80 g, EtOAc al 0-30 %/Heptano, después MeOH al 0-5 %/DCM) para proporcionar el compuesto del título en forma de un aceite incoloro (0.373 g, 27 %). 1H RMN (400MHz, CDCb) 5 = 5,00 (d, J=6,3 Hz, 1H), 3,73 - 3,53 (m, 2H), 2,98 - 2,54 (m, 2H), 2,28 (s, 3H), 2,15 (m, 3H), 1,78 (c, J=6,8 Hz, 2H), 1,56 (d, J=6,8 Hz, 4H), 1,25 (s, 21H), 1,19 (s, 3H), 0,99 - 0,82 (m, 12H), 0,16 - 0,00 (m, 6H).
Intermedio 47b: 1,4-dimetilpiperidin-4-carboxilato de 1-hidroxipentadecan-3-ilo
Figure imgf000096_0003
En un matraz de fondo redondo de 250 ml equipado con una barra de agitación, el Intermedio 47a (373 mg, 0.749 mmol) se disolvió en MeOH (Volumen: 10 ml) a ta. Se añadió CAN (1068 mg, 1.948 mmol) y la mezcla se agitó a ta durante 2 h. A la mezcla se le añadieron una solución sat. de bicarbonato sódico y DCM en un embudo de decantación. Después, los extractos orgánicos se lavaron con bicarb., se extrajeron en DCM, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron a presión para dar la mezcla del producto en bruto. La purificación por cromatografía en columna sobre gel de sílice (columna de 80 g, MeOH al 0-10 %/DCM) proporcionó el compuesto del título en forma de un aceite incoloro con rendimiento cuantitativo (287 mg, 100 %). Fr = 0.20, MeOH al 5 %DCM
* Ejemplo 47: 1,4-dimetilpiperidin-4-carboxilato de 1-((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoiloxi)pentadecan-3-ilo En un matraz de fondo redondo de 50 ml equipado con una barra de agitación, ácido linoleico (252 mg, 0.898 mmol) y el Intermedio 47b (287 mg, 0.748 mmol) se disolvieron en DCM (Volumen: 10 ml). Se añadió DIPEA (0.523 ml, 2.99 mmol), seguido de DMAP (36.6 mg, 0.299 mmol) y, finalmente, EDc Hc I (229 mg, 1.197 mmol). La mezcla se agitó a ta durante una noche. El disolvente se evaporó a presión. La purificación por cromatografía sobre gel de sílice (columna de 40 g, EtOAc al 0-60 %/heptanos) proporcionó el compuesto del título en forma de un aceite incoloro (270 mg, 53 %). 1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 = 5,46 - 5,27 (m, 4H), 5,01 (s a., 1H), 4,17 - 4,00 (m, 2H), 2,77 (t, J=6,5 Hz, 2H), 2,73 - 2,56 (m, 2H), 2,37 - 2,24 (m, 6H), 2,15 (d, J=12,8 Hz, 4H), 2,05 (c, J=6,8 Hz, 5H), 1,98 - 1,81 (m, 3H), 1,69 - 1,48 (m, 7H), 1,44 - 1,22 (m, 30H), 1,20 (s, 3H), 0,89 (dt, J=4,3, 6,8 Hz, 6H). 13C RMN (100 MHz, CDCla) 5 = 176,3, 173,8, 130,2, 130,0, 128,1, 127,9, 70,8, 60,5 (2C), 53,0 (2C), 46,1,41,0, 34,6, 34,2, 34,1, 33,1, 31,9, 31,5, 29,7, 29,6 (3C), 29,5 (2C), 29,4, 29,3 (3C), 29,2, 29,1, 27,2 (2C), 25,6, 25,1, 24,9, 22,7, 22,6 (2C), 14,1 (2C).
Síntesis del Ejemplo 48
Intermedio 48a: 1-((terc-butiidimetilsilil)oxi)tetradecan-2-ol
Figure imgf000097_0001
Una suspensión de tetradecano-1,2-diol (10 g, 43.4 mmol), imidazol (2.95 g, 43.4 mmol) y TBSCI (7.20 g, 477 mmol) en THF se agitó durante 15 h a ta, después se vertió en agua (300 ml) y se extrajo con EtOAc. El extracto orgánico se lavó con salmuera y se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó sobre gel de sílice con EtOAc/heptano como eluyente para proporcionar 11.96 g del producto deseado. 1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 3,59 - 3,70 (m, 2 H), 3,31 - 3,44 (m, 1 H), 2,44 (s a., 1 H), 1,35 - 1,51 (m, 2 H), 1,26 (s, 20 H), 0,81 - 0,98 (m, 12 H), 0,08 (s, 6 H).
Intermedio 48b: (3-(dietilamino)propil) carbonato de 1-((terc-butildimetilsilil)oxi)tetradecan-2-ilo
Figure imgf000097_0002
En un tubo de plástico, el Intermedio 48b (3.27 g, 6.52 mmol) se disolvió en 10 ml de THF y se enfrió en un baño de hielo. Se añadió HFPy (3.43 ml, 195 mmol) gota a gota. Después, la mezcla se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante una hora. Se añadió NaHCO3 sat. y la fase acuosa se extrajo tres veces con EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron y se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida para proporcionar 2.5 g del producto deseado, que se usó sin purificación adicional. Fr = 0.25, MeOH al 15 % en DCM
Ejemplo 48: 4,4-bis((2-etilhexil)oxi)butanoato de 2-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)tetradecilo
Figure imgf000098_0001
Ejemplo 48 pueden prepararse usando métodos similares a los empleados para la síntesis del Ejemplo 12. 1H RMN (400 MHz, CDCls) 5 = 4,83 - 4,96 (m, 1 H), 4,45 (t, J=5,40 Hz, 1 H), 4,30 (dd, J=11,92, 2,64 Hz, 1 H), 4,14 - 4,26 (m, 2 H), 4,05 (dd, J=12,05, 6,53 Hz, 1 H), 3,42 - 3,54 (m, 2 H), 3,28 (td, J=9,03, 6,02 Hz, 2 H), 2,59 (s a., 6 H), 2,41 (t, J=7,65 Hz, 2 H), 1,79 - 2,01 (m, 3 H), 1,52 - 1,74 (m, 3 H), 1,19 - 1,52 (m, 38 H), 1,07 (s a., 6 H), 0,77 - 0,96 (m, 15 H). MS (M 1) = 715,0, Rt = 1,96 min (LC Método 11).
Síntesis del Ejemplo 49:
Intermedio 49a: (12Z,15Z)-1-((terc-butildimetilsilil)oxi)henicosa-12,15-dien-3-ol
Figure imgf000098_0002
Se pesaron limaduras de magnesio (0.516 mg, 21.2 mmol) en un matraz presecado de 100 ml. El matraz se cargó con nitrógeno, se selló con un tabique perforado con una salida de aguja de 16G y se puso en un horno a 120 °C durante 2 horas. El matraz se retiró del horno, se retiró la aguja y el matraz se dejó enfriar a temperatura ambiente. Al matraz se le añadieron 40 ml de THF anhidro y una cantidad catalítica de yodo, seguido de la adición de bromuro linoleílo (5.25 g, 16.0 mmol). El matraz se conectó con un condensador y la reacción se calentó a reflujo en atmósfera de N2 hasta que se consumió la mayor parte del magnesio (aprox. 1 h), y después se enfrió a temperatura ambiente.
A una solución de 3-(terc-butildimetilsililoxi)propanal (Intermedio 1g, 2.5 g, 13.3 mmol) en 50 ml de THF, enfriada en un baño de hielo-agua, se le añadió gota a gota el reactivo de Grinard preparado anteriormente. La reacción se agitó durante 30 min. La reacción se interrumpió con NaHCO3 sat. y se extrajo con acetato de etilo. Los extractos orgánicos combinados se secaron, se concentraron a presión reducida y se purificaron sobre gel de sílice con acetato de etilo al 10 %/heptano como eluyente para proporcionar 2.7 g del producto deseado. 1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 5,17-5,37 (m, 4H), 3,78­ 3,87 (m, 1H), 3,67-3,78 (m, 2H), 2,68 (t, J=4,0 Hz, 2H), 1,89-2,05 (m, 4H), 1,53-1,64 (m, 2H), 1,12-1,44 (m, 18H), 0,77­ 0,85 (m, 14H), 0,00 (s, 6H).
Intermedio 49b: (12Z,15Z)-henicosa-12,15-dieno-1,3-diol
Figure imgf000098_0003
A una solución del Intermedio 49a (1.1 g, 2.5 mmol) en 15 ml de THF a temperatura ambiente se le añadió TBAF (3.01 ml, solución 1.0 M de THF, 3.01 mmol). La reacción se agitó durante 1 h. La reacción se extrajo entre salmuera y acetato de etilo. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato sódico, se concentraron a presión reducida y se purificaron sobre gel de sílice con acetato de etilo al 50 %/heptano como eluyente para proporcionar el producto deseado (0.78 g, 96 %). 1H RMN (CDCls) 5 = 5,24-5,56 (m, 4H), 3,82-4,00 (m, 3H), 2,70-2,87 (m, 2H), 2,19 (s a., 2H), 2,07 (c, J=6,7 Hz, 4H), 1,64-1,82 (m, 2H), 1,20-1,54 (m, 20H), 0,89-0,97 (m, 3H)
Intermedio 49c:
Figure imgf000098_0004
A una solución del Intermedio 49b (390 mg, 1.20 mmol) en DCM (10 ml) se le añadió ácido linoleico (404 mg, 1.44 mmol) seguido de DIPEA (0.210 ml, 1.20 mmol), DMAP (58.7 mg, 0.48 mmol) y EDCHCI (323 mg, 1.68 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 90 min. La reacción se extrajo entre salmuera y acetato de etilo. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato sódico y se filtraron. El filtrado se concentró a presión reducida y el residuo se purificó sobre gel de sílice con acetato de etilo al 15 %/heptano como eluyente para proporcionar el compuesto del título. 1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 5,30 - 5,45 (m, 8 H), 4,39 (ddd, J=11,23, 8,60, 5,02 Hz, 1 H), 4,15 (dt, J=11,17, 5,71 Hz, 1 H), 3,61 - 3,73 (m, 1 H), 2,79 (t, J=6,27 Hz, 4 H), 2,33 (t, J=7,65 Hz, 2 H), 2,07 (c, J=6,94 Hz, 8 H), 1,83 (dddd, J=14,40, 8,69, 5,77, 3,26 Hz, 1 H), 1,54 - 1,75 (m, 3 H), 1,42 - 1,54 (m, 3 H), 1,23 - 1,42 (m, 32 H), 0,85 - 0,96 (m, 6 H)
* Ejemplo 49: octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-(12Z,15Z)-3-((3-(dimetilammo)propanoil)oxi)hemcosa-12,15-dien-1-ilo
Figure imgf000099_0001
El Ejemplo 49 pueden prepararse usando métodos similares a los empleados para la síntesis del Ejemplo 1. 1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 5,16-5,40 (m, 8H), 4,92 (s, 1H), 3,91-4,16 (m, 2H), 2,70 (t, J=6,3 Hz, 4H), 2,49-2,59 (m, 2H), 2,36­ 2,45 (m, 2H), 2,21 (t, J=7,5 Hz, 2H), 2,18 (s, 6H), 1,98 (c, J=7,1 Hz, 8H), 1,74-1,86 (m, 2H), 1,43-1,59 (m, 4H), 1,14-1,35 (m, 32H), 0,69-0,90 (m, 6H). MS (M 1) = 686,5, Rt = 1,13 min (LC Método 6).
Los siguientes ejemplos (Ejemplos 50-53) pueden prepararse usando métodos similares a los empleados para la síntesis del Ejemplo 49.
* Ejemplo 50: 3-octilundecanoato de (12Z,15Z)-3-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)henicosa-12,15-dien-1-ilo, sal formiato
Figure imgf000099_0002
1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 = 8,53 (s, 1 H), 5,27 - 5,47 (m, 4 H), 4,93 - 5,05 (m, 1 H), 4,09 (t, J=6,65 Hz, 2 H), 2,79 (t, J=6,80 Hz, 2 H), 2,67 (dd, J=9,03, 6,53 Hz, 2 H), 2,50 (s, 6 H), 2,39 (t, J=7,15 Hz, 2 H), 2,23 (d, J=6,78 Hz, 2 H), 2,07 (c, J=6,80 Hz, 4 H), 1,78 - 1,99 (m, 5 H), 1,48 - 1,69 (m, 3 H), 1,20 - 1,44 (m, 46 H), 0,83 - 0,96 (m, 9 H). MS (M 1) = 718,4, Rt = 1,34 min (LC Método 6).
* Ejemplo 51: 5-heptildodecanoato de (12Z,15Z)-3-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)henicosa-12,15-dien-1-ilo
Figure imgf000099_0003
1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 = 5,23 - 5,49 (m, 4 H), 4,84 - 5,08 (m, 1 H), 3,95 - 4,19 (m, 2 H), 2,74 - 2,83 (m, 2 H), 2,56 (s a., 6 H), 2,42 (t, J=6,82 Hz, 2 H), 2,27 (t, J=7,58 Hz, 2 H), 2,06 (c, J=6,91 Hz, 6 H), 1,77 - 1,97 (m, 2 H), 1,48 - 1,67 (m, 5 H), 1,14 - 1,42 (m, 46 H), 0,81 - 0,96 (m, 9 H). MS (M 1) = 718,5, Rt = 1,25 min (LC Método 5).
* Ejemplo 52: 7-hexiltridecanoato de (12Z,15Z)-3-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)henicosa-12,15-dien-1-ilo 1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 = 5,25 - 5,48 (m, 4 H), 4,91 - 5,06 (m, 1 H), 4,00 - 4,21 (m, 2 H), 2,78 (t, J=6,53 Hz, 2 H), 2,24 - 2,48 (m, 12 H), 1,99 - 2,13 (m, 4 H), 1,71 - 1,99 (m, 7 H), 1,48 - 1,71 (m, 4 H), 1,24 - 1,48 (m, 30 H), 1,22 (s a., 12 H), 0,76 - 0,99 (m, 9 H). 13C RMN (101 MHz, CDCla) 5 = 173,90, 173,10, 130,19, 130,10, 127,96 (2 C), 71,12, 60,55, 58,82, 45,26 (2 C) 37,35, 34,32, 34,23, 33,60 (2 C) 33,49, 33,02, 32,09, 31,94 (2 C) 31,51, 29,82 (3 C), 29,66 (2 C), 29,48 (2 C), 29,34, 29,29, 27,22, 27,18, 26,62 (2 C), 26,37, 25,60, 25,19, 24,99, 22,71 (2 C), 22,57, 22,54, 14,14 (2 C), 14,09.
* Ejemplo 53: 9-pentiltetradecanoato de (12Z,15Z)-3-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)henicosa-12,15-dien-1-ilo
Figure imgf000100_0003
A una solución de alcohol de linoleílo (2.0 g, 7.5 mmol) en 40 ml de acetato de etilo, enfriada en un baño de hielo-agua, se le añadió trifosgeno (1.11 g, 3.8 mmol), seguido de DIPEA (2.1 ml, 12.0 mmol). La reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 10 min más. Después, la reacción se filtró, se concentró a presión reducida y se purificó sobre gel de sílice con DCM al 20 %/heptano para proporcionar el producto deseado (2.0 g, 81 %). 1H RMN (CDCb) 5 = 5,25­ 5,54 (m, 4H), 4,34 (t, J=6,8 Hz, 2H), 2,80 (t, J=6,4 Hz, 2H), 2,07 (c, J=6,9 Hz, 4H), 1,63-1,82 (m, 2H), 1,19-1,46 (m, 16H), 0,81-0,99 (m, 3H)
Intermedio 54b: carbonato de (12Z,15Z)-3-hidroxihenicosa-12,15-dien-1-il (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-ilo
Figure imgf000100_0001
A una solución del Intermedio 49b (50.0 mg, 0.15 mmol) en 2.0 ml de DCM, enfriada en un baño de hielo-agua, se le añadió el Intermedio 54a (60.8 mg, 0.185 mmol), seguido de piridina (48.7 mg, 0.616 mmol). La reacción se agitó a durante 4.5 h. La reacción se interrumpió con NaHCO3 ac. sat. y se extrajo con acetato de etilo. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato sódico y se filtraron. El filtrado se concentró a presión reducida y el residuo se purificó sobre gel de sílice con acetato de etilo al 15 %/heptano para proporcionar el compuesto del título. 1H RMN (CDCb) 5 = 5,27-5,57 (m, 8H), 4,34-4,49 (m, 1H), 4,20-4,32 (m, 1H), 4,15 (t, J=6,7 Hz, 2H), 3,75 (d, J=6,1 Hz, 1H), 2,80 (t, J=6,4 Hz, 4H), 2,07 (c, J=6,8 Hz, 8H), 1,82-1,96 (m, 1H), 1,57-1,78 (m, 6H), 1,22-1,52 (m, 34H), 0,84-0,98 (m, 6H) *
* Ejemplo 54: 3-(dimetilamino)propanoato de (12Z,15Z)-1-((((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)carbonil)oxi)henicosa-12,15-dien-3-ilo
Figure imgf000100_0002
El Ejemplo 54 pueden prepararse usando métodos similares a los empleados para la síntesis del Ejemplo 49. 1H RMN (CDCb) 5 = 5,26-5,51 (m, 8H), 5,02 (s a., 1H), 4,15 (dt, J=19,7, 6,7 Hz, 4H), 2,79 (t, J=6,4 Hz, 4H), 2,57-2,67 (m, 2H), 2,41-2,57 (m, 2H), 2,26 (s, 6H), 2,06 (c, J=6,9 Hz, 8H), 1,86-2,00 (m, 2H), 1,64-1,73 (m, 2H), 1,23-1,42 (m, 36H), 0,85­ 0,97 (m, 6H). MS (M 1) = 716,8. Rt = 1,12min. (LC Método 11).
* Síntesis del Ejemplo 55:
Intermedio 55a: 2,2-bis(heptiloxi)acetato de heptilo
Figure imgf000101_0001
A una solución de 2,2-dimetoxiacetato de metilo (5.0 g, 37.3 mmol) en heptanol (26.3 ml, 186 mmol) se le añadió ácido canforsulfónico (0.43 g, 1.86 mmol) y la reacción se calentó a 100 °C durante una noche. La reacción se enfrió a temperatura ambiente y se concentró a presión reducida. El concentrado se purificó sobre gel de sílice con diclorometano/heptano como eluyente para proporcionar 4.0 g del compuesto deseado. 1H RMN (400 MHz, CDCb): 5 = 4,86 (s, 1H), 4,21 (t, J = 6,78 Hz, 2H), 3,52-3,69 (m, 4H), 1,55-1,77 (m, 6H), 1,20-1,45 (m, 24H), 0,82-0,98 (m, 9H) ppm.
Intermedio 55b: ácido 2,2-bis(heptiloxi)acético
Figure imgf000101_0002
A una solución del Intermedio 26a (4.06 g, 10.5 mmol) en metanol (50 ml) se l añadió hidróxido sódico (ac. 2 N, 7.88 ml, 15.8 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una noche. La reacción se diluyó con acetato de etilo y salmuera. La capa acuosa se ajustó a pH neutro con HCI ac. 1 N y se extrajo con acetato de etilo. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El concentrado se purificó sobre gel de sílice (equilibrado con amoniaco 0.4 N y metanol al 2 % en diclorometano) con metanol/diclorometano como eluyente para proporcionar 2.3 g del compuesto deseado. 1H RMN (400 MHz, CDCb): 5 = 4,88 (s, 1H), 3,53-3,71 (m, 4H), 1,63 (quin, J = 6,84 Hz, 4H), 1,18-1,43 (m, 16H), 0,84-0,97 (m, 6 H) ppm.
Intermedio 55c:
Figure imgf000101_0003
A una solución del Intermedio 55c (174 mg, 0.286 mmol) en DCM (4.0 ml) enfriada en un baño de hielo-agua se le añadió piridina (0.035 ml, 0.429 mmol) seguido de trifosgeno (42.4 mg, 0.143 mmol). Después de 30 min, se añadió 2-(dimetilamino)etanol (0.086 ml, 0.857 mmol) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. La reacción se extrajo entre NaHCO3 sat. y DCM. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato sódico y se filtraron. El filtrado se concentró a presión reducida y el residuo se purificó sobre gel de sílice con eluyente de acetato de etilo al 60 %/heptano para proporcionar el compuesto del título. 1H RMN (CDCb) 5 = 5,19-5,37 (m, 4H), 4,81 (s, 1H), 4,64 (s, 1H), 4,07-4,18 (m, 4H), 3,43-3,59 (m, 4H), 2,66-2,74 (m, 2H), 2,52 (t, J=5,9 Hz, 2H), 2,21 (s, 6H), 1,92-2,02 (m, 4H), 1,38-1,76 (m, 12H), 1,12-1,36 (m, 32H), 0,72-0,88 (m, 9H). MS (M 1) = 724,4, Rt = 1,21 min (LC Método 6)
* Ejemplo 56: 2,2-bis(heptiloxi)acetato de (13Z,16Z)-4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)docosa-13,16-dien-1-ilo
Figure imgf000102_0001
1H RMN (CDCb) 5 = 5,25-5,51 (m, 4H), 4,89 (s, 1H), 4,61-4,79 (m, 1H), 4,09-4,29 (m, 4H), 3,44-3,71 (m, 4H), 2,79 (t, J=6,4 Hz, 2H), 2,45-2,61 (m, 6H), 2,00-2,15 (m, 4H), 1,71-1,89 (m, 4H), 1,47-1,71 (m, 8H), 1,24-1,43 (m, 34H), 1,02 (t, J=7,2 Hz, 6H), 0,86-0,95 (m, 9H). MS (M 1) = 766,5, Rt = 1,22 min (LC Método 6).
* Síntesis del Ejemplo 57:
Intermedio 57a: ((2,2-bis(heptiloxi)etoxi)metil)benceno
Figure imgf000102_0002
Se combinaron benciloxilacetaldehído (2 g, 13.3 mmol), heptanol (4.64 g, 40.0 mmol) y PPTS (33.0 mg, 0.13 mmol) en un matraz de fondo redondo. La mezcla se calentó a 110 °C durante 72 h. La reacción se cargó directamente sobre gel de sílice y se purificó con acetato de etilo al 3 %/heptano para proporcionar el producto deseado (3.0 g, 62 %). 1H RMN (CDCla) 5 = 7,30-7,40 (m, 5H), 4,68 (t, J=5,3 Hz, 1H), 4,61 (s, 2H), 3,61-3,66 (m, 2H), 3,48-3,55 (m, 4H), 1,60-1,72 (m, 4H), 1,27-1,38 (m, 16H), 0,87-0,93 (m, 6H).
Intermedio 57b: 2,2-bis(heptiloxi)etanol
Figure imgf000102_0003
A una solución del Intermedio 57a (2.7 g, 7.41 mmol) en 40 ml de EtOAc/MeOH (1:1) a temperatura ambiente se le añadió Pd al 10 %/C (0.788 g 0.74 mmol). La atmósfera de reacción se intercambió con H2 y se trató con un globo de H2 a temperatura ambiente durante 3 h. La reacción se filtró, se concentró a presión reducida y se purificó sobre gel de sílice con acetato de etilo al 12 %/heptano para proporcionar el producto deseado (1.0 g, 49 %). 1H RMN (CDCb) 5 = 4,55 (t, J=5,4 Hz, 1H), 3,70 (dt, J=9,3, 6,8 Hz, 2H), 3,59 (d, J=4,8 Hz, 2H), 3,51 (dt, J=9,3, 6,8 Hz, 2H), 1,61 (dt, J=14,3, 6,9 Hz, 4H), 1,21-1,43 (m, 16H), 0,83-0,96 (m, 6H).
Intermedio 57c: ácido 3-((3-(2,2-bis(heptiloxi)etoxi)-3-oxopropil)disulfanil)propanoico
Figure imgf000102_0004
A una suspensión de ácido disulfurodipropanoico (115 mg, 0.547 mmol) en 3.0 ml de DCM se le añadieron el Intermedio 57b (100 mg, 0.364 mmol), DMAP (17.81 mg, 0.656 mmol) y DIPEA (32 ul, 0.182 mmol). Por último, se añadió EDC (126 mg, 0.656 mmol). La mezcla se volvió transparente y se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. La reacción se extrajo entre salmuera y acetato de etilo. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato sódico, se concentraron a presión reducida y se purificaron sobre gel de sílice con acetato de etilo al 30 %/heptano para proporcionar el producto deseado (75 mg, 44 %). 1H RMN (CDCb) 5 = 4,72 (t, J=5,4 Hz, 1H), 4,15 (d, J=5,3 Hz, 2H), 3,65 (dt, J=9,3, 6,8 Hz, 2H), 3,51 (dt, J=9,3, 6,8 Hz, 2H), 2,90-3,03 (m, 4H), 2,75-2,86 (m, 4H), 1,60 (quin, J=7,0 Hz, 4H), 1,19-1,43 (m, 16H), 0,81­ 0,97 (m, 6H).
* Ejemplo 57: 3-((3-etiM0-((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)-8,15-dioxo-7,9,14-trioxa-3-azaheptadecan-17-il)disulfanil)propanoato de 2,2-bis(heptiloxi)etilo
Figure imgf000103_0001
El Ejemplo 57 pueden prepararse usando métodos similares a los empleados para la síntesis del Ejemplo 55. 1H RMN (CDCI3) 5 = 5,23-5,44 (m, 4H), 4,65-4,74 (m, 1H), 4,63 (t, J=5,4 Hz, 1H), 4,14 (td, J=6,5, 1,8 Hz, 2H), 4,00-4,11 (m, 4H), 3,59 (dt, J=9,2, 6,7 Hz, 2H), 3,44 (dt, J=9,1, 6,7 Hz, 2H), 2,83-2,95 (m, 4H), 2,65-2,79 (m, 6H), 2,41-2,52 (m, 6H), 2,01 (c, J=6,9 Hz, 4H), 1,73-1,84 (m, 2H), 1,45-1,73 (m, 10H), 1,16-1,38 (m, 34H), 0,97 (t, J=7,2 Hz, 6H), 0,78-0,89 (m, 9H). MS (M 1) = 944,5, Rt = 1,25min (LC Método 6).
Síntesis del Ejemplo 58:
Ejemplo 58a:
Figure imgf000103_0002
En un matraz de fondo redondo de 500 ml equipado con una barra de agitación, 9-heptadecanol (1.12 g, 4.37 mmol) se disolvió en DCM (30 ml). Se añadieron ácido 4-(terc-butoxi)-4-oxobutanoico (0.913 g, 5.24 mmol) y DMAP (0.107 g, 0.873 mmol), seguido de DIPEA (3.05 ml, 17.47 mmol). La mezcla se agita a ta durante un minuto antes de la adición de EDCHCI (1.172 g, 6.11 mmol). Después, la mezcla se agita a ta durante una noche. La mezcla se concentró a presión reducida y el concentrado se purificó sobre gel de sílice con acetato de etilo/heptano como eluyente para proporcionar el compuesto del título. 1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 4,89 (quin, J=6,27 Hz, 1 H), 2,48 - 2,65 (m, 4 H), 1,48 - 1,57 (m, 4 H), 1,42 - 1,48 (m, 9 H), 1,18 - 1,38 (m, 24 H), 0,84 - 0,96 (m, 6 H) Ejemplo 58b:
Figure imgf000103_0003
El Intermedio 58a se trató con TFA (3.36 ml, 43.7 mmol) y se agitó a ta durante -30 min. La reacción se concentró a sequedad a presión reducida para proporcionar el compuesto del título, que se usó sin purificación adicional. 1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 = 7,94 (s a., 1 H), 4,91 (quin, J=6,27 Hz, 1 H), 2,54 - 2,83 (m, 4 H), 1,50 - 1,62 (m, 4 H), 1,18 - 1,39 (m, 24 H), 0,82 - 1,00 (m, 6 H)
Ejemplo 58: heptadecan-9-il succinato de (13Z,16Z)-4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)docosa-13,16-dien-1-ilo
Figure imgf000103_0004
1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 5,46 - 5,26 (m, 4H), 4,87 (t, J=6,1 Hz, 1H), 4,72 (s a., 1H), 4,19 (t, J=6,5 Hz, 2H), 4,14 -,04 (m, 2H), 2,78 (t, J=6,5 Hz, 2H), 2,62 (s, 4H), 2,43 (d, J=6,5 Hz, 2H), 2,29 (s, 6H), 2,05 (c, J=7,0 Hz, 4H), 1,97 - 1,83 (m, 2H), 1,79 - 1,44 (m, 10H), 1,42 - 1,17 (m, 42H), 0,95 - 0,82 (m, 9H) ppm. LC-MS m/z = 807,2 (MH+). Rt = 2,01 min (LC Método 11).
* Síntesis del Ejemplo 59:
Intermedio 59a: 2-(2-((terc-butildimetilsilil)oxi)etoxi)acetaldehído
Figure imgf000104_0001
A una solución de DMSO (1.04 ml, 14.7 mmol) en 35 ml de DCM, enfriada en un baño de hielo seco/acetona, se le añadió cloruro de oxalilo (0.96 ml, 11.03 mmol), gota a gota. Después de 30 min, se añadió una solución de 2-(2-((tercbutildimetilsilil)oxi)etoxi)etanol (1.62 g, 7.35 mmol) en 5 ml de DCM gota a gota. La reacción se agitó durante 45 min y se añadió TEA (5.12 ml, 36.8 mmol). Después de 15 min, la reacción se calentó a temperatura ambiente. Se añadió NH4O ac. sat. y la reacción se extrajo con acetato de etilo. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato sódico, se concentraron a presión reducida y se purificaron sobre gel de sílice con EtOAc al 30 %/hexano para proporcionar el producto deseado (1.0 g, 62 %). 1H RMN (400 MHz, CDCls) 5 = 9,67 (s, 1H), 4,10 (d, J=1,0 Hz, 2H), 3,73-3,77 (m, 2H), 3,56-3,60 (m, 2H), 0,81-0,83 (m, 9H), -0,02 (s, 6 H).
Intermedio 59b: (11Z,14Z)-1-(2-((terc-butildimetilsilil)oxi)etoxi)icosa-11,14-dien-2-ol
Figure imgf000104_0002
A una solución del Intermedio 59a (0.78 g, 3.57 mmol) en 6.0 ml de THF, enfriada en un baño de hielo-agua, se le añadió bromuro de linoleilmagnesio (12.50 ml, solución 0.4 M de THF, 5.0 mmol), gota a gota. La reacción se agitó durante 30 min. La reacción se interrumpió con NaHCO3 ac. sat. y se extrajo con acetato de etilo. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato sódico, se concentraron a presión reducida y se purificaron sobre gel de sílice con acetato de etilo al 10 %/heptano para proporcionar el producto deseado (0.85 g, 51 %). 1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 5,17-5,40 (m, 4H), 3,63-3,77 (m, 3H), 3,42-3,57 (m, 3H), 3,22 (dd, J=12,0, 8,0 Hz, 1H), 2,69 (m, 2H), 1,97 (m, 4H), 1,11-1,43 (m, 21H), 0,74-0,86 (m, 12H), -0,05-0,04 (s, 6 H).
Intermedio 59c: -(dimetilamino)propanoato de (11Z,14Z)-1-(2-((terc-butildimetilsilil)oxi)etoxi)icosa-11,14-dien-2-ilo
Figure imgf000104_0003
A una solución del Intermedio 59b (450 mg, 0.96 mmol) y ácido dimetilaminopropanoico (188 mg, 1.15 mmol) en 10 ml de DCM se le añadieron DMAP (46.9 mg, 0.38 mmol) y DlPEA (0.50 ml, 2.88 mmol). Por último, se añadió EDC (258 mg, 1.15 mmol). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se extrajo entre salmuera y acetato de etilo. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato sódico, se concentraron a presión reducida y se purificaron sobre gel de sílice con MeOH al 6 %/DCM para proporcionar el producto deseado (370 mg, 6 8 %). 1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 = 5,20-5,43 (m, 4H), 4,91-5,04 (m, 1H), 3,61-3,73 (m, 2H), 3,38-3,56 (m, 4H), 2,71 (t, J=4,0 Hz, 2H), 2,53-2,64 (m, 2H), 2,38-2,50 (m, 2H), 2,20 (s, 6 H), 1,92-2,05 (m, 4H), 1,12-1,35 (m, 20H), 0,76-0,88 (m, 12H), 0,00 (s, 6 H).
Intermedio 59d: 3-(dimetilamino)propanoato de (11Z,14Z)-1-(2-hidroxietoxi)icosa-11,14-dien-2-ilo
Figure imgf000104_0004
A una solución del Intermedio XXc (370 mg, 0.651 mmol) en 10 ml de THF se le añadió TBAF (0.717 ml 10 M en solución de THF, 0.717 mmol) gota a gota. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. La reacción se extrajo entre salmuera y acetato de etilo. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se concentraron a presión reducida para proporcionar el producto deseado, que se usó sin purificación adicional. 1H RMN (400 MHz, CDCls) 5 = 5,26 (s, 4H), 4,93-5,11 (m, 1H), 3,55-3,63 (m, 2H), 3,46-3,54 (m, 1H), 3,39-3,46 (m, 3H), 2,39­ 2,82 (m, 6 H), 2,27 (s, 6 H), 1,89-2,00 (m, 4H), 1,10-1,29 (m, 20H), 0,77-0,81 (m, 3H).
* Ejemplo 59: octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-2-(((11Z,14Z)-2-((3-(dimetilamino)propanoil)oxi)icosa-11,14-dien-1-il)oxi)etilo
Figure imgf000105_0001
Ejemplo 59 pueden prepararse usando métodos similares a los empleados para la síntesis del Ejemplo 1. 1H RMN (CDCla) 5 = 5,18-5,62 (m, 8H), 5,04 (s, 1H), 4,21 (t, J=4,9 Hz, 2H), 3,68-3,79 (m, 1H), 3,60-3,68 (m, 1H), 3,54 (t, J=4,5 Hz, 2H), 2,79 (t, J=6,3 Hz, 4H), 2,60-2,69 (m, 2H), 2,46-2,55 (m, 2H), 2,33 (t, J=7,6 Hz, 2H), 2,26 (s, 6H), 2,06 (c, J=7,2 Hz, 8H), 1,54-1,71 (m, 4H), 1,22-1,44 (m, 32H), 0,85-0,99 (m, 6H). MS (M 1) = 717,1, Rt = 1,32min (LC Método 6).
* Síntesis del Ejemplo 60:
Intermedio 60a: 2-((10-bromodecil)oxi)tetrahidro-2H-pirano
Figure imgf000105_0002
A una solución de 10-bromo-1-decanol (pureza del 85 %, 6.0 g, 25.3 mmol) en diclorometano se le añadieron dihidropirano (2.75 ml, 30.4 mmol) y ácido p-toluenosulfónico monohidrato (2.5 g, 12.6 mmol). La mezcla resultante se agitó a 30 °C durante 2 h. La reacción se diluyó con agua y se extrajo con diclorometano (2 x 50 ml). Los extractos de diclorometano combinados se lavaron con salmuera (50 ml), se secaron sobre sulfato sódico y se filtraron. El filtrado se concentró a presión reducida y el material en bruto se purificó sobre gel de sílice con acetato de etilo/hexanos como eluyente para proporcionar el producto deseado. TLC (gel de sílice, acetato de etilo al 20 %:hexano): Fr = 0,73.
Intermedio 60b: 2-((10-yododecil)oxi)tetrahidro-2H-pirano
Figure imgf000105_0003
A una solución del Intermedio 60a (6.0 g, 18.74 mmol) en acetona (80 ml) se le añadió yoduro de sodio (8.4 g, 56.2 mmol). La reacción se calentó a reflujo durante 24 h. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se concentró a presión reducida. El concentrado se diluyó con agua (100 ml) y se extrajo con diclorometano (2 x 50 ml). Los extractos de diclorometano combinados se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron sobre sulfato sódico y se filtraron. El filtrado se concentró a presión reducida para proporcionar el producto deseado, que se usó sin purificación adicional. TLC (gel de sílice, acetato de etilo al 20 %:hexano): Fr = 0,73.
Intermedio 60c: 1-((terc-butildimetilsilil)oxi)-13-((tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)tridecan-3-ol
Figure imgf000105_0004
A una solución del Intermedio 60b (6.00 g, 16.30 mmol) en pentano (75 ml) y éter dietílico (25 ml), en una atmósfera de argón y enfriada en un baño de hielo seco/acetona, se le añadió terc-butil litio (1.5 M en pentano, 22 ml, 32.6 mmol). Se añadió una solución de 3-((terc-butildimetilsilil)oxi)propanal en éter dietílico (20 ml). La reacción se interrumpió con cloruro de amonio acuoso saturado (50 ml) y la reacción se dejó calentar a temperatura ambiente. La capa acuosa se extrajo con éter dietílico (2 x 100 ml). Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato sódico y se filtraron. El filtrado se concentró a presión reducida y el material en bruto se purificó sobre gel de sílice con acetato de etilo/hexanos como eluyente para proporcionar el producto deseado. TLC (gel de sílice, acetato de etilo al 10 %:hexano): Fr = 0,19.
Intermedio 60d: (4-nitrofenil) carbonato de 1-((terc-butildimetilsilil)oxi)-13-((tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)tridecan-3-ilo
Figure imgf000106_0001
A una solución del Intermedio 60c (2.5 g, 5.81 mmol) en diclorometano (20 ml) se le añadieron cloroformiato de 4-nitrofenilo (1.75 g, 8.71 mmol) y piridina (1.5 ml, 17.43 mmol). La reacción se agitó a 30 °C durante 2 h. La mezcla de reacción se diluyó con agua (50 ml) y la capa acuosa se extrajo con diclorometano (2 x 50 ml). Los extractos de diclorometano combinados se lavaron con salmuera (50 ml), se secaron sobre sulfato sódico y se filtraron. El filtrado se concentró a presión reducida y el material en bruto se purificó sobre gel de sílice con acetato de etilo/hexanos como eluyente para proporcionar el producto deseado. TLC (gel de sílice, acetato de etilo al 20 %:hexano): Fr = 0,73.
Intermedio 60e: (3-(dimetNammo)propM)carbonato de 1-((terc-butildimetilsilil)oxi)-13-((tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)tridecan-3-ilo
Figure imgf000106_0002
A una solución del Intermedio 60d (2.6 g, 4.37 mmol) en diclorometano se le añadieron 2-(dimetilamino)-1-propanol (1.0 ml, 8.73 mmol), piridina (1.1 ml, 13.3 mmol) y DMAP (0.53 g, 4.37 mmol). La mezcla resultante se agitó a 30 °C durante 8 h y después se añadieron más cantidad de 2-(dimetilamino)-1-propanol (1.0 ml, 8.73 mmol), piridina (1.1 ml, 13.3 mmol) y DMAP (0.53 g, 4.37 mmol). La reacción se agitó durante 16 h más y después se añadieron más cantidad de 2-(dimetilamino)-1-propanol (1.0 ml, 8.73 mmol), piridina (1.1 ml, 13.3 mmol) y d Ma P (0.53 g, 4.37 mmol). La reacción se agitó durante 24 h más. La mezcla de reacción se diluyó con agua (100 ml) y la capa acuosa se extrajo con diclorometano (2 x 100 ml). Los extractos de diclorometano combinados se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron sobre sulfato sódico y se filtraron. El filtrado se concentró a presión reducida y el material en bruto se purificó sobre gel de sílice con metanol/diclorometano como eluyente para proporcionar el producto deseado. TLC (gel de sílice, metanol al 10 %:diclorometano): Fr = 0,45.
Intermedio 60f: (1-hidroxi-13-((tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)tridecan-3-il)carbonato de 3-(dimetilamino)propilo
Figure imgf000106_0003
A una mezcla de nitrato de amonio y cerio (800 mg, 1.46 mmol) en agua (20 ml) se le añadió piridina al 50 % en agua para ajustar la solución a pH = 6. Se añadió una solución del Intermedio 60e (1.7 g, 3.04 mmol) en THF (30 ml) y la mezcla se agitó a 30 °C durante 24 h. La reacción se diluyó con agua (30 ml) y se extrajo con acetato de etilo (2 x 50 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera (50 ml), se secaron sobre sulfato sódico y se filtraron. El filtrado se concentró a presión reducida para proporcionar el producto deseado, que se usó sin purificación adicional. TLC (gel de sílice, metanol al 10 %:diclorometano): Fr = 0,24.
Intermedio 60g: octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-((tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)tridecilo
Figure imgf000106_0004
A una solución del Intermedio 60f (1.2 g, 2.69 mmol) en diclorometano (50 ml) se le añadieron ácido linoleico (1.13 g, 4.04 mmol), EDCHCI (1.03 g, 5.39 mmol), DIPEA (1.4 ml, 8.09 mmol) y DMAP (165 mg, 1.35 mmol). La mezcla resultante se agitó a 30 °C durante 16 h. La mezcla de reacción se diluyó con agua (50 ml) y la capa acuosa se extrajo con diclorometano (2 x 100 ml). Los extractos de diclorometano combinados se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron sobre sulfato sódico y se filtraron. El filtrado se concentró a presión reducida y el material en bruto se purificó sobre gel de sílice con metanol/diclorometano como eluyente para proporcionar el producto deseado. TLC (gel de sílice, metanol al 10 %:diclorometano): Fr = 0,67
Intermedio 60h: octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-hidroxitridecilo
Figure imgf000107_0001
A una solución del Intermedio 60g (500 mg, 0.706 mmol) en THF (10 ml), enfriada en un baño de hielo-agua, se le añadió HCI 6 N (ac., 10 ml). La mezcla resultante se agitó durante 2 h y después se calentó a temperatura ambiente. La reacción se neutralizó con una solución saturada de bicarbonato sódico y la reacción se extrajo con acetato de etilo (2 x 40 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato sódico y se filtraron. El filtrado se concentró a presión reducida y el material en bruto se purificó sobre gel de sílice con metanol/diclorometano como eluyente para proporcionar el producto deseado. TLC (gel de sílice, metanol al 10 %:diclorometano): Fr = 0,39
* Ejemplo 60: octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-(octanoiloxi)tridecilo
Figure imgf000107_0002
A una solución de ácido octanoico (320 mg, 0.513 mmol) en diclorometano (20 ml) se le añadieron EDCHCI (295 mg, 1.54 mmol) y DIPEA (0.45 ml, 2.57 mmol). La reacción se agitó a 30 °C durante 1 h, después se añadieron el Intermedio 60h (320 mg, 0.513 mmol) y DMAP (63 mg, 0.513 mmol) y la reacción se agitó durante 23 h más. La reacción se diluyó con agua (20 ml) y la capa acuosa se extrajo con diclorometano (2 x 30 ml). Los extractos de diclorometano combinados se lavaron con salmuera (20 ml), se secaron sobre sulfato sódico y se filtraron. El filtrado se concentró a presión reducida y el material en bruto se purificó sobre gel de sílice con metanol/diclorometano como eluyente para proporcionar el producto deseado. 1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 = 5,27 - 5,47 (m, 4 H) 4,81 (t, J=6,19 Hz, 1 H) 4,10 - 4,25 (m, 4 H) 4,06 (t, J=6,82 Hz, 2 H) 2,78 (t, J=6,57 Hz, 2 H) 2,16 - 2,45 (m, 10 H) 2,06 (c, J=6,82 Hz, 4 H) 1,77 - 1,99 (m, 4 H) 1,48 - 1,71 (m, 8 H) 1,24 - 1,44 (m, 38 H) 0,81 - 0,96 (m, 6 H). MS (M 1) = 750,7, Rt = 1,25 min (LC Método 5).
* Ejemplo 61: 3-octilundecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-(octanoiloxi)tridecilo
Figure imgf000107_0003
1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 = 4,81 (quin, J=6,25 Hz, 1 H) 4,16 - 4,26 (m, 2 H) 4,09 - 4,16 (m, 2 H) 4,06 (t, J=6,69 Hz, 2 H) 2,41 (s a., 2 H) 2,19 - 2,36 (m, 8 H) 1,77 - 2,01 (m, 5 H) 1,50 - 1,74 (m, 10 H) 1,14 - 1,41 (m, 48 H) 0,77 - 1,00 (m, 9 H). 13C RMN (101MHz, CDCla) 5 = 173,68, 173,23, 154,61, 75,35, 65,89, 64,05, 60,12, 55,64, 44,97 (2C), 38,89, 34,69, 34,09, 33,90, 33,55 (2C), 32,74, 31,58 (4C), 31,34, 29,60 (2C), 29,28 (2C), 29,17 (2C), 29,00 (2C), 28,93, 28,79, 28,60, 28,35, 26,22 (3C), 25,63, 24,75, 24,70, 22,35 (2C), 22,26, 13,78 (2C), 13,73.
* Ejemplo 62: 5-heptildodecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-hidroxitridecilo
Figure imgf000108_0001
H RMN (400 MHz, CDCI3) 5 = 4,74 (quin, J=6,21 Hz, 1 H), 4,11 (td, J=6,50, 1,76 Hz, 2 H), 4,06 (t, J=6,50 Hz, 2 H), 3,57 (t, J=6,65 Hz, 2 H), 2,37 (t, J=6,78 Hz, 2 H), 2,22 (s, 6 H), 1,77 - 1,89 (m, 4 H), 1,43 - 1,62 (m, 6 H), 1,07 - 1,33 (m, 43 H), 0,81 (t, J=7,03 Hz, 6 H). MS (M 1) = 642.5, Tr = 0.95 min (Método 6 de LC). *
* Ejemplo 66: 9-pentiltetradecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-(octanoiloxi)tridecilo
Figure imgf000109_0001
1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 4,81 (quin, J=6,25 Hz, 1 H) 4,19 (t, J=6,57 Hz, 2 H) 4,14 (t, J=6,57 Hz, 2 H) 4,06 (t, J=6,69 Hz, 2 H) 2,35 - 2,55 (m, 2 H) 2,19 - 2,35 (m, 9 H) 1,80 - 1,99 (m, 4 H) 1,49 - 1,73 (m, 12 H) 1,13 - 1,42 (m, 46 H) 0,79 -0,98 (m, 9 H). MS (M 1) = 769,0, Rt = 3,11 min (LC Método 4).
* Ejemplo 67: 10-octil decanodioato de 1-(3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-(octanoiloxi)tridecilo)
Figure imgf000109_0002
1H RMN (400 MHz, CDCI3) 5 = 4,71 - 4,89 (m, 1 H), 4,18 (t, J=6,53 Hz, 2 H), 4,08 - 4,16 (m, 2 H), 4,05 (t, J=6,78 Hz, 4 H), 2,44 (t, J=7,15 Hz, 2 H), 2,21 - 2,35 (m, 12 H), 1,81 - 2,01 (m, 4 H), 1,56 - 1,73 (m, 11 H), 1,54 (s a., 1 H), 1,18 - 1,41 (m, 40 H), 0,78 - 0,95 (m, 6 H). MS (M 1) = 784,5, Rt = 0,99 min (LC Método 6 ).
* Ejemplo 68: 10-(octanoiloxi)decanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-(octanoiloxi)tridecilo
Figure imgf000109_0003
1H RMN (400 MHz, CDCI3) 5 = 4,67 - 4,92 (m, 1 H), 4,29 (ddd, J=11,31, 6,63, 4,80 Hz, 1 H), 4,13 - 4,24 (m, 2 H), 3,98 -4,13 (m, 5 H), 3,20 (t, J=6,57 Hz, 2 H), 2,89 (s, 6 H), 2,29 (t, J=7,45 Hz, 6 H), 2,09 - 2,23 (m, 2 H), 1,80 - 2,05 (m, 2 H), 1,50 - 1,74 (m, 12 H), 1,28 (d, J=8,59 Hz, 40 H), 0,77 - 0,98 (m, 6 H). MS (M 1) = 784,6, Rt = 1,11 min (LC Método 6 ).
Síntesis del Ejemplo 69
Intermedio 69a:
Figure imgf000109_0004
A una solución del Intermedio 24c (2.75 g, 9.21 mmol) en THF (30.7 ml) se le añadió hidruro de litio y aluminio (1 M en éter dietílico, 10.1 ml, 10.1 mmol) gota a gota. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1.5 h. Se añadieron varias gotas de EtOAc para interrumpir la reacción, seguido de NH4Cl ac. sat. La reacción se filtró con lavados de acetato de etilo y el filtrado se concentró a presión reducida para proporcionar 2.4 g del compuesto del título, que se usó sin purificación adicional. 1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 = 3,67 (t, J=6,95 Hz, 2 H), 1,48 - 1,59 (m, 2 H), 1,42 (s a., 1 H), 1,18 -1,37 (m, 29 H), 0,83 - 0,96 (m, 6 H)
Intermedio 69b: 3-octilundecanal
Figure imgf000110_0001
Se añadió TEA (5.31 ml, 38.3 mmol) gota a gota mediante una jeringa a una solución del Intermedio 69a (3.63 g, 12.76 mmol) en DCM (100 ml) y se enfrió en un baño de hielo-agua. En un matraz aparte, se añadieron juntos SO3Py (3.05 g, 19.14 mmol) y DMSO (8.16 ml, 115 mmol) y esta mezcla se añadió lentamente al primer mfr mediante una jeringa. La reacción se agitó durante 30 min y después el baño de hielo se retiró. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 h más. La mezcla de reacción se inactivó con agua. La capa de DCM se recogió y el agua se extrajo de nuevo con EtOAc x 1. Las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El aceite en bruto se filtró sobre un lecho de gel de sílice con heptanos (250 ml). Los disolventes se eliminaron a presión reducida para proporcionar el compuesto el compuesto del título en forma de un aceite incoloro (3.3 g, 91 %), que se usó sin purificación adicional. 1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 9,77 (t, J=2,40 Hz, 1 H), 2,33 (dd, J=6,57, 2,27 Hz, 2 H), 1,95 (s a., 1 H), 1,17 - 1,43 (m, 28 H), 0,81 - 0,97 (m, 6 H)
Intermedio 69c: 5-octiltridec-1-en-3-ol
Figure imgf000110_0002
Se añadió bromuro de vinil magnesio (12.85 ml, 12.85 mmol) gota a gota mediante una jeringa a un matraz de fondo redondo cargado con THF anhidro (75 ml), enfriado en un baño de hielo-agua y en atmósfera de N2. Se añadió lentamente el Intermedio 69b (3.3 g, 11.68 mmol) en forma de una solución en 25 ml de THF mediante una jeringa. La reacción se agitó durante 1.5 h, se mantuvo en el baño de hielo-agua y la reacción se interrumpió con NH4Cl ac. sat. y se filtró sobre celite con lavados de EtOAc. El filtrado se vertió en un embudo de decantación y se diluyó adicionalmente con EtOAc. Las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo una vez más con EtOAc. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y el filtrado se concentró a presión reducida. El aceite en bruto se purificó sobre gel de sílice con EtOAc al 0-50 %/heptanos para proporcionar el compuesto del título en forma de un aceite incoloro (2.8 g, 77 %).
1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 5,87 (ddd, J=17,05, 10,48, 6,32 Hz, 1 H), 5,23 (dt, J=17,18, 1,39 Hz, 1 H), 5,10 (dt, J=10,36, 1,26 Hz, 1 H), 4,13 - 4,24 (m, 1 H), 1,36-1,59 (m, 3 H), 1,18 - 1,36 (m, 28 H), 0,79 - 0,98 (m, 6 H).
Intermedio 69d: 5-octil-1-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)tridecan-3-ol
Se disolvieron [Ir(cod)Cl]2 (0.073 g, 0.161 mmol) y DPPE (0.096 g, 0.242 mmol) en DCM en un matraz de fondo redondo cargado con nitrógeno. Se añadió pinacolborano (1.402 ml, 9.66 mmol), seguido de una solución del Intermedio 69c (2.5 g, 8.05 mmol) en 5 ml de DCM. Después de 4 h de agitación a temperatura ambiente, se añadieron 1.5 ml más de pinacolboronato. La mezcla de reacción se agitó durante la noche. Se añadieron cuidadosamente varias gotitas de agua para interrumpir la reacción. La reacción se diluyó con DCM y se lavó con una solución acuosa de bicarbonato sódico. La capa acuosa se extrajo de nuevo con DCM x 1. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El material en bruto se purificó sobre gel de sílice con EtOAc al 0­ 30 %/heptanos para proporcionar el compuesto del título en forma de un aceite incoloro (1 g, 28 %). 1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 4,15 - 4,34 (m, 1 H), 1,38 - 1,63 (m, 4 H), 1,16 - 1,38 (m, 38 H), 0,93 - 1,09 (m, 2 H), 0,83 - 0,93 (m, 8 H).
Intermedio 69e: 5-octiltridecano-1,3-diol
Figure imgf000111_0001
El Intermedio 69d (180 mg, 0.410 mmol) se disolvió en MeOH (2 ml) y THF (2 ml). Se añadió NaOH 3 N (0.410 ml, 1.231 mmol), seguido de 43 ul (0.493 mmol) de una solución al 35 % de H2O2. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Los disolventes se eliminaron a presión reducida y la mezcla en bruto se purificó sobre gel de sílice con EtOAc al 0-100 %/heptanos para proporcionar el compuesto del título en forma de un aceite incoloro (180 mg). 1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 = 3,78 - 4,02 (m, 3 H), 1,60 - 1,73 (m, 2 H), 1,42 - 1,58 (m, 3 H), 1,14 - 1,39 (m, 28 H), 0,88 (t, J=6,82 Hz, 6 H).
Intermedio 69f: octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-3-hidroxi-5-octiltridecilo
Figure imgf000111_0002
.
Ácido linoleico (164 mg, 0.584 mmol), EDCHCI (112 mg, 0.584 mmol) y DMAP (47.6 mg, 0.390 mmol) se disolvieron en 3 ml de DCE. Se añadió DIPEA (0.255 ml, 1.461 mmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. Se añadió una solución del Intermedio 69e (160 mg, 0.487 mmol) en 3 ml de DCE. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche. La mezcla de reacción en bruto se purificó sobre gel de sílice (pre-equilibrado con NH4OH al 1 % en MeOH) eluyendo con EtOAc al 0-15 %/heptanos para proporcionar el compuesto del título (180 mg, 63 %). 1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 = 5,16 - 5,46 (m, 4 H), 4,36 (ddd, J=11,18, 8,53, 5,31 Hz, 1 H), 4,15 (dt, J=11,18, 5,65 Hz, 1 H), 3,74 (dd, J=7,58, 4,04 Hz, 1 H), 2,77 (t, J=6,57 Hz, 2 H), 2,25 - 2,38 (m, 2 H), 1,99 - 2,13 (m, 4 H), 1,93 - 1,99 (m, 1 H), 1,73 - 1,87 (m, 1 H), 1,56 - 1,73 (m, 3 H), 1,40 - 1,55 (m, 2 H), 1,21 - 1,40 (m, 42 H), 0,89 (dq, J=6,82, 3,45 Hz, 9 H).
Ejemplo 69: octadeca-9.12-dienoato de (9Z.12Z)-3-(((3-(d¡met¡lam¡no)propox¡)carbon¡l)ox¡)-5-octiltr¡dec¡lo) El Intermedio 69f (180 mg, 0.305 mmol), DMAP (37.2 mg, 0.305 mmol) y piridina (49.2 pl, 0.609 mmol) se disolvieron en DCE (5000 pl). Se añadió cloroformiato de 4-nitrofenilo (80 mg, 0.396 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche. Después, se añadieron 500 ul de 3-(dimetilamino)propan-1-ol y la reacción se agitó durante 30 min. La mezcla de color amarillo en bruto se purificó sobre gel de sílice con EtOAc al 0-100 %/heptanos y después con MeOH al 0-10 %/DCM. Después, el material se purificó sobre columnas PL-HCO3 MP-SPE eluyendo con 0- MeOH al 50 %/DCM. Los disolventes se eliminaron para proporcionar el compuesto del título (100 mg, 46 %). 1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 5,24 - 5,47 (m, 4 H), 4,78 - 4,97 (m, 1 H), 4,16 (dt, J=16,86, 6,60 Hz, 4 H), 2,78 (t, J=6,57 Hz, 2 H), 2,39 (s a., 2 H), 2,23 -2,35 (m, 8 H), 2,06 (c, J=6,82 Hz, 4 H), 1,79 - 1,99 (m, 4 H), 1,53 - 1,73 (m, 3 H), 1,17 - 1,46 (m, 44 H), 0,82 - 0,98 (m, 9 H). 13C RMN (101MHz, CDCb) 5 = 173,37, 154,59, 129,90, 129,72, 127,72, 127,59, 73,88, 65,89, 60,22, 55,65, 44,99 (2C), 38,41, 33,95, 33,59, 33,31, 33,25, 33,04, 31,59 (2C), 31,20, 29,73, 29,71, 29,30 (4C), 29,03 (4C), 28,88, 28,83, 26,88 (2C), 26,02, 25,94, 25,31, 24,59, 22,36 (2C), 22,24, 13,78 (2C), 13,74.
Síntesis del Ejemplo 70
Intermedio 70a: decanoato de 3-hidroxi-5-octiltridecilo
Figure imgf000112_0001
El Intermedio 69e (300 mg, 0.913 mmol) y ácido decanoico (189 mg, 1.096 mmol) se disolvieron en DCE (10 ml). Se añadieron EDCHCI (210 mg, 1.096 mmol) y DMAP (66.9 mg, 0.548 mmol). Por último, se añadió DIPEA (638 pl, 3.65 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche. La mezcla de reacción en bruto se purificó sobre gel de sílice con EtOAc al 0-50 %/heptanos para proporcionar el compuesto del título en forma de un aceite incoloro (250 mg, 57 %). 1H RMN (400 MHz, CDCla) 5= 4,38 (ddd, J=5,1, 8,5, 11,2 Hz, 1H), 4,15 (td, J=5,7, 11,2 Hz, 1H), 3,83 - 3,65 (m, 1H), 2,37 - 2,25 (m, 2H), 1,81 (dddd, J=3,3, 5,7, 8,7, 14,4 Hz, 2H), 1,73 - 1,57 (m, 3H), 1,54 - 1,40 (m, 2H), 1,40 - 1,14 (m, 40H), 0,89 (t, J=6,7 Hz, 9H).
Ejemplo 70: decanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-5-octiltridecilo
Figure imgf000112_0002
1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 4,80 - 4,99 (m, 1 H) 4,06 - 4,27 (m, 4 H) 2,43 (t, J=7,20 Hz, 2 H) 2,21 - 2,34 (m, 8 H) 1,81 - 2,00 (m, 4 H) 1,55 - 1,71 (m, 3 H) 1,35 - 1,51 (m, 2 H) 1,12 - 1,35 (m, 40 H) 0,78 - 0,95 (m, 9 H). MS (M 1) = 612,8, Rt = 0,94 min (lC Método 6).
Síntesis del Ejemplo 71
Intermedio 71a: 7-octil-1-((tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)pentadecan-5-ol
Figure imgf000113_0001
En un matraz de fondo redondo secado al horno cargado con N2 , se añadieron limaduras de magnesio (0.196 g, 8.07 mmol) y THF (10 ml). Se añadieron 2-(4-bromobutoxi)tetrahidro-2H-pirano (1.595 g, 6.73 mmol) y yodo (0.017 g, 0.067 mmol). La mezcla se calentó a reflujo, después se enfrió y se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. La reacción se enfrió en un baño de hielo-agua y se añadió el Intermedio 69b (1.9 g, 6.73 mmol). La reacción se agitó durante 30 min, después el baño de hielo se eliminó y la reacción se agitó durante 1 h más. La reacción se interrumpió con NH4Cl ac. sat. y después se filtró sobre celite con lavados de EtOAc. La capa orgánica se recogió y la capa acuosa se extrajo una vez más con EtOAc. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y el filtrado se concentró a presión reducida. El material en bruto se purificó sobre gel de sílice con EtOAc al 0-100 %/heptano para proporcionar el compuesto del título en forma de un aceite incoloro (1.7 g, 57 %). 1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 4,52 - 4,64 (m, 1 H), 3,82 - 3,95 (m, 1 H), 3,63 - 3,82 (m, 2 H), 3,46 - 3,57 (m, 1 H), 3,34 - 3,46 (m, 1 H), 1,79 - 1,96 (m, 1 H), 1,68 - 1,79 (m, 1 H), 1,37 - 1,67 (m, 11 H), 1,14 - 1,37 (m, 30 H), 0,82 - 0,98 (m, 6 H).
Intermedio 71b: (7-octiM-((tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)pentadecan-5-M)carbonato de 3-(dimetilamino)propilo
Figure imgf000113_0002
Se disolvieron cloroformiato de p-nitrofenilo (1.244 g, 6.17 mmol) y piridina (0.936 ml, 11.57 mmol) en DCM (30 ml). Se añadió el Intermedio 71a (1.7 g, 3.86 mmol) en 10 ml de DCM mediante una jeringa. Después, se añadió DMAP (0.236 g, 1.929 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 6 h, después se añadió 3-(dimetilamino)propan-1-ol (0.796 g, 7.71 mmol) y la reacción se agita durante una noche. La mezcla de reacción se purificó sobre gel de sílice con EtOAc al 0-100 %/ heptanos y después MeOH al 0-10 %/DCM para proporcionar el compuesto del título (320 mg, 15 %).
1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 = 4,78 (s a., 1H), 4,64 - 4,52 (m, 1H), 4,32 - 4,02 (m, 4H), 3,94 - 3,80 (m, 1H), 3,78 - 3,67 (m, 1H), 3,61 - 3,46 (m, 2H), 3,46 - 3,30 (m, 1H), 2,65 - 2,44 (m, 2H), 2,35 (s, 6H), 1,99 - 1,88 (m, 2H), 1,72 (d, J=3,0 Hz, 1H), 1,70 - 1,47 (m, 7H), 1,47 - 1,33 (m, 4H), 1,33 - 1,08 (m, 28H), 1,07 - 0,77 (m, 6H).
Intermedio 71c: (1-hidroxi-7-octilpentadecan-5-il)carbonato de 3-(dimetilamino)propilo
Figure imgf000113_0003
Se añadió HCl 1 N (2.91 ml, 2.91 mmol) a una solución del Intermedio 71b (553 mg, 0.970 mmol) en MeOH (10 ml) y DCM (1 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 h. La reacción se concentró presión reducida y después el residuo se diluyó de nuevo con DCM y se lavó con una solución ac. de bicarbonato sódico. La capa acuosa se extrajo de nuevo con DCM. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre MgSO4, después se filtraron y el filtrado se concentró a presión reducida para proporcionar el compuesto del título (490 mg), que se usó sin purificación adicional. 1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 4,74 - 4,87 (m, 1 H), 4,10 - 4,27 (m, 2 H), 3,59 - 3,71 (m, 2 H), 2,30 - 2,45 (m, 2 H), 2,23 (s, 6 H), 1,85 (quin, J=6,95 Hz, 2 H), 1,51 - 1,71 (m, 5 H), 1,35 - 1,51 (m, 4 H), 1,16 - 1,35 (m, 28 H), 0,80 - 0,97 (m, 6 H).
Ejemplo 71: octanoato de 5-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-7-octilpentadecilo
Figure imgf000114_0001
El Intermedio 71c (250 mg, 0.515 mmol) y ácido decanoico (82 mg, 0.566 mmol) se disolvieron en DCE (5146 |jl). Se añadieron EDCHCl (118 mg, 0.618 mmol) y DMAP (62.9 mg, 0.515 mmol). Después, se añadió DIPEA (270 jl, 1.544 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. La reacción se transfirió a vial cerrado herméticamente y se calentó con irradiación con microondas a 80 °C durante 20 min. La mezcla en bruto se purificó sobre gel de sílice con EtOAc al 0-100 %/heptanos y después MeOH al 0-15 %/DCM para proporcionar el compuesto del título (168 mg, 53 %). 1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 4,69 - 4,88 (m, 1 H), 4,13 - 4,26 (m, 2 H), 4,06 (t, J=6,57 Hz, 2 H), 2,36 (t, J=7,33 Hz, 2 H), 2,29 (t, J=7,58 Hz, 2 H), 2,23 (s, 6 H), 1,85 (quin, J=7,01 Hz, 2 H), 1,51 - 1,74 (m, 7 H), 1,35 - 1,50 (m, 4 H), 1,15 - 1,35 (m, 36 H), 0,80 - 0,97 (m, 9 H). MS (M 1) = 612,5, Rt = 1,01 min (LC Método 6).
Ejemplo 72: octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-5-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-7-octilpentadecilo
Figure imgf000114_0002
1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 = 5,27 - 5,46 (m, 4 H), 4,73 - 4,86 (m, 1 H), 4,12 - 4,26 (m, 2 H), 4,06 (t, J=6,69 Hz, 2 H), 2,78 (t, J=6,69 Hz, 2 H), 2,32 - 2,42 (m, 2 H), 2,29 (t, J=7,58 Hz, 2 H), 2,23 (s, 6 H), 2,06 (c, J=6,82 Hz, 4 H), 1,78 - 1,91 (m, 2 H), 1,51 - 1,73 (m, 7 H), 1,17 - 1,46 (m, 46 H), 0,81 - 0,95 (m, 9 H). MS (M 1) = 748,6, Rt = 1,33 min (LC Método 6).
* Ejemplo 73: octanoato de 9-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-11-octilnonadecilo
Figure imgf000114_0003
1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 4,72 - 4,85 (m, 1 H), 4,18 (t, J=6,44 Hz, 2 H), 4,06 (t, J=6,69 Hz, 2 H), 2,42 - 2,57 (m, 2 H), 2,25 - 2,37 (m, 8 H), 1,85- 1,99 (m, 2 H), 1,49 - 1,71 (m, 7 H), 1,38 (s a., 3 H), 1,16 - 1,34 (m, 45 H), 0,84 - 0,95 (m, 9 H). MS (M 1) = 668,5, Rt = 1,83 min (LC Método 4).
* Ejemplo 74: decanoato de 9-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-11-octilnonadecilo
Figure imgf000115_0001
1H RMN (400 MHz, CDCI3) 5 = 4,60 - 4,76 (m, 1 H), 4,18 (t, J=6,57 Hz, 2 H), 4,05 (t, J=6,69 Hz, 2 H), 2,39 (s, 2 H), 2,20 -2,31 (m, 8 H), 1,75 - 1,94 (m, 3 H), 1,43 - 1,67 (m, 6 H), 1,21 - 1,39 (m, 54 H), 0,84- 1,05 (m, 9 H). MS (M 1) = 710,5, Rt = 1,33 min (Lc Método 6 ).
* Ejemplo 78: hexanoato de 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)nonadecilo
Figure imgf000116_0001
1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 4,87 (t, J=6,19 Hz, 1 H), 4,05 (t, J=6,69 Hz, 2 H), 2,30 (td, J=7,89, 5,68 Hz, 4 H), 2,25 -2,37 (m, 2 H), 2,22 (s, 6 H), 1,79 (dq, J=7,58, 7,41 Hz, 2H), 1,55 - 1,70 (m, 4 H), 1,50 (d, J=6,06 Hz, 4 H), 1,17 - 1,39 (m, 30 H), 0,89 (c, J=6,99 Hz, 6 H). 13C RMN 13C RMN (101MHz, CDCb) 5 = 173,97, 173,37, 74,19, 64,34 (2C), 58,95, 45,44 (2C), 34,35, 34,13 (2C), 32,47, 31,89, 31,31, 29,57, 29,53 (2C), 29,44, 29,41, 29,31, 29,17, 28,63, 25,89, 25,31, 25,30, 24,69, 23,17, 22,66, 22,31, 14,09, 13,90.
* Ejemplo 79: 3-octilundecanoato de 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)nonadecilo
Figure imgf000116_0002
El Intermedio 80a se disolvió en DCM (50 ml) y se enfrió en un baño de hielo. Después, se añadió TEA (7.80 ml, 56.3 mmol). En otro matraz, se disolvió SO3Py (5.97 g, 37.5 mmol) en DMSO (17.59 g, 225 mmol) y la solución resultante se añadió gota a gota a la solución de DCM fría. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante una noche. La reacción después se diluyó con 800 ml de acetato de etilo y la fase orgánica se lavó tres veces con agua. La fase acuosa combinada se extrajo de nuevo dos veces con 200 ml de EtOAc. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato sódico y se filtraron. El filtrado se concentró a presión reducida y se purificó sobre gel de sílice con MeOH al 0-10 %/DCM para proporcionar 4.8 g del compuesto del título. MS (M 1) = 386.6, Tr = 1.28 min (Método 11 de LC).
Intermedio 80c: Síntesis de ácido 4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoico
Figure imgf000117_0001
En un matraz de fondo redondo de 500 ml, el Intermedio 80b (5 g, 12.97 mmol) y 2-metilbut-2-eno (4.55 g, 64.8 mmol) se disolvieron en f-BuOH (Volumen: 25 ml, Proporción: 1.000) y tampón de ácido fórmico 4 N, pH 3.5 (25 ml). Se añadió una solución ac. 2 M de NaClO2 (9.73 ml, 19.45 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una hora. La mezcla se diluyó con 800 ml de DCM y 50 ml de agua. Se añadió HCl 1 N para ajustar el pH de la capa acuosa a 5 La capa acuosa se extrajo con MeOH al 5 % en DCM. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre Na2SO4 y se filtraron. El filtrado se concentró a presión reducida y se purificó sobre gel de sílice. El material se disolvió de nuevo en MeOH al 5 % en DCM y se lavó con NaHCO3 ac. sat. La fase orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida para proporcionar 4.5 g del compuesto del título. MS (M 1) = 402.6, Tr = 1.23 min (Método 11 de LC).
Ejemplo 80: bis(octadeca-9,12-dienoato) de (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo
Figure imgf000117_0002
En un matraz de fondo redondo, el Intermedio 80c (4.5 g, 11.21 mmol), DMAP (548 mg, 4.48 mmol) y 1,3-dilinoleína (10.37 g, 16.81 mmol) se recogieron en diclorometano (100 ml). Se añadió EDCHCl (4.3 g, 22.41 mmol) en una porción seguido de DIPEA (3.91 ml, 22.41 mmol), gota a gota, y la reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 24 h, la reacción se concentró a presión reducida. El residuo se purificó sobre gel de sílice con 0-60 % acetato de etilo /heptano para proporcionar el compuesto del título (6.17 g). 1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 5,19 - 5,48 (m, 9 H), 4,65 - 4,81 (m, 1 H), 4,30 (dd, J=11,80, 4,27 Hz, 2 H), 4,08 - 4,25 (m, 4 H), 2,77 (t, J=6,40 Hz, 4 H), 2,36 - 2,52 (m, 4 H), 2,20 - 2,36 (m, 10 H), 2,05 (c, J=6,78 Hz, 8 H), 1,81 - 2,00 (m, 5 H), 1,48 - 1,71 (m, 7 H), 1,16 - 1,44 (m, 46 H), 0,81 - 0,96 (m, 9 H). MS (M 1) = 1001,4, Rt = 1,30 min (LC Método 4).
* Ejemplo 81: bis(octadeca-9,12-dienoato) de (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo
Figure imgf000117_0003
1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 = 5,20 - 5,48 (m, 9 H), 4,72 (s a., 1 H), 4,30 (dd, J=11,80, 4,27 Hz, 2 H), 4,06 - 4,25 (m, 4 H), 2,78 (t, J=6,65 Hz, 4 H), 2,47 - 2,60 (m, 6 H), 2,37 - 2,47 (m, 2 H), 2,25 - 2,37 (m, 4 H), 2,05 (c, J=6,78 Hz, 7 H), 1,73 -2,01 (m, 4 H), 1,48 - 1,73 (m, 6 H), 1,17- 1,45 (m, 48 H), 1,02 (t, J=7,15 Hz, 6 H), 0,81 - 0,95 (m, 9 H). MS (M 1) = 1029,0, Rt = 1,51 min (LC Método 6). *
* Ejemplo 82: bis(octadeca-9,12,15-trienoato) de (9Z,9'Z,12Z,12'Z,15Z,15'Z)-2-((4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo
Figure imgf000118_0001
1H RMN (400 MHz, CDCI3) 5 = 5,22 - 5,30 (m, 1 H), 4,67 - 4,78 (m, 1 H), 4,30 (dd, J=12,05, 4,27 Hz, 2 H), 4,10 - 4,24 (m, 4 H), 2,54 (m, 6 H), 2,37 - 2,48 (m, 2 H), 2,26 - 2,37 (m, 4 H), 1,78 - 2,04 (m, 4 H), 1,48 - 1,69 (m, 6 H), 1,26 (m, 60 H), 1,03 (t, J=7,15 Hz, 6 H), 0,83 - 0,93 (m, 9 H). 13C RMN (101 MHz, CDCI3): 5 ppm 173,3(s, 2C), 172,1, 155,0, 77,5, 69,2, 66,5, 62,0(d, 2C), 49,0, 46,9(s, 2C), 34,1, 34,0(s, 2C), 31,9(s, 3C), 30,0, 29,7 - 29,3(solapamiento, 23), 29,1(s,2C), 29,0, 26,3(s a, 1C), 25,1, 24,8(s, 2C), 22,7(s, 2C), 14,1(s, 2C), 11,6(s a, 2C) *
* Ejemplo 85: ditetradecanoato de 2-((4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo
Figure imgf000119_0001
1H RMN (400 MHz, CDCI3) 5 = 5,20 - 5,33 (m, 1 H), 4,66 - 4,79 (m, 1 H), 4,25 - 4,37 (m, 2 H), 4,08 - 4,24 (m, 4 H), 2,35 -2,48 (m, 4 H), 2,28 - 2,35 (m, 4 H), 2,25 (s, 6 H), 1,81 - 2,02 (m, 4 H), 1,49 - 1,70 (m, 6 H), 1,20 - 1,40 (m, 60 H), 0,84 -0,93 (m, 9 H). MS (M 1) = 896,9, Rt = 1,51 min (LC Método 6 ).
* Ejemplo 86: ditetradecanoato de 2-((4-(((3-(etM(metM)ammo)propoxi)carbonM)oxi)hexadecanoM)oxi)propano-1,3-diílo
Figure imgf000119_0002
1H RMN (400 MHz, CDCI3) 5 = 5,26 (m, 1 H), 4,65 - 4,80 (m, 1 H), 4,30 (dd, J=11,92, 4,39 Hz, 2 H), 4,04 - 4,24 (m, 4 H), 2,35 - 2,49 (m, 4 H), 2,28 - 2,35 (m, 4 H), 2,25 (s, 6 H), 1,93 - 2,03 (m, 1H), 1,80 - 1,93 (m, 3 H), 1,48 - 1,70 (m, 6 H), 1,17 - 1,45 (m, 52 H), 0,83 - 0,94 (m, 9 H). MS (M 1) = 840,8, Rt = 1,32 min (LC Método 3). *
* Ejemplo 88: didodecanoato de 2-((4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo
Figure imgf000120_0001
1H RMN (400 MHz, CDCI3) 5 = 5,26 (quin, J=5,08 Hz, 1 H) 4,66 - 4,79 (m, 1 H) 4,30 (dd, J=11,92, 4,39 Hz, 2 H) 4,09 -4,24 (m, 4 H) 2,54 (m, 6 H) 2,36 - 2,49 (m, 2 H) 2,24 - 2,36 (m, 4 H) 1,78-2,02 (m, 4 H) 1,49- 1,69 (m, 6 H) 1,18- 1,40 (m, 52 H) 1,03 (t, J=7,03 Hz, 6 H) 0,88 (t, J=6,78 Hz, 9 H). MS (M 1) = 868,9, Rt = 1,96 min (LC Método 7).
* Ejemplo 89: didodecanoato de 2-((4-(((3-(etM(metM)ammo)propoxi)carbonM)oxi)hexadecanoM)oxi)propano-1,3-diílo
Figure imgf000120_0002
1H RMN (400 MHz, CDCI3) 5 = 5,20 - 5,31 (m, 1 H), 4,67 - 4,78 (m, 1 H), 4,30 (dd, J=12,05, 4,27 Hz, 2 H), 4,06 - 4,24 (m, 4 H), 2,46 - 2,71 (m, 4 H), 2,37 - 2,46 (m, 2 H), 2,20 - 2,37 (m, 7 H), 1,79 - 2,05 (m, 4 H), 1,47 - 1,71 (m, 6 H), 1,18 - 1,45 (m, 52 H), 1,12 (s a., 3 H), 0,79-0,94 (m, 9 H). MS (M 1) = 855,0, Rt = 3,13 min (LC Método 4).
* Ejemplo 90: bis(decanoato) de 2-((4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo
Figure imgf000120_0003
1H RMN (400 MHz, CDCI3) 5 = 5,21 - 5,31 (m, 1 H), 4,67 - 4,78 (m, 1 H), 4,30 (dd, J=12,05, 4,27 Hz, 2 H), 4,10 - 4,25 (m, 4 H), 2,48 - 2,64 (m, 6 H), 2,36 - 2,48 (m, 2 H), 2,27 - 2,36 (m, 4 H), 1,78 - 2,02 (m, 4 H), 1,48- 1,69 (m, 6 H), 1,19- 1,41 (m, 44 H), 1,03 (t, J=7,15 Hz, 6 H), 0,88 (t, J=6,78 Hz, 9 H). MS (M 1) = 813,0, Rt = 1,45 min (LC Método 7). *
* Ejemplo 91: bis(decanoato) de 2-((4-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo
Figure imgf000121_0001
1H RMN (400 MHz, CDCI3) 5 = 5,26 (quin, J=5,02 Hz, 1 H), 4,67 - 4,78 (m, 1 H), 4,30 (dd, J=11,80, 4,27 Hz, 2 H), 4,08 -4,24 (m, 4 H), 2,44 - 2,63 (m, 4 H), 2,36 - 2,44 (m, 2 H), 2,20 - 2,36 (m, 7 H), 1,79 - 2,04 (m, 4 H), 1,48 - 1,72 (m, 6 H), 1,19 - 1,38 (m, 44 H), 1,10 (t, J=6,53 Hz, 3 H), 0,80 - 0,94 (m, 9 H). MS (M 1) = 798,9, Rt = 1,57 min (LC Método 7).
* Ejemplo 92: dioctanoato de 2-((4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo
Figure imgf000121_0002
1H RMN (400 MHz, CDCI3) 5 = 5,26 (quin, J=5,0 Hz, 1H), 4,78 - 4,66 (m, 1H), 4,30 (dd, J=4,3, 11,8 Hz, 2H), 4,24 - 4,10 (m, 4H), 2,64 - 2,47 (m, 6 H), 2,47 - 2,37 (m, 2H), 2,37 - 2,26 (m, 4H), 2,02 - 1,78 (m, 4H), 1,70 - 1,48 (m, 6 H), 1,39 - 1,19 (m, 36H), 1,03 (t, J=7,2 Hz, 6 H), 0,88 (t, J=6 , 8 Hz, 9H). MS (M 1) = 755,9, Rt = 1,89 min (LC Método 7).
* Ejemplo 93: dioctanoato de 2-((4-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo
Figure imgf000121_0003
1H RMN (400 MHz, CDCI3) 5 = 5,19 - 5,32 (m, 1 H), 4,66 - 4,79 (m, 1 H), 4,30 (dd, J=11,92, 4,39 Hz, 2 H), 4,05 - 4,24 (m, 4 H), 2,44 - 2,70 (m, 4 H), 2,37 - 2,44 (m, 2 H), 2,20 - 2,37 (m, 7 H), 1,80 - 2,05 (m, 4 H), 1,48 - 1,71 (m, 6 H), 1,18 - 1,42 (m, 36 H), 1,10 (d, J=6,53 Hz, 3 H), 0,76 - 0,95 (m, 9 H). MS (M 1) = 742,7, Rt = 1,34 min (LC Método 7).
* Síntesis del Ejemplo 94:
Intermedio 94a:
El Intermedio 94a puede sintetizarse usando métodos similares a los ejemplificados para la síntesis del Intermedio 49a.
1H RMN (400 MHz, CDCls) 5 = 5,26 - 5,47 (m, 4 H), 3,64 - 3,73 (m, 2 H), 3,54 - 3,64 (m, 1 H), 2,78 (t, J=6,40 Hz, 2 H), 2,06 (c, J=6,94 Hz, 4 H), 1,56 - 1,74 (m, 3 H), 1,40 - 1,52 (m, 4 H), 1,16 - 1,40 (m, 18 H), 0,91 (s, 9 H), 0,86 - 0,90 (m, 3 H), 0,08 (s, 6 H).
* Ejemplo 94: dioctanoato de 2-(((13Z,16Z)-4-(((3-(dimetilammo)propoxi)carboml)oxi)docosa-13,16-dienoil)oxi)propano-1,3-diNo
Figure imgf000122_0001
El Ejemplo 94 puede sintetizarse usando métodos similares a los ejemplificados para la síntesis del Ejemplo 80. 1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 = 5,45 - 5,21 (m, 5H), 4,73 (d, J=4,3 Hz, 1H), 4,30 (dd, J=4,3, 11,8 Hz, 2H), 4,23 - 4,07 (m, 4H), 2,77 (t, J=6,3 Hz, 2H), 2,49 - 2,36 (m, 4H), 2,36 - 2,21 (m, 9H), 2,12 - 1,80 (m, 7H), 1,70 - 1,48 (m, 6H), 1,40 - 1,20 (m, 36H), 0,94 - 0,81 (m, 9H) ppm. LC-MS m/z = 808,5 (M 1). Rt = 1,59 min (LC Método 7).
* Ejemplo 95: dioctanoato de 2-(((13Z,16Z)-4-(((3-(dietMamino)propoxi)carbonM)oxi)docosa-13,16-dienoil)oxi)propano-1,3-diNo
Figure imgf000122_0002
1H RMN (CDCla) 5 = 5,30-5,46 (m, 4H), 5,21-5,30 (m, 1H), 4,73 (ddd, J=7,2, 4,2, 2,8 Hz, 1H), 4,30 (dd, J=12,0, 4,4 Hz, 2H), 4,10-4,26 (m, 4H), 2,78 (t, J=6,4 Hz, 2H), 2,55 (d, J=5,1 Hz, 6H), 2,36-2,47 (m, 2H), 2,27-2,36 (m, 4H), 2,02-2,12 (m, 4H), 1,76-2,02 (m, 4H), 1,48-1,72 (m, 6H), 1,21-1,42 (m, 34H), 1,04 (t, J=6,9 Hz, 6H), 0,89 (dq, J=6,9, 3,4 Hz, 9H). MS (M 1) = 836,6, Rt = 1,01 min (LC Método 6).
* Síntesis del Ejemplo 96:
Intermedio 96a: ácido 2-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)tetradecanoico
Figure imgf000122_0003
A una solución del Intermedio 48c (2 g, 5.16 mmol), disuelta en acetona (20 ml), enfriada en un baño de hielo-agua, se le añadió reactivo de Jones (5.16 ml, 10.32 mmol, solución 2 M en H2O), gota a gota. El baño de refrigeración se retiró y la agitación se continuó durante una noche. Se añadió iPrOH (1 ml), la mezcla se filtró y el filtrado se eliminó a presión reducida. El residuo se diluyó con agua y heptano. La capa de heptano se separó y se desechó, y la fase acuosa se lavó con EtOAc, que también se desechó. El pH de la capa acuosa se ajustó a 6 y la mezcla se extrajo con MeOH al 5 %/DCM (5 x 4 0 ml). Los extractos de diclorometano combinados se secaron sobre sulfato sódico y se filtraron. El filtrado se concentró a presión reducida para proporcionar 1 g del compuesto del título, que se usó sin purificación adicional. 1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 = 4,67 - 4,78 (m, 1 H), 4,23 - 4,41 (m, 1 H), 4,16 (dt, J=10,98, 5,43 Hz, 1 H), 2,97 - 3,27 (m, 4 H), 2,89 (s a., 1 H), 1,98 - 2,15 (m, 2 H), 1,75 - 1,98 (m, 2 H), 1,55 - 1,75 (m, 1 H), 1,39 - 1,55 (m, 3 H), 1,09 - 1,39 (m, 24 H), 0,89 (t, J=6,53 Hz, 3 H)
* Ejemplo 96: bis(octadeca-9,12-dienoato) de (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((2-(((3-(dietMammo)propoxi)carboml)oxi)tetradecanoM)oxi)propano-1,3-diNo
Figure imgf000123_0001
1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 = 5,28 - 5,45 (m, 9 H), 4,89 (t, J=6,27 Hz, 1 H), 4,25 - 4,35 (m, 2 H), 4,10 - 4,25 (m, 4 H), 2,77 (t, J=6,53 Hz, 4 H), 2,56 (s a., 6 H), 2,26 - 2,37 (m, 4 H), 2,05 (c, J=6,78 Hz, 8 H), 1,78 - 1,95 (m, 3 H), 1,61 (m, 5 H), 1,19 - 1,50 (m, 48 H), 1,06 (s a., 6 H), 0,84 - 0,94 (m, 9 H). MS (M 1) = 1000,9, Rt = 1,43 min (LC Método 4).
* Ejemplo 97: bis(octadeca-9,12-dienoato) de (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((2-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)dodecanoil)oxi)propano-1,3-diílo
Figure imgf000123_0002
1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 = 5,27 - 5,45 (m, 9 H), 4,89 (t, J=6,27 Hz, 1 H), 4,25 - 4,35 (m, 2 H), 4,10 - 4,25 (m, 4 H), 2,77 (t, J=6,53 Hz, 4 H), 2,37 - 2,48 (m, 2 H), 2,22 - 2,37 (m, 10 H), 2,05 (c, J=6,69 Hz, 8 H), 1,79 - 1,95 (m, 5 H), 1,61 (s a., 5 H), 1,21 - 1,49 (m, 42 H), 0,84-0,95 (m, 9 H). 13C RMN (101 MHz, CDCI3) 5 ppm 173,28, 173,17, 169,42, 154,63, 130,25(s, 2C), 130,03(d, 2C), 128,07(s, 2C), 127,90(s, 2C), 75,13, 70,14, 66,88, 61,90, 61,83, 55,85, 45,33(s, 2C), 33,96, 33,93, 31,93, 31,54, 31,13, 29,65 - 29,13(solapamiento, 16C), 27,22(s, 4C), 26,70, 25,64(s, 2C), 24,98, 24,80, 24,77, 22,71,22,60(s, 2C), 14,16, 14,12(s, 2C).
Ejemplo 98: bis(octadeca-9,12-dienoato) de (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((2-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)tetradecanoil)oxi)propano-1,3-diílo
Figure imgf000123_0003
1H RMN (400 MHz, CDCI3) 5 = 5,27 - 5,46 (m, 9 H), 4,89 (t, J=6,27 Hz, 1 H), 4,29 (ddd, J=12,30, 8,66, 4,14 Hz, 2 H), 4,09 - 4,25 (m, 4 H), 2,77 (t, J=6,53 Hz, 4 H), 2,44 (s a., 2 H), 2,23 - 2,37 (m, 10 H), 2,05 (c, J=6,78 Hz, 8 H), 1,78 - 1,98 (m, 4 H), 1,61 (s a., 4 H), 1,23 - 1,50 (m, 48 H), 0,83 - 0,96 (m, 9 H). MS (M 1) = 972,8, Rt = 4,25 min (LC Método 4). *
* Ejemplo 99: bis(octadeca-9,12-dienoato) de (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((2-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)dodecanoil)oxi)propano-1,3-diílo
Figure imgf000124_0001
1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 = 5,27 - 5,46 (m, 9 H), 4,89 (t, J=6,27 Hz, 1 H), 4,25 - 4,35 (m, 2 H), 4,10 - 4,25 (m, 4 H), 2,77 (t, J=6,27 Hz, 4 H), 2,57 (s a., 6 H), 2,26 - 2,38 (m, 4 H), 2,05 (c, J=6,69 Hz, 8 H), 1,78 - 1,96 (m, 4 H), 1,61 (d, J=3,01 Hz, 4 H), 1,20 - 1,50 (m, 44 H), 1,06 (s a., 6 H), 0,82 - 0,95 (m, 9 H). MS (M 1) = 972,8, Rt = 4,25 min (LC Método 4).
* Ejemplo 100: dioctanoato de 2-((2-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)tetradecanoil)oxi)propano-1,3-diílo
Figure imgf000124_0002
1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 = 5,31 - 5,41 (m, 1 H), 4,89 (t, J=6,15 Hz, 1 H), 4,25 - 4,36 (m, 2 H), 4,09 - 4,25 (m, 4 H), 2,59 (s a., 6 H), 2,24 - 2,37 (m, 4 H), 1,78 - 2,03 (m, 4 H), 1,61 (d, J=3,26 Hz, 4 H), 1,43 (s a., 2 H), 1,18 - 1,37 (m, 34 H), 1,07 (s a., 6 H), 0,88 (t, J=6,65 Hz, 9 H). MS (M 1) = 728,5, Rt = 1,37 min (LC Método 7).
* Síntesis del Ejemplo 101:
Intermedio 101a:
Figure imgf000124_0003
Una solución 1.0 M de DIBAL (15.4 ml, 15.4 mmol) en tolueno se añadió a una solución en DCM (60 ml) del Intermedio 11a (5 g, 15.4 mmol), enfriada en un baño de hielo seco/acetona. Después de 1.5 h, la mezcla se dejó calentar a ta y después se trató con una solución ac. sat. de cloruro de amonio (20 ml) y agua (10 ml). La reacción se extrajo con DCM. Los extractos de diclorometano combinados se lavaron dos veces con salmuera, se secaron sobre MgSO4 y se filtraron. El filtrado se concentró a presión reducida y el residuo se disolvió en MeOH (20 ml). Se añadió NaBH4 (581 mg, 15.4 mmol) y la mezcla se agitó a ta. Después de 1 hora, se añadió agua a la mezcla y el MeOH se eliminó a presión reducida. La mezcla resultante se extrajo con EtOAc. Los extractos orgánicos se lavaron con NaHCO3 ac. sat., se secaron sobre Na2SO4 y se filtraron. El filtrado se concentró a presión reducida y el residuo se purificó sobre gel de sílice con EtOAc al 0-20 %/heptano para proporcionar 2.46 g del compuesto del título. 1H RMN (400 MHz, DMSO-cfe) 5 = 4,35 - 4,45 (m, 2 H), 3,47 (dt, J=9,41, 6,46 Hz, 2 H), 3,28 - 3,40 (m, 4 H), 1,35 - 1,57 (m, 8 H), 1,24 (s a., 20 H), 0,79 - 0,91 (m, 6 H).
* Ejemplo 101: 4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoato de 4,4-bis(octiloxi)butilo
Figure imgf000124_0004
1H RMN (400 MHz, CDCI3) 5 = 4,67 - 4,77 (m, 1 H), 4,44 - 4,52 (m, 1 H), 4,13 - 4,25 (m, 2 H), 4,09 (t, J=5,90 Hz, 2 H), 3,56 (dt, J=9,16, 6,71 Hz, 2 H), 3,41 (dt, J=9,22, 6 , 6 8 Hz, 2 H), 2,30 - 2,47 (m, 4 H), 2,25 (s, 6 H), 1,81 - 2,04 (m, 6 H), 1,49- 1,75 (m, 10 H), 1,21 - 1,40 (m, 38 H), 0,82 - 0,96 (m, 9 H). MS (M 1) = 714,7, Rt = 1,83 min (LC Método 7). * Ejemplo 102: 2-(((3-(dietMamino)propoxi)carbonM)oxi)dodecanoato de 4,4-bis(octiloxi)butilo
Figure imgf000125_0001
En un matraz de fondo redondo de 100 ml equipado con una barra de agitación, el Intermedio 103a (465 mg, 1.082 mmol) y HATU (453 mg, 1.191 mmol) se disolvieron en DCM (Volumen: 20 ml). Se añadió DIPEA (0.756 ml, 4.33 mmol) y la mezcla se agitó durante ~30 min antes de la adición de dietanolamina (0.311 ml, 3.25 mmol). Después, la mezcla se agitó a ta durante una noche, cuando el análisis por LCMS mostró la formación del producto. Después, los volátiles se evaporaron a presión y el material en bruto se purificó sobre gel de sílice con MeOH al 0-20 %/DCM para proporcionar 345 mg (62 %) del compuesto del título. LC-MS m/z = 623.3 (MH+). Tr = 0.43 min (Método 5 de LC).
* Ejemplo 103: octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-10-dodecil-3-etil-14-(2-((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoiloxi)etil)-,13-d ioxo-7,9-d ioxa-3,14-d iazahexadecan-16-ilo
Figure imgf000126_0001
En un matraz de fondo redondo de 500 ml equipado con una barra de agitación, ácido linoleico (393 mg, 1.402 mmol) y el Intermedio 103b (345 mg, 0.668 mmol) se disolvieron en DCM (Volumen: 20 ml). Se añadió DIPEA (0.466 ml, 2.67 mmol), seguido de DMAP (32.6 mg, 0.267 mmol) y la mezcla se agitó a ta durante ~5 min antes de la adición de EDCHCl (282 mg, 1.469 mmol). La mezcla se agitó a ta durante una noche. Después, los volátiles se evaporaron a presión reducida y el material en bruto se purificó sobre gel de sílice con (EtOAc al 0-60 %/Heptano) para proporcionar 389 mg (53 %) del compuesto del título. 1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 5,46 - 5,27 (m, 8H), 4,82 - 4,66 (m, 1H), 4,30 - 4,08 (m, 6H), 3,68 -3,52 (m, 4H), 2,78 (t, J=6,5 Hz, 4H), 2,70 - 2,35 (m, 8H), 2,30 (dt, J=3,3, 7,5 Hz, 4H), 2,12 - 1,97 (m, 9H), 1,97 - 1,78 (m, 3H), 1,71 - 1,51 (m, 8H), 1,44 - 1,21 (m, 46H), 1,05 (s a., 6H), 0,95 - 0,82 (m, 9H). 13C RMN (100 MHz, CDCla) 5 = 173,6, 173,4, 172,4, 155,1, 130,2 (2C), 130,0 (2C), 128,0 (2C), 127,9 (2C), 78,3, 66,3, 62,0, 61,6, 49,0, 47,1, 46,8, 45,5 (2C), 34,3, 34,1, 34,0, 31,9, 31,5 (2C), 29,7 (2C), 29,6 (6C), 29,5 (4C), 29,3 (4C), 29,2 (2C), 29,1 (2C), 28,7, 27,2 (4C), 25,6, 25,2, 24,8 (2C), 22,7, 22,6(2C), 14,1 (3C), 11,6 (2C) ppm.
* Síntesis del Ejemplo 104:
Intermedio 104a: 4-oxobutanoato de terc-butilo
Figure imgf000126_0002
El Intermedio 104a se preparó a partir de 4-hidroxibutanoato de terc-butilo en un método similar al usado para la síntesis del Intermedio 1g. 1H RMN (CDCb) 5 = 9,83 (s, 1H), 2,73-2,78 (m, 2H), 2,55-2,60 (m, 2H), 1,47 (s, 9H)
Intermedio 104b 4-hidroxidodec-11-enoato de terc-butilo
Figure imgf000126_0003
Se pesaron limaduras de magnesio (307 mg, 12.64 mmol) en un matraz secado previamente y se secaron en un horno a 120 °C durante 2 horas. El matraz se retiró del horno, se selló y se enfrió a temperatura ambiente. Al matraz se le añadieron 6 ml de THF anhidro y se añadió una partícula de yodo, seguido de la adición de 8-bromooct-1-eno (1.570 g, 8.22 mmol). Se añadió un condensador al matraz, todo el sistema se intercambió con N2 y se protegió con un globo de N2
. La reacción se calentó con un calentador hasta que se disipó el color pardo del yodo. La reacción se calentó a reflujo hasta que se consumió la mayor parte del magnesio (aprox. 1.5 h) y después se enfrió a temperatura ambiente.
A una solución del Intermedio 104a (1.0 g, 6.32 mmol) en 25 ml de THF, enfriada en un baño de hielo seco-acetona, se le añadió gota a gota el reactivo de Grignard recién preparado. La reacción se agitó durante 1 h y después se calentó a temperatura ambiente. La reacción se interrumpió con NaHCO3 ac. sat. y se extrajo con acetato de etilo. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato sódico y se filtraron. El filtrado se concentró a presión reducida y se purificó sobre gel de sílice con acetato de etilo al 10 %/heptano para proporcionar el producto deseado (890 mg, 60 %).
1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 = 5,61-5,85 (m, 1H),4,80-4,98 (m, 2H), 3,48-3,62 (m, 1H), 2,26-2,36 (t, J=7,5Hz, 2H), 1,50­ 1,78 (m, 4H), 1,35-1,44 (m, 19H).
Intermedio 104c: 4-hidroxi-11-oxoundecanoato de terc-butilo
Figure imgf000127_0001
A una solución del Intermedio 104b (300 mg, 0.78 mmol) en 8 ml de dioxano/H2O (3:1) se le añadió 2,6-lutidina (0.36 ml, 3.11 mmol), seguido de OsO4 (0.243 ml, al 2.5 % en peso en f-butanol, 0.02 mmol) y NaIO4 (664 mg, 3.11 mmol). La suspensión se agitó durante 1.5 h a temperatura ambiente. La reacción se filtró a través de celite con lavados de acetato de etilo. Después, el filtrado se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato sódico y se filtró. El filtrado se concentró a presión reducida y se purificó sobre gel de sílice con acetato de etilo al 25 %/heptano para proporcionar el producto deseado (150 mg, 71 %). 1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 = 9,76 (t, J=1,8 Hz, 1H), 3,51-3,72 (m, 1H), 2,43 (td, J=7,3, 1,9 Hz, 2H), 2,37 (t, J=7,2 Hz, 2H), 1,77 (s, 1H), 1,58-1,71 (m, 3H), 1,45 (s, 13H), 1,33 (m, 4H).
Intermedio 104d: 4,11-dihidroxiundecanoato de terc-butilo
Figure imgf000127_0002
El Intermedio 104c (140 mg, 0.51 mmol) se disolvió en 6 ml de THF/MeOH (1:1) y se enfrió en un baño de hielo-agua. Se añadió NaBH4 (29.2 mg, 0.77 mmol) y la mezcla se agitó durante 30 min. La reacción se calentó a temperatura ambiente y después se diluyó con salmuera y acetato de etilo. Los extractos orgánicos se secaron sobre sulfato sódico y se filtraron. El filtrado se concentró a presión reducida para proporcionar el compuesto del título, que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. 1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 = 3,57 (t, J=6,6 Hz, 3H), 2,30 (t, J=7,2Hz, 2H), 1,45-1,77 (m, 7H), 1,33-1,42 (m, 14H), 1,22-130 (m, 4H).
Intermedio 104e: 4-hidroxi-11-(octanoiloxi)undecanoato de terc-butilo
Figure imgf000127_0003
A una solución del Intermedio 104d (130 mg, 0.47 mmol) en 4.0 ml de DCM, se le añadieron ácido octanoico (75 mg, 0.52 mmol), DMAP (17.4 mg. 0.14 mmol), DIPEA (0.083 ml, 0.47 mmol), seguido de EDC (118 mg, 0.62 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. La reacción se diluyó con salmuera y acetato de etilo. Los extractos orgánicos se secaron sobre sulfato sódico y se filtraron. El filtrado se concentró a presión reducida y el residuo se purificó sobre gel de sílice con acetato de etilo al 10 %/heptano para proporcionar el producto deseado (110 mg, 58 %). 1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 4,07 (t, J=6,7 Hz, 2H), 3,56-3,68 (m, 1H), 2,38 (t, J=7,3 Hz, 2H), 2,30 (t, J=7,6 Hz, 2H), 1,85 (m., 2H), 1,55-1,74 (m, 5H), 1,46 (m, 12H), 1,23-1,41 (m, 15H), 0,82-0,96 (m, 3H).
Intermedio 104f: 4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)-11-(octanoiloxi)undecanoato de terc-butilo
A una solución del Intermedio 104e (110 mg, 0.28 mmol) en 3.0 ml de DCM, enfriada en un baño de hielo-agua, se le añadió piridina (0.033 ml, 0.41 mmol), seguido de trifosgeno (40.7 mg, 0.14 mmol). Después de 30 min, se añadió 3-(dietilamino)-1-propanol (0.126 ml, 0.824 mmol). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. La reacción se concentró a presión reducida y el residuo se purificó sobre gel de sílice con MeOH al 5 %/DCM para proporcionar el producto deseado (110 mg, 72 %). 1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 4,64-4,88 (m, 1H), 4,24 (t, J=6,8 Hz, 2H), 4,06 (t, J=6,8 Hz, 2H), 3,10 (s a., 6H), 2,18-2,43 (m, 6H), 1,76-2,00 (m, 2H), 1,50-1,72 (m, 6H), 1,46 (s, 9H), 1,22­ 1,45 (m, 22H), 0,86-0,94 (m, 3H).
Intermedio 104g: ácido 4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)-11-(octanoiloxi)undecanoico
Figure imgf000128_0001
A una solución del Intermedio 104f (110 mg, 0.2 mmol) en 2.4 ml de DCM se le añadieron 0.6 ml de TFA. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. La reacción se secó a presión reducida para proporcionar el compuesto del título, que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. 1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 10,13­ 10,42 (a, s, 1H), 5,75 (s a., 6H), 4,71-4,95 (m, 1H), 4,32-4,60 (m, 1H), 4,07 (t, J=6,8 Hz, 3H), 3,08-3,52 (m, 6H), 2,47-2,64 (m, 1H), 2,37-2,47 (m, 1H), 2,32 (t, J=7,5 Hz, 2H), 2,10 (s a., 3H), 1,85-2,02 (m, 1H), 1,19-1,44 (m, 22H), 0,80-0,99 (m, 3H).
* Ejemplo 104: dioctanoato de 2-((4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)-11-(octanoiloxi)undecanoil)oxi)propano-1,3-diílo
Figure imgf000128_0002
1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 5,20-5,32 (m, 1H), 4,66-4,79 (m, 1H), 4,29 (dd, J=11,8, 4,3 Hz, 2H), 4,09-4,23 (m, 4H), 4,04 (t, J=6,7 Hz, 2H), 2,48-2,58 (m, 6H), 2,36-2,48 (m, 2H), 2,24-2,36 (m, 6H), 1,76-2,02 (m, 4H), 1,47-1,69 (m, 10H), 1,17-1,41 (m, 32H), 1,02 (t, J=7,2 Hz, 6H), 0,81-0,92 (m, 9H). MS (M 1) = 828,61, Rt = 0,89 min. (LC Método 6).
* Síntesis del Ejemplo 105:
Intermedio 105a: bis(octadeca-9,12-dienoato) de (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(hidroximetil)propano-1,3-diílo
Figure imgf000128_0003
En un matraz de fondo redondo, ácido linoleico (95.0 g, 339 mmol), DMAP (4.14 g, 33.90 mmol), DIPEA (74.1 ml, 424 mmol) y 2-(hidroximetil)propano-1,3-diol (18.0 g, 170 mmol) se recogieron en diclorometano (435 ml). Se añadió EDC (81.0 g, 424 mmol) en una porción y la reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 24 h, la reacción se concentra a presión reducida con polvo de gel de sílice para la carga en seco y el residuo se purificó sobre gel de sílice (Biotage) usando acetato de etilo /heptano (del 0 % al 40 %) como eluyente, para proporcionar 47 g (rendimiento del 44 %) del producto deseado en forma de un aceite incoloro. 1H r Mn (400 MHz, CDCb): 5 = 5,19-5,50 (m, 8h ), 4,19 (tt, J = 11,83, 5,87 Hz, 4H), 3,51-3,69 (m, 2H), 2,78 (t, J = 6,53 Hz, 4H), 2,33 (t, J = 7,53 Hz, 4H), 2,20 (quint, J = 5,83 Hz, 2H), 2,06 (c, J = 6,78 Hz, 8H), 1,49-1,72 (m, 5H), 1,20-1,46 (m, 26H), 0,79-0,98 (m, 6H) ppm.
* Ejemplo 105: bis(octadeca-9,12-dienoato) de (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(9-dodecN-2-metN-7,12-dioxo-6,8,13-trioxa-2-azatetradecan-14-il)propano-1,3-diílo
Figure imgf000129_0001
El Ejemplo 105 puede prepararse usando métodos similares a los usados para sintetizar el Ejemplo 80. 1H RMN (400 MHz, CDCla): 5 = 5,55 - 5,18 (m, 8H), 4,71 (dq, J = 6,9, 2,7 Hz, 1H), 4,33 - 4,01 (m, 8H), 2,77 (t, J = 6,5 Hz, 4H), 2,60 -2,17 (m, 15H), 2,17 - 1,76 (m, 12H), 1,75 - 1,46 (m, 7H), 1,45 - 1,16 (m, 47H), 0,88 (td, J = 6,8, 3,9 Hz, 9H). MS (M 1): 1015,3, Rt = 1,28 min (LC Método XX)
El siguiente ejemplo puede prepararse usando secuencias y métodos similares a los empleados para la síntesis del Ejemplo 11.
Ejemplo 106: 4,4-bis(octiloxi)butanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo
Figure imgf000129_0002
1H RMN (400 MHz, CD2Ch) 5 = 4,72 - 4,82 (m, 1H), 4,45 (t, J = 5,56 Hz, 1H), 4,03 - 4,19 (m, 4H), 3,54 (dt, J = 9,23, 6,63 Hz, 2H), 3,38 (dt, J = 9,20, 6,65 Hz, 2H), 2,26 - 2,39 (m, 4H), 2,19 (s, 6H), 1,75 - 1,93 (m, 6H), 1,45 - 1,69 (m, 8H), 1,21 -1,38 (m, 38H), 0,82 - 0,93 (m, 9H) ppm. MS (M 1) = 701,1, Rt = 1,12 min (LC Método 12).
Los siguientes ejemplos puede prepararse usando secuencias y métodos similares a los empleados para la síntesis del Ejemplo 16.
* Ejemplo 107:
6,6-bis(octiloxi)hexanoato de 3-(((3-(piperidin-1-il)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo 1
Figure imgf000129_0003
1H RMN (400 MHz, CD2Ch) 5 = 4,77 (quin, J = 6,24 Hz, 1H), 4,41 (t, J = 5,69 Hz, 1H), 4,05 - 4,18 (m, 4H), 3,53 (dt, J = 9,29, 6,66 Hz, 2H), 3,37 (dt, J = 9,29, 6,66 Hz, 2H), 2,23 - 2,40 (m, 8H), 1,89 (c, J = 6,36 Hz, 2H), 1,80 (quin, J = 6,88 Hz, 2H), 1,46 - 1,66 (m, 14H), 1,16 - 1,45 (m, 44H), 0,83 - 0,93 (m, 9H) ppm.
MS (M 1) = 768.8, Tr = 2.60 min (método 13 de LC).
* Ejemplo 108:
6,6-bis(octiloxi)hexanoato de 3-(((3-(piperazin-1-il)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo
Figure imgf000130_0001
1H RMN (400 MHz, CD2CI2) 5 = 4,77 (quin, J = 6,24 Hz, 1H), 4,41 (t, J = 5,62 Hz, 1H), 4,05-4,18 (m, 4H), 3,53 (dt, J = 9,29, 6,66 Hz, 2H), 3,37 (dt, J = 9,35, 6,63 Hz, 2H), 2,86 (t, J = 4,83 Hz, 4H), 2,34 - 2,64 (m, 7H), 2,29 (t, J = 7,52 Hz, 2H), 1,90 (m, J = 6,44, 6,44, 6,44 Hz, 2H), 1,81 (quin, J = 6,91 Hz, 2H), 1,47 - 1,66 (m, 10H), 1,21 - 1,41 (m, 42H), 0,83 - 0,93 (m, 9H) ppm.
MS (M 1) = 770.2, Tr = 1.18 min (método 14 de LC).
Ejemplo 109:
6,6-bis(octiloxi)hexanoato de 3-(((4-(dietilamino)butoxi)carbonil)oxi)pentadecilo
Figure imgf000130_0002
1H RMN (400 MHz, CD2CI2) 5 = 4,77 (quin, J = 6,24 Hz, 1H), 4,41 (t, J = 5,62 Hz, 1H), 4,02 - 4,20 (m, 4H), 3,53 (dt, J = 9,29, 6,66 Hz, 2H), 3,37 (dt, J = 9,29, 6,66 Hz, 2H), 2,35 - 2,56 (m, 6H), 2,28 (t, J = 7,52 Hz, 2H), 1,90 (c, J = 6,40 Hz, 2H), 1,42 - 1,73 (m, 14H) 1,21 - 1,40 (m, 42H) 0,98 (t, J = 7,09 Hz, 6H) 0,84 - 0,92 (m, 9H) ppm.
MS (M 1) = 771.2, Tr = 2.82 min (método 13 de LC).
* Ejemplo 110: 1
6,6-bis(octiloxi)hexanoato de 3-(((3-(4-metilpiperazin-1-il)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo
Figure imgf000130_0003
1H RMN (400 MHz, CD2CI2) 5 = 4,77 (quin, J = 6,24 Hz, 1H), 4,41 (t, J = 5,62 Hz, 1H), 4,04-4,19 (m, 4H), 3,53 (dt, J = 9,29, 6,66 Hz, 2H), 3,37 (dt, J = 9,35, 6,63 Hz, 2H), 2,24 - 2,55 (m, 12H), 2,22 (s, 3H), 1,89 (c, J = 6,36 Hz, 2H) 1,80 (quin, J = 6,91 Hz, 2H), 1,48 - 1,66 (m, 10H), 1,19 - 1,42 (m, 42H), 0,81 - 0,95 (m, 9H) ppm.
MS (M 1) = 784.2, Tr = 2.64 min (método 13 de LC).
* Ejemplo 111:
6,6-bis(octiloxi)hexanoato de 3-((((1-metilpiperidin-4-il)metoxi)carbonil)oxi)pentadecilo
Figure imgf000131_0001
1H RMN (400 MHz, ACETONITRILO-cb): 5 = 4,76 (quin, J = 6,27 Hz, 1H), 4,41 (t, J = 5,62 Hz, 1 H), 4,07 (t, J = 6,30 Hz, 2H), 4,01 - 3,88 (m, 2H), 3,52 (dt, J = 9,38, 6,56 Hz, 2H), 3,43 - 3,33 (m, 2H), 2,82 - 2,72 (m, 2H), 2,26 (t, J = 7,34 Hz, 3H), 1,90 - 1,80 (m, 2H) 2,16 (s, 3H), 1,68 - 1,46 (m, 12H), 1,38 - 1,20 (m, 46H), 0,88 (t, J = 6,54 Hz, 9H) ppm.
MS (M 1) = 755, Tr = 1.20 min (método 12 de LC).
* Ejemplo 112:
6 ,6 -bis(octiloxi)hexanoato de 3-(((3-morfolinopropoxi)carbonil)oxi)pentadecilo
Figure imgf000131_0002
1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 = 4,85 - 4,76 (m, 1H), 4,45 (t, J = 5,69 Hz, 1H), 4,26-4,04 (m, 4H), 3,75 (s a., 4H), 3,56 (dt, J = 9,26, 6 , 6 8 Hz, 2H), 3,40 (dt, J = 9,29, 6,72 Hz, 2H), 2,54 - 2,39 (m, 4H), 2,35 - 2,26 (m, 2H), 1,96 - 1,88 (m, 2H), 1,70 - 1,51 (m, 12H), 1,37 - 1,22 (m, 44H), 0,93 - 0,85 (m, 9H) ppm.
MS (M 1) = 771, Tr = 1.34 min (método 12 de LC).
Ejemplo 113:
6 ,6 -bis(octiloxi)hexanoato de 3-(((2-(dietilamino)etoxi)carbonil)oxi)pentadecilo
Figure imgf000131_0003
1H RMN (400 MHz, CDCI3) 5 = 4,86 - 4,75 (m, 1H), 4,46 (t, J = 5,69 Hz, 1H), 4,37 - 4,23 (m, 1H), 4,21 - 4,06 (m, 2H), 3,56 (dt, J = 9,29, 6 , 6 6 Hz, 2H), 3,40 (dt, J = 9,29, 6,72 Hz, 2H), 2,31 (t, J = 7,58 Hz, 2H), 1,97 - 1,87 (m, 2H), 1,72 - 1,49 (m, 12H), 1,44 - 1,05 (m, 53H), 0,93 - 0,85 (m, 9H) ppm.
MS (M 1) = 743, Tr = 0.86 min (método 12 de LC).
Síntesis del ejemplo 114:
Los siguientes ejemplos puede prepararse usando secuencias y métodos similares a los empleados para la síntesis del ejemplo 16, acoplamiento con el intermedio 114a, obtenido a partir de 2-propil pentanol.
Intermedio 114a: ácido 6,6-bis((2-propilpentil)oxi)hexanoico
Figure imgf000132_0001
TLC (gel de sílice, MeOH al 10 %/DCM, tinción con PMA): Fr = 0.14.
Ejemplo 114:
6,6-bis((2-propilpentil)oxi)hexanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo
Figure imgf000132_0002
1H RMN (400 MHz, CD2CI2) 5 = 4,77 (quin, J = 6,27 Hz, 1H), 4,37 (t, J = 5,62 Hz, 1H), 4,02 - 4,19 (m, 4H), 3,44 (dd, J = 9,23, 5,69 Hz, 2H), 3,25 (dd, J = 9,23, 5,69 Hz, 2H), 2,48 (c, J = 7,09 Hz, 6H), 2,28 (t, J = 7,58 Hz, 2H), 1,89 (c, J = 6,40 Hz, 2H), 1,76 (t, J = 6,85 Hz, 2H), 1,47 - 1,66 (m, 8H), 1,16 - 1,41 (m, 38H), 0,98 (t, J = 7,09 Hz, 6H), 0,85 - 0,92 (m, 15H) ppm.
MS (M 1) = 757.2, Tr = 2.62 min (método 13 de LC).
Ejemplo 115:
6,6-bis((2-propilpentil)oxi)hexanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo
Figure imgf000132_0003
1H RMN (400 MHz, ACETONITRILO-cb) 5 = 4,80 - 4,71 (m, 1H), 4,38 (t, J= 5,62 Hz, 1H), 4,17 - 4,02 (m, 4H), 3,45 (dd, J = 9,29, 5,62 Hz, 2H), 3,27 (dd, J = 9,29, 5,62 Hz, 2H), 2,27 (td, J = 7,21, 4,65 Hz, 4H), 2,14 (s, 6H), 1,90 - 1,82 (m, 2H), 1,76 (quin, J = 6,85 Hz, 2H), 1,64 - 1,47 (m, 8H), 1,40 - 1,19 (m, 38H), 0,88 (t, J = 7,03 Hz, 15H) ppm.
MS (M 1) = 729, Tr = 1.16 min (método 14 de LC).
Síntesis del ejemplo 116:
El siguiente ejemplo puede prepararse usando secuencias y métodos similares a los empleados para la síntesis del ejemplo 16, pero con el compañero de acoplamiento intermedio 116a, obtenido a partir de 3-etil-1-pentanol.
Intermedio 116a: ácido 6,6-bis((3-etilpentil)oxi)hexanoico
Figure imgf000133_0001
TLC (gel de sílice, MeOH al 10 %/DCM, tinción con PMA): Fr = 0.17.
Ejemplo 116:
6,6-bis((3-etilpentil)oxi)hexanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo
Figure imgf000133_0002
1H RMN (400 MHz, CD2CI2) 5: 4,82 - 4,72 (m, 1H), 4,41 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 4,19 - 4,03 (m, 4H), 3,56 (dt, J = 9,3, 7,1 Hz, 2H), 3,40 (dt, J = 9,3, 7,1 Hz, 2H), 2,30 (dt, J = 10,3, 7,4 Hz, 4H), 2,18 (s, 6H), 1,90 (c, J = 6,4 Hz, 2H), 1,84 - 1,74 (m, 2H), 1,67 - 1,53 (m, 6H), 1,53 - 1,45 (m, 4H), 1,41 - 1,19 (m, 32H), 0,91 - 0,79 (m, 15H).
MS (M 1) = 700.6, Tr = 2.34 min (método 13 de LC).
Los siguientes ejemplos puede prepararse usando secuencias y métodos similares a los empleados para la síntesis del Ejemplos 16.
Intermedio 117a: 1-metilpirrolidin-2-carboxilato de (2R)-1-((terc-butildimetilsilil)oxi)pentadecan-3-ilo
Figure imgf000133_0003
El Intermedio 1h (1.0 g, 2.79 mmol) se disolvió en DMF (30 ml). Se añadieron N-metil-D-prolina (0.54 g, 4.18 mmol), HATU (2.1 g, 5.58 mmol) y DIPEA (2.9 ml, 16.73 ml), seguido de DMAP (0.34 g, 2.79 mmol), y la mezcla se agitó durante 18 h a temperatura ambiente. La mezcla se diluyó con agua (200 ml) y se extrajo con EtOAc (2 * 100 ml). Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron sobre sulfato sódico y se concentraron para obtener un aceite de color verde pálido. La mezcla en bruto se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida sobre alúmina neutra, eluyendo con EtOAc al 8 %/n-hexanos, para dar 1.0 g del producto deseado.
TLC (gel de sílice, MeOH al 10 %/DCM, tinción con PMA): Fr = 0.46.
Intermedio 117b: 1-metilpirrolidin-2-carboxilato de (2R)-1-hidroxipentadecan-3-ilo
Figure imgf000134_0001
El Intermedio 117a (0.60 g, 1.27 mmol) se disolvió en THF (50 ml) y la mezcla se enfrió a 0 °C. Se añadió HFpiridina (4.5 ml de una solución al 70 %) gota a gota y la mezcla se agitó durante 1 h a 0 °C. Después, la mezcla se diluyó con agua (30 ml) y se neutralizó con NaHCO3 sólido. Esta mezcla se extrajo con DCM (2 * 50 m) y las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron sobre sulfato sódico y se concentraron. La mezcla en bruto se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
TLC (gel de sílice, MeOH al 10 %/DCM, tinción con PMA): Fr = 0.28.
Los siguientes ejemplos pueden prepararse usando métodos similares a los empleados para la síntesis del Ejemplos 16, empleando alcoholes similares al intermedio 117b.
* Ejemplo 117:
1-metilpirrolidin-2-carboxilato de (2R)-1-((6,6-bis(octiloxi)hexanoil)oxi)pentadecan-3-ilo
Figure imgf000134_0002
1H RMN (400 MHz, CD2Ch) 5: 5,04 - 4,94 (m, 1H), 4,41 (t, J = 5,7 Hz, 1H), 4,13- 3,99 (m, 2H), 3,53 (dt, J = 9,3, 6,7 Hz, 2H), 3,37 (dt, J = 9,3, 6,7 Hz, 2H), 3,11 - 3,00 (m, 1H), 2,96 - 2,85 (m, 1H), 2,35 (s, 3H), 2,32 - 2,23 (m, 3H), 2,17 - 2,01 (m, 1H), 1,96 - 1,68 (m, 5H), 1,66 - 1,47 (m, 10H), 1,40 - 1,20 (m, 42H), 0,93 - 0,83 (m, 9H).
MS (M 1) = 710.7, Tr = 2.70 min (método 13 de LC).
* Ejemplo 118:
1-metilpirrolidin-2-carboxilato de (2S)-1-((6,6-bis(octiloxi)hexanoil)oxi)pentadecan-3-ilo
Figure imgf000134_0003
1H RMN (400 MHz, CD2Ch) 5: 5,04 - 4,95 (m, 1H), 4,41 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 4,12 - 3,99 (m, 2H), 3,53 (dt, J = 9,3, 6,7 Hz, 2H), 3,37 (dt, J = 9,3, 6,7 Hz, 2H), 3,12 - 3,02 (m, 1H), 2,93 (s a, 1H), 2,36 (s, 3H), 2,33 - 2,23 (m, 3H), 2,18 - 2,02 (m, 1H), 1,96 - 1,81 (m, 4H), 1,82-1,71 (m, 1H), 1,66 - 1,47 (m, 11H), 1,40 - 1,20 (m, 41H), 0,93 - 0,83 (m, 9H).
M S (M 1) = 711.1 , T r = 2.77 m in (m é to d o 13 d e LC ).
* Ejemplo 119:
pirrolidin-2-carboxilato de (2R)-1-((6,6-bis(octiloxi)hexanoil)oxi)pentadecan-3-ilo
Figure imgf000135_0001
1H RMN (400 MHz, CD2CI2) 5: 5,03 - 4,91 (m, 1H), 4,41 (t, J =5,6 Hz, 1H), 4,13 - 4,00 (m, 2H), 3,77 - 3,69 (m, 1H), 3,53 (dt, J = 9,3, 6,7 Hz, 2H), 3,37 (dt, J = 9,3, 6,7 Hz, 2H), 3,10 - 3,00 (m, 1H), 2,94 - 2,83 (m, 1H), 2,76 - 2,34 (s a, 1H), 2,28 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,17 - 2,05 (m, 1H), 1,97 - 1,66 (m, 5H), 1,66 - 1,47 (m, 10H), 1,40 - 1,18 (m, 42H), 0,94 - 0,82 (m, 9H). MS (M 2) = 697.3, Tr = 2.58 min (método 13 de LC).
* Ejemplo 120:
1,3-dimetilpirrolidin-3-carboxilato de 1-((6,6-bis(octiloxi)hexanoil)oxi)pentadecan-3-ilo
Figure imgf000135_0002
1H RMN (400 MHz, CDCI3): 5 = 4,98(m, 1H), 4,42 (t, J = 8 Hz, 1H), 4,10 (c, J = 8 Hz, 2H), 3,48 (c, J = 8 Hz, 2H), 3,40 (c, J = 4 Hz, 2H), 2,88 (d, J = 8 Hz, 1H), 2,68-2,62 (m, 1H), 2,58-2,45 (m, 3H), 2,34-2,24 (m, 4H), 1,96-1,82 (m, 2H), 1,52 (m, 7H), 1,42-1,20 (m, 50H), 0,98-0,82 (m, 9H) ppm.
MS (M 1) = 725.3, Tr = 2.78 min (método 13 de LC).
* Ejemplo 121:
6 ,6 -bis(octiloxi)hexanoato de 3-((3-(1-metilpiperidin-4-il)propanoil)oxi)pentadecilo 1
Figure imgf000135_0003
1H RMN (400 MHz, CDCI3): 8 = 4,98 (m, 1H), 4,42 (m, 1H), 4,10 (m, 2H), 3,58-3,50 (m, 2H), 3,42-3,38 (m, 2H), 2,84 (m, 2H), 2,38-2,22 (m, 8 H), 1,98-1,82 (m, 5H), 1,76-142 (m, 10H), 1,38-1,20 (m, 47H), 0,84-0,80 (m, 9H) ppm.
M S (M 1) = 753.4 , T r = 2.83 m in (m é to d o 13 d e LC ).
* Ejemplo 122:
1,4-dimetilpiperidin-4-carboxilato de 1-((6,6-bis(octiloxi)hexanoil)oxi)pentadecan-3-ilo
Figure imgf000136_0001
El Intermedio 1g (22.5 g, 119.6 mmol) se disolvió en THF (225 ml) y se enfrió a 0 °C. Se añadió bromuro de heptil magnesio (1 M en éter dietílico, 143.5 ml, 143.5 mmol) gota a gota y la mezcla se agitó durante 2 h a 0 °C. La reacción se interrumpió con la adición de cloruro de amonio acuoso (100 ml) y se extrajo con EtOAc (2 * 200 ml). Las capas orgánicas se secaron sobre sulfato sódico y se concentraron para obtener el producto en bruto. La mezcla en bruto se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice, eluyendo con EtOAc al 3 %/heptano para proporcionar 12.8 g del producto deseado.
TLC (gel de sílice, EtOAc al 20 %/heptano, tinción con PMA): Fr = 0.55.
Intermedio 124b: 5-heptil-2,2,9,9,10,10-hexametil-3,3-difenil-4,8-dioxa-3,9-disilaundecano
El Intermedio 124a (12.8 g, 44.4 mmol) se disolvió en DCM (130 ml). Se añadieron imidazol (4.53 g, 66.6 mmol) y DMAP (0.54 g, 4.44 mmol), seguido de TBDPSCI (11.55 ml, 44.4 mmol), y la mezcla se agitó durante 16 h a temperatura ambiente. Después, la mezcla se diluyó con agua (200 ml) y se extrajo con DCM (2 * 100 ml). Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron sobre sulfato sódico y se concentraron. La mezcla en bruto se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice, eluyendo con EtOAc al 1 %/heptano para proporcionar 14.5 g del producto deseado.
TLC (gel de sílice, EtOAc al 10 %/heptano, UV): Fr = 0.96.
Intermedio 124c: 3-((terc-butildifenilsilil)oxi)decan-1-ol
Figure imgf000137_0001
El Intermedio 124b (14.5 g, 27.5 mmol) se disolvió en etanol (145 ml) y se trató con PPTS (7.61 g, 30.3 mmol). La mezcla se agitó durante 16 h a temperatura ambiente. Después, la mezcla se diluyó con agua (300 ml) y se extrajo con DCM (2 * 100 ml). Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron sobre sulfato sódico y se concentraron. El material en bruto se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional TLC (gel de sílice, EtOAc al 10 %/heptano, UV): Fr = 0.31.
Intermedio 124d: 3-((terc-butildifenilsilil)oxi)decanal
Figure imgf000137_0002
Se disolvió IBX (14.4 g, 51.5 mmol) en DMSO (70 ml) y se añadió el intermedio 124c (8.5 g, 20.6 mmol). La mezcla se agitó durante 2 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó con éter dietílico (500 ml), el sólido resultante se filtró, y el filtrado se lavó con salmuera (2 * 100 ml), se secó sobre sulfato sódico y se concentró. El producto en bruto se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
TLC (gel de sílice, EtOAc al 10 %/heptano, UV): Fr = 0.66.
Intermedio 124e: 10-((terc-butildifenilsilil)oxi)heptadecan-8-ol
Figure imgf000137_0003
El Intermedio 124d (8.0 g, 19.5 mmol) se disolvió en THF (80 ml) y se enfrió a 0 °C. Se añadió bromuro de heptil magnesio (1 M en éter dietílico, 23.4 ml, 23.4 mmol) gota a gota y la mezcla se agitó durante 2 h a 0 °C. La reacción se interrumpió con la adición de cloruro de amonio acuoso (100 ml) y se extrajo con EtOAc (2 * 100 ml). Las capas orgánicas se secaron sobre sulfato sódico y se concentraron para obtener el producto en bruto. La mezcla en bruto se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice, eluyendo con EtOAc al 1 %/heptano para proporcionar 6.0 g del producto deseado.
TLC (gel de sílice, EtOAc al 10 %/heptano, UV): Fr = 0.52.
Intermedio 124f: heptadecano-8,10-diol
Figure imgf000137_0004
El Intermedio 124e (6.0 g, 11.7 mmol) se disolvió en THF (60 ml) y se enfrió a 0 °C. Se añadió HF piridina (70 %, 3.39 ml) gota a gota y después la mezcla se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 16 h. La mezcla se diluyó con agua (100 ml) y se extrajo con DCM (2 * 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (100 ml), se secó sobre sulfato sódico y se concentró para obtener el producto en bruto. Después, la mezcla en bruto se trituró con pentano para proporcionar 1.1 g del producto deseado.
TLC (gel de sílice, EtOAc al 10 %/heptano, tinción con PMA): Fr = 0.51.
Intermedio 124g: 5-(4,6-diheptil-1,3-dioxan-2-il)pentanoato de metilo
Figure imgf000138_0001
El Intermedio 16a (1.0 g, 5.2 mmol), intermedio 124f (2.1 g, 7.9 mmol) y KHSO4 se combinaron netos y se calentaron a 70 °C durante 4 h. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con agua (40 ml), y se extrajo con EtOAc (2 * 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron sobre sulfato sódico y se concentraron. La mezcla en bruto se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice, eluyendo con EtOAc al 4 %/heptano para proporcionar 1.1 g del producto deseado.
TLC (gel de sílice, EtOAc al 10 %/heptano, tinción con PMA): Fr = 0.47.
Intermedio 124h: ácido 5-(4,6-diheptil-1,3-dioxan-2-il)pentanoico
Figure imgf000138_0002
El Intermedio 124g (1.0 g, 2.5 mmol) se disolvió en agua/metanol (1:1, 40 ml). Se añadió NaOH (0.5 g, 12.5 mmol) y la mezcla se calentó a reflujo durante 2 h. Después, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se neutralizó con HCl 1 N. Después, la mezcla se extrajo con EtOAc (2 * 50 m) y las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron sobre sulfato sódico y se concentraron. El material en bruto se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
TLC (gel de sílice, EtOAc al 10 %/heptano, tinción con PMA): Fr = 0.14.
El siguiente ejemplo puede prepararse usando secuencias y métodos similares a los empleados para la síntesis del Ejemplo 16.
* Ejemplo 124:
5-(4,6-diheptil-1,3-dioxan-2-il)pentanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo 1
Figure imgf000138_0003
1H RMN (400 MHz, CD2Ch) 5: 4,81 - 4,74 (m, 1H), 4,73 (t, J = 5,1 Hz, 1H), 4,20 - 4,03 (m, 4H), 4,00 - 3,91 (m, 1H), 3,76 - 3,66 (m, 1H), 2,53 - 2,41 (m, 6H), 2,28 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 1,99 - 1,84 (m, 3H), 1,81 - 1,67 (m, 3H), 1,64 - 1,54 (m, 4H), 1,54 - 1,42 (m, 4H), 1,42 - 1,20 (m, 44H), 0,98 (t, J = 7,1 Hz, 6H), 0,92 - 0,84 (m, 9H).
M S (M 1) = 769.2 , T r = 2.73 m in (m é to d o 13 d e LC ).
Síntesis del Ejemplo 125:
Intermedio 125a: 1-((terc-butildimetilsilil)oxi)undecan-3-ol
Figure imgf000139_0001
A una solución del intermedio 1g (4.0 g, 21.2 mmol) en Et2O (40 ml) en un MFR cargado con una barra de agitación magnética en atmósfera de N2 se le añadió bromuro de octil magnesio (2 M en Et2O, 12.6 ml, 25.5 mmol) gota a gota a 0 °C. La mezcla resultante se agitó durante 2 horas a 0 °C, después de lo cual la reacción se interrumpió con NH4Cl acuoso saturado (100 ml) y se extrajo con EtOAc (2 * 200 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron a presión reducida para obtener un líquido en bruto. El producto en bruto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con EtOAc:hexano (producto eluido a EtOAc al 3 %:hexano) para proporcionar el producto deseado en forma de un líquido de color amarillo pálido (1.8 g).
TLC: Fr = 0.7 (EtOAc: Hexano, 2:8), PMA activo.
Intermedio 125b: (3-(dietilamino)propil) carbonato de 1-((terc-butildimetilsilil)oxi)undecan-3-ilo
Figure imgf000139_0002
A una solución agitada del intermedio 125a (1.8 g, 5.9 mmol) en DCM (18 ml) en un MFR cargado con una barra de agitación magnética en atmósfera de N2 se le añadieron piridina (2.4 ml, 29.7 mmol) y DMAP (363 mg, 2.9 mmol), seguido de cloroformiato de 4-nitrofenilo (2.3 g, 11.9 mmol) a ta. La reacción se agitó durante 8 horas, después de lo cual se añadió 3-(dietilamino)propan-1-ol (1.5 g, 11.9 mmol). La reacción se agitó a ta durante 48 horas, después de lo cual se diluyó con H2O y se extrajo con DCM (2 * 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron a presión reducida para obtener un líquido de color amarillo. El producto en bruto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con EtOAc:hexano (producto eluido a EtOAc al 2 %:hexano) para proporcionar el producto deseado en forma de un líquido de color amarillo (1.45 g).
TLC: Fr = 0.6 (EtOAc: Hexano, 2:8), PMA activo.
Intermedio 125c: (1-hidroxiundecan-3-il) carbonato de 3-(dietilamino)propilo
Figure imgf000139_0003
A un solución a 0 °C del intermedio 125b (1.0 g, 2.1 mmol) en THF (20 ml) en un matraz de fondo redondo cargado con una barra de agitación magnética en atmósfera de N2 se le añadió HF-piridina (30-70 %, 3.1 ml). La mezcla resultante se agitó durante 1 hora a 0 °C, después de lo cual se diluyó con H2O (30 ml), se neutralizó con NaHCO3 sólido y se extrajo con DCM (2 * 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron a presión reducida para obtener el producto deseado en forma de un líquido de color verde pálido en bruto (730 mg). El material en bruto se usó para la siguiente etapa sin purificación.
TLC: Fr = 0.4 (MeOH:DCM, 1:9), PMA activo.
Ejemplo 125:
6,6-bis(octiloxi)hexanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)undecilo
A una solución del intermedio 125c (730 mg, 2.1 mmol) en DMF (30 ml) en un MFR cargado con una barra de agitación magnética en atmósfera de N2 se le añadieron el intermedio 16c (1.10 g, 3.11 mmol), EDCHCl (1.20 g, 6.35 mmol), DIPEA (2.2 ml, 12.7 mmol) y DMAP (258 mg, 2.11 mmol). La mezcla resultante se agitó a 25 - 30 °C durante 18 horas, después de lo cual se diluyó con H2O (200 ml) y se extrajo con EtOAc (2 * 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron a presión reducida para obtener un líquido de color verde pálido en bruto. El producto en bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre alúmina neutra, eluyendo con EtOAc:hexano (producto eluido a EtOAc al 8 %:hexano) para proporcionar el producto deseado en forma de un líquido incoloro (250 mg).
1H RMN (400 MHz, CD2Ch) 5 = 4,77 (quin, J=6,25 Hz, 1H), 4,41 (t, J = 5,62 Hz, 1H) 4,02-4,20 (m, 4H) 3,53 (dt, J = 9,22, 6,69 Hz, 2H), 3,37 (dt, J = 9,22, 6,69 Hz, 2H), 2,49 (d, J = 6,06 Hz, 6H), 2,28 (t, J = 7,52 Hz, 2H), 1,89 (c, J = 6,40 Hz, 2H), 1,71 - 1,82 (m, 2H), 1,46 - 1,67 (m, 10H), 1,20 - 1,42 (m, 34H), 0,99 (t, J = 7,01 Hz, 6H), 0,88 (t, J = 6,63 Hz, 9H) ppm.
MS (M 1) = 701.1, Tr = 2.33 min (método 13 de LC).
Síntesis del Ejemplo 126:
Intermedio 126a: 1-((terc-butildimetilsilil)oxi)tridecan-3-ol
Figure imgf000140_0001
A una solución de bromuro de decil magnesio (1 M en Et2O, 26 ml) en un MFR cargado con una barra de agitación magnética en atmósfera de N2 at 0 °C se le añadió el intermedio 1g (4.0 g, 21.2 mmol) en Et2O (70 ml). La mezcla resultante se agitó durante 2 horas a 0 °C, después de lo cual se inactivó lentamente con una solución saturada de NH4Cl (100 ml) a 0 °C y se extrajo con EtOAc (2 * 250 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron de nuevo con una solución saturada de NH4Cl (250 ml), se secaron sobre Na2SO4 y se evaporaron a sequedad para obtener un líquido en bruto incoloro. El producto en bruto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con EtOAc:hexano (producto eluido a EtOAc al 5 %:hexano) para proporcionar el producto deseado en forma de un líquido incoloro (4.0 g).
TLC: Fr = 0.6 (EtOAc: Hexano, 1:9), PMA activo.
Intermedio 126b: 2-(4-nitrofenil)acetato de 1-((terc-butildimetilsilil)oxi)tridecan-3-ilo
Figure imgf000140_0002
A una solución del intermedio 126a (1.5 g, 4.54 mmol) en DCM (30 ml) en un MFR cargado con una barra de agitación magnética en atmósfera de N2 se le añadió piridina (1.2 ml, 13.6 mmol) seguido de cloroformiato de 4-nitrofenilo (1.37 g, 6.81 mmol) y DMAP (1.7 g, 13.6 mmol) a 0 °C. La reacción se agitó durante 2 horas a 30 °C, después de lo cual se interrumpió con H2O (50 ml) y se extrajo con EtOAc (3 * 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se evaporaron a sequedad para obtener un líquido de color amarillo pálido en bruto. El producto en bruto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con EtOAc:hexano (producto eluido a EtOAc al 2 %:hexano) para proporcionar el producto deseado en forma de un líquido de color amarillo pálido (1.8 g).
TLC: Fr = 0.9 (EtOAc: Hexano, 0,5:9,5), PMA activo.
Intermedio 126c: (3-(dietilamino)propil) carbonato de 1-((terc-butildimetilsilil)oxi)tridecan-3-ilo
Figure imgf000140_0003
A una solución del intermedio 126b (1.8 g, 3.63 mmol) en DCM (15 ml) en un MFR cargado con una barra de agitación magnética en atmósfera de N2 se le añadió piridina (0.6 ml, 7.26 mmol) seguido de 3-(dietilamino)propan-1-ol (1.0 ml, 7.26 mmol) y DMAP (900 mg, 7.26 mmol). La reacción se agitó a 30 °C durante 16 horas, después de lo cual se interrumpió con H2O (50 ml) y se extrajo con DCM (3 * 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se evaporaron a sequedad para obtener un líquido de color amarillo pálido en bruto. El producto en bruto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con MeOH:DCM (producto eluido a MeOH al 4 %:DCM) para proporcionar el producto deseado en forma de un líquido de color amarillo pálido (1.4 g).
TLC: Fr = 0.4 (MeOH:DCM, 1:9), PMA activo.
Intermedio 126d: (1-hidroxitridecan-3-il) carbonato de 3-(dietilamino)propilo
Figure imgf000141_0001
A una solución del intermedio 126c (1.4 g, 2.87 mmol) en THF (10 ml) en un matraz de fondo redondo cargado con una barra de agitación magnética en atmósfera de N2 a 0 °C se le añadió HF-piridina (4.9 ml, 60 equiv.). La mezcla resultante se agitó durante 1 hora, después de lo cual se basificó lentamente con NaHCO3 saturado y se extrajo con EtOAc (2 * 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se evaporaron a sequedad para obtener el producto deseado en forma de un aceite de color amarillo pálido en bruto (1.0 g). Este compuesto se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
TLC: Fr = 0.4 (MeOH:DCM, 1:9), PMA activo.
Ejemplo 126:
(6,6-bis(octiloxi)hexanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)tridecilo
Figure imgf000141_0002
A una solución del intermedio 126d (1.00 g, 2.67 mmol) y el intermedio 16c (1.20 g, 3.21 mmol) en DMF (10 ml) en un MFR cargado con una barra de agitación magnética en atmósfera de N2 se le añadieron HATU (2.0 g, 5.35 mmol), DIPEA (1.4 ml, 8.034 mmol) y DMAP (165 mg, 1.33 mmol). La reacción se agitó a 30 °C en atmósfera de N2 durante 16 horas, después de lo cual se interrumpió con H2O (100 ml) y se extrajo con EtOAc (3 * 200 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2SO4 y se evaporaron a sequedad para obtener un líquido de color amarillo pálido en bruto. El producto en bruto se purificó por cromatografía sobre alúmina neutra eluyendo con EtOAc:hexano (producto eluido a EtOAc al 6 %:hexano) para proporcionar el producto deseado en forma de un líquido de color amarillo pálido (500 mg).
1H RMN (400 MHz, CD2Ch) 5 = 4,77 (quin, J=6,22 Hz, 1H), 4,41 (t, J = 5,62 Hz, 1H), 4,02 - 4,21 (m, 4H), 3,53 (dt, J = 9,22, 6,69 Hz, 2H), 3,37 (dt, J = 9,22, 6,69 Hz, 2H), 2,49 (s a., 6H), 2,28 (t, J = 7,52 Hz, 2H), 1,90 (c, J = 6,40 Hz, 2H), 1,78 (s a., 2H), 1,46 - 1,67 (m, 10H), 1,20 - 1,41 (m, 38H), 1,00 (t, J = 6,69 Hz, 6H), 0,88 (t, J = 6,57 Hz, 9H) ppm.
MS (M 1) = 729.2, Tr = 2.60 min (método 13 de LC).
Síntesis del Ejemplo 127:
Intermedio 127a: (6Z,9Z)-18-bromooctadeca-6,9-dieno
Figure imgf000141_0003
A una suspensión de dietil eterato de bromuro de magnesio (22.5 g, 87.1 mmol) en Et2O (250 ml) en un MFR cargado con una barra de agitación magnética en atmósfera de N2 se le añadió mesilato de linoleoílo (15 g, 43.5) lentamente. La reacción se agitó vigorosamente durante 40 min, después de lo cual se interrumpió con H2O enfriada con hielo (200 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo con Et2O (2 * 250 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se evaporaron a sequedad para proporcionar el producto deseado en forma de un aceite de color amarillo pálido en bruto (14.0 g, 98 %). Este material se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
TLC: Fr = 0.9 (EtOAc:hexano, 2:8), PMA activo.
Intermedio 127b: (6Z,9Z)-18-yodooctadeca-6,9-dieno
Figure imgf000142_0001
A una solución del intermedio 127a (14.0 g, 42.659 mmol) en acetona (150 ml) en un MFR cargado con una barra de agitación magnética en atmósfera de N2 se le añadió yoduro sódico (12.7 g, 85.3 mmol). La reacción se calentó a reflujo (55 °C) durante 2 horas, después de lo cual se enfrió a temperatura ambiente y los sólidos se retiraron por filtración. El disolvente se evaporó y los sólidos restantes se eliminaron por disolución en H2O (100 ml) y extracción con DCM (2 * 200 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se evaporaron a sequedad para proporcionar el producto deseado en forma de un líquido de color pardo pálido en bruto (15.5 g, 97 %). Este material se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
TLC: Fr = 0.6 (pentano al 100 %), PMA activo.
Intermedio 127c: (12Z,15Z)-1-((terc-butildimetilsilil)oxi)henicosa-12,15-dien-3-ol
Figure imgf000142_0002
A una solución del intermedio 127b (15.0 g, 39.8 mmol) en Et2O (80 ml) y pentano (20 ml) en un MFR cargado con una barra de agitación magnética en atmósfera de N2 se le añadió t-Butil litio (1.5 M, 53 ml, 79.7 mmol) a -78 °C. Después, se añadió el intermedio 1g (7.5 g, 39.8 mmol) en forma de una solución en 20 ml de Et2O. La reacción se agitó a -78 °C durante 10 minutos, después de lo cual se interrumpió con una solución saturada de NH4Cl (100 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo con Et2O (150 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se evaporaron a sequedad para obtener un líquido viscoso incoloro en bruto. El producto en bruto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con EtOAc:hexano (producto eluido a EtOAc al 4 %:hexano) para proporcionar el producto deseado en forma de un líquido viscoso incoloro (6.0 g).
TLC: Fr = 0.5 (EtOAc: Hexano, 1:9), PMA activo.
Intermedio 127d: (4-nitrofenil) carbonato de (12Z,15Z)-1-((terc-butildimetilsilil)oxi)henicosa-12,15-dien-3-ilo
Figure imgf000142_0003
A una solución del intermedio 127c (1.5 g, 3.41 mmol) en DCM (30 ml) en un MFR cargado con una barra de agitación magnética en atmósfera de N2 se le añadió piridina (0.9 ml, 10.251 mmol) seguido de cloroformiato de 4-nitrofenilo (1.0 g, 5.12 mmol) y DMAP (1.2 g, 10.2 mmol) a 0 °C. La reacción se agitó durante 2 horas a 30 °C, después de lo cual se interrumpió con H2O (50 ml) y se extrajo con EtOAc (3 * 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se evaporaron a sequedad para obtener un líquido de color amarillo pálido en bruto. El producto en bruto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con EtOAc:hexano (producto eluido a EtOAc al 2 %:hexano) para proporcionar el producto deseado en forma de un líquido de color amarillo pálido (1.6 g).
TLC: Fr = 0.9 (EtOAc: Hexano, 0,5:9,5), PMA activo.
Intermedio 127e: (3-(dietilamino)propil) carbonato de (12Z,15Z)-1-((terc-butildimetilsilil)oxi)henicosa-12,15-dien-3-ilo
Figure imgf000143_0001
A una solución del intermedio 127d (1.6 g, 2.65 mmol) en DCM (15 ml) en un MFR cargado con una barra de agitación magnética en atmósfera de N2 se le añadió piridina (0.5 ml, 5.30 mmol) seguido de 3-(dietilamino)propan-1-ol (0.8 ml, 5.30 mmol) y DMAP (650 mg, 5.30 mmol). La reacción se agitó a 30 °C durante 16 horas, después de lo cual se interrumpió con H2O (50 ml) y se extrajo con DCM (3 * 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se evaporaron a sequedad para obtener un líquido de color amarillo pálido en bruto. El producto en bruto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con MeOH:DCM (producto eluido a MeOH al 4 %:DCM) para proporcionar el producto deseado en forma de un líquido de color amarillo pálido (1.1 g).
TLC: Fr = 0.97 (MeOH:DCM, 1:9), PMA activo.
Intermedio 127f: ((12Z,15Z)-1-hidroxihenicosa-12,15-dien-3-il) carbonato de 3-(dietilamino)propilo
Figure imgf000143_0002
A una solución del intermedio 127e (1.1 g, 2.01 mmol) en THF (10 ml) en un matraz de fondo redondo cargado con una barra de agitación magnética en atmósfera de N2 a 0 °C se le añadió HF-piridina (3.5 ml, 60 equiv.). La mezcla resultante se agitó a 0 °C durante 1 hora, después de lo cual se basificó lentamente con NaHCO3 saturado y se extrajo con EtOAc (2 * 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se evaporaron a sequedad para proporcionar el producto deseado en forma de un aceite de color amarillo pálido en bruto (900 mg). Este compuesto se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. TLC: Fr = 0.4 (MeOH:DCM, 1:9), PMA activo.
Ejemplo 127:
6,6-bis(octiloxi)hexanoato de (12Z,15Z)-3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)henicosa-12,15-dien-1-ilo
Figure imgf000143_0003
A una solución del intermedio 127f (900 mg, 1.86 mmol) y el intermedio 16c (1.4 g, 3.738 mmol) en DMF (10 ml) en un MFR cargado con una barra de agitación magnética en atmósfera de N2 se le añadieron HATU (1.4 g, 3.73 mmol), DIPEA (1.0 ml, 5.607 mmol) y DMAP (115 mg, 0.93 mmol). La reacción se agitó a 30 °C en atmósfera de N2 durante 16 horas, después de lo cual se interrumpió con H2O (100 ml) y se extrajo con EtOAc (3 * 200 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2SO4 y se evaporaron a sequedad para proporcionar un líquido de color amarillo pálido en bruto. El producto en bruto se purificó por cromatografía sobre alúmina neutra eluyendo con EtOAc:hexano (producto eluido a EtOAc al 7 %:hexano) para proporcionar el producto deseado en forma de un líquido de color amarillo pálido (550 mg).1
1H RMN (400 MHz, CD2Ch) 5 = 5,25 - 5,45 (m, 4H), 4,77 (quin, J = 6,24 Hz, 1H), 4,41 (t, J = 5,62 Hz, 1H), 4,04 - 4,19 (m, 4H), 3,53 (dt, J = 9,29, 6,66 Hz, 2H), 3,37 (dt, J = 9,29, 6,66 Hz, 2H), 2,78 (t, J = 6,54 Hz, 2H), 2,50 (s a., 6H), 2,29 (t, J = 7,58 Hz, 2H), 2,05 (c, J = 6,81 Hz, 4H), 1,90 (c, J = 6,44 Hz, 2H), 1,77 (s a., 2H), 1,45 - 1,67 (m, 10H), 1,21 - 1,41 (m, 40H), 1,01 (s a., 6H), 0,83 - 0,95 (m, 9H) ppm.
MS (M 1) = 837.3, Tr = 1.20 min (método 14 de LC).
* Síntesis del Ejemplo 128:
Intermedio 128a: 6-(benciloxi)-1-((terc-butildimetilsilil)oxi)hexan-3-ol
Figure imgf000144_0001
A una solución del magnesio (1.76 g, 73.6 mmol) e I2 (100 mg, cantidad catalítica) en THF (50 ml) en un MFR (equipado con un condensador de reflujo) cargado con una barra de agitación magnética en atmósfera de N2 se le añadió
bencil 3-bromopropil éter (14.0 g, 61.4 mmol) en THF (40 ml). La reacción se agitó durante 1 hora, después de lo cual se añadió al intermedio 1g (13.85 g, 73.6 mmol) en THF (60 ml) a 0 °C. La reacción se dejó calentar a 25 °C durante 1 hora y se agitó a es temperatura durante 17 horas, después de lo cual se interrumpió con NH4O saturado (150 ml) y se extrajo con EtOAc (2 * 250 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron a presión
reducida para obtener un líquido de color pardo en bruto. El producto en bruto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con EtOAc:hexano (producto eluido a EtOAc al 15 %:hexano) para proporcionar el producto deseado en forma de un líquido de color amarillo pálido (2.3 g).
TLC: Fr = 0.2 (EtOAc: Hexano, 2:8), PMA activo.
Intermedio 128b: (4-nitrofenil) carbonato de 6-(benciloxi)-1-((terc-butildimetilsilil)oxi)hexan-3-ilo
Figure imgf000144_0002
A una solución del intermedio 128a (2.0 g, 5.91 mmol) en DCM (40 ml) en un MFR cargado con una barra de agitación magnética en atmósfera de N2 se le añadió cloroformiato de 4-nitrofenilo (1.78 g, 8 . 86 mmol) seguido de piridina (1.45 ml, 17.7 mmol) a 0 °C. La reacción se agitó durante 18 horas, después de lo cual se diluyó con H2O (100 ml) y se extrajo con DCM (2 * 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron a presión reducida para obtener un sólido gomoso en bruto. El producto en bruto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con EtOAc:hexano (producto eluido a EtOAc al 5 %:hexano) para proporcionar el producto deseado en forma de un líquido de color pardo en bruto (400 mg).
TLC: Fr = 0.6 (EtOAc: Hexano, 1:9), UV y PMA activo.
Intermedio 128c: (3-(dietilamino)propil) carbonato de 6-(benciloxi)-1-((terc-butildimetilsilil)oxi)hexan-3-ilo
Figure imgf000144_0003
A una solución del intermedio 128b (1.9 g, 3.77 mmol) en DCM (40 ml) en un MFR cargado con una barra de agitación magnética en atmósfera de N2 se le añadieron 3-(dietilamino)propan-1-ol (2.81 ml, 18.8 mmol) seguido de Et3N (5.27 ml, 37.7 mmol) y DMAP (922 mg, 7.55 mmol). La reacción se agitó a ta durante 3 días, después de lo cual se diluyó con H2O (200 ml) y se extrajo con DCM (2 * 200 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (250 ml), se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron a presión reducida para obtener un líquido de color verde pálido en bruto. El producto en bruto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con MeOH:DCM (producto eluido a MeOH al 3 %:DCM) para proporcionar el producto deseado en forma de un líquido de color verde pálido (550 mg).
TLC: Fr = 0.6 (MeOH:DCM, 1:9), PMA activo.
Intermedio 128d: (3-(dietilamino)propil) carbonato de 6-(benciloxi)-1-hidroxihexan-3-ilo
Figure imgf000144_0004
A una solución del intermedio 128c (550 mg, 1.11 mmol) en THF (20 ml) en un matraz de fondo redondo cargado con una barra de agitación magnética en atmósfera de N2 a 0 °C se le añadió HF-piridina (30-70 %, 2.0 ml). La mezcla resultante se agitó a 0 °C durante 1 hora, después de lo cual se diluyó con H2O (30 ml), se neutralizó con NaHCO3 sólido y se extrajo con DCM (2 * 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron a presión reducida para proporcionar el producto deseado en forma de un líquido de color verde pálido en bruto (400 mg).
TLC: Fr = 0.4 (MeOH:DCM, 1:9), I2 y PMA activo.
Intermedio 128e: 6,6-bis(octiloxi)hexanoato de 6-(benciloxi)-3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexilo
Figure imgf000145_0001
A una solución del intermedio 128d (400 mg, 1.04 mmol) en DMF (15 ml) en un MFR cargado con una barra de agitación magnética en atmósfera de N2 se le añadieron secuencialmente el intermedio 16c (585 mg, 1.57 mmol), HATU (797 mg, 2.09 mmol), DIPEA (0.55 ml, 3.147 mmol) y DMAP (128 mg, 1.04 mmol). La reacción se agitó a ta durante 18 horas, después de lo cual se diluyó con H2O (100 ml) y se extrajo con EtOAc (2 * 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron a presión reducida para proporcionar un líquido de color verde pálido en bruto. El producto en bruto se purificó por cromatografía sobre alúmina neutra eluyendo con EtOAc:hexano (producto eluido a EtOAc al 15 %:hexano) para proporcionar el producto deseado en forma de un líquido de color verde pálido (550 mg).
TLC: Fr = 0.6 (MeOH:DCM, 1:9), PMA activo.
Intermedio 128f: 6,6-bis(octiloxi)hexanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)-6-hidroxihexilo
Figure imgf000145_0002
Se añadió Ni Raney (20 mg, cat.) a una solución del intermedio 128e (60 mg, 0.081 mmol) en EtOH (5 ml) en un MFR cargado con una barra de agitación magnética. La mezcla resultante se agitó a presión atmosférica de H2 (usando un globo de hidrógeno) durante 24 horas a ta, después de lo cual se filtró sobre un lecho de celite y se concentró a presión reducida para obtener el producto deseado en forma de un líquido incoloro (40 mg, 76 %). Este compuesto se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
TLC: Fr = 0.4 (MeOH:DCM, 1:9), PMA activo.
* Ejemplo 128:
octanoato de 6-((6,6-bis(octiloxi)hexanoil)oxi)-4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexilo
Figure imgf000145_0003
A una solución del intermedio 128f (440 mg, 0.681 mmol) en DMF (15 ml) en un MFR cargado con una barra de agitación magnética en atmósfera de N2 se le añadieron secuencialmente ácido octanoico (0.22 ml, 1.36 mmol), HATU (777 mg, 2.04 mmol), DIPEA (0.59 ml, 3.40 mmol) y DMAP (83 mg, 0.68 mmol). La reacción se agitó a ta durante 18 horas, después de lo cual se diluyó con H2O (100 ml) y se extrajo con EtOAc (2 * 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron a presión reducida para proporcionar un líquido de color verde pálido en bruto. El producto en bruto se purificó por cromatografía sobre alúmina neutra eluyendo con EtOAc:hexano (producto eluido a EtOAc al 15 %:hexano) para proporcionar el producto deseado en forma de un líquido incoloro (400 mg).
1H RMN (400 MHz, CDCla): ) 5 = 4,82 (m, 1H), 4,33 (m, 1H), 4,20-4,08 (m, 5H), 3,48 (m, 2H), 3,40 (m, 2H), 2,52 (m, 5H), 2,30 (c, J = 8 Hz, 4H), 1,92 (m, 2H), 1,82 (c, J = 8 Hz, 2H), 1,78-1,50 (m, 11H), 1,39-1,22 (m, 35H), 1,02 (t, J = 8 Hz, 6H), 0,92-0,82 (m, 9H) ppm.
MS (M 1) = 773.1, Tr = 2.41 min (método 13 de LC).
* Síntesis del Ejemplo 129:
Intermedio 129a: 1-((terc-butildimetilsilil)oxi)heptadecan-5-ol
Figure imgf000146_0001
A una solución agitada de 5-((terc-butildimetilsilil)oxi)pentanal (6.00 g, 31.2 mmol) en una atmósfera de nitrógeno a 0 °C se le añadió bromuro de dodecil magnesio 1 M (37 ml, 37 mmol) en éter dietílico seco (40 ml). La reacción se agitó durante 2 h a la misma temperatura. El progreso de la reacción se controló por TLC. La mezcla de reacción se inactivó lentamente con 100 ml de una solución saturada de cloruro de amonio a 0 °C y se extrajo con (2 * 250 ml) de acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se lavaron de nuevo con 250 ml de cloruro de amonio saturado, se secaron sobre sulfato sódico y se evaporaron a sequedad para obtener un líquido incoloro en forma bruta. El producto en bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida eluyendo con EtOAc al 5 % en hexanos para proporcionar 5 g de un aceite incoloro.
TLC: Fr = 0.5 (EtOAc: hexanos, 2:8); PMA activo.
Intermedio 129b: (4-nitrofenil) carbonato de 1-((terc-butildimetilsilil)oxi)heptadecan-5-ilo
Figure imgf000146_0002
A una solución del intermedio 129a (2.50 g, 6.47 mmol) en DCM (15 ml) se le añadieron piridina (2 ml, 25.9 mmol) y DMAP (10 mg) seguido de la adición lenta de cloroformiato de 4-nitrofenilo (2 . 6 g, 12.9 mmol) a 0 °C y la reacción se agitó a 30 °C durante 3 h. La mezcla de reacción se inactivó con 50 ml de agua y se extrajo con DCM (3 x 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato sódico y se evaporaron a sequedad para proporcionar un líquido de color amarillo pálido en forma bruta. La mezcla en bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida eluyendo con EtOAc al 5 % en hexanos para proporcionar 3.0 g del producto deseado en forma de un aceite de color amarillo.
TLC: Fr = 0.8 (EtOAc:hexanos, 2:8); PMA activo.
Intermedio 129c: (3-(dietilamino)propil) carbonato de 1-((terc-butildimetilsilil)oxi)heptadecan-5-ilo
Figure imgf000146_0003
A una solución del intermedio 129b (3.0 g, 5.44 mmol) en DCM (6 ml) se le añadieron piridina (1.7 ml, 21.76 mmol) y DMAP (332 mg, 2.72 mmol) seguido de la adición lenta de 3-(dietilamino)propan-1-ol (1.6 ml, 10.9 mmol) y la reacción se agitó a 30 °C durante 16 h. La mezcla de reacción se inactivó con 50 ml de agua y se extrajo con DCM (3 x 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato sódico y se evaporaron a sequedad para proporcionar un líquido de color amarillo pálido en forma bruta. La mezcla en bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida eluyendo con MeOH al 4 % en DCM para proporcionar 2.5 g del producto deseado en forma de un aceite de color amarillo.
TLC: Fr = 0.6 (MeOH:DCM, 1:9); PMA activo.
Intermedio 129d: (1-hidroxiheptadecan-5-il) carbonato de 3-(dietilamino)propilo
Figure imgf000147_0001
A una solución del intermedio 129c (500 mg, 0.92 mmol) en THF (5 ml) se le añadió complejo de HFPiridina (70 %, 1.6 ml, 55.2 mmol) a 0 °C y la reacción se agitó durante 1 h. La mezcla de reacción se basificó lentamente con bicarbonato sódico saturado y se extrajo con (2 x 50 ml) de EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato sódico y se evaporaron a sequedad para proporcionar 400 mg del producto deseado en forma de un aceite de color amarillo pálido.
TLC: Fr = 0.4 (MeOH:DCM, 1:9); PMA activo.
Intermedio 129e: (1-oxoheptadecan-5-il) carbonato de 3-(dietilamino)propilo
Figure imgf000147_0002
A una solución del intermedio 129d (400 mg, 0.931 mmol) y trietil amina (1.2 ml, 8.37 mmol) en DCM (4.6 ml) se le añadió complejo de trióxido de azufre y piridina (666 mg, 4.18 mmol) disuelto en DMSO (5.5 ml) a 0 °C. La reacción se dejó en agitación durante 15 h a 30 °C. La mezcla de reacción se inactivó lentamente con 50 ml de agua y se extrajo con (3 x 50 ml) de EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato sódico y se evaporaron a sequedad para proporcionar un líquido de color amarillo pálido, 400 mg, en forma bruta. El material se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
TLC: Fr = 0.5 (MeOH:DCM, 1:9); PMA activo.
Intermedio 129f: ácido 5-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)heptadecanoico
Figure imgf000147_0003
A una solución agitada del intermedio 129e (400 mg, 0.93 mmol) en t-Butanol (5 ml) y tampón ac. (pH 4.5, NaHPO4:NaH2PO4:H3PO4, 1:1:1, 5 ml) se le añadió 2-metil 2-buteno (1.0 ml, 9.3 mmol) seguido de la adición de clorito sódico (170 mg, 1.87 mmol) disuelto en 1.6 ml de agua. La solución espesa brumosa se agitó a 30 °C durante 20 h. La mezcla de reacción se inactivó con 50 ml de agua y se extrajo con (3 x 50 ml) de EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato sódico y se evaporaron a sequedad para proporcionar un líquido de color amarillo pálido, 450 mg, en forma bruta.
TLC: Fr = 0.4 (MeOH:DCM, 1:9); PMA activo.
Intermedio 129g: ((4,4-dimetoxibutoxi)metil)benceno
Figure imgf000147_0004
A la mezcla de 4-(benciloxi)butanal (16.4 g, 92.13 mmol) y ortoformiato de trimetilo (50 ml) en metanol (100 ml) se le añadió ácido sulfúrico (200 mg) y la reacción se calentó a 80 °C durante 16 h en una atmósfera de nitrógeno. El disolvente se evaporó al vacío para dar un líquido espeso en bruto que se purificó por cromatografía eluyendo con at EtOAc al 10 % en hexanos para proporcionar 12 g de un aceite incoloro.
TLC: Fr = 0.6 (EtOAc: hexanos, 2:8); PMA activo.
Intermedio 129h: ((4,4-bis(octiloxi)butoxi)metil)benceno
Figure imgf000148_0001
A una mezcla del intermedio 129g (12.0 g, 53.53 mmol) y 1-octanol (28.0 g, 214.15 mmol) en benceno (50 ml) se le añadió KHSO4 (1 g). La reacción se calentó a 70 °C durante 4 h en una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se dejó enfriar a temperatura ambiente y se purificó directamente por cromatografía en columna ultrarrápida, eluyendo con EtOAc al 4 % en hexanos para dar 7.5 g del producto deseado.
TLC: Fr = 0.9 (EtOAc:hexanos, 2:8); PMA activo.
Intermedio 129i: 4,4-bis(octiloxi)butan-1-ol
Figure imgf000148_0002
A una solución del intermedio 129h (3.0 g, 7.13 mmol) en EtOH (50 ml) se le añadió Níquel Raney (6.0 g) y la reacción se agitó a presión de globo de hidrógeno durante 7 días a 30 °C. La mezcla de reacción se filtró a través de un lecho de celite y el disolvente se evaporó a sequedad para dar 2 g de un aceite incoloro.
TLC: Fr = 0.5 (EtOAc: hexanos, 2:8); PMA activo.
El siguiente ejemplo puede prepararse usando secuencias y métodos similares a los empleados para la síntesis del Ejemplo 11.
* Ejemplo 129:
5-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)heptadecanoato de 4,4-bis(octiloxi)butilo
Figure imgf000148_0003
1H RMN (400 MHz, CD2Ch) 5 = 4,67 (quin, J = 5,70 Hz, 1 H), 4,45 (m, 1H), 4,14 (td, J = 6,48, 1,71 Hz, 2H), 3,99 - 4,07 (m, 2H), 3,54 (m, 2H), 3,38 (m, 2H), 2,55 (m, 4H), 2,26 - 2,35 (m, 2H), 1,83 (d, J = 6,48 Hz, 2H), 1,47 - 1,72 (m, 14H), 1,21 - 1,38 (m, 42H), 1,03 (t, J = 7,03 Hz, 6H), 0,82 - 0,93 (m, 9H) ppm.
MS (M 1) = 757.2, Tr = 2.73 min (método 13 de LC).
* Síntesis del Ejemplo 130:
Los siguientes intermedios puede prepararse usando secuencias y métodos similares a los empleados para la síntesis del ejemplo 129.
Intermedio 130a: 1-((terc-butildimetilsilil)oxi)pentadecan-3-ol
Figure imgf000148_0004
TLC: Fr = 0.6 (EtOAc:hexanos, 1:9); PMA activo.
Intermedio 130b: (4-nitrofenil)carbonato de 1-((terc-butildimetilsilil)oxi)pentadecan-3-ilo
Figure imgf000149_0001
TLC: Fr = 0.9 (EtOAc: hexanos, 0,5:9,5); PMA activo.
Intermedio 130c: (3-(dietilamino)propil)carbonato de 1-((terc-butildimetilsilil)oxi)pentadecan-3-ilo
Figure imgf000149_0002
TLC: Fr = 0.5 (MeOH:DCM, 1:9); PMA activo.
Intermedio 130d: (1-hidroxipentadecan-3-il)carbonato de 3-(dietilamino)propilo
Figure imgf000149_0003
TLC: Fr = 0.4 (MeOH:DCM, 1:9); PMA activo.
El siguiente ejemplo puede prepararse usando secuencias y métodos similares a los empleados para la síntesis del Ejemplo 11.
* Ejemplo 130:
(3-(dietilamino)propil)pentadecano-1,3-diílo dicarbonato de 4,4-bis(octiloxi)butilo
Figure imgf000149_0004
1H RMN (400 MHz, CD2Ch) 5 = 4,74 - 4,81 (m, 1H), 4,44 (t, J = 5,38 Hz, 1H), 4,06 - 4,21 (m, 6H), 3,54 (dt, J = 9,29, 6,66 Hz, 2H), 3,38 (dt, J = 9,29, 6,66 Hz, 2H), 2,51 (c, J = 6,81 Hz, 6H), 1,89 - 1,97 (m, 2H), 1,75 - 1,82 (m, 2H), 1,68 - 1,74 (m, 2H), 1,49 - 1,66 (m, 8H), 1,22 - 1,37 (m, 40H), 1,00 (t, J = 7,09 Hz, 6H), 0,85 - 0,93 (m, 9H) ppm.
MS (M 1) = 759.2, Tr = 2.62 min (método 13 de LC).
* Síntesis del Ejemplo 131:
Intermedio 131a: 4-((terc-butildimetilsilil)oxi)butanal
4-((terc-Butildimetilsilil)oxi)butan-1-ol y TEA (10.2 ml, 73.4 mmol) se recogieron en DCM (100 ml). Se añadió una solución de complejo de trióxido de azufre y piridina (5.84 g, 36.7 mmol) en DMSO (20.8 ml, 294 mmol) gota a gota a la solución de alcohol y amina en un baño de hielo. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 h. La mezcla en bruto se repartió entre agua y acetato de etilo. La capa orgánica se recogió, se secó, se concentró y se purificó sobre gel de sílice con acetato de etilo al 10 %/hexano para proporcionar 4.5 g del producto deseado en forma de un aceite incoloro.
TLC: Fr = 0.7, Heptano:EtOAc = 1:1
Intermedio 131b: 1-((terc-butildimetilsilil)oxi)hexadecan-4-ol
Figure imgf000150_0001
El Intermedio 131a (4.50 g, 22.2 mmol) se disolvió en 100 ml de THF anhidro y se enfrió a -41 °C. A la solución se le añadió bromuro de dodecilmagnesio 1 M en THF (33.4 ml, 33.4 mmol). La mezcla resultante se agitó a -41 °C durante una hora y después se calentó a temperatura ambiente durante una hora. Se añadió una solución sat. de NH4Cl para interrumpir la reacción. La mezcla de reacción se extrajo con EtOAc (2 x 100 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó por gel de sílice cromatografía en columna ultrarrápida con EtOAc al 0-50 %/Heptano para proporcionar 6.65 g del producto deseado en forma de un aceite incoloro.
1H RMN (400 MHz, CD2Ch) 5 = 3,56 - 3,61 (m, 2H), 3,45 - 3,53 (m, 1H), 1,89 - 1,98 (m, 1H), 1,48 - 1,59 (m, 3H), 1,30 -1,39 (m, 3H), 1,15 - 1,27 (m, 20H), 0,79 - 0,89 (m, 12H), -0,01 (s, 6H) ppm.
Intermedio 131 c: 5-dodecil-2,2,10,10,11,11 -hexametil-3,3-difenil-4,9-dioxa-3,10-disiladodecano.
Figure imgf000150_0002
Al intermedio 131b (1.5 g, 4.02 mmol) en DCM anhidro (15 ml) se le añadió imidazol (0.411 g, 6.04 mmol), seguido de la adición de terc-butildifenilclorosilano (1.24 ml, 4.83 mmol). Después, la reacción se agitó en presencia de nitrógeno durante 5 h. La reacción se diluyó con 30 ml de DCM y se lavó con 50 ml de agua. La capa orgánica separada se secó sobre sulfato sódico, se concentró y se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (EtOAc al 0-25 % en heptano) para proporcionar 2.4 g del producto deseado en forma de un aceite incoloro.
1H RMN (400 MHz, CDCls) 5 = 7,61 - 7,71 (m, 4H), 7,30 - 7,45 (m, 6H), 3,66 - 3,77 (m, 1H), 3,37 - 3,49 (m, 2H), 1,38 -1,52 (m, 5H), 1,09 - 1,34 (m, 21H), 1,04 (s, 9H), 0,80 - 0,90 (m, 12H), 0,00 (s, 6H) ppm.
Intermedio 131 d: 4-((terc-butildifenilsilil)oxi)hexadecan-1-ol
Figure imgf000150_0003
Al intermedio 131c (2.4 g, 3.93 mmol) en EtOH anhidro (15 ml) se le añadió ácido 10-canforsulfónico (0.411 g, 1.76 mmol). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. El análisis por TLC indicó que la reacción se había completado. La mezcla se diluyó con 100 ml de DCM y se lavó con 50 ml de NaHCO3 sat. La capa ac. separada se extrajo con 50 ml más de DCM. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato sódico, se concentraron y se purificaron por cromatografía en columna ultrarrápida (eluyendo con EtOAc al 0-50 % en heptano) para proporcionar 1.4 g del producto deseado en forma de un aceite incoloro.1
1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 =7,52 - 7,64 (m, 4H), 7,23 - 7,36 (m, 6H), 3,60 - 3,72 (m, 1H), 3,34 - 3,45 (m, 2H), 1,27 - 1,50 (m, 7H), 0,92 - 1,23 (m, 20H), 0,90 - 1,00 (m, 9H), 0,80 (t, J = 1,00 Hz, 3H) ppm.
In te rm e d io 131 e : d io c ta n o a to d e 2 -(5 -( (4 -( ( te rc -b u t i ld i fe n i ls il i l) o x i)h e x a d e c il)o x i) -5 -o x o p e n t i l) p ro p a n o -1 ,3 -d ií lo
Figure imgf000151_0001
En un vial, el intermedio 1f (1.20 g, 2.82 mmol), el intermedio 131d (1.4 g, 2.82 mmol), DIPEA (0.984 ml, 5.64 mmol) y DMAP (0.069 g, 0.564 mmol) se recogieron en diclorometano anhidro (10 ml). Se añadió EDc Hc I (1.08 g, 5.64 mmol) en una porción y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche. La reacción después se diluyó con agua (10 ml). La capa orgánica se separó, y la capa acuosa se extrajo con DCM (10 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron, se concentraron y se purificaron por cromatografía en columna ultrarrápida (eluyendo con EtOAc al 0-25 %:heptano) para proporcionar 2.06 g del producto deseado en forma de un aceite incoloro.
1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 = 7,64 - 7,76 (m, 4H), 7,32 - 7,47 (m, 6H), 4,01 - 4,12 (m, 4H), 3,94 (t, J = 6,66 Hz, 2H), 3,71 - 3,80 (m, 1H), 2,23 - 2,37 (m, 6H), 1,94 - 2,06 (m, 1H), 1,58 - 1,70 (m, 6H), 1,11 - 1,49 (m, 46H), 1,07 (s, 9H), 0,90 (td, J = 6,88, 1,77 Hz, 9H) ppm.
Intermedio 131f: dioctanoato de 2-(5-((4-hidroxihexadecil)oxi)-5-oxopentil)propano-1,3-diílo
Figure imgf000151_0002
Al intermedio 131e (2.06 g, 2.27 mmol) en un MFR de 100 ml se le añadió TBAF 1 M en THF (11.35 ml, 11.35 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente en presencia de nitrógeno durante una noche. La mezcla en bruto se diluyó con 40 ml de DCM y se lavó con 40 ml de NaHcOa sat. La capa ac. se extrajo con 40 ml más de DCM. Las capas orgánicas se combinaron y se secaron sobre sulfato sódico, se concentraron y se purificaron por cromatografía en columna ultrarrápida (eluyendo con EtOAc al 0-100 % en heptano) para proporcionar 800 mg del producto deseado en forma de un aceite incoloro.
1H RMN (400 MHz, CD2CI2) 5 = 3,99 - 4,14 (m, 6H), 3,62 (d, J = 5,01 Hz, 1H), 2,25 - 2,38 (m, 6H), 1,94 - 2,05 (m, 1H), 1,23 - 1,86 (m, 53H), 0,85 - 0,98 (m, 9H) ppm.
* Ejemplo 131:
dioctanoato de 2-(5-((4-((1,4-dimetilpiperidin-4-carbonil)oxi)hexadecil)oxi)-5-oxopentil)propano-1,3-diílo
Figure imgf000151_0003
El intermedio 131f (70 mg, 0.105 mmol), sal HCl del ácido 1,4-dimetilpiperidin-4-carboxílico (81 mg, 0.419 mmol), DIPEA (0.110 ml, 0.628 mmol) y DMAP (10.2 mg, 0.084 mmol) se recogieron en diclorometano anhidro (2 ml). Se añadió Ed CHCI (80 mg, 0.419 mmol) en una porción y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche. La reacción en bruto se concentró a presión reducida y se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (eluyendo con EtOAc al 0­ 100 % en heptano) para proporcionar 6 2 mg del producto deseado en forma de un aceite incoloro.1
1H RMN (400 MHz, CD2CI2) 5 = 4,83 - 4,93 (m, 1H), 3,96 - 4,07 (m, 6H), 2,48 - 2,58 (m, 2H), 2,28 (t, J = 7,58 Hz, 6H), 2,18 (s, 3H), 2,02 - 2,11 (m, 4H), 1,94 - 2,01 (m, 1H), 1,20 - 1,68 (m, 54H), 1,16 (s, 3H), 0,82 - 0,92 (m, 9H) ppm.
MS (M 1) = 809.2, Tr = 2.52 min (método 13 de LC).
El siguiente ejemplo puede prepararse usando secuencias y métodos similares a los empleados para la síntesis del ejemplo 131.
* Ejemplo 132:
dioctanoato de 2-(5-((4-((1,3-dimetilpirrolidin-3-carbonil)oxi)hexadecil)oxi)-5-oxopentil)propano-1,3-diílo
Figure imgf000152_0002
El intermedio 133a pueden prepararse usando métodos similares a los empleados para la síntesis del ejemplo 131. 1H RMN (400 MHz, CD2Ch) 5 = 4,83 - 4,94 (m, 1H), 4,22 (dd, J = 8,74, 2,87 Hz, 1H), 3,89 - 4,11 (m, 6H), 3,32 - 3,54 (m, 2H), 2,28 (t, J = 7,52 Hz, 6H), 2,12 - 2,23 (m, 1H), 1,81 - 2,02 (m, 4H), 1,51 - 1,69 (m, 10H), 1,19 - 1,48 (m, 51H), 0,88 (t, J = 6,11 Hz, 9 H) ppm.
* Ejemplo 133:
dioctanoato de 2-(5-oxo-5-((4-(((S)-pirrolidin-2-carbonil)oxi)hexadecil)oxi)pentil)propano-1,3-diílo
Figure imgf000152_0001
Se añadió HCI 4 M en dioxano (1030 pl, 4.16 mmol) al intermedio 133a (120 mg, 0.139 mmol) en un vial. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla en bruto se concentró a presión reducida y se disolvió de nuevo en 5 ml de DCM. Después, la capa orgánica se lavó con 5 ml de una solución 2.0 N de Na2CO3, se secó sobre sulfato sódico, se concentró y se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (eluyendo con EtOAc al 0-100 % en heptano) para proporcionar 48 mg del producto deseado.1
1H RMN (400 MHz, CD2Ch) 5 = 4,85 - 4,96 (m, 1H), 4,02 (t, J = 6,17 Hz, 6H), 3,66 - 3,76 (m, 1H), 3,00 - 3,10 (m, 1H), 2,82 - 2,94 (m, 1H), 2,28 (t, J = 7,58 Hz, 6H), 2,05 - 2,17 (m, 1H), 1,91 - 2,04 (m, 1H), 1,67 - 1,86 (m, 3H), 1,50 - 1,66 (m, 11H), 1,20 - 1,43 (m, 42H), 0,81 - 0,92 (m, 9H) ppm.
MS (M 1) = 766, Tr = 2.23 min (método 13 de LC).
* Síntesis del Ejemplo 134:
In te rm e d io 134 a : d io c ta n o a to d e 2 -(5 -( (4 -( ( (4 -n it ro fe n o x i) c a rb o n il)o x i)h e x a d e c i l)o x i) -5 -o x o p e n t i l) p ro p a n o -1 ,3 -d ií lo
Figure imgf000153_0001
El intermedio 131f (372 mg, 0.556 mmol) se recogió en DCM en un vial cargado con una barra de agitación magnética. Se añadió carbonocloridato de 4-nitrofenilo (134 mg, 0.667 mmol) en una porción. La reacción se tapó y se puso en una atmósfera de nitrógeno, después de lo cual se añadió piridina gota a gota mediante una jeringa. La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante una noche. La reacción después se diluyó con agua (10 ml) y DCM (10 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se lavó con DCM (10 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (10 ml), se secaron con Na2SO4, se filtraron y se concentraron al vacío. El residuo en bruto se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (eluyendo con EtOAc al 0-25 % en heptano) para proporcionar 420 mg del producto deseado en forma de un aceite incoloro.
1H RMN (400 MHz, CD2Ch) 5 = 8,23 - 8,31 (m, 2H), 7,34 - 7,44 (m, 2H), 4,81 - 4,90 (m, 1H), 3,94 - 4,13 (m, 6H), 2,22 -2,35 (m, 6H), 1,92 - 2,04 (m, 1H), 1,54 - 1,78 (m, 12H), 1,20 - 1,44 (m, 40H), 0,88 (t, J = 7,00 Hz, 9H) ppm.
* Ejemplo 134:
dioctanoato de 2-(5-((4-(((((S)-1-metilpirrolidin-3-il)oxi)carbonil)oxi)hexadecil)oxi)-5-oxopentil)propano-1,3-diílo
Figure imgf000153_0002
Se añadió gota a gota (S)-1 -metilpirrolidin-3-ol (34.0 mg, 0.336 mmol) en una pequeña cantidad de ACN anhidro al intermedio 134a (70 mg, 0.084 mmol) en ACN anhidro (3 ml) en un vial cargado con una barra de agitación magnética en atmósfera de N2. Después, se añadió piridina mediante una jeringa, seguido de la adición de DMAP (disuelto en un volumen mínimo de MeCN) en una porción. La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 3 días. La mezcla en bruto después se diluyó con 10 ml de agua y se extrajo con DCM (2 x 10 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con 10 ml de agua, se secaron sobre sulfato sódico y se purificaron por cromatografía en columna ultrarrápida (eluyendo con EtOAc al 0-100 % en heptano) para proporcionar 40 mg del producto deseado en forma de un aceite transparente.
1H RMN (400 MHz, CD2O 2) 5 = 5,08 - 5,17 (m, 1H), 4,68 - 4,79 (m, 1H), 3,99 - 4,13 (m, 6H), 2,70 - 2,95 (m, 3H), 2,40 -2,54 (m, 3H), 2,27 - 2,38 (m, 6H), 1,90 - 2,08 (m, 2H), 1,52 - 1,78 (m, 12H), 1,21 - 1,46 (m, 42H), 0,92 (t, J = 7,60 Hz, 9H) ppm.
MS (M 1) = 797, Tr = 2.48 min (método 13 de LC).
Los siguientes ejemplos puede prepararse usando secuencias y métodos similares a los empleados para la síntesis del Ejemplo 134.
* Ejemplo 135:
dioctanoato de 2-(5-((4-(((((R)-1-metilpirrolidin-3-il)oxi)carbonil)oxi)hexadecil)oxi)-5-oxopentil)propano-1,3-diílo 1H RMN (400 MHz, CD2CI2) 5 = 5,08 - 5,17 (m, 1H), 4,68 - 4,79 (m, 1H), 3,99 - 4,13 (m, 6H), 2,70 - 2,95 (m, 3H), 2,40 -2,54 (m, 3H), 2,27 - 2,38 (m, 6H), 1,90 - 2,08 (m, 2H), 1,52 - 1,78 (m, 12H), 1,21 - 1,46 (m, 42H), 0,92 (t, J = 7,60 Hz, 9H) ppm.
MS (M 1) = 797, Tr = 2.41 min (método 13 de LC).
* Ejemplo 136:
dioctanoato de 2-(5-((4-((((1-etilpiperidin-3-il)metoxi)carbonil)oxi)hexadecil)oxi)-5-oxopentil)propano-1,3-diílo
Figure imgf000154_0002
1H RMN (400 MHz, CD2CI2) 5 = 4,51 - 4,92 (m, 2H), 3,93 - 4,17 (m, 6H), 2,56 - 2,89 (m, 2H), 2,15 - 2,50 (m, 9H), 1,92 -2,07 (m, 3H), 1,73 - 1,89 (m, 2H), 1,43 - 1,71 (m, 14H), 1,17 - 1,42 (m, 40H), 0,88 (t, J = 7,00 Hz, 9H) ppm.
MS (M 1) = 811.4, Tr = 2.48 min (método 13 de LC).
Ejemplo 138:
dioctanoato de 2-(10-dodecil-3-etil-8,15-dioxo-7,9,14-trioxa-3-azanonadecan-19-il)propano-1,3-diílo
Figure imgf000154_0001
1H RMN (400 MHz, CD2CI2) 5 = 4,63 - 4,74 (m, 1H), 4,14 (td, J = 6,51, 2,14 Hz, 2H), 3,95-4,08 (m, 6H), 2,48 (s a., 6H), 2,28 (t, J = 7,52 Hz, 6H), 1,92 - 2,03 (m, 1H), 1,77 (s a, 2H), 1,49 - 1,68 (m, 12H), 1,19 - 1,40 (m, 40H), 0,99 (s a., 6H), 0,82 - 0,93 (m, 9H) ppm.
MS (M 1) = 827.2, Tr = 2.51 min (método 13 de LC).
Síntesis del Ejemplo 139:
Intermedio 139a: (1-hidroxipentadecan-3-il) carbonato de 4-(dietilamino)butilo
Figure imgf000155_0001
El intermedio 139a pueden prepararse usando métodos similares a los empleados para la síntesis del intermedio 1k. MS (M 1) = 416.7, Tr = 1.44 min (método 14 de LC).
Ejemplo 139:
dioctanoato de 2-(11-dodecil-3-etil-9,15-dioxo-8,10,14-trioxa-3-azanonadecan-19-il)propano-1,3-diílo
Figure imgf000155_0002
El ejemplo 15 pueden prepararse usando métodos similares a los empleados para la síntesis del ejemplo 1.
1H RMN (400 MHz, CD2Ch) 5 = 4,77 (quin, J = 6,24 Hz, 1H), 3,95 - 4,18 (m, 8H), 2,38 - 2,60 (m, 6H), 2,23 - 2,33 (m, 6H), 1,94 - 2,03 (m, 1H), 1,90 (c, J = 6,44 Hz, 2H), 1,46 - 1,70 (m, 12H), 1,20 - 1,42 (m, 40H), 1,01 (t, J = 6,66 Hz, 6H), 0,82 -0,94 (m, 9H) ppm.
MS (M 1) = 827.3, Tr = 2.57 min (método 13 de LC).
* Síntesis del Ejemplo 140:
Intermedio 140a: (1-hidroxipentadecan-3-il) carbonato de 3-(1 H-imidazol-1 -il)propilo
Figure imgf000155_0003
El intermedio 140a pueden prepararse usando métodos similares a los empleados para la síntesis del intermedio 1k. MS (M 1) = 397.6, Tr = 0.53 min (método 14 de LC).
* Ejemplo 140:
d io c ta n o a to d e 2 -(5 -( (3 -( ( (3 -(1 H - im id a z o l-1 - i l) p ro p o x i) c a rb o n il)o x i)p e n ta d e c il)o x i) -5 -o x o p e n t i l) p ro p a n o -1 ,3 -d ií lo
Figure imgf000156_0001
El ejemplo 140 pueden prepararse usando métodos similares a los empleados para la síntesis del ejemplo 1.
1H RMN (400 MHz, CD2O 2) 5 = 8,13 (s a., 1H), 7,27 (s a., 1H), 7,15 (s a., 1H), 4,72 - 4,84 (m, 1H), 4,15 - 4,25 (m, 4H), 4,03 (dd, J = 8,19, 5,75 Hz, 6H), 2,25 - 2,36 (m, 6H), 2,14 - 2,23 (m, 2H), 1,48 - 2,00 (m, 11H), 1,17 - 1,41 (m, 40H), 0,82 - 0,96 (m, 9H) ppm.
MS (M 1) = 808.2, Tr = 2.58 min (método 13 de LC).
* Síntesis del Ejemplo 141:
Intermedio 141a: (3-(piperidin-1-il)propil) carbonato de 1-hidroxipentadecan-3-ilo
Figure imgf000156_0002
El intermedio 141a pueden prepararse usando métodos similares a los empleados para la síntesis del intermedio 1k. MS (M 1) = 414.4, Tr = 0.53 min (método 14 de LC).
* Ejemplo 141:
dioctanoato de 2-(5-oxo-5-((3-(((3-(piperidin-1-il)propoxi)carbonil)oxi)pentadecil)oxi)pentil)propano-1,3-diílo
Figure imgf000156_0003
El ejemplo 141 pueden prepararse usando métodos similares a los empleados para la síntesis del ejemplo 1.
1H RMN (400 MHz, CD2Ch) 5 = 4,77 (quin, J = 6,24 Hz, 1H), 3,95 - 4,18 (m, 8H), 2,20 - 2,48 (m, 12H), 1,95 - 2,03 (m, 1H), 1,90 (m, J = 6,40, 6,40, 6,40 Hz, 4H), 1,52 - 1,69 (m, 12H), 1,19 - 1,50 (m, 42H), 0,82 - 0,95 (m, 9H) ppm.
MS (M 1) = 825.2, Tr = 2.52 min (método 13 de LC).
Síntesis del Ejemplo 142:
Intermedio 142a: 3-(benciloxi)pentadecan-1-ol
Figure imgf000157_0001
A una solución del intermedio 1 h (500 mg, 1.39 mmol) en DMF anhidra (5 ml) a 0° en presencia de nitrógeno se le añadió NaH al 60 % en aceite mineral (84 mg, 2.091 mmol). La mezcla resultante se agitó a 0 °C durante 30 min antes de que se añadiera bromuro de bencilo (0.249 ml, 2.091 mmol). La reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante una noche. La reacción se desactivó con 5 ml de NH4Cl sat. y 10 ml de agua y se diluyó con 15 ml de DCM. La capa ac. separada se extrajo con 10 ml más de DCM. Las capas orgánicas separadas se combinaron y se lavaron con 10 ml de agua, se secaron sobre sulfato sódico, se concentraron y se purificaron por cromatografía en columna ultrarrápida (eluyendo con EtOAc al 0-50 % en heptano) para proporcionar 450 mg del producto deseado impuro. Este material se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Después, este compuesto (450 mg, 1.00 mmol) se recogió en MeOH en un vial cargado con una barra de agitación magnética. Se añadió CAN (1.20 g, 2.20 mmol) en una porción. La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente en una atmósfera de nitrógeno durante ~1 hora, después de lo cual el producto deseado era el producto principal observado por LCMS. La reacción se interrumpió con NaHCO3 sat. y los extractos orgánicos se extrajeron con DCM (x 3). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron con Na2SO4 y se purificaron por cromatografía en columna ultrarrápida (eluyendo con EtOAc al 0-50 % en heptano) para proporcionar 30 mg del producto deseado.
1H RMN (400 MHz, CD2Ch) 5 = 7,17 - 7,34 (m, 5H), 4,43 (s, 2H), 3,48 - 3,72 (m, 3H), 1,52 - 1,71 (m, 2H), 1,30 - 1,41 (m, 3H), 1,19 (s a, 20H), 0,81 (t, J = 1,00 Hz, 3H) ppm.
Intermedio 142b: dioctanoato de 2-(5-((3-(benciloxi)pentadecil)oxi)-5-oxopentil)propano-1,3-diílo
Figure imgf000157_0002
El intermedio 142a (130 mg, 0.389 mmol), el intermedio 1f (250 mg, 0.583 mmol), DMAP (18.99 mg, 0.155 mmol) y DIPEA (0.136 ml, 0.777 mmol) se recogieron en diclorometano anhidro (4 ml) en un vial. Se añadió EDCHCl (149 mg, 0.777 mmol) en una porción y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante el fin de semana. La reacción después se diluyó con H2O (10 ml) y DCM (10 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se lavó con DCM (100 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (5 ml), se secaron con Na2SO4, se filtraron y se concentraron al vacío para proporcionar un aceite de color naranja en bruto. El aceite en bruto se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (eluyendo con EtOAc al 0-100 %:heptano) para proporcionar 163 mg del producto deseado en forma de un aceite de color amarillo.
1H RMN (400 MHz, CD2Ch) ) 5 = 7,24 - 7,39 (m, 5H), 5,00 (quin, J = 1,00 Hz, 1H), 4,45 (s, 2H), 3,95 - 4,10 (m, 4H), 3,47 (td, J = 6,42, 4,52 Hz, 2H), 2,20 - 2,31 (m, 6H), 1,92 - 2,01 (m, 1H), 1,79 - 1,87 (m, 2H), 1,51 - 1,65 (m, 8H), 1,19 - 1,42 (m, 40H), 0,88 (t, J = 1,00 Hz, 9H) ppm.
Intermedio 142c: dioctanoato de 2-(5-((1-hidroxipentadecan-3-il)oxi)-5-oxopentil)propano-1,3-diílo
Figure imgf000158_0001
Un vial que contenía el intermedio 142b (163 mg, 0.218 mmol) y una barra de agitación magnética se evacuó y se lavó abundantemente con N2 (x 3). Después, se añadió Pd al 5 %/C (H2O aprox. al 50 %) en una porción and se repitió el lavado con N2. Después, se añadió EtOH en una porción mediante una jeringa por los lados del matraz. El matraz se puso a presión atmosférica de H2 mediante un globo y se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 1 h. La reacción se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida, lo que proporcionó 123 mg del producto deseado en forma de un aceite incoloro.
1H RMN (400 MHz, CD2Ch) 5 = 4,95 - 5,03 (m, 1H), 3,98 - 4,08 (m, 4H), 3,44 - 3,61 (m, 2H), 2,26 - 2,35 (m, 6H), 1,94 -2,02 (m, 1H), 1,73 - 1,84 (m, 1H), 1,51 - 1,69 (m, 10H), 1,34 - 1,41 (m, 4H), 1,20 - 1,33 (m, 36H), 0,84 - 0,91 (m, 9H) ppm.
Intermedio 142d: dioctanoato de 2-(5-((1-(((4-nitrofenoxi)carbonil)oxi)pentadecan-3-il)oxi)-5-oxopentil)propano-1,3-diílo
Figure imgf000158_0002
El intermedio 142c (120 mg, 0.183 mmol) se recogió en DCM (3 ml) en un vial cargado con una barra de agitación magnética. Se añadió carbonocloridato de 4-nitrofenilo en una porción. La reacción se tapó y se puso en una atmósfera de nitrógeno, después de lo cual se añadió piridina gota a gota mediante una jeringa. La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante una noche. La reacción se diluyó con H2O (5 ml) y DCM (5 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se lavó con DCM (5 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (10 ml), se secaron con Na2SO4, se concentraron y se purificaron por cromatografía en columna ultrarrápida (eluyendo con EtOAc al 0-50 % en heptano) para proporcionar 126 mg del producto deseado en forma de un sólido húmedo de color blanco (que contenía impurezas aromáticas minoritarias).
1H RMN (400 MHz, CD2Ch) 5 = 8,22 - 8,32 (m, 2H), 7,33 - 7,44 (m, 2H), 4,97 - 5,08 (m, 1H), 4,25 - 4,36 (m, 2H), 3,94 -4,09 (m, 4H), 2,21 - 2,37 (m, 6H), 1,88 - 2,07 (m, 3H), 1,49 - 1,68 (m, 8H), 1,19 - 1,43 (m, 40H), 0,88 (t, J = 1,00 Hz, 9H) ppm.
Ejemplo 142:
dioctanoato de 2-(12-dodecil-3-etil-8,14-dioxo-7,9,13-trioxa-3-azaoctadecan-18-il)propano-1,3-diílo
Figure imgf000158_0003
Se añadió gota a gota 3-(dietilamino)propan-1-ol en 1 ml de ACN anhidro a una solución del Intermedio 142d (50 mg, 0.061 mmol) en ACN (1 ml) en un vial cargado con una barra de agitación magnética en atmósfera de N2. Después, se añadió piridina mediante una jeringa, seguido de la adición de DMAP (1.49 mg, 0.012 mmol) (disuelto en 0.1 ml de MeCN) en una porción. La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante una noche. La mezcla en bruto después se diluyó con 10 ml de agua y se extrajo con DCM (2 x 10 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato sódico, se concentraron, y se purificaron por cromatografía en columna ultrarrápida (eluyendo con EtOAc al 0-100 % en heptano) para proporcionar 28 mg del producto deseado en forma de un aceite incoloro.
1H RMN (400 MHz, CD2Ch) 5 = 4,90 - 5,00 (m, 1H), 4,09 - 4,17 (m, 4H), 3,94 - 4,08 (m, 4H), 2,47 (c, J = 7,30 Hz, 6H), 2,28 (t, J = 7,52 Hz, 6H), 1,71 - 2,02 (m, 5H), 1,49 - 1,66 (m, 8H), 1,34 - 1,41 (m, 4H), 1,19 - 1,34 (m, 36H), 0,98 (t, J = 7,09 Hz, 6H), 0,84 - 0,93 (m, 9H) ppm. MS (M 1) = 813,2, Rt = 2,61 min (LC Método 13).
Formulaciones lipídicas de ARNip
Las nanopartículas lipídicas (LNP) se formaron mezclando volúmenes iguales de lípidos disueltos en alcohol con ARNip disuelto en un tampón de citrato mediante un proceso de incidencia a chorro. La solución lipídica contiene un compuesto lipídico catiónico de la invención, un lípido auxiliar (colesterol), un lípido neutro opcional (DSPC) y un lípido PEG (PEG) a una concentración de 8-16 mg/ml con un objetivo de 12 mg/ml en un alcohol. La relación de ARNip con respecto a lípido total es de aproximadamente 0.05 (p/p). Cuando una formulación con LNP contiene cuatro componentes lipídicos, las relaciones molares de los lípidos varían entre el 20 y el 70 por ciento molar para el lípido catiónico con un objetivo de 40­ 60, el porcentaje molar del lípido auxiliar varía entre el 20 y el 70 con un objetivo de 30 a 50, el porcentaje molar del lípido neutro varía entre 0- 30, el porcentaje molar del lípido PEG tiene un intervalo de 1 a 6 con un objetivo de 2 a 5. La concentración de solución de ARNip varía de 0.7 a 1.0 mg/ml con un objetivo de 0.8 a 0.9 mg/ml en un tampón de citrato de sodio:cloruro de sodio de pH 4-6, con un objetivo de 4.5 -5.5. Las LNP se forman mezclando volúmenes iguales de solución lipídica en etanol con ARNip disuelto en un tampón de citrato mediante un proceso de incidencia a chorro a través de un dispositivo de mezclado con ID que varía de 0.25 a 2.0 mm a un caudal de 10 a 640 ml/min. La solución de LNP mixta se mantiene a temperatura ambiente durante 0-24 h antes de una etapa de dilución. A continuación, la solución se concentra y se diafiltra con un tampón adecuado mediante un proceso de ultrafiltración o diálisis utilizando membranas con un punto de corte de PM de 30 a 500 KD. El producto final se esteriliza por filtrado y se almacena a 4 °C.
ARNip
El ARNip usado en las nanopartículas lipídicas descritas estaba compuesto de secuencias de ARNip bicatenarias específicas de una secuencia de ARNm diana.
1. Secuencia de doble cadena de ARNip de FVII
5' UUu AAU UGA AAC cAA GAc Auu 3' (SEQ ID NO: 1)
5' uGu cuu GGu uuc AAu uAA Auu 3' (SEQ ID NO: 2)
2. Secuencia de doble cadena de ARNip de PLK1-424
5' UAU UUA AgG AGG GUG AuC Uuu 3' (SEQ ID NO: 3)
5' AGA Uca cCC Ucc uuA AAU auu 3' (SEQ ID NO: 4)
En estas secuencias se usan las siguientes abreviaturas:
A = adenosina
U = uridina
G = guanosina
C = citosina
a = 2'-O-metil-adenosina
u = 2'-O-metil-uridina
g = 2'-O-metil-guanosina
c = 2'-O-metil-citosina
Plásmido
pcDNA3.1(-)Neo de LifeTechnologies número de cat. V795-20 (SEQ ID NO: 5)
GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATG CCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCG CGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGC TTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATT GATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATG GAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCC CCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCC ATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGT ATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATT ATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCAT CGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGA CTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCA AAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGG TAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCA CTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGC GTTTAAACGGGCCCTCTAGACTCGAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCC ACCACACTGGACTAGTGGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTAAGTTTAAACCGCTGATCAG CCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTGCCCCGTGCCTTCCT TGACCCT GG AAGGT GCCACT CCCACT GTCCTTTCCT AAT AAAAT GAGGAAATT GCATCGC ATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGG GAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGA GGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCA TTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCT AGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCG TCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGA CCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGT TTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGA ACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGC CTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGT GTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCA TGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGA AGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCC ATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTT TTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGA GGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCG GATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACG CAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACA ATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTT TGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTAT CGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCG GGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCT TGCTCCT GCCGAGAAAGTATCCAT CATGGCT GAT GCAAT GCGGCGGCT GCAT ACG CTT G A TCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTC GGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCG CCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCG TGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGAT TCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACC CGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGG 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secuencia pGEM-T7o-TEV-hLeptin-GAopt-2xhBG-120A (SEQ ID NO: 6 )
GATCCGGAGGCCGGAGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGACGCGTGTTAAATAACA AATCTCAACACAACATATACAAAACAAACGAATCTCAAGCAATCAAGCATTCTACTTCTATT GCAGCAATTTAAATCATTTCTTTTAAAGCAAAAGCAATTTTCTGAAAATTTTCACCATTTACG AACGATAGCCGCCACCATGCACTGGGGAACCCTGTGCGGATTCCTGTGGCTGTGGCCCT ACCTGTTCTATGTGCAAGCCGTGCCCATCCAGAAGGTGCAGGACGACACCAAGACCCTG ATCAAGACCATCGTGACCCGGATCAACGACATCAGCCACACCCAGAGCGTGTCCAGCAA GCAGAAAGTGACCGGCCTGGACTTCATCCCCGGCCTGCACCCTATCCTGACCCTGTCCA AGATGGACCAGACCCTGGCCGTGTACCAGCAGATCCTGACCAGCATGCCCAGCCGGAAC GTGATCCAGATCAGCAACGACCTGGAAAACCTGCGGGACCTGCTGCACGTGCTGGCCTT CAGCAAG AGCTG CCATCTGCCTTGGGCCAG CGGCCTGGAAACCCTGGATTCTCTGGGCG GAGTGCTGGAAGCCAGCGGCTACTCTACAGAGGTGGTGGCCCTGAGCAGACTGCAGGG CAGCCT G CAGGATAT GCT GT G GCAGCTGGAT CT GAGC CCCGGCTGCTAATAGCGGACCG GCGATAGATGAAGCTCG CTTT CTTGCT GTCCAATTTCTATT AAAGGTTCCTTT GTTCCCT AA GTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAAT AAAAAACATTTATTTTCATTGCAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTT TGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATT CTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCGGCCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAGAGCAAGCTTTCGATAGCGCTGTTC GTAGAAAAAAAAGAAGTAAATAATTACTACTTGCCATATAGACTAAATAGCTGCGCNTAATA CATCTACACTTTCTANNATTGACAAGTGATACGTTGCAAAAGGAGCAACACCCCACAGACT CGATGACTGCGCAGTCATACAGTGAAATTGCCCTAATGTCTTACCTCTGAAAGGGCTAAA CGAAAGTAGAGCACTATTCCGCGTAGCTATTTAGTGCGATCTTTTAGAAATATCAGCCCAG AGAGCTGGGCTGATAAATATTTTATCCGACAAGACGAATTTTGCTCAAATGAGTTAAAACG ATGCTACCACTATCTGCTGCTTTTACGAGATCAGCCCACCATTGCATCATCGGACGACGTT GCTCAAGATAATCACTGCGGTTATAAGCGCGACGCACCTCATTTTTGTCTACATGAGCAA GCGCTGCTTCAATGACATCAGGTGGAAATCCTTCCTCATTGAGTGCCGTACTGGCGATAG AACGCAAGCCGTGTGAAACAAGTACACCTCCTAAGCCAGCACGCTTGAGTGCTGCATTCA CTGTTTGGCTATTCATTGGTTGGTTGGGCTTGATACGGCTAGGAAAGATAAATTCTCGGC CACCACTGAGAGGCTTCATCATTTCCAGAATAGCAAGAGCCCCATCAGATAGTGGAACCG TATGGTCCCGGTTCATCTTCATTCGAGCTGCAGGAATTTTCCATTCGCTAGCATTGAAATC GATCTCATCCCATCGAGCCTCAGCAGCTTCGGCAGGGCGGGTGATGGTTAGAAGTTGCC ACAT GAACAGGCATCTTGTGGACAT GCTGATACTT GCCGTACGCATGGT GTGCATT AGCT GCGGAAGTTGATCCGGCCGGATGCTTGGCATGTTTTTCTTTTGCGGTTTCTCGAAAGCTT GAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTG TGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAG CCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTT TCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGA GGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTATTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGT CGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAG
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TCGGTACCCGGG
ARNm
Breve descripción del protocolo de transcripción de ARNm
Se construyó un molde de ADN plasmídico circular que contenía un casete de transcripción de ARNm que consistía en los siguientes elementos: un promotor de ARN polimerasa dependiente de ADN de bacteriófago T7 consenso, una región 5' sin traducir (UTR), una secuencia de Kozak y marco abierto de lectura, una 3' UTR y una cola de poliadenosina de 120 nucleótidos de longitud (poliA120). El molde de ADN plasmídico se propagó en E. coli, se aisló y se linealizó mediante digestión con enzimas de restricción inmediatamente 3' de la cola de poli120. El ADN plasmídico se combina con la ARN polimerasa de T7, los ribonucleótidos trifosfato, el inhibidor de la RNasa, la enzima pirofosfatasa, el ditiotreitol, la espermidina y el tampón de reacción enzimática y se incuba durante 1 hora a 37 °C. Se añade la enzima DNasa I para digerir el molde de a Dn plasmídico y se incuba durante 0.5 horas a 37 °C. El ARNm se aísla por precipitación secuencial con cloruro de litio, lavado del sedimento en etanol al 70 %, resuspensión del sedimento de ARNm en agua, reprecipitación con isopropanol y acetato de sodio, y lavado del sedimento de nuevo en etanol al 70%. El sedimento de ARNm final se resuspende en a ua.
Figure imgf000165_0001
TEV-hLeptina-GAopt-2xhBG-120A (SEQ ID NO: 7)
Elementos de secuencia:
UTR 5' del virus del grabado del tabaco (TEV): 14-154
Secuencia de Kozak óptima: 155-163
Aminoácidos 1-167 que codifican la leptina humana del n.° de referencia de proteínas NP_000221, codón de secuencia optimizado por GeneArt: 164-664
2 codones de parada: 665-670
2 copias de 3'UTR de beta-globina humana: 689-954
Cola de poliA de 120 nucleótidos: 961-1080
GGGAGACGCGUGUUAAAUAACAAAUCUCAACACAACAUAUACAAAACAAACGAAUCUCA
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AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA TEV-mEpo(Ncol)-2xhBG-120A (SEQ ID NO: 8 )
Elementos de secuencia:
UTR 5' del virus del grabado del tabaco (TEV): 14-154
Secuencia de Kozak óptima: 155-163
Aminoácidos 1-191 que codifican eritropoyetina de ratón del n.° de referencia de proteínas NP_031968, codón de secuencia optimizado por GeneArt: 164-739
Codones de parada: 740-742
2 copias de 3'UTR de beta-globina humana: 743-1008
Cola de poliA de 120 nucleótidos: 1009-1128
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CCUAAUAAAAAACAU U U AU U U UCAU UGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA TEV-hFIX-GAopt-2xhBG-120A (SEQ ID NO: 9)
Elementos de secuencia:
UTR 5' del virus del grabado del tabaco (TEV): 14-154
Secuencia de Kozak óptima: 155-163
Aminoácidos 1-461 que codifican el factor IX humano del n.° de referencia de proteínas NP_000124, codón de secuencia optimizado por GeneArt: 164-1962
2 codones de parada: 1547-1552
2 copias de 3'UTR de beta-globina humana: 1571-1836
Cola de poliA de 120 nucleótidos: 1843-1962
GGGAGACGCGUGUUAAAUAACAAAUCUCAACACAACAUAUACAAAACAAACGAAUCUCA
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AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
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TEV-Fluc(sapl)-2xhBG-120A (SEQ ID NO: 10)
Elementos de secuencia:
UTR 5' del virus del grabado del tabaco (TEV): 14-154
Secuencia de Kozak óptima: 155-163
Secuencia que codifica el polipéptido 99 % idéntico (545/550 aa) a luciferasa de luciérnaga (Photinus piralis) del n.° de referencia de proteínas P08659: 164-18131
1 codón de parada: 1814-1816
2 copias de 3'UTR de beta-globina humana: 1835-2100
Cola de poliA de 120 nucleótidos: 2107-2226
GGGAGACGCGUGUUAAAUAACAAAUCUCAACACAACAUAUACAAAACAAACGAAUCUCA AGCAAUCAAGCAUUCUACUUCUAUUGCAGCAAUUUAAAUCAUUUCUUUUAAAGCAAAAG CAAUUUUCUGAAAAUUUUCACCAUUUACGAACGAUAGCCGCCACCAUGGAAGACGCCAA AAACAUAAAGAAAGGCCCGGCGCCAUUCUAUCCGCUGGAAGAUGGAACCGCUGGAGAG CAACUGCAUAAGGCUAUGAAGAGAUACGCCCUGGUUCCUGGAACAAUUGCUUUUACAG AUGCACAUAUCGAGGUGGACAUCACUUACGCUGAGUACUUCGAAAUGUCCGUUCGGUU GGCAGAAGCUAUGAAACGAUAUGGGCUGAAUACAAAUCACAGAAUCGUCGUAUGCAGU GAAAACUCUCUUCAAUUCUUUAUGCCGGUGUUGGGCGCGUUAUUUAUCGGAGUUGCA GUUGCGCCCGCGAACGACAUUUAUAAUGAACGUGAAUUGCUCAACAGUAUGGGCAUUU CGCAGCCUACCGUGGUGUUCGUUUCCAAAAAGGGGUUGCAAAAAAUUUUGAACGUGCA AAAAAAGCUCCCAAUCAUCCAAAAAAUUAUUAUCAUGGAUUCUAAAACGGAUUACCAGG GAUUUCAGUCGAUGUACACGUUCGUCACAUCUCAUCUACCUCCCGGUUUUAAUGAAUA CGAUUUUGUGCCAGAGUCCUUCGAUAGGGACAAGACAAUUGCACUGAUCAUGAACUCC UCUGGAUCUACUGGUCUGCCUAAAGGUGUCGCUCUGCCUCAUAGAACUGCCUGCGUG AGAUUCUCGCAUGCCAGAGAUCCUAUUUUUGGCAAUCAAAUCAUUCCGGAUACUGCGA UUUUAAGUGUUGUUCCAUUCCAUCACGGUUUUGGAAUGUUUACUACACUCGGAUAUUU GAUAUGUGGAUUUCGAGUCGUCUUAAUGUAUAGAUUUGAAGAGGAGCUGUUUCUGAG GAGCCUUCAGGAUUACAAGAUUCAAAGUGCGCUGCUGGUGCCAACCCUAUUCUCCUUC UUCGCCAAAAGCACUCUGAUUGACAAAUACGAUUUAUCUAAUUUACACGAAAUUGCUUC UGGUGGCGCUCCCCUCUCUAAGGAAGUCGGGGAAGCGGUUGCCAAGAGGUUCCAUCU GCCAGGUAUCAGGCAAGGAUAUGGGCUCACUGAGACUACAUCAGCUAUUCUGAUUACA CCCGAGGGGGAUGAUAAACCGGGCGCGGUCGGUAAAGUUGUUCCAUUUUUUGAAGCG AAGGUUGUGGAUCUGGAUACCGGGAAAACGCUGGGCGUUAAUCAAAGAGGCGAACUG UGUGUGAGAGGUCCUAUGAUUAUGUCCGGUUAUGUAAACAAUCCGGAAGCGACCAACG CCUUGAUUGACAAGGAUGGAUGGCUACAUUCUGGAGACAUAGCUUACUGGGACGAAGA CGAACACUUCUUCAUCGUUGACCGCCUGAAGUCUCUGAUUAAGUACAAAGGCUAUCAG GUGGCUCCCGCUGAAUUGGAAUCCAUCUUGCUCCAACACCCCAACAUCUUCGACGCAG GUGUCGCAGGUCUUCCCGACGAUGACGCCGGUGAACUUCCCGCCGCCGUUGUUGUUU
UGGAGCACGGAAAGACGAUGACGGAAAAAGAGAUCGUGGAUUACGUCGCCAGUCAAGU
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CUUACCGGAAAACUCGACGCAAGAAAAAUCAGAGAGAUCCUCAUAAAGGCCAAGAAGGG
CGGAAAGAUCGCCGUGUGACGGACCGGCGAUAGAUGAAGCUCGCUUUCUUGCUGUCC
AAUUUCUAUUAAAGGUUCCUUUGUUCCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUA
UGAAGGGCCUUGAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCAGC
UCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCCUUUGUUCCCUAAGUCCAACUAC
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A A AA AAAA AA A A A A A A A
Gtx7-Gluc-2xSinV-120A (SEQ ID NO: 11)
Elementos de secuencia:
5' UTR: 14-127
Secuencia de Kozak: 128-133
Secuencia que codifica el polipéptido idéntico a luciferasa de Gaussia princeps del n.° de referencia de proteínas AAG54095: 134-688
1 codón de parada: 689-691
2 copias de 3'UTR de virus sindbis: 699-882
Cola de poliA de 120 nucleótidos: 891-1010
GGGAGACGCGUGUUUCUGACAUCCGGCGGAAUUCUGACAUCCGGCGGAAUUCUGACA
UCCGGCGGAAUUCUGACAUCCGGCGGAAUUCUGACAUCCGGCGGAAGACUCACAACCC
CAGAAACAGACAGCCACCAUGGGAGUCAAAGUUCUGUUUGCCCUGAUCUGCAUCGCUG
UGGCCGAGGCCAAGCCCACCGAGAACAACGAAGACUUCAACAUCGUGGCCGUGGCCAG
CAACUUCGCGACCACGGAUCUCGAUGCUGACCGCGGGAAGUUGCCCGGCAAGAAGCU
GCCGCUGGAGGUGCUCAAAGAGAUGGAAGCCAAUGCCCGGAAAGCUGGCUGCACCAG
GGGCUGUCUGAUCUGCCUGUCCCACAUCAAGUGCACGCCCAAGAUGAAGAAGUUCAUC
CCAGGACGCUGCCACACCUACGAAGGCGACAAAGAGUCCGCACAGGGCGGCAUAGGC
GAGGCGAUCGUCGACAUUCCUGAGAUUCCUGGGUUCAAGGACUUGGAGCCAAUGGAG
CAGUUCAUCGCACAGGUCGAUCUGUGUGUGGACUGCACAACUGGCUGCCUCAAAGGG
CUUGCCAACGUGCAGUGUUCUGACCUGCUCAAGAAGUGGCUGCCGCAACGCUGUGCG
ACCUUUGCCAGCAAGAUCCAGGGCCAGGUGGACAAGAUCAAGGGGGCCGGUGGUGAC
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GUCUACAUAAUCAAUUUAUUAUUUUCUUUUAUUUUAUUCACAUAAAAACUCAAUGUAUU
UCUGAGGAAGCGUGGUGCAUAAUGCCACGCAGUGUCUACAUAAUCAAUUUAUUAUUUU
CUUUUAUUU UAU UCACAUAGCGGCCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
Evaluación biológica
Empaquetamiento de ARNm
Todo el equipo y los suministros desechables están certificados como libres de actividad RNasa por el fabricante o se convierten en libres de RNasa mediante el uso del reactivo RNaseZap (LifeTechnologies). El ARNm se encapsula en una proporción molar de amina lipídica catiónica a ARNm fosfato de 4:1. Los lípidos (lípido catiónico, DSPC, colesterol y PEG lipidado o lípido oculto se disuelven en etanol. Las relaciones molares son 40:10:38:2, respectivamente. La mezcla se trató con ultrasonidos brevemente, a continuación se agitó suavemente durante 5 minutos y se mantuvo a 37 °C hasta su uso. El ARNm se cambió al tampón de citrato de pH 5.8 - 6.0 mediante el uso de concentradores centrífugos Amicon Ultra-15, y la concentración final se ajustó a 0.5 mg/ml y se mantuvo a 37 °C hasta su uso. Se introduce en jeringas desechables un volumen igual de lípidos en etanol, de ARNm en tampón de citrato y de tampón de citrato solo. Los tubos que salen de las jeringas que contienen lípidos y ARNm se unen a la unión en T, y los tubos que salen de la jeringa que contiene sólo tampón de citrato se unen a los tubos que salen de la unión en T sobre un recipiente de recogida que contiene una barra de agitación en una placa de agitación activa. Las jeringas se colocan en una bomba de jeringa ajustada para expulsar el contenido a un caudal de 1 ml por minuto.
La bomba se activa y el ARNm recogido en las nanopartículas lipídicas se transfiere a los tubos de diálisis SnakeSkin (10.000 MWCO, Thermo Scientific). El material se dializa en una solución salina tamponada con fosfato de 1x sin RNAsa y pirógenos durante la noche a 4 °C.
Empaquetamiento de ARNip
Las nanopartículas lipídicas (LNP) se formaron mezclando volúmenes iguales de lípidos disueltos en alcohol con ARNip disuelto en un tampón de citrato mediante un proceso de incidencia a chorro. La solución lipídica contiene un compuesto lipídico catiónico de la invención, un lípido auxiliar (colesterol), un lípido neutro opcional (DSPC) y un lípido oculto (S010, S024, S027 o S031 a una concentración de 8-16 mg/ml con un objetivo de 12 mg/ml en un alcohol. La relación de ARNip con respecto a lípido total es de aproximadamente 0.05 (p/p). Cuando una formulación con LNP contiene cuatro componentes lipídicos, las relaciones molares de los lípidos varían entre el 20 y el 70 por ciento molar para el lípido catiónico con un objetivo de 40-60, el porcentaje molar del lípido auxiliar varía entre el 20 y el 70 con un objetivo de 30 a 50, el porcentaje molar del lípido neutro varía entre 0- 30, el porcentaje molar del lípido PEG tiene un intervalo de 1 a 6 con un objetivo de 2 a 5. La concentración de solución de ARNip varía de 0.7 a 1.0 mg/ml con un objetivo de 0.8 a 0.9 mg/ml en un tampón de citrato de sodio:cloruro de sodio de pH 4-6, con un objetivo de 4.5 -5.5. Las LNP se forman mezclando volúmenes iguales de solución lipídica en etanol con ARNip disuelto en un tampón de citrato mediante un proceso de incidencia a chorro a través de un dispositivo de mezclado con ID que varía de 0.25 a 2.0 mm a un caudal de 10 a 640 ml/min. La solución de LNP mixta se mantiene a temperatura ambiente durante 0-24 h antes de una etapa de dilución. La solución después se concentra y diafiltra con tampón adecuado mediante un proceso de ultrafiltración usando membranas con un punto de corte de PM de 30 a 500 KD. El producto final se esteriliza por filtrado y se almacena a 4 °C.
Medición de la encapsulación de ARNm
El porcentaje de encapsulación de ARNm en las nanopartículas lipídicas se determina utilizando el kit Quant-iT Ribogreen RNA Assay (Life Technologies). La suspensión de LNP-ARNm se somete a ensayo en tampón (ARNm fuera de la partícula), y en tampón más detergente Triton X-100 (ARNm total). La diferencia calculada es el ARNm dentro de la partícula. Preparar una solución madre de 1000 ng/ml del ARN suministrado en el kit y usarlo para generar una curva patrón (0 ng/ml, 15.63- 1000 ng/ml) en TE y TE Triton X-100 al 0.75%. Preparar las muestras de LNP-ARNm en tampón TE y tampón TE Triton X-100 al 0.75% con la dilución adecuada para que la lectura esté en el intervalo de la curva patrón (400-2.000 veces). En una placa de 384 pocillos (Costar sin tratar n.° 3573) añadir 0.04 ml de patrón (por duplicado) o de muestra (por triplicado) por pocillo. Diluir el reactivo Ribogreen 240 veces en tampón TE y añadir 0.06 ml por pocillo. Mezclar el contenido de los pocillos y medir la fluorescencia (excitación = 480 nm, emisión = 520 nm). Restar los valores de fondo (sin ARN) de los valores del patrón y de la muestra de prueba y determinar las concentraciones de ARN en las muestras utilizando las curvas patrón. Determinar el porcentaje de encapsulación de la muestra dividiendo la diferencia de concentraciones entre la muestra triton y la muestra en tampón solo por la concentración de la muestra triton.
Medición de la encapsulación de ARNip
El reactivo de fluorescencia SYBR Gold se utiliza para la determinación de la encapsulación del ARNip en los DLP. Se utilizan DLP con y sin triton x-100 para determinar las cantidades de ARNip libre y de ARNip total. Las muestras de DLP con y sin triton X-100 se excitaron a 485 nm y la emisión de fluorescencia se mide a 530 nm. La eficacia de la encapsulación se calcula a partir de la siguiente fórmula:
Encapsulation efficiency: [(free siRNA concentration - total siRNA concentration) / (total siRNA
concentration)] x 100%
Datos de encapsulación
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Empaquetamiento del ADN plasmídico
Todo el equipo y los suministros desechables están certificados como libres de actividad RNasa por el fabricante o se convierten en libres de RNasa mediante el uso del reactivo RNaseZap (LifeTechnologies). El plásmido se encapsula en una relación molar de amina lipídica catiónica a ADN fosfato (N:P) de 4:1. Los lípidos (lípido catiónico, DSPC, colesterol y PEG lipidado) se disuelven en etanol. Las relaciones molares son 40:10:38:2, respectivamente. La mezcla se trató con ultrasonidos brevemente, se agitó suavemente durante 5 minutos y se mantuvo a 37 °C hasta su uso. El plásmido se intercambia a tampón de citrato de pH 6.0 mediante el uso de concentradores centrífugos Amicon Ultra-15, y la concentración final se ajusta a 0.053 mg/ml y se mantiene a 37 °C hasta su uso. Un volumen igual de lípidos en etanol, plásmido en tampón de citrato y tampón de citrato solo se extrajeron en jeringas desechables. Los tubos que salen de las jeringas que contienen lípidos y ADN se unen a la unión en T, y los tubos que salen de la jeringa que contiene sólo tampón de citrato se unen a los tubos que salen de la unión en T sobre un recipiente de recogida que contiene una barra de agitación en una placa de agitación activa. Las jeringas se colocan en una bomba de jeringa ajustada para expulsar el contenido a un caudal de 1 ml por minuto. La bomba se activa y el ADN recogido en las nanopartículas lipídicas se transfiere a los tubos de diálisis SnakeSkin (10.000 MWCO, Thermo Scientific). El material se dializa en una solución salina tamponada con fosfato de 1x sin RNAsa y pirógenos durante la noche a 4 °C.
Medición de la encapsulación de ADN
El porcentaje de encapsulación de ADN plasmídico en las nanopartículas lipídicas se determina utilizando el kit Quant-iT Ribogreen RNA Assay (Life Technologies). La suspensión de l NP-DNA se somete a ensayo en tampón (ADN fuera de la partícula), y en tampón más detergente Triton X-100 (ADN total). La diferencia calculada es el ADN dentro de la partícula. Preparar una solución madre de 1000 ng/ml utilizando el plásmido sin empaquetar y usarlo para generar una curva patrón (0 ng/ml, 15.63- 1000 ng/ml) en TE y TE Triton X-100 al 0.75%. Preparar las muestras de LNP-plásmido en tampón TE y tampón TE Triton X-100 al 0.75% con la dilución adecuada para que la lectura esté en el intervalo de la curva patrón (25 veces). En una placa de 384 pocillos (Costar sin tratar n.° 3573) añadir 0.04 ml de patrón (por duplicado) o de muestra (por triplicado) por pocillo. Diluir el reactivo Ribogreen 240 veces en tampón TE y añadir 0.06 ml por pocillo. Mezclar el contenido de los pocillos y medir la fluorescencia (excitación = 480 nm, emisión = 520 nm). Restar los valores de fondo (sin ADN) de los valores del patrón y de la muestra de prueba y determinar las concentraciones de ADN en las muestras utilizando las curvas patrón. Determinar el porcentaje de encapsulación de la muestra dividiendo la diferencia de concentraciones entre la muestra triton y la muestra en tampón solo por la concentración de la muestra triton. M e d ic io n e s d e ín d ic e d e p o lid is p e rs ió n (P D I)
A menos que se indique lo contrario, todos los PDI a los que se hace referencia en el presente documento son los PDI de la nanopartícula completamente formada, medidos por dispersión dinámica de la luz en un Malvern Zetasizer. La muestra de nanopartículas se diluyó en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para que el índice de recuento fuera de aproximadamente 200 - 400 kcts. Los datos se presentan en la tabla 3 como un promedio ponderado de la medición de intensidad.
El ta m a ñ o d e p artícu las d e la n a n o p a rtíc u la lip íd ica
A menos que se indique lo contrario, todas las mediciones de tamaño de partículas a las que se hace referencia en la tabla 3 son el tamaño de partícula promedio Z de la nanopartícula completamente formada, medidos por dispersión dinámica de la luz en un Malvern Zetasizer. La muestra de nanopartículas se diluyó en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para que el índice de recuento fuera de aproximadamente 200 - 400 kcts.
D atos d e c a ra c te r iza c ió n d e n a n o p a rtíc u la s lip íd icas
T l : in vir n m l l i n
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D a to s in vivo
D o s ific a c ió n d e l fa c to r V II d e ra tón
Se recibieron ratones CD-1 hembra de Harlan Labs y se mantuvieron en pienso convencional y agua a voluntad. Los animales pesaban aproximadamente 25 gr en el momento de la dosificación. Se administró ARNip de factor VII formulado como una única dosis por vía intravenosa a través de la vena lateral de la cola. Aproximadamente 48 horas después de la inyección, los ratones se sacrificaron mediante inhalación de CO2 seguido de exsanguinación a través de la vena cava. La sangre se recogió en tubos que contenían citrato de sodio 0.105 M anticoagulante para análisis de actividad del factor VII de plasma.
E n s a y o d e a c tiv id a d del fa c to r VII
Se sometió a ensayo plasma recogido de ratones inyectados para determinar la actividad enzimática del factor VII usando el kit Biophen FVII de Hyphen Biomedical (número de catálogo 221304). Se preparó una curva patrón de ensayo usando alícuotas de plasma agrupadas de los animales de control de vehículo. Todas las muestras se diluyeron para que quedaran dentro del intervalo lineal de la curva patrón y se informó de la actividad del factor VII en relación con el plasma de control.
Se probaron nanopartículas lipídicas que comprendían compuestos lipídicos de fórmula (I) y la secuencia de doble cadena de ARNip de FVII enumerada anteriormente en el ensayo de actividad del factor VII. Los resultados de este ensayo se presentan en la tabla 34 a continuación como un porcentaje de eliminación de la actividad enzimática del Factor VII en plasma a una dosis de 0.3 mg/kg y 0.03 mg/kg.
ELISA de EPO de ratón
Se recubre un anticuerpo de rata anti-eritropoyetina de ratón en placas de microtitulación blancas de 384 pocillos durante la noche, y después se bloquea para el ensayo. A continuación, las muestras de plasma se diluyen en un diluyente de muestras basado en caseína y se incuban en la placa con controles de tampón y patrones de EPO de ratón. A continuación, se lava la placa para eliminar el material no unido. A continuación, se añade a la placa un anticuerpo de rata antieritropoyetina de ratón biotinilado para detectar la EPO de ratón unida al anticuerpo de captura. Se vuelve a lavar la placa y se incuba un reactivo de peroxidasa de rábano picante conjugado con estreptavidina en la placa. Se realiza una tercera etapa de lavado y se añade un reactivo quimioluminiscente a la placa y se lee inmediatamente con un lector de placas capaz de utilizar todas las longitudes de onda y un tiempo de integración de 50 milisegundos. Las muestras desconocidas se interpolan a partir de la curva patrón de EPO de ratón.
ELISA para Factor IX humano
Un anticuerpo de oveja contra el factor IX humano (n.° de catálogo FIX-EIA-C) de Enzyme Research Laboratories se recubre en placas de microtitulación blancas de 384 pocillos durante la noche a una concentración de 5 ug/ml, y después se bloquea para el ensayo usando bloqueador KPL (n.° de catálogo 50-82-00). A continuación, las muestras de plasma se diluyen en un diluyente de muestras basado en caseína y se incuban en la placa con controles biológicos y una curva patrón creada a partir de la proteína recombinante (n.° de catálogo HCIX-0040). A continuación, se lava la placa para eliminar el material no unido. A continuación, se añade a la placa anticuerpo de oveja contra el factor IX humano biotinilado (n.° de catálogo FIX-EIA-D) de Enzyme Research Laboratories a 0.6 ug/ml para detectar la proteína factor IX humano unida al anticuerpo de captura. La placa se lava de nuevo y se incuba en ella un reactivo de peroxidasa de rábano picante conjugado con estreptavidina (n.° de catálogo 21140) diluido a 1:1250. Se realiza una tercera etapa de lavado y se combinan y añaden reactivos quimioluminiscentes (n.° de catálogo 1859678 y n.° de catálogo 18596789) a la placa y se lee inmediatamente con un lector de placas capaz de utilizar todas las longitudes de onda y un tiempo de integración de 50 milisegundos. Las muestras desconocidas se interpolan a partir de la curva patrón de factor IX recombinante humano.
Diluyente de muestra de caseína, pH 7.20
El diluyente de la muestra contiene caseína al 0,7 %, fosfato sódico monobásico 1.7 mM, fosfato sódico dibásico heptahidratado 8.1 mM, cloruro sódico 0.15 M, Triton X-100 al 0.7 % y azida sódica al 0.1 %.
Diluyente de caseína de anticuerpo biotinilado, pH 7.15
El diluyente de contiene caseína al 0.4 %, fosfato sódico monobásico 1.7 mM, fosfato sódico dibásico heptahidratado 8.1 mM, cloruro sódico 0.15 M y azida sódica al 0.1 %.
Diluyente de caseína de HRP, pH 7.15
El diluyente contiene caseína al 0.4 %, fosfato sódico monobásico 1.7 mM, fosfato sódico dibásico heptahidratado 8.1 mM, cloruro sódico 0.15 M y cloracetamida leptina al 0.1 %
hLEPTINA
Se midió la leptina humana en plasma de ratón mediante ELISA. Se reconstituyeron anticuerpos adquiridos de R&D Systems duoset (n.° de catálogo DY398E, parte n.° 840279 para anticuerpo de captura y parte n.° 840280 para anticuerpo de detección) usando PBS y se valoraron, usando de nuevo PBS. El anticuerpo de captura se aplicó a 4 ug/ml en 30 ul/pocillo en una placa blanca Nunc® Maxisorp de 384 pocillos (n.° de catálogo 460372). Después de una incubación durante una noche a temperatura ambiente el anticuerpo de captura se aspiró y la placa se bloqueó durante 2 horas a temperatura ambiente con 90 ul/pocillo de bloqueador de leche KPL (n.° de catálogo 50-82-00). Una vez que se hubo completado la incubación, se aspiró la placa y se añadieron patrones recombinantes y muestras a la placa a 30 ul/pocillo durante 2 horas a 37 °C agitando al mismo tiempo a 600 rpm. Se prepararon diluciones de muestra/patrón usando diluyente de muestra de caseína. Se siguió de lavado/aspiración 3 veces con 100 ul/pocillo seguido, usando solución de lavado de placas Teknova (n.° de catálogo P1192). Después, se diluyó anticuerpo de detección usando diluyente de anticuerpo de detección de caseína hasta 12.5 ng/ml y se añadió a 30 ul/pocillo durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de esta incubación, la placa se lavó de nuevo y se añadió una solución de poliestreptavidina-HRP (n.° de catálogo 21140) a una dilución 1:1250 en tampón de dilución de HRP a cada pocillo (30 ul/pocillo) y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Un lavado/aspiración final eliminó la solución de HRP y se añadió un sustrato quimioluminiscente a 30 ul/pocillo (n.° de catálogo 1859678 y 1859679). La placa se leyó rápidamente usando un lector de placas de SpectramaxM5 con un tiempo de integración de 50 ms. El intervalo dinámico del ELISA es de 100-2000 pg/ml (6.25-125 pM) de leptina humana. El ensayo es aplicable al plasma de ratones, ratas y monos cinomolgos.
In v e c c ió n in tra v e n o s a en la v e n a d e la c o la d e ra tón d e A R N m d e lep tin a s in té tic a m o d ific a d a
Antes de la inyección en la vena de la cola, se registraron los pesos corporales de los ratones y se ponderaron con respecto a la dieta, agrupándose los ratones según sus pesos corporales. Los ratones se prepararon calentándolos bajo una lámpara de calentamiento durante- 2 minutos, con los ratones a aproximadamente 30.48 cm (12 pulgadas) de la lámpara de calor.
Para el procedimiento de inyección en la vena de la cola, los ratones se pusieron en un dispositivo de inmovilización y sus colas se limpiaron con alcohol al 70 %. Se insertó una aguja de calibre 27 (Becton Dickinson, n.° de catálogo 305109) conectado con una jeringa de 1 ml (Becton Dickinson, n.° de catálogo 309659) en la vena de la cola, con el bisel hacia arriba, y se tiró del émbolo hacia atrás para garantizar que la sangre se extrajera a la jeringa. El volumen deseado de ARNm de leptina sintética modificada se inyectó a mano con presión y velocidad moderadas. La aguja se extrajo a continuación y se detuvo la hemorragia añadiendo presión al sitio de inyección con gasa.
Se usaron ratones macho, de 8-9 semanas de edad, C57BL/6 alojados individualmente para el estudio in vivo. El ARNm de leptina sintética modificada purificado por FPLC (SEQ ID NO: 6 ) en el que las uridinas se sustituyeron con pseudouridina se empaquetó en un lípido catiónico (relación molar N:P = 8:1) y después se diluyeron en solución salina inyectable a una dosis de 10 |jg por peso corporal promedio de grupo.
El día 0, los animales se pesaron y clasificaron según el peso corporal promedio. Se administraron dosis a los ratones y se registró el consumo de alimentos (FI, por sus siglas en inglés) cada uno de los días 1-7 y los días 9, 11 y 16.
In y ec c ió n s u b c u tá n e a en ra tón d e A R N m d e lep tin a s in té tic a m o d ific a d a
Antes de la inyección subcutánea, se registraron los pesos corporales de los ratones y se ponderaron con respecto a la dieta, agrupándose los ratones según sus pesos corporales. Los ratones se inmovilizaron manualmente y se colocaron sobre una superficie de trabajo. Se pellizcaron sus pescuezos y se levantaron del músculo subyacente, el espacio en el que se insertó una aguja de calibre 25 conectada con una jeringa de 1 ml. El émbolo de la jeringa se retiró hacia atrás de tal manera que se garantizó que no se extraía líquido a la jeringa y después se inyectó manualmente el volumen deseado de ARNm de leptina con presión y velocidad moderadas. Después se extrajo la aguja y se devolvieron los ratones a sus jaulas.
Se usaron ratones macho, de 8-9 semanas de edad, C57BL/6 para el estudio in vivo. El ARNm de leptina sintética modificada purificada con FPLC (SEQ ID NO: 6 ) en el que las uridinas se sustituyeron con pseudouridina (relación molar N:P = 8:1) empaquetadas en lípido catiónico múltiple se diluyeron en solución salina inyectable a una dosis de 10 jg por peso corporal promedio de grupo.
El día 0, los animales se pesaron y clasificaron según el peso corporal promedio. Se administraron dosis a los ratones a las 9 de la mañana y se extrajo sangre a las 9 de la mañana el día 0. También se extrajo sangre a las 9 de la mañana cada uno de los días 1 y 2 y se evaluó para determinar los niveles de proteínas de leptina. También se registraron el peso corporal y el consumo de alimentos.
T a b la 4: D a tos in vivo
E xp re s ió n d e la p ro te ín a (n g /m l) tras la in y ec c ió n IV d e A R N m e n c a p s u la d o en ra to n es C 57B 6
Á c id o Ejemplo 1 * Ejemplo 91 Ejempl n u c le
Figure imgf000177_0001
hLepti 66.3 ng/ml (0.4 mpk, C57) 33.6 ng/ml (0.2 21.4
mpk, ob/ob) mpk, o
mEP 247.6 ng/ml (0.2 mpk, ob/ob)
Figure imgf000177_0002
E xp re s ió n d e la p ro te ín a (n g /m l) tra s la in y ec c ió n S C d e A R N m e n c a p s u la d o en ra to n es C 57B 6
hLepti 16.2 ng/ml(0 . 2 mpk, ob/ob) 1 .2 3.5 ng/ml(0.2 mpk, 8.4 ng/ml(0.2 mpk,
Figure imgf000177_0003
ng/ml (0 . 2 mpk, C57) ob/ob) ob/ob)
Figure imgf000177_0004
Figure imgf000177_0005
E s tu d io s d e in m u n o g e n ic id a d
El ADN plasmídico que codifica los replicones del alfavirus que codifican la proteína F del RSV como un transgén sirvió como molde para la síntesis del ARN in vitro. Los replicones contienen los elementos genéticos de los alfavirus necesarios para la replicación del ARN, pero carecen de los que codifican los productos génicos necesarios para el ensamblaje de las partículas; en su lugar, las proteínas estructurales se sustituyen por una proteína de interés (p. ej., un inmunógeno, como la proteína F del RSV de longitud completa), y de este modo los replicones son incapaces de inducir la generación de partículas infecciosas. Un promotor del bacteriófago T7 cadena arriba del ADNc del alfavirus facilita la síntesis del ARN del replicón in vitro. Otros promotores, tal como el SP6 , podrían utilizarse como alternativa.
Las transcripciones se realizaron durante 2 horas a 37 °C en presencia de ARN polimerasa de T7) 7,5 mM o (ARN polimerasa de SP6 ) 5 M de cada uno de los nucleósidos trifosfato (ATP, CTP, GTP y UTP) siguiendo las instrucciones del fabricante (Ambion). Después de la transcripción, el ADN molde se digirió con TURBO DNasa (Ambion). El ARN del replicón se precipitó con LiCI y se reconstituyó en agua sin nucleasas. El ARN sin proteger terminalmente con caperuza se protegió terminalmente con caperuza después de la transcripción con la enzima de protección con caperuza de vacunas (VCE, por sus siglas en inglés) utilizando el sistema de protección con caperuza ScriptCap m7G (Epicentre Biotechnologies), tal como se indica en el manual de usuario; los replicones protegidos terminalmente con caperuza de este modo llevan el prefijo "v", por ejemplo, vA317 es el replicón A317 protegido terminalmente con caperuza por VCE. El ARN protegido terminalmente con caperuza después de la transcripción se precipitó con LiCI y se reconstituyó en agua sin nucleasas. La concentración de las muestras de ARN se determinó midiendo la DO 260 nm. La integridad de los transcritos in vitro se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante.
Encapsulación en liposomas basados en DlinDMA
El ARN se encapsuló en liposomas preparados esencialmente por el método de Geall et al. (2012) PNAS vol. 109 (36): 14604-14609, Jeffs et al. (2005) Pharmaceutical Research 22 (3):362-372 and Maurer et al. (2001) Biophysical Journal, 80: 2310-2326 Los liposomas estaban compuestos por DSPC (zwitteriónico) al 10 %, lípidos catiónicos al 40 %, colesterol al 48 % y DMG conjugado con PEG (2kDa PEG) al 2 %. Estas proporciones se refieren al % de moles en el total del liposoma.
El DSPC (1,2-diastearoíl-sn-glicero-3-fosfocolina) se adquirió a Genzyme. El colesterol se obtuvo de Sigma-Aldrich. El DMG (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol), sal de amonio) conjugado con PEG, DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano, sal de cloruro) y el DC-col (clorhidrato de 3p-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol) se adquirieron de Avanti Polar Lipids.
Brevemente, los lípidos se disolvieron en etanol (2 ml), un replicón de ARN se disolvió en tampón (2 ml, citrato sódico 100 mM, pH 6 ) y estos se mezclaron con 2 ml de tampón seguido de 1 hora de equilibrio. A continuación, la mezcla se dializó durante la noche contra 1x PBS. El producto resultante contenía liposomas, con una eficacia de encapsulación del 70­ 95 %. Para los experimentos in vitro e in vivo, las formulaciones se diluyeron hasta la concentración de ARN requerida con 1X PBS.
El porcentaje de ARN encapsulado y la concentración de ARN se determinaron mediante el kit de reactivos de ARN Quant-iT RiboGreen (Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante. El patrón de ARN ribosómico suministrado en el kit se utilizó para generar una curva patrón. Los liposomas se diluyeron 10x o 100x en tampón TE 1X (del kit) antes de la adición del colorante. Por separado, los liposomas se diluyeron 10x o 100x en un tampón TE 1X que contenía Triton X al 0.5 % antes de añadir el colorante (para romper los liposomas y así poder analizar el ARN total). A continuación, se añadió una cantidad igual de colorante a cada solución y después se cargaron por duplicado -180 |jl de cada solución tras la adición del colorante- en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos. La fluorescencia (Ex 485 nm, Em 528 nm) se leyó en un lector de microplacas. Todas las formulaciones liposómicas se dosificaron in vivo basándose en la cantidad de ARN encapsulado.
Inmunogenicidad de RSV
Se administró un replicón autorreplicante que codifica la proteína F del RSV a ratones BALB/c, 8 animales por grupo, mediante vacunaciones intramusculares bilaterales (50 j l por pata) en los días 0 y 21 con el replicón (0.1 y 1 ng) formulado como liposomas con los lípidos descritos a continuación. Todos los liposomas probados estaban compuestos por lípidos catiónicos al 40 %, DSPC al 10 %, colesterol al 48 % y PEG-DMG al 2 % con cantidades similares de ARN. Todos los liposomas se prepararon utilizando la misma técnica descrita anteriormente.
% de atrapamiento (%E), concentración de ARN (Conc), tamaño de partícula medido por DLS, y polidispersidad reportada por DLS de LNP r r n if r n lí i i ni
Figure imgf000178_0001
Figure imgf000179_0001
Datos de inmunogenicidad dos semanas después de dos inmunizaciones de ARN vA375 que expresa RSV-F de LNP preparadas n if r n lí i i ni . L LNP r r r n n v r inm niz i n.
Figure imgf000179_0002
Debe entenderse que para todos los límites numéricos que describen algún parámetro en la presente solicitud, tal como "aproximadamente", "al menos", "menos que" y "más que", la descripción también abarca necesariamente cualquier intervalo delimitado por los valores citados. Por consiguiente, por ejemplo, la descripción "al menos 1,2, 3, 4 o 5" también describe, inter alia, los intervalos 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 2-3, 2-4, 2-5, 3-4, 3-5, y 4-5, etcétera.
Los encabezamientos utilizados en la presente solicitud son solamente por comodidad y no afectan a la interpretación de la misma.
Las características preferidas de cada uno de los aspectos proporcionados por la invención son aplicables a todos los diferentes aspectos de la invención mutatis mutandis y, sin limitación, están ejemplificadas por las reivindicaciones dependientes y también abarcan combinaciones y permutaciones de características individuales (p. ej., elementos, incluyendo intervalos numéricos y realizaciones ilustrativas) de realizaciones y aspectos particulares de la invención, incluyendo los ejemplos de trabajo. Por ejemplo, los parámetros experimentales particulares ejemplificados en los ejemplos de trabajo pueden adaptarse para su uso en la invención reivindicada poco a poco sin apartarse de la invención. Por ejemplo, para los materiales que se divulgan, si bien la referencia específica de cada una de las diversas combinaciones y permutaciones individuales y colectivas de estos compuestos puede no divulgarse explícitamente, cada una se contempla y describe de manera específica en el presente documento. Por lo tanto, si se divulga una clase de elementos A, B y C, así como una clase de elementos D, E y F, y se divulga un ejemplo de combinación de elementos A-D, entonces, aunque no se cite cada uno individualmente, se contempla cada uno de manera individual y colectiva. Por lo tanto, en este ejemplo, cada una de las combinaciones A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E, y C-F están específicamente contempladas y deben considerarse divulgadas a partir de la divulgación de A, B y C; D, E y F; y la combinación de ejemplo A-D. Asimismo, cualquier subconjunto o combinación de los mismos también se contempla y divulga específicamente. Por lo tanto, por ejemplo, los subgrupos de A-E, B-F y C-E se contemplan específicamente y deben considerarse divulgados a partir de la divulgación de A, B y C; D, E y F; y la combinación de ejemplo A-D. Este concepto se aplica a todos los aspectos de la presente solicitud, incluidos los elementos de una composición de materia y las etapas del método de fabricación o uso de las composiciones.
Los aspectos anteriores de la invención, tal y como los reconoce el experto habitual en la materia siguiendo las enseñanzas de la memoria descriptiva, pueden reivindicarse en cualquier combinación o permutación en la medida en que sean novedosos y no obvios con respecto al estado de la técnica anterior; por lo tanto, en la medida en que un elemento se describa en una o más referencias conocidas por el experto habitual en la materia, pueden excluirse de la invención reivindicada mediante, inter alia, una condición negativa o una renuncia de la característica o combinación de características.

Claims (25)

R E IV IN D IC A C IO N E S
1. Un compuesto, o sal del mismo, de fórmula (II):
Figure imgf000195_0001
cada uno de R y R' es, independientemente, alquilo Ci-8; y
R2 se selecciona entre alquilo C6-20 y alquenilo C15-19;
Figure imgf000195_0002
2. El compuesto, o sal del mismo, de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto es de fórmula (III):
Figure imgf000196_0001
3. El compuesto, o sal del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde R2 se selecciona entre:
Figure imgf000196_0002
4. El compuesto, o sal del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el compuesto es de fórmula
Figure imgf000196_0003
5. El compuesto, o sal del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde R3 se selecciona entre:
Figure imgf000197_0001
Figure imgf000198_0001
Figure imgf000199_0001
6. El compuesto, o sal del mismo, de una cualquiera de las
Figure imgf000199_0002
:
Figure imgf000199_0003
Figure imgf000199_0004
7. El compuesto, o sal del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde R1 es
Figure imgf000199_0005
O
8. Una composición lipídica que comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
9. La composición lipídica de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende además un agente biológicamente activo.
10. La composición lipídica de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el agente biológicamente activo es un ARNm.
11. La composición lipídica de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la composición lipídica comprende dioctanoato de 2-(10-dodecil-3-etil-8,14-dioxo-7,9,13-trioxa-3-azaoctadecan-18-il)propano-1,3-diílo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y un ARNm.
12. La composición lipídica de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la composición lipídica comprende heptadecan-9-il succinato de (13Z,16Z)-4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)docosa-13,16-dien-1-ilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y un ARNm.
13. La composición lipídica de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la composición lipídica comprende decanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-5-octiltridecilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y un ARNm.
14. La composición lipídica de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la composición lipídica comprende bis(octadeca-9,12-dienoato) de (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y un ARNm.
15. La composición lipídica de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la composición lipídica comprende un compuesto bis(octadeca-9,12-dienoato) de (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((2-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)tetradecanoil)oxi)propano-1,3-diílo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y un ARNm.
16. La composición lipídica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, en donde la composición lipídica está en forma de una nanopartícula lipídica.
17. Una composición farmacéutica que comprende una composición lipídica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 16, y uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
18. La composición de la reivindicación 17, en donde la composición comprende una molécula de ARN que codifica un inmunógeno, opcionalmente en donde el ARN es un ARN autorreplicante.
19. La composición de la reivindicación 18, en donde el inmunógeno puede suscitar una respuesta inmunitaria in vivo contra una bacteria, un virus, un hongo o un parásito.
20. Una composición de acuerdo con la reivindicación 18, para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria a un inmunógeno en un vertebrado que comprende administrar una cantidad eficaz de la composición al vertebrado.
21. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1:
Figure imgf000200_0001
dioctanoato de 2-(10-dodecil-3-etil-8,14-dioxo-7,9,13-trioxa-3-azaoctadecan-18-il)propano-1,3-diílo,
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
22. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1:
Figure imgf000200_0002
heptadecan-9-il succinato de (13Z,16Z)-4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)docosa-13,16-dien-1-ilo,
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
23. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1:
Figure imgf000200_0003
decanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-5-octiltridecilo,
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
24. Un compuesto:
Figure imgf000201_0001
(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((4-(((3-
(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
25. Un compuesto:
Figure imgf000201_0002
bis(octadeca-9,12-dienoato) de (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((2-(((3-(dimetNammo)propoxi)carbonil)oxi)tetradecanoil)oxi)propano-1,3-diílo,
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
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