TW202322826A - 用於純化多核糖核苷酸之組成物及方法 - Google Patents

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Abstract

本揭露關於用於分離和/或純化多核糖核苷酸的組成物和方法。該多核糖核苷酸可從多核糖核苷酸與寡核苷酸的混合物中分離出來，並可作為治療劑使用，該寡核苷酸與多核糖核苷酸的靶區域雜交。

Description

用於純化多核糖核苷酸之組成物及方法
多核糖核苷酸可用於多種治療和工程應用。因此，用於分離和純化多核糖核苷酸的新型組成物和方法係有用的。
在一方面，本發明之特徵在於從多種多核糖核苷酸中分離具有靶區域的多核糖核苷酸之方法。在此方法中，提供了包含該多種多核糖核苷酸的樣本。樣本中該多種多核糖核苷酸的子集具有靶區域。該方法進一步包括使樣本與和靶區域雜交的寡核苷酸接觸，並從樣本中的多種多核糖核苷酸中分離具有與寡核苷酸雜交的靶區域的多核糖核苷酸。
在另一方面，本發明之特徵在於從包含線性多核糖核苷酸和環狀多核糖核苷酸混合物的多種多核糖核苷酸中分離具有靶區域的線性多核糖核苷酸之方法。在此方法中，提供了包含該多種多核糖核苷酸的樣本。樣本中該多種線性多核糖核苷酸的子集具有靶區域。該方法進一步包括使樣本與和靶區域雜交的寡核苷酸接觸，並從樣本中的多種多核糖核苷酸中分離具有與寡核苷酸雜交的靶區域的線性多核糖核苷酸。在一些實施方式中，具有靶區域的多核糖核苷酸缺乏polyA序列（即，polyA尾）。在一些實施方式中，靶區域不位於具有該靶區域的多核糖核苷酸的3'或5'末端。環狀多核糖核苷酸或其子集可能沒有靶區域。
在另一方面，本發明之特徵在於從多種多核糖核苷酸中分離具有靶區域的多核糖核苷酸之方法。該方法包括提供包含該多種多核糖核苷酸的樣本，其中該多種多核糖核苷酸的子集具有該靶區域。該靶區域不位於具有該靶區域的多核糖核苷酸的3’或5’末端（即，該靶區域位於多核糖核苷酸內部）。該方法進一步包括使樣本與和靶區域雜交的寡核苷酸接觸，並從樣本中的多種多核糖核苷酸中分離具有與寡核苷酸雜交的靶區域的多核糖核苷酸。
在另一方面，本發明之特徵在於將具有靶區域的線性多核糖核苷酸與具有該靶區域的多種環狀多核糖核苷酸分離之方法。該方法包括提供包含該多種多核糖核苷酸的樣本。該方法進一步包括使樣本與寡核苷酸接觸。該寡核苷酸以第一結合親和力與線性多核糖核苷酸的靶區域雜交，並且該寡核苷酸以不同於第一結合親和力的第二結合親和力與環狀多核苷酸的靶區域雜交，並將具有與寡核苷酸雜交的靶區域的線性多核糖核苷酸與樣本中的多種環狀多核糖核苷酸分離。在一些實施方式中，第一結合親和力小於第二結合親和力，並且寡核苷酸優先與線性多核糖核苷酸結合。
在另一方面，本發明之特徵在於將具有靶區域的第一構象的多核糖核苷酸與具有該靶區域的第二構象的多種多核糖核苷酸分離之方法。該方法包括提供包含該多種多核糖核苷酸的樣本。該方法進一步包括使樣本與寡核苷酸接觸。寡核苷酸以第一結合親和力與第一構象的多核苷酸的靶區域雜交，並且該寡核苷酸以不同於第一結合親和力的第二結合親和力與第二構象的多核苷酸的靶區域雜交，並將具有與寡核苷酸雜交的靶區域的第一構象的多核糖核苷酸與樣本中第二構象的多種多核糖核苷酸分離。在一些實施方式中，第一結合親和力小於第二結合親和力，並且寡核苷酸優先與第一構象的多核糖核苷酸結合。
在本文所述任何方面的一些實施方式中，分離包括將寡核苷酸固定。
在本文所述任何方法的一些實施方式中，靶區域不位於具有靶區域的多核糖核苷酸的5’或3’末端。例如，靶區域可以位於多核糖核苷酸內部。在一些實施方式中，靶區域不位於多核糖核苷酸的3’末端。
在本文所述任何方法的一些實施方式中，靶區域位於多核糖核苷酸的5’或3’末端，並且靶區域不含polyA序列。在一些實施方式中，靶區域位於多核糖核苷酸的3’末端並且不含polyA序列。
在本文所述任何方法的一些實施方式中，靶區域不含polyA序列。
在以上任何方面的一些實施方式中，寡核苷酸與顆粒軛合。顆粒可以是例如磁性顆粒或珠。珠可以是例如交聯瓊脂糖（例如，SEPHAROSE®）珠。
在以上任何方面的一些實施方式中，寡核苷酸與第一捕獲劑軛合。
在一些實施方式中，寡核苷酸藉由化學連接子（linker）與第一捕獲劑或顆粒軛合。化學連接子可以包括，例如三乙二醇。在一些實施方式中，化學連接子與寡核苷酸的3’端或5’端軛合。
在一些實施方式中，第一捕獲劑包括抗原（例如，生物素）。
在一些實施方式中，該方法進一步包括使樣本與和第一捕獲劑結合的第二捕獲劑接觸。第二捕獲劑可以包括，例如抗體或其抗原結合片段（例如，鏈黴親和素）。
在一些實施方式中，第二捕獲劑與顆粒軛合。顆粒可以是例如磁性顆粒或珠。珠可以是例如交聯瓊脂糖（例如，SEPHAROSE®）珠。在一些實施方式中，第二捕獲劑藉由化學連接子與顆粒軛合。化學連接子可以包括，例如三乙二醇。
在一些實施方式中，具有靶區域的多核糖核苷酸包括內含子或其部分（例如，半內含子（half-intron））。靶區域可以包括內含子或其部分。在一些實施方式中，內含子或其部分係催化內含子（例如，I型催化內含子或II型催化內含子）或其部分。在一些實施方式中，內含子或其部分的長度為至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個或至少100個核苷酸。在一些實施方式中，內含子或其部分的長度為20個至500個、20個至400個、20個至300個、20個至200個、20個至100個、50個至500個、50個至400個、50個至300個、50個至200個、100個至500個、100個至400個、100個至300個或100個至200個核苷酸。
在一些實施方式中，靶區域包括半內含子（例如，催化內含子的5’或3’部分）。在一些實施方式中，靶區域包括5’半內含子（例如，對應於催化內含子5’部分的5’半內含子）。在一些實施方式中，靶區域包括3’半內含子（例如，對應於催化內含子3’部分的3’半內含子）。在一些實施方式中，靶區域包括I型催化內含子的5’一半。在一些實施方式中，I型催化內含子的5’一半來自藍細菌魚腥藻屬前tRNA-Leu基因、四膜蟲（Tetrahymena）前rRNA、T4噬菌體td基因或其變體的5’部分。在一些實施方式中，靶區域包括I型催化內含子的3’一半。在一些實施方式中，I型催化內含子的3’一半選自來自藍細菌魚腥藻屬前tRNA-Leu基因、四膜蟲前rRNA、T4噬菌體td基因或其變體的3’部分。
靶區域可以位於內含子或其部分的5’或3’，或可以包括位於內含子或其部分5’或3’的區域的部分。
在一些實施方式中，該方法包括將剪接的多核糖核苷酸與非剪接或部分剪接的多核糖核苷酸分離。在一些實施方式中，剪接的多核糖核苷酸係環狀多核糖核苷酸。在一些實施方式中，剪接的多核糖核苷酸係線性多核糖核苷酸。在一些實施方式中，剪接的多核糖核苷酸缺乏內含子或其部分（例如，剪接的多核糖核苷酸缺乏催化內含子，比如I型催化內含子或其部分）。
在一些實施方式中，該方法富集了相對於樣本至少10%（例如，至少20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或更多）的量的剪接的多核糖核苷酸。
在一些實施方式中，具有內含子或其部分的多核糖核苷酸係線性多核糖核苷酸。
在一些實施方式中，寡核苷酸的長度為至少5個核苷酸（例如，至少6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個或更多個核苷酸）。在一些實施方式中，寡核苷酸的長度為，例如5-100個、5-95個、10-90個、10-80個、12-60個、15-50個、15-40個、15-30個、18-30個、20-25或20-22個核苷酸。在一些實施方式中，寡核苷酸的長度為23個核苷酸。
在一些實施方式中，寡核苷酸可以具有以下的解鏈溫度（Tm）：例如約45°C至約75°C，例如約46°C、47°C、48°C、49°C、50°C、51°C、52°C、53°C、54°C、55°C、56°C、57°C、58°C、59°C、60°C、61°C、62°C、63°C、64°C、65°C、66°C、67°C、68°C、69°C、70°C、71°C、72°C、73°C、74°C或75°C。在一些實施方式中，寡核苷酸具有約45°C至約65°C的Tm。
在一些實施方式中，該方法進一步包括以下步驟：將具有靶區域的捕獲的多核糖核苷酸洗滌（例如，接觸後和/或分離步驟後）一次或多次（例如，兩次、三次、四次、五次或更多次）。在一些實施方式中，該方法進一步包括將第一和/或第二捕獲劑洗滌一次或多次（例如，兩次、三次、四次、五次或更多次）。
在一些實施方式中，該方法進一步包括進行第一洗脫步驟以釋放捕獲的具有靶區域的多核糖核苷酸的步驟。第一洗脫步驟可以包括，例如添加第一緩衝劑和/或將樣本加熱至例如至少50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C、80°C或更高。
在一些實施方式中，該方法進一步包括進行第二洗脫步驟。第二洗脫步驟可以包括添加第二緩衝劑和/或將樣本加熱至例如至少50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C、80°C或更高。在一些實施方式中，第二緩衝劑包括變性劑，例如甲醯胺或尿素。第二緩衝劑可以包括，例如約40%至約60%的甲醯胺（例如，約40%、45%、50%、55%或60%的甲醯胺）。
在一些實施方式中，該方法包括將樣本與寡核苷酸（例如，與第一捕獲劑軛合的寡核苷酸）一起孵育至少十分鐘（例如，至少20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、60分鐘、70分鐘、80分鐘、90分鐘、100分鐘、110分鐘、120分鐘或更長）。
在一些實施方式中，該方法包括收集未被寡核苷酸結合的樣本部分。在一些實施方式中，該方法包括收集未被捕獲劑（例如，第一和/或第二捕獲劑）結合的樣本部分。
在一些實施方式中，該方法包括提供多種寡核苷酸，其中每種寡核苷酸都與不同的靶區域雜交。在一些實施方式中，每種寡核苷酸都與第一捕獲劑軛合。
在一些實施方式中，該方法包括提供與多個靶區域雜交的寡核苷酸。在一些實施方式中，該方法包括提供與3’半內含子和5’半內含子雜交的單寡核苷酸。
在一些實施方式中，該方法包括提供與3’半內含子雜交的第一寡核苷酸以及與5’半內含子雜交的第二寡核苷酸。在一些實施方式中，該方法包括提供多種寡核苷酸，每種寡核苷酸都與3’半內含子和/或5’半內含子上的不同區域雜交。
在一些實施方式中，寡核苷酸與靶區域的等長部分具有至少80%（例如，至少85%、90%、95%、97%、99%或100%）互補性。
在一些實施方式中，該方法包括提供與多核糖核苷酸的莫耳比為10 : 1至1 : 10（例如，10 : 1、5 : 1、2 : 1、1 : 2、1 : 5或1 : 10）的寡核苷酸。
在另一方面，本發明之特徵在於藉由本文所述之任何實施方式之方法產生的多核糖核苷酸群體。該群體可以包括例如缺乏靶區域的環狀多核糖核苷酸，並且該環狀多核糖核苷酸包括組成物中總多核糖核苷酸的至少1%（例如，至少5%，例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、99%或更多）（mol/mol）。
在一些實施方式中，該群體具有少於50%（例如，少於40%、30%、20%、10%、5%、4%、3%、2%或1%）（mol/mol）的線性多核糖核苷酸。
在另一方面，本發明之特徵在於包括多核糖核苷酸混合物的組成物。該混合物的第一子集包括缺乏靶區域的環狀多核糖核苷酸，並且該多種多核糖核苷酸的第二子集包括具有靶區域的線性多核糖核苷酸。第一子集包括組成物中總多核糖核苷酸的至少1%（例如，至少5%，例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、99%或更多）（mol/mol）。
在另一方面，本發明之特徵在於包括具有靶區域的多核糖核苷酸以及配置為與該靶區域雜交的寡核苷酸的組成物，其中該寡核苷酸與第一捕獲劑（例如抗原，比如生物素）軛合。該組成物可進一步包含例如缺乏靶區域的多核糖核苷酸。缺乏靶區域的多核糖核苷酸可以是，例如環狀多核糖核苷酸。該組成物可以進一步包括配置為與第一捕獲劑結合的第二捕獲劑（例如抗體或其抗原結合片段，比如鏈黴親和素）。第二捕獲劑可以與顆粒軛合。
在一些實施方式中，藉由如本文所述之方法產生該組成物。
在如本文所述之任何組成物的一些實施方式中，線性多核糖核苷酸包括內含子或其部分。靶區域可以包括內含子或其部分。靶區域可以位於內含子或其部分的5’或3’。
在以上任何方面的一些實施方式中，多核糖核苷酸和/或寡核苷酸可以是經修飾的。
在另一方面，本發明之特徵在於包括如本文所述之組成物（例如，藉由如上所述之方法產生的組成物）以及稀釋劑、載劑或賦形劑的藥物組成物。 定義
為了促進對本揭露的理解，下面定義了多個術語。本文定義的術語具有如與本揭露相關的領域中的普通技術人員通常理解的含義。術語比如「一個/種（a、an）」和「該」並不旨在僅指單個實體，而是包括可以使用特定實例來說明的一般類別。術語「或」用於意指「和/或」，除非明確指出僅指替代物或者替代物相互排斥，儘管本揭露支持僅指替代物和「和/或」的定義。本文的術語用於描述特定實施方式，但它們的使用不應被視為限制，除非在請求項中列出。
如本文所用，在值的範圍內提供的任何值都包括上限和下限、以及該上限和下限內含有的任何值。
如本文所用，術語「約」係指列舉值的 ± 10%內的值。
如本文所用，術語「載劑」係藉由對環狀多核糖核苷酸的共價修飾、經由部分或完全包封劑或者它們的組合促進組成物（例如，環狀多核糖核苷酸）轉運或遞送到細胞中的化合物、組成物、試劑或分子。載劑的非限制性實例包括碳水化合物載劑（例如，經酸酐修飾的植物糖原或糖原型材料）、奈米顆粒（例如，包封或共價連接結合至環狀多核糖核苷酸的奈米顆粒）、脂質體、融合體、離體分化的網織紅血球、外泌體、蛋白質載劑（例如，共價連接至環狀多核糖核苷酸的蛋白質）或陽離子載劑（例如，陽離子脂質聚合物或轉染試劑）。
如本文所用，術語「環狀多核糖核苷酸」、「環狀RNA」和「circRNA」可互換使用，並且意指具有無游離端（即，無游離3'或5'端）的結構的多核糖核苷酸分子，例如藉由共價或非共價鍵形成環狀或無端結構的多核糖核苷酸分子。環狀多核糖核苷酸可以是例如共價閉合的多核糖核苷酸。
如本文所用，術語「疾病」、「障礙」和「病症」均指亞健康狀態，例如由或通常將由醫療專業人員診斷或治療的狀態。
「異源」意指發生在與天然存在的（天然的）背景不同的背景中。「異源」多核苷酸序列指示多核苷酸序列以在該序列的天然基因組中發現的方式不同的方式使用。例如，「異源啟動子」用於驅動序列的轉錄，該序列不是由該啟動子天然轉錄的序列；因此，「異源啟動子」序列通常藉由重組核酸技術包括在表現構建體中。術語「異源」也用於指被置於與另一序列的非天然存在的關係中的給定序列；例如，異源編碼或非編碼核苷酸序列通常藉由基因組轉化技術被插入基因組中，產生經基因修飾的基因組或重組基因組。
如本文所用，術語「半內含子」係指內含子的部分，其中第一半內含子和第二半內含子一起形成內含子，比如催化內含子。半內含子可以是內含子的5’部分（例如，催化內含子的5’部分）或內含子的3’部分（例如，催化內含子的3’部分），這樣5’半內含子和3’半內含子一起形成功能性內含子，比如能夠催化自剪接的功能性內含子。術語半內含子意指內含子分成的兩個部分。術語半內含子並非意在指出、暗示或表明這兩個部分或兩半長度相等。術語半內含子與術語斷裂內含子同義使用，並且可以代替術語「內含子片段」使用。
如本文所用，術語「雜質」係存在於組成物（例如，如本文所述之藥物組成物）中的不需要的物質。在一些實施方式中，雜質係製程相關雜質。在一些實施方式中，雜質係最終組成物中除期望產物之外，例如除如本文所述之活性藥物成分（例如，環狀多核糖核苷酸）之外的產物相關物質。如本文所用，術語「製程相關雜質」係在最終的組成物、製劑或產物中，除本文所述之線性多核糖核苷酸外，在組成物、製劑或產物的製造中使用、存在或生成的不需要的物質。在一些實施方式中，製程相關雜質係在多核糖核苷酸的合成或環化中使用的酶。如本文所用，術語「產物相關物質」係在組成物、製劑、或產物或其任何中間體的合成期間產生的物質或副產物。在一些實施方式中，產物相關物質係去氧核糖核苷酸片段。在一些實施方式中，產物相關物質係去氧核糖核苷酸單體。在一些實施方式中，產物相關物質係以下的一種或多種：本文所述之多核糖核苷酸的衍生物或片段，例如10、9、8、7、6、5或4個核糖核酸、單核糖核酸、二核糖核酸或三核糖核酸的片段。
如本文所用，「增加受試者的適應度」或「促進受試者的適應度」係指由於投與本文所述之肽或多肽而產生的生理學上或受試生物進行的任何活動的任何有利的改變，包括但不限於以下希望效果中的任何一種或多種：(1) 對生物或非生物脅迫的耐受性提高；(2) 產率或生物量提高；(3) 開花時間調整；(4) 對有害生物或病原體的抗性提高；(4) 對除草劑的抗性提高；(5) 受試生物群體（例如，農業上重要的昆蟲）增加；(6) 受試生物（例如昆蟲，例如蜂或蠶）的繁殖速率提高；(7) 受試生物（例如昆蟲，例如蜂或蠶）的活動能力增強；(8) 受試生物（例如昆蟲，例如蜂或蠶）的體重增加；(9) 受試生物（例如昆蟲，例如蜂或蠶）的代謝速率或活性提高；(10) 授粉（例如，被授粉植物的數量）增加；(11) 受試生物（例如昆蟲，例如蜂或蠶）副產物（例如，來自蜜蜂的蜂蜜或來自蠶的蠶絲）的產量提高；(12) 受試生物（例如，昆蟲）的營養物（例如，蛋白質、脂肪酸或胺基酸）含量提高；(13) 受試生物對殺有害生物劑（例如，新菸鹼（例如，吡蟲啉）或有機磷殺昆蟲劑（例如硫代磷酸酯，例如殺螟松））的抗性提高；或 (14) 受試生物（比如，人或非人動物）的健康狀況改善或疾病減少。相比於未投與調節劑的受試生物，可以確定宿主適應度的提高。相反地，「降低受試者的適應度」係指由於投與本文所述之肽或多肽而產生的生理學的或受試生物進行的任何活動的任何不利的改變，包括但不限於以下預期效果中的任何一種或多種：(1) 對生物或非生物脅迫的耐受性降低；(2) 產率或生物量降低；(3) 開花時間調整；(4) 對有害生物或病原體的抗性降低；(4) 對除草劑的抗性降低；(5) 受試生物群體（例如，農業上重要的昆蟲）減少；(6) 受試生物（例如昆蟲，例如蜂或蠶）的繁殖速率降低；(7) 受試生物（例如昆蟲，例如蜂或蠶）的活動能力減弱；(8) 受試生物（例如昆蟲，例如蜂或蠶）的體重減輕；(9) 受試生物（例如昆蟲，例如蜂或蠶）的代謝速率或活性降低；(10) 藉由受試生物（例如昆蟲，例如蜂或蠶）進行的授粉（例如，在給定時間內被授粉的植物數量）減少；(11) 受試生物（例如昆蟲，例如蜂或蠶）副產物（例如，來自蜜蜂的蜂蜜或來自蠶的蠶絲）的產量降低；(12) 受試生物（例如，昆蟲）的營養物（例如，蛋白質、脂肪酸或胺基酸）含量降低；(13) 受試生物對殺有害生物劑（例如，新菸鹼（例如，吡蟲啉）或有機磷殺昆蟲劑（例如硫代磷酸酯，例如殺螟松））的抗性降低；或 (14) 受試生物（比如，人或非人動物）的健康狀況下降或疾病減少。相比於未投與調節劑的受試生物，可以確定宿主適應度的降低。對熟悉該項技術者而言將顯而易見的是，受試者的生理學、表型、或活性的某些變化（例如，植物開花時間的調整）可以被認為提高該受試者的適應度或降低該受試者的適應度，這取決於背景（例如，以適應氣候或其他環境條件的變化）。例如，開花時間的延遲（例如，在給定日曆日期開花的群體中的植物減少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%）可以是對較晚或較涼的春季的有益適應，並因此被認為會提高植物的適應度；相反，在較早或較暖的春季背景下，相同的開花時間的延遲可以被認為會降低植物的適應度。
如本文所用，術語「線性多核糖核苷酸」、「線性RNA」和「線性多核糖核苷酸分子」可互換使用，並且意指具有5'和3’端的多核糖核苷酸分子。5'和3’端中的一者或兩者可以是游離端或與另一部分連接。線性多核糖核苷酸可以是未經歷環化的（例如，係環化前的）多核糖核苷酸，並且可用作藉由例如夾板連接、或化學、酶促、核酶催化或剪接催化的環化方法進行環化的起始材料。
如本文所用，術語「經修飾的寡核苷酸」意指含有具有針對糖、核鹼基或核苷酸間鍵的至少一種修飾的核苷酸的寡核苷酸。
如本文所用，術語「經修飾的核糖核苷酸」意指含有具有針對糖、核鹼基或核苷間鍵的至少一種修飾的核苷的核糖核苷酸。
如本文所用，術語「裸遞送」係用於在不借助載劑並且不對有助於遞送到細胞的部分進行共價修飾的情況下遞送到細胞的配製物。裸遞送配製物不含任何轉染試劑、陽離子載劑、碳水化合物載劑、奈米顆粒載劑或蛋白質載劑。例如，環狀多核糖核苷酸的裸遞送配製物係包含無共價修飾的環狀多核糖核苷酸並且不含載劑的配製物。
如本文所用，術語「經切口的RNA」或「經切口的線性多核糖核苷酸」或「經切口的線性多核糖核苷酸分子」可互換使用，並且意指由於環狀RNA切口或降解而產生的具有5'和3’端的多核糖核苷酸分子。「經切口的環狀RNA」意指被切口的環狀RNA。
如本文所用，術語「視需要取代的X」旨在等同於「X，其中X被視需要取代」（例如「烷基，其中所述烷基被視需要取代」）。並不旨在意指特徵「X」（例如，烷基）本身係視需要的。如本文所用，術語「視需要取代的」係指具有0個、1個或更多個取代基（例如，0-25個、0-20個、0-10個或0-5個取代基）。例如，C 1烷基基團（即，甲基）可以被側氧基取代而形成甲醯基並且進一步被-OH或-NH 2取代而形成羧基或胺基。
術語「藥物組成物」旨在同樣揭露包括在藥物組成物中的環狀或線性多核糖核苷酸可用於藉由療法治療人體或動物體。
如本文所用，術語「多核苷酸」意指包括一個或多個核酸亞基或核苷酸的分子，並且可以與「核酸」或「寡核苷酸」互換使用。多核苷酸可以包括一個或多個選自腺苷（A）、胞嘧啶（C）、鳥嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和尿嘧啶（U）或它們的變體的核苷酸。核苷酸可以包括核苷和至少1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多個磷酸（PO 3）基團。核苷酸可以包括核鹼基、五碳糖（核糖或去氧核糖）以及一個或多個磷酸基團。核糖核苷酸係其中糖為核糖的核苷酸。多核糖核苷酸、核糖核酸或RNA可以指包括藉由磷酸二酯鍵的方式聚合的多個核糖核苷酸的大分子。去氧核糖核苷酸係其中糖係去氧核糖的核苷酸。
如本文所用，本文的術語「多核糖核苷酸負載物」包括包含至少一個多核糖核苷酸的任何序列。在實施方式中，多核糖核苷酸負載物包括一個或多個表現（或編碼）序列，其中每個表現（或編碼）序列編碼多肽。在實施方式中，多核糖核苷酸負載物包括一個或多個非編碼序列，如具有調節或催化功能的多核糖核苷酸。在實施方式中，多核糖核苷酸負載物包括表現序列和非編碼序列的組合。在實施方式中，多核糖核苷酸負載物包括本文所述之一個或多個多核糖核苷酸序列，諸如一個或多個調節元件、內部核糖體進入位點（IRES）元件或間隔子序列。
如本文可互換使用，術語「polyA」和「polyA序列」係指核酸分子的長度為至少5個核苷酸並且由腺苷殘基組成的非翻譯連續區域。在一些實施方式中，polyA序列的長度為至少10個、至少15個、至少20個、至少30個、至少40個或至少50個核苷酸。在一些實施方式中，polyA序列位於開放閱讀框（例如，編碼多肽的開放閱讀框）的3’（例如，開放閱讀框下游），並且該polyA序列位於終止元件（例如，終止密碼子）的3’，使得該polyA不被翻譯。在一些實施方式中，polyA序列位於終止元件和3’非翻譯區的3’。
如本文所用，如果核酸的元件位於載體上，使得它們可以被轉錄而形成線性多核糖核苷酸，然後可以使用本文提供之方法將該線性多核糖核苷酸環化成環狀多核糖核苷酸，則該等元件係「可操作地相連的（operably connected）」或「可操作地連接的（operably linked）」。
多去氧核糖核苷酸、去氧核糖核酸和DNA意指包括經由磷酸二酯鍵聚合的多個去氧核糖核苷酸的大分子。核苷酸可以是核苷一磷酸或核苷多磷酸。核苷酸意指包括可檢測標籤（如發光標籤）或標誌物（例如，螢光團）的去氧核糖核苷多磷酸，如例如去氧核糖核苷三磷酸（dNTP），其可以選自去氧腺苷三磷酸（dATP）、去氧胞苷三磷酸（dCTP）、去氧鳥苷三磷酸（dGTP）、尿苷三磷酸（dUTP）和去氧胸苷三磷酸（dTTP）dNTP。核苷酸可以包括可以摻入正在生長的核酸股中的任何亞基。這種亞基可以是A、C、G、T或U，或對一個或多個互補A、C、G、T或U有特異性或與嘌呤（即，A或G或其變體）或嘧啶（即，C、T或U或其變體）互補的任何其他亞基。在一些實例中，多核苷酸係去氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）或其衍生物或變體。在一些情況下，多核苷酸係短干擾RNA（siRNA）、微RNA（miRNA）、質體DNA（pDNA）、短髮夾RNA（shRNA）、小核RNA（snRNA）、信使RNA（mRNA）、先質mRNA（pre-mRNA）、反義RNA（asRNA）（僅舉幾例），並且包括核苷酸序列及其任何結構實施方式，諸如單股、雙股、三股、螺旋、髮夾等。在一些情況下，多核苷酸分子係環狀的。多核苷酸可以具有各種長度。核酸分子的長度可以為至少約10個鹼基、20個鹼基、30個鹼基、40個鹼基、50個鹼基、100個鹼基、200個鹼基、300個鹼基、400個鹼基、500個鹼基、1千鹼基（kb）、2 kb、3 kb、4 kb、5 kb、10 kb、50 kb或更長。可以從細胞或組織中分離多核苷酸。多核苷酸的實施方式包括分離和純化的DNA/RNA分子、合成的DNA/RNA分子以及合成的DNA/RNA類似物。
多核苷酸（例如，多核糖核苷酸或多去氧核糖核苷酸）的實施方式包括含有一個或多個核苷酸變體（包括非標準核苷酸、非天然核苷酸、核苷酸類似物或經修飾的核苷酸）的多核苷酸。經修飾的核苷酸的實例包括但不限於二胺基嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙醯胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基胺基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基胺基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基辨苷（galactosylqueosine）、肌苷、N6-異戊烯腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基胺基甲基尿嘧啶、5-甲氧基胺基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辮苷（mannosylqueosine）、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-D46-異戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸（v）、懷丁苷（butoxosine）、假尿嘧啶、辮苷（queosine）、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸（v）、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-胺基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2,6-二胺基嘌呤等。在一些情況下，核苷酸在其磷酸部分中包括修飾，這包括對三磷酸部分的修飾。此類修飾的非限制性實例包括長度更長的磷酸鏈（例如，具有4、5、6、7、8、9、10個或更多個磷酸部分的磷酸鏈）和帶有硫醇部分（例如，α-硫代三磷酸酯和β-硫代三磷酸酯）的修飾。在實施方式中，核酸分子在鹼基部分（例如，在通常可用於與互補核苷酸形成氫鍵的一個或多個原子處或者在通常不能與互補核苷酸形成氫鍵的一個或多個原子處）、糖部分或磷酸酯主鏈處被修飾。在實施方式中，核酸分子含有胺修飾的基團，比如胺基烯丙基1-dUTP（aa-dUTP）和胺基己基丙烯醯胺-dCTP（aha-dCTP），以允許共價附接胺反應性部分，比如N-羥基琥珀醯亞胺酯（NHS）。本揭露的寡核苷酸中標準DNA鹼基對或RNA鹼基對的替代物可以提供更高的密度（以位/立方毫米計）、更高的安全性（抗天然毒素的偶然或有目的合成）、更容易辨別光程式性聚合酶（photo-programmed polymerases）或較低的二級結構。在Betz K, Malyshev DA, Lavergne T, Welte W, Diederichs K, Dwyer TJ, Ordoukhanian P, Romesberg FE, Marx A. Nat. Chem. Biol. [自然化學生物學] 2012; 8:612-4中描述了與用於從頭或擴增合成的天然和突變體聚合酶相容的此類替代性鹼基對，該文獻出於所有目的藉由引用併入本文。
如本文所用，「多肽」意指最常藉由肽鍵連接在一起的胺基酸殘基（天然或非天然）的聚合物。如本文所用，該術語係指任何大小、結構或功能的蛋白質、多肽和肽。多肽可以包括基因產物、天然存在的多肽、合成的多肽、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段以及前述物質的其他等同物、變體和類似物。多肽可以是單分子或多分子複合物，如二聚體、三聚體或四聚體。它們還可以包括單鏈或多鏈多肽（如抗體或胰島素），並且可以是締合的或連接的。最常見的二硫鍵存在於多鏈多肽中。術語多肽也可以應用於其中一個或多個胺基酸殘基係對應的天然存在的胺基酸的人工化學類似物的胺基酸聚合物。
如本文所用，術語「植物修飾多肽」係指可以以使得植物生理學或表型發生變化（例如，植物適應度增加或降低）的方式改變植物的遺傳特性（例如，增加基因表現、降低基因表現或者以其他方式改變DNA或RNA的核苷酸序列）、表觀遺傳特性或者生物化學或生理學特性的多肽。
如本文所用，術語「純化（purify、purifying和purification）」係指從含有環狀RNA和線性RNA以及其他物質的混合物的樣本中去除雜質（例如，製程相關雜質（例如，酶）、製程相關物質（例如，去氧核糖核苷酸片段、去氧核糖核苷酸單體））或副產物（例如，線性RNA）的一個或多個步驟或過程，以產生含有富集的環狀RNA群體的組成物，其中與原始混合物相比，雜質（例如製程相關雜質（例如，酶）、製程相關物質（例如，去氧核糖核苷酸片段、去氧核糖核苷酸單體））或副產物（例如，線性RNA）的水平降低，或相對於起始混合物，線性RNA或物質減少了按質量計的40%或更多（例如，50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、或99%或更多）。
如本文所用，術語「純的」和「純度」係指分析物（例如，環狀RNA）被分離出並且不含其他組分的程度。在核酸（例如，多核糖核苷酸）的背景下，分離的核酸（例如環狀RNA）的純度可以用不含任何污染物、雜質或副產物（例如線性RNA和其他物質）的核酸群體來表示。例如，環狀RNA群體的純度表示按分離材料的總質量計，該群體中有多少係環狀RNA，可以使用例如純的環狀RNA作為參考進行確定。本揭露中發現的純度水平可以為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、大於95%或大於99%（w/w）。在一些實施方式中，污染物或雜質或副產物的水平不超過約20%、15%、12%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%（w/w）。純度可以藉由以下方式確定：使用凝膠電泳、分光光度法（例如，賽默飛世爾科技公司（ThermoFisher Scientific）的NanoDrop）或適用於測量核酸群體的純度的其他技術檢測特定分析物（例如，環狀RNA）或特定雜質或副產物（例如，線性RNA）的水平，並計算分析物相對於總核酸含量（例如，如藉由本領域已知的測定確定的）的百分比（w/w）。
如本文所用，短語「基本上不含一種或多種雜質或副產物」係指樣本（比如含有富集的環狀RNA群體的樣本）不含一種或多種雜質或副產物（例如，本文揭露的一種或多種雜質或副產物）或含有最少量的一種或多種雜質或副產物的特性。最少量的一種或多種雜質或副產物可能不超過20%（w/w）（例如，不超過19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%（w/w）或更少）。在另一個實例中，如果一種或多種雜質或副產物以小於15%（w/w）（例如，不超過14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%（w/w）或更少）的量存在，則樣本或富集的環狀RNA群體基本上不含該一種或多種雜質或副產物。在另一個實例中，如果一種或多種雜質或副產物以小於10%（w/w）（例如，不超過9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%（w/w）或更少）的量存在，則樣本或富集的環狀RNA群體基本上不含該一種或多種雜質或副產物。在另一個實例中，如果一種或多種雜質或副產物以小於5%（w/w）（例如，不超過4%、3%、2%、1%（w/w）或更少）的量存在，則樣本或富集的環狀RNA群體基本上不含該一種或多種雜質或副產物。在又另一個實例中，如果一種或多種雜質或副產物以小於1%（不超過0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%（w/w）或更少）的量存在，則樣本或富集的環狀RNA群體基本上不含該一種或多種雜質或副產物。
如本文所用，「調節元件」係修飾環狀或線性多核糖核苷酸內表現序列的表現的部分，比如核酸序列。
如本文所用，「間隔子」係指在兩個相鄰多核苷酸區域之間提供距離或柔性的任何連續核苷酸序列（例如，一個或多個核苷酸的連續核苷酸序列）。
如本文所用，術語「序列同一性」係藉由使用全域或局部比對演算法對兩個肽或兩個核苷酸序列進行比對來確定的。當序列在最佳比對時（例如，當藉由程式（如GAP或BESTFIT）使用預設參數進行比對時）共用至少某個最小百分比的序列同一性時，該等序列被稱為「基本上相同的」或「基本上相似的」。GAP使用Needleman和Wunsch全域比對演算法在兩個序列的整個長度上對其進行比對，從而最大程度地增加了匹配數目並最大程度地減少了空位數目。通常，使用GAP預設參數，空位產生罰分 = 50（核苷酸）/8（蛋白質），空位延伸罰分 = 3（核苷酸）/2（蛋白質）。對於核苷酸，使用的預設評分矩陣係nwsgapdna，而對於蛋白質，預設評分矩陣係Blosum62（Henikoff和Henikoff, 1992, PNAS [美國科學院院報] 89, 915-19）。序列比對和百分比序列同一性的評分例如使用電腦程式來確定，該等電腦程式如從美國92121-3752加州聖地牙哥斯克蘭頓路9685號的阿賽樂德公司（Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA）獲得的GCG Wisconsin套裝軟體10.3版或EmbossWin 2.10.0版（使用程式「needle」）。替代性地或額外地，藉由例如使用如FASTA、BLAST等的演算法對數據庫進行搜索來確定同一性百分比。序列同一性係指在序列的整個長度上的序列同一性。
如本文所用，關於RNA的「結構化」係指由RNAFold軟體或類似預測工具預測與其自身或相同RNA分子中的其他序列形成結構（例如，髮夾環）的RNA序列。
如本文所用，術語「受試者」係指生物，比如動物、植物或微生物。在實施方式中，受試者係脊椎動物（例如，哺乳動物、鳥、魚、爬行動物或兩棲動物）。在實施方式中，受試者係人。在實施方式中，受試者係非人哺乳動物。在實施方式中，受試者係非人哺乳動物，諸如非人靈長類動物（例如猴、猿）、有蹄類動物（例如家牛、水牛、野牛、綿羊、山羊、豬、駱駝、美洲駝、羊駝、鹿、馬、驢）、肉食動物（例如狗、貓）、齧齒動物（例如大鼠、小鼠）或兔類動物（例如兔）。在實施方式中，受試者係鳥，諸如鳥類類群雞形目（例如雞、火雞、野雞、鵪鶉）、雁形目（例如鴨、鵝）、古顎下綱（例如鴕鳥、鴯鶓）、鴿形目（例如鴿子、野鴿）或鸚形目（例如鸚鵡）的成員。在實施方式中，受試者係無脊椎動物，比如節肢動物（例如，昆蟲、蛛形綱、甲殼類動物）、線蟲、環節動物、蠕蟲或軟體動物。在實施方式中，受試者係無脊椎動物農業有害生物或者寄生在無脊椎動物或脊椎動物宿主上的無脊椎動物。在實施方式中，受試者係植物，諸如被子植物（其可以是雙子葉植物或單子葉植物）或裸子植物（例如針葉樹、蘇鐵、買麻藤類植物、銀杏）、蕨類、馬尾植物、石鬆類或苔蘚植物。在實施方式中，受試者係真核藻類（單細胞或多細胞）。在實施方式中，受試者係具有農業或園藝重要性的植物，諸如行間作物、生產水果的植物和樹木、蔬菜、樹木以及觀賞植物（包括觀賞花、灌木、樹木、地被植物和草坪草）。
如本文所用，術語「治療（treat和treating）」係指對受試者的疾病或障礙（例如，感染性疾病、癌症、中毒、或過敏反應）進行預防性或治療性治療。治療的效果可以包括逆轉、減輕、降低疾病或者疾病或障礙的一種或多種症狀或表現的嚴重程度，治癒疾病或者疾病或障礙的一種或多種症狀或表現，抑制疾病或者疾病或障礙的一種或多種症狀或表現的進展，降低疾病或者疾病或障礙的一種或多種症狀或表現的復發的可能性，或者與沒有治療性治療的情況下疾病或障礙的狀態或病症相比，穩定（即，不惡化）疾病或障礙的狀態或者預防疾病或障礙的擴散。實施方式包括治療植物以控制由無脊椎動物有害生物或微生物（例如，細菌、真菌、卵菌、或病毒）病原體引起或與之相關的疾病或不利病症。實施方式包括治療植物以增加植物的先天防禦或免疫能力以耐受有害生物或病原體壓力。
如本文所用，「終止元件」係終止環狀或線性多核糖核苷酸中表現序列的翻譯的部分，比如核酸序列。
如本文所用，「翻譯效率」係從核糖核苷酸轉錄物產生蛋白質或肽的速率或量。在一些實施方式中，翻譯效率可以表示為給定量的編碼蛋白或肽的轉錄物產生的蛋白或肽的量，例如在給定的時間段內，例如在給定的翻譯系統（例如，無細胞的翻譯系統，像兔網織紅血球裂解物）中。
如本文所用，「翻譯起始序列」係在環狀或線性多核糖核苷酸中起始表現序列的翻譯的核酸序列。
如本文所用，「治療性多肽」係指當向受試者投與或在受試者中表現時提供一些治療性益處的多肽。在實施方式中，藉由向受試者投與治療性肽或藉由在受試者中表現治療性多肽，將治療性多肽用於治療或預防受試者的疾病、障礙、或病症。在替代性的實施方式中，使治療性多肽在細胞中表現，並且向受試者投與該細胞以提供治療性益處。
如本文所用，「載體」意指一段DNA，它係合成的（例如，使用PCR）或者取自病毒、質體或高等生物的細胞，可以或已經將外來DNA片段插入其中以用於選殖或表現目的。在一些實施方式中，載體可以穩定地維持在生物中。可選擇標誌物載體可以包括例如複製起點、可選擇標誌物或報告基因（諸如抗生素抗性或GFP）或多株位點（MCS）。該術語包括線性DNA片段（例如，PCR產物、線性化質體片段）、質體載體、病毒載體、黏質體、細菌人工染色體（BAC）、酵母人工染色體（YAC）等。在一個實施方式中，本文提供的載體包括多株位點（MCS）。在另一實施方式中，本文提供的載體不包括MCS。
如本文所用，術語「產率」係指純化步驟或製程後獲得的分析物（例如，環狀多核糖核苷酸的群體）與起始材料（例如，多核糖核苷酸的混合群體，比如例如，環狀和線性多核糖核苷酸）中分析物的量相比的相對量（w/w）。產率可以表示為百分比。在本揭露的背景下，可以使用測定（例如，凝膠電泳或分光光度法）對起始材料中分析物（例如，環狀多核糖核苷酸）和純化步驟後獲得的分析物的量進行測量。可以使用本揭露之方法產生相對於起始材料（例如，多核糖核苷酸的混合群體）中存在的量約20%（w/w）或更高的環狀多核糖核苷酸富集群體的產率。例如，可以使用該等方法產生以下產率的純化的環狀多核糖核苷酸：約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、65%、70%、75%、80%、85%、或90%（w/w）或更高。
本揭露描述了用於加工（例如，純化）核糖核苷酸的組成物和方法。多核糖核苷酸（比如線性或環狀多核糖核苷酸）可用於多種工程或治療目的。然而，當經由某些生物反應生成多核糖核苷酸時，可能存在多種雜質、副產物或不完全產物。本發明之特徵在於可用於從樣本中減少或去除該等雜質、副產物或不完全產物之方法，以便產生具有希望的多核糖核苷酸組成、量和/或純度的組成物，或含有多種具有希望的多核糖核苷酸組成、量和/或純度的多核糖核苷酸的群體。
在某些實施方式中，該等方法可用於純化已經經歷剪接反應的多核糖核苷酸。在這種實施方式中，該等方法可用於將剪接的多核糖核苷酸與非剪接的多核糖核苷酸分離，或將非剪接的多核糖核苷酸與剪接的多核糖核苷酸分離。在一些實施方式中，該等方法可用於將環狀多核糖核苷酸（例如，已被剪接的環狀多核糖核苷酸）與線性多核糖核苷酸分離，或將線性多核糖核苷酸與環狀多核糖核苷酸分離。此類含有所需多核糖核苷酸的純化的組成物可用於多種下游應用，比如將多核苷酸負載物（例如，編碼基因或蛋白質）遞送至靶細胞。以下更詳細地描述了該等組成物和方法。 方法
在一些實施方式中，本文所述之方法包括從多種多核糖核苷酸中分離具有靶區域的多核糖核苷酸。該方法包括提供包含該多種多核糖核苷酸的樣本。該多種多核糖核苷酸的子集具有靶區域。該方法進一步包括使樣本與和靶區域雜交的寡核苷酸接觸，並從樣本中的該多種多核糖核苷酸中分離具有與該寡核苷酸雜交的靶區域的多核糖核苷酸（ 圖 1）。
在一些實施方式中，本文所述之方法包括從包含線性多核糖核苷酸和環狀多核糖核苷酸的混合物的多種多核糖核苷酸中分離具有靶區域的線性多核糖核苷酸的步驟。在此方法中，提供了包含該多種多核糖核苷酸的樣本。樣本中該多種線性多核糖核苷酸的子集具有靶區域。該方法進一步包括使樣本與和靶區域雜交的寡核苷酸接觸，並從樣本中的該多種多核糖核苷酸中分離具有與該寡核苷酸雜交的靶區域的線性多核糖核苷酸的步驟。在一些實施方式中，具有靶區域的多核糖核苷酸缺乏polyA序列（例如，polyA尾）。在一些實施方式中，靶區域不位於具有該靶區域的多核糖核苷酸的3'或5'末端。環狀多核糖核苷酸或其子集可能沒有靶區域。
在一些實施方式中，本文所述之方法包括從多種多核糖核苷酸中分離具有靶區域的多核糖核苷酸的步驟。該方法包括提供包含該多種多核糖核苷酸的樣本，其中該多種多核糖核苷酸的子集具有該靶區域。靶區域不位於具有該靶區域的多核糖核苷酸的3’或5’末端（例如，靶區域位於多核糖核苷酸內部）。該方法進一步包括使樣本與和靶區域雜交的寡核苷酸接觸，並從樣本中的多種多核糖核苷酸中分離具有與寡核苷酸雜交的靶區域的多核糖核苷酸。
在一些實施方式中，本文所述之方法包括藉由與靶區域的差異結合親和力分離多核糖核苷酸。當靶結合區存在於差異二級結構元件（調節用於結合的靶位點的進入）內時，可以實現差異結合。例如，寡核苷酸能以第一親和力與第一結構構象的多核糖核苷酸的靶區域結合，並且以第二親和力（例如，其不同於第一親和力）與第二結構構象的多核糖核苷酸的靶區域結合。在一些實施方式中，當靶區域存在於線性或環狀多核糖核苷酸內，或存在於以兩種或更多種不同的結構構象存在的多核糖核苷酸內時，可能出現差異結合或二級結構元件。例如，寡核苷酸能以第一結合親和力與線性多核糖核苷酸的靶區域結合，並且以第二結合親和力與環狀多核糖核苷酸的靶區域結合。第一結合親和力可以大於第二結合親和力。替代性地，第一結合親和力可以小於第二結合親和力。較低的結合親和力使得寡核苷酸優先與靶標結合，例如優先於結合親和力更大的構象的靶標。
在一些實施方式中，本文所述之方法包括將具有靶區域的第一構象的多核糖核苷酸與具有該靶區域的第二構象的多種多核糖核苷酸分離。該方法包括提供包含該多種多核糖核苷酸的樣本。該方法進一步包括使樣本與寡核苷酸接觸。寡核苷酸以第一結合親和力與第一構象的多核苷酸的靶區域雜交，並且該寡核苷酸以不同於第一結合親和力的第二結合親和力與第二構象的多核苷酸的靶區域雜交，並將具有與寡核苷酸雜交的靶區域的第一構象的多核糖核苷酸與樣本中第二構象的多種多核糖核苷酸分離。在一些實施方式中，第一結合親和力小於第二結合親和力，並且寡核苷酸優先與第一構象的多核糖核苷酸結合。
在一些實施方式中，該方法包括使多核糖核苷酸與和顆粒（例如，有或沒有捕獲劑）軛合的寡核苷酸接觸的步驟。
在一些實施方式中，本文所述之方法包括將具有靶區域的線性多核糖核苷酸與具有該靶區域的多種環狀多核糖核苷酸分離的步驟。該方法包括提供包含該多種多核糖核苷酸的樣本。該方法進一步包括使樣本與寡核苷酸接觸。寡核苷酸以第一結合親和力與線性多核苷酸的靶區域雜交，並且寡核苷酸以不同於第一結合親和力的第二結合親和力與環狀多核苷酸的靶區域雜交，並將樣本中具有與該寡核苷酸雜交的靶區域的線性多核糖核苷酸與多種環狀多核糖核苷酸分離。在一些實施方式中，該方法包括使多核糖核苷酸與和顆粒（例如，有或沒有捕獲劑）軛合的寡核苷酸接觸的步驟。
在本文所述方法的一些實施方式中，寡核苷酸與第一捕獲劑軛合。在一些實施方式中，該方法進一步包括提供與第一捕獲劑結合的第二捕獲劑的步驟。第二捕獲劑可以與顆粒軛合。在一些實施方式中，第一捕獲劑與顆粒軛合。
在一些實施方式中，寡核苷酸與顆粒軛合。
在一些實施方式中，本文所述之方法包括從多種多核糖核苷酸中分離具有靶區域的多核糖核苷酸的步驟。該方法包括提供包含該多種多核糖核苷酸和與第一捕獲劑軛合的寡核苷酸的樣本。該多種多核糖核苷酸的子集具有靶區域，並且寡核苷酸與靶區域雜交。該方法進一步包括以下步驟：使樣本與和第一捕獲劑結合的第二捕獲劑接觸，並從樣本中的多種多核糖核苷酸中分離具有與寡核苷酸雜交的靶區域的多核糖核苷酸。
在一些實施方式中，本文所述之方法包括將具有靶區域的第一構象的多核糖核苷酸與具有該靶區域的第二構象的多種多核糖核苷酸分離的步驟。該方法包括提供包含該多種多核糖核苷酸和與第一捕獲劑軛合的寡核苷酸的樣本。寡核苷酸以第一結合親和力與第一構象的多核苷酸的靶區域雜交，並且寡核苷酸以不同於第一結合親和力的第二結合親和力與第二構象的多核苷酸的靶區域雜交。該方法進一步包括以下步驟：使樣本與和第一捕獲劑結合的第二捕獲劑接觸，並將樣本中具有與寡核苷酸雜交的靶區域的第一構象的多核糖核苷酸與第二構象的多種多核糖核苷酸分離。在一些實施方式中，第一結合親和力小於第二結合親和力，並且寡核苷酸優先與第一構象的多核糖核苷酸結合。
在一些實施方式中，本文所述之方法包括將具有靶區域的線性多核糖核苷酸與包含該靶區域的多種環狀多核糖核苷酸分離的步驟。該方法包括提供包含該多種多核糖核苷酸和與第一捕獲劑軛合的寡核苷酸的樣本。寡核苷酸以第一結合親和力與線性多核苷酸的靶區域雜交，並且該寡核苷酸以不同於第一結合親和力的第二結合親和力與環狀多核苷酸的靶區域雜交。該方法進一步包括以下步驟：使樣本與和第一捕獲劑結合的第二捕獲劑接觸，並將樣本中具有與寡核苷酸雜交的靶區域的線性多核糖核苷酸與多種環狀多核糖核苷酸分離。
在一些實施方式中，本文所述之方法包括例如使用沒有第一或第二捕獲劑的寡核苷酸從多種多核糖核苷酸中分離具有靶區域的多核糖核苷酸的步驟。寡核苷酸可以與顆粒直接軛合。該方法包括提供包含該多種多核糖核苷酸和與顆粒軛合的寡核苷酸的樣本。該多種多核糖核苷酸的子集具有靶區域，並且寡核苷酸與靶區域雜交。
在本文所述任何方法的一些實施方式中，靶區域不位於具有靶區域的多核糖核苷酸的5’或3’末端。例如，靶區域可以位於多核糖核苷酸內部。在一些實施方式中，靶區域不位於多核糖核苷酸的3’末端。
在本文所述任何方法的一些實施方式中，靶區域位於該多核糖核苷酸的5’或3’末端，並且靶區域不含polyA序列。在一些實施方式中，靶區域位於多核糖核苷酸的3’末端並且不含polyA序列。
在本文所述任何方法的一些實施方式中，靶區域不含polyA序列（例如，polyA尾）。
在本文所述任何方法的一些實施方式中，分離包括將寡核苷酸固定。該方法可以包括例如，將寡核苷酸、第一捕獲劑、第二捕獲劑、顆粒、或其組合固定。
在一些實施方式中，顆粒係磁性顆粒。該方法可以包括向磁性顆粒施加力，比如磁力。顆粒或珠可以是例如交聯瓊脂糖（例如，SEPHAROSE®）珠。該方法可以包括向珠或顆粒施加力，比如機械力、光學力、離心力或聲學力。
在一些實施方式中，具有靶區域的多核糖核苷酸包括內含子或其部分（例如，半內含子）。靶區域可以包括內含子或其部分。在一些實施方式中，內含子或其部分係催化內含子（例如，I型催化內含子或II型催化內含子）或其部分。在一些實施方式中，內含子或其部分的長度為至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個或至少100個核苷酸。在一些實施方式中，內含子或其部分的長度為20個至500個、20個至400個、20個至300個、20個至200個、20個至100個、50個至500個、50個至400個、50個至300個、50個至200個、100個至500個、100個至400個、100個至300個或100個至200個核苷酸。
在一些實施方式中，靶區域包括半內含子（例如，催化內含子的5’或3’部分）。在一些實施方式中，靶區域包括5’半內含子（例如，對應於催化內含子5’部分的5’半內含子）。在一些實施方式中，靶區域包括3’半內含子（例如，對應於催化內含子3’部分的3’半內含子）。在一些實施方式中，靶區域包括I型催化內含子的5’一半。在一些實施方式中，I型催化內含子的5’一半來自藍細菌魚腥藻屬前tRNA-Leu基因、四膜蟲前rRNA、T4噬菌體td基因或其變體的5’部分。在一些實施方式中，靶區域包括I型催化內含子的3’一半。在一些實施方式中，I型催化內含子的3’一半選自來自藍細菌魚腥藻屬前tRNA-Leu基因、四膜蟲前rRNA、T4噬菌體td基因或其變體的3’部分。
如本文所述之，該等方法可用於將例如剪接的與非剪接的多核糖核苷酸分離。在一些實施方式中，本文所述之方法包括將剪接的多核糖核苷酸與非剪接或部分剪接的多核糖核苷酸分離。在一些實施方式中，剪接的多核糖核苷酸係環狀多核糖核苷酸。在一些實施方式中，剪接的多核糖核苷酸係線性多核糖核苷酸。在一些實施方式中，剪接的多核糖核苷酸缺乏內含子或其部分，例如在生成期間的剪接（例如，自剪接）事件後。在一些實施方式中，具有內含子或其部分的多核糖核苷酸係線性多核糖核苷酸。
在一些實施方式中，該方法進一步包括將捕獲的具有靶區域和/或捕獲劑（例如，第一和/或第二捕獲劑）的多核糖核苷酸洗滌一次或更多次（例如，兩次、三次、四次、五次或更多次）。洗滌可以在接觸後和/或分離步驟後進行。
在一些實施方式中，該方法進一步包括進行第一洗脫步驟，以從具有靶區域的多核糖核苷酸中釋放捕獲的包括靶區域和/或捕獲劑（例如，第一和/或第二捕獲劑）的多核糖核苷酸。第一洗脫步驟可以包括添加第一緩衝劑和/或將樣本加熱至，例如至少50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C、80°C或更高。
在一些實施方式中，該方法進一步包括進行第二洗脫步驟。第二洗脫步驟可以包括添加第二緩衝劑和/或將樣本加熱至例如至少50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C、80°C或更高。在一些實施方式中，第二緩衝劑包括變性劑，例如甲醯胺或尿素。第二緩衝劑可以包括，例如約40%至約60%的甲醯胺（例如，約40%、45%、50%、55%或60%的甲醯胺）。
在一些實施方式中，該方法包括將樣本與寡核苷酸和/或捕獲劑（例如第一和/或第二捕獲劑）一起孵育至少十分鐘（例如，至少20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、60分鐘、70分鐘、80分鐘、90分鐘、100分鐘、110分鐘、120分鐘或更長）。
在一些實施方式中，該方法包括收集不被捕獲劑（例如，第一和/或第二捕獲劑）和/或寡核苷酸結合的樣本的部分。
在一些實施方式中，該方法包括提供多種寡核苷酸，其中每種寡核苷酸都與不同的靶區域雜交。每種寡核苷酸都可以與例如第一捕獲劑或顆粒（例如，磁性顆粒或珠）軛合。
在一些實施方式中，該方法包括提供與多個靶區域雜交的寡核苷酸。在一些實施方式中，該方法包括提供與3’半內含子和5’半內含子雜交的寡核苷酸。
在一些實施方式中，該方法包括提供與3’半內含子雜交的第一寡核苷酸以及與5’半內含子雜交的第二寡核苷酸。在一些實施方式中，該方法包括提供多種寡核苷酸，每種寡核苷酸都與3’半內含子和/或5’半內含子上的不同區域雜交。
在一些實施方式中，該方法包括提供與多核糖核苷酸的莫耳比為10 : 1至1 : 10（例如，10 : 1、5 : 1、2 : 1、1 : 2、1 : 5或1 : 10）的寡核苷酸。
在一些實施方式中，該方法包括提供顆粒（例如珠，例如磁珠）的樣本。顆粒可以存在於容器（例如，微量離心管）中或填充於柱中。顆粒可以與寡核苷酸軛合。該方法可以包括使多核糖核苷酸（例如，與和第一捕獲劑軛合的寡核苷酸）的混合物流動藉由含有顆粒的柱。因此，被寡核苷酸結合的多核糖核苷酸將與柱結合。在一些實施方式中，顆粒與第二捕獲劑軛合，例如，該第二捕獲劑被配置為與和寡核苷酸軛合的第一捕獲劑結合。在其他實施方式中，顆粒與寡核苷酸直接軛合，例如該寡核苷酸被配置為與多核糖核苷酸的靶區域雜交。
在一些實施方式中，例如當使用磁性顆粒時，該方法可以包括例如在容器（例如微量離心管）中藉由提供永磁體來粒化磁性顆粒。
在一些實施方式中，本文所述之方法富集了樣本中一定量的所需多核糖核苷酸。例如，該方法可富集相對於純化前樣本的至少10%（例如，至少20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或更多）的量的所需（例如，剪接的）多核糖核苷酸。
在一些實施方式中，純化方法產生了具有少於50%（mol/mol）（例如，少於40%、30%、20%、10%、5%、4%、3%、2%或1%（mol/mol））的線性多核糖核苷酸的環狀多核糖核苷酸。 寡核苷酸
本文所述之寡核苷酸被配置為與多核糖核苷酸的靶區域雜交。在一些實施方式中，寡核苷酸與靶區域的等長部分具有至少80%（例如，至少85%、90%、95%、97%、99%或100%）互補性。在一些實施方式中，寡核苷酸與多核糖核苷酸的靶區域的錯配至多為10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個或1個。在一些實施方式中，寡核苷酸與靶區域沒有錯配。在一些實施方式中，寡核苷酸可以是經修飾的寡核苷酸（例如，具有經修飾的磷酸鹽、糖或鹼基）。在一些實施方式中，寡核苷酸含有被配置為與靶區域雜交的部分和不與靶區域（例如，末端區域）雜交的部分。
寡核苷酸的長度可以為例如至少5個核苷酸（例如，至少6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個或更多個核苷酸）。在一些實施方式中，寡核苷酸的長度為，例如5-100個、5-95個、10-90個、10-80個、12-60個、15-50個、15-40個、15-30個、18-30個、20-25或20-22個核苷酸。
寡核苷酸可以例如具有30%-70%（例如，30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%或70%）的GC含量。寡核苷酸可以具有例如約45°C至約75°C（例如，約46°C、47°C、48°C、49°C、50°C、51°C、52°C、53°C、54°C、55°C、56°C、57°C、58°C、59°C、60°C、61°C、62°C、63°C、64°C、65°C、66°C、67°C、68°C、69°C、70°C、71°C、72°C、73°C、74°C或75°C）的解鏈溫度（Tm）。 捕獲劑
如本文所述之，寡核苷酸和/或顆粒可以與捕獲劑軛合。捕獲劑被配置為結合（例如，捕獲）靶分子。捕獲劑或一組捕獲劑（例如，第一和/或第二捕獲劑）可以包括任何親和對，比如抗體或其抗原結合片段和抗原。類似地，親和對可以包括受體或其片段和其同源配體。第一捕獲劑和第二捕獲劑可以是配置為以足夠的結合能相互作用以允許共價或非共價（例如，離子或凡得瓦力（van der Waals force））相互作用的任何兩種分子。
在本文所述組成物或方法中使用的寡核苷酸可以與第一捕獲劑軛合。在一些實施方式中，第一捕獲劑包括抗原。抗原可以是例如，生物素。
如本文所述之，捕獲劑或寡核苷酸（例如，與捕獲劑軛合的寡核苷酸）可以與第二捕獲劑結合或被配置為與第二捕獲劑結合。在一些實施方式中，第二捕獲劑包括抗體或其抗原結合片段，例如，被配置為與抗原結合。第二捕獲劑可以是例如，鏈黴親和素。在一些實施方式中，寡核苷酸不與第一捕獲劑軛合或不包括第一捕獲劑，並且第二捕獲劑直接與寡核苷酸結合。
在一些實施方式中，第一捕獲劑係抗體或其抗原結合片段。在一些實施方式中，第二捕獲劑係抗原。 顆粒
本文所述之寡核苷酸和/或捕獲劑可以與顆粒（例如，磁性顆粒或珠）軛合。在一些實施方式中，寡核苷酸和/或捕獲劑與多種顆粒軛合。在一些實施方式中，顆粒與多種捕獲劑和/或寡核苷酸軛合。
磁性顆粒包括至少一種回應於磁力的組分。磁性顆粒可以完全係磁性的或可以含有非磁性組分。磁性顆粒可以是磁珠，例如，基本上呈球形的磁珠。磁性顆粒可以完全係磁性的或可以含有一個或多個磁性核，該等磁性核被一種或多種額外的材料（比如例如，一種或多種官能基和/或用於與一種或多種靶分子結合的修飾）包圍。在一些實例中，磁性顆粒可以含有磁性組分和經一種或多種矽烷醇基團修飾的表面。這種類型的磁性顆粒可用於結合靶核酸分子。
顆粒（例如，磁性顆粒或珠）可以是有孔的、無孔的、中空的、固體的、半固體的、半流體的、流體的和/或其組合。在一些情況下，顆粒（例如，珠）可以是可溶解的或可降解的。在一些情況下，顆粒（例如，珠）可能不是可降解的。在一些實施方式中，珠由交聯瓊脂糖（例如，SEPHAROSE®）構成。
顆粒（例如，磁性顆粒或珠）可以包括天然和/或合成材料。例如，顆粒（例如，珠）可以包括天然聚合物、合成聚合物或天然及合成聚合物二者。天然聚合物的實例包括蛋白質和糖，比如去氧核糖核酸、橡膠、纖維素、澱粉（例如，直鏈澱粉、支鏈澱粉）、蛋白質、酶、多糖、絲、聚羥基鏈烷酸酯、殼聚糖、葡聚糖、膠原、角叉菜膠、車前草（ispaghula）、阿拉伯膠、瓊脂、明膠、蟲膠、梧桐膠、黃原膠、玉米糖膠、瓜爾膠、刺梧桐樹膠、瓊脂糖、海藻酸、海藻酸鹽或其天然聚合物。合成聚合物的實例包括丙烯酸樹脂、尼龍、矽酮、胺綸、黏膠人造絲、多元羧酸、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯醯胺、聚丙烯酸酯、聚乙二醇、聚胺酯、聚乳酸、二氧化矽、聚苯乙烯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚(氯代三氟乙烯)、聚(環氧乙烷)、聚(對苯二甲酸乙二酯)、聚乙烯、聚異丁烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(氧亞甲基)、聚甲醛、聚丙烯、聚苯乙烯、聚(四氟乙烯)、聚(乙酸乙烯酯)、聚(乙烯醇)、聚(氯乙烯)、聚(偏二氯乙烯)、聚(偏二氟乙烯)、聚(氟乙烯)、和/或其組合（例如，共聚物）。珠也可以由除了聚合物之外的材料形成，該等材料包括脂質、膠束、陶瓷、玻璃-陶瓷、複合材料、金屬、其他無機材料等。
交聯可以是永久的或可逆的，這取決於使用的特定交聯劑。可逆交聯在適當的條件下可以使得聚合物線性化或解離。在一些情況下，可逆交聯還可以使與珠表面結合的材料進行可逆附接。
顆粒（例如，珠或磁性顆粒）可以是大小均勻的或大小不均一的。在一些情況下，顆粒（例如，珠）的直徑可以為至少約1 µm、5 µm、10 µm、20 µm、30 µm、40 µm、50 µm、60 µm、70 µm、80 µm、90 µm、100 µm、250 µm、500 µm、1 mm、2 mm、3 mm、4 mm、5 mm、6 mm、7 mm、8 mm、9 mm、10 mm或更大。在一些情況下，顆粒（例如，珠）的直徑可以為小於約1 µm、5 µm、10 µm、20 µm、30 µm、40 µm、50 µm、60 µm、70 µm、80 µm、90 µm、100 µm、250 µm、500 µm、1 mm、2 mm、3 mm、4 mm、5 mm、6 mm、7 mm、8 mm、9 mm、10 mm或更小。在一些情況下，顆粒（例如，珠）的直徑可以為在約40-75 µm、30-75 µm、20-75 µm、40-85 µm、40-95 µm、20-100 µm、10-100 µm、1-100 µm、20-250 µm、或20-500 µm、500 µm-1 mm、1 mm-2 mm、1-5 mm或1-10 mm的範圍內。
顆粒可以具有任何合適的形狀。顆粒（例如，磁性顆粒或珠）形狀的實例包括但不限於球形、非球形、卵形、橢圓形、無定形、環狀、圓柱形及其變體。 連接子
在一些實施方式中，連接子用於軛合本文所述之組成物或方法中使用的兩種或更多種組分。例如，連接子可用於將寡核苷酸與捕獲劑、捕獲劑與顆粒（例如，珠）、寡核苷酸與顆粒（例如，珠）或其任何組合或變體軛合。在一些實施方式中，寡核苷酸藉由化學連接子與第一捕獲劑軛合。化學連接子可以與寡核苷酸的3’端或5’端軛合。替代性地，化學連接子可以與寡核苷酸的內部區域軛合。
在一些實施方式中，第二捕獲劑與顆粒軛合。顆粒可以是例如磁性顆粒或珠。珠可以是例如交聯瓊脂糖（例如，SEPHAROSE®）珠。在一些實施方式中，寡核苷酸直接與顆粒（例如珠，例如磁珠或交聯瓊脂糖（例如，SEPHAROSE®）珠）軛合。
化學連接子提供例如寡核苷酸與捕獲劑（例如，第一捕獲劑）和/或捕獲劑（例如，第二捕獲劑）與顆粒之間的空間、剛性和/或柔性。在一些實施方式中，連接子可以是鍵，例如共價鍵（例如醯胺鍵、二硫鍵、C-O鍵、C-N鍵、N-N鍵、C-S鍵）或由化學反應（例如，化學軛合）產生的任何類型的鍵。在一些實施方式中，連接子包括不超過250個原子（例如，1-2個、1-4個、1-6個、1-8個、1-10個、1-12個、1-14個、1-16個、1-18個、1-20個、1-25個、1-30個、1-35個、1-40個、1-45個、1-50個、1-55個、1-60個、1-65個、1-70個、1-75個、1-80個、1-85個、1-90個、1-95個、1-100個、1-110個、1-120個、1-130個、1-140個、1-150個、1-160個、1-170個、1-180個、1-190個、1-200個、1-210個、1-220個、1-230個、1-240個或1-250個原子；250個、240個、230個、220個、210個、200個、190個、180個、170個、160個、150個、140個、130個、120個、110個、100個、95個、90個、85個、80個、75個、70個、65個、60個、55個、50個、45個、40個、35個、30個、28個、26個、24個、22個、20個、18個、16個、14個、12個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個或1個原子）。在一些實施方式中，連接子包括不超過250個非氫原子（例如，1-2個、1-4個、1-6個、1-8個、1-10個、1-12個、1-14個、1-16個、1-18個、1-20個、1-25個、1-30個、1-35個、1-40個、1-45個、1-50個、1-55個、1-60個、1-65個、1-70個、1-75個、1-80個、1-85個、1-90個、1-95個、1-100個、1-110個、1-120個、1-130個、1-140個、1-150個、1-160個、1-170個、1-180個、1-190個、1-200個、1-210個、1-220個、1-230個、1-240個或1-250個非氫原子；250個、240個、230個、220個、210個、200個、190個、180個、170個、160個、150個、140個、130個、120個、110個、100個、95個、90個、85個、80個、75個、70個、65個、60個、55個、50個、45個、40個、35個、30個、28個、26個、24個、22個、20個、18個、16個、14個、12個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個或1個非氫原子）。在一些實施方式中，連接子的主鏈包括不超過250個原子（例如，1-2個、1-4個、1-6個、1-8個、1-10個、1-12個、1-14個、1-16個、1-18個、1-20個、1-25個、1-30個、1-35個、1-40個、1-45個、1-50個、1-55個、1-60個、1-65個、1-70個、1-75個、1-80個、1-85個、1-90個、1-95個、1-100個、1-110個、1-120個、1-130個、1-140個、1-150個、1-160個、1-170個、1-180個、1-190個、1-200個、1-210個、1-220個、1-230個、1-240個或1-250個原子；250個、240個、230個、220個、210個、200個、190個、180個、170個、160個、150個、140個、130個、120個、110個、100個、95個、90個、85個、80個、75個、70個、65個、60個、55個、50個、45個、40個、35個、30個、28個、26個、24個、22個、20個、18個、16個、14個、12個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個或1個原子）。連接子的「主鏈」係指連接子中一起形成軛合物的一部分至軛合物的另一部分的最短路徑的原子。連接子主鏈中的原子直接參與將軛合物的一部分與軛合物的另一部分連接。例如，連接子主鏈中與碳附接的氫原子不被視為直接參與軛合物的一部分與軛合物的另一部分的連接。
在一些實施方式中，連接子可以包括衍生自例如，合成聚合物（例如，聚乙二醇（PEG）聚合物）的合成基團。化學連接子可以包括，例如三乙二醇（TEG）。在一些實施方式中，連接子可以包括一個或多個胺基酸殘基。在一些實施方式中，連接子可以是胺基酸序列（例如，1-25個胺基酸、1-10個胺基酸、1-9個胺基酸、1-8個胺基酸、1-7個胺基酸、1-6個胺基酸、1-5個胺基酸、1-4個胺基酸、1-3個胺基酸、1-2個胺基酸或1個胺基酸序列）。在一些實施方式中，連接子可以包括一個或多個視需要取代的C 1-C 20伸烷基、視需要取代的C 1-C 20雜伸烷基（例如，PEG單元）、視需要取代的C 2-C 20伸烯基（例如，C 2伸烯基）、視需要取代的C 2-C 20雜伸烯基、視需要取代的C 2-C 20伸炔基、視需要取代的C 2-C 20雜伸炔基、視需要取代的C 3-C 20環伸烷基（例如，環伸丙基、環伸丁基）、視需要取代的C 2-C 20雜環伸烷基、視需要取代的C4-C 20環伸烯基、視需要取代的C 4-C 20雜環伸烯基、視需要取代的C 8-C 20環伸炔基、視需要取代的C 8-C 20雜環伸炔基、視需要取代的C 5-C 15伸芳基（例如，C 6伸芳基）、視需要取代的C 3-C 15雜伸芳基（例如，咪唑、吡啶）、O、S、NRi（Ri係H、視需要取代的C 1-C 20烷基、視需要取代的C 1-C 20雜烷基、視需要取代的C 2-C 20烯基、視需要取代的C 2-C 20雜烯基、視需要取代的C 2-C 20炔基、視需要取代的C 2-C 20雜炔基、視需要取代的C3-C 20環烷基、視需要取代的C 2-C 20雜環烷基、視需要取代的C 4-C 20環烯基、視需要取代的C 4-C 20雜環烯基、視需要取代的C 8-C 20環炔基、視需要取代的C 8-C 20雜環炔基、視需要取代的C 5-C 15芳基或視需要取代的C 3-C 15雜芳基）、P、羰基、硫代羰基、磺醯基、磷酸、磷醯基或亞胺基。
使用連接子的軛合物中兩種或更多種組分的共價軛合可以使用熟知的有機化學合成技術和方法完成。兩種組分上的互補官能基可以彼此反應形成共價鍵。互補反應官能基的實例包括但不限於，例如馬來醯亞胺和半胱胺酸、胺和活化的羧酸、硫醇和馬來醯亞胺、活化的磺酸和胺、異氰酸酯和胺、疊氮化物和炔烴、以及烯烴和四嗪。可以使用本領域已知的技術完成與多肽的位點特異性軛合。 組成物
如本文所述之，本發明之特徵在於包括藉由如本文所述之方法產生的多核糖核苷酸群體的組成物。該群體可以包括，例如缺乏靶區域的環狀多核糖核苷酸，並且該環狀多核糖核苷酸包括組成物中總多核糖核苷酸的至少1%（例如至少5%，例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、99%或更多）（mol/mol）。在一些實施方式中，該群體具有組成物中小於50%（例如，小於40%、30%、20%、10%、5%、4%、3%、2%或1%）（mol/mol）的線性多核糖核苷酸。
在其他實施方式中，該群體可以包括例如具有靶區域的第一構象的多核糖核苷酸以及具有靶區域的第二構象的多核糖核苷酸，並且第一構象的多核糖核苷酸包括組成物中總多核糖核苷酸的至少1%，例如至少5%，例如至少10%、至少20%、至少30%或至少40%（例如，至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、99%或更多）（mol/mol）。
在如本文所述之一些實施方式中，本發明之特徵在於包括多核糖核苷酸混合物的組成物。該混合物的第一子集包括缺乏靶區域的環狀多核糖核苷酸，並且該多種多核糖核苷酸的第二子集包括具有靶區域的線性多核糖核苷酸。第一子集包括組成物中總多核糖核苷酸的至少1%，例如，至少5%，例如至少10%、至少20%、至少30%、或至少40%（例如，至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、99%或更多）（mol/mol）。
在如本文所述之一些實施方式中，本發明之特徵在於包含具有靶區域的多核糖核苷酸和配置為與靶區域雜交的寡核苷酸的組成物，其中寡核苷酸與第一捕獲劑（例如抗原，比如生物素）軛合。該組成物可進一步包含例如缺乏靶區域的多核糖核苷酸。缺乏靶區域的多核糖核苷酸可以是，例如環狀多核糖核苷酸。該組成物可以進一步包括配置為與第一捕獲劑結合的第二捕獲劑（例如抗體或其抗原結合片段，比如鏈黴親和素）。第二捕獲劑可以與顆粒軛合，例如經由連接子。
在如本文所述之任何組成物的一些實施方式中，線性多核糖核苷酸包括內含子或其部分。靶區域可以包括內含子或其部分。靶區域可以位於內含子或其部分的5’或3’。
在一些實施方式中，多核糖核苷酸可以是經修飾的多核糖核苷酸。
在實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）係基於質量至少30%（w/w）、40%（w/w）、50%（w/w）、60%（w/w）、70%（w/w）、80%（w/w）、85%（w/w）、90%（w/w）、91%（w/w）、92%（w/w）、93%（w/w）、94%（w/w）、95%（w/w）、96%（w/w）、97%（w/w）、98%（w/w）、99%（w/w）、或100%（w/w）純的。純度可以藉由熟悉該項技術者已知的多種分析技術中的任一種來測量，該等分析技術諸如但不限於使用分離技術，諸如層析法（使用柱、使用紙、使用凝膠、使用HPLC、使用UHPLC等，或藉由IC、藉由SEC、藉由反相、藉由陰離子交換、藉由混合模式等）或使用或不使用分離前或分離後衍生化方法的電泳（尿素PAGE、基於晶片的、聚丙烯醯胺凝膠、RNA、毛細管、c-IEF等），使用基於質譜法、UV-Vis、螢光、光散射、折射率，或利用銀或染料染色或放射性衰變用於檢測的檢測技術。替代性地，純度可以在不使用分離技術的情況下藉由質譜法、顯微鏡法、圓二色性（CD）光譜法、UV或UV-Vis分光光度法、螢光法（例如，Qubit）、RNA酶H分析、表面電漿共振（SPR）、或利用銀或染料染色或放射性衰變用於檢測之方法。
在一些實施方式中，可以藉由生物學測試方法（例如，基於細胞的或基於受體的測試）來測量純度。在一些實施方式中，本文所述之製劑中總質量核糖核苷酸的至少30%（w/w）、40%（w/w）、50%（w/w）、60%（w/w）、70%（w/w）、80%（w/w）、85%（w/w）、90%（w/w）、91%（w/w）、92%（w/w）、93%（w/w）、94%（w/w）、95%（w/w）、96%（w/w）、97%（w/w）、98%（w/w）、99%（w/w）或100%（w/w）以環狀多核糖核苷酸分子包含。該百分比可以藉由熟悉該項技術者已知的多種分析技術中的任一種來測量，該等分析技術諸如但不限於使用分離技術，諸如層析法（使用柱、使用紙、使用凝膠、使用HPLC、使用UHPLC等，或藉由IC、藉由SEC、藉由反相、藉由陰離子交換、藉由混合模式等）或使用或不使用分離前或分離後衍生化方法的電泳（尿素PAGE、基於晶片的、聚丙烯醯胺凝膠、RNA、毛細管、c-IEF等），使用基於質譜法、UV-Vis、螢光、光散射、折射率，或利用銀或染料染色或放射性衰變用於檢測的檢測技術。替代性地，純度可以在不使用分離技術的情況下藉由質譜法、顯微鏡法、圓二色性（CD）光譜法、UV或UV-Vis分光光度法、螢光法（例如，Qubit）、RNA酶H分析、表面電漿共振（SPR）、或利用銀或染料染色或放射性衰變用於檢測之方法。
在實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）具有至少0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、0.1 µg/mL、0.5 µg/mL、1 µg/mL、2 µg/mL、5 µg/mL、10 µg/mL、20 µg/mL、30 µg/mL、40 µg/mL、50 µg/mL、60 µg/mL、70 µg/mL、80 µg/mL、100 µg/mL、200 µg/mL、300 µg/mL、500 µg/mL、1000 µg/mL、5000 µg/mL、10,000 µg/mL、100,000 µg/mL、200 mg/mL、300 mg/mL、400 mg/mL、500 mg/mL、600 mg/mL、650 mg/mL、700 mg/mL、或750 mg/mL的環狀多核糖核苷酸濃度。在實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）基本上不含單核苷酸或具有不超過1 pg/ml、10 pg/ml、0.1 ng/ml、1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、15 ng/ml、20 ng/ml、25 ng/ml、30 ng/ml、35 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/ml、1000 µg/mL、5000 µg/mL、10,000 µg/mL、或100,000 µg/mL的單核苷酸含量。在實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）具有從檢測限至1 pg/ml、10 pg/ml、0.1 ng/ml、1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、15 ng/ml、20 ng/ml、25 ng/ml、30 ng/ml、35 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/ml、1000 µg/mL、5000 µg/mL、10,000 µg/mL、或100,000 µg/mL的單核苷酸含量。
在實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）具有基於質量占總核苷酸不超過0.1%（w/w）、0.2%（w/w）、0.3%（w/w）、0.4%（w/w）、0.5%（w/w）、0.6%（w/w）、0.7%（w/w）、0.8%（w/w）、0.9%（w/w）、1%（w/w）、2%（w/w）、3%（w/w）、4%（w/w）、5%（w/w）、6%（w/w）、7%（w/w）、8%（w/w）、9%（w/w）、10%（w/w）、15%（w/w）、20%（w/w）、25%（w/w）、30%（w/w）、或其間的任何百分比的單核苷酸含量，其中總核苷酸含量係去氧核糖核苷酸分子和核糖核苷酸分子的總質量。
在實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）具有不超過1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、15 ng/ml、20 ng/ml、25 ng/ml、30 ng/ml、35 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/ml、600 ng/ml、1 µg/ml、10 µg/ml、50 µg/ml、100 µg/ml、200 g/ml、300 µg/ml、400 µg/ml、500 µg/ml、600 µg/ml、700 µg/ml、800 µg/ml、900 µg/ml、1 mg/ml、1.5 mg/ml、2 mg/ml、5 mg/mL、10 mg/mL、50 mg/mL、100 mg/mL、200 mg/mL、300 mg/mL、400 mg/mL、500 mg/mL、600 mg/mL、650 mg/mL、700 mg/mL、或750 mg/mL的線性RNA含量，例如線性RNA對應物或RNA片段。在實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）具有從檢測限至1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、15 ng/ml、20 ng/ml、25 ng/ml、30 ng/ml、35 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/ml、600 ng/ml、1 µg/ml、10 µg/ml、50 µg/ml、100 µg/ml、200 g/ml、300 µg/ml、400 µg/ml、500 µg/ml、600 µg/ml、700 µg/ml、800 µg/ml、900 µg/ml、1 mg/ml、1.5 mg/ml、2 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml、50 mg/ml、100 mg/ml、200 mg/ml、300 mg/ml、400 mg/ml、500 mg/ml、600 mg/ml、650 mg/ml、700 mg/ml、或750 mg/ml的線性RNA含量，例如線性RNA對應物或RNA片段。
在實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）具有不超過10%（w/w）、9.9%（w/w）、9.8%（w/w）、9.7%（w/w）、9.6%（w/w）、9.5%（w/w）、9.4%（w/w）、9.3%（w/w）、9.2%（w/w）、9.1%（w/w）、9%（w/w）、8%（w/w）、7%（w/w）、6%（w/w）、5%（w/w）、4%（w/w）、3%（w/w）、2%（w/w）、1%（w/w）、0.5%（w/w）、或0.1%（w/w）、或其間的百分比的經切口RNA含量。在實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）具有低至零的經切口RNA含量或基本上不含經切口RNA。
在實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）具有不超過30%（w/w）、25%（w/w）、20%（w/w）、15%（w/w）、10%（w/w）、9%（w/w）、8%（w/w）、7%（w/w）、6%（w/w）、5%（w/w）、4%（w/w）、3%（w/w）、2%（w/w）、1%（w/w）、0.5%（w/w）、或0.1%（w/w）、或其間的百分比的組合的線性RNA和經切口RNA含量。在實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）具有低至零的組合的經切口RNA和線性RNA含量或基本上不含經切口和線性RNA。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）具有不超過分析方法的檢測限的線性RNA含量，例如線性RNA對應物或RNA片段，該等分析方法諸如利用以下項之方法：質譜法、UV光譜或螢光檢測器、光散射技術、使用或不使用分離方法包括HPLC的表面電漿共振（SPR）、藉由HPLC、使用或不使用分離前或分離後衍生化方法的基於晶片或凝膠的電泳、使用銀或染料染色或放射性衰變的檢測方法、或顯微鏡法、目測法或分光光度計。
在實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）具有例如如藉由實例2中之方法測量的不超過0.1%（w/w）、1%（w/w）、2%（w/w）、3%（w/w）、4%（w/w）、5%（w/w）、6%（w/w）、7%（w/w）、8%（w/w）、9%（w/w）、10%（w/w）、15%（w/w）、20%（w/w）、25%（w/w）、30%（w/w）、35%（w/w）、40%（w/w）、45%（w/w）、50%（w/w）的線性RNA。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑的線性多核糖核苷酸分子包括環狀多核糖核苷酸分子的線性對應物或其片段。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑的線性多核糖核苷酸分子包括線性對應物（例如，環化前形式）。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑的線性多核糖核苷酸分子包括環狀多核糖核苷酸的非對應物或其片段。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑的線性多核糖核苷酸分子包括環狀多核糖核苷酸的非對應物。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸分子包括環狀多核糖核苷酸的對應物和環狀多核糖核苷酸的非對應物或其片段的組合。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸分子包括環狀多核糖核苷酸的對應物和環狀多核糖核苷酸的非對應物的組合。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸分子片段係長度為至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000個、或更多個核苷酸、或其間的任何核苷酸數的片段。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）具有例如如藉由分光光度計測量的從約1.6至約2.3的A260/A280吸光度比。在一些實施方式中，A260/A280吸光度比係約1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、或其間的任何數。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸生產中的中間體）具有例如如藉由分光光度計測量的大於約1.8的A260/A280吸光度比。在一些實施方式中，A260/A280吸光度比係約1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、或更大。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）基本上不含雜質或副產物。在各種實施方式中，包含環狀多核糖核苷酸的組成物中至少一種雜質或副產物的水平與在去除雜質或副產物的純化或處理之前組成物的該水平相比降低至少30%（w/w）、至少40%（w/w）、至少50%（w/w）、至少60%（w/w）、至少70%（w/w）、至少80%（w/w）、至少90%（w/w）或至少95%（w/w）。在一些實施方式中，至少一種製程相關雜質或副產物的水平與在去除雜質或副產物的純化或處理之前組成物的該水平相比降低至少30%（w/w）、至少40%（w/w）、至少50%（w/w）、至少60%（w/w）、至少70%（w/w）、至少80%（w/w）、至少90%（w/w）或至少95%（w/w）。在一些實施方式中，至少一種產物相關物質的水平與在去除雜質或副產物的純化或處理之前組成物的該水平相比降低至少30%（w/w）、至少40%（w/w）、至少50%（w/w）、至少60%（w/w）、至少70%（w/w）、至少80%（w/w）、至少90%（w/w）、或至少95%（w/w）。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）進一步基本上不含製程相關雜質或副產物。在一些實施方式中，製程相關雜質或副產物包括蛋白質（例如，細胞蛋白質，諸如宿主細胞蛋白質）、去氧核糖核酸（例如，細胞去氧核糖核酸，諸如宿主細胞去氧核糖核酸）、單去氧核糖核苷酸或雙去氧核糖核苷酸分子、酶（例如，核酸酶（諸如核酸內切酶或核酸外切酶）、或連接酶）、試劑組分、凝膠組分、或層析材料。在一些實施方式中，雜質或副產物選自：緩衝試劑、連接酶、核酸酶、RNA酶抑制劑、RNA酶R、去氧核糖核苷酸分子、丙烯醯胺凝膠碎片、和單去氧核糖核苷酸分子。在一些實施方式中，藥物製劑包括少於0.1 ng、1 ng、5 ng、10 ng、15 ng、20 ng、25 ng、30 ng、35 ng、40 ng、50 ng、60 ng、70 ng、80 ng、90 ng、100 ng、200 ng、300 ng、400 ng、或500 ng的蛋白質污染物、雜質或副產物/毫克（mg）環狀多核糖核苷酸分子的蛋白質（例如，細胞蛋白質，比如宿主細胞蛋白質）污染物、雜質或副產物。
在實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）基本上不含DNA含量，例如模板DNA或細胞DNA（例如，宿主細胞DNA），或具有低至零的DNA含量，或具有不超過1 pg/ml、10 pg/ml、0.1 ng/ml、1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、15 ng/ml、20 ng/ml、25 ng/ml、30 ng/ml、35 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/ml、1000 µg/mL、5000 µg/mL、10,000 µg/mL、或100,000 µg/mL的DNA含量。
在實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）基本上不含DNA含量，具有低至零的DNA含量，或具有基於質量占總核苷酸不超過0.001%（w/w）、0.01%（w/w）、0.1%（w/w）、1%（w/w）、2%（w/w）、3%（w/w）、4%（w/w）、5%（w/w）、6%（w/w）、7%（w/w）、8%（w/w）、9%（w/w）、10%（w/w）、15%（w/w）、20%（w/w）、25%（w/w）、30%（w/w）、35%（w/w）、40%（w/w）、45%（w/w）、50%（w/w）的DNA含量，其中總核苷酸分子係去氧核糖核苷酸含量和核糖核苷酸分子的總質量。在實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）基本上不含DNA含量，具有低至零的DNA含量，或具有基於質量占總核苷酸不超過0.001%（w/w）、0.01%（w/w）、0.1%（w/w）、1%（w/w）、2%（w/w）、3%（w/w）、4%（w/w）、5%（w/w）、6%（w/w）、7%（w/w）、8%（w/w）、9%（w/w）、10%（w/w）、15%（w/w）、20%（w/w）、25%（w/w）、30%（w/w）、35%（w/w）、40%（w/w）、45%（w/w）、50%（w/w）的DNA含量，如在藉由消化核苷的酶進行總DNA消化後藉由定量液相層析法-質譜法（LC-MS）測量的，其中DNA的含量從如藉由LC-MS測量的每種鹼基（即，A、C、G、T）的標準曲線反演計算出。
在實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）具有不超過0.1 ng/ml、1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、15 ng/ml、20 ng/ml、25 ng/ml、30 ng/ml、35 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、300 ng/ml、400 ng/ml、或500 ng/ml的蛋白質（例如，細胞蛋白質（CP）（例如，酶）、生產相關蛋白（例如，載劑蛋白））污染物、雜質或副產物。在實施方式中，環狀多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸生產中的中間體）具有從檢測限至0.1 ng/ml、1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、15 ng/ml、20 ng/ml、25 ng/ml、30 ng/ml、35 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、300 ng/ml、400 ng/ml、或500 ng/ml的蛋白質（例如，生產相關蛋白比如細胞蛋白質（CP），例如酶）污染物、雜質或副產物。
在實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）具有少於0.1 ng、1 ng、5 ng、10 ng、15 ng、20 ng、25 ng、30 ng、35 ng、40 ng、50 ng、60 ng、70 ng、80 ng、90 ng、100 ng、200 ng、300 ng、400 ng、或500 ng/毫克（mg）環狀多核糖核苷酸的蛋白質（例如，生產相關蛋白諸如細胞蛋白質（CP），例如酶）污染物、雜質或副產物。在實施方式中，環狀多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸生產中的中間體）具有從檢測水平至0.1 ng、1 ng、5 ng、10 ng、15 ng、20 ng、25 ng、30 ng、35 ng、40 ng、50 ng、60 ng、70 ng、80 ng、90 ng、100 ng、200 ng、300 ng、400 ng、或500 ng/毫克（mg）環狀多核糖核苷酸的蛋白質（例如，生產相關蛋白比如細胞蛋白質（CP），例如酶）污染物、雜質或副產物。
在實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）具有低水平的內毒素或基本上不存在內毒素，例如如藉由鱟變形細胞裂解物（LAL）測試測量的。在一些實施方式中，藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸生產中的中間體如藉由鱟變形細胞裂解物測試所測量包含少於20 EU/kg（重量）、10 EU/kg、5 EU/kg、1 EU/kg的內毒素，或缺乏內毒素。在實施方式中，環狀多核糖核苷酸組成物具有低水平或不存在的核酸酶或連接酶。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）包含不大於約50%（w/w）、45%（w/w）、40%（w/w）、35%（w/w）、30%（w/w）、25%（w/w）、20%（w/w）、19%（w/w）、18%（w/w）、17%（w/w）、16%（w/w）、15%（w/w）、14%（w/w）、13%（w/w）、12%（w/w）、11%（w/w）、10%（w/w）、9%（w/w）、8%（w/w）、7%（w/w）、6%（w/w）、5%（w/w）、4%（w/w）、3%（w/w）、2%（w/w）、1%（w/w）的至少一種酶，例如聚合酶，例如RNA聚合酶。
在實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）係無菌的或基本上不含微生物，例如組成物或製劑如在無菌條件下所測試支持少於100個活微生物的生長，組成物或製劑滿足USP ＜71＞ 的標準，和/或組成物或製劑滿足USP ＜85＞ 的標準。在一些實施方式中，藥物製劑在滅菌之前包含少於100 CFU/100 ml、50 CFU/100 ml、40 CFU/100 ml、30 CFU/100 ml、200 CFU/100 ml、10 CFU/100 ml、或10 CFU/100 ml的生物負荷。
在一些實施方式中，可以使用本領域中已知的去除雜質或副產物的技術（比如柱層析法或pH、小瓶滅活）進一步純化環狀多核糖核苷酸製劑。 多核苷酸
本發明之特徵在於在分離和/或純化方法中使用的以及存在於本文所述之組成物中的多核糖核苷酸。本文所述之多核糖核苷酸可以是線性多核糖核苷酸、環狀多核糖核苷酸或其組合。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸由線性多核糖核苷酸產生（例如，藉由剪接線性多核糖核苷酸的相容端）。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸從去氧核糖核苷酸模板（例如，載體、線性化載體或cDNA）轉錄。因此，本發明之特徵在於可用於產生多核糖核苷酸的線性去氧核糖核苷酸、環狀去氧核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸、和環狀多核糖核苷酸及其組成物。 線性多核糖核苷酸
本發明之特徵在於可以包括以下一種或多種的線性多核糖核苷酸：3’半內含子；3’剪接位點；3’外顯子；多核糖核苷酸負載物；5’外顯子；5’剪接位點；以及5′半內含子。在一些實施方式中，3’半內含子對應於催化I型內含子（例如，來自藍細菌魚腥藻屬前tRNA-Leu基因、四膜蟲前rRNA、T4噬菌體td基因或其變體的催化I型內含子）的3’部分。在一些實施方式中，5’半內含子對應於催化I型內含子（例如，來自藍細菌魚腥藻屬前tRNA-Leu基因、四膜蟲前rRNA、T4噬菌體td基因或其變體的催化I型內含子）的5’部分。
線性多核糖核苷酸可以包括例如在以上所述之元件中的任一者之外或之間的額外的元件。例如，如本文所述之，以上元件的任一者可以藉由間隔子序列隔開。如本文所述之靶區域可以存在於如本文所述之線性多核糖核苷酸的任何區域。在一些實施方式中，靶區域存在於內含子或其部分內。
在某些實施方式中，本文提供了一種藉由使用本文提供的去氧核糖核苷酸（例如，載體、線性化載體或cDNA）作為模板（例如，本文提供的載體、線性化載體或cDNA，它們具有位於編碼線性多核糖核苷酸的區域上游的RNA聚合酶啟動子）在無細胞系統中進行轉錄（例如，體外轉錄）來生成線性多核糖核苷酸之方法。
去氧核糖核苷酸模板可以被轉錄以產生含有本文所述組分的線性多核糖核苷酸。表現後，線性多核糖核苷酸可以產生剪接相容的多核糖核苷酸，該剪接相容的多核糖核苷酸可以被剪接以產生環狀多核糖核苷酸，例如，用於隨後使用。
在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸的長度為50個至20,000個，例如300個至20,000個（例如，50個、60個、70個、80個、90個、100個、150個、200個、250個、300個、400個、500個、600個、700個、800個、900個、1,000個、1,100個、1,200個、1,300個、1,400個、1,500個、1,600個、1,700個、1,800個、1,900個、2,000個、2,500個、3,000個、3,500個、4,000個、5,000個、6,000個、7,000個、8,000個、9,000個、10,000個、11,000個、12,000個、13,000個、14,000個、15,000個、16,000個、17,000個、18,000個、19,000個或20,000個）核糖核苷酸。線性多核糖核苷酸的長度可以為，例如至少500個、至少1,000個、至少2,000個、至少3,000個、至少4,000個或至少5,000個核糖核苷酸。 環狀多核糖核苷酸
在一些實施方式中，本發明之特徵在於環狀多核糖核苷酸。環狀多核糖核苷酸可以包括連接5’外顯子和3’外顯子的剪接點。如本文所述之靶區域可以存在於如本文所述之環狀多核糖核苷酸的任何區域。環狀多核糖核苷酸可能例如在剪接之後缺乏內含子。
環狀多核苷酸可以進一步包含多核糖核苷酸負載物。多核糖核苷酸負載物可以包含表現序列、非編碼序列、或表現序列和非編碼序列的組合。多核糖核苷酸負載物可以包含編碼多肽的表現序列。多核糖核苷酸可以包含與編碼多肽的表現序列可操作地連接的IRES。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸進一步包括IRES與5'外顯子片段或3'外顯子片段之間的間隔子區域。間隔子區域的長度可以為例如至少5個（例如至少10個、至少15個、至少20個）核糖核苷酸。間隔子區域可以為例如5個至500個（例如，10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、150個、200個、250個、300個、350個、400個、450個或500個）核糖核苷酸。在一些實施方式中，間隔子區域包括polyA序列。在一些實施方式中，間隔子區域包括polyA-C、polyA-G、polyA-U或其他異源或隨機序列。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸係至少約20個核苷酸、至少約30個核苷酸、至少約40個核苷酸、至少約50個核苷酸、至少約75個核苷酸、至少約100個核苷酸、至少約200個核苷酸、至少約300個核苷酸、至少約400個核苷酸、至少約500個核苷酸、至少約1,000個核苷酸、至少約2,000個核苷酸、至少約5,000個核苷酸、至少約6,000個核苷酸、至少約7,000個核苷酸、至少約8,000個核苷酸、至少約9,000個核苷酸、至少約10,000個核苷酸、至少約12,000個核苷酸、至少約14,000個核苷酸、至少約15,000個核苷酸、至少約16,000個核苷酸、至少約17,000個核苷酸、至少約18,000個核苷酸、至少約19,000個核苷酸或至少約20,000個核苷酸。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以具有足夠的大小以容納核糖體的結合位點。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的大小係足以編碼有用的多肽的長度，並且因此可以產生至少20,000個核苷酸、至少15,000個核苷酸、至少10,000個核苷酸、至少7,500個核苷酸或至少5,000個核苷酸、至少4,000個核苷酸、至少3,000個核苷酸、至少2,000個核苷酸、至少1,000個核苷酸、至少500個核苷酸、至少1400個核苷酸、至少300個核苷酸、至少200個核苷酸、至少100個核苷酸的長度。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含一個或多個本文所述之元件。在一些實施方式中，該等元件可以藉由間隔子序列彼此隔開。在一些實施方式中，該等元件可以被1個核糖核苷酸、2個核苷酸、約5個核苷酸、約10個核苷酸、約15個核苷酸、約20個核苷酸、約30個核苷酸、約40個核苷酸、約50個核苷酸、約60個核苷酸、約80個核苷酸、約100個核苷酸、約150個核苷酸、約200個核苷酸、約250個核苷酸、約300個核苷酸、約400個核苷酸、約500個核苷酸、約600個核苷酸、約700個核苷酸、約800個核苷酸、約900個核苷酸、約1000個核苷酸、最多約1 kb、至少約1000個核苷酸、或其間任意量的核苷酸彼此隔開。在一些實施方式中，一個或多個元件彼此鄰接，例如缺乏間隔子元件。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包含一個或多個重複元件。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含一個或多個本文所述之修飾。在一個實施方式中，環狀多核糖核苷酸含有至少一個核苷修飾。在一個實施方式中，高達100%的環狀多核糖核苷酸的核苷被修飾。在一個實施方式中，至少一個核苷修飾係尿苷修飾或腺苷修飾。
作為其環化的結果，環狀多核糖核苷酸可能包括某些使其區別於線性多核糖核苷酸的特徵。例如，環狀多核糖核苷酸可以含有比線性多核糖核苷酸更易接近或更難接近的靶區域。在一些實施方式中，與線性多核糖核苷酸相比，環狀多核糖核苷酸可能較不易被核酸外切酶降解。這樣，環狀多核糖核苷酸可以比線性多核糖核苷酸更穩定，尤其是在核酸外切酶存在下孵育時。環狀多核糖核苷酸與線性多核糖核苷酸相比增加的穩定性使得環狀多核糖核苷酸作為產生多肽的細胞轉化試劑更加有用，並且與線性多核糖核苷酸相比，存儲更容易且時間更長。可以使用本領域標準之方法測試用核酸外切酶處理的環狀多核糖核苷酸的穩定性，該等方法確定是否已經發生RNA降解（例如，藉由凝膠電泳）。此外，與線性多核糖核苷酸不同，當環狀多核糖核苷酸與磷酸酶諸如小牛腸磷酸酶一起孵育時，環狀多核糖核苷酸可能不太容易去磷酸化。 多核糖核苷酸負載物
本文所述之多核糖核苷酸負載物包括包含至少一個多核糖核苷酸的任何序列。在一些實施方式中，多核糖核苷酸負載物包括表現序列、非編碼序列、或表現序列和非編碼序列。在一些實施方式中，多核糖核苷酸負載物包括編碼多肽的表現序列。在一些實施方式中，多核糖核苷酸負載物包括與編碼多肽的表現序列可操作地連接的IRES。在一些實施方式中，多核糖核苷酸負載物包括編碼對受試者具有生物學效應的多肽的表現序列。
例如，多核糖核苷酸負載物可以包括至少約40個核苷酸、至少約50個核苷酸、至少約75個核苷酸、至少約100個核苷酸、至少約200個核苷酸、至少約300個核苷酸、至少約400個核苷酸、至少約500個核苷酸、至少約1,000個核苷酸、至少約2,000個核苷酸、至少約5,000個核苷酸、至少約6,000個核苷酸、至少約7,000個核苷酸、至少約8,000個核苷酸、至少約9,000個核苷酸、至少約10,000個核苷酸、至少約12,000個核苷酸、至少約14,000個核苷酸、至少約15,000個核苷酸、至少約16,000個核苷酸、至少約17,000個核苷酸、至少約18,000個核苷酸、至少約19,000個核苷酸、或至少約20,000個核苷酸。在一些實施方式中，多核糖核苷酸負載物包括1-20,000個核苷酸、1-10,000個核苷酸、1-5,000個核苷酸、100-20,000個核苷酸、100-10,000個核苷酸、100-5,000個核苷酸、500-20,000個核苷酸、500-10,000個核苷酸、500-5,000個核苷酸、1,000-20,000個核苷酸、1,000-10,000個核苷酸或1,000-5,000個核苷酸。
在實施方式中，多核糖核苷酸負載物包括一個或多個表現（或編碼）序列，其中每個表現（或編碼）序列編碼多肽。在實施方式中，多核糖核苷酸負載物包括一個或多個非編碼序列。在實施方式中，多核糖核苷酸負載物完全由一個或多個非編碼序列組成。在實施方式中，多核糖核苷酸負載物包括表現（或編碼）和非編碼序列的組合。
在一些實施方式中，如本文所述製備的多核糖核苷酸用作治療或農業中的效應子。例如，可以向受試者投與藉由本文所述之方法（例如，本文所述之無細胞之方法）製備的環狀多核糖核苷酸（例如，在藥物、獸用、或農業組成物中）。在另一個實例中，可將藉由本文所述之方法（例如，本文所述之無細胞方法）製備的環狀多核糖核苷酸遞送到細胞。
在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括如PCT公開案號WO 2019/118919中揭露的任何特徵或特徵的任何組合，該文獻藉由引用以其全文特此併入。
在一些實施方式中，多核糖核苷酸負載物包括開放閱讀框。在一些實施方式中，開放閱讀框與IRES可操作地連接。開放閱讀框可以編碼RNA或多肽。在一些實施方式中，開放閱讀框編碼多肽，並且例如與編碼多肽的線性多核糖核苷酸相比，多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸）提供增加的多肽表現（例如，增加至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更多）。在一些實施方式中，例如與環狀和線性多核糖核苷酸的群體相比，多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸）的純度增加促使多肽的表現增加（例如，增加至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更多）。 多肽表現序列
在一些實施方式中，本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸的多核糖核苷酸負載物）包括一個或多個表現（或編碼）序列，其中每個表現序列編碼多肽。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個表現（或編碼）序列。
每個編碼的多肽可以是直鏈或支鏈的。在實施方式中，多肽具有約5至約40,000個胺基酸、約15至約35,000個胺基酸、約20至約30,000個胺基酸、約25至約25,000個胺基酸、約50至約20,000個胺基酸、約100至約15,000個胺基酸、約200至約10,000個胺基酸、約500至約5,000個胺基酸、約1,000至約2,500個胺基酸或它們之間的任何範圍的長度。在一些實施方式中，長度少於約40,000個胺基酸、少於約35,000個胺基酸、少於約30,000個胺基酸、少於約25,000個胺基酸、少於約20,000個胺基酸、少於約15,000個胺基酸、少於約10,000個胺基酸、少於約9,000個胺基酸、少於約8,000個胺基酸、少於約7,000個胺基酸、少於約6,000個胺基酸、少於約5,000個胺基酸、少於約4,000個胺基酸、少於約3,000個胺基酸、少於約2,500個胺基酸、少於約2,000個胺基酸、少於約1,500個胺基酸、少於約1,000個胺基酸、少於約900個胺基酸、少於約800個胺基酸、少於約700個胺基酸、少於約600個胺基酸、少於約500個胺基酸、少於約400個胺基酸、少於約300個胺基酸或更少的多肽可能是有用的。
本文包括的多肽可包括天然存在的多肽或非天然存在的多肽。在一些實施方式中，該多肽係或包括參考多肽的功能性片段或變體（例如，酶的酶活性片段或變體）。例如，該多肽可以是本文所述之任一多肽的功能活性變體，例如在指定區域或整個序列上與本文所述之多肽或天然存在的多肽的序列具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性。在一些情況下，多肽可以與目的蛋白具有至少50%（例如，至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、99%、或更大）同一性。
多肽的一些實例包括但不限於螢光標籤或標誌物、抗原、治療性多肽、或用於農業應用的多肽。
治療性多肽可以是激素、神經遞質、生長因子、酶（例如，氧化還原酶、代謝酶、粒線體酶、加氧酶、脫氫酶、ATP非依賴性酶、溶酶體酶、去飽和酶）、細胞介素、抗原結合多肽（例如，抗原結合抗體或抗體樣片段，諸如單鏈抗體、奈米抗體或其他含有Ig重鏈或輕鏈的多肽）、Fc融合蛋白、抗凝劑、血液因子、骨成形性蛋白質、干擾素、白介素和溶栓劑。
用於農業應用的多肽可以是細菌素、溶素、抗微生物多肽、抗真菌多肽、根瘤富含C的肽、細菌細胞調節肽、肽毒素、殺蟲多肽（例如，殺昆蟲多肽或殺線蟲多肽）、抗原結合多肽（例如，抗原結合抗體或抗體樣片段，諸如單鏈抗體、奈米抗體或其他含有Ig重鏈或輕鏈的多肽）、酶（例如，核酸酶、澱粉酶、纖維素酶、肽酶、脂肪酶、幾丁質酶）、肽資訊素和轉錄因子。
在一些情況下，多核糖核苷酸表現非人蛋白。
在一些實施方式中，多核糖核苷酸表現抗體，例如抗體片段或其部分。在一些實施方式中，由環狀多核糖核苷酸表現的抗體可以是任何同種型的，如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸表現抗體的一部分，如輕鏈、重鏈、Fc片段、CDR（互補決定區）、Fv片段、或Fab片段、其另外的部分。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸表現抗體的一個或多個部分。例如，環狀多核糖核苷酸可以包括多於一個表現序列，其中每一個表現抗體的一部分，並且其總和可以構成該抗體。在一些情況下，環狀多核糖核苷酸包括一個編碼抗體重鏈的表現序列和另一個編碼抗體輕鏈的表現序列。在一些情況下，當環狀多核糖核苷酸在細胞或無細胞環境中表現時，輕鏈和重鏈可以經受適當的修飾、折疊或其他翻譯後修飾以形成功能性抗體。
在實施方式中，多肽包括多個多肽，例如，一個多肽序列的多個拷貝、或多個不同的多肽序列。在實施方式中，多個多肽藉由連接子胺基酸或間隔胺基酸連接。
在實施方式中，多核苷酸負載物包括編碼訊息肽的序列。已經描述了許多訊息肽序列，例如，Tat（雙精胺酸易位）訊息序列通常是含有共有SRRxFLK「雙精胺酸」模體的N末端肽序列，其用於將含有這種Tat訊息肽的折疊蛋白易位穿過脂質雙層。還參見例如，在www[dot]signalpeptide[dot]de上可公開獲得的訊息肽數據庫。訊息肽也可用於將蛋白質導向特定的細胞器；參見例如，Spdb訊息肽數據庫中揭露的實驗確定和計算預測的訊息肽，該數據庫可在proline.bic.nus.edu.sg/spdb公開獲得。
在實施方式中，多核苷酸負載物包括編碼細胞穿透肽（CPP）的序列。已經描述了數百個CPP序列；參見例如，細胞穿透肽數據庫CPPsite，可在crdd.osdd.net/raghava/cppsite/上公開獲得。常用的CPP序列的實例係聚精胺酸序列，例如八精胺酸或九精胺酸，其可以融合到CGI肽的C末端。
在實施方式中，多核苷酸負載物包括編碼自組裝肽的序列；參見，例如Miki等人 (2021) Nature Communications [自然通訊], 21:3412, DOI: 10.1038/s41467-021-23794-6。
在一些實施方式中，表現序列包括poly-A序列（例如，在表現序列的3’端）。在一些實施方式中，poly-A序列的長度大於10個核苷酸。在一個實施方式中，poly-A序列的長度大於15個核苷酸（例如，至少或大於約10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、70個、80個、90個、100個、120個、140個、160個、180個、200個、250個、300個、350個、400個、450個、500個、600個、700個、800個、900個、1,000個、1,100個、1,200個、1,300個、1,400個、1,500個、1,600個、1,700個、1,800個、1,900個、2,000個、2,500個和3,000個核苷酸）。在一些實施方式中，根據國際專利公開案號WO 2019/118919 A1的 [0202]-[0204] 中poly-A序列的描述設計poly-A序列，該專利公開藉由引用以其全文併入本文。在一些實施方式中，表現序列缺乏poly-A序列（例如，在表現序列的3’端）。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括polyA、缺乏polyA或具有經修飾的polyA以調節環狀多核糖核苷酸的一種或多種特徵。在一些實施方式中，缺乏polyA或具有經修飾的polyA的環狀多核糖核苷酸改善了一種或多種功能特徵，例如免疫原性（例如，免疫或炎性反應的一種或多種標誌物的水平）、半衰期和/或表現效率。 治療性多肽
在一些實施方式中，本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸的多核糖核苷酸負載物）包括至少一個編碼治療性多肽的表現序列。治療性多肽係當向受試者投與或在受試者中表現時提供一些治療性益處的多肽。向受試者投與或在受試者中表現治療性多肽可用於治療或預防疾病、障礙或病症或其症狀。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸編碼兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種或更多種治療性多肽。
在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括編碼治療性蛋白的表現序列。該蛋白可治療有需要的受試者的疾病。在一些實施方式中，治療性蛋白可以補償有需要的受試者中突變的、表現不足的或缺少的蛋白。在一些實施方式中，治療性蛋白可以靶向有需要的受試者中的細胞、組織或病毒，與有需要的受試者中的細胞、組織或病毒相互作用或結合。
治療性多肽可以是可以從細胞分泌或定位於細胞的細胞質、細胞核或膜區室的多肽。
治療性多肽可以是激素、神經遞質、生長因子、酶（例如，氧化還原酶、代謝酶、粒線體酶、加氧酶、脫氫酶、ATP非依賴性酶、溶酶體酶、去飽和酶）、細胞介素、轉錄因子、抗原結合多肽（例如，抗原結合抗體或抗體樣片段，諸如單鏈抗體、奈米抗體或其他含有Ig重鏈或輕鏈的多肽）、Fc融合蛋白、抗凝劑、血液因子、骨成形性蛋白質、干擾素、白介素、溶栓劑、抗原（例如，腫瘤、病毒或細菌抗原）、核酸酶（例如，核酸內切酶，諸如Cas蛋白，例如Cas9）、膜蛋白（例如，嵌合抗原受體（CAR）、跨膜受體、G蛋白偶聯受體（GPCR）、受體酪胺酸激酶（RTK）、抗原受體、離子通道或膜運輸蛋白）、分泌蛋白、基因編輯蛋白（例如，CRISPR-Cas、TALEN或鋅指）或基因書寫蛋白（參見例如，國際專利公開案號WO 2020/047124，該文獻藉由引用以其全文併入本文）。
在一些實施方式中，治療性多肽係抗體，例如，全長抗體、抗體片段、或其一部分。在一些實施方式中，由多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸）表現的抗體可以是任何同種型的，比如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM。在一些實施方式中，多核糖核苷酸表現抗體的一部分，如輕鏈、重鏈、Fc片段、CDR（互補決定區）、Fv片段、或Fab片段、其另外的部分。在一些實施方式中，多核糖核苷酸表現抗體的一個或多個部分。例如，多核糖核苷酸可以包括多於一個表現序列，其中每一個表現抗體的一部分，並且其總和可以構成該抗體。在一些情況下，多核糖核苷酸包括一個編碼抗體重鏈的表現序列和另一個編碼抗體輕鏈的表現序列。當多核糖核苷酸在細胞中表現時，輕鏈和重鏈可以經受適當的修飾、折疊或其他翻譯後修飾以形成功能性抗體。
在一些實施方式中，如本文所述製備的多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸）在療法或農業中用作效應子。例如，可向受試者投與藉由本文所述之方法製備的多核糖核苷酸（例如，在藥物、獸用或農業組成物中）。在實施方式中，受試者係脊椎動物（例如，哺乳動物、鳥、魚、爬行動物或兩棲動物）。在實施方式中，受試者係人。在實施方式中，方法受試者係非人哺乳動物。在實施方式中，受試者係非人哺乳動物，諸如非人靈長類動物（例如猴、猿）、有蹄類動物（例如家牛、水牛、綿羊、山羊、豬、駱駝、美洲駝、羊駝、鹿、馬、驢）、肉食動物（例如狗、貓）、齧齒動物（例如大鼠、小鼠）或兔類動物（例如兔）。在實施方式中，受試者係鳥，諸如鳥類類群雞形目（例如雞、火雞、野雞、鵪鶉）、雁形目（例如鴨、鵝）、古顎下綱（例如鴕鳥、鴯鶓）、鴿形目（例如鴿子、野鴿）或鸚形目（例如鸚鵡）的成員。在實施方式中，受試者係無脊椎動物，諸如節肢動物（例如昆蟲、蛛形綱、甲殼類動物）、線蟲、環節動物、蠕蟲或軟體動物。在實施方式中，受試者係無脊椎動物農業有害生物或者寄生在無脊椎動物或脊椎動物宿主上的無脊椎動物。在實施方式中，受試者係植物，諸如被子植物（其可以是雙子葉植物或單子葉植物）或裸子植物（例如針葉樹、蘇鐵、買麻藤類植物、銀杏）、蕨類、馬尾植物、石鬆類或苔蘚植物。在實施方式中，受試者係真核藻類（單細胞或多細胞）。在實施方式中，受試者係具有農業或園藝重要性的植物，諸如行間作物、生產水果的植物和樹木、蔬菜、樹木以及觀賞植物（包括觀賞花、灌木、樹木、地被植物和草坪草）。 植物修飾多肽
在一些實施方式中，本文所述之多核糖核苷酸（例如，多核糖核苷酸的多核糖核苷酸負載物）包括至少一個編碼植物修飾多肽的表現序列。植物修飾多肽係指可以以使得植物生理學或表型發生變化（例如，植物的適應度增加或降低）的方式改變植物的遺傳特性（例如，增加基因表現、降低基因表現或者以其他方式改變DNA或RNA的核苷酸序列）、表觀遺傳特性或者生理學或生物化學特性的多肽。在一些實施方式中，多核糖核苷酸編碼兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種或更多種不同的植物修飾多肽，或者一種或多種植物修飾多肽的多個拷貝。植物修飾多肽可改變多種植物的生理學或表型或者增加或降低多種植物的適應度，或者可以是在一種或多種特定植物（例如，特定種或屬的植物）中實現這種改變的多肽。
可以用於本文的多肽的實例可以包括酶（例如，代謝重組酶、解旋酶、整合酶、RNAse、DNAse或泛素化蛋白）、成孔蛋白、傳訊配體、細胞穿透肽、轉錄因子、受體、抗體、奈米抗體、基因編輯蛋白（例如，CRISPR-Cas核酸內切酶、TALEN或鋅指）、核糖蛋白、蛋白質適體或伴侶蛋白。 農業多肽
在一些實施方式中，本文所述之多核糖核苷酸（例如，多核糖核苷酸的多核糖核苷酸負載物）包括至少一個編碼農業多肽的表現序列。農業多肽係適合於農業用途的多肽。在實施方式中，將農業多肽施用於植物或種子（例如，藉由葉噴、撒粉、注射或種子包衣）或者植物環境（例如，藉由土壤澆灌或顆粒土壤施用），從而使得植物的生理學、表型或適應度改變。農業多肽的實施方式包括改變寄宿於植物或非人動物宿主中或寄宿於其上的一種或多種微生物的水平、活性或代謝的多肽，該改變導致該宿主的適應度提高。在一些實施方式中，農業多肽係植物多肽。在一些實施方式中，農業多肽係昆蟲多肽。在一些實施方式中，當與非人類脊椎動物、無脊椎動物、微生物或植物細胞接觸時，農業多肽具有生物學作用。
在一些實施方式中，多核糖核苷酸編碼兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種或更多種農業多肽，或者一種或多種農業多肽的多個拷貝。
可用於農業應用的多肽的實施方式包括例如細菌素、溶素、抗微生物肽、根瘤富含C的肽和細菌細胞調節肽。此類多肽可以用於改變靶微生物的水平、活性或代謝以增加昆蟲（諸如蜜蜂和蠶）的適應度。農業上有用的多肽的實施方式包括肽毒素，如由昆蟲病原細菌（例如，蘇雲金芽孢桿菌（ Bacillus thuringiensis）、發光桿菌（ Photorhabdus luminescens）、嗜蟲沙雷氏菌（ Serratia entomophila）或嗜線蟲致病桿菌（ Xenorhabdus nematophila））天然產生的那些，如本領域中已知的。農業上有用的多肽的實施方式包括用於控制農業上重要的有害生物或病原體的多肽（包括小肽，諸如環二肽或二酮哌口井），例如用於控制植物中的疾病的抗微生物多肽或抗真菌多肽，或用於控制無脊椎有害生物諸如昆蟲或線蟲的殺蟲多肽（例如，殺昆蟲多肽或殺線蟲多肽）。農業上有用的多肽的實施方式包括抗體、奈米抗體、及其片段，例如，保留完整抗體或奈米抗體的至少一些（例如，至少10%）特異性結合活性的抗體或奈米抗體片段。農業上有用的多肽的實施方式包括轉錄因子，例如，植物轉錄因子；參見例如，列出了在模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）中鑒定的轉錄因子家族的「AtTFDB」數據庫，其可在agris-knowledgebase[dot]org/AtTFDB/上公開獲得。農業上有用的多肽的實施方式包括核酸酶，例如核酸外切酶或核酸內切酶（例如，Cas核酸酶，諸如Cas9或Cas12a）。農業上有用的多肽的實施方式進一步包括細胞穿透肽、酶（例如，澱粉酶、纖維素酶、肽酶、脂肪酶、幾丁質酶）、肽資訊素（例如，酵母交配資訊素、無脊椎動物繁殖和幼蟲傳訊資訊素，參見例如Altstein (2004) Peptides[肽], 25:1373-76）。 內部核糖體進入位點（ IRES ）
在一些實施方式中，本文所述之多核糖核苷酸（例如，多核糖核苷酸的多核糖核苷酸負載物）包括一個或多個內部核糖體進入位點（IRES）元件。在一些實施方式中，IRES與一個或多個表現序列可操作連接（例如，每個IRES與一個或多個表現序列可操作連接）。在實施方式中，IRES位於異源啟動子與編碼序列的5'端之間。
包括在多核糖核苷酸中的合適的IRES元件包括能夠接合真核核糖體的RNA序列。在一些實施方式中，IRES元件係至少約5 nt、至少約8 nt、至少約9 nt、至少約10 nt、至少約15 nt、至少約20 nt、至少約25 nt、至少約30 nt、至少約40 nt、至少約50 nt、至少約100 nt、至少約200 nt、至少約250 nt、至少約350 nt、或至少約500 nt。
在一些實施方式中，IRES元件衍生自生物體的DNA，該生物體包括但不限於病毒、哺乳動物和果蠅。此類病毒DNA可以衍生自但不限於小核糖核酸病毒互補DNA（cDNA）、腦心肌炎病毒（EMCV）cDNA和脊髓灰質炎病毒cDNA。在一個實施方式中，衍生IRES元件的果蠅DNA包括但不限於來自黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）的觸角足基因。
在一些實施方式中，如果存在，IRES序列係以下病毒的IRES序列：桃拉綜合症（Taura syndrome）病毒、錐獵蝽（Triatoma）病毒、泰勒氏腦脊髓炎病毒（Theiler's encephalomyelitis virus）、猿猴病毒40、紅火蟻（Solenopsis invicta）病毒1、禾穀縊管蚜（Rhopalosiphum padi）病毒、網狀內皮組織增生病毒、福爾曼脊髓灰質炎病毒（fuman poliovirus）1、普勞提婭失速腸病毒（Plautia stall intestine virus）、喀什米爾蜜蜂病毒、人鼻病毒2、假桃病毒葉蟬病毒（Homalodisca coagulata virus）-1、人類免疫缺陷病毒1型、假桃病毒葉蟬病毒-1、Himetobi P病毒、C型肝炎病毒、A型肝炎病毒、GB型肝炎病毒、口蹄疫病毒、人類腸道病毒71、馬鼻炎病毒、茶尺蠖（Ectropis obliqua）小核糖核酸樣病毒、腦心肌炎病毒（EMCV）、果蠅C病毒、十字花科煙草病毒、蟋蟀麻痹病毒、牛病毒性腹瀉病毒1、黑皇后細胞病毒、蚜蟲致死性麻痹病毒、禽腦脊髓炎病毒、急性蜜蜂麻痹病毒、木槿褪綠環斑病毒（Hibiscus chlorotic ringspot virus）、經典豬瘟病毒、人FGF2、人SFTPA1、人AML1/RUNX1、果蠅觸角足、人AQP4、人AT1R、人BAG-l、人BCL2、人BiP、人c-IAPl、人c-myc、人eIF4G、小鼠NDST4L、人LEF1、小鼠HIF1α、人n.myc、小鼠Gtx、人p27kipl、人PDGF2/c-sis、人p53、人Pim-l、小鼠Rbm3、果蠅reaper、犬Scamper、果蠅Ubx、人UNR、小鼠UtrA、人VEGF-A、人XIAP、薩里病毒（Salivirus）、科薩病毒（Cosavirus）、副腸孤病毒（Parechovirus）、果蠅無毛、釀酒酵母（S. cerevisiae）TFIID、釀酒酵母YAP1、人c-src、人FGF-l、猿猴小核糖核酸病毒、蕪菁皺縮病毒（Turnip crinkle virus）、eIF4G的適體、柯薩奇病毒（Coxsackievirus）B3（CVB3）或柯薩奇病毒A（CVB1/2）。在又另一實施方式中，IRES係柯薩奇病毒B3（CVB3）的IRES序列。在另外的實施方式中，IRES係腦心肌炎病毒的IRES序列。
在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括側接至少一個（例如2、3、4、5個或更多個）表現序列的至少一個IRES。在一些實施方式中，IRES側接至少一個（例如2、3、4、5個或更多個）表現序列的兩側。在一些實施方式中，多核糖核苷酸在每個表現序列的一側或兩側包括一個或多個IRES序列，導致所得肽和/或多肽的分離。
在一些實施方式中，多核糖核苷酸負載物包括IRES。例如，多核糖核苷酸負載物可包括環狀RNA IRES，例如如Chen等人. Mol. Cell [分子細胞] 81:1-19, 2021中所述，該文獻藉由引用以其全文特此併入。 調節元件
在一些實施方式中，本文所述之多核糖核苷酸（例如，多核糖核苷酸的多核糖核苷酸負載物）包括一個或多個調節元件。在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括調節元件，例如修飾多核糖核苷酸內表現序列的表現的序列。
調節元件可包括與編碼表現產物的表現序列相鄰定位的序列。調節元件可與相鄰序列可操作連接。如與不存在調節元件時表現的產物的量相比，調節元件可以增加表現的產物的量。另外，一個調節元件可增加串聯附接的多個表現序列表現的產物的量或數目。因此，一個調節元件可以增強一個或多個表現序列的表現。多個調節元件係熟悉該項技術者熟知的。
在一些實施方式中，調節元件係翻譯調節子。翻譯調節子可以調節多核糖核苷酸中表現序列的翻譯。翻譯調節子可以是翻譯增強子或抑制子。在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括與至少一個表現序列相鄰的至少一個翻譯調節子。在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括與每個表現序列相鄰的翻譯調節子。在一些實施方式中，翻譯調節子存在於每個表現序列的一側或兩側，導致表現產物例如肽和/或多肽的分離。
在一些實施方式中，調節元件係微RNA（miRNA）或miRNA結合位點。
調節元件的其他實例在例如國際專利公開案號WO 2019/118919的第[0154]-[0161]段中描述，該文獻藉由引用以其全文特此併入。 翻譯起始序列
在一些實施方式中，本文所述之多核糖核苷酸（例如，多核糖核苷酸的多核糖核苷酸負載物）包括至少一個翻譯起始序列。在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括與表現序列可操作地連接的翻譯起始序列。
在一些實施方式中，多核糖核苷酸編碼多肽並且可包括翻譯起始序列，例如起始密碼子。在一些實施方式中，翻譯起始序列包括Kozak或Shine-Dalgamo序列。在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括與表現序列相鄰的翻譯起始序列，例如Kozak序列。在一些實施方式中，翻譯起始序列係非編碼起始密碼子。在一些實施方式中，翻譯起始序列（例如Kozak序列）存在於每個表現序列的一側或兩側，導致表現產物的分離。在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括與表現序列相鄰的至少一個翻譯起始序列。在一些實施方式中，翻譯起始序列為多核糖核苷酸提供構象柔性。在一些實施方式中，翻譯起始序列在多核糖核苷酸的基本上單股的區域內。翻譯起始序列的其他實例在國際專利公開案號WO 2019/118919的第[0163]-[0165]段中描述，該文獻藉由引用以其全文特此併入。
多核糖核苷酸可包括多於1個起始密碼子，諸如但不限於至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少50個、至少60個或多於60個起始密碼子。翻譯可以在第一起始密碼子上起始或可以在第一起始密碼子的下游起始。
在一些實施方式中，多核糖核苷酸可在不是第一個起始密碼子的密碼子（例如AUG）處起始。多核糖核苷酸的翻譯可以起始於替代的翻譯起始序列，如但不限於ACG、AGG、AAG、CTG/CUG、GTG/GUG、ATA/AUA、ATT/AUU、TTG/UUG。在一些實施方式中，翻譯在選擇性條件（例如，應激誘導條件）下在替代性翻譯起始序列處開始。作為非限制性實例，多核糖核苷酸的翻譯可在替代性翻譯起始序列（諸如ACG）處開始。作為另一非限制性實例，多核糖核苷酸翻譯可以在替代的翻譯起始序列CTG/CUG處開始。作為另一非限制性實例，多核糖核苷酸翻譯可以在替代的翻譯起始序列GTG/GUG處開始。作為另一個非限制性實例，多核糖核苷酸可在重複相關的非AUG（RAN）序列（諸如包括短重複RNA段的替代性翻譯起始序列（例如，CGG、GGGGCC（SEQ ID NO: 1）、CAG、CTG））處開始翻譯。 終止元件
在一些實施方式中，本文所述之多核糖核苷酸（例如，多核糖核苷酸的多核糖核苷酸負載物）包括至少一個終止元件。在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括與表現序列可操作地連接的終止元件。在一些實施方式中，多核苷酸缺乏終止元件。
在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括一個或多個表現序列，並且每個表現序列可或可不具有終止元件。在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括一個或多個表現序列，並且表現序列缺少終止元件，使得多核糖核苷酸被連續翻譯。終止元件的排除可導致表現產物的滾環翻譯或連續表現。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括一個或多個表現序列，並且每個表現序列可或可不具有終止元件。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括一個或多個表現序列，並且表現序列缺乏終止元件，使得環狀多核糖核苷酸被連續翻譯。由於缺乏核糖體停滯或脫落，終止元件的排除可能導致表現產物例如肽或多肽的滾環翻譯或連續表現。在這種實施方式中，滾環翻譯藉由每個表現序列表現連續表現產物。在一些其他實施方式中，表現序列的終止元件可以是交錯元件的一部分。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸中的一個或多個表現序列包含終止元件。然而，在環狀多核糖核苷酸中進行滾環翻譯或後繼（例如，第二、第三、第四、第五等）表現序列的表現。在此類情況下，當核糖體遇到終止元件（例如，終止密碼子）並終止翻譯時，表現產物可以從核糖體上脫落。在一些實施方式中，在核糖體例如核糖體的至少一個亞基與環狀多核糖核苷酸保持接觸時翻譯終止。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸在一個或多個表現序列的端部包括終止元件。在一些實施方式中，一個或多個表現序列連續包含兩個或更多個終止元件。在此類實施方式中，翻譯終止並且滾環翻譯終止。在一些實施方式中，核糖體與環狀多核糖核苷酸完全脫離。在一些此類實施方式中，在環狀多核糖核苷酸中後繼（例如，第二、第三、第四、第五等）表現序列的產生可能需要核糖體在起始翻譯之前與環狀多核糖核苷酸重新接合。通常，終止元件包括發出翻譯終止信號的框內核苷酸三聯體，例如UAA、UGA、UAG。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸中的一個或多個終止元件係閱讀框移位的終止元件，例如但不限於，可終止翻譯的脫框（off-frame）或-1及+1移位的閱讀框（例如，隱藏的終止）。閱讀框移位的終止元件包括出現在表現序列的第二閱讀框和第三閱讀框中的核苷酸三聯體TAA、TAG和TGA。閱讀框移位的終止元件可能對防止通常對細胞有害的mRNA誤讀很重要。在一些實施方式中，終止元件係終止密碼子。
終止元件的其他實例在國際專利公開案號WO 2019/118919的第[0169]-[0170]段中描述，該文獻藉由引用以其全文特此併入。 非翻譯區
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括非翻譯區（UTR）。包括基因的基因組區域的UTR可以轉錄但不翻譯。在一些實施方式中，UTR可以被包括在本文所述之表現序列的翻譯起始序列的上游。在一些實施方式中，UTR可以被包括在本文所述之表現序列的下游。在一些情況下，第一表現序列的一個UTR與第二表現序列的另一個UTR相同或連續或重疊。
示例性非翻譯區在國際專利公開案號WO 2019/118919的第[0197]-[201]段中描述，該文獻藉由引用以其全文特此併入。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括poly-A序列。示例性poly-A序列在國際專利公開案號WO 2019/118919的第[0202]-[0205]段中描述，該文獻藉由引用以其全文特此併入。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺乏poly-A序列。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括內嵌有一段或多段的腺苷和尿苷的UTR。該等AU富集簽名可能會增加表現產物的轉化率。
富含UTR AU的元件（ARE）的引入、去除或修飾可用於調節環狀多核糖核苷酸的穩定性或免疫原性（例如，免疫或炎性反應的一種或多種標誌物的水平）。工程化特定的環狀多核糖核苷酸時，可以將ARE的一個或多個拷貝引入環狀多核糖核苷酸中，並且ARE的該等拷貝可以調節表現產物的翻譯和/或產生。同樣，可以對ARE進行鑒別和去除或工程化至環狀多核糖核苷酸以調節細胞內穩定性，從而影響所得蛋白質的翻譯和產生。
應當理解，可以將來自任何基因的任何UTR摻入環狀多核糖核苷酸的相應側翼區中。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺乏5'-UTR，並且能夠從其一個或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺乏3'-UTR，並且能夠從其一個或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺乏poly-A序列，並且能夠從其一個或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺乏終止元件，並且能夠從其一個或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺乏內部核糖體進入位點，並且能夠從其一個或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺乏帽，並且能夠從其一個或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺乏5'-UTR、3'-UTR和IRES，並且能夠從其一個或多個表現序列表現蛋白質。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸進一步包括以下序列中的一種或多種：編碼一個或多個miRNA的序列、編碼一個或多個複製蛋白的序列、編碼外源基因的序列、編碼治療劑的序列、調節元件（例如，翻譯調節子，例如翻譯增強子或抑制子）、翻譯起始序列、靶向內源基因的一種或多種調節核酸（例如，siRNA、lncRNA、shRNA）和編碼治療性mRNA或蛋白質的序列。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺乏5'-UTR。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺乏3'-UTR。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺乏poly-A序列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺乏終止元件。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺乏內部核糖體進入位點。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺乏核酸外切酶的降解易感性。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺乏降解易感性的事實可能意味著環狀多核糖核苷酸不被核酸外切酶降解，或在僅存在核酸外切酶時被降解的有限程度例如與不存在核酸外切酶時相當或相似。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸不被核酸外切酶降解。在一些實施方式中，當暴露於核酸外切酶時，環狀多核糖核苷酸降解減少。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺乏與帽結合蛋白的結合。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺乏5’帽。 交錯元件
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括與表現序列相鄰的至少一個交錯元件。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括與每個表現序列相鄰的交錯元件。在一些實施方式中，交錯元件存在於每個表現序列的一側或兩側，導致表現產物例如一種或多種肽和/或一種或多種多肽的分離。在一些實施方式中，交錯元件係一個或多個表現序列的一部分。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含一個或多個表現序列，並且該一個或多個表現序列中的每一個藉由環狀多核糖核苷酸上的交錯元件與後繼的表現序列隔開。在一些實施方式中，交錯元件阻止由 (a) 單個表現序列的兩輪翻譯或 (b) 兩個或更多個表現序列的一輪或多輪翻譯生成單一多肽。在一些實施方式中，交錯元件係與一個或多個表現序列隔開的序列。在一些實施方式中，交錯元件包括該一個或多個表現序列的表現序列的一部分。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括交錯元件。為了避免在保持滾環翻譯的同時產生連續表現產物，例如肽或多肽，可以包括交錯元件以在翻譯期間誘導核糖體暫停。在一些實施方式中，交錯元件在一個或多個表現序列中的至少一個的3'端。交錯元件可以被配置為在環狀多核糖核苷酸的滾環翻譯期間使核糖體停滯。交錯元件可包括但不限於2A樣或CHYSEL（SEQ ID NO: 2）（順式作用水解酶元件）序列。在一些實施方式中，交錯元件編碼具有C末端共有序列為X 1X 2X 3EX 5NPGP的序列，其中X 1不存在或G或H，X 2不存在或D或G，X 3係D或V或I或S或M，X 5係任何胺基酸（SEQ ID NO: 83）。在一些實施方式中，該序列包括具有強α-螺旋傾向的胺基酸的非保守序列，然後是共有序列-D(V/I)EXNPGP，其中x = 任何胺基酸（SEQ ID NO: 4）。交錯元件的一些非限定性實例包括GDVESNPGP（SEQ ID NO: 5）、GDIEENPGP（SEQ ID NO: 6）、VEPNPGP（SEQ ID NO: 7）、IETNPGP（SEQ ID NO: 8）、GDIESNPGP（SEQ ID NO: 9）、GDVELNPGP（SEQ ID NO: 10）、GDIETNPGP（SEQ ID NO: 11）、GDVENPGP（SEQ ID NO: 12）、GDVEENPGP（SEQ ID NO: 13）、GDVEQNPGP（SEQ ID NO: 14）、IESNPGP（SEQ ID NO: 15）、GDIELNPGP（SEQ ID NO: 16）、HDIETNPGP（SEQ ID NO: 17）、HDVETNPGP（SEQ ID NO: 18）、HDVEMNPGP（SEQ ID NO: 19）、GDMESNPGP（SEQ ID NO: 20）、GDVETNPGP（SEQ ID NO: 21）、GDIEQNPGP（SEQ ID NO: 22）和DSEFNPGP（SEQ ID NO: 23）。
在一些實施方式中，本文所述之交錯元件裂解表現產物，諸如在本文所述之共有序列的G與P之間。作為一個非限制性實例，環狀多核糖核苷酸包括至少一個交錯元件以裂解表現產物。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括與至少一個表現序列相鄰的交錯元件。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括在每個表現序列後的交錯元件。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括存在於每個表現序列的一側或兩側的交錯元件，導致由每個表現序列翻譯單獨肽和/或多肽。
在一些實施方式中，交錯元件包括一種或多種在翻譯過程中誘導核糖體暫停的經修飾的核苷酸或非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括肽核酸（PNA）、𠰌啉代和鎖核酸（LNA）、以及乙二醇核酸（GNA）和蘇糖核酸（TNA）。諸如此類的實例藉由改變分子主鏈而不同於天然存在的DNA或RNA。修飾可以包括對糖、核鹼基、核苷間鍵（例如，對連接磷酸鹽/磷酸二酯鍵/磷酸二酯主鏈）的修飾以及可以在翻譯期間誘導核糖體暫停的它們的任何組合。本文提供的一些示例性修飾在本文其他處描述。
在一些實施方式中，交錯元件以其他形式存在於環狀多核糖核苷酸中。例如，在一些示例性環狀多核糖核苷酸中，交錯元件包含環狀多核糖核苷酸中的第一表現序列的終止元件，和將終止元件與第一表現序列後繼表現的第一翻譯起始序列隔開的核苷酸間隔子序列。在一些實例中，第一表現序列的第一交錯元件在環狀多核糖核苷酸中的第一表現序列後繼表現的第一翻譯起始序列的上游（5'）。在一些情況下，第一表現序列和第一表現序列後繼表現序列係環狀多核糖核苷酸中的兩個隔開的表現序列。第一交錯元件和第一翻譯起始序列之間的距離可以使得第一表現序列及其後繼表現序列能夠連續翻譯。
在一些實施方式中，第一交錯元件包括終止元件，並將第一表現序列的表現產物與其後繼表現序列的表現產物隔開，從而產生離散的表現產物。在一些情況下，在環狀多核糖核苷酸中後繼序列的第一翻譯起始序列上游包含第一交錯元件的環狀多核糖核苷酸被連續翻譯，而在第二表現序列後繼表現序列的第二翻譯起始序列的上游包含第二表現序列的交錯元件的對應環狀多核糖核苷酸不被連續翻譯。在一些情況下，環狀多核糖核苷酸中僅存在一個表現序列，並且第一表現序列及其後繼表現序列係相同的表現序列。在一些示例性環狀多核糖核苷酸中，交錯元件包含環狀多核糖核苷酸中第一表現序列的第一終止元件，和將終止元件與下游翻譯起始序列隔開的核苷酸間隔子序列。在一些此類實例中，環狀多核糖核苷酸中第一交錯元件在第一表現序列的第一翻譯起始序列的上游（5'）。在一些情況下，第一交錯元件和第一翻譯起始序列之間的距離使得能夠連續翻譯第一表現序列和任何後繼表現序列。
在一些實施方式中，第一交錯元件將第一表現序列的一輪表現產物與第一表現序列的下一輪表現產物分開，從而產生離散的表現產物。在一些情況下，在環狀多核糖核苷酸中的第一序列的第一翻譯起始序列上游包含第一交錯元件的環狀多核糖核苷酸被連續翻譯，而在相應環狀多核糖核苷酸中的第二表現序列的第二翻譯起始序列上游包含交錯元件的相應環狀多核糖核苷酸不被連續翻譯。在一些情況下，相應環狀多核糖核苷酸中第二交錯元件與第二翻譯起始序列之間的距離係環狀多聚核苷酸中第一交錯元件與第一翻譯起始序列之間的距離的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍大。在一些情況下，第一交錯元件與第一翻譯起始之間的距離為至少2 nt、3 nt、4 nt、5 nt、6 nt、7 nt、8 nt、9 nt、10 nt、11 nt、12 nt、13 nt、14 nt、15 nt、16 nt、17 nt、18 nt、19 nt、20 nt、25 nt、30 nt、35 nt、40 nt、45 nt、50 nt、55 nt、60 nt、65 nt、70 nt、75 nt或更大。在一些實施方式中，第二交錯元件與第二翻譯起始之間的距離為至少2 nt、3 nt、4 nt、5 nt、6 nt、7 nt、8 nt、9 nt、10 nt、11 nt、12 nt、13 nt、14 nt、15 nt、16 nt、17 nt、18 nt、19 nt、20 nt、25 nt、30 nt、35 nt、40 nt、45 nt、50 nt、55 nt、60 nt、65 nt、70 nt、75 nt或大於第一交錯元件和第一翻譯起始之間的距離。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括多於一個表現序列。
交錯元件的實例在國際專利公開案號WO 2019/118919的第[0172]-[0175]段中描述，該文獻藉由引用以其全文特此併入。 非編碼序列
在一些實施方式中，本文所述之多核糖核苷酸（例如，多核糖核苷酸的多核糖核苷酸負載物）包括一個或多個非編碼序列，例如不編碼多肽表現的序列。在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或多於十個非編碼序列。在一些實施方式中，多核糖核苷酸不編碼多肽表現序列。
非編碼序列可以是天然的或合成的序列。在一些實施方式中，非編碼序列可以改變細胞行為，如例如淋巴細胞行為。在一些實施方式中，非編碼序列對於細胞RNA序列係反義的。
在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括調節核酸，該等調節核酸係RNA或RNA樣結構，典型地約5-500個鹼基對（bp）（取決於特定的RNA結構，例如miRNA 5-30 bp、IncRNA 200-500 bp）並且可以具有與細胞內表現的靶基因中的編碼序列相同（互補）或幾乎相同（基本上互補）的核鹼基序列。在實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括編碼RNA先質的調節核酸，該RNA先質可以被加工成較小的RNA，例如miRNA先質（其可以是從約50至約1000 bp）可以被加工成較小的miRNA中間體或成熟的miRNA。
長非編碼RNA（IncRNA）被定義為長於100個核苷酸的非蛋白編碼轉錄物。許多IncRNA被表徵為具有組織特異性。在與附近的蛋白編碼基因相反的方向上轉錄的不同IncRNA占很大比例（例如，在哺乳動物基因組中占總IncRNA的約20%）並且可能調節附近的基因的轉錄。在一個實施方式中，本文提供的多核糖核苷酸包括IncRNA的有義股。在一個實施方式中，本文提供的多核糖核苷酸包括IncRNA的反義股。
在實施方式中，多核糖核苷酸編碼與內源基因或基因產物（例如，mRNA）的全部或至少一個片段基本上互補或完全互補的調節核酸。在實施方式中，調節核酸與內含子和外顯子之間的邊界處、在外顯子之間的內部、或與外顯子相鄰的序列互補，從而防止特定基因的新生成的核RNA轉錄物成熟化為用於轉錄的mRNA。與特定基因互補的調節核酸可與該基因的mRNA雜交並防止其翻譯。反義調節核酸可以是DNA、RNA或其衍生物或雜交體。在一些實施方式中，調節核酸包括可以與參與內源基因或外源基因的表現調節的蛋白結合的蛋白結合位點。
在實施方式中，多核糖核苷酸的長度編碼與目的轉錄物雜交的調節核酸，其中調節RNA的長度為約5個至30個核苷酸，約10至30個核苷酸，或約11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個或多於30個核苷酸。在實施方式中，調節RNA與靶向轉錄物的序列同一性程度為至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。
在實施方式中，多核糖核苷酸編碼與靶基因的約5至約25個連續核苷酸相同的微RNA（miRNA）分子或編碼該miRNA的先質。在一些實施方式中，miRNA具有允許mRNA識別特定靶mRNA並與其結合的序列。在實施方式中，miRNA序列以二核苷酸AA開始，包括約30%-70%（約30%-60%、約40%-60%或約45%-55%）的GC含量，並且與待引入該序列的受試者（例如，哺乳動物）的基因組中除靶標之外的任何核苷酸序列不具有高百分比同一性，例如如藉由標準BLAST搜索確定的。
在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括至少一個miRNA（或miRNA先質），例如2、3、4、5、6個或更多個miRNA或miRNA先質。在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括編碼miRNA（或其先質）的序列，該miRNA（或其先質）與靶序列具有至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%或100%核苷酸序列互補性。
siRNA和shRNA類似於內源性微RNA（miRNA）基因的加工途徑中的中間體。在一些實施方式中，siRNA可以充當miRNA，並且反之亦然。像siRNA一樣，微RNA使用RISC來下調靶基因，但與siRNA不同，大多數動物miRNA都不切割mRNA。相反，miRNA藉由翻譯抑制或polyA去除和mRNA降解來降低蛋白輸出。已知的miRNA結合位點位於mRNA 3'UTR內；miRNA似乎靶向與從miRNA 5'端的第2-8個核苷酸幾乎完全互補的位點。該區域稱為種子區域。因為成熟siRNA和miRNA係可互換的，所以外源性siRNA下調具有與siRNA的種子互補性的mRNA。
已知miRNA序列的清單可在研究組織維護的數據庫中找到，該等組織如維康信託基金會桑格研究院（Wellcome Trust Sanger Institute）、賓夕法尼亞生物資訊學中心（Penn Center for Bioinformatics）、斯隆凱特靈癌症中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center）和歐洲分子生物學實驗室（European Molecule Biology Laboratory）等。已知的有效的siRNA序列和同源結合位點也很好地呈現在相關文獻中。藉由本領域已知的技術，RNAi分子易於設計和產生。此外，存在增加發現有效且特異性的序列模體的機會的計算工具。 蛋白質結合序列
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括一個或多個蛋白質結合位點，使得蛋白質例如核糖體能夠結合至RNA序列中的內部位點。藉由將蛋白質結合位點（例如核糖體結合位點）工程化至環狀多核糖核苷酸中，環狀多核糖核苷酸可以逃避或更少地被宿主的免疫系統檢測到，藉由掩蔽宿主免疫系統成分中的環狀多核糖核苷酸來調節降解或調節翻譯。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括至少一個免疫蛋白結合位點，例如用於逃避免疫反應，例如CTL（細胞毒性T淋巴細胞）反應。在一些實施方式中，免疫蛋白結合位點係結合至免疫蛋白並且有助於掩蔽為外源性的環狀多核糖核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方式中，免疫蛋白結合位點係結合至免疫蛋白並有助於將環狀多核糖核苷酸隱藏為外源或外來的核苷酸序列。
核糖體與線性RNA接合的傳統機制包括核糖體與RNA的加帽5'端的結合。核糖體從5’端遷移到起始密碼子，於是形成第一肽鍵。根據本揭露，環狀多核糖核苷酸的翻譯的內部起始（即，不依賴帽）不需要游離端或加帽端。而是，核糖體結合至未加帽的內部位點，由此核糖體在起始密碼子處開始多肽延長。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括一個或多個RNA序列，該RNA序列包括核糖體結合位點，例如起始密碼子。
天然5'UTR具有在翻譯起始中起作用的特徵。它們帶有類似Kozak序列的簽名，該等序列眾所周知參與核糖體起始多種基因的翻譯的過程。Kozak序列具有共有CCR（A/G）CCAUGG（SEQ ID NO: 24），其中R係起始密碼子（AUG）上游三個鹼基的嘌呤（腺嘌呤或鳥嘌呤），其後是另一個「G」。還已知5'UTR形成參與延長因子結合的二級結構。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸編碼與蛋白質結合的蛋白質結合序列。在一些實施方式中，蛋白質結合序列靶向環狀多核糖核苷酸或將其定位至特定靶標。在一些實施方式中，蛋白質結合序列特異性結合蛋白質的精胺酸富集區。
在一些實施方式中，蛋白質結合位點包括但不限於與蛋白質的結合位點，如ACIN1、AGO、APOBEC3F、APOBEC3G、ATXN2、AUH、BCCIP、CAPRIN1、CELF2、CPSF1、CPSF2、CPSF6、CPSF7、CSTF2、CSTF2T、CTCF、DDX21、DDX3、DDX3X、DDX42、DGCR8、EIF3A、EIF4A3、EIF4G2、ELAVL1、ELAVL3、FAM120A、FBL、FIP1L1、FKBP4、FMR1、FUS、FXR1、FXR2、GNL3、GTF2F1、HNRNPA1、HNRNPA2B1、HNRNPC、HNRNPK、HNRNPL、HNRNPM、HNRNPU、HNRNPUL1、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、ILF3、KHDRBS1、LARP7、LIN28A、LIN28B、m6A、MBNL2、METTL3、MOV10、MSI1、MSI2、NONO、NONO-、NOP58、NPM1、NUDT21、PCBP2、POLR2A、PRPF8、PTBP1、RBFOX2、RBM10、RBM22、RBM27、RBM47、RNPS1、SAFB2、SBDS、SF3A3、SF3B4、SIRT7、SLBP、SLTM、SMNDC1、SND1、SRRM4、SRSF1、SRSF3、SRSF7、SRSF9、TAF15、TARDBP、TIA1、TNRC6A、TOP3B、TRA2A、TRA2B、U2AF1、U2AF2、UNK、UPF1、WDR33、XRN2、YBX1、YTHDC1、YTHDF1、YTHDF2、YWHAG、ZC3H7B、PDK1、AKT1和任何其他結合RNA的蛋白質。 間隔子序列
在一些實施方式中，本文所述之多核糖核苷酸包括一個或多個間隔子序列。間隔子係指在兩個相鄰多核苷酸區域之間提供距離或柔性的任何連續核苷酸序列（例如，一個或多個核苷酸的連續核苷酸序列）。間隔子可存在於本文所述之任何核酸元件之間。間隔子也可存在於本文所述之核酸元件內。
間隔子的長度可以為例如至少5個（例如至少10個、至少15個、至少20個）核糖核苷酸。在一些實施方式中，每個間隔子區域的長度為至少5個（例如至少10個、至少15個、至少20個）核糖核苷酸。每個間隔子區域的長度可以為例如5至500個（例如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500個）核糖核苷酸。第一間隔子區域、第二間隔子區域或第一間隔子區域和第二間隔子區域可以包括polyA序列。第一間隔子區域、第二間隔子區域或第一間隔子區域和第二間隔子區域可以包括polyA-C序列。在一些實施方式中，第一間隔子區域、第二間隔子區域或第一間隔子區域和第二間隔子區域包括polyA-G序列。在一些實施方式中，第一間隔子區域、第二間隔子區域或第一間隔子區域和第二間隔子區域包括polyA-T序列。在一些實施方式中，第一間隔子區域、第二間隔子區域或第一間隔子區域和第二間隔子區域包括隨機序列。
間隔子也可存在於本文所述之核酸區域內。例如，多核苷酸負載物區可包括一個或多個間隔子。間隔子可以隔開多核苷酸負載物內的區域。
在一些實施方式中，間隔子序列的長度可以是例如至少10個核苷酸、至少15個核苷酸或至少30個核苷酸。在一些實施方式中，間隔子序列的長度係至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30個核苷酸。在一些實施方式中，間隔子序列的長度不超過100、90、80、70、60、50、45、40、35或30個核苷酸。在一些實施方式中，間隔子序列的長度係20至50個核苷酸。在某些實施方式中，間隔子序列的長度係10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸。
間隔子序列可以是polyA序列、polyA-C序列、polyC序列或poly-U序列。
在一些實施方式中，間隔子序列可以是polyA-T、polyA-C、polyA-G或隨機序列。
間隔子序列可用於將IRES與相鄰結構元件隔開，以保證IRES或相鄰元件的結構和功能。可以根據IRES將間隔子特異性工程化。在一些實施方式中，可以利用RNA折疊電腦軟體（如RNAFold）指導載體的各種元件（包括間隔子）的設計。
在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括5'間隔子序列（例如，在5'退火區域與多核糖核苷酸負載物之間）。在一些實施方式中，5'間隔子序列的長度係至少10個核苷酸。在另一實施方式中，5'間隔子序列的長度係至少15個核苷酸。在另外的實施方式中，5'間隔子序列的長度係至少30個核苷酸。在一些實施方式中，5'間隔子序列的長度係至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30個核苷酸。在一些實施方式中，5’間隔子序列的長度不超過100、90、80、70、60、50、45、40、35或30個核苷酸。在一些實施方式中，5'間隔子序列的長度係在20與50個核苷酸之間。在某些實施方式中，5'間隔子序列的長度係10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸。在一個實施方式中，5'間隔子序列係polyA序列。在另一實施方式中，5'間隔子序列係polyA-C序列。在一些實施方式中，5'間隔子序列包括polyA-G序列。在一些實施方式中，5'間隔子序列包括polyA-T序列。在一些實施方式中，5'間隔子序列包括隨機序列。
在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括3'間隔子序列（例如，在3'退火區域與多核糖核苷酸負載物之間）。在一些實施方式中，3'間隔子序列的長度係至少10個核苷酸。在另一實施方式中，3'間隔子序列的長度係至少15個核苷酸。在另外的實施方式中，3'間隔子序列的長度係至少30個核苷酸。在一些實施方式中，3'間隔子序列的長度係至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30個核苷酸。在一些實施方式中，3'間隔子序列的長度係不多於100、90、80、70、60、50、45、40、35或30個核苷酸。在一些實施方式中，3'間隔子序列的長度係20至50個核苷酸。在某些實施方式中，3'間隔子序列的長度係10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸。在一個實施方式中，3'間隔子序列係polyA序列。在另一實施方式中，5'間隔子序列係polyA-C序列。在一些實施方式中，5'間隔子序列包括polyA-G序列。在一些實施方式中，5'間隔子序列包括polyA-T序列。在一些實施方式中，5'間隔子序列包括隨機序列。
在一個實施方式中，多核糖核苷酸包括5'間隔子序列，但不包括3'間隔子序列。在另一實施方式中，多核糖核苷酸包括3'間隔子序列，但不包括5'間隔子序列。在另一實施方式中，多核糖核苷酸既不包括5'間隔子序列，也不包括3'間隔子序列。在另一實施方式中，多核糖核苷酸不包括IRES序列。在另外的實施方式中，多核糖核苷酸不包括IRES序列、5'間隔子序列或3'間隔子序列。
在一些實施方式中，間隔子序列包括至少3個核糖核苷酸、至少4個核糖核苷酸、至少5個核糖核苷酸、至少約8個核糖核苷酸、至少約10個核糖核苷酸、至少約12個核糖核苷酸、至少約15個核糖核苷酸、至少約20個核糖核苷酸、至少約25個核糖核苷酸、至少約30個核糖核苷酸、至少約40個核糖核苷酸、至少約50個核糖核苷酸、至少約60個核糖核苷酸、至少約70個核糖核苷酸、至少約80個核糖核苷酸、至少約90個核糖核苷酸、至少約100個核糖核苷酸、至少約120個核糖核苷酸、至少約150個核糖核苷酸、至少約200個核糖核苷酸、至少約250個核糖核苷酸、至少約300個核糖核苷酸、至少約400個核糖核苷酸、至少約500個核糖核苷酸、至少約600個核糖核苷酸、至少約700個核糖核苷酸、至少約800個核糖核苷酸、至少約900個核糖核苷酸或至少約100個核糖核苷酸。 生物反應器
在一些實施方式中，本文所述之任何純化多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸）之方法都可以在生物反應器中進行。生物反應器係指在其中進行化學或生物學過程的任何容器，該過程關於生物或衍生自此類生物的生物化學活性物質。生物反應器可以與本文所述之用於純化或產生環狀RNA的無細胞之方法相容。用於生物反應器的容器可包括培養瓶、培養皿或培養袋，它們可以是一次性使用的（一次性的）、可高壓滅菌的或可滅菌的。生物反應器可以由玻璃製成，或者其也可以是基於聚合物的，或者其也可以由其他材料製成。
生物反應器的實例包括但不限於攪拌罐（例如，充分混合的）生物反應器和管式（例如，活塞流）生物反應器、氣升式生物反應器、膜攪拌罐、旋轉過濾攪拌罐、振動混合器、流化床反應器、和膜生物反應器。操作生物反應器的模式可以是間歇的或連續的過程。當試劑和產物流連續地進出系統時，生物反應器係連續的。間歇式生物反應器可以具有連續的再循環流，但沒有連續的試劑進料或產物收穫。
本揭露的一些方法關於大規模生產多核糖核苷酸。對於大規模生產方法，該方法可在1升（L）至50 L或更大（例如，5 L、10 L、15 L、20 L、25 L、30 L、35 L、40 L、45 L、50 L或更大）的體積中進行。在一些實施方式中，該方法可在5 L至10 L、5 L至15 L、5 L至20 L、5 L至25 L、5 L至30 L、5 L至35 L、5 L至40 L、5 L至45 L、10 L至15 L、10 L至20 L、10 L至25 L、20 L至30 L、10 L至35 L、10 L至40 L、10 L至45 L、10 L至50 L、15 L至20 L、15 L至25 L、15 L至30 L、15 L至35 L、15 L至40 L、15 L至45 L或15至50 L的體積中進行。
在一些實施方式中，生物反應器可生產至少1 g RNA。在一些實施方式中，生物反應器可生產1-200 g的RNA（例如，1-10 g、1-20 g、1-50 g、10-50 g、10-100 g、50-100 g或50-200 g的RNA）。在一些實施方式中，生產的量係每升（例如，每升1-200 g）、每批次或反應（例如，每批次或反應1-200 g）或每單位時間（例如，每小時或每天1-200 g）測量的。
在一些實施方式中，可串聯使用多於一個生物反應器以增加生產能力（例如，可串聯使用一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個或九個生物反應器）。 使用方法
在一些實施方式中，如本文所述製備的多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸）在療法或農業中用作效應子。
例如，可以向受試者投與藉由本文所述之方法純化的多核糖核苷酸（例如，在藥物、獸用、或農業組成物中）。在一些實施方式中，受試者係脊椎動物（例如，哺乳動物、鳥、魚、爬行動物、或兩棲動物）。在一些實施方式中，受試者係人。在一些實施方式中，受試者係非人哺乳動物。在實施方式中，受試者係非人哺乳動物，諸如非人靈長類動物（例如猴、猿）、有蹄類動物（例如家牛、水牛、綿羊、山羊、豬、駱駝、美洲駝、羊駝、鹿、馬、驢）、肉食動物（例如狗、貓）、齧齒動物（例如大鼠、小鼠）或兔類動物（例如兔）。在實施方式中，受試者係鳥，諸如鳥類類群雞形目（例如雞、火雞、野雞、鵪鶉）、雁形目（例如鴨、鵝）、古顎下綱（例如鴕鳥、鴯鶓）、鴿形目（例如鴿子、野鴿）或鸚形目（例如鸚鵡）的成員。在實施方式中，受試者係無脊椎動物，諸如節肢動物（例如昆蟲、蛛形綱、甲殼類動物）、線蟲、環節動物、蠕蟲或軟體動物。在實施方式中，受試者係無脊椎動物農業有害生物或者寄生在無脊椎動物或脊椎動物宿主上的無脊椎動物。在實施方式中，受試者係植物，諸如被子植物（其可以是雙子葉植物或單子葉植物）或裸子植物（例如針葉樹、蘇鐵、買麻藤類植物、銀杏）、蕨類、馬尾植物、石鬆類或苔蘚植物。在實施方式中，受試者係真核藻類（單細胞或多細胞）。在實施方式中，受試者係具有農業或園藝重要性的植物，諸如行間作物、生產水果的植物和樹木、蔬菜、樹木以及觀賞植物（包括觀賞花、灌木、樹木、地被植物和草坪草）。
在一些實施方式中，本揭露提供了一種藉由向受試者提供本文所述之組成物或配製物來改變受試者之方法。在一些實施方式中，組成物或配製物係或包括核酸分子（例如，本文所述之DNA分子或RNA分子），並且向真核受試者提供多核苷酸。在一些實施方式中，組成物或配製物係或包括包含本文所述之核酸的真核或原核細胞。
在一些實施方式中，本揭露提供了一種藉由向有需要的受試者提供本文所述之組成物或配製物來治療受試者的病症之方法。在一些實施方式中，組成物或配製物係或包括核酸分子（例如，本文所述之DNA分子或多核糖核苷酸），並且向真核受試者提供多核苷酸。在一些實施方式中，組成物或配製物係或包括包含本文所述之核酸的真核或原核細胞。
在一些實施方式中，本揭露提供了一種藉由向受試者提供包含本文所述之多核苷酸的真核或原核細胞來向受試者提供多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸）之方法。 配製物
在本揭露的一些實施方式中，本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸）可被配製在組成物中，例如用於遞送到細胞、植物、無脊椎動物、非人脊椎動物或人類受試者的組成物，例如農業、獸用或藥物組成物。在一些實施方式中，多核糖核苷酸被配製在藥物組成物中。在一些實施方式中，組成物包含多核糖核苷酸和稀釋劑、載劑、佐劑或它們的組合。在特定實施方式中，組成物包含本文所述之多核糖核苷酸和載劑或不含任何載劑的稀釋劑。在一些實施方式中，包括多核糖核苷酸和不含任何載劑的稀釋劑的組成物用於將多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸）裸遞送給受試者。
藥物組成物可視需要包含一種或多種額外活性物質，例如治療和/或預防活性物質。藥物組成物可以視需要包含充當本文所述之組成物（例如，包含環狀多核糖核苷酸的組成物）的媒介物或介質的非活性物質，諸如由美國食品和藥品管理局（United States Food and Drug Administration）（FDA）批准並且在非活性成分數據中列出的任一種非活性成分。本發明之藥物組成物可以是無菌的和/或無熱原的。可在以下文獻中找到藥劑的配製和/或製造中的一般考慮：例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy [雷明頓：藥物科學與實踐] 第21版, Lippincott Williams & Wilkins [利平科特•威廉斯和威爾金斯出版公司], 2005 （藉由引用併入本文中）。非活性物質的非限制性實例包括溶劑、水性溶劑、非水性溶劑、分散介質、稀釋劑、分散體、懸浮助劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑、乳化劑、防腐劑、聚合物、肽、蛋白質、細胞、透明質酸酶、分散劑、製粒劑、崩散劑、黏合劑、緩衝劑（例如，磷酸鹽緩衝鹽水（PBS））、潤滑劑、油、及其混合物。
儘管本文提供的藥物組成物的描述主要針對適合於投與至人的藥物組成物，但是熟悉該項技術者應理解，此類組成物適合於投與至任何其他動物，例如非人動物，例如非人哺乳動物。為了使組成物適合於投與於各種動物而對適合於投與於人的藥物組成物的修飾係熟知的，並且普通獸醫藥理師可僅藉由普通實驗（如果有的話）來設計和/或進行此種修飾。設想投與藥物組成物的受試者包括但不限於人和/或其他靈長類動物；哺乳動物，包括商業相關的哺乳動物，諸如家牛、豬、馬、綿羊、貓、狗、小鼠和/或大鼠；和/或鳥類，包括商業相關的鳥類，諸如家禽、雞、鴨、鵝和/或火雞。
本文所述之藥物組成物的配製物可藉由藥理學領域中已知的或以後開發的任何方法來製備。通常，此類製備方法包括以下步驟：使活性成分與賦形劑和/或一種或多種其他輔助成分結合，並且然後，如果必要和/或期望的話，將產品分開、成形和/或包裝。
在一些實施方式中，關於製劑中存在的線性多核糖核苷酸分子的量的參考標準係存在不超過1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、15 ng/ml、20 ng/ml、25 ng/ml、30 ng/ml、35 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/ml、600 ng/ml、1 µg/ml、10 µg/ml、50 µg/ml、100 µg/ml、200 g/ml、300 µg/ml、400 µg/ml、500 µg/ml、600 µg/ml、700 µg/ml、800 µg/ml、900 µg/ml、1 mg/ml、1.5 mg/ml、或2 mg/ml的線性多核糖核苷酸分子。
在一些實施方式中，關於製劑中存在的環狀多核糖核苷酸分子的量的參考標準係占藥物製劑中的總核糖核苷酸分子至少30%（w/w）、40%（w/w）、50%（w/w）、60%（w/w）、70%（w/w）、80%（w/w）、85%（w/w）、90%（w/w）、91%（w/w）、92%（w/w）、93%（w/w）、94%（w/w）、95%（w/w）、96%（w/w）、97%（w/w）、98%（w/w）、99%（w/w）、99.1%（w/w）、99.2%（w/w）、99.3%（w/w）、99.4%（w/w）、99.5%（w/w）、99.6%（w/w）、99.7%（w/w）、99.8%（w/w）、99.9%（w/w）、或100%（w/w）的分子。
在一些實施方式中，關於製劑中存在的線性多核糖核苷酸分子的量的參考標準係占藥物製劑中的總核糖核苷酸分子不超過0.5%（w/w）、1%（w/w）、2%（w/w）、5%（w/w）、10%（w/w）、15%（w/w）、20%（w/w）、25%（w/w）、30%（w/w）、40%（w/w）、50%（w/w）的線性多核糖核苷酸分子。
在一些實施方式中，關於製劑中存在的經切口多核糖核苷酸分子的量的參考標準係占藥物製劑中的總核糖核苷酸分子不超過0.5%（w/w）、1%（w/w）、2%（w/w）、5%（w/w）、10%（w/w）、或15%（w/w）的經切口多核糖核苷酸分子。
在一些實施方式中，關於製劑中存在的組合的經切口和線性多核糖核苷酸分子的量的參考標準係占藥物製劑中的總核糖核苷酸分子不超過0.5%（w/w）、1%（w/w）、2%（w/w）、5%（w/w）、10%（w/w）、15%（w/w）、20%（w/w）、25%（w/w）、30%（w/w）、40%（w/w）、50%（w/w）的組合的經切口和線性多核糖核苷酸分子。在一些實施方式中，藥物製劑係最終環狀多核糖核苷酸成品藥的中間體藥物製劑。在一些實施方式中，藥物製劑係原料藥或活性藥物成分（API）。在一些實施方式中，藥物製劑係用於投與至受試者的成品藥。
在一些實施方式中，對環狀多核糖核苷酸的製劑（在減少線性RNA之前、期間或之後）進一步處理以基本上去除DNA、蛋白質污染物、雜質或副產物（例如，細胞蛋白質（比如宿主細胞蛋白質）或蛋白質製程雜質）、內毒素、單核苷酸分子和/或製程相關雜質。 鹽
在一些情況下，本文提供的組成物或藥物組成物包含一種或多種鹽。為了控制張度，本文提供的組成物可以包含生理鹽諸如鈉鹽。其他鹽可以包括氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉和/或氯化鎂等。在一些情況下，該組成物與一種或多種藥學上可接受的鹽一起配製。該一種或多種藥學上可接受的鹽可以包括無機離子，諸如鈉、鉀、鈣、鎂離子等的那些鹽。此類鹽可以包括與無機酸或有機酸的鹽，該無機酸或有機酸諸如鹽酸、氫溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、乙酸、富馬酸、琥珀酸、乳酸、苦杏仁酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸或馬來酸。多核糖核苷酸能以線性或環狀形式存在。 緩衝劑 /pH
本文提供的組成物或藥物組成物可以包含一種或多種緩衝劑，諸如Tris緩衝劑；硼酸鹽緩衝劑；琥珀酸鹽緩衝劑；組胺酸緩衝劑（例如，含氫氧化鋁佐劑）；或檸檬酸鹽緩衝劑。在一些情況下，包含5-20 mM範圍內的緩衝劑。
本文提供的組成物或藥物組成物可以具有約5.0至約8.5、約6.0至約8.0、約6.5至約7.5、或約7.0至約7.8的pH。該組成物或藥物組成物可以具有約7的pH。多核糖核苷酸能以線性或環狀形式存在。 洗滌劑 / 表面活性劑
根據預期的投與途徑，本文提供的組成物或藥物組成物可以包含一種或多種洗滌劑和/或表面活性劑，例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯表面活性劑（通常稱為「吐溫（Tween）」），例如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80；以DOWFAX™商標出售的環氧乙烷（EO）、環氧丙烷（PO）和/或環氧丁烷（BO）的共聚物，諸如線性EO/PO嵌段共聚物；重複的乙氧基(氧基-l,2-乙二基)基團的數目可以變化的辛基酚聚醚，例如辛基酚聚醚-9（Triton X-100或三級辛基苯氧基聚乙氧基乙醇）；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇（IGEPAL CA-630/NP-40）；磷脂，比如磷脂醯膽鹼（卵磷脂）；壬基酚聚氧乙烯醚，諸如Tergitol™ NP系列；衍生自月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚（稱為Brij表面活性劑），諸如三乙二醇單月桂基醚（Brij 30）；和脫水山梨糖醇酯（通常稱為「SPAN」），諸如脫水山梨糖醇三油酸酯（Span 85）和脫水山梨糖醇單月桂酸酯、辛基酚聚醚（諸如辛基酚聚醚9（Triton X-100）或三級辛基苯氧基聚乙氧基乙醇）、十六烷基三甲基溴化銨（「CTAB」）或去氧膽酸鈉。該一種或多種洗滌劑和/或表面活性劑可僅以痕量存在。在一些情況下，該組成物可以包含小於各1 mg/ml的辛基酚聚醚-10和聚山梨醇酯80。在本文中可使用非離子表面活性劑。表面活性劑可以按其「HLB」（親水/親脂平衡值）進行分類。在一些情況下，表面活性劑的HLB為至少10、至少15和/或至少16。多核糖核苷酸能以線性或環狀形式存在。 稀釋劑
在一些實施方式中，本揭露的組成物包含多核糖核苷酸和稀釋劑。在一些實施方式中，本揭露的組成物包含線性多核糖核苷酸和稀釋劑。
稀釋劑可以是非載劑賦形劑。非載劑賦形劑用作組成物（諸如，如本文所述之環狀多核糖核苷酸）的媒介物或介質。非載劑賦形劑用作組成物（諸如，如本文所述之線性多核糖核苷酸）的媒介物或介質。非載劑賦形劑的非限制性實例包括溶劑、水性溶劑、非水性溶劑、分散介質、稀釋劑、分散體、懸浮助劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑、乳化劑、防腐劑、聚合物、肽、蛋白質、細胞、透明質酸酶、分散劑、製粒劑、崩散劑、黏合劑、緩衝劑（例如，磷酸鹽緩衝鹽水（PBS））、潤滑劑、油及其混合物。非載劑賦形劑可以是經美國食品和藥物管理局（FDA）批准並列在非活性成分數據庫中的不表現出細胞穿透作用的任一種非活性成分。非載劑賦形劑可以是適於投與給非人類動物（例如，適合獸醫用途）的任何非活性成分。為了使組成物適於向各種動物投與，對適於向人投與的組成物的修飾得到很好的理解，並且普通技術的獸醫藥理師可以僅藉由普通的實驗（如果有）來設計和/或進行此類修飾。
在一些實施方式中，多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸）可以以裸遞送配製物的形式遞送，諸如包含稀釋劑。裸遞送配製物將多核糖核苷酸遞送至細胞，無需借助於載劑並且無需對多核糖核苷酸、加帽的多核糖核苷酸或其複合物進行修飾或部分或完全包封。
裸遞送配製物係不含載劑的配製物並且其中多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸）沒有結合有助於遞送至細胞的部分的共價修飾，或者沒有對多核糖核苷酸的部分或完全包封。在一些實施方式中，沒有結合有助於遞送至細胞的部分的共價修飾的多核糖核苷酸係未與蛋白質、小分子、顆粒、聚合物或生物聚合物共價結合的多核糖核苷酸。沒有結合有助於遞送至細胞的部分的共價修飾的多核糖核苷酸不含經修飾的磷酸基團。例如，沒有結合有助於遞送至細胞的部分的共價修飾的多核糖核苷酸不含硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼代磷酸鹽、硼代磷酸酯、磷酸氫鹽、胺基磷酸酯、二胺基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯或磷酸三酯。
在一些實施方式中，裸遞送配製物不含任何或所有轉染試劑、陽離子載劑、碳水化合物載劑、奈米顆粒載劑或蛋白質載劑。在一些實施方式中，裸遞送配製物不含植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精、酸酐改性的植物糖原β-糊精、脂轉染胺（lipofectamine）、聚乙烯亞胺、聚(三亞甲基亞胺)、聚(四乙烯亞胺)、聚丙烯亞胺、胺基糖苷-多胺、雙去氧-二胺基-b-環糊精、精胺、亞精胺、聚(2-二甲胺基)乙基甲基丙烯酸酯、聚(離胺酸)、聚(組胺酸)、聚(精胺酸)、陽離子化明膠、樹狀聚合物、殼聚糖、l,2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷（DOTAP）、N-[1-(2,3-二油醯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨（DOTMA）、l-[2-(油醯基氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羥乙基)咪唑鎓氯化物（DOTIM）、2,3-二油醯基氧基-N-[2(精胺甲醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-l-丙烷銨三氟乙酸酯（DOSPA）、3B-[N-(N\N'-二甲基胺基乙烷)-胺基甲醯基]膽固醇鹽酸鹽（DC-膽固醇鹽酸鹽）、雙十七烷基醯胺基甘胺醯亞精胺（DOGS）、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨（DDAB）、N-(l,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨（DMRIE）、N,N-二油基-N,N-二甲基氯化銨（DODAC）、人血清白蛋白（HSA）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）或球蛋白。
在某些實施方式中，裸遞送配製物包括非載劑賦形劑。在一些實施方式中，非載劑賦形劑包括不表現出細胞穿透作用的非活性成分。在一些實施方式中，非載劑賦形劑包括緩衝劑，例如PBS。在一些實施方式中，非載劑賦形劑係溶劑、非水性溶劑、稀釋劑、懸浮助劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑、乳化劑、防腐劑、聚合物、肽、蛋白質、細胞、透明質酸酶、分散劑、製粒劑、崩散劑、黏合劑、緩衝劑、潤滑劑或油。
在一些實施方式中，裸遞送配製物包括稀釋劑。稀釋劑可以是液體稀釋劑或固體稀釋劑。在一些實施方式中，稀釋劑係RNA增溶劑、緩衝劑或等滲劑。RNA增溶劑的實例包括水、乙醇、甲醇、丙酮、甲醯胺和2-丙醇。緩衝劑的實例包括2-(N-𠰌啉代)乙磺酸（MES）、Bis-Tris、2-[(2-胺基-2-氧乙基)-(羧甲基)胺基]乙酸（ADA）、N-(2-乙醯胺基)-2-胺基乙磺酸（ACES）、哌𠯤-N,N'-雙(2-乙磺酸)（PIPES）、2-[[1,3-二羥基-2-(羥甲基)丙-2-基]胺基]乙磺酸（TES）、3-(N-𠰌啉代)丙磺酸（MOPS）、4-(2-羥乙基)-1-哌𠯤乙磺酸（HEPES）、Tris、Tricine、Gly-Gly、Bicine或磷酸鹽。等滲劑的實例包括甘油、甘露醇、聚乙二醇、丙二醇、海藻糖或蔗糖。 載劑
在一些實施方式中，本揭露的組成物包含環狀多核糖核苷酸和載劑。在一些實施方式中，本揭露的組成物包含線性多核糖核苷酸和載劑。
在某些實施方式中，組成物在囊泡或其他基於膜的載劑中包括如本文所述之環狀多核糖核苷酸。在某些實施方式中，組成物在囊泡或其他基於膜的載劑中包括如本文所述之線性多核糖核苷酸。
在其他實施方式中，組成物在細胞、囊泡或其他基於膜的載劑中或經由細胞、囊泡或其他基於膜的載劑包括環狀多核糖核苷酸。在其他實施方式中，組成物在細胞、囊泡或其他基於膜的載劑中或經由細胞、囊泡或其他基於膜的載劑包括線性多核糖核苷酸。在一個實施方式中，組成物在脂質體或其他類似囊泡中包括環狀多核糖核苷酸。在一個實施方式中，組成物在脂質體或其他類似囊泡中包括線性多核糖核苷酸。脂質體係球形囊泡結構，該等球形囊泡結構由圍繞內部水性隔室的單層或多層的脂質雙層和相對不可滲透的外部親脂性磷脂雙層構成。脂質體可以是陰離子的、中性的或陽離子的。脂質體具有生物相容性，無毒，可以遞送親水性和親脂性藥物分子，保護其負載物免受血漿酶的降解，並且將其負載轉運穿過生物膜和血腦屏障（BBB）（關於綜述，參見例如，Spuch和Navarro, Journal of Drug Delivery [藥物遞送雜誌], 第2011卷, 文章ID 469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679）。
囊泡可以由若干種不同類型的脂質製成；然而，磷脂最常用於生成脂質體作為藥物載劑。用於製備多層囊泡脂質之方法係本領域已知的（參見例如美國專利案號6,693,086，其關於多層囊泡脂質製備的教導內容藉由引用併入本文）。儘管當脂質膜與水性溶液混合時，囊泡形成可以是自發的，但也可以藉由經由使用均質器、超音波波儀或擠壓設備以振盪的形式施加力來加快囊泡形成（關於綜述，參見例如，Spuch和Navarro, Journal of Drug Delivery [藥物遞送雜誌], 第2011卷, 文章ID 469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679）。可以藉由擠出通過具有減小尺寸的過濾器來製備擠出的脂質，如Templeton等人, Nature Biotechnol [自然 生物技術], 15:647-52, 1997中所述，該文獻關於擠出脂質製備的教導內容藉由引用併入本文。
在某些實施方式中，本揭露的組成物包含多核糖核苷酸和脂質奈米顆粒，例如本文所述之脂質奈米顆粒。在某些實施方式中，本揭露的組成物包含線性多核糖核苷酸和脂質奈米顆粒。脂質奈米顆粒係為如本文所述之多核糖核苷酸分子提供生物相容性和可生物降解的遞送系統的載劑的另一個實例。脂質奈米顆粒係為如本文所述之線性多核糖核苷酸分子提供生物相容性和可生物降解的遞送系統的載劑的另一個實例。奈米結構化的脂質載劑（NLC）係經修飾的固體脂質奈米顆粒（SLN），該等經修飾的固體脂質奈米顆粒保留了SLN的特徵、改善了藥物穩定性和負載能力、並且防止了藥物洩漏。聚合物奈米顆粒（PNP）係藥物遞送的重要組成部分。該等奈米顆粒可以有效地將藥物遞送引導至特定靶標並且改善藥物穩定性和受控的藥物釋放。也可以使用脂質聚合物奈米顆粒（PLN），即一種組合了脂質體和聚合物的新型載劑。該等奈米顆粒具有PNP和脂質體的互補優勢。PLN由核-殼結構構成；聚合物核提供了穩定的結構，並且磷脂殼提供了良好的生物相容性。這樣，這兩種組分增加了藥物包封效率、促進了表面修飾、並且防止了水溶性藥物的洩漏。有關綜述，參見例如，Li等人2017, Nanomaterials [奈米材料] 7, 122; doi:10.3390/nano7060122。
載劑的其他非限制性實例包括碳水化合物載劑（例如，酸酐改性的植物糖原或糖原型材料）、蛋白質載劑（例如，與多核糖核苷酸共價連接的蛋白質或與線性多核糖核苷酸共價連接的蛋白質）或陽離子載劑（例如，陽離子脂質聚合物或轉染試劑）。碳水化合物載劑的非限制性實例包括植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精、和酸酐修飾的植物糖原β-糊精。陽離子載劑的非限制性實例包括脂轉染胺、聚乙烯亞胺、聚(三亞甲基亞胺)、聚(四乙烯亞胺)、聚丙烯亞胺、胺基糖苷-多胺、雙去氧-二胺基-b-環糊精、精胺、亞精胺、聚(2-二甲胺基)乙基甲基丙烯酸酯、聚(離胺酸)、聚(組胺酸)、聚(精胺酸)、陽離子化明膠、樹狀聚合物、殼聚糖、l,2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷（DOTAP）、N-[1-(2,3-二油醯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨（DOTMA）、l-[2-(油醯基氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羥乙基)咪唑啉鎓氯化物（DOTIM）、2,3-二油醯基氧基-N-[2(精胺甲醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-l-丙烷銨三氟乙酸酯（DOSPA）、3B-[N—(N\N'-二甲基胺基乙烷)-胺基甲醯基]膽固醇鹽酸鹽（DC-膽固醇鹽酸鹽）、雙十七烷基醯胺基甘胺醯亞精胺（DOGS）、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨（DDAB）、N-(l,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨（DMRIE）、和N,N-二油基-N,N-二甲基氯化銨（DODAC）。蛋白質載劑的非限制性實例包括人血清白蛋白（HSA）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、或球蛋白。
外泌體也可用作本文所述之組成物或製劑的藥物遞送媒介物。外泌體可用作本文所述之線性多核糖核苷酸組成物或製劑的藥物遞送媒介物。對於綜述，參見Ha等人2016年7月.Acta Pharmaceutica Sinica B [藥學學報] 第6卷第4期, 第287-96頁; doi.org/10.1016/j.apsb.2016.02.001。
離體分化的紅血球也可用作本文所述組成物或製劑的載劑。離體分化的紅血球也可用作本文所述之線性多核糖核苷酸組成物或製劑的載劑。參見，例如，國際專利公開案號WO 2015/073587；WO 2017/123646；WO 2017/123644；WO 2018/102740；WO 2016/183482；WO 2015/153102；WO 2018/151829；WO 2018/009838；Shi等人. 2014. Proc Natl Acad Sci USA [美國國家科學院院刊].111(28): 10131-10136；美國專利9,644,180；Huang等人. 2017. Nature Communications [自然 通訊] 8: 423；Shi等人. 2014. Proc Natl Acad Sci USA [美國國家科學院院刊]. 111(28): 10131-10136。
例如國際專利公開案號WO 2018/208728中所述之融合體組成物也可以用作載劑遞送本文所述之多核糖核苷酸分子。例如WO 2018/208728中所述之融合體組成物也可以用作載劑遞送本文所述之線性多核糖核苷酸分子。
病毒體和病毒樣顆粒（VLP）也可用作載劑將本文所述之多核糖核苷酸分子遞送至靶向的細胞。病毒體和病毒樣顆粒（VLP）也可用作載劑將本文所述之線性多核糖核苷酸分子遞送至靶向的細胞。
例如國際專利公開案號WO 2011/097480、WO 2013/070324、WO 2017/004526或WO 2020/041784中所述之植物奈米囊泡和植物信使包（PMP）也可用作載劑遞送本文所述之組成物或製劑。植物奈米囊泡和植物信使包（PMP）也可用作載劑遞送本文所述之線性多核糖核苷酸組成物或製劑。
微泡也可以用作載劑遞送本文所述之多核糖核苷酸分子。微泡也可用作載劑遞送本文所述之線性多核糖核苷酸分子。參見，例如，US 7115583；Beeri, R.等人, Circulation. [循環] 2002年10月1日; 106(14):1756-1759；Bez, M.等人, Nat Protoc. [自然實驗室指南] 2019年4月; 14(4): 1015-1026；Hernot, S.等人, Adv Drug Deliv Rev. [高級藥物遞送綜述] 2008年6月30日; 60(10): 1153-1166；Rychak, J.J.等人, Adv Drug Deliv Rev. [高級藥物遞送綜述] 2014年6月; 72: 82-93。在一些實施方式中，微泡係白蛋白包被的全氟化碳微泡。
包含本文所述之多核糖核苷酸的載劑可以包含多個顆粒。該等顆粒可具有30至700奈米的中值粒度（例如30至50、50至100、100至200、200至300、300至400、400至500、500至600、600至700、100至500、50至500或200至700奈米）。可以優化顆粒的大小以有利於包括多核糖核苷酸在內的有效載荷沈積到細胞中。多核糖核苷酸沈積到某些細胞類型中可有利於不同的粒度。例如，可以優化粒度以使多核糖核苷酸沈積到抗原呈遞細胞中。可以優化粒度以使多核糖核苷酸沈積到樹突細胞中。另外，可以優化粒度以使多核糖核苷酸沈積到引流淋巴結細胞中。 脂質奈米顆粒
本揭露提供的組成物、方法和遞送系統可以採用本文所述之任何合適的載劑或遞送形式，在某些實施方式中包括脂質奈米顆粒（LNP）。在一些實施方式中，脂質奈米顆粒包含一種或多種離子脂質，諸如非陽離子脂質（例如，中性或陰離子或兩性離子脂質）；一種或多種軛合的脂質（諸如WO 2019217941的表5中描述的PEG軛合的脂質或軛合至聚合物的脂質；其藉由引用以其全文併入本文）；一種或多種固醇（例如，膽固醇）。
可用於形成奈米顆粒（例如，脂質奈米顆粒）的脂質包括例如WO 2019217941（藉由引用併入）的表4中描述的那些—例如，含脂質的奈米顆粒可包含WO 2019217941的表4中的一種或多種脂質。脂質奈米顆粒可以包括另外的要素，諸如聚合物，諸如WO 2019217941（藉由引用併入）的表5中描述的聚合物。
在一些實施方式中，軛合的脂質，當存在時，可以包括以下的一種或多種：PEG-二醯基甘油（DAG）（諸如l-(單甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻醯甘油（PEG-DMG））、PEG-二烷氧基丙基（DAA）、PEG-磷脂、PEG-神經醯胺（Cer）、聚乙二醇化磷脂醯乙醇胺（PEG-PE）、PEG琥珀酸二醯基甘油（PEGS-DAG）（諸如4-0-(2',3'-二(十四烷醯氧基)丙基-l-0-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯（PEG-S-DMG））、PEG二烷氧基丙基胺基甲酸酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺鈉鹽，以及在WO 2019051289的表2中描述的那些（藉由引用併入）和前述的組合。
在一些實施方式中，可以摻入脂質奈米顆粒中的固醇包括膽固醇或膽固醇衍生物中的一種或多種，諸如W02009/127060或US 2010/0130588（藉由引用併入）中的那些。另外的示例性固醇包括植物固醇，包括藉由引用併入本文的Eygeris等人(2020)，dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c01386中描述的那些。
在一些實施方式中，脂質顆粒包含可電離脂質、非陽離子脂質、抑制顆粒聚集的軛合脂質和固醇。該等組分的量可以獨立地變化，以獲得所需特性。例如，在一些實施方式中，脂質奈米顆粒包含可電離脂質，其量為總脂質的約20 mol%至約90 mol%（在其他實施方式中，其可為存在於脂質奈米顆粒中的總脂質的20%-70%（mol）、30%-60%（mol）或40%-50%（mol）；約50 mol%至約90 mol%）；非陽離子脂質，其量為總脂質的約5 mol%至約30 mol%；軛合脂質，其量為總脂質的約0.5 mol%至約20 mol%；以及固醇，其量為總脂質的約20 mol%至約50 mol%。總脂質與核酸的比率可以根據需要變化。例如，總脂質與核酸（質量或重量）的比率可為約10 : 1至約30 : 1。
在一些實施方式中，脂質與核酸的比率（質量/質量比率；w/w比）可處於約1 : 1至約25 : 1、約10 : 1至約14 : 1、約3 : 1至約15 : 1、約4 : 1至約10 : 1、約5 : 1至約9 : 1或約6 : 1至約9 : 1的範圍內。可以調節脂質和核酸的量以提供所需的N/P比，例如3、4、5、6、7、8、9、10或更高的N/P比。通常，脂質奈米顆粒配製物的總脂質含量可在約5 mg/ml至約30 mg/mL的範圍內。
可用於（例如，與其他脂質組分組合）形成用於遞送本文所述之組成物，例如本文所述之核酸（例如，RNA（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸））的脂質奈米顆粒的脂質化合物的一些非限制性實例包括：
Figure 02_image001
(i)
在一些實施方式中，包含式 (i) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。
Figure 02_image003
(ii)
在一些實施方式中，包含式 (ii) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。
Figure 02_image005
(iii)
在一些實施方式中，包含式 (iii) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。
Figure 02_image007
(iv)
Figure 02_image009
(v)
在一些實施方式中，包含式 (v) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。
Figure 02_image011
(vi)
在一些實施方式中，包含式 (vi) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。
Figure 02_image013
(vii)
Figure 02_image015
(viii)
在一些實施方式中，包含式 (viii) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。
Figure 02_image017
(ix)
在一些實施方式中，包含式 (ix) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。
Figure 02_image019
(x) 其中 X 1係O、NR 1或直接鍵，X 2係C2-5伸烷基，X 3係C(=O)或直接鍵，R 1係H或Me，R 3係C1-3烷基，R 2係C1-3烷基，或R 2與它所附接的氮原子和X 2的1-3個碳原子一起形成4-員、5-員或6-員環，或X 1係NR 1，R 1和R 2與它們所附接的氮原子一起形成5-員或6-員環，或R 2與R 3和它們所附接的氮原子一起形成5-員、6-員或7-員環，Y 1係C2-12伸烷基，Y 2選自
Figure 02_image021
Figure 02_image023
Figure 02_image025
（在任一取向上），（在任一取向上），（在任一取向上）， n為0至3，R 4為C1-15烷基，Z 1為C1-6伸烷基或直接鍵，
Figure 02_image027
（在任一取向上）或不存在，條件係如果Z 1係直接鍵，則Z 2不存在； R 5係C5-9烷基或C6-10烷氧基，R 6係C5-9烷基或C6-10烷氧基，W係亞甲基或直接鍵，並且R 7係H或Me，或其鹽，條件係如果R 3和R 2係C2烷基，X 1係O，X 2係直鏈C3伸烷基，X 3係C(=0)，Y 1係直鏈Ce伸烷基，(Y 2)n-R 4係
Figure 02_image029
，R 4係直鏈C5烷基，Z 1係C2伸烷基，Z 2不存在，W係亞甲基，並且R 7係H，則R 5和R 6不是Cx烷氧基。
在一些實施方式中，包含式 (xii) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。
Figure 02_image031
(xi)
在一些實施方式中，包含式 (xi) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。
Figure 02_image033
其中R =
Figure 02_image035
(xii)
Figure 02_image037
(xiii)
Figure 02_image039
(xiv)
在一些實施方式中，LNP包含式 (xiii) 的化合物和式 (xiv) 的化合物。
Figure 02_image041
(xv)
在一些實施方式中，包含式 (xv) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。
Figure 02_image043
(xvi)
在一些實施方式中，包含式 (xvi) 的配製物的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。
Figure 02_image045
(xvii)
Figure 02_image047
其中X =
Figure 02_image049
(xviii)(a)
Figure 02_image051
(xviii)(b)
Figure 02_image053
(xix)
在一些實施方式中，用於形成用於遞送本文所述之組成物，例如本文所述之核酸（例如，RNA（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸））的脂質奈米顆粒的脂質化合物藉由以下反應之一製成：
Figure 02_image055
+
Figure 02_image057
(xx)(a)
Figure 02_image059
+
Figure 02_image061
(xx)(b)。
在一些實施方式中，包含式 (xxi) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。在一些實施方式中，具有式 (xxi) 的LNP係WO 2021113777描述的LNP（例如，具有式 (1) 的脂質，比如WO 2021113777的表1的脂質）。
Figure 02_image063
(xxi) 其中 每個n獨立地是2-15的整數；L 1和L 3各自獨立地是-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」表示與R 1或R 3的附接點； R 1和R 3各自獨立地是視需要被一個或多個選自由以下組成之群組的取代基取代的直鏈或支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥基烷基、二羥基烷基、羥基烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基和烷基碸烷基；並且 R 2選自由以下組成之群組：
Figure 02_image065
在一些實施方式中，包含式 (xxii) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。在一些實施方式中，具有式 (xxii) 的LNP係WO 2021113777描述的LNP（例如，具有式 (2) 的脂質，比如WO 2021113777的表2的脂質）。
Figure 02_image067
(xxii) 其中 每個n獨立地是1-15的整數； R 1和R 2各自獨立地選自由以下組成之群組：
Figure 02_image069
R 3選自由以下組成之群組：
Figure 02_image071
。
在一些實施方式中，包含式 (xxiii) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。在一些實施方式中，式 (xxiii) 的LNP係WO 2021113777描述的LNP（例如，式 (3) 的脂質，諸如WO 2021113777的表3的脂質）。
Figure 02_image073
(xxiii) 其中 X選自-O-、-S-或-OC(O)-*，其中*表示與R 1的附接點； R 1選自由以下組成之群組：
Figure 02_image075
且R 2選自由以下組成之群組：
Figure 02_image077
在一些實施方式中，在包含可電離脂質的LNP中提供了本文所述之組成物（例如，核酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）或蛋白質）。在一些實施方式中，可電離脂質係十七烷-9-基8-((2-羥乙基)(6-側氧基-6-(十一烷氧基)己基)胺基)辛酸酯（SM-102）；例如，如US 9,867,888的實例1中所述（藉由引用以其全文併入本文）。在一些實施方式中，可電離脂質係9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八碳-9,12-二烯酸酯（LP01），例如，如WO 2015/095340（將其藉由引用以其全文併入本文）的實例13中合成的。在一些實施方式中，可電離脂質係二((Z)-非-2-烯-1-基)9-((4-二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸酯（L319），例如，如US 2012/0027803（藉由引用以其全文併入本文）的實例7、8和9中合成的。在一些實施方式中，可電離脂質係1,1'-((2-(4-(2-((2-(雙(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)哌𠯤-1-基)乙基)氮烷二基)雙(十二烷-2-醇)（C12-200），例如，如WO 2010/053572（藉由引用以其全文併入本文）的實例14和實例16中合成的。在一些實施方式中，可電離脂質係咪唑膽固醇酯（ICE）脂質(3S,10R,13R,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-lH-環戊烯并[a]菲-3-基3-(1H-咪唑-4-基)丙酸酯，例如來自WO 2020/106946（藉由引用以其全文併入本文）的結構 (I)。
在一些實施方式中，可電離脂質可以是陽離子脂質、可電離陽離子脂質，例如可以根據pH以帶正電荷的形式或中性形式存在的陽離子脂質，或可以容易地質子化的含胺脂質。在一些實施方式中，陽離子脂質係例如在生理條件下能夠帶正電的脂質。示例性的陽離子脂質包括一個或多個帶有正電荷的胺基。在一些實施方式中，脂質顆粒包含與以下中的一種或多種一起配製的陽離子脂質：中性脂質、可電離的含胺脂質、可生物降解的炔烴脂質、類固醇、磷脂（包括多不飽和脂質）、結構脂質（例如甾醇）、PEG、膽固醇和聚合物軛合脂質。在一些實施方式中，陽離子脂質可以是可電離的陽離子脂質。如本文所揭露的示例性陽離子脂質可具有超過6.0的有效pKa。在實施方式中，脂質奈米顆粒可包含具有與第一陽離子脂質不同的有效pKa（例如，大於第一有效pKa）的第二陽離子脂質。脂質奈米顆粒可包含40莫耳%至60莫耳%的包封在脂質奈米顆粒內或與脂質奈米顆粒締合的陽離子脂質、中性脂質、類固醇、聚合物軛合的脂質和治療劑，例如本文所述之核酸（例如RNA（例如環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸））。在一些實施方式中，核酸與陽離子脂質共同配製。核酸可以吸附到LNP（例如包含陽離子脂質的LNP）的表面。在一些實施方式中，核酸可以包封在LNP（例如包含陽離子脂質的LNP）中。在一些實施方式中，脂質奈米顆粒可包含靶向部分，例如用靶向劑包被的靶向部分。在實施方式中，LNP配製物係可生物降解的。在一些實施方式中，包含一種或多種本文所述之脂質（例如式 (i)、(ii)、(ii)、(vii) 和/或 (ix)）的脂質奈米顆粒包封至少1%、至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%或100%的RNA分子。
可用於脂質奈米顆粒配製物中的示例性可電離脂質包括但不限於WO 2019051289（藉由引用併入本文）的表1中所列的那些。另外的示例性脂質包括但不限於下式中的一種或多種：US 2016/0311759的X；US 20150376115或US 2016/0376224中的I；US 20160151284的I、II或III；US 20170210967的I、IA、II或IIA；US 20150140070的I-c；US 2013/0178541的A；US 2013/0303587或US 2013/0123338的I；US 2015/0141678的I；US 2015/0239926的II、III、IV或V；US 2017/0119904的I；WO 2017/117528的I或II；US 2012/0149894的A；US 2015/0057373的A；WO 2013/116126的A；US 2013/0090372的A；US 2013/0274523的A；US 2013/0274504的A；US 2013/0053572的A；W02013/016058的A；W02012/162210的A；US 2008/042973的I；US 2012/01287670的I、II、III或IV；US 2014/0200257的I或II；US 2015/0203446的I、II或III；US 2015/0005363的I或III；US 2014/0308304的I、IA、IB、IC、ID、II、IIA、IIB、IIC、IID或III-XXIV；US 2013/0338210；W02009/132131的I、II、III或IV；US 2012/01011478的A；US 2012/0027796的I或XXXV；US 2012/0058144的XIV或XVII；US 2013/0323269；US 2011/0117125的I；US 2011/0256175的I、II或III；US 2012/0202871的I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII；US 2011/0076335的I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、X、XII、XIII、XIV、XV或XVI；US 2006/008378的I或II；US 2013/0123338的I；US 2015/0064242的I或X-A-Y-Z；US 2013/0022649的XVI、XVII或XVIII；US 2013/0116307的I、II或III；US 2013/0116307的I、II或III；US 2010/0062967的I或II；US 2013/0189351的I-X；US 2014/0039032的I；US 2018/0028664的V；US 2016/0317458的I；US 2013/0195920的I；US 10,221,127的5、6或10；WO 2018/081480的III-3；WO 2020/081938的I-5或I-8；US 9,867,888的18或25；US 2019/0136231的A；WO 2020/219876的II；US 2012/0027803的1；US 2019/0240349的OF-02；US 10,086,013的23；Miao等人 (2020) 的cKK-E12/A6；WO 2010/053572的C12-200；Dahlman等人 (2017) 的7C1；Whitehead等人的304-O13或503-O13；US 9,708,628的TS-P4C2；WO 2020/106946的I；WO 2020/106946的I；和WO 2021/113777的 (1)、(2)、(3) 或 (4)。示例性脂質還包括WO 2021/113777的表1-16中任一個的脂質。
在一些實施方式中，可電離脂質係MC3 (6Z,9Z,28Z,3 lZ)-三十七烷-6,9,28,3 l-四烯-l9-基-4-(二甲基胺基)丁酸酯（DLin-MC3-DMA或MC3），例如，如WO 2019051289A9（藉由引用以其全文併入本文）的實例9中所述。在一些實施方式中，可電離脂質係脂質ATX-002，例如，如WO 2019051289A9（藉由引用以其全文併入本文）的實例10中所述。在一些實施方式中，可電離脂質係(l3Z,l6Z)-A,A-二甲基-3-壬基二十二-l3, l6-二烯-l-胺（化合物32），例如，如WO 2019051289A9（藉由引用以其全文併入本文）的實例11中所述。在一些實施方式中，可電離脂質係化合物6或化合物22，例如，如WO 2019051289A9（藉由引用以其全文併入本文）的實例12中所述。
示例性非陽離子脂質包括但不限於二硬脂醯-sn-甘油基-磷酸乙醇胺、二硬脂醯磷脂醯膽鹼（DSPC）、二油醯磷脂醯膽鹼（DOPC）、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼（DPPC）、二油醯磷脂醯膽鹼（DOPG）、二棕櫚醯磷脂醯甘油（DPPG）、二油醯磷脂醯乙醇胺（DOPE）、棕櫚醯油醯磷脂醯膽鹼（POPC）、棕櫚醯油醯磷脂醯乙醇胺（POPE）、二油醯-磷脂醯乙醇胺4-(N-馬來醯亞胺甲基)-環己烷-1-羧酸酯（DOPE-mal）、二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺（DPPE）、二肉豆蔻醯磷酸乙醇胺（DMPE）、二硬脂醯-磷脂醯-乙醇胺（DSPE）、單甲基-磷脂醯乙醇胺（諸如16-O-單甲基PE）、二甲基-磷脂醯乙醇胺（諸如16-O-二甲基PE）、l8-l-反式PE、l-硬脂醯-2-油醯-磷脂醯乙醇胺（SOPE）、氫化大豆磷脂醯膽鹼（HSPC）、卵磷脂醯膽鹼（EPC）、二油醯磷脂醯絲胺酸（DOPS）、神經鞘磷脂（SM）、二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼（DMPC）、二肉豆蔻醯磷脂醯甘油（DMPG）、二硬脂醯磷脂醯甘油（DSPG）、二芥醯基磷脂醯膽鹼（DEPC）、棕櫚醯油醯磷脂醯甘油（POPG）、二反油烯醯-磷脂醯乙醇胺（DEPE）、卵磷脂、磷脂醯乙醇胺、溶血卵磷脂、Lys磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂（ESM）、腦磷脂、心磷脂、磷脂酸、腦苷脂、雙十六烷基磷酸、Lys磷脂醯膽鹼、二亞油醯基磷脂醯膽鹼或其混合物。應當理解，也可以使用其他二醯基磷脂醯膽鹼和二醯基磷脂醯乙醇胺磷脂。該等脂質中的醯基基團較佳的是源自具有C10-C24碳鏈的脂肪酸的醯基基團，例如月桂醯基、肉豆蔻醯基、棕櫚醯基、硬脂醯基或油醯基。在某些實施方式中，另外的示例性脂質包括但不限於Kim等人 (2020) dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c01386（藉由引用併入本文）中描述的那些。在一些實施方式中，此類脂質包括發現會改善用mRNA進行肝臟轉染的植物脂質（例如DGTS）。
適合用於脂質奈米顆粒中的非陽離子脂質的其他實例包括但不限於非磷脂質，例如硬脂胺、十二烷基胺、十六烷基胺、乙醯基棕櫚酸酯、蓖麻酸甘油酯、硬脂酸十六烷基酯、肉豆蔻酸異丙酯、兩性丙烯酸聚合物、三乙醇胺-月桂基硫酸酯、烷基-芳基硫酸酯、聚乙氧基化脂肪酸醯胺、雙十八烷基二甲基溴化銨、神經醯胺、鞘磷脂等。其他非陽離子脂質在WO 2017/099823或美國專利公開US 2018/0028664中描述，其內容藉由引用以其全文併入本文。
在一些實施方式中，非陽離子脂質係油酸或US 2018/0028664（藉由引用以其全文併入）的式I、II或IV的化合物。非陽離子脂質可以占脂質奈米顆粒中存在的總脂質的例如0-30%（莫耳）。在一些實施方式中，非陽離子脂質含量係脂質奈米顆粒中存在的總脂質的5%-20%（莫耳）或10%-15%（莫耳）。在實施方式中，可電離脂質與中性脂質的莫耳比為約2 : 1至約8 : 1（例如，約2 : 1、3 : 1、4 : 1、5 : 1、6 : 1、7 : 1或8 : 1）。
在一些實施方式中，脂質奈米顆粒不包含任何磷脂。
在一些方面，脂質奈米顆粒可進一步包含諸如固醇的組分以提供膜完整性。可用於脂質奈米顆粒中的一種示例性固醇係膽固醇及其衍生物。膽固醇衍生物的非限制性實例包括極性類似物，諸如5a-膽甾烷醇、53-糞甾烷醇、膽甾醇基-(2 ,-羥基)-乙基醚、膽甾醇基-(4'-羥基)-丁基醚和6-酮膽甾烷醇；非極性類似物，諸如5a-膽甾烷、膽甾烯酮、5a-膽甾烷酮、5p-膽甾烷酮和膽甾醇癸酸酯；及其混合物。在一些實施方式中，膽固醇衍生物係極性類似物，例如，膽甾醇基-(4'-羥基)-丁基醚。示例性膽固醇衍生物在PCT公開W02009/127060和美國專利公開US 2010/0130588（它們各自藉由引用以其全文併入本文）中描述。
在一些實施方式中，提供膜完整性的組分（諸如固醇）可占脂質奈米顆粒中存在的總脂質的0-50%（莫耳）（例如，0-10%、10%-20%、20%-30%、30%-40%或40%-50%）。在一些實施方式中，這種組分占脂質奈米顆粒的總脂質含量的20%-50%（莫耳）、30%-40%（莫耳）。
在一些實施方式中，脂質奈米顆粒可包含聚乙二醇（PEG）或軛合的脂質分子。通常，該等用於抑制脂質奈米顆粒的聚集和/或提供空間穩定。示例性的軛合脂質包括但不限於PEG-脂質軛合物、聚㗁唑啉（POZ）-脂質軛合物、聚醯胺-脂質軛合物（諸如ATTA-脂質軛合物）、陽離子聚合物脂質（CPL）軛合物及其混合物。在一些實施方式中，軛合脂質分子係PEG-脂質軛合物，例如(甲氧基聚乙二醇)軛合脂質。
示例性的PEG-脂質軛合物包括但不限於PEG-二醯基甘油（DAG）（諸如l-(單甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻醯甘油（PEG-DMG））、PEG-二烷氧基丙基（DAA）、PEG-磷脂、PEG-神經醯胺（Cer）、聚乙二醇化磷脂醯乙醇胺（PEG-PE）、PEG琥珀酸二醯基甘油（PEGS-DAG）（諸如4-0-(2',3'-二(十四烷醯氧基)丙基-l-0-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯（PEG-S-DMG））、PEG二烷氧基丙基胺基甲酸酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-l,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺鈉鹽或其混合物。另外的示例性PEG-脂質軛合物例如在US 5,885,6l3、US 6,287,59l、US 2003/0077829、US 2003/0077829、US 2005/0175682、US 2008/0020058、US 2011/0117125、US 2010/0130588、US 2016/0376224、US 2017/0119904、US 2018/0028664和WO 2017/099823中描述，所有該等的內容藉由引用以其全文併入本文。在一些實施方式中，PEG-脂質係US2018/0028664（其內容藉由引用以其全文併入本文）的式III、III-a-I、III-a-2、III-b-1、III-b-2或V的化合物。在一些實施方式中，PEG-脂質具有US 20150376115或US 2016/0376224的式II，兩者的內容藉由引用以其全文併入本文。在一些實施方式中，PEG-DAA軛合物可以是例如PEG-二月桂基氧基丙基、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基、PEG-二棕櫚基氧基丙基或PEG-二硬脂基氧基丙基。PEG-脂質可以是以下的一種或多種：PEG-DMG、PEG-二月桂基甘油、PEG-二棕櫚醯甘油、PEG-二硬脂基甘油、PEG-二月桂基甘油脂醯胺、PEG-二肉豆蔻基甘油脂醯胺、PEG-二棕櫚醯甘油脂醯胺、PEG-二硬脂基甘油脂醯胺、PEG-膽固醇（l-[8'-(膽甾-5-烯-3[β]-氧基)甲醯胺基-3',6'-二氧雜辛基]胺基甲醯基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB（3,4-雙十四烷氧基苄基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚）和1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。在一些實施方式中，PEG-脂質包含PEG-DMG、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。在一些實施方式中，PEG-脂質包括選自以下的結構：
Figure 02_image079
在一些實施方式中，與PEG以外的分子軛合的脂質也可用於代替PEG-脂質。例如，聚㗁唑啉（POZ）-脂質軛合物、聚醯胺-脂質軛合物（諸如ATTA-脂質軛合物）和陽離子聚合物脂質（GPL）軛合物可用於代替PEG-脂質或與PEG-脂質一起使用。
示例性的軛合脂質（即PEG-脂質、（POZ）-脂質軛合物、ATTA-脂質軛合物和陽離子聚合物-脂質）在WO 2019051289 A9的表2中列出的PCT和LIS專利申請（所有該等的內容藉由引用以其全文併入本文）中描述。
在一些實施方式中，PEG或軛合脂質可以占脂質奈米顆粒中存在的總脂質的0-20%（莫耳）。在一些實施方式中，PEG或軛合脂質的含量為脂質奈米顆粒中存在的總脂質的0.5%-10%或2%-5%（莫耳）。可電離脂質、非陽離子脂質、固醇和PEG/軛合脂質的莫耳比可以根據需要變化。例如，脂質顆粒可包含按組成物的莫耳或總重量計30%-70%的可電離脂質，按組成物的莫耳或總重量計0-60%的膽固醇，按組成物的莫耳或總重量計0-30%的非陽離子脂質和按組成物的莫耳或總重量計1%-10%的軛合脂質。較佳的是，組成物包含按組成物的莫耳或總重量計30%-40%的可電離脂質，按組成物的莫耳或總重量計40%-50%的膽固醇，和按組成物的莫耳或總重量計10%-20%的非陽離子脂質。在一些其他實施方式中，該組成物係按組成物的莫耳或總重量計50%-75%的可電離脂質，按組成物的莫耳或總重量計20%-40%的膽固醇和按組成物的莫耳或總重量計5%至10%的非陽離子脂質以及按組成物的莫耳或總重量計1%-10%的軛合脂質。該組成物可以含有按組成物的莫耳或總重量計60%-70%的可電離脂質，按組成物的莫耳或總重量計25%-35%的膽固醇，以及按組成物的莫耳或總重量計5%-10%的非陽離子脂質。該組成物還可含有按組成物的莫耳或總重量計至多90%的可電離脂質和按組成物的莫耳或總重量計2%至15%的非陽離子脂質。配製物也可以是脂質奈米顆粒配製物，例如包含按組成物的莫耳或總重量計8%-30%的可電離脂質，按組成物的莫耳或總重量計5%-30%的非陽離子脂質，以及按組成物的莫耳或總重量計0-20%的膽固醇；按組成物的莫耳或總重量計4%-25%的可電離脂質，按組成物的莫耳或總重量計4%-25%的非陽離子脂質，按組成物的莫耳或總重量計2%至25%的膽固醇，按組成物的莫耳或總重量計10%至35%的軛合脂質，以及按組成物的莫耳或總重量計5%的膽固醇；或按組成物的莫耳或總重量計2%-30%的可電離脂質，按組成物的莫耳或總重量計2%-30%的非陽離子脂質，按組成物的莫耳或總重量計1%至15%的膽固醇，按組成物的莫耳或總重量計2%至35%的軛合脂質，以及按組成物的莫耳或總重量計1%-20%的膽固醇；或按組成物的莫耳或總重量計甚至高達90%的可電離脂質和按組成物的莫耳或總重量計2%-10%的非陽離子脂質，或按組成物的莫耳或總重量計甚至100%的陽離子脂質。在一些實施方式中，脂質顆粒配製物包含莫耳比為50 : 10 : 38.5 : 1.5的可電離脂質、磷脂、膽固醇和聚乙二醇化脂質。在一些其他實施方式中，脂質顆粒配製物包含莫耳比為60:38.5:1.5的可電離脂質、膽固醇和聚乙二醇化脂質。
在一些實施方式中，脂質顆粒包含可電離脂質、非陽離子脂質（例如，磷脂）、固醇（例如，膽固醇）和聚乙二醇化脂質，其中對於可電離脂質，脂質的莫耳比在20至70莫耳百分比的範圍內，目標為40-60，非陽離子脂質的莫耳百分比在0至30的範圍內，目標為0至15，固醇的莫耳百分比在20至70的範圍內，目標為30至50，並且聚乙二醇化脂質的莫耳百分比在1至6的範圍內，目標為2至5。
在一些實施方式中，脂質顆粒包含莫耳比為50 : 10 : 38.5 : 1.5的可電離脂質/非陽離子脂質/固醇/軛合脂質。
在一個方面，本揭露提供了包含磷脂、卵磷脂、磷脂醯膽鹼和磷脂醯乙醇胺的脂質奈米顆粒配製物。
在一些實施方式中，還可以包括一種或多種另外的化合物。那些化合物可以單獨投與，或者另外的化合物可以包括在本發明之脂質奈米顆粒中。換言之，除核酸或至少第二核酸之外，脂質奈米顆粒可含有不同於第一核酸的其他化合物。非限制性地，其他另外的化合物可以選自由以下組成之群組：小的或大的有機分子或無機分子、單糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、肽、蛋白質、其肽類似物和衍生物、肽模擬物、核酸、核酸類似物和衍生物、由生物材料製成的提取物，或其任何組合。
在一些實施方式中，LNP包括可生物降解的可電離脂質。在一些實施方式中，LNP包含(9Z,l2Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八碳-9,l2-二烯酸酯，也稱為3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基(9Z,l2Z)-十八碳-9,l2-二烯酸酯)或另一種可電離脂質。參見，例如，WO 2019/067992、WO/2017/173054、WO 2015/095340和WO 2014/136086以及其中提供的參考文獻的脂質。在一些實施方式中，在LNP脂質的上下文中術語陽離子和可電離係可互換的，例如，其中可電離脂質根據pH係陽離子的。
在一些實施方式中，LNP配製物的平均LNP直徑可以在數十nm和數百nm之間，例如藉由動態光散射（DLS）測量的。在一些實施方式中，LNP配製物的平均LNP直徑可以為約40 nm至約150 nm，諸如約40 nm、45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、105 nm、110 nm、115 nm、120 nm、125 nm、130 nm、135 nm、140 nm、145 nm或150 nm。在一些實施方式中，LNP配製物的平均LNP直徑可為約50 nm至約100 nm、約50 nm至約90 nm、約50 nm至約80 nm、約50 nm至約70 nm、約50 nm至約60 nm、約60 nm至約100 nm、約60 nm至約90 nm、約60 nm至約80 nm、約60 nm至約70 nm、約70 nm至約100 nm、約70 nm至約90 nm、約70 nm至約80 nm、約80 nm至約100 nm、約80 nm至約90 nm或約90 nm至約100 nm。在一些實施方式中，LNP配製物的平均LNP直徑可為約70 nm至約100 nm。在特定實施方式中，LNP配製物的平均LNP直徑可為約80 nm。在一些實施方式中，LNP配製物的平均LNP直徑可為約100 nm。在一些實施方式中，LNP配製物的平均LNP直徑範圍為約l mm至約500 mm、約5 mm至約200 mm、約10 mm至約100 mm、約20 mm至約80 mm、約25 mm至約60 mm、約30 mm至約55 mm、約35 mm至約50 mm，或約38 mm至約42 mm。
在一些情況下，LNP可以是相對均質的。多分散性指數可用於指示LNP的均質性，例如脂質奈米顆粒的粒度分佈。小的（例如，小於0.3）多分散性指數通常指示窄的粒度分佈。LNP的多分散性指數可為約0至約0.25，諸如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25。在一些實施方式中，LNP的多分散性指數可為約0.10至約0.20。
LNP的ζ電位可用於指示組成物的電動電位。在一些實施方式中，ζ電位可以描述LNP的表面電荷。具有相對低電荷（正電荷或負電荷）的脂質奈米顆粒通常是期望的，因為更高電荷的物質可能不理想地與體內的細胞、組織和其他元素相互作用。在一些實施方式中，LNP的ζ電位可為約-10 mV至約+20 mV、約-10 mV至約+15 mV、約-10 mV至約+10 mV、約-10 mV至約+5 mV、約-10 mV至約0 mV、約-10 mV至約-5 mV、約-5 mV至約+20 mV、約-5 mV至約+15 mV、約-5 mV至約+10 mV、約-5 mV至約+5 mV、約-5 mV至約0 mV、約0 mV至約+20 mV、約0 mV至約+15 mV、約0 mV至約+10 mV、約0 mV至約+5 mV、約+5 mV至約+20 mV、約+5 mV至約+15 mV或約+5 mV至約+10 mV。
蛋白質和/或核酸的包封效率描述了相對於所提供的初始量，在製備後被包封或以其他方式與LNP締合的蛋白質和/或核酸的量。包封效率理想的是較高（例如，接近100%）。包封效率可以例如藉由比較在用一種或多種有機溶劑或洗滌劑破碎脂質奈米顆粒之前和之後含有脂質奈米顆粒的溶液中蛋白質或核酸的量來測量。陰離子交換樹脂可用於測量溶液中游離蛋白質或核酸（例如RNA）的量。螢光可用於測量溶液中游離蛋白質和/或核酸（例如RNA）的量。對於本文所述之脂質奈米顆粒，蛋白質和/或核酸的包封效率可以是至少50%，例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施方式中，包封效率可以是至少80%。在一些實施方式中，包封效率可以是至少90%。在一些實施方式中，包封效率可以是至少95%。
LNP可以視需要包括一層或多層包衣。在一些實施方式中，LNP可以配製在具有包衣的膠囊、膜或片劑中。包含本文所述之組成物的膠囊、膜或片劑可具有任何可用的尺寸、拉伸強度、硬度或密度。
WO 2020/061457和WO 2021/113777（它們各自藉由引用以其全文併入本文）教導了LNP的另外的示例性脂質、配製物、方法和表徵。Hou等人, Lipid nanoparticles for mRNA delivery [用於mRNA遞送的脂質奈米顆粒]. Nat Rev Mater [自然評論材料] (2021). doi.org/10.1038/s41578-021-00358-0（藉由引用以其全文併入本文）教導了LNP的另外的示例性脂質、配製物、方法和表徵（參見，例如，Hou等人的圖2的示例性脂質和脂質衍生物）。
在一些實施方式中，使用LIPOFECTAMINE® MessengerMax（賽默飛世爾公司（Thermo Fisher））或TransIT-mRNA轉染試劑（米盧斯生物公司（Mirus Bio））進行體外或離體細胞脂質轉染。在某些實施方式中，使用GenVoy_ILM可電離脂質混合物（精密奈米系統（Precision NanoSystems））配製LNP。在某些實施方式中，使用2,2-二亞油基-4-二甲基胺基乙基-[1,3]-二氧戊環（DLin‐KC2‐DMA）或二亞油基甲基‐4‐二甲基胺基丁酸酯（DLin-MC3-DMA或MC3）配製LNP，其配製和體內用途在Jayaraman等人, Angew Chem Int Ed Engl [德國應用化學] 51(34):8529-8533 (2012)（藉由引用以其全文併入本文）中教導。
優化用於遞送CRISPR-Cas系統（例如Cas9-gRNA RNP、gRNA、Cas9 mRNA）的LNP配製物在兩者均藉由引用併入的WO 2019067992和WO 2019067910中有描述，並且可用於遞送本文所述之環狀多核糖核苷酸和線性多核糖核苷酸。
可用於遞送核酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）的另外的特定LNP配製物在兩者均藉由引用併入的US 8158601和US 8168775中有描述，其包括帕替西蘭（patisiran）中使用的以名稱ONPATTRO銷售的配製物。
在實施方式中，編碼本文所述之蛋白質或多肽的至少部分（例如，抗原的部分）的多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）被配製在LNP中，其中：(a) LNP包括陽離子脂質、中性脂質、膽固醇和PEG脂質，(b) LNP的平均粒度為80 nm和160 nm之間，以及 (c) 多核糖核苷酸。在實施方式中，配製在LNP中的多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）係疫苗。
多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）LNP的示例性給藥可包括約0.1、0.25、0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、8、10或100 mg/kg（RNA）。在一些實施方式中，本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）抗原的組成物的劑量為30-200 mcg之間，例如30 mcg、50 mcg、75 mcg、100 mcg、150 mcg或200 mcg。 實例
提出以下實例係為了向熟悉該項技術者提供可以如何使用、製備和評價本文所述之組成物和方法之描述，並且旨在純粹作為本揭露的示例，而不旨在限制諸位發明人認為係其發明之範圍。 實例 1 ：用於富集環狀 RNA 的線性 RNA 拉下法
此實例描述從藉由自剪接生成的環狀RNA中去除線性RNA副產物之方法設計。
當藉由自剪接生成環狀RNA時，體外轉錄（IVT）混合物中可能有幾種主要的線性雜質或副產物：非剪接的線性RNA、部分剪接的線性RNA、經切口的環狀RNA和剪接的內含子（ 圖 2）。
寡聚物設計為具有針對內含子區域的互補序列。內含子區域中序列不存在於環狀RNA產物中、而僅存在於線性副產物中作為線性RNA的一部分或剪接掉的形式（ 圖 2 和圖 3）。寡聚物設計為具有藉由TEG連接子連接的生物素，能以高親和力與鏈黴親和素蛋白結合。一旦寡聚物與含有內含子序列的線性副產物結合，該等副產物可以被鏈黴親和素-珠捕獲，並且可以富集未結合部分中的環狀RNA。 實例 2 ：線性 RNA 拉下特異性地捕獲線性副產物並富集環狀 RNA
此實例顯示藉由經由寡聚物-鏈黴親和素相互作用捕獲線性副產物對環狀RNA的富集。
在此實例中，構建體設計為包括催化內含子的3’一半、外顯子片段2（E2）、包括開放閱讀框（ORF）的多核糖核苷酸負載物、外顯子片段1（E1）和催化內含子的5’一半。ORF係高斯螢光素酶（Gluc，針對 圖 4）或螢火蟲螢光素酶（Fluc，針對 圖 5）。ORF為Gluc時，線性RNA的長度為大約1.4 Kb，ORF為Fluc時，線性RNA的長度為大約2.6 Kb。
對於去除含有內含子序列的線性副產物的線性RNA拉下（LP），設計了針對內含子區域的六種不同寡聚物，其中四種寡聚物針對3’半內含子，兩種寡聚物針對5’半內含子。每種寡聚物皆為23個核苷酸並且具有藉由TEG連接的生物素。
在7.5 mM NTP存在下使用T7 RNA聚合酶藉由體外轉錄從DNA模板合成線性RNA。藉由用DNA酶處理20分鐘去除模板DNA。用RNA純化套組（kit）（新英格蘭生物實驗室公司（New England Biolabs），T2050）純化合成的線性RNA。自剪接在轉錄期間發生；不需要另外的或額外的反應。
在1X結合緩衝劑（150 mM NaCl、15 mM檸檬酸鈉、0.5 mM EDTA）的存在下，將自剪接的RNA（200 pmol）與等量的各種寡聚物（每種寡聚物200 pmol，寡聚物總共1.2 nmol）混合（最終的RNA濃度為400 nM），總共500 μl。為了測試RNA:寡聚物比率對LP效率的影響，使用了兩倍（800 nM）和五倍的寡聚物（2 µM）。作為陰性對照，使用了無寡聚物的RNA。將RNA-寡聚物混合物在室溫（RT）下孵育30分鐘，然後與100 µl鏈黴親和素-SEPHAROSE®（西格瑪公司（Sigma））混合。將混合物在RT下在轉子混合器上孵育1小時，並且藉由離心旋轉沈降鏈黴親和素-SEPHAROSE®珠來收集未結合部分。用1X結合緩衝劑將珠洗滌三次。藉由在75°C下、在1X結合緩衝劑的存在下將樹脂加熱10分鐘來洗脫與珠結合的RNA（ 圖 4 和 5中的「洗脫」）。藉由在95°C下、在95%甲醯胺的存在下將珠加熱5分鐘來洗脫仍與珠結合的RNA（ 圖 4 和 5中的「樹脂」）。藉由Qubit測量未結合和洗脫的RNA的濃度，並且藉由尿素聚丙烯醯胺凝膠電泳（尿素PAGE）分離200 ng的RNA，使用凝膠染色劑染色並且使用成像系統視覺化。
在1.4 Kb RNA（ 圖 4）和2.6 Kb RNA（ 圖 5）二者中，與輸入物相比，在未結合部分有環狀RNA的顯著富集（1.4 Kb RNA中大約90%富集（ 圖 4），2.6K RNA中50%富集（ 圖 5））。與樹脂結合的大多數RNA係含有內含子區域的線性RNA（線性RNA， 圖 4 和 5），這表明寡聚物特異性捕獲含有內含子的RNA。在1.4 Kb RNA和2.6 Kb RNA中，寡聚物濃度的增加均不影響環狀RNA富集產率。 實例 3 ：單寡聚物可以捕獲線性 RNA 副產物並富集環狀 RNA
此實例顯示藉由經由寡聚物-鏈黴親和素相互作用捕獲線性副產物對環狀RNA的富集。在此實例中，線性RNA在3’半內含子的5’端包括延伸區域，該區域在自剪接期間被剪接掉。
在此實例中，構建體設計為包括催化內含子的3’一半、外顯子片段2（E2）、包括ORF的多核糖核苷酸負載物、外顯子片段1（E1）和催化內含子的5’一半。構建體包括5’端延伸序列的36個核苷酸。
為了拉下含有延伸序列的線性副產物，設計了針對延伸區域的寡聚物。該寡聚物係36個核苷酸並且具有藉由TEG連接的生物素。
在7.5 mM NTP存在下使用T7 RNA聚合酶藉由體外轉錄從DNA模板合成線性RNA。藉由用DNA酶處理20分鐘去除模板DNA。用RNA純化套組（新英格蘭生物實驗室公司（New England Biolabs），T2050）純化合成的線性RNA。自剪接在轉錄期間發生；不需要另外的/額外的反應。
在1X結合緩衝劑（150 mM NaCl、15 mM檸檬酸鈉、0.5 mM EDTA）的存在下，將自剪接的RNA（200 pmol）與400 pmol寡聚物混合（最終的RNA濃度為400 nM，並且寡聚物濃度為800 nM）。為了測試RNA:寡聚物比率對線性RNA拉下效率的影響，使用了2.5倍（1 µM）或5倍（2 µM）的寡聚物。作為陰性對照，使用了無寡聚物的RNA。將RNA-寡聚物混合物在RT下孵育30分鐘，然後與100 µl鏈黴親和素-SEPHAROSE®（西格瑪公司）混合。將混合物在RT下在轉子混合器上孵育1小時，並且藉由離心旋轉沈降SEPHAROSE®珠來收集未結合部分。用1X結合緩衝劑將珠洗滌三次。藉由在75°C下、在1X結合緩衝劑的存在下將樹脂加熱10分鐘來洗脫與樹脂結合的RNA（ 圖 6中的「洗脫」）。藉由在95°C下、在95%甲醯胺的存在下將樹脂加熱5分鐘來洗脫仍與珠結合的RNA（ 圖 6中的「樹脂」）。藉由Qubit測量未結合和洗脫的RNA的濃度，並且藉由尿素PAGE分離200 ng的RNA，使用凝膠染色劑染色並藉由使用成像系統視覺化。
與輸入物相比，在未結合部分中環狀RNA有顯著的富集（800 nM寡聚物中50%富集（ 圖 6））。與樹脂結合的大多數RNA係含有延伸區域的線性RNA，這表明寡聚物特異性地捕獲具有延伸區域的線性RNA（線性RNA， 圖 6）。寡聚物濃度的增加顯著影響環狀RNA富集產率，富集產率從800 nM寡聚物時的50%增加至4 µM寡聚物時的96%。 實例 4 ：比較分批純化法和柱填充法
此實例顯示用於藉由經由寡核苷酸-鏈黴親和素相互作用捕獲線性副產物而富集環狀RNA的兩種不同方式。一種方法係將RNA-寡聚物混合物與鏈黴親和素-SEPHAROSE®珠一起在管中孵育（分批法），另一種方法係將珠預填充在柱中，並借助重力穿過RNA-寡聚物混合物（柱法）。
在此實例中，構建體設計為包括催化內含子的3’一半、外顯子片段2（E2）、包括ORF的多核糖核苷酸負載物、外顯子片段1（E1）和催化內含子的5’一半。
為了拉下含有內含子序列的線性副產物，設計了針對內含子區域的六種不同寡聚物，其中四種寡聚物針對3’半內含子，兩種寡聚物針對5’半內含子。每種寡聚物皆為23個核苷酸並且具有藉由TEG連接的生物素。
在7.5 mM NTP存在下使用T7 RNA聚合酶藉由體外轉錄從DNA模板合成線性RNA。藉由用DNA酶處理20分鐘去除模板DNA。用RNA純化套組（新英格蘭生物實驗室公司（New England Biolabs），T2050）純化合成的線性RNA。自剪接在轉錄期間發生；不需要另外的/額外的反應。
在1X結合緩衝劑（150 mM NaCl、15 mM檸檬酸鈉、0.5 mM EDTA）的存在下，將自剪接的RNA（1 nmol）與2 nmol的每種寡聚物混合，總共2.5 ml（針對每種寡聚物，最終的RNA濃度為400 nM，並且寡聚物濃度為800 nM）。將RNA-寡聚物混合物在RT孵育30分鐘，伴隨或不伴隨在75°C下加熱3分鐘。將沒有寡聚物的RNA混合物用作陰性對照。對於分批純化方法，將500 μl鏈黴親和素-SEPHAROSE®珠添加至混合物中。然後將混合物在RT下在轉子混合器上孵育1小時，並且藉由離心旋轉沈降SEPHAROSE®珠來收集未結合部分。對於柱純化，將500 μl珠預填充在空柱中，並且將RNA-寡聚物混合物置於填充的樹脂上。RNA-寡聚物混合物借助重力穿過樹脂，並收集流通物。藉由Qubit測量未結合的或流通物中的RNA的濃度，並且藉由尿素-PAGE分離200 ng RNA，使用凝膠染色劑染色並且使用成像系統視覺化。
與輸入物相比，未發現分批純化法和柱純化法之間在環狀RNA富集方面有顯著差異（參見例如，泳道3和4分別相對於泳道6和7）（ 圖 7）。加熱或冷卻RNA-寡聚物不會增加環狀RNA的富集。此數據表明，線性RNA拉下法（LP）可以通過SEPHAROSE®珠的柱填充擴大。 實例 5 ：當環化效率低時，連續的線性 RNA 拉下可以進一步富集環狀 RNA
此實例顯示藉由連續的線性RNA拉下對環狀RNA的富集。
在此實例中，構建體設計為包括催化內含子的3’一半、外顯子片段2（E2）、包括ORF的多核糖核苷酸負載物、外顯子片段1（E1）和催化內含子的5’一半。
為了拉下含有內含子序列的線性副產物，設計了針對內含子區域的六種不同寡聚物，其中四種針對3’半內含子，兩種針對5’半內含子。每種寡聚物皆為23個核苷酸並且具有藉由TEG連接的生物素。
在7.5 mM NTP存在下使用T7 RNA聚合酶藉由體外轉錄從DNA模板合成線性RNA。藉由用DNA酶處理20分鐘去除模板DNA。用RNA純化套組（新英格蘭生物實驗室公司（New England Biolabs），T2050）純化合成的線性RNA。自剪接在轉錄期間發生；不需要另外的/額外的反應。在1X結合緩衝劑（150 mM NaCl、15 mM檸檬酸鈉、0.5 mM EDTA）的存在下，將自剪接的RNA（1 nmol）與2 nmol的每種寡聚物混合，總共2.5 ml（針對每種寡聚物，最終的RNA濃度為400 nM，並且寡聚物濃度為800 nM）。將RNA-寡聚物混合物在RT下孵育30分鐘。對於柱純化，將500 μl珠預填充在空柱中，並且將RNA-寡聚物混合物置於填充的樹脂上。RNA-寡聚物混合物借助重力穿過樹脂，並收集流通物。將收集的流通物與額外的寡聚物（最終800 nM）混合，然後穿過新預填充的樹脂。收集流通物並藉由Qubit測量第一輪和第二輪流通物的濃度。藉由尿素-PAGE分離200 ng RNA，使用凝膠染色劑染色並使用成像系統視覺化。
在第一輪線性RNA拉下中，有130%的環狀RNA富集（ 圖 8，第一輪LP；環狀RNA純度從23%至54%）。隨著第二輪拉下，有額外的富集，然後最終實現了超過200%的富集（ 圖 8，第二輪LP；環狀RNA純度從23%至72%）。 實例 6 ：不同鹽濃度下線性 RNA 拉下的優化
此實例顯示結合緩衝劑中鹽濃度對藉由經由寡核苷酸-鏈黴親和素相互作用捕獲線性副產物來富集環狀RNA的影響。
在此實例中，構建體設計為包括催化內含子的3’一半、外顯子片段2（E2）、包括ORF的多核糖核苷酸負載物、外顯子片段1（E1）和催化內含子的5’一半。該ORF係hEPO（hEPO，針對 圖 9A）或SARS-CoV-2刺突蛋白（Spike，針對 圖 9B）。ORF為hEPO和SARS-CoV-2 Spike時，線性RNA的長度分別為大約1.2 Kb和大約4.5 Kb（在6%尿素PAGE上用2 Kb梯度電泳，儘管RNA的大小為4.5 Kb）。
為了拉下含有內含子序列的線性副產物，設計了針對內含子區域的六種不同寡聚物，其中四種針對3’半內含子，兩種針對5’半內含子。每種寡聚物皆為23個核苷酸並且具有藉由TEG連接的生物素。
在7.5 mM NTP存在下使用T7 RNA聚合酶藉由體外轉錄從DNA模板合成線性RNA。藉由用DNA酶處理20分鐘去除模板DNA。用RNA純化套組（新英格蘭生物實驗室公司（New England Biolabs），T2050）純化合成的線性RNA。自剪接在轉錄期間發生；不需要另外的/額外的反應。
在1X結合緩衝劑（150 mM NaCl、15 mM檸檬酸鈉、0.5 mM EDTA）的存在下，將自剪接的RNA（1 nmol）與2 nmol的每種寡聚物混合，總共2.5 ml（針對每種寡聚物，最終的RNA濃度為400 nM，並且寡聚物濃度為800 nM）。為了測試鹽濃度對環狀RNA富集的影響，還測試了500 mM、1000 mM和2000 mM的NaCl濃度。將RNA-寡聚物混合物在RT下孵育30分鐘。對於柱純化，將500 μl珠預填充在空柱中，並且將RNA-寡聚物混合物置於填充的樹脂上。RNA-寡聚物混合物借助重力穿過樹脂，並收集流通物。收集流通物並藉由Qubit測量流通物中RNA的濃度。藉由尿素-PAGE分離200 ng RNA，使用凝膠染色劑染色並使用成像系統視覺化。
在1.2 Kb RNA的情況下，在不同的鹽條件下，環狀RNA富集沒有顯著差異（ 圖 9A）。然而，當鹽濃度增加時，4.5 Kb RNA的環狀RNA的富集增加（ 圖 9B）。在150 mM NaCl時有60%的富集（從輸入物20%的環狀RNA純度至32%的環狀RNA純度），而在2000 mM NaCl時有90%的富集（從輸入物20%的環狀RNA純度至38%的環狀RNA純度）。此數據表明，在線性RNA拉下（LP）中，更高濃度的鹽可以改善長RNA的環狀RNA富集。 實例 7 ：線性 RNA 拉下介導的環狀 RNA 富集增強了下游製程純化後的環狀 RNA 表現
此實例顯示藉由線性RNA拉下法純化的環狀RNA的增強的表現。
在此實例中，構建體設計為包括催化內含子的3’一半、外顯子片段2（E2）、包括ORF的多核糖核苷酸負載物、外顯子片段1（E1）和催化內含子的5’一半。ORF係高斯螢光素酶（Gluc，針對 圖 10）或hEPO（針對 圖 11）。
為了拉下含有內含子序列的線性副產物，設計了針對內含子區域的六種不同寡聚物，其中四種寡聚物針對3’半內含子，兩種寡聚物針對5’半內含子。每種寡聚物皆為23個核苷酸並且具有藉由TEG連接的生物素。
在7.5 mM NTP存在下使用T7 RNA聚合酶藉由體外轉錄從DNA模板合成線性RNA。藉由用DNA酶處理20分鐘去除模板DNA。用RNA純化套組（新英格蘭生物實驗室公司（New England Biolabs），T2050）純化合成的線性RNA。自剪接在轉錄期間發生；不需要另外的/額外的反應。
在1X結合緩衝劑（150 mM NaCl、15 mM檸檬酸鈉、0.5 mM EDTA）的存在下，將自剪接的RNA（1 nmol）與2 nmol的每種寡聚物混合，總共2.5 ml（針對每種寡聚物，最終的RNA濃度為400 nM，並且寡聚物濃度為800 nM）。將RNA-寡聚物混合物在RT下孵育30分鐘。對於柱純化，將500 μl珠預填充在空柱中，並且將RNA-寡聚物混合物置於填充的樹脂上。RNA-寡聚物混合物借助重力穿過樹脂，並收集流通物。通過Amicon超離心過濾器（100 K截止值）將收集的流通物與水進行緩衝劑交換。
使用不同的下游製程純化富集的環狀RNA。並行純化未富集的體外轉錄RNA用於對照。
對於編碼Gluc的環狀RNA，測試了四種不同的純化方法。第一種方法係柱純化，對富集的環狀RNA進行柱純化（Monarch）。第二種方法係凝膠純化。將編碼Gluc的富集環狀RNA藉由尿素-PAGE純化，在緩衝劑（0.5 M乙酸鈉、0.1% SDS、1 mM EDTA）中洗脫，乙醇沈澱並重懸於無RNA酶的水中。第三種方法係反相層析法（RP）。藉由反相層析法純化編碼Gluc的環狀RNA，並在Amicon超離心過濾器（100 K截止值）中將級分與檸檬酸鈉、然後與水進行緩衝劑交換。第四種方法係陰離子交換層析法（AEX）。藉由陰離子交換層析法（AEX）純化編碼Gluc的環狀RNA，並在Amicon超離心過濾器（100 K截止值）中將級分與水進行緩衝劑交換。對體外轉錄RNA進行RP和AEX純化用於比較。
對於編碼hEPO的環狀RNA，測試了四種不同的純化方法。第一種方法不純化，僅使用緩衝劑交換的環狀RNA（BE）。第二種方法係凝膠純化。將編碼hEPO的富集環狀RNA藉由尿素-PAGE純化，在緩衝劑（0.5 M乙酸鈉、0.1% SDS、1 mM EDTA）中洗脫，乙醇沈澱並重懸於無RNA酶的水中。第三種方法係反相層析法（RP）。藉由反相層析法純化編碼hEPO的環狀RNA，並在Amicon超離心過濾器（100 K截止值）中將級分與檸檬酸鈉、然後與水進行緩衝劑交換。第四種方法係陰離子交換層析法（AEX）。藉由陰離子交換層析法（AEX）純化編碼hEPO的環狀RNA，並在Amicon超離心過濾器（100 K截止值）中將級分與水進行緩衝劑交換。對體外轉錄RNA進行凝膠純化、RP和AEX純化用於比較。
為了比較富集的（LP）或未富集的（IVT）環狀RNA對Gluc的表現，使用LIPOFECTAMINE® MessengerMax轉染試劑（英傑公司（Invitrogen））用0.1 pmol純化環狀RNA轉染海拉（HeLa）細胞（96孔板中，10,000個細胞/孔）。在6小時、24小時或48小時時收穫細胞培養基。為了測量Gluc活性，將10 µl收穫的細胞培養基轉移到白色96孔板中，並根據製造商的說明使用生物發光報告基因測定系統（皮爾斯高斯螢光素酶快速檢測套組（Pierce Gaussia Luciferase Flash Assay Kit），16158，賽默科技公司（Thermo Scientific））。在光度計儀器（普洛麥格公司（Promega））中讀取板。
為了比較富集的（LP）或未富集的（IVT）環狀RNA對hEPO的表現，使用LIPOFECTAMINE® MessengerMax轉染試劑（英傑公司）用0.25 pmol純化環狀RNA轉染海拉細胞（96孔板中，10,000個細胞/孔）。在24小時或48小時時收穫細胞培養基。根據製造商的說明藉由hEPO ELISA套組（英傑公司）測量分泌的hEPO蛋白的量。
在Gluc RNA和hEPO RNA中，經由線性RNA拉下（LP）純化的環狀RNA均顯示出比未富集（如果使用相同之方法純化環狀RNA）時更好的表現（例如，在Gluc的情況下，LP-RP顯示出比IVT-RP高出4倍多的表現，在hEPO的情況下，高出2倍）。此數據表明，使用本文所述之方法進行的環狀RNA富集增強了表現。 實例 8 ：使用數量減少的寡聚物的線性 RNA 拉下富集環狀 RNA
此實例顯示使用數量更少的寡聚物時藉由經由寡核苷酸-鏈黴親和素相互作用捕獲線性副產物對環狀RNA的富集。
在此實例中，構建體設計為包括催化內含子的3’一半、外顯子片段2（E2）、包括ORF的多核糖核苷酸負載物、外顯子片段1（E1）和催化內含子的5’一半。對於此實例，ORF係hEPO，並且帶有hEPO ORF的線性RNA的長度為大約1.4 Kb。
對於去除含有內含子序列的線性副產物的線性拉下，設計了針對內含子區域的六種不同寡聚物，其中四種寡聚物針對3’半內含子（#1至#4），兩種寡聚物針對5’半內含子（#5和#6）（ 圖 12）。每種寡聚物皆為23個核苷酸並且具有藉由TEG連接的生物素。在此實例中，檢驗了使用減少數量的寡聚物的拉下效率。
在第一研究中，測試了針對3’半內含子的寡聚物（#1至#4）。在7.5 mM NTP存在下使用T7 RNA聚合酶藉由體外轉錄從DNA模板合成線性RNA。藉由用DNA酶處理20分鐘去除模板DNA。用RNA純化套組（新英格蘭生物實驗室公司（New England Biolabs），T2050）純化合成的線性RNA。自剪接在轉錄期間發生；不需要另外的或額外的反應。
在1X結合緩衝劑（150 mM NaCl、15 mM檸檬酸鈉、0.5 mM EDTA）的存在下，將自剪接的RNA（200 pmol）與兩個不同濃度（2.4 µM或4.8 µM）的針對3’半內含子的每種寡聚物（#1至#4）混合（最終的RNA濃度為400 nM），共500 µl。作為陰性對照，使用了無寡聚物的RNA。對於陽性對照，使用了所有六種寡聚物（#1至#6）的混合物。將RNA-寡聚物混合物在室溫（RT）下孵育30分鐘。對於柱純化，將500 μl樹脂預填充在空柱中，並且將RNA-寡聚物混合物置於填充的樹脂上。RNA-寡聚物混合物借助重力穿過樹脂，並收集流通物。藉由Qubit測量流通物的RNA的濃度，並且藉由尿素PAGE分離200 ng RNA，使用凝膠染色劑溶液染色並且使用成像系統視覺化。
在2.4 µM和4.8 µM濃度下，#1和#2寡聚物均顯示出與陽性對照相似的富集效率，陽性對照使用了用於拉下的所有六種寡聚物（ 圖 13A，6%凝膠）並去除了3’半內含子（ 圖 13B，10%凝膠）。
在第二研究中，對針對3’半內含子（#1和#2）和5’半內含子（#5和#6）的寡聚物的組合均進行了測試。在7.5 mM NTP存在下使用T7 RNA聚合酶藉由體外轉錄從DNA模板合成線性RNA。藉由用DNA酶處理20分鐘去除模板DNA。用RNA純化套組（新英格蘭生物實驗室公司（New England Biolabs），T2050）純化合成的線性RNA。自剪接在轉錄期間發生；不需要另外的或額外的反應。
在1X結合緩衝劑（150 mM NaCl、15 mM檸檬酸鈉、0.5 mM EDTA）的存在下，將自剪接的RNA（200 pmol）與#1寡聚物和#5或#6寡聚物的組合、或#2寡聚物和#5或#6寡核苷酸的組合混合，總共500 µl（最終的RNA濃度為400 nM）（最終的寡聚物濃度各自為2.4 µM）。作為陰性對照，使用了無寡聚物的RNA。作為另外的對照，使用了僅#1寡聚物或僅#5寡聚物。對於陽性對照，使用了所有六種寡聚物（#1至#6）的混合物。將RNA-寡聚物混合物在室溫（RT）下孵育30分鐘。對於柱純化，將500 μl樹脂預填充在空柱中，並且將RNA-寡聚物混合物置於填充的樹脂上。RNA-寡聚物混合物借助重力穿過樹脂，並收集流通物。藉由Qubit測量流通物中RNA濃度，並且藉由尿素PAGE分離200 ng RNA，使用凝膠染色劑染色並且使用成像系統視覺化。
針對3’半內含子或5’半內含子的兩種寡聚物的組合顯示出與使用針對3’半內含子的單寡聚物相似的環狀RNA富集效率（ 圖 14A，6%凝膠）和更好的內含子去除（ 圖 14B，10%凝膠）。#1和#5寡聚物組合顯示出與陽性對照（其中使用了用於拉下的所有六種寡聚物）相似的環狀RNA富集效率（ 圖 14A）和內含子去除效率（ 圖 14B）。該等數據證明，使用兩種寡聚物與使用六種寡聚物具有等同的環狀RNA富集和內含子去除效率。 實例 9 ：使用數量減少的寡聚物進行的線性 RNA 拉下介導的環狀 RNA 富集促使環狀 RNA 表現
此實例顯示藉由使用兩種寡聚物的線性RNA拉下法純化的環狀RNA表現。
在此實例中，構建體設計為包括催化內含子的3’一半、外顯子片段2（E2）、包括hEPO ORF的多核糖核苷酸負載物、外顯子片段1（E1）和催化內含子的5’一半。在7.5 mM NTP存在下使用T7 RNA聚合酶藉由體外轉錄從DNA模板合成線性RNA。藉由用DNA酶處理20分鐘去除模板DNA。用RNA純化套組（新英格蘭生物實驗室公司（New England Biolabs），T2050）純化合成的線性RNA。自剪接在轉錄期間發生；不需要額外的反應。
對於去除含有內含子序列的線性副產物的線性拉下，如實例8中所述設計了針對內含子區域的六種不同寡聚物（#1至#6）。
在1X結合緩衝劑（150 mM NaCl、15 mM檸檬酸鈉、0.5 mM EDTA）的存在下，將自剪接的RNA（200 pmol）與#1寡聚物和#5或#6寡聚物、或#2寡聚物和#5或#6寡核苷酸混合，總共500 μl（最終的RNA濃度為400 nM）（最終的寡聚物濃度各自為2.4 µM）。作為陰性對照，使用了無寡聚物的RNA。作為另一個對照，使用了僅#1寡聚物或僅#5寡聚物。對於陽性對照，使用了所有六種寡聚物（#1至#6）的混合物。將RNA-寡聚物混合物在室溫（RT）下孵育30分鐘。對於柱純化，將500 μl樹脂預填充在空柱中，並且將RNA-寡聚物混合物置於填充的樹脂上。RNA-寡聚物混合物借助重力穿過樹脂，並收集流通物。通過Amicon超離心過濾器（100 K截止值）將收集的流通物與水進行緩衝劑交換。
為了比較用不同寡聚物富集的（LP）環狀RNA對hEPO的表現，使用LIPOFECTAMINE® MessengerMax轉染試劑（英傑公司）用0.25 pmol純化環狀RNA轉染海拉細胞（96孔板中，10,000個細胞/孔）。在24小時收穫細胞培養基。根據製造商的說明藉由hEPO ELISA套組（英傑公司）測量分泌的hEPO蛋白的量。
使用兩種寡聚物經由線性拉下（LP）純化的環狀RNA與使用所有六種寡聚物（#1至#6）經由LP純化的環狀RNA顯示出相當的表現（ 圖 15）。特別地，數據顯示，環狀RNA表現獲得自使用兩種寡聚物（即，針對3’半內含子的寡聚物和針對5’半內含子的寡聚物）的組合經由LP純化的環狀RNA，並且與從使用所有六種寡聚物經由LP純化的環狀RNA觀察到的表現相當。 實例 10 ：使用同時靶向 3’ 半內含子和 5’ 半內含子的單寡聚物的線性 RNA 拉下
此實例顯示環狀RNA的富集，方式為用同時靶向3’半內含子和5’半內含子的單寡聚物經由寡聚物-鏈黴親和素相互作用捕獲線性副產物。
在此實例中，構建體設計為包括催化內含子的3’一半、外顯子片段2（E2）、包括ORF的多核糖核苷酸負載物、外顯子片段1（E1）和催化內含子的5’一半。ORF係hEPO，並且線性RNA的長度為大約1.4 Kb。
在此實例中，設計了兩種寡聚物：寡聚物5-Bio_1A5由#1寡聚物（如實例8所述之針對3’半內含子的寡聚物）和隨後的#5寡聚物（如實例8所述之針對5’半內含子的寡聚物）組成；寡聚物5-Bio_5A1由#5寡聚物和隨後的#1寡聚物組成。5-Bio_1A5和5-Bio_5A1寡聚物在不同的寡聚物序列之間都有八個核苷酸的腺苷連接子和藉由TEG與寡聚物連接的5’端生物素。在 圖 16中提供了5-Bio_1A5和5-Bio_5A1寡聚物之示意圖。
在7.5 mM NTP存在下使用T7 RNA聚合酶藉由體外轉錄從DNA模板合成線性RNA。藉由用DNA酶處理20分鐘去除模板DNA。用RNA純化套組（新英格蘭生物實驗室公司（New England Biolabs），T2050）純化合成的線性RNA。自剪接在轉錄期間發生；不需要額外的反應。
在1X結合緩衝劑（150 mM NaCl、15 mM檸檬酸鈉、0.5 mM EDTA）的存在下，將自剪接的RNA（200 pmol）與同時靶向3’半內含子和5’半內含子的寡聚物5-Bio_1A5或5-Bio_5A1（2.4 µM濃度）混合，總體積為500 µl（最終的RNA濃度為400 nM）。作為陰性對照，使用了無寡聚物的RNA。對於陽性對照，使用了所有六種寡聚物（#1至#6）的混合物。將RNA-寡聚物混合物在室溫（RT）下孵育30分鐘。對於柱純化，將500 μl樹脂預填充在空柱中，並且將RNA-寡聚物混合物置於填充的樹脂上。RNA-寡聚物混合物借助重力穿過樹脂，並收集流通物。藉由Qubit測量流通物中RNA濃度，並且藉由尿素PAGE分離200 ng RNA，使用凝膠染色劑染色並且使用成像系統視覺化。
使用5-Bio_1A5或5-Bio_5A1經由線性拉下法純化的環狀RNA有效地去除了線性RNA（ 圖 17A）和內含子RNA（ 圖 17B）。環狀RNA富集效率（ 圖 17A）和內含子去除效率（ 圖 17B）與使用了所有六種用於拉下的寡聚物的陽性對照相似。該等數據說明，設計為同時靶向3’半內含子和5’半內含子的單寡聚物可用於線性拉下以富集環狀RNA，具有與使用六種寡聚物的LP相當的環狀RNA富集和內含子去除效率。 其他實施方式
雖然已經結合本發明之特定實施方式描述了本發明，但是應當理解，能夠進行進一步的修改，並且本申請旨在涵蓋總體上遵循本發明之原理並且包括在本發明所屬領域內的已知或常規實踐內的與本發明之此類偏離的本發明之任何變化、使用或改編，並且可應用於在上文中闡述的基本特徵，並且遵循請求項的範圍。其他實施方式在請求項中。
無
[ 圖 1]係示出如本文所述方法之示意圖。左側的是線性和環狀多核糖核苷酸的混合物，其中一些含有靶區域。將與第一捕獲劑軛合的寡核苷酸添加至多核糖核苷酸的混合物中，並與含有靶區域的多核糖核苷酸雜交。與顆粒軛合的第二捕獲劑與第一捕獲劑結合，從而將含有靶區域的多核糖核苷酸與缺乏靶區域的多核糖核苷酸分離。
[ 圖 2]係示出體外轉錄（IVT）混合物中線性副產物的凝膠，其中環狀RNA藉由自剪接生成。該凝膠示出了需要的環狀RNA產物、非剪接的線性RNA、部分剪接的線性RNA、經切口的環狀RNA和剪接的內含子。
[ 圖 3]係示出用於從自剪接生成的環狀RNA中去除線性RNA副產物之方法設計之示意圖。
[ 圖 4]係示出藉由經由寡聚物-鏈黴親和素相互作用捕獲線性副產物的環狀RNA富集的凝膠。構建體設計為包括催化內含子的3’一半、外顯子片段2（E2）、多核糖核苷酸負載物、外顯子片段1（E1）和催化內含子的5’一半。開放閱讀框（ORF）係模型蛋白：高斯螢光素酶（gaussia luciferase，Gluc）。
[ 圖 5]係示出藉由經由寡聚物-鏈黴親和素相互作用捕獲線性副產物的環狀RNA富集的凝膠。構建體設計為從5’至3’包括：催化內含子的3’一半、外顯子片段2（E2）、多核糖核苷酸負載物、外顯子片段1（E1）和催化內含子的5’一半。ORF係螢火蟲螢光素酶（Fluc）。
[ 圖 6]係示出藉由經由寡聚物-鏈黴親和素相互作用捕獲線性副產物的環狀RNA富集的凝膠。
[ 圖 7]係示出藉由經由寡聚物-鏈黴親和素相互作用捕獲線性副產物的環狀RNA富集的兩種不同方式的凝膠。一種方法係將RNA-寡聚物混合物與鏈黴親和素-SEPHAROSE®珠一起在管中孵育（分批法（Batch method）），另一種方法係將珠預裝在柱中，並借助重力穿過RNA-寡聚物混合物（柱法）。
[ 圖 8]係示出藉由連續線性RNA拉下進一步富集環狀RNA的凝膠。
[ 圖 9A 和 9B]中凝膠示出結合緩衝劑中鹽濃度對藉由經由寡聚物-鏈黴親和素相互作用捕獲線性副產物的環狀RNA富集的影響。 圖 9A示出了構建體，其設計為包括催化內含子的3’一半、外顯子片段2（E2）、包括ORF的多核糖核苷酸負載物、外顯子片段1（E1）和催化內含子的5’一半。ORF係hEPO。 圖 9B示出了與 圖 9A相似的構建體但ORF係SARS-CoV-2刺突蛋白（Spike）。
[ 圖 10]中凝膠示出藉由線性RNA拉下法純化的環狀RNA的增強的表現，線性RNA拉下法用於經由寡聚物-鏈黴親和素相互作用捕獲線性副產物而富集環狀RNA。構建體設計為包括催化內含子的3’一半、外顯子片段2（E2）、包括ORF的多核糖核苷酸負載物、外顯子片段1（E1）和催化內含子的5’一半。ORF係模型蛋白：高斯螢光素酶（Gluc）
[ 圖 11]中凝膠示出藉由線性RNA拉下法純化的環狀RNA的增強的表現，線性RNA拉下法用於經由寡聚物-鏈黴親和素相互作用捕獲線性副產物而富集環狀RNA。構建體設計為包括催化內含子的3’一半、外顯子片段2（E2）、包括ORF的多核糖核苷酸負載物、外顯子片段1（E1）和催化內含子的5’一半。ORF係hEPO。
[ 圖 12]係示出在本文所述之線性拉下法中使用的3’半內含子（#1至#4）和5’半內含子（#5和#6）的示例性寡聚物設計之示意圖。
[ 圖 13A和 13B]中凝膠示出使用減少數量的寡聚物對藉由線性RNA拉下進行的環狀RNA富集的影響，線性RNA拉下藉由經由寡聚物-鏈黴親和素相互作用捕獲線性副產物進行。
[ 圖 14A和 14B]中凝膠示出使用兩種寡聚物（即，針對3’半內含子的寡聚物和針對5’半內含子的寡聚物）的組合對藉由線性RNA拉下進行的環狀RNA富集的影響，線性RNA拉下藉由經由寡聚物-鏈黴親和素相互作用捕獲線性副產物進行。
[ 圖 15]係示出藉由線性RNA拉下法純化的環狀RNA的表現的柱狀圖，線性RNA拉下法用於藉由經由寡核苷酸-鏈黴親和素相互作用捕獲線性副產物來富集環狀RNA。
[ 圖 16]係示出同時靶向3’半內含子和5’半內含子的示例性單寡聚物之示意圖。
[ 圖 17A和 17B]中凝膠示出使用同時靶向3’半內含子和5’半內含子的單寡聚物對藉由線性RNA拉下進行的環狀RNA富集的影響，線性RNA拉下藉由經由寡聚物-鏈黴親和素相互作用捕獲線性副產物進行。
無

Claims (62)

  1. 一種從包含線性多核糖核苷酸和環狀多核糖核苷酸混合物的多種多核糖核苷酸中分離包含靶區域的線性多核糖核苷酸之方法，該方法包括： (a) 提供包含該多種多核糖核苷酸的樣本，其中該多種多核糖核苷酸的子集包含含有該靶區域的線性多核糖核苷酸； (b) 使該樣本與和該靶區域雜交的寡核苷酸接觸；以及 (c) 從該樣本中的多種多核糖核苷酸中分離包含與該寡核苷酸雜交的靶區域的線性多核糖核苷酸。
  2. 如請求項1所述之方法，其中該等環狀多核糖核苷酸缺乏該靶區域。
  3. 一種從多種多核糖核苷酸中分離包含靶區域的多核糖核苷酸之方法，該方法包括： (a) 提供包含該多種多核糖核苷酸的樣本，其中該多種多核糖核苷酸的子集包含該靶區域，其中該靶區域不位於包含該靶區域的多核糖核苷酸的3’末端或5’末端； (b) 使該樣本與和該靶區域雜交的寡核苷酸接觸；以及 (c) 從該樣本中的該多種多核糖核苷酸中分離包含與該寡核苷酸雜交的靶區域的該多核糖核苷酸。
  4. 一種將包含靶區域的線性多核糖核苷酸與包含該靶區域的多種環狀多核糖核苷酸分離之方法，該方法包括： (a) 提供包含該多種多核糖核苷酸的樣本； (b) 使該樣本與寡核苷酸接觸，其中該寡核苷酸以第一結合親和力與該線性多核糖核苷酸的靶區域雜交，並且其中該寡核苷酸以不同於該第一結合親和力的第二結合親和力與該環狀多核苷酸的靶區域雜交；以及 (c) 將該樣本中包含與該寡核苷酸雜交的靶區域的線性多核糖核苷酸與該多種環狀多核糖核苷酸分離。
  5. 如請求項4所述之方法，其中該第一結合親和力小於該第二結合親和力，並且其中該寡核苷酸優先與該線性多核糖核苷酸結合。
  6. 一種將包含靶區域的第一構象的多核糖核苷酸與包含該靶區域的第二構象的多種多核糖核苷酸分離之方法，該方法包括： (a) 提供包含該多種多核糖核苷酸的樣本； (b) 使該樣本與寡核苷酸接觸，其中該寡核苷酸以第一結合親和力與該第一構象的多核苷酸的靶區域雜交，並且其中該寡核苷酸以不同於該第一結合親和力的第二結合親和力與該第二構象的多核苷酸的靶區域雜交；以及 (c) 將該樣本中包含與該寡核苷酸雜交的靶區域的第一構象的多核糖核苷酸與該第二構象的多種多核糖核苷酸分離。
  7. 如請求項6所述之方法，其中該第一結合親和力小於該第二結合親和力，並且其中該寡核苷酸優先與該第一構象的多核糖核苷酸結合。
  8. 如請求項1-7中任一項所述之方法，其中步驟 (c) 包括將該寡核苷酸固定。
  9. 如請求項1-8中任一項所述之方法，其中該靶區域缺乏polyA序列。
  10. 如請求項1-9中任一項所述之方法，其中該寡核苷酸與顆粒軛合。
  11. 如請求項1-9中任一項所述之方法，其中該寡核苷酸與第一捕獲劑軛合。
  12. 如請求項11所述之方法，其中該寡核苷酸藉由化學連接子與該第一捕獲劑軛合。
  13. 如請求項12所述之方法，其中該化學連接子包含三乙二醇。
  14. 如請求項12或13所述之方法，其中該化學連接子與該寡核苷酸的3’端或5’端軛合。
  15. 如請求項11-14中任一項所述之方法，其中該第一捕獲劑包含抗原。
  16. 如請求項15所述之方法，其中該抗原係生物素。
  17. 如請求項11-16中任一項所述之方法，其中該方法進一步包括提供與該第一捕獲劑結合的第二捕獲劑。
  18. 如請求項17所述之方法，其中該第二捕獲劑包含抗體或其抗原結合片段。
  19. 如請求項18所述之方法，其中該抗體或其抗原結合片段係鏈黴親和素。
  20. 如請求項17-19中任一項所述之方法，其中該第二捕獲劑與顆粒軛合。
  21. 如請求項20所述之方法，其中該顆粒係磁性顆粒或珠。
  22. 如請求項1-21中任一項所述之方法，其中包含該靶區域的多核糖核苷酸包含內含子或其部分。
  23. 如請求項22所述之方法，其中該靶區域包含內含子或其部分。
  24. 如請求項22所述之方法，其中該靶區域位於該內含子或其部分的5’或3’。
  25. 如請求項23或24所述之方法，其中該方法包括將剪接的多核糖核苷酸與非剪接或部分剪接的多核糖核苷酸分離。
  26. 如請求項25所述之方法，其中該剪接的多核糖核苷酸係環狀多核糖核苷酸。
  27. 如請求項25所述之方法，其中該剪接的多核糖核苷酸係線性多核糖核苷酸。
  28. 如請求項25-27中任一項所述之方法，其中該剪接的多核糖核苷酸缺乏內含子或其部分。
  29. 如請求項28所述之方法，其中該方法富集了相對於該樣本至少50%的量的該剪接的多核糖核苷酸。
  30. 如請求項22-29中任一項所述之方法，其中該包含內含子或其部分的多核糖核苷酸係線性多核糖核苷酸。
  31. 如請求項1-30中任一項所述之方法，該方法進一步包括對捕獲的包含該靶區域的多核糖核苷酸進行一次或多次洗滌。
  32. 如請求項1-31中任一項所述之方法，該方法進一步包括在步驟 (c) 之後，進行第一洗脫步驟以釋放該捕獲的包含靶區域的多核糖核苷酸。
  33. 如請求項32所述之方法，其中該第一洗脫步驟包括添加第一緩衝劑和/或加熱該樣本。
  34. 如請求項33所述之方法，其中該第一洗脫步驟包括將該樣本加熱至至少50°C。
  35. 如請求項32-34中任一項所述之方法，該方法進一步包括在該第一洗脫步驟之後，進行第二洗脫步驟。
  36. 如請求項34所述之方法，其中該第二洗脫步驟包括添加第二緩衝劑和/或加熱該樣本。
  37. 如請求項36所述之方法，其中該第二洗脫步驟包括將該樣本加熱至至少50°C。
  38. 如請求項36或37所述之方法，其中該第二緩衝劑包含變性劑。
  39. 如請求項38所述之方法，其中該變性劑包含甲醯胺或尿素。
  40. 如請求項1-39中任一項所述之方法，其中步驟 (a) 包括將該樣本與該寡核苷酸一起孵育至少十分鐘。
  41. 如請求項1-40中任一項所述之方法，其中步驟 (b) 包括收集未被該寡核苷酸結合的該樣本的部分。
  42. 如請求項1-41中任一項所述之方法，其中該方法包括提供多種寡核苷酸，其中每種寡核苷酸都與不同的靶區域雜交。
  43. 如請求項42所述之方法，其中每種寡核苷酸都與第一捕獲劑軛合。
  44. 如請求項1-43中任一項所述之方法，其中該寡核苷酸與該靶區域的等長部分具有至少80%互補性。
  45. 如請求項44所述之方法，其中該寡核苷酸與該靶區域的等長部分具有至少85%、90%、95%、97%、99%或100%互補性。
  46. 如請求項1-45中任一項所述之方法，其中步驟 (a) 包括提供與包含該靶區域的多核糖核苷酸的莫耳比為10 : 1至1 : 10的寡核苷酸。
  47. 一種多核糖核苷酸群體，其藉由如請求項1-46中任一項所述之方法產生。
  48. 如請求項47所述之多核糖核苷酸群體，其中該群體包含缺乏靶區域的環狀多核糖核苷酸，並且該環狀多核糖核苷酸包含組成物中至少40%（mol/mol）的總多核糖核苷酸。
  49. 一種組成物，其包含多核糖核苷酸的混合物，其中該混合物的第一子集包含缺乏靶區域的環狀多核糖核苷酸，並且該多種多核糖核苷酸的第二子集包含含有該靶區域的線性多核糖核苷酸，其中該第一子集包含該組成物中至少40%（mol/mol）的總多核糖核苷酸。
  50. 如請求項47-49中任一項所述之組成物，其中該群體包含少於50%（mol/mol）的線性多核糖核苷酸。
  51. 一種組成物，其包含含有靶區域的多核糖核苷酸和配置為與該靶區域雜交的寡核苷酸，其中該寡核苷酸與第一捕獲劑軛合。
  52. 如請求項51所述之組成物，其進一步包含缺乏該靶區域的多核糖核苷酸。
  53. 如請求項52所述之組成物，其中該缺乏靶區域的多核糖核苷酸係環狀多核糖核苷酸。
  54. 如請求項51-53中任一項所述之組成物，其進一步包含配置為與該第一捕獲劑結合的第二捕獲劑。
  55. 如請求項54所述之組成物，其中該第二捕獲劑與顆粒軛合。
  56. 如請求項51-55中任一項所述之組成物，其中該第一捕獲劑係生物素。
  57. 如請求項51-56中任一項所述之組成物，其中該第二捕獲劑係鏈黴親和素。
  58. 如請求項49-57中任一項所述之組成物，其中該組成物藉由如請求項1-46中任一項所述之方法產生。
  59. 如請求項49-58中任一項所述之組成物，其中該線性多核糖核苷酸包含內含子或其部分。
  60. 如請求項59所述之組成物，其中該靶區域包含內含子或其部分。
  61. 如請求項60所述之組成物，其中該靶區域位於該內含子或其部分的5’或3’。
  62. 一種藥物組成物，其包含如請求項47-61中任一項所述之組成物以及稀釋劑、載劑或賦形劑。
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