KR102095085B1 - Rna 전달을 위한 이온화가능한 양이온성 지질 - Google Patents

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파드마나브 치부쿨라
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아크투루스 쎄라퓨틱스, 인크.
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Abstract

기술되는 것은 식 (1)의 화합물이다
Figure 112017093909619-pct00043
(1)
여기서
R1 및 R2는 동일하거나 상이하며, 각각 1 내지 9 개의 탄소로 구성된 선형 또는 분지형 알킬, 또는 2 내지 11 개의 탄소로 구성된 알케닐 또는 알키닐;
L1 및 L2는 동일하거나 상이하며, 각각 5 내지 18 개의 탄소로 구성된 선형 알킬, 또는 N를 가지는 헤테로사이클을 형성하고;
X1는 결합이거나, 또는 이에 의해 L2-CO-O-R2가 형성되는 -CO-O-;
X2는 S 또는 O; L3는 결합 또는 저급 알킬이거나, 또는 N를 가지는 헤테로사이클을 형성하고;
R3는 저급 알킬; 및 R4 및 R5는 동일하거나 상이하며, 각각 저급 알킬;
또는 그의 제약학적으로 허용가능한 염.

Description

RNA 전달을 위한 이온화가능한 양이온성 지질 {ionizable cationic lipid for rna delivery}
관련출원에 대한 상호참조
본 출원은 2013년 11월 18일에 출원된 미국 가특허출원 제 61/905,724호에 대해 우선권을 주장하고, 그의 내용은 참고로서 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
많은 질환의 치료를 위한 치료제로서 많은 상이한 타입의 핵산이 현재 개발 중이다. 이들 핵산은 유전자 요법에서의 DNA, 플라스미드-기초 간섭 핵산, siRNA을 포함하는 RNA 간섭 (RNAi)에서 사용을 위한 짧은 간섭 핵산, miRNA, 안티센스 분자, 리보자임 및 앱타머를 포함한다. 이들 분자가 개발됨에 따라, 안정하고 긴 저장수명을 가지고 무수 유기 또는 무수 극성 아프로틱 용매 내로 쉽게 포함되어 극성 수성 용액 또는 비극성 용매 내에서 발생할 수 있는 부반응 없이 상기 핵산의 캡슐화를 가능하게 할 수 있는 형태로 이들 분자를 생성할 필요가 생겼다.
본발명은 생물학적으로 활성인 및 치료적 분자의 세포내 전달을 촉진시키는 신규한 지질 조성물에 관한 것이다. 본발명은 또한 그러한 지질 조성물을 포함하고, 환자의 세포 내 치료적으로 효과적인 양의 생물학적으로 활성인 분자를 전달하기 위해 유용한 제약학적 조성물에 관한 것이다.
개체에의 치료적 화합물의 전달은 그의 치료적 효과에 중요하고 통상 표적화된 세포 및 조직에 도달하기 위한 화합물의 한정된 능력에 의해 제한될 수 있다. 그러한 화합물이 다양한 전달 수단에 의해 조직의 표적화된 세포 내로 들어가는 것을 향상시키는 것이 중요하다. 본발명은 생물학적으로 활성인 분자의 표적화된 세포내 전달을 촉진시키는 신규한 지질에 관한 것이다.
환자의 조직에 대한 효과적인 표적화가 종종 달성되지 않는 생물학적으로 활성인 분자의 예시는 다음을 포함한다: (1) 면역글로불린 단백질을 포함하는 많은 단백질, (2) 폴리누클레오티드 가령 게놈 DNA, cDNA, 또는 mRNA (3) 안티센스 폴리누클레오티드; 및 (4) 많은 저분자량 화합물, 합성이든지 또는 자연발생적이든지, 가령 펩티드 호르몬 및 항생제.
의료 종사자가 이제 당면한 근본적 문제 중 하나는 많은 질환의 치료에 대한 치료제로서 많은 상이한 타입의 핵산이 현재 개발되어 있다는 것이다. 이들 핵산은 유전자 요법에서의 DNA, RNA 간섭 (RNAi)에서의 사용을 위한 플라스미드 짧은 간섭 핵산 (iNA), 안티센스 분자, 리보자임, 안타고미르, microRNA 및 앱타머를 포함한다. 이들 핵이 개발됨에 따라, 용이하게 제조되고 표적 조직에 전달될 수 있는 지질 제제를 제조할 필요가 있다.
요약
본 명세서에서 기술되는 것은 식 1의 화합물이고
Figure 112016058650241-pct00001
1
여기서
R1 및 R2는 동일하거나 상이하며, 각각 선형 또는 분지형 알킬, 알케닐, 또는 알키닐,
L1 및 L2는 동일하거나 상이하며, 각각 적어도 다섯 개의 탄소로 구성된 선형 알킬이거나, 또는 N를 가지는 헤테로사이클을 형성하고,
X1는 결합이거나, 또는 이에 의해 L2-CO-O-R2가 형성되는 -CO-O-
X2는 S 또는 O,
L3는 결합 또는 저급 알킬,
R3는 저급 알킬,
R4 및 R5는 동일하거나 상이하며, 각각 저급 알킬이다.
본 명세서에서 또한 기술되는 것은 식 1의 화합물이고, 여기서 L3는 부재하고, R1 및 R2는 각각 적어도 일곱 개의 탄소 원자로 구성되고, R3은 에틸렌 또는 n-프로필렌이고, R4 및 R5은 메틸 또는 에틸이고, L1 및 L2는 각각 적어도 다섯 개의 탄소로 구성된 선형 알킬로 구성된다.
본 명세서에서 또한 기술되는 것은 식 1의 화합물이고, 여기서 L3는 부재하고, R1 및 R2는 각각 적어도 일곱 개의 탄소 원자로 구성되고, R3은 에틸렌 또는 n-프로필렌이고, R4 및 R5은 메틸 또는 에틸이고, L1 및 L2는 각각 적어도 다섯 개의 탄소로 구성된 선형 알킬로 구성된다.
본 명세서에서 또한 기술되는 것은 식 1의 화합물이고, 여기서 L3는 부재하고, R1 및 R2는 각각 적어도 아홉 개의 탄소 원자의 알케닐로 구성되고, R3은 에틸렌 또는 n-프로필렌이고, R4 및 R5은 메틸 또는 에틸이고, L1 및 L2는 각각 적어도 다섯 개의 탄소로 구성된 선형 알킬로 구성된다.
본 명세서에서 또한 기술되는 것은 식 1의 화합물이고, 여기서 L3은 메틸렌이고, R1 및 R2는 각각 적어도 일곱 개의 탄소 원자로 구성되고, R3은 에틸렌 또는 n-프로필렌이고, R4 및 R5은 메틸 또는 에틸이고, L1 및 L2는 각각 적어도 다섯 개의 탄소로 구성된 선형 알킬로 구성된다.
본 명세서에서 또한 기술되는 것은 식 1의 화합물이고, 여기서 L3은 메틸렌이고, R1 및 R2는 각각 적어도 아홉 개의 탄소 원자로 구성되고, R3은 에틸렌 또는 n-프로필렌이고, R4 및 R5은 각각 메틸, L1 및 L2는 각각 적어도 일곱 개의 탄소로 구성된 선형 알킬로 구성된다.
본 명세서에서 또한 기술되는 것은 식 1의 화합물이고, 여기서 L3은 메틸렌이고, R1 적어도 아홉 개의 탄소로 구성된 알케닐로 구성되고 및 R2로 구성되고 알케닐을 가지는 적어도 일곱 개의 탄소 원자, R3은 n-프로필렌이고, R4 및 R5은 각각 메틸, L1 및 L2는 각각 적어도 일곱 개의 탄소로 구성된 선형 알킬로 구성된다.
본 명세서에서 또한 기술되는 것은 식 1의 화합물이고, 여기서 L3은 메틸렌이고, R1 및 R2는 각각 적어도 아홉 개의 탄소로 구성된 알케닐로 구성되고, R3은 에틸렌이고, R4 및 R5은 각각 메틸, L1 및 L2는 각각 적어도 일곱 개의 탄소로 구성된 선형 알킬로 구성된다.
본 명세서에서 또한 기술되는 것은 다음 구조를 가지는 화합물이다
Figure 112016058650241-pct00002
ATX-001.
본 명세서에서 또한 기술되는 것은 다음 구조를 가지는 화합물이다
Figure 112016058650241-pct00003
ATX-002.
본 명세서에서 또한 기술되는 것은 다음 구조를 가지는 화합물이다
Figure 112016058650241-pct00004
ATX-003.
본 명세서에서 또한 기술되는 것은 다음 구조를 가지는 화합물이다
Figure 112016058650241-pct00005
ATX-004.
본 명세서에서 또한 기술되는 것은 다음 구조를 가지는 화합물이다
Figure 112016058650241-pct00006
ATX-005.
본 명세서에서 또한 기술되는 것은 다음 구조를 가지는 화합물이다
Figure 112016058650241-pct00007
ATX-006.
본 명세서에서 또한 기술되는 것은 다음 구조를 가지는 화합물이다
Figure 112016058650241-pct00008
ATX-007.
본 명세서에서 또한 기술되는 것은 다음 구조를 가지는 화합물이다
Figure 112016058650241-pct00009
ATX-008.
본 명세서에서 또한 기술되는 것은 다음 구조를 가지는 화합물이다
Figure 112016058650241-pct00010
ATX-009.
본 명세서에서 또한 기술되는 것은 다음 구조를 가지는 화합물이다
Figure 112016058650241-pct00011
ATX-010.
본 명세서에서 또한 기술되는 것은 다음 구조를 가지는 화합물이다
Figure 112016058650241-pct00012
ATX-011
본 명세서에서 또한 기술되는 것은 다음 구조를 가지는 화합물이다
Figure 112016058650241-pct00013
ATX-012
본 명세서에서 또한 기술되는 것은 지질 분자의 나노입자 또는 2층을 포함하는 지질 조성물 내 아래 표 1에 나열된 ATX-001 내지 ATX-032 내에 나열된 화합물 중 어느 것, 또는 그의 제약학적으로 허용가능한 염이다. 지질 2층은 바람직하게는 추가로 중성 지질 또는 중합체를 포함한다. 상기 지질 조성물은 바람직하게는 액체 매체를 포함한다. 상기 조성물은 바람직하게는 추가로 핵산을 캡슐화한다. 상기 핵산은 바람직하게는 RNA 간섭 (RNAi)를 이용함에 의해 표적 유전자의 발현을 억제하는 활성을 가진다. 상기 지질 조성물은 바람직하게는 추가로 핵산 및 중성 지질 또는 중합체를 포함한다. 상기 지질 조성물은 바람직하게는 상기 핵산을 캡슐화한다.
상기 핵산은 바람직하게는 표적 유전자의 발현을 억제하는 활성을 가진다. 상기 표적 유전자는 바람직하게는 염증과 관련된 유전자이다.
본 명세서에서 또한 기술되는 것은 상기 조성물 중 어느 것을 사용함에 의해 포유동물의 세포 내로 핵산을 도입하는 방법이다. 상기 세포는 간, 폐, 신장, 뇌, 혈액, 비장, 또는 뼈 내에 있을 수 있다. 상기 조성물은 바람직하게는 정맥내, 피하로, 복강내, 또는 척추내 투여된다. 바람직하게는, 본 명세서에서 기술되는 조성물은 암 또는 염증성 질환을 치료하기 위한 방법에서 사용된다. 상기 질환은 면역 장애, 암, 신장 질환, 섬유증 질환, 유전적 이상, 염증, 및 심혈관 장애로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것일 수 있다.
도 1는 상이한 양이온성 지질에 의해 캡슐화된 siRNA의 넉다운 활성을 나타낸다. 상기 지질은 MC3 (0.3 mg/kg), NC1 (0.3 mg/kg), ATX-547 (0.3 mg/kg), ATX-001 (0.3 및 1.0 mg/kg), ATX-002 (0.3 및 1.0 mg/kg), 및 ATX-003 (0.3 및 1.0 mg/kg)을 포함한다. 비히클 단독의 주사와 비교하여 C57BL6 마우스에 대한 siRNA 제제의 투여 이후 마우스 혈장 내 인자 VII 넉다운의 양이 나타내어져 있다. 비정상 및 정상 인간 혈장 내 인자 VII의 양이 대조구로서 포함되어 있다. 인자 VII 수준 (p<0.01)에서의 통계적으로 상당한 감소는 별표 (*)에 의해 나타내어져 있다.
도 2는 도 2에 나타낸 결과에 기초하고, 비히클 단독과 비교하여 퍼센트 넉다운로 정상화된 인자 VII 활성의 siRNA의 효과의 평가를 나타낸다.
도 3는 상이한 양이온성 지질에 의해 캡슐화된 siRNA의 넉다운 활성을 나타낸다. 상기 지질은 MC3 (0.3 및 1.5 mg/kg), NC1 (0.3 mg/kg), AT547 (0.1 및 0.3 mg/kg), AT004 (0.3), AT006 (0.3 및 1.0 mg/kg), ATX-010 (0.3 mg/kg), 및 AT001 (0.3 및 1.5 mg/kg)을 포함한다. 비히클 단독의 주사와 비교하여 C57BL6 마우스에의 siRNA 제제의 투여 이후 마우스 혈장 내 인자 VII 넉다운의 양이 나타내어져 있다. 비정상 및 정상 인간 혈장 내 인자 VII의 양이 대조구로서 포함되어 있다. 인자 VII 수준 (p<0.01)에서의 통계적으로 상당한 감소는 별표 (*)에 의해 나타내어져 있다.
도 4는 도 2에 나타낸 결과에 기초하고, 비히클 단독과 비교하여 퍼센트 넉다운으로 정상화된 인자 VII 활성의 siRNA의 효과 평가를 나타낸다.
“적어도 하나”는 하나 이상 (예를 들면, 1-3, 1-2, 또는 1)을 의미한다.
“조성물”은 특정된 양으로 특정된 성분을 포함하는 생성물, 그리고 특정된 양으로 특정된 성분의 조합으로부터, 직접 또는 간접적으로 얻어지는 어느 생성물을 포함한다.
본발명의 치료 방법에서 다른 약제와 식 (1)의 화합물의 투여를 기술하기 위해 사용된“와 조합된”는 식 (1)의 화합물 및 다른 약제가 별도의 투여 형태로 순차적으로 또는 동시에 투여되든지, 또는 동일 투여 형태로 동시에 투여되는 것을 의미한다.
“포유동물”은 인간 또는 다른 포유동물을 의미하고, 또는 인간을 의미한다.
“환자”는 인간 및 다른 포유동물 둘 다를 포함하고, 바람직하게는 인간을 포함한다.
“알킬”은 포화 또는 불포화, 직쇄형 또는 분지형, 탄화수소 사슬이다. 다양한 구체예에서, 상기 알킬 기는 1-18 개의 탄소 원자를 가진다, 즉 C1-C18 기, 또는 C1-C12 기, C1-C6 기, 또는 C1-C4 기이다. 독립적으로, 다양한 구체예에서, 상기 알킬 기는 제로 분지 (즉, 직쇄형 사슬), 하나의 분지, 두 개의 분지, 또는 두 개 초과의 분지를 가진다. "알케닐"은 하나의 이중 결합, 두 개의 이중 결합, 두 개 초과의 이중 결합을 가질 수 있는 불포화 알킬이다. "알키날"은 하나의 삼중 결합, 두 개의 삼중 결합이거나, 또는 두 개 초과의 삼중 결합을 가질 수 있는 불포화 알킬이다. 알킬 사슬은 1 치환체 (즉, 상기 알킬 기가 모노-치환된), 또는 1-2 치환체, 또는 1-3 치환체, 또는 1-4 치환체, 등으로 임의로 치환될 수 있다. 상기 치환체는 히드록시, 아미노, 알킬아미노, 보로닐, 카복시, 니트로, 시아노, 등으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다. 상기 알킬 기가 하나 이상 헤테로원자를 포함할 때, 상기 알킬 기는 본 명세서에서 헤테로알킬 기로 언급된다. 알킬 기 상 치환체가 탄화수소일 때, 이후 얻어지는 기는 단순히 치환된 알킬로 언급된다. 다양한 양상에서, 치환체를 포함하는 상기 알킬 기는 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 또는 7 탄소 미만을 가진다.
“저급 알킬”은 사슬 직쇄형 또는 분지형일 수 있는 사슬 내에 약 1 내지 약 6 탄소로 구성된 기를 의미한다. 적절한 알킬 기의 비-제한 예시는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, n-펜틸, 및 헥실을 포함한다.
“알콕시”는 알킬-O-기를 의미하고 여기서 알킬은 상기에서 정의된 바와 같다. 알콕시 기의 비-제한 예시는 다음을 포함한다: 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시 및 헵톡시. 부모 모이어티에 대한 결합은 에테르 산소를 통한다.
“알콕시알킬”은 알콕시-알킬-기를 의미하고 여기서 알콕시 및 알킬은 이전에 기술된 바와 같다. 바람직한 알콕시알킬은 저급 알킬 기를 포함한다. 부모 모이어티에 대한 결합은 상기 알킬을 통한다.
“알킬아릴”은 알킬-아릴-기를 의미하고 여기서 상기 알킬 및 아릴은 이전에 기술된 바와 같다. 바람직한 알킬아릴은 저급 알킬 기를 포함한다. 부모 모이어티에 대한 결합은 상기 아릴을 통한다.
“아미노알킬”은 NH2-알킬-기를 의미하고, 여기서 알킬은 상기에서 정의된 바와 같고, 부모 모이어티에 대한 결합은 상기 알킬 기를 통한다.
“카복시알킬”은 HOOC-알킬-기를 의미하고, 여기서 알킬은 상기에서 정의된 바와 같고, 부모 모이어티에 대한 결합은 상기 알킬 기를 통한다.
“상업적으로 이용가능한 화학물질” 및 본 명세서에서 규정된 실시예에서 사용된 화학물질은 표준 상업 공급원으로부터 얻어질 수 있고, 그러한 공급원은 예를 들면, Acros Organics (Pittsburgh, Pa.), Sigma-Adrich Chemical (Milwaukee, Wis.), Avocado Research (Lancashire, U.K.), Bionet (Cornwall, U.K.), Boron Molecular (Research Triangle Park, N.C.), Combi-Blocks (San Diego, Calif.), Eastman Organic Chemicals, Eastman Kodak Company (Rochester, N.Y.), Fisher Scientific Co. (Pittsburgh, Pa.), Frontier Scientific (Logan, Utah), ICN Biomedicals, Inc. (Costa Mesa, Calif.), Lancaster Synthesis (Windham, N.H.), Maybridge Chemical Co. (Cornwall, U.K.), Pierce Chemical Co. (Rockford, Ill.), Riedel de Haen (Hannover, Germany), Spectrum Quality Product, Inc. (New Brunswick, N.J.), TCI America (Portland, Oreg.), 및 Wako Chemicals USA, Inc. (Richmond, Va.)을 포함한다.
“화학 문헌에서 기술된 화합물”은, 본 업계에서 통상의 숙련가에게 공지된 바와 같이 화학물질 화합물 및 화학물질 반응에 관한 참고 서적 및 데이터베이스를 통해 확인될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 화합물 제조에서 유용한 반응물 합성을 설명하고, 또는 본 명세서에서 개시된 화합물 제조를 기술하는 논문에 대한 참고문헌을 제공하는 적절한 참고 서적 및 논문은 예를 들면, “Synthetic Organic Chemistry”, John Wiley and Sons, Inc. New York; S. R. Sandler et al, “Organic Functional Group Preparations,” 2nd Ed., Academic Press, New York, 1983; H. O. House, “Modern Synthetic Reactions,” 2nd Ed., W. A. Benjamin, Inc. Menlo Park, Calif., 1972; T. L. Glichrist, “Heterocyclic Chemistry,” 2nd Ed. John Wiley and Sons, New York, 1992; J. March, “Advanced Organic Chemistry: reactions, Mechanisms and Structure,” 5th Ed., Wiley Interscience, New York, 2001을 포함하고; 특정 및 유사한 반응물은 대부분의 대중 및 대학 도서관에서 이용가능한 American Chemical Society의 Chemical Abstract Service에 의해 제조된 공지된 화학물질의 색인을 통해, 그리고 온라인 데이터베이스 (상세사항은 American Chemical Society, Washington, D.C.와 연락할 수 있다)를 통해 또한 확인될 수 있다. 카탈로그에서 공지되었지만 상업적으로 이용가능하지 않은 화학물질은 맞춤형 화학 합성 공급자에 의해 제조될 수 있고, 많은 표준 화학물질 공급자 (가령, 상기 나열된)가 맞춤형 화학 합성 서비스를 제공한다.
“할로”는 플루오로, 클로로, 브로모, 또는 아이오도 기를 의미한다. 플루오로, 클로로 또는 브로모가 바람직하고, 플루오로 및 클로로가 더욱 바람직하다.
“할로겐”은 불소, 염소, 브롬, 또는 요오드를 의미한다. 불소, 염소 및 브롬이 바람직하다.
“헤테로알킬”은 탄소 및 적어도 하나 헤테로원자를 함유하는 포화 또는 불포화, 직쇄형 또는 분지형, 사슬이다. 상기 헤테로알킬 기는, 다양한 구체예에서, 하나의 헤테로원자, 또는 1-2 헤테로원자, 또는 1-3 헤테로원자, 또는 1-4 헤테로원자를 가질 수 있다. 하나의 양상에서 상기 헤테로알킬 사슬은 1 내지 18 (즉, 1-18) 구성원 원자 (탄소 및 헤테로원자)를 함유하고, 다양한 구체예에서 1-12, 또는 1-6, 또는 1-4 구성원 원자를 함유한다. 독립적으로, 다양한 구체예에서, 상기 헤테로알킬 기는 제로 분지 (즉, 직쇄형 사슬), 하나의 분지, 두 개의 분지, 또는 두 개 초과의 분지를 가진다. 독립적으로, 하나의 구체예에서, 헤테로알킬 기는 포화된다. 또다른 구체예에서, 상기 헤테로알킬 기는 불포화된다. 다양한 구체예에서, 불포화 헤테로알킬은 하나의 이중 결합, 두 개의 이중 결합, 두 개 초과의 이중 결합, 및/또는 하나의 삼중 결합, 두 개의 삼중 결합이거나, 또는 두 개 초과의 삼중 결합를 가질 수 있다. 헤테로알킬 사슬은 치환 또는 비치환될 수 있다. 하나의 구체예에서, 상기 헤테로알킬 사슬은 비치환된다. 또다른 구체예에서, 상기 헤테로알킬 사슬은 치환된다. 치환된 헤테로알킬 사슬은 1 치환체 (즉, 모노치환된)를 가질 수 있고, 또는 1-2 치환체, 또는 1-3 치환체, 또는 1-4 치환체, 등을 가질 수 있다. 예시적 헤테로알킬 치환체는 에스테르 (-C(O)-O-R) 및 카르보닐 (-C(O)-)을 포함한다.
“히드록시알킬”은 HO-알킬-기를 의미하고, 여기서 알킬은 이전에 정의되어 있다. 바람직한 히드록시알킬은 저급 알킬을 함유한다. 적절한 히드록시알킬 기의 비-제한 예시는 히드록시메틸 및 2-히드록시에틸을 포함한다.
“수화물”은 용매 분자가 H2O인 용매화물이다.
“용매화물”은 하나 이상 용매 분자와 본 개시물의 화합물의 물리적 결합을 의미한다. 이 물리적 결합은 다양한 정도의 수소 결합을 포함하는 이온성 및 공유결합성 결합을 수반한다. 특정의 경우, 예를 들면 하나 이상 용매 분자가 결정성 고체의 결정 격자 내에 포함될 때 용매화물을 분리가능할 것이다. “용매화물”은 용액-상 및 분리가능한 용매화물 둘 다를 포함한다. 적절한 용매화물의 비-제한 예시는 에탄올레이트, 메탄올레이트, 등을 포함한다.
용어 “치환된”은 동일 또는 상이할 수 있고, 각각, 예를 들면, 독립적으로 선택되는 수소 이외의 특정된 기, 또는 하나 이상 기, 모이어티, 또는 라디칼로 치환을 의미한다.
"안티센스 핵산"은 RNA-RNA 또는 RNA-DNA 또는 RNA-PNA (단백질 핵산; Egholm et al., 1993 Nature 365, 566) 상호반응에 의해 표적 RNA에 결합하고 상기 표적 RNA의 활성을 변경하는 비-효소적 핵산 분자를 의미한다 (검토를 위해, Stein 및 Cheng, 1993 Science 261, 1004 및 Woolf et al., 미국특허 제 5,849,902호 참조). 대표적으로, 안티센스 분자는 안티센스 분자의 단일 인접한 서열을 따라 표적 서열에 상보적이다. 그러나, 특정의 구체예에서, 안티센스 분자는 기질 분자가 루프를 형성하도록 기질에 결합할 수 있거나, 및/또는 안티센스 분자가 루프를 형성하도록 안티센스 분자가 결합할 수 있다. 따라서, 안티센스 분자는 두 개의 (또는 더욱 초과의) 비-인접한 기질 서열에 상보적일 수 있거나 또는 안티센스 분자의 두 개의 (또는 더욱 초과의) 비-인접한 서열 부분은 표적 서열 또는 둘 다에 상보적일 수 있다. 또한, 안티센스 DNA는 DNA-RNA 상호반응에 의해 RNA를 표적화하기 위해 사용될 수 있고, 이에 의해, 이중 가닥 내 상기 표적 RNA를 소화하는 RNase H를 활성화시킨다. 안티센스 올리고누클레오티드는 표적 RNA의 RNAse H 절단을 활성화시킬 수 있는 하나 이상 RNAse H 활성화 영역을 포함할 수 있다. 안티센스 DNA는 화학적으로 합성 또는 단일 가닥 DNA 발현 벡터 또는 그의 동등물의 사용을 통해 발현될 수 있다. "안티센스 RNA"는 상기 표적 유전자 mRNA에 결합에 의해 RNAi를 유도할 수 있는 표적 유전자 mRNA에 상보적인 서열을 가지는 RNA 가닥이다. “안티센스 RNA"는 표적 유전자 mRNA에 상보적 서열을 가지고, 상기 표적 유전자 mRNA에 결합에 의해 RNAi를 유도한다고 생각되는 RNA 가닥이다. "센스 RNA"은 안티센스 RNA에 상보적이고, 그의 상보적 안티센스 RNA에 어닐링되어 iNA를 형성하는 서열을 가진다. 이들 안티센스 및 센스 RNA들은 RNA 합성기로 통상적으로 합성되어 왔다.
"핵산"은 단일- 또는 이중-가닥 형태인 데옥시리보누클레오티드 또는 리보누클레오티드 및 그의 중합체를 언급한다. 이 용어는 공지된 누클레오티드 유사물질 또는 개질된 골격 잔기 또는 연결을 함유하는 핵산을 포함하고, 이는 합성, 자연발생적, 및 비-자연발생적이고, 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 가지고, 기준 누클레오티드와 유사한 방식으로 대사된다. 그러한 유사물질의 예시는, 제한 없이, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 카이랄-메틸 포스포네이트, 2'-O-메틸 리보누클레오티드, 펩티드-핵산 (PNAs)을 포함한다.
"RNA"는 적어도 하나 리보누클레오티드 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. "리보누클레오티드"는 β-D-리보-푸라노스 모이어티의2' 위치에서 히드록실기를 가지는 누클레오티드를 의미한다. 이 용어들은 이중-가닥 RNA, 단일-가닥 RNA, 분리된 RNA 가령 부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합적으로 생성된 RNA, 그리고 하나 이상 누클레오티드의 부가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연발생적 RNA와 상이한 변형된 RNA을 포함한다. 그러한 변경은, 가령 간섭 RNA의 말단(들)에 또는, 예를 들면 RNA의 하나 이상 누클레오티드에서 내부적으로 비-누클레오티드 재료의 부가를 포함할 수 있다. 본발명의 RNA 분자 내 누클레오티드는 또한 비-표준 누클레오티드, 가령 비-자연발생적 누클레오티드 또는 화학적으로 합성된 누클레오티드 또는 데옥시누클레오티드를 포함할 수 있다. 이들 변형된 RNA는 자연발생적 RNA 유사물질 또는 유사물질로 언급될 수 있다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "리보핵산" 및 "RNA"은 siRNA, 안티센스 RNA, 단일 가닥 RNA, microRNA, mRNA, 비코드 RNA, 및 다가 RNA을 포함하는, 적어도 하나의 리보누클레오티드 잔기를 함유하는 분자를 언급한다. 리보누클레오티드는 ß-D-리보-푸라노스 모이어티의2' 위치에서 히드록실기를 가지는 누클레오티드이다. 이들 용어는 이중-가닥 RNA, 단일-가닥 RNA, 분리된 RNA 가령 부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합적으로 생성된 RNA, 그리고 하나 이상 누클레오티드의 부가, 결실, 치환, 개질, 및/또는 변경에 의해 자연발생적 RNA와 상이한 개질된 및 변형된 RNA을 포함한다. RNA의 변경은 간섭 RNA의 말단(들)에 또는, 예를 들면 비-표준 누클레오티드, 가령 비-자연발생적 누클레오티드 또는 화학적으로 합성된 누클레오티드 또는 데옥시누클레오티드를 포함하는 RNA 분자 내 RNA 누클레오티드의 하나 이상 누클레오티드에서 내부적으로 비-누클레오티드 재료의 부가를 포함할 수 있다. 이들 변형된 RNA는 유사물질로 언급될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "누클레오티드"는 천연 염기 (표준), 및 본 업계에서 널리 공지된 개질된 염기를 포함한다고 본 업계에서 인식되어 있다. 그러한 염기는 누클레오티드 당 모이어티의 1' 위치에서 일반적으로 위치한다. 누클레오티드는 일반적으로 염기, 당, 및 포스페이트 기를 포함한다. 누클레오티드는 비개질된 또는 당, 포스페이트, 및/또는 염기 모이어티에서 개질될 수 있다 (또한 누클레오티드 유사물질, 개질된 누클레오티드, 비-천연 누클레오티드, 비-표준 누클레오티드 등으로 상호변경가능하게 언급됨; 참조, 예를 들면, Usman 및 McSwiggen, supra; Eckstein, et al., International PCT 공개공보 제 WO 92/07065호; Usman, et al, International PCT 공개공보 제 WO 93/15187 호; Uhlman & Peyman, supra, 참고로서 본 명세서에서 모두 포함됨). Limbach, et al, Nucleic Acids Res. 22:2183, 1994에 요약된 바와 같이 본 업계에서 공지된 개질된 핵산 염기의 몇가지 예시가 있다. 핵산 분자에 도입될 수 있는 염기 개질의 비-제한 예시의 일부는, 이노신, 퓨린, 피리딘-4-온, 피리딘-2-온, 페닐, 슈도우라실, 2,4,6-트리메톡시 벤젠, 3-메틸 우라실, 디하이드로우리딘, 나프틸, 아미노페닐, 5-알킬시티딘 (예를 들면, 5-메틸시티딘), 5-알킬우리딘 (예를 들면, 리보티미딘), 5-할로우리딘 (예를 들면, 5-브로모우리딘) 또는 6-아자파리미딘 또는 6-알킬파리미딘 (예를 들면 6-메틸우리딘), 프로핀, 등을 포함한다 (Burgin, et al., Biochemistry 35:14090, 1996; Uhlman & Peyman, 위와 같음). 이 양상에서 "개질된 염기"는 1' 위치에서 아데닌, 구아닌, 시토신, 및 우라실 이외의 누클레오티드 염기 또는 그의 동등물을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 상보적 누클레오티드 염기는 서로 수소 결합을 형성하는 누클레오티드 염기의 쌍이다. 아데닌 (A)은 RNA 내 티민 (T) 또는 우라실 (U)과 짝을 이루고 구아닌 (G)은 시토신 (C)과 짝을 이룬다. 서로 혼성화하는 (수소 결합에 의해 결합) 핵산의 상보적 세그먼트 또는 가닥. "상보적"은 전통적 Watson-Crick 또는 다른 비-전통적 결합 모드에 의해 핵산이 다른 핵산 서열과 수소 결합(들)을 형성할 수 있음을 의미한다.
MicroRNAs (miRNA)는 길이에서 약 21-23 누클레오티드의 단일-가닥 RNA 분자이고 유전자 발현을 조절하고, miRNAs는 DNA로부터 전사되지만 단백질로 번역되지 않는 유전자 (비-코드 RNA)에 의해 암호화되고; 대신 이들은 pri-miRNA로 공지된 1차 전사물로부터 pre-miRNA로 불리는 짧은 줄기-루프 구조로 및 마지막으로 기능적 miRNA로 가공된다. 성숙한 miRNA 분자는 하나 이상의 메신저 RNA (mRNA) 분자에 부분적으로 상보적이고, 그의 주요 기능한 유전자 발현을 하향조절하는 것이다
본 명세서에서 사용된, 어떤 경우 짧은 간섭 RNA 또는 사일런싱 RNA로 공지된, 용어 짧은 간섭 RNA (siRNA)는, 생물학에서 다양한 역할을 하는, 길이에서16-40 누클레오티드의 이중-가닥 RNA 분자의 부류를 언급하도록 사용된다. 가장 주목할만 것으로서, siRNA는 RNA 간섭 (RNAi) 경로에 관여하고, 여기서 특정 유전자의 발현을 간섭한다. RNAi 경로에서의 그의 역할 이외에, siRNAs는, 예를 들면, 항바이러스 메커니즘으로서 RNAi-관련 경로에서, 또는 게놈의 염색질 구조를 성형함에 있어서도 또한 작용하고; 이들 경로의 복잡성은 단지 이제 규명되고 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 RNAi은 RNA-유도 사일런싱 복합체 (RISC)에 의해 제어되고 세포 내 짧은 이중-가닥 RNA 분자에 의해 개시된 RNA-의존성 유전자 사일런싱 공정을 언급하고, 세포 내 짧은 이중-가닥 RNA 분자는 효소적 RISC 성분 아르고노트와 상호작용한다. 이중-가닥 RNA 또는 RNA-형 iNA 또는 siRNA가 외인성일 때 (RNA 게놈을 가진 바이러스에 의한 감염으로부터 또는 감염된 iNA 또는 siRNA로부터 온), RNA 또는 iNA는 세포질 내로 직접 유입되고 효소 다이서에 의해 짧은 단편으로 절단된다. 개시 dsRNA는, 게놈 내 RNA-코드 유전자로부터 발현된 pre-microRNAs 내에서와 같이 또한 내인성일 수 있다 (상기 세포 내에서 유래). 그러한 유전자로부터의 1차 전사물은 일단 핵 내 pre-miRNA의 특징적 줄기-루프 구조를 형성하도록 가공되고, 이후 다이서에 의해 절단되는 세포질로 유출된다. 따라서, 두 개의 dsRNA 경로, 외인성 및 내인성은, RISC 복합체에서 수렴한다. RNA-유도 사일런싱 복합체 (RISC)의 활성 성분은 아르고노트 단백질로 불리는 엔도뉴클레아제이고, 그의 결합된 siRNA 또는 iNA에 상보적인 상기 표적 mRNA 가닥을 절단한다. 다이서에 의해 생성된 단편이 이중-가닥이기 때문에, 이들은 각각 이론상 기능적 siRNA 또는 iNA을 생성할 수 있다. 그러나, 가이드 가닥으로서 공지된 두 개의 가닥 중 단지 하나는 아르고노트 단백질을 결합하고 유전자 사일런싱을 지시한다. 다른 항-가이드 가닥 또는 패신저 가닥이 RISC 활성화 동안 분해된다.
식 (1)의 화합물은 또한 이 개시물의 범위 이내인 염을 형성한다. 본 명세서에서 식 (1)의 화합물에 대한 언급은 달리 표시되지 않는 한, 그의 염에 대한 언급도 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어 “염(들)”은 무기 및/또는 유기 산으로 형성된 산성 염, 그리고 무기 및/또는 유기 염기로 형성된 염기성 염을 지칭한다. 또한, 식 (1)의 화합물이 염기성 모이어티, 가령, 제한 없이, 피리딘 또는 이미다졸, 및 산성 모이어티, 가령, 제한 없이, 카복시산 둘 다를 함유할 때, 쌍성이온 (“내부 염”)이 형성될 수 있고 본 명세서에서 사용된 용어 “염(들)” 이내에 포함된다. 상기 염은 비록 다른 염이 또한 유용하지만 제약학적으로 허용가능한 (즉, 비-독성, 생물학적으로 허용가능한) 염일 수 있다. 예를 들면, 염이 침전하는 것과 같은 매체 내에서 또는 수성 매체 내에서 산 또는 염기의 양, 가령 동량과 식 (1)의 화합물을 반응시키고 이후 동결건조시킴에 의해 식 (1)의 화합물의 염이 형성될 수 있다.
예시적 산 부가 염은 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 바이설페이트, 보레이트, 부티레이트, 시트레이트, 캠퍼레이트, 캠퍼설포네이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로아이오다이드, 2-히드록시에탄설포네이트, 락테이트, 말리에이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 옥살레이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 살리실레이트, 숙시네이트, 설페이트, 설포네이트 (가령 언급된 것 본 명세서에서), 타르타레이트, 티오시아네이트, 톨루엔설포네이트 (또한 로서 공지된 토실레이트) 운데카노에이트, 등을 포함한다. 부가적으로, 염기성 제약학적 화합물으로부터 제약학적으로 유용한 염의 형성을 위해 적절하다고 일반적으로 생각되는 산은, 예를 들면, S. Berge et al, J. Pharmaceutical Sciences (1977) 66(1)1-19; P. Gould, International J. Pharmaceutics (1986) 33 201-217; Anderson et al, The Practice of Medicinal Chemistry (1996), Academic Press, New York; and in The Orange Book (Food & Drug Administration, Washington, D.C. 웹사이트에서)에 의해 논의되어 있다. 이들 개시물은 참고로서 본 명세서에서 포함된다.
예시적 염기성 염은 암모늄 염, 알칼리 금속 염 가령 소듐, 리튬, 및 포타슘 염, 알칼리토 금속 염 가령 칼슘 및 마그네슘 염, 유기 염기 (예를 들면, 유기 아민) 가령 벤자틴, 디시클로헥실아민, 하이드라바민 (N,N-bis(데하이드로아비에틸)에틸렌디아민로 형성된), N-메틸-D-글루카민, N-메틸-D-글루카미드, t-부틸 아민와의 염, 및 아미노 산 가령 아르기닌, 리신, 등과의 염을 포함한다. 염기성 질소-함유 기는 물질 가령 저급 알킬 할라이드 (예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 및 부틸 클로라이드, 브로마이드, 및 아이오다이드), 디알킬 설페이트 (예를 들면, 디메틸, 디에틸, 디부틸, 및 디아밀 설페이트), 긴 사슬 할라이드 (예를 들면, 데실, 라우릴, 미리스틸, 및 스테아릴 클로라이드, 브로마이드, 및 아이오다이드), 아릴알킬 할라이드 (예를 들면, 벤질 및 펜에틸 브로마이드), 등으로 4차화될 수 있다.
모든 그러한 산 및 염기 염은 본 개시물의 범위 이내 제약학적으로 허용가능한 염으로 의도되고 모든 산 및 염기 염은 본 개시물의 목적을 위해 상응하는 화합물의 유리 형태와 동등하다고 생각된다.
식 (1)의 화합물은, 수화된 형태를 포함하는 비용매화된 및 용매화된 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 제약학적으로 허용가능한 용매 가령 물, 에탄올, 등을 사용한 용매화된 형태는, 이 개시물의 목적을 위해 비용매화된 형태와 동등하다.
식 (1)의 화합물 및 염, 그의 용매화물은, 그의 토토머 형태로 존재할 수 있다 (예를 들면, 아미드 또는 이미노 에테르로서). 모든 그러한 토토머 형태는 본 개시물의 일부로서 본 명세서에서 고려된다.
또한 이 개시물의 화합물의 다형도 본 개시물의 범위 이내이다 (즉, 식 1의 화합물의 다형은 이 개시물 범위 이내이다).
본 화합물의 모든 입체이성질체 (예를 들면, 기하 이성질체, 광학 이성질체, 등) (염, 용매화물의 것들, 및 상기 화합물의 프로드럭 그리고 프로드럭의 염 및 용매화물을 포함하는), 가령 거울상 이성질체 형태 (심지어 비대칭 탄소의 부재 하에 존재할 수 있는), 회전 이성질체 형태, 아트로프 이성질체이성질체, 및 부분입체 이성질체 형태를 포함하는, 다양한 치환체 상에 비대칭 탄소로 인해 존재할 수 있는 것들은 이 개시물 범위 이내로 생각된다. 이 개시물의 화합물의 개별 입체이성질체는, 예를 들면, 실질적으로 다른 이성질체가 없을 수 있고, 또는, 예를 들면, 라세메이트로서 또는 모든 다른, 또는 다른 선택되는, 입체이성질체와 혼합될 수 있다. 상기 본 명세서에서 화합물의 카이랄 중심은 IUPAC 1974 Recommendations에 의해 정의된 바와 같이 S 또는 R 배열을 가질 수 있다. 용어 “염”, “용매화물”, 등의 사용은 거울상 이성질체, 입체이성질체, 회전 이성질체, 호변 이성질체, 라세메이트, 또는 개시된 화합물의 프로드럭의 염 및 용매화물에 동등하게 적용된다고 의도된다.
화학요법제 (항종양제)로서 사용될 수 있는 화합물 부류는 다음을 포함한다: 알킬화제, 대사길항물질, 천연 생성물 및 그의 유도체, 호르몬 및 스테로이드 (합성 유사물질을 포함하는), 및 합성물. 이들 부류 이내 화합물의 예시가 아래 주어진다.
양이온성 지질
본 개시물은 특정의 양이온성 지질 화합물의 합성을 포함한다. 상기 화합물은 이후의 부분에서 설명된 바와 같이 세포 및 조직에 폴리누클레오티드를 전달하기 위해 특히 적절하다. 본 명세서에서 기술되는 지방거대고리 화합물은 다른 목적 그리고, 예를 들면, 수용자 및 첨가제에 대해 사용될 수 있다.
양이온성 지질 화합물에 대한 합성 방법은 본 업계에서의 기술로 합성될 수 있다. 본 업계의 숙련가는 이들 화합물을 생성하고, 또한 본 개시물의 다른 화합물을 생성하기 위해 다른 방법을 이해할 것이다.
양이온성 지질 화합물은 마이크로입자, 나노입자, 리포솜, 또는 미셀을 형성하는 물질과 조합될 수 있다. 입자, 리포솜, 또는 미셀에 의해 전달될 물질은 가스, 액체, 또는 고체의 형태일 수 있고, 폴리누클레오티드, 단백질, 펩티드, 또는 짧은 분자일 수 있다. 상기 지방거대고리 화합물은 다른 양이온성 지질 화합물, 중합체 (합성 또는 천연), 계면활성제, 콜레스테롤, 탄수화물, 단백질, 지질, 등과 조합되어 입자를 형성할 수 있다. 이들 입자는 이후 임의로 제약학적 부형제와 조합되어 제약학적 조성물을 형성할 수 있다.
본 개시물은 그러한 양이온성 지질 화합물의 사용에 기초하여 신규한 양이온성 지질 화합물 및 약물 전달 시스템을 제공한다. 이 시스템은 환자, 조직, 장기, 또는 세포에 폴리누클레오티드, 단백질, 짧은 분자, 펩티드, 항원, 약물, 등을 전달하기 위해 제약학적/약물 전달 기술에서 사용될 수 있다. 이들 신규한 화합물은 또한 코팅, 첨가제, 부형제, 재료, 또는 바이오엔지니어링용 재료로서 사용될 수 있다.
본 개시물의 양이온성 지질 화합물은 약물 전달 기술에서 몇가지 상이한 용도를 위해 제공한다. 양이온성 지질 화합물의 아민-함유 부분은 복합체 폴리누클레오티드에 대해 사용될 수 있고, 이에 의해 폴리누클레오티드의 전달을 향상시키고 그의 분해를 방해한다. 양이온성 지질 화합물은 전달될 입자를 함유하는 피코입자, 나노입자, 마이크로입자, 리포솜, 및 미셀의 형성에서 또한 사용될 수 있다. 바람직하게는, 양이온성 지질 화합물은 생체적합성 및 생분해성이고, 상기 형성된 입자는 또한 생분해성 및 생체적합성이고 전달될 물질의 제어된, 지연된 방출을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 이들 및 그의 상응하는 입자는 또한 이들이 저급 pH에서 프로톤화되는 것을 고려하면 pH 변화에 반응성일 수 있다. 이들은 엔도좀 분해를 유발하도록 세포에 물질의 전달에서 프로톤 스폰지로서 또한 작용할 수 있다.
특정의 구체예에서, 양이온성 지질 화합물은 상대적으로 비-세포독성이다. 양이온성 지질 화합물은 생체적합성 및 생분해성일 수 있다. 양이온성 지질은 대략 5.5 내지 대략 7.5, 더욱 바람직하게는 대략 6.0 및 대략 7.0 사이 범위 내 pKa s를 가질 수 있다. 대략 3.0 및 대략 9.0 사이, 또는 대략 5.0 및 대략 8.0 사이 소정의 pKa를 가지도록 설계될 수 있다. 본 명세서에서 기술되는 양이온성 지질 화합물은 몇가지 이유로 약물 전달용으로 특히 매력적이다: 이들은 pH를 완충하기 위해, 엔도-삼투분해를 유발하기 위해, 전달될 물질을 보호하기 위해 DNA, RNA, 다른 폴리누클레오티드, 기타 음으로 대전된 물질과 상호작용하기 위한 아미노 기를 함유하고, 이들은 상업적으로 이용가능한 출발 재료로부터 합성될 수 있고; 및/또는 이들은 pH 반응성이고 소정의 pKa로 설계될 수 있다.
양이온성 지질 화합물을 함유하는 조성물은 30-70% 양이온성 지질 화합물, 0-60 % 콜레스테롤, 0-30% 인지질 및 1-10% 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)일 수 있다. 바람직하게는, 상기 조성물은 30-40% 양이온성 지질 화합물, 40- 50 % 콜레스테롤, 및 10-20% PEG이다. 다른 바람직한 구체예에서, 상기 조성물은 50-75% 양이온성 지질 화합물, 20-40% 콜레스테롤, 및 5 내지 10% 인지질, 및 1-10% PEG이다. 상기 조성물은 60-70% 양이온성 지질 화합물, 25-35% 콜레스테롤, 및 5-10% PEG을 함유할 수 있다. 상기 조성물은 최대 90% 양이온성 지질 화합물 및 2 내지 15% 헬퍼 지질을 함유할 수 있다.
상기 제제는 예를 들면 8-30% 화합물, 5-30% 헬퍼 지질, 및 0-20% 콜레스테롤; 4-25% 양이온성 지질, 4-25% 헬퍼 지질, 2 내지 25% 콜레스테롤, 10 내지 35% 콜레스테롤-PEG, 및 5% 콜레스테롤-아민; 또는 2-30% 양이온성 지질, 2-30% 헬퍼 지질, 1 내지 15% 콜레스테롤, 2 내지 35% 콜레스테롤-PEG, 및 1-20% 콜레스테롤-아민; 또는 최대 90% 양이온성 지질 및 2-10% 헬퍼 지질, 또는 심지어 100% 양이온성 지질을 함유하는 지질 입자 제제일 수 있다.
투여용 조성물 및 제제
이 개시물의 핵산-지질 조성물은, 예를 들면, 정맥내, 비경구, 복강내, 또는 외용 경로를 통해 전신 전달을 실행하기 위해 다양한 경로로 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, siRNA는, 예를 들면, 표적 조직 가령 폐 또는 간의 세포 내에, 또는 염증난 조직 내에서 세포내에서 전달될 수 있다. 일부 구체예에서, 이 개시물은 생체내 siRNA의 전달을 위한 방법을 제공한다. 핵산-지질 조성물은 개체에 정맥내, 피하로, 또는 복강내 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시물은 포유동물 개체의 폐로 간섭 RNA의 생체내 전달을 위한 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 이 개시물은 포유동물 개체 내 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 핵, 양이온성 지질, 양쪽 친매성 물질, 인지질, 콜레스테롤, 및 PEG-연결된 콜레스테롤을 함유하는 치료적으로 효과적인 양의 이 개시물의 조성물은 상기 조성물에 의해 감소, 감쇄, 하향조절 또는 사일런싱될 수 있는 유전자의 발현 또는 과발현과 관련된 질환 또는 장애를 가지는 개체에 투여될 수 있다.
본 개시물의 조성물 및 방법은 경구, 직장, 질내, 비강내, 폐내, 또는 경피 또는 피부 전달에 의해, 또는 눈, 귀, 피부, 또는 다른 점막 표면에 외용 전달에 의해를 포함하는 다양한 점막 투여 모드에 의해 개체에 투여될 수 있다. 이 개시물의 일부 양상에서, 점막 조직 층은 상피 세포 층을 포함한다. 상피 세포는 폐, 기관, 기관지, 폐포, 코, 구강, 상피, 또는 위장관일 수 있다. 이 개시물의 조성물은 종래 작동기 가령 기계적 분무 장치, 그리고 가압된, 전기적으로 활성화된, 또는 다른 타입의 작동기를 사용하여 투여될 수 있다.
이 개시물의 조성물은 코 또는 폐 분무로서 수성 용액으로 투여될 수 있고 본 업계에서 숙련가에게 공지된 다양한 방법에 의해 분무 형태로 분산될 수 있다. 이 개시물의 조성물의 폐 전달은, 예를 들면, 에어로졸화, 분무, 또는 살포될 수 있는 점안제, 입자, 또는 분무제 형태인 상기 조성물을 투여함에 의해 달성된다. 상기 조성물, 분무, 또는 에어로졸의 입자는 액체 또는 고체 형태일 수 있다. 코 분무제로서 액체를 분배하기 위한 바람직한 시스템은 미국특허 제 4,511,069호에 개시되어 있다. 그러한 제제는 본 개시물에 따른 조성물을 물 내 용해시켜 수성 용액을 생성함에 의해 편리하게 제조될 수 있고, 상기 용액을 무균으로 만든다. 상기 제제는 다중-투여 용기, 예를 들면 미국특허 제 4,511,069호에 개시된 밀봉된 분배 시스템 내에 제시될 수 있다. 다른 적절한 코 분무 전달 시스템이 Transdermal Systemic Medication, Y. W. Chien ed., Elsevier Publishers, New York, 1985에서; 및 미국특허 제 4,778,810호에서 기술되어 있다. 부가적 에어로졸 전달 형태는, 예를 들면, 압축된 공기-, 제트-, 초음파- 및 압전기 분무기를 포함할 수 있고, 이는 제약학적 용매, 예를 들면, 물, 에탄올, 또는 그의 혼합물 내에 용해 또는 현탁된 생물학적으로 활성인 물질을 전달한다.
본 개시물의 코 및 폐 분무 용액은 대표적으로 약물 또는 계면활성제, 가령 비이온성 계면활성제 (예를 들면, 폴리소르베이트-80), 및 하나 이상 완충제로 임의로 제제화되어 전달될 약물을 포함한다. 본 개시물의 일부 구체예에서, 코 분무 용액은 추가로 추진제를 포함한다. 코 분무 용액의 pH는 약 pH 6.8 내지 7.2일 수 있다. 사용된 제약학적 용매는 또한 pH 4-6의 약간 산성 수성 완충제일 수 있다. 화학물질 안정성을 향상 또는 유지하기 위해, 보존제, 계면활성제, 분산제, 또는 가스를 포함하는 다른 성분을 부가할 수 있다.
일부 구체예에서, 이 개시물은 이 개시물의 조성물을 함유하는 용액 및 및 폐, 점막, 또는 비강내 분무 또는 에어로졸에 대한 작동자를 포함하는 제약학적 생성물이다.
이 개시물의 조성물의 투여 형태는 액적 또는 에멀전의 형태, 또는 에어로졸 형태인 액체일 수 있다.
이 개시물의 조성물의 투여 형태는 투여 이전에 액체 내에서 재구성될 수 있는 고체일 수 있다. 고체는 분말로서 투여될 수 있다. 고체는 캡슐, 정제, 또는 겔 형태일 수 있다.
본 개시물 내 폐 전달을 위한 조성물을 조제하기 위해, 생물학적으로 활성인 물질은 다양한 제약학적으로 허용가능한 첨가제, 그리고 염기 또는 활성인 물질(들)의 분산을 위한 담체와 조합될 수 있다. 첨가제의 예시는 pH 조절제 가령 아르기닌, 소듐 하이드록사이드, 글리신, 염산, 시트르산, 및 그의 혼합물을 포함한다. 다른 첨가제는 국소마취제 (예를 들면, 벤질 알콜), 등장화제 (예를 들면, 소듐 클로라이드, 만니톨, 솔비톨), 흡착 저해제 (예를 들면, Tween 80), 용해도 향상제 (예를 들면, 시클로덱스트린 및 그의 유도체), 안정화제 (예를 들면, 혈청 알부민), 및 환원제 (예를 들면, 글루타치온)을 포함한다. 점막 전달을 위한 조성물이 액체일 때, 단일성으로서 간주되는0.9% (w/v) 생리적 식염수 용액의 긴장성을 참조하여 측정되는 제제의 긴장성은 투여 부위에서의 점막에서 어떠한 상당한, 비가역적 조직 손상이 유도되지 않는 값까지 대표적으로 조정된다. 일반적으로, 용액의 긴장성은 약 1/3 내지 3, 더욱 대표적으로 1/2 내지 2, 및 가장 종종 3/4 내지 1.7의 값으로 조정된다.
생물학적으로 활성인 물질은 생물학적으로 활성인 물질 및 어느 소정의 첨가제를 분산하는 능력을 가지는 친수성 화합물을 포함할 수 있는 염기 또는 비히클 내에 분산될 수 있다. 상기 염기는, 제한 없이, 폴리카복시산의 공중합체 또는 그의 염, 다른 단량체 (예를 들면, 메틸(메트)아크릴레이트, 아크릴산, 등)와의 카복시무수물 (예를 들면 말레산 무수물), 친수성 비닐 중합체 가령 폴리비닐 아세테이트, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스 유도체 가령 히드록시메틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 등, 및 천연 중합체 가령 키토산, 콜라겐, 소듐 알기네이트, 젤라틴, 히알루론산, 및 그의 비독성 금속 염을 포함하는 적절한 담체의 넓은 범위로부터 선택될 수 있다. 종종, 염기 또는 담체로서, 예를 들면, 폴리락트산, 폴리(젖산-글리콜산) 공중합체, 폴리히드록시부티르산, 폴리(히드록시부티르산-글리콜산) 공중합체 및 그의 혼합물인 생분해성 중합체가 선택된다. 택일적으로 또는 부가적으로, 합성 지방산 에스테르 가령 폴리글리세린 지방산 에스테르, 수크로스 지방산 에스테르, 등이 담체로서 사용될 수 있다. 친수성 중합체 및 기타 담체는 단독 또는 조합으로 사용될 수 있고, 부분 결정화, 이온성 결합, 가교결합, 등에 의해 담체에 향상된 구조적 완전성을 부여할 수 있다. 유체 또는 점성 용액, 겔, 페이스트, 분말, 마이크로스피어, 및 코 점막에 대한 직접 도포를 위한 필름을 포함하는 다양한 형태로 담체가 제공될 수 있다. 이 문맥에서 선택되는 담체의 사용은 생물학적으로 활성인 물질의 흡착 촉진을 유발할 수 있다.
점막, 코, 또는 폐 전달을 위한 제제는 염기 또는 부형제로서 친수성 저분자량 화합물을 함유할 수 있다. 그러한 친수성 저분자량 화합물은 통과매체를 제공하고 이를 통해 물-가용성 활성 물질, 가령 생물학적으로 활성인 펩티드 또는 단백질은 활성 물질이 흡착되는 체표면으로 염기를 통해 확산할 수 있다. 친수성 저분자량 화합물은 임의로 점막 또는 투여 대기로부터 수분을 흡수하고 물-가용성 활성 펩티드를 용해시킨다. 친수성 저분자량 화합물의 분자량은 일반적으로 10,000 이하 및 바람직하게는 3000 이하이다. 친수성 저분자량 화합물의 예시는 폴리올 화합물, 가령 올리고-, 디- 및 모노사카라이드을 포함하는 수크로스, 만니톨, 락토스, L-아라비노스, D-에리트로스, D-리보스, D-자일로스, D-만노스, D-갈락토스, 락툴로스, 셀로비오스, 젠티비오스, 글리세린, 폴리에틸렌 글리콜, 및 그의 혼합물을 포함한다. 친수성 저분자량 화합물의 추가 예시는 N-메틸피롤리돈, 알콜 (예를 들면, 올리고비닐 알콜, 에탄올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 등), 및 그의 혼합물을 포함한다.
이 개시물의 조성물은 생리적 조건과 유사하게 하기 위해 필요한 제약학적으로 허용가능한 담체 물질, 가령 pH 조정 및 완충제, 긴장성 조정제, 및 습윤제, 예를 들면, 소듐 아세테이트, 소듐 락테이트, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올리에이트, 및 그의 혼합물을 택일적으로 함유할 수 있다. 고체 조성물에 대해, 예를 들면, 제약학적 수준의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 탈쿰, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스, 마그네슘 카보네이트, 등을 포함하는 종래 비독성 제약학적으로 허용가능한 담체가 사용될 수 있다.
본 개시물의 특정의 구체예에서, 생물학적으로 활성인 물질은, 예를 들면 느린 방출 중합체를 포함하는 조성물 내에서 시간 방출 제제로 투여될 수 있다. 상기 활성인 물질은 신속 방출에 대해 보호하는 담체, 예를 들면 제어된 방출 비히클 가령 중합체, 마이크로캡슐화된 전달 시스템 또는 생부착성 겔로 제조될 수 있다. 본 개시물의 다양한 조성으로 상기 활성인 물질의 연장된 전달은 조성물 내에 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 하이드로겔 및 젤라틴을 조성물 내에 포함시킴에 의해 발생할 수 있다.
이 개시물은 특정의 구체예와 관련하여 기술되었고 설명 목적으로 많은 상세내용이 설명되었지만, 개시물은 부가적 구체예를 포함하고, 본 명세서에서 기술된 일부 구체사항은 이 개시물을 벗어남 없이 상당히 변경가능함이 본 업계에서의 숙련가에게 명백하다. 이 개시물은 그러한 부가적 구체예, 변형 및 동등물을 포함한다. 특히, 이 개시물은 다양한 예시적 성분 및 예시의 특징, 용어, 또는 요소의 어느 조합을 포함한다.
실시예
실시예 1.
식 (1)의 예시적 화합물이 표 1에 제공된다.
Figure 112016058650241-pct00014
Figure 112016058650241-pct00015
Figure 112016058650241-pct00016
표 1는 실시예 19에서 아래에 기술되는 어세이에서 각각의 화합물의 명칭 및 구조, 그의 분자량, 그의 pKa, 및 그의 넉다운 생활성 (KD)을 나타낸다.
실시예 2. 메틸 8- 브로모옥타노에이트의 합성
Figure 112016058650241-pct00017
Figure 112016058650241-pct00018
N2 대기 하에서, 8-브로모옥탄 산을 건조 메탄올 내에 용해시켰다. 농축 H2SO4을 한방울씩 부가하고 반응 혼합물을 환류 하에서 3 시간 동안 교반하였다.
반응을 박막 크로마토그래피에 의해 완료시까지 모니터링하였다. 용매를 진공 하에서 완전히 제거하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고 물로 세척하였다. 물 층을 에틸 아세테이트로 재-추출하였다. 총 유기 층을 포화 NaHCO3 용액으로 세척하였다. 유기 층을 다시 물로 세척하고 마지막으로 식염수로 세척하였다. 생성물을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축하였다.
실시예 3. 디메틸 8,8'-( 벤잔디일 ) 디옥타노에이트의 합성
Figure 112016058650241-pct00019
Figure 112016058650241-pct00020
건조 K2CO3을 취하고 건조 디메틸포름아미드에 N2 하에서 부가하였다. 디메틸포름아미드 내 벤질 아민을 천천히 부가하였다. 디메틸포름아미드 내 용해된 메틸 8-브로모옥타노에이트를 이후 실온에서 부가하였다. 반응 혼합물을 80o C까지 가열하고 교반하면서 36 시간 동안 반응을 유지하였다.
반응을 박막 크로마토그래피에 의해 완료시까지 모니터링하였다. 반응 생성물을 실온까지 냉각시키고 물을 부가하였다. 상기 화합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 물 층을 에틸 아세테이트로 재-추출하였다. 총 유기 층을 물 및 마지막으로 식염수 용액으로 세척하였다. 생성물을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축하였다.
반응 생성물을 클로로포름 내 3% 메탄올 내 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 44 gm의 순수한 생성물을 회수하였다.
클로로포름 내10% 메탄올의 TLC 시스템을 사용하여, 생성물을 Rf: 0.8로 이동시키고, 닌히드린 내 탄화에 의해 가시화하였다. 전체 수율은 82%였다. 상기 화합물은 밝은 갈색 액체였다. 구조를 1H-NMR에 의해 확인하였다.
실시예 4. 디메틸 8,8'- 아잔디일디옥타노에이트의 합성
Figure 112016058650241-pct00021
디메틸 8,8'-(벤잔디일)디옥타노에이트를 수소화 유리 용기로 옮기고, 에탄올, 이후 10% Pd/C을 부가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 50 psi H2 기압 하에서 2 시간 동안 Parr-셰이커 장치 내에서 교반하였다.
반응 생성물을 셀라이트를 통해 여과하고 뜨거운 에틸 아세테이트로 세척하였다. 여액을 진공 하에서 농축하였다.
실시예 5. 디메틸 8,8'-(( tert부톡시카르보닐 ) 아잔딜 ) 디옥타노에이트의 합성
Figure 112016058650241-pct00022
Figure 112016058650241-pct00023
디메틸 8,8'-아잔디일디옥타노에이트를 DCM로 옮기고 Et3N 반응 매쓰에 0oC 까지 냉각시켰다. DCM 내 희석된 Boc 무수물을 한방울씩 상기 반응물에 부가하였다. 부가를 완료 후, 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다.
반응을 물로 급냉시키고 DCM 층을 분리하였다. 물 상을 DCM로 재-추출하고 조합된 DCM 층을 식염수 용액으로 세척하고 Na2SO4로 건조시켰다. 농축 후, 40 gm의 크루드 화합물을 수집하였다.
크루드 반응 생성물을 헥산 내 0-12% 에틸 아세테이트를 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 회수된 수율은 48%였다. 단일 생성물을 0.5의 Rf로 헥산 내 20% 에틸 아세테이트 내 박막 크로마토그래피에 의해 이동시켰고, 닌히드린으로 탄화시켰다.
실시예 6. 8,8'-(( tert부톡시카르보닐 ) 아잔디일 ) 디옥탄 산의 합성
Figure 112016058650241-pct00024
Figure 112016058650241-pct00025
디메틸 8,8'-((tert부톡시카르보닐)아잔딜) 디옥타노에이트를 THF로 옮켰다. 6N 소듐 하이드록사이드 용액을 실온에서 부가하였다. 반응을 밤새 실온에서 교반하면서 유지하였다.
THF 를 제거하기 위해 25oC에서 진공 하에서 반응 매쓰를 증발시켰다. 반응 생성물을 5N HCl로 산성화시켰다 . 에틸 아세테이트를 수성 층에 부가하였다. 분리된 유기 층을 물로 세척하고 물 층을 에틸 아세테이트로 재-추출하였다. 조합시킨 유기 층을 식염수 용액으로 세척하고 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용액의 농축으로 18 gm의 크루드 매쓰를 얻었다.
실시예 7. 디((Z)-비-2-엔-1-일) 8, 8'((tert부톡시카르보닐)아잔디일 )의 합성
Figure 112016058650241-pct00026
Figure 112016058650241-pct00027
8,8'-((tert부톡시카르보닐)아잔디일) 디옥탄 산을 건조 DCM 내에 용해시켰다. HATU을 이 용액에 부가하였다. 디-이소프로필 에틸 아민을 실온에서 반응 혼합물에 천천히 부가하였다. 내부 온도는 40oC까지 상승하고 옅은 황색 용액이 형성되었다. DMAP을, 이후 건조 DCM 내 cis-2-노넨-1-올 용액을 반응 혼합물에 부가하였다. 반응은 갈색으로 변했다. 반응을 5 시간 동안 실온에서 교반하였다.
반응을 박막 크로마토그래피에 의해 완결 하에서 확인하였다. 물을 반응 생성물에 부가하였고, 이를 DCM 로 추출하였다. DCM 층을 물로, 이후 식염수 용액으로 세척하였다. 유기 층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축하여 35 gm의 크루드 화합물을 얻었다.
실시예 8. ATX -001의 합성
Figure 112016058650241-pct00028
디((Z)-비-2-엔-1-일) 8,8'((tert부톡시카르보닐)아잔디일) 디옥타노에이트 (0.023 mol, 15 g)을 건조 디클로로메탄 (DCM) (200 ml) 내에 용해시켰다. 반응을 개시하기 위해 트리플루오로아세트산 (TFA)을 0oC에서 부가하였다. 교반하면서 30 분 동안에 걸쳐 반응 온도를 천천히 실온까지 데워지도록 방치하였다. 박막 크로마토그래피는 반응이 완료됨을 나타내었다. 반응 생성물을 진공 하에서 40℃에서 농축하고 크루드 잔사를 DCM로 희석하고, 10% NaHCO3 용액으로 세척하였다. 수성 층을 DCM로 재-추출하고, 조합된 유기 층을 식염수 용액으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고 농축하였다. 수집된 크루드 생성물 (12 grams)을 질소 가스 하에서 건조 DCM (85 ml) 내에 용해시켰다. 트리포스겐을 부가하고 반응 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, Et3N을 한방울씩 부가하였다. 반응 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 박막 크로마토그래피는 반응이 완료됨을 나타내었다. DCM 용매를 N2 하에서 증류에 의해 반응 매쓰로부터 제거하였다. 반응 생성물을 0℃까지 냉각시키고, DCM (50 ml), 및 2-((2-(디메틸아미노)에틸)티오) 아세트산 (0.039 mol, 6.4g) 및 카보디이미드 (EDC.HCl) (0.054 mol, 10.4 g)로 희석하였다. 반응 혼합물을 이후 밤새 실온에서 교반하였다. 박막 크로마토그래피는 반응이 완료됨을 나타내었다. 반응 생성물을 0.3M HCl 용액 (75 ml)로 희석하고, 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM로 재-추출하고, 조합된 유기 층을 10% K2CO3 수성 용액 (75ml)로 세척하고 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매의 농축으로 10 그램의 크루드 매쓰를 얻었다. 크루드 화합물을 3% MeOH/DCM을 사용하여 실리카 겔 칼럼 (100-200 메쉬)에 의해 정제하였다. 수율은 10.5 g (68%)였다.
실시예 9. ATX -002의 합성
Figure 112016058650241-pct00029
디((Z)-비-2-엔-1-일) 8,8'((tert부톡시카르보닐)아잔디일) 디옥타노에이트 (13.85 mmol, 9 그램)을 건조 DCM (150 ml) 내에 용해시켰다. 반응을 개시하기 위해 TFA을 0℃에서 부가하였다. 교반하면서 30 분 동안에 걸쳐 반응 온도를 천천히 실온까지 데워지도록 방치하였다. 박막 크로마토그래피는 반응이 완료됨을 나타내었다. 반응 생성물을 진공 하에서 40℃에서 농축하고 크루드 잔사를 DCM로 희석하고, 10% NaHCO3 용액으로 세척하였다. 수성 층을 DCM로 재-추출하고, 조합된 유기 층을 식염수 용액으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고 농축하였다. 수집된 크루드 생성물을 질소 가스 하에서 건조 DCM (85 ml) 내에 용해시켰다. 트리포스겐을 부가하고 반응 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, Et3N을 한방울씩 부가하였다. 반응 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 박막 크로마토그래피는 반응이 완료됨을 나타내었다. DCM 용매를 N2 하에서 증류에 의해 반응 매쓰로부터 제거하였다. 반응 생성물을 0℃까지 냉각시키고, DCM(50 ml)로 희석하고, 2-(디메틸아미노)에탄티올 HCl (0.063 mol, 8.3 g), 이후 Et3N (건조)을 부가하였다. 반응 혼합물을 이후 밤새 실온에서 교반하였다. 박막 크로마토그래피는 반응이 완료됨을 나타내었다. 반응 생성물을 0.3M HCl 용액 (75 ml)로 희석하고, 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM로 재-추출하고, 조합된 유기 층을 10% K2CO3 수성 용액 (75 ml)로 세척하고 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매의 농축으로 10 그램의 크루드 매쓰를 얻었다. 크루드 화합물을 3% MeOH/DCM을 사용하여 실리카 겔 칼럼 (100-200 메쉬)에 의해 정제하였다. 수율은 3.1 그램이었다.
실시예 10. ATX -003의 합성
Figure 112016058650241-pct00030
디((Z)-비-2-엔-1-일) 8,8'((tert부톡시카르보닐)아잔디일) 디옥타노에이트 (0.00337 mol, 2.2 g)을 건조 DCM (20 ml) 내에 용해시켰다. 반응을 개시하기 위해 TFA을 0℃에서 부가하였다. 교반하면서 30 분 동안에 걸쳐 반응 온도를 천천히 실온까지 데워지도록 방치하였다. 박막 크로마토그래피는 반응이 완료됨을 나타내었다. 반응 생성물을 진공 하에서 40℃에서 농축하고 크루드 잔사를 DCM로 희석하고, 10% NaHCO3 용액으로 세척하였다. 수성 층을 DCM로 재-추출하고, 조합된 유기 층을 식염수 용액으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하였다. 수집된 크루드 생성물을 질소 가스 하에서 건조 DCM (10 ml) 내에 용해시켰다. 트리포스겐 (0.0182 mol, 5.4 g)을 부가하고 반응 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, Et3N을 한방울씩 부가하였다. 반응 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 박막 크로마토그래피는 반응이 완료됨을 나타내었다. DCM 용매를 N2 하에서 증류에 의해 반응 매쓰로부터 제거하였다. 반응 생성물을 0℃까지 냉각시키고, DCM로 희석하고 (15 ml), 및 2-(디메틸아미노)프로판티올.HCl (0.0182 mol, 2.82 g), 이후 Et3N (건조)을 부가하였다. 반응 혼합물을 이후 밤새 실온에서 교반하였다. 박막 크로마토그래피는 반응이 완료됨을 나타내었다. 반응 생성물을 0.3 M HCl 수성 용액 (20 ml)로 희석하고, 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM로 재-추출하고, 조합된 유기 층을 10% K2CO3 수성 용액 (50 ml)로 세척하고 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매의 농축으로 5 그램의 크루드 매쓰를 얻었다. 크루드 화합물을 3% MeOH/DCM을 사용하여 실리카 겔 칼럼 (100-200 메쉬)에 의해 정제하였다. 수율은 0.9 그램이었다.
실시예 11. ATX -004의 합성
Figure 112016058650241-pct00031
디((Z)-비-2-엔-1-일) 8,8'((tert부톡시카르보닐)아잔디일) 디옥타노에이트 (0.023 mol, 15 g)을 DCM 내 (200 ml) 용해시켰다. 반응을 개시하기 위해 TFA을 0℃에서 부가하였다. 교반하면서 30 분 동안에 걸쳐 반응 온도를 천천히 실온까지 데워지도록 방치하였다. 박막 크로마토그래피는 반응이 완료됨을 나타내었다. 반응 생성물을 진공 하에서 40℃에서 농축하고 크루드 잔사를 DCM로 희석하고, 10% NaHCO3 용액으로 세척하였다. 수성 층을 DCM로 재-추출하고, 조합된 유기 층을 식염수 용액으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고 농축하였다. 수집된 크루드 생성물, 디((Z)-비-2-엔-1-일)8,8'-아잔디일디옥타노에이트 (5.853 mmol, 3.2 g)을 질소 하에서 건조 디메틸 포름아미드 (DMF) 내에 용해시키고, 2-((3-(디메틸아미노)프로필)티오)아세트산 (10.48 mmol, 1.85 g) 및 EDC.HCl (14.56 mmol, 2.78 g)을 부가하였다. 반응 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 반응을 물로 급냉시키고 (30 ml) 및 DCM로 희석하고 (30 ml), 및 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM로 재-추출하고, 조합된 유기 층을 10% K2CO3 수성 용액으로 세척하고 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 크루드 화합물을 3% MeOH/DCM을 사용하여 실리카 겔 칼럼 (100-200 메쉬)에 의해 정제하였다. 수율은 1 그램 (24.2%).
실시예 12. ATX -005의 합성
Figure 112016058650241-pct00032
디((Z)-비-2-엔-1-일) 8,8'((tert부톡시카르보닐)아잔디일) 디옥타노에이트 (0.023 mol, 15 g)을 건조 DCM (200 ml) 내에 용해시켰다. 반응을 개시하기 위해 TFA을 0℃에서 부가하였다. 교반하면서 30 분 동안에 걸쳐 반응 온도를 천천히 실온까지 데워지도록 방치하였다. 박막 크로마토그래피는 반응이 완료됨을 나타내었다. 반응 생성물을 진공 하에서 40℃에서 농축하고 크루드 잔사를 DCM로 희석하고, 10% NaHCO3 용액으로 세척하였다. 수성 층을 DCM로 재-추출하고, 조합된 유기 층을 식염수 용액으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고 농축하였다. 크루드 반응 생성물, 디((Z)-비-2-엔-1-일)8,8'-아잔디일디옥타노에이트 (5.853 mmol, 3.2 g)을 질소 가스 하에서 DMF 내에 용해시켰다. 2-((3-(디메틸아미노)프로필)티오)아세트산 (10.48 mmol, 1.85 g) 및 EDC.HCl (14.56 mmol, 2.78 g) 및 반응 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 박막 크로마토그래피는 반응이 완료됨을 나타내었다. 반응 생성물을 물 (30 ml)로 급냉시키고 DCM (30 ml)로 희석하였다. 수성 층을 DCM로 재-추출하고, 조합된 유기 층을 10% K2CO3 수성 용액 (75 ml)으로 세척하고 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매의 농축으로 5 그램의 크루드 매쓰를 얻었다. 크루드 화합물을 3% MeOH/DCM을 사용하여 실리카 겔 칼럼 (100-200 메쉬)에 의해 정제하였다. 수율은 1 그램 (24.2%).
실시예 13. ATX -006의 합성
Figure 112016058650241-pct00033
디((Z)-비-2-엔-1-일) 8,8'((tert부톡시카르보닐)아잔디일) 디옥타노에이트를 건조 DCM (150 ml) 내에 용해시켰다. 반응을 개시하기 위해 TFA을 0℃에서 부가하였다. 교반하면서 30 분 동안에 걸쳐 반응 온도를 천천히 실온까지 데워지도록 방치하였다. 박막 크로마토그래피는 반응이 완료됨을 나타내었다. 반응 생성물을 진공 하에서 40℃에서 농축하고 크루드 잔사를 DCM로 희석하고, 10% NaHCO3 용액으로 세척하였다. 수성 층을 DCM로 재-추출하고, 조합된 유기 층을 식염수 용액으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고 농축하였다. 수집된 크루드 생성물을 질소 가스 하에서 건조 DCM (85 ml) 내에 용해시켰다. 트리포스겐을 부가하고 반응 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, Et3N을 한방울씩 부가하였다. 반응 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 박막 크로마토그래피는 반응이 완료됨을 나타내었다. 크루드 반응 생성물을 질소 대기 하에서 건조 DMF 내에 용해시키고, 2-((2-(디에틸아미노)에틸)티오)아세트산 (3.93 mmol, 751 mg) 및 EDC.HCl (5.45 mmol, 1.0 g)을 부가하였다. 반응 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 반응을 물로 급냉시키고 (3 ml) 및 과량의 DMF을 진공 하에서 25℃에서 제거하였다. 반응 생성물을 물로 희석하고 수성 층을 두번 DCM (20 ml)로 추출하였다. 조합시킨 유기 층을 식염수 용액으로 세척하고 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매의 농축으로 2 그램의 크루드 매쓰를 얻었다. 3% MeOH/DCM을 사용하여 실리카 겔 칼럼 (100-200 메쉬)에 의한 정제 후, 수율은 1.2 그램 (76%)이었다.
실시예 14. ATX -009의 합성
Figure 112016058650241-pct00034
디((Z)-비-2-엔-1-일) 8,8'(tert부톡시카르보닐)아잔디일) 디옥타노에이트 (13.85 mmol, 9 그램)을 건조 DCM (20 ml) 내에 용해시켰다. 반응을 개시하기 위해 TFA을 0℃에서 부가하였다. 교반하면서 30 분 동안에 걸쳐 반응 온도를 천천히 실온까지 데워지도록 방치하였다. 박막 크로마토그래피는 반응이 완료됨을 나타내었다. 반응 생성물을 진공 하에서 40℃에서 농축하고 크루드 잔사를 DCM로 희석하고, 10% NaHCO3 용액으로 세척하였다. 수성 층을 DCM로 재-추출하고, 조합된 유기 층을 식염수 용액으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고 농축하였다. 디((Z)-비-2-엔-1-일)8,8'-아잔디일디옥타노에이트 (0.909 mmol, 500 mg)을 질소 대기 하에서 건조 DCM (20 ml) 내에 용해시켰다. 트리포스겐을 부가하고 반응 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, Et3N을 한방울씩 부가하였다. 반응 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 박막 크로마토그래피는 반응이 완료됨을 나타내었다. DCM 용매를 질소 대기 하에서 증류에 의해 반응 매쓰로부터 제거하였다. 2-(에틸(메틸)아미노)에탄-1-티올 하이드로클로라이드 (4.575 mmol, 715 mg)을 DMF (7 ml) 및 테트라하이드로푸란 (THF) (5 ml) 내에 용해시키고, 0o C에서 THF 내 소듐 하이드라이드 현탁액에 한방울씩 부가하였다. 반응 혼합물을 이후 밤새 실온에서 교반하였다. 박막 크로마토그래피는 반응이 완료됨을 나타내었다. 반응 생성물을 에틸 아세테이트 및 냉수로 희석하였다. 반응을 5% HCl (9 ml)로 중성화하고, 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트 (EtOAc) (20 ml) 로 재-추출하고, 냉수 및 식염수 내에서 세척하고, 조합된 유기 층을 세척하고 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매의 농축으로 1 그램 또는 크루드 생성물을 얻었다. 상기 화합물을 3% MeOH/DCM을 사용하여 실리카 겔 칼럼 (100-200 메쉬)에 의해 정제하여 100 mg을 얻었다.
실시예 15. ATX -010의 합성
Figure 112016058650241-pct00035
디((Z)-비-2-엔-1-일) 8,8'((tert부톡시카르보닐)아잔디일) 디옥타노에이트 (3.079 mmol, 2 g)을 건조 DCM (20 ml) 내에 용해시켰다. 반응을 개시하기 위해 TFA을 0℃에서 부가하였다. 교반하면서 30 분 동안에 걸쳐 반응 온도를 천천히 실온까지 데워지도록 방치하였다. 박막 크로마토그래피는 반응이 완료됨을 나타내었다. 반응 생성물을 진공 하에서 40℃에서 농축하고 크루드 잔사를 DCM로 희석하고, 10% NaHCO3 용액으로 세척하였다. 수성 층을 DCM로 재-추출하고, 조합된 유기 층을 식염수 용액으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고 농축하였다. 수집된 크루드 생성물을 질소 가스 하에서 건조 DCM (20 ml) 내에 용해시켰다. 트리포스겐 (14.55 mmol, 4.32 g)을 부가하고 반응 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, Et3N을 한방울씩 부가하였다. 반응 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 박막 크로마토그래피는 반응이 완료됨을 나타내었다. DCM 용매를 N2 하에서 증류에 의해 반응 매쓰로부터 제거하였다. 반응 생성물을 0℃까지 냉각시키고, DCM로 희석하고 (20 ml), 및 2-(디메틸아미노)에탄티올 HCl (0.063 mol, 8.3 g), 이후 Et3N (건조)을 부가하였다. 반응 혼합물을 이후 밤새 실온에서 교반하였다. 박막 크로마토그래피는 반응이 완료됨을 나타내었다. 반응 생성물을 0.3 M HCl 용액 (20 ml)으로 희석하고, 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM로 재-추출하고, 조합된 유기 층을 10% K2CO3 수성 용액 20 ml) 으로 세척하고 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매의 농축으로 10 그램의 크루드 매쓰를 얻었다. 크루드 화합물을 3% MeOH/DCM을 사용하여 실리카 겔 칼럼 (100-200 메쉬)에 의해 정제하였다. 수율은 1.4 g (75%)
실시예 16. ATX -011 내지 ATX -030 및 ATX -32의 합성
ATX-011 내지 ATX-30의 합성은 거기에 기술된 합성 반응에 대해 적절한 출발 성분을 치환함에 의해, 실시예 1-15의 합성을 따른다.
실시예 17. ATX -031의 합성
Figure 112016058650241-pct00036
실시예 19. 생체내 마우스 인자 VII 사일런싱
리포좀 라이브러리의 간-지향 생체내 스크린을 사용하여, 상기 세포를 간 연조직을 포함하는 간세포 내 높은 수준의 siRNA 매개된 유전자 사일런싱을 촉진시키는 일련의 화합물을 시험하였다. 인자 VII, 혈액 응고 인자는 간에 기능적 siRNA 전달을 시험하기 위해 적절한 표적 유전자이다. 이 인자는 특히 간세포에서 생성되기 때문에, 유전자 사일런싱은 세망내피계 (예를 들면, Kupffer 세포)의 세포에 전달과는 반대인, 연조직에의 성공적 전달을 나타낸다. 또한, 인자 VII는 혈청 내에서 용이하게 측정될 수 있는 분비된 단백질이고, 동물을 마취할 필요성을 회피시킨다. 단백질 수준을 측정함에 의해 mRNA 수준에서 사일런싱이 용이하게 결정될 수 있다. 이는 단백질의 짧은 반감기 (2-5 시간) 때문이다. C57BL/6 마우스 (Charles River Labs)는 0.006 ml/g의 부피에서 꼬리 정맥 주사를 통해 리포좀 제제 내 식염수 또는 siRNA를 투여받았다. 투여 후 48 h에서, 동물을 이소플루란 흡입으로 마취하고 혈액을 안와후 출혈에 의해 혈청 분리기 튜브 내로 수집하였다. 인자 VII 단백질의 혈청 수준을 제조자의 프로토콜에 따라 발색 어세이 (Biophen FVII, Aniara Corporation)을 사용하여 샘플 내에서 결정하였다. 식염수-처리 동물로부터 수집한 혈청을 사용하여 표준 커브를 작성하였다.
인자 VIII에 관한 siRNA을 가지는 조성물을 ATX-001, ATX-002, ATX-003, 및 ATX-547, 및 비교기 샘플 NC1 및 MC3 (Alnylam)로 조제하였다. 이들을 0.3 mg/kg 및 1 mg/kg에서 동물 내로 주사하였다. MC3 (0.3 mg/kg), NC1 (0.3 mg/kg), ATX-547 (0.3 mg/kg), ATX-001 (0.3 및 1.0 mg/kg), ATX-002 (0.3 및 1.0 mg/kg), 및 ATX-003 (0.3 및 1.0 mg/kg)에 의해 캡슐화된 siRNA을 C57BL6 마우스에 대한 siRNA 제제의 투여 이후 마우스 혈장 내 넉다운 인자 VII에 대한 능력에 대해 측정하였다. 결과는 ATX-001 및 ATX-002는 대조구와 비교하여 0.3 mg/kg에서 가장 효과적임을 나타내었다 (도 1 및 2).
MC3 (0.3 및 1.5 mg/kg), NC1 (0.3 mg/kg), ATX-547 (0.1 및 0.3 mg/kg), ATX-004 (0.3), ATX-006 (0.3 및 1.0 mg/kg), ATX-010 (0.3 mg/kg), 및 ATX-001 (0.3 및 1.5 mg/kg) 캡슐화된 siRNA는 C57BL6 마우스에 대한 siRNA 제제의 투여 이후 마우스 혈장 내 인자 VII 넉다운에 대해 측정하였다. 결과는 ATX-001 및 ATX-010가 가장 효과적임을 나타내었다 (도 3 및 4). 실시예 화합물의 넉다운 활성은 ATX-018, ATX-019, 및 ATX-020에 대해 0.3 mg/kg 또는 0.05 mg/kg에 대해 나타내어져 있다 (표 1).

Claims (26)

  1. 식 I의 화합물
    Figure 112019050715002-pct00037
    1
    여기서
    R1 및 R2는 동일하거나 상이하며, 각각 1 내지 9 개의 탄소로 구성된 선형 알킬 또는 2 내지 11 개의 탄소로 구성된 알케닐이고,
    L1 및 L2는 동일하거나 상이하며, 각각 5 내지 18 개의 탄소로 구성된 선형 알킬렌이고,
    X1은 결합이거나, 또는 이에 의해 L2-CO-O-R2가 형성되는 -CO-O-이고,
    X2는 S이고,
    L3는 결합이거나, 1 내지 6 개의 탄소로 구성된 선형 또는 분지형 알킬렌이고,
    R3는 1 내지 6 개의 탄소로 구성된 선형 또는 분지형 알킬렌이고, 및
    R4 및 R5는 동일하거나 상이하며, 각각 수소이거나, 1 내지 6 개의 탄소로 구성된 선형 또는 분지형 알킬임;
    또는 그의 제약학적으로 허용가능한 염.
  2. 제1항에 있어서, L3는 결합인 화합물.
  3. 제1항에 있어서, L3는 메틸렌인 화합물.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, R3는 에틸렌인 화합물.
  6. 제1항에 있어서, R3는 n-프로필렌 또는 이소부틸렌인 화합물.
  7. 제1항에 있어서, R4 및 R5는 개별적으로 메틸, 에틸, 또는 이소프로필인 화합물.
  8. 제1항에 있어서, L1 및 L2는 동일한 화합물.
  9. 제1항에 있어서, L1 및 L2는 상이한 화합물.
  10. 제1항에 있어서, L1 또는 L2는 7 개의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬렌으로 구성되는 화합물.
  11. 제1항에 있어서, L1 또는 L2는 9 개의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬렌으로 구성되는 화합물.
  12. 제1항에 있어서, R1 및 R2는 동일한 화합물.
  13. 제1항에 있어서, R1 및 R2는 상이한 화합물.
  14. 제12항에 있어서, R1 및 R2는 각각 알케닐로 구성되는 화합물.
  15. 제12항에 있어서, R1 및 R2는 각각 알킬로 구성되는 화합물.
  16. 제14항에 있어서, 상기 알케닐은 단일 이중 결합으로 구성되는 화합물.
  17. 제12항에 있어서, R1 또는 R2는 9 개의 탄소 원자로 구성되는 화합물.
  18. 제12항에 있어서, R1 또는 R2는 11 개의 탄소 원자로 구성되는 화합물.
  19. 제12항에 있어서, R1 또는 R2는 7 개의 탄소 원자로 구성되는 화합물.
  20. 제1항에 있어서, L3은 메틸렌이고, R3은 에틸렌이고, X2는 S이고, R4 및 R5는 각각 메틸인 화합물.
  21. 제1항에 있어서, L3는 결합이고, R3은 에틸렌이고, X2는 S이고, R4 및 R5는 각각 메틸인 화합물.
  22. 제1항에 있어서, L3는 결합이고, R3은 n-프로필렌이고, X2는 S이고, R4 및 R5는 각각 메틸인 화합물.
  23. 제1항에 있어서, L3는 결합이고, R3은 에틸렌이고, X2는 S이고, R4 및 R5는 각각 에틸인 화합물.
  24. 식 ATX-002, ATX-004 내지 ATX-020, ATX-023 내지 ATX-028, 및 ATX-031로 구성된 그룹으로부터 선택되는 화합물.
    ATX-002
    Figure 112019050715002-pct00048

    ATX-004
    Figure 112019050715002-pct00049

    ATX-005
    Figure 112019050715002-pct00050

    ATX-006
    Figure 112019050715002-pct00051

    ATX-007
    Figure 112019050715002-pct00052

    ATX-008
    Figure 112019050715002-pct00053

    ATX-009
    Figure 112019050715002-pct00054

    ATX-010
    Figure 112019050715002-pct00055

    ATX-011
    Figure 112019050715002-pct00056

    ATX-012
    Figure 112019050715002-pct00057

    ATX-013
    Figure 112019050715002-pct00058

    ATX-014
    Figure 112019050715002-pct00059

    ATX-015
    Figure 112019050715002-pct00060

    ATX-016
    Figure 112019050715002-pct00061

    ATX-017
    Figure 112019050715002-pct00062

    ATX-018
    Figure 112019050715002-pct00063

    ATX-019
    Figure 112019050715002-pct00064

    ATX-020
    Figure 112019050715002-pct00065

    ATX-023
    Figure 112019050715002-pct00066

    ATX-024
    Figure 112019050715002-pct00067

    ATX-025
    Figure 112019050715002-pct00068

    ATX-026
    Figure 112019050715002-pct00069

    ATX-027
    Figure 112019050715002-pct00070

    TX-028
    Figure 112019050715002-pct00071
    및
    ATX-031
    Figure 112019050715002-pct00072
    .

  25. 삭제
  26. 식 ATX-0029 또는 0030의 화합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 화합물
    Figure 112019128082915-pct00042
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