KR102029657B1 - 표적 약물 전달체 및 ｓｉＲＮＡ 활성을 증가시키는 화합물 - Google Patents

표적 약물 전달체 및 ｓｉＲＮＡ 활성을 증가시키는 화합물 Download PDF

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조지프 이. 페인
정 하우
존 에이. 가우데트
씨. 나가라잔 스리드하
빅토르 노포브
리처드 피. 비테
모하마드 아마디안
로렌 에이. 페렌맨
야스노부 다나카
비올레타 아코피안
프리야 칼말리
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Abstract

여기에 설명된 화학식I의 화합물:
Figure 112018119950312-pat00135
I.
여기서 R1 및 R2는 독립적으로 C10 내지 C18 알킬(alkyl), C12 내지 C18알케닐(alkenyl), 및 올레일(oleyl)군으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서 R3 및 R4 는 독립적으로 C1 내지 C6 알킬(alkyl), 및 C2 내지 C6 알칸올(alkanol)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며; 여기서 X는 -CH2-, -S-, 및 -O- 로 선택되거나또는 존재하지 않으며(absent); 여기서 Y는 -(CH2)n, -S(CH2)n, -O(CH2)n-, 티에노(thiophene), -SO2(CH2)n-, 및 에스터(ester)로 선택되고, 여기서 n = 1-4; 여기서 a=1-4; 여기서 b=1-4; 및 여기서 Z는 반대이온(counterion)이고; 및
구조(표적 분자)m-링커-(표적 분자)n,
[여기서 표적 분자는 레티노이드 또는 표적 세포에서 특이적인 수용체(receptor)를 가지고 있는 인지질 비타민; m 및 n은 독립적인 0, 1, 2 또는 3; 및 여기서 링커(linker)는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG) 또는 PEG-유사 분자]로 구성된, 표적 세포(target cell)에 약물 전달 촉진용 화합물, 뿐만 아니라 치료제의 전달에 유용한 이들 화합물의 하나 또는 두 개 이상을 포함하는 조성물 및 약학적 제제; 및 이러한 조성물 및 약학적 제제를 사용하는 방법.

Description

표적 약물 전달체 및 ｓｉＲＮＡ 활성을 증가시키는 화합물{COMPOUNDS FOR TARGETING DRUG DELIVERY AND ENHANCING ｓｉＲＮＡ ACTIVITY}
관련 출원에 대한 상호 참조(CROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATION)
본 발명은 2011년 6월 8일 출원된 미국 가출원 번호 61/494,840 및 61/494,710의 우선권을 주장한다. 이의 각각은 여기에 전체적으로 참조로 통합된다.
기술분야
본 발명은 siRNA를 포함한 치료 분자의 활성을 표적으로 하고 직접적으로 양이온성 지질 및 지용성 비타민의 화합물의 용도에 관한 것이다.
간의 섬유증(fibrosis)는 세포간 조직(interstitial tissue)에서 축적된 많은 종류의 콜라겐(collagen) 분자 및 피브로넥틴(fibronectin)을 야기하는, 활성화된 간성상세포(hepatic stellate cells, HSC)에 의해 유발될 수 있다. 이것은 간경변증(hepatic cirrhosis), 간부전(hepatic failure), 및/또는 간세포암종(hepat℃ellular carcinoma)을 유도할 수 있다. 뿐만 아니라, 간섬유증(hepatic fibrosis)과 동일한 기전에 의한 췌장섬유증(pancreatic fibrosis )의 결과로서 만성 췌장염(chronic pancreatitis)이 발달한다(Madro, et al., 2004; Med Sci Monit. 10:RA166-70; Jaster, 2004, Mol Cancer. 6:26). 뿐만 아니라, 성상세포는 성대 손상(v℃al cord scarring), 성대점막섬유증(v℃al cord mucosal fibrosis), 및 후두 섬유증(laryngeal fibrosis)과 같은 성대(v℃al cord) 및 후두(larynx)의 성대 손상 장애에 존재한다. 이들 기관들 및 신체 어디에서 나타나는 섬유증을 예방 또는 치료하기 위하여, 약물 담체(drug carrier) 및 약물 전달체 키트(kit)의 발달을 위한 요구가 있다.
성상세포는 섬유증을 치료하기 위한 중요한 표적 후보들 중 하나이다(Fallowfield et al., 2004, Expert Opin Ther Targets. 8:423-35; Pinzani, et al., 2004, Dig Liver Dis.36:231-42). 섬유화 동안, 성상세포는 주변 세포들에서부터의 사이토카인(cytokines)에 의해 활성화된다. 성상세포는 비타민 A(vitamin A)를 저장하고, 그리고 근섬유아세포 군(myofibroblast family)에 속하며, 간 섬유화를 일으킬 많은 요인이 생성된다.
섬유증 예방 또는 치료를 위한 치료 방법으로 콜라겐 대사, 콜라겐 분해 시스템의 증진, 및 성상세포의 활성 억제를 조절하는 것을 시도한다. 그러나, 모든 이들 경우에서, 활동의 낮은 특이성 및/또는 낮은 기관 특이성, 이러한 것은, 제한된 효율성 및 부작용이 문제를 일으킨다.
콜라겐 단백질 합성의 억제는 치료 방법으로서 성립되어 있지 않다. 콜라겐 생산을 표적으로 하는 분자들의 효능(potency)은 부작용을 야기하는 가능성 때문에 제한적이다. 콜라겐 생산을 억제하는 것은 섬유증을 예방하거나 또는 치료하기 위한 직접적으로 또다른 치료 방법으로 제공한다. 이런 방법은 하나 또는 그 이상의 다양한 종류의 I 내지 IV 타입 콜라겐을 조절하는 것을 요구한다. 이것을 달성하기 위한 방법은 세포내 이동을 위해 필수적이고 다양한 타입의 콜라겐을 위해 분자적 성숙이 필요한 콜라겐-특이적 분자 샤프론(collagen-specific molecular chaperone)인, HSP47를 통해서일 수 있다. 그러므로, 만약 HSP47의 기능이 특히 기관의 성상세포에서 조절될 수 있다면, 기관(organ)에서 간 섬유증을 억제하는 것의 가능성이 있다.
다수의 기술은 바이러스 성 형질 전환 시스템 및 비 - 바이러스 성 형질 전환 시스템의 사용을 포함하여, 이러한 세포에로의 siRNA 치료제를 전달이 가능하다. 비 바이러스 성 형질 전환 시스템은, 바이러스 성 형질 전환 시스템 및 비 - 바이러스 성 형질 감염 시스템의 사용을 포함한다. 비 바이러스 성 형질 전환 시스템, 예를 들면, 고분자, 지질, 리포좀, 미셀, 덴드리머, 나노 물질을 포함 할 수 있다. 이전에 세포 형질 감염을 위해 연구되어 중합체의 예로는 폴리 (L-라이신) (PLL), 폴리에틸렌 이민 (PEI), 키토산 및 폴리 (2 - 디메틸 아미노) 에틸 메타 크릴 레이트 (pDMAEMA) 양이온 성 중합체를 포함한다.
시스템의 각 유형의 각각의 장점과 단점이 있다. 예를 들어, 바이러스 시스템은 높은 형질 전환 효율을 얻을 수 있지만, 일부 비 바이러스 시스템 등의 안전하지 않을 수 있다. 또한, 바이러스 시스템을 준비하는 복잡한 및 / 또는 비용이 많이들 수 있습니다. 양이온 성 중합체와 같은 비 - 바이러스 성 형질 전환 시스템은, 세포에 플라스미드 DNA를 전달하는 것으로 보고되었다. 그러나, 양이온 성 고분자를 사용하는 몇 가지 단점은 세포에 자신의 독성 및 / 또는 안정성의 결여 있다.
이와 같이, 세포, 조직 및 생물에 새로운 화합물, 조성물, 및 핵산 등의 치료 약물의 전달을 개선하기 위해 양이온 성분을 이용하는 방법에 대해 가압 할 필요가 있다.
요약(SUMMARY)
설명의 또 다른 측면은 화학식 Ｉ의 화합물이다
Figure 112018119950312-pat00001
I
여기서 R1 및 R2는 독립적으로 C10 내지 C18 알킬(alkyl), C12 내지 C18알케닐(alkenyl), 및 올레일(oleyl)군으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서 R3 및 R4 는 독립적으로 C1 내지 C6 알킬(alkyl), 및 C2 내지 C6 알칸올(alkanol)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며; 여기서 X는 -CH2-, -S-, 및 -O- 로 선택되거나또는 존재하지 않으며(absent); 여기서 Y는 -(CH2)n, -S(CH2)n, -O(CH2)n-, 티에노(thiophene), -SO2(CH2)n-, 및 에스터(ester)로 선택되고, 여기서 n = 1-4; 여기서 a=1-4; 여기서 b=1-4; 및 여기서 Z는 반대이온(counterion)이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 구조 (표적 분자) n-링커-(표적 분자) n , [여기서 표적 분자는 레티노이드 또는 표적 세포에 대해 특이적인 수용체(receptor)를 가지고 있는 지용성 비타민; 여기서n=0, 1, 2 또는3; 및 여기서 링커(linker)는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG) 또는 PEG-유사 분자]로 구성된, 표적세포(target cell)에 약물전달 촉진용 화합물을 제공한다.
하나의 실시예에서, 레티노이드는 비타민 A(vitamin A), 레티노산(retinoic acid), 트레티노인(tretinoin), 아다팔렌(adapalene), 4-하이드로시(페닐)레티나마이드(4-hydroxy(phenyl)retinamide(4-HPR)), 레티닐 팔미테이트(retinyl palmitate), 레티날(retinal), 포화된 레티노 산(saturated retinoic acid), 및 포화된, 디메틸레이티드 레티노 산(saturated demethylated retinoic acid)으로 선택되는 화합물이다.
또 다른 하나의 실시예에서, 링커는 비스-아미도-PEG(bis-amido-PEG), 트리스-아미도-PEG(tris-amido-PEG), 테트라-아미도-PEG(tetra-amido-PEG), 리스-비스-아미도-PEG(Lys-bis-amido-PEG-Lys), 리스-트리스-아미도-PEG-리스(Lys-tris-amido-PEG-Lys), 리스-테트라-아미도-PEG-리스(Lys-tetr-amido-PEG-Lys), 리스-PEG-리스(Lys-PEG-Lys), PEG2000, PEG1250, PEG1000, PEG750, PEG550, PEG-Glu, Glu, C6, Gly3, 및 GluNH로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물이다.
또 다른 하나의 실시예에서, 화합물은 레티노이드-PEG-레티노이드(retinoid-PEG-retinoid), (레티노이드)2-PEG-(레티노이드)2(retinoid)2-PEG-(retinoid)2, VA-PEG2000-VA, (레티노이드)2-비스-아미도-PEG-(레티노이드)2(retinoid)2-bis-amido-PEG-(retinoid)2, (레티노이드)2-리스-비스-아미도-PEG-리스-(레티노이드)2(retinoid)2-Lys-bis-amido-PEG-Lys-(retinoid)2로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물이다.
또 다른 하나의 실시예에서, 레티노이드는 비타민 A(vitamin A), 레티노 산(retinoic acid), 트레티노인(tretinoin), 아다팔렌(adapalene), 4-하이드로시(페닐)레티나마이드(4-hydroxy(phenyl)retinamide(4-HPR)), 레티닐 팔미테이트(retinyl palmitate), 레티날(retinal), 포화된 레티노산(saturated retinoic acid), 및 포화된, 디메틸레이티드 레티노산(saturated demethylated retinoic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물.
또 다른 하나의 실시예에서, 화합물은 화학식의 조성물
Figure 112018119950312-pat00002
여기서, q, r, 및 s는 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10임.
또 다른 하나의 실시예에서, 조성물 구성의 화합물
Figure 112018119950312-pat00003
다른 실시예에서, 본 발명은 구조(레티노이드) m -링커-(레티노이드) n ;[여기서 m 및 n은 독립적인 0, 1, 2, 또는 3; 및 여기서, 링커는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol (PEG)) 또는 PEG-유사 분자]로 구성된, 레티노이드 분자의 성상 세포 특이적 양을 포함하는 성상-세포-특이적 약물 전달체를 제공한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 리포좀 조성물을 더 포함하는 약물 전달체를 제공한다. 다른 실시예에서, 리포좀(liposomal) 조성물은 지질 분자의 이중층(bilayer)을 포함하는 지질 소포(lipid vesicle)를 포함하는 약물 전달체이다.
특정 실시예에서, 레티노이드 분자는 약물 전달체가 성상세포에 도달하기 전에 약물 전달체의 외부(exterior)에 적어도 부분적으로 노출되는 약물 전달체이다.
다른 실시예에서, 레티노이드는 지질 분자의 0.1 몰(mol)% 내지 20(mol)%인 약물 전달체이다.
본 발명은 또한 실시예에서 지질 분자는 HEDC, DODC, HEDODC, DSPE, DOPE, 및 DC-6-14로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 지질을 포함하는 약물 전달체를 제공한다. 다른 실시예에서, 지질 분자는 S104를 더 포함하는 약물 전달체이다.
특정 실시예에서, 핵산을 더 포함하는 약물 전달체이다.
다른 실시예에서, 핵산은 성상세포에서 hsp47 mRNA의 발현을 녹 다운 시킬 수 있는 siRNA인 약물 전달체이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 구조(지질) m-링커-(표적 분자) n; [여기서 표적 분자는 레티노이드 또는 표적 세포에서 특이적인 수용체(receptor)를 가지고 있는 인지질 비타민; m 및 n은 독립적인0, 1, 2 또는3; 및 여기서 링커(linker)는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG) 또는 PEG-유사 분자]로 구성된, 표적 세포(target cell)에 약물 전달 촉진용 화합물이다.
다른 실시예에서, 지질 분자는 HEDC, DODC, HEDODC, DSPE, DOPE, 및 DC-6-14로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 지질을 포함하는 약물 전달체이다.
다른 실시예에서, 레티노이드는 비타민 A(vitamin A), 레티노 산(retinoic acid), 트레티노인(tretinoin), 아다팔렌(adapalene), 4-하이드로시(페닐)레티나마이드(4-hydroxy(phenyl)retinamide(4-HPR)), 레티닐 팔미테이트(retinyl palmitate), 레티날(retinal), 포화된 레티노 산(saturated retinoic acid), 및 포화된, 디메틸레이티드 레티노 산(saturated demethylated retinoic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물이다.
다른 실시예에서, 레티노이드는 비타민 A(vitamin A), 레티노산(retinoic acid), 트레티노인(tretinoin), 아다팔렌(adapalene), 4-하이드로시(페닐)레티나마이드(4-hydroxy(phenyl)retinamide(4-HPR)), 레티닐 팔미테이트(retinyl palmitate), 레티날(retinal), 포화된 레티노 산(saturated retinoic acid), 및 포화된, 디메틸레이티드 레티노 산(saturated demethylated retinoic acid)으로 선택되는 화합물이다.
본 발명의 다른 실시예에서, 지용성(fat-soluble) 비타민은 비타민 D(vitamin D), 비타민 E(vitamin E), 또는 비타민 K(vitamin K)인 화합물이다.
다른 실시예에서, 링커는 비스-아미도-PEG(bis-amido-PEG), 트리스-아미도-PEG(tris-amido-PEG), 테트라-아미도-PEG(tetra-amido-PEG), 리스-비스-아미도-PEG(Lys-bis-amido-PEG-Lys), 리스-트리스-아미도-PEG-리스(Lys-tris-amido-PEG-Lys), 리스-테트라-아미도-PEG-리스(Lys-tetr-amido-PEG-Lys), 리스-PEG-리스(Lys-PEG-Lys), PEG2000, PEG1250, PEG1000, PEG750, PEG550, PEG-Glu, Glu, C6, Gly3, 및 GluNH로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물이다.
본 발명의 다른 실시예에서 DSPE-PEG-VA, DSPE-PEG2000-Glu-VA, DSPE-PEG550-VA, DOPE-VA, DOPE-Glu-VA, DOPE-Glu-NH-VA, DOPE-Gly3-VA, DC-VA, DC-6-VA, 및 AR-6-VA로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물이다.
도 1은 설명의 특정실시예의 녹다운 효율성을 묘사하였다. 이것은 HEDC 리포좀과 DC-6-14 리포플렉스 대조군 비교를 포함하고 있다.
도 2는 양이온성 지질을 사용하여 유전자 녹다운의 비교를 생체외(in vitro)에서 묘사하고 있다.
도 3은 본발명의 전형적인 HEDODC 리포좀 제제와 생체내(in vivo)에서 유전자 발현의 평가를 묘사하고 있다(* 나타내다 p<0.05).
도 4는 실시예 15의 전형적인 HEDC 리포좀 제제와 생체외(in vitro) 유전자 발현의 평가를 묘사하고 있다. 오차 막대(Error bars)는 표준 편차(standard deviations)(n=3)을 나타낸다. S모양 투여 용량 반응 곡선(sigmoidal dose-response curve)은 가장 적합한 것을 바탕으로 나타내었다. 이 곡선에서 EC50 값을 계산하였다. 이것은 11.8 nM을 나타내었다.
도 5는 랫트 DMNQ 모델을 사용하여 생체내(in vivo)에서 결과를 측정하는 것을 나아내었다. 그런 다음 자연 그대로 군에서 gp46 mRNA 수치 배경을 뺀 후, 모든 테스트 군 값(test group values)은 처리군(vehicle group)의 gp46 mRNA 평균으로 표준화(normalized)하였다(처리군의 백분율로 나타내었다). gp46 mRNA 수치 평균은 처리 용량-독립적 반응 및 S모양 투여 용량 반응 커브로 0.79 mg/kg의 EC50 수율에 따라 나타내었다.
도 6은 랫트 DMNQ 모델을 사용하여 생체내(in vivo)에서 결과를 측정하는 것을 나아내었다. 그런 다음 자연 그대로 군에서 gp46 mRNA 수치 배경을 뺀 후, 모든 테스트 군 값(test group values)은 처리군(vehicle group)의 gp46 mRNA 평균으로 표준화(normalized)하였다(처리군의 백분율로 나타내었다). MRPL19 mRNA 수치는 정량적 RT-PCR (TaqMan®) 분석에 의해 측정하였다. gp46에 대한 mRNA 수치는 MRPL19 수치로 표준화 하였다.(*** 나타내다 p<0.02.)
도 7은 폐 블레오마이신 모델을 사용하여 생체내(in vivo)에서 측정의 결과를 나타내었다. 막대 그래프는 각 군에 대한 폐를 섹션하여 Azan-염색한 것의 섬유 점수를 요약하였다. 통계적 분석은 원 웨이 아노바(One way ANOVA), 프리즘5 소프트웨어(Prism5 software) 본페로니 다중 비교 테스트(Bonferroni multi comparison test)를 사용하였다.
도 8은 장식을 통행 VA-결합체를 리포좀에 첨가하여 siRNA 활성을 향상시켰다.
도 9는 VA-결합체를 리보좀에 공동-가용화를 통해 첨가하여 siRNA 활성을 향상시켰다.
도 10은 VA-결합체를 리포좀에 공동-가용화를 통해 첨가하여 siRNA 활성을 향상시켰다.
도 11은 VA-결합체를 리포좀에 공동-가용화를 통해 첨가하여 siRNA 활성을 향상시켰다.
도 12는 VA-결합체를 리포플레스에 공동-가용화 vs 장치를 통해 첨가하였다.
도 13은 마우스 CCl4 모델에서 생체내 효율성
도 14는 장식 vs 공동-가용화 레티노이드 결합체 생체내 효율성
도 15는 생체외 효율성(pHSC), 리포좀 제제에서 레티노이드 결합체의 효과.
도 16은 생체내(in vivo)(rat DMNQ)에서 레티노이드 결합체 내용(mol%)의 상관관계 효율성을 나타내었다. 수컷 Sprague-Dawley 랫트에 0, 0.25, 0.5, 1,이 포함된 제제 및 0.75 mg/kg siRNA의 용량에서 2% DiVA , 또는 PBS(처리)를 복강내 주입하거나, 한 시간 후 DMN의 마지막 주입을 하였다.
설명의 범위 내에서 화학식 I의 화합물
Figure 112018119950312-pat00004
I
여기서 R1 및 R2는 독립적으로 C10 내지 C18 알킬(alkyl), C12 내지 C18알케닐(alkenyl), 및 올레일(oleyl)군으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서 R3 및 R4 는 독립적으로 C1 내지 C6 알킬(alkyl), 및 C2 내지 C6 알칸올(alkanol)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며; 여기서 X는 -CH2-, -S-, 및 -O- 로 선택되거나또는 존재하지 않으며(absent); 여기서 Y는 -(CH2)n, -S(CH2)n, -O(CH2)n-, 티에노(thiophene), -SO2(CH2)n-, 및 에스터(ester)로 선택되고, 여기서 n = 1-4; 여기서 a=1-4; 여기서 b=1-4; 및 여기서 Z는 반대이온(counterion)이다.
본 발명의 화합물은 또한 다른 이름 화합물의 클라스내에 있는 것으로 지칭되는 “양이온 성 지질”이다. 양이온성 지질은 적어도 어느 한기 잔기 및 양전화로 하전된(positively charged) 질소와 관련있는 반대된 것을 포함하고 있는 화합물이다. “지질”은 소수성 알킬(hydrophobic alkyl) 또는 알케닐 잔기(alkenyl moiety) 및 카복식 산 또는 에스터 잔기로 구성되는 기술분야로 이해되고 있다.
그것은 종래 화학식 I의 화합물의 아미노 - 알킬 하이드록실(amino-alkyl-hydroxyl)(-N-알킬-OH)(-N-alkyl-OH) 잔기는 이전에 보고 된 이전의 다른 양이온 성 지질로 볼 수없는 본 발명의 제형에 속성을 부여하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 제제는 단백질 발현에서 눈에 띄게 감소되는 화학식 I 결과의 화합물을 포함하고 있고, 화학식 I의 화합물을 포함하지 않는 제제와 비교하였다. 특별하게 놀라운 것은 본 발명의 제제의 능력은 화학식 I의 화합물이 HSP47의 발현을 감소하는 것을 포함하고 있다.
본 발명의 바람직한 것은 여기서 R1 및 R2 는 독립적으로 각각 C10-C30 알킬 이러한 것을 포함하는 것이다. 더욱 바람직한 실시예에서, R1 및 R2는 독립적으로 각각 C10-C20 알킬 이다. 더욱 더 바람직한 실시예에서, R1 및 R2는 각각 C12-C15 알킬 이다. 특별하게 더욱 바람직한 실시예에서 여기서 R1 및 R2는 독립적으로 각각 C13-C17 알킬 이러한 것을 포함한다. 가장 선호하는 이러한 화합물은 여기서 R1 및 R2는 각각 C13 알킬이다.
다른 실시예에서, R1 및 R2는 독립적으로 각각 C10-C30 알켄일이다. 더욱 바람직한 실시예에서, R1 및 R2는 독립적으로 각각 C10-C20 알켄일이다. 또 다른 실시예에서, R1 및 R2는 독립적으로 각각 C12-C15 알켄일이다. 다른 하나의 실시예 측면에서, R1 및 R2는 독립적으로 각각 C13-C17 알켄일이다. 본 발명의 가장 선호하는 화화물은 여기서 R1 및 R2는 각각 C17 알켄일 이러한 것을 포함한다.
또한 화학식 I의 화합물, R3 및 R4는 C1 내지 C6 알킬로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 것이다. 바람직하게 실시예에서, R3 및 R4는 독립적으로 각각 C1-C3 알킬이다. 더욱 바람직하게, R3 및 R4는 가각 메틸이다. 또 다른 실시예에서, R3 및 R4 의 적어도 하나는 CH2CH2OH이다.
화학식 I의 가장 바람직한 이러한 화합물은 여기서 a = b = c = 1.
Z는 어느 질소 반대이온(counterion)일 수 있고, 이것에 대한 용어는 당업계에서 이해되고 있다. 질소 반대이온은 할로겐을 포함하고, 클로라이드 및 브로마이드가 특히 선호하고 메실레이트(mesylate)(SO3CH3)를 선호한다. 다른 양이온 지질과 반대하에 이전에 설명된 여기서 반대이온에 따른 양이온 지질의 효과, 화학식 I의 화합물의 효율성, 놀랍게도, 반대이온 선택에 관계가 있는것이 나타나지 않았다.
[0053] 화학식 I의 예시 화합물을 포함:
Figure 112018119950312-pat00005
Figure 112018119950312-pat00006
발명의 범위 내에서 표적 세포로 약물 전달을 용이 하게 하기위한 화합물이고, 구조 (표적 분자) n-링커-(표적 분자) n , [여기서 표적 분자는 레티노이드 또는 표적 세포에 대해 특이적인 수용체(receptor)를 가지고 있는 지용성 비타민; 여기서n=0, 1, 2 또는3; 및 여기서 링커(linker)는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG) 또는 PEG-유사 분자]로 구성된, 표적세포(target cell)에 약물전달 촉진용 화합물 및 이것은 “화학식 A”로 지정한다.
본 발명은 또한 범위 내에서 표적 세포로 약물 전달을 용이하기 위한 화합물을 포함하고, 구조(지질) m-링커-(표적 분자) n; [여기서 표적 분자는 레티노이드 또는 표적 세포에서 특이적인 수용체(receptor)를 가지고 있는 인지질 비타민; m 및 n은 독립적인0, 1, 2 또는3; 및 여기서 링커(linker)는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG) 또는 PEG-유사 분자]로 구성된, 표적 세포(target cell)에 약물 전달 촉진용 화합물 및 이것을 “화학식 B”로 지정한다.
화학식 A 또는 화학식 B의 화합물에 속성을 부여하여 이전에 볼수 없는 본 발명의 제형을 발견하였다. 본 발명의 제제는 화학식 A 또는 화학식 B의 화합물이 유전자 발현에서 눈에 띄게 감소하는 결과를 포함하고, 제제 비교는 이러한 화합물이 포함하고 있지 않다. 특히 본 발명의 제제의 능력은 화학식 A의 화합물이 눈에 띄게 HSP47의 발현 감소하는 것을 포함하고 있다.
특정 바람직한 실시예에서, 레티노이드는 비타민 A(vitamin A), 레티노 산(retinoic acid), 트레티노인(tretinoin), 아다팔렌(adapalene), 4-하이드로시(페닐)레티나마이드(4-hydroxy(phenyl)retinamide(4-HPR)), 레티닐 팔미테이트(retinyl palmitate), 레티날(retinal), 포화된 레티노 산(saturated retinoic acid), 및 포화된, 디메틸레이티드 레티노 산(saturated demethylated retinoic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물이다.
바람직한 실시예에서 링커는 비스-아미도-PEG(bis-amido-PEG), 트리스-아미도-PEG(tris-amido-PEG), 테트라-아미도-PEG(tetra-amido-PEG), 리스-비스-아미도-PEG-리스(Lys-bis-amido-PEG-Lys), 리스-트리스-아미도-PEG-리스(Lys-tris-amido-PEG-Lys), 리스-테트라-아미도-PEG-리스(Lys-tetr-amido-PEG-Lys), 리스-PEG-리스(Lys-PEG-Lys), PEG2000, PEG1250, PEG1000, PEG750, PEG550, PEG-Glu, Glu, C6, Gly3, 및 GluNH로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물이고, 다른 실시예에서, PEG는 모노 분산(mono disperse)이다.
다른 실시예에서 화합물은 레티노이드-PEG-레티노이드(retinoid-PEG-retinoid), (레티노이드)2-PEG-(레티노이드)2(retinoid)2-PEG-(retinoid)2, VA-PEG2000-VA, (레티노이드)2-비스-아미도-PEG-(레티노이드)2(retinoid)2-bis-amido-PEG-(retinoid)2, (레티노이드)2-리스-비스-아미도-PEG-리스-(레티노이드)2(retinoid)2-Lys-bis-amido-PEG-Lys-(retinoid)2로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 A.
또 다른 바람직한 실시예에서, 화합물 공식
Figure 112018119950312-pat00007
여기서 q,r, 및 s는 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10.
또 다른 바락직한 실시예에서, 화합물의 화학식을 포함하다.
Figure 112018119950312-pat00008
본 발명의 다른 실시예에서 표 1에 나타낸 구조를 포함한다.
표 1
Figure 112018119950312-pat00009
본 발명의 조성물은 적어도 하나의 화학식 I 및 리포좀 더 하나 또는 그 이상 레티노이드 결합체 구성을 포함하고 있다. 본 발명의 더 바람직한 실시예에서, 레티노이드 결합체는 약 0.3 내지 약 30 중량 백분율(weight percent), 조성물의 총 중량을 기초 또는 제제의 농도에서 나타내고, 이것은 약 0.1 내지 약 10 mol.%로 동등하고, 이것은 약 0.1 내지 약 10의 동등한 몰 비율(molar ratio)이다. 바람직하게, 레티노이드 결합체는 레티노이드-링커-지질 분자 또는 레티노이드-링커-레티노이드 분자이다.
레티노이드 결합체의 예는 화학식II의 이러한 화합물을 포함한다:
여기서 q, r, 및 s는 독립적으로 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10, 및 그것의 광학이성질체(enantiomers) 및 부분입체이성질체(diastereomers)이다.
Figure 112018119950312-pat00010
여기서 q,r, 및 s는 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10, 및 이들의 거울상이성질체(enantiomer) 및 부분입체이성질체(diastereomer).
화학식 II의 바람직한 화합물은 여기서q, r, 및 s은 독립적으로 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7. 더 바람직하게 화학식 II의 화합물은 여기서 q, r, 및 s은 독립적으로 각각 3, 4, 또는 5이다. 더 바락직하게 화학식 II의 화합물은 여기서 q는 3, r은 5, 및 s는 3. 화학식 II의 화합물의 하나 예는
Figure 112018119950312-pat00011
DiVA-PEG-DiVA
DiVA-PEG-DiVA는 입체중싱(stere℃enters) 및 모든 광학이성질체(enantiomers) 및 부분입체이성질체(diastereomers)를 포함하고 본 발명의 점수를 고려하였다.
본 발명의 조성물에서 양이온성 지질의 농도는, 화학식 I의 이러한 양이온성 지질을 포함하고, 1 내지 약 80 중량 백분율일 수 있고, 지질 조성물의 총 중량을 기초로 할 수 있다. 더욱 바람직하게, 1 내지 약 75 중량 백분율로부터 농도일 수 있다. 더욱 바람직하게, 농도는 약 30 내지 약 75 중량 백분율로부터 일 수 있다. 약 30 내지 약 75 중량으로부터 농도는 약 30 내지 60 mol.% 및 약 30-60의 몰 비율(molar ratio)일 수 있다. 가장 바람직하게 이러한 조성물은 약 50 중량 백분율의 양이온성 지질 농도를 포함하고 있다. 이 제제는 이온화 양이온성 지질의 혼합물, 화합물 I의 4차 아민 양이온성 지질을 포함하고, 더 바람직하게 mol%는 5% 내지 45 mol%이고, 더 더욱 바람직하게는 대략 이온화 양이온성 지질의 20 mol% 혼합물 및 화학식 I에 대한 4차 아민 양이온성 지질의 20 mol%이다.
이러한 조성물은 또한 수성 배지(aqueous medium)를 포함한다. 화학식 I의 이러한 양이온성 지질을 포함하고, 실이예에서 수성배지로 접근하기 어려운것과 같이 리포좀을 캡슐화 하였다. 더욱, 화학물 I의 이러한 양이온성 지질을 포함하고, 리포좀의 외면의 지역화 및 수성 배지를 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 화학식 I의 적어도 하나 화합물 및 리포좀, 및 화학식 II의 조성물과 같은 선택적인 레티노이드 결합체를 포함하고, 또는 siRNA를 포함한다. 또는 본 발명의 점수는 화학식 A 또는 B 및 siRNA의 적어도 하나 화합물로 구성한다.
이것은 어느 siRNA 분자와 함께 본 발명의 점수를 상상한다. siRNA는 SEQ ID NO:1에 의한 인간 hsp47 예시에 대한 mRNA 코딩(coding)을 안티센스 서열(antisense sequence)로 하고, 이것은 아래에 나타난 것을 따른다.
Figure 112018119950312-pat00012
Figure 112018119950312-pat00013
예를 들면,
센스(Sense) (5'->3') GGACAGGCCUCUACAACUATT (SEQ. ID. NO. 2)
안티센스(Antisense) (3'->5') TTCCUGUCCGGAGAUGUUGAU (SEQ. ID. NO. 3).
이러한 조성물은 또한 수성 배지를 포함할 수 있다. 바람직하게, 이러한 조성물은 siRNA와 복합적으로 더해진 것에 화학식 I의 적어도 하나 화합물을 본질적으로 구성한다. 이러한 조성물은 화학식 I의 화합물을 포함 및 siRNA는 더 액체 배지로 구성될 수 있다. 하나 실시예에서, 액체 배지는 살아있는 유기체(living organism)로 적합하게 주입할 수 있다. 본 발명의 설명된 실시예의 범위와 함께 액체 배지는 수성일 수 있고, 이것은, 수성 용매의 전적으로 구성 될 수 있고, 및 염, 버퍼, 및/또는 다른 제약 부형제를 포함한다. 다른 실시예에서, 액체 배지는 예를 들면, 유기 용매와 같은 다른 액체 용매와 결합된 것에서 수성 용매로 구성된 액체 배지 일 수 있다. 본 발명의 실시예에 설명된 어느 하나의 점수와 액체 배지는 또한 어느 하나 유기 용매를 포함할 수 있다. 유기 용매는 당업계에 알려저 있는 per se 및 C1 내지 C4 알코올(alcohols), 디메틸 설프옥사이드(dimethyl sulfoxide)("DMSO"), 및 이러한 비슷한 것들을 포함 할 수 있다. 이러한 액체 배지는 물 및 적어도 어느 하나 유기 옹매의 혼합물 또는 본 발명의 설명된 실시예의 어느 하나의 범위를 포함한다.
또한 본 발명의 범위 구성은 적어도 화학식 I의 화합물 및 리포좀에서 어느 하나로 구성된 것이다. 이러한 실시예에서 화학식 I의 화합물의 혼합물을 포함한다. 다른 실시예에서, 리포좀 및 화학식 I의 범위를 포함하지 않는 양이온성 지질을 첨가하여 하나 또는 화학식 I의 그 이상 화합물을 포함 할 수 있다.
일부 실시예에서, siRNA는 수성 배지로 접근하기 어려운 리포좀에 의해 캡슐화된 siRNA일 수 있다. 또 다른 실시예에서, siRNA는 리포좀에 의해 캡슐화되지 않을 수 있다. 이러한 실시예에서, siRNA는 리포좀의 외부 표면에서 복잡(complexed)해 질 수 있다. 이러한 실시예에서, siRNA는 수성 배지에 접근할 수 있다.
또 다른 실시예에서 리포좀 조성물로 구성된 성상-세포-약물 전달체를 포함한다. 리포좀 조성물은 지질 분자의 이중층(bilayer)을 포함하는 지질 소포(lipid vesicle)를 구성한다. 다른 실시예에서, 이것은 레티노이드 분자는 약물 전달체가 선상세포에 도달하기 전에 약물 전달체의 외부(exterior)에 적어도 부분적으로 노출되는 약물 전달체일 수 있다.
본 발명의 특정 실시에서 지질은 DODC, HEDODC, DSPE, DOPE, 및 DC-6-14로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 지질을 포함하는 것을 제공한다. 또 다른 실시예에서, 분자는 S104으로 더 구성할 수 있다.
Figure 112018119950312-pat00014
일부 실시예에서, siRNA는 수성 배지로 접근하기 어려운 리포좀에 의해 캡슐화된 siRNA일 수 있다. 또 다른 실시예에서, siRNA는 리포좀에 의해 캡슐화되지 않을 수 있다. 이러한 실시예에서, siRNA는 리포좀의 외부 표면에서 복잡(complexed)해 질 수 있다. 이러한 실시예에서, siRNA는 수성 배지에 접근할 수 있다.
또 다른 실시예에서 리포좀 조성물로 구성된 성상-세포-약물 전달체를 포함한다. 리포좀 조성물은 지질 분자의 이중층(bilayer)을 포함하는 지질 소포(lipid vesicle)를 구성한다. 다른 실시예에서, 이것은 레티노이드 분자는 약물 전달체가 선상세포에 도달하기 전에 약물 전달체의 외부(exterior)에 적어도 부분적으로 노출되는 약물 전달체일 수 있다.
특정 바람직한 실시예에서, 레티노이드는 지질 분자의 0.1 몰% 내지 20 몰%이다.
상기 조성물은 PEG-결합된 지질을 포함할 수 있고, 이것은 당업계에서 알려진 per se, PEG-인지질(PEG-phospholipids) 및 PEG-서아미트(PEG-ceramides), 하기로부터 선택되는 하나 또는 그 이상 분자 일 수 있다:PEG2000-DSPE, PEG2000-DPPE, PEG2000-DMPE, PEG2000-DOPE, PEG1000-DSPE, PEG1000-DPPE, PEG1000-DMPE, PEG1000-DOPE, PEG550-DSPE, PEG550-DPPE, PEG-550DMPE, PEG-1000DOPE, PEG-콜레스테롤( PEG-cholesterol), PEG2000-서아미드(PEG2000-ceramide), PEG1000-서아미드( PEG1000-ceramide), PEG750-서아미드(PEG750-ceramide), 및 PEG550-서아미드(PEG550-ceramide).
본 발명의 상기 조성물은 예를 들면,1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포코라인(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosph℃holine)("DSPC"), 디팔미토일포스패티딜콜라인(dipalmitoylphosphatidylcholine)("DPPC"), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)("DPPE"), 및 1,2-디오레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)("DOPE")과 같은 하나 또는 그 이상의 인지질을(phospholipids) 포함 할 수 있다. 바람직하게, 인지질은 DOPE를 도와준다.
예를 들면, 리포좀과 본 발명의 범위는 여러 가지 PEG-지질을 사용하여 제조, 여기에 설명된 방법으로 공동-가용화를 사용하여 통합하였다. 이러한 제제는 양이온성 지질:DOPE:콜레스테롤:DiVA-PEG-DiVA:PEG-지질(50:10:38:5:2 몰 비율(molar ratio))로 구성되고 각 제제는 200 nM의 농도에서 인간/랫트 HSP-47-C siRNA를 사용하여 여기서 설명한 생체외 분석 방법 하에 pHSC에서 실험을 하였다. 이 결과는 하기 표에 나타낸 것과 같다:
Figure 112018119950312-pat00015
본 발명의 상기 조성물은 예를 들면,1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포코라인(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosph℃holine)("DSPC"), 디팔미토일포스패티딜콜라인(dipalmitoylphosphatidylcholine)("DPPC"), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)("DPPE"), 및 1,2-디오레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)("DOPE")과 같은 하나 또는 그 이상의 인지질을(phospholipids) 포함 할 수 있다. 바람직하게, 인지질은 DOPE를 도와준다.
화학식I의 양이온성 지질은 추가적으로, 다른 지질을 사용할 수 있다. 이러한 것은 이온화 양이온성 지질을 포함하고, S104를 포함하고, 하기와 같이 나타내었다.
Figure 112018119950312-pat00016
S104
전달체 제제는 이온화 양이온성 지질과 결합된 것에 화학식 I의 양이온성 지질로 구성 될 수 있다. 이온화 양이온성 지질은 예를 들면.,S104를 포함한다. 이온화 양이온성 지질은 0 내지 45 mol %의 농도에서, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45 mol %로부터 선택된 농도를 포함한 것에서 나타날 수 있다.
또한 본 발명의 범위에서 약제학적 제제는 약학적으로 유용한 전달체 또는 희석제로써 앞서 설명한 조성물의 어느 하나를 포함한다. 본 발명의 약제학적 제제는 어느 하나 치료상의 물질을 포함한다. 바람직하게, 치료상의 물질은 siRNA이다. 이것은 어느 siRNA 분자를 본 발명의 범위로 사용할 수 있는 것을 구상하였다.
또한 본 발명의 범위에서 약제학적 제제는 약학적으로 유용한 전달체 또는 희석제로써 앞서 설명한 조성물의 어느 하나를 포함한다. 본 발명의 제약학적 제제는 적어도 어느 하나 치료상의 물질을 포함할 것이다. 바람직하게, 치료상의 물질은 siRNA이다. 이것은 어느 siRNA 분자를 본 발명의 범위로 사용할 수 있는 것을 구상하였다. 앞서 설명한 바와 같이, siRNA는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4에 나타낸 것과 같은 서열을 포함한다.
siRNA를 포함하는 본 발명의 바람직한 제형에서의 siRNA를 리포좀으로 캡슐화된다. 다른 실시예에서, siRNA는 리보좀의 외부가 될 수 있다. 이러한 실시예에서, siRNA는 리포좀의 외부로 착화 될 수 있다.
양이온성 지질의 유용한 범위(지질 질소로 siRNA 포스페이트 비율,"N:P")는 0.2 내지 5.0이다. 더 바람직한 N:P 의 범위는 조성물 및 본 발명의 제제로서 1.5 내지 2.5이다.
본 발명의 바람직한 제제는 HEDC:S104:DOPE:콜레스테롤:PEG-DMPE:DiVA-PEG-DiVA (20:20:30:25:5:2 몰 비율(molar ratio)) 및 HEDC:S104:DOPE:콜레스테롤:PEG-DMPE:DiVA-PEG-DiVA (20:20:30:25:5:2 몰 비율) 여기서 DiVA-PEG-DiVA 는 공동-가용화이다.DODC:DOPE:콜레스테롤:Peg-지질:DiVA-PEG-DiVA (50:10:38:2:5 몰 비율) 및 DODC:DOPE:콜레스테롤:Peg-지질:DiVA-PEG-DiVA 이러한 것으로 구성되어 있다.
본 발명의 다른 제제는 HEDODC:DOPE:콜레스테롤-PEG-지질:DiVA-PEG-DiVA (50:10:38:2:5 몰 비율(molar ratio)) 및 HEDODC:DOPE:콜레스테롤-PEG-지질:DiVA-PEG-DiVA 제제 여기서 DiVA-PEG-DiVA는 공동-가용화로 구성된 이러한 것을 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 제제는 DC-6-14:DOPE:콜레스테롤: DiVA-PEG-DiVA (40:30:30:5, 몰 비율(molar ratios)) 및 DC-6-14:DOPE:콜레스테롤:DiVA-PEG-DiVA 여기서DiVA-PEG-DiVA는 공동-가용화 된 것이고, 이러한 것을 구성한다.
또한 본 발명의 범위내를 환자에게 치료제로 전달하는 방법이다. 이러한 방법은 상기 조성물 및 약학적으로 유용한 전달체 또는 희석제의 어느 하나로 구성된 것; 및 환자에게 약학적 제제를 투여하는 것을 포함하여 약학적 제제로 제공한다.
정의(DEFINITIONS)
본 명세서에서 사용된 것과 같이, “알킬”("alkyl")은 직선 또는 완전히 가지로 포화된(branched fully saturated)(이중 또는 삼중 본등이지 않는것) 하이드로카본 군, 예를 들면, 보통의 화학식-CnH2n + 1 을 포함하는 군으로 언급된 것이다. 알킬 군은 1 내지 50 탄소수(carbon atoms)(본 명세서에 나타낸, 수치 범위는여기서 주어진 범위에서 “1 내지 50”로 언급된 각 정수(integer) 이다; 예를 들면., “1 내지 50 탄소수”평균은 알킬 군이 1 탄소수, 2 탄소수, 3 탄소수로 구성되고, 예를 들면 까지 및 50 탄소수를 포함하고, 본 정의는 더 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "알킬"의 발생을 다루고 있다). 알킬군은 또한 1 내지 30 탄소수를 가지고 있는 중간 크기 알킬일 수 있다. 알킬 군은 또한 1 내지 5 탄소수를 가지고 있는 낮은 알킬일 수 있다. 화합물의 알킬군은 "C1-C4 알킬" 로 지정하고 또는 이와 비슷한 것을 지정한다. 단지 예로서, "C1-C4 알킬"은 알킬 쇄(alkyl chain)에서 하나 내지 네 개 탄소수를 나타낸 것이고, 예를 들면., 알킬 쇄는 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸, 및 t-부틸의 구성된 군으로부터 선택된 것이다. 전형적인 알킬 군은 포함한다, 그러나 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 3차 부틸, 펜틸, 헥실 및 이와 같은 것으로 한정되는 방법이지 않는다.
본 명세서에서 사용된, “알켄일”은 직선 또는 가지 탄화수소쇄(branched hydr℃arbon chain) 하나 또는 어느 이중 본드를 포함하는 알킬 군으로부터 언급하였다. 알켄일 군은 비치환된 또는 치환되었다. 치환되었을때, 치환된(substitutent)(s)는 알킬기 치환과 관련하여 상기 개시된 바와 같은 군에서 달리 언급하지 않는 것으로부터 선택된 것이다.
본 명세서에서 사용된, “알킨일”은 직선 또는 가지 탄화수소쇄(branched hydr℃arbon chain) 하나 또는 어느 세 개 본드를 포함한 알킨군으로부터 언급하였다. 알킨일 군은 비치환된(unsubstituted) 또는 치환된(substituted)것이다. 치환되었을때, 치환된(substitutent)(s)는 알킬기 치환과 관련하여 상기 개시된 바와 같은 군에서 달리 언급하지 않는 것으로부터 선택된 것이다.
본 명세서에서 사용된, “할로겐”은 F, Cl, Br 및 I에서 언급하였다.
본 명세서에서 사용된, “메실레이트”는 OSO2CH3에서 언급되었다.
본 명세서에서 사용된, “약학적 제제”단어는 하나 또는 그이상 화학적 구성물과 여기에 설명되어 있는 혼합물에서 언급되었고, 희석제 또는 추가적으로 약학적 전달체와 같다. 약학적 제제는 유기체 구성의 투여를 용이하게 하였다. 약학적 제제 투여의 다중 기법은 당업계에 포함된 것으로 나타내었고, 그러나 주입 및 비경 구 투여에 제한하지 않았다.
본 명세서에서 사용된, “약학적 전달체”단어는 세포 또는 조직으로 화합물의 촉진을 용이하게 하는 화학적 화합물에서 언급되었다. 예를 들면 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide)(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직으로 많은 유기 화학물의 끌어당겨 촉진하는 것과 같은 일반적으로 사용되는 전달체이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "희석제"는 또한 제제를 용해뿐만 아니라 제제의 생물학적으로 활성인 형태를 안정화된 물(예를 들면., (화합물, 레티노이드, 지질 제, 안정 화제 및 / 또는 치료제를 포함 할 수있는 제제)로 희석한 화학 화합물을 지칭한다. 기술 분야에서 희석제로 이용 버퍼 솔루션스애어(solutionsare)에 용해되는 염. 그것은 인간의 혈액의 염 상태를 모방하고 있기 때문 일반적으로 사용되는 완충 용액은 인산염 완충 생리 식염수이다. 완충 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 조절할 수 있기 때문에, 희석된 버퍼는 드물게 제제의 생물학적 활성을 수정 없다. 본 명세서에서 사용되는 "부형제"는 조성물 등에 한정 벌크, 일관성, 안정성, 결합능, 윤활제, 붕 해제 능력없이 제공하는 제제에 첨가되는 불활성 물질을 말한다. "희석제"부형제의 유형이다.
본 발명에서 사용된, “치료적의 물질”은 화합물로부터 언급하고, 치료 효과적인 양에서 포유류로 투여 할 수 있고, 포유류에 치료효과를 제공하였다. 치료적의 물질은 본 발명에서 약물과 같이 언급하였다. 당업계에서 이러한 방법은 용어 "치료적의 물질"이 규제 당국의 승인을 받은 의약품에 한정되지 않는다. “치료적의 물질”은 본 발명에 설명한 바와 같이 영양을 끼친 화합물과 관련된, 레티노이드, 및/또는 두 번째 지질이다. 예를 들면, 두 번째 지질은 본 발명에서 설명한 리포좀 형태 및 치료제의 물질은 리포좀에 영향을 미칠 수 있다, 예를 들면, 본 발명에 설명한 것과 같다.
본 발명에서 사용된, “리포플렉스 제제”는 이러한 제제에서 언급하였고 여기서 리포좀의 외부 표면은 siRNA이다. 바람직하게 리포플렉스 제제는, siRNA는 리포좀의 외부 표면에서 복잡하게 된다. 다른 바람직하게 리포플렉스 제제는 여기서 siRNA는 리포좀의 외부 표면에 나타나는 어느 배지로 허용하는 이러한 것들을 포함한다.
본 발명에서 사용된, “리포좀 제제”는 이러한 제제 여기서 siRNA는 리포좀과 함께 캡슐화 된 것에서 언급하였다. 바람직하게 리포좀 제제, siRNA는 리포좀의 외부 표면에서 나타내는 어느 배지로 허용한다.
본 발명에서 사용된,“공동-가용화된”단어는 비어있는 소포체 형태 전 양이온성 지질 혼합물로 구성물의 추가된 것으로 언급하였다.
본 발명에서 사용된, "장식" 단어는 처리 제제 후 구성물의 추가적인 것으로 언급하였다.
본 발명에서 사용된, "DC-6-14" 는 양이온성 지질에 따른 것으로 언급하였다:
Figure 112018119950312-pat00017
DC-6-14
본 발명에서 사용된, "DODC"는 양이온성 지질 화합물에 따른 것으로 언급하였다:
Figure 112018119950312-pat00018
DODC
본 발명에서 사용된, "HEDODC"는 양이온성 지질 화합물에 따른 것으로 언급하였다:
Figure 112018119950312-pat00019
HEDODC
본 발명에서 사용된, “레티노이드”는 머리-내지-꼬리 매너에서 4개 이소프레노이드 단위의 화합물 구성의 클라스의 멤버이고, see G. P. Moss, "Bi℃hemical Nomenclature and Related D℃uments,"2nd Ed. Portland Press, pp. 247-251 (1992). “비타민 A"는 레티노이드의 생물학적 활성을 질적으로 나타내는 레티노이드에 애한 일반적인 설명이다. 본 발명에서 사용된, 레티노이드는 자연적 및 첫 번째 세대, 두 번째 세대, 및 세 번째 세댈티노이드를 포함하는 합성된 레티노이드에서 언급하였다. 자연적으로 발생하는 레티노이드를 포함하는 예는,(1) 11-cis-레티날(retinal), (2) all-트랜스레티놀(transretinol), (3) 레티닐 팔미테이트(retinyl palmitate), (4) 모든-트랜스레티노익산(all-transretinoic acid), 및 (5) 13-시스-레티노익산(13-cis-retinoic acids) 및 이의 유도체에, 대해 제한적이지 않다 .
본 발명에서 사용된, “레티노이드 결합체”는 적어도 하나 레티노이드 잔기를 포함하는 분자에서 언급하였다.
본 발명에서 사용된, “레티노이드-링커-지질 분자”는 적어도 하나 레티노이드 잔기가 적어도 하나 링커, 예를 들면, PEG 잔기와 같은 것을 통하여 적어도 하나 지질 잔기에 붙어 있는 것을 포함하는 분자에서 언급하였다.
본 발명에서 사용된, “레티노이드 링커-레티노이드 분자”는 적어도 하나 레티노이드 잔기가 적어도 하나 링커를 통하여 적어도 다른 하나 레티노이드 잔기에 붙어있는 것 예를 들면, PEG 잔기와 같은 것을 통하여 포함하는 분자에서 언급하였다(이것은 똑같거나 또는 다르다).
본 발명에서 사용된, “비타민 D"는 구루병(antirachitic) 활성을 가지고 있는 비타민의 군에서 일반적인 설명이다. 비타민 D 군은 포함한다: 비타민 D2 (칼시페롤)(calciferol), 비타민 D3(방사선 22-디하이드로에고느테롤)(irradiated 22-dihydroergosterol), 비타민 D4(방사선 디하이드로에고느테롤)(irradiated dehydrositosterol) 및 비타민 D5(방사선 디하이드로에고느테롤)(irradiated dehydrositosterol).
본 발명에서 사용된 “비타민 E"는 항산화 활성 분자의 군에 대한 일반적인 설명이다. 비타민 E 가족은 α-토코페롤, β-토코페롤, γ-토코페롤 및 δ-토코페롤 포함, α-토코페롤이 일반적이다.(Brigelius-Flohe 및 Traber, The FASEB Journal. 1999;13:1145-1155).
본 발명에서 사용된, “비타민 K"는 항출혈성 인자(antihemorrahgic factor) 및 비타민 K3, 비타민 K4 및 비타민 K5에 대한 일반적인 설명이다. K3-5 합성하는 동안, 비타민 K1 및 K2은 자연적이다.
본 발명에서 사용된, “레티노이드-링커-지질 분자”는 적어도 하나 레티노이드 잔기가 적어도 하나 링커를 통해, 예를 들며, PEG잔기와 같은 적어도 하나 지질 잔기에 붙는 것을 포함하는 분자에서 언급하였다.
본 발명에서 사용된, “레티노이드 링커-레티노이드 분자”는 적어도 하나 레티노이드 잔기가 적어도 하나 링커, 예를 들면, PEG 잔기와 같은 것을 통해 적어도 하나 다른 레티노이드 잔기(이것은 같거나 또는 다를수 있다)가 붙는 것을 포함하는 분자에서 언급하였다.
본 발명에서 사용된,“지질” 및“친유성”단어는 그들 통상의 의미에서 당업자에 의해 이해되는 단어로 본 발명에서 사용하였다. 지질의 비-제한적 예 및 지방 산류(fatty acids), 스테롤(sterols), C2-C50 알킬(alkyl), C2-C50 헤테로알킬, C2-C50 알케닐, C2-C50 헤테로알케닐, C5-C50 알릴, C5-C50 헤테로알릴, C2-C50 알킨일, C2-C50 헤테로알킨일, C2-C50 카보식알켄일, 및 C2-C50 카복시에테로알켄일을 포함한다. 지방산류는 포화된 또는 포화되지 않는 긴-쇄 모노카복실릭산, 예를 들면, 12 내지 24 을 포함하는 탄수소 지질 특성은 일반적으로 물 불용성, 약 0.01%(중량 기본) 보다 적은 물에서 용해하는 것을 가지고 있다. 본 발명에서 사용되된, “지질 잔기”및 “친유성 잔기” 단어는 지질 또는 단백질 그것이 다른 군으로 붙는 것으로부터 언급하였다. 예를 들면, 지질의 작용기(functional group)(카보실릭 산 군과 같은) 및 약 모노머의 작용기 사이에서 화학적 반응에 의해 다른 화합물(예를 들면., 모노머)에 붙는 지질 군이다.
본 발명에서 사용된, “siRNA”는 작은 간섭 RNA에서 언급되었고, 또한 짧은 간섭 RNA와 같은 그 방면 또는 조용한 RNA에서 알려졌다. siRNA는 당업계에서 알려진 다양한 효과를 가진 이중 가닥 RNA 분자의 클라스이고, 모든 주목할 특정 유전자와 단백질 발현으로 간섭되었다.
본 발명에서 사용된,“리포좀에 의한 캡슐화된 치환 또는 전적으로 리포좀 구조로 구성물에서 언급하였다.
본 발명에서 사용된, “수성 배지로 허용”은 수성 배지와 접촉할 수 있는 구성물로 언급하였다.
본 발명에서 사용된, “수성배지로 허용할 수 없는” 수성 배지와 접촉할 수 없는 구성물로 언급하였다.
본 발명에서 사용된, “리포좀의 외부 표면에서 복잡한”은 리포좀의 외부 표면과 관련된 구성물에서 언급하였다.
본 발명에서 사용된, “리포좀의 외부 표면에서 위치를 알아내다”는 구성물이 시작되거나 또는 리포좀의 외부 표면에 가까운 곳으로 언급하였다.
본 발명에서 사용된, “복잡하게 착화된”정전과 관련이 있는것에서 언급하였다.
본 발명에서 사용된, “ 관련된것에 영향을 끼치는” 본 발명에서 설명된 화합물과 전자활성(electronic) 사이의 상호작용, 치료적 물질, 레티노이드, 및/또는 두 번째 지질에서 언급하였다. 이와 같은 상호작용은 화학적 본드, 코발렌트 본드(covalent bond), 폴라 코발렌트 본드(polar covalent bond), 이온화 본드(ionic bond), 전자활성 관련(electrostatic ass℃iation), 코디네이트 코발렌트 본드(coordinate covalent bond), 아로마틱 본드(aromatic bond), 수소 본드(hydrogen bond), 다이폴(dipole), 또는 벤 더 웰 상호관계를 포함하고, 그러나 한정적이지 않다. 당업자는 이러한 상호 작용의 상대적 강도가 광범위하게 변할 수 있다는 것을 이해한다.
본 발명에서 사용된 용어“리포좀”은 당업자에 의해 이해되는 통상의 의미, 및 대체로 수성 미디어(aqueous media)에서 근접한 구조인 지질이 극(polar), 친수성(hydrophilic) 군에 붙는 것을 포함하는 지질 이중층(lipid bilayer) 구조에서 언급하였다. 일부 실시예에서, 치료제의 물질 및 레티노이드 또는 레티노이드 결합체와 같은, 리포좀은 하나 또는 그이상의 화합물과 관련있는것일 수 있다. 리포좀은 단일 지질 이중층(예를 들면., 단일층(unilamellar))의 구성일 수 있고 또는 이것은 두 개 또는 그이상의 중심이 같은 지질 이중층(concentric lipid bilayers)(예를 들면., 다중층(multilamellar))일 수 있다. 추가적으로, 리포좀은 대략 구형(spherical) 또는 타원형 모양일 수 있다.
“표적 세포로 용이하게 약물 전달”은 레티노이드 원래의 능력 향상 또는 지용성(fat soluble) 비타민 화합물이 siRNA이 세포와 같이 치료적 분자의 전달을 향상시키는 것에서 언급하였다. 이론에 의해 한정하고자하는 것은 아니지만, 표적세포에서 측정할 수 있는 특이성과 함께 레티노이드 또는 지용성 비타민 화합물이 특정 수용체 또는 [활성/결합 부위]와 상호작용할 수 있다. 예를 들면, 결합은 일반적으로 １０６Ｍ－ １의 결합친화력일 때 고려하였고, 바람직하게 １０７Ｍ－１ 또는 더 크게, 더 바람직하게 １０８Ｍ－１ 또는 더 크게, 및 가장 바람직하게 １０９Ｍ－１ 또는 더 크게이다. 항체의 결합 친화력은 예를 들면, Scatchard 분석에 의해 용이하게 당업자에 의해 결정되었다(Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660, 1949).
핵산(Nucleic acid) 전달 시스템은, 예를 들면, 수성 및 비수성 젤, 크림, 다중 에멀젼( multiple emulsions), 마이크로에멀젼(microemulsions), 리포좀, 연고(ointments), 수성 및 비수성 용액, 로션, 에어로졸, 탄화수소 기지(hydr℃arbon bases)을 포함할 수 있고 및 파우더 및 가용화제(solubilizers), 투과 촉진제(permeation enhancers)(예를 들면., 지방산, 지방산 에스터, 지방 알콜(fatty alcohols) 및 아미노 산), 및 친수성 폴리머(예를 들면., 폴리카보필(polycarbophil 및 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrolidone)을 포함할 수 있다.
추가적으로 화학식 I의 양이온성 지질, 다른 지질을 사용할 수 있다. 이것은 이온화 양이온성 지질을, 포함
Figure 112018119950312-pat00020
S104
제제 전달체는 이온화 양이온성 지질과 결합된 것에서 화학식 I의 양이온성 지질의 구성이다. 이온화 양이온성 지질은 예를 들면., S104,을 포함한다. 이온화 지질은 0 내지 45 mol %의 농도에서 나타내고, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45 mol %으로부터 선택된 농도를 포함한다.
폴리에틸렌(polyethylene) 글리콜 분자(PEG)에 결합된 지질은, 리포좀 입자에서 나타낸다. PEG-지질 포함
* 1,2-디미리스토레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-PEG (1,2-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-PEG)(PEG-DMPE)
1,2-디파미토일-sn-글리세로-포스포에탄올아민-N-PEG(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-PEG)(PEG-DPPE),
1,2-디스테로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민-N-PEG(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-PEG)(PEG-DSPE), 또는
1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-PEG (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-PEG)(PEG-DOPE) 및/또는
PEG-세라미드(PEG-ceramide).
제제 전달체는 PEG-지질 결합에서 화학식 I의 양이온성 지질의 구성될 수 있다. PEG-지질은 0 내지 15 mol %, 바람직하게 1 내지 10 mol %, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10 mole %으로부터 선택되는 농도를 포함하는 것에서 나타낼 수 있다.
비-양이온성 지질의 제한되지 않는 예는 레시틴(lecithin), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 리솔레시틴(lysolecithin), 리소포스파티딜에탄올아민(lysophosphatidylethanolamine), 포스파티딜세링(phosphatidylserine), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 스핑고미엘링(sphingomyelin), 에그 스핑고마이엘링(egg sphingomyelin)(ESM), 체팔링(cephalin), 카디오리핀(cardiolipin), 포스파티드산(phosphatidic acid), 세레브로사이드(cerebrosides), 디세틸포스페이트(dicetylphosphate), 디스테로일포스패티딜코라인(distearoylphosphatidylcholine)(DSPC), 디올레오일포스페티딜코라인(dioleoylphosphatidylcholine)(DOPC), 디파미토일포느패티딜코라인(dipalmitoylphosphatidylcholine)(DPPC), 디오레오일포스페티딜그리세롤(dioleoylphosphatidylglycerol)(DOPG), 디파미토일포스페티딜글리세롤(dipalmitoylphosphatidylglycerol)(DPPG), 디오레오일포스페티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine)(DOPE), 파미토일오레오일-포스페티딜코라인(palmitoyloleoyl-phosphatidylcholine)(POPC), 파미토일오레오일-포스페티딜글리세롤(palmitoyloleoyl-phosphatidylethanolamine)(POPE), 파미토일오레오일-포스페티딜글리세롤(palmitoyloleyol-phosphatidylglycerol)(POPG), 디오레오일포스페티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine) 4-(N-마레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카보실레이트(4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate) (DOPE-mal), 디파미토일-포스페티딜에탄올아민(dipalmitoyl-phosphatidylethanolamine) (DPPE), 디미리스토일-포스페티딜에탄올아민(dimyristoyl-phosphatidylethanolamine) (DMPE), 디스테로일-포스페티딜에탄올아민(distearoyl-phosphatidylethanolamine)(DSPE), 모노메틸-포스페티딜에탄올아민(monomethyl-phosphatidylethanolamine), 디메틸-포스페티딜에탄올아민(dimethyl-phosphatidylethanolamine), 디엘라이도일-포스페티딜에탄올아민(dielaidoyl-phosphatidylethanolamine)(DEPE),스테로일오레일-포스페티딜에탄올아민(stearoyloleoyl-phosphatidylethanolamine)(SOPE), 라이소포스페티딜코라인(lysophosphatidylcholine), 딜리노레오일포스페티딜코라인( dilinoleoylphosphatidylcholine)과 같은 인지질(phospholipids) 및 이들의 혼합물을 포함한다. 다른 디아실포스페티딜코라인(diacylphosphatidylcholine) 및 디아실포스페티딜에낱올아민(diacylphosphatidylethanolamine) 인지질 또한 사용할 수 있다. 이러한 지질에서 아실 군은 바람직하게 C10-C24 탄소 쇄(carbon chains), 예를 들면., 라우로일(lauroyl), 미리스토일( myristoyl), 파미토일(palmitoyl), 스테로일 (stearoyl), 또는 오레오일(oleoyl)을 가지고 있는 지방산으로부터 유래 되었다.
특정 예시에서, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 및 55%로부터 선택되는 농도에서 더 특히, 약 0 mol % 내지 약 55 mol %에서 구성된 입자에서 인지질 현재의 양이다. 비-제한적인것과 같은 예를 들면, 인지질은 DOPE이다.
비-양이온성 지질의 추가적인 예는 콜레스테롤 및 이들로부터 유래되는 콜레스테놀, 콜레스탠원(cholestanone), 콜레스텐원(cholestenone), 코프로스탠올(coprostanol), 콜레스텔일-2'-하이드록시에틸에털, 콜레스텔일-4'-하이드옥시부틸 에터, 및 이들의 혼합물을 포함한다.
특정 예시에서, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 및 55%로부터 선택되는 농도에서 더 특히, 약 0 mol % 내지 약 55 mol %에서 구성된 입자에서 콜레스테롤 현재의 양이다. 비-제한적인 것과 같은 예를 들면, 콜레스테롤 지질 입자에 존재한다.
또 다른 특정 예시에서, 약 30 mol % 내지 약 40 mol %, 약 30 mol % 내지 약 35 mol %에서. 또는 약 35 mol % 내지 약 40 mol %, 약 30 mol % 내지 약 35 mol %에서 인지질 및 콜레스테롤 구성의 혼합물을 포함하는 지질 입자에서 콜레스테롤은 존재하고, 또는 입자에서 총 지질의 약 35 mol % 내지 약 40 mol %가 존재한다. 비-제한전 예시는, 입자에서 약 총 지질의 34 mol % 이 존재하는 콜레스테롤을 구성하는 인지질 및 콜레스테롤의 혼합물을 구성하는 지질 입자이다.
추가 실시예에서, 약 10 mol % 내지 약 30 mol %, 약 15 mol % 내지 약 25 mol %에서, 또는 입자에서 총 지질의 약 17 mol % 내지 약 23 mol %가 존재하는 것으로부터 인지질 및 콜레스테롤 구성의 혼합물을 포함하는 지질 입자에서 콜레스테롤이 존재한다. 비-제한적 예를 들면, 입자에서 총 지질의 약 20 mol % 이 존재하는 콜레스테롤 구성은 인지질 및 콜레스테롤의 혼합물은 지질 입자 구성이 될 수 있다.
핵산의 전달을 위해 유용한 레티노이드(retinoid) 또는 레티노이드 접합체는 이것이 용해되고 또는 용해하거나 또는 이것을 보유하는 배지와 함께 혼합된 상태에 있다.
어느 레티노이드 또는 레티노이드 접합체는 이것이 성상세포에 의해 활발하게 축적되는 한 본 설명에서 사용될 수도 있고; 레티노이드의 예는 트레티노인(tretinoin), 아다팔렌(adapalene), 레티놀 팔미테이트(retinol palmitate), 및 특히 비타민 A(vitamin A), 포화 비타민 A(saturated vitamin A), 레티노산(retinoic acid), 및 레티날(retinal)을 포함하나, 한정되지 않는다. 레티노이드-접합체의 예는 PEG-레티노이드 접합체를 포함한다. 본 설명은 양성적으로 레티노이드 및/또는 레티노이드 접합체를 포함하기 위하여 성상세포의 성질을 이용하고, 및 약물 담체로서 레티노이드 및/또는 레티노이드 접합체를 사용함에 의해 또는 또 다른 약물 담체 구성성분에 결합하거나 또는 포함됨에 의해, 원하는 재료 또는 몸체가 성상세포에 특이적으로 수송된다. 레티노이드는 4 개 이소프레노이드 유닛(isoprenoid unit)이 머리-꼬리(head-to-tail) 방식으로 결합된 골격을 가지는 화합물의 클래스(class)의 구성물이다. G. P. Moss, “Bi℃hemical Nomenclature and Related D℃uments,"2nd Ed. Portland Press, pp. 247-251 (1992) 참조. 비타민 A는 레티놀의 생물학적 활성을 질적으로 보여주는 레티노이드에 대한 제네릭 기술어(generic descriptor)이다. 본 설명에서 레티노이드는 암세포 및 CAF에 특이적 물질 전달을 촉진한다(즉, 물질은 이들 세포에 표적이 된다). 이런 레티노이드는 특히 제한되지 않고, 및 이들의 예는 레티놀, 비타민 A, 포화 비타민 A, 레티날, 레티노산, 레티놀의 에스테르 및 지방산, 지방족 알콜올(aliphatic alcohol)의 에스테르 및 레티노산, 에트레티네이(etretinate), 트레티노인, 이소트레티노인(isotretinoin), 아다팔렌, 아시트레틴(acitretine), 타자로틴(tazarotene), 및 레티놀 팔미테이트, 및 펜네티나이드(fenretinide), 및 벡사로텐(bexarotene)과 같은 비타민 A 아날로그를 포함한다. 레티노이드 접합체는 PEG-접합체, 예를 들어, 다음 구조에서 나타낸, diVA-PEG-diVA 및 VA-PEG-VA를 포함한다.
본 설명의 약물 담체는 그러므로 레티노이드 및/또는 레티노이드-접합체보다 다른 약물 담체 구성성분을 포 함할 수도 있다. 이런 구성성분은 특히 제한되지 않고, 및 의학 및 약학 분야에서 알려진 어느 구성성분이 사용될 수도 있으나, 이것이 레티노이드 및/또는 레티노이드 접합체를 포함할 수 있는 것이 바람직하다.
뿐만 아니라, 본 설명의 약물 담체는 성상세포, 예를 들어, 레티놀-결합 단백 질(retinol-binding protein, RBP)에 포함을 개선하는 물질을 포함할 수도 있다.
본 설명의 약물 담체 와 레티노이드 및/또는 레티노이드 접합체의 결합 또는 포함은 화학적 및/또는 생리적 방법에 의해 약물 담 체의 또 다른 구성성분과 함께 레티노이드 및/또는 레티노이드 접합체를 결합하거나 또는 포함함에 의해 또 한 전달될 수도 있다. 또는 본 설명의 약물 담체와 함께 레티노이드 및/또는 레니토이드 접합체의 결합 또 는 포함은 약물 담체의 제조 동안 약물 담체 구성성분으로, 형성-친화도(formation-affinity)를 가지는 레티 노이드 및/또는 레티노이드 접합체 및 약물 담체의 기본 구성성분을 혼합함으로써 또한 전달될 수도 있다.
레티노이드 및 / 또는 레티노이드 복합체에 결합하거나, 본 설명의 약물 전달체에 포함의 양은 약물 담체 성분에 대하여 중량 비율로 0.1 mol % 내지 20 mol% 일 수 있고, 바람직하게, 0.2 내지 10%, 및 더 바람직하게 0.5 내지 5 mol%일 수 있고, 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0. 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 및 5.0 mol% 값에서 선택되는 농도를 포함한다.
특정 실시예에서, 본 발명은 챔버 내에서 혼합을 통해 제조 될 수있는 리포좀을 제공한다. 이 핵산을 포함하는 수용액을 제공하는 공정을 포함한다. 제 1 저장(first reservoir)에 RNA 간섭, 제 2 저장(second reservoir)에 유기 지질 용액 제공, 및 유기 용매 농도의 변화(gradient)에서 리보좀이 핵산(예를 들면., siRNA)을 캡슐화할 수 있도록 유기 지질 용액과 수성 용액을 혼합한것과 같이 유기 지질 용매와 수성 용매를 혼합한다.
혼합 방법을 사용하여 형성된 리포솜은 일반적으로 약 40 nm 내지 약 250 nm 크기를 갖고, 약 50 nm 내지 약 150 nm 크기, 약 60 nm 내지 150 nm크기를 갖는다. 이렇게 형성된 입자는 응집되지 않고 임의로 균일 한 입자 크기를 달성하기 위해 크기가 정해져 있다.
본 설명의 약물 담체는 원하는 재료 또는 몸체가 성상세포를 표적으로 하여 수송될 수 있는 한 어느 형태에 있을 수도 있고, 및 형태의 예는 폴리머 미셀, 리포좀, 에멀젼, 마이크로스피어(microsphere), 및 나노스피어(nanosphere)를 포함하나, 한정되지 않는다. 뿐만 아니라, 본 설명의 약물 담체는 이들에 포함된 레티노이드 및/또는 레티노이드가 적어도 부분적으로 이것이 마지막에 성상세포에 도달하기 전에 제제의 외부에 노출되는 한 담체 수송되고, 수송되는 물질의 외부에 부착되거나, 또는 수송되는 물질과 혼합되는 물질의 내부에서 포함될 수도 있다.
본 설명의 약물 담체는 특이적으로 성상세포를 표적으로 하고 및 예를 들어, 섬유증의 억제 또는 예방과 같은 원하는 효과가, 예를 들어, 성상세포의 활성 또는 성장을 조절하기 위한 약물과 같은 원하는 재료 또는 몸체를 성상세포에 효율적으로 운송함에 의해 최대 효과 및 최소 부작용을 나타낼 수 있게 할 수 있다. 본 약물 담체 전달에 있어서 재료 또는 몸체는 특히 한정되지 않으나, 이것은 바람직하게 살아있는 신체에서 투여된 부위에서 성상세포가 존재하는 곳인, 간, 이자 등으로 생리적 이동을 할 수 있는 크기를 갖는다. 본 설명의 약물 담체는 그러므로 원자, 분자, 화합물, 단백질 또는 핵산과 같은 재료뿐만 아니라 벡터, 바이러스 입자, 세포, 하나 또는 그 이상의 요소 또는 마이크로머신으로 구성된 약물 분비 시스템과 같은 몸체를 수송할 수 있다. 재료 또는 몸체는 바람직하게 성상세포에서 일부 효과를 가하는 것의 성질을 갖으며, 이들의 예는 성상세포를 표지하는 것 및 성상세포의 활성 또는 성장을 조절하는 것을 포함한다.
그러므로, 본 설명의 하나의 실시양태에서, 이것은 약물 담체를 전달하는 성상세포의 활성 또는 성장을 조절하기 위한 약물이다. 이것은 섬유증의 촉진에 포함되는 성상세포의 생리화학적 활동을 직접적으로 또는 간접적으로 억제하는 어느 약물일 수도 있고, 및 이의 예는, 한정되지 않으나, 절단형 TGFβ 타입 II 수용체(truncated TGFβ type II receptor) 및 수용성 TGFβ 타입 II 수용체와 같은 TGFβ 활성 억제제, HGF 및 이를 위한 발현 벡터와 같은 성장 인자 제제, MMP 유전자-포함 아데노바이러스 벡터와 같은 MMP 생산 프로모터(promoters), 안티센스 TIMP 핵산과 같은 TIMP 생성 억제제, PPARγ 리간드(ligand), 세포 활성 억제제 및/또는 안지오텐신(angiotensin) 활성 억제제와 같은 세포 성장 억제제, PDGF 활성 억제제, 및 나트륨 채널 억제제, 및 또한 화합물 861 및 글리오톡신(gliotoxin)과 같은 세포사 유도제(inducers), 아디포넥틴(adiponectin), 및 (+)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-1-(4-피리딜카보모일)사이클로헥산((+)-trans-4-(1-aminoethyl)-1-(4-pyridylcarbamoyl)cyclohexane)과 같은 Rho 키나아제(kinase) 억제 활성을 가지는 화합물을 포함한다. 뿐만 아니라, 본 설명에서 `성상세포의 활성 또는 성장을 조절하기 위한 약물`은 섬유증의 억제에 직접적으로 또는 간접적으로 포함된 성상세포의 생리화학적 활동을 직접적으로 또는 간접적으로 촉진하는 어느 약물일 수도 있고, 및 이의 예는, 한정되지 않으나, 콜라겐 분해 시스템, 예를 들어, MMP 발현 벡터와 같은 MMP 생성 프로모터, HGF, 및 HGF 아날로그 및 이를 위한 발현 벡터와 같은 HGF-유사 활성을 가지는 약물을 촉진하기 위한 약물을 포함한다.
본 설명에서 성상세포의 활성 또는 성장을 조절하기 위한 약물의 다른 실시예는 콜라겐과 같은 세포외기질의 대사를 조절하기 위한 약물, 예를 들어, siRNA, 리보자임(ribozyme), 및 안티센스 핵산(RNA, DNA, PNA, 및 이들의 합성물 포함)과 같은, 표적 분자의 발현을 억제하는 효과를 가지는 물질, 우성 음성 효과(dominant negative effect)를 가지는 물질, 및 예를 들어, 성상세포에 의해 생산된 세포외기질 구성 분자를 표적으로 하고 또는 세포외기질 구성 분자를 생산하거나 또는 분비하는 기능을 가지는 하나 또는 그 이상의 분자를 표적으로 하는, 동일하게 발현하는 벡터를 포함한다.
본 설명은 또한 성상세포-관련된 장애를 치료하기 위한 의약품, 약물 담체 및 성상세포의 활성 또는 성장을 조절하기 위한 약물을 포함하는 의약품과 관련이 있고, 및 성상세포-관련된 장애를 치료하기 위한 약학적 조성물의 생산에 있어서 약물 담체의 용도와 관련이 있다. 성상세포-관련된 질환은 여기서 성상세포가 질환의 과정, 즉, 질환의, 개시, 악화, 개선, 차도(remission), 치료 등에 직접적으로 또는 간접적으로 포함되는 질환을 의미하고, 및 이의 예는 간염, 특히 만성 간염, 간섬유증, 간경화, 및 간암과 같은 간질환, 및 췌장염, 특히 만성 췌장염, 췌장섬유증, 및 줴장암과 같은 췌장 질환을 포함한다.
본 설명의 의약품에 있어서, 약물 담체는 이것의 내부에 약물을 포함하고, 약물-포함 물질의 외부에 부착될 수 있고, 또는 약물 담체에 포함된 레티노이드 및/또는 레티노이드 접합체가 이것이 마지막에 성상세포에 도달하기 전에 제제의 외부에 적어도 부분적으로 노출되는 한 약물과 함께 혼합될 수도 있다. 그러므로, 투여의 루트 또는 약물이 분비되는 방식에 의존하여, 의약품이 적절한 재료, 예를 들어, 장용성 코팅(enteric coating) 또는 오랜 시간 후 산산조각나는 재료와 같은, 적절한 재료로 둘러싸여 질 수도 있고, 또는 적절한 약물 분해 시스템에 포함될 수도 있다.
본 설명은 그러므로 약물 담체 또는 하나 또는 그 이상의 약물 담체 구성, 레티노이드 및/또는 레티노이드 접합체, 및/또는 약물을 포함하는 하나 또는 그 이상의 용기(containers)를 포함하는 의약품 제조 키트를 포함하고, 및 또한 약물 담체 또는 이런 키트의 형태에서 제공되는 의약품을 위해 필수적인 구성성분을 포함한다. 본 설명의 키트는, 위에 설명된 것들뿐만 아니라, 약물 담체를 위한 제조 방법 또는 투여 방법 및 본 설명의 의약품이 설명되는, 설명 등을 포함할 수도 있다. 뿐만 아니라, 본 설명의 키트는 약물 담체 또는 본 명세서의 의약품을 완성하기 위한 모든 구성성분을 포함할 수도 있으나 모든 구성성분이 필수불가결하게 필요한지는 않다. 본 명세서의 키트는 그러므로 시약 또는 예를 들어, 멸균수, 셀라인, 또는 글루코스 용액과 같은, 의학적 치료, 실험장치(experimental facility) 등의 장소에서 정상적으로 사용할 수 있는 용매(solvent)를 포함할 필요가 없다.
본 명세서는 더욱 성상세포-관련된 질환의 치료를 위한 방법, 유효한 양의 의약품을 이것이 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는 방법과 관련이 있다. 여기서 언급된 유효한 양은 표적 장애의 시작을 억제하고, 이의 증상을 완화하고 또는 이의 진행을 막는 양이고, 및 바람직하게 표적 질환의 시작을 막거나 또는 표적 질환을 치료하는 양이다. 이것은 또한 바람직하게 투여로부터의 이점을 초과하는 역효과를 야기하지 않는 양이다. 이런 양은 배양된 세포 등을 이용한 생체 외(in vitro) 시험, 또는 마우스, 랫드, 개, 또는 돼지와 같은 모델 동물에서의 시험에 의해 적절하게 결정될 수 있고, 및 이런 시험 방법은 당 업계에 숙련된 사람에게 잘 알려져 있다.
본 명세서의 방법에 있어서, 용어 `개체(subject)`는 어느 살아있는 개인, 바람직하게 동물, 더 바람직하게 포유류, 및 그러나 더 바람직하게 인간 개인을 의미한다. 본 명세서에 있어서, 개체는 건강하거나 또는 일부 질환에 영향을 받을 수도 있고, 및 의도된 질환의 치료의 경우에 있어서, 개체는 전형적으로 질환에 영향을 받고 또는 영향을 받을 위험을 가진 개체를 의미한다.
뿐만 아니라, 용어 `치료`는 장애의 치료, 일시적 차도, 예방 등의 목적을 위한 모든 타입의 의학적으로 수용 가능한 예방용(prophylactic) 및/또는 치료용 간섭을 포함한다. 예를 들어, 장애가 간섬유증일 때, 용어 `치료`는 섬유증의 진행을 연장하거나 정지하는 것, 병변의 퇴행 및 소멸, 섬유증의 개시의 예방, 또는 재발의 예방을 포함하는 다양한 목적을 위하여 의학적으로 수용 가능한 간섭을 포함한다.
본 명세서는 또한 약물 담체를 사용하여 성상세포에 약물을 전달하기 위한 방법과 관련이 있다. 이 방법은, 제한되지 않으나, 약물 담체에 전달되는 물질을 지지하는 단계, 및 성상세포-포함하는 살아있는 몸 또는, 예를 들어, 배양 배지와 같은 배지에 전달되는 물질을 운반하는 약물 담체를 투여하거나 또는 첨가하는 단계를 포함한다. 이들 단계는 어는 알려진 방법, 본 기술서 등에서 설명된 방법에 따라 적절하게 달성될 수도 있다. 이 전달 방법은 또 다른 전달 방법, 예를 들어, 성상세포가 존재하는 곳인 기관이 표적인 것 등의 또 다른 전달 방법과 결합될 수도 있다.
핵산 분자는 섬유증(예를 들어, 간, 신장, 복막, 및 폐) 질환, 특성, 상태 및/또는 장애, 및/또는 관련된 어느 다른 특징, 질환, 장애 또는 상태를 예방 또는 치료하기 위한 용도로 맞춰질 수도 있고 또는 세포 또는 조직에서, 단독 또는 다른 치료방법과 조합으로 hsp47의 수준에 반응할 것이다. 핵산 분자는 리포좀, 개체에 투여를 위하여, 담체 및 희석액 및 이들의 염을 포함한, 전달 소포체를 포함할 수도 있고, 및/또는 약학적으로 허용 가능한 제형에 존재할 수 있다.
명세서의 핵산 분자는 표 3에 나타낸 서열을 포함할 수도 있다. 이런 핵산 분자의 예는 표 3에 제공된 서열을 필수적으로 구성한다.
핵산 분자는 에어로졸 또는 관련된 폐 조직으로 핵산 분자의 빠른 국소 흡수를 제공하는, 흡입 장치 또는 분무기(nebulizer)에 의해 투여되는 제형이 건조된 스프레이의 흡입에 의한 것과 같은, 폐 전달을 통해 투여될 수도 있다. 미분화된(micronized) 핵산 조성물의 호흡할 수 있는 건조 입자를 포함하는 고체 미립자 조성물은 건조된 또는 감압동결건조된 핵산 조성물을 갈고, 및 그 다음 미분화된 조성물을, 예를 들어, 큰 덩어리는 쪼개거나 또는 분리하기 위한 400 메쉬(mesh) 스크링을 통과함에 의해 제조될 수 있다. 명세서의 핵산 조성물을 포함하는 고체 미립자 조성물은 추가적으로 다른 치료용 화합물뿐만 아니라 에어로졸의 형성을 가능하게 하기 위해 제공되는 분산제(dispersant)를 포함할 수 있다. 적절한 분산제는 락토오스(lactose)이고, 이는 1:1 중량비와 같은, 어느 적절한 비율로 핵산 화합물과 섞일 수 있다.
액체 입자의 에어로졸은 여기에서 밝혀진 핵산 분자를 포함할 수도 있고 분무기(예를 들어 보면, U.S. Pat. No. 4,501,729)와 같은, 어느 적절한 수단에 의해 생산될 수 있다. 분무기는 용액 또는 좁은 벤츄리 오리피스(venturi orifice)를 통해, 압축된 가스, 전형적으로 공기 또는 산소의 가속을 수단으로 또는 초음파 교반(ultrasonic agitation)을 수단으로 치료용 에어로졸 미스트(mist)에 있는 활성 성분의 서스펜션(suspension)으로 변형시키는 상업적으로 사용 가능한 장치이다. 분무기에 사용하는 적절한 제형은 40% w/w 이상 바람직하게 20% w/w 제형보다 적은 양으로 액체 담체에 활성 성분을 포함한다. 담체는 전형적으로 물 또는 희석된 수용성 알코올 용액이고, 바람직하게 예를 들어, 염화나트륨 또는 다른 적절한 염의 첨가에 의해 체액(body fluids)과 함께 식염수(isotonic)로 만들어진다. 추가적인 첨가제는 만약 제형이 멸균 제조되지 않으면 보존제(preservatives), 예를 들어, 메틸 하이드로벤조에이트(methyl hydroxybenzoate), 항산화제, 향미제, 휘발성 오일, 완충제 및 유화제(emulsifier) 및 다른 제형 계면활성제를 포함한다. 활성 조성물 및 계면활성제를 포함하는 고체 입자의 에어로졸은 또한 어느 고체 미립자 에어로졸 발생기를 가지고 생산될 수 있다. 개체에 치료용 고체 미립자를 투여하기 위한 에어로졸 발생기는, 위에 설명된 것과 같이, 호흡할 수 있는 입자를 생산하고, 및 인간 투여에 적절한 비율로 사전 결정된 계량된 투여량의 치료용 조성물을 포함하는 부피의 에어로졸을 발생한다. 하나의 실례가 되는 고체 미립자 에어로졸 발생기는 취입기(insufflator)이다. 취입기에 의한 투여를 위한 적절한 제형은 취입기를 수단으로 전달될 수 있는 잘게 세분한 파우더를 포함한다. 취입기에 있어서, 파우더, 예를 들어, 여기서 설명된 치료를 수행하는데 효과적인 이들의 계량된 투여량은 캡슐 또는 전형적으로 젤라틴(gelatin) 또는 체내(in situ)구멍이 나게 되거나 또는 열리게 되는 플라스틱으로 만들어진, 카트리지(catridges)에 포함되고 및 파우더는 흡입하자마자 장치를 통해 끌어 당겨진 공기에 의해 또는 수동으로 작동되는 펌프의 수단에 의해 전달된다. 취입기에서 쓰여진 파우더는 활성 성분 단독으로 또는 활성 성분, 락토오스와 같은, 적절한 파우더 희석제, 및 추가적인 계면활성제를 포함하는 파우더 블랜드(blend)로 구성된다. 활성 성분은 전형적으로 0.1 내지 100 w/w의 제형을 포함한다. 두 번째 타입의 실례가 되는 에어로졸 발생기는 정량흡입기(metered dose inhaler)를 포함한다. 정량흡입기는 전형적으로 서스펜션 또는 액화된 분산제(liquefied propellant)에 있는 활성 성분의 에어로졸의 용액 제형을 포함하는, 압축된 에어로졸 디스펜터(dispensers)이다. 사용하는 동안 이들 장치는 활성 성분을 포함한 미세한 입자 스프레이를 생산하기 위해 계량된 부피를 전달하기에 적절한 벨브를 통해 제형을 충전한다. 적절한 분산제는 특정 클로로플루오로카본(chlorofluor℃arbon) 화합물, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄(dichlorodifluoromethane), 트리클로로플루오로메탄(trichlorofluoromethane), 디클로로테트라플루오로에탄(dichlorotetrafluoroethane), 및 이들의 혼합물을 포함한다. 제형은 추가적으로 하나 또는 그 이상의 공용매(co-solvents), 예를 들어, 에탄올, 유화제 및 올레산(oleic acid) 또는 소르비탄 트리올리에이트(sorbitan trioleate), 항산화제 및 적절한 향미제와 같은, 다른 제형 계면활성제를 포함할 수 있다. 폐 전달을 위한 다른 방법은, 예를 들어, US20040037780, US6592904, US6582728, 및 US6565885에서 설명된다. WO08132723는 호흡기관에서, 일반적으로 올리고뉴클레오티드의, 및 특히 siRNA의 에어로졸 전달과 관련이 있다.
핵산 분자는 중추신경계(central nervous system, CNS) 또는 말초신경계(peripheral nervous system, PNS)에 투여될 수도 있다. 실험은 신경세포에 의한 핵산의 효과적인 생체 내 흡수를 증명한다. 예를 들어 참조, Sommer et al., 1998, Antisense Nuc. Acid Drug Dev., 8:75; Epa et al., 2000, Antisense Nuc. Acid Drug Dev., 10:469; Broaddus et al., 1998, J. Neurosurg., 88:734; Karle et al., 1997, Eur. J. Pharm℃ol., 340:153; Bannai et al., 1998, Brain Research, 784:304; Rajakumar et al., 1997, Synapse, 26:199; Wu-pong et al., 1999, BioPharm, 12:32; Bannai et al., 1998, Brain Res. Prot℃., 3:83; 및 Simantov et al., 1996, Neuroscience, 74:39. 핵산 분자는 그러므로 CNS 및/또는 PNS에서 세포에 전달하고 및 세포에 의해 흡수되는 것을 받아들인다.
CNS로 핵산 분자의 전달은 다양한 다른 전략에 의해 제공된다. 사용될 수 있는 CNS 전달을 위한 전통적인 목표는, 제한적이지 않으나, 척추초내(intrathecal) 및 뇌실내(intracerebroventricular) 투여, 카테터(catheter) 및 펌프의 이식, 직접 주입 또는 손상 또는 병변 부위에 관류, 뇌동맥계(brain arterial system)로, 또는 혈뇌장벽(blood-brain barrier)의 화학적 또는 삼투압적 열림에 의한 주입을 포함한다. 다른 목표는, 예를 들어 접합체 및 생분해성의 폴리머의 사용을 통한, 다양한 수송 및 담체 시스템의 이용을 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 예를 들어, Kaplitt et al., U.S. Pat. No. 6,180,613 및 Davidson, WO 04/013280에 설명된, 유전자 치료 접근법은 CNS에서 핵산 분자를 발현하기 위하여 사용될 수 있다.
핵산 분자는 제형화 되거나 또는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine)(예를 들어, 선형 또는 가지형 PEI) 및/또는 갈락토오스 PEI(galactose PEI), 콜레스테롤 PEI(cholesterol PEI), 항체 유도된 PEI, 및 이들의 폴리에틸렌 글리콜 PEI(PEG-PEI) 유도체와 같은 예를 들어 접합된 PEI를 포함한, 폴리에틸렌이민 유도체와 복합될 수도 있다(예를 들어 보면 Ogris et al., 2001, AAPA PharmSci, 3, 1-11; Furgeson et al., 2003, Bi℃onjugate Chem., 14, 840-847; Kunath et al., 2002, Pharm Res 19:810-17; Choi et al., 2001, Bull. Korean Chem. S℃., 22:46-52; Bettinger et al., 1999, Bi℃onjugate Chem., 10:558-561; Peterson et al., 2002, Bi℃onjugate Chem. 13:845-54; Erbacher et al., 1999, J Gene Med 1:1-18; Godbey et al., 1999., PNAS, 96:5177-81; Godbey et al., 1999, J Controlled Release, 60:149-60; Diebold et al., 1999, J Biol Chem, 274:19087-94; Thomas et al., 2002, PNAS, 99, 14640-45; 및 Sagara, U.S. Pat. No. 6,586,524).
핵산 분자는 생체접합체(bi℃onjugate), 예를 들어 Vargeese et al., U.S. Ser. No. 10/427,160; U.S. Pat. No. 6,528,631; U.S. Pat. No. 6,335,434; U.S. Pat. No. 6,235,886; U.S. Pat. No. 6,153,737; U.S. Pat. No. 5,214,136; U.S. Pat. No. 5,138,045에서 설명된 것과 같은 핵산 접합체를 포함할 수도 있다.
여기서 밝혀진 조성물, 방법 및 키트는 핵산 분자의 발현을 허락하는 방식으로 명세서의 적어도 하나의 핵산 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함할 수도 있다. 핵산 분자 또는 세포의 환경으로 dsRNA의 가닥을 발현할 수 있는 하나 또는 그 이상의 벡터를 도입하는 것의 방법은 세포의 타입 및 환경의 구성에 의존할 것이다. 핵산 분자 또는 벡터 컨트스럭트(construct)는 직접적으로 세포에 도입될 수도 있고(즉, 세포 내의); 또는 세포 외적으로 구멍, 틈새 공간(interstitial space)으로, 기관의 순환으로 도입되고, 입을 통해 도입되거나, 또는 유기체 또는 dsRNA를 포함하는 용액에 있는 세포를 담굼(bathing)으로써 도입될 수도 있다. 세포는 바람직하게 포유류 세포; 더욱 바람직하게 인간 세포이다. 발현 벡터의 핵산 분자는 센스 영역 및 안티센스 영역을 포함할 수 있다. 안티센스 영역은 hsp47를 암호화하는 RNA 또는 DNA 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있고 센스 영역은 안티센스 영역에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 핵산 분자는 센스 및 안티센스 영역에 상보성을 갖는 두 개의 별개의 가닥을 포함할 수 있다. 핵산 분자는 센스 및 안티센스 영역에 상보성을 갖는 단일 가닥을 포함할 수 있다.
표적 RNA 분자와 상호작용하고 표적 RNA 분자(예를 들어, 여기서 Genbank Accession numbers에 의해 언급된 표적 RNA 분자)를 암호화하는 유전자를 하향 조절하는 핵산 분자는 DNA 또는 RNA 벡터에 삽입된 전사 유닛으로부터 발현될 수도 있다. 재조합 벡터는 DNA 플라스미드(plasmids) 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터를 발현하는 핵산 분자는, 제한된 않으나, 아데노-관련된 바이러스(adeno-ass℃iated virus), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 또는 알파바이러스(alphavirus)에 기반하여 구성될 수 있다. 핵산 분자를 발현하는 것이 가능한 재조합 벡터는 여기서 설명된 것과 같이 전달되고, 및 표적 세포를 고집할 수 있다. 또는, 바이러스 벡터는 핵산 분자의 일시적(transient) 발현을 제공하기 위하여 사용될 수 있다. 이런 벡터는 반복적으로 필요할 때 투여될 수 있다. 발현되면, 핵산 분자는 결합하고 및 RNA 간섭(RNAi)을 통해 유전자 기능 또는 발현을 하향 조절한다. 벡터를 발현하는 핵산 분자의 전달은, 정맥내 또는 근육내 투여에 의한, 개체로부터 외식된(ex-planted) 뒤이어 개체에 재도입하는 표적 세포로 투여에 의한, 원하는 표적 세포로 도입을 허용하는 어느 다른 수단에 의한 것과 같이, 전신성(systemic)일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상을 포함하는 약학 제형 이상의 생리 학적으로 허용 가능한 계면 활성제, 약학 적 담체, 희석제, 부형제, 현탁 제, 또는 이들의 조합에 관한 것이다 ; 및 제제는(예를 들면, 제제는 레티노이드, 두 번째 지질, 안정화제, 및/또는 치료학적 물질을 포함할 수 있다). 치료 적 사용을위한 약제 학적으로 허용 가능한 부가 담체 또는 희석제은 제약 업계에 공지되고 기술되어,예를 들면, 레밍톤스 제약 과학, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990), 이것은 그 전체가 본원에 참고로 인용되었다. 방부제, 안정 화제, 염색 등이 제형으로 제공 될 수 있다. 예를 들면, 나트륨 벤조 에이트, 아스코르브 산 및 p-히드 록시 벤조산의 에스테르를 방부제로서 첨가 될 수 있다. 추가적으로, 산화 방지제 및 현탁제를 사용할 수 있다. 다양한 실시 예에서, 알코올, 에스테르, 황산 화 된 지방족 알콜 등이 표면 활성제로서 사용될 수 있으며, 수 크로스, 글루코스, 락토스, 전분, 결정화 된 셀룰로즈, 만니톨, 라이트 무수 실리케이트, 마그네슘 알루미 네이트, 마그네슘 메타 실리케이트 알루미 네이트, 합성 알루미늄 실리케이트, 탄산 칼슘, 나트륨 산 카보네이트, 인산 수소 칼슘, 칼슘 카복시 메틸 셀룰로즈 등을 부형제로서 사용할 수 있다; 코코넛 오일, 올리브 오일, 참기름, 땅콩 기름, 콩은 현탁 제 또는 윤활제로서 사용될 수있다; 셀룰로즈 또는 당 또는 폴리 비닐의 유도체로서 메틸 아세테이트 - 메타 크릴 레이트 공중 합체와 같은 탄수화물의 유도체로서 셀룰로즈 아세테이트 프탈레이트가 현탁 제로서 사용될 수있다; 그러한 에스테르 프탈레이트 등과 같은 가소제는 현탁 제로서 사용될 수있다.
본 명세서에 기재된 약학적 제제는 인간 환자 per se 에게 투여 할 수 있고, 또한 그들은 다른 활성 성분과 혼합하여 약제 제형에 투여 할 수 있고, 치료와 결합한 곳에, 또는 적당한 약학적 전달체 또는 부형제(들)에 투여할 수 있다. 본 출원의 화합물의 제형 및 투여 기법은 “레밍턴의 제약 과학 "Mack Publishing Co., Easton, PA, 18th edition, 1990에서 찾을 수 있다.
투여의 적합적인 노선은 예를 들면, 비경구 전달(parenteral delivery), 근육내(intramuscular), 피하의(subcutaneous), 정맥(intravenous), 골수 강내 주입(intramedullary injections)을 포함하고, 이와 같은 척추(intrathecal), 직접 뇌실내(intraventricular), 복강(intraperitoneal), 비강(intranasal) 또는 안구 주입(intra℃ular injections)을 포함할 수 있다. 제제는(예를 들면, 레티노이드, 두 번째 지질, 안정화제(stabilizing agent), 및/또는 지료적 물질, 화합물을 포함할 수 있다) 또한, 지속 또는 용량 형태로 조절할 수 있고, 주입을 저장할 수 있고, 삼투압 펌프(osmotic pumps)에서 투여, 및 이와 같은, 연장에 대해 및/또는 시간, 미리 정해진 속도에서 투여를 제거하였다. 추가적으로, 투여의 범위는 위치 또는 조직일 수 있다.
공지의 방식으로 제조는, 예를 들면., 통상적인 혼합물, 용해, 과립(granulating), 드라제-제조(dragee-making), 가루(levigating), 유화(emulsifying), 캡슐화, 갇힌(entrapping) 또는 타블렛 제조의 의미일 수 있다.
약학적 제형은 약제 학적으로 사용될 수 있는 제제로 활성 화합물의 가공을 용이한 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리 학적으로 허용되는 약제 학적 담체를 사용하는 통상적인 방식으로 제제화 할 수 있다. 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 의존한다. 잘 알려진 기술, 약제 학적 담체, 부형제와의 상관이 적합한 것으로 당업계 이해로서 사용될 수있다; 예를 들면, 상기 레밍톤 제약 과학.
주입액은 하나의 액체 용액 또는 현탁액, 투입 전에 액체, 또는 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태로서, 종래의 형태로 제조 할 수 있는 유화와 같다. 적합한 부형제는, 예를 들어 물, 식염수, 자당, 포도당, 덱스 트로 오스, 만니톨, 락토스, 레시틴, 알부민, 나트륨 글루타메이트, 시스테인 히드로 클로라이드 등을 포함한다. 추가적으로, 원한다면, 투입에 가능한 약제 학적 제제는 예컨대 습윤제, 산도 완충제 등과 같은 비 독성 보조 물질을 소량으로 함유 할 수 있다. 생리적으로 호환 가능한 버퍼를 포함하지만의 행크스 용액(Hanks’s solution), 링거 용액(inger’s solution), 또는 생리 식염수 완충액으로 한정되지 않는다. 원한다면, 흡수 강화 제제는 이용 될 수 있다.
비경 구 투여를 위한 제약 제제, 예를 들면., 일시 주입 또는 연속 주입에 의해 수용성 형태로 활성 제제의 수용액(예를 들면, 화합물, 레티노이드, 지질 제, 안정 화제 및 / 또는 치료제를 포함 할 수있는 제제) 을 포함한다. 추가적으로, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로서 제조 될 수있다. 수성 주사 현탁액은 나트륨 카르복시 메틸 셀룰로오스, 소르비톨, 또는 덱스 트란과 같은 현탁액의 점도를 증가 물질을 함유 할 수있다. 임의로, 현탁액은 또한 고 농축 용액의 제조를 허용하는 화합물의 용해도를 증가 적합한 안정 화제 또는 제제를 함유 할 수있다. 주입 용 제제는 단위 투여 형태로 제공 될 수있고, 예를 들면, 앰플 또는 다중 - 투여 용기에, 방부제가 첨가되었다. 제형은 현탁액, 용액 또는 유성 또는 수성 처리군의 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있고, 현탁 제, 안정 화제 및 / 또는 분산제와 같은 제형 화제를 함유할 수 있다. 다르게는, 활성 성분은 적합한 처리제와 함께 구성을 위해 분말 형태 일 수 있다, 예를 들면., 사용 전, 멸균 발열 물질이 없는 물.
실시예
실시예 1: 2-(비스(bis)(2-테트라디카노일로시(tetradecanoyloxy)에틸(ethyl))아미노(amino))-N-(2-하이드로시에틸(2-hydroxyethyl))-N,N-디메틸(dimethyl)-2-옥소에단(oxoethan)-아미누염 브로마이드(aminium bromide)(HEDC)의 준비
Figure 112018119950312-pat00021
중간 1의 준비:2,2'-(털트(tert)-(부톡시카보닐아재인딜(butoxycarbonylazanediyl))비스(bis)(에탄-2,1-딜(ethane-2,1-diyl))다이테트라디캐노애이트(ditetradecanoate)(HEDC-BOC-IN)
Figure 112018119950312-pat00022
DCM (1750 mL)에 있는 N-BOC-다이에탄올아민(diethanolamine)(194 g, 0.946 몰(mol), 트리에틸아민(201 g, 2.03 몰) 및 디아미노피리닌(diaminopyridine)(23.1 g, 0.19 몰)의 용액을 0℃에서 냉각하였다. DCM(440 mL)에 있는 미리스토일 클로라이드(491 g, 1.99 몰)를 0-10℃에서 50 분 동안 첨가하였고, 및 혼합물은 주위 온도(ambient temperature)에서 따듯하게 하였다. 모든 변환은 20-24℃에서 1.5 시간이 지난 후 TLC에 의해 나타났다. 물(1750 mL) 첨가 및 pH 미터기(pH meter)에 의해 pH 8.3을 측정하였다. 유기상(organic phase)은 분리되었고, (1) 6% NaHCO3(500 mL), (2) 0.3 M HCl(1700 mL), (3) 12.5% 염화 나트륨(sodium chloride) (1700 mL)을 사용하여 세척하였고, 및 무수 황산 마그네슘(anhydrous magnesium sulphate)(120 g)으로 건조하였다. 50℃ 및 50 mBar에서 여액을 증발하였을 때 2,2'-(털트(tert)-(부톡시카보닐아재인딜(butoxycarbonylazanediyl))비스(bis)(에탄-2,1-딜(ethane-2,1-diyl))다이테트라디캐노애이트(ditetradecanoate)(HEDC-BOC-IN)의 622 g을 수득하였다. 이 증류 잔류(distillation residue), 조건에 맞게 고체화(solidified)를 시켰고, 다음 단계에서 사용하였다.
중간 2의 준비:2,2'-(털트(tert)-(부톡시카보닐아재인딜(butoxycarbonylazanediyl))비스(bis)(에탄-2,1-딜(ethane-2,1-diyl))다이테트라디캐노애이트(ditetradecanoate)(HEDC-BOC-아민-IN) TFA 염
Figure 112018119950312-pat00023
HEDC-BOC-IN (620 g, 0.990 몰)은 50℃-배스(bath)로 가열 및 그런 다음 25℃ 아래에서 냉각시키면서 액체(liquid)로 변환하였다. TFA (940 mL, 1.39 kg, 1.18 몰)을 액체에 30분 동안 첨가하였고, 25℃ 이하 온도로 유지하기 위하여 적당한 냉각을 사용하였다. TFA의 양의 3 분의 2를 첨가하였고, 유의적으로 가스 방출(gas evolution)이 관찰되었다. 상온(ambient temperature)에서 하룻밤 동안 혼합물이 반응하도록 교반하였다. TLC은 HEDC-BOC-IN의 미량(trace)을 나타내었다. 혼합물 반응을 TFA의 증류 50-55℃의 워터바스(water bath)로부터 압력(125-60 mBar)을 감소시켜 가열하고, 및 증류는 혼합물 반응이 늦어 질 때까지 계속되었다. TFA 가스(fume)는 10% 수산화 나트륨(sodium hydroxide)과 스크러버(scrubber)에서 흡수하였다. 헵탄(2000 mL)을 첨가, 젓기(stirred), 및 압력이 감소할 때까지 증류하였다. 잔류물질이 고체가 될 때까지 헵탄(2000 mL)을 첨가하고, 및 혼합물은 45℃로 가열하고, 이 온도에서 약간 탁한 용액(turbid solution)을 형성하였다. 용액을 냉각하였고, 40℃에서 분주하고, 및 40-36℃에서 25분 동안 교반(stirred)하여 침전물이 형성되었다. 상온에서 40분 동안 냉각 및 교반 하였고, 무거운 결정(heavy crystal)의 침전물을 여과하여 분리시키고, 필터 케이크(filter cake)를 헵탄 (1000 ㎖)으로 세척하였다. 젖은 필터 케이크(wet filter cake)(914 g)는 하룻 밤(overnight) 동안 상온에서 압력(<1 mBar)이 감소할 때까지 건조하였고 하얀 크리스탈(white crystal)과 같은 2,2'-(털트(tert)-(부톡시카보닐아재인딜(butoxycarbonylazanediyl))비스(bis)(에탄-2,1-딜(ethane-2,1-diyl))다이테트라디캐노애이트(ditetradecanoate)(HEDC-BOC-아민-IN) TFA염의 635 g이 만들어졌다.
중간 3의 준비: 2,2'-(2-(다이메틸아미노)(dimethylamino)아세틸아제인딜(acetylazanediyl))비스(bis)(에탄-2,1-딜)(ethane-2,1-diyl)다이테트라디카-노트(ditetradeca-noate)(HEDC-DiMeGly-IN)
Figure 112018119950312-pat00024
DMF (3.5 L)에 N,N-디메틸글리신(Dimethylglycine)(56.6 g, 548 몰), HOBt 하이드레이트(hydrate)(83.9 g, 548 몰) 및 EDC 하이드로클로라이드(105 g, 548 몰)을 첨가, 및 1시간 동안 상온에서 혼합물을 교반 하였다. 깨끗한 용액으로 형성되었다. HEDC-아민-IN TFA 염(270 g, 442 몰)을 DCM (1.15 L) 및 6% 탄산수소 나트륨(sodium bicarbonate)(1.15 L)과 혼합하였다. DMF에서 커플링 혼합물(coupling mixture)에 무 아민(free amine)을 첨가하여 유기상을 분리하고, 및 약 9℃의 증가 온도에서 침전물을 관찰하였다. 트리에틸아민(Triethylamine)(47.0 g, 464 몰)을 첨가, 및 반응 혼합물(reaction mixture)을 5시간 동안 25-30℃에서 교반 하였다. TLC는 불안전하게 전환되는 것으로 나타났으며, 및 부가적으로 EDC 하이드로클로라이드(29.5 g, 154 몰)을 첨가하였다. 상온에서 하룻밤 동안 교반하였으며, 깨끗한 용액이 관찰되었고, 및 TLC는 전부 변환되는 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 DCM (2.3 L) 및 2% 탄산수소 나트륨(sodium bicarbonate)(7 L)과 혼합시켰다. 유기상(organic phase)는 1.25% 염산 나트륨(sodium chloride)(5 L 각)으로 두번 세척하였고 무 황산 마그네슘(anhydrous magnesium sulphate)(186 g)으로 건조하였다. 필터는 50℃ 및 30 mBar에서 증발하여 원유의 253 g을 수득하였다. 원료(crude material)는 Gel 60 (40-63 u)의 2.6 kg과 함께 컬럼 고정상(column packed)에 가득 채웠다(loaded). 생성물(product)은 톨루엔(toluene): 에틸 아세테이트(ethyl acetate)(8:2)(4 L), 및 에틸 아세테이트(ethyl acetate): 메탄올(methanol)(1:1) (5 L)로 용출되었다. 물질은 분획물(3.5-8 L)을 증발시켜 오일과 같은 2,2'-(2-(다이메틸아미노)(dimethylamino)아세틸아제인딜(acetylazanediyl))비스(bis)(에탄-2,1-딜)(ethane-2,1-diyl)다이테트라디카-노트(ditetradeca-noate)(HEDC-DiMeGly-IN)의 208 g (66%)을 수득한 것을 포함하였다.
HEDC의 준비: 2-(비스(bis)(2-(테트라디카노일옥시)에틸)(2-(tetradecanoyloxy))에틸(ethyl))아미노(amino))-N-(2-하이드로시에틸)(2-hydroxyethyl)-N,N-디메틸(dimethyl)-2-옥세탄아미늄 브로마이드(oxethanaminium bromide)
Figure 112018119950312-pat00025
HEDC-DiMeGly-IN(206 g, 337 몰) 및 2-브로모에탄올(2-bromoethanol)(274 g, 2.19 몰)의 혼합물을 2시간 동안 80℃에서 교반 하였다. HPLC로 미반응(unreacted)디메틸글리신-중간(dimethylglycin-intermediate)의 8.1%를 나타내었다. 추가적으로 80℃에서 40 분 동안, HPLC로 미반응 디메틸글리신-중간의 7.8%가 나타내었다. 따듯한(65℃) 에틸 아세테이트(2 L)를 첨가하였다. 뜨거운 용액의 빈 여과를 뜨거운 에틸 아세테이트(0.5 L)로 세척하였다. 결합한 여과(combined filtrates)는 0℃에서 냉각 및 분주에 의해 결정화(crystallization)가 시작(initiated)되었다. 물질은 40분 동안 -16 내지 -18℃에서 천천히 냉각 및 교반할 때 정지되었다. 침전물은 여과, 및 차가운 에틸 아세테이트(200 mL)로 필터 케이크를 세척하여 분리하였다. 하룻밤(20℃/<1 mBar)동안 건조하여 원료(crude material)의 211 g을 수득하였다. 그런 다음 35℃에서 에틸 아세테이트(2.1 L) 및 에탄올(105 mL) 가열 및 25℃에서 분주하여 혼합물로부터 원료를 다시 결정화하였다. 침전물은 10℃에서 분리되었고, 차가운 에틸 아세테이트(300 mL)로 세척 및 하룻밤 동안(20℃/<1 mBar)로 건조하여 2-(비스(bis)(2-(테트라디카노일옥시)에틸)(2-(tetradecanoyloxy))에틸(ethyl))아미노(amino))-N-(2-하이드로시에틸)(2-hydroxyethyl)-N,N-디메틸(dimethyl)-2-옥세탄아미늄 브로마이드(oxethanaminium bromide)의 161 g을 수득하였다. HPLC로 99.5% 순도(purity)가 나타났다.QTOF MS ESI+: m/z 655.6(M + H).
실시예 2: 2-(비스( bis )(3-(테트라디카노일옥시)프로필)아미노)(3-(tetradecanoyloxy)propyl)amino)-N-(2-하이드로시에틸)(2-hydroxyethyl)-N,N-다이메틸(dimethyl)-2-oxo-에탄아미늄 브로마이드( ethanaminium bromide)(Pr- HEDC )의 준비
Figure 112018119950312-pat00026
[ 0199] 중간 1의 준비: 3,3'-아제인딜비스(azanediylbis)프로판-1-ol(propan-1-ol)
Figure 112018119950312-pat00027
3-아미노-1-프로파놀(3-amino-1-propanol)(14.5 mL, 19.0 mmol), 1-클로로-3-하이드로시 프로판(1-chloro-3-hydroxy propane)(8 mL, 95.6 몰) 및 H2O (~50 mL)의 혼합물을 24시간 동안 환류(refluxed)하였다. 수산화 칼륨(Potassium hydroxide)(5.40 g)을 첨가하였다. 용해(dissolution)한 후, 기름 점성(viscous oil) 및 염화 칼륨(potassium chloride)의 큰 양(large quantities)이 남도록(leave) H2O의 전체를 증발시켰다. 이것들은 건조된 아세톤 및 디클로로메탄(dichloromethane)으로 여과 및 세척하였다. 유기상은 Na2SO4 , 여과 및 농도로 건조 시켰다. 생성 물질을 실리카 젤 크로마토그라피(silica gel chromatography)와 DCM/MeOH 그래디언트(gradient)가 2.5 g 3,3'-아제인딜비스(azanediylbis)프로판-1-ol(azanediylbis(propan-1-ol)) 수율을 통해 정제시켰다.
중간 2의 준비: 털트(tert )-부틸 비스(butyl bis)(3-하이드로실프로필)(3-hydroxypropyl)카바메이트(carbamate)
Figure 112018119950312-pat00028
DCM(25mL)에서 3,3'-아제인딜비스(프로판-1-ol)(3,3'-Azanediylbis(propan-1-ol))(12.5g, 95.4 몰)을 희석(dissolved)하였다. DCM(25mL)에서 디-털트-부틸 디카보네이트(di-tert-butyl dicarbonate)의 용액(26g, 119.25 몰)을 Ar 가스의 블랭킷(blanket) 하에 교반 하면서 천천히 첨가하였다. 하룻밤 동안 반응하도록 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시켰다. 실리카 젤 크로마토그라피(silica gel chromatography)와 DCM/MeOH 그래디언트(gradient)가 털트-부틸 비스(3-하이드로프로필)카바메이트(tert-butyl bis(3-hydroxypropyl)carbamate) 수율에 의해 정제시켰다.
중간 3의 준비:((털트-뷰톡시카보닐)아제인딜)비스(프로판-3,1-딜)디테트라디카노에이트)((tert-butoxycarbonyl)azanediyl)bis(propane-3,1-diyl) ditetradecanoate)
Figure 112018119950312-pat00029
클로로폼(50 mL)에서 털트-부틸 비스(3-하이드로실프로필)카바메이트(tert-Butyl bis(3-hydroxypropyl)carbamate)(4.00 g, 17.3 몰), 트리에틸아민(triethylamine)(4.80 ml, 34.6 몰) 및 4-디메틸아미노피리닌(4-dimethylaminopyridine)(529 mg, 4.33 몰)을 용해(dissolved)하였다. 미리스토일 클로라이드(myristoyl chloride)의 용액을 첨가하여 15분 동안 아이스-배스(ice-bath)에서 교반 하였다. 추가적으로 첨가 반응의 온도가 30 ℃를 초과하지 않는 방식으로 하였다. 하룻밤 동안 상온(room temperature)에서 교반 하여 반응하도록 하였다. 그 다음날, MeOH(50 mL) 및 0.9% 생리식염수 용액(saline solution)(50 mL)을 첨가하여 급냉 반응(quench the reaction)하도록 하였다. 유기층을 1M NaHCO3 로 분리 및 세척하였다. 용매(Solvent)를 오일로서 수율이((털트-부토실카보닐)마제인딜)비스(프로판-3,1-딜)디테트라디카노에이트((tert-butoxycarbonyl)azanediyl)bis(propane-3,1-diyl)ditetradecanoate)로 되도록 진공 하에(vacuo) 농축 오일로서 Na2SO4, 여과 및 농축하였다.
중간 4의 준비: 아제인딜비스(프로판-3,1-일)디테트라디카노에이트 TFA 염
Figure 112018119950312-pat00030
TFA/CHCl3 (1:1, 20mL)에서 ((털트-부토실카보닐)아제인딜)비스(프로판-3-1-dyl) 디테트라디카노에이트)((tert-butoxycarbonyl)azanediyl)bis(propane-3,1-diyl)) 용해 및 혼합물을 15분 동안 상온에서 교반 하였다. 혼합물을 진공에서 농축하였다. 이것을 두번 씩 반복하였다. 남는 잔액은 DCM에서 희석하였고 및 H2O로 세척하였고 Na2SO4로 건조하고, 및 진공에서 농축하였다. 실리카 젤 크로마토그라피(silica gel chromatography)와 DCM/MeOH 그래디언트(gradient)가 아제인딜비스(프로판-3,1-일)디테트라디카노에이트 TFA 염(750mg) 수율에 의해 정제하였다.
중간 5의 준비:((2-디메틸아미노)아세틸)아제인딜)비스(프로판-3,1-딜)디테트라디카노에이트)(((2-(dimethylamino)acetyl)azanediyl)bis(propane-3,1-diyl) ditetradecanoate))
Figure 112018119950312-pat00031
아제인딜비흐(프로판-3,1-딜)디테트라디카노에이트 TFA 염(Azanediylbis(propane-3,1-diyl) ditetradecanoate TFA salt)(750mg, 1.35몰)을 DCM (5mL)와 희석하였고 DCM(5mL)에서 N,N-디메틸글리신(N,N-dimethylglycine)(154mg, 1.49 몰), HATU(616mg, 1.62 몰) 및 DIEA(495uL, 2.84 몰)의 예비-활성된 혼합물을 첨가하였다. 물질은 아르곤(argon)으로 씻어내었고(flushed) 및 상온에서 하룻밤 동안 교반하고, 그런 다음 농축하였다. 실리카 젤 크로마토그라피(silica gel chromatography)와 DCM/MeOH 그래디언트(gradient) 수율이 465 mg (2-디메틸아미노)아세틸)아제인딜)비스(프로판-3,1-딜)디테트라디카노에이트)((2-(dimethylamino)acetyl)azanediyl)bis(propane-3,1-diyl)ditetradecanoate에 의해 정제하였다.
Pr-HEDC의 준비: 2-(비스(3-테트라디카노일옥시)프로필)아미노)-N-(2-하이드로시에틸)-N,N-디메틸-2-옥소데탄아미늄 브로마이드(2-(bis(3-(tetradecanoyloxy)propyl)amino)-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-2-oxoethanaminium bromide)
*
Figure 112018119950312-pat00032
밀폐된 시스템(sealed system)에서, ACN(10 mL)에 ((2-디메틸아미노)에틸)아제인딜)비스(프로판-3,1-딜)디트라디캐노에이트(246 mg, 0.385 몰)를 용해, 및 2-브로모에탄올(2-bromoethanol)(500 uL)을 첨가하였다. 반응 관(reaction vessel)은 불활성 가스로 플러스(flushed)하고, 그런 다음 밀폐(sealed)하였다. 혼합물은 80℃에서 가열하였고, 하룻밤 동안 교반 하고, 및 진공에서 냉각 및 농축하였다. 실리카 젤 크로마토그라피(silica gel chromatography)와 DCM/MeOH 그래디언트(gradient) 수율은 99 mg 2-(비스(3-테트라디카노일옥시)프로필)아미노)-N-(2-하이드로시에틸)-N,N-디메틸-2-옥소데탄아미늄 브로마이드(2-(bis(3-(tetradecanoyloxy)propyl)amino)-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-2-oxoethanaminium bromide)에 의해 정제되었다. QTOF MS ESI+: m/z 683.6 (M + H).
실시예 3: 2 -( 비스(3-(오레오일옥시)프로필)아미노 -N-(2- 하이드로시에틸 )-N,N-디메틸-2-옥소데탄아미늄 브로마이드(Pr-HE-DODC)
Figure 112018119950312-pat00033
중간 1의 준비: (Z)-((털트-부톡시카보닐)아제인딜)비스(프로판-3,1-딜) 디올에이트)(Z)-((tert-butoxycarbonyl)azanediyl)bis(propane-3,1-diyl) dioleate)
Figure 112018119950312-pat00034
클로로폼(chloroform)에서 털트-부틸 비스(3-하이드로프로필)카바메이트(합성은 이전에 설명하였다),트리에틸아마인(triethylamine) 및 DMAP를 용해하였다. 아이스-배스(ice-bath)에서 교반하면서, 올레일 클로라이드의 용액을 15분 동안 첨가하였다. 추가적으로 첨가 반응의 온도가 30℃를 초과하지 않는 방식으로 수행하였다. 하룻밤 동안 반응하도록 상온에서 교반 하였다. 그 다음날, MeOH(50 mL) 및 0.9% 생리식염수 용액((saline solution)(50 mL)을 첨가하여 급냉 반응(quench the reaction) 하도록 하였다. 유기층은 1M NaHCO로 분리 및 세척하였다. 용매를 수율이 기름과 같이 Na2SO4와, 여과 및 농축하였다. (Z)-((털트-부톡시카보닐)아제인딜)비스(프로판-3,1-딜) 디올에이트)는 추가의 정제 없이 앞으로 운반하였다.
중간 2의 준비:(Z)-아제인딜피브(프로판-3,1-딜)디올레이트 TFA 염((Z)-azanediylbis(propane-3,1-diyl) dioleate TFA salt)
Figure 112018119950312-pat00035
TFA/CHCl3(1:1, 20 mL)에서 (Z)-아제인딜피브(프로판-3,1-딜)디올레이트((Z)-azanediylbis(propane-3,1-diyl)(13.2 g, 17.3 몰)은 용해되었고 혼합물은 상온에서 15분 동안 교반 하였다. 혼합물을 진공상태에서 농축하였다. 상기 방법을 두번 씩 반복하였다. 남는 잔해물(Residue)은 DCM에서 용해하고, H2O로 세척하고, Na2SO4로 건조 및 농축하였다. 실리카 젤 크로마토그라피(silica gel chromatography)와 DCM/MeOH 그래디언트(gradient) 수율은 (Z)-아제인딜피브(프로판-3,1-딜)디올레이트 TFA 염((Z)-azanediylbis(propane-3,1-diyl) dioleate TFA salt(750 mg))에 의하여 정제되었다.
중간 3의 준비:((Z)-((2-(디메틸아미노)아세틸)아제인딜)비스(프로판-3,1-딜)디올레이에이트)((Z)-((2-(dimethylamino)acetyl)azanediyl)bis(propane-3,1-diyl) dioleate)
Figure 112018119950312-pat00036
(Z)-아제인딜비스(프로판-3,1-딜)디올레이에이트 TFA 염(750 mg, 1.13 몰)을 DCM(5 mL)과 함께 희석 및 DCM(5 mL)에서 N,N-디메틸글리신(N,N-dimethylglycine)(128 mg, 1.24 몰), HATU(517 mg, 1.36 몰) 및 DIEA(413 uL, 2.37 몰)의 예비-활성화된 혼합물(pre-activated mixture)을 첨가하였다. 아르곤(argon)으로 플라스크를 씻어냈으며 하룻밤 동안 교반 하였다. 반응 혼합물은 농축, 및 실리카 젤 크로마토그라피(silica gel chromatography)와 DCM/MeOH 가 ((Z)-((2-(디메틸아미노)아세틸)아제인딜)비스(프로판-3,1-딜)디올레이에이트)((Z)-((2-(dimethylamino)acetyl)azanediyl)bis(propane-3,1-diyl) dioleate)로 수득하도록 실시하였다.
Pr-HE-DODC의 준비: 2-(비스(3-(오레오일옥시)프로실)아미노)-N-(2-하이드로시에틸)-N,N-디메틸-2-옥소에탄아미늄 브로마이드(2-(bis(3-(oleoyloxy)propyl)amino)-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-2-oxoethanaminium bromide)
Figure 112018119950312-pat00037
밀폐된 시스템(sealed system)에서, ACN (10 mL)에 (Z)-((디메틸아미노)아세틸)비스(프로판-3,1-딜)디올리에이트(269 mg, 0.360 몰) 용해하고 및 2-브로모에탄올(2-Bromoethanol)(200 uL)을 첨가하였다. 반응 관(reaction vessel)은 불활성 가스로 플러스(flushed)하고, 그런 다음, 밀폐하였다. 혼합물은 80℃에서 가열하였고, 하룻밤 동안 교반 하였다. 반응 혼합물은 냉각 및 농축하였다. 실리카 젤 크로마토그라피(silica gel chromatography)와 DCM/MeOH 그래디언트(gradient) 수율은 2-(비스(3-(오레오일옥시)프로실)아미노)-N-(2-하이드로시에틸)-N,N-디메틸-2-옥소에탄아미늄 브로마이드(2-(bis(3-(oleoyloxy)propyl)amino)-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-2-oxoethanaminium bromide)(129 mg)에 의해 정제되었다. QTOF MS ESI+: m/z 791.7 (M + H).
실시예 4: 3 -( 비스(2-(테트라디카노일옥시)에틸)아미노 )-N-(2- 하이드로옥시에틸 )-N,N-디메틸-3-옥소-프로-판-1-아미늄 브로마이드(HE-Et-DC)(3-( bis (2-(tetradecanoyloxy)ethyl)amino)-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-3-oxopro-pan-1-aminium bromide)(HE-Et-DC)
Figure 112018119950312-pat00038
중간 1의 준비:((3-디메틸아미노)프로판오일)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜)디테트라디카-노에이트((3-(dimethylamino)propanoyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl) ditetradeca-noate)
Figure 112018119950312-pat00039
아제인딜비스(에탄-2,1-딜)디테트라디카노에이트 TFA 염의 합성은 이전에 설명하였다. 아제인딜비스(에탄-2,1-딜)(Azanediylbis(ethane-2,1-diyl)) 디테트라디카노에이트 TFA 염(1.5 g, 2.85 mmol)은 DCM(10 mL)과 함께 희석 및 DCM(10 mL)에서 3-(디메틸아미노)프로피오닉산 HCL 염(3-(dimethylamino)propionic acid HCl salt) (482mg, 3.14 mmol), HATU(1.30 g, 3.42 mmol) 및 DIEA(1.04 mL, 5.98 mmol)의 예비-활성된 혼합물을 첨가하였다. 아르곤으로 플라스크 아래 밑부분을 씻어냈으며 반응 혼합물은 하룻밤 동안 상온에서 교반 하였다. 반응 혼합물을 농축하였다. 실리카 젤 크로마토그라피와 DCM/MeOH 그래디언트 수율((3-디메틸아미노)프로판오일)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜)디테트라디카-노에이트((3-(dimethylamino)propanoyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl) ditetradeca-noate)에 의해 정제되었다.
HE-Et-DC의 준비: 3-(비스(2-테트라디카노일옥시)에틸)아미노)-N-2(하이드록시에틸)-N,N-디메틸-3-옥소프로판-1-아미늄 브로마이드(3-(bis(2-(tetradecanoyloxy)ethyl)amino)-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-3-oxopropan-1-aminium bromide)
Figure 112018119950312-pat00040
밀폐된 시스템(sealed system)에서, ACN (10 mL)에 ((3-디메틸아미노)프로판오일)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜)디테트라디캐노에이트(606mg, 0.970mmol)를 용해 시키고 2-브로모에탄올(2-Bromoethanol)을 첨가하였다. 반응 관(reaction vessel)은 불활성 가스로 플러스(flushed)하고, 그런 다음, 밀폐하였다. 혼합물은 80℃에서 가열하였고, 하룻밤 동안 교반 하고, 그런 다음 냉각 및 농축하였다. 실리카 젤 크로마토그라피(silica gel chromatography)와 DCM/MeOH 그래디언트(gradient) 수율은 3-(비스(2-테트라디카노일옥시)에틸)아미노)-N-2(하이드록시에틸)-N,N-디메틸-3-옥소프로판-1-아미늄 브로마이드(3-(bis(2-(tetradecanoyloxy)ethyl)amino)-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-3-oxopropan-1-aminium bromide)(80 mg)에 의해 정제되었다. QTOF MS ESI+: m/z 669.6 (M + H).
실시예 5: 3 -( 비스(2-오레오일옥시)에틸 )아미노)-N-(2- 하이드로에틸 )- N,N -디메틸-3-옥소프로판-1-아미늄 브로마이드(HE-Et- DODC )(3-( bis(2-(oleoyloxy)ethyl) amino)-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-3-oxopropan-1-aminium bromide (HE-Et-DODC))
Figure 112018119950312-pat00041
중간 1의 준비: (Z)-((털트-부토옥시카보닐)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜)디올레이트)((Z)-((tert-butoxycarbonyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl) dioleate))
Figure 112018119950312-pat00042
클로로폼(chloroform)의 350 mg에서 N-복 디에타놀아민(N-BOC diethanolamine)(Aldrich 15268, Lot# 0001406013, MW 205.25; 17.81 g, 0.087 mole), 트리에틸아마인(triethylamine)(Aldrich, MW 101.19; 24.4 ml, 0.176 mole) 및 4-(디메틸아미노)피리딘(4-(dimethylamino)pyridine)(Aldrich, MW 122.17; 2.76 g, 1.3 g, 0.023 mole)을 용해하였다. 교반하는 동안에, 클로로폼의 100 ml에서 올레오일 클로라이드(oleoyl chloride)(MW 300.91; 61.6 g, 0.174 mole)의 용액을 10 분 동안 첨가하였다(그렇지 않으면, N-복 디에타놀아민의 클로로폼 용액은 오레오일 클로라이드를 첨가하는 동안 아이스/워터 배스(ice/water bath )에 집어넣었다). 첨가할 때 반응 혼합물의 온도가 50℃를 초과하지 않는 방식으로 수행하였다. 하룻밤 동안 반응 혼합물을 2시간 동안 상온에서 교반 하였다. 메탄올의 200 ml의 혼합물(EMD MX0485-5, Lot 50350) 및 0.9% 생리식염수 용액(saline solution)의 200 ml(염화나트륨, BDH, BDH8014, Lot# 92717)을 첨가하여 급냉 반응하도록 하였다. 수성 탄산수소나트륨(aqueous sodium bicarbonate)(Aldrich S6014, Batch# 095K0143)을 2 Ｘ 100 ml로 희석하여 유기층(organic layer)을 분리 및 세척하였다. 회전증발(rotary evaporation) 옅은 노란색 기름과 같은 원료 생성물(crude product)((MW 734.14; 59.5 g, 0.081 mole, 100% yield)의 59.5 g을 회전증발(rotary evaporation) 하여 용매(solvent)를 제거하였다. 상기 물질은 추가적으로 정제하지 않고 다음 단계에 사용하였다.1H NMR(400 MHz, CDCl3) 0.87(t,6H, CH3), 1.20-1.40(m, 40H, CH2), 1.45(s, 9H, tBu CH3), 1.59(m, 4H, CH2CH2C(=O)), 2.00(m, 8H, CH2CH=CH), 2.33(t, 4H, CH2C(=O)), 3.48(m, 4H, NCH2CH2O), 4.18(m, 4H,NCH2CH2O), 5.33(m, 4H, CH=CH).
중간 2의 준비:(z)-아제인딜비스(에탄-2,1-딜)디올레이트 TFA 염((Z)-azanediylbis(ethane-2,1-diyl) dioleate TFA salt)
Figure 112018119950312-pat00043
(Z)-((털트-부톡시카보닐)아제인딜)비프(에탄-2,1-딜)디오레이트(59.5 g, 0.081 mole)는 100 ml 트리플루오르아세트산(trifluoroacetic acid )(Alfa Aesar St℃k# A12198, Lot# D07W005, MW 114.02; 100 ml, 1.35 mole) 및 클로로폼(chloroform)의 100 ml(Aldrich 154733, Lot# KBF5943V)을 두번 씩 처리하였다. 10분 동안 상온에서 각 구성을 교반, 및 용매는 각 처리의 끝에서 회정 증발에 의해 제거하였다. 두번 째 처리 후, 반응 혼합물은 회전 증발에 의하여 농축되었다. 잔류 물은 메틸렌 클로라이드(methylene chloride)의 200 ml에서 용해하였고, 100 ml 물로 혼합물을 두 번 세척하였다. 잔류물은 메탄올(methanol)(EMD MX0485-5, Lot 50350) 및 메틸렌 클로라이드(methylene chloride)(EMD DX0835-5, Lot 51090)를 용리액(eluent)으로서 (z)-아제인딜비스(에탄-2,1-딜)디올레이트 TFA 염((Z)-azanediylbis(ethane-2,1-diyl) dioleate TFA salt)의 44 g 수율의 혼합물을 사용하여 실리카 젤 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. 1H NMR(400 MHz, CDCl3) 0.87(t, 6H, CH3), 1.20-1.40(m, 40H, CH2), 1.59(m, 4H, CH2CH2C(=O)),2.00(m, 8H, CH2CH=CH), 2.33(t, 4H, CH2C(=O)), 3.31(m, 4H, NCH2CH2O), 4.38(m, 4H, NCH2CH2O), 5.33(m, 4H, CH=CH).
중간 3의 준비:(((Z)-((3-(디메틸아미노)프로필)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜)디올레이트((Z)-((3-(dimethylamino)propanoyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl) dioleate))
Figure 112018119950312-pat00044
DCM (10 mL)에서 (Z)-아제인딜비스(에탄-2,1-딜)디올레이트 TFA 염(1.50 g, 2.37 mmol)를 희석 및 DCM (10 mL)에 3-(디메틸아미노)프로피오닐 산 HCL 염(3-(dimethylamino)propionic acid HCl salt)(383 mg, 2.49 mmol)의 예비-활성된 혼합물, HATU (1034 mg, 2.72 mmol) 및 DIEA (831 uL, 4.77 mmol)을 첨가하였다. 플라스크 바닥 주위를 아르곤(argon)으로 깨긋이 씻어내고 반응 혼합물을 하룻밤 동안 상온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하였다. DCM/MeOH 그래디언트 수율(((Z)-((3-(디메틸아미노)프로필)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜)디올레이트((((Z)-((3-(dimethylamino)propanoyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl) dioleate)은 실리카 젤 크로마토그래피에 의하여 정제하였다.
HE-Et-DODC의 준비: 3-(비스(2-(올레오일옥시)에틸)아미노)-N-(2-하이드로실에틸)-N,N-디메틸-3-옥소-프로판-1-아미늄 브로마이드(3-(bis(2-(oleoyloxy)ethyl)amino)-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-3-oxo-propan-1-aminium bromide)
*
Figure 112018119950312-pat00045
밀폐된 시스템(sealed system)에서, ACN (10 mL)에 (((Z)-((3-(디메틸아미노)프로파노일)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜)디올레이트(88 mg, 0.802 mmol)를 용해 및 20브로모에탄올(200 uL)을 첨가하였다. 반응 관(reaction vessel)은 불활성 가스로 플러스(flushed)하고, 그런 다음, 밀폐하였다. 혼합물은 80에서 가열하였고, 하룻밤 동안 교반 하고, 그런 다음 냉각 및 농축하였다. DCM/MeOH 그래디언트(gradient) 수율 3-(비스(2-(올레오일옥시)에틸)아미노)-N-(2-하이드로실에틸)-N,N-디메틸-3-옥소-프로판-1-아미늄 브로마이드 (160 mg)(3-(bis(2-(oleoyloxy)ethyl)amino)-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-3-oxopropan-1-aminium bromide(160 mg))은 실리카 젤 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. QTOF MS ESI+: m/z 764.3 (M + H).
실시예 6: 4 -( 비스(2-테트라디카노일옥시)에틸 )아미노-N-(2- 하이드로식에틸 )-N,N-디메틸-4-옥소부탄-1-아미늄 브로마이드(HE-Pr-DC)(4-(bis(2-(tetradecanoyloxy)ethyl)amino)-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-4-oxobutan-1-aminium bromide) (HE-Pr-DC)
Figure 112018119950312-pat00046
중간 1의 제조: ((4-디메틸아미노)부타노일)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜)디테트라-디캐노에이트((4-(dimethylamino)butanoyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl) ditetra-decanoate)
Figure 112018119950312-pat00047
상기 실시예에서 아제인딜비스(에탄-2,1-ELF)디테트라디캐노이트 TFA 염의 합성에 대하여 설명하였다. DCM(5 mL)에 아제인딜비스(에탄-2,1-ELF)디테트라디캐노이트 TFA 염(Azanediylbis(ethane-2,1-diyl) ditetradecanoate TFA salt)(1.00 g, 1.90 mmol)을 희석하였고 DCM(5 mL)에 4-(디메틸아미노)부티릭산 HCL 염(4-(dimethylamino) butyric acid HCl salt)(382 mg, 2.28 mmol), HATU(867 mg, 2.28mmol) 및 DIEA(728 uL, 4.18 mmol)의 예비-활성된 혼합물을 첨가하였다. 플라스크 바닥 주위를 아르곤(argon)으로 깨긋이 씻어내고 반응 혼합물을 하룻밤 동안 상온에서 교반하고, 반응 혼합물을 농축하였다. DCM/MeOH 그래디언트 수율 ((4-디메틸아미노)부타노일)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜)디테트라-디캐노에이트((4-(dimethylamino)butanoyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl) ditetra-decanoate)로 실리카 젤 크로마토그래피에 의하여 정제되었다.
HE-Pr-DC의 제조: 4-(비스(2-(테트라디카노일옥시)에틸)아미노)-N-(2-하이드로식에틸)N-N-디메틸-4-옥소부탄-1-아미늄 브로마이드(4-(bis(2-(tetradecanoyloxy)ethyl)amino)-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-4-oxobutan-1-aminium bromide)
Figure 112018119950312-pat00048
밀폐된 시스템(sealed system)에서, ACN(10 mL)에 ((4-디메틸아미노)부타노일)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜)디테트라디케노에이트((4-(dimethylamino)butanoyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl)ditetradecanoate)((300 mg, 0.469 mmol) 및 2-브로모에탄올(500 uL)을 첨가하였다. 반응 관(reaction vessel)은 불활성 가스로 플러스(flushed)하고, 그런 다음, 밀폐하였다. 혼합물은 80℃에서 가열하였고, 하룻밤 동안 교반 하고, 그런 다음 냉각 및 농축하였다. DCM/MeOH 그래디언트 수율 4-(비스(2-(테트라디카노일옥시)에틸)아미노)-N-(2-하이드로식에틸)N-N-디메틸-4-옥소부탄-1-아미늄 브로마이드(4-(bis(2-(tetradecanoyloxy)ethyl)amino)-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-4-oxobutan-1-aminium bromide)(140 mg)로 실리카 젤 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. LCMS ESI+: m/z 684.4 (M + H).
Example 7: 4 -( 비스(2-올레오일옥시)에틸 )아미노-N-(2- 하이드로옥시에틸 )-N,N-디메틸-4-옥소부탄-1-아미늄 브로마이드(4-( bis(2-(oleoyloxy)ethyl) amino)-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-4-oxobutan-1-aminium bromide)(HE-Pr-DODC)
Figure 112018119950312-pat00049
[ 0227] 중간 1의 준비:(Z)-((4-(디메틸아미노)부탄오일)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜)디오레이트((Z)-((4-(dimethylamino)butanoyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl)dioleate)
Figure 112018119950312-pat00050
(Z)-아제인딜비스(에탄-2,1-딜)디올레이트 TFA염의 합성에 대하여 상기에 설명하였다. DCM(5 mL)에 (Z)-아제인딜비스(에탄-2,1-딜)디올레이트 TFA염(1.00 g, 1.58 mmol)을 희석하였고 DCM (5 mL)에 4-(디메틸아미노)부티릭산(butyric acid) HCl 염(317 mg, 1.89 mmol), HATU(719 mg, 1.89 mmol) 및 DIEA(606 uL, 3.48 mmol)의 예비-활성된 혼합물을 첨가하였다. 플라스크는 아르곤으로 씻어내었고 반응 혼합물을 하룻 밤 동안 상온에서 교반하고, 그런 다음 농축하였다. DCM/MeOH 그래디언트 수율(Z)- ( (4-(디메틸아미노)부탄오일) 아제인딜 ) 비스(에탄-2,1-딜)디오레이트((Z)-((4-(dimethylamino)butanoyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl)dioleate)은 실리카 젤 크로마토그래피에 의하여 정제하였다.
HE-Pr-DODC의 준비:(4-(비스(2-(올렐옥시)에틸)아미노)-N-(2-하이드로시에틸)-N,N-디메틸-4-옥소부탄-1-아미늄 브로마이드(4-(bis(2-(oleoyloxy)ethyl)amino)-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-4-oxobutan-1-aminium bromide)
*
Figure 112018119950312-pat00051
밀폐된 시스템(sealed system)에서, ACN (5 mL)에 ((4-디메틸아미노)부타노일)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜)디테트라디케노에이트((4-(dimethylamino)butanoyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl)ditetradecanoate)(400 mg, 0.535 mmol) 용해하고 2-브로모에탄올(500 uL)을 첨가하였다. 반응 관(reaction vessel)은 불활성 가스로 씻어내고, 그런 다음, 밀폐하였다. 혼합물은 80에서 가열하였고, 하룻밤 동안 교반 하고, 그런 다음 농축하였다. DCM/MeOH 그래디언트 수율 (4-(비스(2-(올렐옥시)에틸)아미노)-N-(2-하이드로시에틸)-N,N-디메틸-4-옥소부탄-1-아미늄 브로마이드(4-(bis(2-(oleoyloxy)ethyl)amino)-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-4-oxobutan-1-aminium bromide)(255 mg)은 실리카 젤 크로마토그래피에 의하여 정제하였다.LCMS ESI+: m/z 792.5 (M + H).
실시예 8: 2 -( 비스(2-(오레오일옥시)에틸)아미노 )- N,N - 비스 (2- 하이드로실에틸 )-N-메틸-2-옥소데탄아미늄 브로마이드(2-( bis(2-(oleoyloxy)ethyl) amino)- N,N -bis(2-hydroxyethyl)-N-methyl-2-oxoethanaminium bromide) (HE2DODC)
Figure 112018119950312-pat00052
중간 1의 준비:(Z)-((2-브로모아세틸)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜)디올레이드( (Z)-((2-bromoacetyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl) dioleate)
Figure 112018119950312-pat00053
(Z)-아제인딜비스(에탄-2,1-딜)디올레이트 TFA염의 합성에 대하여 상기에 설명하였다. DCM (20mL)에 (Z)-아제인딜비스(에탄-2,1-딜)디올레이트 염(1.50 g, 2.34 mmol)을 용해하고 아이스-배스(ice-bath)에 집어넣었다. 트리에틸아민(triethylamine)(685 uL, 4.91 mmol)에 따라 브로모아세틸 브로마이드(Bromoacetyl bromide)(214 uL, 2.46 mmol) 첨가하였다. 아이스-배스를 제거하고 반응은 불화성 가스하에 실온에서 하룻밤 동안 교반 시켰고, 그런 다음 DCM 100 mL DCM로 희석, 및 1M HCl(75 mL), H2O(75 mL), 포화된 NaHCO3 용액(75 mL) 및 포화된 브라인 용액(75 mL)으로 세척하였다. 모든 수용액은 DCM(25 mL) 으로 추출하였다. MgSO4로 유기물(organics)을 건조하고, 진공하에 여과 및 농축을 하였다. 에틸 아세테이트 수율(Z)-((2-브로모아세틸)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜)디올레이드(Z)-((2-bromoacetyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl) dioleate)(1.22 g)은 실리카 젤 크로마토그레피에 의하여 정제하였다.
HE2DODC의 준비: 2-(비스(2-(오레오일옥시)에틸)아미노)-N,N-비스(2-하이드로옥시에틸)-N-메틸-2-옥소에탄아미늄 브로마이드(2-(bis(2-(oleoyloxy)ethyl)amino)-N,N-bis(2-hydroxyethyl)-N-methyl-2-oxoethanaminium bromide)
Figure 112018119950312-pat00054
밀폐된 시스템(sealed system)에서, (Z)-((2-브로모아세틸)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜)디올레이트(2.08 g, 2.75 mmol)에 N-메틸디에틸아민(1.58 mL, 13.8 mmol) 첨가하여 결합하였다. 반응 관은 불화성 가스로 씻어내었고 그런 다음 밀폐하였다. 반응은 50℃로 가열하고 하룻 밤 동안 교반하고, 및 그런 다음 농축하였다. DCM/MeOH 그래디언트 수율(2-(비스(2-(오레오일옥시)에틸)아미노)-N,N-비스(2-하이드로옥시에틸)-N-메틸-2-옥소에탄아미늄 브로마이드(2-(bis(2-(oleoyloxy)ethyl)amino)-N,N-bis(2-hydroxyethyl)-N-methyl-2-oxoethanaminium bromide)(479 mg)는 실리카 젤 크로마토그레피에 의하여 정제하였다. LCMS ESI+: m/z 793.7 (M + H).
실시예 9: 2 -( 비스(2-((9Z,12Z)-옥타에 카-9,12- 디에노일옥시 )에틸)아미노)-N-(2-하이드로옥시에틸)-N,N-디메틸-2-옥소데탄아미늄 브로마이드(2-(bis(2-((9Z,12Z)-℃tadeca-9,12-dienoyloxy)ethyl)amino)-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-2-oxoethanaminium bromide)(HEDC-DLin)
Figure 112018119950312-pat00055
2-(비스(2-((9Z,12Z)-옥타에카-9,12-디에노일옥시)에틸)아미노)-N-(2-하이드로옥시에틸)-N,N-디메틸-2-옥소데탄아미늄 브로마이드는 미리스토일 클로라이드로 (9Z,12Z)-옥타디카-9,12-디에노일 클로라이드의 치환과 HEDC 유사한 방식으로 준비하였다.
실시예 10: 2(비스(2-(도디카노일옥시)에틸)아미노)-N-(2-하이드로에틸)-N,N-디메틸-2-옥소에탄아미늄 브로마이드(2-( bis(2-(dodecanoyloxy) ethyl)amino)-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-2-oxoethanaminium bromide)(HEDC-12)
Figure 112018119950312-pat00056
2(비스(2-(도디카노일옥시)에틸)아미노)-N-(2-하이드로에틸)-N,N-디메틸-2-옥소에탄아미늄 브로마이드(2-(bis(2-(dodecanoyloxy)ethyl)amino)-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-2-oxoethanaminium bromide는 미리스토일 클로라이드(myristoyl chloride)에 대한 도디카노일(dodecanoyl) 클로라이드 치환과 HEDC 유사한 방식으로 준비하였다.
실시예 11: 2 -((2- 비스(2-(테트라디카노일옥시)에틸)아미노 )-2- 옥소에딜 ) 티오 )-N-(2-하이드로옥시에틸)-N,N-디메틸 에탄아미늄 브로마이드(2-((2-(bis(2-(tetradecanoyloxy)ethyl)amino)-2-oxoethyl)thio)-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethylethanaminium bromide)(HES104)
Figure 112018119950312-pat00057
중간 1의 준비: ((2-((2-(디메틸아미노)에틸)티오)아세틸)아제일딜)비스(에탄-2,1-딜)디테트라디카노에이트(((2-((2-(dimethylamino)ethyl)thio)acetyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl) ditetradecanoate)(S104)
Figure 112018119950312-pat00058
아제인딜비스(에탄-2,1-딜)디테트라디카노에이트 TFA 염의 합성에 대하여 상기에 설명하였다. 아제인딜비스(에탄-2,1-딜)디테트라디카노에이트 TFA 염(152 g, 238 mmol)은 DCM(2.3 L) 및 10% 탄산수소칼륨(potassium bicarbonate)(1.15 L)와 0-5℃에서 교반하였다. 유기상은 분리되었고 수상(aqueous phase)은 DCM(1.15 L)로 추출하였다. 결합된 유기상은 황산 마그네슘 수화물(magnesium sulfate hydrate)(236 g)과 0-5℃에서 30분 동안 교반하고, DCM(1.15 L)으로 여과 및 세척하였다. 2-((2-(디메틸아미노)에틸)티오)아세틱산 하이드로클로라이드(2-((2-(dimethylamino)ethyl)thio)acetic acid hydr℃hloride)(57.0 g, 285 mmol), EDC 하이드로클로라이드(68.4 g, 357 mmol) 및 DMAP (2.91 g, 23.8 mmol)을 첨가하여 결합 여과 하고, 및 상온에서 하룻 밤 동안 교반하여 현탁(suspension) 하고, 그런 다음 현탁액은 시간이 지나면서 깨끗한 용액을 형성하였다. MQ-물(2.3 L) 및 메탄올(460 mL)을 첨가 및 그런 다음 10 분의 시간동안 교반함으로써 유기상은 분리되었다. DCM(575 mL)md로 혼탁한 수상(turbid aqueous phase)(pH 3.0)을 추출하였다. 결합된 유기는 하이드로클로라이드 염과 같은 원료(crude material)의 143 g 농도 수율로 추출하였다. 원료(142.6g)는 증류플라스크에 DCM (500mL), 및 에틸 아세테이트(1 L)를 첨가하여 변화시켰다. 용액은 대기 압력(atmospheric pressure)에서 증류를 가열하고, 및 76℃의 잔류물의 온도를 얻기 위하여 70분 동안 증류를 계속적으로 가열하였다. 에틸 아세테이트(800 mL), 및 에탄올(70 mL)을 첨가하여 1.4 L의 총 전체 부피를 수득하였다. 50℃에서 37℃로 깨끗한 용액을 냉각하고 모결정(Seed crystals)체를 첨가하였다. 37-35℃에서 10분 동안의 기간에 걸쳐 유의적인 결정화의 시작을 관찰하고, 현탄액(suspension)은 0℃에서 하룻 밤 동안 냉각 및 교반 하였고 침전물은 여과를 통하여 분리시키고, 및 차가운 에틸 아세테이트(210 mL)로 세척하였다. 4.5 시간에 걸쳐 오일 펌프 진공 하에 상온에서 일정 중량으로 건조하여 하이드로클로라이드 염과 같은 재결정 물질의 134 g, 하얀 결정체 고체를 제조하였다. 제삼인산칼륨(Tripotassium phosphate)(85 g, 0.40 mol) 및 디포타슘 인산수소칼륨(dipotassium hydrogen phosphate)(226 g, 1.30 mol)을 정제된 물(1.7 L)에 첨가하고, 및 용액 형태는 pH 10.9로 18-20℃에서 냉각하였다. DCM (1.3 L) 및 재결정체 S104 염산염(hydrochloride)(133 g, 0.188 mol)을 첨가, 및 혼합물을 10분 동안 교반 하였다. 깨끗한 유리상은 적당한 속도(35분의 기간 동안)에서 분리되고, 및 혼탁한 수상은 DCM (650 mL)으로 추출하였다. 결합된 유기상은 무수 황산 마그네슘(anhydrous magnesium sulfate)(65 g)으로 40분의 기간 동안 교반하고, 및 혼합물을 교반, DCM(200 mL)으로 세척하였다. 결합된 여과액을 감압(20 mBar 아래로, 이 압력이 1시간 동안 계속적으로 증발) 하에 50℃ 물 배스에서 증발하였다. 추가적으로, 기름 펌프 진공(oil pump vacuum)에서 15-20℃ 물 배스로 증발하고, 부분적으로 응고된 기름 126 g이 결과이다. -20℃ 배스에서 냉각하여 완전히 응고 시키고, 및 그런 다음 -20℃ 기름 펌프 진공하에 건조시키고, 본 발명자들은 ((2-((2-디메틸아미노)에틸)티오)아세틸)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜)디테트라디케노에이트(((2-((2-(dimethylamino)ethyl)thio)acetyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl) ditetradecanoate)(S104)의 126g을 수득하였다. HPLC은 98.1% 순도(purity)를 나타내었다.
HES104의 준비: 2-((2-비스(2-(테트라디케노일옥시)에틸)아미노)-2-옥소에틸)티오)-N-(2-하이드로옥시에틸)-N,N-디메틸에탄아미늄 브로마이드(2-((2-(bis(2-(tetradecanoyloxy)ethyl)amino)-2-oxoethyl)thio)-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethylethanaminium bromide)
Figure 112018119950312-pat00059
밀폐된 시스템, ((2-((2-(디메틸아미노)에틸)티오)아세틸)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜)디테트라디케노에이트((2-((2-(dimethylamino)ethyl)thio)acetyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl)ditetradecanoate)(1.00 g, 1.49 mmol)에 2-브로모에탄(687 uL, 9.69 mmol)을 첨가하여 결합하였다. 반응관은 불화성 가스로 깨끗이 씻어내고 그런다음 밀폐하였다. 반응은 75℃로 가열하고 하룻밤동안 가열하고, 그런 다음 냉각하고, 진공하에 농축하였다. DCM/MeOH 그래디언트 수율은 2-((2-비스(2-(테트라디케노일옥시)에틸)아미노)-2-옥소에틸)티오)-N-(2-하이드로옥시에틸)-N,N-디메틸에탄아미늄 브로마이드(2-((2-(bis(2-(tetradecanoyloxy)ethyl)amino)-2-oxoethyl)thio)-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethylethanaminium bromide)(HES104)(790 mg)로 실리카 젤 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. LCMS ESI+: m/z 715.7 (M + H).
실시예 12: 2 -((2-( 비스(2-(오레오일옥시)에틸)아미노 )-2- 옥소에틸 ) 티오 )-N-(2-하이드로옥시에틸)-N,N-디메틸에탄아미늄 브로마이드(2-((2-(bis(2-(oleoyloxy)ethyl)amino)-2-oxoethyl)thio)-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethylethanaminium bromide)(HES104-DO)
Figure 112018119950312-pat00060
중간 1의 제조: (Z)-((2-((2-(디메틸아미노)에틸)티오)아세틸)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜)디올레이트(Z)-((2-((2-(dimethylamino)ethyl)thio)acetyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl) dioleate
상기에서 (Z)-아제인딜비스(에탄-2,1-딜) 디올레이트 TFA 염의 합성에 대해서 설명하였다. DCM(60 mL)에 (Z)-아제인딜비스(에탄-2,1-딜) 디올레이트 TFA 염(4.06 g, 6.41 mmol)과 10% K2CO3(30 mL)를 0-5℃에서 교반 하였다. 30분 후, 유기층은 분리되었고 수용층은 DCM(30 mL)으로 추출하였다. 결합된 유기층은 0-5℃에서 30분 동안의 기간으로 무수 MgSO4와 교반, 여과, 및 DCM(30 mL)으로 세척하였다. 결합된 여과물에 2-((2-(디메틸아미노)에틸)티오)아세틱산(1.26 g, 7.70 mmol), EDC HCl 염(1.84 g, 9.62 mmol), DMAP(78.3 mg, 0.64 mmol)을 첨가하였다. 얇은 현탄액은 하룻밤 동안 상온에서 교반하고; 교반 후 시간의 기간 동안, 용액은 깨끗하게 변하였다. 그 다음날, 탈이온수(deionized water)(60 mL) 및 메탄올(30 mL)을 첨가하였다. 그런 다음 10분 동안 교반하고, 깨끗한 유기층을 분리하였다. 혼탁된 수성 층은 DCM으로 추출하였다. 결합된 유기 추출물을 농축하였다. 원료는 실리카의 플러그를 통해 여과하고 및 DCM(40 mL)에 흡수하고 PBS(pH=11, 50 mL)을 첨가하였다. 혼합물은 10분 동안 상온에서 교반하였다. 그런 다음, 유기층은 분리되었고 수성층은 또 다시 DCM(15 mL)으로 추출하였다. 결합된 유기층은 무수 MgSO4 으로 30분의 기간 동안 교반하였다. 혼합물을 그 다음에 여과하고, 및 DCM으로 세척하였다. 결합된 여과액은 징공하에 2-((2-(비스(2-(오레오일옥시)에틸)아미노)-2-옥소에틸)티오)-N-(2-하이드로옥시에틸)-N,N-디메틸에탄아미늄 브로마이드(2-((2-(bis(2-(oleoyloxy)ethyl)amino)-2-oxoethyl)thio)-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethylethanaminium bromide)(324 mg) 수율로 농축하였다.
HES104-DO의 준비
Figure 112018119950312-pat00061
밀폐 시스템에서, (Z)-((2-(디메틸아미노)에틸)티오)아세틸)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜) 디오레이트(540mg, 0.693mmol)을 2-브로모에탄올(319uL, 4.50)을 첨가하여 결합하였다. 반응관은 불화성 가스로 깨끗이 씻어내었고 그런다음 밀폐하였다. 반응은 75℃ 로 가열하고 하룻 밤동안 교반하도록 하였다. 그 다음날, 진공하에 냉각 및 농축하였다. DCM/MeOH 그래디언트 수율 2-((2-비스(2-(오레오일옥시)에틸)아미노)-2-옥소에틸)티오)-N-(2-하이드로옥시에틸)-N,N-디메틸에탄아미늄 브로마이드(2-((2-(bis(2-(oleoyloxy)ethyl)amino)-2-oxoethyl)thio)-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethylethanaminium bromide(324mg)로 실리카 젤 크로마토그래피에 의하여 정제하였다.
LCMS ESI+: m/z 823.8 (M + H).
실시예 13: 2 -(( 비스(-2(오레오일옥시)에틸)카보닐 ) 티오 )-N-(2- 하이드로옥시에틸 )-N,N-디메틸에탄-아미늄 브로마이드(2-(( bis(2-(oleoyloxy)ethyl) carbamoyl)thio)-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethylethan-aminium bromide)(HETU104-DO)
Figure 112018119950312-pat00062
중간 1의 방법: (Z)-(((2-(디메틸아미노)에틸)티오)카보닐)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜)디올레이트((Z)-((((2-(dimethylamino)ethyl)thio)carbonyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl) dioleate)
Figure 112018119950312-pat00063
상기에서 (Z)-(털트-부톡시카보닐)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜)디올레이트의 합성에 대하여 설명하였다. DCM(20mL)에서 (Z)-(털트-부톡시카보닐)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜)디올레이트(4.2 g, 5.72 mmol)을 용해하고 아이스 바스(ice bath)에서 0℃ 로 냉각하였다. TFA(20mL)를 첨가하고 혼합물을 20분 동안 불활성 가TM로 뒤덮 일 때 교반하도록 하였다. 그런 다음 진공하에 혼합물을 농축하였다. 잔류물 10% K2CO3(20 mL) 및 DCM(20 mL) 사이에서 분배하였다. 혼합물을 아이스 배스에서 20분 동안 교반하였다. 유기 부분(Organic portion)을 채취하고, 및 혼탁한 수용 층은 DCM(2 x 10 mL)으로 추출하였다. 결합된 유기 추출물에 무수 MgSO4를 첨가하고 20분 동안 0℃ 에서 교반하였다. 현탄액은 여과하고 DCM(10 mL)으로 세척하였다. 디포스겐(Diphosgene)(1.38 mL, 11.4 mmol)을 DCM에 존재하는 (Z)-아제인딜비스(에탄-2,1-딜)디올레이트 원료에 첨가하고 불화성 가스로 뒤덮인 하에 상온에서 교반하였다. 그 다음날, DCM 및 초과된 디포스겐을 진공하에 제거하였다. 2-(디메틸아미노)에탄 티올 HCl 염(4.05 g, 28.6 mmol)은 DCM(50 mL) 및 트리에틸아민(5.2 mL, 37.2 mmol)을 흡수하고 (Z)-((클로로카보닐)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜)디올에이트 잔류물을 첨가하였다. 그 다음날, DCM으로 희석하고 0.3M HCl(75 mL), 물(75 mL) 및 10% K2CO3 (75mL)로 세척하였다. 추출된 모든 수성(aqueous)은 DCM (25mL)과 세척하였다. 유기물(organic)은 무수 MgSO4로 건조, 여과, 및 진공하에서 농축하였다. DCM/MeOH 그래디언트 수율 (Z)-(((2-(디메틸아미노)에틸)티오)카보닐)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜)디올레이트((Z)-((((2-(dimethylamino)ethyl)thio)carbonyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl)dioleate)(1.90 g)은 실리카 젤 크로마토그래피에의하여 정제하였다.
HETU104DO의 준비
Figure 112018119950312-pat00064
밀페된 시스템에서, (Z)-(((2-(디메틸아미노)에틸)티오)카보닐)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜)디오레이트(615 mg, 0.804 mmol)에 2-브로모에탄올(370 uL, 5.22 mmol)을 첨가하여 결합하였다. 반응관은 불화성 가스로 깨끗이 씻어내고, 그런 다음 밀폐하였다. 반응은 75℃에서 가열하고 하룻 밤 동안 교반하도록 허용하고, 그런 다음 냉각 및 진공하에 농축하였다. DCM/MeOH 그래디언트 수율 2-((비스(2-(오레오일옥시)에틸)카바모일)티오)-N-(2-하이드로시에틸)-N,N-디메틸에탄마이늄 브로마이드(2-((bis(2-(oleoyloxy)ethyl)carbamoyl)thio)-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethylethanaminium bromide)(473 mg)은 실리카 젤 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. LCMS ESI+: m/z 809.8 (M + H).
실시예 14: Dope-Glu-VA의 합성
(Z)-(2R)-3-(((2-(5-(((2E,4E,6E,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸시크로엑스-1-엔-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔-1-일)옥시)-5-옥소펜탄아미도)에톡시)(하이드로시)포스포릴)옥시)프로판-1,2-ELF 디올에이트((Z)-(2R)-3-(((2-(5-(((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraen-1-yl)oxy)-5-oxopentanamido)ethoxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)propane-1,2-diyl dioleate)(DOPE-Glu-VA)
Figure 112018119950312-pat00065
중간 1의 준비:
(5-(((2E,4E,6E,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸시크로엑스-1-엔-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔-1-일)옥시)-옥소펜타노익산(5(5-(((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraen-1-yl)oxy)-5-oxopentanoic acid)
Figure 112018119950312-pat00066
디클로로메탄(5 mL)에 존재하에 무수물(Glutaric anhydride)(220 mg, 1.93 mmol) 및 레틴올(500 mg, 1.75 mmol)을 엠버-칼라드 바이얼(amber-colored vial)에서 용해하였다. 트리에틸아민(Triethylamine)(513 ul, 3.68 mmol)을 첨가하고 아르곤으로 바이알을 깨끗이 세척하였다. 반응 혼합물은 4시간동안 상온에서 교반하도록 하였다. 물질은 농축되고 디클로로메탄/메탄올 그래디언트로 실리카 젤 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. 분획물은 모으고(pooled) 황색 오일(700 mg)을 농축하여 수득하였다. 생성물은 NMR에 의하여 확인되었다.
DOPE- Glu -VA의 준비: (Z)-(2R)-3-(((2-5-(((2E,4E,6E,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸시크로헥스-1-엔-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔-1-일)옥시)-5-옥소펜탄아미도)에톡시)(하이드로시)포스포릴)옥시)프로판-1,2-ELF 디올에이트((Z)-(2R)-3-(((2-(5-(((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraen-1-yl)oxy)-5-oxopentanamido)ethoxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)propane-1,2-diyl dioleate)
Figure 112018119950312-pat00067
클로로폼/DMF(10 mL, 1:1 mixture)에서 1,2-디오레오일-sn-글리세로-3포스포에탄올아민(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)(500 mg, 0.672 mmol), N,N,N’,N’-테트라메틸-O-( 7-아자펜조스리아졸-1-일)우로늄 헥사플로로포스페이트(N,N,N’,N’-Tetramethyl-O-(7-azabenzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate)(306.5mg, 0.806 mmol) 및 5-(((2E,4E,6E,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔-1-일)옥시)-5-옥소펜타노익산(269 mg, 0.672 mmol)(5-(((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nona-
2,4,6,8-tetraen-1-yl)oxy)-5-oxopentanoic acid)(269 mg, 0.672 mmol)을 용해하고 엠버-컬러드 바이알(amber-colored vial)에 아르곤으로 깨끗이 씻어내고 N,N-다이아이소프로필에틸렌아민(N,N-Diisopropylethylamine)(300 uL,1.68mmol)을 첨가하였다. 반은 혼합물은 상온에서 하룻밤 동안 교반하도록 하였다. 반응 혼합물은 농축 및 그런 다음 디클로메탄/메탄올 그래디언트를 사용하여 실리카 젤 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. 분획물을 모으고 황색 오일(460 mg, 61%) 수율로 농축하였다. 생성물은 NMR에 의하여 확인되었다. 1HNMR(400MHz),δH:8.6(d,1H),8.27(d,1H),6.57-6.61(dd,1H),6.08-6.25(m,4H),5.57(t,1H),5.30-5.34(m,4H),5.18(m,1H),4.68-4.70(d,2H),4.28-4.35(m,1H),4.05-4.15(m,1H),3.81-3.97(m,4H),3.52-3.62(m,1H),3.35-3.45(m,2H),2.95-3.05(m,1H),2.33-2.35(t,3H),2.2-2.3(m,7H),1.9-2.05(m,17H),1.85(s,3H),1.69(s,3H),1.5-1.65(m,6H),1.4-1.5(m,2H),1.18-1.38(m,~40H),1.01(s,3H),0.84-0.88(m,12H).
실시예 15: DOPE-Glu-NH-VA
(Z)-(2R)-3-(((2-(4-((2E,4E,6E,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노나-2,4,6,8-테트라에나미도)부탄아미노)에톡시)(하이드록시)포스포릴)옥시)프로판-1,2-딜 디올에이트((Z)-(2R)-3-(((2-(4-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenamido)butanamido)ethoxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)propane-1,2-diyl dioleate) (DOPE-Glu-NH-VA)의 준비
Figure 112018119950312-pat00068
중간 1의 준비: (Z)-(2R)-3-(((2-(4-아미노부탄아미도)에톡시)하이드록시)포스포릴)옥시)프로판-1,2-딜 디올에이트((Z)-(2R)-3-(((2-(4-aminobutanamido)ethoxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)propane-1,2-diyl dioleate)
Figure 112018119950312-pat00069
DMF/클로로폼(25 mL, 1:1 mixture)에서 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)(2500 mg, 3.36 mmol), BOC-GABA-OH (751 mg, 3.70 mmol) 및 N,N,N,N-테트라메틸-O-(7-아자벤조트리마졸-1-yl)우로늄 헥사플로로포스페이트(1531 mg, 4.03 mmol)를 용해하였다. N,N-다이아이소프로필에틸렌아민(880 uL,5.05mmol)을 첨가 하고 비어있는 파곤(fargon)하에 혼합물을 하룻밤 동안 상온에서 교반할 수 있도록 하였다. 반응 혼합물을 ~200 mL H2O에 희석하고 생성물을 디클로로메탄(3x100ml)으로 추출하였다. 생성물을 ~75 mL pH 4.0 PBS 버퍼로 세척하고, 유기물은 황산나트륨(sodium sulfate)으로 건조하고, 여과 및 농축하였다. 물질을 그런 다음 디클로메탄/메탄올(dichloromethane/methanol gradient)과 실리카 젤 크로마토그래피에 의하여 정제하고, 및 옅은 기름색(colorless oil (2.01 g, 64%) 수율로 농축하였다. 생성물은 NMR로 확인하였다. 물질을 그런 다음 2 M HCl/디에틸 에테르(HCl/diethyl ether)의 30 mL에서 흡수하였다. H2O 배스(H2O bath)에서 상온으로 반응이 일어날 수 있게 하였다. 2 시간 후, 용액은 (Z)-(2R)-3-(((2-(4-아미노부탄아미도)에톡시)하이드록시)포스포릴)옥시)프로판-1,2-딜 디올에이트((Z)-(2R)-3-(((2-(4-aminobutanamido)ethoxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)propane-1,2-diyl dioleate) 수율로 농축하였다.
DOPE-Glu-NH-VA의 준비: (Z)-(2R)-3-(((2-(4-((2E,4E,6E,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-일)노나-2,4,6,8-테트라엔아미도)부탄아미도)에톡시)(하이드록시)포스포릴)옥시)프로판-1,2-딜 디올레이트((Z)-(2R)-3-(((2-(4-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenamido)butanamido)ethoxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)propane-1,2-diyl dioleate)
Figure 112018119950312-pat00070
DMF/클로로폼(10 mL, 1:1 mixture)에서 (Z)-(2R)-3-(((2-(4-아미노부탄아미도)에톡시)(하이드록시)포스포릴)옥시)프로판-1,2-딜 디올레이트( (Z)-(2R)-3-(((2-(4-aminobutanamido)ethoxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)propane-1,2-diyl dioleate) (1200 mg, 1.45 mmol), 레티노익 산(retinoic acid)(500 mg, 1.66 mmol) 및 N,N,N,N-테트라메틸-O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플로로포스페이트(N,N,N,N’-Tetramethyl-O-(7-azabenzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate)(689 mg, 1.81 mmol)는 뜨는 미립자다. N,N-다이스로필에틸아민(N,N-Diisopropylethylamine)(758 uL,4.35mmol)을 첨가하였다. 플라스크 아래 밑바닥을 아르곤으로 깨끗이 씻어내고 알루미늄 호일(aluminum foil)로 감쌌다(covered). 반응 혼합물은 상온에서 4시간 동안 교반하고, 디클로로메탄(dichloromethane) (75 mL) 및 H2O(75mL)으로 분리하고, 디클로로 메탄으로 추출하여, 황산소다(sodiumsulfate)로 건조하고, 여과 및 농축하였다. 디클로로메탄/메탄올 그래디언트 수율 (Z)-(2R)-3-(((2-(4-((2E,4E,6E,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔아미도)부탄아미도)엑소(하이드록시)포스포릴)옥시)프로판-1,2-ELF 디올에이트(292 mg, 18%)로 사용하여 실리카 젤 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. 생성물 특성(characterized)은 LCMS & NMR에 의하여 나타내었다. 1HNMR(400MHz),dH: 8.55 (s, 1H), 8.2 (d, 1H), 7.3 (s, 1H), 6.6 (dd, 1H), 6.10-6.27 (m, 5H), 5.5 (t, 1H), 5.31 (s, 4H), 5.1-5.2 (m, 2H), 4.68 (d, 2H), 4.3 (d, 2H), 4.1 (m, 2H), 3.9 (m, 8H), 3.58 (q, 4H), 3.4 (s, 4H), 3.0 (q, 4H), 2.33-2.35 (t, 3H), 2.2-2.3 (m, 7H), 1.9-2.05 (m, 17H), 1.85 (s, 3H), 1.69 (s, 3H), 1.5-1.65 (m, 6H), 1.4-1.5 (m, 2H), 1.18-1.38 (m, ~40H), 1.01 (s, 3H), 0.84-0.88 (m, 12H) . MS: m/z1112.44(M+H+).
실시예 16: DSPE-PEG550-VA
(2R)-3-(((((45E,47E,49E,51E)-46,50-디메틸-4,44-디옥소-52-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-도데카옥사-3,43-디아자도펜타콘타-45,47,49,51-테트라엔-1-일)옥시)하이드록시)포스포릴)옥시)프로판-1,2-딜 디스테아레이트( (2R)-3-(((((45E,47E,49E,51E)-46,50-dimethyl-4,44-dioxo-52-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-dodecaoxa-3,43-diazadopentaconta-45,47,49,51-tetraen-1-yl)oxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)propane-1,2-diyl distearate)(DSPE-PEG550-VA)
Figure 112018119950312-pat00071
중간 1의 준비: (2R)-3-((((2,2-디메틸-4,44-다이옥소-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-트리디카옥사-5,45-다이아자헵테이테트라콘탄-47-일)옥시)(하이드로옥시)포스포릴)옥시)프로판-1,2-딜 디스테아레이트( (2R)-3-((((2,2-dimethyl-4,44-dioxo-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-tridecaoxa-5,45-diazaheptatetracontan-47-yl)oxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)propane-1,2-diyl distearate)
Figure 112018119950312-pat00072
클로로폼/메탄올/H2O(6mL,65:35:8)존재 하에 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)(200 mg, 0.267 mmol),t-BOC-N-amido-dPEG12-acid(211 mg,0.294 mmol)및 N,N,N,N-테트라에틸-O-(7-아카벤조트리아졸-1-일)우로니윰 헥사플로로포스-페이트(N,N,N’,N’-Tetramethyl-O-(7-azabenzotriazol-1-yl)uroniumhexafluorophos-phate )(122 mg, 0.320 mmol)을 용해하고 20 mL 양성자 바이얼(scintillation vial)을 아르곤을 깨끗이 씻어냈다. N,N-다이소프로필에틸아민(N,N-Diisopropylethylamine)(116 uL,0.668 mmol)을 첨가하였다. 반응은 4시간 동안 25℃에서 교반하고 농축하였다. 물질을 그런 다음, 디클로로메탄/메탄올 그래디언트를 기름과(252 mg, 65%) 같은 (2R)-3-((((2,2-디메틸-4,44-다이옥소-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-트리디카옥사-5,45-다이아자헵테이테트라콘탄-47-일)옥시)(하이드로옥시)포스포릴)옥시)프로판-1,2-딜 디스테아레이트((2R)-3-((((2,2-dimethyl-4,44-dioxo-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-tridecaoxa-5,45-diazaheptatetracontan-47-yl)oxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)propane-1,2-diyl distearate) 수율로 실리카 젤 크로마토그래피를 통하여 정제하였다.
DSPE-PEG550-VA의 준비:(2R)-3-(((((45E,47E,49E,51E)-46,50-디메틸-4,44-다이옥소-52-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-도데카옥사-3,43-다이마자도펜타콘타-45,47,49,51-테트라엔-1-일)옥시)하이드록시)포스포릴)옥시)프로판-1,2-딜 디스테아레이트( (2R)-3-(((((45E,47E,49E,51E)-46,50-dimethyl-4,44-dioxo-52-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-dodecaoxa-3,43-diazadopentaconta-45,47,49,51-tetraen-1-yl)oxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)propane-1,2-diyl distearate)
Figure 112018119950312-pat00073
디에틸에테르(diethyl ether)(5 mL)에서 2R)-3-((((2,2-디메틸-4,44-다이옥소-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-트리데카옥사-5,45-디아자헵테트라콘탄-47-일)옥시)(하이드록시)포스포릴)옥시)프로판-1,2-딜 디스테아레이트((2R)-3-((((2,2-dimethyl-4,44-dioxo-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-tridecaoxa-5,45-diazaheptatetracontan-47-yl)oxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)propane-1,2-diyl distearate )(252 mg, 0.174 mmol)을 용해하였다. H2O 배스(H2O bath)안에 넣고 상온하에 반응 시켰다. 2 M HCl/디에틸 에테르(2 M HCl/diethyl ether)(2 mL, 4 mmol)을 첨가하고 반응물을 대략 1시간 동안 교반하도록 하였다. 그 다음에, 진공하에 용매(solvent) 및 초과된 HCl을 제거하였다. 2 mL N,N-디메틸포름아미드에서 현탁된 물질은 아르곤을 사용하여 플라스크 밑바닥 주위를 깨끗이 씻어냈다. 레티노익산(Retinoic acid)(57.5 mg, 0.191 mmol), N,N,N'N'-테트라메틸-O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플로로포스페이트(N,N,N'N'-Tetramethyl-O-(7-azabenzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate)(79 mg, 0.209 mmol) 및 N,N-다이소프로필에틸아민(N,N-Diisopropylethylamine)(106 uL, 0.609 mmol)을 첨가하였다. 물질이 완전히 용해 되지 않았으므로 클로로폼/메탄올/H2O(1mL,65:35:8v:v:vmixture) 더 첨가하여 반응 균질(reaction homogeneous)을 수득할 수 있도록 하였다. 3.5 시간 후, 반응 혼합물을 농축하였다. 물질을 그런 다음 디클로로메탄/메탄올 그래디언트로 고체 선해(tan solid)(210 mg, 74%)와 같은 (2R)-3-(((((45E,47E,49E,51E)-46,50-디메틸-4,44-다이옥소-52-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-도데카옥사-3,43-다이마자도펜타콘타-45,47,49,51-테트라엔-1-일)옥시)하이드록시)포스포릴)옥시)프로판-1,2-딜 디스테아레이트 ((2R)-3-(((((45E,47E,49E,51E)-46,50-dimethyl-4,44-dioxo-52-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-dodecaoxa-3,43-diazadopentaconta-45,47,49,51-tetraen-1-yl)oxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)propane-1,2-diyl distearate) 수율로 실리카 젤 크로마토 그래피를 통하여 정제하였다. 물질은 NMR & LCMS에 의하여 확인하였다. 1HNMR(400MHz),dH: 8.6 (s, 1H), 8.25 (d, 1H), 6.8-6.9 (dd, 1H), 6.3-6.4 (m, 1H), 6.12-6.25 (dd, 5H), 5.71 (s, 1H), 5.18 (m, 2H), 4.33 (dd, 2H), 4.13 (m, 2H), 3.95 (m, 2H), 3.74 (m, 8H), 3.63 (s, ~48H), 3.0 (q, 2H), 2.5 (t, 3H), 2.35 (s, 3H), 2.25 (t, 8H), 1.97 (m, 7H), 1.7 (3, 3H), 1.5 (m, 2H), 1.36 (m, 12H), 1.23 (m, ~56H), 1.01 (s, 6H), 0.86 (t, 12H). MS: m /z1630.28(M+H+).
실시예 17: DSPE-PEG2000-Glu-VA
DSPE-PEG2000-Glu-VA의 준비
Figure 112018119950312-pat00074
중간 1의 준비: 5-(((2E,4E,6E,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔-1-일)옥시)-5-옥소펜타노익 산(5-(((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraen-1-yl)oxy)-5-oxopentanoic acid)
Figure 112018119950312-pat00075
엠버-컬러드 바이알(amber-colored vial)안에 존재하는 디클로로메탄(3 mL)에서 무수물(Glutaric anhydride)(115 mg, 1.01 mmol) 및 레티놀(240 mg, 0.838 mmol)을 용해시켰다. 트리에틸아민(Triethylamine)(257 ul, 1.84 mmol)을 첨가하고 아르곤으로 바이알을 깨끗이 씻어내었다. 반응은 하룻밤 동안 상온에서 교반하도록 하였다. 반응 혼합물은 농축하고 디클로로메탄/메탄올 그래디언트로 황색 기름(yellowish oil)(700 mg, 78%)과 같은 5-(((2E,4E,6E,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔-1-일)옥시)-5-옥소펜타노익 산(5-(((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraen-1-yl)oxy)-5-oxopentanoic acid) 수율을 실리카 젤 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. 물질 특성은 NMR에 의하여 확인하였다.
DSPE-PEG2000-Glu-VA의 준비
Figure 112018119950312-pat00076
엠버-칼라드 섬광 바이얼(scintillation vial)존재하에 있는 N,N-디메틸포름아미드(N,N-dimethylformamide)(2mL)에서 5-(((2E,4E,6E,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이크로헥스-1-엔-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔-1-일)옥시)-5-옥소펜타노익 산(5-(((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraen-1-yl)oxy)-5-oxopentanoic acid(43 mg, 0.108 mmol), DSPE-PEG2000-NH2(250mg,0.090mmol) 및 N,N,N,N-테트라메틸-O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)우리늄 헥사플로로포스페이트(N,N,N’,N’-tetramethyl-O-(7-azabenzotriazol-1-yl)uroniumhexafluorophosphate)(45 mg,0.117 mmol) 용해하고 아르곤 가스로 깨끗이 씻어 내었다. N,N-다이소프로필에틸아민(N,N-diisopropylethylamine)(47 uL,0.270mmol)을 첨가하고 반응은 하룻 밤 동안 상온에서 교반하도록 하고, 그런 다음 디클로로메탄/메탄올 그래디언트로 황색 기름(59mg,20.7%) 수율로 실리카 젤 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 물질은 NMR에 의하여 확인하였다. 1HNMR(400MHz),δH: 706 (m, 1H), 6.59-6.66 (dd, 1H), 6.06-6.30 (m 5H), 5.56-5.60 (t, 1H), 5.17-5.23 (m, 2H), 4.35-4.42 (dd, 2H), 4.12-4.25 (m, 5H), 3.96-3.97 (m, 6H), 3.79-3.81 (t, 1H), 3.66 (m, ~180H), 3.51-3.58 (m, 2H), 3.4-3.48 (m, 4H), 3.3-3.38 (m, 2H), 2.25-2.45 (m, 14H), 1.5-2.0 (m, 15H), 1.23-1.32 (m, ~56H), 1.01 (s, 3H), 0.85-0.88 (t, 12H).
실시예 18: DOPE-Gly 3 -VA
Z)-(2R)-3-(((((14E,16E,18E,20E)-15,19-디메틸-4,7,10,13-테트라옥소-21-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-일)-3,6,9,12-테트라아자헤니코사-14,16,18,20-테트라엔-1-일)옥스)(하이드록시)포스포릴)옥시)프로판-1,2-ELF 디올레이트((Z)-(2R)-3-(((((14E,16E,18E,20E)-15,19-dimethyl-4,7,10,13-tetraoxo-21-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)-3,6,9,12-tetraazahenicosa-14,16,18,20-tetraen-1-yl)oxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)propane-1,2-diyl dioleate)(DOPE-Gly3-VA)의 준비
Figure 112018119950312-pat00077
중간 1의 준비: (Z)-(2R)-3-(((2-(2-(2-(2-아미노아세트아미도)아세트아미도)아세트아미도)에톡시)(하이드록시)포스포릴)옥시)프로판-1,2-ELF 디올레이트 ((Z)-(2R)-3-(((2-(2-(2-(2-aminoacetamido)acetamido)acetamido)ethoxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)propane-1,2-diyl dioleate)
Figure 112018119950312-pat00078
DMF(5 mL)에서 BOC-Gly-Gly-Gly-OH(382 mg, 1.34 mmol) 및 N,N,N,N-테트라메틸-O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플로로포스페이트(N,N,N,N-Tetramethyl-O-(7-azabenzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate)(532 mg, 1.4 mmol)을 용해하였다. N,N-다이프로필에틸아민(488 uL, 2.8 mmol)을 첨가하고 혼합물을 10-15분 동안 상온에서 교반하도록 하였다. 그런 다음, 클로로폼(chloroform)(5 mL)에서 1,2-디올레오일-sn-그리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)(833 mg, 1.12 mmol)의 용액을 첨가하고 반응관을 아르곤으로 깨끗이 씻어냈다. 16시간 후, 상온에서, 반응 혼합물을 농축하고 디클로로메탄(50 mL) 및 H2O(50 mL)사이에서 분리하고, 디클로로메탄(dichloromethane)(3x50mL)으로 추출하고 황산소다로 건조하고 여과 및 농축하였다. 물질은 디클로로메탄/메탄올(dichloromethane/methanol) 그래디언트로 색깔이 옅은 기름 잔류 수율로 사용하여 실리카 젤 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. 이에, 2 M HCl/디에틸 에테르(HCl/Diethyl Ether)(5 mL)을 첨가하고 반응 혼합물을 약 2시간 동안 H2O 배스(H2O bath)에서 교반하도록 하였다. 반응 혼합물을 농축하고 잔여물을 디클로로메탄(dichloromethane)(75 mL)으로 흡수한다음, 포화된 탄산수소 나트륨 용액(saturated sodium bicarbonate solution)(75 mL)으로 세척하고, 디클로로메탄(3 x 75 mL)으로 생성물을 추출하고, 황산나트륨(sodium bicarbonate)(75 mL)으로 건조하고, 반 고체(semi-solid)(765 mg, 90%)와 같은(Z)-(2R)-3-(((2-(2-(2-(2-아미노아세트아미도)아세트아미도)아세트아미도)에톡시)(하이드록시)포스포릴)옥시)프로판-1,2-ELF 디올레이트 ((Z)-(2R)-3-(((2-(2-(2-(2-aminoacetamido)acetamido)acetamido)ethoxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)propane-1,2-diyl dioleate) 수율로 여과 및 농축하였다. NMR에 의하여 확인하였다.
DOPE-Gly3-VA의 준비: (Z)-(2R)-3-(((((14E,16E,18E,20E)-15,19-디메틸-4,7,10,13-테트라옥소-21-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)-3,6,9,12-테트라아카헤니코사-14,16,18,20-테트라엔-1-일)옥시)(하이드록시)포스프로필)옥시)프로판-1,2-딜 디올레이트((Z)-(2R)-3-(((((14E,16E,18E,20E)-15,19-dimethyl-4,7,10,13-tetraoxo-21-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)-3,6,9,12-tetraazahenicosa-14,16,18,20-tetraen-1-yl)oxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)propane-1,2-diyl dioleate)
Figure 112018119950312-pat00079
N,N-디메틸포름아미드(N,N-Dimethylformamide)(5 mL)에서 (Z)-(2R)-3-(((2-(2-(2-(2-아미노아세트아미도)아세트아미도)아세트아미도)에톡시)(하이드록시)포스프로필)오깃)프로판-1,2-딜 디올레이트((Z)-(2R)-3-(((2-(2-(2-(2-aminoacetamido)acetamido)acetamido)ethoxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)propane-1,2-diyl dioleate)(765 mg, 0.836 mmol), 레티노익 산(retinoic acid)(301 mg, 1.00 mmol), 및 N,N,N,N-테트라메틸-O-(7-아카벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플로로포스페이트(N,N,N,N’-Tetramethyl-O-(7-azabenzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate)(413 mg, 1.09 mmol) 부유(suspended)하였다. N,N-다이소프로필에틸아민(N,N-Diisopropylethylamine)(437uL,2.51 mmol)을 첨가하고 반응관을 아르곤 가스로 깨끗이 씻어내었다. 물질의 용매화를 돕기위하여 클로로폼(chloroform)(5 mL)을 첨가하였다. 플라스크 밑바닥 주위에 존재하는 반응물질을 상온에서 ~4시간 동안 교반하도록 하고 알루미늄 호일로 덮었다(covered). 물질을 H2O(100mL) 및 디클로로메탄(100mL) 사이에서 분리하였다. 디클로로메탄(dichloromethane)(3 x 100 mL)으로 추출하고, 황산 나트륨으로 건조하고, 여과 및 농축하였다. 물질을 그런 다음 디클로로메탄/메탄올 그래디언트를 사용하여 주황색 기름과 같은(orange oil)(704 mg, 70%) (Z)-(2R)-3-(((((14E,16E,18E,20E)-15,19-디메틸-4,7,10,13-테트라옥소-21-(2,6,6-트리메틸사이클로핵스-1-엔-1-일)3,6,9,12-테트라아카헤니코사-14,16,18,20-테트라엔-1-일)옥시)(하이드록시)포스프로일)옥시)프로판-1,2-딜 디올레이트((Z)-(2R)-3-(((((14E,16E,18E,20E)-15,19-dimethyl-4,7,10,13-tetraoxo-21-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)-3,6,9,12-tetraazahenicosa-14,16,18,20-tetraen-1-yl)oxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)propane-1,2-diyl dioleate) 수율로써 실리카 젤 크로마토 그래피를 통하여 정제하였다. 생성물은 LCMS & NMR으로 확인하였다. 1HNMR(400MHz),δH: 6.90 (t, 1H), 6.21 (q, 2H), 6.08-6.12 (d, 2H), 5.83 (s, 1H), 5.31 (s, 4H), 5.30 (s, 2H), 4.37 (d, 1H), 4.15 (m, 1H), 3.91 (m, 8H), 3.59 (m, 2H), 3.29 (m, 2H), 3.01 (m, 2H), 2.28 (m, 6H), 1.95-1.98 (m, 12H), 1.44 (s, 3H), 1.5-1.6 (m, 2H), 1.44 (m, 6H), 1.24 (m, ~48H), 1.00 (s, 6H), 0.86 (t, 3H). MS: m/z1198.42(M+H+).
실시예 19: VA-PEG-VA
N1,N19-bis((16E,18E,20E,22E)-17,21-디메틸-15-옥소-23-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)4,7,10-트리옥사-14-아자트리코사-16,18,20,22-테트라엔-1-일)-4,7,10,13,16-펜타옥사노나디케인-1,19-디아미드( N1,N19-bis((16E,18E,20E,22E)-17,21-dimethyl-15-oxo-23-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)-4,7,10-trioxa-14-azatricosa-16,18,20,22-tetraen-1-yl)-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecane-1,19-diamide)(VA-PEG-VA)의 준비
Figure 112018119950312-pat00080
VA-PEG-VA의 준비: N1,N19-bis((16E,18E,20E,22E)-17,21-디메틸-15-oxo-23-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)4,7,10-트리옥사-14-아자트리코사-16,18,20,22-테트라엔-1-일)-4,7,10,13,16-펜타옥사노나디케인-1,19-디아미드 (N1,N19-bis((16E,18E,20E,22E)-17,21-dimethyl-15-oxo-23-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)-4,7,10-trioxa-14-azatricosa-16,18,20,22-tetraen-1-yl)-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecane-1,19-diamide)
Figure 112018119950312-pat00081
N,N-디메틸포름아미드(N,N-dimethylformamide)(10mL)에서 레티노익 산(Retinoic acid)(2913 mg, 9.70 mmol), N,N,N,N-테트라메틸-O-(7-아카벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플로로포스페이트(N,N,N,N’-Tetramethyl-O-(7-azabenzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (3992 mg, 10.50 mmol) 및 디아미도-dPEG11-디아민(diamido-dPEG11-diamine)(3000 mg,4.04 mmol)부유되었다. N,N-다이소프로필에틸아민(N,N-Diisopropylethylamine)(4222 , 24.24 mmol)을 첨가하고 반응관을 아르곤으로 씻어내었다. 플라스크 밑바닥 주위를 알루미늄 호일로 덮은 다음 하룻 밤 동안 상온에서 반응하도록 하였다. 그 다음나, 물질을 에틸 아세테이트(ethyl acetate)(125 mL) 및 물(125 mL)사이에서 분리하였다. 에틸 아세테이트(ethyl acetate)(3x125 mL)로 추출하고, 황산 나트륨으로 건조하고, 여과 및 농축하였다. 물질을 그런 다음 디클로로메탄/메탄올 그래디언트로 실리카 젤 크로마토그래피를 통하여 정제하였다. 분획물을 모으고 황색 기름(yellow oil)(2900 mg, 54.9%) 수율로 농축하였다. 물질은 LCMS & NMR에 의하여 확인하였다. 1HNMR(400MHz),δH: 7.1 (s, 2H), 6.87 (t, 2H), 6.51 (t, 2H), 6.12-6.20 (dd, 8H), 5.66 (s, 2H), 3.6-3.8 (m, ~44H), 3.4 (q, 4H), 3.3 (q, 4H), 2.46 (t, 4H), 2.32 (s, 6H), 1.9-2.05 (m, 10H), 1.7-1.85 (m, 15H), 1.6 (m, 4H), 1.3-1,5 (m, 6H), 1.01 (s, 12H). QTOF MS: m/z1306(M+H+).
실시예 20: VA-PEG2000-VA
(2E,2'E,4E,4'E,6E,6'E,8E,8'E)-N,N'-(3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78,81,84,87,90,93,96,99,102,105,108,111,114,117,120,123,126,129,132,135,138-헥사테트라콘타옥사테트라콘타헥탄-1,140-딜)비스(3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이크로헥스-1-엔-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔아미드( (2E,2'E,4E,4'E,6E,6'E,8E,8'E)-N,N'-(3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78,81,84,87,90,93,96,99,102,105,108,111,114,117,120,123,126,129,132,135,138-hexatetracontaoxatetracontahectane-1,140-diyl)bis(3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenamide))(VA-PEG2000-VA)의 준비
Figure 112018119950312-pat00082
VA- PEG2000 -VA의 준비: 2E,2'E,4E,4'E,6E,6'E,8E,8'E)-N,N'-(3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78,81,84,87,90,93,96, 99,102,105,108,111,114,117,120,123,126,129,132,135,138-헥사테트라콘타옥사테트라콘타헥탄1,140-딜)비스(3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔아미드( (2E,2'E,4E,4'E,6E,6'E,8E,8'E)-N,N'-(3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78,81,84,87,90,93,96, 99,102,105,108,111,114,117,120,123,126,129,132,135,138-hexatetracontaoxatetracontahectane-1,140-diyl)bis(3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenamide))
Figure 112018119950312-pat00083
N,N-디메틸포름아미드(N,N-Dimethylformamide)(3mL)에서 레티노익 산(Retinoic acid)(109 mg, 0.362 mmol), N,N,N,N-테트라메틸-O-(7-아카벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플로로포스페이트(N,N,N,N’-Tetramethyl-O-(7-azabenzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate)(149 mg, 0.392 mmol) 및 아민-PEG2K-아민(amine-PEG2K-amine)(333 mg,0.151 mmol)을 부유하였다. N,N-다이소프로필에틸아민(N,N-Diisopropylethylamine)(158 , 0.906 mmol)을 첨가하고 관을 아르곤으로 깨끗이 씻어내었다. 플라스크 밑바닥 주위를 알루미늄 호일로 덮은 다음 하룻밤 동안 상온에서 반응하도록 교반하였다. 그 다음날, 물질을 에틸 아세테이트(30 mL) 및 물(30 mL) 사이에서 분리하였다. 에틸 아세테이트(3x30 mL)로 추출하고, 황산 나트륨으로 건조시키고, 여과 및 농축하였다. 물질을 그런 다음 디클로로메탄/메탄올 그래디언트로 실리카 젤 크로마토그래피를 통하여 정제하였다. 분획물을 모으고 황색 기름(yellow oil)(97 mg, 23%)과 같은 2E,2'E,4E,4'E,6E,6'E,8E,8'E)-N,N'-(3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78,81,84,87,90,93,96, 99,102,105,108,111,114,117,120,123,126,129,132,135,138-헥사테트라콘타옥사테트라콘타헥탄1,140-딜)비스(3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔아미드( (2E,2'E,4E,4'E,6E,6'E,8E,8'E)-N,N'-(3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78,81,84,87,90,93,96, 99,102,105,108,111,114,117,120,123,126,129,132,135,138-hexatetracontaoxatetracontahectane-1,140-diyl)bis(3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenamide))수율로 농축하였다. 생성물은 LCMS & NMR으로 확인하였다. 1HNMR(400MHz),dH: 6.85-6.92 (t, 2h), 6.20-6.32 (M, 6H), 6.08-6.12 (d, 4H), 5.72 (s, 2H), 3.55-3.70 (m, ~180H), 3.4-3.5 (m, 4H), 2.79 (m, 4H), 2.78 (s, 6H), 2.33 (s, 6H), 2.05 (m, 4H), 1.97 (s, 6H), 1.80 (m, 2H), 1.79 (s, 6H), 1.69 (s, 6H), 1.60 (m, 4H), 1.45 (m, 4H), 1.01 (s, 12H). QTOF MS: m/z2651(M+H+)..
실시예 21: DSPE-PEG2000-VA
Figure 112018119950312-pat00084
DSPE-PEG2000-VA의 준비
Figure 112018119950312-pat00085
N,N-디메틸포름아미드(N,N-Dimethylformamide)에서 DSPE-PEG2000-NH2(250mg,0.090mmol), 레티노익 산(retinoic acid)(33 mg,0.108 mmol) 및 N,N,N,N-테트라메틸-O-(7-아카벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플로로포스페이트(N,N,N’,N’-Tetramethyl-O-(7-azabenzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate)(45mg,0.117mmol)를 용해하였다. N,N-다이소프로필에틸아민(N,N-Diisopropylethylamine)(47 , 0.270 mmol)을 첨가하고 혼합하였다. 엠버 컬러드 섬광 바이얼(amber colored scintillation vial)은 아르곤으로 깨끗이 씻어내고 상온에서 3일 동안 교반하도록 하였다. 물질은 그런 다음 디클로로메탄/메탄올 그래디언트를 하용하여 실리카 젤 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. 분획물을 모으고 황색 기름(yellow oil)(245 mg, 89%)과 같은 DSPE-PEG2000-VA 수율로 농축하였다. 생성물은 NMR에 의하여 확인되었다. 1HNMR(400MHz),δH: 6.86 (dd, 1H), 6.25 (m, 1H), 6.09-6.21 (dd, 4H), 5.71 (s, 1H), 5.1-5.2 (m, 1H), 4.3-4.4 (d, 1H), 4.1-4.2 (m, 3H), 3.85-4.0 (m, 4H), 3.8 (t, 1H), 3.5-3.75 (m, ~180H), 3.4-3.5 (m, 8H), 3.3 (m, 2H), 2.35 (s, 3H), 2.26 (m, 4H), 1.70 (s, 3H), 1.55-1.65 (m, 6H), 1.47 (m, 2H), 1.23 (s, ~60H), 1.01 (s, 6H), 0.85 (t, 6H).
실시예 22: diVA-PEG-diVA, 또한 DiVA”로 알려져 있다.
N1,N19-bis((S,23E,25E,27E,29E)-16-((2E,4E,6E,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이클로-헥스-1엔-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔아미도)-24,28-디메틸-15,22-디옥소-30-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)-4,7,10-트리옥사-14,21-디아자트리아콘타-23,25,27,29-테트라엔-1-일)-4,7,10,13,16-펜타옥사노나디케인-1,19-디아미드(N1,N19-bis((S,23E,25E,27E,29E)-16-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclo-hex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenamido)-24,28-dimethyl-15,22-dioxo-30-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)-4,7,10-trioxa-14,21-diazatriaconta-23,25,27,29-tetraen-1-yl)-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecane-1,19-diamide)(diVA)
Figure 112018119950312-pat00086
중간 1의 준비: 테트라벤질((5S,57S)-6,22,40,56-테트라옥소-11,14,17,25,28,31,34,37, 45,48,51-언데카옥사-7,21,41,55-7,21,41,55-테트라아자헨헥사콘테인-1,5,57,61-테트라일)테트라카바메이트(tetrabenzyl ((5S,57S)-6,22,40,56-tetraoxo-11,14,17,25,28,31,34,37, 45,48,51-undecaoxa-7,21,41,55-tetraazahenhexacontane-1,5,57,61-tetrayl) tetracarbamate), 또한 Z-DiVA-PEG-DiVA-IN으로 알려져 있다.
Figure 112018119950312-pat00087
질소로 몰아내어(purged) 1 L 반응 플라스크를 5 10°C 로 냉각시키고 디클로로메탄(dichloromethane)(300mL), d-PEG-11-diamine(QuantalotEK1-A-1100-010,50.0g,0.067mol),Z-(L)-Lys(Z)-OH(61.5g,0.15mol), 및 HOB 하이드레이트(HOBthydrate)(22.5g,0.15mol)로 채웠다. 4-메틸모르폴링(4-Methylmorpholine)(4-MMP)(15.0 g, 0.15mol)을 부유(suspension)하도록 첨가하고 가벼운 발연 반응(light exothermic reaction)이 관찰되었다. EDC 하이드로클로라이드(43.5 g, 0.23 mol)의 현탄액 및 디클로로메탄(dichloromethane)(150 mL)에 존재하는 4-MMP(20.0 g, 0.20 mol)을 30분의 기간동안 첨가하고, 및 적당한 냉각은 20-23℃의 온도를 유지하기 위해 필요했다. 약간 혼탁한 용액을 상온에서 하룻밤 동안 교반하고, 및 반응의 완성(completion)은 HPLC로 나타내었다. 탈이온수(Deionized water)(300 mL)을 첨가하고 그런 다음 10분 동안 교반하고, 빠르게 상(phase)가 분리되는 것이 관찰되었다. 일부 상을 느리게 분리하는 것과 함께-수성상(aqueous phase)을 디클로로메탄(dichloromethane)(150 mL)으로 추출하였다. 결합된 유기 추출물은 6% 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate)(300 mL)으로 세척하고 황산 마그네슘(magnesium sulphate)(24 g)으로 건조하였다. 원료의 132 g을 만들기 위하여 40-45℃ 물 배스(water bath)안에서 증발하였다. 에틸 아세테이트 존재하에 8% 메탄올에서 원료(131 g)의 용액을 실리카 젤 60(40-63 )안에 가득 채웠고, 에틸 아세테이트에서 8% 메탄올과 함께 가득 채웠다. 컬럼(column)은 에틸 아세테이트(7.5 L)에서 8% 메탄올과 함께 방출하였다. 분획물은 충분히 순수한 물질(5.00-7.25 L)을 포함하여 압력 감소 및 정제된 물질 83.6 g 하에 45℃ 물 배스(water bath)에서 증발시켰다. 디클로로메탄(200 mL)에서 정제된 물질(83.6 g)의 용액을 Dowex 650 C(H+)(200 g)의 컬럼에서 가득채웠고, 디클로로메탄(250 mL)으로 상기 컬럼을 세척하였다. 컬럼은 디클로로메탄(200 mL)과 함께 용출 되었다. 결합된 물질은 황산 마그네슘(magnesium sulphate)(14 g)으로 건조 및 압력을 감소하여 Z-DiVA-PEG-DiVA-IN(77.9 g, HPLC 순수도 94.1%)와 같은 테트라벤질((5S,57S)-6,22,40,56-테트라옥소-11,14,17,25,28,31,34,37, 45,48,51-언데카옥사-7,21,41,55-7,21,41,55-테트라아자헨헥사콘테인-1,5,57,61-테트라일)테트라카바메이트( tetrabenzyl ((5S,57S)-6,22,40,56-tetraoxo-11,14,17,25,28,31,34,37, 45,48,51-undecaoxa-7,21,41,55-tetraazahenhexacontane-1,5,57,61-tetrayl)tetracarbamate)수율로 45°C 워터 배스에서 증발한 분획물을 포함하였다.
중간 2의 준비:
DiVA-PEG-DiVA-IN로 알려져 있는 N1,N19-bis((S)-16,20-디아미노-15-옥소-4,7,10-트리옥사-14-아카이코실)-4,7,10,13,16-펜타옥사노나디케인-1,19-디아미드(N1,N19-bis((S)-16,20-diamino-15-oxo-4,7,10-trioxa-14-azaicosyl)-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecane-1,19-diamide).
Figure 112018119950312-pat00088
1 L 반응 플라스크를 질소로 제거하고 메탄올(600 mL) 및 Z-DiVA-PEG-DiVA-IN(92.9, 60.5 mmol)으로 채웠다. 혼합물을 질소로 용액이 관찰 될 때까지 교반하였다. 촉매제로, 10% Pd/C/50%물(Aldrich, 10 g)을 첨가하였다. 혼합물을 제거하고, 및 그런 다음 압력을 질소에 의해 같게 하였다. 혼합물을 제거하고, 및 그런 다음 압력을 수소에 의해 같게 하였다. 반응 혼합물에 수소의 저 수류(low flow)로 안정이 되었을 때, 교반을 시작하였다. 수소의 수류에서 한 시간 동안 계속 수소화(Hydrogenation)되었다. 시스템을 닫고, 및 ~0.1bar에서 한 시간 동안 계속 수소화 하였다. 혼합물을 제거하고 그런 다음 수소와 함께 ~0.1bar에서 다지 압력을 가하였다. 한 시간 동안 수소화를 한다음, 혼합물을 제거 및 그런 다음 수소와 함께 ~0.1bar에서 다지 압력을 가하였다. 수소하에 교반은 시작 물질이 HPLC에 의해 검출되지 않을 수있는 시간 후에 15시간 동안 계속 하였다. 혼합물을 제거하고, 그런 다음 질소와 동등하게 압력을 가하였다. 혼합물을 제거하고, 그런 다음 질소와 동등하게 압력을 가하였다. 반응 혼합물은 그런 다음 셀라이트 545의 패드에서 여과하였다. 여과 케이크를 메탄올(100 mL)로 세척하였다. 결합된 여과액을 농축하고, 마지막으로 45°C에서 50 mbar 보다 적은 압력을 가하였다. 톨루엔(Toluene)(100 mL)을 첨가하고 생성된 혼합물(resulting mixture)을 다시 45°C에서 40 mbar 보다 적은 압력하에 고체화된 기름과 같은, DiVA-PEG-DiVA-IN로 알려져 있는 N1,N19-bis((S)-16,20-디아미노-15-옥소-4,7,10-트리옥사-14-아카이코실)-4,7,10,13,16-펜타옥사노나디케인-1,19-디아미드(N1,N19-bis((S)-16,20-diamino-15-oxo-4,7,10-trioxa-14-azaicosyl)-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecane-1,19-diamide) 수율로 농축하였다.
DiVA-PEG-DiVA의 준비:
N1,N19-비스((S,23E,25E,27E,29E)-16-((2E,4E,6E,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이크로헥스-1-엔-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔아미도)-24,28-디메틸-15,22-디옥소-30-(2,6,6-트리-메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)-4,7,10-트리옥사-14,21-디아카트리아콘타-23,25,27,29-테트라엔-1-일)-4,7,10,13,16-펜타옥사노나디케인-1,19-디아미드(N1,N19-bis((S,23E,25E,27E,29E)-16-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenamido)-24,28-dimethyl-15,22-dioxo-30-(2,6,6-tri-methylcyclohex-1-en-1-yl)-4,7,10-trioxa-14,21-diazatriaconta-23,25,27,29-tetraen-1-yl)-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecane-1,19-diamide)
Figure 112018119950312-pat00089
A 2 L 반응기(reactor)에 아르곤을 가득 넣고 디클로로메탄(500 mL),DiVA-PEG-DiVA-IN(52.3 g, 52.3 mmol), 레티노익 산(70.6 g, 235 mmol) 및 4-N,N-디메틸아미노피리딘(4-N,N-dimethylaminopyridine)(2.6 g, 21.3 mmol)으로 채웠다. 혼합물을 용해 될때까지(~20분 동안) 아르곤과함께 교반하였다. 10 20°C에서 반응의 온도를 유지하고, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필카보디이미드)(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)(EDCI)(70.6 g, 369 mmol)을 10-15분의 기간동안 비율에 맞게 첨가하였다(첫 번째 30-60분에서 약간의 발열성 반응이 있었다). 반응기를 알루미늄 호일로 감싸고 혼합물을 15-20 시간 동안 18 내지 21°C에서 교반하였다. 부틸레이티드 하이드록시토룰렌(Butylated hydroxytoluene)(BHT)(25 mg)을 첨가하고 반응 혼합물을 그런 다음 반응 혼합물이 아르곤과 공기중에 유지하면서 수성 6% 탄산수소나트륨(sodium hydrogen carbonate)(500 mL)을 부었다. 유기층은 분리되었다. 수성 층을 디클로로메탄(50 mL)으로 세척하였다. 결합된 유기 층을 불화성 공기 및 밝은 빛으로부터 방지(protected) 하에 황산마그네슘(magnesium sulphate)(150 g)으로 건조하였다. 건조 물질은 여과(압력 여과를 선호하였다) 및 필터 케이크는 이클로로메탄(500 mL)으로 세척하였다. 여과물을 35 내지 40℃의 물 배스를 사용하여 압력을 감소시킨 상태에서 증발에 의하여 농축하였다. 기름진 잔류물질은 톨룰렌(toluene)(150 mL)을 첨가하고 210 g의 반고체(semi-solid) 잔류물질 수율로 다시 증발하였다. 이 잔류물을 디클로로메탄(250 mL)에서 용해하고 디클로로메탄(4 L)에서 실리카 젤 60(1.6 kg) 및 0.5% 메탄올로부터 준비된 컬럼에 적용하였다. 컬럼은 티클로로메탄(7.2 L), 디클로로메탄(13 L)에서 3% 메탄올, 디클로로메탄(13 L)에서 5% 메탄올, 디클로로메탄(18 L)에서 10% 메탄올로 용출하였다. 하나 10 L 분획물을 빼내고, 그런 다음 2.5 L 분획물을 빼내었다. 분획물, 밝은 샘플로부터 보호하였고, 아르곤으로 깨끗이 씻어내고 밀봉하였다. 걷어낸 분획물을 TLC(디클로로메탄안에 있는 10% 메탄올, UV)에 의하여 분석하였다. 분획물은 DiVA-PEG-DiVA를 잡고 있었으며 HPLC에 의해 더 분석하였다. 분획물은 < 85% 순수(증발 잔류물의 32g을 주다)하고 실리카 젤 및 용매의 원래 양의 오직 25%를 사용하여, 동일한 방법에서 다시-정제하였다. 35 40°C의 물 바스를 사용하여, 감소된 압력에서 결합 및 증발하여 HPLC에 의해 분획물>85% 순수를 분석하였다. 증발된 잔류물(120 g)을 디클로로메탄(1.5L)에서 다시-용해하고 이온 교환기(ion exchanger) Dowex 650C, H+ (107 g)로부터 준비된 컬럼을 통하여 천천히(약 1시간) 통과하였다. 칼럼은 그런 다음 디클로로메탄(1 L)로 세척하였다. 결합된 용출(3277.4 g)을 잘 혼합하였고 샘플(25 mL, 33.33 g) 을 증발시키고, 마지막으로 상온 및 < 0.1 mBar의 압력으로 0.83 g의 형태로 할 수 있도록 하였다. 상기 도는 고체 물질의 총 양(total amount)이고 따라서 80.8 g(72.5%)의 수율을 계산하였다. 남은 용액의 3.24 kg을 423 g으로 농축하였다. 266 g의 이용액을 시럽 수율로 더 농축하고 그런 다음 abs.에탄올(abs.ethanol)(200 mL)에서 다시 용해하였다. 35 40°C의 물 배스를 사용하여, 감소된 압력에서 증발 시키고, 또한, DiVA-PEG-DiVA로 알려져 있는, 또한 “DiVA”로 알려져 있는, N1,N19-비스((S,23E,25E,27E,29E)-16-((2E,4E,6E,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이크로헥스-1-엔-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔아미도)-24,28-디메틸-15,22-디옥소-30-(2,6,6-트리-메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)-4,7,10-트리옥사-14,21-디아카트리아콘타-23,25,27,29-테트라엔-1-일)-4,7,10,13,16-펜타옥사노나디케인-1,19-디아미드(N1,N19-bis((S,23E,25E,27E,29E)-16-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenamido)-24,28-dimethyl-15,22-dioxo-30-(2,6,6-tri-methylcyclohex-1-en-1-yl)-4,7,10-trioxa-14,21-diazatriaconta-23,25,27,29-tetraen-1-yl)-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecane-1,19-diamide)의 50.8 g을 가지고 있는 94.8 g의 마지막 에탄올 용액 수율로 증발 시켰다. NMR & QTOF에 의해 감별(Characterized)하였다. 1H NMR (400 MHz), δH: 7.07 (t, 2H), 7.01 (t, 2H), 6.87-6.91 (m, 4.0H), 6.20-6.24 (m, 10H), 6.10-6.13 (m, 8H), 5.79 (s, 2H), 5.71 (s, 2H), 4.4 (q, 2H), 3.70 (t, 6H), 3.55-3.65 (m, ~34H), 3.59 (t, 6H), 3.4 (m, 2H), 3.25-3.33 (m, 10H), 3.16 (m, 2H), 2.44 (t, 4H), 2.33 (s, 12H), 1.97-2.01 (m, 12H), 1.96 (s, 6H), 1.7-1.9 (m, 12H), 1.69 (s, 12H), 1.5-1.65 (m, 12H), 1.35-1.5(m, 24H), 1.01 (s, 24H). QTOF MS ESI+: m/z 2128 (M + H+).
실시예 23:DOPE-VA
(Z)-(2R)-3-(((2-((2E,4E,6E,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-일)노나-2,4,6,8-테트라엔아미도)에톡시)(하이트록시)포스프포일)옥시)프로판-1,2-elf 디올레이트((Z)-(2R)-3-(((2-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenamido)ethoxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)propane-1,2-diyl dioleate)(DOPE-VA)
Figure 112018119950312-pat00090
DOPE-VA의 준비:
(Z)-(2R)-3-(((2-((2E,4E,6E,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이크로헥스-1-엔-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔아미도)에톡시)(하이드록시)포스포릴)옥시)프로판-1,2-elf 디올레이트((Z)-(2R)-3-(((2-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenamido)ethoxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)propane-1,2-diyl dioleate)
Figure 112018119950312-pat00091
디에틸 에테르존재 하에 레티노익 산의 용액을 -78°C에서 교반하고, 디에틸아미노(diethylamino)황 불화(sulfur trifluoride (130 μl, 0.90 mmol)의 용액을 차가운 에테르(20 mL)를 주사기를 통하여 첨가하였다. 반응 혼합물을 차가운 배스에서 RJ내고 추가적으로 2시간 동안 계속 교반하였다. 마지막으로, 회전 증발에 의하여 용매를제거하였다. 잔류물은 고체Na2CO3(50 mg)가 존재하는 클로로폼(50 mL)에서 다시 용해 하였다. 이 용액에 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)(600mg, 0.81 mmol)을 첨가하고 반응 혼합물을 추가적으로 24시간 동안 상온에서 교반하였다. 회전 증발에 의하여 용매를 제거하였다. 잔류물은 디클로로메탄/메탄올 그래디언트 (Z)-(2R)-3-(((2-((2E,4E,6E,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이크로헥스-1-엔-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔아미도)에톡시)(하이드록시)포스포릴)옥시)프로판-1,2-딜 디올레이트((Z)-(2R)-3-(((2-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenamido)ethoxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)propane-1,2-diyl dioleate)(240 mg, 28%) 수율로 실리카 젤 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) d 0.87 (t, 6H, CH3), 1.01 (s, 6H, CH3) 1.20-1.40 (m, 40H, CH2), 1.40-1.60 (m, 8H, CH2), 1.70 (s, 3H, CH3-C=C), 1.80-2.10 (m, 8H), 2.32 (m, 4H, CH2C(=O)), 3.50 (m, 2H), 3.92-4.18 (m, 5H), 4.35 (m, 2H), 5.20 (m, 1H, NHC(=O)), 5.31 (m, 4H, CH=CH), 5.80-6.90 (m, 6H, CH=CH).
실시예 24:DC-VA
(((2E,4E,6E,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-일)노나-2,4,6,8-테트라엔오일)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜) 디테트라디케노에이트(DC-VA) (((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenoyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl) ditetradecanoate)(DC-VA)의 준비
Figure 112018119950312-pat00092
DC-VA의 준비:
(((2E,4E,6E,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔오일)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜)디테트라디케노에이트 (((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenoyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl) ditetradecanoate)
Figure 112018119950312-pat00093
디에틸 에테르(25 mL)에서 레티노익 산(600 mg, 2.0 mmol)의 용액을 -78°C에서 교반하고, 차가운 에테르의 5 mL을 황불화(sulfur trifluoride)(0.3 ml, 2.1 mmol)의 용액에 주사기(syringe)를 사용하여 첨가하였다. 반응 혼합물을 차가운 배스에서 꺼내고 추가적으로 상온에서 1시간동안 계속 교반하였다. 회전 증발(rotary evaporation)에 의해 용매를 제거 한 후, 잔류물을 2 고체 Na2CO3(25 mg)가 존재하는 디클로로메탄(20 mL)에서 다시 용해하였다. 이러한 용액에 아제인딜비스(에탄-2,1-딜)디테트라디케노에이트(azanediylbis(ethane-2,1-diyl) ditetradecanoate)(1.05 g, 2.0 mmol)을 첨가하고, 및 추가적으로 반응 혼합물을 24시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄(50mL)으로 희석하고 MgSO4으로 건조하였다. 회전 증발에 의하여 옹매를 제거하였고, 잔액물은 디클로로메탄/메탄올 그래디언트로 (((2E,4E,6E,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔오일)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜)디테트라디케노에이트 (((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenoyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl) ditetradecanoate)(800 mg, 50%) 수율을 실리카 젤 크로마토 그래피에 의해 정제하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) d 0.87 (t, 6H, CH3), 1.02 (s, 6H, CH3) 1.20-1.40 (m, 40H, CH2), 1.40-1.60 (m, 8H, CH2), 1.70 (s, 3H, CH3-C=C), 1.97(s, 3H, CH3-C=C), 2.05 (m, 2H, CH2), 2.15(s, 3H, CH3-C=C), 2.32 (m, 4H, CH 2C(=O)), 3.67 (m, 4H, NCH 2CH2O), 4.15-4.30 (m, 4H, NCH2CH 2O), 5.80-6.90 (m, 6H, CH=CH).
실시예 25: DC-6-VA
((6-((2E,4E,6E,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1엔-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔아미도)헥사노일)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜)디테트라디케노에이트(DC-6-VA)((6-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenamido)hexanoyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl) ditetradecanoate)의 준비
Figure 112018119950312-pat00094
중간 1의 준비:
((6-아미노헥사노일)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜)디테트라디케노에이트 TFA 염((6-aminohexanoyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl) ditetradecanoate TFA salt)
Figure 112018119950312-pat00095
피리딘(pyridine)(40 mL)에서 아제인딜비스(에탄-2,1-딜)디테트라디케노에이트(2.5 g, 4.8 mmol)의 혼합물,BOC-아미노 카프로산(BOC-amino caproic acid )(1.3 g, 5.6 mmol), N,N-디사이클로헥실카르보디이미드( N,N’-dicyclohexylcarbodiimide)(1.3 g, 6.3 mmol) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민(N,N-diisopropylethylamine)(2.6 mL, 0.015 mmol)을 용해하였다. 용액은 60°C에서 하룻밤 동안 교반하였다. 혼합물을 디클로로메탄(50 mL)으로 희석하고 생리 식염수(saline)(3 x 50 mL)으로 세척하였다. 회전 증발에 의하여 농축이 되고 난 후, 잔류물을 트리플루오로아세트산디클로로메탄(trifluoroacetic acid/dichloromethane)(100mL, 1:1)으로 처리하였다. 혼합물을 농축하고 디클로로메탄(50 mL)으로 다시 용해 하고 생리 식염수(3 x 50 mL)으로 세척하였다. 유기층을 분리하고 ((6-아미노헥사노일)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜)디테트라디케노에이트 TFA 염((6-aminohexanoyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl) ditetradecanoate TFA salt)(1.5 g, 33%)수율로 농축하였다.
DC-6-VA의 준비:
((6-((2E,4E,6E,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔아미도))헥사노일)아제인딜)비스(에탄-2-,1-딜) ((6-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenamido)hexanoyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl))
Figure 112018119950312-pat00096
디에틸 에테르(40 mL)에서 레티노익산(retinoic acid)(800 mg, 2.67 mmol)의 용액을 -78°C에서 교반하고, (디에틸아미노) 황 불화(sulfur trifluoride)(0.4 mL, 22.80 mmol)의 용액을 차가운 에테르(7 mL)에서 주사기를 통하여 첨가하였다. 반응 혼합물을 차가운 배스에서 꺼내고 추가적으로 1시간 동안 상온에서 계속 교반하였다. 회전 증발에 의하여 용매를 제거한 후, 잔액물은 고체 Na2CO3 (40 mg)이 존재하는 디클로로메탄(25 ml)에서 다시 용해하였다. 이 용액을 ((6-아미노헥사노일)아제인딜)비스(에탄-2,1-딜)디테트라디케노에이트 TFA 염((6-aminohexanoyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl) ditetradecanoate TFA salt (1.5 g, 1.6 mmol))을 첨가 및 추가적으로 반응 혼합물을 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄(50 mL) 및 건조된 MgSO4으로 희석하였다. 회전 증발에 의하여 용매를 제거한 후, 잔류물을 5% 메탄올/디클로로메탄을 사용하여 컬럼 크로마토 그래피로 ((6-((2E,4E,6E,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔아미도))헥사노일)아제인딜)비스(에탄-2-,1-딜) ((6-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenamido)hexanoyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl))(360 mg, 24%) 수율로 방출하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) d 0.87 (t, 6H, CH3), 1.02 (s, 6H, CH3) 1.20-1.40 (m, 42H, CH2), 1.40-1.60 (m, 12H, CH2), 1.70 (s, 3H, CH3-C=C), 1.97(s, 3H, CH3-C=C), 2.05 (m, 2H, CH2), 2.15(s, 3H, CH3-C=C), 2.32 (m, 6H, CH 2C(=O)), 3.20 (m, 2H, CH 2NHC(=O)), 3.56 (m, 4H, NCH 2CH2O), 4.15-4.30 (m, 4H, NCH2CH 2O), 5.10 (m, 1H), 5.80-6.90 (m, 6H, CH=CH).
실시예 26: satDiVA의 합성
N1,N19-bis((16S)-16-(3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노나아미도)24,28-디메틸-15,22-다이옥스-30-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)-4,7,10-트리옥사-14,21-디아자트리아콘트일)-4,7,10,13,16-펜타옥사노나디케인-1,19-디아미드(satDIVA)(N1,N19-bis((16S)-16-(3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nonanamido)-24,28-dimethyl-15,22-dioxo-30-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)-4,7,10-trioxa-14,21-diazatriacontyl)-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecane-1,19-diamide)(satDIVA)
Figure 112018119950312-pat00097
중간 1의 준비: 3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노난산(3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nonanoic acid)
Figure 112018119950312-pat00098
핵산/IPA(hexanes/IPA)(3:1, 40 mL)에서 모든-트랜스 레티노익산(retinoic acid)(2000 mg, 6.66 mmol)을 초음파(sonication)로 용해하였다. Parr-쉐이커 병(Parr-shaker bottle)안에 존재하는 물질을 불화성 가스로 깨끗이 씻어내었다. 10% Pd/C (200mg)을 첨가하고 관을 다시한번 불화성 가스로 깨끗이 씻어내었다. 물질은 하룻밤 동안 Parr-쉐이커 병(Parr-shaker bottle)안에서 >70 psi 수소 가스와 함께 나두었다. 반응 혼합물을 그런 다음, 셀라이트의 패드를 통해 여과하고 3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노난산(3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nonanoic acid)(2 g) 수율로 농축하였다.
satDIVA의 준비: N1,N19-bis((16S)-16-(3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노난아미도)24,28-디메틸-15,22-디옥소-30-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)-4,7,10-트리옥사-14,21-디아자트리아콘틸)-4,7,10,13,16-펜타옥사노나디케인-1,19-디아미드(N1,N19-bis((16S)-16-(3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nonanamido)-24,28-dimethyl-15,22-dioxo-30-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)-4,7,10-trioxa-14,21-diazatriacontyl)-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecane-1,19-diamide)
Figure 112018119950312-pat00099
N1,N19-비스((16S)-16-(3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노난아미도)-24,28-디메틸-15,22-디옥소-30-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)-4,7,10-트리옥사-14,21-디아카트리아콘트일)-4,7,10,13,16-펜타옥사노나디케인-1,19-디아미드, 본 발명에 설명되어 있는 N1,N19-bis((S)-16,20-eal도-15-옥소-4,7,10-트리옥사-14-아카이코실)-4,7,10,13,16-펜타옥사노나디케인-1,19-디아미드(N1,N19-bis((S)-16,20-diamino-15-oxo-4,7,10-trioxa-14-azaicosyl)-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecane-1,19-diamide)와 모든-트랜스 레티오닉 산에 대한 3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노난오익산(3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nonanoic acid)의 대체로 부터 satDIVA로 알려져 있는, diva-PEG-diVA와 유사한 방식으로 제조되었다.QTOF MS ESI+: m/z 2161, 2163, 2165 & 2167 (M + H+)
실시예 27: simDiVA의 합성
N1,N19-비스((S)-15,22-디옥소-30-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)-16-(9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노나아미도)-4,7,10-트리옥사-14,21-디아카트리아콘트릴)-4,7,10,13,16-펜타옥사노나디케인-1,19-디아미드(simDiVA)(N1,N19-bis((S)-15,22-dioxo-30-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)-16-(9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nonanamido)-4,7,10-trioxa-14,21-diazatriacontyl)-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecane-1,19-diamide)(simDiVA).
Figure 112018119950312-pat00100
중간 1의 준비: 2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일 트리플로로메탄설포네이트(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl trifluoromethanesulfonate)
Figure 112018119950312-pat00101
건조 THF에서 2,2,6-트리메틸사이클로헥사논(2,2,6-trimethylcyclohexanone)의 용액을 -78 °C에서 질소하에서 2 M 리튬(lithium) 다이소프로필아미드 용액을 적하(drop wise)하였다. 혼합물을 -78 °C에서 3시간 동안 교반하였다. THF에서 N-페닐-비스(트리플로로메탄설포네이트)(N-phenyl-bis(trifluoromethanesulfonimide))의 용액을 적하(-78 °C에서)하여 첨가하였다. 반응 플라스크를 건조-아이스에서 포장하고 하룻밤 동안 교반하였다. 모든 물질이 용해될 때까지 그 시간 하에서 상온에서 3시간 동안 계속 교반하였다. 반응 물질을 농축하고 잔류물질에 강한 교반하(vigorous stirring)에 천천히 헥산(hexane)(350 mL)을 첨가하였다. 여과물을 농축하고 헥산(150 mL)을 더 첨가하였다. 고체 원료를 여과에 의하여 제거하고 여과물을 농축하였다. 침전물을 다시 한 번 반복하고 난 후 이것의 잔류물을 색깔이 옅은 기름(23.2 g, 60% 수율)과 같은 2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일 트리플로로메탄설포네이트(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl trifluoromethanesulfonate)로 가져다 주는 플래쉬 크로마토그래피(flash chromatography)(실리카, 헥산)(silica, hexane)에 의해 정제하였다.
중간 2의 준비: 에틸-9-(브로모진시오)노난오에이트(ethyl 9-(bromozincio)nonanoate)
Figure 112018119950312-pat00102
건조된 반응 튜브를 질소 하에 아연 먼지(zinc dust)(3.70 g, 56.6 mmol), 아이오딘(iodine)(479 mg, 1.89 mmol) 및 건조 DMA(20 mL)으로 채웠다. 혼합물을 아이오딘의 색이 사라질(disappeared) 때까지 상온에서 교반하였다. 에틸 9-브로모노나노에이트를 첨가, 및 혼합물을 4시간 동안 80 °C에서 그런 다음 하룻밤 동안 상온에서 교반하였다. (아연 삽입의 완전한 반응은 가수분회된 반응 혼합물의 GCMS 분석에 의하여 확인하였다.) 반응 혼합물을 다음 단계에서 추가의 처리 없이 사용하였다.GCMS m/z 186 [M]+ (에틸 노난오에이트)(ethyl nonanoate).
중간 3의 준비: 에틸 9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노난오에이트(ethyl 9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nonanoate)
Figure 112018119950312-pat00103
디메틸아세트아미드에서 에틸 9-(브로모진시오)노난오에이트(37.7 mmol)를 반응 튜브(reaction tube)에서 질소 하에 준비하여 2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일 트리플로로메탄설포네이트(10.8 g, 39.6 mmol)를 테트라키스(트리페킬포스핀)파라듐(tetrakis(triphenylphosphine)palladium)(0)(872 mg, 0.754 mmol) 뒤이어 첨가하였다. 튜브를 밀봉하고 혼합물을 2시간 동안 95 °C에서 교반하였다. 반응 혼합물을 냉각하도록 허용하고 그런 다음 디에틸 에테르(100 mL)를 부었다. 상층(upper layer)을 붓고 하층은 디에틸 에테르(2 x 25 mL)로 두 번 세척하였다. 결합된 에테르 층을 NH4Cl 및 브라인(brine)으로 세척하고, (MgSO4)로 건조 및 원료 물질(~12 g)로 가져다 줄 수 있게 농축하였다. 원료는 플래쉬 크로마토그래피(실리카, 0 내지1.5% EtOAcin 헥산)에 의해 정제하였다. 수득된 기름은 이외의 생성물(side-product), 에틸 노난오에이트의 모든 것을 제거하기 위하여, 8시간 동안 진공 하에 교반하고, 그런 다음 두 번째 플래시 크로마토그래피(실리카, 헥산에 존재하는 0 내지 15% 토룰렌)에 의해 정제하였다. 분획물은 LCMS 및 GCMS에 의해 분석하였다. 순수한 분획물을 수집 및 색깔이 옅은 기름(두가지 이상의 단계로 산출된 6.16 g, 53%)과 같은 에틸9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노난오에이트(ethyl 9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nonanoate)로 갖게할 수 있도록 25 °C 아래 온도에서 농축하였다. LCMS ESI+ m/z 309 [M+H]+; GCMS m/z 308 [M]+.
중간 4의 준비: 9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노난오익산(9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nonanoic acid)
Figure 112018119950312-pat00104
에탄올(80 mL)에서 에틸 9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노난오에이트(9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nonanoate)(13.2 g, 42.9 mmol)에 4 M KOH(43 mL) 첨가하였다. 혼합물을 1.5시간 동안 상온에서 교반하였다. 물(350 mL)을 첨가하고 용액을 tert-부틸 메틸 에테르(tert-butyl methyl ether)(2 x 100 mL)로 세퍽하였다. SimVA , 수성 층을 차갑게 하고, 4 M HCl(~45 mL)로 산화 하고 펜탄(pentane )(100 mL)으로 추출하였다. 결합된 펜탄 추출물을 물(200 mL)로 세척하고, (MgSO4)로 건조하고, 여과하고, 고 진공 하에 농축 및 건조하였다. 펜탄(100 mL)에서 물질을 다시 용해하고, 색깔이 옅은 기름(11.1 g, 92% 수율)과 같은 9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노난오익산 (9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nonanoic acid)으로 가질 수 있도록 다시 한 번 고 진공 하에서 농축 및 건조하였다. MS ESI- m/z 279 [M-H]-.
simdiVA의 준비: N1,N19-비스((S)-15,22-디옥소-30-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)-16-(9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노난아미도)-4,7,10-트리옥사-14,21-디아카트리아콘틸)-4,7,10,13,16-펜타옥사노난디케인-1,19-디아미드(N1,N19-bis((S)-15,22-dioxo-30-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)-16-(9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nonanamido)-4,7,10-trioxa-14,21-diazatriacontyl)-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecane-1,19-diamide).
Figure 112018119950312-pat00105
simDIVA는 본 명세서에 설명된 N1,N19-비스((S)-16,20-디아미노-15-옥소4,7,10-트리옥사-14-아카이코실)-4,7,10,13,16-펜타옥사노나디케인-1,19-디아미드와 모든-트랜스 레티노익 산 9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노난오익 산(9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nonanoic acid)의 대체로부터 유사한 방식으로 제조하였다. QTOF MS ESI+: m/z 2050 (M + H+)
실시예 28: DiVA-PEG18의 합성
(2E,2'E,2''E,4E,4'E,4''E,6E,6'E,6''E,8E,8'E,8''E)-N,N',N''-((5R,69R,76E,78E,80E,82E)-77,81-디메틸-6,68,75-트리옥소-83-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)-10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64-노나디캐옥사-7,67,74-트리아자트리옥타콘타-76,78,80,82-테트라엔-1,5,69-트릴)트리스(3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔아미드)(DIVA-PEG18)(2E,2'E,2''E,4E,4'E,4''E,6E,6'E,6''E,8E,8'E,8''E)-N,N',N''-((5R,69R,76E,78E,80E,82E)-77,81-dimethyl-6,68,75-trioxo-83-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)-10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64-nonadecaoxa-7,67,74-triazatriotaconta-76,78,80,82-tetraene-1,5,69-triyl)tris(3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenamide) (DIVA-PEG18)의 준비
Figure 112018119950312-pat00106
(2E,2'E,2''E,4E,4'E,4''E,6E,6'E,6''E,8E,8'E,8''E)-N,N',N''-((5R,69R,76E,78E,80E,82E)-77,81-디메틸-6,68,75-트리옥소-83-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)-10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64-노나디캐옥사-7,67,74-트리아자트리옥타콘타-76,78,80,82-테트라엔-1,5,69-트릴)트리스(3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔아미드)((2E,2'E,2''E,4E,4'E,4''E,6E,6'E,6''E,8E,8'E,8''E)-N,N',N''-((5R,69R,76E,78E,80E,82E)-77,81-dimethyl-6,68,75-trioxo-83-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)-10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52, 55,58,61,64-nonadecaoxa-7,67,74-triazatrioctaconta-76,78,80,82-tetraene-1,5,69-triyl)tris(3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenamide)), 또한 DIVA-PEG18로 알려져 있는 유사한 방식으로 diVA와 같은 디아미도-dPEG11-디아민(diamido-dPEG11-diamine) PEG18 디아민의 대체로 준비하였다. LCMS ESI+: m/z 2305 (M + Na).
실시예 29: TriVA의 합성
TriVA의 준비
Figure 112018119950312-pat00107
중간 1의 준비: (S)-메틸 6-(((벤질옥시)카보닐)아미노)-2-((S)-2,6-비스(((벤질옥시)카보닐)아미노)헥산아미도)) 헥사노에이트((S)-methyl 6-(((benzyloxy)carbonyl)amino)-2-((S)-2,6-bis(((benzyloxy) carbonyl)amino)hexanamido) hexanoate)
Figure 112018119950312-pat00108
플라스크를 불화성 가스로 제거하고 디클로로메탄(dichloromethane)(50 mL)에서 H-Lys(Z)-OMe HCl 염(4g, 12.1 mmol), HOBt 하이드레이트(HOBt hydrate)(1.84 g, 13.6 mmol), Z-Lys(Z)-OH(5.64g, 13.6 mmol)가 부유(suspended)하였다. NMM(1.5mL, 13.6 mmol)를 현탄액(suspension)에 첨가하고 용액은 깨끗해 졌다. 디클로로메탄에서 현탄액 EDC HCl 염(4.01g, 20.9 mmol) 및 NMM(2.0 mL, 18.2 mmol)을 10분의 기간동안 첨가하였다. 반응물을 하룻밤 동안 상온에서 교반하고, 그런 다음 1M HCl(100 mL), H2O(100 mL), 포화된 중탄산염 용액(bicarbonate solution)(100 mL) 및 포화된 브라인 용액(brine solution)(100 mL)으로 세척하였다. 모든 수성은 디클로로메탄(50 mL)으로 다시 추출한 것으로 세척하였다. 건조된 유기는 Na2SO4, 여과 및 농축하였다. 물질을 디클로로메탄/메탄올 그래디언트 (S)-메틸 6-(((벤질옥시)카보닐)아미노)-2-((S)-2,6-비스(((벤질옥시)카보닐)아미노)헥산아미도)) 헥사노에이트((S)-methyl 6-(((benzyloxy)carbonyl)amino)-2-((S)-2,6-bis(((benzyloxy) carbonyl)amino)hexanamido) hexanoate)(6.91g) 수율로 실리카 젤 크로마토그래피에 의하여 정제하였다.
중간 2의 준비: (S)-6-(((벤질옥시)카보닐)아미노)-2-((S)-2,6-비스(((벤킬옥시)카보닐)아미노)헥사노아미도)헥산오익 산((S)-6-(((benzyloxy)carbonyl)amino)-2-((S)-2,6-bis(((benzyloxy)carbonyl) amino)hexanamido)hexanoic acid)
Figure 112018119950312-pat00109
6-(((벤질옥시)카보닐)아미노)-2-((S)-2,6-비스(((벤질옥시)카보닐)아미노)헥산아미도)헥사노에이트6-(((benzyloxy)carbonyl)amino)-2-((S)-2,6-bis(((benzyloxy)carbonyl)amino)hexanamido) hexanoate)(6.91g, 10 mmol)을 메탄올(50mL)과 함께 용해하였다. KOH(2.24g, 40 mmol) 첨가 및 35℃에서 혼합할 수 있도록 교반하였다. 2시간 후, H2O(200mL) 첨가에 의해 퀀치 반응(quenched reaction) 및 디에틸 에테르(50mL)와 혼합물을 세척하였다. 그런 다음, 1M HCl 산으로 pH를 ~2로 조절하였다. 추출된 물질을 디클로로메탄(3 x 100mL), Na2SO4로 건조, 여과 및 (S)-6-(((벤질옥시)카보닐)아미노)-2-((S)-2,6-비스(((벤질옥시)카보닐)아미노)헥산아미도)헥산오익산((S)-6-(((benzyloxy)carbonyl)amino)-2-((S)-2,6-bis(((benzyloxy)carbonyl)amino)hexanamido)hexanoic acid)(4g) 수율로 농축하였다.
* 중간3의 준비: (Cbz)6-보호된N1,N19-비스((16S,19S)-19,23-디아미노-16-(4-아미노부틸)-15,18-디옥소-4,7,10-트리옥사-14,17-디아자트리코실)-4,7,10,13,16-펜타옥사노나디케인-1,19-디아미드((Cbz)6-protected N1,N19-bis((16S,19S)-19,23-diamino-16-(4-aminobutyl)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14,17-diazatricosyl)-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecane-1,19-diamide)
Figure 112018119950312-pat00110
불화성 가스로 플라스크 밑바닥 주변을 제거하고 디클로로메탄(25 mL)에서 디아미도-dPEG11-디아민(diamido-dPEG11-diamine)(1g, 1.35mmol), S)-6-(((벤질옥시)카보닐)아미노)-2-((S)-2,6-비스(((벤질옥시)카보닐)아미노)헥산아미도)헥사노익산((S)-6-(((benzyloxy)carbonyl)amino)-2-((S)-2,6-bis(((benzyloxy)carbonyl)amino)hexanamido)hexanoic acid (2.05 g, 3.03 mmol)), HOBt 하이드레이트(HOBt hydrate)(409 mg, 3.03mmol)으로 부유하였다. NMM(333 uL, 3.03 mmol)을 현탄액에 첨가하고 용액은 깨끗해 졌다. 디클로로메탄에 현탄액 EDC HCl 염(893 mg, 4.66 mmol) 및 NMM(445 uL, 4.05 mmol)을 10분의 기간동안 첨가하였다. 반응액을 상온에서 하룻밤동안 교반 하도록 하고, 그런 다음 1M HCl(100 mL), H2O(100 mL), 포화된중탄산칼륨 용액(saturated bicarbonate solution)(100 mL) 및 포화된 브라인 용액(saturated brine solution)(100 mL)으로 세척하였다. 디클로로메탄(50 mL)으로 다시 추출된 모든 수용액을 세척하였다. 건조된 유기물과 Na2SO4, 여과하고 추출하였다. 물질은 디클로로메탄/메탄올 그래디언트를 (Cbz)6-보호된N1,N19-비스((16S,19S)-19,23-디아미노-16-(4-아미노부틸)-15,18-디옥소-4,7,10-트리옥사-14,17-디아자트리코실)-4,7,10,13,16-펜타옥사노나디케인-1,19-디아미드((Cbz)6-protected N1,N19-bis((16S,19S)-19,23-diamino-16-(4-aminobutyl)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14,17-diazatricosyl)-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecane-1,19-diamide)(480 mg) 수율로 실리카 젤 크로마토그래피에 의하여 정제하였다.
중간 4의 준비:
N1,N19-비스((16S,19S)-19,23-디아미노-6-(4-아미노부틸)-15,18-디옥소-4,7,10-트리옥사-14,17-디아카트리코실)-4,7,10,13,16-펜타옥사논아데케인-1,19-디아미드(N1,N19-bis((16S,19S)-19,23-diamino-16-(4-aminobutyl)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14,17-diazatricosyl)-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecane-1,19-diamide)
Figure 112018119950312-pat00111
플라스크 밑 바닥 주위에 있는 메탄올(30mL)에서 (Cbz)6-보호된N1,N19-비스((16S,19S)-19,23-디아미노-16-(4-아미노부틸)-15,18-디옥소-4,7,10-트리옥소--14,17-디아카트리코실)-4,7,10,13,16-펜타옥사노나디케인-1,19-디아미드((Cbz)6-protected N1,N19-bis((16S,19S)-19,23-diamino-16-(4-aminobutyl)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14,17-diazatricosyl)-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecane-1,19-diamide) 용해하고 불화성 가스로 깨끗이 씻어 내었다. 10% Pd/C(135mg)를 첨가하고 플라스크를 다시한번 불화성 가스로 씻어내어고 그런 다음 모든 공기를 진공 펌프(vacuum pump)를 통하여 제거하였다. 8" H2 (밸룬)balloon을 첨가하고 반응물이 상온에서 교반할 수 있도록 하였다. 2시간 후, 셀라이트(celite)의 패드를 통하여 여과에 의해 Pd/C를 제거하고 메탄올로 세척하여, 및 N1,N19-비스((16S,19S)-19,23-디아미노-16-(4-아미노부틸)-15,18-디옥소-4,7,10-트리옥사-14,17-디아카트리코실)-4,7,10,13,16-펜타옥사논아데케인-1,19-디아미드(N1,N19-bis((16S,19S)-19,23-diamino-16-(4-aminobutyl)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14,17-diazatricosyl)-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecane-1,19-diamide)(823 mg) 수율로 농축하였다.
TriVA의 준비
Figure 112018119950312-pat00112
디클로로메탄에서 N1,N19-비스((16S,19S)-19,23-디아미노-16-(4-아미노부틸)-15,18-디옥소-4,7,10-트리옥사-14,17-디아카트리코실)-4,7,10,13,16-펜타옥사논아데케인-1,19-디아미드(N1,N19-bis((16S,19S)-19,23-diamino-16-(4-aminobutyl)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14,17-diazatricosyl)-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecane-1,19-diamide)를 교반하고 DMAP 및 레티노익 산(retinoic acid)을 첨가하였다. NMM을 첨가하고 플라스크 밑 주변을 알루미늄 호일로 감싼 다음 용액을 교반하면서 상온에서 불활성 가스로 깨끗이 씻어내었다. 디클로로메탄(20 mL)에서 EDC HCl 염 & NMM 현탄액을 천천히 반응하도록 10분의 기간 동안 첨가하였다. 반응물을 상온에서 하룻밤 동안 교반할 수 있도록 하였다. 그 다음날, 100 mL 디클로로메탄으로 희석하였다. H2O(100 mL), 포화된 중탄산 칼륨 용액(bicarbonate solution)(100 mL) 및 포화된 브라인 용액(brine solution)(100 mL)으로 세척하였다. 모든 수성은 디클로로메탄(50 mL)으로 다시 추출물로 세척하였다. Na2SO4 와 유기물을 건조하고, 여과 및 농축하였다. 물질은 디클로로메탄/에탄올 그래디언트가 TriVA(780 mg) 수율로 보통 아루미나 크로마토그래피에 의하여 정제하였다.LCMS ESI+: m/z 2972 (M + Na).
실시예 30: 4TTNPB의 합성
N1,N19-비스((R)-1,8-디옥소-7-(4-((E)-2-(5,5,8,8-테트라메틸-5,6,7,8-테트라하이드로-나프탈렌-2-일-프로프-1-엔-1-일)벤즈아미도)-1-(4-((E)-2-(5,5,8,8-테트라메틸-5,6,7,8-테트라하이드로나프탈렌-2-yl)프로프-1-엔-1-일)펜일)-13,16,19-트리옥사-2,9-디아카도코산-22-일)-4,7,10,13,16-펜타옥사노나디케인-1,19-디아미드(4TTNPB) (N1,N19-bis((R)-1,8-dioxo-7-(4-((E)-2-(5,5,8,8-tetramethyl-5,6,7,8-tetrahydro-naphthalen-2-yl)prop-1-en-1-yl)benzamido)-1-(4-((E)-2-(5,5,8,8-tetramethyl-5,6,7,8-tetrahydronaphthalen-2-yl)prop-1-en-1-yl)phenyl)-13,16,19-trioxa-2,9-diazadocosan-22-yl)-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecane-1,19-diamide)(4TTNPB)의 준비.
Figure 112018119950312-pat00113
N1,N19-비스((R)-1,8-디옥소-7-(4-((E)-2-(5,5,8,8-테트라메틸-5,6,7,8-테트라하이드로-나프탈렌-2-일-프로프-1-엔-1-일)벤즈아미도)-1-(4-((E)-2-(5,5,8,8-테트라메틸-5,6,7,8-테트라하이드로나프탈렌-2-yl)프로프-1-엔-1-일)펜일)-13,16,19-트리옥사-2,9-디아카도코산-22-일)-4,7,10,13,16-펜타옥사노나디케인-1,19-디아미드(4TTNPB) (N1,N19-bis((R)-1,8-dioxo-7-(4-((E)-2-(5,5,8,8-tetramethyl-5,6,7,8-tetrahydro-naphthalen-2-yl)prop-1-en-1-yl)benzamido)-1-(4-((E)-2-(5,5,8,8-tetramethyl-5,6,7,8-tetrahydronaphthalen-2-yl)prop-1-en-1-yl)phenyl)-13,16,19-trioxa-2,9-diazadocosan-22-yl)-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecane-1,19-diamide), 또한 4TTNPB으로 알려져 있는 것을 모든-트랜스 레티오닉 산(all-trans retinoic acid)에 대한 TTNPB의 대체와 함께 N1,N19-비스((s)-16,20-디아미노-15-옥소-4,7,10-트리옥사-14-아자이코실)-4,7,10,13,16-펜타옥사노나디케인-1,19-디아미드로(N1,N19-bis((S)-16,20-diamino-15-oxo-4,7,10-trioxa-14-azaicosyl)-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecane-1,19-diamide)부터, 또한 diVA로 알려진 N1,N19--비스((S,23E,25E,27E,29E)-16-((2E,4E,6E,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이클로-헥스-1-엔-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔아미도)-24,28-디메틸-15,22-디옥소-30-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)-4,7,10-트리옥사-14,21-디아자트리아콘타-23,25,27,29-테트라엔-1-일)-4,7,10,13,16-펜타옥사노나디케인-1,19-디아미드(N1,N19-bis((R)-1,8-dioxo-7-(4-((E)-2-(5,5,8,8-tetramethyl-5,6,7,8-tetrahydro-naphthalen-2-yl)prop-1-en-1-yl)benzamido)-1-(4-((E)-2-(5,5,8,8-tetramethyl-5,6,7,8-tetrahydronaphthalen-2-yl)prop-1-en-1-yl)phenyl)-13,16,19-trioxa-2,9-diazadocosan-22-yl)-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecane-1,19-diamide) 와 유사한 방식으로 준비하였다.
실시예 31: 4Myr의 합성
N1,N19-비스((R)-15,22-디옥소-16-테트라디캔아미도-4,7,10-트리옥사-14,21-디아자펜타-트리아콘틸)-4,7,10,13,16-펜타옥사노나디케인-1,19-디아미드(4Myr)(N1,N19-bis((R)-15,22-dioxo-16-tetradecanamido-4,7,10-trioxa-14,21-diazapenta-triacontyl)-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecane-1,19-diamide)(4Myr)의 준비
Figure 112018119950312-pat00114
4Myr의 준비: N1,N19-비스((R)-15,22-디옥소-16-테트라디캔아미도-4,7,10-트리옥사-14,21-디아자-펜타-트리아콘틸)-4,7,10,13,16-펜타옥사노나디케인-1,19-디아미드(N1,N19-bis((R)-15,22-dioxo-16-tetradecanamido-4,7,10-trioxa-14,21-diaza-penta-triacontyl)-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecane-1,19-diamide)
Figure 112018119950312-pat00115
디클로로메탄에서 N1,N19-비스((S)-16,20-디아미노-15-옥소-4,7,10-트리옥사-14-아자이코실)-4,7,10,13,16-펜타옥사노나디케인-1,19-디아미드(본 발명에 설명된 방법으로 합성)를 아이스-배스하에서 용해하였다. 미리느토일 클로라이드를 트리에틸아민에 의하여 첨가하였다. 아이스-배스를 제거하고 반응물을 불화성 가스가 뒤덮힌하에 상온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 그 다음날, 100 mL 디클로로메탄으로 희석하고 1M HCl(75 mL), H2O(75mL),포화된 중탄산칼륨 용액(75mL) 및 포화된 브라인 용액(75mL)으로 세척하였다. 모든 수성은 디클로로메탄 (25mL)으로 세척하여 다시 추출하였다. 유기물을 MgSO4으로 건조하고 여과 및 농축하였다. 디크롤로메탄/메탄올 그래디언트가 N1,N19-비스((R)-15,22-디옥소-16-테트라디캔아미도-4,7,10-트리옥사-14,21-디아자-펜타-트리아콘틸)-4,7,10,13,16-펜타옥사노나디케인-1,19-디아미드(N1,N19-bis((R)-15,22-dioxo-16-tetradecanamido-4,7,10-trioxa-14,21-diaza-penta-triacontyl)-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecane-1,19-diamide)(410mg) 수율로 실리카 젤 크로마토그래피에 의해 정제하였다. LCMS ESI+: m/z1841(M+H).
실시예 32: DiVA-242의 합성
N1,N16-비스((R,18E,20E,22E,24E)-11-((2E,4E,6E,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸-사이클로헥스-1-엔-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔아미도)-19,23-디메틸-10,17-디옥소-25-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)-3,6-디옥사-9,16-디아자펜타코사-18,20,22,24-테트라엔-1-일)-4,7,10,13-테트라옥사헥사디케인-1,16-디아미드(N1,N16-bis((R,18E,20E,22E,24E)-11-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethyl-cyclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenamido)-19,23-dimethyl-10,17-dioxo-25-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)-3,6-dioxa-9,16-diazapentacosa-18,20,22,24-tetraen-1-yl)-4,7,10,13-tetraoxahexadecane-1,16-diamide)의 준비, 또한 DIVA-242로 알려져 있다.
Figure 112018119950312-pat00116
중간 1의 준비: 디-털트-부틸(10,25-디옥소-3,6,13,16,19,22,29,32-옥타옥사-9,26-디아자테트라트리아콘탄-1,34-딜)디카바메이트(di-tert-butyl (10,25-dioxo-3,6,13,16,19,22,29,32-octaoxa-9,26-diazatetratriacontane-1,34-diyl)dicarbamate
Figure 112018119950312-pat00117
디클로로메탄(25 mL)을 포함하고 있는 플라스크 밑바닥 주위를 불화성 가스로 제거하고 Bis-dPeg4 산(Bis-dPeg4 acid)(1000mg,3.40mmol),N-BOC-3,6-디옥사-1,8-옥탄디아민(N-BOC-3,6-dioxa-1,8-octanediamine)(1816uL,7.65mmol) 및 HOBt 하이드레이트(HOBt hydrate)(1034mg,7.65mmol)를 첨가하였다. NMM(841 uL, 7.65 mmol)를 현탄액에 첨가하고 용액은 깨끗해졌다. 디클로로메탄(25 mL)에서 EDC HCl 염 NMM (1121 uL, 10.2 mmol)의 현탄액을 DMAP (62 mg, 0.51 mmol)에 의해 첨가하였다. 반응물을 상온에서 하룻밤 동안 교반하도록 하였다. 이 반응 물을 그런 다음 100 mL 디클로로메탄으로 희석하고 H2O(100 mL), 10%K2CO3(100 mL) 및 포화된 브라인 용액(100mL)으로 세척하고, 다시 추출된 모든 수성은 디클로로메탄(30mL)으로 세척하고, MgSO4으로 건조하고, 여과 및 농축하였다. 디클로로메탄/메탄올 그래디언트 수율 디-털트-부틸(10,25-디옥소-3,6,13,16,19,22,29,32-옥타옥사-9,26-디아자테트라트리아콘탄-1,34-딜)디카바메이트(di-tert-butyl (10,25-dioxo-3,6,13,16,19,22,29,32-octaoxa-9,26-diazatetratriacontane-1,34-diyl)dicarbamate (2.57 g)로 실리카 젤 크로마토 그래피에 의해 정제하였다.
중간 2의 준비: N1,N16-비스(2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)-4,7,10,13-테트라옥사헥사-디케인-1,16-디아미드 TFA 염( N1,N16-bis(2-(2-(2-aminoethoxy)ethoxy)ethyl)-4,7,10,13-tetraoxahexa-decane-1,16-diamide TFA salt.
Figure 112018119950312-pat00118
디클로로메탄(15 mL)에서 디-털트-부틸(10,25-디옥소-3,6,13,16,19,22,29,32-옥타옥사-9,26-디아자세트라트리아콘탄-1,34-딜)디카바메이트(di-tert-butyl (10,25-dioxo-3,6,13,16,19,22,29,32-octaoxa-9,26-diazatetratriacontane-1,34-diyl) dicarbamate 를 용해하고 아이스 배스안에 방치하였다. 플라스크 밑바닥 주위를 불활성 가스로 깨끗이 씻어내고 TFA(15 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 20분 동안 교반하도록 하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 N1,N16-비스(2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)-4,7,10,13-테트라옥사헥사-디케인-1,16-디아미드 TFA 염(N1,N16-bis(2-(2-(2-aminoethoxy)ethoxy)ethyl)-4,7,10,13-tetraoxahexa-decane-1,16-diamide TFA salt(1885 mg) 수율로 농축하였다.
DIVA-242의 준비: N1,N16-비스((R,18E,20E,22E,24E)-11-((2E,4E,6E,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔아미도)-19,23-디메틸-10,17-디옥소-25-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)-3,6-디옥사-9,16-디아자펜타코사-18,20,22,24-테트라엔-1-일)-4,7,10,13-테트라옥사헥사디케인-1,16-디아미드( N1,N16-bis((R,18E,20E,22E,24E)-11-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenamido)-19,23-dimethyl-10,17-dioxo-25-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)-3,6-dioxa-9,16-diazapentacosa-18,20,22,24-tetraen-1-yl)-4,7,10,13-tetraoxahexadecane-1,16-diamide)
Figure 112018119950312-pat00119
N1,N16-비스((R,18E,20E,22E,24E)-11-((2E,4E,6E,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔아미도)-19,23-디메틸-10,17-디옥소-25-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)-3,6-디옥사-9,16-디아자펜타코사-18,20,22,24-테트라엔-1-일)-4,7,10,13-테트라옥사헥사디케인-1,16-디아미드( N1,N16-bis((R,18E,20E,22E,24E)-11-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenamido)-19,23-dimethyl-10,17-dioxo-25-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)-3,6-dioxa-9,16-diazapentacosa-18,20,22,24-tetraen-1-yl)-4,7,10,13-tetraoxahexadecane-1,16-diamide)(DIVA-242)는 N1,N16-비스(2-(2-(2-아미노엑톡시)에톡시)에틸)-4,7,10,13-테트라옥사헥사디케인-1,16-디아미드 TFA염(N1,N16-bis(2-(2-(2-aminoethoxy)ethoxy)ethyl)-4,7,10,13-tetraoxahexadecane-1,16-diamide TFA salt)에 diVA와 같은 동일한 방법을 따라 합성하였다. LCMS ESI+: m/z1940(M+H).
Example 33: 핵산-지질 입자의 형성
[ 0335] siRNA는 당업계 프로토콜(formulation protocols)에서 이중 가닥(double stranded)과 21-머 표적화(mer targeting) HSP47/gp46 여기서 HSP47(마우스) 및 gp46(랫트)은 상동체(homologs)- 다른 종에서 동일한 유전자와 관련이 있다:
생채외(in vitro) 분석을 위해 사용한 랫트 HSP47-C 이중가닥 siRNA(rat pHSCs)
센스(Sense)(5'->3') GGACAGGCCUCUACAACUATT(SEQ. ID NO. 2)
안티센스(Antisense)(3'->5') TTCCUGUCCGGAGAUGUUGAU(SEQ. ID NO. 3)
생채외(in vitro) 분석을 위해 사용한 마우스 HSP47-C 이중가닥 siRNA(마우스 CCl4 모델)
센스(Sense)(5'->3') GGACAGGCCUGUACAACUATT (SEQ. ID NO. 4)
안티센스(Antisense)(3'->5') TTCCUGUCCGGACAUGUUGAU (SEQ. ID NO. 5)
양이온성 지질(Cationic Lipid) 저장액(Stock)을 준비하였다. 양이온성 지질의 저장액은 양이온성 지질이 에탄올에서 DOPE, 콜레스테롤, 및 diVA-PEG-diVA이 6.0, 5.1 및 2.4mg/mL 각각의 농도로 결합하여 준비하였다. 용액이 필요한 경우, 약 50°C로 따뜻하게 양이온성 지질을 용액에서 용해하였다.
비어있는 리포솜 준비(Empty Liposome Preparation)
양이온성 지질 저장액을 주입부 포트(injection port) 당1.5 mL/분에서 주사 바늘을 통하여 35-40 °C에서 수용성 혼합물을 빠르게 교반하여 주입하였다. 양이온성 지질 저장액을 수성 용액 비율(v/v) 35:65로 고정하였다. 혼합시, 자발적으로 소포체(vesicles)는 비어있는 형태로 되었다. 소포체 결과물을 에탄올 물질(content) 가 ~ 12%로 감소하기 전에 10분 동안 35-40℃에서 균형을 유지하도록 하였다. 비어있는 소포체는 수용액 버퍼의 10 X 부피(volume)로 에탄올을 제거하는 것에 대하여 정용 여과(diafiltered)하였다.
리포플렉스 준비. 비어있는 소포체는 상기 방법에 따라 9% 자당(sucrose)에 의한 양이온성 지질 1 mM의 마지막 부피로 희석하였다. 용액을 교반할 때, 자당의 100 을 RNase-5% 유리수(free water)에 첨가하였다. 희석된 비어있는 소포체(“EV”)의 모든 mL을 첨가하고 혼합하였다. RNase- 유리수에 10 mg/mL siRNA 용액의 150 을 다시 한 번 첨가하고 혼합하였다. 혼합물을 그런 다음 5% 자당 용액과 1.750 mL으로 모든 EV의 mL로 사용하여 희석하였다. 혼합물을 상온에서 10분 동안 약 200 rpm으로 교반하였다. 연동 펌프(peristaltic pump)(e. g. Midgee Hoop, UFP-100-H24LA)를 사용하여 직교류(cross-flow) 한외여과기(ultrafiltration) 시스템에서 반-투과성 멤브레인(semi-permeable membrane)과 ~100000 MWCO, 혼합물을 원래 부피(volume)(또는 원하는 부피)의 약 1/3 정도로 농축하고 그런 다음 3 % 수 크로스, 2.9 % 글루코스를 함유하는 수용액을 사용하는 샘플 량의 5 배에 대하여 정용 여과를 하였다. 물질은 필터를 사용하기 전에 무균 조건(aseptic conditions)하에 0.8/0.2 마이크론 폴 사이즈의 결합된 필터를 통하여 여과하였다.
리포솜이 포함하고 있는 non- diVA siRNA의 형태(fromulation). 양이온성 지질(Cationic lipid), DOPE,콜레스테롤(cholesterol), 및 PEG-결합 지질은 50:10:38:2의 분자 비율에서 무수 에탄올(absolute ethanol)(200 proof)에 존재 하에 가용화되었다(solubilized). 50 mM 시트레이트 버퍼(citrate buffer)에서 가용화 하였고 온도는 35-40°C로 조절하였다. 에탄올/지질혼합물을 그런 다음 siRNA이 리포좀에 형성하도록 자연스럽게 교반하면서 siRNA-포함되어 있는 버퍼를 첨가하였다. 지질은 siRNA을 결합하여 마지막 총 지질이 15:1 (wt:wt)의 siRNA 비율이 되도록 하였다. 범위는 5:1 내지 15:1이고, 바락직하게는 7:1 내지 15:1이다. siRNA가 형성된 리포좀을 PBS(pH 7.2)의 부피 10X으로 에탄올을 제거하기 위해 정용 여과(diafiltered) 및 버퍼를 교환하였다. 마지막 물질은 오염 감소bioburden reduction)를 하기 위하여 0.22 , 멸균 그래이드(sterilizing grade), PES 필터를 통하여 여과하였다. 이 과정은 리포좀 수율은 50-100 nm의 평균 입자 직경(particle diameter), PDI <0.2,및 >85% 리포좀 수율 포착 효율성(entrapment efficiency)이다.
diVA . siRNA-diVA-리포솜(diVA . siRNA-diVA-Liposome) 형태와 공동-가용화(co-solubilized) 된 리포솜을 포함하는 siRNA의 형태를 상기에 설명한 방법을 사용하여 제조하였다. DiVA-PEG-diVA 는 siRNA를 포함하는 버퍼를 첨가하기 전에 무수에탄올과 다른 지질(50:10:38:2의 비율에서 양이온성 지질, DOPE, 콜레스테롤, 및 PEG-결합된 지질)과 함께 공동-가용화 되었다. 0.1 내지 5 몰(molar) 비율(50:10:38:2:0.1 내지 50:10:38:2:5)로부터 diVA-PEG-diVA의 몰을 구성하였다. 이 과정은 리포좀 수율은 50-100 nm의 평균 입자 직경(particle diameter), PDI <0.2,및 >85% 리포좀 수율 포착 효율성(entrapment efficiency)이다.
양이온성 지질.siRNA-diVA-리포좀(cationic lipids . siRNA-diVA-Liposome) 형태와 리포좀이 포함된 siRNA 의 형태(Formation) 및 siRNA-리포좀 제제는 상기 설명된 방법을 사용하여 제조하였다. 양이온성 지질은, 예를 들어, HEDC, HEDODC, DC-6-14, 또는 양이온성 지질의 결합된 어느 것일 수 있다.
diVA로 장식된 리포좀을 포함하는 siRNA 의 형태. siRNA-제제는 상기 설명된 방법을 사용하여 제조 및 PBS에서 0.5 mg/mL의 siRNA 농도로 희석하였다. 양이온성 지질은 HEDC, HEDODC, DC-6-14, 또는 이러한 양이온성 지질의 결합된 어느 것일 수 있다. diVA-PEG-diVA는 무수 에탄올에서 마지막 농도 범위가 10 내지 50 mg/mL가 되도록 용해 하였다. 약 에탄올 용액의 양을 siRNA-리포좀 용액에 첨가하여 마지막 몰 백분율(molar percentage)이 2 내지 10 mol% 수율로 되도록 하였다. 용액을 위로 제거 하고 아래로 피펫(pipette)을 사용하여 혼합하도록 반복하였다. diVA-PEG-diVA 농도 및 에탄올을 추가 볼륨>1.0 및 마지막 에탄올 농도 < 3% (vol/vol)가 유지 되도록 조절 하였다.장식된 리포좀을 그런 다음 생체외(in vitro), 생체내(in vivo) 평가를 하기 전에 오비탈 쉐이커(orbital shaker)안에서 한시간 동안 상온에서 부드럽게 흔들었다.
본 발명의 바람직한 실시 예를 나타낸 다음 표는 동등한 몰(%) 및 제충 백분율과 같은 몰 비율(molar ratios) 측면으로 나타내었다.
Figure 112018119950312-pat00120
실시예 34: 리포좀 제제로 형질전환( Transfection with liposomal formulations)
형질전환 방법은 LX-2 및 pHSCs와 같다. 리포좀 제제 또는 본 발명의 리포플렉스 제제는 적당한 농도에서 성장 배지로 혼합하였다. 혼합물의 100 μl을 96-웰 플레이트안에 있는 세포에 첨가하고 37 °C 5% CO2 배양기 안에서 30분 동안 배양하였따. 30 분 후, 배지를 새로운 성장배지로 교체해 주었다. 48시간의 형진전환 후, 세포는 당업계에 알려진 방법으로 Cell-to-Ct용해 시약(lysis reagents)(Applied Biosystems)을 사용하여 제조하였다.
HSP47 mRNA 발현 측정을 하기 위한 정량적 RT-PCR(qRT-PCR)
HSP47 및 GAPDH TaqMan 분석 및 첫 번째-단계 RT-PCR 마스터 혼합(master mix)은 생물계에 적용되(Applied Biosystems)는 것으로 구입하였다. 각 PCR반응은 다음과 같은 구성을 포함하였다: 첫 번째-단계 RT-PCR는 5 μl, TaqManRT 효소 혼합 0.25 μl, TaqMan 유전자 발현 분석 프로브 (HSP47) 0.25 μl, TaqMan 유전자 발현 분석 프로브(GAPDH) 0.5 μl, RNase-자유 물 3.25 μl, 세포 용해 0.75 μl, 10 μl의 총 부피를 혼합하였다.GAPDH는 HSP47 mRNA 수치의 관련 정량성 내재 대조군(endogenous control)으로 사용하였다. 정량적 RT-PCR은 내재 관련 정량적 방법(in-built Relative Quantification method)을 사용하여 ViiA 7 real-time PCR 시스템(Applied Biosciences)에서 수행하였다. 모든 값은 목 형질전환된 세포(mock transfected cells)의 HSP47 발현 평균 및 HSP47 발현의 백분율을 목과 함께 비교한 백분율로 정량화하여 나타내었다.
생체외 실험(In vivo experiments): 본 발명에서는 교배를 끝낸 24-30 그램의 체중 범위인 암컷 C57Bl/6 마우스(Charles River)를 사용하였다. 동물은 무작위로 10마리씩의 10군으로 나누었다. 모든 동물 절차는 Bio-Quant’s IACUC /또는 필요에 따라 수의사를 참석시키고 모든 동물 복지 문제를 해결하고 문서화 하였다. 마우스는 아이소 플루 란(Isoflurane)으로 마취하고 아래 정맥을 통하여 피를 뽑고 희생하였다.
열 쇼크 단백질 47(HSP47)의 상향 조절은 CCl4 (올리브 기름안에 있는 CCl4, 1:7 (vol/vol), 체중 그램 당 1 L )로 7(날짜 0, 2, 4, 6)일 동안 매일 통하여 복강내 주입하였다. 당일 3 마리 마우스는 4일 연속(날짜 3, 4, 5, 6) 리포좀 또는 본 발명의 리포플렉스 제제를 처리 또는 RH리 정맥을 통하여 IV 주입을 하였다. 10 마리 마우스(자연 그대로)의 한 그룹은 정상 HSP47 유전자 발현을 하는 정상 대조군(control group)처럼 CCl4 처리를 하지 않거나 IV 주입을 하지 않았다.
실험 타임라인(Experimental Timeline)
Figure 112018119950312-pat00121
7일 및 마지막 IV 주입을 한 24시간 후, 모든 남은 마우스를 희생 및 PCR 분석을 위해 간 샘플 수집을 하기 전에 PBS로 간을 제거하였다. 각 마우스 간으로부터 대략 150 mg 샘플을 수집하고 나중에 안정화되는 시약(later stabilization reagent)(Qiagen) 1.5 mL RNA 및 분석 될 때까지 2-8℃에서 저장하였다. 간 샘플은 깨끗한 부분 및 간 손상 및/또는 종양으로부터는 수집하지 않았다.
마우스 간으로부터 총 RNA는 RNeasy 컬럼(RNeasy columns)(Qiagen)을 당업계의 제조방법에 따라 사용하여 추출하였다. 총 RNA의 20 ng은 정량 RT- PCR을 사용하여 HSP47 발현을 측정하였다. HSP47 및 GAPDH TaqMan® 분석 및 첫 번째-단계 RT-PCR 마스터 혼합은 생물계에 적용되(Applied Biosystems)는 것으로 구입하였다. 각 PCR 반응은 다음과 같은 구성을 포함하였다: 첫 번째-단계 RT-PCR는 5 μl, TaqManRT 효소 혼합 0.25 μl, TaqMan® 유전자 발현 분석 프로브 (HSP47) 0.25 μl, TaqMan 유전자 발현 분석 프로브(GAPDH) 0.5 μl, RNase-자유 물 3.25 μl, 세포 용해 0.75 μl, 10 μl의 총 부피를 혼합하였다.GAPDH는 HSP47 mRNA 수치의 관련 정량성 내재 대조군(endogenous control)으로 사용하였다. 정량적 RT-PCR은 내재 관련 정량적 방법(in-built Relative Quantification method)을 사용하여 ViiA 7 real-time PCR 시스템(Applied Biosciences)에서 수행하였다. 모든 값은 자연 그대로 동물 군(naanimal group)의 HSP47 발현 평균 및 HSP47 발현의 백분율을 자연 그대로 군(nagroup)과 함께 비교한 백분율로 정량화하여 나타내었다.
도 1은 하기에 따라 제형을 설명하였다:
Figure 112018119950312-pat00122
*VA-PEG-VA 및 공동-가용화를 통하여 diVA-PEG-diVA를 첨가하였다. 장식 전-처리를 통해 VA를 첨가하였다.
도 2는 하기에 따라 제형을 설명하였다:
Figure 112018119950312-pat00123
*공동-가용화를 통하여 diVA-PEG-diVA를 첨가하였다. 장식 전-처리를 통해 VA를 첨가하였다.
도 3은 하기에 따라 제형을 설명하였다:
Figure 112018119950312-pat00124
*공동-가용화를 통하여 diVA-PEG-diVA를 첨가하였다. 장식 전-처리를 통해 VA를 첨가하였다.
실시예 35: 생체외( in vitro) 효율성(pHSC)- 용량 반응
생체외( in vitro) 분석에서 pHSC 설명:
siRNA 농도 증가의 제제(HEDC:S104:DOPE:Chol:Peg-DMPE:DiVA, 20:20:30:25:5:2) 와 일차 간성상 세포(Primary hepatic stellate cells)(pHSCs)를 96-웰 플레이트에서 배양하였다. 30분 후, 세포를 세척하고 새로운 성장 배지로 처리하여 48시간 동안 37°C에서 배양하였다. 이때, 세포를 용해하고 및 정량적 RT-PCR (TaqMan)) 분석에 의하여 gp46 및 GAPDH mRNA를 측정하였다. gp46의 mRNA 수치는 GAPDH 수치에 의하여 표준화하였다. 표준화된 gp46 수치는 처리하지 않는 대조군(untreated control cells)의 백분율로 나타내었다. 도 4에 결과를 나타내었다. 오차 막대(Error bars)는 표준편차(standard deviations)(n=3)을 나타내었다. 그래프 패드(Graph pad Prism)를“클래식 S모양 투여 용량 반응”(“Classic sigmoidal dose response function") 데이터에 도입하여 11.8 nM의 EC50 수율을 나타내었다.
*실시예 36: 독성(Toxicity)
HepG2 독성 분석(cytotoxicity assay) 설명:
HepG2 세포, 간실질세포암(hepatic cellular carcinoma)에서 부착성 세포 주가 유래되었고, 10% FBS (Hyclone, Logan, Utah Cat# SH30910) 보충제가 포함된 MEM/EBSS(Hyclone, Logan, Utah, Cat# SH30024.01)에서 배양하였다. HepG2 세포를 5000 세포/웰의 밀도로 96-웰 옵티플럭스 블랙 플레이트(Optilux black plates)(BD Falcon, Cat # BD353220)에 분주하였다. 제제는 마지막 siRNA 농도(n=3)로 나타날 때 각 웰에 첨가하였다. 48 시간 포스트 제제 첨가, 세포 독성(cell viability)은 당업계의 제조 방법에 따라 CellTiter-Glo 발광(Luminescent) 세포 독성 분석 키트를 사용하여 측정하였다. 화학 발광(Chemiluminescent) 시그날은 발광 투명 마이크로 리더기(Clarity Luminescence Microplate Reader)(502-Biotek, Winooski, Vermont)를 사용하여 측정하였다. 생존(Viability)은 목을 처리한 웰에 대하여 제제를 처리한 웰에서 발광 시그날의 %를 바탕으로 계산하였다.
화학식I의 양상이온화 지질 본 발명자들의 화학식I의 모든 4차 아민 양상이온화 지질성이 있는 것과 제제 후를 확인하고, 본 발명자들은 화학식I의 4차 아민 양이온화 지질의 결합과 그들 각각의 이온화 합성 전구체(ionizable synthetic precursors)를 평가하였다(하기 예에서 나타내었다, i-DC 및 HEDC, INT4 및 DODC, S104 및 HES104).
Figure 112018119950312-pat00125
표에서 다른 제제로부터 실시예 결과를 나타내었다. 놀라운 정도인 이온화 양이온성과 4차 아민 이온성 지질의 결합 및 예기치 않은(unexpectedly) 하나의 양이온 성 지질을 함유하는 리포좀보다 독성이 있었다(하기 표에 HEDC vs. HEDC+ iDC; 및 DODC vs. DODC+INT4 예시로 나타내었다). HEDC+S104 결합을 또 다른 바람직한 제제로 확인하였다.
Figure 112018119950312-pat00126
생체내( in vivo ) 독성
HEDC:S104(20:20) 제제는 생체내 독성 연구에서 예비에서 예외적으로 허용 하였다. 정맥 주입은 복용량 25 mg/kg(랫트) 및 12 mg/kg(원숭이)에서 독성이 발견되지 않았다. 이것은 이 분야에서 뛰어난 것으로 간주 된다. 예를 들면, Alnylam 제약은 AsiaTIDES 회의(conference)에서 3월 1,2012에 그들의 세 번째 세대 지질 나노입자가 가지고 있는 10 mg/kg의 NOAEL 독성을 밝혀냈다(단일 용량, 랫트).
실시예 37: 생체내( in vivo ) 효율(랫트 DMNQ)
표적화 제제의 생체내(in vivo) 활성을 단기 간 손상 모델(Quick Model, DMNQ로 나타태다)에서 평가하였다. 이 모델은, 디메틸니트로사민(dimethylnitrosamine)(DMN)과 같은 간독성 작용제를 처리하여 단기 간 손상을 유발시켜 gp46 mRNA 수치의 평가를 하였다. 이러한 유발로 인한 변화는, 수컷 Sprague-Dawley 랫트에 연속적으로 6일 동안 복강내 DMN을 주입하였다. DMN 처리 기간이 끝나갈 때, 상기 랫트를 개별 동물의 체종에 기초하여 그룹을 무작위로 나누었다. 제제는 단일 복강 용량으로 관리하였고, 하시간 후 마지막으로 DMN를 주입하였다. 24시간 후, 간 엽을 절제하고 모든 gp46 및 MRPL19 mRNA 수치를 정량적 RT-PCR(quantitative RT-PCR)(TaqMan)에 의하여 분석하였다.gp46 mRNA의 수치는 MRPL19 수치로 표준화하였다.
수컷 Sprague-Dawley 랫트는 1, 2, 3일에 10 mg/kg로 DMN을 처리하고 4, 5, 6일에는 5 mg/kg 을 복강내 용량으로 간 손상을 유발하였다. 동물(n = 8/group)은 HEDC:S104:DOPE:Chol:Peg-DMPE:DiVA (20:20:30:25:5:2)의 제제 구성에서 0.5, 0.75, 1.0, 2 mg/kg siRNA의 용량으로 제제와 함께 복강 내 주입을 하거나 PBS(처리군)(vehicle), 한시간 후 DMN을 마지막 주입을 하였다. 24시간 후, 각 동물에서 오른쪽 간 엽의 섹션에서 총 siRNA 정제 및 RNA가 분리 될 때까지 4℃에서 저장하였다. 대조군(Control groups)은 PBS 처리군(PBS vehicle group)(DMN-treated) 및 자연 그대로(na)(처리하지 않은; DMN이 없는)군을 포함하였다. 도 5는 측정의 결과를 나타내었다. 자연 그대로 군에서 gp46 mRNA 수치 배경을 뺀 후, 모든 테스트 군 값(test group values)은 처리군(vehicle group)의 gp46 mRNA 평균으로 표준화(normalized)하였다(처리군의 백분율로 나타내었다). gp46 mRNA 수치 평균은 처리 용량-독립적 반응 및 S모양 투여 용량 반응 커브로 0.79 mg/kg의 EC50 수율에 따라 나타내었다.
실시예 38: 생체내 효율(랫트 DMNC)
수컷 Sprague Dawley 랫트(130-160 g)는 복강내 용량 DMN을 처리하여 간섬유를 유도하였다. DMN 처리 방법(treatment regimen)은 첫 번째 3주에는 10 mg/kg(예를 들면., 2.0 mL/kg 체중의 용량에서 DMN의 5.0 mg/mL)로 각 주마다 3번(월요일, 수요일 및 금요일) 및 22 내지 57일에는 5 mg/kg의 반 복용량(half dose)(예를 들면.,1.0 mL/kg의 용량에서 DMN의 5 mg/mL)이다. 대조군 동물(sham group animal)에 상기와 같은 방법으로 PBS(DMN에 대한 용매)를 주입하였다. 22일에, 24 시간에 마지막으로 DMN을 처리하고, 혈액(blood) 샘플을 수집하고 간 질환(liver disease) 바이오마커로 DMN 처리의 효율을 확인하기 위하여 분석하였다. DMN 처리 된 동물은 체중에 따라 각기 다른 처리 군으로 나누어 지고 각 군에서 체중 평균(mena) 및 동물의 체중의 범위(range)에서 우의적인 변화가 없음을 확인하였다. 전처리 군 동물은 치료 시작 전 질병의 진행 단계가 시작하여 평가하기 위하여 25일에 희생하였다. gp46 siRNA를 포함한 제제로 처리하고 2 처리/주 총 10번으로 siRNA 용량을 25일에 지정하였다. 59일에, 마지막 제제 처리 48시간 후 및 마지막 DMN 처리 72시간 후, 동물은 CO2 흡입에 의해 희생하였다. 간 엽 절제 및 모든 gp46 및 MRPL19 mRNA 수치 결정은 정량적 RT-PCR(quantitative RT-PCR)(TaqMan)에 의해 분석하였다. gp46에 대한 mRNA 수치는 MRPL19 수치로 표준화하였다.
수컷 Sprague-Dawley 랫트는 3주(3번/주)동안 10 mg/kg에서 DMN을 처리하고 그런 다음 22 내지 57(3번/주)에 5 mg/kg 을 복강내 용량을 통해 간섬유를 유발하였다. 동물(n = 10/군)은 복강내로 1.5, 1.0, 0.75,에서 HEDC:S104:DOPE:Chol:Peg-DMPE:DiVA (20:20:30:25:5:2)의 구성인 제제이거나 0.5 mg/kg siRNA 또는 PBS(처리군)(vehicle)을 10번(2 번/주) 주입하고, 1시간 후 마지막 DMN의 주입을 하였다. 59일, 각 동물에서 오른쪽 간 엽의 섹션으로부터 총 siRNA는 정제하고 분석하기 전까지 4°C에 저장하였다. 대조군은 PBS 처리군(DMN-유도, PBS 처리, n=7) 및 쉠 군(sham group) ( DMN의 장소에서 PBS 처리 및 제제, n=10) 군을 포함한다. 자연 그대로 군에서 gp46 mRNA 수치 배경을 뺀 후, 모든 테스트 군 값은 처리 군(vehicle group)(처리군의 백분율로 나타내었다)의gp46 mRNA 수치 평균으로 표준화 하였다. 동물은 전처리 군(n=7)을 25일에 희생하여 처리 시작하기 전 질병 수준 수치를 평가하였다. One-way Anova 분석은 듀네트‘s 테스튿에 의해 모든 처리군에서 유의적으로 처리군과 gp46 유전자 녹다운을 비교하여 나타내었다(***, P<0.001).
다음 표는 본 명세서에 기재된 화합물을 요약, 및 생체내(in vivo ) 및 생체외(in vitro)에서 이들의 화합물 테스트에 의하여 결과를 확인하였다.
Figure 112018119950312-pat00127
실시예 39: 생체내 항-폐-섬유( anti-pulmonary-fibrosis)
수컷 S-D 랫트(8 랫트/군, 8주령, Charles River Laboratories 일본, Inc.)를 식염수의 0.1 mL을 용해하여 0.45 mg 블레오마이신(bleomycin)(BLM)을 마취하에 기관지(intratracheally cannulating)(MicroSprayer, Penn-Century, Inc.)에 의해 폐로 복용하고, 블레오마이신 폐 섬유 모델을 제조하였다. 이 방법은, 약 2주 후 유의적으로 섬유를 폐에서 발생시켰다. 리포좀 제제(siRNA의 양과 같은 1.5 mg/kg, 부피에서 1 ml/kg, 예를 들면., 200 g의 랫트에 200 ) 또는 PBS (부피에서 1 ml/kg)를 꼬리 정맥으로 랫트에 복용시키고, 블레오마이신을 복용한 2주 후 시작하였고, 총 10번(매일) 하였다. 랫트는 마지막 처리 2틀 전 희생시키고 폐 조직의 조직학적 확인을 나타내었다(도 7). One way ANOVA 및 본페로니 멀티 비교 테스트는 통계적으로-유이한 차이의 평가를 사용하여 나타내었다.
제거 된 폐의 부분은 통상적 인 방법에 따라 포르말링으로 고정 및 azan으로 염색 시켰다(아조카마인(azocarmine), 안일라인 청 오렌지G 용액(aniline blue orange G solution)).
조직학적 점수(T. Ashcroft 점수)의 결과는 도7에 의해 나타내고, 제제 복용 군(처리군)에서, 간섬유 점수는 유의적으로 감소하였다.
실시예 40: LX -2 세포주 및 랫트 일차 간 성상 세포(( pHSCs )에서 녹다운 효울성에 대한 VA-siRNA-리포좀 제제의 생체외( In vitro )평가
LX2 세포(Dr. S.L. Friedman, 의과의 마운트 시나이 학교(Dr. S.L. Friedman, Mount Sinai School of Medicine, NY)는 10 % 우태아혈청(fetal bovine serum)(Invitrogen)을 보충제와 DMEM(Invitrogen)에서 성장하고 5% CO2 배양기에서 37 °C로 배양하였다. 세포는 TryPLExpress 용액(Invitrogen)을 사용하여 37 °C 배양기에서 트립신(trypsinized)하였다. 세포 농도는 헤모사이토미터(hemocytometer)에서 세포 카운팅에 의해 측정되었고 96-웰 플레이트에 3000 세포/웰로 분주되었다. 세포는 형질전환이 되기 전 24시간 동안 성장하였다.
랫트 일차 간 성상 세포(pHSCs)는 Sprague-Dawley rats로부터 이전에 발행된 방법(Nat. Biotechnol. 2008, 26(4):431-42)에 따라 분리하였다. pHSCs는 DMEM 보충제 10% 우태아혈청에서 성장하였다. 세포는 생체외(in vitro) 스크리닝에 이들을 사용하기 전 분리한 후 두 페세지(two passages)에서 성장하였다. 세포는 96-웰 플레이트에서 1000 세포/웰의 세포 밀도에서 분포하였고 그들을 형질전환에 사용하기 전에 48 시간 동안 성장하였다.
VA- siRNA - Liposome 제제와 형질전환. 형질전환 방법은 LX-2 및 pHSC 세포와 같다. VA-siRNA-리포좀 또는 VA-siRNA-리포플렉스 제제는 원하는 농도에서 성장 배지와 함께 혼합하였다. 혼합물의 100 μl을 96-웰 플레이트에 있는 세포에 첨가하고 세포는 30분 동안 5% CO2 배양기에서 37 °C로 배양하였다. 30분 후, 배지는 새로운 성장배지로 교체해 주었다. 형질전환의 48 시간 후, 세포는 당업계의 제조 방법에 따라 Cell-to-Ct 용해 시약(적용된 바이오시스템)을 사용하여 제조하였다.
HSP47 mRNA 발현 측정을 위한 정량적(Quantitatve)(q) RT-PCR.
HSP47 및 GAPDH TaqMan 분석 및 첫 번째-단계 RT-PCR 마스터 혼합은(master mix)은 생물계에 적용되(Applied Biosystems)는 것으로 구입하였다. 각 PCR반응은 다음과 같은 구성을 포함하였다: 첫 번째-단계 RT-PCR는 5 μl, TaqManRT 효소 혼합 0.25 μl, TaqMan 유전자 발현 분석 프로브 (HSP47) 0.25 μl, TaqMan 유전자 발현 분석 프로브(GAPDH) 0.5 μl, RNase-자유 물 3.25 μl, 세포 용해 0.75 μl, 10 μl의 총 부피를 혼합하였다.GAPDH는 HSP47 mRNA 수치의 관련 정량성 내재 대조군(endogenous control)으로 사용하였다. 정량적 RT-PCR은 내재 관련 정량적 방법(in-built Relative Quantification method)을 사용하여 ViiA 7 real-time PCR 시스템(Applied Biosciences)에서 수행하였다. 모든 값은 목 형질전환된 세포(mock transfected cells)의 HSP47 발현 평균 및 HSP47 발현의 백분율을 목과 함께 비교한 백분율로 정량화 하여나타내었다.
siRNA는 당업계 프로토콜(formulation protocols)에서 이중 가닥(double stranded)과 21-머 표적화(mer targeting) HSP47/gp46 여기서 HSP47(마우스) 및 gp46(랫트)은 상동체(homologs)- 다른 종에서 동일한 유전자와 관련이 있다:
생채외(in vitro) 분석을 위해 사용한 랫트 HSP47-C 이중가닥 siRNA(rat pHSCs)
센스(Sense)(5'->3') GGACAGGCCUCUACAACUATT(SEQ. ID NO. 1)
안티센스(Antisense)(3'->5') TTCCUGUCCGGAGAUGUUGAU(SEQ. ID NO. 2).
양이온 지질 저장용 제조. 양이온 지질의 저자 용액은 양이온 지질과 DOPE, 콜레스테롤 및 diVA-PEG-DiVAin가 에탄올에서 6.0, 5.1 및 2.7 및 2.4 mg/mL 각각 결합되는 것에 의해 준비하였다. 필요한 경우, 용액은 약 50℃ 로 따듯하게 하여 용액으로 양이온 성 지질의 용해를 촉진하였다.
비어있는 리포솜 준비(Empty Liposome Preparation). 양이온성 지질 저장액을 주입부 포트(injection port) 당1.5 mL/분에서 주사 바늘을 통하여 35-40℃에서 9% 수크로스(sucrose)의 수용성 혼합물을 빠르게 교반하여 주입하였다. 야이온성 지질 저장 용액은 35:65에서 수용성 용액 비율(v/v)로 고정하였다. 혼합시, 비어있는 소포체는 자발적인 형태였다. 소포체 결과는 그런 다음 에탄올 내용물을 ~ 12%로 감소시키기 전에 10분 동안 40℃에서 동등하게 하였다.
리포플렉스 준비. 비어있는 소포체는 상기 방법에 따라 9% 자당(sucrose)에 의한 양이온성 지질 1 mM의 마지막 부피로 희석하였다. 용액을 교반할 때, 자당의 100 을 RNase-5% 유리수(free water)에 첨가하였다. 희석된 비어있는 소포체(“EV”)의 모든 mL을 첨가하고 혼합하였다. RNase- 유리수에 10 mg/mL siRNA 용액의 150 을 다시 한 번 첨가하고 혼합하였다. 혼합물을 그런 다음 5% 자당 용액과 1.750 mL으로 모든 EV의 mL로 사용하여 희석하였다. 혼합물을 상온에서 10분 동안 약 200 rpm으로 교반하였다. 연동 펌프(peristaltic pump)(e. g. Midgee Hoop, UFP-100-H24LA)를 사용하여 직교류(cross-flow) 한외여과기(ultrafiltration) 시스템에서 반-투과성 멤브레인(semi-permeable membrane)과 ~100000 MWCO, 혼합물을 원래 부피(volume)(또는 원하는 부피)의 약 1/3 정도로 농축하고 그런 다음 3 % 수 크로스, 2.9 % 글루코스를 함유하는 수용액을 사용하는 샘플 량의 5 배에 대하여 정용 여과를 하였다. 물질은 필터를 사용하기 전에 무균 조건(aseptic conditions)하에 0.8/0.2 마이크론 폴 사이즈의 결합된 필터를 통하여 여과하였다.
리포솜이 포함하고 있는 non- diVA siRNA의 형태(fromulation). 양이온성 지질(Cationic lipid), DOPE,콜레스테롤(cholesterol), 및 PEG-결합(예를 들면., Peg-Lipid) 지질은 50:10:38:2의 분자 비율에서 무수 에탄올(absolute ethanol)(200 proof)에 존재 하에 가용화되었다(solubilized). 50 mM 시트레이트 버퍼(citrate buffer)에서 가용화 하였고 온도는 35-40°C로 조절하였다. 에탄올/지질혼합물을 그런 다음 siRNA이 리포좀에 형성하도록 자연스럽게 교반하면서 siRNA-포함되어 있는 버퍼를 첨가하였다. 지질은 siRNA을 결합하여 마지막 총 지질이 15:1 (wt:wt)의 siRNA 비율이 되도록 하였다. 범위는 5:1 내지 15:1이고, 바락직하게는 7:1 내지 15:1이다. siRNA가 형성된 리포좀을 PBS(pH 7.2)의 부피 10X으로 에탄올을 제거하기 위해 정용 여과(diafiltered) 및 버퍼를 교환하였다. 마지막 물질은 오염 감소(bioburden reduction)를 하기 위하여 0.22 , 멸균 그래이드(sterilizing grade), PES 필터를 통하여 여과하였다. 이 과정은 리포좀 수율은 50-100 nm의 평균 입자 직경(particle diameter), PDI <0.2,및 >85% 리포좀 수율 포착 효율성(entrapment efficiency)이다.
diVA . siRNA-diVA-리포솜(diVA . siRNA-diVA-Liposome) 형태와 공동-가용화(co-solubilized) 된 리포솜을 포함하는 siRNA의 형태를 상기에 설명한 방법을 사용하여 제조하였다. DiVA-PEG-diVA 는 siRNA를 포함하는 버퍼를 첨가하기 전에 무수에탄올과 다른 지질(50:10:38:2의 비율에서 양이온성 지질, DOPE, 콜레스테롤, 및 PEG-결합된 지질)과 함께 공동-가용화 되었다. 0.1 내지 5 몰(molar) 비율(50:10:38:2:0.1 내지 50:10:38:2:5)로부터 diVA-PEG-diVA의 몰을 구성하였다. 이 과정은 리포좀 수율은 50-100 nm의 평균 입자 직경(particle diameter), PDI <0.2,및 >85% 리포좀 수율 포착 효율성(entrapment efficiency)이다.
양이온성 지질과 리포좀이 포함된 siRNA 의 제제. siRNA-diVA-리포좀(cationic lipids . siRNA-diVA-Liposome) 제제 및 siRNA-리포좀 제제는 상기 설명된 방법을 사용하여 제조하였다. 양이온성 지질은, 예를 들어, HEDC, HEDODC, DC-6-14, 또는 양이온성 지질의 결합된 어느 것일 수 있다.
diVA 로 장식된 리포좀을 포함하는 siRNA 의 형태. siRNA-제제는 상기 설명된 방법을 사용하여 제조 및 PBS에서 0.5 mg/mL의 siRNA 농도로 희석하였다. 양이온성 지질은 HEDC, HEDODC, DC-6-14, 또는 이러한 양이온성 지질의 결합된 어느 것일 수 있다. diVA-PEG-diVA는 무수 에탄올에서 마지막 농도 범위가 10 내지 50 mg/mL가 되도록 용해 하였다. 약 에탄올 용액의 양을 siRNA-리포좀 용액에 첨가하여 마지막 몰 백분율(molar percentage)이 2 내지 10 mol% 수율로 되도록 하였다. 용액을 위로 제거 하고 아래로 피펫(pipette)을 사용하여 혼합하도록 반복하였다. diVA-PEG-diVA 농도 및 에탄올을 추가 볼륨>1.0 및 마지막 에탄올 농도 < 3% (vol/vol)가 유지 되도록 조절 하였다.장식된 리포좀을 그런 다음 생체외(in vitro), 생체내(in vivo) 평가를 하기 전에 오비탈 쉐이커(orbital shaker)안에서 한 시간 동안 상온에서 부드럽게 흔들었다.
결과
도 8에 siRNA의 녹다운 효율성이 장식 증가를 통하여 VA-결합된 리포좀의 추가가 된 것, siRNA 활성 강화를 나타내었다. Peg-지질. 모든 샘플에 대한 용량은 867 nM siRNA HSP47-C이다. 모든 예를 든 곳에 VA-결합된 것을 첨가하여 리포좀, siRNA 활성을 레티노이드가 포함되어 있지 않는 리포좀 및 무(비-결합된) 레티노이드로 장식된 리포좀을 비교하여 증가한 것을 나타내었다. RNAiMAX는 상업적으로 형질전환 시약이다.
도 9는 공동 가용화를 통해 리포좀 VA-결합체의 추가는 siRNA의 녹다운 효율을 향상 시키는 것을 나타내었다. 이것은 공동 가용화를 통해 리포좀과 VA-결합체를 첨가한 것을 포함한 DODC이다. 제제는 50:10:38:2:X, 여기서 X = 1 내지 10(DODC:DOPE:콜레스테롤:PEG-Lipid:VA-결합체, 몰 비율)이다. 모든 인스턴스에서 농도는 100 nM siRNA HSP47-C이다. 결과는 VA-결합체의 추가는 공동 가용화 siRNA 활성 향상을 통한 결과를 나타내었다.
도 10은 공동 가용화를 통해 리포좀 VA-복합체 또한 극적으로의 siRNA의 최저 효율을 향상시키는 것을 나타낸다. 결과는 세 가지 다른 리포좀, DC-1-14 DODC, VA-복합체와 HEDODC 공동 가용화를 통해 추가를 포함한다. 제형은 모두에 대해 동일하고, 50:10:38:2, 양이온 성 지질 : DOPE : 콜레스테롤 : 페그 - 지질 만 양이온 성 지질 변화와 함께한다. siRNA의 농도는 200 nm의 siRNA를 HSP47-C 모두에 대해 동일하다. 이 결과는 공동 용해에 의해 준비할 때 다른 양이온 성 지질은 크게, siRNA의 활동을 강화하는 데 리포좀이 VA-공액 추가로 표시하였다.도 11은 공동-가용화를 통하여 DC-6-14 양성이온화 지질을 포함하고 있는 리포플렉스로 VA-결합체의 추가는, 및 siRNA 코팅 리포좀의 외관은 siRNA의 활동을 강화한 것을 나타내었다. 제제는 40% 리포플렉스 형태, 40:30:30, DC-6-14:DOPE:콜레스테롤이다. 모든 샘플에 대한 농도는 867 nM siRNA HSP47-C이다. 공동-가용화를 통하여 VA-결합체 추가는 리포플렉스에서 siRNA활성 향상이 나타내었다.
도 12는 공동-가용화를 통해 VA-결합체의 추가로 리포플렉스 형태와 장식을 통하여 VA-결합체 첨가된 리포플렉스와 비교한 것을 나타내었다. 이러한 결과는 DC-6-14 및 DODC 리포플렉스에서이다. 제제는 40:30:30, DC-6-14:DOPE:콜레스테롤로 구성되어 있다. 농도는 각 샘풀에서 867 nM siRNA HSP47-C이다. 공동-가용성은 VA-결합체 추가로 생체외에서 유의적으로 녹다운 효율성을 증가시키고, 관련된 장식에 의해 VA-결합체를 첨가하였다.
실시예 41: 생체내( In vivo ) 실험
교배를 끝낸 24-30 그램의 체중 범위인 암컷 C57Bl/6 마우스(Charles River)를 사용하였다. 동물은 무작위로 10마리씩의 10군으로 나누었다. 모든 동물 절차는 Bio-Quant’s IACUC /또는 필요에 따라 수의사를 참석시키고 모든 동물 복지 문제를 해결하고 문서화 하였다. 마우스는 아이소 플루 란(Isoflurane)으로 마취하고 아래 정맥을 통하여 피를 뽑고 희생하였다.
생채내(in vivo) 분석을 위해 제제에서 마우스 HSP47-C 이중가닥 siRNA를 사용하였다(마우스 CCl4 모델)
센스(Sense) (5'->3') GGACAGGCCUGUACAACUATT (SEQ. ID NO. 3)
안티센스(Antisense)(3'->5') TTCCUGUCCGGACAUGUUGAU (SEQ. ID NO. 4)
열 충격(heat shock) 단백질 47(HSP47)의 상향 조절은 CCl4(CCl4inoliveoil, 1:7(vol/vol), 체중 당 1mL)로 7 일(하루 0, 2, 4, 6)에 매일 복강내 주입을 통해 유발하였다. 하루에 3마리 마우스를 4일 연속으로 리포솜 또는 발명의 리포플렉스 제제 또는 꼬리 정맥으로 IV 주입에 의해 PBS를 처리하였다. 열 마리 마우스의 한 군(자연 그대로)은 CClCCl4 처리도 하지 않고 정상 HSP47 유전자 발현에 대한 대조군과 같이 IV 주입도 처리하지 않았다.
실험 타임라인(Experimental Timeline)
Figure 112018119950312-pat00128
7일 및 마지막 IV 주입을 한 24시간 후, 모든 남은 마우스를 희생 및 PCR 분석을 위해 간 샘플 수집을 하기 전에 PBS로 간을 제거하였다. 각 마우스 간으로부터 대략 150 mg 샘플을 수집하고 나중에 안정화되는 시약(later stabilization reagent)(Qiagen) 1.5 mL RNA 및 분석 될 때까지 2-8℃에서 저장하였다. 간 샘플은 깨끗한 부분 및 간 손상 및/또는 종양으로 부터는 수집하지 않았다.
마우스 간으로부터 총 RNA는 RNeasy 컬럼(RNeasy columns)(Qiagen)을 당업계의 제조방법에 따라 사용하여 추출하였다. 총 RNA의 20 ng은 정량 RT- PCR을 사용하여 HSP47 발현을 측정하였다. HSP47 및 GAPDH TaqMan 분석 및 첫 번째-단계 RT-PCR 마스터 혼합은 생물계에 적용되(Applied Biosystems)는 것으로 구입하였다. 각 PCR 반응은 다음과 같은 구성을 포함하였다: 첫 번째-단계 RT-PCR는 5 μl, TaqManRT 효소 혼합 0.25 μl, TaqMan 유전자 발현 분석 프로브 (HSP47) 0.25 μl, TaqMan 유전자 발현 분석 프로브(GAPDH) 0.5 μl, RNase-자유 물 3.25 μl, 세포 용해 0.75 μl, 10 μl의 총 부피를 혼합하였다.GAPDH는 HSP47 mRNA 수치의 관련 정량성 내재 대조군(endogenous control)으로 사용하였다. 정량적 RT-PCR은 내재 관련 정량적 방법(in-built Relative Quantification method)을 사용하여 ViiA 7 real-time PCR 시스템(Applied Biosciences)에서 수행하였다. 모든 값은 자연 그대로 동물 군(naanimal group)의 HSP47 발현 평균 및 HSP47 발현의 백분율을 자연 그대로 군(nagroup)과 함께 비교한 백분율로 정량화 하여나타내었다.
실시예 42: 생체외( IN VITRO )에서 HEDC을 활용(CONJUGATE)하여 지용성 비타민(FAT-SOLUBLE VITAMIN) 표적의 활용: S104:DOPE:Chol:PEG-DMPE:DiVA
50 nM siRNA와 리포좀 제제로 실험하였다. 리포좀은 어느 하나:HEDC:S104:DOPE:Chol:PEG-DMPE:DiVA (+DiVA) 또는 비타민 A 일부분 제어 결여(-DiVA)이거나 및 간 성상세포(hepatic stellate cell)를 포함한 96-웰 배양 플레이트에서 30분 동안 배양하였다. 30분 후, 새로운 성장 배지(fresh growth medium)와 함께 배지를 교체해 주었다. 48 시간 후, 세포를 용해(lysed)하고 gp46 및 GAPDH mRNA 수치를 정량 RT-PCR (TaqMan) 분석을 통하여 측정하고, gp46 수치는 GAPDH 수치로 정량화 하였다.
생체외 효능(pHSC ), 2% DiVA siRNA의 효과는 2 % diVA 및 14nM의 EC50 이 가지고 있는 효능. 96 웰 플레이트에 PHSCs를 표적화(-DiVA)에 대한 비타민 일부분 결여, 또는 50 nM siRNA에서 일부분 비타민(+DiVA)를 포함하는 제제. 30 분 후, 배지는 새로운 성장 배지로 교체하였다. 48시간 후, 세포를 용해(lysed)하고 gp46 및 GAPDH mRNA 수치를 정량 RT-PCR (TaqMan) 분석을 통하여 측정하고, gp46 수치는 GAPDH 수치로 정량화 하였다. gp46 수치 정량화는 대조군 세포(mock control cells)의 백분율로 나타내었다. 오차 막대(Error bars)는 표준편차(standard deviations)(n=3)를 나타내었다. gp46 수치 평균은 단일 표본 티-테스트(one-tailed t-test)에 따라 대조군처리(mock control treatment)로부터 유의적으로 차이가나는 것을 포함하는 DiVA에 의한 것이다.
DiVA 및 satDiVA의 비교
리포솜 제제는 96-웰 플레이트에서 30분 동안 랫트 pHSCs로 형질전환되었다. 48 시간 후, 세포는 Cells-to-Ct용해 시약(lysis reagents)(Applied Biosystems)을 사용하여 처리하고 HSP47 mRNA 수치는 by qRT-PCR에 의해 정량하였다. HSP47 발현은 대조군(mock control)으로 표준화하였다. EC50는 siRNA의 6 반-로그 용량에서 HSP47 녹다운(knockdown)(KD)을 결정하고 그래프 패드(Graph pad Prism)에서 “클래식 S모양 투여 용량 반응”(“Classic sigmoidal dose response function” )을 데이터에 도입하였다.
결과는 모든 DiVA 및 Sat DiVA가 증가하여 KD 효능(테이블 아래 및 또한 Fig 15)을 나타내었다. EC50는 12nM에 대한 DiVA 및 EC50는 SatDiVA에 대한 14nM.
Figure 112018119950312-pat00129
레티노이드 결합( Retinoid conjugate) vs 비- 레티노이드 (non- retinoid conjugate 결합
레티노이드 결합은 생체외(in vitro)과 비-레티노이드 동등(4TTNBB 및 4Myrv를 나타내다. 레티노이드 결합 동등 satDiVA 및 DiVA)에 일관되게 더 유력한 것을 발견하였다. PCR 분석을 위해 간 샘플 수집을 하기 전에 PBS로 간을 제거하였다. 각 마우스 간으로부터 대략 150 mg 샘플을 수집하고 나중에 안정화되는 시약(later stabilization reagent)(Qiagen) 1.5 mL RNA 및 분석 될 때까지 2-8° C에서 저장하였다. 간 샘플은 깨끗한 부분 및 간 손상 및/또는 종양으로 부터는 수집하지 않았다.
Figure 112018119950312-pat00130
실시예 43: 생체내( IN VIVO )에서 HEDC을 활용(CONJUGATE)하여 지용성 비타민(FAT-SOLUBLE VITAMIN) 표적의 활용: S104:DOPE:Chol:PEG-DMPE:DiVA
표적 제제의 생체 내 활성은(빠른 모형, DMNQ이라 함) 단기 간 손상 모델(short-term liver damage model)에서 평가 하였다. 상기 모델에서, 단기 간 손상은 디메틸니트로스아민(DMN)과 같은 간독성 작용제(hepatotoxic agent)를 처리하여 유발시켰으며, 그리고 gp46 mRNA 수치(levels)의 증가를 동반하였다. 수컷 Sprague-Dawley 렛트에 DMN를 복강내 주사로 6일 연속으로 변화를 유도하였다. DMN 처리 기간이 끝나갈 때, 상기 랫트를 개별 동물의 체종에 기초하여 그룹을 무작위로 나누었다. 제형은 단일 IV 투여 량으로 투여하고, 마지막 DMN의 주입 한 시간 후 받았다. 24시간 후, 간 엽(liver lobes)을 절제하고 모든 gp46 및 MRPL19 mRNA 수치를 정량적 RT-PCR(quantitative RT-PCR)(TaqMan?)에 의하여 분석하였다. GP46에 대한 mRNA 수치는 MRPL19 수준으로 표준화(normalized) 하였다.
결과(도 16)은 레티노이드 활용의 양 및 분명한 효과(efficacy is evident)사이에서 연관성(correlation)을 나타내었다. 랫트 DMNQ 모델에서 오직 0.25 mol% 는 유의적으로 효과를 나타내는데 필요하였다. 2 mol % DiVA는 gp46 발현의 녹다운 시키는 것을 관찰하였다. 도 16은 수컷 Sprague-Dawley 랫트에 간 손상을 유도하는 복강 내 투여를 통해 1 ,2, 3일에 DMN 10 mg/kg 및 4, 5, 6일에 5 mg/kg을 처리하는 것을 나타내었다. 동물(animals)(n = 8/군)에 0, 0.25, 0.5, 1를 포함한 제제 및 0.75 mg/kg siRNA의 용양(dose)에서 2% DiVA, 또는 PBS (처리군)(vehicle)의 어느 하나를 정맥안으로 주입하고, 한시간 후 DMN의 마지막 주입하도록 하였다. 24시간 후, 각 동물에서 오른쪽 간 엽의 섹션에서 총 siRNA 정제 및 RNA가 분리 될 때까지 4℃에서 저장하였다. 대조군(Control groups)은 PBS 처리군(PBS vehicle group)(DMN-treated) 및 자연 그대로(naive)(처리하지 않은; DMN이 없는)군을 포함하였다. 자연 그대로 군에서 gp46 mRNA 수치 배경을 뺀 후, 모든 테스트 군 값(test group values)은 처리군(vehicle group)의 gp46 mRNA 평균으로 표준화(normalized)하였다(처리군의 백분율로 나타내었다).
수컷 Sprague Dawley 랫트(130-160 g)에 DMN을 복강내 투여를 통해 처리하여 간섬유(liver fibrosis)을 유도하도록 하였다. DMN 처리 방법(treatment regimen)은 첫 번째 3주에는 10 mg/kg(예를 들면., 2.0 mL/kg 체중의 용량에서 DMN의 5.0 mg/mL)로 각 주마다 3번(월요일, 수요일 및 금요일) 및 22 내지 57일에는 5 mg/kg의 반 복용량(half dose)(예를 들면.,1.0 mL/kg의 용량에서 DMN의 5 mg/mL)이다. 대조군 동물(sham group animal)에 상기와 같은 방법으로 PBS(DMN에 대한 용매)를 주입하였다. 22일에, 24 시간에 마지막으로 DMN을 처리하고, 혈액(blood) 샘플을 수집하고 간 질환(liver disease) 바이오마커로 DMN 처리의 효율을 확인하기 위하여 분석하였다. DMN 처리 된 동물은 체중에 따라 각기 다른 처리 군으로 나누어 지고 각 군에서 체중 평균(mena) 및 동물의 체중의 범위(range)에서 우의적인 변화가 없음을 확인하였다. 전처리 군 동물은 치료 시작 전 질병의 진행 단계가 시작하여 평가하기 위하여 25일에 희생하였다. gp46 siRNA를 포함한 제제로 처리하고 2 처리/주 총 10번으로 siRNA 용량을 25일에 지정하였다. 59일에, 마지막 제제 처리 48시간 후 및 마지막 DMN 처리 72시간 후, 동물은 CO2 흡입에 의해 희생하였다. 간 엽 절제 및 모든 gp46 및 MRPL19 mRNA 수치 결정은 정량적 RT-PCR(quantitative RT-PCR)(TaqMan)에 의해 분석하였다. gp46에 대한 mRNA 수치는 MRPL19 수치로 표준화하였다.
각 간행물이 구체적으로 및 개별적으로 참고로 포함되도록 나타낸 것처럼 청구항의 내용, 특허(patents), 및 특허 출원(patent applications) 및 모든 서류(documents) 및 전자적으로 유요한 정보(electronically available information)가 언급 또는 본 명세서에 언급, 동일한 정도로 그 전체가 참고로 인용된다.
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본 명세서의 범위 및 사상에서 벗어남이 없이 여기에서 개시된 본 명세서의 다양한 치환 및 변형은 통상의 당업자에게 자명한 것일 것이다. 그러므로, 이러한 부가적 실시예는 본 발명의 명세서 및 다음의 청구항의 범위 내에 있다. 본 발명 명세서는 RNAi 활성 조절을 위한 개선된 활성을 가지는 핵산 컨스트럭트를 생산하는 것에 대하여 여기에서 기재된 것의 다양한 조합 및/또는 화학적 변형의 치환을 테스트하는 통상의 당업자를 개시하고 있다. 이러한 개선 활성은 개선된 안정성, 개선된 생체 이용률, 및/또는 개선된 세포 반응 조절 RNAi를 포함할 수 있다. 그러므로, 여기에서 개시된 특정 실시예에 한정되지 않고 통상의 당업자는 개선된 활성을 가지는 핵산 분자를 판별하는 것에 대하여 과도한 실험없이 여기에 개시된 내용의 변형의 조합을 용이하게 시험할 수 있을 것이라고 용이하게 기대할 수 있다.
본 명세서에 실례적으로 여기에서 개시된 것은 여기에서 특이적으로 언급되지 않은 어떠한 요소, 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부존재하에서 수행되기에 적합할 수 있다. 그러므로, 예를 들면 본 명세서에 기재된 용어 "a" 및 "an" 및 "the" 및 이와 유사한 것(특히, 다음의 청구항의 내용)은 여기에서 지시되거나 명백하게 내용과 배치되지 않는 이상, 단수 및 복수를 모두 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 용어 "포함하는(comprising)" "가지는(having)" "포함하는(including)" "함유하는(containing)" 은 광범위하게 이해되고, 제한이 없다(즉, 의미 "포함하는, 그러나 제한되지 않는."). 여기에서 지시되어 있지 않는 한, 여기에서 값의 범위의 열거는 단순히 범위에 속하는 각 분리된 값을 개별적으로 의미하는 약칭의 방법으로 사용되는 의도이고, 각 분리된 값은 여기에서 개별적으로 설명된 것처럼 본 명세서에 통합되어 있다. 여기에서 개시된 모든 방법은 여기에서 지시하거나 내용과 명백하게 배치되지 않는 한 어떠한 적당한 순서로 수행될 수 있다. 어떠한 모든 예시, 또는 예시적 언어(예를 들면 "와 같은")의 사용은 여기에서 제공되었으며, 단순히 명세서를 더 명백하기 위한 의도이고, 청구되지 않는 인상 본 명세서의 범위를 제한하는 것이 아니다. 명세서의 언어는 명세서의 실시에 필수적인 비-청구된 요소를 지시하지는 것으로 해석되어서는 안된다. 부가적으로 여기에서 사용된 용어 및 표현은 명세서의 용어로 사용되었고, 한정되지 않으며, 기재된 또는 이의 부분 및 나타낸 특징과 어떠한 동등의 것도 배제하는 이러한 용어 및 표현의 사용을 의도하는 것이 없고, 그러나 본 명세서의 청구 범위 내에서 다양한 변형이 가능하다고 인식된다. 그러므로 비록 바람직한 실시예, 선택적 특징에 의해 상세하게 본 발명의 명세서가 개시되어 있다고 하더라도, 여기에서 개시된 설명의 변형 및 변이는 통상의 당업자에게 재분류될 수 있는 것으로 이해되어야 하고, 이러한 변형 및 변이는 본 발명의 명세서 범위에 포함되는 것으로 고려된다.
본 명세서는 여기에서 넓고 일반적으로 개시되었다. 일반적인 개시에 속하는 더 좁은 종 및 아속의 그룹화 각각은 또한 본 명세서의 일부분을 형성한다. 삭제된 내용이 여기에서 상세하게 설명되었는지 여부와 상관없이, 이것은 속(the genus)으로부터 어떠한 사안이 제거된 단서 또는 부정적 한정을 가지는 본 명세서의 일반적인 설명을 포함한다. 그 외의 실시예는 다음의 청구항에 포함된다. 또한, 명세서의 특징 또는 측면은 마쿠쉬 그룹의 관점에서 개시되었고, 통상의 당업자는 어떠한 마쿠쉬 그룹의 개별적 구성 또는 하위그룹 구성의 관점에서 본 명세서가 기재되어 있다는 것을 인식할 것이다.
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Claims (13)

  1. (지질) m-링커-(레티노이드) n [여기서 m 및 n은 독립적인 1, 2 또는 3; 및 여기서 링커(linker)는 비스-아미도-PEG(bis-amido-PEG), 트리스-아미도-PEG(tris-amido-PEG), 테트라-아미도-PEG(tetra-amido-PEG), 리스-비스-아미도-PEG-리스(Lys-bis-amido-PEG-Lys), 리스-트리스-아미도-PEG-리스(Lys-tris-amido-PEG-Lys), 리스-테트라-아미도-PEG-리스(Lys-tetr-amido-PEG-Lys), 리스-PEG-리스(Lys-PEG-Lys), PEG2000, PEG1250, PEG1000, PEG750, PEG550, PEG-Glu, Glu, Gly3, 및 GluNH로 이루어진 군으로부터 선택되고, 및 지질은 하기 화학식 I의 화합물로 구성] 구조로 구성된, 컨쥬게이트:
    [화학식 I]
    Figure 112019049432309-pat00131

    (상기 화학식 I에서,
    R1 및 R2는 독립적으로 C10 내지 C18 알킬(alkyl), C12 내지 C18알케닐(alkenyl), 및 올레일(oleyl)군으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서 R3 및 R4 는 독립적으로 C1 내지 C6 알킬(alkyl), 및 C2 내지 C6 알칸올(alkanol)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며; 여기서 X는 -CH2-, -S-, 및 -O- 로 선택되거나또는 존재하지 않으며(absent); 여기서 Y는 -(CH2)n, -S(CH2)n, -O(CH2)n-, 티오펜(thiophene), -SO2(CH2)n-, 및 에스터(ester)로 선택되고, 여기서 n = 1-4; 여기서 a=1-4; 여기서 b=1-4; 여기서 c=1-4; 및 여기서 Z는 반대이온이다).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 지질은 하기 군으로부터 선택되는 하나 또는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트:
    Figure 112019049432309-pat00132
    .
  3. 제2항에 있어서,
    레티노이드는 비타민 A(vitamin A), 레티노 산(retinoic acid), 트레티노인(tretinoin), 아다팔렌(adapalene), 4-하이드로시(페닐)레티나마이드(4-hydroxy(phenyl)retinamide(4-HPR)), 레티닐 팔미테이트(retinyl palmitate), 레티날(retinal), 포화된 레티노 산(saturated retinoic acid), 및 포화된, 디메틸레이티드 레티노 산(saturated demethylated retinoic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 컨쥬게이트.
  4. 삭제
  5. DSPE-PEG-VA(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-PEG-vitamin A), DSPE-PEG2000-Glu-VA(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-PEG2000-Glu-vitamin A), DSPE-PEG550-VA(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-PEG550-vitamin A), DOPE-VA(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-vitamin A), DOPE-Glu-VA(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-Glu-vitamin A), DOPE-Glu-NH-VA(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-Glu-NH-vitamin A), DOPE-Gly3-VA(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-Gly3-vitamin A), DC-VA((((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenoyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl) ditetradecanoate), 및 DC-6-VA(((6-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenamido)hexanoyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl) ditetradecanoate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 컨쥬게이트.
  6. 제1항의 컨쥬게이트를 포함하는 약물 전달체이되, 상기 약물 전달체는 리포좀 형태인 약물 전달체.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 리포좀은 지질 분자의 이중층(bilayer)을 포함하는 지질 소포(lipid vesicle)를 포함하는 약물 전달체.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 레티노이드 분자는 약물 전달체가 선상세포에 도달하기 전에 약물 전달체의 외부(exterior)에 적어도 부분적으로 노출되는 약물 전달체.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 레티노이드는 지질 분자의 0.1 몰% 내지 20 몰% 인 약물 전달체.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 지질 분자는 하기 군으로부터 선택되는 하나 또는 하나 이상의 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 전달체:
    Figure 112019049432309-pat00133
    .
  11. 제6항에 있어서,
    상기 지질 분자는 하기 S104 구조로 구성되는 화합물을 더 포함하는 약물 전달체:
    Figure 112019049432309-pat00134
    .
  12. 제6항에 있어서,
    핵산을 더 포함하는 약물 전달체.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 약물 전달체는 표적 세포로의 약물 전달을 용이하게 하기 위한 것인 약물 전달체.
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