JP6232083B2 - 薬物送達を標的化しｓｉＲＮＡ活性を増強する化合物 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年６月８日出願の米国仮出願第61/494,840号および61/494,710号の利益を主張し、これらはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明は、ｓｉＲＮＡなどの治療用分子を標的化し、その活性を増強するためのカチオン性脂質および脂溶性ビタミン化合物の使用に関する。
肝臓の線維症は、活性化された肝星細胞（ＨＳＣ）によって引き起こされ得て、その結果、複数種のコラーゲン分子およびフィブロネクチンが間質組織に沈着する。これにより、肝硬変、肝不全、および／または肝細胞癌が生じ得る。さらに、肝線維症と同じメカニズムにより、膵線維症の結果として慢性膵炎が発症する（Madro, et al., 2004, Med Sci Monit. 10:RA166-70、Jaster, 2004, Mol Cancer. 6:26）。さらに星細胞は、声帯瘢痕、声帯粘膜線維症、および喉頭線維症などの声帯および喉頭の疾患に存在する。これらの臓器および体内の他の場所における線維症を予防または処置するため、薬物担体および薬物担体キットの開発に対する要求が存在する。
星細胞は、線維症を処置するための重要な標的候補の１つである（Fallowfield et al., 2004, Expert Opin Ther Targets. 8:423-35、Pinzani, et al., 2004, Dig Liver Dis.36:231-42）。線維症において、星細胞は近傍の細胞からのサイトカインによる活性化を受けて活性化される。星細胞はビタミンＡの貯蔵細胞として知られており、筋線維芽細胞ファミリーに属し、肝線維症を引き起こす多くの因子を産生する。
線維症を予防または処置する治療方法は、コラーゲン代謝の制御、コラーゲン分解系の促進、および星細胞の活性化の阻害を目指す。しかし全ての場合において、作用特異性および／または臓器特異性が低いため、限られた有効性と有害な副作用の問題が存在する。
コラーゲンタンパク質合成の阻害は、治療法として確立されていない。コラーゲン産生を標的化する分子の効力は、副作用を引き起こす可能性のために限定されている。コラーゲン産生の直接的阻害は、線維症を予防または処置するための明らかな治療法となるであろう。これを行うには、種々のＩ〜ＩＶ型コラーゲンのうちの１または２以上の制御が必要である。これを達成する方法は、種々のタイプのコラーゲンが必要とする細胞内輸送および分子成熟に必須のコラーゲン特異的分子シャペロンであるＨＳＰ４７を介するものであってもよい。したがって、ＨＳＰ４７の機能を臓器の星細胞において特異的に制御できれば、その臓器における肝線維症を抑制する可能性がある。
ｓｉＲＮＡなどの治療剤を細胞に送達するために多くの技術が利用可能であり、これは、ウイルストランスフェクション系および非ウイルストランスフェクション系の使用を含む。非ウイルストランスフェクション系としては、例えば、ポリマー、脂質、リポソーム、ミセル、デンドリマー、およびナノ材料が挙げることができる。細胞トランスフェクションのために以前から研究されてきたポリマーの例としては、ポリ（Ｌ−リジン）（ＰＬＬ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、キトサン、およびポリ（２−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ｐＤＭＡＥＭＡ）などのカチオン性ポリマーが挙げられる。
各種類の系は、それぞれの利点と欠点を有する。例えば、ウイルス系は、高いトランスフェクション効率を得ることができるが、一部の非ウイルス系程には安全ではない。さらに、ウイルス系は調製が複雑および／または高価となる可能性がある。カチオン性ポリマーなどの非ウイルストランスフェクション系は、プラスミドＤＮＡを細胞に伝達することが報告されている。しかしながら、カチオン性ポリマーの使用におけるいくつかの欠点としては、細胞への毒性および／または安定性の欠如が挙げられる。
このように、核酸などの治療薬の、細胞、組織および生体への送達を改善するための、新規な化合物、組成物、およびカチオン性成分を用いる方法に対する緊急の必要性が存在する。
本明細書の一側面は、式Ｉ：
式中、Ｒ１およびＲ２は独立して、Ｃ１０〜Ｃ１８アルキル、Ｃ１２〜Ｃ１８アルケニル、およびオレイル基からなる群から選択され、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ２〜Ｃ６アルカノールからなる群から選択され、Ｘは、−ＣＨ２−、−Ｓ−、および−Ｏ−からなる群から選択されるか、または不在であり、Ｙは、−（ＣＨ２）ｎ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−、チオフェン、−ＳＯ２（ＣＨ２）ｎ−、およびエステルから選択され、ｎ＝１〜４であり、ａ＝１〜４であり、ｂ＝１〜４であり、ｃ＝１〜４であり、Ｚは対イオンである、
で表される化合物である。
一側面において、本発明は、標的細胞への薬物送達を促進する化合物であって、（標的化分子）ｍ−リンカー−（標的化分子）ｎの構造からなり、式中、標的化分子は、標的細胞上に特異的受容体または活性化／結合部位を有するレチノイドであり、ｍおよびｎは独立して、０、１、２または３であり、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＰＥＧ様分子を含む、前記化合物を提供する。
一態様において、レチノイドは、ビタミンＡ、レチノイン酸、トレチノイン、アダパレン、４−ヒドロキシ（フェニル）レチンアミド（４−ＨＰＲ）、パルミチン酸レチニル、レチナール、飽和レチノイン酸、および飽和脱メチル化レチノイン酸からなる群から選択される。
別の態様において、リンカーは、ビス−アミド−ＰＥＧ、トリス−アミド−ＰＥＧ、テトラ−アミド−ＰＥＧ、Ｌｙｓ−ビス−アミド−ＰＥＧ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−トリス−アミド−ＰＥＧ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−テトラ−アミド−ＰＥＧ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ１２５０、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ７５０、ＰＥＧ５５０、ＰＥＧ−Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ｃ６、Ｇｌｙ３、およびＧｌｕＮＨからなる群から選択される。
別の態様において、化合物は、レチノイド−ＰＥＧ−レチノイド、（レチノイド）２−ＰＥＧ−（レチノイド）２、ＶＡ−ＰＥＧ２０００−ＶＡ、（レチノイド）２−ビス−アミド−ＰＥＧ−（レチノイド）２、（レチノイド）２−Ｌｙｓ−ビス−アミド−ＰＥＧ−Ｌｙｓ−（レチノイド）２からなる群から選択される。
別の態様において、レチノイドは、ビタミンＡ、レチノイン酸、トレチノイン、アダパレン、４−ヒドロキシ（フェニル）レチンアミド（４−ＨＰＲ）、パルミチン酸レチニル、レチナール、飽和レチノイン酸、および飽和脱メチル化レチノイン酸からなる群から選択される。
別の態様において、化合物は、式：
式中、ｑ、ｒ、およびｓは各々独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である、
の組成物である。
別の態様において、化合物の式は、
を含む。
別の側面において、本発明は、星細胞特異的な量の、（標的化分子）ｍ−リンカー−（標的化分子）ｎの構造からなるレチノイド分子を含む、星細胞特異的薬物坦体であって、式中、ｍおよびｎは独立して、０、１、２または３であり、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＰＥＧ様分子を含む、前記薬物坦体を提供する。
別の態様において、本発明は、リポソーム組成物を含む組成物を提供する。他の態様において、リポソーム組成物は、脂質分子の二重層を含む脂質小胞を含む。
一部の態様において、レチノイド分子は、薬物坦体が星細胞に到達する前に、少なくとも部分的に薬物坦体の外部に露出される。
別の態様において、レチノイドは、脂質分子の０．１ｍｏｌ％〜２０ｍｏｌ％である。
本発明においては、脂質分子が、ＨＥＤＣ、ＤＯＤＣ、ＨＥＤＯＤＣ、ＤＳＰＥ、ＤＯＰＥ、およびＤＣ−６−１４からなる群から選択される１または２以上の脂質を含む態様も提供される。別の態様において、脂質分子はさらにＳ１０４を含む。
特定の態様において、薬物担体は核酸を含む。
他の態様において、核酸は、星細胞におけるｈｓｐ４７ ｍＲＮＡの発現をノックダウン可能なｓｉＲＮＡである。
別の側面において、本発明は、標的細胞への薬物送達を促進する化合物であって、（脂質）ｍ−リンカー−（標的化分子）ｎの構造からなり、式中、標的化分子は、標的細胞上に特異的受容体または活性化／結合部位を有するレチノイドまたは脂溶性ビタミンであり、ｍおよびｎは独立して、０、１、２または３であり、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を含む、前記化合物を提供する。
一態様において、脂質は、ＤＯＤＣ、ＨＥＤＯＤＣ、ＤＳＰＥ、ＤＯＰＥ、およびＤＣ−６−１４からなる群の１または２以上から選択される。
別の態様において、レチノイドは、ビタミンＡ、レチノイン酸、トレチノイン、アダパレン、４−ヒドロキシ（フェニル）レチンアミド（４−ＨＰＲ）、パルミチン酸レチニル、レチナール、飽和レチノイン酸、および飽和脱メチル化レチノイン酸からなる群から選択される。
本発明の別の態様において、脂溶性ビタミンは、ビタミンＤ、ビタミンＥ、またはビタミンＫである。
別の態様において、リンカーは、ビス−アミド−ＰＥＧ、トリス−アミド−ＰＥＧ、テトラ−アミド−ＰＥＧ、Ｌｙｓ−ビス−アミド−ＰＥＧ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−トリス−アミド−ＰＥＧ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−テトラ−アミド−ＰＥＧ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ１２５０、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ７５０、ＰＥＧ５５０、ＰＥＧ−Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ｃ６、Ｇｌｙ３、およびＧｌｕＮＨからなる群から選択される。
別の態様において、本発明は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＶＡ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｇｌｕ−ＶＡ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５５０−ＶＡ、ＤＯＰＥ−ＶＡ、ＤＯＰＥ−Ｇｌｕ−ＶＡ、ＤＯＰＥ−Ｇｌｕ−ＮＨ−ＶＡ、ＤＯＰＥ−Ｇｌｙ３−ＶＡ、ＤＣ−ＶＡ、ＤＣ−６−ＶＡ、およびＡＲ−６−ＶＡからなる群から選択される。
図１は、本明細書の特定の態様のノックダウン効力を示した図である。これは、ＤＣ−６−１４リポプレックス対照と比較したＨＥＤＣリポソームを含む。
図２は、カチオン性脂質を用いた遺伝子ノックダウンのin vitroの比較を示した図である。
図３は、本発明の例示的なＨＥＤＯＤＣリポソーム製剤による、in vivoの遺伝子発現の評価を示した図である（＊はｐ＜０．０５を表す）。
図４は、例１５の例示的なＨＥＤＣリポソーム製剤による、in vitroの遺伝子発現の評価を示した図である。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。シグモイド用量反応曲線を、最良適合に基づいて示す。ＥＣ５０値はこの曲線から算出した。これは１１．８ｎＭであることが示されている。
図５は、ラットＤＭＮＱモデルを用いたin vivoでの測定結果を示す。未処置群から決定したバックグラウンドのｇｐ４６ ｍＲＮＡレベルを減算した後、全てのテスト群の値を、ビヒクル群の平均ｇｐ４６ ｍＲＮＡに対して正規化した（ビヒクル群のパーセントとして表される）。処置後の平均ｇｐ４６ ｍＲＮＡレベルは、用量依存性応答およびシグモイド用量反応曲線に適合する曲線を示した。算出したＥＤ５０値は０．７９ｍｇ／ｋｇである。
図６は、ラットＤＭＮＣモデルを用いたin vivoでの測定結果を示す。未処置群から決定したバックグラウンドのｇｐ４６ ｍＲＮＡレベルを減算した後、すべてのテスト群の値を、ビヒクル群の平均ｇｐ４６ ｍＲＮＡに対して正規化した（ビヒクル群のパーセントとして表される）。ＭＲＰＬ１９ ｍＲＮＡレベルは定量的ＲＴ−ＰＣＲ（TaqMan(R)）アッセイにより決定した。ｇｐ４６のｍＲＮＡレベルはＭＲＰＬ１９レベルに対して正規化した。（＊＊＊はｐ＜０．０２を示す。）
図７は、ラット肺ブレオマイシンモデルを用いたin vivoでの測定結果を示した図である。棒グラフは各群のアザン染色肺切片の線維症（Ｔ．アシュクロフト）スコアの概要である。統計解析は、Prism5ソフトウェアによる一元配置ＡＮＯＶＡ、ボンフェローニ多重比較検定を用いて行った。 図８は、ＶＡ結合体のリポソームへのデコレーション（decoration）による付加が、ｓｉＲＮＡ活性を高めることを示した図である。
図９は、ＶＡ結合体のリポソームへの共可溶化による付加がｓｉＲＮＡ活性を高めることを示した図である。
図１０は、ＶＡ結合体のリポソームへの共可溶化による付加がｓｉＲＮＡ活性を高めることを示した図である。
図１１は、ＶＡ結合体のリポプレックスへの共可溶化による付加がｓｉＲＮＡ活性を高めることを示した図である。
図１２は、ＶＡ結合体のリポプレックスへの共可溶化ｖｓデコレーションによる付加を示した図である。
図１３は、マウスＣＣｌ４モデルにおけるin vivo有効性を示した図である。
図１４は、デコレーションされたレチノイド結合体ｖｓ共可溶化されたレチノイド結合体のin vivo有効性を示した図である。 図１５は、in vitro有効性（ｐＨＳＣ）、リポソーム製剤におけるレチノイド結合体の効果を示した図である。
図１６は、レチノイド結合体含量（ｍｏｌ％）とin vivo（ラットＤＭＮＱ）有効性の相関を示した図である。雄性Sprague-Dawleyラットに、０、０．２５、０．５、１、および２％のＤｉＶＡを含有する製剤を０．７５ｍｇ／ｋｇ ｓｉＲＮＡ の用量で、またはＰＢＳ（ビヒクル）のいずれかを、ＤＭＮの最後の注射の１時間後に静脈内注射した。
本明細書の範囲内であるのは、式Ｉ：
式中、Ｒ１およびＲ２は独立して、Ｃ１０〜Ｃ１８アルキル、Ｃ１２〜Ｃ１８アルケニル、およびオレイル基からなる群から選択され、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ２〜Ｃ６アルカノールからなる群から選択され、Ｘは、−ＣＨ２−、−Ｓ−、および−Ｏ−からなる群から選択されるか、または不在であり、Ｙは、−（ＣＨ２）ｎ、−Ｓ（ＣＨ２）ｎ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ、チオフェン、−ＳＯ２（ＣＨ２）ｎ、およびエステルから選択され、ｎ＝１〜４であり、ａ＝１〜４であり、ｂ＝１〜４であり、ｃ＝１〜４であり、Ｚは対イオンである、
で表される化合物である。
本発明の化合物は、本明細書においてまた、「カチオン性脂質」として知られる化合物のクラスにあるものとして言及される。カチオン性脂質とは、少なくとも１つの脂質部分と、対イオンと会合する正に帯電した窒素とを含む化合物である。「脂質」は、当技術分野において、疎水性のアルキルまたはアルケニル部分、および、カルボン酸またはエステル部分から構成されるものと理解されている。
したがって、式Ｉの化合物のアミノ−アルキル−ヒドロキシル（−Ｎ−アルキル−ＯＨ）部分は、本発明の製剤に、以前に報告された他のカチオン性脂質には見られない特性を付与することが見出された。式Ｉの化合物を含む本発明の製剤は、式Ｉの化合物を含まない製剤に比べて、タンパク質発現の大幅な低下をもたらす。特に驚くべきことは、式Ｉの化合物を含む本発明の製剤の、ＨＳＰ４７の発現を低下させる能力である。
本発明の好ましい化合物は、Ｒ１およびＲ２が各々独立して、Ｃ１０〜Ｃ３０アルキルであるものである。より好ましい態様において、Ｒ１およびＲ２は各々独立して、Ｃ１０〜Ｃ２０アルキルである。さらにより好ましい態様において、Ｒ１およびＲ２は各々独立して、Ｃ１２〜Ｃ１８アルキルである。特に好ましい態様としては、Ｒ１およびＲ２が各々独立して、Ｃ１３〜Ｃ１７アルキルであるものを含む。最も好ましいのは、Ｒ１およびＲ２がそれぞれＣ１３アルキルである化合物である。
別の態様において、Ｒ１およびＲ２は各々独立して、Ｃ１０〜Ｃ３０アルケニルである。より好ましい態様において、Ｒ１およびＲ２は各々独立して、Ｃ１０〜Ｃ２０アルケニルである。さらに別の態様において、Ｒ１およびＲ２は各々独立して、Ｃ１２〜Ｃ１８アルケニルである。さらに別の態様において、Ｒ１およびＲ２は各々独立して、Ｃ１３〜Ｃ１７アルケニルである。本発明の最も好ましい化合物は、Ｒ１およびＲ２がそれぞれＣ１７アルケニルであるものを含む。
式Ｉの化合物についてまた、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択される。好ましい態様において、Ｒ３およびＲ４は各々独立して、Ｃ１〜Ｃ３アルキルである。最も好ましくは、Ｒ３およびＲ４はそれぞれメチルである。別の態様において、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つは−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨである。
最も好ましいのは、ａ＝ｂ＝ｃ＝１である、式Ｉの化合物である。
Ｚは、用語が当技術分野で容易に理解される意味において、任意の窒素対イオンであることができる。好ましい窒素対イオンはハロゲンおよびメシレート（ＳＯ３ＣＨ３ −）を含み、ハロゲンとしては塩化物および臭化物が特に好ましい。その効果が対イオンに依存している、以前に記載された別のカチオン性脂質とは対照的に、式Ｉの化合物の有効性は、驚くべきことに、選択された対イオンに関連しないようにみえる。
例示的な式Ｉの化合物は、以下を含む：
本発明の範囲内にあるのは、標的細胞への薬物送達を促進する化合物であって、（標的化分子）ｍ−リンカー−（標的化分子）ｎの構造からなり、式中、標的化分子は、標的細胞上に特異的受容体または[活性化／結合部位]を有するレチノイドまたは脂溶性ビタミンであり、ｍおよびｎは独立して、０、１、２または３であり、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＰＥＧ様分子を含むものであり、これは「式Ａ」と称される。
本発明はまた、標的細胞への薬物送達を促進する化合物であって、（脂質）ｍ−リンカー−（標的化分子）ｎの構造からなり、式中、標的化分子は、標的細胞上に特異的受容体を有するレチノイドまたは脂溶性ビタミンであり、ｍおよびｎは独立して、０、１、２または３であり、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧ様分子を含むものであり、これは「式Ｂ」と称される。
これまでに、式Ａまたは式Ｂの化合物は、本発明の製剤に以前には見られなかった特性を付与することが見出されている。式Ａまたは式Ｂの化合物を含む本発明の製剤は、これらの化合物を含まない製剤に比べて、遺伝子発現の大幅な低減をもたらす。特に驚くべきことは、式Ａの化合物を含む本発明の製剤の、ＨＳＰ４７の発現を低減する能力である。
一定の好ましい態様において、レチノイドは、ビタミンＡ、レチノイン酸、トレチノイン、アダパレン、４−ヒドロキシ（フェニル）レチンアミド（４−ＨＰＲ）、パルミチン酸レチニル、レチナール、飽和レチノイン酸、および飽和脱メチル化レチノイン酸からなる群から選択される。
好ましい態様は、リンカーが、ビス−アミド−ＰＥＧ、トリス−アミド−ＰＥＧ、テトラ−アミド−ＰＥＧ、Ｌｙｓ−ビス−アミド−ＰＥＧ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−トリス−アミド−ＰＥＧ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−テトラ−アミド−ＰＥＧ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ１２５０、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ７５０、ＰＥＧ５５０、ＰＥＧ−Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ｃ６、Ｇｌｙ３、およびＧｌｕＮＨからなる群から選択される化合物を含む。別の態様において、ＰＥＧは単分散である。
別の態様は、式Ａがレチノイド−ＰＥＧ−レチノイド、（レチノイド）２−ＰＥＧ−（レチノイド）２、ＶＡ−ＰＥＧ２０００−ＶＡ、（レチノイド）２−ビス−アミド−ＰＥＧ−（レチノイド）２、（レチノイド）２−Ｌｙｓ−ビス−アミド−ＰＥＧ−Ｌｙｓ−（レチノイド）２からなる群から選択される、化合物を提供する。
別の好ましい態様において、化合物は、式：
式中、ｑ、ｒ、およびｓは各々独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である、
で表される。
別の好ましい態様において、式の化合物は、
を含む。
本発明の別の態様は、表１に示す構造を含む。
少なくとも１種の式Ｉの化合物およびリポソームを含む本発明の組成物はさらに、１または２以上のレチノイド結合体を含んでよい。本発明の好ましい態様において、レチノイド結合体は、組成物または製剤の全重量に基づいて約０．３〜約３０ｗｔ％の濃度で存在し、これは約０．１〜約１０ｍｏｌ％と等価であり、これは約０．１〜約１０のモル比と等価である。好ましくはレチノイド結合体は、レチノイド−リンカー−脂質分子またはレチノイド−リンカー−レチノイド分子である。
レチノイド結合体の例としては、式ＩＩ：
式中、ｑ、ｒ、およびｓは各々独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である、
で表される化合物、ならびにそのエナンチオマーおよびジアステレオマーを含む。
式ＩＩの好ましい化合物としては、ｑ、ｒ、およびｓが各々独立して、１、２、３、４、５、６、または７であるものを含む。より好ましいのは、ｑ、ｒ、およびｓが各々独立して、３、４、または５である式ＩＩの化合物である。最も好ましいのは、ｑが３、ｒが５、およびｓが３である、式ＩＩの化合物である。式ＩＩの化合物の一例は
である。
ＤｉＶＡ−ＰＥＧ−ＤｉＶＡは立体中心を含み、全てのエナンチオマーおよびジアステレオマーは本発明の範囲内とみなされる。
式Ｉのカチオン性脂質を含む、本発明の組成物中のカチオン性脂質の濃度は、脂質組成物の全重量に基づき１〜約８０ｗｔ％であることができる。より好ましくは、濃度は１〜約７５ｗｔ％である。さらにより好ましくは、濃度は約３０〜約７５ｗｔ％である。約３０〜約７５ｗｔ％の濃度は、約３０〜６０ｍｏｌ％および約３０〜６０のモル比に相当する。最も好ましいのは、約５０ｗｔ％のカチオン性脂質濃度を有する組成物である。イオン化可能なカチオン性脂質と式Ｉの四級アミンカチオン性脂質との混合物を含む製剤において、好ましいｍｏｌ％は、５％〜４５ｍｏｌ％であり、さらにより好ましいのは、約２０ｍｏｌ％のイオン化可能なカチオン性脂質と２０ｍｏｌ％の式Ｉの四級アミンカチオン性脂質との混合物である。
かかる組成物はまた、水性媒体を含むことができる。式Ｉのものを含むカチオン性脂質は、かかる態様においてリポソーム内にカプセル化することができ、水性媒体にアクセス不能となり得る。さらに、式Ｉのものを含むカチオン性脂質は、リポソームの外表面に局在させて、水性媒体にアクセス可能とすることができる。
少なくとも１種の式Ｉの化合物およびリポソーム、および任意に、例えば式ＩＩの化合物などのレチノイド結合体を含む本発明の組成物はまた、ｓｉＲＮＡも含むことができる。さらに本発明の範囲内であるのは、式ＡまたはＢの少なくとも１種の化合物およびｓｉＲＮＡを含む製剤である。
任意のｓｉＲＮＡ分子を、本発明の範囲内で用いることができると想定される。ｓｉＲＮＡは、以下に示す配列番号１により例示されるヒトｈｓｐ４７のｍＲＮＡコード配列に対するアンチセンス配列を含んでもよい。
例えば、
である。
かかる組成物はまた、水性媒体を含むことができる。好ましくは、かかる組成物は、電荷複合体中の少なくとも１種の式Ｉの化合物およびｓｉＲＮＡから本質的になる。式Ｉの化合物およびｓｉＲＮＡを含むかかる組成物は、さらに、液体媒体を含むことができる。一態様において、液体媒体は、生体への注入に適している。本発明の任意の記載された態様の範囲内の液体媒体は、水性であることができ、すなわち、完全に水性溶剤から構成することができ、および塩、緩衝剤、および／または他の医薬賦形剤を含むことができる。別の態様において、液体媒体は、水性溶剤と、例えば有機溶剤などの他の液体溶剤との組合せからなってもよい。本発明の任意の記載された態様の範囲内の液体媒体はまた、少なくとも１種の有機溶剤を含むことができる。有機溶剤は、それ自体当技術分野で知られており、Ｃ１〜Ｃ４アルコール、ジメチルスルホキシド（「ＤＭＳＯ」）などを含む。水と少なくとも１種の有機溶剤との混合物を含む、これらの液体媒体もまた、本発明のあらゆる記載された態様の範囲内である。
さらに本発明の範囲内であるのは、少なくとも１種の式Ｉの化合物とリポソームとを含む組成物である。一部の態様は、式Ｉの化合物の混合物とリポソームとを含むことができる。他の態様は、リポソームおよび１または２以上の式Ｉの化合物を、式Ｉの範囲内ではないカチオン性脂質に加えて含むことができる。
一部の態様において、ｓｉＲＮＡはリポソームによりカプセル化され、このｓｉＲＮＡは水性媒体にアクセス不能となる。他の態様において、ｓｉＲＮＡはリポソームによりカプセル化されない。かかる態様において、ｓｉＲＮＡはリポソームの外表面上に複合体化することができる。これらの態様においては、ｓｉＲＮＡは水性媒体にアクセス可能である。
他の態様は、リポソーム組成物を含む星細胞特異的薬物担体を含む。リポソーム組成物は、脂質分子の二重層を含む脂質小胞を含むことができる。特定の態様において、レチノイド分子は、薬物担体が星細胞に到達する前に、少なくとも部分的に薬物担体の外部に露出されることが好ましい場合もある。
本発明の特定の態様は、脂質分子が、ＨＥＤＣ、ＤＯＤＣ、ＨＥＤＯＤＣ、ＤＳＰＥ、ＤＯＰＥ、およびＤＣ−６−１４からなる群から選択される１または２以上の脂質を含む。他の態様において、脂質分子はさらに、Ｓ１０４を含むことができる。
一部の態様において、ｓｉＲＮＡはリポソームによりカプセル化され、このｓｉＲＮＡは水性媒体にアクセス不能となる。他の態様において、ｓｉＲＮＡはリポソームによりカプセル化されない。かかる態様において、ｓｉＲＮＡはリポソームの外表面上に複合体化することができる。これらの態様において、ｓｉＲＮＡは水性媒体にアクセス可能である。
他の態様は、リポソーム組成物を含有する星細胞特異的薬物担体を含む。リポソーム組成物は、脂質分子の二重層を含む脂質小胞を含むことができる。他の態様において、レチノイド分子は、薬物担体が星細胞に到達する前に、少なくとも部分的に薬物担体の外部に露出される。
特定の好ましい態様において、レチノイドは脂質分子の０．１ｍｏｌ％〜２０ｍｏｌ％である。
前述の組成物はまた、当技術分野においてそれ自体既知の、ＰＥＧリン脂質およびＰＥＧセラミドを含むＰＥＧ結合脂質を含むことができ、これらは以下から選択される１または２以上の分子を含む：ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ、ＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥ、ＰＥＧ２０００−ＤＭＰＥ、ＰＥＧ２０００−ＤＯＰＥ、ＰＥＧ１０００−ＤＳＰＥ、ＰＥＧ１０００−ＤＰＰＥ、ＰＥＧ１０００−ＤＭＰＥ、ＰＥＧ１０００−ＤＯＰＥ、ＰＥＧ５５０−ＤＳＰＥ、ＰＥＧ５５０−ＤＰＰＥ、ＰＥＧ−５５０ＤＭＰＥ、ＰＥＧ−１０００ＤＯＰＥ、ＰＥＧ−コレステロール、ＰＥＧ２０００−セラミド、ＰＥＧ１０００−セラミド、ＰＥＧ７５０−セラミド、およびＰＥＧ５５０−セラミド。
本発明の前述の組成物は、１または２以上のリン脂質、例えば１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（「ＤＳＰＣ」）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（「ＤＰＰＣ」）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（「ＤＰＰＥ」）、および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）などを含むことができる。好ましくは、ヘルパーリン脂質はＤＯＰＥである。
例えば、本発明の範囲内のリポソームは、本明細書に記載の共可溶化法を用いて組み込まれる、種々のＰＥＧ脂質を用いて調製された。これらの製剤は、カチオン性脂質：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤｉＶＡ−ＰＥＧ−ＤｉＶＡ：ＰＥＧ脂質（５０：１０：３８：５：２のモル比）を含み、各製剤は本明細書に記載のｐＨＳＣ in vitroアッセイにおいて、ヒト／ラットＨＳＰ−４７−Ｃ ｓｉＲＮＡを２００ｎＭの濃度で用いて試験した。結果を以下の表に示す。
本発明の前述の組成物は、１または２以上のリン脂質、例えば、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（「ＤＳＰＣ」）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（「ＤＰＰＣ」）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（「ＤＰＰＥ」）、および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）などを含むことができる。好ましくは、ヘルパーリン脂質はＤＯＰＥである。
式Ｉのカチオン性脂質に加えて、他の脂質も有用たり得る。これらは、以下に示されるＳ１０４を含む、イオン化可能なカチオン性脂質を含む。
送達製剤は、式Ｉのカチオン性脂質と、イオン化可能なカチオン性脂質との組合せからなるものであってもよい。イオン化可能なカチオン性脂質は、例えばＳ１０４を含んでもよい。イオン化可能なカチオン性脂質は０〜４５ｍｏｌ％の濃度で存在することができ、これは５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、および４５ｍｏｌ％から選択される濃度を含む。
さらに本発明の範囲内にあるのは、薬学的に許容し得る担体または希釈剤に加えて、前述の組成物のいずれかを含む医薬製剤である。本発明の医薬製剤は、少なくとも１種の治療剤を含む。好ましくは、治療剤はｓｉＲＮＡである。あらゆるｓｉＲＮＡ分子を、本発明の範囲内で使用し得ることが想定される。
さらに本発明の範囲内にあるのは、薬学的に許容し得る担体または希釈剤に加えて、前述の化合物のいずれかを含む医薬製剤である。本発明の医薬製剤は、少なくとも１種の治療剤を含む。好ましくは、治療剤はｓｉＲＮＡである。あらゆるｓｉＲＮＡ分子を、本発明の範囲内で使用し得ることが想定される。前述のように、ｓｉＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４として示される配列を含む。
ｓｉＲＮＡを含む本発明の好ましい製剤において、ｓｉＲＮＡは、リポソームによってカプセル化される。他の態様において、ｓｉＲＮＡはリポソームの外側にあってもよい。これらの態様において、ｓｉＲＮＡは、リポソームの外側に複合体化することができる。
カチオン性脂質：ｓｉＲＮＡ（脂質の窒素のｓｉＲＮＡのリン酸に対する比率、「Ｎ：Ｐ」）の範囲は、０．２から５．０である。本発明の組成物および製剤のためのＮ：Ｐの特に好ましい範囲は、１．５〜２．５である。
本発明の好ましい製剤としては、ＨＥＤＣ：Ｓ１０４：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＭＰＥ：ＤｉＶＡ−ＰＥＧ−ＤｉＶＡ（２０：２０：３０：２５：５：２のモル比）、およびＨＥＤＣ：Ｓ１０４：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＭＰＥ：ＤｉＶＡ−ＰＥＧ−ＤｉＶＡ（２０：２０：３０：２５：５：２のモル比）であってＤｉＶＡ−ＰＥＧ−ＤｉＶＡが共可溶化されているもの、ＤＯＤＣ：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＰＥＧ−脂質：ＤｉＶＡ−ＰＥＧ−ＤｉＶＡ（５０：１０：３８：２：５のモル比）、およびＤＯＤＣ：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＰＥＧ脂質：ＤｉＶＡ−ＰＥＧ−ＤｉＶＡ製剤であってＤｉＶＡ−ＰＥＧ−ＤｉＶＡが共可溶化されているもの、を含むものが挙げられる。
本発明の他の製剤としては、ＨＥＤＯＤＣ：ＤＯＰＥ：コレステロール−ＰＥＧ−脂質：ＤｉＶＡ−ＰＥＧ−ＤｉＶＡ（５０：１０：３８：２：５のモル比）を含むもの、およびＨＥＤＯＤＣ：ＤＯＰＥ：コレステロール−ＰＥＧ−脂質：ＤｉＶＡ−ＰＥＧ−ＤｉＶＡ製剤であってＤｉＶＡ−ＰＥＧ−ＤｉＶＡが共可溶化されているものが挙げられる。
本発明の他の製剤としては、ＤＣ−６−１４：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤｉＶＡ−ＰＥＧ−ＤｉＶＡ（４０：３０：３０：５、モル比）、およびＤＣ−６−１４：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤｉＶＡ−ＰＥＧ−ＤｉＶＡであってＤｉＶＡ−ＰＥＧ−ＤｉＶＡが共可溶化されているもの、を含むものが挙げられる。
また本発明の範囲内であるのは、患者に治療剤を送達する方法である。これらの方法は、上記の任意の組成物および薬学的に許容し得る担体または希釈剤を含む医薬製剤を提供すること、および該医薬製剤を患者に投与することを含む。
定義
本明細書において、「アルキル」は、直鎖または分枝の完全飽和（二重結合または三重結合なし）炭化水素基を意味し、例えば一般式−ＣｎＨ２ｎ＋１を有する基である。アルキル基は、１〜５０個の炭素原子（本明細書で表示される場合、「１〜５０」などの数値範囲は、与えられた範囲内の各整数を意味する、例えば、「１〜５０個の炭素原子」とは、アルキル基が１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子等、最大５０個までの炭素原子から構成され得ることを意味するが、ただし本定義はまた、数値範囲が指定されていない用語「アルキル」の出現も包含する）。アルキル基はまた、１〜３０個の炭素原子を有する中間サイズのアルキルであってもよい。アルキル基はまた、１〜５個の炭素原子を有する低級アルキルであることもできる。化合物のアルキル基は、「Ｃ１〜Ｃ４アルキル」または類似の名称で指定することができる。ほんの一例として、「Ｃ１〜Ｃ４アルキル」はアルキル鎖に１〜４個の炭素原子が存在することを示し、すなわちアルキル鎖は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、およびｔ−ブチルからなる群から選択される。典型的なアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において、「アルケニル」は、直鎖または分枝の炭化水素鎖内に１または２以上の二重結合を含むアルキル基を指す。アルケニル基は、非置換であっても、置換されていてもよい。置換されている場合、置換基（単数または複数）は特に明記しない限り、アルキル基の置換に関して上記で開示されたものと同じ基から選択することができる。
本明細書において、「アルキニル」は、直鎖または分枝の炭化水素鎖内に１または２以上の三重結合を含むアルキル基を指す。アルキニル基は、非置換であっても、置換されていてもよい。置換されている場合、置換基（単数または複数）は特に明記しない限り、アルキル基の置換に関して上記で開示されたものと同じ基から選択することができる。
本明細書において、「ハロゲン」は、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩを指す。
本明細書において、「メシレート」は、−ＯＳＯ２ＣＨ３を指す。
本明細書において、用語「医薬製剤」は、本明細書に開示された組成物と、希釈剤または追加の医薬用担体などの１または２以上の他の化学成分との混合物を指す。医薬製剤は、組成物の生物への投与を容易にする。医薬製剤を投与する多数の技術が当技術分野に存在し、これらは注射および非経口投与を含むが、これらに限定されるものではない。
本明細書において、用語「医薬担体」は、化合物の細胞または組織への取り込みを促進する化合物を指す。例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、多くの有機化合物の、生物の細胞または組織への取り込みを促進するため、一般的に利用される担体である。
本明細書において、用語「希釈剤」は、水中に希釈された化合物であって、対象となる製剤（例えば、化合物、レチノイド、第２の脂質、安定剤、および／または治療剤を含み得る製剤）を溶解し、また製剤の生物学的に活性な形態を安定化させるものを指す。緩衝液に溶解された塩は、当技術分野において希釈剤として利用される。一般的に使用される１つの緩衝液は、ヒト血液の塩条件を模倣するリン酸緩衝生理食塩水である。緩衝塩は低濃度で溶液のｐＨを制御することができるため、緩衝希釈剤は、製剤の生物学的活性をほとんど改変しない。本明細書において、「賦形剤」は、限定することなく、嵩、硬度（consistency）、安定性、結合性、滑沢性、崩壊能などを組成物に提供するために、製剤に添加される不活性物質を指す。「希釈剤」は賦形剤の一種である。
本明細書において、「治療剤」は、哺乳動物に対して治療有効量で投与された場合に、哺乳動物に治療上の利益を提供する化合物を指す。治療剤は、本明細書において薬物と呼ぶことができる。当業者は、用語「治療剤」が、規制認可された薬物に限定されないことを理解する。「治療剤」は、本明細書に記載の化合物、レチノイド、および／または第２の脂質などに、動作可能に結合させることができる。例えば、本明細書に記載の第２の脂質はリポソームを形成することができ、そして治療剤は、例えば本明細書に記載のように、リポソームと動作可能に結合させることができる。
本明細書において、「リポプレックス製剤」は、ｓｉＲＮＡがリポソームの外側にある製剤を指す。好ましいリポプレックス製剤において、ｓｉＲＮＡはリポソームの外側に複合体化される。別の好ましいリポプレックス製剤としては、ｓｉＲＮＡが、リポソームの外側に存在する任意の媒体にアクセス可能であるものが挙げられる。
本明細書において、「リポソーム製剤」は、ｓｉＲＮＡがリポソーム内にカプセル化された製剤を指す。好ましいリポソーム製剤において、ｓｉＲＮＡは、リポソームの外側に存在する任意の媒体にアクセス不能である。
本明細書において、用語「共可溶化された」は、空の小胞が形成される前に、成分をカチオン性脂質混合物に添加することを指す。
本明細書において、用語「デコレーションされた」は、小胞形成後に、成分を添加することを指す。
本明細書において、「ＤＣ−６−１４」は、次のカチオン性脂質化合物を指す：
本明細書において、「ＤＯＤＣ」は、次のカチオン性脂質化合物を指す：
本明細書において、「ＨＥＤＯＤＣ」は、次のカチオン性脂質化合物を指す：
本明細書において、「レチノイド」は、ヘッド−トゥー−テイル式に連結された４つのイソプレノイド単位で構成される化合物のクラスの成員である。G. P. Moss, “Biochemical Nomenclature and Related Documents,” 2nd Ed. Portland Press, pp. 247-251 (1992)参照。「ビタミンＡ」は、レチノールの生物学的活性を定性的に示すレチノイドについての一般的な記述子である。本明細書においてレチノイドは、第１世代、第２世代および第３世代レチノイドを含む、天然および合成レチノイドを指す。天然に存在するレチノイドの例としては、限定することなく、（１）１１−ｃｉｓ−レチナール、（２）ａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノール、（３）パルミチン酸レチニル、（４）ａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸、および（５）１３−ｃｉｓ−レチノイン酸が挙げられる。さらに、用語「レチノイド」は、レチノール、レチナール、レチノイン酸、レキシノイド、脱メチル化および／または飽和レチノイン酸、およびそれらの誘導体を包含する。
本明細書において、「レチノイド結合体」は、少なくとも１つのレチノイド部分を含む分子を指す。
本明細書において、「レチノイド−リンカー−脂質分子」は、例えばＰＥＧ部分などの少なくとも１つのリンカーを介して、少なくとも１つの脂質部分に付着した少なくとも１つのレチノイド部分を含む分子を指す。
本明細書において、「レチノイド−リンカー−レチノイド分子」は、少なくとも１つのレチノイド部分であって、例えばＰＥＧ部分などの少なくとも１つのリンカーを介して、少なくとも１つの別のレチノイド部分（これは同一でも異なっていてもよい）に付着した前記レチノイド部分を含む、分子を指す。
本明細書において、「ビタミンＤ」は、抗くる病活性を有するビタミン群についての一般的な記述子である。ビタミンＤ群は、以下を含む：ビタミンＤ２（カルシフェロール）、ビタミンＤ３（照射２２−ジヒドロエルゴステロール）、ビタミンＤ４（照射ジヒドロシトステロール）、およびビタミンＤ５（照射デヒドロシトステロール）。
本明細書において、「ビタミンＥ」は、抗酸化活性を有する分子群についての一般的な記述子である。ビタミンＥファミリーはα−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、およびδ−トコフェロールを含み、α−トコフェロールが最も一般的である（Brigelius-Flohe and Traber, The FASEB Journal. 1999;13:1145-1155）。
本明細書において、「ビタミンＫ」は、抗出血因子についての一般的な記述子であり、ビタミンＫ１（フィトナジオン）、ビタミンＫ２（メナキノン）、ビタミンＫ３、ビタミンＫ４およびビタミンＫ５が含まれる。ビタミンＫ１およびＫ２は天然であり、一方Ｋ３〜５は合成である。
本明細書において、「レチノイド−リンカー−脂質分子」は、例えばＰＥＧ部分などの少なくとも１つのリンカーを介して、少なくとも１つの脂質部分に付着した少なくとも１つのレチノイド部分を含む分子を指す。
本明細書において、「レチノイド−リンカー−レチノイド分子」は、少なくとも１つのレチノイド部分であって、例えばＰＥＧ部分などの少なくとも１つのリンカーを介して、少なくとも１つの別のレチノイド部分（これは同一でも異なっていてもよい）に付着した前記レチノイド部分を含む、分子を指す。
本明細書で用いる場合、用語「脂質」および「親油性」は、当業者によって理解されるその通常の意味で本明細書において用いられる。脂質および親油性基の非限定的な例は、脂肪酸、ステロール、Ｃ２〜Ｃ５０アルキル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ５０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルケニル、Ｃ５〜Ｃ５０アリール、Ｃ５〜Ｃ５０ヘテロアリール、Ｃ２〜Ｃ５０アルキニル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルキニル、Ｃ２〜Ｃ５０カルボキシアルケニル、およびＣ２〜Ｃ５０カルボキシヘテロアルケニルを含む。脂肪酸は、例えば、１２〜２４個の炭素原子を含む飽和または不飽和長鎖モノカルボン酸である。脂質は、本質的に水不溶性であることを特徴とし、約０．０１％（重量基準）未満の水溶解度を有する。本明細書において、用語「脂質部分」および「親油性部分」は、別の基に付着した脂質またはその一部を指す。例えば、脂質基は、脂質の官能基（例えば、カルボン酸基など）とモノマーの適当な官能基との化学反応によって、別の化合物（例えば、モノマー）に付着させることができる。
本明細書において、用語「ｓｉＲＮＡ」は低分子干渉ＲＮＡを指し、これは当技術分野において短鎖（低分子）干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡとしても知られている。ｓｉＲＮＡは、当技術分野で既知の様々な効果を有する二本鎖ＲＮＡ分子のクラスであり、最も注目されるのは、特定の遺伝子の発現およびタンパク質発現との干渉である。
本明細書において、「リポソームによってカプセル化された」とは、成分が実質的に、または完全にリポソーム構造内にあることを指す。
本明細書において、「水性媒体にアクセス可能」とは、成分が水性媒体と接触可能であることを指す。
本明細書において、「水性媒体にアクセス不能」とは、成分が水性媒体と接触不可能であることを指す。
本明細書において、「リポソームの外側表面に複合体化される」とは、成分がリポソームの外表面に動作可能に結合されることを指す。
本明細書において、「リポソームの外側表面に局在化される」とは、成分がリポソームの外表面にあるか、その近傍にあることを指す。
本明細書において、「電荷複合体化される（charge complexed）」とは、静電結合を指す。
本明細書において、「動作可能に結合する」とは、本明細書に記載の化合物、治療剤、レチノイド、および／または第２の脂質の間の電子的相互作用を意味する。かかる相互作用は化学結合の形態をとるが、これには、限定することなく、共有結合、極性共有結合、イオン結合、静電結合、配位共有結合、芳香族結合、水素結合、双極子またはファンデルワールス相互作用が含まれる。当業者は、かかる相互作用の相対強度が大きく異なり得ることを理解する。
用語「リポソーム」は、本明細書において当業者により理解される通常の意味で用いられ、極性の親水性基に付着した脂質を含む脂質二重層構造を指し、これは、水性媒体中で実質的に閉じた構造を形成する。一部の態様において、リポソームは、治療剤およびレチノイドまたはレチノイド結合体などの１または２以上の化合物と、動作可能に結合することができる。リポソームは、単一の脂質二重層（すなわち、単層）から構成されてもよく、または２もしくは３以上の以上の同心脂質二重層（すなわち、多層）から構成されてもよい。さらに、リポソームは、ほぼ球状または楕円体状の形状であることができる。
用語「標的細胞への薬物送達を促進する」とは、ｓｉＲＮＡなどの治療用分子の細胞への送達を増強する、本レチノイドまたは脂溶性ビタミン化合物の増強された能力を指す。理論に束縛されることを意図するものではないが、レチノイドまたは脂溶性ビタミン化合物は、標的細胞上の特定の受容体または［活性化／結合部位］と、測定可能な特異性をもって相互作用する。例えば、結合は一般に、結合親和性（Ｋａ）が１０６Ｍ−１またはそれより大きい場合、好ましくは１０７Ｍ−１またはそれより大きい場合、より好ましくは１０８Ｍ−１またはそれより大きい場合、および最も好ましくは１０９Ｍ−１またはそれより大きい場合に、特異的と考えられる。抗体の結合親和性は、当業者により容易に、例えばスキャッチャード分析により、決定することができる（Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660, 1949）。
核酸送達システムは、例えば、水性および非水性ゲル、クリーム、多重エマルジョン、マイクロエマルジョン、リポソーム、軟膏、水性および非水性溶液、ローション、エアロゾル、炭化水素基剤および粉末を含んでよく、また可溶化剤、浸透促進剤（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコールおよびアミノ酸）、および親水性ポリマー（例えば、ポリカルボフィルおよびポリビニルピロリドン）などの賦形剤を含有することができる。
式Ｉのカチオン性脂質に加えて、他の脂質も有用となり得る。これには、イオン化可能なカチオン性脂質、例えば以下を含む：
送達製剤は、式Ｉのカチオン性脂質と、イオン化可能なカチオン性脂質との組合せで構成されたものであってもよい。イオン化可能なカチオン性脂質としては、例えば、Ｓ１０４を含むことができる。イオン化可能なカチオン性脂質は、０〜４５ｍｏｌ％の濃度で存在することができ、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、および４５ｍｏｌ％から選択される濃度を含む。
ポリエチレングリコール分子（ＰＥＧ）に結合した脂質は、リポソーム粒子中に存在してもよい。ＰＥＧ−脂質としては、
・１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＭＰＥ）
・１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＰＰＥ）、
・１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、または
・１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＯＰＥ）および／または
・ＰＥＧセラミド、
が挙げられる。
送達製剤は、式Ｉのカチオン性脂質と、ＰＥＧ−脂質との組合せで構成されていてもよい。ＰＥＧ−脂質は、０〜１５ｍｏｌ％の濃度、好ましくは１〜１０ｍｏｌ％の濃度で存在することができ、これは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０ｍｏｌ％から選択される濃度を含む。
非カチオン性脂質の非限定的な例としては、リン脂質、例えば、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン ４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル−ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル−ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、ステアロイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、およびこれらの混合物などが挙げられる。他のジアシルホスファチジルコリンおよびジアシルホスファチジルエタノールアミンリン脂質を用いることもできる。これらの脂質のアシル基は、好ましくは、Ｃ１０〜Ｃ２４炭素鎖を有する脂肪酸由来のアシル基であり、例えば、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、またはオレオイルである。
ある態様において、粒子中に存在するリン脂質の量は、約０ｍｏｌ％〜約５５ｍｏｌ％を構成し、より具体的には５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０および５５％から選択される濃度である。非限定的な例としては、リン脂質はＤＯＰＥである。
非カチオン性脂質のさらなる例は、コレステロールなどのステロールおよびその誘導体を含み、例えばコレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル−２’−ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル−４’−ヒドロキシブチルエーテル、およびそれらの混合物である
特定の態様において、粒子中に存在するコレステロールまたはコレステロール誘導体は、約０ｍｏｌ％〜約５５ｍｏｌ％を構成し、より具体的には５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０および５５ｍｏｌ％から選択される濃度である。非限定的な例として、コレステロールは脂質粒子中に存在する。
他の特定の態様において、リン脂質とコレステロールの混合物を含有する脂質粒子中に存在するコレステロールは、粒子中に存在する全脂質の約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％、または約３５ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％を構成する。非限定的な例として、リン脂質とコレステロールの混合物を含む脂質粒子は、コレステロールを、粒子中に存在する全脂質の約３４ｍｏｌ％で含むことができる。
さらなる態様において、リン脂質とコレステロールの混合物を含有する脂質粒子中に存在するコレステロールは、粒子中に存在する全脂質の約１０ｍｏｌ％〜約３０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％〜約２５ｍｏｌ％、または約１７ｍｏｌ％〜約２３ｍｏｌ％を構成する。非限定的な例として、リン脂質とコレステロールの混合物を含む脂質粒子は、コレステロールを、粒子中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％で含むことができる。
核酸の送達のために有用なレチノイドまたはレチノイド結合体は、それを溶解または保持することができる媒体中に、溶解または混合された状態にある。
任意のレチノイドまたはレチノイド結合体は、それが星細胞により積極的に蓄積される限り、本明細書において使用することができ、レチノイドの例としては、限定されるものではないが、トレチノイン、アダパレン、パルミチン酸レチノール、特にビタミンＡ、飽和ビタミンＡ、レチノイン酸、レチナールが挙げられる。レチノイド結合体の例としては、ＰＥＧ−レチノイド結合体を含む。本明細書は、レチノイドおよび／またはレチノイド結合体を積極的に組み込む星細胞の特性を利用するものであり、レチノイドおよび／またはレチノイド結合体を薬物担体として用いるか、またはこれを別の薬物担体成分に結合させるか含めることによって、所望の物質または物体を星細胞に特異的に輸送する。レチノイドは、４つのイソプレノイド単位がヘッド−トゥー−テイル式に連結した骨格を有する化合物のクラスの成員である。G. P. Moss, “Biochemical Nomenclature and Related Documents,” 2nd Ed. Portland Press, pp. 247-251 (1992)を参照のこと。ビタミンＡは、レチノールの生物学的活性を定性的に示すレチノイドについての一般的な記述子である。本明細書におけるレチノイドは、がん細胞およびＣＡＦへの特定の物質の送達を促進する（すなわち、物質はこれらの細胞を標的とする）。かかるレチノイドは特に限定されず、例としては、レチノール、ビタミンＡ、飽和ビタミンＡ、レチナール、レチノイン酸、レチノールと脂肪酸のエステル、脂肪族アルコールとレチノイン酸のエステル、エトレチナート、トレチノイン、イソトレチノイン、アダパレン、アシトレチン、タザロテン、およびパルミチン酸レチノール、およびフェンレチニドなどのビタミンＡアナログ、およびベキサロテンが挙げられる。レチノイド結合体は、ＰＥＧ結合体、例えばｄｉＶＡ−ＰＥＧ−ｄｉＶＡおよびＶＡ−ＰＥＧ−ＶＡを含む。
したがって本明細書の薬物担体は、レチノイドおよび／またはレチノイド結合体以外の薬物担体成分を含んでいてもよい。かかる成分としては、特に限定されるものではなく、医学および薬学の分野で知られる任意の成分を用いることができるが、レチノイドおよび／またはレチノイド結合体を包含する能力があることが好ましい。さらに、本明細書の薬物担体は、星細胞への取り込みを改善する物質、例えば、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）を含んでいてもよい。レチノイドおよび／またはレチノイド結合体の、本明細書の薬物担体との結合または包含はまた、レチノイドおよび／またはレチノイド結合体を、薬物担体の他の成分と、化学的および／または物理的方法によって結合または包含することによっても実現できる。代替的に、レチノイドおよび／またはレチノイド結合体の、本明細書の薬物担体との結合または包含はまた、形成親和性を有するレチノイドおよび／またはレチノイド結合体と薬物担体の基本成分を、薬物担体の調製の間に薬物担体成分中に混合することにより、行ってもよい。
本明細書の薬物担体中に結合または包含されるレチノイドおよび／またはレチノイド結合体の量は、薬物担体成分に対する重量比として、０．１ｍｏｌ％〜２０ｍｏｌ％、好ましくは０．２ｍｏｌ％〜１０ｍｏｌ％、およびより好ましくは０．５ｍｏｌ％〜５ｍｏｌ％であってよく、０．２５、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、および５．０ｍｏｌ％の値から選択される濃度を含む。
特定の態様において、本発明は、チャンバ内で混合することによって製造されるリポソームを提供する。これには、第１のリザーバに干渉ＲＮＡなどの核酸を含む水溶液を提供する工程、第２のリザーバに有機脂質溶液を提供すること、および水溶液を有機脂質溶液と混合して、有機脂質溶液が水溶液と混合し、有機溶媒濃度の勾配中に、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）をカプセル化したリポソームを生成すること、を含む。
混合法を用いて形成したリポソームは、典型的に、約４０ｎｍ〜約２５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１５０ｎｍのサイズを有する。このようにして形成された粒子は凝集せず、任意に大きさにより区分され（sized）、均一な粒径を達成する。
本明細書の薬物担体の形態は、所望の物質や物体を、標的とする星細胞に運搬できればいずれの形態でもよく、たとえば、限定するものではないが、高分子ミセル、リポソーム、エマルジョン、微小球、ナノ小球などのうちいずれの形態をとることもできる。また、本明細書の薬物担体は、これに含まれるレチノイドおよび／またはレチノイド結合体が、遅くとも星細胞に到達するまでに、製剤の外部に少なくとも部分的に露出していれば、運搬物を内部に含んでも、運搬物の外部に付着して存在しても、また、運搬物と混合されていてもよい。
本明細書の薬物担体は、星細胞を特異的な標的とするものであり、所望の物質や物体、たとえば星細胞の活性または増殖を制御する薬物等を星細胞に効率的に運搬することによって、最大の効果および最小の副作用において、所望の効果、たとえば線維化の抑制または予防を可能にする。本薬物担体が送達する物質や物体は特に制限されないが、投与部位から星細胞が存在する肝臓や膵臓などへ、生物の体内を物理的に移動できるような大きさであることが好ましい。したがって、本明細書の薬物担体は、原子、分子、化合物、タンパク質、核酸等の物質はもとより、ベクター、ウイルス粒子、細胞、１以上の要素で構成された薬物放出システム、マイクロマシン等の物体をも運搬することができる。前記物質または物体は、好ましくは星細胞に何らかの影響を与える性質を有し、たとえば、星細胞を標識するものや、星細胞の活性または増殖を制御するものを含む。
したがって、本明細書の一態様においては、薬物担体が送達するものは「星細胞の活性または増殖を制御する薬物」であり、これは、線維化促進に関係する星細胞の物理化学的な作用を直接または間接に抑制する何れの薬物であってもよく、限定するものではないが、たとえばtruncated TGFβ type II receptor、およびsoluble TGFβ type II receptorなどのＴＧＦβ活性阻害剤、ＨＧＦなどの増殖因子製剤およびそれらの発現ベクター、ＭＭＰ遺伝子含有アデノウイルスベクターなどのＭＭＰ産生促進剤、アンチセンスＴＩＭＰ核酸などのＴＩＭＰ産生阻害剤、ＰＰＡＲγリガンド、アンジオテンシン活性阻害剤、ＰＤＧＦ活性阻害剤、ナトリウムチャンネル阻害剤を含む細胞活性化抑制剤および／または細胞増殖抑制剤、ならびにcompound 861、gliotoxinなどのアポトーシス誘導剤、アディポネクチン、（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−１−（４−ピリジルカルバモイル）シクロヘキサンなどのＲｈｏキナーゼ阻害活性を有する化合物を包含する。また、本明細書における「星細胞の活性または増殖を制御する薬物」は、線維化抑制に直接または間接に関係する星細胞の物理化学的な作用を直接または間接に促進する何れの薬物であってもよく、限定するものではないが、たとえばコラーゲン分解系を促進する薬物、たとえばＭＭＰ発現ベクターなどのＭＭＰ産生促進剤、およびＨＧＦ、ＨＧＦアナログ、またはこれらの発現ベクターなどのＨＧＦ様の活性を有する薬物を包含する。
本明細書における「星細胞の活性または増殖を制御する薬物」の別の例としては、細胞外マトリクス、たとえばコラーゲンの代謝を制御する薬物、たとえば星細胞によって産生される細胞外マトリクス構成分子を標的とする、または該細胞外マトリクス構成分子の産生もしくは分泌に機能する分子のうちの１つまたはそれ以上を標的とする、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、またはこれらの複合物を含む）などの標的分子の発現を抑制する効果を有する物質、もしくはドミナントネガティブ効果を有する物質、またはこれらを発現するベクターなどが挙げられる。
本明細書はまた、前記薬物担体と、前記星細胞の活性または増殖を制御する薬物とを含む、星細胞に関連する疾患を処置するための医薬、ならびに、前記薬物担体の、星細胞に関連する疾患を処置するための医薬の製造への使用に関する。ここで、星細胞に関連する疾患とは、星細胞が、疾患の過程、すなわち疾患の発症、増悪、改善、寛解、治癒などに直接的または間接的に関与している疾患を指し、たとえば、肝炎、特に慢性肝炎、肝線維症、肝硬変および肝がん等の肝疾患、膵炎、特に慢性膵炎、膵線維症および膵がん等の膵疾患が含まれる。
本明細書の医薬においては、薬物担体に含まれるレチノイドおよび／またはレチノイド結合体の少なくとも一部が、遅くとも星細胞に到達するまでに製剤の外部に露出していれば、薬物担体が薬物を内部に含んでも、薬物含有体の外部に付着して存在しても、また、薬物と混合されていてもよい。したがって、投与経路や薬物放出様式などに応じて、上記医薬を、適切な材料、たとえば、腸溶性のコーティングや、時限崩壊性の材料で被覆してもよく、また、適切な薬物放出システムに組み込んでもよい。
したがって本明細書は、薬物担体構成物質、およびレチノイドおよび／もしくはレチノイド結合体、および／または薬物のうちの１つまたはそれ以上を含む１つまたはそれ以上の容器を含む薬物担体または医薬の調製キットを含み、そのようなキットの形で提供される薬物担体または医薬の必要構成要素をも含む。本明細書のキットは、上記のほか、本明細書の薬物担体および医薬の調製方法や投与方法などが記載された説明書等を含んでいてもよい。また、本明細書のキットは、本明細書の薬物担体または医薬を完成するための構成要素の全てを含んでいてもよいが、必ずしも全ての構成要素を含んでいなくてもよい。したがって、本明細書のキットは、医療現場や、実験施設などで通常入手可能な試薬や溶媒、たとえば、無菌水や、生理食塩水、ブドウ糖溶液などを含んでいなくてもよい。
本明細書はさらに、前記医薬の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、星細胞に関連する疾患を処置するための方法に関する。ここで、有効量とは、対象疾患の発症を低減し、症状を軽減し、または進行を防止する量であり、好ましくは、対象疾患の発症を予防し、または対象疾患を治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。
本明細書の方法において、用語「対象」は、任意の生物個体を意味し、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体である。本明細書において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、疾患の処置が企図される場合には、典型的には同疾患に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。
また、用語「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全てのタイプの予防的および／または治療的介入を包含するものとする。たとえば、疾患が肝線維症の場合、「処置」の用語は、線維化の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、線維症発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
本明細書はまた、上記薬物担体を利用した、星細胞への薬物送達方法に関する。この方法は、限定されずに、たとえば、上記薬物担体に送達物を担持させる工程と、送達物を担持した薬物担体を星細胞を含む生物や媒体、たとえば培養培地などに投与または添加する工程とを含む。これらの工程は、公知の任意の方法や、本明細書中に記載された方法などにしたがって適宜達成することができる。上記送達方法はまた、別の送達方法、たとえば、星細胞が存在する臓器を標的とする他の送達方法などと組み合わせることもできる。
核酸分子は、線維性の（例えば、肝臓、腎臓、腹膜、および肺の）疾患、形質、状態および／または障害、ならびに／または、細胞もしくは組織におけるｈｓｐ４７のレベルに関連するかまたは応答する任意の他の形質、疾患、障害または状態を予防または処置するために、単独で、または他の治療と組み合わせて適用することができる。核酸分子は、リポソームを含む、対象に投与するための送達ビヒクル、担体および希釈剤およびそれらの塩を含むことができ、および／または核酸分子は、薬学的に許容し得る製剤中に存在することができる。
本明細書の核酸分子は、表３に示す配列を含むことができる。かかる核酸分子の例は、表３に提供される配列から本質的になる。
核酸分子は肺送達、例えば、関連する肺組織への核酸分子の迅速な局所取り込みをもたらす吸入装置または噴霧器によって投与されるエアゾールまたは噴霧乾燥製剤の吸入などによって投与することができる。微粉化された核酸組成物の呼吸可能な乾燥粒子を含む固体粒子組成物は、乾燥または凍結乾燥した核酸組成物を粉砕し、次いで、微粉化された組成物を４００メッシュのスクリーンに通し、大きな集塊を分割または分離することにより調製することができる。本明細書の核酸組成物を含む固体粒子組成物は、任意に、エアゾールの形成を容易にするのに役立つ分散剤、ならびに、他の治療化合物を含んでもよい。好適な分散剤はラクトースであり、それは任意の好適な比率、例えば１対１の重量比で、核酸化合物と混合することができる。
液体粒子のエアゾールは、本明細書に開示される核酸分子を含んでもよく、任意の好適な手段、例えば噴霧器（例えば米国特許第4,501,729号参照）などにより製造することができる。噴霧器は、圧縮ガス、典型的には空気または酸素の、狭いベンチュリ開口を介した加速か、または超音波撹拌により、活性成分の溶液または懸濁液を治療的なエアゾールに変換する市販の装置である。噴霧器に用いられる好適な製剤は、活性成分を、製剤の４０％ｗ/ｗまでの量、好ましくは２０％ｗ/ｗ未満の量で液体担体に含む。担体は、典型的には、水または希釈アルコール水溶液であり、好ましくは、例えば塩化ナトリウムまたは他の好適な塩の添加によって体液と等張にされる。任意の添加剤は、製剤が無菌で調製されない場合は防腐剤、例えば、ヒドロキシ安息香酸メチル、抗酸化剤、香味料、揮発油、緩衝剤および乳化剤および他の製剤界面活性剤を含む。活性組成物と界面活性剤とを含む固体粒子のエアゾールは、任意の固体粒子エアゾール発生器で同様に製造することができる。対象に固体粒子治療剤を投与するためのエアゾール発生器は、上記で説明したとおり、吸入可能な粒子を産生し、ヒトへの投与に好適な速度で、治療組成物の予め定められた計量された用量を含むエアゾールの量を生成する。固体粒子エアゾール発生器の１つの例示的な種類は、吸入器（insufflator）である。吸入法による投与のための好適な製剤は、吸入器で送達することができる、微細に粉砕された粉末を含む。吸入器内で、粉末、例えば本明細書に記載の処置を実行するのに有効なその計量された用量は、カプセルまたはカートリッジ（典型的にはゼラチンまたはプラスチック製）に含まれ、それはin situで穿刺されるか開放され、粉末は、吸入により装置を介して吸い込まれる空気によって、または手動ポンプによって送達される。吸入器で使用される粉末は、単に活性成分のみか、または、活性成分、好適な粉末希釈剤、例えばラクトースおよび任意に界面活性剤を含む粉末混合物からなる。活性成分は、典型的には、製剤の０．１〜１００ｗ／ｗを含む。エアゾール発生器の第２の例示的な種類は、定量式インヘラー（inhaler）を含む。定量式インヘラーは、加圧式エアゾールディスペンサーであり、典型的には、液化噴射剤中の活性成分の懸濁液または溶液製剤を含む。使用の間、これらのデバイスは、計量された容量を送達し、活性成分を含む微粒子スプレーを生成するよう構成されたバルブを介して製剤を放出する。好適な噴射剤は、一部のクロロフルオロカーボン化合物、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンおよびこれらの混合物を含む。製剤は、１種または２種以上の共溶媒、例えば、エチルアルコール、乳化剤および他の製剤界面活性剤、例えば、オレイン酸またはトリオレイン酸ソルビタン、抗酸化剤および好適な香料をさらに含むことができる。肺送達のための他の方法は、例えば、US 20040037780、US 6,592,904、US 6,582,728およびUS 6,565,885号に記載されている。WO2008/132723は、概してオリゴヌクレオチドの、そして特にｓｉＲＮＡの呼吸器系へのエアゾール送達に関する。
核酸分子は、中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）に投与することができる。実験は、in vivoでのニューロンによる核酸の効果的な取り込みを証明した。例えば、Sommer et al., 1998, Antisense Nuc. Acid Drug Dev., 8:75、Epa et al., 2000, Antisense Nuc. Acid Drug Dev., 10:469、Broaddus et al., 1998, J. Neurosurg., 88:734、Karle et al., 1997, Eur. J. Pharmocol., 340:153、Bannai et al., 1998, Brain Research, 784:304、Rajakumar et al., 1997, Synapse, 26:199、Wu-pong et al., 1999, BioPharm, 12:32、Bannai et al., 1998, Brain Res. Protoc., 3:83、およびSimantov et al., 1996, Neuroscience, 74:39を参照のこと。核酸分子は、したがって、ＣＮＳおよび／またはＰＮＳにおける細胞への送達およびこれらの細胞による取り込みに適している。
ＣＮＳへの核酸分子の送達は、種々の異なる戦略によって提供される。用いることができるＣＮＳ送達の伝統的なアプローチは、限定されずに、クモ膜下および脳室内投与、カテーテルおよびポンプの移植、損傷部位または病変部位への直接注射または灌流、脳動脈系への注射、または血液脳関門の化学的または浸透圧的開放を含む。他のアプローチは、種々の輸送および担体システムの使用、例えば、コンジュゲートおよび生分解性ポリマーの使用を介するものを含んでもよい。さらに、ＣＮＳで核酸分子を発現させるために、遺伝子治療アプローチ、例えば、Kaplitt et al.、米国特許第6,180,613号およびDavidson、WO 04/013280に記載のものを用いることができる。
核酸分子は、ポリエチレンイミン（例えば、直鎖または分枝ＰＥＩ）、および／または、例えば、グラフトＰＥＩ、例えば、ガラクトースＰＥＩ、コレステロールＰＥＩ、抗体誘導体化ＰＥＩ、およびこれらのポリエチレングリコールＰＥＩ（ＰＥＧ−ＰＥＩ）誘導体を含む、ポリエチレンイミン誘導体（例えば、Ogris et al., 2001, AAPA PharmSci, 3, 1-11、Furgeson et al., 2003, Bioconjugate Chem., 14, 840-847、Kunath et al., 2002, Pharm Res 19:810-17、Choi et al., 2001, Bull. Korean Chem. Soc., 22:46-52、Bettinger et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10:558-561、Peterson et al., 2002, Bioconjugate Chem. 13:845-54、Erbacher et al., 1999, J Gene Med 1:1-18、Godbey et al., 1999., PNAS, 96:5177-81、Godbey et al., 1999, J Controlled Release, 60:149-60、Diebold et al., 1999, J Biol Chem, 274:19087-94、Thomas et al., 2002, PNAS, 99, 14640-45、およびSagara, 米国特許第6,586,524号参照）と製剤化または複合体化されてもよい。
核酸分子は、バイオコンジュゲート、例えばVargeese et al.、米国出願第10/427,160号、米国特許第6,528,631号、米国特許第6,335,434号、米国特許第6,235,886号、米国特許第6,153,737号、米国特許第5,214,136号、米国特許第5,138,045号などに記載の核酸コンジュゲートを含んでもよい。
本明細書に開示される組成物、方法およびキットは、本明細書の少なくとも１個の核酸分子を、該核酸分子の発現を可能にする様式でコードする核酸配列を含む発現ベクターを含んでもよい。核酸分子またはｄｓＲＮＡの鎖を発現することができる１個または２個以上のベクターを細胞の環境に導入する方法は、細胞の種類およびその環境の構成に依存する。核酸分子またはベクター構築物は、細胞の内部に（すなわち、細胞内に）、直接導入しても、または生体の空洞内、間質腔内、循環中に、細胞外導入しても、経口的に導入しても、または、生体または細胞をｄｓＲＮＡを含む溶液に浸すことによって導入してもよい。細胞は、好ましくは哺乳動物細胞であり、より好ましくはヒト細胞である。発現ベクターの核酸分子は、センス領域とアンチセンス領域とを含むことができる。アンチセンス領域は、ｈｓｐ４７をコードするＲＮＡまたはＤＮＡの配列に相補的な配列を含んでもよく、センス領域はアンチセンス領域に相補的な配列を含んでもよい。核酸分子は、相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有する２本の異なった鎖を含んでもよい。核酸分子は、相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有する単一の鎖を含んでもよい。
標的ＲＮＡ分子と相互作用し、標的ＲＮＡ分子（例えば、本明細書に記載のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号によって示される標的ＲＮＡ分子）をコードする遺伝子を下方調節する核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現させてもよい。組換えベクターは、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターであってもよい。核酸分子を発現するウイルスベクターは、限定されずに、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアルファウイルスをベースに構築することができる。核酸分子を発現させることができる組換えベクターは本明細書に記載のとおりに送達され、標的細胞内に存続することができる。あるいは、ウイルスベクターは、核酸分子の一過性発現をもたらすことに用いることができる。かかるベクターは、必要に応じて繰り返し投与することができる。核酸分子は、ひとたび発現されると、結合し、遺伝子機能または発現をＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して下方調節する。核酸分子を発現するベクターの送達は、全身性であってもよく、これは例えば静脈内もしくは筋肉内投与によるもの、対象から外植した標的細胞への投与と、その後の対象への再導入によるもの、または、所望の標的細胞への導入を可能にする他のあらゆる手段によるものであってもよい。
別の側面において、本開示は、１または２以上の生理学的に許容し得る界面活性剤、医薬担体、希釈剤、賦形剤、および懸濁剤、またはそれらの組合せを含む医薬製剤に、および本明細書に開示された製剤（例えば、化合物、レチノイド、第２の脂質、安定剤、および／または治療剤を含み得る製剤）に関する。治療用の、許容し得る追加の医薬担体または希釈剤は、製薬技術分野において周知であり、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)に記載されており、この文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。保存剤、安定剤、色素などを、医薬製剤中に提供することができる。例えば、安息香酸ナトリウム、アスコルビン酸およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルは、保存剤として添加してもよい。また、酸化防止剤および懸濁剤を使用することができる。様々な態様において、アルコール、エステル、硫酸化脂肪族アルコール等を界面活性剤として用いることができ、スクロース、グルコース、ラクトース、デンプン、結晶化セルロース、マンニトール、軽質無水ケイ酸、アルミン酸マグネシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、炭酸カルシウム、酸性炭酸ナトリウム、リン酸水素カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム等を、賦形剤として用いることができ、ヤシ油、オリーブ油、ゴマ油、落花生油、大豆油を、懸濁剤または潤滑剤として使用することができ、炭水化物誘導体としてのセルロースアセテートフタレート、例えばセルロースまたは糖、またはポリビニル誘導体としての酢酸メチル−メタクリレート共重合体を、懸濁剤として使用することができ、およびフタル酸エステル等の可塑剤を、懸濁剤として使用することができる。
本明細書に記載の医薬製剤は、ヒト患者に対して、それ自体で、または併用療法において見られるように他の活性成分と、または適当な医薬担体もしくは賦形剤（単数または複数）と混合された医薬製剤にて投与することができる。本出願の化合物の製剤化および投与のための技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences,” Mack Publishing Co., Easton, PA, 18th edition, 1990に見出すことができる。
適切な投与経路としては、例えば、筋肉内、皮下、静脈内、髄内への注射、および髄腔内、脳室内直接、腹腔内、鼻腔内、または眼内への注射を含む非経口送達が挙げられる。製剤（例えば、化合物、レチノイド、第２の脂質、安定剤、および／または治療剤を含み得る製剤）はまた、デポー注射、浸透圧ポンプなどの徐放または制御放出剤形で、所定の速度において、長時間および／または時限的、パルス的に投与することができる。さらに、投与経路は、局所的または全身的であってよい。
医薬製剤は、それ自体知られている様式で、例えば従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、湿式粉砕、乳化、カプセル化、封入または打錠プロセスにより、製造することができる。
医薬製剤は、任意の従来の方法で、賦形剤および助剤を含有する１または２以上の生理学的に許容し得る医薬担体であって、活性化合物の、薬学的に用いることのできる製剤への加工を促進するものを用いて、製剤化することができる。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。任意の周知の技術、医薬担体、および賦形剤を、適切かつ当技術分野において理解されているように、例えば上記Remington’s Pharmaceutical Sciencesにおけるように用いることができる。
注射剤は、従来の形態で、液体溶液または懸濁液として、液体中の溶液または懸濁液に適した注射前の固体形態で、またはエマルジョンとして、調製することができる。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、スクロース、グルコース、デキストロース、マンニトール、ラクトース、レシチン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウム、塩酸システインなどが挙げられる。必要に応じてさらに、注射用医薬製剤は、例えば、湿潤剤、ｐＨ緩衝剤等の少量の非毒性補助物質を含むことができる。生理学的に適合し得る緩衝液としてはハンクス液、リンゲル液、または生理食塩緩衝液が含まれるが、これらに限定されない。所望により、吸収促進製剤を用いてもよい。
非経口投与のための医薬製剤、例えばボーラス注射または連続注入によるものとしては、水溶性形態における、活性製剤（例えば、化合物、レチノイド、第２の脂質、安定剤、および／または治療剤を含み得る製剤）の水溶液を含む。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油性の注射用懸濁液として調製することができる。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの、懸濁液の粘度を増大させる物質を含んでもよい。任意に、懸濁液はまた、高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を増加させる好適な安定剤または薬剤を含むことができる。注射用製剤は、保存剤を添加して、例えばアンプルまたは複数回投与容器内に、単位剤形で提示することができる。製剤は、懸濁液、溶液または油性もしくは水性ビヒクル中のエマルジョンなどの形態をとることができ、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの製剤化剤を含んでもよい。あるいは、活性成分は、使用前に好適なビヒクル、例えば、無菌パイロジェンフリー水で構成するための粉末形態であってもよい。
前述の製剤に加えて、製剤はまた、デポー製剤として製剤化することもできる。かかる長時間作用型製剤は、筋肉内注射によって投与することができる。したがって例えば、製剤（例えば、化合物、レチノイド、第２の脂質、安定剤、および／または治療剤を含み得る製剤）は、適切なポリマーまたは疎水性材料を用いて（例えば許容し得る油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂を用いて、または例えば難溶性塩などの難溶性誘導体として、製剤化することができる。
本明細書の一部の態様は、治療剤を細胞に送達する方法を対象とする。例えば、一部の態様は、ｓｉＲＮＡなどの治療剤を細胞に送達する方法を対象とする。本明細書に記載の方法に従って使用するのに適した細胞は、原核生物、酵母、または植物および動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）を含む高等真核細胞を含む。一部の態様において、細胞は、ヒト線維肉腫細胞（例えば、ＨＴ１０８０細胞株）であってもよい。他の態様において、細胞はがん細胞であることができる。がんについてのモデル系である細胞株を用いることができ、例えば限定はされないが、乳がん（ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４３８細胞株）、Ｕ８７グリア芽腫細胞株、Ｂ１６Ｆ０細胞（黒色腫）、ＨｅＬａ細胞（子宮頸がん）、Ａ５４９細胞（肺がん）、およびラット腫瘍細胞株ＧＨ３および９Ｌを含む。これらの態様において、本明細書に記載の製剤は、細胞をトランスフェクトするために使用することができる。これらの態様は、細胞を、治療剤を含む本明細書に記載の製剤と接触させることを含んでよく、これにより、治療剤を細胞に送達する。
本明細書に開示されるのは、本明細書に記載の製剤の治療有効量を投与することを含む、異常な線維化を特徴とする状態を処置するための方法である。異常な線維化を特徴とする状態は、がんおよび／または線維性疾患を含み得る。本明細書に記載の製剤により処置または改善することができるがんの種類としては、限定することなく、肺がん、膵がん、乳がん、肝がん、胃がん、および大腸がんが挙げられる。一態様において、処置または改善することができるがんは、膵がんである。別の態様において、処置または改善することができるがんは、肺がんである。本明細書に記載の製剤により処置または改善することができる線維性疾患の種類としては、限定することなく、肝線維症、肝硬変、膵炎、膵線維症、嚢胞性線維症、声帯瘢痕、声帯粘膜線維症、喉頭線維症、肺線維症、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、および腎性全身性線維症が挙げられる。一態様において、処置または改善することができる状態は、肝線維症である。
本明細書に記載の製剤または医薬組成物は、対象に対して、任意の適切な手段により投与することができる。投与法の非限定的例としては、特に、（ａ）注射による投与であって、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内、眼窩内、関節内（intracapsularly）、脊髄内、胸骨内（intrasternally）などへの、輸液ポンプ送達を包含する注射、（ｂ）局所的投与、例えば腎臓または心臓領域内への、例えばデポー移植による直接注射など、また、活性化合物を生体組織と接触させるための、当業者により適切と認められたものが挙げられる。
投与に適した医薬組成物としては、活性成分がその意図した目的を達成するのに有効な量で含まれる製剤（例えば、化合物、レチノイド、第２の脂質、安定剤、および／または治療剤を含み得る製剤）が挙げられる。本明細書に開示された化合物の、用量として必要な治療有効量は、投与経路、ヒトを含む処置すべき動物の種類、考慮されている特定の動物の物理的特性に依存する。用量は、所望の効果を達成するように調整することができるが、体重、食事、併用投薬および医学分野の当業者が認識する他の要因などの要因に依存する。より具体的には、治療有効量は、疾患の症状を予防、緩和または改善する、または処置される対象の生存を延長するのに有効な、組成物の量を意味する。治療有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示に照らして、当業者の能力の範囲内である。
当業者には容易に明らかなように、投与すべき有用なin vivo投与量および特定の投与方法は、年齢、体重、処置する哺乳動物種、用いる特定の化合物、およびこれらの化合物が用いられる特定の用途に応じて変化する。所望の成果を達成するために必要な有効投与量レベルの決定は、当業者により、ルーチンの薬理学的方法を用いて遂行することができる。典型的には、製品のヒトへの臨床応用は低い投与量レベルで開始され、所望の効果が達成されるまで投与量レベルが増加される。代替的に、許容し得るin vitro試験を用いて、確立された薬理学的方法により、本発明の方法により同定された組成物の有用な用量および投与経路を確立することができる。
非ヒト動物試験では、可能性ある製品の適用は、より高い投与量レベルで開始され、所望の効果がもはや達成されないか、または有害な副作用が消えるまで、投与量を減少させる。投与量は、所望の効果および治療指標に依存して、広い範囲にすることができる。一般的に、投与量は、約１０μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／体重ｋｇ、好ましくは約１００μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／体重ｋｇである。代替的に、投与量は、当業者によって理解されるように、患者の表面積に基づいて算出してもよい。
医薬組成物のための具体的な剤形、投与経路、および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選択することができる。（本明細書にその全体が参照により本明細書に組み込まれるFingl et al. 1975の“The Pharmacological Basis of Therapeutics”、特にCh. 1, p. 1を参照のこと）。典型的には、患者に投与される組成物の用量範囲は、約０．５〜約１０００ｍｇ／患者の体重ｋｇであることができる。投与量は、単一でも、患者の必要に応じて、１または２日以上の間に与えられる２または３以上のシリーズであってもよい。化合物についてのヒトの投与量が、少なくともいくつかの条件について確立されている場合、投与量は確立されたヒトの投与量とほぼ同じか、またはその約０．１％〜約５００％、より好ましくは約２５％〜約２５０％である。新たに発見された医薬組成物のケースのように、ヒトの投与量が確立されていない場合には、ＥＤ５０またはＩＤ５０値から、または、動物での毒性試験および有効性試験により認定されるように、in vitroまたはin vivo試験から得られた他の適切な値から、推定することができる。
主治医は、毒性または臓器機能不全により、如何にしてまたいつ、投与を終了、中断、または調整するかを知っているであろうことに留意すべきである。逆に主治医は、臨床反応が適切でなかった場合に（毒性は除外する）、処置をより高いレベルに調整することも知っている。対象となる疾患の管理において投与された用量の程度は、処置すべき症状の重症度および投与経路により変化する。症状の重症度は、例えば、標準的な予後評価方法によって部分的に評価することができる。さらに、用量およびおそらく投与頻度も、個々の患者の年齢、体重および反応に応じて変化するであろう。上述したものに相当するプログラムは、獣医学において使用することができる。
正確な投与量は薬物毎に決定されるが、ほとんどの場合、投与量に関していくつかの一般化を行うことができる。成人のヒト患者の毎日の投薬レジメンは、例えば、約０．１ｍｇ〜２０００ｍｇの各活性成分の投与量、好ましくは約１ｍｇ〜約５００ｍｇ、例えば５〜２００ｍｇであることができる。他の態様において、約０．０１ｍｇ〜１００ｍｇの各活性成分の静脈内、皮下、または筋肉内用量、好ましくは約０．１ｍｇ〜約６０ｍｇ、例えば約１ｍｇ〜約４０ｍｇが用いられる。薬学的に許容し得る塩の投与の場合、投与量は、遊離塩基として算出してもよい。一部の態様において、製剤は、１日当たり１〜４回投与される。代替的に、製剤は、連続静脈内注入により、好ましくは各活性成分１日当たり約１０００ｍｇまでの用量で投与することができる。当業者によって理解されるように、特定の状況において、本明細書に開示された製剤を、上記の好ましい用量範囲を超えた、またはさらに大幅に超えた量で投与して、特に侵攻性の疾患または感染症を効果的かつ積極的に処置することが必要となる場合もある。一部の態様において、製剤は、連続治療の期間、例えば１週間またはそれ以上、または数ヶ月または数年間投与されるであろう。
投与量および間隔を個別に調節して、調節効果または最小有効濃度（ＭＥＣ）を維持するための、活性部分の血漿レベルを提供することができる。ＭＥＣは各化合物について変化するが、in vitroデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は、個々の特徴および投与経路に依存する。しかし、ＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイを用いて、血漿濃度を決定することができる。
投与間隔はまた、ＭＥＣ値を用いて決定することができる。組成物は、ＭＥＣを超える血漿レベルを、１０〜９０％の時間、好ましくは３０〜９０パーセントの間、最も好ましくは５０％〜９０％の間維持するレジメンを用いて投与すべきである。
局所投与または選択的取り込みの場合において、薬物の有効な局所濃度は、血漿濃度と関連しない場合もある。
投与する製剤の量は、処置する対象、対象の体重、苦痛の重症度、投与方法および処方する医師の判断に依存してよい。
本明細書に開示される製剤（例えば、化合物、レチノイド、第２の脂質、安定剤、および／または治療剤を含み得る製剤）は、既知の方法を用いて有効性および毒性について評価することができる。例えば、特定の化合物の、または特定の化学的部分を共有する化合物のサブセットの毒性は、例えば、哺乳動物などの細胞株、好ましくはヒトの細胞株に対するin vitro毒性を決定することにより、確立することができる。かかる研究の結果は、例えば哺乳動物、より具体的にはヒトなどの動物における毒性をしばしば予測する。代替的に、マウス、ラット、ウサギ、またはサルなどの動物モデルにおける特定の化合物の毒性は、既知の方法を用いて決定することができる。特定の化合物の有効性は、in vitro方法、動物モデルまたはヒト臨床試験などのようないくつかの認められた方法を使用して確立することができる。認められたin vitroモデルは、ほぼ全てのクラスの疾患について存在し、これには限定することなく、がん、心臓血管疾患、および様々な免疫機能障害を含む。同様に、許容される動物モデルを用いて、かかる疾患を処置するための化学薬品の有効性を確立することができる。有効性を決定するためのモデルを選択する場合、当業者は、適切なモデル、用量および投与の経路、およびレジメンを選択するために、従来技術により、ガイドされることができる。当然ながら、ヒト臨床試験もまた、ヒトにおける化合物の有効性を決定するために使用することができる。
製剤は所望により、活性成分を含む１または２以上の単位剤形を含んでよいパックまたはディスペンサーデバイスで提供することができる。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含んでもよい。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書を添付してもよい。パックまたはディスペンサーはまた、医薬品の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定された形式の、容器に付随する表示を伴ってもよく、この表示は、ヒトまたは獣医学的投与に対する薬物の形態についての、該機関の承認を反映するものである。かかる表示は、例えば、米国食品医薬品局による処方薬についての承認のラベル、または承認された製品のインサートであってよい。適合する薬学的担体中に製剤化された化合物を含む組成物も、調製し、適切な容器に入れ、適応となる状態の処置用にラベルを付すことができる。
１または２以上の立体中心を有する、本明細書に記載の任意の化合物は、絶対立体化学が明示的に示されていない場合、各中心は、独立してＲ配置またはＳ配置またはそれらの組合せであってもよいことが理解される。したがって、本明細書で提供される化合物は、鏡像異性的に純粋であるか、または立体異性体の混合物であってもよい。さらに、ＥまたはＺとして定義可能な幾何異性体を生成する１または２以上の二重結合を有する任意の化合物において、各二重結合は独立してＥまたはＺ、その組合せであってよいことが理解される。同様に、全ての互変異性形態も含まれることが意図される。
本発明は、以下の例を参照することによりさらに例示することができる。これらの例は例示のみであり、本発明を限定することを意図しない。
例
例１：２−（ビス（２−（テトラデカノイルオキシ）エチル）アミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−オキソエタン−アミニウムブロミド（ＨＥＤＣ）の調製
中間体１の調製：２，２’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエート（ＨＥＤＣ−ＢＯＣ−ＩＮ）
ＤＣＭ（１７５０ｍＬ）中の、Ｎ−ＢＯＣ−ジエタノールアミン（１９４ｇ、０．９４６ｍｏｌ）、トリエチルアミン（２０１ｇ、２．０３ｍｏｌ）およびジアミノピリジン（２３．１ｇ、０．１９ｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却した。ＤＣＭ（４４０ｍＬ）中の塩化ミリストイル（４９１ｇ、１．９９ｍｏｌ）溶液を、０〜１０℃で５０分かけて加え、混合物を周囲温度に昇温させた。完全な変換は、ＴＬＣにより２０〜２４℃で１．５時間後に示された。水（１７５０ｍＬ）を添加し、ｐＨ８．３をｐＨメーターで測定した。有機相を分離し、（１）６％ＮａＨＣＯ３（５００ｍＬ）、（２）０．３Ｍ ＨＣｌ（１７００ｍＬ）、（３）１２．５％塩化ナトリウム（１７００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウム（１２０ｇ）で乾燥した。ろ液の５０℃および５０ｍＢａｒでの蒸発により、６２２ｇの２，２’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエート（ＨＥＤＣ−ＢＯＣ−ＩＮ）を得た。放置すると固化したこの蒸留残渣を、次の工程で使用した。
中間体２の調製：２，２’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエート（ＨＥＤＣ−アミン−ＩＮ）ＴＦＡ塩
ＨＥＤＣ−ＢＯＣ−ＩＮ（６２０ｇ、０．９９０ｍｏｌ）を、５０℃の浴中で短時間加熱することにより液体に変換し、次に２５℃未満に冷却した。ＴＦＡ（９４０ｍＬ、１．３９ｋｇ、１．１８ｍｏｌ）を、温度を２５℃以下に維持するために適度な冷却を用いて、３０分かけて液体に加えた。ＴＦＡ量の３分の２を添加すると、顕著なガスの発生が観察された。反応混合物を周囲温度で一晩撹拌した。ＴＬＣにより、微量のＨＥＤＣ−ＢＯＣ−ＩＮが示された。反応混合物を加熱して、ＴＦＡを５０〜５５℃の水浴から減圧下（１２５〜６０ｍＢａｒ）で蒸留し、蒸留が極めて緩徐になるまで蒸留を継続した。ＴＦＡフューム（煙霧）を、スクラバー内で１０％水酸化ナトリウムにより吸収した。ヘプタン（２０００ｍＬ）を添加し、撹拌し、そして減圧下で留去した。ヘプタン（２０００ｍＬ）を部分的に固化した残渣に添加し、混合物を４５℃に加熱し、この温度で僅かに濁った溶液が形成された。溶液を冷却し、４０℃でシーディングし、４０〜３６℃で２５分間攪拌することにより、沈殿物が形成された。冷却し、周囲温度で４０分攪拌し、重い結晶の沈殿物をろ過により単離し、フィルターケーキをヘプタン（１０００ｍＬ）で洗浄した。湿ったフィルターケーキ（９１４ｇ）を、周囲温度で減圧下（＜１ｍＢａｒ）で一晩撹拌して、６３５ｇ（１００％）の２，２’（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエート（ＨＥＤＣ−アミン−ＩＮ）ＴＦＡ塩を白色結晶として得た。
中間体３の調製：２，２’−（２−（ジメチルアミノ）アセチルアザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエート（ＨＥＤＣ−ＤｉＭｅＧｌｙ−ＩＮ）
Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（５６．６ｇ、５４８ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ水和物（８３．９ｇ、５４８ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ塩酸塩（１０５ｇ、５４８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３．５Ｌ）に加え、混合物を周囲温度で１時間撹拌した。透明な溶液が形成された。ＨＥＤＣ−アミン−ＩＮ ＴＦＡ塩（２７０ｇ、４４２ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（１．１５Ｌ）および６％重炭酸ナトリウム（１．１５Ｌ）と混合した。分離した有機相と遊離アミンを、ＤＭＦ中でカップリング混合物に加え、沈殿物と約９℃の温度上昇が観察された。トリエチルアミン（４７．０ｇ、４６４ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を２５〜３０℃で５時間撹拌した。ＴＬＣにより不完全な変換が示され、追加のＥＤＣ塩酸塩（２９．５ｇ、１５４ｍｍｏｌ）を加えた。周囲温度で一晩攪拌し、透明な溶液が観察され、ＴＬＣは今度は完全な変換を示した。反応混合物を、ＤＣＭ（２．３Ｌ）および２％重炭酸ナトリウム（７Ｌ）と混合した。有機相を、１．２５％の塩化ナトリウム（各５Ｌ）で２回洗浄し、無水硫酸マグネシウム（１８６ｇ）で乾燥した。ろ液を５０℃、３０ｍＢａｒで蒸発させ、２５３ｇの粗油を得た。粗物質を、２．６ｋｇのシリカゲル６０（４０〜６３μ）を充填したカラムに負荷した。生成物を、トルエン：酢酸エチル（８：２）（４Ｌ）、次いで酢酸エチル：メタノール（１：１）（５Ｌ）で溶出した。画分（３．５〜８Ｌ）を含有する生成物を蒸発させて（５０℃／２５０〜２０ｍＢａｒ）、２０８ｇ（６６％）の２，２’−（２−（ジメチルアミノ）アセチルアザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエート（ＨＥＤＣ−ＤｉＭｅＧｌｙ−ＩＮ）を、油として得た。
ＨＥＤＣの調製：２−（ビス（２−（テトラデカノイルオキシ）エチル）アミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−オキソエタンアミニウムブロミド
ＨＥＤＣ−ＤｉＭｅＧｌｙ−ＩＮ（２０６ｇ、３３７ｍｍｏｌ）および２−ブロモエタノール（２７４ｇ、２．１９ｍｏｌ）の混合物を、８０℃で２時間撹拌した。ＨＰＬＣにより、８．１％の未反応のジメチルグリシン中間体が示された。８０℃でさらに４０分間撹拌後、ＨＰＬＣにより、７．８％の未反応のジメチルグリシン中間体が示された。温かい（６５℃）酢酸エチル（２Ｌ）を加えた。熱い溶液のろ過ブランク（blank filtration）を熱酢酸エチル（０．５Ｌ）で洗浄した。合わせたろ液を０℃に冷却し、シーディングにより結晶化を開始させた。生成物の懸濁液を緩徐に冷却し、−１６〜−１８℃で４０分間撹拌した。沈殿物をろ過により単離し、フィルターケーキを冷酢酸エチル（２００ｍＬ）で洗浄した。一晩の乾燥により（２０℃／＜１ｍＢａｒ）、２１１ｇの粗物質を得た。物質を次に、３５℃に加熱して２５℃でシーディングすることにより、酢酸エチル（２．１Ｌ）とエタノール（１０５ｍＬ）の混合物から再結晶させた。沈殿物を１０℃で単離し、冷酢酸エチル（３００ｍＬ）で洗浄し、一晩乾燥させて（２０℃／＜１ｍＢａｒ）、１６１ｇ（６６％）の２−（ビス（２−（テトラデカノイルオキシ）エチル）アミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−オキソエタンアミニウムブロミド（ＨＥＤＣ）を得た。ＨＰＬＣは、９９．５％の純度を示した。QTOF MS ESI+: m/z 655.6 (M + H)。
例２：２−（ビス（３−（テトラデカノイルオキシ）プロピル）アミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−オキソ−エタンアミニウムブロミド（Ｐｒ−ＨＥＤＣ）の調製
中間体１の調製：３，３’−アザンジイルビス（プロパン−１−オール）
３−アミノ−１−プロパノール（１４．５ｍＬ、１９．０ｍｍｏｌ）、１−クロロ−３−ヒドロキシプロパン（８ｍＬ、９５．６ｍｍｏｌ）およびＨ２Ｏ（〜５０ｍＬ）の混合物を、２４時間にわたって還流した。次に水酸化カリウム（５．４０ｇ）を添加した。溶解後、全てのＨ２Ｏを蒸発させると、粘性油および大量の塩化カリウムが残った。これらをろ過し、乾燥アセトンとジクロロメタンで洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、そして濃縮した。次いで生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによりＤＣＭ／ＭｅＯＨの勾配を用いて精製し、１２．５ｇの３，３’−アザンジイルビス（プロパン−１−オール）を得た。
中間体２の調製：ｔｅｒｔ−ブチルビス（３−ヒドロキシプロピル）カルバメート
３，３’−アザンジイルビス（プロパン−１−オール）（１２．５ｇ、９５．４ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（２５ｍＬ）で希釈した。ＤＣＭ（２５ｍＬ）中のジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（２６ｇ、１１９．２５ｍｍｏｌ）の溶液を、Ａｒガスのブランケット下で攪拌しながら緩徐に加えた。反応物を一晩撹拌した。反応混合物を濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによりＤＣＭ／ＭｅＯＨの勾配を用いて精製し、ｔｅｒｔ−ブチルビス（３−ヒドロキシプロピル）カルバメートを得た。
中間体３の調製：（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アザンジイル）ビス（プロパン−３，１−ジイル）ジテトラデカノエート
ｔｅｒｔ−ブチルビス（３−ヒドロキシプロピル）カルバメート（４．００ｇ、１７．３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（４．８０ｍｌ、３４．６ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（５２９ｍｇ、４．３３ｍｍｏｌ）を、クロロホルム（５０ｍＬ）に溶解した。氷浴中で攪拌しながら、塩化ミリストイルの溶液を約１５分間で添加した。添加は、反応温度が３０℃を超えないようにして行った。反応物を室温で一晩撹拌した。翌日、ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）および０．９％食塩水（５０ｍＬ）を加えて反応をクエンチした。有機層を分離し、１Ｍ ＮａＨＣＯ３で洗浄した。溶媒を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、真空中で濃縮して、（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アザンジイル）ビス（プロパン−３，１−ジイル）ジテトラデカノエートを油として得た。
中間体４の調製：アザンジイルビス（プロパン−３，１−ジイル）ジテトラデカノエートＴＦＡ塩
（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アザンジイル）ビス（プロパン−３，１−ジイル）ジテトラデカノエート（１１．３ｇ、１７．３ｍｍｏｌ）を、ＴＦＡ／ＣＨＣｌ３（１：１、２０ｍＬ）に溶解し、混合物を室温で１５分攪拌した。次いで、混合物を真空中で濃縮した。これを２回繰り返した。次に残渣をＤＣＭに溶解し、Ｈ２Ｏで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、真空中で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによりＤＣＭ／ＭｅＯＨの勾配を用いて精製して、アザンジイルビス（プロパン−３，１−ジイル）ジテトラデカノエートをＴＦＡ塩（７５０ｍｇ）として得た。
中間体５の調製：（（２−（ジメチルアミノ）アセチル）アザンジイル）ビス（プロパン−３，１−ジイル）ジテトラデカノエート
アザンジイルビス（プロパン−３，１−ジイル）ジテトラデカノエートＴＦＡ塩（７５０ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（５ｍＬ）中のＮ，Ｎ−ジメチルグリシン（１５４ｍｇ、１．４９ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（６１６ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（４９５μＬ、２．８４ｍｍｏｌ）の予備活性化された混合物に加えた。生成物をアルゴンでフラッシュし、室温で一晩撹拌し、次いで濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによりＤＣＭ／ＭｅＯＨの勾配を用いて精製して、４６５ｍｇの（（２−（ジメチルアミノ）アセチル）アザンジイル）ビス（プロパン−３，１−ジイル）ジテトラデカノエートを得た。
Ｐｒ−ＨＥＤＣの調製：２−（ビス（３−（テトラデカノイルオキシ）プロピル）アミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−オキソエタンアミニウムブロミド
密閉系にて、（（２−（ジメチルアミノ）アセチル）アザンジイル）ビス（プロパン−３，１−ジイル）ジテトラデカノエート（２４６ｍｇ、０．３８５ｍｍｏｌ）をＡＣＮ（１０ｍＬ）に溶解し、２−ブロモエタノール（５００μＬ）を加えた。反応容器を不活性ガスでフラッシュした後、密閉した。混合物を、８０℃に加熱し、一晩撹拌し、次いで冷却し、真空中で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによりＤＣＭ／ＭｅＯＨの勾配を用いて精製して、９９ｍｇの２−（ビス（３−（テトラデカノイルオキシ）プロピル）アミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−オキソエタンアミニウムブロミドを得た。QTOF MS ESI+: m/z 683.6 (M + H)。
例３：２−（ビス（３−（オレオイルオキシ）プロピル）アミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−オキソエタンアミニウムブロミド（Ｐｒ−ＨＥ−ＤＯＤＣ）の調製
中間体１の調製：（Ｚ）−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アザンジイル）ビス（プロパン−３，１−ジイル）ジオレエート
ｔｅｒｔ−ブチルビス（３−ヒドロキシプロピル）カルバメート（合成は前述した）、トリエチルアミンおよびＤＭＡＰを、クロロホルムに溶解した。氷浴中で攪拌しながら、塩化オレオイル溶液を１５分間かけて添加した。添加は、反応温度が３０℃を超えないようにして行った。反応物を室温で一晩撹拌した。翌日、ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）および０．９％食塩水（５０ｍＬ）を加えて反応をクエンチした。有機層を分離し、１Ｍ ＮａＨＣＯ３で洗浄した。溶媒をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮して、油を得た。（Ｚ）−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アザンジイル）ビス（プロパン−３，１−ジイル）ジオレエートは、さらなる精製なしで次に進めた。
中間体２の調製：（Ｚ）−アザンジイルビス（プロパン−３，１−ジイル）ジオレエートＴＦＡ塩
（Ｚ）−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アザンジイル）ビス（プロパン−３，１−ジイル）ジオレエート（１３．２ｇ、１７．３ｍｍｏｌ）を、ＴＦＡ／ＣＨＣｌ３（１：１、２０ｍＬ）に溶解し、混合物を室温で１５分攪拌した。次いで、混合物を真空中で濃縮した。これを２回繰り返した。次に残渣をＤＣＭに溶解し、Ｈ２Ｏで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによりＤＣＭ／ＭｅＯＨの勾配を用いて精製して、（Ｚ）−アザンジイルビス（プロパン−３，１−ジイル）ジオレエートＴＦＡ塩（７５０ｍｇ）を得た。
中間体３の調製：（Ｚ）−（（２−ジメチルアミノ）アセチル）アザンジイル）ビス（プロパン−３，１−ジイル）ジオレエート
（Ｚ）−アザンジイルビス（プロパン−３，１−ジイル）ジオレエートＴＦＡ塩（７５０ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（５ｍＬ）中のＮ，Ｎ−ジメチルグリシン（１２８ｍｇ、１．２４ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（５１７ｍｇ、１．３６ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（４１３μＬ、２．３７ｍｍｏｌ）の予備活性化された混合物に加えた。フラスコをアルゴンでフラッシュし、室温で一晩撹拌した。反応混合物を濃縮し、ＤＣＭ／ＭｅＯＨの勾配でシリカゲルクロマトグラフィーにかけて、（Ｚ）−（（２−ジメチルアミノ）アセチル）アザンジイル）ビス（プロパン−３，１−ジイル）ジオレエートを得た。
Ｐｒ−ＨＥ−ＤＯＤＣの調製：２−（ビス（３−（オレオイルオキシ）プロピル）アミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−オキソエタンアミニウムブロミド
密閉系にて、（Ｚ）−（（２−ジメチルアミノ）アセチル）アザンジイル）ビス（プロパン−３，１−ジイル）ジオレエート（２６９ｍｇ、０．３６０ｍｍｏｌ）をＡＣＮ（１０ｍＬ）に溶解し、２−ブロモエタノール（２００μＬ）を加えた。反応容器を不活性ガスでフラッシュした後、密閉した。混合物を８０℃に加熱し、一晩撹拌した。反応混合物を冷却して濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによりＤＣＭ／ＭｅＯＨの勾配を用いて精製して、２−（ビス（３−（オレオイルオキシ）プロピル）アミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−オキソエタンアミニウムブロミド（１２９ｍｇ）を得た。QTOF MS ESI+: m/z 791.7 (M + H)。
例４：３−（ビス（２−（テトラデカノイルオキシ）エチル）アミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−オキソプロパン−１−アミニウムブロミド（ＨＥ−Ｅｔ−ＤＣ）の調製
中間体１の調製：（（３−（ジメチルアミノ）プロパノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエート
アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエートＴＦＡ塩の合成は、前述した。アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエートＴＦＡ塩（１．５ｇ、２．８６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の３−（ジメチルアミノ）プロピオン酸ＨＣｌ塩（４８２ｍｇ、３．１４ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．３０ｇ、３．４２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１．０４ｍＬ、５．９８ｍｍｏｌ）の予備活性化された混合物に加えた。丸底フラスコをアルゴンでフラッシュし、反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによりＤＣＭ／ＭｅＯＨの勾配を用いて精製して、（（３−（ジメチルアミノ）プロパノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエートを得た。
ＨＥ−Ｅｔ−ＤＣの調製：３−（ビス（２−（テトラデカノイルオキシ）エチル）アミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−オキソプロパン−１−アミニウムブロミド
密閉系にて、（（３−（ジメチルアミノ）プロパノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエート（６０６ｍｇ、０．９７０ｍｍｏｌ）をＡＣＮ（１０ｍＬ）に溶解し、２−ブロモエタノール（５００μＬ）を加えた。反応容器を不活性ガスでフラッシュした後、密閉した。混合物を８０℃に加熱し、一晩撹拌し、次に冷却して濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによりＤＣＭ／ＭｅＯＨの勾配を用いて精製して、３−（ビス（２−（テトラデカノイルオキシ）エチル）アミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−オキソプロパン−１−アミニウムブロミド（８０ｍｇ）を得た。QTOF MS ESI+: m/z 669.6 (M + H)。
例５：３−（ビス（２−（オレオイルオキシ）エチル）アミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−オキソプロパン−１−アミニウムブロミド（ＨＥ−Ｅｔ−ＤＯＤＣ）の調製
中間体１の調製：（Ｚ）−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレエート
Ｎ−Ｂｏｃジエタノールアミン（Aldrich 15268、Lot # 0001406013、ＭＷ ２０５．２５、１７．８１ｇ、０．０８７ｍｏｌ）、トリエチルアミン（Aldrich、ＭＷ １０１．１９、２４．４ｍｌ、０．１７６ｍｏｌ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（Aldrich、ＭＷ １２２．１７、２．７６ｇ、１．３ｇ、０．０２３ｍｏｌ）を、３５０ｍｌのクロロホルムに溶解した。攪拌しながら、１００ｍｌのクロロホルム中の塩化オレオイル（ＭＷ ３００．９１、６１．６ｇ、０．１７４ｍｏｌ）を、１０分かけて加えた（あるいは、Ｎ−Ｂｏｃジエタノールアミンのクロロホルム溶液を、塩化オレオイルを加えながら、氷／水浴中に浸漬した）。添加は、反応混合物の温度が５０℃を超えないようにして実施した。反応混合物を室温で２時間攪拌した。２００ｍｌのメタノール（EMD MX0485-5、Lot 50350）および２００ｍｌの０．９％生理食塩水（塩化ナトリウム、BDH、BDH8014、Lot # 92717）の混合物を加えて、反応をクエンチした。有機層を分離し、１００ｍｌの希重炭酸ナトリウム水溶液（Aldrich S6014、Batch # 095K0143）で２回洗浄した。溶媒を回転蒸発により除去して、５９．５ｇの粗生成物を淡黄色の油として得た（ＭＷ ７３４．１４、５９．５ｇ、０．０８１ｍｏｌ、収率１００％）。この物質をさらに精製することなく次の工程に用いた。
中間体２の調製：（Ｚ）−アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレエートＴＦＡ塩
（Ｚ）−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレエート（５９．５ｇ、０．０８１ｍｏｌ）を、１００ｍｌのトリフルオロ酢酸（Alfa Aesar Stock # A12198、Lot # D07W005、ＭＷ １１４．０２、１００ｍｌ、１．３５ｍｏｌ）および１００ｍｌのクロロホルム（Aldrich 154733、Lot # KBF5943V）で２回処理した。各処理は室温での１０分間の撹拌からなり、溶媒を各処理の終了時に回転蒸発によって除去した。２回目の処理の後、反応混合物を回転蒸発により濃縮した。残渣を２００ｍｌの塩化メチレンに溶解し、混合物を２回、１００ｍｌの水で洗浄した。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィーによりメタノール（EMD MX0485-5、Lot # 50350）と塩化メチレン（EMD DX0835-5、Lot # 51090）の混合物を溶離剤として用いて精製し、４４ｇの（Ｚ）−アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレエートＴＦＡ塩を得た（４４．０ｇ）。
中間体３の調製：（Ｚ）−（（３−（ジメチルアミノ）プロパノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレエート
（Ｚ）−アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレエートＴＦＡ塩（１．５０ｇ、２．３７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の、３−（ジメチルアミノ）プロピオン酸ＨＣｌ塩（３８３ｍｇ、２．４９ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１０３４ｍｇ、２．７２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（８３１μＬ、４．７７ｍｍｏｌ）の予備活性化された混合物に加えた。丸底フラスコをアルゴンでフラッシュし、反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによりＤＣＭ／ＭｅＯＨの勾配を用いて精製して、（Ｚ）−（（３−（ジメチルアミノ）プロパノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレエートを得た。
ＨＥ−Ｅｔ−ＤＯＤＣの調製：３−（ビス（２−（オレオイルオキシ）エチル）アミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−オキソ−プロパン−１−アミニウムブロミド
密閉系にて、（Ｚ）−（（３−（ジメチルアミノ）プロパノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレエート（５８８ｍｇ、０．８０２ｍｍｏｌ）をＡＣＮ（１０ｍＬ）に溶解し、２−ブロモエタノール（２００μＬ）を加えた。反応容器を不活性ガスでフラッシュし、次いで密閉した。混合物を８０℃に加熱し、一晩撹拌し、次に冷却して真空中で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによりＤＣＭ／ＭｅＯＨの勾配を用いて精製して、３−（ビス（２−（オレオイルオキシ）エチル）アミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−オキソプロパン−１−アミニウムブロミド（１６０ｍｇ）を得た。QTOF MS ESI+: m/z 764.3 (M + H)。
例６：４−（ビス（２−（テトラデカノイルオキシ）エチル）アミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソブタン−１−アミニウムブロミド（ＨＥ−Ｐｒ−ＤＣ）の調製
中間体１の調製：（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエート
アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエートＴＦＡ塩の合成は、前述した。アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエートＴＦＡ塩（１．００ｇ、１．９０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（５ｍＬ）中の４−（ジメチルアミノ）酪酸ＨＣｌ塩（３８２ｍｇ、２．２８ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（８６７ｍｇ、２．２８ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（７２８μＬ、４．１８ｍｍｏｌ）の予備活性化された混合物に加えた。フラスコをアルゴンでフラッシュし、反応混合物を室温で一晩撹拌し、濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによりＤＣＭ／ＭｅＯＨの勾配を用いて精製して、（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエートを得た。
ＨＥ−Ｐｒ−ＤＣの調製：４−（ビス（２−（テトラデカノイルオキシ）エチル）アミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソブタン−１−アミニウムブロミド
密閉系にて、（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエート（３００ｍｇ、０．４６９ｍｍｏｌ）をＡＣＮ（５ｍＬ）に溶解し、２−ブロモエタノール（５００μＬ）を加えた。反応容器を不活性ガスでフラッシュし、次いで密閉した。混合物を８０℃に加熱し、一晩撹拌し、次に濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによりＤＣＭ／ＭｅＯＨの勾配を用いて精製して、４−（ビス（２−（テトラデカノイルオキシ）エチル）アミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソブタン−１−アミニウムブロミド（１４０ｍｇ）を得た。LCMS ESI+: m/z 684.4 (M + H)。
例７：４−（ビス（２−（オレオイルオキシ）エチル）アミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソブタン−１−アミニウムブロミド（ＨＥ−Ｐｒ−ＤＯＤＣ）の調製
中間体１の調製：（Ｚ）−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレエート
（Ｚ）−アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレエートＴＦＡ塩の合成は、前述した。（Ｚ）−アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレエートＴＦＡ塩（１．００ｇ、１．５８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（５ｍＬ）中の４−（ジメチルアミノ）酪酸ＨＣｌ塩（３１７ｍｇ、１．８９ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（７１９ｍｇ、１．８９ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（６０６μＬ、３．４８ｍｍｏｌ）の予備活性化された混合物に加えた。フラスコをアルゴンでフラッシュし、反応混合物を室温で一晩撹拌し、濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによりＤＣＭ／ＭｅＯＨの勾配を用いて精製して、（Ｚ）−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレエートを得た。
ＨＥ−Ｐｒ−ＤＯＤＣの調製：４−（ビス（２−（オレオイルオキシ）エチル）アミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソブタン−１−アミニウムブロミド
密閉系にて、（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエート（４００ｍｇ、０．５３５ｍｍｏｌ）をＡＣＮ（５ｍＬ）に溶解し、２−ブロモエタノール（５００μＬ）を加えた。反応容器を不活性ガスでフラッシュし、次いで密閉した。混合物を８０℃に加熱し、一晩撹拌し、次に濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによりＤＣＭ／ＭｅＯＨの勾配を用いて精製して、４−（ビス（２−（オレオイルオキシ）エチル）アミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソブタン−１−アミニウムブロミド（２５５ｍｇ）を得た。LCMS ESI+: m/z 792.5 (M + H)。
例８：２−（ビス（２−（オレオイルオキシ）エチル）アミノ）−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ−メチル−２−オキソエタンアミニウムブロミド（ＨＥ２ＤＯＤＣ）の調製
中間体１の調製：（Ｚ）−（（２−（ブロモアセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレエート
（Ｚ）−アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレエートＴＦＡ塩の合成は、前述した。（Ｚ）−アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレエートＴＦＡ塩（１．５０ｇ、２．３４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２０ｍＬ）で希釈し、氷浴に入れた。ブロモアセチルブロミド（２１４μＬ、２．４６ｍｍｏｌ）、次いでトリエチルアミン（６８５μＬ、４．９１ｍｍｏｌ）を加えた。氷浴を取り除き、反応物を不活性ガス下、室温で一晩攪拌し、次にＤＣＭで１００ｍＬに希釈し、１Ｍ ＨＣｌ（７５ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（７５ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（７５ｍＬ）および飽和ブライン溶液（７５ｍＬ）で洗浄した。全ての水性洗浄液をＤＣＭ（２５ｍＬ）で逆抽出した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、真空中で濃縮した。酢酸エチルを用いたシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、（Ｚ）−（（２−（ブロモアセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレエート（１．２２ｇ）を得た。
ＨＥ２ＤＯＤＣの調製：２−（ビス（２−（オレオイルオキシ）エチル）アミノ）−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ−メチル−２−オキソエタンアミニウムブロミド
密閉系にて、（Ｚ）−（（２−（ブロモアセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレエート（２．０８ｇ、２．７５ｍｍｏｌ）をＮ−メチルジエチルアミン（１．５８ｍＬ、１３．８ｍｍｏｌ）と組み合わせて添加した。反応容器を不活性ガスでフラッシュし、次いで密閉した。混合物を５０℃に加熱し、一晩撹拌し、次に濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによりＤＣＭ／ＭｅＯＨの勾配を用いて精製して、２−（ビス（２−（オレオイルオキシ）エチル）アミノ）−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ−メチル−２−オキソエタンアミニウムブロミド（４７９ｍｇ）を得た。LCMS ESI+: m/z 793.7 (M + H)。
例９：２−（ビス（２−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノイルオキシ）エチル）アミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−オキソエタンアミニウムブロミド（ＨＥＤＣ−ＤＬｉｎ）の調製
２−（ビス（２−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノイルオキシ）エチル）アミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−オキソエタンアミニウムブロミドの調製を、ＨＥＤＣと同様の方法で、（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノイルクロリドを塩化ミリストイルの代わりに用いて行った。
例１０：２−（ビス（２−（ドデカノイルオキシ）エチル）アミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−オキソエタンアミニウムブロミド（ＨＥＤＣ−１２）の調製
２−（ビス（２−（ドデカノイルオキシ）エチル）アミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−オキソエタンアミニウムブロミドの調製を、ＨＥＤＣと同様の方法で、塩化ドデカノイルを塩化ミリストイルの代わりに用いて行った。
例１１：２−（（２−（ビス（２−（テトラデカノイルオキシ）エチル）アミノ）−２−オキソエチル）チオ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミニウムブロミド（ＨＥＳ１０４）の調製
中間体１の調製：（（２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエート（Ｓ１０４）
アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエートＴＦＡ塩の合成は、前述した。アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエートＴＦＡ塩（１５２ｇ、２３８ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（２．３Ｌ）および１０％重炭酸カリウム（１．１５Ｌ）と共に０〜５℃で撹拌した。有機相を分離し、水相をＤＣＭ（１．１５Ｌ）でさらに抽出した。合わせた有機相を、硫酸マグネシウム水和物（２３６ｇ）と共に０〜５℃で３０分撹拌し、ろ過し、ＤＣＭ（１．１５Ｌ）で洗浄した。合わせたろ液に、２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）酢酸塩酸塩（５７．０ｇ、２８５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ塩酸塩（６８．４ｇ、３５７ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（２．９１ｇ、２３．８ｍｍｏｌ）を加え、懸濁液を周囲温度で一晩撹拌し、その後透明な溶液が形成された。ＭＱ水（２．３Ｌ）およびメタノール（４６０ｍＬ）を添加し、１０分間攪拌した後、透明な有機相を分離した。濁った水相（ｐＨ３．０）をＤＣＭ（５７５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を濃縮し、１４３ｇの粗物質を塩酸塩として得た。粗物質（１４２．６ｇ）をＤＣＭ（５００ｍＬ）と共に蒸留フラスコに移し、酢酸エチル（１Ｌ）を添加した。溶液を大気圧下で蒸留まで加熱し、蒸留を７０分にわたって継続して、７６℃の残渣温度を得た。総体積１．４Ｌを、酢酸エチル（８００ｍＬ）を添加して得て、エタノール（７０ｍＬ）を加えた。５０℃の透明な溶液を３７℃に冷却し、種結晶を添加した。３７〜３５℃で１０分間にわたって顕著な結晶化の開始を観察したら、懸濁液を冷却し、０℃で一晩撹拌し、沈殿物をろ過により単離し、冷酢酸エチル（２１０ｍＬ）で洗浄した。オイルポンプ真空中で周囲温度にて一定重量になるまで４．５時間かけて乾燥し、１３４ｇの再結晶物質を、塩酸塩、白色結晶性固体として得た。リン酸三カリウム（８５ｇ、０．４０ｍｏｌ）およびリン酸水素二カリウム（２２６ｇ、１．３０ｍｏｌ）を、精製水（１．７Ｌ）に加え、ｐＨ１０．９で形成された溶液を１８〜２０℃に冷却した。ＤＣＭ（１．３Ｌ）および再結晶化したＳ１０４塩酸塩（１３３ｇ、０．１８８ｍｏｌ）を加え、混合物を１０分間攪拌した。透明な有機相を適度な速度で分離し（３５分かけて）、濁った水相をＤＣＭ（６５０ｍＬ）でさらに抽出した。合わせた有機相を無水硫酸マグネシウム（６５ｇ）と共に４０分間撹拌し、混合物をろ過し、ＤＣＭ（２００ｍＬ）で洗浄した。合わせたろ液を５０℃の水浴から、減圧下で蒸発させた（２０ｍＢａｒまで、この圧力で蒸発を１時間継続した）。１５〜２０℃の水浴からの追加の蒸発をオイルポンプバキュームで行って、１２６ｇの部分的に固化した油を得た。−２０℃の冷却浴中で冷却して完全に固化させ、オイルポンプによる真空下にて−２０℃で乾燥した後、１２６ｇの（（２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエート（Ｓ１０４）を得た。ＨＰＬＣは９８．１％の純度を示した。
ＨＥＳ１０４の調製：２−（（２−（ビス（２−（テトラデカノイルオキシ）エチル）アミノ）−２−オキソエチル）チオ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミニウムブロミド
密閉系にて、（（２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエート（１．００ｇ、１．４９ｍｍｏｌ）を２−ブロモエタノール（６８７μＬ、９．６９ｍｍｏｌ）と組み合わせて添加した。反応容器を不活性ガスでフラッシュし、次いで密閉した。混合物を７５℃に加熱し、一晩撹拌し、次に冷却して真空中で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによりＤＣＭ／ＭｅＯＨの勾配を用いて精製して、２−（（２−（ビス（２−（テトラデカノイルオキシ）エチル）アミノ）−２−オキソエチル）チオ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミニウムブロミド（ＨＥＳ１０４）（７９０ｍｇ）を得た。LCMS ESI+: m/z 715.7 (M + H)。
例１２：２−（（２−（ビス（２−（オレオイルオキシ）エチル）アミノ）−２−オキソエチル）チオ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミニウムブロミド（ＨＥＳ１０４−ＤＯ）
中間体１の調製：（Ｚ）−（（２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレエート
（Ｚ）−アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレエートＴＦＡ塩の合成は、前述した。（Ｚ）−アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレエートＴＦＡ塩（４．０６ｇ、６．４１ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（６０ｍＬ）および１０％Ｋ２ＣＯ３（３０ｍＬ）中０〜５℃で撹拌した。３０分後、有機相を分離し、水相をＤＣＭ（３０ｍＬ）でさらに抽出した。合わせた有機相を、無水ＭｇＳＯ４と共に０〜５℃で３０分撹拌し、ろ過し、ＤＣＭ（３０ｍＬ）で洗浄した。合わせたろ液に、２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）酢酸（１．２６ｇ、７．７０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ ＨＣｌ塩（１．８４ｇ、９．６２ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（７８．３ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）を加えた。薄い懸濁液を周囲温度で一晩撹拌した。その後溶液は透明となった。翌日、脱イオン水（６０ｍＬ）およびメタノール（３０ｍＬ）を添加した。１０分間攪拌した後、透明な有機相を分離した。濁った水相をＤＣＭで抽出した。合わせた有機抽出物を濃縮した。粗物質をシリカのプラグを通してろ過し、ＤＣＭ（４０ｍＬ）に取り、ＰＢＳ（ｐＨ＝１１、５０ｍＬ）を加えた。混合物を室温で１０分間撹拌した。次に有機相を分離し、水相をＤＣＭ（１５ｍＬ）で再度抽出した。合わせた有機相を無水ＭｇＳＯ４と共に３０分間攪拌した。次いで混合物をろ過し、ＤＣＭで洗浄した。合わせたろ液を真空中で濃縮して、（Ｚ）−（（２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレエート（３．４４ｇ）を得た。
ＨＥＳ１０４−ＤＯの調製
密閉系にて、（Ｚ）−（（２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレエート（５４０ｍｇ、０．６９３ｍｍｏｌ）を２−ブロモエタノール（３１９μＬ、４．５０）と組み合わせて添加した。反応容器を不活性ガスでフラッシュし、次いで密閉した。混合物を７５℃に加熱し、一晩撹拌した。翌日冷却して真空中で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによりＤＣＭ／ＭｅＯＨの勾配を用いて精製して、２−（（２−（ビス（２−（オレオイルオキシ）エチル）アミノ）−２−オキソエチル）チオ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミニウムブロミド（３２４ｍｇ）を得た。LCMS ESI+: m/z 823.8 (M + H)。
例１３：２−（（ビス（２−（オレオイルオキシ）エチル）カルバモイル）チオ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタン−アミニウムブロミド（ＨＥＴＵ１０４−ＤＯ）の調製
中間体１の調製：（Ｚ）−（（（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）カルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレエート
（Ｚ）−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレエートの合成は、前述した。（Ｚ）−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレエート（４．２ｇ、５．７２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２０ｍｌ）に溶解し、氷浴中で０℃に冷却した。ＴＦＡ（２０ｍｌ）を添加し、混合物を不活性ガスのブランケット下で２０分間撹拌した。その後、混合物を真空中で濃縮した。残渣を１０％Ｋ２ＣＯ３（２０ｍＬ）とＤＣＭ（２０ｍＬ）との間で分配した。混合物を氷浴中で２０分間攪拌した。有機部分を回収し、濁った水層をＤＣＭ（２×１０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物に無水ＭｇＳＯ４を加え、０℃で２０分間撹拌した。懸濁液をろ過し、ＤＣＭ（１０ｍＬ）で洗浄した。ジホスゲン（１．３８ｍＬ、１１．４ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ中の（Ｚ）−アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレエート材料に加え、不活性ガスのブランケット下室温で攪拌した。翌日、ＤＣＭおよび過剰ジホスゲンを真空中で除去した。２−（ジメチルアミノ）エタンチオールＨＣｌ塩（４．０５ｇ、２８．６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５０ｍＬ）およびトリエチルアミン（５．２ｍＬ、３７．２ｍｍｏｌ）に取り、（Ｚ）−（（クロロカルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレエート残渣に添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。翌日、混合物をＤＣＭで希釈し、０．３Ｍ ＨＣｌ（７５ｍＬ）、水（７５ｍＬ）および１０％Ｋ２ＣＯ３（７５ｍＬ）で洗浄した。全ての水性洗浄液をＤＣＭ（２５ｍＬ）で逆抽出した。有機物を、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、真空中で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによりＤＣＭ／ＭｅＯＨの勾配を用いて精製して、（Ｚ）−（（（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）カルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレエート（１．９０ｇ）を得た。
ＨＥＴＵ１０４ＤＯの調製
密閉系にて、（Ｚ）−（（（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）カルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレエート（６１５ｍｇ、０．８０４ｍｍｏｌ）を２−ブロモエタノール（３７０μＬ、５．２２ｍｍｏｌ）と組み合わせて添加した。反応容器を不活性ガスでフラッシュし、次いで密閉した。混合物を７５℃に加熱し、一晩撹拌し、次に冷却して真空中で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによりＤＣＭ／ＭｅＯＨの勾配を用いて精製して、２−（（ビス（２−（オレオイルオキシ）エチル）カルバモイル）チオ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミニウムブロミド（４７３ｍｇ）を得た。LCMS ESI+: m/z 809.8 (M + H)。
例１４：Ｄｏｐｅ−Ｇｌｕ−ＶＡの調製
（Ｚ）−（２Ｒ）−３−（（（２−（５−（（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエン−１−イル）オキシ）−５−オキソペンタンアミド）エトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）プロパン−１，２−ジイルジオレエート（ＤＯＰＥ−Ｇｌｕ−ＶＡ）の調製
中間体１の調製：５−（（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエン−１−イル）オキシ）−５−オキソペンタン酸
グルタル酸無水物（２２０ｍｇ、１．９３ｍｍｏｌ）およびレチノール（５００ｍｇ、１．７５ｍｍｏｌ）を琥珀色のバイアル中でジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解した。トリエチルアミン（５１３μＬ、３．６８ｍｍｏｌ）を加え、バイアルをアルゴンでフラッシュした。反応混合物を室温で４時間攪拌した。物質を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーによりジクロロメタン／メタノール勾配で精製した。画分をプールし、濃縮して、帯黄色油（７００ｍｇ）を得た。生成物はＮＭＲにより確認した。
ＤＯＰＥ−Ｇｌｕ−ＶＡの調製：（Ｚ）−（２Ｒ）−３−（（（２−（５−（（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエン−１−イル）オキシ）−５−オキソペンタンアミド）エトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）プロパン−１，２−ジイルジオレエート
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（５００ｍｇ、０．６７２ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（３０６．５ｍｇ、０．８０６ｍｍｏｌ）および５−（（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエン−１−イル）オキシ）−５−オキソペンタン酸（２６９ｍｇ、０．６７２ｍｍｏｌ）を、アルゴンでフラッシュした琥珀色のバイアル中のクロロホルム／ＤＭＦ（１０ｍＬ、１：１混合物）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３００μＬ、１．６８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を濃縮し、次いでシリカゲルクロマトグラフィーによりジクロロメタン／メタノール勾配を用いて精製した。画分をプールし、濃縮して、帯黄色油を得た（４６０ｍｇ、６１％）。生成物はＮＭＲにより確認した。
例１５：ＤＯＰＥ−Ｇｌｕ−ＮＨ−ＶＡ
（Ｚ）−（２Ｒ）−３−（（（２−（４−（（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエンアミド）ブタンアミド）エトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）プロパン−１，２−ジイルジオレエート（ＤＯＰＥ−Ｇｌｕ−ＮＨ−ＶＡ）の調製
中間体１の調製：（Ｚ）−（２Ｒ）−３−（（（２−（４−アミノブタンアミド）エトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）プロパン−１，２−ジイルジオレエート
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（２５００ｍｇ、３．３６ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−ＧＡＢＡ−ＯＨ（７５１ｍｇ、３．７０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（１５３１ｍｇ、４．０３ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ／クロロホルム（２５ｍＬ、１：１混合物）に溶解した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（８８０μＬ、５．０５ｍｍｏｌ）を加え、混合物をアルゴンのブランケット下、室温で一晩撹拌した。反応混合物を〜２００ｍＬの水で希釈し、生成物をジクロロメタン（３×１００ｍｌ）で抽出した。生成物を〜７５ｍＬのｐＨ４．０のＰＢＳ緩衝液で洗浄し、有機物を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮した。物質を次にシリカゲルクロマトグラフィーによりジクロロメタン／メタノール勾配を用いて精製し、濃縮して、無色の油（２．０１ｇ、６４％）を得た。生成物はＮＭＲにより確認した。次いで、物質を３０ｍＬの２Ｍ ＨＣｌ／ジエチルエーテルに入れた。反応物をＨ２Ｏ浴中室温で攪拌した。２時間後、溶液を濃縮して（Ｚ）−（２Ｒ）−３−（（（２−（４−アミノブタンアミド）エトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）プロパン−１，２−ジイルジオレエートを得た。
ＤＯＰＥ−Ｇｌｕ−ＮＨ−ＶＡの調製：（Ｚ）−（２Ｒ）−３−（（（２−（４−（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエンアミド）ブタンアミド）エトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）プロパン−１，２−ジイルジオレエート
（Ｚ）−（２Ｒ）−３−（（（２−（４−アミノブタンアミド）エトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）プロパン−１，２−ジイルジオレエート（１２００ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ）、レチノイン酸（５００ｍｇ、１．６６ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（６８９ｍｇ、１．８１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ／クロロホルム（１０ｍＬ、１：１混合物）に懸濁した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（７５８μＬ、４．３５ｍｍｏｌ）を加えた。丸底フラスコをアルゴンでフラッシュし、アルミ箔で覆った。反応混合物を室温で４時間攪拌し、ジクロロメタン（７５ｍＬ）とＨ２Ｏ（７５ｍＬ）に分配し、ジクロロメタンで抽出し、乾燥し（硫酸ナトリウム）、ろ過し、濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによりジクロロメタン／メタノール勾配を用いて精製し、（Ｚ）−（２Ｒ）−３−（（（２−（４−（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエンアミド）ブタンアミド）エトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）プロパン−１，２−ジイルジオレエートを得た（２９２ｍｇ、１８％）。生成物はＬＣＭＳおよびＮＭＲにより特徴付けた。
例１６：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５５０−ＶＡ
（２Ｒ）−３−（（（（（４５Ｅ，４７Ｅ，４９Ｅ，５１Ｅ）−４６，５０−ジメチル−４，４４−ジオキソ−５２−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）−７，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７，４０−ドデカオキサ−３，４３−ジアザドペンタコンタ−４５，４７，４９，５１−テトラエン−１−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）プロパン−１，２−ジイルジステアレート（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５５０−ＶＡ）の調製
中間体１の調製：（２Ｒ）−３−（（（（２，２−ジメチル−４，４４−ジオキソ−３，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５，３８，４１−トリデカオキサ−５，４５−ジアザヘプタテトラコンタン−４７−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）プロパン−１，２−ジイルジステアレート
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（２００ｍｇ、０．２６７ｍｍｏｌ）、ｔ−Ｂｏｃ−Ｎ−アミド−ｄＰＥＧ１２−酸（２１１ｍｇ、０．２９４ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（１２２ｍｇ、０．３２０ｍｍｏｌ）を、アルゴンでフラッシュした２０ｍＬのシンチレーションバイアル中のクロロホルム／メタノール／Ｈ２Ｏ（６ｍＬ、６５：３５：８）に溶解した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１６μＬ、０．６６８ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を２５℃で４時間攪拌し、濃縮した。次いで、物質をシリカゲルクロマトグラフィーによりジクロロメタン／メタノール勾配を用いて精製し、（２Ｒ）−３−（（（（２，２−ジメチル−４，４４−ジオキソ−３，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５，３８，４１−トリデカオキサ−５，４５−ジアザヘプタテトラコンタン−４７−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）プロパン−１，２−ジイルジステアレートを、油として得た（２５２ｍｇ、６５％）。
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５５０−ＶＡの調製：（２Ｒ）−３−（（（（（４５Ｅ，４７Ｅ，４９Ｅ，５１Ｅ）−４６，５０−ジメチル−４，４４−ジオキソ−５２−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）−７，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７，４０−ドデカオキサ−３，４３−ジアザドペンタコンタ−４５，４７，４９，５１−テトラエン−１−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）プロパン−１，２−ジイルジステアレート
（２Ｒ）−３−（（（（２，２−ジメチル−４，４４−ジオキソ−３，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５，３８，４１−トリデカオキサ−５，４５−ジアザヘプタテトラコンタン−４７−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）プロパン−１，２−ジイルジステアレート（２５２ｍｇ、０．１７４ｍｍｏｌ）を、ジエチルエーテル（５ｍＬ）に溶解した。反応物を室温でＨ２Ｏ浴に入れた。２Ｍ ＨＣｌ／ジエチルエーテル（２ｍＬ、４ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を約１時間撹拌した。その後、溶媒および過剰のＨＣｌを真空中で除去した。丸底フラスコ内の２ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の懸濁物をアルゴンでフラッシュした。レチノイン酸（５７．５ｍｇ、０．１９１ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（７９ｍｇ、０．２０９ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１０６μＬ、０．６０９ｍｍｏｌ）を加えた。物質は完全には溶解せず、したがってさらにクロロホルム／メタノール／Ｈ２Ｏ（１ｍＬ、６５：３５：８ ｖ：ｖ：ｖの混合物）を加えて、反応物が均一なるようにした。３．５時間後、反応混合物を濃縮した。次いで、物質をシリカゲルクロマトグラフィーによりジクロロメタン／メタノール勾配を用いて精製し、（２Ｒ）−３−（（（（（４５Ｅ，４７Ｅ，４９Ｅ，５１Ｅ）−４６，５０−ジメチル−４，４４−ジオキソ−５２−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）−７，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７，４０−ドデカオキサ−３，４３−ジアザドペンタコンタ−４５，４７，４９，５１−テトラエン−１−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）プロパン−１，２−ジイルジステアレートを、黄褐色の固体として得た（２１０ｍｇ、７４％）。生成物をＮＭＲおよびＬＣＭＳにより確認した。
例１７：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｇｌｕ−ＶＡ
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｇｌｕ−ＶＡの調製
中間体１の調製：５−（（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエン−１−イル）オキシ）−５−オキソペンタン酸
グルタル酸無水物（１１５ｍｇ、１．０１ｍｍｏｌ）およびレチノール（２４０ｍｇ、０．８３８ｍｍｏｌ）を、琥珀色のバイアル中でジクロロメタン（３ｍＬ）に溶解した。トリエチルアミン（２５７μＬ、１．８４ｍｍｏｌ）を加え、バイアルをアルゴンでフラッシュした。反応物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を濃縮し、次にシリカゲルクロマトグラフィーによりジクロロメタン／メタノール勾配を用いて精製し、５−（（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエン−１−イル）オキシ）−５−オキソペンタン酸を帯黄色油として得た（７００ｍｇ、７８％）。物質は、ＮＭＲによって特徴付けた。
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｇｌｕ−ＶＡの調製
５−（（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエン−１−イル）オキシ）−５−オキソペンタン酸（４３ｍｇ、０．１０８ｍｍｏｌ）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２（２５０ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（４５ｍｇ、０．１１７ｍｍｏｌ）を、アルゴンガスでフラッシュした琥珀色のシンチレーションバイアル内のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）に溶解した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４７μＬ、０．２７０ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で一晩攪拌し、次いで、シリカゲルクロマトグラフィーによりジクロロメタン／メタノール勾配を用いて精製し、帯黄色油を得た（５９ｍｇ、２０．７％）。生成物はＮＭＲで確認した。
例１８：ＤＯＰＥ−Ｇｌｙ３−ＶＡ
（Ｚ）−（２Ｒ）−３−（（（（（１４Ｅ，１６Ｅ，１８Ｅ，２０Ｅ）−１５，１９−ジメチル−４，７，１０，１３−テトラオキソ−２１−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）−３，６，９，１２−テトラアザヘニコサ−１４，１６，１８，２０−テトラエン−１−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）プロパン−１，２−ジイルジオレエート（ＤＯＰＥ−Ｇｌｙ３−ＶＡ）の調製
中間体１の調製：（Ｚ）−（２Ｒ）−３−（（（２−（２−（２−（２−アミノアセトアミド）アセトアミド）アセトアミド）エトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）プロパン−１，２−ジイルジオレエート
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＨ（３８２ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（５３２ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４８８μＬ、２．８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で１０〜１５分間攪拌した。その後、クロロホルム（５ｍＬ）中の１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（８３３ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を加え、反応容器をアルゴンでフラッシュした。室温で１６時間後、反応混合物を濃縮し、ジクロロメタン（５０ｍＬ）とＨ２Ｏ（５０ｍＬ）の間で分配し、ジクロロメタン（３×５０ｍＬ）で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮した。物質は、シリカゲルクロマトグラフィーによりジクロロメタン／メタノール勾配を用いて精製して、無色の油残渣を得た。これに、２Ｍ ＨＣｌ／ジエチルエーテル（５ｍＬ）を加え、反応混合物をＨ２Ｏ浴中で約２時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、残渣をジクロロメタン（７５ｍＬ）に入れ、飽和重炭酸ナトリウム溶液（７５ｍＬ）で洗浄し、生成物をジクロロメタンで抽出し（３×７５ｍＬ）、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮して、（Ｚ）−（２Ｒ）−３−（（（２−（２−（２−（２−アミノアセトアミド）アセトアミド）アセトアミド）エトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）プロパン−１，２−ジイルジオレエートを、半固体として得た（７６５ｍｇ、９０％）。ＮＭＲにより確認した。
ＤＯＰＥ−Ｇｌｙ ３ −ＶＡの調製：（Ｚ）−（２Ｒ）−３−（（（（（１４Ｅ，１６Ｅ，１８Ｅ，２０Ｅ）−１５，１９−ジメチル−４，７，１０，１３−テトラオキソ−２１−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）−３，６，９，１２−テトラアザヘニコサ−１４，１６，１８，２０−テトラエン−１−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）プロパン−１，２−ジイルジオレエート
（Ｚ）−（２Ｒ）−３−（（（２−（２−（２−（２−アミノアセトアミド）アセトアミド）アセトアミド）エトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）プロパン−１，２−ジイルジオレエート（７６５ｍｇ、０．８３６ｍｍｏｌ）、レチノイン酸（３０１ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（４１３ｍｇ、１．０９ｍｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）に懸濁した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４３７μＬ、２．５１ｍｍｏｌ）を加え、反応容器をアルゴンガスでフラッシュした。物質の溶媒和を助けるためにクロロホルム（５ｍＬ）を添加した。反応物は、アルミ箔で覆われた丸底フラスコ中、室温で〜４時間撹拌した。物質を、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）とジクロロメタン（１００ｍＬ）の間で分配した。ジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して濃縮した。次に物質を、シリカゲルクロマトグラフィーによりジクロロメタン／メタノール勾配を用いて精製し、（Ｚ）−（２Ｒ）−３−（（（（（１４Ｅ，１６Ｅ，１８Ｅ，２０Ｅ）−１５，１９−ジメチル−４，７，１０，１３−テトラオキソ−２１−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）−３，６，９，１２−テトラアザヘニコサ−１４，１６，１８，２０−テトラエン−１−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）プロパン−１，２−ジイルジオレエートを、オレンジ色の油として得た（７０４ｍｇ、７０％）。生成物をＬＣＭＳおよびＮＭＲにより確認した。
例１９：ＶＡ−ＰＥＧ−ＶＡ
Ｎ１，Ｎ１９−ビス（（１６Ｅ，１８Ｅ，２０Ｅ，２２Ｅ）−１７，２１−ジメチル−１５−オキソ−２３−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）−４，７，１０−トリオキサ−１４−アザトリコサ−１６，１８，２０，２２−テトラエン−１−イル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン-１，１９−ジアミド（ＶＡ−ＰＥＧ−ＶＡ）の調製
ＶＡ−ＰＥＧ−ＶＡの調製：Ｎ１，Ｎ１９−ビス（（１６Ｅ，１８Ｅ，２０Ｅ，２２Ｅ）−１７，２１−ジメチル−１５−オキソ−２３−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）−４，７，１０−トリオキサ−１４−アザトリコサ−１６，１８，２０，２２−テトラエン−１−イル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミド
レチノイン酸（２９１３ｍｇ、９．７０ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（３９９２ｍｇ、１０．５０ｍｍｏｌ）およびジアミド−ｄＰＥＧ１１−ジアミン（３０００ｍｇ、４．０４ｍｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）に懸濁した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４２２２μＬ、２４．２４ｍｍｏｌ）を加え、容器をアルゴンでフラッシュした。反応物を、アルミ箔で覆われた丸底フラスコ中、室温で一晩撹拌した。翌日、物質を酢酸エチル（１２５ｍＬ）と水（１２５ｍＬ）の間で分配した。酢酸エチル（３×１２５ｍＬ）で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮した。物質を次にシリカゲルクロマトグラフィーによりジクロロメタン／メタノール勾配を用いて精製した。画分をプールし、濃縮して、黄色油を得た（２９００ｍｇ、５４．９％）。生成物をＬＣＭＳおよびＮＭＲにより確認した。
例２０：ＶＡ−ＰＥＧ２０００−ＶＡ
（２Ｅ，２’Ｅ，４Ｅ，４’Ｅ，６Ｅ，６’Ｅ，８Ｅ，８’Ｅ）−Ｎ，Ｎ’−（３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６，３９，４２，４５，４８，５１，５４，５７，６０，６３，６６，６９，７２，７５，７８，８１，８４，８７，９０，９３，９６，９９，１０２，１０５，１０８，１１１，１１４，１１７，１２０，１２３，１２６，１２９，１３２，１３５，１３８−ヘキサテトラコンタオキサテトラコンタヘクタン−１，１４０−ジイル）ビス（３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエンアミド）（ＶＡ−ＰＥＧ２０００−ＶＡ）の調製
ＶＡ−ＰＥＧ２０００−ＶＡの調製：（２Ｅ，２’Ｅ，４Ｅ，４’Ｅ，６Ｅ，６’Ｅ，８Ｅ，８’Ｅ）−Ｎ，Ｎ’−（３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６，３９，４２，４５，４８，５１，５４，５７，６０，６３，６６，６９，７２，７５，７８，８１，８４，８７，９０，９３，９６，９９，１０２，１０５，１０８，１１１，１１４，１１７，１２０，１２３，１２６，１２９，１３２，１３５，１３８−ヘキサテトラコンタオキサテトラコンタヘクタン−１，１４０−ジイル）ビス（３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエンアミド）
レチノイン酸（１０９ｍｇ、０．３６２ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（１４９ｍｇ、０．３９２ｍｍｏｌ）およびアミン−ＰＥＧ２Ｋ−アミン（３３３ｍｇ、０．１５１ｍｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）に懸濁した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１５８μＬ、０．９０６ｍｍｏｌ）を加え、容器をアルゴンでフラッシュした。反応物を、アルミ箔で覆われた丸底フラスコ中、室温で一晩撹拌した。翌日、物質を酢酸エチル（３０ｍＬ）と水（３０ｍＬ）の間で分配した。酢酸エチル（３×１２５ｍＬ）で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮した。物質を次に、シリカゲルクロマトグラフィーによりジクロロメタン／メタノール勾配を用いて精製した。画分をプールし、濃縮して、（２Ｅ，２’Ｅ，４Ｅ，４’Ｅ，６Ｅ，６’Ｅ，８Ｅ，８’Ｅ）−Ｎ，Ｎ’−（３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６，３９，４２，４５，４８，５１，５４，５７，６０，６３，６６，６９，７２，７５，７８，８１，８４，８７，９０，９３，９６，９９，１０２，１０５，１０８，１１１，１１４，１１７，１２０，１２３，１２６，１２９，１３２，１３５，１３８−ヘキサテトラコンタオキサテトラコンタヘクタン−１，１４０−ジイル）ビス（３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエンアミド）を黄色油として得た（９７ｍｇ、２３％）。生成物をＬＣＭＳおよびＮＭＲにより確認した。
1H NMR (400 MHz), δH: 6.85-6.92 (t, 2h), 6.20-6.32 (M, 6H), 6.08-6.12 (d, 4H), 5.72 (s, 2H), 3.55-3.70 (m, ~180H), 3.4-3.5 (m, 4H), 2.79 (m, 4H), 2.78 (s, 6H), 2.33 (s, 6H), 2.05 (m, 4H), 1.97 (s, 6H), 1.80 (m, 2H), 1.79 (s, 6H), 1.69 (s, 6H), 1.60 (m, 4H), 1.45 (m, 4H), 1.01 (s, 12H). QTOF MS: m/z 2651 (M + H+)。
例２１：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＶＡ
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＶＡの調製
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２（２５０ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）、レチノイン酸（３．３ｍｇ、０．１０８ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（４５ｍｇ、０．１１７ｍｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４７μＬ、０．２７０ｍｍｏｌ）を混合物に加えた。琥珀色のシンチレーションバイアルをアルゴンでフラッシュし、室温で３日間撹拌した。物質を次に、シリカゲルクロマトグラフィーによりジクロロメタン／メタノール勾配を用いて精製した。画分をプールし、濃縮して、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＶＡを黄色油として得た（２４５ｍｇ、８９％）。生成物をＮＭＲにより確認した。
例２２：ｄｉＶＡ−ＰＥＧ−ｄｉＶＡ、別称「ＤｉＶＡ」
Ｎ１，Ｎ１９−ビス（（Ｓ，２３Ｅ，２５Ｅ，２７Ｅ，２９Ｅ）−１６−（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３,７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロ−ヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエンアミド）−２４，２８−ジメチル−１５，２２−ジオキソ−３０−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）−４，７，１０−トリオキサ−１４，２１−ジアザトリアコンタ−２３，２５，２７，２９−テトラエン−１−イル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミド（ｄｉＶＡ）の調製
中間体１の調製：テトラベンジル（（５Ｓ，５７Ｓ）−６，２２，４０，５６−テトラオキソ−１１，１４，１７，２５，２８，３１，３４，３７，４５，４８，５１−ウンデカオキサ−７，２１，４１，５５−テトラアザヘンヘキサコンタン−１，５，５７，６１−テトライル）テトラカルバメート、別称Ｚ−ＤｉＶＡ−ＰＥＧ−ＤｉＶＡ−ＩＮ
５〜１０℃に冷却した１Ｌの反応フラスコを窒素でパージし、ジクロロメタン（３００ｍＬ）、ｄ−ＰＥＧ−１１−ジアミン（Quanta lot EK1-A-1100-010、５０．０ｇ、０．０６７ｍｏｌ）、Ｚ−（Ｌ）−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＨ（６１．５ｇ、０．１５ｍｏｌ）、およびＨＯＢｔ水和物（２２．５ｇ、０．１５ｍｏｌ）を入れた。４−メチルモルホリン（４−ＭＭＰ）（１５．０ｇ、０．１５ｍｏｌ）を懸濁液に添加し、光発熱反応が観察された。ジクロロメタン（１５０ｍＬ）中のＥＤＣ塩酸塩（４３．５ｇ、０．２３ｍｏｌ）と４−ＭＭＰ（２０．０ｇ、０．２０ｍｏｌ）の懸濁液を３０分間かけて添加し、２０〜２３℃に温度を維持するために適度な冷却が必要であった。わずかに濁った溶液を周囲温度で一晩撹拌し、ＨＰＬＣにより反応の完了が示された。脱イオン水（３００ｍＬ）を添加し、１０分間撹拌した後、迅速な相分離が観察された。水相をジクロロメタン（１５０ｍＬ）で、やや遅い相分離にて抽出した。合わせた有機抽出物を６％重炭酸ナトリウム（３００ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウム（２４ｇ）で乾燥した。減圧下で４０〜４５℃の水浴からの蒸発により、１３２ｇの粗生成物を得た。酢酸エチル中の８％メタノール中の粗生成物（１３１ｇ）の溶液を、酢酸エチル中の８％メタノールを充填したシリカゲル６０（４０〜６３μ）のカラムに負荷した。カラムを酢酸エチル（７．５Ｌ）中の８％メタノールで溶出した。十分に純粋な生成物（５．００〜７．２５Ｌ）を含有する画分を減圧下で４５℃の水浴から蒸発させ、精製された生成物８３．６ｇを得た。ジクロロメタン（２００ｍＬ）中の精製された生成物（８３．６ｇ）の溶液を、Dowex 650 C (H+)（２００ｇ）のカラムに負荷し、これをジクロロメタン（２５０ｍＬ）で洗浄した。カラムをジクロロメタン（２００ｍＬ）で溶出した。画分を含有する合わせた生成物（３００〜４００ｍＬ）を硫酸マグネシウム（１４ｇ）で乾燥し、減圧下で４５℃の水浴から蒸発させて、テトラベンジル（（５Ｓ，５７Ｓ）−６，２２，４０，５６−テトラオキソ−１１，１４，１７，２５，２８，３１，３４，３７，４５，４８，５１−ウンデカオキサ−７，２１，４１，５５−テトラアザヘンヘキサコンタン−１，５，５７，６１−テトライル）テトラカルバメート、別称Ｚ−ＤｉＶＡ−ＰＥＧ−ＤｉＶＡ−ＩＮを得た（７７．９ｇ、ＨＰＬＣ純度９４．１％）。
中間体２の調製：Ｎ１，Ｎ１９−ビス（（Ｓ）−１６，２０−ジアミノ−１５−オキソ−４，７，１０−トリオキサ−１４−アザイコシル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミド、別称ＤｉＶＡ−ＰＥＧ−ＤｉＶＡ−ＩＮ
１Ｌの反応フラスコを窒素でパージし、メタノール（６００ｍＬ）およびＺ−ＤｉＶＡ−ＰＥＧ−ＤｉＶＡ−ＩＮ（９２．９、６０．５ｍｍｏｌ）を入れた。混合物を、溶液が得られるまで窒素下で撹拌した。触媒である１０％Ｐｄ／Ｃ／５０％水（Aldrich、１０ｇ）を添加した。混合物を排気した（evacuated）後、圧力を窒素によって均一化した。この混合物を排気した後、圧力を水素によって均一化した。反応混合物上の水素の定常的な低流量を確保しながら、撹拌器を始動させた。水素添加を水素流中で１時間続けた。次に系を閉じ、水素添加を〜０．１ｂａｒで１時間続けた。混合物を排気し、次いで水素で〜０．１ｂａｒに再加圧した。さらに１時間水素添加した後、混合物を排気し、水素で０．１ｂａｒに再度加圧した。水素下で撹拌を１５時間続け、その後ＨＰＬＣにより出発物質が検出されなかった。この混合物を排気し、圧力を窒素によって均一化した。この混合物を排気し、圧力を窒素によって均一化した。次いで、反応混合物をセライト545のパッドでろ過した。フィルターケーキをメタノール（１００ｍＬ）で洗浄した。合わせたろ液を、最終的に４５℃、５０ｍｂａｒ未満の圧力で濃縮した。トルエン（１００ｍＬ）を添加し、得られた混合物を再度、最終的に４５℃、４０ｍｂａｒ未満の圧力で濃縮して、Ｎ１，Ｎ１９−ビス（（Ｓ）−１６，２０−ジアミノ−１５−オキソ−４，７，１０−トリオキサ−１４−アザイコシル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミド、別称ＤｉＶＡ−ＰＥＧ−ＤｉＶＡ−ＩＮを、放置すると固化する油として得た（６３．４ｇ）。
ＤｉＶＡ−ＰＥＧ−ＤｉＶＡの調製：Ｎ１，Ｎ１９−ビス（（Ｓ，２３Ｅ，２５Ｅ，２７Ｅ，２９Ｅ）−１６−（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエンアミド）−２４，２８−ジメチル−１５，２２−ジオキソ−３０−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）−４，７，１０−トリオキサ−１４，２１−ジアザトリアコンタ−２３，２５，２７，２９−テトラエン−１−イル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミド
２Ｌの反応器にアルゴンを充填し、ジクロロメタン（５００ｍＬ）、ＤｉＶＡ−ＰＥＧ−ＤｉＶＡ−ＩＮ（５２．３ｇ、５２．３ｍｍｏｌ）、レチノイン酸（７０．６ｇ、２３５ｍｍｏｌ）、および４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（２．６ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）を入れた。この混合物をアルゴン下で溶解するまで（〜２０分）撹拌した。反応物の温度を１０〜２０℃に維持しながら、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）（ＥＤＣＩ）（７０．６ｇ、３６９ｍｍｏｌ）を、一部分ずつ１０〜１５分かけて添加した（反応は、最初の３０〜６０分間はわずかに発熱性であった）。反応器をアルミ箔で覆い、混合物を１８〜２１℃で１５〜２０時間撹拌した。ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）（２５ｍｇ）を加え、反応混合物を次に、混合物上にアルゴン雰囲気を維持しながら、水性６％重炭酸ナトリウム（５００ｍＬ）に注いだ。有機相を分離した。水相をジクロロメタン（５０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機相を、不活性雰囲気下で光から保護しながら、硫酸マグネシウム（１５０ｇ）で乾燥した。乾燥剤をろ別し（圧力フィルタが好ましい）、フィルターケーキをジクロロメタン（５００ｍＬ）で洗浄した。ろ液を、減圧下で３５〜４０℃の水浴を用いて蒸発により濃縮した。油状残渣をトルエン（１５０ｍＬ）に加え、再び蒸発させて、２１０ｇの半固体残渣を得た。この残渣をジクロロメタン（２５０ｍＬ）に溶解し、シリカゲル６０（１．６ｋｇ）とジクロロメタン（４Ｌ）中の０．５％メタノールから調製したカラムに適用した。カラムを、ジクロロメタン（７．２Ｌ）、２）、ジクロロメタン（１３Ｌ）中の３％メタノール、ジクロロメタン（１３Ｌ）中の５％メタノール、ジクロロメタン中（１８Ｌ）の１０％メタノールで溶出した。１０Ｌの画分１つを採取し、次に２．５Ｌの画分を採取した。光から保護した画分をサンプルし、アルゴンでフラッシュして密閉した。採取した画分は、ＴＬＣ（ジクロロメタン中１０％メタノール、ＵＶ）により分析した。ＤｉＶＡ−ＰＥＧ−ＤｉＶＡを保持する画分をさらにＨＰＬＣで分析した。５つの画分＜８５％純度（３２ｇの蒸発残渣を与えた）を、シリカゲルおよび溶媒の元の量の２５％のみを使用して、同じ方法で再精製した。ＨＰＬＣによる純度＞８５％の画分を合わせて、３５〜４０℃の水浴を用いて減圧下で蒸発させた。蒸発残留物（１２０ｇ）をジクロロメタン（１．５Ｌ）中に再溶解し、イオン交換体Dowex 650C、Ｈ＋型（１０７ｇ）から調製したカラムに緩徐に通した（約１時間）。次いでカラムを、ジクロロメタン（１Ｌ）で洗浄した。合わせた溶出液（３２７７．４ｇ）をよく混合し、試料（２５ｍＬ、３３．３３ｇ）を、最終的に室温および＜０．１ｍＢａｒの圧力で蒸発させて、０．８３ｇの泡を得た。この数値から固体物質の総量は、８０．８ｇ（７２．５％）の収率と計算された。溶液の残り３．２４ｋｇを４２３ｇに濃縮した。この溶液２６６ｇをさらに濃縮してシロップを得、次いで無水エタノール（２００ｍＬ）に再溶解した。減圧下で３５〜４０℃の水浴を用いた蒸発を続けて、９４．８ｇの最終的なエタノール溶液を得、これは５０．８ｇ（５３．６％ｗ／ｗ）のＮ１，Ｎ１９−ビス（（Ｓ，２３Ｅ，２５Ｅ，２７Ｅ，２９Ｅ）−１６−（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエンアミド）−２４，２８−ジメチル−１５，２２−ジオキソ−３０−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）−４，７，１０−トリオキサ−１４，２１−ジアザトリアコンタ−２３，２５，２７，２９−テトラエン−１−イル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミド、別称ＤｉＶＡ−ＰＥＧ−ＤｉＶＡ、別称「ＤｉＶＡ」、を保持している。ＮＭＲおよびＱＴＯＦにより特徴付けた。
例２３：ＤＯＰＥ−ＶＡ
（Ｚ）−（２Ｒ）−３−（（（２−（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６,６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエンアミド）エトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）プロパン−１，２−ジイルジオレエート（ＤＯＰＥ−ＶＡ）の調製
ＤＯＰＥ−ＶＡの調製：（Ｚ）−（２Ｒ）−３−（（（２−（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６,６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエンアミド）エトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）プロパン−１，２−ジイルジオレエート
−７８℃で撹拌されているジエチルエーテル（２０ｍＬ）中のレチノイン酸（２５０ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）の溶液に、冷エーテル（２０ｍＬ）中の（ジエチルアミノ）硫黄トリフルオリド（１３０μＬ、０．９０ｍｍｏｌ）の溶液を、シリンジを介して加えた。反応混合物を冷浴から取り出し、攪拌を室温でさらに２時間続けた。最後に、溶媒を回転蒸発により除去した。残渣を、固体Ｎａ２ＣＯ３（５０ｍｇ）の存在下でクロロホルム（５０ｍＬ）に再溶解した。この溶液に、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（６００ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温でさらに２４時間攪拌した。溶媒を回転蒸発により除去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーによりジクロロメタン／メタノール勾配を用いて精製し、（Ｚ）−（２Ｒ）−３−（（（２−（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６,６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエンアミド）エトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）プロパン−１，２−ジイルジオレエート（２４０ｍｇ、２８％）を得た。
例２４：ＤＣ−ＶＡ
（（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエート（ＤＣ−ＶＡ）の調製
ＤＣ−ＶＡの調製：（（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエート
−７８℃で撹拌されているジエチルエーテル（２５ｍＬ）中のレチノイン酸（６００ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）の溶液に、５ｍＬの冷エーテル中の（ジエチルアミノ）硫黄トリフルオリド（０．３ｍＬ、２．１ｍｍｏｌ）の溶液を、シリンジを介して加えた。反応混合物を冷浴から取り出し、攪拌を室温でさらに１時間続けた。溶媒を回転蒸発により除去した後、残渣を、固体Ｎａ２ＣＯ３（２５ｍｇ）の存在下で、ジクロロメタン（２０ｍＬ）に再溶解した。この溶液に、アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエート（１．０５ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温でさらに２４時間攪拌した。反応混合物をジクロロメタン（５０ｍｌ）で希釈し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を回転蒸発により除去した後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーによりジクロロメタン／メタノール勾配を用いて精製し、（（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエートを得た（８００ｍｇ、５０％）。
例２５：ＤＣ−６−ＶＡ
（（６−（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエンアミド）ヘキサノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエート（ＤＣ−６−ＶＡ）の調製
中間体１の調製：（（６−アミノヘキサノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエートＴＦＡ塩
アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエート（２．５ｇ、４．８ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−アミノカプロン酸（１．３ｇ、５．６ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．３ｇ、６．３ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（２．６ｍＬ、０．０１５ｍｍｏｌ）の混合物を、ピリジン（４０ｍＬ）に溶解した。溶液を６０℃で一晩撹拌した。混合物をジクロロメタン（５０ｍＬ）で希釈し、生理食塩水（３×５０ｍＬ）で洗浄した。回転蒸発により濃縮した後、残渣をトリフルオロ酢酸／ジクロロメタン（１００ｍＬ、１：１）で処理した。混合物を濃縮し、ジクロロメタン（５０ｍＬ）に再溶解し、生理食塩水（３×５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を単離し、濃縮して、（（６−アミノヘキサノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエートＴＦＡ塩を得た（１．５ｇ、３３％）。
ＤＣ−６−ＶＡの調製：（（６−（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエンアミド）ヘキサノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエート
−７８℃で撹拌されているジエチルエーテル（４０ｍＬ）中のレチノイン酸（８００ｍｇ、２．６７ｍｍｏｌ）の溶液に、冷エーテル（７ｍＬ）中の（ジエチルアミノ）硫黄トリフルオリド（０．４ｍＬ、２２．８０ｍｍｏｌ）の溶液を、シリンジを介して加えた。反応混合物を冷浴から取り出し、攪拌を室温でさらに１時間続けた。溶媒を回転蒸発により除去した後、残渣を、固体Ｎａ２ＣＯ３（４０ｍｇ）の存在下でジクロロメタン（２５ｍＬ）に再溶解した。この溶液に、（（６−アミノヘキサノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエートＴＦＡ塩（１．５ｇ、１．６ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温でさらに２４時間攪拌した。反応混合物をジクロロメタン（５０ｍｌ）で希釈し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を回転蒸発により除去した後、残渣をカラムクロマトグラフィーにより５％メタノール／ジクロロメタンを溶出液として用いて精製し、（（６−（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエンアミド）ヘキサノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノエートを得た（３６０ｍｇ、２４％）。
例２６：ｓａｔＤｉＶＡの合成
Ｎ１，Ｎ１９−ビス（（１６Ｓ）−１６−（３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナンアミド）−２４，２８−ジメチル−１５，２２−ジオキソ−３０−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）−４，７，１０−トリオキサ−１４，２１−ジアザトリアコンチル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミド（ｓａｔＤＩＶＡ）の調製。
中間体１の調製：３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナン酸
ａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸（２０００ｍｇ、６．６６ｍｍｏｌ）を、ヘキサン／ＩＰＡ（３：１、４０ｍＬ）に超音波処理を用いて溶解した。物質をパール−シェーカーボトルに入れ、不活性ガスでフラッシュした。１０％のＰｄ／Ｃ（２００ｍｇ）を添加し、容器を再び不活性ガスでフラッシュした。物質をパール−シェーカーに＞７０ｐｓｉの水素ガスと共に一晩置いた。次いで、反応混合物をセライトのパッドを通してろ過し、濃縮して、３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナン酸を得た（２ｇ）。
ｓａｔＤｉＶＡの調製：Ｎ１，Ｎ１９−ビス（（１６Ｓ）−１６−（３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナンアミド）−２４，２８−ジメチル−１５，２２−ジオキソ−３０−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）−４，７，１０−トリオキサ−１４，２１−ジアザトリアコンチル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミド
Ｎ１，Ｎ１９−ビス（（１６Ｓ）−１６−（３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナンアミド）−２４，２８−ジメチル−１５，２２−ジオキソ−３０−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）−４，７，１０−トリオキサ−１４，２１−ジアザトリアコンチル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミド、別称ｓａｔＤｉＶＡを、ｄｉＶＡ−ＰＥＧ−ｄｉＶＡと同様の方法で、前述のＮ１，Ｎ１９−ビス（（Ｓ）−１６，２０−ジアミノ−１５−オキソ−４，７，１０−トリオキサ−１４−アザイコシル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミドから、３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナン酸をａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸の代わりに用いて調製した。QTOF MS ESI+: m/z 2161, 2163, 2165 & 2167 (M + H+)。
例２７：ｓｉｍＤｉＶＡの合成
Ｎ１，Ｎ１９−ビス（（Ｓ）−１５，２２−ジオキソ−３０−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）−１６−（９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナンアミド）−４，７，１０−トリオキサ−１４，２１−ジアザトリアコンチル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミド（ｓｉｍＤｉＶＡ）の調製
中間体１の調製：２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イルトリフルオロメタンスルホネート
窒素下−７８℃にて、乾燥ＴＨＦ中の２，２，６−トリメチルシクロヘキサノンの溶液に、２Ｍ リチウムジイソプロピルアミド溶液を滴加した。混合物を−７８℃で３時間撹拌した。ＴＨＦ中のＮ−フェニル−ビス（トリフルオロメタンスルホンイミド）の溶液を、次いで（−７８℃で）滴加した。反応フラスコをドライアイス中に入れ、一晩撹拌した。攪拌を室温で３時間続け、この間にすべての物質が溶解した。反応混合物を濃縮し、激しく撹拌しながら、残渣をヘキサン（３５０ｍＬ）に緩徐に添加した。固体物質をろ過により除去し、ヘキサン（２×５０ｍＬ）で洗浄した。ろ液を濃縮し、さらにヘキサン（１５０ｍＬ）を添加した。固体物質をろ過により除去し、ろ液を濃縮した。沈殿をもう一度繰り返し、その後残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、ヘキサン）により精製して、２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イルトリフルオロメタンスルホネートを無色油として得た（２３．２ｇ、収率６０％）。
中間体２の調製：エチル（９−ブロモジンシオ）ノナノエート
乾燥した反応管に窒素下で、亜鉛粉（３．７０ｇ、５６．６ｍｍｏｌ）、ヨウ素（４７９ｍｇ、１．８９ｍｍｏｌ）および乾燥ＤＭＡ（２０ｍｌ）を入れた。混合物を室温で、ヨウ素の色が消えるまで撹拌した。エチル９−ブロモノナノエートを加え、混合物を８０℃で４時間、次に室温で一晩撹拌した。（亜鉛挿入反応の完了を、加水分解した反応混合物のＧＣＭＳ分析により確認した）。反応混合物は、さらなる処理なしに、その後の工程で使用した。GCMS m/z 186 [M]+（ノナン酸エチル）。
中間体３の調製：エチル９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナノエート
窒素下の反応管内のジメチルアセトアミド中の新しく調製されたエチル（９−ブロモジンシオ）ノナノエート（３７．７ｍｍｏｌ）に、２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イルトリフルオロメタンスルホネート（１０．８ｇ、３９．６ｍｍｏｌ）、次いでテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（８７２ｍｇ、０．７５４ｍｍｏｌ）を加えた。管を密閉し、混合物を９５℃で２時間撹拌した。反応混合物を冷却した後、ジエチルエーテル（１００ｍＬ）中に注いだ。上層をデカントし、下層をジエチルエーテル（２×２５ｍＬ）で２回洗浄した。合わせたエーテル層を飽和ＮＨ４Ｃｌおよびブラインで洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して粗物質を得た（〜１２グラム）。物質をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、ヘキサン中０〜１．５％のＥｔＯＡｃ）により精製した。得られた油を真空下で８時間撹拌して、ほとんどの副生成物、ノナン酸エチルを除去し、次に第２のフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、ヘキサン中０〜１５％トルエン）で精製した。画分をＬＣＭＳおよびＧＣＭＳにより分析した。最も純粋な画分を収集し、２５℃未満の温度で濃縮して、エチル９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナノエートを無色油として得た（６．１６ｇ、２工程にわたり５３％の収率）。LCMS ESI+ m/z 309 [M+H]+、 GCMS m/z 308 [M]+。
中間体４の調製：９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナン酸
エタノール（８０ｍＬ）中のエチル９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナノエート（１３．２ｇ、４２．９ｍｍｏｌ）に、４Ｍ ＫＯＨ（４３ｍＬ）を加えた。混合物を室温で１．５時間で撹拌した。水（３５０ｍＬ）を加え、溶液をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（２×１００ｍＬ）で洗浄した。ＳｉｍＶＡ、水相を冷却し、４Ｍ ＨＣｌ（〜４５ｍＬ）で酸性化し、ペンタン（３×１００ｍＬ）で抽出した。合わせたペンタン抽出物を水（２００ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、ろ過し、濃縮し、高真空下で乾燥した。物質を、ペンタン（１００ｍＬ）中に再溶解させ、濃縮し、高真空下で再度乾燥して、９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナン酸を無色油として得た（１１．１ｇ、収率９２％）。MS ESI- m/z 279 [M-H]-。
ｓｉｍｄｉＶＡの調製：Ｎ１，Ｎ１９−ビス（（Ｓ）−１５，２２−ジオキソ−３０−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）−１６−（９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナンアミド）−４，７，１０−トリオキサ−１４，２１−ジアザトリアコンチル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミド
ｓｉｍＤＩＶＡを、ｄｉＶＡと同様の方法で、前述のＮ１，Ｎ１９−ビス（（Ｓ）−１６，２０−ジアミノ−１５−オキソ−４，７，１０−トリオキサ−１４−アザイコシル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミドから、９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナン酸をａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸の代わりに用いて調製した。QTOF MS ESI+: m/z 2050 (M + H+)。
例２８：ＤｉＶＡ−ＰＥＧ１８の合成
（２Ｅ，２’Ｅ，２”Ｅ，４Ｅ，４’Ｅ，４”Ｅ，６Ｅ，６’Ｅ，６”Ｅ，８Ｅ，８’Ｅ，８”Ｅ）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−（（５Ｒ，６９Ｒ，７６Ｅ，７８Ｅ，８０Ｅ，８２Ｅ）−７７，８１−ジメチル−６，６８，７５−トリオキソ−８３−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）−１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７，４０，４３，４６，４９，５２，５５，５８，６１，６４−ノナデカオキサ−７，６７，７４−トリアザトリオクタコンタ−７６，７８，８０，８２−テトラエン−１，５，６９−トリイル）トリス（３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエンアミド）（ＤＩＶＡ−ＰＥＧ１８）の調製
（２Ｅ，２’Ｅ，２”Ｅ，４Ｅ，４’Ｅ，４”Ｅ，６Ｅ，６’Ｅ，６”Ｅ，８Ｅ，８’Ｅ，８”Ｅ）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−（（５Ｒ，６９Ｒ，７６Ｅ，７８Ｅ，８０Ｅ，８２Ｅ）−７７，８１−ジメチル−６，６８，７５−トリオキソ−８３−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）−１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７，４０，４３，４６，４９，５２，５５，５８，６１，６４−ノナデカオキサ−７，６７，７４−トリアザトリオクタコンタ−７６，７８，８０，８２−テトラエン−１，５，６９−トリイル）トリス（３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエンアミド）、別称ＤＩＶＡ−ＰＥＧ１８を、ｄｉＶＡと同様の方法で、ＰＥＧ１８ジアミンをジアミド−ｄＰＥＧ１１−ジアミンの代わりに用いて調製した。LCMS ESI+: m/z 2305 (M + Na)。
例２９：ＴｒｉＶＡの合成
ＴｒｉＶＡの調製
中間体１の調製：（Ｓ）−メチル６−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−２−（（Ｓ）−２，６−ビス（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）ヘキサンアミド）ヘキサノエート
フラスコを不活性ガスでパージし、Ｈ−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＭｅのＨＣｌ塩（４ｇ、１２．１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ水和物（１．８４ｇ、１３．６ｍｍｏｌ）、Ｚ−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＨ（５．６４ｇ、１３．６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に懸濁する。ＮＭＭ（１．５ｍＬ、１３．６ｍｍｏｌ）を懸濁液に添加し、溶液が透明になった。ジクロロメタン（５０ｍＬ）中のＥＤＣ ＨＣｌ塩（４．０１ｇ、２０．９ｍｍｏｌ）およびＮＭＭ（２．０ｍＬ、１８．２ｍｍｏｌ）の懸濁液を、１０分間かけて添加した。反応物を室温で一晩撹拌し、次に１Ｍ ＨＣｌ（１００ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）、飽和重炭酸塩溶液（１００ｍＬ）および飽和ブライン溶液（１００ｍＬ）で洗浄した。全ての水性洗浄液を、ジクロロメタン（５０ｍＬ）で逆抽出した。有機物をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。物質をシリカゲルクロマトグラフィーによりジクロロメタン／メタノール勾配を用いて精製し、（Ｓ）−メチル６−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−２−（（Ｓ）−２，６− ビス（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）ヘキサンアミド）ヘキサノエートを得た（６．９１ｇ）。
中間体２の調製：（Ｓ）−６−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−２−（（Ｓ）−２，６−ビス（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）ヘキサンアミド）ヘキサン酸
６−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−２−（（Ｓ）−２，６−ビス（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）ヘキサンアミド）ヘキサノエート（６．９１ｇ、１０ｍｍｏｌ）をメタノール（５０ｍｌ）で溶解した。ＫＯＨ（２．２４ｇ、４０ｍｍｏｌ）を加え、混合物を３５℃で撹拌した。２時間後、Ｈ２Ｏ（２００ｍＬ）の添加により反応をクエンチし、混合物をジエチルエーテル（５０ｍｌ）で洗浄した。その後、１Ｍ ＨＣｌ酸でｐＨを〜２に調整した。生成物はジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮して、（Ｓ）−６−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−２−（（Ｓ）−２，６−ビス（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）ヘキサンアミド）ヘキサン酸を得た（４ｇ）。
中間体３の調製：（Ｃｂｚ）６保護Ｎ１，Ｎ１９−ビス（（１６Ｓ，１９Ｓ）−１９，２３−ジアミノ−１６−（４−アミノブチル）−１５，１８−ジオキソ−４，７，１０−トリオキサ−１４，１７−ジアザトリコシル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミド
丸底フラスコを不活性ガスでパージし、ジアミド−ｄＰＥＧ１１−ジアミン（１ｇ、１．３５ｍｍｏｌ）、（Ｓ）−６（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−２−（（Ｓ）−２，６−ビス（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）ヘキサンアミド）ヘキサン酸（２．０５ｇ、３．０３ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ水和物（４０９ｍｇ、３．０３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２５ｍＬ）中に懸濁する。ＮＭＭ（３３３μＬ、３．０３ｍｍｏｌ）を懸濁液に添加し、溶液は透明になった。ジクロロメタン（２５ｍＬ）中のＥＤＣ ＨＣｌ塩（８９３ｍｇ、４．６６ｍｍｏｌ）とＮＭＭ（４４５μＬ、４．０５ｍｍｏｌ）の懸濁液を、１０分間かけて添加した。反応物を室温で一晩撹拌し、次に１Ｍ ＨＣｌ（１００ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）、飽和重炭酸塩溶液（１００ｍＬ）および飽和ブライン溶液（１００ｍＬ）で洗浄した。全ての水性洗浄液をジクロロメタン（５０ｍＬ）で逆抽出した。有機物をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。物質を、シリカゲルクロマトグラフィーによりジクロロメタン／メタノール勾配を用いて精製し、（Ｃｂｚ）６保護Ｎ１，Ｎ１９−ビス（（１６Ｓ，１９Ｓ）−１９，２３−ジアミノ−１６−（４−アミノブチル）−１５，１８−ジオキソ−４，７，１０−トリオキサ−１４，１７−ジアザトリコシル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミドを得た（４８０ｍｇ）。
中間体４の調製：Ｎ１，Ｎ１９−ビス（（１６Ｓ，１９Ｓ）−１９，２３−ジアミド−１６−（４−アミノブチル）−１５，１８−ジオキソ−４，７，１０−トリオキサ−１４，１７−ジアザトリコシル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミド
（Ｃｂｚ）６保護Ｎ１，Ｎ１９−ビス（（１６Ｓ，１９Ｓ）−１９，２３−ジアミノ−１６−（４−アミノブチル）−１５，１８−ジオキソ−４，７，１０−トリオキサ−１４，１７−ジアザトリコシル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミドを、丸底フラスコ内のメタノール（３０ｍｌ）に溶解し、不活性ガスでフラッシュした。１０％のＰｄ／Ｃ（１３５ｍｇ）を添加し、フラスコを再び不活性ガスでフラッシュした後、全ての空気を真空ポンプで除去した。８”のＨ２バルーンを添加し、反応物を室温で攪拌した。２時間後、Ｐｄ／Ｃを、セライトのパッドを通してろ過しメタノールで洗浄することにより除去し、濃縮して、Ｎ１，Ｎ１９−ビス（（１６Ｓ，１９Ｓ）−１９，２３−ジアミド−１６−（４−アミノブチル）−１５，１８−ジオキソ−４，７，１０−トリオキサ−１４，１７−ジアザトリコシル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミドを得た（８２３ｍｇ）。
ＴｒｉＶＡの調製
Ｎ１，Ｎ１９−ビス（（１６Ｓ，１９Ｓ）−１９，２３−ジアミド−１６−（４−アミノブチル）−１５，１８−ジオキソ−４，７，１０−トリオキサ−１４，１７−ジアザトリコシル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミドを、ジクロロメタンに撹拌し、ＤＭＡＰおよびレチノイン酸を添加した。ＮＭＭを加え、溶液をアルミ箔で覆った丸底フラスコ中に撹拌し、室温にて不活性ガスでフラッシュした。ジクロロメタン（２０ｍＬ）中のＥＤＣ ＨＣｌ塩とＮＭＭの懸濁液を緩徐に１０分かけて反応物に添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。翌日、ジクロロメタンで１００ｍＬに希釈した。Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）、飽和重炭酸塩溶液（１００ｍＬ）および飽和ブライン溶液（１００ｍＬ）で洗浄した。全ての水性洗浄液をジクロロメタン（５０ｍＬ）で逆抽出した。有機物をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。物質を、塩基性アルミナクロマトグラフィーによりジクロロメタン／メタノール勾配で溶出して精製し、ＴｒｉＶＡ（７８０ｍｇ）を得た。LCMS ESI+: m/z 2972 (M + Na)。
例３０：４ＴＴＮＰＢの合成
Ｎ１，Ｎ１９−ビス（（Ｒ）−１，８−ジオキソ−７−（４−（（Ｅ）−２−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル）プロプ−１−エン−１−イル）ベンズアミド）−１−（４−（（Ｅ）−２−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル）プロプ−１−エン−１−イル）フェニル）−１３，１６，１９−トリオキサ−２，９−ジアザドコサン−２２−イル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミド（４ＴＴＮＰＢ）の調製
Ｎ１，Ｎ１９−ビス（（Ｒ）−１，８−ジオキソ−７−（４−（（Ｅ）−２−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル）プロプ−１−エン−１−イル）ベンズアミド）−１−（４−（（Ｅ）−２−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル）プロプ−１−エン−１−イル）フェニル）−１３，１６，１９−トリオキサ−２，９−ジアザドコサン−２２−イル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミド、別称４ＴＴＮＰＢを、Ｎ１，Ｎ１９−ビス（（Ｓ，２３Ｅ，２５Ｅ，２７Ｅ，２９Ｅ）−１６−（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエンアミド）−２４，２８−ジメチル−１５，２２−ジオキソ−３０−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）−４，７，１０−トリオキサ−１４，２１−ジアザトリアコンタ−２３，２５，２７，２９−テトラエン−１−イル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミド、別称ｄｉＶＡと同様の方法で、Ｎ１，Ｎ１９−ビス（（Ｓ）−１６，２０−ジアミノ−１５−オキソ−４，７，１０−トリオキサ−１４−アザイコシル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミドから、ＴＴＮＢをａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸の代わりに用いて調製した。LCMS ESI+: m/z 2343 (M + Na)。
例３１：４Ｍｙｒの合成
Ｎ１，Ｎ１９−ビス（（Ｒ）−１５，２２−ジオキソ−１６−テトラデカンアミド−４，７，１０−トリオキサ−１４，２１−ジアザペンタ−トリアコンチル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミド（４Ｍｙｒ）の調製。
４Ｍｙｒの調製：Ｎ１，Ｎ１９−ビス（（Ｒ）−１５，２２−ジオキソ−１６−テトラデカンアミド−４，７，１０−トリオキサ−１４，２１−ジアザ−ペンタ−トリアコンチル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミド
Ｎ１，Ｎ１９−ビス（（Ｓ）１６，２０−ジアミノ−１５−オキソ−４，７，１０−トリオキサ−１４−アザイコシル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミド（合成は前述した）を、ジクロロメタンに溶解し、氷浴に入れた。塩化ミリストイル、次いでトリエチルアミンを加えた。氷浴を取り除き、反応物を、不活性ガスのブランケット下で室温にて一晩攪拌した。翌日、ジクロロメタンで１００ｍＬに希釈し、１Ｍ ＨＣｌ（７５ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（７５ｍＬ）、飽和重炭酸塩溶液（７５ｍＬ）および飽和ブライン溶液（７５ｍＬ）で洗浄した。全ての水性洗浄液をジクロロメタン（２５ｍＬ）で逆抽出した。有機物をＭｇ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによりジクロロメタン／メタノール勾配を用いて精製し、Ｎ１，Ｎ１９−ビス（（Ｒ）−１５，２２−ジオキソ−１６−テトラデカンアミド−４，７，１０−トリオキサ−１４，２１−ジアザペンタ−トリアコンチル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミド（４１０ｍｇ）を得た。LCMS ESI+: m/z 1841 (M + H)。
例３２：ＤｉＶＡ−２４２の合成
Ｎ１，Ｎ１９−ビス（（Ｒ，１８Ｅ，２０Ｅ，２２Ｅ，２４Ｅ）−１１−（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチル−シクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエンアミド）−１９，２３−ジメチル−１０，１７−ジオキソ−２５−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）−３，６−ジオキサ−９，１６−ジアザペンタコサ−１８，２０，２２，２４−テトラエン−１−イル）−４，７，１０，１３−テトラオキサヘキサデカン−１，１６−ジアミド、別称ＤＩＶＡ−２４２、の調製
中間体１の調製：ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（１０，２５−ジオキソ−３，６，１３，１６，１９，２２，２９，３２−オクタオキサ−９，２６−ジアザテトラトリアコンタン−１，３４−ジイル）ジカルバメート
ジクロロメタン（２５ｍｌ）を含有する丸底フラスコに不活性ガスをパージし、ビス−ｄＰｅｇ４酸（１０００ｍｇ、３．４０ｍｍｏｌ）、Ｎ−ＢＯＣ−３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジアミン（１８１６μＬ、７．６５ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ水和物（１０３４ｍｇ、７．６５ｍｍｏｌ）を加えた。ＮＭＭ（８４１μＬ、７．６５ｍｍｏｌ）を懸濁液に添加し、溶液が透明になった。ジクロロメタン（２５ｍＬ）中のＥＤＣ ＨＣｌ塩（２２４９ｍｇ、１１．７ｍｍｏｌ）とＮＭＭ（１１２１μＬ、１０．２ｍｍｏｌ）の懸濁液を加え、続いてＤＭＡＰ（６２ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を室温で一晩撹拌した。次いで、これを、ジクロロメタンで１００ｍＬに希釈し、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）、１０％Ｋ２ＣＯ３（１００ｍＬ）、および飽和ブライン溶液（１００ｍＬ）で洗浄し、全ての水性洗浄液をジクロロメタン（３０ｍＬ）で逆抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによりジクロロメタン／メタノール勾配を用いて精製し、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（１０，２５−ジオキソ−３，６，１３，１６，１９，２２，２９，３２−オクタオキサ−９，２６−ジアザテトラトリアコンタン−１，３４−ジイル）ジカルバメート（２．５７ｇ）を得た。
中間体２の調製：Ｎ１，Ｎ１６−ビス（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）−４，７，１０，１３−テトラオキサヘキサ−デカン−１，１６−ジアミドＴＦＡ塩
ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（１０，２５−ジオキソ−３，６，１３，１６，１９，２２，２９，３２−オクタオキサ−９，２６−ジアザテトラトリアコンタン−１，３４−ジイル）ジカルバメートを、ジクロロメタン（１５ｍＬ）に溶解し、氷浴に入れた。丸底フラスコを不活性ガスでフラッシュし、ＴＦＡ（１５ｍＬ）を加えた。混合物を２０分間撹拌した。その後、反応混合物を濃縮して、Ｎ１，Ｎ１６−ビス（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）−４，７，１０，１３−テトラオキサヘキサ−デカン−１，１６−ジアミドＴＦＡ塩（１８８５ｍｇ）を得た。
ＤＩＶＡ−２４２の調製：Ｎ１，Ｎ１６−ビス（（Ｒ，１８Ｅ，２０Ｅ，２２Ｅ，２４Ｅ）−１１−（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエンアミド）−１９，２３−ジメチル−１０，１７−ジオキソ−２５−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）−３，６−ジオキサ−９，１６−ジアザペンタコサ−１８，２０，２２，２４−テトラエン−１−イル）−４，７，１０，１３−テトラオキサヘキサデカン−１，１６−ジアミド
Ｎ１，Ｎ１６−ビス（（Ｒ，１８Ｅ，２０Ｅ，２２Ｅ，２４Ｅ）−１１−（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエンアミド）−１９，２３−ジメチル−１０，１７−ジオキソ−２５−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）−３，６−ジオキサ−９，１６−ジアザペンタコサ−１８，２０，２２，２４−テトラエン−１−イル）−４，７，１０，１３−テトラオキサヘキサデカン−１，１６−ジアミド（ＤＩＶＡ−２４２）の合成は、ｄｉＶＡと同じプロトコルに従い、Ｎ１，Ｎ１６−ビス（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）−４，７，１０，１３−テトラオキサヘキサデカン−１，１６−ジアミドＴＦＡ塩から行った。LCMS ESI+: m/z 1940 (M + H)。
例３３：核酸−脂質粒子の形成
製剤プロトコルで言及されるｓｉＲＮＡは、ＨＳＰ４７／ｇｐ４６を標的とする２１ｍｅｒの二本鎖ｓｉＲＮＡ配列であり、ここでＨＳＰ４７（マウス）およびｇｐ４６（ラット）はホモログ、すなわち異なる種における同じ遺伝子である：
in vitroアッセイに使用するための、ラットＨＳＰ４７−Ｃ二本鎖ｓｉＲＮＡ（ラットｐＨＳＣ）
in vivoアッセイ用の製剤において使用するための、マウスＨＳＰ４７−Ｃ二本鎖ｓｉＲＮＡ（マウスＣＣ１４モデル）
カチオン性脂質ストック調製物。カチオン性脂質の原液を、カチオン性脂質をエタノール中のＤＰＰＥ、コレステロール、およびｄｉＶＡ−ＰＥＧ−ｄｉＶＡと、それぞれ６．０、５．１および２．７、および２．４ｍｇ／ｍＬの濃度で組み合わせることにより調製した。必要に応じて、溶液を約５０℃まで加温し、カチオン性脂質の溶液への溶解を促進した。
空のリポソーム調製物。カチオン性脂質原液を、高速で撹拌されている水性混合物に、３５〜４０℃で１または２以上の注射針を介して注入ポートあたり１．５ｍＬ／分で注入した。カチオン性脂質原液と水溶液との比率（ｖ／ｖ）は、３５：６５に固定されている。混合すると、空の小胞が自発的に形成された。得られた小胞を次に、エタノール含量が〜１２％に減少する前に、３５〜４０℃で１０分間平衡化させた。空のリポソームを次に、１０倍容量の水性緩衝液に対して透析ろ過して、エタノールを除去した。
リポプレックス調製物。上記の方法に従って調製した空の小胞を、９％スクロースを用いて１ｍＭ濃度のカチオン性脂質の最終容量に希釈した。撹拌溶液に対し、希釈した空の小胞（［ＥＶ］）の各ｍＬにつき、ＲＮａｓｅフリー水中の５％グルコース１００μｌを添加し、十分に混合した。次に、ＲＮａｓｅフリー水中の１０ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ溶液１５０μｌを一度に加えて、十分に混合した。混合物を次に、使用するＥＶの各ｍＬにつき、５％グルコース溶液１．７５０ｍＬを用いて希釈した。混合物を、約２００ｒｐｍで室温で１０分間撹拌した。クロスフロー限外ろ過システムにて〜１０００００ＭＷＣＯの半透膜を用い、適切に選択した蠕動ポンプ（例えばMidgee Hoop、UFP-100- H24LA）を用いて、混合物を元の体積の約１／３（または所望の体積）に濃縮し、次に３％スクロースおよび２．９％グルコースを含有する水溶液を用いて、試料体積の５倍に対して透析ろ過した。生成物を、使用前に無菌条件下で、０．８／０．２ミクロンの細孔径の組合わせフィルターを通してろ過した。
ｄｉＶＡ ｓｉＲＮＡ非含有リポソームの形成。カチオン性脂質、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＰＥＧ結合脂質を、無水エタノール（２００ｐｒｏｏｆ）に５０：１０：３８：２のモル比で可溶化した。ｓｉＲＮＡを、５０ｍＭクエン酸緩衝液中に可溶化し、温度を３５〜４０℃に調整した。エタノール／脂質混合物を次にｓｉＲＮＡ含有緩衝液に撹拌しながら加え、ｓｉＲＮＡを負荷したリポソームを自然に形成させた。脂質をｓｉＲＮＡと混合して、最終的な全脂質：ｓｉＲＮＡ比率を１５：１（ｗｔ：ｗｔ）にした。範囲は、５：１〜１５：１、好ましくは７：１〜１５：１とすることができる。ｓｉＲＮＡ負荷リポソームを、１０倍の体積のＰＢＳ（ｐＨ７．２）に対して透析ろ過してエタノールを除去し、緩衝液を交換した。最終生成物を、０．２２μｍの殺菌グレードのバイオバーデン低減用のＰＥＳフィルターを通してろ過した。このプロセスにより、平均粒径５０〜１００ｎｍ、ＰＤＩ＜０．２．および封入効率＞８５％のリポソームを得た。
ｄｉＶＡと共可溶化したｓｉＲＮＡ含有リポソームの形成。ｓｉＲＮＡ−ｄｉＶＡ−リポソーム製剤を、上述の方法を用いて調製した。ＤｉＶＡ−ＰＥＧ−ｄｉＶＡを、無水エタノール中で別の脂質（カチオン性脂質、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＰＥＧ結合脂質を、５０：１０：３８：２の比率）と共可溶化し、その後ｓｉＲＮＡ含有緩衝液に添加した。ｄｉＶＡ−ＰＥＧ−ｄｉＶＡのモル含有量は、０．１〜５モル比（５０：１０：３８：２：０．１〜５０：１０：３８：２：５）の範囲であった。このプロセスにより、平均粒径５０〜１００ｎｍ、ＰＤＩ＜０．２．および封入効率＞８５％のリポソームを得た。
カチオン性脂質を有するｓｉＲＮＡ含有リポソームの形成。ｓｉＲＮＡ−ｄｉＶＡ−リポソーム製剤およびｓｉＲＮＡ−リポソーム製剤を、上述の方法を用いて調製した。カチオン性脂質は、例えば、ＨＥＤＣ、ＨＥＤＯＤＣ、ＤＯ−６−１４またはこれらカチオン性脂質の任意の組合せとすることができる。
ｄｉＶＡでデコレーションされたｓｉＲＮＡ含有リポソームの形成。ｓｉＲＮＡ−リポソーム製剤を上述の方法を用いて調製し、ＰＢＳ中で０．５ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ濃度に希釈した。カチオン性脂質は、ＨＥＤＣ、ＨＥＤＯＤＣ、ＤＯ−６−１４またはこれらカチオン性脂質の任意の組合せとすることができる。ｄｉＶＡ−ＰＥＧ−ｄｉＶＡを無水エタノール（２００ｐｒｏｏｆ）に溶解し、最終濃度を１０〜５０ｍｇ／ｍＬの範囲にした。適量のエタノール溶液を、ｓｉＲＮＡ−リポソーム溶液に加えて、最終モル百分率を２〜１０ｍｏｌ％にした。溶液を、ピペットを用いて繰り返し上下に動かして混合した。ｄｉＶＡ−ＰＥＧ−ｄｉＶＡ濃度およびエタノールの添加量を調節して、添加量＞１．０μＬおよび最終エタノール濃度＜３％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を保つようにした。次にデコレーションされたリポソームを、オービタルシェーカー上周囲温度で１時間緩徐に振盪し、その後in vitroまたはin vivo評価を行った。
次の表は、モル比、当量ｍｏｌ％および重量％で表した、本発明の好ましい態様を示す。
例３４：リポソーム製剤によるトランスフェクション
トランスフェクション法は、ＬＸ−２およびｐＨＳＣについて同じものである。本発明のリポソーム製剤またはリポプレックス製剤は、所望の濃度で増殖培地と混合した。１００μｌの混合物を９６ウェルプレート中の細胞に添加し、細胞を５％ＣＯ２のインキュベーター内で３７℃で３０分間インキュベートした。３０分後、培地を新鮮な増殖培地と交換した。４８時間のトランスフェクション後、細胞を製造業者の指示に従ってCell-to-Ct(R)溶解試薬（Applied Biosystems）を用いて処理した。
ＨＳＰ４７ ｍＲＮＡ発現測定のための定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
ＨＳＰ４７およびＧＡＰＤＨのTaqMan(R)アッセイおよびOne-step ＲＴ−ＰＣＲマスターミックスは、Applied Biosystemsから購入した。各ＰＣＲ反応は以下の成分を含む：One-step ＲＴ−ＰＣＲミックス５μｌ、TaqMan(R)ＲＴ酵素ミックス０．２５μｌ、TaqMan(R)遺伝子発現アッセイプローブ（ＨＳＰ４７）０．２５μｌ、TaqMan(R)遺伝子発現アッセイプローブ（ＧＡＰＤＨ）０．５μｌ、ＲＮａｓｅフリー水３．２５μｌ、細胞溶解液０．７５μｌ、合計容量１０μｌ。ＧＡＰＤＨは、ＨＳＰ４７ ｍＲＮＡレベルの相対的定量化のための内因性対照として使用した。定量的ＲＴ−ＰＣＲを、ＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosciences）で、内蔵の相対定量法を用いて行った。すべての値は、モックトランスフェクトされた細胞の平均ＨＳＰ４７発現に対して正規化し、モックと比較したＨＳＰ４７発現のパーセンテージとして表した。
in vivo実験：２４〜３０ｇの重量範囲の雌Ｃ５７Ｂｌ／６退役繁殖マウス（Charles River）を、この研究に使用した。動物は、重量により無作為に１０匹ずつの１０群に区分した。全ての動物手順は、Bio-QuantのＩＡＣＵＣおよび／または必要に応じて参加獣医師により承認され、すべての動物福祉の問題が対処され文書化された。マウスをイソフルランで麻酔し、下大静脈を介して放血した。
熱ショックタンパク質４７（ＨＳＰ４７）の上方制御を、ＣＣｌ４の腹腔内注入（オリーブ油中のＣＣｌ４、１：７（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、体重１ｇ当たり１μＬ）を一日おきに７日間（０、２、４、６日目）行うことにより誘導した。３日目にマウスを、本発明のリポソームまたはリポプレックス製剤、またはＰＢＳの尾静脈へのＩＶ注射により、連続４日間（３、４、５、６日目）処置した。１０匹のマウスの１群（未処置）は、ＣＣｌ４処置もＩＶ注射も受けず、正常なＨＳＰ４７遺伝子発現の対照群として用いた。
実験スケジュール
７日目、最終ＩＶ注射の約２４時間後に、残りの全マウスを犠牲にし、肝臓をＰＢＳで灌流して、ＰＣＲ分析用の肝臓試料を採取した。各マウスの肝臓から約１５０ｍｇの試料を採取し、１．５ｍＬのRNAlater安定化試薬（Qiagen）に入れ、分析まで２〜８℃で保存した。肝臓試料は、明確かつ顕著な肝障害および／または壊死の領域からは採取しなかった。
マウスの肝臓からの全ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従ってRNeasyカラム（Qiagen）を用いて抽出した。２０ｎｇの全ＲＮＡを、ＨＳＰ４７発現を測定するための定量的ＲＴ−ＰＣＲに使用した。ＨＳＰ４７およびＧＡＰＤＨのTaqMan(R)アッセイおよびOne-step ＲＴ−ＰＣＲマスターミックスは、Applied Biosystemsから購入した。各ＰＣＲ反応は以下の成分を含む：One-step ＲＴ−ＰＣＲミックス５μｌ、TaqMan(R)ＲＴ酵素ミックス０．２５μｌ、TaqMan(R)遺伝子発現アッセイプローブ（ＨＳＰ４７）０．２５μｌ、TaqMan(R)遺伝子発現アッセイプローブ（ＧＡＰＤＨ）０．５μｌ、ＲＮａｓｅフリー水３．２５μｌ、ＲＮＡ０．７５μｌ、合計体積１０μｌ。ＧＡＰＤＨは、ＨＳＰ４７ ｍＲＮＡレベルの相対的定量化のための内因性対照として使用した。定量的ＲＴ−ＰＣＲを、ＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosciences）で、内蔵の相対定量法を用いて行った。すべての値は、未処置動物群の平均ＨＳＰ４７発現に対して正規化し、未処置群と比較したＨＳＰ４７発現のパーセンテージとして表した。
図１に記載の製剤は以下のとおりである：
図２に記載の製剤は以下のとおりである：
図３に記載の製剤は以下のとおりである：
例３５：in vitro有効性（ｐＨＳＣ）−用量反応
ｐＨＳＣin vitroアッセイの説明：
９６ウェルプレート内の初代肝星細胞（ｐＨＳＣ）を、漸増ｓｉＲＮＡ濃度の製剤（ＨＥＤＣ：Ｓ１０４：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ：Ｐｅｇ−ＤＭＰＥ：ＤｉＶＡ、２０：２０：３０：２５：５：２）と共にインキュベートした。３０分後、細胞を洗浄し、新鮮な増殖培地で処理し、３７℃で４８時間インキュベートした。その時点で細胞を溶解し、ｇｐ４６およびＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲ（TaqMan(R)）アッセイにより測定した。ｇｐ４６のｍＲＮＡレベルは、ＧＡＰＤＨレベルに対して正規化した。正規化ｇｐ４６レベルは、未処理の対照細胞のパーセントとして表される。図４にその結果を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。Graphpadを用いたシグモイド用量反応曲線へのデータ適合により、ＥＣ５０は１１．８ｎＭであった。
例３６：毒性
ＨｅｐＧ２細胞毒性アッセイの説明：
ヒト肝細胞癌由来の付着細胞株であるＨｅｐＧ２細胞を、１０％ＦＢＳ（Hyclone, Logan, Utah Cat# SH30910）加ＭＥＭ／ＥＢＳＳ（Hyclone, Logan, Utah, Cat# SH30024.01）で培養した。ＨｅｐＧ２細胞を９６ウェルOptilux黒色プレート（BD Falcon, Cat # BD353220）に、５０００個の細胞／ウェルの密度で一晩播種した。製剤を各ウェルに添加して、表示された最終ｓｉＲＮＡ濃度（ｎ＝３）にした。製剤添加の４８時間後に、細胞の生存率を、CellTiter-Glo発光細胞生存アッセイキット（Promega, Cat #G7572）を用いて製造業者の指示に従って測定した。化学発光シグナルは、製造業者の指示に従ってClarity Luminescence Microplate Reader（502-Biotek, Winooski, Vermont）で測定した。生存率は、製剤で処理したウェルにおける化学発光シグナルを、モック処理したウェルに対して正規化した％に基づき算出した。
最も強力な式Ｉの四級アミンカチオン性脂質を有する製剤を探索した後、式Ｉの四級アミンカチオン性脂質とそれぞれのイオン化可能な合成前駆体との組合せを評価した（以下の例に示すように、ｉ−ＤＣとＨＥＤＣ、ＩＮＴ４とＤＯＤＣ、Ｓ１０４とＨＥＳ１０４）。
次の表は、異なる製剤からの例示的な結果を提供する。四級アミンカチオン性脂質とイオン化可能なカチオン性脂質との組合せは、驚くべきことに、また予想外に、単一のカチオン性脂質を含むリポソームよりも毒性が低かった（以下の表の例、ＨＥＤＣ対ＨＥＤＣ＋ｉＤＣ、およびＤＯＤＣ対ＤＯＤＣ＋ＩＮＴ４を参照）。ＨＥＤＣ＋Ｓ１０４の組合せは、別の好ましい製剤として同定された。
In vivo毒性
ＨＥＤＣ：Ｓ１０４（２０：２０）製剤は、予備的なin vivoでの毒性試験において非常に良好に耐容される。毒性は、製剤を２５ｍｇ／ｋｇ（ラット）および１２ｍｇ／ｋｇ（サル）までの用量で静脈内に注射した場合には、観察されない。これは、この分野で優れていると考えられる。例えば、Alnylam Pharmaceuticalsは、２０１２年３月１日のアジアＴＩＤＥＳ会議にて、最も毒性の低い第３世代の脂質ナノ粒子が１０ｍｇ／ｋｇのＮＯＡＥＬを有することを明らかにした（単回投与、ラット）。
例３７：in vivoでの有効性（ラットＤＭＮＱ）
対象製剤のin vivo活性を、短期肝障害モデル（急速モデル（Quick Model）、ＤＭＮＱと呼ぶ）で評価した。このモデルにおいて、ジメチルニトロソアミン（ＤＭＮ）などの肝毒性剤で処置することにより誘導される短期的な肝障害には、ｇｐ４６ ｍＲＮＡレベルの上昇が伴う。これらの変化を誘導するため、雄性Sprague-Dawleyラットに、ＤＭＮを６日間連続で腹腔内注射した。ＤＭＮ処置期間の終了時に、動物を、個々の動物の体重に基づき無作為に複数群に分けた。製剤は、単回静脈内投与量として、ＤＭＮの最後の注射の１時間後に投与した。２４時間後に肝葉を切除し、ｇｐ４６とＭＲＰＬ１９両方のｍＲＮＡレベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲ（TaqMan(R)）アッセイにより決定した。ｇｐ４６ ｍＲＮＡレベルは、ＭＲＰＬ１９レベルに対して正規化した。
雄性Sprague-Dawleyラットを、１０ｍｇ／ｋｇのＤＭＮで１、２、３日目に、および５ｍｇ／ｋｇのＤＭＮで４、５、６日目に、腹腔内投与を介して処置して、肝障害を誘導した。動物（ｎ＝８／群）に対して、ＨＥＤＣ：Ｓ１０４：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ：Ｐｅｇ−ＤＭＰＥ：ＤｉＶＡ（２０：２０：３０：２５：５：２）からなる製剤中の０．５、０．７５、１．０、２ｍｇ／ｋｇの用量のｓｉＲＮＡ、またはＰＢＳ（ビヒクル）を、ＤＭＮの最後の注射の１時間後に、腹腔内注射した。２４時間後、全ｓｉＲＮＡを各動物の右肝葉の切片から精製し、ＲＮＡの単離まで４℃で保存した。対照群には、ＰＢＳビヒクル群（ＤＭＮ処置）および未処置（処置なし、ＤＭＮなし）が含まれていた。図５に測定結果を示す。未処置群から決定されたバックグラウンドのｇｐ４６ ｍＲＮＡレベルを減算した後、すべての試験群の値は、ビヒクル群の平均ｇｐ４６ ｍＲＮＡ（ビヒクル群のパーセントとして表される）に対して正規化した。処置後の平均ｇｐ４６ ｍＲＮＡレベルは、用量依存性応答を示し、シグモイド用量反応曲線への曲線適合により、ＥＣ５０は０．７９ｍｇ／ｋｇであった。
実施例３８：in vivoでの有効性（ラットＤＭＮＣ）
雄性Sprague-Dawleyラット（１３０〜１６０ｇ）を、腹腔内投与を介してＤＭＮで処置し、肝線維症を誘導した。ＤＭＮ処置レジメンは、各週３回（月、水および金）で、最初の３週間は１０ｍｇ／ｋｇ（すなわち、５．０ｍｇ／ｋｇのＤＭＮを、２．０ｍＬ／体重ｋｇで）、および２２〜５７日目は半分の用量の５ｍｇ／ｋｇ（すなわち、５ｍｇ／ｋｇのＤＭＮを、１．０ｍＬ／体重ｋｇで）であった。シャム群の動物は、同じスケジュールを用いてＰＢＳ（ＤＭＮ用の溶媒）を注射した。２２日目、最後のＤＭＮ処置の２４時間後、血液試料を採取し、肝疾患のバイオマーカーについて検査して、ＤＭＮ処置の有効性を確認した。ＤＭＮ処置した動物は体重に基づいて異なる治療群に割り当て、各群の動物の平均体重と体重範囲に有意差がないことを保証した。前処置の群からの動物は２５日目に犠牲にして、処置開始前の疾患の進行段階を評価した。ｇｐ４６ ｓｉＲＮＡを含む製剤による処置は２５日目から開始し、所定のｓｉＲＮＡ用量で２回の処置／週にて全１０回行った。５９日目、最後の製剤処置の４８時間後、および最後のＤＭＮ処置の７２時間後に、動物をＣＯ２吸入によって犠牲にした。肝葉を切除し、ｇｐ４６とＭＲＰＬ１９両方のｍＲＮＡレベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲ（TaqMan(R)）アッセイにより決定した。ｇｐ４６ ｍＲＮＡレベルは、ＭＲＰＬ１９レベルに対して正規化した。
雄性Sprague-Dawleyラットを、１０ｍｇ／ｋｇのＤＭＮで３週間（３回／週）、次に５ｍｇ／ｋｇで２２〜５７日目まで（３回／週）、腹腔内投与を介して処置して、肝線維症を誘導した。動物（ｎ＝１０／群）に対して、ＨＥＤＣ：Ｓ１０４：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ：Ｐｅｇ−ＤＭＰＥ：ＤｉＶＡ（２０：２０：３０：２５：５：２）からなる製剤中の１．５、１．０、０．７５、および０．５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡか、またはＰＢＳ（ビヒクル）を１０回（２回／週）、ＤＭＮの最後の注射の１時間後に腹腔内注射した。５９日目に、全ｓｉＲＮＡを各動物の右肝葉の切片から精製し、分析まで４℃で保存した。対照群には、ＰＢＳビヒクル群（ＤＭＮ誘導、ＰＢＳ処置、ｎ＝７）およびシャム群（ＤＭＮおよび製剤の代りにＰＢＳ処置、ｎ＝１０）が含まれていた。図６に測定結果を示す。未処置群から決定されたバックグラウンドのｇｐ４６ ｍＲＮＡレベルを減算した後、すべての試験群の値は、ビヒクル群の平均ｇｐ４６ ｍＲＮＡ（ビヒクル群のパーセントとして表される）に対して正規化した。前処置群からの動物（ｎ＝７）は２５日目に犠牲にして、処置開始前の疾患の進行レベルを評価した。一元配置分散分析とその後のダネット検定により、ビヒクル群と比較して、全ての処置群において有意なｇｐ４６遺伝子ノックダウンが示された（＊＊＊、ｐ＜０．００１）。
次の表は、本明細書に記載の化合物および、これら化合物のin vivoおよびin vitroでの試験から得られた結果の概要を示す。
例３９：in vivo肺線維症治療
雄性ＳＤラット（８匹／群、８週齢、日本チャールスリバー株式会社）に、０．１ｍＬの生理食塩水に溶解した０．４５ｍｇのブレオマイシン（ＢＬＭ）を、麻酔下で気管内カニューレ挿入（MicroSprayer, Penn-Century, Inc.）により肺に１回投与して、ブレオマイシン肺線維症モデルを作製した。この方法では、一般的に約２週間後に、顕著な線維症が肺に発生する。リポソーム製剤（ｓｉＲＮＡの量として１．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｌ／ｋｇの体積、すなわち、２００ｇのラットに対して２００μｌ）またはＰＢＳ（１ｍｌ／ｋｇの体積）を、ブレオマイシン投与の２週間後から開始して合計１０回（１日おきに）、尾静脈を介してラットに投与した。ラットは最後の処置後２日目に犠牲にし、肺組織の組織学的検討を行った（図７参照）。一元配置分散分析とボンフェローニ多重比較試験を、統計的有意差を評価するために用いた。
取り出した肺の一部は、常法に従ってホルマリン固定し、アザン染色（アゾカルミン、アニリンブルーオレンジＧ溶液）を行った。
図７の組織学的スコア（Ｔ.アシュクロフトスコア）の結果が示すとおり、製剤投与群（処置）において、線維化スコアが有意に減少した。
例４０：ＶＡ−ｓｉＲＮＡ−リポソーム製剤のＬＸ−２細胞株およびラット初代肝星細胞（ｐＨＳＣ）におけるノックダウン効率のin vitro評価
ＬＸ２細胞（Dr. S.L. Friedman, Mount Sinai School of Medicine, NY）を、１０％ウシ胎児血清（Invitrogen）加ＤＭＥＭ（Invitrogen）中３７℃にて、５％ＣＯ２のインキュベーター内で増殖させた。細胞を、TryPLExpress溶液（Invitrogen）を用いて、インキュベーター内にて３７℃で３分間、トリプシン処理した。細胞濃度は、血球計数器で細胞計数することにより決定し、ウェル当たり３０００細胞を、９６ウェルプレートに播種した。細胞は、トランスフェクションの前に２４時間増殖させた。
ラット初代肝星細胞（ｐＨＳＣ）を、以前に公開された方法（Nat. Biotechnol. 2008, 26(4):431-42）に従ってSprague-Dawleyラットから単離した。ｐＨＳＣを、１０％ウシ胎児血清加ＤＭＥＭ中で増殖させた。細胞を単離後、これらをin vitroスクリーニングに用いる前に、２継代まで増殖させた。細胞を、ウェル当たり１０００細胞の細胞密度で９６ウェルプレートに播種し、トランスフェクションに使用する前に４８時間増殖させた。
ＶＡ−ｓｉＲＮＡ−リポソーム製剤によるトランスフェクション。トランスフェクション法は、ＬＸ−２およびｐＨＳＣ細胞について同じものである。ＶＡ−ｓｉＲＮＡ−リポソームまたはＶＡ−ｓｉＲＮＡ−リポプレックス製剤を、所望の濃度で増殖培地に混合した。１００μｌの混合物を９６ウェルプレート中の細胞に添加し、細胞を、５％ＣＯ２のインキュベーター内にて３７℃で３０分インキュベートした。３０分後、培地を新鮮な増殖培地と交換した。４８時間のトランスフェクションの後、細胞を、Cell-to-Ct溶解試薬（Applied Biosystems）を用い、製造業者の指示に従って処理した。
ＨＳＰ４７ ｍＲＮＡ発現を測定するための定量的（ｑ）ＲＴ−ＰＣＲ。
ＨＳＰ４７およびＧＡＰＤＨのTaqMan(R)アッセイおよびOne-stepＲＴ−ＰＣＲマスターミックスは、Applied Biosystemsから購入した。各ＰＣＲ反応は以下の成分を含む：One-step ＲＴ−ＰＣＲミックス５μｌ、TaqMan(R)ＲＴ酵素ミックス０．２５μｌ、TaqMan(R)遺伝子発現アッセイプローブ（ＨＳＰ４７）０．２５μｌ、TaqMan(R)遺伝子発現アッセイプローブ（ＧＡＰＤＨ）０．５μｌ、ＲＮａｓｅフリー水３．２５μｌ、細胞溶解液０．７５μｌ、合計体積１０μｌ。ＧＡＰＤＨは、ＨＳＰ４７ ｍＲＮＡレベルの相対的定量化のための内因性対照として使用した。定量的ＲＴ−ＰＣＲを、内蔵の相対定量法を用いてＶｉｉＡTM７リアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosciences）で行った。すべての値は、モックトランスフェクトされた細胞の平均ＨＳＰ４７発現に対して正規化し、モックと比較したＨＳＰ４７発現のパーセンテージで表した。
製剤プロトコルで言及されるｓｉＲＮＡは、ＨＳＰ４７／ｇｐ４６を標的とする２１ｍｅｒの二本鎖ｓｉＲＮＡ配列であり、ここでＨＳＰ４７（マウス）およびｇｐ４６（ラット）はホモログ、すなわち異なる種における同じ遺伝子である：
in vitroアッセイに用いるための、ラットＨＳＰ４７−Ｃ二本鎖ｓｉＲＮＡ（ラットｐＨＳＣ）
カチオン性脂質ストック調製物。カチオン性脂質の原液を、カチオン性脂質をエタノール中のＤＰＰＥ、コレステロール、およびｄｉＶＡ−ＰＥＧ−ＤｉＶＡと、それぞれ６．０、５．１および２．７、および２．４ｍｇ／ｍＬの濃度で組み合わせることによって調製した。必要に応じて、溶液を約５０℃まで加温し、カチオン性脂質の溶液への溶解を促進した。
空のリポソーム調製物。カチオン性脂質原液を、高速で撹拌されている９％スクロースの水性混合物に、４０±１℃で１または２以上の注射針を介して注入ポートあたり１．５ｍＬ／分で注入した。カチオン性脂質原液と水溶液との比率（ｖ／ｖ）は、３５：６５に固定されている。混合すると、空の小胞が自発的に形成された。得られた小胞は次に、エタノール含量が〜１２％に減少する前に、４０℃で１０分間平衡化させた。
リポプレックス調製物。上記の方法に従って調製した空の小胞を、９％スクロースを用いて１ｍＭ濃度のカチオン性脂質最終容量に希釈した。撹拌溶液に対し、希釈した空の小胞（［ＥＶ］）の各ｍＬにつき、ＲＮａｓｅフリー水中の５％グルコース１００μｌを添加し、十分に混合した。次に、ＲＮａｓｅフリー水中の１０ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ溶液１５０μｌを一度に加えて、十分に混合した。混合物を次に、使用するＥＶの各ｍＬにつき、５％グルコース溶液１．７５０ｍＬ用いて希釈した。混合物を、約２００ｒｐｍで室温で１０分間撹拌した。クロスフロー限外ろ過システムにて〜１０００００ＭＷＣＯの半透膜を用い、適切に選択した蠕動ポンプ（例えばMidgee Hoop, UFP-100- H24LA）を用いて、混合物を元の体積の約１／３（または所望の体積）に濃縮し、次に３％スクロースおよび２．９％グルコースを含有する水溶液を用いて、試料体積の５倍に対して透析ろ過した。生成物を、使用前に無菌条件下０．８／０．２ミクロンの細孔径の組合せフィルターを通してろ過した。
ｄｉＶＡ ｓｉＲＮＡ非含有リポソームの形成。カチオン性脂質、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＰＥＧ結合脂質（例えばＰＥＧ−脂質）を、無水エタノール（２００ｐｒｏｏｆ）に５０：１０：３８：２のモル比で可溶化した。ｓｉＲＮＡを５０ｍＭクエン酸緩衝液中に可溶化し、温度を３５〜４０℃に調整した。エタノール／脂質混合物を次に、ｓｉＲＮＡ含有緩衝液に撹拌しながら加え、ｓｉＲＮＡを負荷したリポソームを自然に形成させた。脂質をｓｉＲＮＡと混合して、最終的な全脂質：ｓｉＲＮＡ比率を１５：１（ｗｔ：ｗｔ）にした。範囲は、５：１〜１５：１、好ましくは７：１〜１５：１とすることができる。ｓｉＲＮＡ負荷リポソームを、１０倍の体積のＰＢＳ（ｐＨ７．２）に対して透析ろ過してエタノールを除去し、緩衝液を交換した。最終生成物を、０．２２μｍの殺菌グレードのバイオバーデン低減用のＰＥＳフィルターを通してろ過した。このプロセスにより、平均粒径５０〜１００ｎｍ、ＰＤＩ＜０．２．および封入効率＞８５％のリポソームを得た。
ｄｉＶＡと共可溶化したｓｉＲＮＡ含有リポソームの形成。ｓｉＲＮＡ−ｄｉＶＡ−リポソーム製剤を、上述の方法を用いて調製した。ｄｉＶＡ−ＰＥＧ−ｄｉＶＡを、無水エタノール中で別の脂質（カチオン性脂質、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＰＥＧ結合脂質を、５０：１０：３８：２の比率）と共可溶化し、その後ｓｉＲＮＡ含有緩衝液に添加した。ｄｉＶＡ−ＰＥＧ−ｄｉＶＡのモル含有量は、０．１〜５モル比（５０：１０：３８：２：０．１〜５０：１０：３８：２：５）の範囲であった。このプロセスにより、平均粒径５０〜１００ｎｍ、ＰＤＩ＜０．２．および封入効率＞８５％のリポソームを得た。
カチオン性脂質を有するｓｉＲＮＡ含有リポソームの形成。ｓｉＲＮＡ−ｄｉＶＡ−リポソーム製剤およびｓｉＲＮＡ−リポソーム製剤を、上述の方法を用いて調製した。カチオン性脂質は、例えば、ＤＯＤＣ、ＨＥＤＣ、ＨＥＤＯＤＣ、ＤＯ−６−１４またはこれらカチオン性脂質の任意の組合せとすることができる。
ｄｉＶＡでデコレーションされたｓｉＲＮＡ含有リポソームの形成。ｓｉＲＮＡ−リポソーム製剤を上述の方法を用いて調製し、ＰＢＳ中で０．５ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ濃度に希釈した。カチオン性脂質は、ＤＯＤＣ、ＨＥＤＣ、ＨＥＤＯＤＣ、ＤＯ−６−１４またはこれらカチオン性脂質の任意の組合せとすることができる。ｄｉＶＡ−ＰＥＧ−ｄｉＶＡを、無水エタノール（２００ｐｒｏｏｆ）に溶解し、最終濃度を１０〜５０ｍｇ／ｍＬの範囲にした。適量のエタノール溶液を、ｓｉＲＮＡ−リポソーム溶液に加えて、最終モル百分率を２〜１０ｍｏｌ％にした。溶液を、ピペットを用いて繰り返し上下に動かして混合した。ｄｉＶＡ−ＰＥＧ−ｄｉＶＡ濃度およびエタノールの添加量を調節して、添加量＞１．０μＬおよび最終エタノール濃度＜３％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を保つようにした。次にデコレーションされたリポソームを、オービタルシェーカー上周囲温度で１時間緩徐に振盪し、その後in vitroまたはin vivo評価を行った。
結果
図８は、ＶＡ結合体の、デコレーションを介したリポソームへの付加が、ｓｉＲＮＡのノックダウン効率を改善し、ｓｉＲＮＡ活性を高めたことを示す。ＰＥＧ−脂質。すべての試料についての用量は、８６７ｎＭ ｓｉＲＮＡ ＨＳＰ４７−Ｃであった。結果は、ＶＡ結合体がリポソームに付加されたすべての例において、ｓｉＲＮＡの活性は、レチノイドなしのリポソームと比較して、また遊離（非結合）レチノールでデコレーションされたリポソームと比較して、増強されたことを示した。RNAiMAXは、市販のトランスフェクション試薬である。
図９は、ＶＡ結合体の、共可溶化を介したリポソームへの添加が、ｓｉＲＮＡのノックダウン効率を改善することを示す。これらは、ＤＯＤＣ含有リポソームに、ＶＡ結合体を共可溶化を介して加えたものである。配合は５０：１０：３８：２：Ｘであり、ここで、Ｘ＝１〜１０である（ＤＯＤＣ：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＰＥＧ−脂質：ＶＡ結合体、モル比）。すべての例において、濃度は１００ｎＭ ｓｉＲＮＡ ＨＳＰ４７−Ｃであった。結果は、共可溶化を介したＶＡ結合体のリポソームへの付加が、ｓｉＲＮＡ活性を増強することを示す。
図１０は、ＶＡ結合体の、共可溶化を介したリポソームへの付加が、ｓｉＲＮＡのノックダウン効率を大幅に改善することを示す。結果は、３つの異なるリポソーム、ＤＣ−６−１４、ＤＯＤＣ、ＨＥＤＯＤＣに、共可溶化を介してＶＡ結合体が付加されたものを含む。配合は全て同一で、カチオン性脂質：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＰＥＧ−脂質につき５０：１０：３８：２であり、カチオン性脂質のみが変化する。ｓｉＲＮＡの濃度は、２００ｎＭのｓｉＲＮＡ ＨＳＰ４７−Ｃで全て同一である。結果は、共可溶化により調製した場合に、異なるカチオン性脂質を有するリポソームへのＶＡ結合体の付加は、ｓｉＲＮＡ活性を大幅に増強することを示す。
図１１は、ＤＣ−６−１４カチオン性脂質を有するリポプレックスへの、共可溶化を介したＶＡ結合体の付加、およびリポソーム外側をコーティングするｓｉＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ活性を増強することを示す。製剤は、４０％リポプレックス製剤、４０：３０：３０、ＤＣ−６−１４：ＤＯＰＥ：コレステロールである。全試料についての濃度は、８６７ｎＭのｓｉＲＮＡ ＨＳＰ４７−Ｃである。結果は、共可溶化による、リポプレックスへのＶＡ結合体の付加が、ｓｉＲＮＡ活性を増強することを示す。
図１２は、ＶＡ結合体の、共可溶化を介したリポプレックスへの付加と、ＶＡ結合体の、デコレーションを介したリポプレックスへの付加の比較を示す。これらの結果は、ＤＣ−６−１４およびＤＯＤＣリポプレックスからのものである。製剤は、４０：３０：３０、ＤＣ−６−１４：ＤＯＰＥ：コレステロールからなる。各試料の濃度は、８６７ｎＭのｓｉＲＮＡ ＨＳＰ４７−Ｃである。共可溶化によるＶＡ結合体の付加は、デコレーションによるＶＡ結合体の付加と比べて、in vitroでのノックダウン効率を大幅に増強する。
例４１：in vivo実験
２４〜３０ｇの重量範囲の、雌Ｃ５７ＢＬ／６退役繁殖マウス（Charles River）を使用した。動物は、重量により無作為に１０匹ずつの１０群に区分した。全ての動物手順は、Bio-QuantのＩＡＣＵＣおよび／または必要に応じて参加の獣医師により承認され、すべての動物福祉の問題が対処され、文書化された。マウスをイソフルランで麻酔し、下大静脈を介して放血した。
マウスＨＳＰ４７−Ｃの二重鎖ｓｉＲＮＡを、in vivoアッセイ用の製剤に用いる（マウスＣＣｌ４モデル）。
熱ショックタンパク質４７（ＨＳＰ４７）の上方制御を、ＣＣｌ４の腹腔内注入（オリーブ油中のＣＣｌ４、１：７（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、体重１ｇ当たり１μＬ）を一日おきに７日間（０、２、４、６日目）行って誘導した。３日目にマウスを、本発明のリポソームもしくはリポプレックス製剤またはＰＢＳの、尾静脈へのＩＶ注射により、連続４日間（３、４、５、６日目）処置した。１０匹のマウスの１群（未処置）は、ＣＣｌ４処置もＩＶ注射も受けず、正常なＨＳＰ４７遺伝子発現の対照群として用いた。
実験スケジュール
７日目、最終ＩＶ注射の約２４時間後に、残りの全マウスを犠牲にし、肝臓をＰＢＳで灌流して、ＰＣＲ分析用の肝臓試料を採取した。各マウスの肝臓から約１５０ｍｇの試料を採取し、１．５ｍＬのRNAlater安定化試薬（Qiagen）に入れ、分析まで２〜８℃で保存した。肝臓試料は、明確かつ顕著な肝障害および／または壊死の領域から採取しなかった。
マウスの肝臓からの全ＲＮＡを、RNeasy(R)カラム（Qiagen）を用いて、製造業者のプロトコルに従って抽出した。２０ｎｇの全ＲＮＡを、ＨＳＰ４７発現を測定するための定量的ＲＴ−ＰＣＲに使用した。ＨＳＰ４７およびＧＡＰＤＨのTaqMan(R)アッセイおよびOne-step ＲＴ−ＰＣＲマスターミックスは、Applied Biosystemsから購入した。各ＰＣＲ反応は以下の成分を含む：One-step ＲＴ−ＰＣＲミックス５μｌ、TaqMan(R)ＲＴ酵素ミックス０．２５μｌ、TaqMan(R)遺伝子発現アッセイプローブ（ＨＳＰ４７）０．２５μｌ、TaqMan(R)遺伝子発現アッセイプローブ（ＧＡＰＤＨ）０．５μｌ、ＲＮａｓｅフリー水３．２５μｌ、ＲＮＡ０．７５μｌ、合計体積１０μｌ。ＧＡＰＤＨは、ＨＳＰ４７ ｍＲＮＡレベルの相対的定量化のための内因性対照として使用した。定量的ＲＴ−ＰＣＲを、内蔵の相対定量法を用いてＶｉｉＡTM７リアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosciences）で行った。すべての値は、未処置動物群の平均ＨＳＰ４７発現に対して正規化し、未処置群と比較したＨＳＰ４７発現のパーセンテージとして表した。
例４２：脂溶性ビタミン標的化結合体ＨＥＤＣ：Ｓ１０４：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ：Ｐｅｇ−ＤＭＰＥ：ＤｉＶＡのin vitro有効性
５０ｎＭのｓｉＲＮＡを有するリポソーム製剤を試験した。リポソームは、ＨＥＤＣ：Ｓ１０４：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ：Ｐｅｇ−ＤＭＰＥ：ＤｉＶＡ（＋ＤｉＶＡ）またはビタミンＡ部分が欠如した対照（−ＤｉＶＡ）のいずれかであり、ラット肝星細胞を含む９６ウェル培養プレート内で３０分間インキュベートした。３０分後、培地を新鮮な増殖培地と交換した。４８時間後、細胞を溶解し、ｇｐ４６およびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲ（TaqMan(R)）アッセイにより測定し、ｇｐ４６レベルをＧＡＰＤＨレベルに対して正規化した。
in vitroでの有効性（ｐＨＳＣ）、２％ＤｉＶＡの効果：ｓｉＲＮＡは、２％ＤｉＶＡで有効であり、１４ｎＭのＥＣ５０を有した。９６ウェルプレート中のｐＨＳＣを、標的化用のビタミンＡ部分の欠如した製剤（−ＤｉＶＡ）、またはビタミンＡ部分を含む製剤（＋ＤｉＶＡ）を用いて、５０ｎＭのｓｉＲＮＡでインキュベートした。３０分後、培地を新鮮な増殖培地と交換した。４８時間後、細胞を溶解し、ｇｐ４６およびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲ（TaqMan(R)）アッセイにより測定し、ｇｐ４６レベルをＧＡＰＤＨレベルに対して正規化した。正規化されたｇｐ４６レベルは、モック対照細胞のパーセントとして表した。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。ＤｉＶＡを含む処置後の平均ｇｐ４６レベルは、片側ｔ−検定に基づき、モック対照処置と有意に異なる（Ｐ＜０．００１）。
ＤｉＶＡとｓａｔＤｉＶＡの比較
リポソーム製剤を、９６ウェルプレート内のラットｐＨＳＣに３０分間トランスフェクトした。４８時間後、細胞を、Cell-to-Ct(R)溶解試薬（Applied Biosystems）を用いて処理し、ＨＳＰ４７ ｍＲＮＡレベルをｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化した。ＨＳＰ４７発現はモック対照に対して正規化した。ＥＣ５０は、ＨＳＰ４７ノックダウン（ＫＤ）をｓｉＲＮＡの６種類の半対数用量にて測定し、データをGraphpad Prism(R)5.04の「古典的シグモイド用量反応関数」に当てはめることにより決定した。
結果は、ＤｉＶＡとＳａｔＤｉＶＡ両方が、ＫＤ有効性を増加させたことを示す（下の表および図１５）。ＥＣ５０は、ＤｉＶＡについて１２ｎＭであり、ＳａｔＤｉＶＡについて１４ｎＭである。
レチノイド結合体ｖｓ非レチノイド結合体
レチノイド結合体は、非レチノイド同等物よりも、一貫してin vitroで強力であることが見出された（４ＴＴＮＢＢおよび４Ｍｙｒに対する、レチノイド結合体同等物であるｓａｔＤｉＶＡおよびＤｉＶＡを参照）。
例４３：脂溶性ビタミン標的化結合体ＨＥＤＣ：Ｓ１０４：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ：Ｐｅｇ−ＤＭＰＥ：ＤｉＶＡのin vivo有効性
対象製剤のin vivo活性を、短期肝障害モデル（急速モデル、ＤＭＮＱと呼ぶ）で評価した。このモデルにおいて、短期的な肝障害は、ジメチルニトロソアミン（ＤＭＮ）などの肝毒性剤で処置することによって誘導され、ｇｐ４６ ｍＲＮＡレベルの上昇を伴う。これらの変化を誘導するため、雄性Sprague-Dawleyラットに、ＤＭＮを６日間連続で腹腔内注射した。ＤＭＮ処置期間の終了時に、動物を、個々の動物の体重に基づいて無作為に複数群に分けた。製剤は単回ＩＶ用量として投与し、ＤＭＮの最後の注射の１時間後に与えた。２４時間後に肝葉を切除し、ｇｐ４６とＭＲＰＬ１９両方のｍＲＮＡレベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（TaqMan(R)）アッセイにより決定した。ｇｐ４６のｍＲＮＡレベルは、ＭＲＰＬ１９レベルに対して正規化した。
結果（図１６）は、レチノイド結合体の量と有効性との相関関係が明白であることを示す。ラットＤＭＮＱモデルにおいて有意な効果を確認するには、０．２５ｍｏｌ％が必要であるにすぎない。２ｍｏｌ％のＤｉＶＡにより、ｇｐ４６発現の強いノックダウンが観察される。図１６は、肝障害を誘発するために、腹腔内投与を介して、１、２、３日目に１０ｍｇ／ｋｇ、４、５、６日目に５ｍｇ／ｋｇのＤＭＮで処置した雄性Sprague-Dawleyラットを示す。動物（ｎ＝８／群）に、０、０．２５、０．５、１、および２％のＤｉＶＡを含有する製剤（０．７５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ用量で）、またはＰＢＳ（ビヒクル）のどちらかを、ＤＭＮの最後の注射の１時間後に静脈内注射した。２４時間後、全ｓｉＲＮＡを各動物の右肝葉の切片から精製し、ＲＮＡの単離まで４℃で保存した。対照群には、ＰＢＳビヒクル群（ＤＭＮ処置）および未処置（処置なし、ＤＭＮなし）が含まれていた。未処置群から決定されたバックグラウンドのｇｐ４６ ｍＲＮＡレベルを減算した後、すべての試験群の値は、ビヒクル群の平均ｇｐ４６ ｍＲＮＡ（ビヒクル群のパーセントとして表される）に対して正規化した。
雄性Sprague-Dawleyラット（１３０〜１６０ｇ）を、腹腔内投与を介してＤＭＮで処置して、肝線維症を誘導した。ＤＭＮ処置レジメンは、各週３回（月、水および金）で、最初の３週間は１０ｍｇ／ｋｇ（すなわち、５．０ｍｇ／ｋｇのＤＭＮを２．０ｍＬ／体重ｋｇで）、および２２〜５７日目は半分の用量の５ｍｇ／ｋｇ（すなわち、５ｍｇ／ｋｇのＤＭＮを１．０ｍＬ／ｋｇで）であった。シャム群の動物は同じスケジュールを用いて、ＰＢＳ（ＤＭＮ用の溶媒）を注射した。２２日目、最後のＤＭＮ処置の２４時間後、血液試料を採取し、肝疾患のバイオマーカーについて検査して、ＤＭＮ処置の有効性を確認した。ＤＭＮ処置した動物は体重に基づいて異なる治療群に割り当て、各群の動物の平均体重と体重範囲に有意差がないことを保証した。前処置の群からの動物は２５日目に犠牲にして、処置開始前の疾患の進行段階を評価した。ｇｐ４６ ｓｉＲＮＡを含む製剤による処置は２５日目から開始し、所定のｓｉＲＮＡ用量で２回の処置／週にて全１０回行った。５９日目、最後の製剤処置の４８時間後、および最後のＤＭＮ処置の７２時間後に、動物をＣＯ２吸入によって犠牲にした。肝葉を切除し、ｇｐ４６とＭＲＰＬ１９両方のｍＲＮＡレベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（TaqMan(R)）アッセイにより決定した。ｇｐ４６ ｍＲＮＡレベルは、ＭＲＰＬ１９レベルに対して正規化した。
本明細書に記載または引用された論文、特許、および特許出願、および他のすべての文書および電子的に入手可能な情報の内容は、個々の刊行物が参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されるのと同程度に、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
出願人は、本出願に、任意のかかる論文、特許、特許出願、または他の物理的および電子的文書からの任意の全ての資料および情報を、物理的に組み込む権利を留保する。
本明細書に開示された記載に対して、種々の置換および改変を本明細書の範囲および精神から逸脱することなく行えることは、当業者には容易に明らかである。したがって、かかる追加の態様は、本明細書および以下の特許請求の範囲の範囲内である。本明細書では、当業者に対して、ＲＮＡｉ活性を媒介するための改良された活性を有する核酸コンストラクトを生成するために、本明細書に記載の化学的修飾の様々な組合せおよび／または置換を試験することを教示している。かかる改善された活性には、改善された安定性、改善された生物学的利用能、および／または、ＲＮＡｉを媒介する細胞応答の改善された活性化を含めることができる。したがって、本明細書に記載された特定の態様は限定的ではなく、当業者は容易に、本明細書に記載の変形の特定の組合せが、改良されたＲＮＡｉ活性を有する核酸分子の同定のために、過度の実験なしで試験可能であることを理解することができる。
本明細書に例示的に記載された説明は、本明細書に具体的には開示されていない、任意の１要素または複数要素、および１つの限定または複数の限定の不在のもとで、好適に実施することができる。したがって、例えば、明細書の記載の文脈における（特に、以下の特許請求の範囲の文脈における）用語「a」および「an」および「the」および類似の指示は、本明細書に別の記述がなければ、または明らかに文脈と矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。用語「含む」、「有する」、「含む（including）」、「含有する（containing）」などは、拡張的に、かつ、限定なしで読まれるべきである（例えば、「〜を含むがこれらに限定されない」を意味する）。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書に別の記載がない限り、範囲内の個々の値を個別に言及するための簡略方法として機能することのみを意図し、各個別の値は、それぞれが明細書に言及されているかのように明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書に別の記載がない限り、または文脈により明らかに矛盾がない限り、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書に提供される、任意の、または全ての例、または例示する用語（例えば、「などの」）は、本明細書をより明らかにすることのみを意図しており、別の主張がない限り、記載の範囲の限定を意図しない。明細書中の如何なる用語も、任意のクレームされていない要素が、説明の実施に不可欠であることを示すものと解釈されるべきではない。また、本明細書で用いる用語および表現は、説明のための用語であり、限定する用語として使用されず、かかる用語および表現の使用において、示され記載された特徴の任意の均等物またはその一部を除外するとの意図はないが、クレームされた記述の範囲内で、種々の変更が可能であることが認識される。したがって本説明は、好ましい態様および任意の特徴によって特定的に開示されているが、本明細書に開示された、具体化された記述の変更および変形は、当業者により再区分することができ、かかる変更および変形は、本明細書の範囲内と考えられる。
本明細書は、広くかつ一般的に記載されている。一般的開示内に含まれる狭い種および亜属のグループの各々もまた、明細書の一部を形成する。これは、但書または任意の主題を属（genus）から取り除く否定的限定を有する、説明の一般的記述を含み、それは、切り取られる物質が具体的に本明細書に記載されているか否かとは無関係である。他の態様は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。さらに、明細書の特徴または側面がマーカッシュグループで記載されている場合には、当業者は、明細書がこれにより、マーカッシュグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの観点からも記載されていることを認識する。

Claims (12)

  1. （レチノイド）ｍ−リンカー−（レチノイド） ｎ
    の構造からなり、式中、ｍおよびｎは独立して２または３であり、リンカーは、ＮＨ−（ＣＨ ２ ） ４ −Ｃ（ＮＨ）−ＣＯ−ＮＨ−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ＮＨ−ＣＯ、ＣＯ−（ＣＨ２）３−ＣＯ、ヘキサノイル、Ｇｌｙ３、および／または、ＣＯ−（ＣＨ２）３−ＮＨを含み、ここで、ＣＯ−（ＣＨ ２ ） ３ −ＣＯに隣接する元素の一方がＮおよびもう一方がＯである、前記化合物。
  2. レチノイドが、ビタミンＡ、レチノイン酸、トレチノイン、アダパレン、４−ヒドロキシ（フェニル）レチンアミド（４−ＨＰＲ）、パルミチン酸レチニル、レチナール、飽和レチノイン酸、および飽和脱メチル化レチノイン酸からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
  3. リンカーが、ＮＨ−（ＣＨ ２ ） ４ −Ｃ（ＮＨ）−ＣＯ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−ＰＥＧ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ（ＮＨ）−（ＣＨ ２ ） ４ −ＮＨ、ＮＨ−（ＣＨ ２ ） ４ −Ｃ（ＮＨ）−ＣＯ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−ＰＥＧ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−ＰＥＧ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ（ＮＨ）−（ＣＨ ２ ） ４ −ＮＨ、およびＮＨ−（ＣＨ ２ ） 4 −Ｃ（ＮＨ）−ＣＯ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ（ＮＨ）−（ＣＨ ２ ） ４ −ＮＨからなる群から選択される、請求項１または２に記載の化合物。
  4. （レチノイド）−ＮＨ−（ＣＨ ２ ） ４ −Ｃ（ＮＨ−（レチノイド））−ＣＯ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−ＰＥＧ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ（ＮＨ−（レチノイド））−（ＣＨ ２ ） ４ −ＮＨ−（レチノイド）である、請求項１または２に記載の化合物。
  5. 式：
    式中、ｑ、ｒ、およびｓは各々独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である、
    で表される、請求項４に記載の化合物。
  6. 式：
    で表される、請求項５に記載の化合物。
  7. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物を含む、組成物。
  8. 脂質粒子の形態を有する、請求項７に記載の組成物。
  9. 標識または薬物をさらに含む、請求項７または８に記載の組成物。
  10. 薬物が核酸である、請求項９に記載の組成物。
  11. 線維性疾患またはがんを処置するための、請求項９または１０に記載の組成物。
  12. 標的細胞への薬物送達を促進するための、７〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
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